JPH01469A - 高分子ヒアルロン酸の測定方法および測定キット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は関節膣の滑液等に含まれるヒアルロン酸の測定
方法および測定キットに関するものである。特に、高分
子状のヒアルロン酸を対象とする高感度なヒアルロン酸
の測定方法に関するものである。

従来の技術 ヒアルロン酸は、Ｎ−アセチルグルコサミンとグルクロ
ン酸が交互にβ−１，４結合により重合した酸性ムコ多
糖類であり、皮下組織を接合させる作用を有し、謄帯、
関節膣の滑液および眼の硝子体等に含まれている。

ところで、リウマチ等の炎症あるいは癌等の疾患により
、血液中のヒアルロン酸の濃度が上昇することが知られ
ている。このため血液中のヒアルロン酸を定量すること
は炎症の進行や手術後の回復の診断あるいは癌の診断等
において有用であるとされている。

従来、このようなヒアルロン酸の測定方法として、放射
性ヨウ素を付加したヒアルロン酸結合性蛋白を用いる放
射線分析法、あるいはヒアルロネクチンを利用した酵素
分析法が知られている。

放射線分析法の場合には、まず、ヒアルロン酸を結合し
たセファロースと測定対象物であるヒアルロン酸を含む
試料とを混合し、次いで放射性ヨウ素で標識したヒアル
ロン酸結合性蛋白を加えて放置する。この場合、固相で
あるセファロースに結合したヒアルロン酸と放射性ヨウ
素により標識されたヒアルロン酸結合性蛋白との結合は
試料中のヒアルロン酸の濃度に依存して阻害されるので
、阻害された結合中の標識されたヒアルロン酸結合性蛋
白を測定することで、試料中のヒアルロン酸の濃度を間
接的に測定することができる。

発明が解決しようとする課題 しかし、上記の放射線分析法および酵素分析法は、いず
れも競合反応を利用した方法であり、ヒアルロン酸の測
定感度がせいぜい４０ｎｇとあまり高くないという欠点
があった。

また、上記方法では、結合性蛋白やヒアルロネクチンと
の結合部位を１箇所でも有している低分子のヒアルロン
酸も上記競合反応に関与する可能性がある。そのため、
生理的に意味のない低分子のヒアルロン酸も測定されて
しまうという欠点があった。特に、リウマチ等の炎症の
診断において比較的高分子量のヒアルロン酸が観測の対
象となるため上記欠点は深刻である。

このため、上記のような低分子のヒアルロン酸を被測定
物に含めず、しかも従来よりも高感度なヒアルロン酸の
測定方法が要望されている。

そこで本発明は、競合反応を用いず、しかも測定対象外
の低分子のヒアルロン酸を除いて高分子のヒアルロン酸
を選択的に測定でき且つ高感度なヒアルロン酸の測定方
法を提供することにある。

本発明はさらに、上記測定方法に使用されるヒアルロン
酸の測定用キットを提供する。

課題を解決するための手段 本発明者は上記問題点を解決するために鋭意検討・研究
した結果、生理的に意味のある高分子量のヒアルロン酸
にはヒアルロン酸結合性蛋白との結合サイトが２以上存
在することに着目し、２以上のヒアルロン酸結合性蛋白
が立体障害なく結合し得るような高分子量のヒアルロン
酸（本明細書においては、このようなヒアルロン酸を「
高分子ヒアルロン酸」と称する）に２以上のとアルロン
酸結合性蛋白を結合したサンドイッチ状結合体を形成せ
しめ、該結合体の濃度を測定することにより検体中の高
分子ヒアルロン酸の濃度を高感度に定量する方法を開発
することに成功した。

すなわち、本発明は、固相に固着されたヒアルロン酸結
合性蛋白に検体ヒアルロン酸を含む試料を添加して該固
着されたヒアルロン酸結合性蛋白と該検体ヒアルロン酸
を結合せしめ、さらにヒアルロン酸結合性蛋白と標識物
質とをそれぞれ添加するか、あるいは予め標識物質で標
識されたヒアルロン酸結合性蛋白を添加して、該固相に
固着されたヒアルロン酸結合性蛋白と該検体ヒアルロン
酸と該標識されたヒアルロン酸結合性蛋白とのサンドイ
ッチ状結合体を形成せしめ、該サンドイッチ状結合体中
の標識物質により該検体ヒアルロン酸を定量することを
特徴とする高分子ヒアルロン酸の測定方法を提供するも
のである。

本発明の測定方法に従えば、先ず、固相の表面にヒアル
ロン酸結合性蛋白を固着する。この際、該固相上にはさ
らにヒアルロン酸結合性蛋白または他の分子種が固着し
得る表面部分が存在し、測定すべき試料を添加の際に試
料中に含まれる検体ヒアルロン酸である高分子ヒアルロ
ン酸やその他の血中成分などが固着する恐れがある。

このため、試料を添加する前にブロック体を添加してヒ
アルロン酸結合性蛋白が固着していない部分を被覆して
おくことが好ましい。

このようなブロック体としては、例えば、牛等から採取
できるＴ−グロブリン、血清アルブミン、血清等が挙げ
られ、固相にファルコンプレートを使用した場合には牛
γ−グロブリンが好適である。

次いで、上記ヒアルロン酸結合性蛋白が固着した固相に
、検体である高分子ヒアルロン酸を含む試料を添加する
。この際、試料は高分子ヒアルロン酸が抽出分離されて
いる必要はなく、人体などの血液や体液をそのまま使用
できる。或いはブロック体溶液や希釈血清で試料を溶解
してヒアルロン酸結合性蛋白が固着した固相に加えても
よい。

このようにして固相に固着したヒアルロン酸結合性蛋白
に高分子ヒアルロン酸を結合した後、固相表面を洗浄す
るのが好ましい。

さらに本発明に従えば、該高分子ヒアルロン酸を結合し
た上記固相に、予め所定の標識物質で標識されたヒアル
ロン酸結合性蛋白を添加する。この標識物質としては、
アイソトープ、蛍光色素、アビジン、ビオチン、化学発
光物質、酵素等が挙げられるが、通常、高分子物質等の
標識に使用可能なものであれば特に限定されない。

また、該高分子ヒアルロン酸を結合した上記固［目に、
標識物質と結合しやすい蛋白物質などをヒアルロン酸結
合性蛋白に予め結合させ、この標識物質と結合しやすい
蛋白物質などと結合したヒアルロン酸結合性蛋白を標識
物質とともに添加してもよい。

上記のようにヒアルロン酸結合性蛋白をさらに添加する
ことにより、固相に固着されたヒアルロン酸結合性蛋白
と該高分子ヒアルロン酸と該標識された或いは容易に標
識可能なヒアルロン酸結合性蛋白とのサンドイッチ状結
合体を形成することができる。

次に、本発明に従い、該サンドイッチ状の結合体の有す
る標識物質を測定して該高分子ヒアルロン酸を定量する
。

この際、該サンドイッチ状結合体は測定対象物である高
分子ヒアルロン酸を挟み込んでおり、−方、本発明の測
定対象物以外の低分子のヒアルロン酸は上記のようなサ
ンドイッチ状の結合体を形成しえない。

従って、固相表面上の標識物質の濃度を測定することで
上記サンドイッチ状結合体を形成しうる高分子ヒアルロ
ン酸のみが定量される。

標識物質の濃度の測定方法としては、標識物質により異
なるが、例えば標識物質に化学発光物質を使用する場合
には該物質による反応後の溶液の吸光度を測定すればよ
い。

本発明の方法では、予め使用する標識物質および検体ヒ
アルロン酸である高分子ヒアルロン酸について、既知濃
度の試料を用意し、信号強度と該既知濃度の関係につい
て検量線を作成しておき、測定値を較正可能とすること
が好適である。

上述した本発明において使用する固相としては、プレー
ト、チューブ、ビーズ、メンブレン、ゲル等が挙げられ
るが、特にこれらに限定されるものではなく、ヒアルロ
ン酸結合性蛋白が固着し得る固相ならばいずれも使用可
能である。

また、本発明において使用するヒアルロン酸結合性蛋白
とは、Ａ、Ｅ、ｔ：ｌ−レント　（Ｌａｕｒｅｎｔ）ら
により精製されたプロテオグリカン（Ａｎａｌｙｔｉｃ
ａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１０９．３８６−３９
４．　（１９８０））　、リンクプロティン、ヒアルロ
ネクチン等が挙げられる。

本発明の他の観点から提供されるヒアルロン酸測定用キ
ットは一基本的に、ヒアルロン酸結合性蛋白が固着され
た固相体と、添加用ヒアルロン酸結合性蛋白と、検体ヒ
アルロン酸定量用標識物質とによって構成され、これら
３つの成分はそれぞれ別体の容器に収容しておき、使用
時に上記処方に従って使えるキットとして保存しておく
ことができる。

上記キットに、ヒアルロン酸結合性蛋白が固着していな
い部分を被覆するブロック体や、通常容易に入手可能な
前記洗浄液等をさらに追加することも可能である。

また、上記添加用ヒアルロン酸結合性蛋白は予め上記標
識物質で標識したものでもよい。さらに、上記ヒアルロ
ン酸結合性蛋白を固着した固相の表面の該ヒアルロン酸
結合性蛋白が固着していない部分をブロック体により被
覆しておくこともできる。このブロック体としては、Ｔ
−グロブリン、血清アルブミン、血清からなる群より選
択した１種にすることができる。

上記固相体としては、プレート、チューブ、ビーズ、メ
ンブレン、ゲルからなる群より選択することができ、上
記標識物質は、アイソトープ、蛍光色素、アビジン、ビ
オチン、化学発光物質、酵素から選択することができる
。

咋」 本発明の測定対象物はリウマチ等の炎症の診断あるいは
癌等の診断において重要な因子とされている比較的高分
子のヒアルロン酸であるため、非対象物である低分子の
ヒアルロン酸までが測定されるのを防止する必要がある
。

本発明においては、高分子ヒアルロン酸を２以上のヒア
ルロン酸結合性蛋白が結合したサンドインチ状結合体と
して定量するため、上記のような低分子ヒアルロン酸、
すなわちヒアルロン酸結合性蛋白との結合サイトが一つ
しかないものは上記サンドイッチ状結合体を形成せず全
く測定されないという特徴がある。

また、ヒアルロン酸の測定方法は、従来、競合反応を用
いていたが、本発明では競合反応を用いない点に特徴が
ある。このため、予め精製した試薬としてのヒアルロン
酸を必要とせず、しかも操作が簡単であるという特徴を
有する。

さらに、本発明のヒアルロン酸の測定方法は高感度であ
るため１０ｎｇという極めて微量の高分子のヒアルロン
酸の検出および定量にも好適である。

実施例 以下、本発明を実施例により詳細に説明するが本発明は
これらに何ら限定されるものではない。

最初に本発明に用いるヒアルロン酸結合性蛋白の精製方
法について述べ、次いで既知量の高分子ヒアルロン酸を
含む試料を用いて本発明の方法を実施して検量線を作製
した具体例について述べる。

以下において、使用する単位表示としてＭは（ｍｏｌ／
β〉を示し、％は（ｇ／１００ｍ）を示すものである。

ヒアルロン酸結合性蛋白の精製 本発明に用いるヒアルロン酸結合性蛋白を抽出、精製す
るために　Ａ、Ｅ、　　ローレノト（Ｌａｕｒｅｎｔ）
ら（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
　１０９．　３８６−３９４　（１９８０）　　）の精
製方法に従って、以下のような操作を行った。

まず、牛の鼻中隔軟骨（東京芝浦臓器より人手）３００
ｇをハサミで小片に切断し、予め４℃に保持された塩酸
グアニジン４Ｍを含むナトリウムアセテ−）０．５Ｍ溶
液（ｐＨ５，８）　　（以下、緩衝液Ａと称する）に投
入して４℃に保持したまま一夜、撹拌抽出した。

次いで、１３０００Ｇにて２０分間遠心分離した後、上
清液を分離採取した。

該上清液を精製水に透析させた後、凍結、乾燥させた。

このようにして得られた固形分を粉砕して粗抽出粉末を
得た。

このようにして得られた粗抽出粉末についてトリプシン
（Ｔｒｙｐｓｉｎ）処理するため以下のような操作を行
った。

粗抽出粉末１６００ｍｇとトリプシン（シグマ社製）０
．８ｍｇとをナトリウムアセテート０．ＩＭを含んだＱ
、ＩＭ）リス−塩酸緩衝溶液（ｐｆｌ　７．３）　２５
ｍ１中に加え、３７℃にて２時間保存させた。

次いで、大豆からのトリプシン阻害剤１ｍｇ　（シグマ
社製）および塩酸グアニジン（和光純薬製）１９、１　
ｇを加えた後、さらに０．５Ｍのナトリウムアセテート
溶液を足して総量を５Ｍ！とじた。

以上のようにしてトリプシン処理したヒアルロン酸結合
性蛋白含有溶液についてアフィニティークロマトグラフ
ィーを用いて次のようにしてヒアルロン酸結合性蛋白を
精製した。

上記トリプシン処理されたヒアルロン酸結合性蛋白含有
溶液５０ｍ１！に、予め作成したヒアルロン酸結合セフ
ァロースＩ　（作成方法は後述）　５０ｍ１を加え混合
し、直ちに透析膜の中に入れた後、４℃に冷却した９倍
量の精製水中で一夜透析させた。

透析後、ゲル全量を内径３．２ｃｍ０カラムに充填した
後、ＩＭのＮａＣ１溶液で洗浄し、未設着分を除去した
。

さらに１Ｍ〜３ＭのＮａＣＩで順次、洗浄し不要な蛋白
を除去した後、緩衝液Ａで吸着骨を溶出させて回収した
。

次いで、回収分をＤＩＡＰＬＯＰＭ−１０（アミコン社
製）にて濃縮させて全量を４ｍｌとし、セファロース（
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）　　６　Ｂカラム（φ３．　ｌ　
Ｘ　４３ｃｍ　）を通過させた。第２および第３ピーク
を示す成分を回収し、それぞれ、上記ＤＩＡＰＬＯＰＭ
−１０で分離濃縮し、ヒアルロン酸結合性蛋白試薬とし
た。

〔ヒアルロン酸結合セファロース“の作５ｉ　例Ｅヒア
ルロン酸ナトリウム６００ｍｇ　（生化学工業製）、Ａ
Ｈ−セファロース（ファルマシア社製）　７５ｒｎｌお
よび精製水２００ｒｎｌの混合液に水溶性カルボジイミ
ド１．４ｇを添加した後、室温にて２４時間放置した。

このような溶液に酢酸１０ｒｄを加え反応を停止させた
。得られたゲルを取り出し、それぞれ１ｊ７のＩ　ＭＮ
ａＣｌ　、　Ｉ　ＭＮａＣｌを含むＯ，１Ｍ　Ｔｒｉｓ
−ＨＣＩ　（ｐＨ８、１）　、０．０５Ｍギ酸エステル
−（ｐＨ３，１）　、情製氷および０．５Ｍナトリウム
−アセテート　（ｐＨ５，７）により、順次、ゲルを洗
浄してヒアルロン酸結合セファロースを得た。

ビオチン−ヒアルロン酸結合性蛋白の調製上記のように
得られたヒアルロン酸結合性蛋白について、標識物質で
あるＰＯＤを結合させるための前処理としてビオチンの
結合体を調製するため以下のような操作を行った。

ヒアルロン酸を結合したヒアルロン酸結合性を白液１ｍ
ｇ　（１ｍｇ／ｍｆ　ＮａＨＣＯ３溶液中）に、ビオチ
ン−〇　−３ｕ　（ＰＩＲＣＥ社より人手）（１ｍｇ／
ｍｌジメチルスルフォキサイド中）を加え室温にて４時
間保存した。

次いで、このような保存液をカラム（ｃｏｌｏｕｍｎｓ
ＰＤ−１０）に充填されたセファデックス（Ｓｅｐｈａ
ｄｅｘ）　Ｇ２５Ｃ０，１％ＮａＮ３および０．９％Ｎ
ａＣ１を含む１０　ｍ　Ｍ燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
７，４）　（以下、ＰＢＳと称す）で平衡化したもの〕
を通過させた。

蛋白部分を回収した後、塩酸グアニジン（和光純薬製Ｈ
，５３ｇを加え、ヒアルロン酸結合性セファロースゲル
懸濁液〔ヒアルロン酸結合セファロースゲル（ｌＱｍｌ
　ｗｅｔ　ｖｏｌｕｍｅ）を０．１％ＢＳＡを含む緩衝
液（１，５ＭＮａＣ１を含む２５ｍＭ燐酸ナトリウム（
ｐＨ７，０）　　（以下、緩衝液Ｂと称する）　４Ｑｍ
ｌに混合したもの〕に投入した。このような懸濁液を４
℃にて一夜保存した。

その後、全量をカラムに充填させ、緩衝液Ｂを２５０ｍ
１、プロテース（Ｐｒｏｔｅａｓｅ）阻害剤（ＥＤＴＡ
。

トリフシン阻害剤、フェニルメチルスルホニルフルオラ
イド、ヨウ素化酢酸、ε−アミノカプロン酸、ベンズア
ミジン、ペプスタチンの混合物）を含む緩衝液Ｂを２５
０ｍ１ｌ！、および３ＭのＮａＣ１溶液で順次、洗浄し
た後、緩衝液Ａで吸着分を溶出させて回収した。

回収液につき、紫外光吸光度（波長２８０ｎｍ）が０．
２以上になるまで濃縮した。

得られた濃縮分を分注し、凍結保存したものをビオチン
−ヒアルロン酸結合性蛋白試薬とした。

実施例１　（ヒアルロン酸の定量） 精製されたヒアルロン酸結合性蛋白のＮａ　ＨＣＯ：＋
溶液（結合性蛋白の濃度２０μｇ／ｍｌり５０μβをフ
ァルコンプレート　（Ｂｅｃｔｏｎ　０ｉｋｉｎｓｏｎ
社製）に均一にコーティングし、４℃にて一夜保存した
。

次いで、ファルコンプレート上のヒアルロン酸結合性蛋
白が被覆されてない表面部分を完全に被覆するためのブ
ロック体として、牛Ｔ−グロブリン０．５％を含む溶液
を加え、さらに室温にて２時間保存した。

このようなプレートを洗浄液（Ｔｗｅｅｎ　２０を０．
０５％含む０．８５ＭのＮａＣ１溶液）で３回洗浄した
。

次いで、このようなプレートに濃度１０ｎｇ／−の高分
子ヒアルロン酸を含む血清を１１倍に稀釈した標準試料
５０μβを加え室温にて２時間保存した。

血清に代えてブロック体溶液を使用してヒアルロン酸の
試料を加えてもよいことを確認した。

この後、上記洗浄液にて３回洗浄し、前記調製したビオ
チン−ヒアルロン酸結合性蛋白（前記ブロック体溶液に
て３００倍希釈したもの）をヒアルロン酸等量に対して
過剰量加え、さらに室温にて２時間保存した。

その後、上記洗浄液で３回洗浄した後、アビジン−ＰＯ
Ｄ　（ＶＥＣＴＯＲ社製）を前記ブロック体溶液にて３
０００倍希釈した溶液を加え、室温にて４５分間保存し
た。

次いで、上記洗浄液で３回洗浄後、濃度２ｍｇ／−のオ
ルトフェニレンジアミン（半井化学製）（Ｈ２０□０．
０１５％、クエン酸０．０１８Ｍ、リン酸水素ナトリウ
ム０．０６４Ｍおよびサリチル酸０．１％を含む）溶液
１００μｌを加えて室温にて３０分間保存した後、８規
定Ｈ２Ｓ　Ｏ，を２滴滴下してオルトフェニレンジアミ
ンの分解反応を停止させた。

こうしてオルトフェニレンジアミンの分解による着色液
を紫外・可視吸光光度計にて４９２ｎｍの吸光度を測定
した。

以上の操作について、ヒアルロン酸標準品の濃度を５０
．１００．５００．１１０００ｎ／ｒｄ！とした場合に
ついてそれぞれ試料を作製し、オルトフェニレンジアミ
ンの分解発色について分光光度計にて吸光度（４９２０
ｍ）を測定した。

得られた結果を第１図に示す。

これより、本発明の測定方法によればＬｏｎｇのオーダ
の高分子ヒアルロン酸の検出および測定が可能であるこ
とが判る。

発明の効果 以上、説明したように本発明のヒアルロン酸の測定方法
は、低分子ヒアルロン酸を除外し高分子のヒアルロン酸
だけを選択的に測定することができる。

また本発明は競合反応を使用しないため、試薬としての
ヒアルロン酸を必要とせず簡単な操作でありしかも１０
ｎｇという極微量な高分子ヒアルロン酸の検出および測
定が可能である。

従って、本発明の方法は、リウマチ等の炎症の診断ある
いは癌の診断に極めて有効な方法であり、その技術的な
価値は高い。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明のヒアルロン酸の測定方法により得ら
れた高分子ヒアルロン酸濃度と吸光度の関係を示すグラ
フである。

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. （１）固相に固着されたヒアルロン酸結合性蛋白に検体
   ヒアルロン酸を含む試料を添加して該固着されたヒアル
   ロン酸結合性蛋白と該検体ヒアルロン酸を結合せしめ、
   さらにヒアルロン酸結合性蛋白と標識物質とをそれぞれ
   添加してあるいは予め標識物質で標識されたヒアルロン
   酸結合性蛋白を添加して、該固相に固着されたヒアルロ
   ン酸結合性蛋白と該検体ヒアルロン酸と該標識されたヒ
   アルロン酸結合性蛋白とのサンドイッチ状結合体を形成
   せしめ、該サンドイッチ状結合体中の標識物質により該
   検体ヒアルロン酸を定量することを特徴とする高分子ヒ
   アルロン酸の測定方法。
2. （２）上記ヒアルロン酸結合性蛋白を固着した後に、ブ
   ロック体を添加することによって、上記ヒアルロン酸結
   合性蛋白を固着した固相の表面の該ヒアルロン酸結合性
   蛋白が固着していない部分をブロック体により被覆する
   ことを特徴とする請求項１に記載の高分子ヒアルロン酸
   の測定方法。
3. （３）上記検体ヒアルロン酸が、ヒアルロン酸結合性蛋
   白と少なくとも２ヶ所の結合サイトを有していることを
   特徴とする請求項１または２に記載の高分子ヒアルロン
   酸の測定方法。
4. （４）上記固相が、プレート、チューブ、ビーズ、メン
   ブレン、ゲルからなる群より選択した１種であることを
   特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載の高分
   子ヒアルロン酸の測定方法。
5. （５）上記ヒアルロン酸結合性蛋白が、プロテオグリカ
   ン、リンクプロテイン、ヒアルロネクチンからなる群よ
   り選択した一種であることを特徴とする請求項１から４
   のいずれか１項に記載の高分子ヒアルロン酸の測定方法
   。
6. （６）上記標識物質がアイソトープ、蛍光色素、アビジ
   ン、ビオチン、化学発光物質、酵素からなる群より選択
   した１種であることを特徴とする請求項１乃至５のいず
   れか１項に記載の高分子ヒアルロン酸の測定方法。
7. （７）上記ブロック体が、γ−グロブリン、血清アルブ
   ミン、血清からなる群より選択した１種であることを特
   徴とする請求項１乃至６のいずれか１項に記載の高分子
   ヒアルロン酸の測定方法。
8. （８）ヒアルロン酸結合性蛋白が固着された固相体と、
   添加用ヒアルロン酸結合性蛋白と、検体ヒアルロン酸定
   量用標識物質とによって構成される高分子ヒアルロン酸
   測定用キット。
9. （９）上記添加用ヒアルロン酸結合性蛋白が予め上記標
   識物質で標識されて一体になっていることを特徴とする
   請求項８に記載の高分子ヒアルロン酸測定用キット。
10. （１０）上記ヒアルロン酸結合性蛋白を固着した固相の
    表面の該ヒアルロン酸結合性蛋白が固着していない部分
    がブロック体により被覆されていることを特徴とする請
    求項８または９に記載の高分子ヒアルロン酸測定用キッ
    ト。
11. （１１）上記ブロック体が、γ−グロブリン、血清アル
    ブミン、血清からなる群より選択した１種であることを
    特徴とする請求項１０に記載の高分子ヒアルロン酸測定
    用キット。
12. （１２）上記固相体が、プレート、チューブ、ビーズ、
    メンブレン、ゲルからなる群より選択した１種であるこ
    とを特徴とする請求項８から１１のいずれか１項に記載
    の高分子ヒアルロン酸測定用キット。
13. （１３）上記標識物質がアイソトープ、蛍光色素、アビ
    ジン、ビオチン、化学発光物質、酵素からなる群より選
    択した１種であることを特徴とする請求項８から１２の
    いずれか１項に記載の高分子ヒアルロン酸測定用キット
    。