ES2852001T3 - Conjugados de anticuerpo-ureasa para propósitos terapéuticos - Google Patents

Conjugados de anticuerpo-ureasa para propósitos terapéuticos Download PDF

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Abstract

Una composición farmacéutica que comprende una solución acuosa farmacéuticamente aceptable adecuada para inyección intravenosa y un conjugado anticuerpo-ureasa de dominio único, en la que el conjugado tiene una relación de conjugación de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, o 12 fracciones de anticuerpos de dominio único por fracción de ureasa, y en la que dicha composición contiene menos del 10 % de ureasa no conjugada en base al peso del conjugado de anticuerpo-ureasa.

Description

DESCRIPCIÓN
Conjugados de anticuerpo-ureasa para propósitos terapéuticos
Referencia cruzada a solicitudes relacionadas
Esta solicitud reivindica el beneficio de la fecha de presentación de la Solicitud Provisional de Estados Unidos No.: 62/107,210, presentada el 23 de enero de 2015.
Lista de secuencias
La presente solicitud contiene un Listado de Secuencias que se ha enviado electrónicamente en formato ASCII.
Campo de la invención
Esta divulgación proporciona conjugados de anticuerpo-ureasa que tienen utilidad terapéutica. Más específicamente, la divulgación se refiere a conjugados terapéuticos que tienen uno o más anticuerpos conjugados con ureasa, composiciones, usos y preparación de los mismos.
Antecedentes
La ureasa es una enzima que cataliza la hidrólisis de urea en dióxido de carbono y amoníaco. Específicamente, la ureasa cataliza la hidrólisis de urea para producir amoniaco y carbamato, el carbamato producido se degrada posteriormente por hidrólisis espontánea para producir otro amoniaco y ácido carbónico. En este sentido, la actividad de la ureasa tiende a incrementar el pH del entorno local en el que produce amoniaco, que es una molécula básica que tiene toxicidad general.
El concepto de utilizar anticuerpos para atacar antígenos asociados a tumores en el tratamiento del cáncer se ha apreciado durante algún tiempo (Herlyn et. al., (1980) Cancer Research 40, 717). Sin embargo, en cuanto a la ureasa, el componente tóxico es el entorno alcalino producido por la degradación enzimática de la urea, y se emplearon fragmentos de anticuerpos de alta afinidad. Los conjugados de anticuerpo-ureasa que tienen utilidad terapéutica y diagnóstica se describen, por ejemplo, en el documento WO 2014/165985.
Chao ET AL divulga el “Development of an alkalizing antibody-enzyme conjugate for NSCLC treatment that is in Phase I clinical testing Preclinical Studies Abstract Background Starting Dose Derivations Acknowledgement”, L-DOS47 PRESENTATION AT AACR 2013 ANNUAL MEETING, 5 de abril 2013, http://www.helixbiopharma.com/wpcontent/uploads/2014/02/Helix-BioPharma-AACR.pdf.
Resumen de la invención
La presente invención se define en las reivindicaciones independientes, a las cuales ahora se debe hacer referencia. Las realizaciones ventajosas se establecen en las subreivindicaciones. La presente tecnología está dirigida a un conjugado anticuerpo-ureasa. La presente tecnología proporciona una composición farmacéutica que comprende una solución acuosa farmacéuticamente aceptable adecuada para inyección intravenosa y un conjugado de anticuerpoureasa substancialmente libre de ureasa, libre de anticuerpo no conjugado, y/o libre de solventes de HPLC no acuosos.
En algunos aspectos, el conjugado tiene una relación de conjugación de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, o 12 fracciones de anticuerpo por fracción de ureasa. En algunos aspectos, el conjugado tiene una relación de conjugación de aproximadamente 6 o más fracciones de anticuerpo por fracción de ureasa. En algunos aspectos, el conjugado tiene una relación de conjugación de 6, 7, 8, 9, 10, 11, o 12 fracciones de anticuerpo por fracción de ureasa. En algunos aspectos, el conjugado tiene una relación de conjugación de 8, 9, 10, 11, o 12 fracciones de anticuerpo por fracción de ureasa. En algunos aspectos, el conjugado tiene una relación de conjugación promedio de aproximadamente 6 o más fracciones de anticuerpo por fracción de ureasa. En algunos aspectos, el conjugado tiene una relación de conjugación promedio de aproximadamente 8-11 fracciones de anticuerpo por fracción de ureasa. En algunos aspectos, la ureasa es una ureasa de judía gigante.
En algunos aspectos, el anticuerpo es un anticuerpo humanizado o no humano. En algunos aspectos, el peso molecular del anticuerpo es desde aproximadamente 5 kDa hasta aproximadamente 200 kDa. En algunos aspectos, el peso molecular del anticuerpo es desde aproximadamente 5 kDa hasta aproximadamente 50 kDa. En algunos aspectos, el anticuerpo es un anticuerpo de dominio único. En algunos aspectos, el anticuerpo de dominio único tiene un tamaño de no más de 110 residuos de aminoácidos, o desde aproximadamente 90 hasta 130 residuos de aminoácidos. En algunos aspectos, el peso molecular del anticuerpo de dominio único es desde aproximadamente 10 kDa hasta aproximadamente 50 kDa. En algunos aspectos, el peso molecular del anticuerpo de dominio único es desde aproximadamente 12 kDa hasta aproximadamente 15 kDa. En algunos aspectos, el anticuerpo tiene especificidad para un antígeno de una célula tumoral. En algunos aspectos, el anticuerpo tiene especificidad para un antígeno tumoral expresado por carcinoma de pulmón de células no microcíticas. En algunos aspectos, el anticuerpo tiene especificidad para CEACAM6.
En algunos aspectos, el anticuerpo tiene una afinidad de unión a CEACAM6 con un valor Kd mayor que aproximadamente 1 x 10-6 M. En algunos aspectos, el conjugado tiene una afinidad de unión a CEACAM6 con un valor Kd de no más de aproximadamente 1 x 10-8 M. En algunos aspectos, el conjugado tiene una afinidad de unión a CEACAM6 con un valor Kd de no más de aproximadamente 1 x 10-10 M. En algunos aspectos, el conjugado tiene una afinidad de unión a CEACAM6 con un valor IC50 de no más de aproximadamente 5 nM. En algunos aspectos, el valor IC50 es de aproximadamente 3 nM a aproximadamente 5 nM. En algunos aspectos, el valor IC50 es de aproximadamente 3.22 nM. En algunos aspectos, el conjugado se une a CEACAM6 con un valor IC50 de aproximadamente 10 pg/ml a aproximadamente 30 pg/ml. En algunos aspectos, el conjugado se une a CEACAM6 con un valor IC50 de aproximadamente 20 pg/ml.
En algunos aspectos, el anticuerpo comprende un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 1. En algunos aspectos, el anticuerpo comprende un polipéptido que comprende al menos una modificación a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 1.
La presente divulgación proporciona un método para tratar el cáncer en un sujeto en necesidad del mismo, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición proporcionada en el presente documento, tratando de esta manera el cáncer en el sujeto.
En algunos aspectos, el cáncer es uno o más de carcinoma de pulmón de células no microcíticas, cáncer de mama, páncreas, ovario, pulmón, colon, o una combinación de los mismos. En algunos aspectos, el cáncer es carcinoma de pulmón de células no microcíticas. En algunos aspectos, el sujeto es un humano.
La presente tecnología proporciona un método para preparar una composición que comprende un conjugado de anticuerpo-ureasa substancialmente libre de ureasa, cuyo método comprende combinar el anticuerpo activado y ureasa en un tampón acuoso que tiene un pH de aproximadamente 6.0-7.0, tal como aproximadamente 6.5, ajustar el pH a 8.0-9.0, tal como aproximadamente 8.3 para formar el conjugado de anticuerpo-ureasa, y purificar el conjugado de anticuerpo-ureasa, en el que el método no comprende una etapa de purificación cromatográfica, tal como métodos cromatográficos comúnmente utilizados para purificaciones de proteínas, que incluyen cromatografía de exclusión por tamaño (SEC), cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, cromatografía de afinidad de metales inmovilizados, cromatografía de inmunoafinidad, cromatografía de adsorción líquido-sólido, cromatografía de interacción hidrófoba (HIC), cromatografía de fase inversa (RPC) y cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), etc. En algunos aspectos, el conjugado anticuerpo-ureasa se purifica mediante ultradiafiltración.
En algunos aspectos, el conjugado de anticuerpo-ureasa tiene una relación de conjugación de 8-11 fracciones de anticuerpo por fracción de ureasa. En algunos aspectos, el tampón que tiene un pH de aproximadamente 6.5 es un tampón de acetato de sodio. En algunos aspectos, el pH se ajusta a aproximadamente 8.3 mediante un método que comprende la adición de una solución de borato de sodio.
La presente tecnología proporciona un método para aumentar la afinidad de unión de anticuerpos a un antígeno tumoral, que comprende conjugar una pluralidad de las moléculas de anticuerpo a una molécula de ureasa para formar un conjugado de anticuerpo-ureasa, en el que el conjugado tiene una afinidad de unión al antígeno tumoral al menos aproximadamente 100 veces mayor que el anticuerpo no conjugado.
En algunos aspectos, el anticuerpo es un anticuerpo humanizado o no humano. En algunos aspectos, el anticuerpo es un anticuerpo de dominio único. En algunos aspectos, el antígeno tumoral se expresa por carcinoma de pulmón de células no microcíticas. En algunos aspectos, el anticuerpo tiene especificidad para CEACAM6.
La presente tecnología proporciona adicionalmente un kit que comprende la composición proporcionada en el presente documento e instrucciones para uso de la composición.
Estos y otros aspectos de la divulgación se describen con más detalle a continuación.
Breve descripción de los dibujos
La FIG. 1A-B ilustra un ejemplo de estudios de unión y citotoxicidad de L-DOS47 en estirpes celulares cancerosas. (A) Unión directa de L-DOS47 a cinco estirpes celulares cancerosas: BxPC-3, Capan-1, ZR-75-30, LS174T y MDA-MB231. La señal de unión se representó por la cantidad de amoníaco generado tras la incubación con urea 20 mM. Se observó unión de L-DOS47 buena en células BxPC-3 ( • ) , Capan-1 (t ) y ZR-75-30 (♦), mientras que se observó unión moderada en las células LS174T (A ) y no se encontró unión en células MDA-MB231 (■). Además, no se observó unión con el control DOS47 no conjugado sobre las estirpes celulares correspondientes (datos no mostrados), lo que sugiere que la unión de L-DOS47 fue específica y contribuida por la fracción de anticuerpo. (B) Citotoxicidad inducida por L-DOS47 sobre las estirpes celulares cancerosas tras la adición de urea 20 mM. No se observaron efectos en las células MDA-MB231 (■), lo que coincidió con el estudio de unión. BxPC-3 ( • ) y ZR-75-30 (♦) fueron altamente susceptibles a L-DOS47, mientras que sólo se encontraron efectos moderados en las células Capan-1 (▼) y LS174T (A ).
La FIG. 2A-B ilustra un ejemplo de unión directa y competitiva del anticuerpo L-DOS47, DOS47 y AFAIKL2 a células BxPC-3. (A) La unión de anticuerpo L-DOS47 etiquetado con rutenio, AFAIKL2 y DOS47 no conjugado a células BxPC-3. El ensayo de electroquimioluminiscencia proporciona una medición directa de la unión del anticuerpo L-DOS47 y AFAIKL2 a las células BxPC-3. Se observó una señal de unión débil con el anticuerpo AFAIKL2 (A ), mientras que L-DOS47 mostró una señal de unión mucho más fuerte ( • ) debido a la avidez de múltiples anticuerpos AFAIKL2 presentados sobre el conjugado de anticuerpos. No se observó unión con el control negativo DOS47 (0). (B) La unión de la etiqueta L-DOS47 a las células BxPC-3 compitió con L-DOS47, anticuerpo AFAIKL2 o DOS47. Las aparentes afinidades de unión de tanto el anticuerpos L-DOS47 como AFAIKL2, se pueden comparar mediante la IC50 (la cantidad de competidor requerida para provocar una disminución del 50 % en la unión) de los artículos de prueba. La IC50 de L-DOS47 ( • ) y el anticuerpo AFAIKL2 (A ) se estimaron en 2 y 20 jg/m l (o 3.22 nM y 1.55 |j M), respectivamente, lo que indica que la afinidad de unión de L-DOS47 es aproximadamente 500 veces la del anticuerpo AFAIKL2. No se observó inhibición con el control negativo DOS47 (0). Los resultados representan la media (n = 3) de experimentos representativos.
La FIG. 3A-C ilustra un ejemplo sobreexpresión y atenuación del gen CEACAM6. (A) Unión de L-DOS47 a células H23 transfectadas con CEACAM6. La población de la estirpe celular transfectada (A ) se enriqueció mediante clasificación de células FACS junto con una cantidad aumentada de antibiótico de selección. El perfil de unión en comparación con aquel de las células H23 nativas (O) y las células A549 (A) mostró que CEACAM6 se expresó en las células transfectadas a un nivel menor que aquel de las células A549. (B) Ensayo de citotoxicidad de L-DOS47 sobre células H23 transfectadas con CEACAM6. La sobreexpresión de CEACAM6 en células H23 (A ) ha mejorado enormemente su susceptibilidad a la citotoxicidad de L-DOS47 en comparación con las células BxPC-3 ( • ) , A549 (A) y H23 (O) nativas. Curiosamente, las células H23 transfectadas eran más susceptibles a la citotoxicidad de L-DOS47 que las células A549 y BxPC-3, a pesar de que se observó una unión de L-DOS47 más débil en (A). (C) Unión de L-DOS47 a células BxPC-3 con gen CEACAM6 atenuado. Se observó buena señal de unión en las células BxPC-3 nativas ( • ) y de control (HUSH-TR3 A ). Sin embargo, la unión de L-DOS47 se perdió ya que el gen CEACAM6 fue silenciado por ARNhc (HUSH # 6T y HUSH # 7 A), lo que sugiere que CEACAM6 es el antígeno de superficie que está siendo reconocido por el conjugado de anticuerpo. Los resultados representan la media (n = 3) de experimentos representativos. La desviación estándar (DE) fue menor del 10 % para todos los valores.
La FIG. 4 ilustra la tinción inmunohistoquímica de adenocarcinoma de pulmón y colon humano con L-DOS47. La tinción positiva se muestra en color oscuro.
La FIG. 5 ilustra una secuencia de aminoácidos del anticuerpo AFAIKL2 (SEQ ID NO: 1).
La FIG. 6 ejemplifica una síntesis del producto conjugado L-DOS47 mediante una reacción de dos etapas. La Etapa 1 es una activación del anticuerpo utilizando SIAB, y la Etapa 2 implica la conjugación del anticuerpo activado con la enzima ureasa para formar el bioconjugado L-DOS47.
La FIG. 7 ilustra un ejemplo de cromatogramas de exclusión por tamaño de blanco de formulación, AFAIKL2, ureasa de alta pureza (HPU) y L-DOS47 conjugado. Un pico muy pequeño para el dímero para cada constituyente aparece en la parte delantera de los respectivos picos de monómero. El blanco de formulación contiene histidina 10 mM, sacarosa al 1 %, EDTA 0.2 mM, pH 6.8.
La FIG. 8 ilustra un ejemplo de Cromatogramas de Intercambio Iónico de blanco de formulación (A), L-DOS47 (B) y L-DOS47 con adición de 2.4 % (C), 4.8 % (D) y 7.2 % (E) de ureasa HP (HPU). El blanco de formulación contiene histidina 10 mM, sacarosa al 1 % (p/v), Ed Ta 0.2 mM, pH 6.8.
La FIG. 9 ilustra un ejemplo de captura de una ventana Experion SDS. Panel 1: superposición de electroferogramas de las líneas 2 y 4. Panel 2: Línea L, escalera de peso molecular (MW); Líneas 1, 2, 7 y 8: L-DOS47 producido con AFAIKL2 activado que se había sometido a una purificación IEC adicional; Líneas 3-6: L-DOS47 producido con AFAIKL2 que no se había sometido a IEC adicional; Línea 9 y 10, HPU. En el panel 1, los números 2-14 en el Panel 1 sobre el eje x son los números de pico del electroferograma de la Línea 1; 3* representa el pico marcador de peso molecular más bajo y 14* el pico marcador de MW más alto para el estándar de MW interno.
La FIG. 10 ilustra un ejemplo de electroferograma de L-DOS47 (línea 2 de la Figura 9) que muestra los picos discretos para las subunidades de ureasa unidas con 0-4 moléculas de anticuerpo. Los números del 1-11 sobre el eje x son los números de pico; 3* representa el pico marcador de peso molecular más bajo y 11* el pico marcador de MW más alto para el estándar de MW interno.
La FIG. 11 ilustra un ejemplo del efecto de la relación de conjugación sobre la actividad de unión de L-DOS47. Se preparó L-DOS47 con diferentes relaciones de conjugación de anticuerpos (de 1.8 a 12). Se determinó la unión directa de las muestras de L-DOS47 a moléculas de CEACAM6-A inmovilizadas.
La FIG. 12 ilustra un ejemplo de transferencia Western de AFAIKL2, Ureasa y L-DOS47. Panel izquierdo: electroforesis en gel de L-DOS47, ureasa y AFAIKL2 (teñido con azul de Coomassie). Panel central: transferencia Western de AFAIKL2, ureasa y L-DOS47 (carga estándar y sobrecarga de 5x) sondeada con anticuerpo anti-AFAIKL2. Panel derecho: transferencia Western de AFAIKL2, ureasa y L-DOS47 (carga estándar y sobrecarga de 5x) sondeada con anticuerpo anti-ureasa. Recuadro insertado: ampliación de L-DOS47.
La FIG. 13 ilustra un ejemplo de cromatograma de RP-HPLC a 420 nm de una digestión tríptica de AFAIKL2-Cys-FL. Los péptidos conjugados identificados y sus masas de péptidos se indican en los picos de HPLC correspondientes.
La FIG. 14 ilustra un ejemplo de unión directa de L-DOS47 a estirpes celulares cancerosas BxPC-3, A549 y MCF7. La señal de unión se representó por la cantidad de amoníaco generado tras la incubación con urea 20 mM. Se observó una unión de L-DOS47 elevada en BxPC-3 ( • ) , mientras que se observó una unión moderada en las células A549 (A ) y no se encontró unión en las células MCF7 (▼). Además, no se encontró unión con el control DOS47 no conjugado en las estirpes celulares correspondientes (O, A, V), lo que sugiere que la unión de L-DOS47 fue específica para las células BxPC-3 y A549.
La FIG. 15 ilustra un ejemplo de citotoxicidad inducida por L-DOS47 sobre células BxPC-3 y A549 tras la adición de urea 20 mM. No se observaron efectos en las células MCF7 (▼). BxPC-3 ( • ) fue altamente susceptible a L-DOS47, mientras que solo se observaron efectos moderados en las células A549 (A ). Además, no se observó unión con el control DOS47 no conjugado a las estirpes celulares correspondientes (O, A, V). Los resultados de los gráficos representan la media (n = 3) de experimentos representativos. La desviación estándar (DE) fue menor del 10 % para todos los valores.
Descripción detallada
Se debe entender que la presente divulgación no se limita a aspectos o realizaciones particulares descritos, ya que, por supuesto, pueden variar. También se debe entender que la terminología utilizada en el presente documento tiene solo el propósito de describir aspectos o realizaciones particulares, y no pretende ser limitante, ya que el alcance de la presente divulgación estará limitado únicamente por las reivindicaciones adjuntas.
La descripción detallada de la presente divulgación se divide en varias secciones sólo para conveniencia del lector y la divulgación que se encuentra en cualquier sección se puede combinar con la de otra sección. A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el comúnmente entendido por un experto en la técnica a la que pertenece la presente divulgación.
Definiciones
Se debe observar que, como se utiliza en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares “un”, “una” y “el” incluyen referentes en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por lo tanto, por ejemplo, la referencia a “un compuesto” incluye una pluralidad de compuestos.
Como se utiliza en el presente documento, el término “aproximadamente” cuando se utiliza antes de una designación numérica, por ejemplo, temperatura, tiempo, cantidad, concentración y otros, que incluye un rango, indica aproximaciones que pueden variar en (+) o (-) 10 %, 5 % o 1 % del valor establecido.
Como se utiliza en el presente documento, el término “administración” puede efectuarse en una dosis, de forma continua o intermitente o mediante varias subdosis que en el agregado proporcionan una dosis única. La dosificación se puede realizar durante el curso del tratamiento. Aquellos expertos en la técnica conocen métodos para determinar los medios y la dosificación de administración más eficaces y variarán con la composición utilizada para la terapia, el propósito de la terapia, la célula diana que se va a tratar y el sujeto que se está tratando. Se pueden realizar administraciones únicas o múltiples con el nivel de dosis y el patrón seleccionados por el médico tratante. Las formulaciones de dosificación adecuadas y los métodos de administración de los agentes se conocen en la técnica. La ruta de administración también se puede determinar y el método para determinar la ruta de administración más eficaz es conocido por aquellos expertos en la técnica y variará con la composición utilizada para el tratamiento, el propósito del tratamiento, estado de salud o etapa de la enfermedad del sujeto que se está tratando y célula o tejido diana. Los ejemplos no limitantes de ruta de administración incluyen administración oral, vaginal, nasal, inyección, aplicación tópica, sublingual, pulmonar y mediante supositorio.
Como se utiliza en el presente documento, el término “afinidad” se refiere a la fuerza de unión entre los receptores y sus ligandos, por ejemplo, entre un anticuerpo y su antígeno. El término “Kd” o “constante de disociación” se refiere a la afinidad entre un anticuerpo y un antígeno, es decir, con qué fuerza se une el anticuerpo al antígeno particular. El término “ IC50” o “la mitad de la concentración inhibidora máxima” representa la cantidad de competidor requerida para provocar una disminución del 50 % en la unión de los artículos de prueba.
Como se utiliza en el presente documento, el término “aminoácido” se refiere a L-aminoácido o D-aminoácido o una mezcla de los mismos, que incluye tanto el aminoácido natural como el aminoácido sintético o similares siempre que se mantenga la propiedad funcional deseada por el polipéptido. NH2, cuando se utiliza al comienzo de una secuencia de péptidos, se refiere al grupo amino libre presente en el terminal amino (o terminal N) de un polipéptido. COOH, cuando se utiliza al final de una secuencia de péptidos, se refiere al grupo carboxi libre presente en el terminal carboxi (o terminal C) de un polipéptido. Las abreviaturas de polipéptidos estándar para residuos de aminoácidos son las siguientes: A (Ala o Alanina); C (Cys o cisteína); D (Asp o ácido aspártico); E (glu o ácido glutámico); F (Phe o fenilalanina); G (Gly o glicina); H (His o Histidina); I (IIe o isoleucina); K (Lys o Lisina); L (Leu o leucina); M (Met o metionina); N (Asn o Asparagina); P (Pro o Prolina); Q (Gln o glutamina); R (Arg o Arginina); S (Ser o Serina); T (Thr o treonina); V (Val o Valina); W (Trp o triptófano); X (Xaa o Desconocido u Otro); Y (Tyr o tirosina); Z (Glx/Gln/Glu o ácido glutámico/glutamina); y Dpr (ácido 2,3-diaminopropiónico). Todas las secuencias de residuos de aminoácidos representadas en el presente documento por la fórmula tienen una orientación de izquierda a derecha en la dirección convencional del terminal amino al terminal carboxi. Un guión al principio o al final de una secuencia de residuos de aminoácidos indica un enlace peptídico a una secuencia adicional de uno o más residuos de aminoácidos o un enlace covalente a un grupo de terminal amino tal como NH2 o acetilo o a un grupo de terminal carboxi tal como COOH.
Como se utiliza en el presente documento, el término “que comprende” o “comprende” pretende significar que las composiciones y métodos incluyen los elementos enumerados, pero sin excluir otros. “Que constituye esencialmente en” cuando se utiliza para definir composiciones y métodos, significará excluir otros elementos de cualquier significado esencial para la combinación para el propósito establecido. Por lo tanto, una composición o proceso que consiste esencialmente en los elementos como se definen en el presente documento no excluiría otros materiales o etapas que no afecten materialmente a las características básicas y novedosas de la divulgación. “Que consiste en” significará excluir más que oligoelementos de otros ingredientes y etapas del método sustanciales. Las realizaciones definidas por cada uno de estos términos de transición están dentro del alcance de esta divulgación.
Como se utiliza en el presente documento, los términos “agente activo”, “fármaco” y “agente farmacológicamente activo” se utilizan indistintamente en el presente documento para referirse a un material o compuesto químico que, cuando se administra a un sujeto, induce un efecto farmacológico deseado, y está destinado a incluir un agente terapéutico, que incluye radionúclidos, fármacos, agentes anticancerígenos, toxinas y similares. Un ejemplo de agente activo es un conjugado de anticuerpo ureasa.
Como se utiliza en el presente documento, el término “anticuerpo” se refiere a un péptido, polipéptido o proteína que tiene afinidad de unión a un antígeno. Una unidad estructural de anticuerpo típica comprende un tetrámero. Cada tetrámero está compuesto por dos pares idénticos de cadenas de polipéptidos, cada par tiene una cadena “ligera” y una cadena “pesada”. El terminal N de cada cadena define una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos principalmente responsables del reconocimiento de antígenos. Los términos “cadena ligera variable” (VL) y “cadena pesada variable” (VH) se refieren a estas cadenas ligera y pesada, respectivamente. Los anticuerpos existen como inmunoglobulinas intactas o como fragmentos tales como F(ab)'2, un dímero de Fab que en sí mismo es una cadena ligera unida a VH-CH1 por un enlace disulfuro, o un monómero Fab', que puede resultar de la ruptura del enlace disulfuro en la región bisagra. El monómero Fab' es esencialmente un Fab con parte de la región bisagra (véase Fundamental Immunology, W.E. Paul, ed., Raven Press, NY (1993), para una descripción más detallada de otros fragmentos de anticuerpos). Los fragmentos de anticuerpos se pueden producir mediante la digestión de un anticuerpo intacto mediante, por ejemplo, diversas peptidasas, sintetizadas de novo ya sea químicamente o al utilizar metodología de ADN recombinante. Por tanto, el término “anticuerpo”, como se utiliza en el presente documento, también incluye fragmentos de anticuerpos producidos mediante la modificación de anticuerpos o sintetizados de novo utilizando metodologías de ADN recombinante. Los anticuerpos incluyen anticuerpos de cadena sencilla, que incluyen los anticuerpos Fv(sFv) de cadena sencilla en los que una VH y una VL se unen juntas (directamente o mediante un ligador peptídico) para formar un polipéptido continuo.
Como se utiliza en el presente documento, el término “anticuerpo de dominio único” (sdAb o “VHH”) se refiere al dominio variable de cadena pesada sencilla de anticuerpos del tipo y, en algunos aspectos, se puede encontrar en mamíferos camélidos que carecen naturalmente de cadenas ligeras. En algunos aspectos, el anticuerpo de dominio único se puede derivar de una región VH, una región VHH o una región VL. En algunos aspectos, el anticuerpo de dominio único es de origen humano. En algunos aspectos, el anticuerpo de dominio único humano comprende las secuencias de cadena ligera o pesada divulgadas en los documentos WO2006/099747 y WO2009/079793 y WO2012/100343. En un aspecto, el anticuerpo de dominio único humano comprende secuencias de cadena pesada o ligera con enlaces disulfuro dentro de la región marco como se discute en el documento WO2012/100343.
Como se utiliza en el presente documento, el término “fragmento de anticuerpo” también incluye cualquier proteína sintética o modificada genéticamente que actúa como un anticuerpo al unirse a un antígeno específico para formar un complejo.
Como se utiliza en el presente documento, el término “conjugado” se refiere a dos o más moléculas que están ligadas covalentemente para formar una construcción más grande. En un aspecto, las dos moléculas están ligadas por un enlace directo en el que un grupo funcional reactivo sobre la ureasa se une a un grupo funcional reactivo complementario sobre el anticuerpo tal como una funcionalidad amino de lisina que se une a una funcionalidad carboxilo de ácido aspártico o glutámico. Se entiende que dichas reacciones pueden requerir una modificación convencional del grupo carboxilo más reactiva. En otro aspecto, las dos moléculas están ligadas a través de una fracción ligadora.
Como se utiliza en el presente documento, los términos “proteína”, “polipéptido” o “péptido”, como se utiliza en el presente documento, se refieren indistintamente. La proteína tiene una estructura primaria representada por su secuencia de subunidades y puede tener estructuras secundarias helicoidales o de pliegues, así como una estructura tridimensional general. Aunque “proteína” se refiere comúnmente a un polipéptido relativamente grande, por ejemplo, que contiene 100 o más aminoácidos, y “péptido” a polipéptidos más pequeños, los términos se utilizan indistintamente en el presente documento. Es decir, el término “proteína” puede referirse a un polipéptido más grande, así como a un péptido más pequeño, y viceversa.
Como se utiliza en el presente documento, el término “fracción diana” se refiere a una molécula que se une a una población definida de células o tipo de célula seleccionado. La fracción diana se puede unir a un receptor, un oligonucleótido, un sustrato enzimático, un determinante antigénico u otro sitio de unión presente sobre o en la célula o población celular diana. Una fracción diana ejemplar es un anticuerpo. Los fragmentos de anticuerpos y las pequeñas secuencias de péptidos capaces de reconocer los antígenos expresados también se contemplan como fracciones diana.
Como se utiliza en el presente documento, los términos “tratar”, “que trata” o “tratamiento”, como se utiliza en el presente documento, incluyen aliviar, disminuir o mejorar una enfermedad o afección o uno o más síntomas de la misma, prevenir síntomas adicionales, mejorar o prevenir la causas metabólicas subyacentes de los síntomas, inhibir la enfermedad o afección, por ejemplo, detener o suprimir el desarrollo de la enfermedad o afección, aliviar la enfermedad o afección, provocar la regresión de la enfermedad o afección, aliviar una afección provocada por la enfermedad o afección, o suprimir los síntomas de la enfermedad o afección, y están destinados a incluir profilaxis. Los términos también incluyen aliviar la enfermedad o afecciones, por ejemplo, causar la regresión de los síntomas clínicos. Los términos incluyen además lograr un beneficio terapéutico y/o un beneficio profiláctico. Por beneficio terapéutico se entiende la erradicación o mejora del trastorno subyacente que se está tratando. También, se logra un beneficio terapéutico con la erradicación o mejora de uno o más de los síntomas fisiológicos asociados con el trastorno subyacente, de manera que se observa una mejora en el individuo, a pesar de que el individuo todavía padece el trastorno subyacente.
Los términos “sujeto”, “ individuo” y “paciente” se utilizan indistintamente en el presente documento para referirse a cualquier diana del tratamiento. La presente divulgación también proporciona un método para tratar células tumorales in situ, o en su posición o ubicación normal, por ejemplo, células neoplásicas de tumores de mama o próstata. Estos tumores in situ se pueden ubicar dentro o sobre una amplia variedad de anfitriones; por ejemplo, de humano a anfitriones, anfitriones caninos, anfitriones felinos, anfitriones equinos, anfitriones bovinos, anfitriones porcinos y similares. Se puede tratar cualquier anfitrión en el que se encuentra un tumor o células tumorales. Por tanto, un sujeto incluye un vertebrado, preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un humano.
Como se utiliza en el presente documento, el término “sustancialmente libre de” partículas carecería por completo de partículas, o carecería casi por completo de partículas ya que el efecto sería el mismo que si careciera por completo de partículas. En otras palabras, una composición que es “sustancialmente libre de' un ingrediente o elemento puede contener realmente dicho artículo siempre que no haya un efecto medible del mismo. El término “sustancialmente” a menos que se indique lo contrario significa mayor de aproximadamente 90 %, mayor de aproximadamente 95 %, mayor de aproximadamente 96 %, mayor de aproximadamente 97 %, mayor de aproximadamente 98 %, o mayor de aproximadamente 99 %. En algunas realizaciones, la composición que comprende el conjugados de anticuerpo-ureasa es substancialmente libre de ureasa no conjugada, lo que significa que la composición contiene mayor de aproximadamente 90 % de conjugados de anticuerpo-ureasa, mayor de aproximadamente 95 % de conjugados de anticuerpo-ureasa, mayor de aproximadamente 96 % de conjugados de anticuerpo-ureasa, mayor de aproximadamente 97 % de conjugado de anticuerpo-ureasas, mayor de aproximadamente 98 % de conjugados de anticuerpo-ureasa, o mayor de aproximadamente 99 % de conjugados de anticuerpo-ureasa. En otras palabras, la composición contiene menos de aproximadamente 0.1 % de ureasa no conjugada, menos de aproximadamente 0.5 % de ureasa no conjugada, menos de aproximadamente 1 % de ureasa no conjugada, menos de aproximadamente 2 % de ureasa no conjugada, menos de aproximadamente 3% de ureasa no conjugada, menos de aproximadamente 4% de ureasa no conjugada, menos de aproximadamente 5 % de ureasa no conjugada, o menos de aproximadamente 10 % de ureasa no conjugada. El término “ureasa no conjugada” se refiere a una ureasa sin estar conjugada con un anticuerpo.
Como se utiliza en el presente documento, el término “ureasa” se refiere a una enzima que tiene la actividad enzimática de una amidohidrolasa de urea (EC 3.5.1.5), ya sea de origen natural u obtenida mediante, por ejemplo, técnicas de ácido nucleico recombinante y/o síntesis química. La ureasa también incluye proteínas de fusión que comprenden la ureasa completa, subunidades o fragmentos de la misma y/o ureasa con sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos que conservan la actividad de urea amidohidrolasa del polipéptido.
Como se utiliza en el presente documento, el término “DOS47” se refiere a una ureasa purificada.
Conjugación de anticuerpo-ureasa
La presente tecnología se dirige a un conjugado de anticuerpo-ureasa. La presente tecnología proporciona una composición farmacéutica que comprende una solución acuosa farmacéuticamente aceptable adecuada para inyección intravenosa y un conjugado de anticuerpo-ureasa substancialmente libre de ureasa, libre de anticuerpo no conjugado, y libre de solventes de HPLC no acuosos Los solventes de HPLC no acuosos incluyen solventes orgánicos comúnmente utilizados en HPLC preparativa o purificación por HPLC, tales como metanol, acetonitrilo, ácido trifluoroacético, etc. En algunos aspectos, el conjugado anticuerpo-ureasa está sustancialmente libre de fosfato de un tampón de fosfato. En algunos aspectos, se utiliza tampón de fosfato que contiene fosfato 10 mM, NaCl 50 mM pH 7.0 para la purificación de SEC. En algunos aspectos, no se realiza purificación por HPLC en la producción de fabricación de conjugado anticuerpo-ureasa.
En algunos aspectos, el conjugado tiene una relación de conjugación de aproximadamente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 fracciones de anticuerpo por fracción de ureasa. En algunos aspectos, el conjugado tiene una relación de conjugación de aproximadamente 6, 7, 8, 9, 10, 11, o 12 fracciones de anticuerpo por fracción de ureasa. En algunos aspectos, el conjugado tiene una relación de conjugación de aproximadamente 8, 9, 10, 11, o 12 fracciones de anticuerpo por fracción de ureasa. En algunos aspectos, el conjugado tiene una relación de conjugación promedio de aproximadamente 6 o más fracciones de anticuerpo por fracción de ureasa. En algunos aspectos, el conjugado tiene una relación de conjugación promedio de aproximadamente 8, 9, 10, o 11 fracciones de anticuerpo por fracción de ureasa.
En algunos aspectos, el ligamiento es un enlace covalente o ligamiento directo en el que un grupo funcional reactivo sobre la ureasa se une a un grupo funcional reactivo complementario sobre el anticuerpo, tal como una funcionalidad amino (NH2) de, por ejemplo, la unión de lisina a una funcionalidad de carboxilo (COOH) de por ejemplo, ácido aspártico o glutámico, o un sulfhidrilo (SH) de cisteína. Se entiende que dichas reacciones pueden requerir una modificación convencional del grupo carboxilo más reactiva.
Las funcionalidades reactivas pueden ser las mismas, tal como ácido oxálico, ácido succínico y similares, o pueden ser funcionalidades ortogonales, tales como grupos amino (que se convierte en NH después de conjugación) y carboxilo (que se convierte en CO o COO después de conjugación). Alternativamente, el anticuerpo y/o ureasa se pueden derivatizar para exponer o unir grupos funcionales reactivos adicionales. La derivatización puede implicar la unión de cualquiera de varias moléculas ligadoras tales como aquellas disponibles de Pierce Chemical Company, Rockford III.
Un “ligador”, como se utiliza en el presente documento, es una molécula que se utiliza para unir la fracción diana al agente activo, tal como un anticuerpo a la ureasa. El ligador es capaz de formar enlaces covalentes tanto con la fracción diana como con el agente activo. Los ligadores adecuados son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, ligadores de carbono de cadena lineal o ramificada, ligadores de carbono heterocíclicos o ligadores de péptidos. Cuando la fracción diana y la molécula de agente activo son polipéptidos, los ligadores se pueden unir a los aminoácidos constituyentes a través de sus grupos laterales (por ejemplo, a través de un ligamiento de disulfuro a cisteína). En un aspecto preferido, los ligadores se unirán a los grupos amino y carboxilo de carbono alfa de los aminoácidos terminales. En algunos aspectos, el ligamiento se realiza a través de un ligador que tiene dos o más funcionalidades, tales como carboxi o amino, que le permiten reaccionar tanto con las ureasas como con el anticuerpo. Los ligadores son bien conocidos en la técnica y normalmente comprenden de 1 a 20 átomos que incluyen carbono, nitrógeno, hidrógeno, oxígeno, azufre y similares.
Se puede utilizar un ligador bifuncional que tiene un grupo funcional reactivo con un grupo sobre la ureasa y otro grupo reactivo con un anticuerpo para formar el inmunoconjugado deseado. Alternativamente, la derivatización puede implicar el tratamiento químico de la fracción diana, por ejemplo, la división por glicol de la fracción de azúcar de un anticuerpo de glicoproteína con peryodato para generar grupos aldehído libres. Los grupos aldehído libres sobre el anticuerpo pueden reaccionar con grupos amina o hidrazina libres sobre un agente para unir el agente al mismo. (Véase Patente de Estados Unidos No. 4,671,958). También se conocen procedimientos para la generación de grupos sulfhidrilo libres sobre polipéptidos, tales como anticuerpos o fragmentos de anticuerpos (véase patente de Estados Unidos No. 4,659,839).
Otras moléculas ligadoras y el uso de las mismas incluyen aquellas descritas en, por ejemplo, la Solicitud de Patente Europea No. 188,256; Patentes de Estados Unidos Nos. 4,671,958, 4,659,839, 4,414,148, 4,699,784; 4,680,338; 4,569,789; y 4,589,071; y Borlinghaus et al. (1987) Cancer Res. 47: 4071-4075).
En algunos aspectos, el ligamiento se puede dividir en o en las proximidades del sitio diana y la ureasa se libera de la fracción diana cuando la molécula conjugada ha alcanzado su sitio diana. La división del ligamiento para liberar la ureasa de la fracción diana puede ser provocada por la actividad enzimática o las condiciones a las que se somete el conjugado dentro de la célula diana o en las proximidades del sitio diana. En algunos aspectos, se puede utilizar un ligador que se pueda dividir bajo las condiciones presentes en el sitio del tumor (por ejemplo, cuando se expone a enzimas asociadas al tumor o pH ácido).
Los ligadores divisibles incluyen aquellos descritos en, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos Nos. 4,618,492; 4,542,225, y 4,625,014. Los mecanismos para la liberación de un agente activo de estos grupos ligadores incluyen, por ejemplo, la irradiación de un enlace fotolábil e hidrólisis catalizada por ácido. La Patente de Estados Unidos No.
4,671,958, por ejemplo, incluye una descripción de inmunoconjugados que comprenden ligadores que se dividen en el sitio diana in vivo por las enzimas proteolíticas del sistema del complemento del paciente. En algunos aspectos, un ligador adecuado es un residuo de un separador de aminoácido o péptido que consiste en dos o más aminoácidos.
En algunos aspectos, un ligador adecuado es R1-L-R2, en el que R1 y R2 son grupos funcionales iguales o diferentes, uno de los cuales está conectado al anticuerpo y el otro está conectado a ureasa. R1 y R2 se pueden seleccionar independientemente de, pero sin limitarse a, -NH-, -CO-, -COO-, -O-, -S-, -NHNH-, -N=N-, = N-NH-, etc. L puede ser una cadena de hidrocarburo lineal o ramificada, tal como una cadena de alquilo, en la que uno o más de los carbonos están opcionalmente reemplazados con oxígeno, nitrógeno, amida, azufre, sulfóxido, sulfona, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo, heteroarilo, etc. En algunos aspectos, el ligador puede ser un residuo de aminoácido o un péptido. En algunas circunstancias, el ligador se puede dividir mediante una enzima o cambia el pH a o se aproxima al sitio diana. Ciertos ligadores y procedimientos adecuados para preparar conjugados se describen en las Patentes de Estados Unidos Nos. 4,414,148, 4,545,985, 4,569,789, 4,671,958, 4,659,839, 4,680,338, 4,699,784, 4,894,443, y 6,521,431. En algunos aspectos, el ligador es
Figure imgf000009_0001
en el que *j w - y -----representa los puntos de conexión con el anticuerpo o ureasa. En algún aspecto, ' / v u ' representa el punto de conexión a un grupo amino de un anticuerpo y -----representa el punto de conexión a un átomo de S de un grupo tio de ureasa. Este ligador es el residuo de utilizar el agente de ligamiento SIAB (N-succinimidil(4-yodoacetil)aminobenzoato) para conjugar el anticuerpo y la ureasa. En algunos aspectos, la ultrapurificación es el método de separación adecuado para el método de conjugación que utiliza SIAB como agente de entrecruzamiento.
En algunos aspectos, el ligador es el residuo de utilizar un agente ligador de la fórmula:
Figure imgf000009_0002
en la que X es bromo o yodo, y L es el ligador como se describe en el presente documento.
En algunos aspectos, el agente de ligamiento es SBAP (3-[bromoacetamino]propionato de succinimidilo) o SIA (yodoacetato de N-succinimidilo), que se puede utilizar para la conjugación bajo condiciones similares (por ejemplo, no se necesita purificación cromatográfica por HPLC y solo puede ser necesaria la ultrafiltración) como la de SIAB. En algunos aspectos, la longitud del brazo del ligamiento de SIAB (10.6 Anstrong) es más adecuada/reflexiva que la de SBAP (6.2 A) y SIA (1.5 A). En algunos aspectos, el agente de ligamiento es SPDP (3-(piridilditio)propionato de succinimidilo), SMPT (succinimidiloxicarbonil-metil-(2-piridilditio) tolueno) o SMCC (4-(N-maleimidometil)ciclohexanocarboxilato de succinimidilo), que se puede utilizar para la conjugación, pero puede ser necesario más de un método de separación, tal como IEC y fraccionamiento con etanol, para separar la ureasa sin reaccionar de la solución de reacción de conjugación con un rendimiento menor.
Incluso adicionalmente, también se pueden unir componentes adicionales, tales como pero sin limitarse a, agentes terapéuticos tales como agentes anti-cancerígenos a los anticuerpos para mejorar adicionalmente el efecto terapéutico.
Ureasa
Varios estudios han proporcionado información detallada a cerca de la genética de las ureasas de una variedad de bacterias, plantas, hongos y virus evolutivamente diversos (Mobley, H. L. T. et al. (1995) Microbiol. Rev. 59: 451-480; Eur J. Biochem., 175, 151-165 (1988); Labigne, A. (1990) Publicación Internacional No. WO 90/04030; Clayton, C. L. et al. (1990) Nucleic Acid Res. 18, 362; y Patentes de Estados Unidos Nos. 6,248,330 y 5,298,399). De particular interés es la ureasa que se encuentra en plantas (Sirko, A. and Brodzik, R. (2000) Acta Biochim Pol 47(4): 1189-95).
Una ureasa vegetal ejemplar es la ureasa de judía gigante. Se pueden identificar otras secuencias de ureasa útiles en bases de datos públicas, por ejemplo, Entrez (ncbi.nlm.nih.gov/Entrez).
En algunos aspectos, la ureasa es una ureasa de judía gigante. La ureasa de judía gigante tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 2, como se muestra a continuación:
KKLSPREVEKLGLHNAGYLAQKRLARGVRLNY7EAVAL:ASQ
IKEYARDGEKTVAQLt'ÍCLGQHLLGRRQVLPAVPHLLNAVQVE
A7FPDG7KLV7VHDPISRENGELQEALFGSLLPVPSLDKFAE
TKEDNRIPGEILCEDECLTLNIGRKAVILKVTSKGDRPIQVG
SHYHFIEVHPYLTFDRRKAYGKRLNIAAGTAVRFEPGDCKSV
7LVSIEGNKVIRGGNAIADGPVNETNLEAANHAVRSKGFGHE
eekdasegftkedpncpfntfihrkeyankygpttgdk:rlg
D7NLLAEIEKDYALYGDECVFGGGKVIRDGMGQSCGHPPAIS
ldtvitnaviidytgiikadigikdgliasigkagnpdikng
VFSNMIIGANTEVIAGEGLIVTAGAIDCHVHYICPQLVYEAI
SSGITTLVGGGTGPAAGTRATTCTPSPTQKRLKLQSTDDLPL
NFGFTGKGSSSKPDELHEIIKAGAKGLKLHEDWGSTPAAIDN
CL7IAEHHDIQIN1HTDTLNEAGFVEHSIAAFKGRT1HTYHS
EGAGGGHAPDIIKVCGIKNVLPSSTNPTRPLTSNTIDEHLDM
LMVCHHLDREIPEDLAFAHSRIRKKTIAAEDVLNDIGAISII
SSDSQAKGRVGEVISRTWQTADKKKAQTGPLKCDSSDNDHFR
ZRRYIAKY7INPAIANGFSQYVGSVEVGKLADLVKWKPSFFG
7 KPEtíVIKGGMVAWADIGDPNASIPTPEPVKMRPMYG7LGKA
GGALSIAFVSKAALDQRVNVLYGLNKRVEAVSNVRKL7KLD1Í
KLHDALPEITVDPESYTVKADGKLLCVSEATTVPLSRNYFLF
(SEQ ID No. 2)
Se pueden identificar secuencias de ureasa útiles en bases de datos públicas, por ejemplo, Entrez (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/). Adicionalmente, se pueden utilizar los cebadores que son útiles para amplificar las ureasas de una amplia variedad de organismos como se describe por Baker, K.M. and Collier, J.L.
(http: //www.science.smith.edu/departments/Biology/lkatz/NEMEB_webpage/abstracts.html) o utilizando el CODEHOP (Cebador de Oligonucleótidos Híbridos COnsensus-DEgenerate) como se describe en Rose, et al. (1998) Nucl. Acids Res. 26: 1628.
La ureasa puede convertir el sustrato urea en amoniaco y carbamato. Esta actividad enzimática puede aumentar el pH haciendo que el entorno sea más básico. El entorno alrededor de una célula cancerosa es normalmente ácido (Webb, SD, et al. (2001) Novartis Found Symp 240: 169-81. Por lo tanto, al elevar el pH del entorno extracelular de esta manera, se inhibe el crecimiento de la célula cancerosa. De acuerdo con lo anterior, la adición de conjugados de anticuerpo-ureasa en ciertos aspectos de la presente tecnología hace que el pH del líquido intersticial se eleve en aproximadamente 0.1 unidades de pH, por ejemplo, 0.1-0.5 unidades de pH o más.
La ureasa de la presente tecnología incluye las formas de origen natural de ureasa así como sus variantes funcionalmente activas. Se contemplan dos tipos generales de variantes de secuencia de aminoácidos. Las variantes de la secuencia de aminoácidos son aquellas que tienen una o más sustituciones en aminoácidos específicos que no destruyen la actividad de ureasa. Estas variantes incluyen variantes silenciosas y variantes modificadas de forma conservadora que son sustancialmente homólogas y funcionalmente equivalentes a la proteína nativa. Una variante de una proteína nativa es “substancialmente homóloga” a la proteína nativa cuando al menos aproximadamente 80 %, más preferiblemente al menos aproximadamente 90 %, incluso más preferiblemente al menos aproximadamente 95 %, aún incluso más preferiblemente 98 %, y aún más preferiblemente al menos aproximadamente 99 % de su secuencia de aminoácidos es idéntica a la secuencia de aminoácidos de la proteína nativa. Una variante puede diferir en tan solo 1 o hasta 10 o más aminoácidos.
Un segundo tipo de variante incluye variantes de tamaño de ureasa que son fragmentos activos aislados de ureasa. Las variantes de tamaño se pueden formar, por ejemplo, al fragmentar la ureasa, mediante modificación química, mediante digestión con enzimas proteolíticas o mediante combinaciones de los mismos. Adicionalmente, se pueden emplear técnicas de modificación genética, así como métodos para sintetizar polipéptidos directamente a partir de residuos de aminoácidos, para producir variantes de tamaño.
Por “funcionalmente equivalente” se entiende que la secuencia de la variante define una cadena que produce una proteína que tiene sustancialmente la misma actividad biológica que la ureasa nativa. Dichas variantes funcionalmente equivalentes que abarcan variaciones sustanciales de secuencia también están incluidas en la presente tecnología. Por tanto, una variante funcionalmente equivalente de la proteína ureasa nativa tendrá una actividad biológica suficiente para ser terapéuticamente útil. Los métodos están disponibles en la técnica para determinar la equivalencia funcional. La actividad biológica se puede medir utilizando ensayos diseñados específicamente para medir la actividad de la proteína ureasa nativa. Adicionalmente, los anticuerpos producidos contra la proteína nativa biológicamente activa pueden probarse para determinar su capacidad para unirse a la variante funcionalmente equivalente, donde la unión efectiva es indicativa de una proteína que tiene una conformación similar a la de la proteína nativa.
Las secuencias de la proteína ureasa de la presente tecnología, que incluyen las secuencias sustituidas de forma conservadora, pueden estar presentes como parte de secuencias de polipéptidos más grandes, tales como las que se producen tras la adición de uno o más dominios para la purificación de la proteína (por ejemplo, segmentos de poli His, segmentos de etiqueta FLAG, etc.), donde los dominios funcionales adicionales tienen poco o ningún efecto sobre la actividad de la porción de proteína ureasa de la proteína, o donde los dominios adicionales se pueden eliminar mediante etapas de procesamiento posteriores a la síntesis, tales como mediante el tratamiento con una proteasa.
La adición de uno o más ácidos nucleicos o secuencias que no alteran la actividad codificada de una molécula de ácido nucleico de la presente tecnología, tal como la adición de una secuencia no funcional, es una variación conservadora de la molécula de ácido nucleico básico, y la adición de uno o más residuos de aminoácidos que no alteran la actividad de un polipéptido de la presente tecnología es una variación conservadora del polipéptido básico. Ambos tipos de adiciones son características de la presente tecnología. Un experto en la técnica apreciará que muchas variaciones conservadoras de las construcciones de ácido nucleico que se divulgan producen una construcción funcionalmente idéntica.
Se puede utilizar una variedad de métodos para determinar las relaciones de secuencia, que incluyen alineación manual y alineación y análisis de secuencia asistida por ordenador. Este último enfoque es un enfoque preferido en la tecnología actual, debido al mayor rendimiento que ofrecen los métodos asistidos por ordenador. Se encuentran disponibles una variedad de programas de ordenador para realizar la alineación de secuencias, o se pueden producir por un experto.
Como se señaló anteriormente, las secuencias de los ácidos nucleicos y polipéptidos (y fragmentos de los mismos) empleadas en la presente tecnología no necesitan ser idénticas, pero pueden ser sustancialmente idénticas (o sustancialmente similares), a la secuencia correspondiente de una molécula de polipéptido o ácido nucleico de ureasa (o fragmento de la misma) de la presente tecnología o molécula relacionada. Por ejemplo, los polipéptidos pueden estar sujetos a varios cambios, tales como inserciones, deleciones y sustituciones de uno o más aminoácidos o ácidos nucleicos, ya sean conservadoras o no conservadoras, que incluye cuando, por ejemplo, dichos cambios podrían proporcionar ciertas ventajas en su uso, por ejemplo, en su aplicación terapéutica o de administración.
Fracciones diana
Las fracciones diana se contemplan como entidades químicas de la presente tecnología y se unen a un tipo de célula seleccionada, definida o población de células diana, tal como células cancerosas. Las fracciones diana útiles a este respecto incluyen anticuerpos y fragmentos de anticuerpos, péptidos y hormonas. Las proteínas correspondientes a receptores de superficie celular conocidos (que incluyen lipoproteínas de baja densidad, transferrina e insulina), enzimas fibrinolíticas, proteínas de unión a plaquetas tales como anexinas y modificadores de la respuesta biológica (que incluyen interleucina, interferón, eritropoyetina y factor estimulante de colonias) también se contemplan como fracciones diana. Los oligonucleótidos, por ejemplo, oligonucleótidos antisentido que son complementarios a una porción de un ácido nucleico de la célula diana, se pueden utilizar como fracciones diana en la presente tecnología. Las fracciones diana también pueden ser oligonucleótidos que se unen a la superficie de una célula diana. Los análogos de las fracciones diana enumeradas anteriormente que conservan la capacidad de unirse a una población de células diana definida también se pueden utilizar como fracciones diana.
Los equivalentes funcionales de las fracciones diana mencionadas anteriormente también son útiles como fracciones diana de la presente tecnología. Un equivalente funcional de la fracción diana ejemplar es una construcción química orgánica diseñada para imitar la configuración y/u orientación adecuadas para la unión de la célula diana de la fracción diana. Otro equivalente funcional de la fracción diana es un polipéptido corto que exhibe la afinidad de unión de la fracción diana.
En algunos aspectos, las fracciones diana de la presente divulgación son anticuerpos, péptidos, oligonucleótidos o similares, que son reactivos con un antígeno sobre la superficie de una célula diana. Se pueden emplear tanto anticuerpos policlonales como monoclonales que están disponibles comercialmente o descritos en la bibliografía. Los anticuerpos pueden ser anticuerpos completos o fragmentos de los mismos. Se pueden producir anticuerpos monoclonales y fragmentos de acuerdo con técnicas convencionales, tales como síntesis de hibridomas, técnicas de ADN recombinante y síntesis de proteínas. Los fragmentos y anticuerpos monoclonales útiles se pueden derivar de cualquier especie (que incluyen humanos) o se pueden formar como proteínas quiméricas que emplean secuencias de más de una especie.
En algunos aspectos, la fracción diana es un anticuerpo humanizado o no humano. En algunos aspectos, la fracción diana es un anticuerpo de dominio único. En algunos aspectos, el anticuerpo de dominio único (sdAb) o “VHH” se refiere a dominio variable de cadena pesada sencilla de anticuerpos del tipo que se puede encontrar en mamíferos Camélidos que carecen naturalmente de cadenas ligeras. En algunos aspectos, el anticuerpo de dominio único se puede derivar de una región VH, una región VHH o una región VL. En algunos aspectos, el anticuerpo de dominio único es de origen humano. En algunos aspectos, el anticuerpo de dominio único humano comprende secuencias de cadena pesada o ligera divulgadas en los documentos WO2006/099747 y WO2009/079793 y WO2012/100343. En un aspecto, el anticuerpo de dominio único humano comprende secuencias de cadena pesada o ligera con enlaces disulfuro dentro de la región marco como se divulga en el documento WO2012/100343.
En algunos aspectos, la fracción diana (por ejemplo, anticuerpo) tiene especificidad para un antígeno tumoral expresado por carcinomas, leucemias, linfomas y sarcomas. Los carcinomas pueden ser de ano, tracto biliar, vejiga, mama, colon, recto, pulmón, orofaringe, hipofaringe, esófago, estómago, páncreas, hígado, riñón, vesícula biliar y conductos biliares, intestino delgado, tracto urinario, ovario, colon, carcinoma de pulmón de células no microcíticas, tracto genital, glándulas endocrinas, tiroides y piel. En algunos aspectos, la fracción diana (por ejemplo, anticuerpo) tiene especificidad para un antígeno tumoral expresado por tumores carcinoides, tumores del estroma gastrointestinal, tumores de cabeza y cuello, tumores primarios, hemangiomas, melanomas, mesotelioma maligno, mieloma múltiple y tumores del cerebro, nervios, ojos y meninges. En algunos aspectos, la fracción diana (por ejemplo, anticuerpo) tiene especificidad para un antígeno tumoral expresado por carcinoma, cáncer de mama, páncreas, ovario, pulmón y colon. En algunos aspectos, la fracción diana (por ejemplo, el anticuerpo) tiene especificidad para un antígeno tumoral expresado por el carcinoma de pulmón de células no microcíticas.
En algunos aspectos, el anticuerpo tiene especificidad para un antígeno tumoral expresado por carcinoma de pulmón de células no microcíticas. En algunos aspectos, el antígeno tumoral expresado por carcinoma de pulmón de células no microcíticas es CEACAM6 (molécula 6 de adhesión celular relacionada con el antígeno carcinoembrionario), y el anticuerpo tiene especificidad para CEACAM6. CEACAM6, también conocida como antígeno no específico de reacción cruzada (NCA) o CD66c, es un antígeno de cáncer bien caracterizado (11, 12). Este comparte una alta homología de secuencia con otros antígenos carcinoembrionarios humanos tales como CEACAM1, CEACAM7 y CEACAM8. Es una proteína de la superficie celular ligada al glicosilfosfoinositol (GPI) pero sin dominio citoplásmico conocido. La expresión de CEACAM6 está significativamente elevada en tejidos de cáncer de mama, páncreas, ovario, pulmón y colon. Su mayor expresión está implicada en el comportamiento invasivo y metastásico de las células tumorales (13). En algunos aspectos, el anticuerpo tiene una afinidad de unión a CEACAM6 con un valor Kd mayor que aproximadamente 1 x 10-6 M. En algunos aspectos, el conjugado tiene una afinidad de unión a CEACAM6 con un valor Kd de no más de aproximadamente 1 x 10-8 M, 1 x 10-9 M, 1 x 10-10 M, o 1 x 10-20 M. En algunos aspectos, el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo de camélido de dominio único (AFAIKL2, SEQ ID NO. 1) que reconoce CEACAM6 sobre células de adenocarcinoma de pulmón. En algunos aspectos, el anticuerpo comprende un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 1 como se muestra en la Figura 5. En algunos aspectos, el anticuerpo comprende un polipéptido que comprende al menos una modificación a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 1. En algunos aspectos, el anticuerpo comprende un polipéptido que comprende al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % y 99 % de homología de secuencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 1.
En algunos aspectos, el anticuerpo CEACAM6 es un anticuerpo anti-CEACAM6 (9A6): sc-59899 disponible de Santa Cruz Biotech. El anticuerpo CEACAM6 (9A6) es un IgG1 monoclonal de ratón proporcionado en 200 pg/ml, que se eleva contra estirpes de células tumorales que expresan CEACAM6 de origen humano. Se recomienda para detección de CEACAM6 de origen humano.
En algunos aspectos, el anticuerpo CEACAM6 es un anticuerpo anti-CEACAM6 (ab56234) disponible de abeam. El anticuerpo anti-CEACAM6 (ab56234) es un policlonal de conejo para CEACAM6. Se elevó contra una región dentro del péptido sintético (IQNPASANRS DPVTLNVLYG PDGPTISPSK ANYRPGENLN LSCHAASNPP (SEQ ID NO: 3)), que corresponde a los aminoácidos 217-266 de secuencia interna de CEACAM6 humano.
En algunos aspectos, el anticuerpo CEACAM6 es un anticuerpo anti-CEACAM-6/CD66c disponible de Novus Biologicals, que es un anticuerpo policlonal de conejo contra CEACAM6 y se valido sobre transferencia de Western e inmunohistoquímica-P. Se elevó contra el péptido sintético (EIQNPASANRSD (SEQ ID NO: 4)) dirigido hacia la región medio de CEACAM6 humano (NP_002474).
En algunos aspectos, el anticuerpo CEACAM6 es un anticuerpo anti-CEACAM6 EPR4403 disponible de OriGene, que es un anticuerpo monoclonal de conejo contra CEACAM6 (clon EPR4403). Se elevó contra un péptido sintético que corresponde a los residuos en CEACAM6 humano. Tiene reactividad para CEACAM6 de ratón, rata, y humano.
En algunos aspectos, el conjugado tiene una afinidad de unión a CEACAM6 con un valor IC50 de no más de aproximadamente 10 nM. En algunos aspectos, el conjugado tiene una afinidad de unión a CEACAM6 con un valor IC50 de no más de aproximadamente 5 nM. En algunos aspectos, el conjugado tiene una afinidad de unión a CEACAM6 con un valor IC50 de no más de aproximadamente 4 nM. En algunos aspectos, el valor IC50 es de aproximadamente 3.22 nM. En algunos aspectos, el conjugado se une a CEACAM6 con un valor IC50 de aproximadamente 10-30 pmg/ml. En algunos aspectos, el conjugado se une a CEACAM6 con un valor IC50 de aproximadamente 20 pg/ml. La afinidad de unión de un anticuerpo o un conjugado a un antígeno diana se puede determinar de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento o conocido en la técnica. En algunos aspectos, la presente tecnología describe este conjugado anti-CEACAM6-ureasa (L-DOS47). En algunos aspectos, la presente tecnología describe un conjugado de anticuerpo-ureasa, por ejemplo, AFAIKL2-ureasa. Se utiliza una biblioteca de fagos derivada del repertorio de anticuerpos de cadena pesada de una llama para identificar un anticuerpo de dominio único (sdAb) al analizar contra el adenocarcinoma de pulmón de células no microcíticas A549. El sdAb se denomina AFAI. La secuencia de genes de AFAI se optimiza para propósitos de conjugación y se renombra como AFAIKL2. En algunos aspectos, el anticuerpo AFAIKL2 se clona y se expresa en el sistema E. coli BL21 (DE3) pT7-7.
Las fracciones diana humanizadas son capaces de disminuir la inmunorreactividad del anticuerpo o polipéptido en el receptor del anfitrión, permitiendo un aumento de la vida media y una reducción de las reacciones inmunitarias adversas. Los anticuerpos monoclonales de murino se pueden humanizar, por ejemplo, al recombinar genéticamente la secuencia de nucleótidos que codifica la región Fv de murino o las regiones determinantes de complementariedad de la misma con la secuencia de nucleótidos que codifica una región de dominio constante humano y una región Fc. Los residuos de murino también se pueden retener dentro de los dominios marco de región variable humana para asegurar las características de unión al sitio diana adecuadas. Los anticuerpos modificados genéticamente para el suministro de diversos agentes activos a las células cancerosas se revisan en Bodey, B. (2001) Expert Opin Biol. Ther.
1(4):603-17.
En algunos aspectos, la fracción diana es un ligando que es reactivo con un receptor sobre la superficie de la célula diana. Por tanto, la fracción diana puede incluir, sin limitación, hormonas con afinidad para un componente de unión celular, cualquier molécula que contenga una fracción de carbohidrato reconocida por un componente de unión celular y fármacos o moléculas pequeñas que se unen a un componente de unión celular. La frase “componente de unión” incluye moléculas receptoras y aceptoras. Preferiblemente, el componente de unión es un componente de unión a la superficie celular. En un aspecto, la fracción diana es una proteína de origen natural, tal como insulina, que se une a un sitio diana. Las citocinas, que incluyen las interleucinas y factores tales como el factor estimulante de colonias de granulocitos/macrófagos (GM-CSF) y el factor de necrosis tumoral (TNF), también son fracciones diana específicas, que se sabe que se unen a células específicas que expresan altos niveles de sus receptores (Terlikowski, Sj (2002) Toxicology 174(3): 143-152).
Con el fin de disminuir la exposición a ureasa u otro agente activo a células o tejidos no diana, se pueden cribar las fracciones diana para identificar aquellas que muestran una reactividad no diana mínima, mientras que retienen la especificidad y reactividad diana. Al reducir la exposición no diana (y la localización y/o toxicidad adversas no diana), se pueden administrar dosis aumentadas de ureasa u otro agente activo. Esto permite la administración de la concentración más alta posible de ureasa u otro agente terapéutico con el fin de maximizar la exposición de las células diana, mientras permanece por debajo del umbral de toxicidad de células no diana inaceptable.
En algunos aspectos, se emplean dos o más conjugados de fracción diana de agente activo, en los que cada conjugado incluye una fracción diana diferente, por ejemplo, una especie de anticuerpo diferente. Cada uno de las fracciones diana utilizadas se une a una región de sitio diana diferente que puede estar asociada con el mismo sitio diana o con uno diferente. El componente de agente activo de cada conjugado administrado puede ser el mismo o diferente. Véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos Nos. 4,867,962 y 5,976,535. En algunos aspectos, se mejora la acreción del sitio diana del conjugado del agente activo al sitio diana, porque cada fracción diana, por ejemplo, especie de anticuerpo, reconoce una región de sitio diana diferente (es decir, epítopo). Este enfoque de la región del sitio diana alternativo proporciona más puntos de unión al sitio diana potenciales para el agente activo. En consecuencia, se puede evitar la saturación del sitio diana real o eficaz, por ejemplo, mediante saturación de epítopos y/o impedimento estérico. Por tanto, se puede lograr la acumulación aditiva de agente activo, por ejemplo, ureasa. Alternativamente, o en combinación, se pueden emplear productos génicos específicos de ureasa adicionales como agentes activos, por ejemplo, para la producción de una holoenzima catalíticamente activa en el sitio diana. Una apoenzima de ureasa ejemplar incluye las subunidades gamma, beta y alfa codificadas por los genes ureABC bacterianos (Burne, RA and Chen, Y.M. (2000) Microbes and Infection 2: 533-542).
Se pueden analizar los patrones de reactividad cruzada para anticuerpos monoclonales dirigidos contra un sitio diana particular para identificar un conjunto de dos o más anticuerpos monoclonales específicos diana con reactividad cruzada no superpuesta para uso en una aplicación terapéutica. La frase “patrones no superpuestos de reactividad cruzada” indica que los tejidos no diana unidos por una especie de anticuerpo difieren sustancialmente de los tejidos no diana unidos por otra especie de anticuerpo. Los patrones de reactividad cruzada difieren en la medida necesaria para reducir proporcionalmente la exposición del agente activo para aplicaciones terapéuticas. Se prefiere una menor superposición de pares de anticuerpos (o un conjunto más grande de anticuerpos).
Los anticuerpos se pueden cribar mediante una variedad de métodos. Puede emplearse el análisis inmunohistoquímico para determinar la reactividad con el tejido diana y la reactividad cruzada con el tejido no diana. Los tejidos a los que se unen las especies de anticuerpos se pueden identificar al exponer el tejido al anticuerpo; lavar el tejido para eliminar cualquier anticuerpo no unido; y detectar la presencia de anticuerpo unido. Los procedimientos histoquímicos in vitro son conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Sánchez-Islas, E. and Leon-Olea, M. (2001) Nitric Oxide 5(4): 302-16.
Cuando la fracción diana es relativamente corta, se puede sintetizar utilizando técnicas de síntesis de péptidos químicos estándar. La síntesis en fase sólida en la que el aminoácido de terminal C de la secuencia se une a un soporte insoluble seguido de la adición secuencial de los aminoácidos restantes en la secuencia se contempla para un aspecto del método para la síntesis química de los polipéptidos. Las técnicas para la síntesis en fase sólida se describen por Barany and Merrifield, Solid-Phase Peptide Synthesis; pp. 3-284 en The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology. Vol. 2: Special Methods in Peptide Synthesis, Parí A., Merrifield, et al. J. Am. Chem. Soc., 85: 2149-2156 (1963), and Stewart et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed. Pierce Chem. Co., Rockford, III. (1984)
El ADN que codifica el anticuerpo o la ureasa se puede preparar mediante cualquier método adecuado, que incluye, por ejemplo, la clonación y restricción de secuencias apropiadas o síntesis química directa mediante métodos tales como el método del fosfotriéster de Narang et al. (1979) Meth. Enzymol. 68: 90-99; el método del fosfodiéster de Brown et al. (1979) Meth. Enzymol. 68: 109-151; el método de dietilfosforamidita de Beaucage et al. (1981) Tetra. Lett., 22: 1859-1862; y el método de soporte sólido de la Patente de Estados Unidos No. 4,458,066.
La síntesis química produce un oligonucleótido de cadena sencilla. Este se puede convertir en ADN de cadena doble mediante hibridación con una secuencia complementaria o mediante polimerización con una polimerasa de ADN utilizando la cadena sencilla como plantilla. Un experto reconocería que, si bien la síntesis química de ADN se limita a secuencias de aproximadamente 100 bases, se pueden obtener secuencias más largas mediante ligación de las secuencias más cortas.
Alternativamente, se pueden clonar subsecuencias y dividirse las subsecuencias apropiadas utilizando enzimas de restricción apropiadas. A continuación, los fragmentos se pueden ligar para producir la secuencia de ADN deseada.
Métodos de preparación de conjugados de anticuerpo-ureasa
La presente tecnología proporciona un método para preparar una composición que comprende un conjugado de anticuerpo-ureasa y substancialmente libre de ureasa no conjugada, tal como no más de aproximadamente 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, o 1 % de ureasa en base al peso del conjugado de anticuerpo-ureasa, cuyo método comprende (1) combinar el anticuerpo activado y ureasa en un solvente en el que substancialmente no reacciona el anticuerpo activado y la ureasa, tal como no más de 10 %, 5 % o 1 % de reacción por hora, para formar una mezcla de reacción en la que la distribución del anticuerpo activado y ureasa en el solvente es uniforme, y (2) alterar una propiedad de la mezcla de (1) de tal manera que el anticuerpo activado reaccione fácilmente con la ureasa para formar el conjugado de anticuerpo-ureasa. En algunos aspectos, la propiedad de la mezcla de (1) es el valor de pH. En algunos aspectos, la alteración de la propiedad de la mezcla de (1) comprende el aumento del pH a un valor en el que el anticuerpo activado reacciona fácilmente con la ureasa para formar el conjugado de anticuerpo-ureasa. En algunos aspectos, el anticuerpo activado, por ejemplo, al menos 90 % o al menos 95 % de anticuerpo activado, reacciona fácilmente con la ureasa en (2) a una tasa en la que la mezcla está substancialmente libre de ureasa no conjugada aproximadamente 6 horas, aproximadamente 5 horas, aproximadamente 4 horas, aproximadamente 3 horas, aproximadamente 2 horas, o aproximadamente 1 hora después de que se altera la propiedad de la mezcla.
En algunos aspectos, el método comprende combinar el anticuerpo activado y la ureasa en un tampón acuoso ácido que tiene un pH de aproximadamente 6.0-7.0, tal como aproximadamente 6.5, ajustar el pH a pH básico de aproximadamente 8.0-9.0, tal como aproximadamente 8.3 para formar el conjugado de anticuerpo-ureasa, y purificar el conjugado de anticuerpo-ureasa mediante ultradiafiltración, en el que el método no comprende una etapa de purificación cromatográfica. En algunos aspectos, el tampón acuoso tiene un pH de aproximadamente 5 a 8. En algunos aspectos, el anticuerpo activado y ureasa se combinan en el tampón acuoso ácido. En algunos aspectos, la relación de anticuerpo activado y ureasa es desde aproximadamente 3 hasta aproximadamente 12. En algunos aspectos, el conjugado de anticuerpo-ureasa tiene una relación de conjugación de 6-15 fracciones de anticuerpo por fracción de ureasa. En algunos aspectos, el conjugado de anticuerpo-ureasa tiene una relación de conjugación de 8­ 11 fracciones de anticuerpo por fracción de ureasa. En algunos aspectos, el ajustador de pH es un agente tampón o una solución de tampón. En algunos aspectos, el ajustador de pH comprende uno o más de ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido bórico, ácido carbónico, ácido bicarbónico, ácido glucónico, hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, amoníaco acuoso, ácido cítrico, monoetanolamina, ácido láctico, ácido acético, ácido succínico, ácido fumárico, ácido maleico, ácido fosfórico, ácido metanosulfónico, ácido málico, ácido propiónico, ácido trifluoroacético, una sal de los mismos o una combinación de los mismos. En algunos aspectos, el agente tampón comprende uno o más de glicina, ácido acético, ácido cítrico, ácido bórico, ácido ftálico, ácido fosfórico, ácido succínico, ácido láctico, ácido tartárico, ácido carbónico, ácido clorhídrico, hidróxido de sodio, una sal de los mismos, o una combinación de los mismos. En algunos aspectos, la solución tampón comprende uno o más de tampón de clorhidrato de glicina, tampón de acetato, tampón de citrato, tampón de lactato, tampón de fosfato, tampón de ácido cítrico-fosfato, tampón de fosfato-acetato-borato, tampón de ftalato o una combinación de los mismos. En algunos aspectos, el tampón no es un tampón de fosfato. En algunos aspectos, el tampón ácido es un tampón de acetato de sodio. En algunos aspectos, el pH se ajusta al pH básico mediante un método que comprende la adición de una solución de base acuosa, tal como una solución de borato de sodio (por ejemplo, 0.1-5 M o 1 M). Sin desear estar limitado por la teoría, el tampón de acetato de sodio tiene una baja capacidad de tampón y es adecuado para ajustar el pH a 8.3 en tampón de borato 1M de pH 8.5. En algunos aspectos, se utiliza tampón de Tris-HCl (por ejemplo, Tris-HCl 1 M) para ajustar la mezcla a pH 8-9, por ejemplo, 8.3.
En algunos aspectos, los tiempos de reacción y la relación de anticuerpo/ureasa se mantienen como constantes. En algunos aspectos, la relación molar del anticuerpo/ureasa en la mezcla de reacción es de aproximadamente 25 o aproximadamente 21, o aproximadamente 1.8 a 12 anticuerpos/ureasa. En algunos aspectos, la relación molar de anticuerpo/ureasa se ajusta desde 4 hasta 25. En algunos aspectos, la relación molar de anticuerpo/ureasa al menos 6.
En algunos aspectos, no más de 1 % o 2 % de anticuerpo sin reaccionar está presente en la mezcla después de purificación tal como ultradiafiltración. En algunos aspectos, se pueden utilizar otros métodos de purificación sin HPLC. Por ejemplo, se puede utilizar cristalización/fraccionamiento de etanol para purificación con menor rendimiento. En algunos aspectos, el peso molecular del anticuerpo no es mayor de 50 kDa, tal como aproximadamente 10-20 kDa, o aproximadamente 13 kDa, y la purificación es ultradiafiltración. En algunos aspectos, el método proporciona el conjugado de anticuerpo-ureasa en un rendimiento de al menos aproximadamente 60 % de proteína total en peso, aproximadamente 70 % de proteína total en peso, aproximadamente 80 % de proteína total en peso, o al menos 90 % de proteína total en peso. Proteína total significa la cantidad combinada (en peso) de ureasa y anticuerpo AFAIKL2. En algunos aspectos, no más de 10-20 % (en peso de proteína total) de anticuerpo no conjugado permanece en la mezcla de reacción antes de purificación.
La presente tecnología proporciona una composición estable que comprende un anticuerpo activado y ureasa en un solvente acuoso ácido (como se describió anteriormente) y substancialmente libre de conjugado de anticuerpo-ureasa, tal como no más de aproximadamente 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, o 1 % de conjugado de anticuerpo-ureasa en base al peso de ureasa. La presente tecnología proporciona adicionalmente una composición que comprende un conjugado de anticuerpo-ureasa y substancialmente libre de ureasa no conjugada, tal como no más de aproximadamente 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, o 1 % de ureasa en base al peso del conjugado de anticuerpo-ureasa en un solvente acuoso, en el que el solvente acuoso tiene un pH de aproximadamente 8-9, por ejemplo, 8.3 (como se describió anteriormente). En algunos aspectos, la composición que comprende el conjugado de anticuerpo-ureasa comprende adicionalmente no más de aproximadamente 40 a 60 % de anticuerpo no conjugado por anticuerpo total (anticuerpo activado y anticuerpo sin reaccionar). En algunos aspectos, la composición que comprende el conjugado de anticuerpo-ureasa comprende adicionalmente no más de aproximadamente 10 a 20 % de anticuerpo no conjugado por proteínas totales.
Dado que la ureasa provoca la liberación de amoniaco in vivo que tiene toxicidad general y por sí misma no se dirige a los tumores, la presencia de ureasa no conjugada aumenta el riesgo de que la ureasa esté presente y produzca toxicidad en los tejidos normales. Sin embargo, debido al tamaño y otras propiedades de ureasa, la conjugación de anticuerpos a la ureasa no da como resultado un tamaño suficiente u otros diferenciales para permitir la separación fácil del conjugado anticuerpo-ureasa de la ureasa no conjugada mediante métodos de purificación cromatográfica, especialmente en cantidades a gran escala.
La presente tecnología sorprendentemente proporciona substancialmente conjugación completa de la ureasa con anticuerpos, de tal manera que el producto resultante está substancialmente libre de ureasa no conjugada sin ninguna purificación cromatográfica. Al estar sustancialmente libres de ureasa, las composiciones descritas en el presente documento suministran sustancialmente todas las fracciones de ureasa de la composición al sitio diana a través de la administración sistémica. El suministro diana de ureasa al sitio diana reduce o elimina la toxicidad general del amoníaco producido por la ureasa y reduce la cantidad de ureasa que se necesita administrar para producir un efecto terapéutico. La presente tecnología es especialmente adecuada para preparar a gran escala, tal como al menos aproximadamente 1 g, 10 g, 100 g o 1 kg, el conjugado anticuerpo-ureasa que está sustancialmente libre de ureasa para usos clínicos, en particular para tratar tumores metastásicos que son difíciles o poco prácticos de tratar mediante la administración local de ureasa.
La presente tecnología también proporciona un método para aumentar la afinidad de unión de anticuerpos a un antígeno tumoral, que comprende conjugar una pluralidad de las moléculas de anticuerpo a una molécula de ureasa para formar un conjugado de anticuerpo-ureasa, en la que el conjugado tiene una afinidad de unión al antígeno tumoral al menos aproximadamente 100 veces, tal como aproximadamente 200 veces, aproximadamente 300 veces, aproximadamente 400 veces, y aproximadamente 500 veces, mayor que el anticuerpo no conjugado. En algunos aspectos, el ensayo de unión competitiva muestra que la afinidad de unión del conjugado de anticuerpo-ureasa es de aproximadamente 100 veces, aproximadamente 200 veces, aproximadamente 300 veces, aproximadamente 400 veces, y aproximadamente 500 veces más fuerte que aquel del anticuerpo de dominio único nativo debido a una mayor avidez. En algunos aspectos, el conjugado tiene una relación de conjugación de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, o 12 fracciones de anticuerpo por fracción de ureasa. En algunos aspectos, el conjugado tiene una relación de conjugación de aproximadamente 6 o más fracciones de anticuerpo por fracción de ureasa. En algunos aspectos, el conjugado tiene una relación de conjugación de 6, 7, 8, 9, 10, 11, o 12 fracciones de anticuerpo por fracción de ureasa. En algunos aspectos, el conjugado tiene una relación de conjugación de 8, 9, 10, o 11 fracciones de anticuerpo por fracción de ureasa. En algunos aspectos, el conjugado tiene una relación de conjugación promedio de aproximadamente 8, 9, 10, o 11 fracciones de anticuerpo por fracción de ureasa. En algunos aspectos, la ureasa es una ureasa de judía gigante. En algunos aspectos, el anticuerpo es un anticuerpo humanizado o no humano. En algunos aspectos, el anticuerpo es un anticuerpo de dominio único. En algunos aspectos, el antígeno tumoral se expresa por carcinoma de pulmón de células no microcíticas. En algunos aspectos, el anticuerpo tiene especificidad para CEACAM6. En algunos aspectos, el anticuerpo tiene una afinidad de unión a CEACAM6 con un valor Kd mayor que aproximadamente 1 x 10-6 M. En algunos aspectos, el conjugado se une a CEACAM6 con un valor Kd de no más de aproximadamente 1 x 10-8 M. En algunos aspectos, el conjugado se une a CEACAM6 con un valor Kd de no más de aproximadamente 1 x 10-10 M. En algunos aspectos, el conjugado se une a CEACAM6 con un valor IC50 de no más de aproximadamente 5 nM. En algunos aspectos, el valor IC50 es de aproximadamente 3.22 nM. En algunos aspectos, el conjugado se une a CEACAM6 con un valor IC50 de aproximadamente 20 pg/ml. CEACAM6, también conocido como antígeno de reacción cruzada inespecífica (NCA) o CD66c, es un antígeno de cáncer bien caracterizado. Comparte alta homología de secuencia con otros antígenos carcinoembrionarios humanos como CEACAM1, CEACAM7 y CEACAM8. Es una proteína de superficie celular ligada al glicosilfosfoinositol (GPI) pero sin dominio citoplásmico conocido. La expresión de CEACAM6 está significativamente elevada en tejidos de cáncer de mama, páncreas, ovario, pulmón y colon.
Formulaciones de composición
Las composiciones de la presente tecnología comprenden un conjugado de anticuerpo-ureasa substancialmente libre de ureasa y opcionalmente libre de solventes de HPLC no acuosos. En algunos aspectos, la composición es una composición farmacéuticamente aceptable. La composición puede comprender adicionalmente un portador, adyuvante o vehículo farmacéutico biocompatible. En algunos aspectos, la composición está en una forma sólida. En algunos aspectos, la composición está en una solución acuosa que comprende aproximadamente 0.1-10 mg/ml, aproximadamente 0.5-5 mg/ml, aproximadamente 1-5 mg/ml, o aproximadamente 1.5-2.0 mg/ml de conjugado. En algunos aspectos, la solución acuosa comprende Adicionalmente un excipiente tal como uno o más d histidina, sacarosa, y EDTA. En algunos aspectos, la solución acuosa comprende aproximadamente histidina 1-20 mM tal como 10 mM, aproximadamente 0.1-5 % p/vtal como 1 % de p/v de sacarosa, aproximadamente EDTA 0.1-0.5 mM tal como 0.2 mM. En algunos aspectos, la solución acuosa tiene un pH de aproximadamente 6.5 a 7, tal como aproximadamente 6.8. En algunos aspectos, la solución acuosa no contiene fosfato. En algunos aspectos, la composición es una forma sólida obtenida mediante liofilización de la solución acuosa. En algunos aspectos, la forma sólida no contiene fosfato.
La composición también puede incluir otras secuencias de nucleótidos, polipéptidos, fármacos u hormonas mezcladas con excipiente(s) u otros portadores farmacéuticamente aceptables. Las composiciones distintas de las composiciones farmacéuticas comprenden opcionalmente líquido, es decir, agua o un líquido a base de agua.
Los excipientes farmacéuticamente aceptables que se agregan a las composiciones farmacéuticas también son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica y están fácilmente disponibles. La elección del excipiente estará determinada en parte por el método particular utilizado para administrar el producto. De acuerdo con lo anterior, existe una amplia variedad de formulaciones adecuadas para uso en el contexto de la presente tecnología.
Las técnicas para la formulación y administración de composiciones farmacéuticas se pueden encontrar en Remington's Pharmaceutical Sciences, 19a edición, 19a edición, Williams & Wilkins, 1995, y son bien conocidas por aquellos expertos en la técnica. La elección del excipiente estará determinada en parte por el método particular utilizado para administrar el producto de acuerdo con la presente tecnología. De acuerdo con lo anterior, existe una amplia variedad de formulaciones adecuadas para uso en el contexto de la presente tecnología. Los siguientes métodos y excipientes son solo ejemplares y no son limitantes de ninguna manera.
Las composiciones farmacéuticas de la presente tecnología se pueden fabricar utilizando cualquier método convencional, por ejemplo, procesos de mezcla, disolución, granulación, levigación, emulsión, encapsulación, atrapamiento, hilado en fusión, secado por pulverización o liofilización. Sin embargo, un experto en la técnica determinará la formulación farmacéutica óptima dependiendo de la ruta de administración y la dosificación deseada. Dichas formulaciones pueden influir en el estado físico, estabilidad, tasa de liberación in vivo y tasa de depuración in vivo del agente administrado.
Las composiciones farmacéuticas se formulan para contener portadores farmacéuticamente aceptables adecuados y, opcionalmente, pueden comprender excipientes y auxiliares que facilitan el procesamiento de los compuestos activos en preparaciones que se pueden utilizar farmacéuticamente. La modalidad de administración determinará generalmente la naturaleza del portador. Por ejemplo, las formulaciones para administración parenteral pueden comprender soluciones acuosas de los compuestos activos en forma soluble en agua. Los portadores adecuados para la administración parenteral se pueden seleccionar entre solución salina, solución salina tamponada, dextrosa, agua y otras soluciones fisiológicamente compatibles. Los portadores preferidos para administración parenteral son tampones fisiológicamente compatibles tales como solución de Hank, soluciones de Ringer o solución salina tamponada fisiológicamente. Para administración a tejidos o celular, se utilizan penetrantes apropiados en la formulación para la barrera particular que se va a permear. Dichos penetrantes son generalmente conocidos en la técnica. Para preparaciones que comprenden proteínas, la formulación puede incluir materiales estabilizantes, tales como polioles (por ejemplo, sacarosa) y/o tensioactivos (por ejemplo, tensioactivos no iónicos) y similares.
Alternativamente, las formulaciones para uso parenteral pueden comprender suspensiones de los compuestos activos preparadas como suspensiones de inyección aceitosas apropiadas. Los solventes o vehículos lipófilos adecuados incluyen aceites grasos, tales como aceite de sésamo, y ésteres de ácidos grasos sintéticos, tales como oleato de etilo o triglicéridos, o liposomas. Las suspensiones de inyección acuosas pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión, como carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol o dextrano. Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizadores o agentes adecuados que aumentan la solubilidad de los compuestos para permitir la preparación de soluciones altamente concentradas. También se pueden utilizar emulsiones, por ejemplo, dispersiones de aceite en agua y agua en aceite, opcionalmente estabilizadas por un agente emulsionante o dispersante (materiales de superficie activa; tensioactivos). Los liposomas, como se describió anteriormente, que contienen el agente activo también se pueden emplear para administración parenteral.
Alternativamente, las composiciones farmacéuticas que comprenden el agente en dosificaciones adecuadas para administración oral se pueden formular utilizando portadores farmacéuticamente aceptables bien conocidos en la técnica. Las preparaciones formuladas para administración oral pueden estar en forma de comprimidos, píldoras, cápsulas, sellos, pastillas, líquidos, geles, jarabes, pastas, suspensiones o polvos. Para ilustrar, se pueden obtener preparaciones farmacéuticas para uso oral al combinar los compuestos activos con un excipiente sólido, opcionalmente triturar la mezcla resultante y procesar la mezcla de gránulos, después de agregar auxiliares adecuados si se desea, para obtener comprimidos. Las formulaciones orales pueden emplear portadores líquidos de tipo similar a aquellos descritos para uso parenteral, por ejemplo, soluciones acuosas tamponadas, suspensiones y similares.
Estas preparaciones pueden contener uno o más excipientes, que incluyen, sin limitación: a) diluyentes tales como azúcares, que incluyen lactosa, dextrosa, sacarosa, manitol o sorbitol; b) aglutinantes tales como silicato de magnesio y aluminio, almidón de maíz, trigo, arroz, papa, etc.; c) materiales de celulosa tales como metilcelulosa, hidroxipropimetilcelulosa y carboximetilcelulosa de sodio, polivinilpirrolidona, gomas tales como goma arábiga y goma tragacanto, y proteínas tales como gelatina y colágeno; d) agentes disgregantes o solubilizantes tales como polivinilpirrolidona entrecruzada, almidones, agar, ácido algínico o una sal del mismo tal como alginato de sodio; o composiciones efervescentes; e) lubricantes tales como sílice, talco, ácido esteárico o su sal de magnesio o calcio, y polietilenglicol; f) aromatizantes y edulcorantes; g) colorantes o pigmentos, por ejemplo, para identificar el producto o para caracterizar la cantidad (dosificación) de agente activo; y h) otros ingredientes tales como conservantes, estabilizadores, agentes de hinchamiento, agentes emulsionantes, promotores de solución, sales para regular la presión osmótica y tampones.
La composición farmacéutica se puede proporcionar como una sal del agente activo, que se puede formar con muchos ácidos, que incluyen pero no se limitan a, clorhídrico, sulfúrico, acético, láctico, tartárico, málico, succínico, etc. Las sales tienden a ser más soluble en solventes acuosos u otros protónicos que son las formas de base libre correspondientes.
Las características del conjugado en si mismo y la formulación del conjugado pueden influir en el estado físico, estabilidad, tasa de liberación in vivo y tasa de depuración in vivo del conjugado administrado. Dicha información farmacocinética y farmacodinámica se puede recopilar mediante estudios preclínicos in vitro e in vivo, que luego se confirman en humanos durante el transcurso de los ensayos clínicos. Se puede obtener orientación para realizar ensayos clínicos en humanos basados en datos animales in vivo de una serie de fuentes, que incluyen, por ejemplo, http://www.clinicaltrials.gov. Por tanto, para cualquier compuesto utilizado en el método de la presente tecnología, se puede estimar inicialmente una dosis terapéuticamente eficaz en mamíferos, particularmente seres humanos, a partir de ensayos bioquímicos y/o basados en células. Luego, la dosificación se puede formular en modelos animales para lograr un rango de concentración circulante deseable que modula la actividad del conjugado. A medida que se realicen estudios en humanos, surgirá información adicional sobre los niveles de dosificación apropiados y duración del tratamiento para diversas enfermedades y afecciones.
La toxicidad y la eficacia terapéutica del conjugado se pueden determinar mediante procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo, para determinar la LD50 (la dosis letal para el 50 % de la población) y la ED50 (la dosis terapéuticamente efectiva en 50 % de la población).
Agentes activos adicionales
También se pueden incluir agentes activos adicionales en la composición de la presente tecnología. Se pueden utilizar agentes activos adicionales, por ejemplo, un agente antitumoral (un agente activo contra las células de proliferación), en la composición antes, al mismo tiempo o después de que las células se pongan en contacto con un primer agente activo. Por ejemplo, después de que la ureasa se ha dirigido a las células tumorales, puede tener la capacidad de modular o regular el entorno externo del tumor, por ejemplo, mediante cambios de pH. Los agentes activos, como los agentes antitumorales, que favorecen un entorno básico, serán entonces más eficaces.
En ciertos aspectos, se contempla el uso como agentes activos de sustratos que son capaces de ser procesados enzimáticamente por ureasa. En algunos aspectos, el agente activo es un sustrato que la ureasa puede utilizar para formar iones amonio, por ejemplo, urea.
Los agentes antitumorales ejemplares incluyen citocinas y otras fracciones, tales como interleucinas (por ejemplo, IL-2, IL-4, IL-6, IL-12 y similares), factor de crecimiento transformante beta, linfotoxina, factor de necrosis tumoral, interferones (por ejemplo, gamma-interferón), factores estimulantes de colonias (por ejemplo, GM-CSF, M-CSF y similares), factor de permeabilidad vascular, promotores de la respuesta inflamatoria de lectina (selectinas), tales como L-selectina, E-selectina, P-selectina y fracciones proteicas, tales como la proteína receptora C1q y NK. Los agentes antitumorales adecuados adicionales incluyen compuestos que inhiben la angiogénesis y por lo tanto inhiben la metástasis. Ejemplos de dichos agentes incluyen protamina medroxiprogesterona, polisulfato de pentosano, suramina, taxol, talidomida, angiostatina, interferón-alfa, inhibidores de metaloproteinasas, factor plaquetario 4, somatostatina, tromobospondina. Otros ejemplos representativos y no limitantes de agentes activos útiles de acuerdo con la presente tecnología incluyen vincristina, vinblastina, vindesina, busulfán, clorambucilo, espiroplatino, cisplatino, carboplatino, metotrexato, adriamicina, mitomicina, bleomicina, arabinósido de citosina, arabinosil adenina, mercaptopurina, mitotano, procarbazina, dactinomicina (antinomicina D), daunorrubicina, clorhidrato de doxorrubicina, taxol, plicamicina, aminoglutetimida, estramustina, flutamida, leuprolida, acetato de megestrol, tamoxifeno, testolactona, trilostano, amsacrina (m-AMSA), asparaginasa (L- asparaginasa), etopósido, hemoderivados tales como hematoporfirinas o derivados de los anteriores. Otros ejemplos de agentes activos incluyen material genético tal como ácidos nucleicos, ARN y ADN de origen natural o sintético, que incluyen ARN y ADN recombinantes. El ADN que codifica ciertas proteínas se puede utilizar en el tratamiento de muchos tipos diferentes de enfermedades. Por ejemplo, pueden proporcionarse genes del factor de necrosis tumoral o de la interleucina-2 para tratar cánceres avanzados; se pueden proporcionar genes de timidina quinasa para tratar cáncer de ovario o tumores cerebrales; y se pueden proporcionar genes de interleucina-2 para tratar neuroblastoma, melanoma maligno o cáncer de riñón. Los agentes activos adicionales contemplados para uso en la presente tecnología se describen en la Patente de Estados Unidos No. 6,261,537. Los agentes antitumorales y los cribados para detectar dichos agentes se revisan en Monga, M. and Sausville, E.A. (2002) Leukemia 16(4): 520-6.
En algunos aspectos, el agente activo es un compuesto antitumoral débilmente básico cuya eficacia se reduce por un gradiente de pH intracelular más alto/extracelular más bajo en un tumor sólido. Ejemplos de compuestos antitumorales débilmente básicos incluyen doxorrubicina, daunorrubicina, mitoxantrona, epirrubicina, mitomicina, bleomicina, alcaloides vinca, tales como vinblastina y vincristina, agentes alquilantes, tales como ciclofosfamida y clorhidrato de mecloretamina, y derivados de purina y pirimidna antrineoplásticos.
En algunos aspectos, la composición incluye ureasa y carece sustancialmente de cualesquier citoquinas, por ejemplo, factor de necrosis tumoral y/o interferones. En este aspecto, la ureasa sola o con agentes activos distintos de las citoquinas, en combinación con agentes antitumorales de molécula pequeña, es eficaz para inhibir el crecimiento de células cancerosas. Por tanto, en este aspecto, la composición puede actuar o no en concierto con citocinas endógenas o nativas presentes en el sujeto que se va a tratar, pero la composición que se administra no contiene citocinas exógenas adicionales.
En algunos aspectos, el agente activo adicional no es pemetrexed y/o carboplatino. En algunos aspectos, el agente activo adicional no es un antimetabolito de folato y/o un agente de platino.
Métodos de suministro y administración
Se puede administrar la composición de conjugado de anticuerpo-ureasa a las células cancerosas mediante varios métodos conocidos en la técnica. En aplicaciones terapéuticas, la composición se administra a un paciente que tiene células cancerosas en una cantidad suficiente para inhibir el crecimiento de células cancerosas. Las composiciones farmacéuticas se pueden exponer a las células cancerosas mediante la administración por varias rutas, que incluyen, sin limitación, parenteral, enteral, transepitelial, transmucosa, transdérmica y/o quirúrgica.
Las modalidades de administración parenteral incluyen aquellas en las que la composición se administra, por ejemplo, mediante inyecciones en bolo con aguja intravenosas, intraarteriales, intraperitoneales, intramedulares, intramusculares, intraarticulares, intratecales e intraventriculares, subcutáneas, intragonadales o intratumorales, o continuas prolongadas, perfusiones o microinfusiones pulsátiles o planificadas utilizando la tecnología de bomba adecuada. Las modalidades de administración enteral incluyen, por ejemplo, administración oral (que incluyen bucal y sublingual) y rectal. Las modalidades de administración transepitelial incluyen, por ejemplo, administración transmucosa y administración transdérmica. La administración transmucosa incluye, por ejemplo, administración entérica, así como administración nasal, por inhalación y pulmonar profunda, administración vaginal y administración rectal. La administración transdérmica incluye modalidades transdérmicas o transcutáneas pasivas o activas, que incluyen, por ejemplo, parches y dispositivos de iontoforesis, así como la aplicación tópica de pastas, pomadas o ungüentos. Las técnicas quirúrgicas incluyen la implantación de composiciones de depósito (reservorio), bombas osmóticas y similares.
Se pueden administrar administraciones únicas o múltiples del agente activo dependiendo de la dosificación y frecuencia según lo requiera y tolere el sujeto. En cualquier caso, la composición debería proporcionar una cantidad suficiente del agente activo para tratar eficazmente al sujeto.
En algunos aspectos, la presente divulgación contempla el uso de vesículas tales como liposomas y/o nanocápsulas como entidades químicas para el suministro de la composición farmacéutica que comprende un conjugado anticuerpoureasa a células cancerosas. Dichas formulaciones pueden ser preferidas para la introducción de formulaciones farmacéuticamente aceptables de los polipéptidos, productos farmacéuticos y/o anticuerpos divulgados en el presente documento. Aquellos expertos en la técnica conocen generalmente la formación y el uso de liposomas. (Véase, por ejemplo, Backer, M.V., et al. (2002) Bioconjug Chem 13(3): 462-7). En un aspecto preferido, la composición divulgada puede quedar atrapada en un liposoma.
Las nanocápsulas generalmente pueden atrapar compuestos de una manera estable y reproducible (Whelan, J. (2001) Drug Discov Today 6(23): 1183-84). Para evitar los efectos secundarios debidos a la sobrecarga polimérica intracelular, dichas partículas ultrafinas (de un tamaño de alrededor de 0.1 pm) se pueden diseñar utilizando polímeros capaces de degradarse in vivo. Las nanopartículas de poliisobutilcianoacrilato biodegradables que cumplen estos requisitos se contemplan para uso en la presente tecnología, y dichas partículas se pueden fabricar fácilmente, como se describe en, por ejemplo, Lambert, G., et al. (2001) Int J Pharm 214(1-2): 13-6. Los métodos para preparar nanopartículas de polialquil-ciano-acrilato que contienen sustancias biológicamente activas y su uso se describen en las Patentes de Estados Unidos Nos. 4,329,332, 4,489,055 y 4,913,908. Las nanocápsulas están disponibles comercialmente de fuentes tales como Capsulution, Inc. (www.capsulution.com).
Las composiciones farmacéuticas que contienen nanocápsulas para el suministro de composiciones se describen en las Patentes de Estados Unidos Nos. 5,500,224, 5,620,708 y 6,514,481. La Patente de Estados Unidos No. 5,500,224 describe una composición farmacéutica en forma de suspensión coloidal de nanocápsulas que comprende una fase aceitosa constituida esencialmente por un aceite que contiene disuelto en la misma un tensioactivo, y suspendidas en ella una pluralidad de nanocápsulas de diámetro inferior a 500 nanómetros. La Patente de Estados Unidos 5,620,708 describe composiciones y métodos para la administración de fármacos y otros agentes activos. Las composiciones comprenden una partícula portadora de agente activo unida a una fracción de unión que se une específicamente a una molécula diana presente sobre la superficie de un enterocito de mamífero. La fracción de unión se une a la molécula diana con una afinidad o avidez de unión suficiente para iniciar la endocitosis o fagocitosis del portador del agente activo en partículas de modo que el portador sea absorbido por el enterocito. El agente activo luego se liberará del portador a la circulación sistémica del anfitrión. De esta forma, se puede evitar la degradación de fármacos sensibles a degradación, tales como polipéptidos, en los intestinos mientras aumenta la absorción de proteínas y polipéptidos del tracto intestinal. Alternativamente, la presente tecnología contempla la liberación del agente activo en el entorno que rodea a la célula diana. Por ejemplo, en un aspecto, los conjugados de anticuerpo-ureasa se liberan de la nanocápsula después de la unión de la fracción diana a la célula diana, de tal manera que la ureasa se libera en el microentorno que rodea la célula diana, por ejemplo, una célula tumoral. Las Patentes de Estados Unidos Nos.
6,379,683 y 6,303,150 describen métodos para preparar nanocápsulas y el uso de las mismas.
La composición farmacéutica utilizada se administra a un sujeto en una cantidad eficaz. Generalmente, una cantidad eficaz es una cantidad eficaz para (1) reducir los síntomas de la enfermedad que se busca tratar; o (2) inducir un cambio farmacológico relevante para tratar la enfermedad que se busca tratar. Para el cáncer, una cantidad eficaz puede incluir una cantidad eficaz para: reducir el tamaño de un tumor; retardar el crecimiento de un tumor; prevenir o inhibir las metástasis; o aumentar la esperanza de vida del sujeto afectado, el contacto incluye agregar a las células un conjugado que comprende una fracción diana y un primer péptido formador de espirales caracterizado por una carga seleccionada y la capacidad de interactuar con un segundo péptido formador de espirales cargado opuestamente para formar un heterodímero de espiral en espiral helicoidal estable. Posteriormente, se agrega un liposoma a las células. El liposoma comprende una superficie exterior y un compartimento interno; un agente activo, por ejemplo, ureasa, ubicada dentro del compartimento interno del liposoma; y una pluralidad de segundos péptidos, en los que cada segundo péptido está conectado a la superficie exterior del liposoma.
En algunos aspectos, el contacto incluye agregar liposomas a las células, en las que los liposomas tienen el agente activo, por ejemplo, conjugados de anticuerpo-ureasa, en forma atrapada, y las superficies externas del liposoma incluyen una fracción diana celular eficaz para unirse específicamente a una superficie diana, y un recubrimiento de polímero hidrófilo eficaz para proteger la fracción diana de la interacción con la superficie diana. El recubrimiento de polímero hidrófilo puede estar formado por cadenas de polímero que están ligadas covalentemente a los componentes lipídicos de la superficie en los liposomas a través de ligamientos liberables. En algunos aspectos, se agrega un agente de liberación a las células tumorales en una cantidad eficaz para provocar la liberación de una porción sustancial de los enlaces en los liposomas agregados, exponiendo de esta manera la fracción diana a la superficie diana. Los ligamientos liberables pueden ser ligamientos químicos reducibles tales como ligamientos de disulfuro, éster y péptido.
En algunos aspectos, se contempla un método de terapia basada en liposomas para un sujeto mamífero. El método incluye administrar la administración sistémica al sujeto, por ejemplo, administración intravenosa, de liposomas que tienen una fracción diana unida a la superficie y un recubrimiento de polímero hidrófilo. El recubrimiento de polímero hidrófilo, compuesto por cadenas de polímero unidas de forma liberable, es eficaz para proteger la fracción diana de la interacción con su diana. Los liposomas administrados se dejan circular sistémicamente hasta que se logra una biodistribución deseada de los liposomas. Se administra al sujeto un agente de liberación en una cantidad eficaz para provocar la división de una porción sustancial, por ejemplo, más de aproximadamente el 50 %, preferiblemente más de aproximadamente el 70 % y más preferiblemente más de aproximadamente el 90 % de los ligamientos liberables en los liposomas administrados. La fracción diana se expone tras la liberación de la cadena de polímero hidrófilo para la interacción con su diana.
En algunos aspectos, los liposomas se utilizan para el tratamiento de un tumor sólido. Los liposomas incluyen un conjugado de anticuerpo-ureasa y, opcionalmente, un agente activo adicional, por ejemplo, un fármaco antitumoral, en forma atrapada y se dirigen a la región tumoral mediante una fracción diana eficaz para unirse específicamente a un antígeno específico del tumor. En un método ejemplar, los liposomas se dirigen a las células endoteliales vasculares de los tumores al incluir un ligando VEGF en los liposomas, para unión selectiva a los receptores Flk-1,2 expresados sobre las células endoteliales tumorales en proliferación (Niederman, T.M., et al. (2002) Proc Natl Aced Sci 99(10): 7009-14).
En algunos aspectos, los liposomas tienen un tamaño entre aproximadamente 30-400 nm. Se ha demostrado que los liposomas en este rango de tamaño pueden ingresar a los tumores a través de “espacios” presentes en el revestimiento de las células endoteliales de la vasculatura del tumor (Maruyama, K, et al. (1999) Adv Drug Deliv Rev 40(1-2): 89­ 102).
Después de la administración de los liposomas, por ejemplo, la administración intravenosa, y después de que haya transcurrido el tiempo suficiente para permitir que los liposomas se distribuyan a través del sujeto y se unan al tumor, se administra al sujeto un agente de liberación para liberar el recubrimiento de superficie hidrófila de los liposomas. La liberación del recubrimiento de superficie es eficaz para exponer la fracción diana para permitir la unión de los liposomas a las células diana. En un aspecto, el recubrimiento de superficie hidrófila se une a los liposomas mediante ligamientos sensibles al pH. Los ligamientos se liberan después de que los liposomas se unen al tumor.
Los liposomas en cualquiera de los aspectos descritos anteriormente pueden incluir, opcionalmente, uno o más fármacos antitumorales atrapados o agentes de formación de imágenes o ambos. Los liposomas se pueden agregar y dejar que se distribuyan, después de lo cual se puede administrar un agente de liberación para liberar el recubrimiento de superficie hidrófila para exponer la fracción diana unida e iniciar la unión. Los liposomas se pueden preparar y administrar como se describe en la Patente de Estados Unidos No. 6,043,094.
En la presente divulgación se pueden emplear agentes de administración adicionales tales como pequeñas vesículas unilaminares (SUV), como se describe en la patente de Estados Unidos No. 6,180.114.
Un experto en la materia entenderá que hay algunas regiones que no están muy vascularizadas o que están protegidas por células unidas por uniones estrechas y/o mecanismos de transporte activo que reducen o previenen la entrada de macromoléculas presentes en el torrente sanguíneo. Por tanto, por ejemplo, la administración sistémica de productos terapéuticos para tratar gliomas u otros cánceres cerebrales puede verse limitada por la barrera hematoencefálica que resiste la entrada de macromoléculas en el espacio subaracnoideo. En estos tipos de tumores, la composición terapéutica se puede administrar preferiblemente directamente al sitio del tumor. Por lo tanto, por ejemplo, los tumores cerebrales se pueden tratar al administrar la composición terapéutica directamente en el sitio del tumor, por ejemplo, a través de una inyección en bolo, microinfusión o un catéter implantado quirúrgicamente.
Dosificación
Para el método de la presente divulgación, se puede utilizar cualquier régimen de administración eficaz que regule el tiempo y la secuencia de dosis. Los niveles de dosificación ejemplares para un sujeto humano dependerán del modo de administración, extensión (tamaño y distribución) del tumor, tamaño del paciente y capacidad de respuesta del cáncer al tratamiento con ureasa.
Cuando se administra una composición de conjugado de anticuerpo-ureasa, tal como se inyecta directamente en un tumor, una dosis ejemplar es aproximadamente 0.1 a 100010 pg/kg de peso corporal, tal como aproximadamente 0.2 a 5 pg/kg, o aproximadamente 0.5 a 2 pg/kg. La colocación de la aguja de inyección puede ser guiada por técnicas de guía de imagen convencionales, por ejemplo, fluoroscopia, de modo que el médico pueda ver la posición de la aguja con respecto al tejido diana. Dichas herramientas de orientación pueden incluir ultrasonido, fluoroscopia, CT o MRI.
En algunos aspectos, se puede monitorizar la eficacia o distribución de la dosis administrada de conjugados de anticuerpo-ureasa, durante o después de la administración del conjugado de anticuerpo-ureasa en el tumor, al monitorizar el tejido tumoral mediante una herramienta capaz de detectar cambios en pH dentro de la región de tejido canceroso del sujeto. Dichas herramientas pueden incluir una sonda de pH que se puede insertar directamente en el tumor, o una herramienta de visualización, tal como formación de imágenes por resonancia magnética (MRI), tomografía computarizada (Ct) o fluoroscopia. El interrogatorio por MRI se puede llevar a cabo en ausencia de agentes de formación de imagen adicionales, basándose simplemente en las diferencias en las propiedades magnéticas del tejido en función del pH. La tomografía computarizada o la formación de imagen fluoroscópica pueden requerir un agente de formación de imagen adicional sensible al pH cuya opacidad se ve afectada por el pH del medio de tejido. Dichos agentes son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica.
Antes de cualquier administración de conjugados de anticuerpo-ureasa, el tejido tumoral se puede visualizar por su pH más bajo en relación con el tejido normal circundante. Por tanto, el tejido normal puede tener un pH normal de aproximadamente 7.2, mientras que el tejido tumoral puede ser de 0.1 a 0.4 o más unidades de pH menor. Es decir, antes de inyectar cualquier conjugado de anticuerpo-ureasa, la extensión del tejido tumoral puede definirse por su pH más bajo. Después de la administración de ureasa, el pH de la región tumoral que tiene ureasa comenzará a aumentar y se puede identificar al comparar las imágenes resultantes con las imágenes previas a la dosificación anteriores.
Al interrogar el tejido de esta manera, se puede monitorizar el grado de cambio de pH y la extensión del tejido afectado. En base a este interrogatorio, el médico puede administrar una composición adicional al sitio y/o puede administrar la composición en áreas adicionales dentro del sitio del tumor. Este procedimiento se puede repetir hasta que se haya logrado un grado deseado de cambios de pH, por ejemplo, de 0.2 a 0.4 unidades de pH, en toda la región del tumor sólido.
La dosificación tal como mediante inyección directa se puede repetir a intervalos adecuados, por ejemplo, cada semana o dos veces por semana, hasta que se observe un criterio de valoración deseado, preferiblemente una regresión sustancial o completa de la masa tumoral. Se puede monitorizar la eficacia del tratamiento, como anteriormente, al visualizar cambios en el pH del tejido tratado durante el curso del tratamiento. Por lo tanto, antes de cada inyección adicional, se puede visualizar el pH del tejido para determinar la presente extensión del tumor, después de lo cual se pueden utilizar cambios en el pH del tejido para monitorizar la administración de la nueva dosis de composición de anticuerpo-ureasa al tejido.
Cuando la composición de anticuerpo-ureasa se administra por vía parenteral mediante un método distinto de la inyección directa, una dosis ejemplar de la composición de anticuerpo-ureasa es 100-100,000 unidades internacionales/kg de actividad ureasa/kg de peso corporal del sujeto. Como se indica en el presente documento, la composición de anticuerpo-ureasa en este método incluye un anticuerpo para dirigir la ureasa a las células cancerosas, por ejemplo, el sitio de un tumor sólido, o para secuestrar la ureasa, por ejemplo, en forma liposomal, selectivamente en el sitio del tumor.
Se pueden utilizar técnicas de formación de imágenes que son sensibles a los cambios en el pH del tejido para controlar la eficacia de la dosis administrada. Dado que dicha diana puede llevar varias horas o más, el método puede implicar la monitorización del pH del tumor, como se indicó anteriormente, antes de la inyección de la composición de anticuerpo-ureasa y varias horas después de dosificación, por ejemplo, 12-24 horas, para confirmar que se ha dosificado adecuadamente el sitio del tumor, como lo demuestra el aumento del pH de la región tumoral. Dependiendo de los resultados de esta interrogación, el método puede dictar una dosificación adicional hasta que se observe un aumento deseado en el pH, por ejemplo, 0.2-0,4 unidades de pH. Una vez que se establece esta dosis, el paciente se puede tratar con una dosis similar de la composición de ureasa de forma regular, por ejemplo, una o dos veces por semana, hasta que se logre un cambio en el tamaño o condición del tumor.
El régimen de dosificación final será determinado por el médico tratante en vista de la buena práctica médica, considerando varios factores que modifican la acción de los fármacos, por ejemplo, la actividad específica del agente, gravedad del estado de enfermedad, capacidad de respuesta del paciente, edad, condición, peso corporal, sexo y dieta del paciente, gravedad de cualquier infección y similares. Los factores adicionales que pueden tenerse en cuenta incluyen el tiempo y la frecuencia de administración, las combinaciones de fármacos, la sensibilidad a las reacciones y la tolerancia/respuesta a la terapia. El médico experto realiza de forma rutinaria un refinamiento adicional de la dosificación apropiada para el tratamiento que implica cualquiera de las formulaciones mencionadas en el presente documento, especialmente a la luz de la información de dosificación y los ensayos divulgados, así como los datos farmacocinéticos observados en los ensayos clínicos. Las dosificaciones apropiadas se pueden determinar a través del uso de ensayos establecidos para determinar la concentración del agente en un fluido corporal u otra muestra junto con los datos de respuesta a dosis.
La frecuencia de dosificación dependerá de los parámetros farmacocinéticos del agente y de la ruta de administración. La dosificación y administración se ajustan para proporcionar niveles suficientes del agente activo o para mantener el efecto deseado. De acuerdo con lo anterior, las composiciones farmacéuticas se pueden administrar en una sola dosis, múltiples dosis discretas, infusión continua, depósitos de liberación sostenida o combinaciones de los mismos, según se requiera para mantener el nivel mínimo deseado del agente.
Las composiciones farmacéuticas de acción corta (es decir, semivida corta) se pueden administrar una vez al día o más de una vez al día (por ejemplo, dos, tres o cuatro veces al día). Las composiciones farmacéuticas de acción prolongada se pueden administrar cada 3 a 4 días, cada semana o una vez cada dos semanas. Bombas, tales como bombas subcutáneas, intraperitoneales o subdurales para infusión continua.
Se pueden preparar composiciones que comprenden el conjugado en un portador farmacéuticamente aceptable, colocar en un recipiente apropiado y etiquetarse para el tratamiento de una afección indicada. Las condiciones indicadas en la etiqueta pueden incluir, pero no se limitan a, el tratamiento de varios tipos de cáncer. También se contemplan los kits, como se describe a continuación, en los que el kit comprende una forma de dosificación de una composición farmacéutica y un prospecto que contiene instrucciones para el uso de la composición en el tratamiento de una afección médica.
Generalmente, las composiciones conjugadas se administran a un sujeto en una cantidad eficaz. Generalmente, una cantidad eficaz es una cantidad eficaz para (1) reducir los síntomas de la enfermedad que se busca tratar; o (2) inducir un cambio farmacológico relevante para tratar la enfermedad que se busca tratar. Para el cáncer, una cantidad eficaz puede incluir una cantidad eficaz para: reducir el tamaño de un tumor; retardar el crecimiento de un tumor; prevenir o inhibir las metástasis; o aumentar la esperanza de vida del sujeto afectado.
Método de tratamiento (no abarcado por la materia objeto reivindicada)
La presente divulgación proporciona un método para tratar el cáncer en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición proporcionada en el presente documento, tratando de esta manera el cáncer en el sujeto. Los cánceres adecuados para el tratamiento mediante los métodos del presente dic incluyen generalmente carcinomas, leucemias, linfomas y sarcomas. Los carcinomas pueden ser de ano, tracto biliar, vejiga, mama, colon, recto, pulmón, orofaringe, hipofaringe, esófago, estómago, páncreas, hígado, riñón, vesícula biliar y conductos biliares, intestino delgado, tracto urinario, ovario, colon, carcinoma de pulmón de células no microcíticas, tracto genital, glándulas endocrinas, tiroides y piel. Otros cánceres adecuados incluyen tumores carcinoides, tumores del estroma gastrointestinal, tumores de cabeza y cuello, tumores primarios, hemangiomas, melanomas, mesotelioma maligno, mieloma múltiple y tumores del cerebro, nervios, ojos y meninges.
En algunos aspectos, los cánceres que se van a tratar forman tumores sólidos, tales como carcinomas, sarcomas, melanomas y linfomas. En algunos aspectos, el cáncer es uno o más de carcinoma de pulmón de células no microcíticas, cáncer de mama, páncreas, ovario, pulmón, colon o una combinación de los mismos. En algunos aspectos, el cáncer es un carcinoma de pulmón de células no microcíticas. En algunos aspectos, el sujeto es un humano.
Se puede estimar una dosis terapéuticamente eficaz mediante métodos bien conocidos en la técnica. Los modelos de animales de cáncer, tales como ratones inmunocomprometidos con tumores de murino o ratones inmunodeprimidos (por ejemplo, ratones sin pelo) con xenoinjertos de tumores humanos, son bien conocidos en la técnica y se describen ampliamente en muchas referencias. Dicha información se utiliza en combinación con estudios de seguridad en ratas, perros y/o primates no humanos para determinar dosis iniciales seguras y potencialmente útiles en humanos. La información adicional para estimar la dosis de los organismos puede provenir de estudios en cáncer humano real, informes de ensayos clínicos.
En algunos aspectos, el método de tratamiento del cáncer pretende abarcar la curación, así como la mejora de al menos un síntoma del cáncer. Los pacientes con cáncer son tratados si el paciente se cura del cáncer, el cáncer entra en remisión, la supervivencia se prolonga de manera estadísticamente significativa, el tiempo hasta la progresión del tumor aumenta de manera estadísticamente significativa, hay una reducción en la carga tumoral linfocítica o hematopoyética en base a los criterios estándar establecidos para cada tipo de malignidad linfocítica o hematopoyética, o se ha reducido la carga de tumores sólidos según lo definido por los criterios de evaluación de respuesta en tumores sólidos (RECIST 1.0 o RECIST versión 1.1, Therasse et al. J Natl. Cancer Inst. 92(3):205-216, 2000 and Eisenhauer et al. Eur. J. Cancer 45:228-247, 2009). Como se utiliza en el presente documento, “remisión” se refiere a la ausencia de células cancerosas en crecimiento en el paciente que previamente tiene evidencia de cáncer. Por tanto, un paciente con cáncer en remisión se cura de su cáncer o el cáncer está presente pero no es fácilmente detectable. Por tanto, el cáncer puede estar en remisión cuando el tumor no se agranda o se metastatiza. La remisión completa, como se utiliza en el presente documento, es la ausencia de enfermedad según lo indicado por métodos de diagnóstico, tales como formación de imágenes, tales como rayos X, MRI, CT y PET, o biopsia de sangre o médula ósea. Cuando un paciente con cáncer entra en remisión, esto puede ir seguido de una recaída, cuando el cáncer reaparece.
En algunos aspectos, el tratamiento no se combina con pemetrexed y/o carboplatino. En algunos aspectos, el tratamiento no se combina con un compuesto antimetabolito de folato y/o un agente de platino.
Kits
En algunos aspectos, esta presente tecnología proporciona kits para inhibir el crecimiento de células tumorales utilizando los métodos descritos en el presente documento. Los kits incluyen un recipiente que contiene uno o más agentes activos. Los kits pueden incluir adicionalmente cualquiera de los otros componentes descritos en el presente documento para la práctica de los métodos de la presente tecnología.
Los kits pueden incluir opcionalmente materiales instructivos que contienen direcciones (es decir, protocolos) que divulgan el uso de agentes activos para inhibir el crecimiento de células tumorales. Por tanto, en un aspecto, el kit incluye una composición farmacéutica que contiene un agente activo, preferiblemente una enzima ureasa, y materiales de instrucción que enseñan la administración de la composición a un sujeto, para el tratamiento de un cáncer en el sujeto. En un aspecto, el material instructivo enseña cómo administrar la composición de ureasa a un sujeto en una cantidad que depende del tamaño, del tumor y entre 0.1 y 100 unidades internacionales de actividad ureasa por mm3 de tumor, cuando la composición se administra mediante inyección directa en el tumor, y en una cantidad entre 100­ 100,000 unidades internacionales/kg de unidades internacionales de actividad ureasa/kg de peso corporal del sujeto, cuando la composición se administra por vía parenteral al sujeto de otra manera que no sea por inyección directa en el tumor.
En otro aspecto, el material instructivo enseña a administrar la composición de ureasa a un sujeto que también está recibiendo un compuesto antitumoral débilmente básico cuya eficacia se reduce por un gradiente de pH intracelular/extracelular más alto en un tumor sólido, en una cantidad de ureasa eficaz para reducir o revertir el gradiente de pH intracelular más alto/extracelular más bajo en un tumor sólido.
Alternativamente, el material instructivo enseña a administrar la composición de ureasa a un sujeto que contiene, o se sospecha que contiene, un tumor sólido, bajo condiciones efectivas para localizar la ureasa en un tumor sólido en el sujeto, al interrogar al sujeto con una herramienta de diagnóstico capaz de detectar cambios en el pH extracelular en el tejido de un sujeto e identificar una región de tejido dentro del sujeto que muestra una elevación en el pH extracelular después de dicha administración.
Si bien los materiales de instrucción comprenden normalmente materiales escritos o impresos, no se limitan a ellos. Cualquier medio capaz de almacenar dichas instrucciones y comunicarlas a un usuario final está contemplado por la presente tecnología. Dichos medios incluyen, pero no se limitan a, medios de almacenamiento electrónicos (por ejemplo, discos magnéticos, cintas, cartuchos, chips), medios ópticos (por ejemplo, CD ROM) y similares. Dichos medios pueden incluir direcciones a sitios de Internet que brindan dichos materiales instructivos.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos se dan con el propósito de ilustrar varios aspectos de la divulgación.
Ejemplo 1: L-DOS47: un conjugado de anticuerpo-ureasa dirigido a tumores que expresan CEACAM6
El microentorno de los tumores es a menudo ácido en relación con el tejido normal. La acumulación de lactato de la glucólisis anaeróbica en respuesta a la hipoxia regional de la vasculatura aberrante parece ser la causa directa (1,2). Sin embargo, las células cancerosas continúan metabolizando la glucosa de forma anaeróbica incluso en presencia de oxígeno (3). Esto sugiere que el fenotipo metabólico convertido y el entorno ácido resultante pueden conferir una ventaja de crecimiento a las células cancerosas (4).
Se ha mostrado que la ureasa de judía gigante, que convierte la urea en amoniaco y eleva el pH de la solución, es citotóxica para las células cancerosas (8). La inyección intratumoral de la enzima en ratones que llevan xenoinjertos de pulmón y mama humanos también retrasó significativamente el crecimiento del tumor (8). Sin embargo, el suministro intratumoral de agentes terapéuticos contra el cáncer en un entorno clínico es una práctica difícil. En pacientes con enfermedad metastásica avanzada y significativa, la inyección intratumoral no es una opción viable. Un enfoque más práctico es suministrar la enzima mediante inyección intravenosa. Sin embargo, la ureasa carece de un dominio de direccionamiento y la administración sistémica de la enzima puede resultar en toxicidad fuera de la diana. Se utiliza un conjugado de anticuerpo-enzima que se dirige específicamente a los tumores para suministrar ureasa a los sitios del cáncer. Este anticuerpo utilizado en el conjugado reconoce CEACAM6 específicamente en pacientes con cáncer de pulmón de células no microcíticas.
Se eligió un fragmento de anticuerpo de camélido de dominio único (AFAIKL2, SEQ ID NO. 1) que reconoce CEACAM6 sobre células de adenocarcinoma de pulmón (17) para conjugarlo con ureasa de judía gigante (DOS47) para generar un producto terapéutico contra el cáncer. La presente tecnología describe algunos de los estudios preclínicos pertinentes que se realizaron sobre este conjugado anti-CEACAM6-ureasa (L-DOS47), que actualmente se encuentra en un estudio clínico de fase I en humanos.
La actividad antitumoral de la ureasa de judía gigante se combinó con la especificidad del anticuerpo de dominio único anti-CEACAM6 en forma de conjugado de anticuerpo-ureasa (L-DOS47). L-DOS47 se unió específicamente a estirpes celulares cancerosas que expresan CEACAM6 y ejerció potentes efectos citotóxicos. El ensayo de unión competitiva mostró que la afinidad de unión de L-DOS47 era aproximadamente 500 veces más fuerte que la del anticuerpo de dominio único nativo debido al aumento de la avidez. La citotoxicidad de L-DOS47 depende de la disponibilidad de urea in situ y de la susceptibilidad de las células diana a la toxicidad por amoniaco. Las células BxPC-3 se protegieron de los efectos de L-DOS47 al silenciar el gen CEACAM6, mientras que la sobreexpresión de CEACAM6 hizo que las células H23 transfectadas fueran susceptibles a la citotoxicidad de L-DOS47. La tinción inmunoquímica de tejidos humanos normales y cancerosos mostró que el L-DOS47 se unía preferentemente al adenocarcinoma de pulmón, así como al adenocarcinoma de colon y páncreas con tinción positiva pero más débil. Un estudio de metástasis de células A549 de adenocarcinoma de pulmón en ratones también mostró que L-DOS47 era eficaz para reducir el recuento de células cancerosas en el pulmón a una concentración de 10 pg/ml.
Materiales. Se obtuvo ureasa de judía gigante (Canavalia ensiformis) de BioVectra Inc. (PEI, Canadá) y se purificó adicionalmente mediante precipitación ácida, fraccionamiento con alcohol y cromatografía de intercambio iónico. La pureza de la enzima fue > 97 % según se determinó mediante SDS-PAGE, HPLC y espectrometría de masas. Una unidad de ureasa se define como la producción de 1 pmol/minuto de amoniaco a 25 °C y pH 7.6.
Se utilizó una biblioteca de fagos derivada del repertorio de anticuerpos de cadena pesada de una llama para identificar un anticuerpo de dominio único (sdAb) mediante absorción contra el adenocarcinoma de pulmón de células no microcíticas A549. El sdAb se denominó AFAI (17). La secuencia de genes de AFAI se optimizó para propósitos de conjugación y se renombró como AFAIKL2. A continuación, se clonó el anticuerpo AFAIKL2 y se expresó en el sistema pT7-7 de E. coli BL21 (DE3). El anticuerpo se purificó a partir de los cuerpos de inclusión utilizando cromatografía de intercambio iónico. La conjugación del anticuerpo a la ureasa se realizó utilizando el entrecruzador heterobifuncional N-succinimidil(4-yodoacetil)amino-benzoato (SIAB). El anticuerpo AFAIKL2 se activó primero con la porción éster de NHS del ligador SIAB a través de grupos de amina primaria. El anticuerpo activado se unió a la ureasa a través del grupo yodoacetilo del entrecruzador a los grupos sulfhidrilo libres presentes sobre la enzima. Se controló una relación de conjugación diana (1:6 a 1:10, relación de ureasa a anticuerpo) al mezclar la ureasa de alta pureza y el anticuerpo activado en una relación de masa de 2:1. El conjugado anticuerpo-ureasa se purificó mediante ultrafiltración.
Se adquirieron urea, tripsina (grado para cultivo de tejidos), etosulfato de fenazina (PES), nitroprusiato de sodio, solución de hipoclorito de sodio, fenol, NaCl, KH2PO4 , MgSO4 , NaHCO3 y glutaraldehído de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). Se adquirieron 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolio (MTS) y tripsina (para uso en la fragmentación de péptidos y análisis de espectrometría de masas), de Promega Corp. (Madison, WI). Se adquirieron peróxido de hidrógeno (30 %), SIAB, KCl, D-glucosa, HCl, Na2HPO4 y NaH2PO4 de Fisher Scientific (Ottawa, ON). Se adquirió la fracción V de albúmina de suero bovino (BSA) de Roche (Indianapolis, IN). Se adquirió cloruro de amonio (0.100 M) de Ricca Chemical (Arlington, TX). El conjugado anti-AFAIKL2-peroxidasa fue producido por Rockland Immunochemicals (Gilbertsville, PA). Se obtuvieron medio de cultivo celular (RpMI), suero fetal bovino y antibióticos de Life Technologies (Burlington, ON). Los ratones sin pelo CrTac:NCr-Foxn1nu hembra fueron suministrado por Taconic (Hudson, NY). El tampón Krebs Ringer modificado (KRB) utilizado en los experimentos contenía NaCl (98.3 mM), KCl (4,73 mM), KH2PO4 O .19 mM), MgSO4(1.19 mM), D-glucosa (11.7 mM), Na2HPO4(11.1 mM), y NaH2PO4(2.77 mM), pH 7.2.
Ensayo de indofenol
La cantidad de amoniaco producida por la reacción enzimática de la ureasa se determinó utilizando un ensayo de indofenol modificado (18). En resumen, la Solución A se preparó recientemente al disolver 165 mg de fenol y 132 mg de gránulos de NaOH en 10 ml de agua, seguido al agregar 66 pl de solución de nitroprusiato de sodio (10 mg/ml). La solución B se preparó al agregar 40 pl de hipoclorito de sodio a 5 ml de agua. Las soluciones de muestra (30 pl cada una) del ensayo de unión de células completas (véase a continuación) se transfirieron a una nueva placa de 96 pozos que contenía 50 pl/pozo de NaOH 5 N: H2O (3.3:46.7) y 20 pl/pozo de agua. Se agregaron la Solución A (50 pl/pozo) y la Solución B (50 pl/pozo) y las placas se transfirieron luego a un lector de microplacas para el desarrollo del color a 37 °C durante 30 minutos. La OD se midió a 630 nm. La cantidad de amoníaco producido en los pozos se calculó a partir de una curva de calibración utilizando cloruro de amoníaco como estándares (de 0 a 150 pM).
Ensayo de unión de células completas de L-DOS47
Se prepararon monocapas de células al sembrar 100 pl/pozo de células tumorales (4x104 células/pozo) en placas de cultivo de 96 pozos y se incubaron durante la noche a 37 °C. Se retiró el medio de las placas y se fijaron las monocapas de células con 100 pl/pozo de glutaraldehído al 0.05 % (en solución salina tamponada con fosfato, PBS) durante 10 minutos a temperatura ambiente (Ta). Después, las placas se lavaron con PBS y se agregaron 120 pl/pozo de solución de glicina (50 mM) y se incubaron a 37 °C durante 20 minutos. Después de la incubación, las placas se bloquearon con 120 pl/pozo de BSA al 1 %/PBS a 37 °C durante 30 minutos. Luego, las placas se lavaron 3 veces con Tampón A (BSA al 0.05 % en PBS) y se agregaron 80 pl/pozo de soluciones diluidas de L-DOS47 o DOS47 y se incubaron a 37 °C durante 1.5 horas. La señal de unión se generó mediante métodos de urea o de anticuerpos: (1) Con el enfoque de urea, las placas se lavaron 4 veces con Tampón A y se agregaron 80 pl/pozo de urea 20 mM (preparada en tampón de fosfato 0.1 M, pH 7.6) y se incubaron a 37 °C durante 30 minutos. Después de incubación, se agregaron 40 pl/pozo de HCl 1 N para detener la reacción. La cantidad de amoniaco producida en cada pozo se determinó utilizando el ensayo de indofenol. (2) Para el método del anticuerpo, la peroxidasa endógena se inactivó primero con 100 pl/pozo de peróxido de hidrógeno al 0.3% durante 30 minutos antes de la etapa de bloqueo. Después de la incubación con los artículos de prueba, las placas se lavaron con PBS y se preparó un conjugado de anticuerpo anti-AFAIKL2-peroxidasa diluido (1:8000) en Tampón A que contenía Tween-20 al 0.05 % y leche en polvo al 0.1 %. Las placas se lavaron 3 veces con Tampón A y se agregaron a las placas 100 pl/pozo de conjugado anticuerpo-peroxidasa. Después de incubar a 37 °C durante 1 hora, las placas se lavaron 3 veces con Tampón A. Se preparó sustrato de peroxidasa a 1 mM en tampón de citrato de sodio que contenía H2O2 al 0.03%y se agregaron 100 pl/pozo de la solución de sustrato y se incubó a Ta durante 30 minutos. Las placas se transfirieron a un lector de microplacas para medir la OD a 405 nm.
Ensayo de citotoxicidad de L-DOS47
Se prepararon monocapas de células al sembrar 100 pl/pozo de células tumorales (4x104 células/pozo) en placas de cultivo de 96 pozos y se incubaron durante la noche a 37 °C. Se retiró el medio de cada pozo y se agregaron 80 pl/pozo de L-DOS47 o DOS47 y se incubaron adicionalmente a 37 °C durante 2 horas. Después de incubación, las placas se lavaron 3 veces con Tampón A. Luego, se agregaron 100 pl/pozo de urea (20 mM) en KRB a las placas, que se incubaron a 37 °C durante la noche. El medio se retiró y se reemplazó con 100 pl/pozo de medio solo. La viabilidad celular se determinó mediante el ensayo de viabilidad celular MTS, en el que se preparó una mezcla de solución MTS/PES (20: 1 vol/vol; MTS, 2 mg/ml; PES, 1 mg/ml) y se agregaron 20 pl/pozo de la mezcla a las placas. Después, las placas se incubaron a 37 °C durante 1-2 horas y se midió la OD a 630 nm con referencia a 490 nm.
Ensayo de unión por electroquimioluminiscencia (ECL) basada en células
Se marcaron L-DOS47, anticuerpo AFAIKL2 y DOS47 con rutenio-NHS-éster (Sulfo-Tag, Meso Scale Discovery MSD; Rockville, MD) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Estas proteínas marcadas con rutenio permitieron la medición directa de la unión de L-DOS47 y AFAIKL2 al antígeno diana. Para el ensayo de unión directa, se preparó la monocapa de células BxPC-3 sobre una placa SECTOR PR High-Bind (MSD) de 96 pozos. Después de la fijación y el bloqueo, se agregaron varias cantidades de etiqueta L-DOS47 o etiqueta AFAIKL2. La placa se incubó a 37 °C durante 1.5 horas. Después de incubación, la placa se lavó dos veces y se llenó con Tampón de Lectura (MSD). La señal ECL se leyó entonces inmediatamente utilizando el lector SECTOR PR-100 (MSD). Para el ensayo de unión competitiva, se utilizó el anticuerpo L-DOS47 o AFAIKL2 para inhibir la unión de la etiqueta L-DOS47 a las células BxPC-3. Se utilizó la etiqueta L-DOS47 a 1 pg/ml para unirse a células BxPC-3. Se utilizaron varias concentraciones de competidores (L-DOS47 o AFAIKL2) para competir con la unión del L-DOS47 etiquetado. Después de la incubación, la placa se lavó dos veces y se llenó con Tampón de Lectura. A continuación, la placa se leyó inmediatamente utilizando el lector SECTOR Pr -100.
Atenuación del gen CEACAM6 en células BxPC-3
Para confirmar que CEACAM6 es el antígeno específico reconocido por L-DOS47, se silenció el gen CEACAM6 de la estirpe celular positiva BxPC-3 utilizando clones de expresión en horquilla HuSH-29 de OriGene (Rockville, MD). Estos plásmidos transcriben secuencias de ARN en horquilla corta (ARNhc), que bloquean la transcripción del gen diana a través de la interferencia de ARN. La célula BxPC-3 se transfectó con los plásmidos HuSH y las células transfectadas de forma estable se seleccionaron utilizando puromicina. Se obtuvieron diferentes clones de la transfección de HuSH6 (AAGGCGAAAGAGTGGATGGCAACAGTCTA (SEQ ID NO: 5)), HuSH7 (AAGAAGCAACCGGACAGTTCCATGTATAC (SEQ ID NO: 6)), y el plásmido de control HuSH-TRS. Se obtuvieron dos estirpes celulares estables positivas (HUSH #6 y HUSH #7) y el control (HUSH-TRS) mediante selección de antibióticos. Estos clones se utilizaron luego para verificar la unión con L-DOS47 utilizando un ensayo de unión de células completas. Después de incubación con L-DOS47, las placas se lavaron 3 veces con Tampón A y se agregaron 80 pl/pozo de urea 20 mM (preparada en tampón de fosfato 0.1 M, pH 7.6). Las placas se incubaron a 37 °C durante 30 minutos. La reacción enzimática se detuvo al agregar 40 pl/pozo de HCl 1 N. La cantidad de amoniaco producida se determinó utilizando el ensayo de indofenol.
Transfección del gen CEACAM6 a células H23
El vector de expresión de mamífero que contenía el marcador seleccionable G418 se clonó con genes PMP-GFP (proteína de membrana plasmática-proteína verde fluorescente) y CEACAM6. Se utilizó reactivo Cellfectin (Life Technologies) para transfectar el vector de expresión en células H23. En resumen, se sembraron 2x106 células/pozo de células H23 en 2 ml de medio RPMI completo (que contenía suero bovino fetal al 10 % y 50 U/ml de penicilina y 50 pg/ml de estreptomicina) en una placa de cultivo de 6 pozos y se incubaron a 37 °C durante la noche. El reactivo Cellfectin (10 pl) y el ADN (1-2 pl) se diluyeron en 100 pl de medio RPMI libre de suero, respectivamente. Después, las dos soluciones diluidas se combinaron, se mezclaron suavemente y se incubaron a Ta durante 30 minutos. Las placas se lavaron dos veces con 1.5 ml de medio RPMI libre de suero. La solución combinada se diluyó en 0.8 ml de medio RPMI libre de suero, se mezcló suavemente y se agregó a las células. Las células se incubaron a 37 °C en una incubadora de CO2 durante la noche. Al día siguiente, el medio se reemplazó con 2 ml de medio RPMI completo. Las células transfectadas coexpresaron GFP del mismo ARNm como CEACAM6. Las células transfectadas se seleccionaron mediante incubación en un medio que contenía 400 pg/ml de antibiótico G418. Las células se clasificaron directamente o después de la incubación con L-DOS47 marcado con cy5.5, lo que indica la expresión superficial de CEACAM6.
Tinción inmunoquímica de tejidos tumorales humanos por L-DOS47
Se cribó un total de 400 muestras de tejido que representan 42 tejidos cancerosos y normales (Axel Wellmann, University Hospital Aachen, RWTH Aachen Alemania). Los portaobjetos se incubaron primero en un horno seco a 62 °C durante 1 hora en una orientación vertical para eliminar la parafina. Luego, los portaobjetos se desparafinaron en un sustituto de xileno durante 5x4 minutos. Los portaobjetos se hidrataron en etanol al 100 %, 95 % y 75 % durante 2 x 3 minutos cada uno, y luego se sumergieron en agua corriente durante 5 minutos. La peroxidasa endógena se inactivó con H2O2 al 0.3% durante 30 minutos. Se utilizó el kit Vectastain Elite ABC (Vector Labs, Burlington, ON) para detectar la unión de L-DOS47 sobre los portaobjetos. En resumen, después de lavar en PBS durante 3 x 5 minutos, los portaobjetos se incubaron en suero de bloqueo a 4 °C durante la noche. A continuación, los portaobjetos se incubaron en una solución de L-DOS47 (20 pg/ml en tampón A) a 37 °C durante 1.5 horas. Después de lavar con PBS, los portaobjetos se incubaron con anticuerpo anti-ureasa de ratón (Sigma, 1:1500) a 37 °C durante 1 hora. Después de lavar con PBS, los portaobjetos se incubaron con solución de anticuerpo secundario biotinilado (Vector Labs) durante 30 minutos. Después de lavar con PBS, los portaobjetos se incubaron con reactivo Vectastain Elite ABC durante 30 minutos. Después de lavar con PBS, los portaobjetos se incubaron en una mezcla de solución de sustrato de peroxidasa (3,3'-diaminobencidina) DAB reciente (Vector Labs) a Ta durante 2 minutos. La reacción se detuvo al lavar con agua corriente durante 5 minutos. A continuación, los portaobjetos se contratiñeron en hematoxilina de Meyer durante 10 segundos. Los portaobjetos se deshidrataron en etanol al 75 %, 80 %, 95 % y 100 %. Después de aclarar en xileno, los portaobjetos se montaron con Medio de Montaje Clarion.
Estudio de metástasis A549
Se sembraron células tumorales A549 (5x106) y se cultivaron en placas de cultivo de baja unión. Una vez que se obtuvieron cantidades suficientes, las células se recolectaron y se resuspendieron en medio de cultivo a una concentración de 5x106 células/ml. A continuación, las células se colocaron en placas de cultivo de tejido de baja unión de 6 pozos a 1 ml/pozo. A continuación, se agregó a cada pozo L-DOS47 (1 ml) a una concentración final de 10 o 15 pg/ml. El control de isotipo se trató con 10 pg/ml del conjugado V21-DOS47 (un conjugado de anticuerpo-ureasa dirigido al receptor del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF)). Las células se incubaron a 37 °C durante 4 horas. Después de incubación, las células se centrifugaron y lavaron 3 veces con PBS estéril y se resuspendieron a 1x107 células/ml en PBS estéril. A continuación, cada ratón recibió una única inoculación de 1x106 células tratadas. Este estudio consistió en 4 grupos de ratones CrTac:NCr-Foxn1nu hembra (sin tratar, isotipo y L-DOS47 (10 y 15 pg/ml)). Se inocularon un total de cuarenta ratones (10 por cada grupo) con células tumorales A549 por vía intravenosa a través de la vena de la cola.
Se sacrificaron cinco animales por grupo el día 22 (3 semanas) mientras que los animales restantes se mantuvieron hasta el día 71 (10 semanas). Después del sacrificio, a los animales se les inyectó por vía intratraqueal tinta india (Calvert Labs; Olyphant, PA); luego se extirparon los pulmones y posteriormente se fijaron en solución de Fekete (Calvert Labs). El efecto del artículo de prueba sobre la metástasis tumoral se determinó al contar el número de tumores metastásicos (focos) en cada pulmón bajo un microscopio de disección. Se fotografiaron pulmones representativos de cada grupo.
Unión de L-DOS47 a varias estirpes celulares cancerosas
Se observaron diferentes perfiles de unión de L-DOS47 entre cinco estirpes celulares tumorales: BxPC-3, Capan-1, ZR-75-30, LS174T y MDA-MB231 (Fig. 1A). Los resultados mostraron que L-DOS47 se unió bien a las dos estirpes celulares pancreáticas (BxPC-3 y Capan-1) y de mama (ZR-75-30), lo que indica que el antígeno CEACAM6 se expresó sobre la superficie celular. También se observó unión moderada en la estirpe celular de colon LS174T, pero no se encontró unión en la estirpe celular de mama MDA-MB231 (control negativo). El anticuerpo AFAIKL2, cuando se conjuga con la enzima ureasa, proporcionó una diana específica hacia las células que expresan CEACAM6. Esto se confirmó por la ausencia de señal de unión en células tratadas con DOS47 (datos no mostrados).
Citotoxicidad de L-DOS47
La Figura 1B mostró que tanto BxPC-3 como ZR-75-30 son susceptibles a la citotoxicidad de L-DOS47. Se observó una rápida caída en la supervivencia celular en estas dos estirpes celulares tratadas con menos de 1 pg/ml de L-DOS47. Se observaron efectos moderados en las células Capan-1 y LS174T. L-DOS47 no tiene ningún efecto sobre la estirpe celular de control negativo MDA-MB231. En la Tabla 1 se muestra una lista de resultados de unión y citotoxicidad de más estirpes celulares. La citotoxicidad de L-DOS47 depende directamente de la actividad de unión de L-DOS47 sobre las estirpes celulares correspondientes. La respuesta citotóxica más débil de A549 y Capan-1 se debe a que estas dos estirpes celulares son más tolerantes a la toxicidad del amoníaco (datos no mostrados). Por otro lado, las células H23 son muy sensibles al amoníaco (datos no mostrados). A pesar de la ausencia del antígeno CEACAM6 sobre la superficie celular, las células H23 todavía muestran una respuesta citotóxica débil a L-DOS47, probablemente debido a la presencia de L-DOS47 unido no específicamente en los pozos.
Tabla 1. Resumen de los resultados obtenidos de varios estudios de unión y citotoxicidad de L-DOS47 en nueve estir es celulares tumorales humanas
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Cinco estirpes celulares (BxPC-3, Capan-1, ZR-75-30, LS174T y A549) de cuatro tejidos humanos mostraron una fuerte unión a L-DOS47 y una buena susceptibilidad a la citotoxicidad de L-DOS47 (excepto A549) como se muestra en la Tabla 1. Los efectos citotóxicos de L-DOS47 dependen más o menos de la fuerza de unión relativa a las células cancerosas. Los resultados en los gráficos representan la media (n = 3) de experimentos representativos. La desviación estándar (DE) fue menor del 10 % para todos los valores.
Unión directa y competitiva de L-DOS47 a células BxPC-3
El ensayo de unión por electroquimioluminiscencia basado en células permite la detección directa del conjugado de anticuerpo marcado con rutenio unido a células tumorales. En la Figura 2A, se encontró que tanto el anticuerpo L-DOS47 etiquetado con rutenio como el AFAIKL2 se unían a las células BxPC-3, mientras que el DOS47 etiquetado con rutenio actuó como control negativo. L-DOS47 mostró una afinidad de unión mucho más alta que el anticuerpo AFAIKL2 debido a una mayor avidez de anticuerpos (6-10 anticuerpos) presentada en L-DOS47. El resultado se confirmó adicionalmente utilizando L-DOS47 y anticuerpo AFAIKL2 como competidores para inhibir la unión de L-DOS47 etiquetado con rutenio a células BxPC-3 (Fig. 2B). Tanto el anticuerpo L-DOS47 como el AFAIKL2 inhibieron la unión de L-DOS47 etiquetado con rutenio a BxPC-3 y, como se esperaba, L-DOS47 demostró una mejor afinidad de unión y, por lo tanto, una inhibición más fuerte de la unión de L-DOS47 etiquetado con rutenio a BxPC-3 que el anticuerpo AFAIKL2. Las aparentes afinidades de unión de los anticuerpos L-DOS47 y AFAIKL2 se pueden comparar mediante la IC50 (la cantidad de competidor necesaria para provocar una disminución del 50 % en la unión) de los artículos de prueba. Se estimó que la IC50 del anticuerpo L-DOS47 y AFAIKL2 era de 2 y 20 pg/ml, respectivamente; o 3.22 nM para L-DOS47 (MW= 622 k para una relación de conjugación de 6 anticuerpos a 1 ureasa) y 1.55 pM para AFAIKL2 (MW = 12.9 k). Los resultados sugirieron que la afinidad de unión de L-DOS47 es aproximadamente 500 veces aquel del anticuerpo AFAIKL2.
Sobreexpresión del gen CEACAM6 transfectado en células H23
Después de la transfección con el gen CEACAM6, se identificó un clon positivo H23-CC6 # 7. Se obtuvieron clones con un nivel de CEACAM6 más cercano al de las células A549 al recurrir al clon H23-CC6 # 7 con L-DOS47-cy5.5. La incubación adicional del clon con una mayor cantidad de antibiótico G418 (800 pg/ml) ayudó a seleccionar el que tenía un mayor nivel de expresión de CEACAM6. Aunque H23-CC6 # 7 expresó menos CEACAM6 sobre la superficie celular que las células A549 y BxPC-3, este clon transfectado con CEACAM6 fue incluso más susceptible que las células BxPC-3 a la citotoxicidad de L-DOS47 (Fig. 3B) debido a su alta susceptibilidad. a la toxicidad del amoniaco (datos no mostrados).
Atenuación del gen CEACAM6 en células BxPC-3
La unión de L-DOS47 a dos clones de atenuación de CEACAM6 (HUSH# 6 y HUSH# 7) se redujo significativamente en comparación con aquel de las células BxPC-3 nativas y el clon de control (HUSH-TR3) (Fig. 3C). El experimento mostró claramente que la presencia de CEACAM6 sobre la superficie celular era importante para la unión de L-DOS47. El silenciamiento del gen redujo sustancialmente la unión de L-DOS47.
Tinción inmunoquímica de tejidos tumorales humanos por L-DOS47
El cribado de tejido normal y canceroso demostró que L-DOS47 reconocía el subtipo de adenocarcinoma casi exclusivamente (Tabla 2). De las más de 400 muestras de tejido cribadas, que representan 42 grupos que consisten en varios tejidos cancerosos y normales emparejados, los tejidos del adenocarcinoma de pulmón mostraron una tinción considerable con más del 80 % de las células reconocidas. Los correspondientes tejidos pulmonares normales de la misma edad fueron negativos con indicios de tinción focal en unos pocos neumocitos activados. Los otros tejidos que mostraron alguna tinción positiva pero débil fueron el adenocarcinoma de colon y páncreas. La Figura 4 muestra la tinción inmunoquímica de adenocarcinoma de colon y pulmón con L-DOS47.
Tabla 2. Cribado en teido humano normal canceroso de unión de L-DOS47
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La tinción inmunohistoquímica de adenocarcinoma de pulmón y colon humano con L-DOS47 es como se muestra en la Figura 4.
Estudio de metástasis A549
A las 3 semanas, los ratones que recibieron células A549 tratadas con 10 y 15 pg/ml de L-DOS47 mostraron recuentos de tumores pulmonares disminuidos, demostrando una disminución significativa (p < 0.05) en comparación con el grupo de control no tratado (Tabla 3). Sin embargo, no se observaron disminuciones significativas en el número medio de recuentos de células tumorales a las 10 semanas. Aunque no es estadísticamente significativo, el tratamiento con 10 pg/ml de L-DOS47 tanto a las 3 como a las 10 semanas posteriores al tratamiento mostró una disminución constante en el número de células tumorales promedio en comparación con el grupo de control no tratado (Tabla 3). Curiosamente, el control de isotipo (V21-DOS47) también afectó y redujo el número de recuentos de tumores en el pulmón. En resumen, el tratamiento de las células A549 con L-DOS47 a 10 pg/ml redujo el número medio de tumores pulmonares a las 3 semanas posteriores al tratamiento, pero este efecto fue transitorio ya que no se observaron disminuciones significativas en el número de tumores medio a las 10 semanas posteriores al tratamiento.
T l . N m r m i m r lm n r n n l i m i A 4
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Como se muestra en la Tabla 3, se trataron células de adenocarcinoma de pulmón humano A549 con L-DOS47 o control de isotipo (V21-DOS47) in vitro. Después de incubación a 37 °C durante 4 horas, las células se lavaron 3 veces con PBS y se resuspendieron en PBS a 1x107 células/ml. A continuación, cada ratón recibió una única inoculación de 1x106 células tratadas. Se sacrificaron cinco animales por grupo a las 3 semanas y 10 semanas después de inyección. El efecto del artículo de prueba sobre la metástasis tumoral se determinó al contar el número de tumores metastásicos en cada pulmón bajo un microscopio de disección. El crecimiento del tumor metastásico en el grupo tratado con L-DOS47 se comparó con el grupo de control no tratado mediante la prueba t para datos no apareados. La coinyección con L-DOS473 semanas después del tratamiento ha reducido significativamente el número de recuentos de tumores.
Se demostró el uso de ureasa como producto terapéutico contra el cáncer potencial basado en la producción de amoniaco y la elevación del pH local mediada por la enzima (8). Sin embargo, la falta de selectividad de la enzima por las células tumorales sobre las células normales ha limitado su aplicación como producto terapéutico contra el cáncer. La aplicación de conjugado anticuerpo-fármaco (ADC) o más específicamente, la terapia con profármacos de enzima dirigida por anticuerpos (ADEPT) de esta tecnología puede sortear esta limitación. En este ejemplo, se preparó una forma específica de conjugado anticuerpo-ureasa (L-DOS47) al conjugar un anticuerpo de dominio único de llama específico de CEACAM6 (AFAIKL2) con ureasa (DOS47). Los anticuerpos AFAIKL2 conjugados proporcionan la especificidad y, por tanto, mejoran la eficacia de la enzima ureasa frente a tumores que expresan CEACAM6. La especificidad de L-DOS47 para las células cancerosas que expresan CEACAM6 sobre la superficie celular se evaluó mediante estudios de unión in vitro (Fig. 1 y 2). Los resultados de estos estudios demostraron que L-DOS47 se unía a estirpes celulares que expresan CEACAM6 (BxPC-3, Capan-1, ZR-75-30 y LS174T), pero no a estirpes celulares que no la expresan (MDA-MB231). Además, el papel funcional de CEACAM6 fue confirmado por experimentos de sobreexpresión y atenuación de CEACAM6 en células cancerosas (Fig. 3). El CEACAM6 se sobreexpresó al transfectar el plásmido codificado por CEACAM6 en células H23, mientras que la atenuación de genes se realizó mediante una pequeña deleción de CEACAM6 mediada por ARN en horquilla en células BxPC-3. Los estudios de unión mostraron que L-DOS47 se unía a células BxPC-3 nativas con alta afinidad pero no a células BxPC-3 con el gen CEACAM6 anulado (Fig. 3C). Por el contrario, la sobreexpresión de CEACAM6 en células H23 ha hecho que las células sean susceptibles a la unión de L-DOS47 y a la citotoxicidad (Fig. 3A y 3B). Estos resultados mostraron que la unión específica de L-DOS47 al antígeno CEACAM6 es importante para que el conjugado de anticuerpos induzca citotoxicidad tumoral. Otro beneficio de conjugar anticuerpos a ureasa sobre los anticuerpos individuales es un aumento general de la avidez. Los ensayos de unión a ECL mostraron que L-DOS47 con una relación de conjugación molar de 6-10 anticuerpos a 1 ureasa se unía 500 veces mejor que un solo anticuerpo a las células BxPC-3 (Fig. 2B). Estudios de unión adicionales han sugerido que una relación de conjugación de anticuerpo a enzima superior a 6:1 es óptima para la unión de L-DOS47 a CEACAM6 (datos no mostrados).
El mecanismo de acción se investigó a través de estudios in vitro e in vivo. La ureasa es el componente activo de L-DOS47 y los estudios previos han demostrado que la ureasa es citotóxica para las células tumorales humanas in vitro (8). La administración intratumoral de ureasa a tumores A549 (pulmón) y MCF-7 (mama) en ratones sin pelo inhibió significativamente el crecimiento tumoral (8). Sin embargo, la eficacia citotóxica de la ureasa o L-DOS47 también depende de la susceptibilidad de las estirpes celulares tumorales al amoníaco. Por ejemplo, en la Figura 1A, L-DOS47 se unió casi igualmente bien a BxPC-3, ZR-75-30 y Capan-1, pero Capan-1 mostró una respuesta citotóxica moderada en comparación con las otras dos estirpes celulares (Fig. 1B). Capan-1 es menos susceptible al efecto citotóxico del amoniaco en comparación con BxPC-3 y ZR-75-30 (datos no mostrados). De manera similar, las células H23 del adenocarcinoma de pulmón humano son sensibles a la presencia de amoníaco; una vez transfectada con el gen CEACAM6, la estirpe celular se volvió susceptible a la citotoxicidad de L-DOS47 (Fig. 3B) a pesar de que se presentaron menos antígenos CEACAM6 sobre la superficie celular en comparación con BxPC-3 (datos no mostrados) y células A549 (Fig. 3A). En conclusión, para que L-DOS47 ejerza efectos citotóxicos sobre un tumor, la expresión de CEACAM6 en la superficie celular y la susceptibilidad al amoníaco son dos requisitos importantes.
El cribado inmunohistoquímico de tejidos cancerosos humanos mostró que L-DOS47 era específico del adenocarcinoma de pulmón, colon y páncreas (Tabla 2) pero no de los tejidos normales correspondientes. La conjugación de múltiples anticuerpos sobre la superficie de la ureasa ha mejorado enormemente la especificidad hacia el antígeno CEACAM6 (Fig. 1A y 2) y ha reducido la naturaleza de unión no específica de la enzima (datos no mostrados). Los estudios in vivo confirmaron adicionalmente la eficacia de L-DOS47 contra el xenoinjerto tumoral. Se observó inhibición del crecimiento tumoral en la administración IV de L-DOS47 a xenoinjerto de tumor de ratón sin pelo (datos no mostrados) y en el estudio de metástasis del adenocarcinoma de pulmón A549 (Tabla 3). Se observó una reducción significativa de los focos pulmonares en las células A549 tratadas con 10 o 15 pg/ml de L-DOS47 3 semanas después de la inyección (Tabla 3). Sin embargo, no se encontraron diferencias significativas después de 10 semanas, posiblemente debido a la depuración de L-DOS47 del animal. El control de isotipo (V21-DOS47, un conjugado anti-VEGFR2-DOS47) también provocó algunos grados de reducción de los focos pulmonares, a pesar de que las células A549 no expresan VEGFR2 bajo condiciones normales. Ohwada et al (19) informaron que la funcionalidad de VEGFR se indujo en células A549 después de la exposición con HCl 50 mM. La proliferación suprimida de las células A549 afligidas se podría restaurar mediante la administración de VEGF exógeno, mientras que la adición de anticuerpos neutralizantes anti-VEGFR1 y anti-VEGFR2 resuprimió la proliferación celular. Sin embargo, tanto los anticuerpos VEGF como los anti-VEGFR no tuvieron efectos sobre las células de control. Sin pretender imponer ninguna teoría, es posible que la funcionalidad de VEGFR2 en células A549 se pueda inducir durante el proceso de preparación celular en este estudio de metástasis. Esto explica por qué se observó una reducción del recuento de células en el grupo de control de isotipo. Los resultados de estudios in vitro e in vivo han demostrado que la conjugación de anticuerpos sobre ureasa permite que el conjugado de anticuerpos se dirija específicamente a tumores que expresan CEACAM6 con buena selectividad y eficacia, lo que proporciona una prueba de concepto para el desarrollo clínico de L-DOS47.
Ejemplo 2. Un estudio de escalamiento de dosis de L-DOS47 en NSCLC (cáncer de pulmón de células no microcíticas) no epidermoide recurrente o metastásico
El propósito principal de este estudio de investigación es evaluar qué tan seguro, qué tan bien tolerado y qué tan efectivo es un rango de dosis de L-DOS47 en combinación con la terapia doble estándar de pemetrexed/carboplatino en pacientes con cáncer de pulmón de células no microcíticas no epidermoide recurrente o metastásico en Estadio IV (TNM M1a y M1b).
Las medidas de resultado primarias son las siguientes. El número de pacientes con eventos adversos como medida de seguridad y tolerabilidad de L-DOS47 en el tratamiento de combinación con pemetrexed/carboplatino es que los participantes serán seguidos durante 12 semanas. Esto se designa como problema de seguridad. El período de notificación de AE comienza el día 1 del ciclo 1 hasta la última visita del estudio. Las medidas de resultado secundarias son las siguientes. La tasa de respuesta objetiva de los pacientes que reciben el tratamiento de combinación de acuerdo con RECIST versión 1.1 es de hasta 12 semanas y no se designa como problema de seguridad. La respuesta objetiva del tumor se evaluará de acuerdo con RECIST versión 1.1 en pacientes que hayan completado al menos 2 ciclos de tratamiento del estudio y que tengan al menos 1 evaluación de la enfermedad posterior al tratamiento. El número de pacientes que reciben un beneficio clínico sostenido se sigue hasta 12 semanas y no se designa como problema de seguridad. Definido como el porcentaje de pacientes que han logrado una respuesta completa, una respuesta parcial y una enfermedad estable después del tratamiento de combinación con L-DOS47 pemetrexed/carboplatino. La concentración en plasma máxima observada (Cmax) de L-DOS47 después de dosificación en el tratamiento de combinación con pemetrexed/carboplatino es de hasta 12 semanas y no se designa como problema de seguridad. Los parámetros farmacocinéticos para L-DOS47 se determinarán a partir de muestras de plasma recolectadas de todos los pacientes que se dosificaron con L-DOS47. El tiempo hasta la concentración en plasma máxima observada (Tmax) de L-DOS47 después de dosificación en el tratamiento de combinación con pemetrexed/carboplatino es de hasta 12 semanas y no se designa como problema de seguridad. Los parámetros farmacocinéticos para L-DOS47 se determinarán a partir de muestras de plasma recolectadas de todos los pacientes que se dosificaron con L-DOS47. El área bajo la curva de concentración (AUC) frente al tiempo de L-DOS47 después de dosificación en el tratamiento de combinación con pemetrexed/carboplatino es de hasta 12 semanas y no se designa como problema de seguridad. Los parámetros farmacocinéticos para L-DOS47 se determinarán a partir de muestras de plasma recolectadas de todos los pacientes que se dosificaron con L-DOS47. La vida media de eliminación terminal de L-DOS47 después de dosificación en el tratamiento de combinación con pemetrexed/carboplatino es de hasta 12 semanas y no se designa como problema de seguridad. Los parámetros farmacocinéticos para L-DOS47 se determinarán a partir de muestras de plasma recolectadas de todos los pacientes tratados con L-DOS47. La presencia de anticuerpos anti-L-DOS47 para pacientes dosificados con L-DOS47 en el tratamiento de combinación con pemetrexed/carboplatino es de hasta 12 semanas y se designa como problema de seguridad. Se recolectarán y analizarán muestras de suero de todos los pacientes dosificados con L-DOS47.
Se llevarán a cabo experimentos que involucran Pemetrexed y Carboplatino más L-DOS47. Los pacientes serán reclutados en cohortes de dosis de escalamiento de L DOS47, con un mínimo de 3 y un máximo de 6 pacientes por cohorte. La dosis inicial de L DOS47 será de 0.59 pg/kg; otros posibles niveles de dosis que se pueden evaluar son 0.78, 1.04, 1.38 y 1.84 pg/kg. Las dosis de atención estándar de pemetrexed [500 mg/m2] y carboplatino [AUC6], respectivamente, que se administrarán en combinación con L-DOS47, permanecerán constantes en todas las cohortes. Un ciclo de tratamiento será de 21 días, y los pacientes recibirán L DOS47 en los días 1, 8 y 15 del ciclo y pemetrexed/carboplatino el día 1 de cada ciclo de tratamiento. Está previsto que los pacientes reciban 4 ciclos de tratamiento de combinación con L-DOS47 pemetrexed/carboplatino. Los pacientes que no hayan progresado después de los 4 ciclos de tratamiento de combinación y que no hayan experimentado una toxicidad inaceptable tendrán la oportunidad de continuar recibiendo el tratamiento con L-DOS47 mientras exista un beneficio clínico y sea bien tolerado, en opinión del investigador, hasta la progresión de la enfermedad. Los pacientes que no puedan completar 4 ciclos de tratamiento de combinación de L-DOS47 pemetrexed/carboplatino debido a la toxicidad de pemetrexed/carboplatino tendrán la oportunidad de continuar recibiendo el tratamiento con L-DOS47 después de la interrupción del tratamiento con pemetrexed/carboplatino, siempre que haya beneficio clínico y sea bien tolerado, en opinión del investigador, hasta la progresión de la enfermedad.
Ejemplo 3. Estudio de escalamiento de dosis no aleatorizado, de etiqueta abierta, fase I/II de inmunoconjugado L-DOS47 para el tratamiento de cáncer de pulmón de células no microcíticas
El propósito principal de este estudio de investigación es evaluar cuán seguro, cuán bien tolerado y cuán efectivo es un rango de dosis de L-DOS47 en pacientes con cáncer de pulmón no microcítico no epidermoide cuando se administra como monoterapia.
Las medidas de resultado primarias son las siguientes. La incidencia y la gravedad de los eventos adversos relacionados con el fármaco como medida de seguridad y tolerabilidad de L-DOS47 son de hasta 12 semanas y se designan como un problema de seguridad. Estos se evalúan durante el período de informe de AE que comienza en el día 1 del ciclo 1 hasta la última visita del estudio.
Las medidas de resultado secundarias son las siguientes. La toxicidad relacionada con L-DOS47 durante las primeras 2 horas después de la infusión es durante las primeras 2 horas después de la infusión y se designa como problema de seguridad. Estos se evalúan por la incidencia y la gravedad de los AE y SAE y los cambios en los signos vitales. La incidencia y la gravedad de todos los eventos adversos informados y los eventos adversos graves se encuentran bajo el Periodo de tiempo en el que los Participantes serán seguidos durante 12 semanas y el período de seguimiento de 30 días. Estos se designan como problemas de seguridad y se evalúan durante el período de informe de AE que comienza en el Ciclo 1 Día 1 hasta la última visita del estudio. Los cambios del valor de referencia para parámetros de seguridad adicionales (evaluaciones de laboratorio clínico, signos vitales, peso, requerimiento de oxígeno y ECG de 12 electrodos están bajo el periodo de tiempo de hasta 12 semanas y se designan como problema de seguridad. Los parámetros de seguridad incluyen evaluaciones de laboratorio clínico, signos vitales, peso, requerimiento de oxígeno y ECG de 12 electrodos. La evaluación del anticuerpo anti-L-DOS47 a lo largo del tiempo es de hasta 12 semanas y se designa como problema de seguridad. Se recolectarán y analizarán muestras de suero de todos los pacientes que hayan recibido la dosis de L-DOS47.
Otras medidas de resultado son las siguientes. La concentración en plasma máxima observada (Cmax) de L-DOS47 en cada nivel de dosis está por debajo del periodo de tiempo de hasta 12 semanas y no se designa como problema de seguridad. Los parámetros farmacocinéticos para L-DOS47 se determinarán a partir de muestras de plasma recolectadas de todos los pacientes que se dosificaron con L-DOS47. El tiempo hasta la concentración en plasma máxima observada (Tmax) de L-DOS47 en cada nivel de dosis es de hasta 12 semanas y no se designa como problema de seguridad. Los parámetros farmacocinéticos para L-DOS47 se determinarán a partir de muestras de plasma recolectadas de todos los pacientes que se dosificaron con L-DOS47. El área bajo la curva de concentración (AUC) frente al tiempo de L-DOS47 en cada nivel de dosis se mide hasta 12 semanas y no se designa como problema de seguridad. Los parámetros farmacocinéticos para L-DOS47 se determinarán a partir de muestras de plasma recolectadas de todos los pacientes que se dosificaron con L-DOS47. La vida media de eliminación terminal de L-DOS47 en cada nivel de dosis está bajo el periodo de tiempo de hasta 12 semanas y no se designa como un problema de seguridad. Los parámetros farmacocinéticos para L-DOS47 se determinarán a partir de muestras de plasma recolectadas de todos los pacientes que se dosificaron con L-DOS47. Los pacientes serán reclutados en cohortes de dosis de escalamiento de L-DOS47, con un mínimo de 3 y un máximo de 6 pacientes por cohorte. La dosis inicial de L-DOS47 será de 0.12 pg/kg; otros posibles niveles de dosis incluyen 0.21, 0.33, 0.46, 0.59, 0.78, 1.04, 1.38, 1.84, 2.45, 3.26 y 4.33 pg/kg. Un ciclo de tratamiento será de 21 días y los pacientes recibirán L-DOS47 en los Días 1 y 8 del ciclo.
Los pacientes se reclutarán en cohortes, con un mínimo de tres y un máximo de seis pacientes por cohorte. Todos los pacientes a un nivel de dosis dado deben completar el ciclo 1 (período de 3 semanas) antes de que pueda continuar el escalamiento en pacientes posteriores. La decisión del escalamiento de dosis al siguiente nivel de dosis se tomará después de que el Comité Directivo del Ensayo (TSC) haya revisado los datos de seguridad y farmacocinéticos (PK) disponibles. El escalamiento de L-DOS47 continuará hasta que se alcance una dosis máxima tolerada (MTD). Después de que se haya determinado la MTD de L-DOS47 en la Fase I, se inscribirán hasta 20 pacientes (sacados de la Fase I) para evaluar la eficacia preliminar de L-DOS47 (es decir, la tasa de respuesta utilizando los criterios de los Criterios de Evaluación de Respuesta en tumores sólidos [RECIST] versión 1.1, progresión de la enfermedad y supervivencia); el seguimiento incluirá evaluaciones radiológicas cada segundo ciclo. La seguridad y tolerabilidad de L-DOS47 también se evaluarán adicionalmente. Se recopilará información farmacocinética, así como observaciones relevantes sobre la actividad de L-DOS47.
Para todos los pacientes, el tratamiento con L-DOS47 continuará hasta que el paciente experimente progresión de la enfermedad, toxicidad inaceptable, el paciente retire el consentimiento o haya completado cuatro ciclos de tratamiento y no desee continuar con ciclos adicionales, lo que ocurra primero. Después de cuatro ciclos, los pacientes pueden continuar recibiendo L-DOS47 mientras exista un beneficio clínico sostenido y sea bien tolerado, en opinión del investigador.
Ejemplo 4: Producción y caracterización de un conjugado de enzima ureasa-anticuerpo de dominio único de camélido para el tratamiento del cáncer de pulmón de células no microcíticas (NSCLC)
La eficacia de los fármacos quimioterapéuticos contra el cáncer más comúnmente utilizados está limitada por sus estrechos índices terapéuticos y la falta de efectos selectivos sobre las células tumorales. La terapia con profármacos enzimáticos dirigida por anticuerpos (ADEPT) mejora la selectividad al suministrar conjugados de enzima-anticuerpo a los sitios del tumor donde se unen a los antígenos asociados al tumor mientras que los conjugados restantes no unidos se eliminan del torrente sanguíneo [20]. Una vez que se acumulan los conjugados anticuerpo-enzima, se administra el profármaco y se convierte en el sitio del tumor a su forma citotóxica activa mediante la porción de enzima del conjugado anticuerpo-enzima, logrando de esta manera la muerte selectiva de las células tumorales. Desde que Bagshawe introdujo el concepto ADEPT en 1987 [20-22], los investigadores han aplicado variaciones de este concepto para desarrollar fármacos contra el cáncer más potentes y específicos. [22-24]. Se desarrollaron diferentes generaciones de profármacos galactosídicos y conjugados anticuerpo-galactosidasa con el fin de reducir la toxicidad sistémica al tiempo que se aumenta la citotoxicidad del fármaco activado [25]. Se modificaron las formas mutadas de la purina nucleósido fosforilasa humana para mejorar la especificidad de los profármacos basados en adenosina como sustrato [26]. Además, se han desarrollado diferentes tipos de proteínas de infusión de inmunoenzimas para mejorar la actividad enzimática y la avidez de los anticuerpos [27-29].
Se describe la fabricación y caracterización de L-DOS47, que es un conjugado químico de un anticuerpo recombinante de dominio único y ureasa de judía gigante con una relación de conjugación de aproximadamente 10 anticuerpos por molécula de ureasa nativa. El inmunoconjugado L-DOS47 utiliza urea, que es naturalmente abundante en los tejidos tumorales, como profármaco para producir amoníaco. La unión selectiva del anticuerpo AFAIKL2 al antígeno asociado al tumor CEACAM6 [33] sobre las células tumorales diana da como resultado la acumulación de ureasa y la consiguiente hidrólisis de urea extracelular para producir amoníaco, que es citotóxico y crea un entorno alcalino desfavorable para las células cancerosas [34]. Debido a la complejidad y al tamaño del conjugado, que puede tener un peso molecular de hasta 680 kDa, los procedimientos de química de conjugación, reacción y separación se desarrollaron para abordar los desafíos en la producción a gran escala. Dado que la ureasa tiene múltiples sitios de conjugación potenciales para el anticuerpo seleccionado, la relación de conjugación de L-DOS47, que es esencial para la potencia del fármaco, se caracterizó utilizando un sistema de electroforesis en gel de microcanales Experion SDS [31,32]. La pureza del conjugado L-DOS47 se determinó mediante cromatografía de exclusión por tamaño. La identidad química de L-DOS47 se caracterizó por mapeo de péptidos por espectrometría de masas y transferencia Western. Debido a que una amina primaria (K32) se transporta sobre la región CDR3 del anticuerpo de dominio único, la distribución de los sitios de conjugación en el lado del anticuerpo se determinó mediante RP-HPLC y espectrometría de masas MALDI. Los sitios de conjugación para los lados del anticuerpo y de la ureasa también se caracterizaron mediante espectrometría de masas ESI. El efecto de la relación de conjugación sobre la afinidad de la unión de L-DOS47 por CEACAM6 se evaluó mediante ELISA. Se realizaron estudios in vitro para confirmar la unión de L-DOS47 y su capacidad para provocar citotoxicidad en estirpes celulares cancerosas que expresan CEACAM6.
Se desarrolló y caracterizó un inmunoconjugado (L-DOS47) como agente terapéutico para tumores que expresan CEACAM6. El anticuerpo de dominio único AFAIKL2 que se dirige a CEACAM6 se expresó en el sistema E. coli BL21 (DE3) pT7-7. Se extrajo y purificó ureasa de alta pureza (HPU) de molinos de judía gigante. AFAIKL2 se activó utilizando N-succinimidil[4-yodoacetil] aminobenzoato (SIAB) como entrecruzador y luego se conjugó con ureasa. Las reacciones de activación y conjugación se controlaron al alterar el pH. Bajo estas condiciones, la relación de material alcanzó proporciones de conjugación de 8-11 anticuerpos por molécula de ureasa, el contenido de ureasa libre residual fue prácticamente insignificante (< 2 %) y el conjugado L-DOS47 de alta pureza (> 95 %) se pudo producir utilizando solo ultradiafiltración para eliminar el anticuerpo que no ha reaccionado y el entrecruzador hidrolizado. L-DOS47 se caracterizó por un panel de técnicas analíticas que incluyen SEC, IEC, transferencia Western, ELISA y mapeo de péptidos LC-MSE. A medida que aumentaba la relación de conjugado anticuerpo-ureasa, se observó una señal de unión más alta. Sin embargo, el efecto fue menos evidente en proporciones de conjugación superiores a 6 anticuerpos por ureasa. La especificidad y citotoxicidad de L-DOS47 se confirmó mediante cribado en tres estirpes celulares (BxPC-3, A549 y MCF7). Se encontró que BxPC-3, una estirpe celular que expresa CEACAM6 era más susceptible a L-DOS47. L-DOS47 se está investigando como un agente terapéutico potencial en estudios clínicos de fase I en humanos para el cáncer de pulmón de células no microcíticas (NSCLC).
La producción de Ureasa intermedia de Ureasa de Alta Pureza (denominada ureasa cruda o DOS47 de en el presente documento en adelante) se adquirió de BioVectra Inc. (Charlottetown, PE Canadá). Antes de uso en conjugación, se purificó la ureasa cruda para eliminar los contaminantes de la proteína de la matriz de la judía gigante tales como la canavalina y la concanavalina A. Se disolvió ureasa cruda en agua de alta pureza y el pH se llevó a 5.15 con ácido acético 10 mM, EDTA 0.2 mM (tampón acetato-EDTA) luego se filtró al vacío utilizando una suspensión de Celite 503. La torta se lavó con acetato de sodio 10 mM, EDTA 1 mM, pH 5.15 y se secó al vacío. El filtrado que contenía ureasa se enfrió a 0-4 °C y se fraccionó al agregar etanol enfriado hasta una concentración final del 25 % (v/v). La mezcla se agitó durante 15 minutos y luego se filtró al vacío utilizando Celite 503 lavada. La torta se lavó con tampón acetato-EDTA que contenía etanol al 25 % (v/v) y luego se secó al vacío.
Las tortas se resuspendieron en tampón acetato-EDTA y la suspensión se filtró a través de Celite al vacío para recolectar el filtrado. La torta resultante se lavó con tampón acetato-EDTA y se secó al vacío. El lavado y el filtrado inicial se filtraron a través de una cápsula de 0.65 pm. Este filtrado de ureasa fraccionado con etanol se concentró ~2X utilizando dos membranas de polietersulfona Sartorius Sartocon 100000 Da MWCO seguido de intercambio de tampón en tampón acetato-EDTA.
Se agregaron imidazol y TCEP (clorhidrato de tris(2-carboxietil)fosfina) a esta ureasa de pureza media a concentraciones finales de 20 mM y 1 mM respectivamente y el pH se ajustó a 6.5. La solución de proteína se cargó sobre una columna de DEAE-Sepharose Fast Flow preequilibrada con imidazol 20 mM, TCEP 1 mM, pH 6.5 (tampón imidazol-TCEP). Todas las etapas se realizaron a un índice de fluidez de 500 ml/min. La columna se lavó con tampón imidazol-TCEP seguido de tampón imidazol-TCEP que contenía NaCl 80 mM para eliminar las impurezas no unidas. La ureasa se eluyó con tampón imidazol-TCEP que contenía NaCl 180 mM. Se agruparon las fracciones con A280 > 0.1 y pureza por SEC de > 90-97 %.
Las fracciones agrupadas se concentraron hasta una concentración de proteína diana de 6-8 mg/ml utilizando dos membranas Sartorious Sartocon 100000 Da MWCO PESU, luego se diafiltraron contra tampón acetato-EDTA que contenía acetato de sodio 10 mM, EDTA 1 mM, pH 6.5. El rendimiento de esta etapa es normalmente > 55 % de la actividad inicial. La expresión y purificación del fármaco AFAIKL2 intermedio de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo AFAIKL2 se muestra en la Figura 5 (SEQ ID NO. 1).
El gen del anticuerpo se expresó en el sistema E. coli BL21 (DE3) pT7-7. Un frasco del banco de células maestras se inoculó asépticamente mediante tres etapas de siembra a 350 L de Luria HiVeg (20 g/L) suplementado con 50 mg/L de kanamicina, 1 g/L de cerelosa, 0.02 g/L de MgSO4 y reactivo antiespumante Biospumex al 0.01 % en un fermentador de 500 L. El proceso se controló para mantener el oxígeno disuelto a > 20 %, la temperatura a 37 °C ± 2 °C, la contrapresión entre 34.5-137.9 kPa (5-20 psi), el pH a 7.0 ± 0.2, la OD600 entre 0.5-40 y la concentración de glucosa entre 1-3 g/L. Una vez que el cultivo alcanzó una OD600 de 7-10, se indujo la expresión del anticuerpo mediante la adición de IPTG a una concentración final de 1 mM y se dejó que continuara durante 6-8 horas. Las células se recolectaron por centrifugación, se lavaron y lisaron para liberar los cuerpos de inclusión, luego se resuspendieron en 10 volúmenes de imidazol 50 mM pH 6.8. La suspensión celular se homogeneizó en lotes y el homogeneizado se pasó primero a través de una malla sanitaria de acero inoxidable de 75 micrones y luego a través de un microfluidizador con una presión mínima de 68.9 MPa (10,000 psi) para un total de tres pasadas mientras se mantenía la temperatura por debajo de 10 °C. El lisado celular se centrifugó, el material insoluble se agrupó y el sedimento se resuspendió con homogeneización en 10 volúmenes de Triton X-100 al 1 % con DTT 5 mM. El sedimento lavado se recolectó mediante centrifugación. Este lavado se repitió y se siguió de dos lavados con acetato de sodio 25 mM, pH 4.0 que contenía DTT 5 mM para eliminar el Triton X-100 residual y tamponar el sedimento a pH 4.
El sedimento que contenía los cuerpos de inclusión lavados se resuspendió en urea 8 M, DTT 25 mM, acetato de sodio 125 mM, pH 4.0, luego se solubilizó alternativamente con un homogeneizador Ross y luego un mezclador superior hasta que no hubo más cambios en la apariencia visual, y luego se mezcló con un mezclador superior solo durante un tiempo total de 3 horas. Los cuerpos de inclusión solubilizados se centrifugaron y el sobrenadante clarificado se cargó a 550 ml/min sobre una columna SP-Sepharose XL que se preequilibró con urea 8 M en acetato de sodio 125 mM pH 4.0 (tampón de equilibrio SP). Después de que se cargó el sobrenadante clarificado, la columna se lavó con tampón de equilibrio hasta que el eluato A280 cayó por debajo de 0.05, seguido de urea 8 M en acetato de sodio, pH 4.0 con NaCl 50 mM hasta que el eluato A280 cayó por debajo de 0.05. La velocidad de la bomba se redujo a 275 ml/min y se aplicaron a la columna 3 cv de urea 8 M que contenía acetato de sodio 25 mM, NaCl 180 mM, pH 4.0 para eluir el AFAIKL2. Las fracciones con A280 > 0.4 y una relación A280/A260 > 1.5 se agregaron y analizaron para determinar la pureza y el contenido de proteína. El rendimiento porcentual de esta etapa fue normalmente del 35 al 45 %. El material agrupado se diluyó con tampón de equilibrio SP a < 2.5 g/L, el pH se ajustó a 8.0 con Tris-Cl 2 M pH 8.0, se agregó DTT a 2.5 mM y el agrupamiento acondicionado se mezcló durante 60 minutos para reducir completamente la proteína desnaturalizada. La solución de proteína desnaturalizada se diluyó luego a una concentración final de proteína de menos de 0.1 mg/ml en el tampón de replegamiento que contenía Tris-Cl 25 mM, pH 8.5. El replegamiento se llevó a cabo a 2-8 °C y se siguió mediante el ensayo de Ellman y HPLC de fase inversa C18 hasta que el nivel de sulfhidrilo libre fue < 0.75 pM y solo se pudo detectar la proteína completamente oxidada.
La solución de proteína replegada se cargó sobre una columna Q-Sepharose XL preequilibrada con imidazol 25 mM pH 6.8 y la columna se lavó con tampón de equilibrio hasta que el A280 fue < 0.05, seguido de imidazol 25 mM pH 6.8 que contenía NaCl 50 mM hasta que el A280 fue < 0.01. Después, la proteína se eluyó con imidazol 25 mM pH 6.8 que contenía NaCl 150 mM y se recolectaron las fracciones hasta que el A280 fue < 0.3. Las fracciones se combinaron para crear un agrupamiento diana con no menos del 97 % de pureza y un rendimiento de no menos del 45 %. El agrupamiento luego se concentró a 3-5 g/L utilizando un sistema UF/d F con cartuchos de MWCO 5000 de celulosa regenerada Hydrosart, seguido de intercambio de tampón contra tampón fosfato 10 mM pH 7.0 y liofilización.
Química de conjugación
La conjugación se llevó a cabo en dos etapas (Figura 6). En la primera etapa, los grupos amina primaria sobre AFAIKL2 se activaron por reacción con la porción de éster NHS de SIAB. En la segunda etapa, el AFAIK2 activado se acopló a grupos tiol sobre ureasa a través del extremo yodoacetamida de SIAB. Como se muestra en la Figura 6, la síntesis del producto conjugado L-DOS47 es una reacción de dos etapas. La etapa 1 es una activación del anticuerpo utilizando SIAB y la etapa 2 implica la conjugación del anticuerpo activado con la enzima ureasa para formar el bioconjugado L-DOS47.
Activación del anticuerpo AFAIKL2. Se disolvió AFAIKL2 liofilizado (25 g) en agua para inyección (WFI). Se disolvió SIAB (2.00 g) en DMF anhidro y se agregó a la solución de AFAIKL2 en tres alícuotas iguales con 60 minutos de agitación después de cada adición. Una hora después de la adición final de SIAB, cualquier grupo NHS que quedara sin reaccionar se inactivó mediante la adición de un exceso de 10X molar de glicina sobre la cantidad original de SIAB agregada. Para eliminar el SIAB hidrolizado y desactivado con glicina, la solución de reacción se concentró a 10 mg/ml de AFAIKL2 utilizando un Sartorious Sartocon 5000 Da MWCO seguido de intercambio de tampón en acetato de sodio 10 mM, pH 6.5, EDTA 1 mM.
Conjugación de anticuerpo activado a ureasa. Se mezcló ureasa de alta pureza (50 g) con AFAIKL2 activado en acetato de sodio 10 mM pH 6.5, EDTA 1 mM. A continuación, se llevó el pH a 8.3 mediante la adición de borato de sodio 1 M, pH 8.5, lo que permite que el grupo yodoacetilo del anticuerpo activado reaccione con los residuos de cisteína disponibles sobre la ureasa. Se dejó que la reacción prosiguiera durante 90 minutos con agitación. A continuación, los grupos yodoacetilo sin reaccionar se inactivaron mediante la adición de un exceso de 10X molar de cisteína sobre la cantidad original de SIAB agregada y la solución se mezcló durante 60 minutos. Para eliminar el AFAIKL2 no conjugado, el L-DOS47 se concentró hasta una diana de 6 mg/ml utilizando un Sartorious Sartocon 100 000 Da MWCO seguido de intercambio de tampón en L-histidina 10 mM, pH 6.8, EDTA 0.2 mM. Se agregó sacarosa hasta una concentración final del 1 % p/v y el L-DOS47 se diluyó hasta una concentración diana de 1.8 g/L con L-histidina 10 mM, pH 6.8, EDTA 0.2 mM.
Cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) para evaluación de pureza. Se empleó un sistema de HPLC Waters 2695 con un 996 PAD con el software Empower 2 para la adquisición y el procesamiento de datos. Los cromatogramas se registraron en 210-400 ± 4 nm con la señal a 280 nm extraída para su procesamiento. La separación se realizó sobre una columna Superose 6 100/300 GL (GE). Las proteínas se eluyeron en fosfato 10 mM, NaCl 50 mM, EDTA 0.2 mM, pH 7.2. La separación se llevó a cabo con un flujo isocrático a 0.5 ml/min después de inyección de 100 pl de muestras puras. La columna se hizo funcionar a temperatura ambiente mientras que la temperatura de la muestra se controló a 5 ± 2 °C.
Cromatografía de intercambio iónico (IEC) para ureasa residual. Se empleó un sistema de HPLC Waters 2695 con un 996 PAD y software Empower. Los cromatogramas se adquirieron sobre 210-400 nm ± 4 nm con la señal a 280 nm extraída para su procesamiento. La columna (Mono-Q 5/50 GL, GE) se hizo funcionar a temperatura ambiente mientras que la temperatura de la muestra se controló a 5 ± 2 °C. Los tampones de elución contenían acetato 50 mM, polisorbato 80 al 0.025 % (superpuro, HX2, NOF Corporation, Tokio) con (Tampón B) o sin (Tampón A), NaCl 0.70 M, pH 5.50. La columna se equilibró con tampón B al 15 % y tampón A al 85 % durante 6 min a un índice de fluidez de 1 ml/min (6 CV) antes se inyectaron las muestras. Después de un ciclo de lavado (tampón B al 15 % a 1.0 ml/min durante 6 min), las proteínas se eluyeron mediante un gradiente de tampón B al 15-60 % en 20 minutos con un índice de fluidez de 0.5 ml/min. Después de limpiar con tampón B al 100 % durante 6 minutos a 1.0 ml/min, la columna se volvió a equilibrar con tampón B al 15 % antes de la siguiente inyección de muestra. Se agregaron 800 pl de muestras puras de L-DOS47 con estándar de referencia de ureasa HP hasta porcentajes finales de 0-8 % p/p y se inyectaron 50 pl/muestra. Se utilizó la altura pico para calcular el contenido de ureasa residual utilizando la adición estándar como método de calibración.
La electroforesis en gel de microcanal Experion SDS se utiliza para la determinación de la relación de conjugación. Se emplearon un sistema de electroforesis automático BioRad Experion y un kit de electroforesis en gel BioRad SDS (Kit Pro260) para analizar las relaciones de conjugación de L-DOS47. Las muestras se diluyeron con tampón Tris-HCl (10 mM, EDTA 0.2 mM, pH 7.0) hasta una concentración de proteína diana de 0.5 mg/ml, luego se mezclaron 4 pl de muestra diluida o escala de peso molecular con 2 pl de tampón de muestra y se centrifugaron brevemente. Las muestras se calentaron a 70 °C durante 10 minutos y luego se cargaron sobre el chip de microcanales después de que el sistema y los canales se cebaron con una solución de tinción en gel. Los electroferogramas se registraron automáticamente mediante el software Experion.
Transferencia Western para caracterización de identidad. Las muestras de prueba L-DOS47 y los controles AFAIKL2/HPU se resolvieron mediante electroforesis en gel SDS-PAGE y luego se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa utilizando el sistema Invitrogen iBlot. Se hicieron transferencias por duplicado a partir de geles que se corrieron en paralelo. La confirmación de la identidad de AFAIKL2 requiere la detección utilizando un anticuerpo primario IgG anti-AFAIKL2 de conejo (Rockland) con detección secundaria utilizando un IgG anti-conejo de cabra conjugado con fosfatasa alcalina (AP) (Sigma). La confirmación de la identidad de la ureasa requiere la detección utilizando un anticuerpo primario IgG anti-ureasa de conejo (Rockland) con detección secundaria utilizando un IgG anti-conejo de cabra conjugado con AP (Sigma). Para la detección utilizando IgG anti-AFAIKL2, las muestras de L-DOS47 se diluyeron a 0.002 mg/mL en 1X TBS que contenían 0.1 mg/mL de BSA y luego se mezclaron 1:1 con tampón de carga de gel de proteína, se calentaron a 70 °C durante 10 minutos y se cargaron 0.01 pg de L-DOS47 por línea. Para la detección utilizando IgG anti-ureasa, las muestras de L-DOS47 se diluyeron a 0.02 mg/mL en 1X TBS que contenían 0.1 mg/mL de BSA, luego se mezclaron 1: 1 con tampón de carga de gel de proteína, se calentaron a 70 °C durante 10 minutos y se cargaron 0.1 pg de L-DOS47 por línea. El desarrollo final de las transferencias Western se realizó con tampón A p que contenía NBT/BCIP.
ELISA de L-DOS47 con diferentes relaciones de conjugación
Para estudiar el efecto de la relación de conjugación sobre la afinidad de la unión de L-DOS47 a su antígeno diana CEACAM6, se produjeron conjugados de L-DOS47 con diferentes relaciones de conjugación a escala de laboratorio al ajustar las relaciones molares AFAIKL2/HPU durante conjugación. Las relaciones de conjugación de los conjugados resultantes se determinaron mediante SDS-Experion y las concentraciones de proteínas se determinaron mediante micro Lowry utilizando un kit de proteína total (Sigma, TP0200). Se recubrieron placas de microvaloración con 100 pl/pozo de CEACAM6-A, el dominio A del antígeno CEACAM6 completo (2.5 pg/ml en PBS) y se incubaron a temperatura ambiente durante 6 horas. Las placas se lavaron dos veces con Tampón A (BSA al 0.05 % en PBS), se bloquearon con 150 pl/pozo de BSA al 3%/PBS a 4 °C durante la noche y luego se lavaron dos veces con Tampón A. Todas las etapas posteriores se realizaron a temperatura ambiente con agitación suave. Se agregó L-DOS47 (100 pl/pozo) y se incubó durante 2 horas, las placas se lavaron 3 veces con Tampón A, luego se agregaron 100 pl/pozo de IgG anti-ureasa (1: 12000, Rockland) y se incubaron durante 1 hora. Después de tres lavados con Tampón A, se agregaron 100 pl/pozo de IgG-AP anti-conejo de cabra (1: 6000, Sigma) y se incubó durante 1 hora. Después de tres lavados con Tampón A, se agregaron 100 pl/pozo de solución de sustrato AP y se incubó durante 25 min. La absorbancia se determinó a 405 nm.
Determinación de los sitios de activación en el anticuerpo AFAIKL2
Para preparar cisteína marcada con fluoresceína (Cys-FL), se hizo reaccionar cisteína en exceso con éster de NHS fluoresceína (Pierce) en borato 1 M, pH 8.0 durante 60 minutos a temperatura ambiente. La solución de reacción se separó mediante RP-HPLC con una columna C8. La fracción de pico de Cys-FL se identificó mediante espectrometría de masas MALDI y su concentración se determinó mediante espectrometría de acuerdo con su coeficiente de extinción a 493 nm y pH 7. Se liofilizaron alícuotas de la fracción de pico y se almacenaron en la oscuridad a -20 °C. El anticuerpo AFAIKL2 se activó primero con el entrecruzador SIAB a escala de laboratorio y el SIAB hidrolizado se eliminó mediante una columna de desalinización G25 preparada internamente. Se dejó que el anticuerpo activado reaccionara con la cisteína marcada con fluoresceína (Cys-FL) en tampón de borato 100 mM pH 8.3 durante 90 minutos a temperatura ambiente. Se cambió el tampón de la solución de reacción con hidrogenocarbonato de amonio 30 mM mediante una columna de desalinización G25 y se diluyó el AFAIKL2-Cys-FL resultante hasta 0.5-0.8 mg/ml en hidrogenocarbonato de amonio 30 mM que contenía acetonitrilo al 20 %. Se agregó tripsina (Promega) a una relación final de proteína a tripsina de 20:1 y la digestión se llevó a cabo a 37 °C durante 36 horas. La digestión tríptica resultante se redujo al agregar TCEP 0.1 M a una concentración final de 2 mM y luego se separó mediante HPLC de fase inversa (sistema Agilent 1100 con una columna Zobax 300SB-C18. 5 pm, 4.6 x 150 mm, gradiente de acetonitrilo al 0 a 45 %, TFA al 0.025 % en 55 minutos) y la absorción se registró a 420 nm. Debido a que la lisina activada por SIAB sobre AFAIKL2 estaba ligada a la cisteína marcada con fluoresceína, no era probable que fuera accesible por tripsina y debería generarse el péptido (XnKXm)-Cys-FL. Se recolectaron las fracciones de pico que contenían péptidos modificados con fluoresceína y se aplicó espectrometría de masas MALDI en modo Reflectron (Micromass Tof 2e). Las áreas de los picos de HPLC de los péptidos correspondientes se utilizaron para calcular el porcentaje de distribución de cada sitio de activación.
El mapeo de péptidos y la identificación de péptidos conjugados se realizaron mediante espectrometría de masas ESI. Se empleó un espectrómetro de masas Waters Xevo G2 QTOF y un sistema Acquity UPLC de clase H con una columna BEH300 C18 (1,7 pm, 2.1 x 150 mm). Cada muestra de L-DOS47 (1.5-2.0 mg/ml, 50.0 pl) se mezcló con 0.063 ± 0.003 g de guanidina-HCl. Una vez que la sal se disolvió por completo, se agregaron 1.50 pl de DTT 0.7 M y la solución se incubó a 60 °C durante 30 minutos. Se agregaron 10.0 pl de yodoacetamida (IAA) 0.20 M y el pH se ajustó a 8.0 - 8.5 con solución saturada de Tris-Base. La muestra se incubó a 37 °C durante 60 minutos. Se mezclaron 50.0 pl de cada muestra alquilada con 15.0 pl de CaCl20.1 M y 80.0 pl de tampón Tris (Tris-HCl 50 mM, pH 8.0), luego se agregaron 3.00 pl de solución de tripsina 0.5 mg/ml. La digestión tríptica se llevó a cabo a 37 °C durante 20-24 horas. Después de digestión tríptica, se mezclaron 50.0 pl de la digestión con 0.50 pl de ácido fórmico puro para análisis LC-MS. La temperatura de la columna se fijó a 60 °C y se utilizaron el Solvente A (ácido fórmico al 0.075 % v/v en agua) y el Solvente B (ácido fórmico al 0.075 % en acetonitrilo) para la separación por UPLC. La UPLC se realizó con un índice de fluidez de 0.15 ml/min con un gradiente de Solvente B al 0 a 55 % en 80 minutos.
El análisis de LC-MS se controló mediante el software Masslynx V4.1. La adquisición de datos LC-MSETIC (recuento total de iones) se llevó a cabo en un rango M/Z de 50-2000 Da en modo de resolución con una tasa de exploración de 0.3/s, voltaje capilar 3.0 kV, voltaje del cono de muestra 25 V, voltaje del cono de extracción 4.0 kV. La adquisición de datos de TIC de fragmentación inducida por colisión de alta energía se realizó con una rampa de energía de colisión de 20 a 40 V. La temperatura de la fuente de iones se fijó en 100 °C y la temperatura de desolvatación se fijó en 300 °C. El flujo de gas de desolvatación fue de 600 l/hora. Se adquirió un conjunto de datos brutos de TIC de masa de bloqueo en tiempo real (barrido/20 s) con 100 fmoles/pl de Glu-Fib B a un índice de fluidez de 3.0 pl/minuto.
Los datos brutos de espectrometría de masas se procesaron con BioPharmalynx (v1.2) en modo de mapa de péptidos con una resolución de 20000. Se aplicó una masa de bloqueo de 785.8426 Da para la calibración de masa punto a punto en tiempo real. El umbral de intensidad de iones de MS de baja energía se estableció en 3000 recuentos, y el umbral de intensidad de iones de alta energía de MSE se estableció en 300 recuentos. Las tolerancias de igualación de masas se establecieron en 15 ppm para los conjuntos de datos MS y MSE. Las secuencias de aminoácidos de AFAIKL2 y ureasa se introdujeron en la biblioteca de secuencias para el emparejamiento/identificación de péptidos. Se aplicaron modificadores variables que incluyen Desamidación N, Desamidación succinimida N, Oxidación M, Oxidación 2xM, K, Na y un modificador fijo de Carbamidometil C (para cisteína alquilada) para el análisis del mapa de péptidos. Para identificar los péptidos conjugados en el lado de AFAIKL2, los péptidos de ureasa que contienen cisteína más la sección de ligamiento del entrecruzador SIAB (C9H7O2N, 161.0477 Da) se crearon como modificadores de variables y se incluyeron en la biblioteca de modificadores de variables. En este caso, se incluyó Carbamidometil C como modificador variable. Para identificar los péptidos conjugados en el lado de la ureasa, se crearon los péptidos lisina en medio XnKXm de AFAIKL2 más la sección de ligamiento de SIAB como modificadores de variables y se incluyeron en la biblioteca de modificadores de variables.
Ensayo de unión de células completas de L-DOS47
Se prepararon monocapas de células al sembrar 100 pl/pozo de células MCF-7, BxPC-3 y A549 (4x104 células/pozo) en placas de cultivo de 96 pozos e incubar durante la noche a 37 °C. A continuación, se retiró el medio de las placas y se fijaron las monocapas de células con 100 pl/pozo de glutaraldehído al 0.05 % en PBS durante 10 min a temperatura ambiente (Ta). Después, las placas se lavaron con PBS y se agregaron 120 pl/pozo de glicina 50 mM. Después de la incubación a 37 °C durante 20 min, las placas se bloquearon con 120 pl/pozo de BSA al 1 %/PBS a 37 °C durante 30 min. Después, las placas se lavaron 3 veces con Tampón A (BSA al 0.05 % en PBS) y se agregaron 80 pl/pozo de L-DOS47 o DOS47 diluido y se incubaron a 37 °C durante 1.5 horas. Las placas se lavaron 4 veces con Tampón A y se agregaron 80 pl/pozo de urea 20 mM en PBS 0.1 M, pH 7.6 y se incubaron a 37 °C durante 30 min. Después de incubación, se agregaron 40 pl/pozo de HCl 1 N para detener la reacción. La cantidad de amoniaco producida en cada pozo se determinó utilizando un ensayo de indofenol modificado. En resumen, la Solución A se preparó recientemente al disolver 165 mg de fenol y 132 mg de NaOH en 10 ml de agua, seguido de la adición de 66 pl de solución de nitroprusiato de sodio (10 mg/ml). La Solución B se preparó al agregar 40 pl de hipoclorito de sodio a 5 ml de agua. Las soluciones de muestra (30 pl cada una) del ensayo de unión de células completas se transfirieron a una nueva placa de 96 pozos que contenía 50 pl/pozo de NaOH 5 N:H2O (3.3: 46.7) y 20 pl/pozo de agua. Se agregaron Solución A (50 pl/pozo) y Solución B (50 pl/pozo) y las placas se transfirieron luego a un lector de microplacas para el desarrollo del color a 37 °C durante 30 minutos. La OD se midió a 630 mn. La cantidad de amoníaco producido en los pozos se calculó a partir de una curva de calibración utilizando cloruro de amonio de 0 a 150 mM como estándares.
Ensayo de citotoxicidad de L-DOS47. Se prepararon monocapas de células al sembrar 100 pl/pozo de células MCF-7, BxPC-3 y A549 (4 x 104 células/pozo) en placas de cultivo de 96 pozos e incubar durante la noche a 37 °C. A continuación, se retiró el medio de las placas y se agregaron 80 pl/pozo de L-DOS47 o DOS47 diluido y se incubó adicionalmente a 37 °C durante 2 horas. Después de la incubación, las placas se lavaron 3 veces con tampón KR-II/BSA al 0.05 % y se agregaron 100 pl/pozo de solución de urea 20 mM. Las placas se incubaron a 37 °C durante la noche, luego se retiró el medio y se reemplazó con 100 pl/pozo de medio solo. La viabilidad celular se determinó utilizando un ensayo de viabilidad celular MTS, en el que se preparó una solución 21:1 v/v de MTS/PES (MTS, 2 mg/ml; PES, 1 mg/ml) y se agregaron 20 pl/pozo de la mezcla a las placas. A continuación, las placas se incubaron a 37 °C durante 1 hora y se midió la OD a 630 nm con referencia a 490 nm.
La ureasa de judía gigante es una enzima hexámera que consta de seis subunidades idénticas de aproximadamente 91 kDa cada una con 15 residuos de cisteína no unidos por subunidad. El anticuerpo AFAIKL2 contiene siete aminas primarias y un enlace disulfuro. Las aminas primarias sobre el anticuerpo y los residuos de cisteína sobre la ureasa son las bases para la conjugación química a través de un entrecruzador heterobifuncional. Sin embargo, el tamaño molecular del conjugado y la naturaleza de las dos proteínas crearon desafíos en la producción, purificación y caracterización a gran escala del producto conjugado. El inmunoconjugado debe ser soluble y estable en un medio acuoso cercano al pH fisiológico para uso como fármaco parenteral; por lo tanto, el punto isoeléctrico (pl) del anticuerpo recombinante requirió un diseño de secuencia cuidadoso ya que la ureasa se extrae de una fuente vegetal y su pl (pl observado 4.8-5.1) no se pudo alterar. La optimización para asegurar la uniformidad de la reacción y la eliminación de los reactivos residuales y los productos secundarios fue fundamental para la química de la conjugación. Aunque varios entrecruzadores [24, 30] se utilizan ampliamente para conjugaciones de proteínas y se cribaron durante el desarrollo, se eligió N-succinimidil[4-yodoacetil] aminobenzoato (SIAB) para la producción de conjugado L-DOS47 debido a las diferencias en el pH óptimo para las dos reacciones de entrecruzamiento. Durante la producción, el anticuerpo se activa con el entrecruzador a pH 7.0, luego se cambia el tampón a pH 6.5 y se mezcla con ureasa. A continuación, el anticuerpo se liga a la ureasa al aumentar el pH del medio de reacción a 8.3. Debido a que la tasa de reacción que une el AFAIKL2 activado con la ureasa es muy baja a pH 6.5, y la uniformidad del material en un recipiente de reacción grande se asegura al premezclar a pH 6.5. Por lo tanto, la distribución de ureasa libre residual y la subespecie de ureasa-(Ab)x están determinadas únicamente por la probabilidad y las relaciones molares del material. En relaciones de conjugación de 8-11 anticuerpos/ureasa, el contenido de ureasa residual es teóricamente insignificante y el conjugado L-DOS47 puede purificarse utilizando ultradiafiltración para eliminar el anticuerpo que no ha reaccionado y el entrecruzador hidrolizado. Los cromatogramas de exclusión de tamaño del conjugado L-DOS47, AFAIKL2 libre y ureasa libre se muestran en la Figura 7.
El conjugado L-DOS47 se eluye a ~24.6 minutos, el dímero (posiblemente ligado por un enlace disulfuro o por una molécula AFAIKL2 activada con dos SIAB) se eluye como un pequeño pico no resuelto a los 20.5 minutos, y el polímero se eluye como un pico traza en el tiempo vacío (~15 minutos). Un pico traza en ~40 minutos representa los componentes del tampón. El ancho del pico del conjugado L-DOS47 es ligeramente mayor que el de la ureasa libre pero comparable al de la ureasa libre, lo que sugiere una reacción de conjugación distribuida uniformemente. El anticuerpo libre se eluye a los 37 minutos. Un pequeño pico no resuelto al frente del pico del anticuerpo representa un dímero no covalente. Normalmente se observa una alta pureza del anticuerpo (> 95 %) en los lotes de producción, con especies de alto peso molecular que incluyen dímeros que no superan el 5 %. HPU normalmente se eluye con un pico principal a -26.9 minutos, un pico de dímero pequeño a los 24 minutos y un pico de polímero traza a los 15 minutos. La purificación de ureasa cruda a HPU dio como resultado ~97 % de monómero, mientras que la suma de dímero y polímero no es más del 3%. Por lo general, se logra una pureza mayor de 95 % de L-DOS47 mediante una simple purificación utilizando solo ultradiafiltración. Debido a que el SEC se hace funcionar bajo condiciones nativas, puede determinar cambios en los pesos moleculares efectivos debido a la degradación y disociación de las estructuras cuaternarias de proteínas; por lo tanto, este método también se utiliza como ensayo indicador de estabilidad para L-DOS47. La presencia de ureasa libre residual en L-DOS47 se evaluó mediante cromatografía de intercambio iónico (Figura 8).
La ureasa libre residual se eluye a los 15.33 minutos, que está muy cerca del pico de ureasa agregada (15.42 minutos). El pico de HPU está bastante bien resuelto a partir del gran pico de L-DOS47 (Rs de 1,48). Como se muestra en el inserto de la Figura 8, el método de adición estándar (L-DOS47 agregado con 2.4 %, 4.8 % y 7.2 % p/p de HPU) para determinar el contenido de ureasa residual presenta una buena linealidad (R2 de 0.9995). El contenido de ureasa residual calculado de esta muestra es 0.72 %, y la ureasa residual no ha superado el 2 % en todos los lotes de producción hasta la fecha, lo que demuestra que la ureasa residual es prácticamente insignificante bajo estas condiciones y que el proceso de fabricación no requiere una etapa adicional para separar el conjugado L-DOS47 de ureasa no conjugada.
Durante la producción de L-DOS47, cada una de las seis subunidades de ureasa monomérica se puede conjugar con cero, una, dos, tres o cuatro moléculas AFAIKL2; por lo tanto, bajo condiciones de desnaturalización, SDS-Experion de L-DOS47 produce un patrón de múltiples picos/bandas discretos de -90-155 kDa. Adicionalmente, durante la reacción de activación del anticuerpo, una pequeña porción del anticuerpo se puede activar aleatoriamente con dos SIAB por molécula de anticuerpo (AFAIKL2-(SIAB)2), lo que da como resultado la conjugación de cada una de esas moléculas de anticuerpo con dos subunidades de ureasa. En consecuencia, las dos subunidades de un anticuerpo producen un segundo conjunto más pequeño de picos/bandas mal resueltos que varían de 200-260 kDa.
En la Figura 9, el Panel 2 representa una imagen de gel virtual y el Panel 1 contiene una superposición de los electroferogramas de las líneas 1 y 4. La muestra de escala de laboratorio L-DOS47 en las líneas 1 - 2 y 7 - 8 se produjo con AFAIKL2 activado que se había purificado mediante cromatografía de intercambio iónico antes de la segunda reacción de conjugación. Debido a que se eliminó la especie AFAIKL2-(SIAB)2, el conjugado resultante carecía de las subunidades entrecruzadas y se observó un único conjunto de picos/bandas. En la muestra de L-DOS47 en las líneas 3-6, el AFAIKL2 se había utilizado directamente en conjugación después de la etapa de activación sin purificación adicional y, en consecuencia, está presente el pequeño segundo conjunto de picos/bandas. Las líneas 9 y 10 estaban sobrecargadas con una muestra de HPU.
Las áreas de los picos (Figura 9, Panel 1) y las intensidades de banda (Figura 9, Panel 2) dependen de las abundancias relativas de subunidades de ureasa ligadas con el número correspondiente de moléculas de anticuerpo. Las áreas pico se integraron en el software después de la corrección del valor de referencia y la relación de conjugación (CR) de L-DOS47 se calcula de la siguiente manera (véase la Figura 10, que representa la línea 2 del gel de la Figura 9):
CR= 6 *( PK, *0+ PK:*¡+PK) *2+PK4 *J+PK, *4}/( PK,+PK2+PK<+PK4+PKf)
Donde PKi (i = 1-5) es el área pico de la subunidad de ureasa ligada con moléculas de anticuerpo i-1.
Debido a que el anticuerpo activado no se somete a purificación cromatográfica de intercambio iónico durante la producción a gran escala de L-DOS47, el segundo conjunto de picos mal resueltos aparece en los electroferogramas de estas muestras. Sin embargo, se espera que los dos conjuntos de picos tengan patrones de intensidad similares ya que la distribución del sitio de activación está determinada por la probabilidad y por la relación molar de anticuerpo a SIAB. Por lo tanto, este segundo conjunto de picos no se utiliza para calcular las relaciones de conjugación porque las bandas están mal resueltas y se solapan con el marcador de peso molecular de 260 kDa. Mientras que la especie AFAIKL2-(SIAB)2 teóricamente podría generar conjugados de dímeros o polímeros al ligarse a dos subunidades de diferentes moléculas de ureasa nativa, los niveles mínimos (menos del 3%) de las áreas de picos de dímero y polímero combinados observados en el cromatograma de exclusión de tamaño de la muestra de L-DOS47 (Figura 7) sugiere que la mayoría de las especies AFAIKL2-(SIAB)2 contribuyen al ligamiento entre subunidades de una única molécula de ureasa nativa para producir el monómero L-DOS47 y no a ligamientos intermoleculares para producir conjugados de dímero y polímero. Además, la presencia de estos picos de dímeros y polímeros en los cromatogramas SEC se podría atribuir lógicamente a enlaces disulfuro porque también aparecieron picos similares en los cromatogramas de exclusión por tamaño de HP ureasa. Por lo tanto, el segundo conjunto de picos en los electroforegramas no se emplea como parámetro para el control de calidad.
La relación de conjugación de L-DOS47 es crítica para su afinidad por CEACAM6, el antígeno tumoral dirigido por el anticuerpo. Se produjo L-DOS47 con diferentes relaciones de conjugación (1.8 a 12 AFAIK por ureasa) al ajustar las relaciones molares de AFAIKL2/HP ureasa para evaluar el efecto de la relación de conjugación sobre la afinidad de unión. Se encontró que la afinidad de unión de L-DOS47 a CEACAM6-A inmovilizado era directamente proporcional al número de anticuerpos conjugados con ureasa (Figura 11). Cuantos más anticuerpos se conjugaron, mayor fue la señal de unión que se observó. Sin embargo, el efecto fue menos profundo en relaciones de conjugación de 6 o más.
El análisis de L-DOS47 mediante transferencia Western dual (Figura 12) confirma el patrón de bandas visto mediante SDS-Experion. El recuadro insertado muestra un agrandamiento de la región encuadrada de la transferencia principal en la que se marcan la ureasa y las especies conjugadas (N1-N4 que corresponde a ureasa con 1 a 4 AFAIKL2 conjugado respectivamente). Cuando se sondea con un anticuerpo antiureasa, la banda de ureasa de 91 kDa es la que se visualiza con mayor intensidad y disminuye la intensidad de las bandas de mayor peso molecular (que corresponde a especies más altamente conjugadas). Por el contrario, cuando se sondea con un anticuerpo anti-AFAIKL2, la banda de 91 kDa es apenas visible y las dos bandas siguientes de mayor peso molecular son las más intensas (N1 y N2). Esto se debe al hecho de que son las bandas dominantes en el conjugado. La capacidad de L-DOS47 para ser visualizado por los anticuerpos anti-AFAIKL2 y anti-ureasa demuestra la presencia de ambas especies en el conjugado, y la especificidad de los anticuerpos se confirma por el hecho de que el anticuerpo anti-AFAIKL2 no se une a ureasa y el anticuerpo anti-ureasa no se une a AFAIKL2.
Debido a que L-DOS47 es un conjugado químico de AFAIKL2 y ureasa, los péptidos trípticos tanto del anticuerpo como de la enzima ureasa así como los péptidos entrecruzados covalentemente de ambas proteínas se deben detectar a partir de digestiones trípticas del conjugado. Se realizó el mapeo de péptidos ESI LC-MSE para caracterizar el conjugado. Como se muestra en el contenido asociado, los péptidos de AFAIKL2 aparecieron en el espectro L-DOS47 pero no en el espectro de ureasa HP. A partir de las digestiones trípticas de L-DOS47, las coberturas de péptidos para las secuencias de aminoácidos de AFAIKL2 y ureasa fueron del 100 % con un error de masa atípico de menos de 6 ppm y cada uno de los péptidos fue confirmado por sus iones de fragmentos MS/MS b/y de alta energía con errores de masa de menos de ± 15 ppm.
Para identificar los sitios de activación de AFAIKL2 y para determinar la distribución de cada sitio de conjugación, se activó AFAIKL2 utilizando SIAB y luego se conjugó con cisteína marcada con fluoresceína (Cys-FL). Después de la digestión con tripsina del AFAIKL2-Cys-FL resultante y la separación por cromatografía RP-HPLc , se recolectaron las fracciones de los picos para MALDI-Ms para identificar los péptidos trípticos de anticuerpos unidos a Cys-FL. Debido a que solo los sitios activados por SIAB se pueden unir a Cys-fluoresceína, para la cual la longitud de onda de absorción máxima en TFA al 0.025 % es 420 nm, solo se deben detectar los picos de péptidos activados a 420 nm. Por ejemplo, si la lisina # 32 de AFAIKL2 es activada por SIAB, debería estar ligada a Cys-FL y este sitio de digestión tríptica se perderá durante la digestión tríptica; por lo tanto, se debe observar un pico con una masa molecular de 2768.113 Da que represente el péptido de lisina en medio ligado a Cys-FL, (LSCAAHDPIFDK32NLMGWG)-Cys-FL (SEQ ID NO: 7), denotado como L2K32-Cys-FL. El cromatograma RP-h PlC de una digestión tríptica de AFAIKL2-Cys-FL se muestra en la Figura 13.
Los péptidos conjugados identificados con valores de masa detectados también se marcan en los picos de HPLC correspondientes en la Figura 13. De acuerdo con la secuencia de aminoácidos del anticuerpo, las aminas primarias de los seis residuos de lisina y la amina de terminal N están teóricamente disponibles para la reacción de activación. Sin embargo, en la práctica solo cuatro de ellos se activaron sustancialmente. Lo más probable es que esto se deba a que la estructura terciaria del anticuerpo expone esas cuatro aminas primarias en la superficie mientras que entierra las otras dentro de la estructura nativa. La distribución de cada sitio de activación (Tabla 4) se calculó de acuerdo con su área pico y la suma de todas las áreas pico de HPLC identificadas en la Figura 13.
T l 4. Ár i r n i ri i n ii iv i n r AFAIKL2
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Como se muestra en la Tabla 4, el sitio más activo del anticuerpo para el entrecruzador es L2K76, seguido de L2M1 y luego L2 K44. L2 K32 es esencial para la unión de anticuerpos y también es el sitio menos activo, pero aún contribuye a ~18 % de la reactividad total. Para L-DOS47, el AFAIKL2 activado por entrecruzador se ligó covalentemente a los residuos de cisteína expuestos sobre la superficie de la estructura cuaternaria de ureasa. Por tanto, se deben detectar los péptidos entrecruzados covalentemente a partir del espectro de péptidos de una digestión tríptica de L-DOS47.
Para identificar los péptidos entrecruzados covalentemente, los datos brutos de ESI LC-MSE de las digestiones trípticas de las muestras de L-DOS47 fueron procesados por BiopharmaLynx, pero se buscaron con una biblioteca de modificadores de variables que contenía un conjunto de modificadores creado por el usuario para los 15 residuos de cisteína en el lado de la ureasa. De acuerdo con la distribución de activación en la Tabla 4, esos modificadores creados por el usuario fueron los tres péptidos de lisina en medio más la porción de ligamiento de SIAB (C9H5O2N, 159.0320 Da) (denotado como L2 K76, L2 K44 y L2 K32), y la metionina de terminal N más el enlace (indicado como L2 M1). Los resultados (detalles en el contenido asociado) demostraron que entre los 15 residuos de cisteína de cada subunidad de ureasa, solo 6 estaban sustancialmente conjugados. La cisteína más accesible es UCs24, seguida en orden por UC663, UC59, UC207, UC329 y UC268. El residuo de cisteína CyS592, que es esencial para la actividad de la enzima ureasa, no se conjugó sustancialmente. Las accesibilidades relativas de los cuatro sitios AFAIKL2 activados por entrecruzadores a cada uno de los seis residuos de cisteína en el lado de la ureasa también fueron diferentes. Por ejemplo, UC329 solo era accesible para L2Mi. Esos sitios de conjugación sustanciales también fueron confirmados por sus perfiles de fragmentos MS/MS. Como ejemplo, el péptido conjugado, L2 K32UC663 cuya secuencia es (LSCAAHDPIFDKNLMGWGR (SEQ ID NO: 8))-ligamiento-(CDSSDNDNFR (SEQ ID NO: 9)) y que tiene una masa de péptido de 3517.4873 se identificó con un error de coincidencia masiva de 2.1 ppm al buscarlo como CDSSDNDNFR, un péptido de ureasa (SEQ ID NO: 9) modificado con (LSCAAHDPIFDKNLMGWGR (SEQ ID NO: 8)) -ligamiento-(2346.0674 Da) del lado de AFAIKL2 como modificador. El mismo péptido también se identificó con un error de coincidencia masiva de 2.1 ppm al buscarlo como LSCAAHDPIFDKNLMGWGR (SEQ ID NO: 8) un péptido AFAIKL2 modificado con el ligamiento-(CDSSDNDNFR (SEQ ID NO: 9)) (1330.4520 Da) del lado de ureasa como modificador. El espectro de MS/MS inducido por colisión de alta energía de este péptido conjugado se mapeó con iones de fragmentos de 9 b/y del lado de ureasa al buscarlo como un péptido de ureasa modificado con el modificador del lado de AFAIKL2. También se mapeó el mismo espectro con iones de 14 b/y del lado de AFAIKL2 al buscarlo como un péptido AFAIKL2 con el modificador del lado de ureasa.
Se observaron diferentes perfiles de unión de L-DOS47 entre las estirpes celulares BxPC-3, A549 y MCF7 (Figura 14). Los resultados mostraron que L-DOS47 se unía bien a la estirpe celular pancreática BxPC-3, lo que indica que el antígeno CEACAM6 se expresó sobre la superficie celular. Se observó una unión moderada en la estirpe celular pulmonar A549, pero no se encontró unión en la estirpe celular de mama MCF7. El anticuerpo AFAIKL2, cuando se conjugó con la enzima ureasa (DOS47), proporcionó una diana específica hacia las células que expresan CEACAM6. Esto se confirmó por la ausencia de señal de unión en las tres estirpes celulares tratadas con el control DOS47 no conjugado.
Las células BxPC-3 eran muy susceptibles a la citotoxicidad de L-DOS47 (Figura 15), como muestra la rápida caída en la supervivencia celular observada cuando las células se trataron con menos de 1 pg/ml de L-DOS47. Se observó una citotoxicidad moderada en las células A549, mientras que no se observaron efectos en MCF7, de acuerdo con los resultados del estudio de unión. Además, el control negativo DOS47 no tuvo ningún efecto citotóxico sobre ninguna de las estirpes celulares.
Los procedimientos desarrollados para la conjugación y purificación del inmunoconjugado L-DOS47 se emplearon con éxito en su producción a gran escala. Utilizando la química de conjugación y las condiciones de reacción establecidas, se logró una buena uniformidad al mezclar previamente el anticuerpo activado por entrecruzador con el intermedio de ureasa HP y luego ajustar el pH para activar la reacción de conjugación. En relaciones de conjugación de 8-11 anticuerpos por molécula de ureasa, el contenido de ureasa residual era prácticamente insignificante y el conjugado L-DOS47 se podía purificar utilizando solo ultradiafiltración para eliminar el anticuerpo sin reaccionar y el entrecruzador hidrolizado y se evitó una etapa desafiante para separar la ureasa residual del inmunoconjugado final. Este procedimiento produjo un producto L-DOS47 de alta pureza (> 95 %) con ureasa libre a menos del 2 %. La afinidad de unión de L-DOS47 a CEACAM6-A inmovilizado según la evaluación de ELISA fue directamente proporcional al número de anticuerpos conjugados con ureasa, y se estabilizó cuando la proporción de conjugación fue mayor que 6. Las relaciones de conjugación variaron de 9 a 11 anticuerpos por molécula de ureasa para todas las tandas a gran escala, lo que demuestra que se había logrado una conjugación óptima en estas condiciones. El ensayo de transferencia Western de doble anticuerpo confirmó la identidad química del conjugado. El análisis de mapeo de péptidos ESI LC-MSE logró recuperaciones de secuencia del 100 % tanto para el anticuerpo como para la ureasa del inmunoconjugado L-DOS47. Las secuencias de péptidos con más de 3 residuos de aminoácidos, que incluyen las secuencias de terminal C y de terminal N de AFAIKl2 y ureasa, se confirmaron mediante mapas de fragmentos MS/MS b/y de los péptidos correspondientes. Los sitios de conjugación efectivos (4 en el lado de AFAIKL2 y 6 en el lado de ureasa) se identificaron mediante análisis de mapeo de péptidos ESI LC-MSE de muestras de L-DOS47. Esos péptidos entrecruzados se confirmaron mediante mapas de fragmentos MS/MS b/y de los péptidos relacionados tanto de los lados del anticuerpo como de la ureasa.
La especificidad de L-DOS47 hacia las dos estirpes celulares BxPC-3 y A549 que expresan CEACAM6 se ilustró por la ausencia de actividades de unión y citotóxicas de DOS47 frente a la contraparte L-DOS47 conjugada con anticuerpo. Entre las tres estirpes celulares probadas, BxPC-3 mostró la señal de unión más fuerte, mientras que A549 solo demostró una unión moderada. La señal de unión de BxPC-3 fue aproximadamente cinco veces mayor que la de A549. Los resultados fueron consistentes con aquellos observados en los ensayos de citotoxicidad. L-Do s 47 indujo un efecto citotóxico mucho mayor en BxPC-3 que en A549. No se observó respuesta citotóxica en MCF-7 debido a la falta de unión de L-DOS47. L-DOS47 se está investigando como un agente terapéutico potencial en estudios clínicos de fase I en humanos para el cáncer de pulmón de células no microcíticas.
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Claims (17)

REIVINDICACIONES
1. Una composición farmacéutica que comprende una solución acuosa farmacéuticamente aceptable adecuada para inyección intravenosa y un conjugado anticuerpo-ureasa de dominio único, en la que el conjugado tiene una relación de conjugación de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, o 12 fracciones de anticuerpos de dominio único por fracción de ureasa, y en la que dicha composición contiene menos del 10 % de ureasa no conjugada en base al peso del conjugado de anticuerpo-ureasa.
2. La composición farmacéutica de la reivindicación 1, en la que la ureasa no conjugada es menor de 5 % p/p, menor de 2 % p/p, o menor de 1 % p/p, y/o libre de solventes de HPLC no acuosos, y opcionalmente en la que el pH es 6.8 (+/-10 %).
3. La composición farmacéutica de la reivindicación 1 o 2, en la que el conjugado anticuerpo-ureasa de dominio único tiene una relación de conjugación de 6 o más fracciones de anticuerpos de dominio único por fracción de ureasa, u 8­ 11 fracciones de anticuerpos de dominio único por fracción de ureasa.
4. La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la ureasa es una ureasa de judía gigante.
5. La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que el anticuerpo de dominio único es un anticuerpo humanizado o no humano.
6. La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que el anticuerpo de dominio único tiene especificidad para un antígeno tumoral expresado por carcinoma de pulmón de células no microcíticas.
7. La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que el anticuerpo de dominio único tiene especificidad para CEACAM6, opcionalmente en la que:
(i) el anticuerpo de dominio único tiene una afinidad de unión a CEACAM6 con un valor Kd mayor que 1 x 10'6 M (+/-10 %);
(ii) el conjugado de anticuerpo de dominio único tiene una afinidad de unión a CEACAM6 con un valor Kd de no más de 1 x 10-8 M (+/-10 %);
(iii) el conjugado de anticuerpo de dominio único tiene una afinidad de unión a CEACAM6 con un valor Kd de no más de 1 x 10-10 M (+/-10 %);
(iv) el conjugado de anticuerpo de dominio único tiene una afinidad de unión a CEACAM6 con un valor IC50 de no más de 5 nM (+/-10 %);
(v) el conjugado de anticuerpo de dominio único tiene una afinidad de unión a CEACAM6 con un valor IC50 de 3.22 nM (+/-10 %); y/o
(vi) el conjugado de anticuerpo de dominio único se une a CEACAM6 con un valor IC50 de 20 pg/ml (+/-10 %).
8. La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que el anticuerpo de dominio único comprende un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO.1, o el anticuerpo de dominio único comprende un polipéptido que comprende al menos una modificación a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO.1.
9. La composición de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, para uso en el tratamiento de cáncer en un sujeto.
10. La composición para uso de acuerdo con la reivindicación 9, en la que el cáncer es uno o más de carcinoma de pulmón de células no microcíticas, cáncer de mama, páncreas, ovario, pulmón, colon, o una combinación de los mismos, preferiblemente carcinoma de pulmón de células no microcíticas.
11. Un método para preparar una composición que comprende un conjugado anticuerpo-ureasa de dominio único que contiene menos del 5 % de ureasa no conjugada en base al peso del conjugado de anticuerpo-ureasa, cuyo método comprende:
(1) combinar un anticuerpo de dominio único activado y la ureasa en un solvente en el que el anticuerpo de dominio único activado y la ureasa sustancialmente no reaccionan para formar una mezcla de reacción, en la que la distribución del anticuerpo de dominio único activado y la ureasa en el solvente es uniforme;
(2) aumentar el pH de la mezcla de (1) de tal manera que el anticuerpo de dominio único activado reaccione fácilmente con la ureasa para formar el conjugado anticuerpo-ureasa de dominio único que tiene una relación de conjugación de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, o 12 fracciones de anticuerpos de dominio único por fracción de ureasa, en la que no más de 10-20 % de anticuerpo no conjugado, en peso de proteína total, permanece en la mezcla de reacción; y
(3) opcionalmente purificar el conjugado anticuerpo-ureasa de dominio único mediante una etapa de purificación, en la que el método no comprende una etapa de purificación cromatográfica,
opcionalmente en la que la composición comprende no más de 2 % (+/-10%) de anticuerpo de dominio único no conjugado en peso de proteína total después de la etapa de purificación.
12. Un método para aumentar la afinidad de unión de anticuerpos a un antígeno tumoral, que comprende conjugar una pluralidad de moléculas de anticuerpo de dominio único a una molécula de ureasa para formar un conjugado anticuerpo-ureasa de dominio único que tiene una relación de conjugación de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, o 12 moléculas de anticuerpo por molécula de ureasa, en la que el conjugado de anticuerpo de dominio único tiene una afinidad de unión al antígeno tumoral al menos 100 veces mayor que un anticuerpo no conjugado, y formar una composición de dicho conjugado anticuerpo-ureasa de dominio único, en el que dicha composición contiene menos del 10 % de ureasa no conjugada en base al peso del conjugado de anticuerpo-ureasa y/o comprende no más del 2 % (+/-10 %) de anticuerpo de dominio único no conjugado en peso de proteína total.
13. El método de la reivindicación 12, en el que la ureasa es una ureasa de judía gigante.
14. El método de la reivindicación 12 o 13, en el que el anticuerpo de dominio único es un anticuerpo humanizado o no humano.
15. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, en el que el antígeno tumoral se expresa por carcinoma de pulmón de células no microcíticas.
16. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15, en el que el anticuerpo de dominio único tiene especificidad para CEACAM6, opcionalmente en el que:
(i) el anticuerpo de dominio único tiene una afinidad de unión a CEACAM6 con un valor Kd mayor que 1 x 10'6 M (+/-10 %);
(ii) el conjugado de anticuerpo de dominio único se une a CEACAM6 con un valor Kd de no más de 1 x 10-8 M (+/-10 %);
(iii) el conjugado de anticuerpo de dominio único se une a CEACAM6 con un valor Kd de no más de 1 x 10'1° M (+/-10 %);
(iv) el conjugado de anticuerpo de dominio único se une a CEACAM6 con un valor IC50 de no más de 5 nM (+/-10 %); (v) el conjugado de anticuerpo de dominio único se une a CEACAM6 con un valor IC50 de 3.22 nM (+/-10 %); y/o (vi) el conjugado de anticuerpo de dominio único se une a CEACAM6 con un valor IC50 de 20 pg/ml (+/-10 %).
17. Un kit que comprende la composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, e instrucciones para uso de la composición.
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