PL199384B1

PL199384B1 - Sposób wytwarzania preparatu radiodiagnostycznego na bazie gammaglobuliny

Info

Publication number: PL199384B1
Application number: PL383396A
Authority: PL
Inventors: Urszula Karczmarczyk; Alina Markiewicz; Joanna Michalik
Original assignee: Inst En Atomowej O & Sacute Ro
Priority date: 2004-11-16
Filing date: 2004-11-16
Publication date: 2008-09-30
Also published as: PL383396A1

Abstract

Sposób wytwarzania preparatu radiodiagnostycznego na bazie gammaglobuliny do obrazowania stanów zapalnych u człowieka. W pierwszym etapie prowadzi się proces otrzymywania pochodnej gammaglobuliny, w którym do gammaglobuliny rozpuszczonej w buforze, korzystnie fosforanowym o stężeniu 0,1 mol/l dodaje się stopniowo roztwór HYNIC w dimetyloformamidzie o stężeniu 30 mmol w czasie od 4 do 8 godzin przy temperaturze od 14°C do 26°C, gdzie HYNIC oznacza kwas 6-hydrazydopirydyno-3-karboksylowy, przy czym stosunek molowy HYNIC do gammaglobuliny zawiera się w granicach od 3:1 do 8:1, korzystnie 5:1. Otrzymaną mieszaninę poddaje się procesowi oczyszczania na kolumnie chromatograficznej. W drugim etapie pochodną w postaci koniugatu gammaglobuliny z HYNIC poddaje się procesowi znakowania technetem-99m w obecności koliganda, korzystnie EDTA prowadząc inkubację w czasie od 15 do 60 minut w temperaturze od 15°C do 40°C i przy pH od 5 do 8,5, z kolei w trzecim etapie prowadzi się proces stabilizacji wyznakowanego preparatu poprzez dodanie soli kationu dwuwartościowego, korzystnie chlorku magnezu w ilości od 0,2 mg do 0,7 mg w 0,1 M buforze fosforanowym o objętości co najwyżej 1 ml.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania preparatu radiofarmaceutycznego na bazie gammaglobuliny do obrazowania stanów zapalnych u człowieka.

Gammaglobulina ludzka jest dużą cząsteczką białka wielkości 150000 Daltonów i stanowi obok innych klas globulin istotny składnik układu immunologicznego człowieka. Należy do grupy białek o znanej sekwencji aminokwasów. Gammaglobulina, inaczej immunoglobulina G jest pozyskiwana z osocza krwi czł owieka i charakteryzuje się dużą zawartoś cią mostków disiarczkowych, które stabilizują strukturę przestrzenną cząsteczki oraz gwarantują prawidłowe jej pofałdowanie. Te specyficzne cechy warunkują zachowanie własności immunogennych wykazujących specyficzną aktywność biologiczną, wykorzystywaną do wytwarzania preparatów farmaceutycznych na bazie gammaglobuliny. Gammaglobulina gromadzi się niespecyficznie w obszarach objętych stanem zapalnym różnych tkanek, co daje możliwość nieinwazyjnej lokalizacji stanu zapalnego nieznanego pochodzenia w diagnostyce oraz terapii. Preparat gammaglobuliny ludzkiej jest stosowany do wytwarzania radiofarmaceutyków umożliwiających obrazowanie stanów zapalnych różnego pochodzenia np. bakteryjnych, grzybiczych, pierwotniakowych, jak również stanów zapalnych powstających wokół implantów protez naczyniowych i kostno-stawowych.

Znanym radiofarmaceutykiem do diagnostyki i terapii stanów zapalnych jest gammaglobulina znakowana technetem-99m. Jednym ze stosowanych do tego celu jest preparat firmy Mallincrodt, wykonywany w jednofiolkowym zestawie Technescan HIG o składzie: poliklonalna ludzka gammaglobulina (n-4-imino-4 merkaoptobutylo) w ilości 1 mg, winian dwusodowy w ilości 4,2 mg, chlorek cyny w ilości 8 μm.

Drugim preparatem o podobnym zastosowaniu diagnostycznym jest dwufiolkowy suchy zestaw gammaglobuliny wytwarzany przez Fundację Akademii Medycznej w Łodzi.

Pierwsza fiolka tego zestawu zawiera: 5 mg gammaglobuliny, 0,4 mg kwasu metylenodwufosfonowego, 0,03 mg chlorku cyny. W drugiej fiolce znajduje się: 8 mg chlorku sodu, 1,38 mg dwuwodoro-fosforanu sodu.

Sposób otrzymywania tych preparatów jest opisany w polskim patencie 171 608. W stanie techniki tego patentu jest podany sposób wykonywania zestawu Technescan HIG, a przedmiot patentu dotyczy sposobu otrzymywania dwufiolkowego suchego zestawu Akademii Medycznej w Łodzi.

Technescan HIG otrzymuje się poprzez redukcję mostków dwusiarczkowych gammaglobuliny 4-merkaptobutylem i łączenie zmodyfikowanej gammaglobuliny ze związkiem chelatującym winianem dwusodowym. Z kolei sposób otrzymywania zestawu dwufiolkowego polega na tym, że redukcję mostków dwusiarczkowych w cząsteczce gammaglobuliny prowadzi się 2-merkaptoetanolem, zaś jako związku chelatującego używa się kwasu metylenodwufosfonowego.

Oba opisane zestawy są bezpośrednio znakowane technetem-99m, co może prowadzić do naruszenia struktury przestrzennej cząsteczki białka.

Zgodnie z wynalazkiem sposób wytwarzania preparatu radio-diagnostycznego na bazie gammaglobuliny do obrazowania stanów zapalnych u człowieka polega na tym, że w pierwszym etapie prowadzi się proces otrzymywania pochodnej gammaglobuliny. W czasie tego procesu do gammaglobuliny rozpuszczonej w buforze, korzystnie fosforanowym o stężeniu 0,1 mol/l dodaje się stopniowo roztwór HYNIC w dimetyloformamidzie o stężeniu 30 mmol w czasie od 4 do 8 godzin, przy temperaturze od 14°C do 26°C, korzystnie bez dostępu światła, gdzie HYNIC oznacza kwas 6-hydrazydopirydyno-3-karboksylowy acid. Stosunek molowy HYNIC do gammaglobuliny zawiera się w granicach od 3:1 do 8:1, korzystnie 5:1. Następnie mieszaninę poddaje się oczyszczaniu na kolumnie chromatograficznej, korzystnie wypełnionej złożem Sephadex G-25 Medium, przeznaczonym do rozdziału związków wielkocząsteczkowych typu gammaglobuliny od drobnocząsteczkowych, jak sole nieorganiczne i inne składniki mieszaniny inkubacyjnej. W drugim etapie otrzymaną pochodną w postaci koniugatu gammaglobuliny z HYNIC poddaje się procesowi znakowania technetem-99m w obecności koliganda. Korzystnie stosuje się EDTA prowadząc inkubację w czasie od 15 do 60 minut w temperaturze od 15°C do 40°C, przy pH od 5 do 8,5, korzystnie 7,3.

Z kolei w trzecim etapie prowadzi się proces stabilizacji wyznakowanego preparatu poprzez dodanie soli kationu dwuwartościowego, korzystnie chlorku magnezu w ilości 0,3 mg do 0,7 mg w 0,1 M buforze fosforanowym o objętości co najwyżej 1 ml.

Sposób wytwarzania radiofarmaceutyku na bazie gammaglobuliny, w którym technet-99m wprowadza się do pochodnej gammaglobuliny w postaci koniugatu gammaglobulina-HYNIC, pozwala

PL 199 384 B1 na otrzymanie natywnej struktury drugo- i trzeciorzędowej cząsteczki białka i zachowanie jej własności immunogennych. Zastosowanie etapu stabilizacji wyznakowanego preparatu zwiększa jego stabilność przy badaniu diagnostycznym do około 95%.

Wynalazek jest bliżej wyjaśniony w przykładzie wykonania, który podaje sposób wytwarzania preparatu radio-diagnostycznego na bazie gammaglobuliny.

P r z y k ł a d

W pierwszym etapie otrzymywania radiofarmaceutyku naważ k ę czystej gammaglobuliny firmy Biomed o wadze 200 mg rozpuszcza się w 2 ml 0,1 M buforu fosforanowego o pH 7,3. Następnie dodaje się kroplami, stale mieszając roztwór 30 mM HYNIC w dimetyloformamidzie (DFM). Reakcję sprzęgania prowadzi się w temperaturze 20°C bez dostępu światła. Stosunek molowy HYNIC do gammaglobuliny wynosi 5:1, co gwarantuje wyczerpujące sprzęganie cząsteczki białka z hydrazynonikotynoamidem. Proces oczyszczania prowadzi się na kolumnie chromatograficznej P-10 wypełnionej złożem Sephadex G-25 Medium zrównoważonej buforem fosforanowym.

Czystość i stężenie właściwe koniugatu analizuje się metodą chromatografii HPLC na kolumnie zawierającej złoże Bio Sep SEC 4000 w środowisku buforu fosforanowego w warunkach natywnych.

Następnie produkt przesącza się przez filtr bakteriologiczny 0,22 μm. W drugim etapie otrzymywania radiofarmaceutyku tak uzyskany koniugat poddaje się procesowi znakowania technetem-99m w obecności koliganda EDTA prowadząc inkubację w czasie 30 minut w temperaturze 36°C przy pH wynoszącym 7,3.

Z kolei w trzecim etapie prowadzi się proces stabilizacji wyznakowanego preparatu przez dodanie roztworu chlorku magnezu w ilości 0,36 mg w 0,1 M buforze fosforanowym.

Claims

1. Sposób wytwarzania preparatu radiodiagnostycznego na bazie gammaglobuliny do obrazowania stanów zapalnych u człowieka, znamienny tym, że w pierwszym etapie prowadzi się proces otrzymywania pochodnej gammaglobuliny, w którym do gammaglobuliny rozpuszczonej w buforze, korzystnie fosforanowym o stężeniu 0,1 mol/l dodaje się stopniowo roztwór HYNIC w dimetyloformamidzie o stężeniu 30 mmol w czasie od 4 do 8 godzin przy temperaturze od 14°C do 26°C, korzystnie bez dostępu światła, gdzie HYNIC oznacza kwas 6-hydrazydopirydyno-3-karboksylowy, przy czym stosunek molowy HYNIC do gammaglobuliny zawiera się w granicach od 3:1 do 8:1, korzystnie 5:1, po czym mieszaninę poddaje się procesowi oczyszczania na kolumnie chromatograficznej, następnie w drugim etapie otrzymaną pochodną w postaci koniugatu gammaglobuliny z HYNIC poddaje się procesowi znakowania technetem-99m w obecności koliganda, korzystnie EDTA prowadząc inkubację w czasie od 15 do 60 minut w temperaturze od 15°C do 40°C i przy pH od 5 do 8,5, korzystnie 7,3, z kolei w trzecim etapie prowadzi się proces stabilizacji wyznakowanego preparatu poprzez dodanie soli kationu dwuwartościowego, korzystnie chlorku magnezu w ilości od 0,2 mg do 0,7 mg w 0,1 M buforze fosforanowym o objętości co najwyżej 1 ml.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że proces oczyszczania mieszaniny prowadzi się na kolumnie chromatograficznej wypełnionej złożem Sephadex G-25 Medium do rozdziału związków wielkocząsteczkowych od drobnocząsteczkowych.