ES2938186T3 - Procedimiento de fabricación selectiva de un conjugado anticuerpo-fármaco - Google Patents

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Shigeru Noguchi
Ken Sakurai
Daisuke Okajima
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Abstract

Un método para fabricar una composición conjugada de anticuerpo y fármaco que comprende (i) un paso para hacer reaccionar un anticuerpo con un agente reductor en una solución tampón para reducir los disulfuros intercatenarios, y (ii) un paso para hacer reaccionar un intermediario de enlace de fármaco con el anticuerpo. teniendo un grupo tiol obtenido en el paso (i), caracterizándose el método de fabricación porque: la temperatura de reacción en el paso (i) es de -10°C a 10°C; el número medio de fármacos acoplados en la composición del conjugado anticuerpo-fármaco fabricado es de 3,5 a 4,5; y la proporción de conjugados de anticuerpo-fármaco en los que cuatro enlazadores de fármaco están acoplados a un tiol intercatenario pesado-ligero es del 50% o superior. Una composición conjugada de anticuerpo-fármaco en la que el número medio de fármacos acoplados es de 3,5 a 4,5, (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Procedimiento de fabricación selectiva de un conjugado anticuerpo-fármaco
Campo técnico
La presente invención se refiere a un procedimiento para producir una composición de conjugado anticuerpo-fármaco, en el que se controlan el número de fármacos unidos y los sitios de unión.
Técnica anterior
Se puede anticipar que un conjugado anticuerpo-fármaco (en adelante en la presente memoria también denominado "ADC") formado por la unión de un fármaco que tiene citotoxicidad a un anticuerpo que se une a un antígeno capaz de expresarse en la superficie de una célula cancerosa, y al internalizarse en la célula será capaz de administrar selectivamente el fármaco a la célula cancerosa, de forma que hace que el fármaco se acumule en la célula cancerosa y destruya la célula cancerosa (véanse las bibliografías no patentadas 1 a 3). Como tal, se conoce un conjugado anticuerpo-fármaco, un conjugado anticuerpo-fármaco formado por la unión de exatecan que es un derivado de la camptotecina a un anticuerpo anti-B7-H3, o similar (Bibliografía de Patentes 1).
Un anticuerpo tiene cuatro disulfuros entre cadenas. Estos disulfuros entre cadenas son abordados por los disolventes más fácilmente que otros disulfuros, y se reducen con facilidad. Por lo tanto, dicho disulfuro entre cadenas se puede utilizar como sitio de unión a un fármaco (o a un enlazador de fármacos) en un conjugado anticuerpo-fármaco. Se reduce el disulfuro intercadena de un anticuerpo y, a continuación, se permite que un fármaco se una a los grupos tiol generados de este modo, para producir un conjugado anticuerpo-fármaco en el que de 2 a 8 fármacos se unen a una única molécula de anticuerpo. Además, se conoce un procedimiento para producir selectivamente un conjugado anticuerpo-fármaco que tiene cuatro enlazadores de fármaco unidos a tioles de intercadena pesados, en el que el procedimiento comprende primero reducir completamente los disulfuros de intercadena en un anticuerpo, reoxidar algunos de los tioles de intercadena generados para devolverlos a disulfuros, y luego permitir que los fármacos se unan a los tioles de intercadena restantes (Bibliografía de Patente 2). Sin embargo, todavía no se conoce un procedimiento para producir selectivamente un conjugado anticuerpo-fármaco que tenga cuatro enlazadores del fármaco unidos a tioles de intercadena pesada-ligera.
Listado de citas
Bibliografía de patentes
Bibliografía de patentes 1: Publicación Internacional No WO2014/057687
Bibliografía de patentes 2: Publicación Internacional No WO2005/084390
Bibliografía no de patente
Bibliografía no de Patente 1: Ducry, L., et al., Bioconjugate Chem. (2010) 21, 5-13
Bibliografía no de Patente 2: Alley, S. C., et al., Current Opinion in Chemical Biology (2010) 14, 529-537.
Bibliografía no de Patente 3: Damle N. K., Expert Opin. Biol. Ther. (2004) 4, 1445-1452.
Sumario de la invención
Problema Técnico
Un conjugado anticuerpo-fármaco, en el que 8 fármacos están unidos a una única molécula de anticuerpo, es excelente en términos de efectos antitumorales, pero puede causar problemas en términos de seguridad, tales como efectos secundarios y toxicidad, en algunos casos. Por lo tanto, para reducir los efectos secundarios o la toxicidad, y mantener al mismo tiempo la eficacia terapéutica, hay casos en los que se utiliza un conjugado anticuerpo-fármaco en el que el número medio de fármacos unidos es inferior a 8. Un conjugado anticuerpo-fármaco de este tipo, en el que el número medio de fármacos unidos es inferior a 8, se puede obtener, por ejemplo, al hacer reaccionar fármacos con un anticuerpo, con el control de la cantidad de fármacos por molécula de anticuerpo. Los productos de reacción son composiciones de conjugados anticuerpo-fármaco, en las que el número de fármacos unidos es 2, 4, 6 y 8. En consecuencia, existe el posible caso de que, aunque las composiciones de conjugado anticuerpo-fármaco tengan el mismo número medio de fármacos unidos entre sí, su eficacia terapéutica y toxicidad sean diferentes entre sí, si cada una de ellas tiene una distribución diferente del número de fármacos unidos. Es decir, cuando el contenido de conjugados anticuerpo-fármaco en los que el número de fármacos unidos es 0 y 8 es alto en una composición de conjugado anticuerpo-fármaco en la que el número medio de fármacos unidos es 4, se puede reducir su eficacia terapéutica y expresar una fuerte toxicidad, en comparación con el caso en el que el contenido de conjugados anticuerpo-fármaco en los que el número de fármacos unidos es 4 es alto. Además, también existe el posible caso de que, aunque los conjugados anticuerpo-fármaco tengan el mismo número de fármacos unidos entre sí, su eficacia terapéutica y toxicidad sean diferentes entre sí debido a una diferencia en los sitios de unión de los fármacos. Por lo tanto, se ha deseado desarrollar un procedimiento para producir una composición de conjugado anticuerpo-fármaco en el que el número de fármacos unidos y los sitios de unión se controlen en la producción de la composición de conjugado anticuerpo-fármaco.
Solución al problema
Como resultado de intensos estudios dirigidos a alcanzar el objeto mencionado, los presentes inventores han encontrado un procedimiento para producir una composición de conjugado anticuerpo-fármaco en la que el número de fármacos unidos y los sitios de unión están controlados, con operaciones más sencillas. Es decir, los inventores han descubierto que una composición de conjugado anticuerpo-fármaco, en la que el contenido de conjugados anticuerpo-fármaco en los que el número medio de fármacos unidos es de 3,5 a 4,5, y cuatro enlazadores de fármacos están unidos a tioles de intercadena pesada-ligera, es del 50% o más, se puede producir al reducir un anticuerpo mediante el uso de un agente reductor en un tampón a una temperatura de 0°C a 1°C, y luego al hacer reaccionar intermediarios de enlazador de fármaco con el anticuerpo obtenido que tiene grupos tiol. Además, los presentes inventores también han descubierto que la composición de conjugado de anticuerpo-fármaco tiene una seguridad más excelente que las composiciones de conjugado de anticuerpo-fármaco producidas por el procedimiento de producción convencional (es decir, una composición de conjugado de anticuerpo-fármaco, en la que el contenido de conjugados de anticuerpo-fármaco en los que el número medio de fármacos unidos es de 3,5 a 4,5, y cuatro enlazadores de fármacos están unidos a tioles de intercadena pesada-ligera, es del 35% o menos), para de este modo completar la presente invención.
Específicamente, la invención de la presente solicitud se refiere a lo siguiente (1) a (18):
(1) Un procedimiento para producir una composición conjugada anticuerpo-fármaco, que comprende:
(i) una etapa de reacción de un anticuerpo con un agente reductor en un tampón para reducir los disulfuros entre cadenas; y
(ii) una etapa de reacción de los productos intermedios del enlazador del fármaco con el anticuerpo que tiene grupos tiol obtenidos en la etapa (i), en la que
el anticuerpo tiene isotipo IgG1,
el agente reductor es tris(2-carboxietil)fosfina o una sal del mismo,
el agente reductor se utiliza en una cantidad de 2 a 3 equivalentes molares por molécula de anticuerpo, el tampón comprende un agente quelante, y el agente quelante es ácido etilendiaminotetraacético, el tiempo de reacción en la etapa (i) es de 5 a 10 horas,
la temperatura de reacción en la etapa (i) es de 0°C a 1°C,
el enlace intermedio del fármaco es
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en el que -GGFG- representa un residuo tetrapéptido formado por glicina-glicina-fenilalanina-glicina, y el número medio de fármacos unidos en la composición de conjugado anticuerpo-fármaco producida es de 3,5 a 4,5, y el contenido de conjugados anticuerpo-fármaco en los que cuatro enlazadores de fármacos están unidos a tioles de intercadena pesada-ligera, en la composición de conjugado anticuerpo-fármaco producida es del 50% o más.
(2) El procedimiento de producción de acuerdo con lo anterior (1), en el que el número medio de fármacos unidos en la composición de conjugado anticuerpo-fármaco producida es de 4,0 a 4,1.
(3) El procedimiento de producción de acuerdo con lo anterior (1) o (2), en el que el contenido de conjugados anticuerpo-fármaco en los que cuatro enlazadores del fármaco están unidos a tioles intercadena pesados-ligeros, en la composición de conjugado anticuerpo-fármaco producida está en el intervalo de 50% a 90%.
(4) El procedimiento de producción de acuerdo con lo anterior (3), en el que el contenido de conjugados anticuerpofármaco en los que cuatro enlazadores del fármaco están unidos a tioles de cadena intermedia pesada-ligera, en la composición de conjugado anticuerpo-fármaco producida está en el intervalo de 50% a 80%.
(5) El procedimiento de producción de acuerdo con lo anterior (4), en el que el contenido de conjugados anticuerpofármaco en los que cuatro enlazadores del fármaco están unidos a tioles de cadena intermedia pesada-ligera, en la composición de conjugado anticuerpo-fármaco producida está en el intervalo de 50% a 70%.
(6) El procedimiento de producción de acuerdo con lo anterior (5), en el que el contenido de conjugados anticuerpofármaco en los que cuatro enlazadores del fármaco están unidos a tioles de cadena intermedia pesada-ligera, en la composición de conjugado anticuerpo-fármaco producida está en el intervalo de 50% a 60%.
(7) El procedimiento de producción de acuerdo con cualquiera de los anteriores (1) a (6), en el que el contenido de conjugados anticuerpo-fármaco en los que cuatro enlazadores del fármaco están unidos a tioles pesados entre cadenas, en la composición de conjugado anticuerpo-fármaco producida es del 5% o menos.
(8) El procedimiento de producción de acuerdo con lo anterior (7), en el que el contenido de conjugados anticuerpofármaco en los que cuatro enlazadores del fármaco están unidos a tioles pesados entre cadenas, en la composición de conjugado anticuerpo-fármaco producida es del 1% o menos.
(9) El procedimiento de producción de acuerdo con cualquiera de los anteriores (1) a (8), en el que el contenido de conjugados anticuerpo-fármaco en los que dos enlazadores del fármaco están unidos a tioles intercadena pesadospesados y dos enlazadores del fármaco están unidos a tioles intercadena pesados-ligeros, en la composición de conjugado anticuerpo-fármaco producida es del 5% o menos.
(10) El procedimiento de producción de acuerdo con cualquiera de los anteriores (1) a (8), en el que el contenido de conjugados anticuerpo-fármaco en los que dos enlazadores del fármaco están unidos a tioles intercadena pesados-pesados y dos enlazadores del fármaco están unidos a tioles intercadena pesados-ligeros, en la composición de conjugado anticuerpo-fármaco producida es del 1% o menos.
(11) El procedimiento de producción de acuerdo con cualquiera de los anteriores (1) a (10), en el que la temperatura de reacción en la etapa (ii) es de 0°C a 2°C.
(12) El procedimiento de producción de acuerdo con cualquiera de los anteriores (1) a (11), en el que la sal de tris(2-carboxietil)fosfina es clorhidrato de tris(2-carboxietil)fosfina.
(13) El procedimiento de producción de acuerdo con cualquiera de los anteriores (1) a (12), en el que el tampón es un tampón de histidina.
(14) El procedimiento de producción de acuerdo con cualquiera de los anteriores (1) a (13), en el que el anticuerpo es un anticuerpo anti-TROP2, un anticuerpo anti-CD98, un anticuerpo anti-B7-H3, o un anticuerpo anti-HER2. (15) El procedimiento de producción de acuerdo con lo anterior (14), en el que el anticuerpo es un anticuerpo anti-TROP2.
(16) El procedimiento de producción de acuerdo con lo anterior (14), en el que el anticuerpo es un anticuerpo anti-CD98.
(17) El procedimiento de producción de acuerdo con lo anterior (14), en el que el anticuerpo es un anticuerpo anti-B7-H3.
(18) El procedimiento de producción de acuerdo con lo anterior (14), en el que el anticuerpo es un anticuerpo anti-HER2.
Efectos ventajosos de la invención
De acuerdo con la presente invención, se proporciona un procedimiento para producir una composición conjugada anticuerpo-fármaco en la que el número de fármacos unidos y los sitios de unión están controlados, y una composición conjugada anticuerpo-fármaco en la que el número de fármacos unidos y los sitios de unión están controlados. La composición de conjugado anticuerpo-fármaco es excelente en términos de seguridad, y es útil como medicamento para el tratamiento de tumores y/o cáncer. Además, dado que se puede obtener una composición de conjugado anticuerpo-fármaco en la que el número de fármacos unidos y los sitios de unión se controlan para que sean constantes, también es excelente en términos de control de calidad y, por lo tanto, es preferente.
Breve descripción de los dibujos
[Figura 1] La Figura 1 es una vista que muestra la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo humanizado anti-TROP2 de cadena pesada (hTINA1-H1).
[Figura 2] La Figura 2 es una vista que muestra la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo humanizado anti-TROP2 de cadena ligera (hTINA1-L1).
[Figura 3] La Figura 3 es una vista que muestra la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo humanizado anti-CD98 de cadena pesada (h23M-H1).
[Figura 4] La Figura 4 es una vista que muestra la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo humanizado anti-CD98 de cadena ligera (h23M-L1).
[Figura 5] La Figura 5 es un gráfico que muestra la relación de área de pico (%) de cada cadena en una composición ADC de anticuerpo humanizado anti-TROP2 (hTINA1-H1L1) producida por el procedimiento convencional.
[Figura 6] La Figura 6 es un gráfico que muestra la distribución (%) de cada número de fármacos unidos en una composición ADC de anticuerpo humanizado anti-TROP2 (hTINA1-H1L1) producida por el procedimiento convencional.
[Figura 7] La Figura 7 es un gráfico que muestra la relación de área de pico (%) de cada cadena en una composición ADC de anticuerpo humanizado anti-TROP2 (hTINA1-H1L1) producida por el procedimiento de la presente invención.
[Figura 8] La figura 8 es un gráfico que muestra la distribución (%) de cada número de fármacos unidos en una composición ADC humanizada de anticuerpo anti-TROP2 (hTINA1-H1L1) producida por el procedimiento de la presente invención.
[Figura 9] La Figura 9 es un gráfico que muestra la relación de área de pico (%) de cada cadena en una composición ADC de anticuerpo humanizado anti-CD98 (hM23-H1L1) producida por el procedimiento convencional.
[Figura 10] La Figura 10 es un gráfico que muestra la distribución (%) de cada número de fármacos unidos en una composición ADC de anticuerpo humanizado anti-CD98 (hM23-H1L1) producida por el procedimiento convencional.
[Figura 11] La Figura 11 es un gráfico que muestra la relación de área de pico (%) de cada cadena en una composición ADC de anticuerpo humanizado anti-CD98 (hM23-H1L1) producida por el procedimiento de la presente invención.
[Figura 12] La Figura 12 es un gráfico que muestra la distribución (%) de cada número de fármacos unidos en una composición ADC humanizada de anticuerpo anti-CD98 (hM23-H1L1) producida por el procedimiento de la presente invención.
[Figura 13] La Figura 13 es una vista que muestra la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo humanizado anti-B7-H3 de cadena pesada (M30-H1).
[Figura 14] La Figura 14 es una vista que muestra la secuencia de aminoácidos de una cadena ligera de anticuerpo humanizado anti-B7-H3 (M30-L4).
[Figura 15] La Figura 15 es un gráfico que muestra la relación de área de pico (%) de cada cadena en una composición ADC de anticuerpo humanizado anti-B7-H3 (M30-H1-L4) producida por el procedimiento convencional.
[Figura 16] La Figura 16 es un gráfico que muestra la distribución (%) de cada número de fármacos unidos en una composición ADC humanizada de anticuerpo anti-B7-H3 (M30-H1-L4) producida por el procedimiento convencional.
[Figura 17] La Figura 17 es un gráfico que muestra la relación de área de pico (%) de cada cadena en una composición ADC humanizada de anticuerpo anti-B7-H3 (M30-H1-L4) producida por el procedimiento de la presente invención.
[Figura 18] La Figura 18 es un gráfico que muestra la distribución (%) de cada número de fármacos unidos en una composición ADC humanizada de anticuerpo anti-B7-H3 (M30-H1-L4) producida por el procedimiento de la presente invención.
[Figura 19] La Figura 19 es una vista que muestra la secuencia de aminoácidos de una cadena pesada de anticuerpo anti-HER2 humanizado.
[Figura 20] La Figura 20 es una vista que muestra la secuencia de aminoácidos de una cadena ligera de anticuerpo anti-HER2 humanizado.
[Figura 21] La Figura 21 es un gráfico que muestra la relación de área de pico (%) de cada cadena en una composición ADC de anticuerpo anti-HER2 humanizado producida por el procedimiento convencional.
[Figura 22] La Figura 22 es un gráfico que muestra la distribución (%) de cada número de fármacos unidos en una composición ADC de anticuerpo anti-HER2 humanizado producida por el procedimiento convencional.
[Figura 23] La Figura 23 es un gráfico que muestra la relación de área de pico (%) de cada cadena en una composición de ADC de anticuerpo anti-HER2 humanizado producida por el procedimiento de la presente invención.
[Figura 24] La Figura 24 es un gráfico que muestra la distribución (%) de cada número de fármacos unidos en una composición ADC de anticuerpo anti-HER2 humanizado producida por el procedimiento de la presente invención.
[Figura 25] La Figura 25 es un gráfico que muestra el efecto inhibidor del crecimiento tumoral de una composición ADC de anticuerpo anti-TROP2 humanizado producida por el procedimiento convencional, y el efecto inhibidor del crecimiento tumoral de una composición ADC de anticuerpo anti-TROP2 humanizado producida por el procedimiento de la presente invención.
Descripción de las realizaciones
En la presente descripción, el término "cáncer" tiene el mismo significado que el término "tumor".
En la presente descripción, el término "gen" se utiliza para incluir, no sólo el ADN, sino también su ARNm y ADNc, y el ARNc del mismo.
En la presente descripción, el término "polinucleótido" tiene el mismo significado que el de ácido nucleico, e incluye ADN, ARN, una sonda, un oligonucleótido y un cebador.
En la presente descripción, el término "polipéptido" tiene el mismo significado que el término "proteína".
En la presente descripción, el término "célula" incluye células de un animal individual y células cultivadas.
En la presente descripción, el término "disulfuro entre cadenas" se utiliza para referirse a un disulfuro situado entre dos cadenas pesadas en un anticuerpo (un disulfuro entre cadenas pesadas-pesadas), o un disulfuro situado entre una cadena pesada y una cadena ligera en un anticuerpo (un disulfuro entre cadenas pesadas-ligeras).
En la presente descripción, el término "tiol intercadena" se utiliza para referirse a un grupo tiol obtenido por medio de la reducción de un disulfuro intercadena de un anticuerpo.
En la presente descripción, el término "tiol de intercadena pesada-pesada" se utiliza para referirse a un grupo tiol obtenido mediante la reducción de un disulfuro de intercadena pesada-pesada de un anticuerpo.
En la presente descripción, el término "tiol entre cadenas ligeras pesadas" se utiliza para referirse a un grupo tiol obtenido por medio de la reducción de un disulfuro entre cadenas ligeras pesadas de un anticuerpo.
En la presente descripción, el término "antígeno asociado a tumor (TAA)" se utiliza para referirse a un antígeno que se expresa tanto en células normales como en células tumorales, pero cuya expresión está relativamente restringida a las células tumorales.
En la presente descripción, el término "antígeno tumor-específico (TSA)" se utiliza para referirse a un antígeno que es específico de las células tumorales.
En la presente descripción, el término "TROP2" se utiliza para tener el mismo significado que el de una proteína TROP2.
En la presente descripción, el término "CD98" se utiliza para tener el mismo significado que el de una proteína CD98. Dado que CD98 consta de una cadena pesada y una cadena ligera, los términos "cadena pesada c D98" y "cadena ligera CD98" tienen el mismo significado que los de proteína de cadena pesada CD98 y proteína de cadena ligera CD98, respectivamente. Además, en la presente descripción, el término "CD98" se utiliza de forma interconvertible con cualquiera de "cadena pesada CD98" y "cadena ligera CD98", o "cadena pesada CD98" o "cadena ligera CD98", a menos que se especifique lo contrario.
En la presente descripción, el término "anticuerpo anti-TROP2" se utiliza para referirse a un anticuerpo capaz de unirse a TROP2.
En la presente descripción, el término "anticuerpo anti-CD98" se utiliza para referirse a un anticuerpo capaz de unirse a CD98.
En la presente descripción, el término "anticuerpo anti-B7-H3" se utiliza para referirse a un anticuerpo capaz de unirse a B7-H3.
En la presente descripción, el término "anticuerpo anti-HER2" se utiliza para referirse a un anticuerpo capaz de unirse a HER2.
En la presente descripción, el término "citotóxico" se utiliza para significar que se produce un cambio patológico en las células por cualquier vía. No sólo significa una lesión externa directa, sino también todo tipo de daños estructurales o funcionales producidos en las células, tales como la rotura del ADN, la formación de un dímero de bases, la rotura cromosómica, los daños en el aparato mitótico de una célula y la reducción de las actividades de varios tipos de enzimas.
En la presente descripción, el término "citotoxicidad" se utiliza para referirse a una acción que causa el fenómeno citotóxico descrito anteriormente.
En la presente descripción, el término "citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos" se utiliza para referirse a una "actividad citotóxica celular dependiente de anticuerpos (ADCC)", y esta actividad se refiere a la actividad de las células NK para provocar un daño a las células diana, tales como las células tumorales, mediada por un anticuerpo.
En la presente descripción, el término "citotoxicidad dependiente del complemento" se utiliza para referirse a una "actividad citotóxica dependiente del complemento (CDC)", y esta actividad significa la actividad de un complemento para provocar un daño a células diana tales como células tumorales, mediada por un anticuerpo.
En la presente descripción, el término "epítopo" se utiliza para referirse al péptido parcial o a la estructura tridimensional parcial de un antígeno que se une a un anticuerpo específico. Dicho epítopo, que es un péptido parcial de un antígeno, se puede determinar por procedimientos bien conocidos por un experto en la técnica, tales como un inmunoensayo, por ejemplo, por medio del procedimiento siguiente. En primer lugar, se producen varias estructuras parciales de un antígeno. Para la producción de tales estructuras parciales, se puede aplicar una técnica conocida de síntesis de oligopéptidos. Por ejemplo, una serie de péptidos, en los que un antígeno se ha cortado sucesivamente a una longitud apropiada del C-terminal o N-terminal del mismo, se producen por medio de técnicas de recombinación genética bien conocidas por un experto en la técnica y, a continuación, se estudia la reactividad de un anticuerpo con dichos polipéptidos y se determinan aproximadamente los sitios de reconocimiento. A continuación, se sintetizan otros péptidos más cortos y se estudia su reactividad con los péptidos mencionados para determinar un epítopo. Además, un epítopo, que es una estructura tridimensional parcial de un antígeno que se une a un anticuerpo específico, se puede determinar al especificar los residuos de aminoácidos de un antígeno adyacente al anticuerpo descrito por medio de un análisis estructural con rayos X.
En la presente descripción, la frase "anticuerpo que se une al mismo epítopo" se utiliza para referirse a un anticuerpo diferente que se une a un epítopo común. Si un segundo anticuerpo se une a un péptido parcial o a una estructura tridimensional parcial a la que se une un primer anticuerpo, se puede determinar que el primer anticuerpo y el segundo se unen al mismo epítopo. Además, al confirmar que un segundo anticuerpo compite con la unión de un primer anticuerpo a un antígeno (es decir, un segundo anticuerpo impide que un primer anticuerpo se una a un antígeno), se puede determinar que el primer anticuerpo y el segundo se unen al mismo epítopo, aunque no se haya determinado la secuencia o estructura específica del epítopo. Además, cuando un primer anticuerpo y un segundo anticuerpo se unen al mismo epítopo y, además, el primer anticuerpo tiene efectos especiales tales como la actividad antitumoral, cabe esperar que el segundo anticuerpo tenga la misma actividad que la del primer anticuerpo.
En la presente descripción, el término "CDR" se utiliza para referirse a una región determinante de la complementariedad (CDR). Se sabe que la cadena pesada y la cadena ligera de una molécula de anticuerpo tienen tres CDR cada una. Dicha CDR también se denomina dominio hipervariable, y está presente en la región variable de la cadena pesada y la cadena ligera de un anticuerpo, en la que la mutación de una estructura primaria es particularmente elevada. La CDR está separada en tres sitios en la estructura primaria de una cadena polipeptídica en cada una de la cadena pesada y la cadena ligera. En la presente descripción, con respecto a las c Dr de un anticuerpo, las CDR de una cadena pesada se denominan CDRH1, CDRH2 y CDRH3, respectivamente, desde el lado N-terminal de la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada, mientras que las CDR de una cadena ligera se denominan CDRL1, CDRL2 y CDRL3, respectivamente, desde el lado N-terminal de la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera. Estos sitios están situados cerca unos de otros en la estructura tridimensional, y determinan la especificidad del anticuerpo frente a un antígeno, al que se une el anticuerpo.
En la presente descripción, el término "varios" se utiliza para referirse a un número de 2 a 10. El número es preferentemente de 2 a 9, más preferentemente de 2 a 8, aún más preferentemente de 2 a 7, más preferentemente de 2 a 6, aún más preferentemente de 2 a 5, aún más preferentemente de 2 a 4, mucho más preferentemente de 2 ó 3, y mucho más preferentemente de 2.
En la presente descripción, el término "composición de conjugado anticuerpo-fármaco" se utiliza para referirse a una composición que comprende, en cualquier proporción dada, un conjugado anticuerpo-fármaco unido por dos enlazadores de fármacos, un conjugado anticuerpo-fármaco unido por cuatro enlazadores de fármacos, un conjugado anticuerpo-fármaco unido por seis enlazadores de fármacos, un conjugado anticuerpo-fármaco unido por ocho enlazadores de fármacos y un anticuerpo no unido por ningún enlazador de fármacos. En la presente descripción, la "composición de conjugado anticuerpo-fármaco" también se denomina "composición de ADC".
En la presente descripción, el "número medio de fármacos unidos" también se denomina relación fármaco-anticuerpo (DAR), y el número medio de fármacos unidos significa el número medio de fármacos que se unen a una única molécula de anticuerpo en una composición de conjugado anticuerpo-fármaco.
En la presente descripción, el término "contenido" se utiliza para referirse al contenido (% molar en base a un anticuerpo) de conjugados anticuerpo-fármaco que tienen un número específico de fármacos unidos y sitios de unión específicos en una composición de conjugado anticuerpo-fármaco.
En la presente descripción, el término "identidad" tiene el mismo significado que el término "homología".
1. Anticuerpo
El anticuerpo utilizado en la presente invención se puede generar con respecto a un antígeno de interés, por ejemplo, con respecto a un antígeno específico de tumor (TAA) o un antígeno asociado a tumor (TSA). Dicho anticuerpo tiene la propiedad de ser capaz de reconocer células tumorales, la propiedad de ser capaz de unirse a dichas células tumorales y la propiedad de ser capaz de incorporarse a dichas células tumorales e internalizarse en ellas.
El tipo de dicho antígeno de interés no está particularmente limitado, siempre que sea un antígeno asociado a células tumorales. Ejemplos del antígeno de interés incluyen B7-H3, CD3, CD30, CD33, CD37, CD56, CD98, DR5, EGFR, EPHA2, FGFR2, FGFR4, FOLR1 (Folate Receptor 1), HER2, HER3, TROP2, y VEGF.
El anticuerpo utilizado en la presente invención se puede obtener por el procedimiento descrito, por ejemplo, en los documentos WO2009/091048, WO2011/027808, o WO2012/133572. En concreto, se inmuniza a un animal no humano con un antígeno de interés y, a continuación, se recogen fluidos linfáticos, tejidos linfoides, muestras de células sanguíneas o células derivadas de la médula ósea del animal inmunizado. A continuación, se seleccionan las células plasmáticas y/o plasmoblastos del animal no humano que se unen específicamente al antígeno de interés. A partir de las células plasmáticas y/o plasmoblastos obtenidos, se recoge un gen de anticuerpo que reacciona contra el antígeno de interés, y a continuación se identifica la secuencia de nucleótidos del gen de anticuerpo. A partir de ahí, el anticuerpo descrito anteriormente o un fragmento de anticuerpo del mismo se puede obtener en base a la secuencia de nucleótidos identificada del gen. Los anticuerpos así obtenidos se examinan en función de su actividad de unión al antígeno de interés, de forma que se pueda seleccionar un anticuerpo aplicable a las enfermedades humanas.
Alternativamente, de acuerdo con procedimientos conocidos (p. ej, Kohler y Milstein, Nature (1975) 256, pp. 495­ 497; Kennet, R. ed., Monoclonal Antibodies, pp. 365-367, Plenum Press, N.Y. (1980)), las células productoras de anticuerpos que producen un anticuerpo que reacciona contra el antígeno de interés se fusionan con células de mieloma para establecer hibridomas, con el fin de obtener un anticuerpo monoclonal. Ejemplos específicos de tales procedimientos se describen en el documento WO2009/048072 (publicado el 16 de abril de 2009) y en el documento WO2010/117011 (publicado el 14 de octubre de 2010).
El anticuerpo utilizado en la presente invención incluye anticuerpos genéticamente recombinantes, que se modifican artificialmente con el fin de reducir la antigenicidad heteróloga contra humanos, por ejemplo, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado y un anticuerpo humano. Estos anticuerpos se pueden producir de acuerdo con procedimientos conocidos.
El anticuerpo quimérico es, por ejemplo, un anticuerpo cuya región variable y región constante son heterólogas entre sí, tal como un anticuerpo quimérico formado conjugando la región variable de un anticuerpo derivado de ratón o rata con una región constante derivada de un humano (véase Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 81,6851-6855 (1984).
Entre los ejemplos de anticuerpo humanizado se incluye un anticuerpo formado por medio de la incorporación de sólo CDR en un anticuerpo derivado de un ser humano (véase Nature (1986) 321, pp. 522-525), y un anticuerpo formado trasplantando los residuos de aminoácidos en algunos armazones, así como CDR, en un anticuerpo humano de acuerdo con un procedimiento de injerto de CDR (Publicación Internacional No. WO90/07861).
Ejemplos preferentes del anticuerpo incluyen un anticuerpo anti-TROP2, un anticuerpo anti-CD98, un anticuerpo anti-B7-H3, y un anticuerpo anti-HER2.
Un ejemplo real del anticuerpo humanizado anti-TROP2 puede ser cualquier combinación dada de: una cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada que consiste en cualquiera de (1) una secuencia de aminoácidos que consiste en residuos de aminoácidos en las posiciones 20 a 140 de SEC ID NO: 2, (2) una secuencia de aminoácidos que tenga una homología de al menos el 95% con respecto a la secuencia de aminoácidos de la anterior (1), y (3) una secuencia de aminoácidos que comprenda una supresión, sustitución o adición de uno o varios aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de la anterior (1); y una cadena ligera que comprenda una región variable de cadena ligera consistente en uno cualquiera de (4) una secuencia de aminoácidos consistente en residuos de aminoácidos en las posiciones 21 a 129 de SEC ID NO: 4, (5) una secuencia de aminoácidos que tenga una homología de al menos el 95% con respecto a la secuencia de aminoácidos de la anterior (4), y (6) una secuencia de aminoácidos que comprenda una supresión, sustitución o adición de uno o varios aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de la anterior (4).
Un ejemplo del anticuerpo descrito anteriormente que comprende una combinación preferente de la cadena pesada y la cadena ligera puede ser un anticuerpo (hTINA1-H1L1), que consiste en una cadena pesada consistente en una secuencia de aminoácidos consistente en residuos de aminoácidos en las posiciones 20 a 470 de SEC ID NO: 2, y una cadena ligera consistente en una secuencia de aminoácidos consistente en residuos de aminoácidos en las posiciones 21 a 234 de SEC ID NO: 4.
El anticuerpo humanizado anti-TROP2 no se limita a un anticuerpo humanizado específico, siempre que conserve la CDRH1 consistente en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID NO: 5 (TAGMQ), CDRH2 consistente en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID NO: 6 (WINTHSGVPKYAEDFKG), CDRH3 consistente en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID NO: 7 (SGFGSSYWYFDV), CDRL1 consistente en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID NO: 8 (KASQDVSTAVA), CDRL2 consistente en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID NO: 9 (SASYRYT), y CDRL3 consistente en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID NO: 10 (QQHYITPLT), que se muestran en el listado de secuencias.
Un ejemplo del anticuerpo anti-CD98 humanizado puede ser cualquier combinación dada de: una cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada que consiste en cualquiera de (1) una secuencia de aminoácidos que consiste en residuos de aminoácidos en las posiciones 20 a 135 de SEC ID NO: 12, (2) una secuencia de aminoácidos que tenga una identidad de al menos el 95% con respecto a la secuencia de aminoácidos de la anterior (1), y (3) una secuencia de aminoácidos que comprenda una deleción, sustitución o adición de uno o varios aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de la anterior (1); y una cadena ligera que comprenda una región variable de cadena ligera consistente en cualquiera de (4) una secuencia de aminoácidos consistente en residuos de aminoácidos en las posiciones 21 a 135 de SEC ID NO: 14, (5) una secuencia de aminoácidos que tenga una identidad de al menos el 95% con respecto a la secuencia de aminoácidos de la anterior (4), y (6) una secuencia de aminoácidos que comprenda una supresión, sustitución o adición de uno o varios aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de la anterior (4).
Un ejemplo del anticuerpo descrito anteriormente que comprende una combinación preferente de la cadena pesada y la cadena ligera puede ser un anticuerpo (hM23-H1L1), que consiste en una cadena pesada formada por una secuencia de aminoácidos consistente en residuos de aminoácidos en las posiciones 20 a 465 de SEC ID NO: 12, y una cadena ligera consistente en una secuencia de aminoácidos consistente en residuos de aminoácidos en las posiciones 21 a 240 de SEC ID NO: 14.
El anticuerpo humanizado anti-CD98 no se limita a un anticuerpo humanizado específico, siempre que conserve la CDRH1 consistente en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID NO: 15 (NYLIE), CDRH2 consistente en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID NO: 16 (VINPGSGVTNYNEKFKG), CDRH3 consistente en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID NO: 17 (AEAWFAY), CDRL1 consistente en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID NO: 18 (KSSQSLLYSSNQKNYLA), CDRL2 consistente en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID NO: 19 (WASTRES), y CDRL3 consistente en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID NO: 20 (QRYYGYPWT), que se muestran en el listado de secuencias.
Un ejemplo del anticuerpo anti-B7-H3 humanizado puede ser cualquier combinación dada de: una cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada que consiste en cualquiera de (1) una secuencia de aminoácidos que consiste en residuos de aminoácidos en las posiciones 20 a 141 de SEC ID NO: 25, (2) una secuencia de aminoácidos que tenga una identidad de al menos el 95% con respecto a la secuencia de aminoácidos de la anterior (1), y (3) una secuencia de aminoácidos que comprenda una deleción, sustitución o adición de uno o varios aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de la anterior (1); y una cadena ligera que comprenda una región variable de cadena ligera consistente en cualquiera de (4) una secuencia de aminoácidos consistente en residuos de aminoácidos en las posiciones 21 a 128 de SEC ID NO: 26, (5) una secuencia de aminoácidos que tenga una identidad de al menos el 95% con respecto a la secuencia de aminoácidos de la anterior (4), y (6) una secuencia de aminoácidos que comprenda una supresión, sustitución o adición de uno o varios aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de la anterior (4).
Un ejemplo del anticuerpo descrito anteriormente que comprende una combinación preferente de la cadena pesada y la cadena ligera puede ser un anticuerpo (M30-H1-L4), que consiste en una cadena pesada consistente en una secuencia de aminoácidos consistente en residuos de aminoácidos en las posiciones 20 a 471 de SEC ID NO: 25, y una cadena ligera consistente en una secuencia de aminoácidos consistente en residuos de aminoácidos en las posiciones 21 a 233 de SEC ID NO: 26.
El anticuerpo humanizado anti-B7-H3 no se limita a un anticuerpo humanizado específico, siempre que conserve la CDRH1 consistente en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID NO: 27 (NYVMH), CDRH2 consistente en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID NO: 28 (YINPYNDDVKYNe Kf KG), CDRH3 consistente en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID NO: 29 (WGYYGSPLYYFDY), CDRL1 consistente en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID NO: 30 (RASSRLIYMH), CDRL2 consistente en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID NO: 31 (ATSNLAS), y CDRL3 consistente en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID NO: 32 (QQWNSNPPT), que se muestran en el listado de secuencias.
Un ejemplo del anticuerpo humanizado anti-HER2 puede ser un anticuerpo, que consiste en una cadena pesada que consiste en una secuencia de aminoácidos que consiste en residuos de aminoácidos en las posiciones 1 a 449 de SEC ID NO: 33, y una cadena ligera consistente en una secuencia de aminoácidos consistente en residuos de aminoácidos en las posiciones 1 a 214 de SEC ID NO: 34 (trastuzumab; U. Patente estadounidense n° 5821337).
Además, un anticuerpo humanizado modificado con CDR, en el que de 1 a 3 residuos de aminoácidos en cada CDR se sustituyen con otros residuos de aminoácidos, también se incluye en el anticuerpo utilizado en la presente invención, siempre que el anticuerpo humanizado modificado con CDR tenga actividad de unión a células tumorales.
El anticuerpo utilizado en la presente invención incluye además un anticuerpo humano. Dicho anticuerpo humano se puede obtener por medio de un procedimiento de utilización de un ratón productor de anticuerpos humanos que tenga un fragmento cromosómico humano que comprenda los genes de la cadena pesada y de la cadena ligera de un anticuerpo humano (véase Tomizuka, K. et. al., Nature Genetics (1997) 16, pp. 133-143; Kuroiwa, Y. et. al., Nucl. Acids Res. (1998) 26, pp. 3447-3448; Yoshida, H. et. al., Tecnología celular animal: Basic and Applied Aspects vol. 10, pp.
69-73 (Kitagawa, Y., Matsuda, T. and Iijima, S. eds.), Kluwer Academic Publishers, 1999.; Tomizuka, K. y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 97, pp. 722-727etc.).
Además, existen procedimientos conocidos de obtención de un anticuerpo humano derivado de una visualización de fagos seleccionada de una biblioteca de anticuerpos humanos (véase Wormstone, I. M. et. al, Investigative Ophthalmology & Visual Science. (2002) 43(7), pp. 2301-2308; Carmen, S. y otros, Briefings in Functional Genomics and Proteomics (2002), 1(2), pp. 189-203; Siriwardena, D. et. al., Ophthalmology (2002) 109(3), pp. 427-431etc.).
Por ejemplo, se puede utilizar un procedimiento de visualización de fagos que comprende permitir que la región variable de un anticuerpo humano se exprese como un anticuerpo de cadena simple (scFv) en la superficie de un fago, y luego seleccionar un fago que se una a un antígeno (Nature Biotechnology (2005), 23, (9), pp. 1105-1116). Al analizar el gen de un fago seleccionado en función de su actividad de unión a un antígeno, se puede determinar una secuencia de ADN que codifica la región variable de un anticuerpo humano que se une a un antígeno. Si se dilucidara la secuencia de ADN de unión de scFv a un antígeno, sería posible obtener un anticuerpo humano al producir un vector de expresión que tuviera la secuencia de ADN, e introducir después el vector de expresión en un hospedador adecuado (WO92/01047, WO92/20791, WO93/06213, WO93/11236, WO93/19172, WO95/01438, WO95/15388, Annu. Rev. Immunol (1994) 12, pp. 433-455, Nature Biotechnology (2005) 23(9), pp. 1105-1116).
Se evalúa la actividad de unión del anticuerpo descrito anteriormente a un antígeno de interés, de forma que se pueda seleccionar un anticuerpo preferente. La constante de disociación entre un anticuerpo y un antígeno se puede medir mediante el uso de Biacore T200 (GE Healthcare Bioscience), que utiliza la resonancia de plasmón superficial (SPR) como principio de detección. Por ejemplo, se deja que un anticuerpo, ajustado para tener una concentración adecuada con respecto a un antígeno en fase sólida como ligando, reaccione con un analito, y a continuación se miden su asociación y disociación, a fin de obtener una constante de velocidad de asociación ka1, una constante de velocidad de disociación kd1 y una constante de disociación (KD; KD = kd1/ka1). La actividad de unión a un antígeno de interés se puede evaluar, no sólo con el uso de Biacore T200, sino también mediante el uso de un aparato que implique la Resonancia de Plasmón Superficial (SPR) como principio de detección, KinExA (Sapidyne Instruments) que implique el Ensayo de Exclusión Cinética como principio de detección, BLItz System (Pall) que implique la Interferometría de Biocapa como principio de detección, un procedimiento ELISA (Ensayo Inmunoabsorbente Enzimático), o similares.
La actividad de internalización en las células se puede confirmar al aplicar (1) un ensayo de visualización de un anticuerpo incorporado en las células bajo un microscopio de fluorescencia, mediante el uso de un anticuerpo secundario (etiqueta fluorescente) que se une a un anticuerpo terapéutico (Muerte celular y diferenciación (2008) 15, 751-761), (2) un ensayo de medición de la cantidad de fluorescencia incorporada a las células, mediante el uso de un anticuerpo secundario (etiqueta fluorescente) unido a un anticuerpo terapéutico (Biología Molecular de la Célula Vol.
15, 5268-5282, diciembre de 2004), o (3) un ensayo Mab-ZAP, en el que se utiliza una inmunotoxina que se une a un anticuerpo terapéutico, y cuando la inmunotoxina se incorpora a las células, se libera la toxina y se suprime el crecimiento celular (BioTechniques 28: 162-165, Enero (2000) Como inmunotoxina de este tipo, también se puede utilizar una proteína conjugada recombinante formada por una región catalítica de la toxina diftérica y una proteína G.
Un ejemplo de otro indicador utilizado para una comparación de las propiedades de los anticuerpos puede ser la estabilidad del anticuerpo. La calorimetría diferencial de barrido (DSC) es un procedimiento capaz de medir con rapidez y precisión un punto medio de desnaturalización térmica (Tm) que sirve como buen indicador de la estabilidad estructural relativa de una proteína. Mediante el uso del DSC para medir dichos valores de Tm y la comparación después los valores obtenidos, se puede comparar una diferencia en la estabilidad térmica. Se sabe que la estabilidad de conservación de un anticuerpo muestra cierto grado de correlación con la estabilidad térmica de un anticuerpo (Lori Burton, et. al., Pharmaceutical Development and Technology (2007) 12, pp. 265-273), y mediante el uso de la estabilidad térmica como indicador, se puede seleccionar un anticuerpo preferente. Ejemplos de otros indicadores para la selección de un anticuerpo incluyen un alto rendimiento en células huésped adecuadas, y baja cohesividad en una solución acuosa. Por ejemplo, dado que un anticuerpo con el mayor rendimiento no siempre presenta la mayor estabilidad térmica, se toma una decisión global en base a los indicadores antes mencionados, y es necesario seleccionar un anticuerpo que sea el más adecuado para ser administrado a los seres humanos.
Además, al regular la unión de la modificación de la cadena de azúcar a un anticuerpo, se puede mejorar la citotoxicidad dependiente de anticuerpos. Como técnicas de regulación de la modificación de la cadena de azúcar de un anticuerpo, las descritas en los documentos WO99/54342, WO2000/61739, WO2002/31140etc., pero las técnicas no se limitan a ellas.
Cuando se ha aislado un gen de anticuerpo y, posteriormente, se ha introducido el gen en un hospedador adecuado para producir un anticuerpo, se puede utilizar una combinación adecuada de un hospedador y un vector de expresión. Un ejemplo específico del gen del anticuerpo puede ser una combinación de un gen que codifica la secuencia de cadena pesada del anticuerpo descrito en la presente descripción y un gen que codifica la secuencia de cadena ligera del anticuerpo descrito en la misma. A fin de la transformación de las células huésped, se puede insertar un gen de secuencia de cadena pesada y un gen de secuencia de cadena ligera en un único vector de expresión, o también se pueden insertar cada uno de estos genes en vectores de expresión diferentes. Cuando se utilizan células eucariotas como huéspedes, se pueden emplear células animales, vegetales o microorganismos eucariotas. Ejemplos de células animales son las células de mamíferos, tales como las células COS, que son células de mono (Gluzman, Y., Cell (1981) 23, pp. 175-182aTCC CRL-1650), fibroblastos de ratón NIH3T3 (ATCC No. CRL-1658), y una línea celular dihidrofolato reductasedeficiente de células de ovario de hámster chino (células CHO, ATCC CCL-61) (Urlaub, G. y Chasin, L. A. Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. (1980) 77, pp. 4126-4220). Por otro lado, cuando se utilizan células procariotas como huéspedes, se pueden emplear, por ejemplo, Escherichia coli o Bacillus subtilis. Un gen de anticuerpo de interés se introduce en estas células para su transformación, y las células transformadas se cultivan in vitro para obtener un anticuerpo. En el procedimiento de cultivo mencionado anteriormente, se da el caso de que el rendimiento es diferente dependiendo de la secuencia de un anticuerpo, y por lo tanto, es posible seleccionar un anticuerpo, que se produzca fácilmente como medicamento, a partir de anticuerpos que tengan una actividad de unión equivalente, mediante el uso del rendimiento como indicador.
El isotipo del anticuerpo utilizado en la presente invención es IgG1.
Entre los ejemplos de la función general de un anticuerpo se incluyen la actividad de unión a antígeno, la actividad de neutralización de la actividad de un antígeno, la actividad de potenciación de la actividad de un antígeno, la citotoxicidad dependiente de anticuerpos, la citotoxicidad dependiente de complemento, la citotoxicidad celular dependiente de complemento y la actividad de internalización.
Además, el anticuerpo utilizado en la presente invención puede ser un anticuerpo multiespecífico que tenga especificidad para al menos dos tipos de antígenos diferentes. En general, una molécula de este tipo se une a dos tipos de antígeno (es decir, un anticuerpo biespecífico). Sin embargo, el "anticuerpo multiespecífico" en la presente invención incluye un anticuerpo que tiene especificidad para más antígenos (por ejemplo, 3 tipos de antígenos).
El anticuerpo utilizado en la presente invención puede ser un anticuerpo que tenga una identidad (u homología) del 80% al 99% con la cadena pesada y/o la cadena ligera del anticuerpo descrito anteriormente. Al combinar secuencias que tengan una alta homología con la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada y la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera descritas anteriormente, se puede seleccionar un anticuerpo que tenga una actividad de unión al antígeno y una actividad de internalización equivalentes a las de cada uno de los anticuerpos descritos anteriormente. Dicha homología es generalmente del 80% o más, preferentemente del 90% o más, más preferentemente del 95% o más, y más preferentemente del 99% o más. Además, al combinar secuencias de aminoácidos que comprenden una sustitución, supresión y/o adición de uno a varios residuos de aminoácidos con respecto a las secuencias de aminoácidos de una cadena pesada y/o una cadena ligera, se puede seleccionar un anticuerpo que tenga varios tipos de acciones que sean equivalentes a las de cada uno de los anticuerpos descritos anteriormente. El número de residuos de aminoácidos a sustituir, eliminar y/o añadir es generalmente de 10 o menos residuos de aminoácidos, preferentemente 9 o menos residuos de aminoácidos, más preferentemente 8 o menos residuos de aminoácidos, más preferentemente 7 o menos residuos de aminoácidos, aún más preferentemente 6 o menos residuos de aminoácidos, aún más preferentemente 5 o menos residuos de aminoácidos, aún más preferentemente 4 o menos residuos de aminoácidos, aún más preferentemente 3 o menos residuos de aminoácidos, aún más preferentemente 2 o menos residuos de aminoácidos, y lo más preferentemente 1 residuo de aminoácido.
Se sabe que el residuo de lisina en el extremo carboxilo de la cadena pesada de un anticuerpo producido en células de mamífero cultivadas se elimina (Journal of Chromatography A, 705: 129-134 (1995)), y además, se sabe que los dos residuos de aminoácidos en el extremo carboxilo de la cadena pesada, glicina y lisina, se eliminan, y que el residuo de prolina situado en el extremo carboxilo se amida de nuevo (Bioquímica Analítica, 360: 75-83 (2007) Sin embargo, la supresión y modificación de estas secuencias de cadena pesada no influyen en la actividad de unión al antígeno ni en la función efectora (activación de un complemento, citotoxicidad dependiente de anticuerpos, etc.) de un anticuerpo. Por consiguiente, la presente invención también incluye un anticuerpo que ha sufrido la modificación mencionada, y ejemplos específicos de dicho anticuerpo incluyen un mutante de deleción que comprende una deleción de 1 o 2 aminoácidos en el extremo carboxilo de la cadena pesada, y un mutante de deleción formado por amidación del mutante de deleción mencionado (por ejemplo, una cadena pesada en la que se amida el residuo de prolina en el sitio carboxilo terminal). Sin embargo, los mutantes de deleción relativos a una deleción en el extremo carboxilo de la cadena pesada del anticuerpo de acuerdo con la presente invención no se limitan a los mutantes de deleción descritos anteriormente, siempre que conserven la actividad de unión a antígeno y la función efectora. Dos cadenas pesadas que constituyen el anticuerpo de acuerdo con la presente invención pueden ser cualquier tipo de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en un anticuerpo de longitud completa y los mutantes de deleción descritos anteriormente, o una combinación de dos tipos cualesquiera seleccionados del grupo mencionado anteriormente. La proporción de cantidad de mutantes de deleción individuales se puede ver influida por los tipos de células de mamífero cultivadas que producen el anticuerpo de acuerdo con la presente invención, y las condiciones de cultivo. El ingrediente principal del anticuerpo de acuerdo con la presente invención puede ser el caso en el que se elimina un residuo de aminoácido en cada uno de los extremos carboxílicos de las dos cadenas pesadas.
La homología entre dos tipos de secuencias de aminoácidos se puede determinar mediante el uso del parámetro por defecto del algoritmo Blast versión 2.2.2 (Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, y David J.Lipman (1997), "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs," Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402). El algoritmo Blast también está disponible accediendo a la web www.ncbi.nlm.nih.gov/blast en Internet. Cabe señalar que, mediante el uso del algoritmo Blast descrito anteriormente, se pueden calcular dos tipos de valores porcentuales, a saber, Identidad (o Identidades) y Positividad (o Positividades). El primero es un valor que se obtiene cuando los residuos de aminoácidos son idénticos entre dos tipos de secuencias de aminoácidos cuya homología se desea obtener. Este último es un valor numérico, para el que también se consideran los residuos de aminoácidos que tienen una estructura química similar. En la presente descripción, el valor de identidad cuando los residuos de aminoácidos son idénticos entre sí se define como el valor de homología.
El anticuerpo obtenido se puede purificar hasta que se vuelva homogéneo. A fin de la separación y purificación del anticuerpo, se pueden utilizar los procedimientos ordinarios de separación y purificación que se aplican a las proteínas. Un anticuerpo se puede separar y purificar al seleccionar adecuadamente los procedimientos, por ejemplo, entre cromatografía en columna, filtración, ultrafiltración, eliminación de sales, diálisis, electroforesis preparativa en gel de poliacrilamida y enfoque isoeléctrico, y combinando después los procedimientos seleccionados (Strategies for Protein Purification and Characterization:A Laboratory Course Manual, Daniel R. Marshak et. al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996); Anticuerpos: Manual de laboratorio. Ed Harlow y David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)), pero los procedimientos de separación y purificación no se limitan a ellos.
Ejemplos de la cromatografía incluyen cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía hidrofóbica, cromatografía de filtración en gel, cromatografía de fase inversa y cromatografía de adsorción.
Estos procedimientos cromatográficos se pueden llevar a cabo mediante el uso de cromatografía líquida tal como HPLC o FPLC.
Ejemplos de una columna utilizada en cromatografía de afinidad incluyen una columna de proteína A y una columna de proteína G.
2. Fármaco
El fármaco utilizado en la presente invención es un compuesto que tiene efectos antitumorales y que también tiene un sustituyente o una estructura parcial capaz de unirse a una estructura enlazadora. Con respecto a dicho fármaco, una parte o la totalidad del enlazador se escinde en una célula tumoral, y se libera una porción de compuesto antitumoral, de forma que se exhiben efectos antitumorales. Si el enlazador se escinde en una porción de unión al fármaco, se libera un compuesto antitumoral que conserva su estructura original, de forma que se exhiben los efectos antitumorales originales. Se permite que el fármaco se una al anticuerpo a través de una porción enlazadora que tiene una estructura específica. En la presente descripción, un enlazador de fármaco que incluye este fármaco y esta porción de enlazador también se denomina "fármaco".
El compuesto antitumoral es exatecan.
Exatecan ((1S,9S)-1-amino-9-ethyl-5-fluoro-2,3-dihydro-9-hydroxy-4-iriethyMH,12H-benzo[de]pyrano[3',4': 6,7]indolizino[1,2-b]quinolina-10,13(9H,15H)-diona), que es un derivado de la camptotecina, es un compuesto representado por la siguiente fórmula.
Figure imgf000012_0001
3. Enlazador
El fármaco utilizado en la presente invención puede unirse a un anticuerpo a través de un enlazador. El enlazador utilizado en la presente invención tiene un grupo maleimidilo N-sustituido.
El enlazador utilizado en la presente invención tiene una estructura inducida a partir de la siguiente fórmula:
Figure imgf000012_0002
El término "GGFG" significa un residuo tetrapéptido formado por glicina-glicina-fenilalanina-glicina.
El enlazador utilizado en la presente invención se puede preparar, por ejemplo, de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo 58 del documento WO2014/057687.
4. Fármaco enlazador intermedio
El fármaco enlazador intermedio utilizado en la presente invención se puede producir al hacer reaccionar el grupo carboxilo del compuesto enlazador descrito anteriormente con el grupo amino de un compuesto antitumoral, mediante el uso de un agente condensador, etc.
El fármaco enlazador intermedio utilizado en el procedimiento de la presente invención es un compuesto susceptible de reacción con un tiol intercadena de un anticuerpo. El presente fármaco enlazador intermedio es un compuesto que tiene un grupo maleimidilo N-sustituido, y es
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El fármaco enlazador intermedio utilizado en la presente invención se puede preparar, por ejemplo, de acuerdo con los procedimientos descritos en el Ejemplo 58, el Ejemplo 43 y el Ejemplo 14 del documento W o 2014/057687. Se permite que el presente fármaco enlazador intermedio reaccione con un tiol intercadena generado por reducción de un disulfuro intercadena de un anticuerpo, de forma que se pueda permitir que el anticuerpo se una al fármaco a través del enlazador. Por consiguiente, el fármaco enlazador intermedio es un compuesto que tiene un grupo maleimidilo N-sustituido.
5. Conjugado anticuerpo-fármaco
En lo que respecta a un conjugado anticuerpo-fármaco, el número de fármacos que se unen a una única molécula de anticuerpo es un factor importante que influye en la eficacia y la seguridad. Dado que un anticuerpo tiene cuatro disulfuros entre cadenas y que dicho disulfuro está constituido por dos grupos tiol, el número de fármacos que se unen a una única molécula de anticuerpo es 2, 4, 6 u 8.
Los ejemplos de un conjugado anticuerpo-fármaco en el que dos fármacos se unen a una única molécula de anticuerpo (en adelante en la presente memoria también denominado "D2") incluyen un conjugado anticuerpo-fármaco en el que dos enlazadores de fármacos están unidos a tioles de intercadena pesada-ligera (en adelante en la presente memoria también denominado "D2-1"), y un conjugado anticuerpo-fármaco en el que dos enlazadores de fármacos están unidos a tioles de intercadena pesada-pesada (en adelante en la presente memoria también denominado "D2-2").
Figure imgf000013_0001
Los ejemplos de un conjugado anticuerpo-fármaco en el que cuatro fármacos se unen a una única molécula de anticuerpo (en adelante en la presente memoria también denominado "D4") incluyen un conjugado anticuerpo-fármaco en el que cuatro enlazadores del fármaco están unidos a tioles intercadena pesados-ligeros (en adelante en la presente memoria también denominado "D4-1"), un conjugado anticuerpo-fármaco en el que cuatro enlazadores del fármaco están unidos a tioles pesados-pesados entre cadenas (en adelante en la presente memoria también denominado "D4-2"), y un conjugado anticuerpo-fármaco en el que dos enlazadores del fármaco están unidos a tioles pesados-ligeros entre cadenas y dos enlazadores del fármaco están unidos a tioles pesados-pesados entre cadenas (en adelante en la presente memoria también denominado "D4-3").
Figure imgf000013_0002
Los ejemplos de un conjugado anticuerpo-fármaco en el que seis fármacos se unen a una única molécula de anticuerpo (en adelante en la presente memoria también denominado "D6") incluyen un conjugado anticuerpo-fármaco en el que cuatro enlazadores de fármacos se unen a tioles inter-cadena pesados-ligeros y dos enlazadores de fármacos se unen a tioles inter-cadena pesados-pesados (en adelante en la presente memoria también denominado "D6-1"), y un conjugado anticuerpo-fármaco en el que dos enlazadores del fármaco están unidos a tioles inter-cadena pesadosligeros y cuatro enlazadores del fármaco están unidos a tioles inter-cadena pesados-pesados (en adelante en la presente memoria también denominado "D6-2") .
[F órm u la 21 ]
Figure imgf000013_0003
0 6 -1 D 6-2
Un ejemplo de conjugado anticuerpo-fármaco en el que ocho enlazadores de fármaco están unidos a una única molécula de anticuerpo (en adelante en la presente memoria también denominado "D8") es un conjugado anticuerpofármaco en el que cuatro enlazadores de fármaco están unidos a tioles de intercadena pesada-ligera y cuatro enlazadores de fármaco están unidos a tioles de intercadena pesada-pesada.
[Fórmula 22]
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DS
El tiol intercadena de un anticuerpo forma un tioéter, por ejemplo, con la posición 3 del grupo maleimidilo N-sustituido de un intermediario de enlace de fármaco, y se une al mismo. Es decir, la porción de unión de un anticuerpo con un enlazador de fármaco está representada, por ejemplo, por la siguiente fórmula:
Figure imgf000014_0002
en la que el "Anticuerpo-S-" se deriva del anticuerpo.
El enlazador del fármaco es
Figure imgf000014_0003
en el que A representa el sitio de unión al anticuerpo.
Se produce un conjugado anticuerpo-fármaco, al tiempo que se determinan las condiciones de reacción, tales como las cantidades de materias primas y/o reactivos utilizados en la reacción, de forma que se pueda controlar el número de fármacos unidos. A diferencia de la reacción química de un compuesto de bajo peso molecular, el conjugado anticuerpo-fármaco se obtiene generalmente en forma de mezcla a la que se unen distintos números de fármacos. El número de fármacos que se unen a una única molécula de anticuerpo se especifica y se indica como valor medio, es decir, el número medio de fármacos unidos.
El procedimiento de producción de la presente invención es un procedimiento para producir una composición de conjugado anticuerpo-fármaco en la que el número de fármacos unidos y los sitios de unión están controlados, y el presente procedimiento de producción consiste en una primera etapa de reducción selectiva de disulfuro(s) de intercadena pesada-luminosa de un anticuerpo para convertirlos en grupos tiol, y una segunda etapa de reacción de intermediarios de enlace de fármaco con el anticuerpo que tiene grupos tiol, para producir una composición de conjugado anticuerpo-fármaco en la que el número de fármacos unidos y los sitios de unión están controlados. A continuación, se describe cada etapa en detalle.
(Primera etapa) Reducción del anticuerpo
Un anticuerpo con grupos tiol se puede producir al hacer reaccionar un anticuerpo con un agente reductor en un tampón a una temperatura de 0°C a 1°C.
La cantidad del agente reductor es de 2 a 3 equivalentes molares, en base a la cantidad de una sola molécula de anticuerpo.
El agente reductor es tris(2-carboxietil)fosfina o una sal del mismo, y preferentemente clorhidrato de tris(2-carboxietil)fosfina.
Como tampón, se puede utilizar un tampón de histidina, un tampón de fosfato, un tampón de borato, un tampón de acetato, un tampón HEPES (ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfónico) o similares, y entre otros, es preferente un tampón de histidina.
El tampón comprende un agente quelante. El agente quelante utilizado en la presente memoria es el ácido etilendiaminotetraacético (en adelante en la presente memoria también denominado "EDTA"). Dicho tampón se puede utilizar en una concentración de 1 a 20 mM.
El tiempo de reacción es preferentemente de 5 a 10 horas, y más preferentemente de 5 a 7 horas.
El pH aplicado para la reacción es de pH 5 a 9, preferentemente de pH 6 a 8, y más preferentemente de pH 6,8 a 7,2.
(Segunda etapa) Conjugación del anticuerpo con el intermediario enlazador del fármaco
Los intermediarios del enlazador del fármaco se dejan reaccionar con el anticuerpo que tiene grupos tiol obtenidos en la primera etapa para producir una composición de conjugado anticuerpo-fármaco. Los intermedios de enlace del fármaco se utilizan en una cantidad de 2 a 10 equivalentes molares, y preferentemente de 4 a 6 equivalentes molares, en base a la cantidad de una única molécula de anticuerpo.
Específicamente, se añade una solución en la que se ha disuelto el fármaco enlazador intermedio a un tampón que contiene el anticuerpo con grupos tiol obtenido en la primera etapa, para que puedan reaccionar entre sí.
Ejemplos del disolvente en el que se disuelve el fármaco enlazador intermedio, que pueden usarse en la presente memoria, incluyen disolventes orgánicos tales como una solución acuosa de acetona al 50%, una solución acuosa de etanol al 80 una solución acuosa de metanol al 80%, una solución acuosa de isopropanol al 80%, una solución acuosa de dimetilsulfóxido al 80%, dimetilsulfóxido (DMSO), dimetilformamida (DMF), dimetilacetamida (DMA) y N-metil-2-pirrolidona (NMP). Entre estos disolventes, es preferente una solución acuosa de acetona al 50% o una solución acuosa de dimetilsulfóxido al 80%.
La solución de disolvente orgánico, en la que se ha disuelto el fármaco enlazador intermedio, se añade en una cantidad de 1% a 20% v/v a un tampón que comprende el anticuerpo que tiene grupos tiol, para que puedan reaccionar entre sí.
La temperatura de reacción es preferentemente de -10°C a 10°C, más preferentemente de -5°C a 5°C, y aún más preferentemente de 0°C a 2°C.
El tiempo de reacción es preferentemente de 0,5 a 2 horas.
La reacción de conjugación se puede terminar al desactivar la reactividad de los intermediarios del enlazador del fármaco sin reaccionar con un reactivo que contenga un grupo tiol.
Como tal, se puede utilizar un reactivo que contenga un grupo tiol, por ejemplo, cisteína o N-acetil-L-cisteína. Más concretamente, la reacción de conjugación se puede terminar al añadir N-acetil-L-cisteína en una cantidad de 1 a 2 equivalentes molares al intermediario de enlace de fármaco utilizado, y al hacerlos reaccionar a continuación a temperatura ambiente durante 10 a 30 minutos.
Una vez completada la reacción de conjugación, la purificación se puede llevar a cabo mediante el uso de una membrana de ultrafiltración comercial o similar. Mientras se añade un tampón de acetato, un tampón de histidina, un tampón de fosfato o similar al producto de reacción, se puede eliminar una porción de bajo peso molecular mediante el uso de la membrana de ultrafiltración. Como tal membrana de ultrafiltración, se puede utilizar una membrana de ultrafiltración adecuada. Se puede utilizar una membrana de ultrafiltración con un peso molecular de 1 kDa a 100 kDa, en la que es preferente una membrana de ultrafiltración con un peso molecular de 30 kDa.
6. Identificación de la composición del conjugado anticuerpo-fármaco
La composición de conjugado anticuerpo-fármaco producida se somete a concentración, intercambio tampón, purificación y medición de una concentración de anticuerpo y del número medio de fármacos unidos, de acuerdo con las siguientes operaciones, de forma que se pueda identificar la composición de conjugado anticuerpo-fármaco.
(1) Concentración de la solución acuosa de anticuerpo o de conjugado anticuerpo-fármaco
Se coloca un anticuerpo o una solución de conjugado anticuerpo-fármaco en un recipiente de Amicon Ultra (50.000 MWCO, Millipore Corporation), y a continuación se somete a una operación de centrifugado (centrifugado a 2000 G a 3800 G durante 5 a 20 minutos), mediante el uso de una centrifugadora (Allegra X-15R, Beckman Coulter, Inc.), para poder concentrar el anticuerpo o la solución de conjugado anticuerpo-fármaco.
(2) Medición de la concentración de anticuerpos
Mediante el uso de un aparato de medición UV (Nanodrop 1000, Thermo Fisher Scientific Inc.), la concentración del anticuerpo se puede medir de acuerdo con el procedimiento proporcionado por el fabricante. Durante la medición, se utilizan coeficientes de absorción de 280 nm (1,3mlmg-1cm-1 a 1,8mlmg-1cm-1), que son diferentes según los anticuerpos individuales.
(3) Intercambio de tampón por anticuerpo
Una columna NAP-25 (Cat. N° 17-0852-02, GE Healthcare Japan Corporation), en el que se utiliza un soporte Sephadex G-25, se equilibra con un tampón fosfato que contiene cloruro sódico (137 mM) y ácido etilendiaminotetraacético (5 mM) (10 mM, pH 6,0; en adelante en la presente memoria también "PBS6,0/e Dt A") de acuerdo con el procedimiento proporcionado por el fabricante. A continuación, se aplican 2,5 mL de una solución acuosa de anticuerpo a una sola columna NAP-25, y se fracciona una fracción (3,5 mL) eluida con 3,5 mL de PBS6,0/EDTA. Esta fracción se concentra por el mismo procedimiento que el descrito anteriormente (1), y a continuación se mide la concentración del anticuerpo por el mismo procedimiento que el descrito anteriormente (2). A continuación, la concentración del anticuerpo puede ajustarse mediante el uso de PBS6.0/EDTA.
(4) Purificación de la composición del conjugado anticuerpo-fármaco
Una columna NAP-25 se equilibra con un tampón acetato que contiene sorbitol (5%) (10 mM, pH 5,5; en adelante en la presente memoria también denominado "ABS"). A esta columna NAP-25 se le aplica una solución acuosa de reacción anticuerpo-fármaco (2,5 mL), y a continuación se eluye con un tampón en una cantidad determinada por el fabricante, con el fin de fraccionar una fracción de anticuerpo. Esta fracción se aplica de nuevo a la columna nAP-25 y, a continuación, se repite dos o tres veces en total una operación de purificación por filtración en gel que implica la elución con un tampón, con el fin de obtener una composición de conjugado anticuerpo-fármaco, de la que se han eliminado los intermediarios del enlazador del fármaco no unidos o los compuestos de bajo peso molecular (clorhidrato de tris(2-carboxietil)fosfina, N-acetil-L-cisteína y dimetilsulfóxido).
(5) Procedimiento de separación por medio de cromatografía en columna hidrofóbica para la composición del conjugado anticuerpo-fármaco (5-1) Procedimiento de medición HPLC
Se llevó a cabo un análisis por HPLC en las siguientes condiciones de medición.
Sistema HPLC: Sistema HPLC Shimadzu Science
Detector: Espectrómetro de absorción ultravioleta (longitud de onda de medición: 280 nm).
Columna: TSKgel Butyl-NPR (4,6 * 100 mm, 2,5 pm; TOSOH CORPORATION)
Temperatura de la columna: 30°C
Fase móvil A: solución acuosa 25 mM de tampón fosfato (pH 7,0) con 1,5 M de sulfato de amonio
Fase móvil B: Solución mixta compuesta por 75% de tampón fosfato 25 mM (pH 7,0) y 25% de alcohol isopropílico Programa de gradiente: 20% - 60% (0 min - 20 min), 20% - 80% (20 min - 20,1 min), 80% - 80% (20,1 min - 23 min), 80% -20% (23 min -23,1 min), 20% -20% (23,1 min -40 min)
Cantidad de muestra inyectada: 2 pL
(5-2) Análisis de datos
En cuanto a los datos actuales, dado que los conjugados anticuerpo-fármaco se eluyen en el orden de aumento del número de fármacos unidos en base a una diferencia en la concentración de sal debido a las características de la columna, la distribución en el número de enlaces se puede asumir al medir los valores de área individuales. Los picos son D0 (un anticuerpo no unido a ningún enlace farmacológico), D2, D4-1, D4-2, D6 y D8 en el orden de elución, por lo que se puede comprender la condición de distribución.
El contenido de conjugados anticuerpo-fármaco, en los que el número de fármacos unidos es 4, en la composición de conjugado anticuerpo-fármaco producida por el procedimiento de producción de la presente invención es del 50% o más.
El contenido de D4-1 en la composición conjugada anticuerpo-fármaco producida por el procedimiento de producción de la presente invención es del 50% o más, o en el intervalo de 50% a 90%, 50% a 80%, 50% a 70%, o 50% a 60%.
El contenido de D4-2 en la composición de conjugado anticuerpo-fármaco producida por el procedimiento de producción de la presente invención es preferentemente del 5% o menos, y más preferentemente del 1% o menos.
El contenido de D4-3 en la composición de conjugado anticuerpo-fármaco producida por el procedimiento de producción de la presente invención es preferentemente del 5% o menos, y más preferentemente del 1% o menos.
(6) Medición de la concentración de anticuerpos y del número medio de fármacos unidos en la composición del conjugado anticuerpo-fármaco (procedimiento UV)
La concentración de fármacos unidos en la composición de conjugado anticuerpo-fármaco se puede calcular al medir la absorbancia UV de una solución acuosa de conjugado anticuerpo-fármaco a dos longitudes de onda, 280 nm y 370 nm, y realizar a continuación el siguiente cálculo.
Dado que la absorbancia total a una determinada longitud de onda es igual a la suma de las absorbancias de todas las especies químicas absorbentes en el sistema [aditividad de la absorbancia], si se supone que los coeficientes de absorción molar de un anticuerpo y un fármaco no cambian antes y después de la conjugación del anticuerpo con el fármaco, la concentración de anticuerpo y la concentración de fármaco en la composición conjugada anticuerpofármaco se representan por medio de las siguientes expresiones relacionales.
A?g(í - Au,23G A f t , £33 - £ u , 2 9 & C l; + £ ¿ , 2 8 3 ^ * E x p r e s i ó n
í l )
A.V70 = A D,370 A *,37 ~ = S|j,370Cu 6ft,.V)3Cjk E x p r e s i ó n
( 2 )
En las expresiones anteriores, A280 representa la absorbancia de una solución acuosa de conjugado anticuerpofármaco a 280 nm, A370 representa la absorbancia de una solución acuosa de conjugado anticuerpo-fármaco a 370 nm, Aa,280 representa la absorbancia de un anticuerpo a 280 nm, Aa, 370 representa la absorbancia de un anticuerpo a 370 nm, Ad,280 representa la absorbancia de un precursor de conjugado a 280 nm, Ad,370 representa la absorbancia de un precursor de conjugado a 370 nm, £a,280 representa el coeficiente de absorción molar de un anticuerpo a 280 nm, £a, 370 representa el coeficiente de absorción molar de un anticuerpo a 370 nm, £d,280 representa el coeficiente de absorción molar de un precursor de conjugado a 280 nm, £d,370 representa el coeficiente de absorción molar de un precursor de conjugado a 370 nm, Ca representa la concentración de anticuerpo en una composición de conjugado anticuerpo-fármaco, y Cd representa la concentración de fármaco en una composición de conjugado anticuerpofármaco.
En este caso, para los valores representados por £a,280, £a,370, £d,280 y £d,370, se utilizan valores previamente preparados (valores de cálculo estimados, o valores medidos obtenidos por la medición UV de un compuesto). Por ejemplo, el valor £a,280 se puede suponer a partir de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo de acuerdo con un procedimiento de cálculo conocido (Protein Science, 1995, vol. 4, 2411-2423). El valor £a,370 es generalmente cero. Los valores £d,280 y £d,370 se pueden obtener al medir la absorbancia de una solución, en la que el precursor conjugado utilizado está disuelto en una determinada concentración, de acuerdo con la ley de Lambert-Beer (absorbancia = concentración molar * coeficiente de absorción molar * longitud del paso de luz de la célula). Se miden los valores A280 y A370 de la solución acuosa del conjugado anticuerpo-fármaco, y los valores obtenidos se sustituyen en las fórmulas (1) y (2) para resolver las ecuaciones simultáneas, para de este modo obtener Ca y Cd. Además, Cd se divide por Ca para obtener el número medio de fármacos unidos por anticuerpo.
(7) Medición del número medio de fármacos unidos por cada molécula de anticuerpo en la composición del conjugado anticuerpo-fármaco (procedimiento RPC)
El número medio de fármacos unidos por molécula individual de anticuerpo en una composición de conjugado anticuerpo-fármaco también se puede obtener por medio del análisis de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) mencionado a continuación, mediante el uso de un procedimiento de cromatografía en fase reversa (RPC), en lugar del procedimiento UV mencionado anteriormente.
(7-1) Preparación de la muestra utilizada para el análisis por HPLC (reducción del conjugado anticuerpofármaco)
Se mezcla una solución de conjugado anticuerpo-fármaco (aproximadamente 1 mg/mL, 60 j L) con una solución acuosa de ditiotreitol (DTT) (100 mM, 15 j L) . La mezcla se incuba a 37°C durante 30 minutos para obtener una muestra en la que se han escindido los disulfuros entre cadenas del conjugado anticuerpo-fármaco y, a continuación, la muestra obtenida se utiliza en un análisis por HPLC.
(7-2) Análisis HPLC
Se lleva a cabo un análisis por HPLC en las siguientes condiciones de medición.
Sistema HPLC: Sistema HPLC Agilent 1290 (Agilent Technologies)
Detector: Espectrómetro de absorción ultravioleta (longitud de onda de medición: 280 nm).
Columna: p Lr P-S (2,1 * 50 mm, 8 jm , 1000 A; Agilent Technologies, N/P PL1912-1802)
Temperatura de la columna: 80°C
Fase móvil A: 0,04% Solución acuosa de ácido trifluoroacético (TFA)
Fase móvil B: Solución de acetonitrilo que contiene 0,04% de TFA (v/v)
Programa de gradiente: 29% - 36% (0 min -12,5 min), 36% - 42% (12,5 min -15 min), 42% - 29% (15 min -15,1 min), 29% -29% (15,1 min -25 min)
Cantidad de muestra inyectada: 15 j L
(7-3) Análisis de datos
(7-3-1) Cuando se compara con la cadena ligera (Lo) y la cadena pesada (Ho) de un anticuerpo al que no está unido ningún fármaco, en el caso de una cadena ligera a la que está unido un fármaco (una cadena ligera a la que está unido un fármaco: Li) y cadenas pesadas a las que está(n) unido(s) un(os) fármaco(s) (una cadena pesada a la que está unido un fármaco: Hi, una cadena pesada a la que se unen dos fármacos: H2, y una cadena pesada a la que se unen tres fármacos: H3), la hidrofobicidad aumenta en proporción al número de fármacos unidos y el tiempo de retención se prolonga. De este modo, la elución tiene lugar en el orden Lo, Li, Ho, Hi, H2, y H3. Como resultado de hacer una comparación en términos de tiempo de retención entre Lo y Ho, el pico de detección se puede asignar a cualquiera de Lo, Li, Ho, Hi, H2, y H3.
Figure imgf000018_0001
(7-3-2) Dado que un enlazador de fármaco absorbe UV, los valores del área de pico se corrigen de acuerdo con las siguientes expresiones, mediante el uso de los coeficientes de absorción molar de una cadena ligera, una cadena pesada y un enlazador de fármaco, dependiendo del número de enlazadores de fármaco unidos.
[Expresión 1]
Cadena ligera corrección valor de área de pico (Li)
_ Area de pico
Coeficiente de absorciónmolarde cadena ligera
X -------- —----------------------- 7------------------------------- ------------------ ;---------------- -—------------ -----------------—--------
Coeficiente de absorciónmolarde cadena ligera el numero de fáun acó s unido sx coeficiente de ab sorción m olar de enla z a dor de f árm acó
[Expresión 2]
Cadena pesa da corrección valor de área de pico (Hj)
Figure imgf000018_0002
En el presente documento, con respecto a los coeficientes de absorción molar (28o nm) de la cadena ligera y la cadena pesada de cada anticuerpo, los valores asumidos a partir de las secuencias de aminoácidos de la cadena ligera y la cadena pesada de cada anticuerpo de acuerdo con un procedimiento de cálculo conocido (Protein Science, i995, vol.
4, 24ii-2423). Además, con respecto al coeficiente de absorción molar (28o nm) de un enlazador de fármaco, se puede utilizar el coeficiente de absorción molar (28o nm) realmente medido de un compuesto preparado al hacer reaccionar cada intermedio de enlazador de fármaco con mercaptoetanol o N-acetil cisteína y convertir después un grupo maleimidilo N-sustituido en un tioéter de succinimida.
(7-3-3) La relación de área de pico (%) de cada cadena con respecto a un total de valores de corrección de área de pico se calcula de acuerdo con la siguiente expresión.
i8
[Expresión 3]
Relación de área depico de cadena=-----^¡2-----x 100
ligera L^O ^Li
Relación de área depico de cadena
pecada
Figure imgf000019_0001
Valor de corrección del área del pico de cada uno de Alí, Ahí Li, Hi
Si Li y 0i se han generado preferentemente, se puede suponer que los disulfuros entre cadenas pesadas y ligeras se han reducido selectivamente. Por otra parte, si se han generado preferentemente L0 y H2, cabe suponer que los disulfuros pesados entre cadenas se han reducido selectivamente.
(7-3-4) El número medio de fármacos unidos en una composición de conjugado anticuerpo-fármaco se calcula de acuerdo con la expresión siguiente.
El número medio de fármacos ligados = (proporción de área de pico Lo x 0 proporción de área de pico L1 x 1 proporción de área de pico Ho x 0 proporción de área de pico Hi x 1 proporción de área de pico H2 x 2 proporción de área de pico H3 x 3) / 100 x 2
El número medio de fármacos unidos en la composición de conjugado anticuerpo-fármaco producida por el procedimiento de producción de la presente invención es preferentemente de 3,5 a 4,5, y más preferentemente de 4,0 a 4,1.
7. Fármaco que comprende una composición conjugada anticuerpo-fármaco
Después de que la composición conjugada anticuerpo-fármaco obtenida por la presente invención se ha transferido a las células tumorales, la porción enlazadora de la misma se escinde, y el fármaco se libera en las células tumorales. En el caso de un conjugado anticuerpo-fármaco representado por la siguiente fórmula:
Figure imgf000019_0002
Figure imgf000020_0001
se libera. Como este compuesto tiene una estructura aminal inestable, se hidroliza aún más, de forma que se obtiene un compuesto representado por la fórmula siguiente:
Figure imgf000020_0002
se puede generar.
Dado que la composición de conjugado anticuerpo-fármaco obtenida por la presente invención exhibe citotoxicidad sobre células cancerosas, se puede utilizar como ingrediente activo de una composición farmacéutica para tratar y/o prevenir el cáncer.
Es decir, la composición de conjugado anticuerpo-fármaco obtenida por la presente invención se puede seleccionar y utilizar como un agente para quimioterapia que es un procedimiento de tratamiento principal en la terapia del cáncer, y como resultado del uso de la misma, el crecimiento de las células cancerosas se puede retrasar, la proliferación de las mismas se puede suprimir, y además, las células cancerosas se pueden destruir. De este modo, se puede conseguir la liberación de los síntomas causados por el cáncer o la mejora de la CdV de los pacientes oncológicos, y se puede mantener la vida de los pacientes oncológicos, de forma que se pueden conseguir efectos terapéuticos. Incluso en el caso de que no se pueda lograr la destrucción de las células cancerosas, se puede conseguir una mayor calidad de vida de los pacientes de cáncer por medio de la supresión o el control del crecimiento de las células cancerosas, de forma que se pueda lograr la supervivencia de los pacientes durante un periodo de tiempo más largo.
La composición de conjugado anticuerpo-fármaco obtenida por la presente invención se puede utilizar, no sólo en forma de fármaco solo en dicha terapia farmacológica, sino también en forma de agente que se combina con otras terapias en la terapia adyuvante. La presente composición de conjugado anticuerpo-fármaco se puede combinar con operaciones quirúrgicas, radioterapia, terapia hormonal, etc. Además, la presente composición de conjugado anticuerpo-fármaco también se puede utilizar como agente utilizado para la terapia farmacológica en la terapia neoadyuvante.
Además del uso terapéutico mencionado, se puede esperar que la composición de conjugado anticuerpo-fármaco obtenida por la presente invención tenga el efecto de suprimir el crecimiento de células cancerosas metastásicas muy pequeñas y destruir aún más tales células cancerosas metastásicas. Por ejemplo, se puede esperar que la presente composición de conjugado anticuerpo-fármaco tenga el efecto de suprimir y destruir células cancerosas en un fluido corporal en un proceso metastásico, o el efecto de suprimir y destruir células cancerosas muy pequeñas, que se encuentran inmediatamente después de haberse adherido a cualquier tejido. Por lo tanto, cabe esperar que la presente composición de conjugado anticuerpo-fármaco tenga el efecto de suprimir y prevenir la metástasis del cáncer, en particular tras la extirpación del cáncer por medio de la operación quirúrgica.
La composición de conjugado anticuerpo-fármaco obtenida por la presente invención no sólo se administra a un paciente por medio de terapia sistémica, sino que también cabe esperar que la composición de conjugado anticuerpofármaco se administre tópicamente a tejidos cancerosos y exhiba efectos terapéuticos sobre los mismos.
Ejemplos del tipo de cáncer incluyen cáncer de pulmón, cáncer de riñón, cáncer urotelial, cáncer de colon, cáncer de próstata, glioblastoma multiforme, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de mama, melanoma, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, cáncer de estómago, cáncer de cuello de útero, cáncer uterino, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de esófago, cáncer de vías biliares, cáncer de tiroides, linfoma, leucemia mielocítica aguda, leucemia linfocítica aguda, leucemia mielógena crónica y mieloma múltiple, pero sin limitarse a ellos.
La composición de conjugado anticuerpo-fármaco obtenida por la presente invención se puede utilizar como ingrediente activo de una composición farmacéutica para tratar una enfermedad autoinmune, o una composición farmacéutica para suprimir una reacción de rechazo contra un trasplante.
Cuando una composición farmacéutica que comprende la composición conjugada anticuerpo-fármaco obtenida por la presente invención se administra a un mamífero (por ejemplo, un humano, un caballo, un bovino, un porcino, etc., y preferentemente, un humano), se puede administrar sistémica o tópicamente, y preferentemente por administración parenteral.
Los ejemplos de la vía de administración parenteral incluyen las vías intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa y subcutánea, pero no se limitan a ellas. Los ejemplos del procedimiento de administración incluyen la inyección y la inyección en bolo, y el procedimiento de administración es preferentemente la inyección.
La composición farmacéutica se puede preparar al seleccionar una forma adecuada en función del procedimiento de administración y aplicar a continuación un procedimiento comúnmente utilizado para preparar diversos tipos de preparados. Por ejemplo, la composición de conjugado anticuerpo-fármaco obtenida por la presente invención se mezcla con un disolvente tal como un líquido esterilizado (que incluye agua y aceite; aceite derivado del petróleo, animales, vegetales, o aceite sintético, por ejemplo, aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo, etc.), una solución salina, una solución acuosa de dextrosa, o una solución acuosa de glicerol, y aditivos tales como un humectante, un emulsionante, o un tampón de pH, que se describen en "Remington's Pharmaceutical Sciences" escrito por E. W. Martin, y similares, para preparar la composición farmacéutica.
La composición farmacéutica puede comprender un solubilizante, un anestésico local (por ejemplo, lignocaína) para aliviar el dolor en un punto de inyección, etc. La composición farmacéutica se puede suministrar en un aspecto en el que un principio activo, un disolvente y similares se colocan cada uno en recipientes diferentes. Además, cuando la composición farmacéutica se administra por inyección, se puede administrar, por ejemplo, en forma de un frasco de inyección que contiene un principio activo y un agua o solución salina esterilizada de calidad farmacéutica. Cuando la composición farmacéutica se administra por inyección, el principio activo se puede mezclar con agua esterilizada para inyección o solución salina, antes de la administración de la misma.
La composición farmacéutica puede comprender una composición de conjugado anticuerpo-fármaco y al menos un agente terapéutico contra el cáncer distinto de la composición de conjugado anticuerpo-fármaco antes mencionada. La composición de conjugado anticuerpo-fármaco obtenida por la presente invención también se puede administrar junto con otros agentes terapéuticos contra el cáncer, y la presente composición de conjugado anticuerpo-fármaco puede de este modo potenciar los efectos anticancerígenos. Otros agentes anticancerígenos utilizados para tal fin se pueden administrar a un sujeto individual, simultánea, separada o continuamente con la presente composición de conjugado anticuerpo-fármaco. De lo contrario, estos otros agentes anticancerígenos también se pueden administrar a intervalos de administración diferentes de los de la composición de conjugado anticuerpo-fármaco. Ejemplos de tales agentes terapéuticos contra el cáncer incluyen carboplatino, cisplatino, gemcitabina, irinotecan (CPT-11), paclitaxel, pemetrexed, sorafenib, vinblastin, los agentes descritos en la Publicación Internacional No. WO2003/038043y, además, análogos de la LH-RH (leuprorelina, goserelina, etc.), estramustina-fosfato, antagonistas de estrógenos (tamoxifeno, raloxifeno, etc.) e inhibidores de la aromatasa (anastrozol, letrozol, exemestano, etc.). Sin embargo, el tipo de agente terapéutico contra el cáncer no está limitado, siempre que se trate de un agente con actividad antitumoral.
La composición farmacéutica invención también se puede proporcionar en forma de una preparación liofilizada o una preparación líquida. Cuando la composición farmacéutica se suministra como un preparado liofilizado, puede ser un preparado que comprenda aditivos de preparación adecuados que se utilizan en el campo técnico en cuestión. Asimismo, cuando la composición farmacéutica se presenta como un preparado líquido, puede ser un preparado que incluya aditivos de preparación adecuados que se utilicen en el campo técnico en cuestión.
La composición de la composición farmacéutica y la concentración de un principio activo de la misma se modifican en función de un procedimiento de administración. En el caso de la composición de conjugado anticuerpo-fármaco comprendida en la composición farmacéutica, a medida que aumenta la afinidad del conjugado anticuerpo-fármaco por el antígeno, es decir, a medida que aumenta la afinidad en términos de la constante de disociación (valor Kd) del conjugado anticuerpo-fármaco por el antígeno (es decir, a medida que disminuye el valor Kd), la composición de conjugado anticuerpo-fármaco es capaz de mostrar efectos medicinales, aunque se administre en una pequeña cantidad. En consecuencia, para la determinación de la dosis aplicada de la composición de conjugado anticuerpofármaco, la dosis se puede determinar en base a la condición de la afinidad del conjugado anticuerpo-fármaco por el antígeno. Cuando la composición de conjugado anticuerpo-fármaco producida por el procedimiento de producción de la presente invención se administra a un humano, la composición de conjugado anticuerpo-fármaco se puede administrar, por ejemplo, a una dosis de aproximadamente 0,001 a 100 mg/kg al humano, una vez, o dividida en varias administraciones, a intervalos de una vez cada 1 a 180 días.
La presente invención se describirá específicamente en los siguientes Ejemplos. Sin embargo, estos ejemplos no pretenden limitar el alcance de la presente invención. Además, los siguientes Ejemplos no se interpretan restrictivamente en ningún sentido. Además, los reactivos, disolventes y materiales de partida descritos en la presente descripción se pueden adquirir fácilmente de fuentes de suministro disponibles en el mercado, a menos que se especifique lo contrario.
Ejemplos
(Ejemplo 1) Construcción del vector de expresión del anticuerpo humanizado anti-TROP2 y producción del anticuerpo (i) Construcción del vector de expresión de la cadena pesada del anticuerpo humanizado anti-TROP2 (hTINA1-H1)
Un fragmento de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica la región variable de una cadena pesada de anticuerpos anti-TROP2 humanizados (hTINA1-H1) que está representada por los números de nucleótidos 36 a 437 en la secuencia de nucleótidos de una cadena pesada de anticuerpos anti-TROP2 humanizados (hTINA1-H1) mostrada en SEC ID NO: 2 en la lista de secuencias (Servicio de Síntesis de Genes Artificiales, GENEART). Mediante el uso del fragmento de ADN sintetizado como molde, se amplificó un fragmento de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica la región variable de la cadena pesada de un anticuerpo humanizado anti-TROP2 (hTINA1-H1) con KOD-Plus-(TOYOBO) y el siguiente conjunto de cebadores. A continuación, un vector de expresión para cadenas pesadas de anticuerpos quiméricos y humanizados de tipo IgG1, pCMA-G1, se escindió con la enzima de restricción BlpI, y el fragmento de ADN se insertó en el sitio escindido, mediante el uso del kit de clonación PCR In-Fusion HD (CLONTECH), para construir un vector de expresión de anticuerpos humanizados de cadena pesada anti-TROP2 (hTINA1-H1). El vector de expresión obtenido se denominó "pCMA-G1/hTINA1-H1".
Primer conjunto:
5'-agctcccagatgggtgctgagc-3' (SEC ID NO: 21: primer EG-Inf-F)
5'-gggcccttggtggaggctgagc-3' (SEC ID NO: 22: imprimación EG1-Inf-R)
(ii) Construcción del vector de expresión del anticuerpo humanizado anti-TROP2 de cadena ligera (hTINA1-L1)
Un fragmento de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica la región variable de una cadena ligera de anticuerpo humanizado anti-TROP2 (hTINA1-L1) que está representada por los números de nucleótidos 38 a 402 en la secuencia de nucleótidos de una cadena ligera de anticuerpo humanizado anti-TROP2 (hTINA1-L1) mostrada en SEC ID NO: 4 en la lista de secuencias (Servicio de Síntesis de Genes Artificiales, GENEART). Mediante el uso del fragmento de ADN sintetizado como molde, se amplificó un fragmento de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica la región variable de una cadena ligera de un anticuerpo humanizado anti-TROP2 (hTINA1-L1) con KOD-Plus-(TOYOBO) y el siguiente conjunto de cebadores. A continuación, un vector de expresión para cadenas ligeras de anticuerpos quiméricos y humanizados, pCMA-LK, se escindió con la enzima de restricción BsiWI, y el fragmento de ADN se insertó en el sitio escindido, mediante el uso del kit de clonación PCR In-Fusion HD (CLONTECH), para construir un vector de expresión de cadena ligera de anticuerpos humanizados anti-TROP2 (hTINA1-L1). El vector de expresión obtenido se denominó "pCMA-LK/hTINA1-L1".
Primer conjunto:
5'-ctgtggatctccggcgcgtacggc-3' (SEC ID NO: 23: primer CM-LKF)
5'-ggagggggcggccaccgtacg-3' (SEC ID NO: 24: primer KCL-Inf-R)
(iii) Producción de anticuerpo humanizado anti-TROP2 (hTINA1-H1L1)
Se subcultivaron y cultivaron células FreeStyle 293F (Invitrogen) siguiendo el manual de instrucciones. En concreto, se inocularon 1,2 *109 células FreeStyle 293F (Invitrogen), que se encontraban en la fase de crecimiento logarítmico, en un matraz Fernbach Erlenmeyer de 3 L (CORNING) y, a continuación, se diluyeron con un medio de expresión FreeStyle293 (Invitrogen) para ajustarlas a 1,0 *10® células/mL. A continuación, las células se sometieron a un cultivo por agitación a 37°C en una incubadora con un 8% de CO2 a 90 rpm durante 1 hora. A continuación, se disolvió polietilenimina (Polyscience #24765; 3,6 mg) en Opti-Pro SFM (Invitrogen; 20 mL), y después se añadieron a Opti-Pro SFM (Invitrogen; 20 mL) un vector de expresión de cadena ligera (0,8 mg) y un vector de expresión de cadena pesada (0,4 mg), que se habían preparado mediante el uso del kit PureLink HiPure Plasmid (Invitrogen). La solución mixta de vector de expresión/Opti-Pro SFM (20 mL) se añadió a la solución mixta de polietilenimina/Opti-Pro SFM (20 mL) y, a continuación, la mezcla obtenida se agitó suavemente y se dejó reposar durante 5 minutos. A continuación, se añadieron las células FreeStyle 293F a la mezcla de reacción. La mezcla obtenida de este modo se sometió a cultivo en agitación a 37°C en una incubadora con un 8% de CO2 durante 7 días a 90 rpm, y el sobrenadante de cultivo obtenido se filtró con un filtro de cápsula desechable (ADVANTEC #CCS-045-E1H).
El anticuerpo humanizado anti-TROP2 obtenido por medio de la combinación de pCMA-G1/hTINA1-H1 con pCMA-LK/hTINA1-L1 se denominó "hTINA1-H1L1".
(iv) Purificación del anticuerpo humanizado anti-TROP2 (hTINA1-H1L1)
Se purificó un anticuerpo a partir del sobrenadante de cultivo obtenido en el punto (iii) anterior por medio de un proceso de dos etapas, a saber, por medio de cromatografía de afinidad de rProteína A (4°C - 6°C) e hidroxiapatita cerámica (temperatura ambiente). Tras la purificación mediante cromatografía de afinidad de rProteína A y tras la purificación por medio de hidroxiapatita cerámica, se llevó a cabo una etapa de sustitución de tampones a 4°C a 6°C. En primer lugar, el sobrenadante del cultivo se aplicó a MabSelect SuRe (columna HiTrap, fabricada por GE Healthcare Bioscience), que se había equilibrado con PBS. Una vez introducido todo el sobrenadante del cultivo en la columna, ésta se lavó con PBS en una cantidad igual o superior al doble del volumen de la columna. A continuación, se procedió a la elución con una solución de clorhidrato de arginina 2 M (pH 4,0), para recoger una fracción que contenía el anticuerpo. La fracción se sustituyó por PBS de acuerdo con diálisis (Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette, Thermo Scientific) y, a continuación, se aplicó una solución de anticuerpo, que se había diluido cinco veces con un tampón compuesto por 5 mM de fosfato sódico y 50 mM de MES (pH 7.0), se aplicó a una columna cerámica de hidroxiapatita (Bio-Scale CHTType-I Hydroxyapatite Column, JAPAN Bio-Rad Laboratories K. K.), que se había equilibrado con un tampón compuesto por 5 mM de NaPi, 50 mM de MES y 30 mM de NaCl (pH 7,0). Posteriormente, se llevó a cabo una elución en gradiente de concentración lineal mediante el uso de cloruro sódico, y se recogió una fracción que contenía el anticuerpo. La fracción se sustituyó con HBSor (25 mM histidina/5% sorbitol, pH 6,0) de acuerdo con diálisis (Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette, Thermo Scientific). Por último, el resultante se concentró mediante el uso del Dispositivo de Filtración UF Centrífuga VIVASPIN20 (peso molecular de corte: UF10K, Sartorius, 4°C), y la concentración de IgG se ajustó a 20 mg/mL o más, para preparar una muestra purificada.
(v) Cambio de tampón para el anticuerpo humanizado anti-TROP2 (hTINA1-H1L1) y ajuste de la concentración
Una columna NAP-25 (Cat. N° 17-0852-02, GE Healthcare Japan Corporation), en el que se utilizó un soporte Sephadex G-25, se equilibró con un tampón fosfato que contenía cloruro sódico (137 mM) y ácido etilendiaminotetraacético (5 mM) (10 mM, pH 6,0; en adelante en la presente memoria también "PBS6,0/e Dt A") de acuerdo con el procedimiento proporcionado por el fabricante. 2.se aplicaron 5 mL de una solución acuosa de anticuerpo que comprendía el anticuerpo humanizado anti-TROP2 (hTINA1-H1L1) producido en el punto (iv) anterior a una sola columna NAP-25 descrita anteriormente, y se recogió una fracción (3,5 mL) eluida con 3,5 mL de PBS6,0/EDTA. Esta fracción se colocó en un recipiente de Amicon Ultra (50.000 MWCO, Millipore Corporation), y a continuación se sometió a una operación de centrifugado (centrifugado a 2000 G a 3800 G durante 5 a 20 minutos) mediante el uso de una centrifugadora (Allegra X-15R, Beckman Coulter, Inc.), con el fin de concentrar la solución de anticuerpos. Mediante el uso de un aparato de medición UV (Nanodrop 1000, Thermo Fisher Scientific Inc.), se midió la concentración del anticuerpo de acuerdo con el procedimiento proporcionado por el fabricante. Para la medición, la concentración del anticuerpo se midió mediante el uso de un coeficiente de absorción de 280 nm (1,54mLmg'1cirr1), y después, mediante el uso de PBS6,0/EDTA, la concentración del anticuerpo se ajustó a 21,8 mg/mL.
(Ejemplo 2) Producción del intermediario de enlace del fármaco
N-[6-(2,5-Dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1 -yl)hexanoil]glicilglicil-L-fenilalanil-N-[(2-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10, 13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-2-oxoetoxi)metil]glicinamida, que se representa por la siguiente fórmula, se sintetizó por el procedimiento descrito en el Ejemplo 58 de WO2014/057687.
Figure imgf000023_0001
(Ejemplo 3) Producción de composición ADC humanizada de anticuerpo anti-TROP2
(Ejemplo 3-1) Producción de una composición ADC de anticuerpo humanizado anti-TROP2 (hTINA1-H1L1) de acuerdo con el procedimiento convencional
(i) Reducción de anticuerpos
Un anticuerpo humanizado anti-TROP2 (hTINA1-H1L1) (15 mL: correspondiente a 327 mg, concentración: 21.8 mg/mL; tampón de histidina 25 mM) en un recipiente de reacción de vidrio, al que se añadió un tampón de histidina 25 mM (18 mL, pH 5,0). A la presente solución de reacción, se añadió una solución acuosa de EDTA 0,5 M (0,027 mL; 6 equivalentes en base al anticuerpo) y, a continuación, una solución acuosa de polisorbato 20 de 0,1 g/mL (0,033 mL; 0,01% en base al anticuerpo). A continuación, se añadió a la mezcla de reacción una solución acuosa de hidrogenofosfato disódico 0,3 M, de forma que la mezcla se ajustó a pH 7,12. Bajo agitación a 24°C, se añadió a la mezcla de reacción una solución acuosa de clorhidrato de tris(2-carboxietil)fosfina de 1,00 mg/mL (1,58 mL; 2,45 equivalentes por molécula única de anticuerpo), y la mezcla obtenida se calentó durante 3 horas para dar lugar a una temperatura interna de 35°C a 36°C, de forma que se redujeran los disulfuros entre cadenas del anticuerpo.
(ii) Conjugación del anticuerpo con el enlace intermedio del fármaco
La solución obtenida en lo anterior (i) se enfrió, y una solución acuosa de acetona al 50% de 6,67 mg/mL (1,71 mL; 5,2 equivalentes por molécula de anticuerpo único) del compuesto obtenido en el Ejemplo 2 se añadió entonces a la solución de reacción a una temperatura interna de 16°C a 17°C bajo agitación durante 60 minutos. La mezcla obtenida se agitó a la misma temperatura que la descrita anteriormente durante 20 minutos, de forma que se permitió que el intermediario enlazador del fármaco se uniera al anticuerpo. Posteriormente, se añadió a la mezcla de reacción una solución acuosa de N-acetilcisteína 50 mM (0,135 mL; 3 equivalentes por cada molécula de anticuerpo), y la mezcla obtenida de este modo se agitó de nuevo a la misma temperatura descrita anteriormente durante 20 minutos. La reacción del fármaco enlazador intermedio se dio por terminada, y el pH de la mezcla de reacción se ajustó entonces a pH 5,0 mediante el uso de una solución acuosa de ácido acético al 10%.
(iii) Depuración
Mediante el uso de Pellicon XL (Millipore Japón, 50 cm2), se hizo circular la solución obtenida en el punto (ii) anterior, mientras se añadía a la misma un tampón de histidina 10 mM (pH 5,0) utilizando una bomba de rodillo, y se llevó a cabo una operación de lavado hasta que la cantidad de agua descargada llegó a 500 mL, de modo que se eliminaron las sustancias de bajo peso molecular. A continuación, la solución restante se concentró para obtener 17,6 mL de una solución que contenía una composición de ADC de anticuerpo humanizado anti-TROP2 (hTINA1-H1L1).
(iv) Evaluación de las propiedades
[Operación común A] Medición del número medio de fármacos unidos por cada molécula de anticuerpo en la composición del conjugado anticuerpo-fármaco
El número medio de fármacos unidos por molécula individual de anticuerpo en una composición de conjugado anticuerpo-fármaco se obtuvo por medio de un análisis de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) mediante el uso del siguiente procedimiento.
1. Preparación de la muestra utilizada en el análisis por HPLC (reducción del conjugado anticuerpo-fármaco)
Se mezcló una solución de conjugado anticuerpo-fármaco (aproximadamente 1 mg/mL, 60 pL) con una solución acuosa de ditiotreitol (DTT) (100 mM, 15 pL) . La mezcla se incubó a 37°C durante 30 minutos para preparar una muestra en la que se escindieron los disulfuros entre la cadena pesada y la cadena ligera y entre la cadena pesada y la cadena pesada del conjugado anticuerpo-fármaco. La muestra obtenida se utilizó en un análisis por HPLC.
2. Análisis HPLC
Se llevó a cabo un análisis por HPLC en las siguientes condiciones de medición.
Sistema HPLC: Sistema HPLC Shimadzu Science
Detector: Espectrómetro de absorción ultravioleta (longitud de onda de medición: 280 nm).
Columna: p Lr P-S (2,1 * 50 mm, 8 pm, 1000 A; Agilent Technologies)
Temperatura de la columna: 80°C
Fase móvil A: 0.solución acuosa de ácido trifluoroacético (TFA) al 05
Fase móvil B: Solución de acetonitrilo que contiene 0,04% de TFA (v/v)
Programa de gradiente: 29% - 36% (0 min -12,5 min), 36% - 42% (12,5-15 min), 42% - 29% (15 min -15,1 min), 29% -29% (15,1 min -25 min)
Cantidad de muestra inyectada: 15 pL
4. Análisis de datos
Cuando se compara con la cadena ligera (L0) y la cadena pesada (H0) de un anticuerpo al que no se unió un fármaco, en el caso de una cadena ligera a la que se unió un fármaco (una cadena ligera a la que se unió un fármaco: L1) y cadenas pesadas a las que se unió un fármaco o fármacos (una cadena pesada a la que se unió un fármaco: H1, una cadena pesada a la que se unen dos fármacos: H2, y una cadena pesada a la que se unen tres fármacos: H3), la hidrofobicidad aumentaba en proporción al número de fármacos unidos y el tiempo de retención se prolongaba. De este modo, la elución tuvo lugar en el orden Lo, Li, Ho, Hi, H2, y H3. Como resultado de hacer una comparación en términos de tiempo de retención entre L0 y H0, el pico de detección se asignó a cualquiera de L0, L1, H0, H1, H2 y H3.
Dado que un enlazador de fármaco absorbía UV, los valores del área de pico se corrigieron de acuerdo con las siguientes expresiones, mediante el uso de los coeficientes de absorción molar de una cadena ligera, una cadena pesada y un enlazador de fármaco, lo que depende del número de enlazadores de fármaco unidos.
"Expresión 4]
Cadena ligara corrección valor de área de pico (L{)
Figure imgf000025_0001
Cadena pesa da corrección valor de área de pico (Hi)
— Area de pico
Coeficiente de absorción m olar de cadena pesa da
Coeficiente de absorción molar de cadena p esa da el número de fáim acó s unido sx
coeficiente de absorciónmolarde enlazador de fánn acó
En el presente documento, con respecto a los coeficientes de absorción molar (280 nm) de la cadena ligera y la cadena pesada de cada anticuerpo, los valores asumidos a partir de las secuencias de aminoácidos de la cadena ligera y la cadena pesada de cada anticuerpo de acuerdo con un procedimiento de cálculo conocido (Protein Science, 1995, vol.
4, 2411-2423). En el caso del anticuerpo humanizado anti-TROP2 (hTINA1-H1L1), en base a su secuencia de aminoácidos, se utilizó el número 27640 como valor estimado para el coeficiente de absorción molar de la cadena ligera, y el número 83810 como valor estimado para el coeficiente de absorción molar de la cadena pesada. Además, con respecto al coeficiente de absorción molar (280 nm) de un enlazador de fármaco, se utilizó el coeficiente de absorción molar (280 nm) realmente medido de un compuesto preparado al hacer reaccionar cada intermedio de enlazador de fármaco con mercaptoetanol o N-acetil cisteína y convertir después un grupo maleimidilo N-sustituido en un tioéter de succinimida.
La relación de área de pico (%) de cada cadena con respecto a un total de valores de corrección de área de pico se calculó de acuerdo con la siguiente expresión.
"Expresión 6]
Relación de áreadepicode cadena
ligera
Figure imgf000025_0002
Relación de áreadepicode cadena
peEada
Figure imgf000025_0003
Valor de corrección del área del pico de cada uno deAu, Ahí Li, Hi
El número medio de fármacos unidos por molécula única de anticuerpo en una composición de conjugado anticuerpofármaco se calculó de acuerdo con la siguiente expresión.
El número medio de fármacos unidos = (L3 relación de área
de pico x 0 Li relación de área de pico x 1 Hc relación
de área pico x 0 Hi relación de área de pico x 1 H2
relación de área de pico x 2 H3 relación de área de pico
x 3] / 100 x 2
La concentración del anticuerpo resultó ser de 16,49 mg/mL, el rendimiento del anticuerpo resultó ser de 290 mg (86%), y el número medio de fármacos unidos (n) por molécula de anticuerpo única, que se midió por medio de la operación común A, resultó ser de 4,4. En la Figura 5 se muestra el cromatógrafo HPLC que representa la relación de áreas de pico (%) de cada cadena.
[Operación común B] Procedimiento de separación por medio de cromatografía en columna hidrófoba para la composición de conjugados anticuerpo-fármaco
1. Procedimiento de medición HPLC
Se llevó a cabo un análisis por HPLC en las siguientes condiciones de medición.
Sistema HPLC: Sistema HPLC Shimadzu Science
Detector: Espectrómetro de absorción ultravioleta (longitud de onda de medición: 280 nm).
Columna: TSKgel Butyl-NPR (4,6 * 100 mm, 2,5 pm; TOSOH CORPORATION)
Temperatura de la columna: 30°C
Fase móvil A: solución acuosa 25 mM de tampón fosfato (pH 7,0) con 1,5 M de sulfato de amonio
Fase móvil B: Solución mixta compuesta por 75% de tampón fosfato 25 mM (pH 7,0) y 25% de alcohol isopropílico Programa de gradiente: 20% - 60% (0 min - 20 min), 20% - 80% (20 min - 20,1 min), 80% - 80% (20,1 min - 23 min), 80% -20% (23 min -23,1 min), 20% -20% (23,1 min -40 min)
Cantidad de muestra inyectada: 2 pL
2. Análisis de datos
En cuanto a los datos actuales, dado que los conjugados anticuerpo-fármaco se eluyeron en el orden de aumento del número de fármacos unidos en base a una diferencia en la concentración de sal debido a las características de la columna, se asumió una distribución en el número de enlaces al medir los valores de área individuales. Los picos fueron D0 (un anticuerpo no unido por ningún enlazador de fármaco), D2, D4-1, D4-2, D6 y D8 en el orden de elución, y las condiciones de distribución fueron las siguientes: D0: 4,8%, D2-2: 16,8%, D4-1: 24,6%, D4-2: 13,1%, D6: 24,8%, y D8: 12,6% (Figura 6).
(Ejemplo 3-2) Producción de la composición de ADC de anticuerpo humanizado anti-TROP2 (hTINA1-H1L1) de acuerdo con el procedimiento de la presente invención
(i) Reducción de anticuerpos
Un anticuerpo humanizado anti-TROP2 (hTINA1-H1L1) (22,9 mL: correspondiente a 500 mg, concentración: 21.8 mg/mL; tampón de histidina 25 mM) en un recipiente de reacción de vidrio, al que se añadió un tampón de histidina 25 mM (22 mL, pH 5,0). A la presente solución de reacción, se añadió una solución acuosa de EDTA 0,5 M (0,0344 mL; 5 equivalentes en base al anticuerpo) y, a continuación, una solución acuosa de polisorbato 20 de 0,1 g/mL (0,050 mL; 0,01% en base al anticuerpo). A continuación, se añadió a la mezcla de reacción una solución acuosa de hidrogenofosfato disódico 0,3 M, de forma que la mezcla se ajustó a pH 7,12, y después, se enfrió la mezcla. Bajo agitación, se añadió a la mezcla de reacción una solución acuosa de clorhidrato de tris(2-carboxietil)fosfina de 1,00 mg/mL (2,54 mL; 2,58 equivalentes por molécula única de anticuerpo) a una temperatura interna de 0°C a 1°C, y la mezcla obtenida se agitó durante 6 horas a una temperatura interna de 0°C a 1°C, de forma que se redujeran los disulfuros entre cadenas del anticuerpo.
(ii) Conjugación del anticuerpo con el enlace intermedio del fármaco
Se añadió una solución acuosa de acetona al 50% de 6,03 mg/mL (2,99 mL; 5,1 equivalentes por molécula de anticuerpo única) del compuesto obtenido en el Ejemplo 2 a la solución obtenida en el inciso (i) anterior a una temperatura interna de 0°C a 2°C bajo agitación durante 10 minutos. La mezcla obtenida se agitó a la misma temperatura que la descrita anteriormente durante 40 minutos, de forma que se permitió que el intermediario enlazador del fármaco se uniera al anticuerpo. Posteriormente, se añadió a la mezcla de reacción una solución acuosa de N-acetilcisteína 50 mM (0,206 mL; 3 equivalentes por cada molécula de anticuerpo), y la mezcla obtenida de este modo se agitó de nuevo a la misma temperatura descrita anteriormente durante 10 minutos. La reacción del fármaco enlazador intermedio se dio por terminada, y el pH de la mezcla de reacción se ajustó entonces a pH 5,0 mediante el uso de una solución acuosa de ácido acético al 10%.
(iii) Depuración
Mediante el uso de Pellicon XL (Millipore Japón, 50 cm2), se hizo circular la solución obtenida en el punto (ii) anterior, mientras se añadía a la misma un tampón de histidina 10 mM (pH 5,0) mediante el uso de una bomba de rodillo, y se llevó a cabo una operación de lavado hasta que la cantidad de agua descargada llegó a 700 mL, de forma que se eliminaron las sustancias de bajo peso molecular. A continuación, la solución restante se concentró para obtener 23,6 mL de una solución que contenía una composición de ADC de anticuerpo humanizado anti-TROP2 (hTINA1-H1L1).
(iv) Evaluación de las propiedades
El número medio de fármacos unidos se midió de la misma manera que la operación común A descrita en el Ejemplo 3-1, (iv) . En el caso del anticuerpo humanizado anti-TROP2 (hTINA1-H1L1), en base a su secuencia de aminoácidos, se utilizó el número 27640 como valor estimado para el coeficiente de absorción molar de la cadena ligera, y el número 83810 como valor estimado para el coeficiente de absorción molar de la cadena pesada.
La concentración del anticuerpo resultó ser de 19,63 mg/mL, el rendimiento del anticuerpo resultó ser de 463 mg (92%), y el número medio de fármacos unidos (n) por molécula de anticuerpo única, que se midió por medio de la operación común A, resultó ser de 4,1. En la Figura 7 se muestra el cromatógrafo HPLC que representa la relación de áreas de pico (%) de cada cadena.
El valor del área del número de fármacos ligados se midió de la misma manera que la operación común B descrita en el Ejemplo 3-1, (iv). La condición de distribución del número de drogas ligadas fue la siguiente: D0: 1,9%, D2: 19,5%, D4-1: 53,3%, D6: 18,5%, y D8: 5,5% (Figura 8).
(v) Resultados
El número medio de fármacos unidos en la composición de ADC de anticuerpo humanizado anti-TROP2 producida por el procedimiento convencional (Ejemplo 3-1) fue de 4,4, y el contenido de D4-1 en la misma fue del 24,6%. Por otra parte, el número medio de fármacos unidos en la composición de ADC de anticuerpo humanizado anti-TROP2 producida por el procedimiento de la presente invención (Ejemplo 3-2) fue de 4,1, y el contenido de D4-1 en la misma fue del 53,3%.
(Ejemplo 4) Construcción del vector de expresión del anticuerpo humanizado anti-CD98 y producción del anticuerpo (i) Construcción del vector de expresión de la cadena pesada del anticuerpo humanizado anti-CD98 (hM23-H1)
Un fragmento de ADN (números de nucleótidos 36 a 422) que comprende una secuencia de ADN que codifica la región variable de una cadena pesada de anticuerpo anti-CD98 humanizado (hM23-H1) que está representada por los números de nucleótidos 58 a 405 en la secuencia de nucleótidos de una cadena pesada de anticuerpo anti-CD98 humanizado (hM23-H1) mostrada en SEC ID NO: 11 (Servicio de Síntesis de Genes Artificiales, GENEa Rt ). Mediante el uso del fragmento de ADN sintetizado como molde, se amplificó un fragmento de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica la región variable de hM23-H1 con KOD-Plus-(TOYOBO) y el siguiente conjunto de cebadores. A continuación, se escindió un vector de expresión para cadenas pesadas de anticuerpos quiméricos y humanizados de tipo IgG1, pCMA-G1, con la enzima de restricción BlpI, y se insertó el fragmento de ADN en el sitio escindido, mediante el uso del kit de clonación por PCR In-Fusion Hd (CLONTECH), para construir un vector de expresión de anticuerpos humanizados anti-CD98 de cadena pesada (hM23-H1). El vector de expresión obtenido se denominó "pCMA-G1/hM23-H1".
Primer conjunto:
5'-AGCTCCCAGATGGGTGCTGAGC-3' (SEC ID NO: 21: primer EG-Inf-F)
5'-GGGCCCTTGGTGGAGGCTGAGC-3' (SEC ID NO: 22: imprimación EG1-Inf-R)
(ii) Construcción del vector de expresión del anticuerpo humanizado anti-CD98 de cadena ligera (hM23-L1)
Un fragmento de ADN (números de nucleótidos 38 a 420) que comprende una secuencia de ADN que codifica la región variable de una cadena ligera de anticuerpo anti-CD98 humanizado (hM23-L1) que está representada por los números de nucleótidos 61 a 405 en la secuencia de nucleótidos de una cadena ligera de anticuerpo anti-CD98 humanizado (hM23-L1) mostrada en SEC ID NO: 13 (Servicio de Síntesis de Genes Artificiales, GENEa Rt ). Mediante el uso del fragmento de ADN sintetizado como molde, se amplificó un fragmento de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica la región variable de una cadena ligera de un anticuerpo humanizado anti-CD98 (hM23-L1) con KOD-Plus- (TOYOBO) y el siguiente conjunto de cebadores. A continuación, un vector de expresión para cadenas ligeras de anticuerpos quiméricos y humanizados, pCMA-LK, se escindió con la enzima de restricción BsiWI, y el fragmento de ADN se insertó en el sitio escindido, mediante el uso del kit de clonación PCR In-Fusion HD (CLONTECH), para construir un vector de expresión de cadena ligera de anticuerpos humanizados anti-CD98 (hM23-L1). El vector de expresión obtenido se denominó "pCMA-LK/hM23-L1".
Primer conjunto:
5'-CTGTGGATCTCCGGCGCGTACGGC-3' (SEC ID NO: 23: primer CM-LKF)
5'-GGAGGGGGCGGCCACCGTACG-3' (SEC ID NO: 24: primer KCL-Inf-R)
(iii) Producción de anticuerpo humanizado anti-CD98 (hM23-H1L1)
Se produjo un anticuerpo humanizado anti-CD98 por el mismo procedimiento que el aplicado en el Ejemplo 1, (iii). Se denominó "hM23-H1L1" a un anticuerpo humanizado anti-CD98 obtenido por medio de la combinación de pCMA-G1/hM23-H1 con pCMA-LK/hM23-L1.
(iv) Purificación del anticuerpo humanizado anti-CD98 (hM23-H1L1)
Se purificó un anticuerpo a partir del sobrenadante de cultivo obtenido en lo anterior (iii) por el mismo procedimiento que el aplicado en el Ejemplo 1, (iv).
(v) Cambio de tampón para el anticuerpo humanizado anti-CD98 (hM23-H1L1) y ajuste de la concentración
El anticuerpo humanizado anti-CD98 (hM23-H1L1) purificado en lo anterior (iv) se sometió al intercambio del tampón y al ajuste de la concentración del mismo por el mismo procedimiento que el aplicado en el Ejemplo 1, (v). Durante la operación, se midió la concentración del anticuerpo mediante el uso de un coeficiente de absorción de 280 nm (1,65 mLmg'1cirr1) y, a continuación, se ajustó la concentración de anticuerpo a 40 mg/mL mediante el uso de PBS6,0/EDTA.
(Ejemplo 5) Producción de composición ADC humanizada de anticuerpo anti-CD98
(Ejemplo 5-1) Producción de una composición ADC de anticuerpo humanizado anti-CD98 (hM23-H1L1) de acuerdo con el procedimiento convencional
(i) Reducción de anticuerpos
Un anticuerpo humanizado anti-CD98 (hM23-H1L1) (12 mL: correspondiente a 480 mg, concentración: 40 mg/mL; tampón de histidina 25 mM) en un recipiente de reacción de vidrio, al que se añadió un tampón de histidina 25 mM (36 mL, pH 5,0). A la presente solución de reacción, se añadió una solución acuosa de EDTA 0,5 M (CALBIOCHEM; 0,0394 mL; 6 equivalentes basados en el anticuerpo) y, a continuación, se añadió una solución acuosa de polisorbato 20 de 0,1 g/mL (NOF CORPORATION) (0,048 mL; 0,01% basado en el anticuerpo). A continuación, se añadió a la mezcla de reacción una solución acuosa de hidrogenofosfato disódico 0,3 M, de forma que la mezcla se ajustó a pH 7,10. Bajo agitación a 21°C, se añadió a la mezcla de reacción una solución acuosa de clorhidrato de tris(2-carboxietil)fosfina de 1,00 mg/mL (Nacalai Tesque, Inc.) (2,17 mL; 2,31 equivalentes por molécula de anticuerpo simple), y la mezcla obtenida se calentó durante 3 horas para dar lugar a una temperatura interna de 35°C a 36°C, de forma que se redujeran los disulfuros entre cadenas del anticuerpo.
(ii) Conjugación del anticuerpo con el enlace intermedio del fármaco
La solución obtenida en lo anterior (i) se enfrió, y una solución acuosa de acetona al 50% de 6,20 mg/mL (2,74 mL; 5,2 equivalentes por molécula de anticuerpo único) del compuesto obtenido en el Ejemplo 2 se añadió entonces a la solución de reacción a una temperatura interna de 17°C a 18°C bajo agitación durante 7 minutos. La mezcla obtenida se agitó a la misma temperatura que la descrita anteriormente durante 40 minutos, de forma que se permitió que el intermediario enlazador del fármaco se uniera al anticuerpo. Posteriormente, se añadió a la mezcla de reacción una solución acuosa de N-acetilcisteína 50 mM (Kishida Chemical Co., Ltd.) (0,197 mL; 3 equivalentes por cada molécula de anticuerpo), y la mezcla obtenida de este modo se agitó de nuevo a la misma temperatura descrita anteriormente durante 30 minutos. La reacción del fármaco enlazador intermedio se dio por terminada, y el pH de la mezcla de reacción se ajustó entonces a pH 5,0 mediante el uso de una solución acuosa de ácido acético al 10%.
(iii) Depuración
Mediante el uso de Pellicon XL (Millipore Japón, 50 cm2), se hizo circular la solución obtenida en el punto (ii) anterior, mientras se añadía a la misma un tampón de histidina 10 mM (pH 5,0) mediante el uso de una bomba de rodillo, y se llevó a cabo una operación de lavado hasta que la cantidad de agua descargada llegó a 600 mL, de forma que se eliminaron las sustancias de bajo peso molecular. A continuación, la solución restante se concentró para obtener 21,6 mL de una solución que contenía una composición de ADC de anticuerpo humanizado anti-CD98 (hM23-H1L1).
(iv) Evaluación de las propiedades
El número medio de fármacos unidos se midió de la misma manera que la operación común A descrita en el Ejemplo 3-1, (iv) . En el caso del anticuerpo humanizado anti-CD98 (hM23-H1L1), en base a su secuencia de aminoácidos, se utilizó el número 41370 como valor estimado para el coeficiente de absorción molar de la cadena ligera, y el número 77810 como valor estimado para el coeficiente de absorción molar de la cadena pesada.
La concentración del anticuerpo resultó ser de 20,8 mg/mL, el rendimiento del anticuerpo resultó ser de 449 mg (91%), y el número medio de fármacos unidos (n) por molécula de anticuerpo única, que se midió por medio de la operación común A, resultó ser de 4,0. En la Figura 9 se muestra el cromatógrafo HPLC que representa la relación de áreas de pico (%) de cada cadena.
El valor del área del número de fármacos ligados se midió de la misma manera que la operación común B descrita en el Ejemplo 3-1, (iv). La condición de distribución del número de drogas ligadas fue la siguiente: D0: 4,2%, D2: 24,2%, D4-1: 27,8%, D4-2: 13,3%, D6: 20.8%, y D8: 7.6% (Figura 10).
(Ejemplo 5-2) Producción de la composición de ADC de anticuerpo humanizado anti-CD98 (hM23-H1L1) de acuerdo con el procedimiento de la presente invención
(i) Reducción de anticuerpos
Un anticuerpo humanizado anti-CD98 (hM23-H1L1) (12,5 mL: correspondiente a 500 mg, concentración: 40 mg/mL; tampón de histidina 25 mM) en un recipiente de reacción de vidrio, al que se añadió un tampón de histidina 25 mM (27,5 mL, pH 5,0). A la presente solución de reacción, se añadió una solución acuosa de EDTA 0,5 M (CALBIOCHEM; 0,041 mL; 6 equivalentes en base al anticuerpo) y, a continuación, se añadió una solución acuosa de polisorbato 20 de 0,1 g/mL (NOF CORPORATION) (0,050 mL; 0,01% en base al anticuerpo). A continuación, se añadió a la mezcla de reacción una solución acuosa de hidrogenofosfato disódico 0,3 M, de forma que la mezcla se ajustó a pH 7,10. La solución de reacción se enfrió, y bajo agitación a una temperatura interna de 0°C a 1°C, se añadió a la mezcla de reacción una solución acuosa de clorhidrato de tris(2-carboxietil)fosfina (Nacalai Tesque, Inc.) de 1,00 mg/mL (2,75 mL; 2,80 equivalentes por molécula de anticuerpo simple), y la mezcla obtenida se agitó durante 6 horas para dar lugar a una temperatura interna de 0°C a 1°C, de forma que se redujeran los disulfuros entre cadenas del anticuerpo.
(ii) Conjugación del anticuerpo con el enlace intermedio del fármaco
Se añadió una solución acuosa de acetona al 50% de 6,08 mg/mL (3,14 mL; 5,4 equivalentes por molécula de anticuerpo única) del compuesto obtenido en el Ejemplo 2 a la solución obtenida en el inciso (i) anterior a una temperatura interna de 0,7°C a 1,2°C bajo agitación durante 10 minutos. La mezcla obtenida se agitó a la misma temperatura que la descrita anteriormente durante 50 minutos, de forma que se permitió que el intermediario enlazador del fármaco se uniera al anticuerpo. Posteriormente, se añadió a la mezcla de reacción una solución acuosa de N-acetilcisteína 50 mM (Kishida Chemical Co., Ltd.) (0,205 mL; 3 equivalentes por cada molécula de anticuerpo), y la mezcla obtenida de este modo se agitó de nuevo a la misma temperatura descrita anteriormente durante 30 minutos. La reacción del fármaco enlazador intermedio se dio por terminada, y el pH de la mezcla de reacción se ajustó entonces a pH 5,0 mediante el uso de una solución acuosa de ácido acético al 10%.
(iii) Depuración
Mediante el uso de Pellicon XL (Millipore Japón, 50 cm2), se hizo circular la solución obtenida en el punto (ii) anterior, mientras se añadía a la misma un tampón de histidina 10 mM (pH 5,0) mediante el uso de una bomba de rodillo, y se llevó a cabo una operación de lavado hasta que la cantidad de agua descargada llegó a 600 mL, de forma que se eliminaron las sustancias de bajo peso molecular. A continuación, la solución restante se concentró para obtener 23,6 mL de una solución que contenía una composición de ADC de anticuerpo humanizado anti-CD98 (hM23-H1L1).
(iv) Evaluación de las propiedades
El número medio de fármacos unidos se midió de la misma manera que la operación común A descrita en el Ejemplo 3-1, (iv) . En el caso del anticuerpo humanizado anti-CD98 (hM23-H1L1), en base a su secuencia de aminoácidos, se utilizó el número 41370 como valor estimado para el coeficiente de absorción molar de la cadena ligera, y el número 77810 como valor estimado para el coeficiente de absorción molar de la cadena pesada.
La concentración del anticuerpo resultó ser de 19,91 mg/mL, el rendimiento del anticuerpo resultó ser de 470 mg (94%), y el número medio de fármacos unidos (n) por molécula de anticuerpo única, que se midió por medio de la operación común A, resultó ser de 4,1. En la Figura 11 se muestra el cromatógrafo HPLc que representa la relación de áreas de pico (%) de cada cadena.
El valor del área del número de fármacos ligados se midió de la misma manera que la operación común B descrita en el Ejemplo 3-1, (iv). La condición de distribución del número de drogas ligadas fue la siguiente: D0: 2,2%, D2: 18,1%, D4-1: 51,0%, D6: 20.6%, y D8: 7.6% (Figura 12).
(v) Resultados
El número medio de fármacos unidos en la composición de ADC de anticuerpo humanizado anti-CD98 producida por el procedimiento convencional (Ejemplo 5-1) fue de 4,0, y el contenido de D4-1 en la misma fue del 27,8%. Por otra parte, el número medio de fármacos unidos en la composición de ADC de anticuerpo humanizado anti-CD98 producida por el procedimiento de la presente invención (Ejemplo 5-2) fue de 4,1, y el contenido de D4-1 en la misma fue del 51,0%.
(Ejemplo 6) Producción de composición ADC humanizada de anticuerpo anti-B7-H3
(Ejemplo 6-1) Producción de una composición de ADC de anticuerpo humanizado anti-B7-H3 (M30-H1-L4) de acuerdo con el procedimiento convencional
(i) Reducción de anticuerpos
Un anticuerpo humanizado anti-B7-H3 (M30-H1-L4) (producido de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo de referencia 1 del documento WO2014/057687, 12,4 mL: correspondiente a 250 mg, concentración: 20.1 mg/mL; tampón citrato 25 mM) en un recipiente de reacción de vidrio, al que se añadió además un tampón histidina 25 mM (18 mL, pH 7,5). A la presente solución de reacción, se añadió una solución acuosa de EDTA 0,5 M (CALBIOCHEM; 0,018 mL; 5 equivalentes en base al anticuerpo) y, a continuación, se añadió una solución acuosa de polisorbato 80 de 0,1 g/mL (NOF CORPORATION) (0,013 mL; 0,01% en base al anticuerpo). A continuación, se añadió a la mezcla de reacción una solución acuosa de hidrogenofosfato disódico 0,3 M, de forma que la mezcla se ajustó a pH 7,02. Bajo agitación a 35°C, se añadió a la mezcla de reacción una solución acuosa de clorhidrato de tris(2-carboxietil)fosfina de 1,00 mg/mL (Nacalai Tesque, Inc.) (1,05 mL; 2,15 equivalentes por molécula de anticuerpo simple), y la mezcla obtenida se calentó durante 2 horas para dar lugar a una temperatura interna de 35°C a 36°C, de forma que se redujeran los disulfuros entre cadenas del anticuerpo.
(ii) Conjugación del anticuerpo con el enlace intermedio del fármaco
La solución obtenida en lo anterior (i) se enfrió, y una solución acuosa de acetona al 50% de 6,22 mg/mL (1,36 mL; 4,8 equivalentes por molécula de anticuerpo único) del compuesto obtenido en el Ejemplo 2 se añadió entonces a la solución de reacción a una temperatura interna de 15°C a 16°C bajo agitación durante 4 minutos. La mezcla obtenida se agitó a la misma temperatura que la descrita anteriormente durante 20 minutos, de forma que se permitió que el intermediario enlazador del fármaco se uniera al anticuerpo. Posteriormente, se añadió a la mezcla de reacción una solución acuosa de N-acetilcisteína 50 mM (Kishida Chemical Co., Ltd.) (0,102 mL; 3 equivalentes por cada molécula de anticuerpo), y la mezcla obtenida de este modo se agitó de nuevo a la misma temperatura descrita anteriormente durante 20 minutos. La reacción del fármaco enlazador intermedio se dio por terminada, y el pH de la mezcla de reacción se ajustó entonces a pH 5,0 mediante el uso de una solución acuosa de ácido acético al 10%.
(iii) Depuración
Mediante el uso de Pellicon XL (Millipore Japón, 50 cm2), se hizo circular la solución obtenida en el punto (ii) anterior, mientras se añadía a la misma un tampón de histidina 10 mM (pH 5,0) mediante el uso de una bomba de rodillo, y se llevó a cabo una operación de lavado hasta que la cantidad de agua descargada llegó a 300 mL, de forma que se eliminaron las sustancias de bajo peso molecular. A continuación, la solución restante se concentró para obtener 13,1 mL de una solución que contenía una composición de ADC de anticuerpo humanizado anti-B7-H3 (M30-H1-L4).
(iv) Evaluación de las propiedades
El número medio de fármacos unidos se midió de la misma manera que la operación común A descrita en el Ejemplo 3-1, (iv) . En el caso del anticuerpo humanizado anti-B7-H3 (M30-H1-L4), en base a su secuencia de aminoácidos, se utilizó el número 30160 como valor estimado para el coeficiente de absorción molar de la cadena ligera, y el número 87250 como valor estimado para el coeficiente de absorción molar de la cadena pesada.
La concentración del anticuerpo resultó ser de 18,4 mg/mL, el rendimiento del anticuerpo resultó ser de 241 mg (94%), y el número medio de fármacos unidos (n) por molécula de anticuerpo única, que se midió por medio de la operación común A, resultó ser de 3,8. En la Figura 15 se muestra el cromatógrafo HPLC que representa la relación de áreas de pico (%) de cada cadena.
El valor del área del número de fármacos ligados se midió de la misma manera que la operación común B descrita en el Ejemplo 3-1, (iv). La condición de distribución del número de drogas ligadas fue la siguiente: D0: 6,5%, D2: 30,5%, D4-1: 27,9%, D4-2: 12,3%, D6: 17,7%, y D8: 4,9% (Figura 16).
(Ejemplo 6-2) Producción de composición ADC humanizada de anticuerpo anti-B7-H3 (M30-H1-L4) de acuerdo con el procedimiento de la presente invención
(i) Reducción de anticuerpos
Un anticuerpo humanizado anti-B7-H3 (M30-H1-L4) (producido de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo de referencia 1 del documento WO2014/057687, 27,1 mL: correspondiente a 500 mg, concentración: 18,5 mg/mL; tampón de 10 mM de histidina) en un recipiente de reacción de vidrio, al que se añadió una solución acuosa de 10 mM de histidina (25 mL). A la presente solución de reacción, se añadieron sacarosa (MERCK; 1,25 g) y una solución acuosa de EDTA 0,5 M (CALBIOCHEM; 0,041 mL; 6 equivalentes en base al anticuerpo) y, a continuación, se añadió una solución acuosa de polisorbato 80 (NOF CORPORATION) de 0,1 g/mL (0,050 mL; 0,01% en base al anticuerpo). A continuación, se añadió a la mezcla de reacción una solución acuosa de hidrogenofosfato disódico 0,3 M, de forma que la mezcla se ajustó a pH 7,08. La solución de reacción se enfrió, y bajo agitación a una temperatura interna de 0°C a 1°C, se añadió a la mezcla de reacción una solución acuosa de clorhidrato de tris(2-carboxietil)fosfina (Nacalai Tesque, Inc.) de 1,00 mg/mL (2,08 mL; 2,13 equivalentes por molécula de anticuerpo simple), y la mezcla obtenida se agitó durante 5,5 horas para dar lugar a una temperatura interna de 0°C a 1°C, de forma que se redujeran los disulfuros entre cadenas del anticuerpo.
(ii) Conjugación del anticuerpo con el enlace intermedio del fármaco
Se añadió una solución acuosa de acetona al 50% de 6,04 mg/mL (2,82 mL; 4,8 equivalentes por molécula de anticuerpo única) del compuesto obtenido en el Ejemplo 2 a la solución obtenida en el inciso (i) anterior a una temperatura interna de 0°C a 1°C bajo agitación durante 20 minutos. La mezcla obtenida se agitó a la misma temperatura que la descrita anteriormente durante 20 minutos, de forma que se permitió que el intermediario enlazador del fármaco se uniera al anticuerpo. Posteriormente, se añadió a la mezcla de reacción una solución acuosa de N-acetilcisteína 50 mM (Kishida Chemical Co., Ltd.) (0,205 mL; 3 equivalentes por cada molécula de anticuerpo), y la mezcla obtenida de este modo se agitó de nuevo a la misma temperatura descrita anteriormente durante 20 minutos. La reacción del fármaco enlazador intermedio se dio por terminada, y el pH de la mezcla de reacción se ajustó entonces a pH 5,0 mediante el uso de una solución acuosa de ácido acético al 10%.
(Mi) Depuración
Mediante el uso de Pellicon XL (Millipore Japón, 50 cm2), se hizo circular la solución obtenida en el punto (ii) anterior, mientras se añadía a la misma un tampón de histidina 10 mM (pH 5,0) mediante el uso de una bomba de rodillo, y se llevó a cabo una operación de lavado hasta que la cantidad de agua descargada llegó a 800 mL, de forma que se eliminaron las sustancias de bajo peso molecular. A continuación, la solución restante se concentró para obtener 23,6 mL de una solución que contenía una composición de ADC de anticuerpo humanizado anti-B7-H3 (M30-H1-L4).
(iv) Evaluación de las propiedades
El número medio de fármacos unidos se midió de la misma manera que la operación común A descrita en el Ejemplo 3-1, (iv). En el caso del anticuerpo humanizado anti-B7-H3 (M30-H1-L4), en base a su secuencia de aminoácidos, se utilizó el número 30160 como valor estimado para el coeficiente de absorción molar de la cadena ligera, y el número 87250 como valor estimado para el coeficiente de absorción molar de la cadena pesada.
La concentración del anticuerpo resultó ser de 19,4 mg/mL, el rendimiento del anticuerpo resultó ser de 455 mg (89%), y el número medio de fármacos unidos (n) por molécula de anticuerpo única, que se midió por medio de la operación común A, resultó ser de 4,1. En la Figura 17 se muestra el cromatógrafo HPLC que representa la relación de áreas de pico (%) de cada cadena.
El valor del área del número de fármacos ligados se midió de la misma manera que la operación común B descrita en el Ejemplo 3-1, (iv). La condición de distribución del número de drogas ligadas fue la siguiente: D0: 2,7%, D2: 22,3%, D4-1: 58,4%, D6: 14,1%, y D8: 2,4% (Figura 18).
(v) Resultados
El número medio de fármacos unidos en la composición de ADC de anticuerpo humanizado anti-B7-H3 producida por el procedimiento convencional (Ejemplo 6-1) fue de 3,8, y el contenido de D4-1 en la misma fue del 27,9%. Por otra parte, el número medio de fármacos unidos en la composición de ADC de anticuerpo humanizado anti-B7-H3 producida por el procedimiento de la presente invención (Ejemplo 6-2) fue de 4,1, y el contenido de D4-1 en la misma fue del 58,4%.
(Ejemplo 7) Producción de composición ADC humanizada de anticuerpo anti-HER2
(Ejemplo 7-1) Producción de una composición de ADC de anticuerpo anti-HER2 humanizado de acuerdo con el procedimiento convencional
(i) Reducción de anticuerpos
Un anticuerpo humanizado anti-HER2 (trastuzumab; Patente de EE.UU. n° 5821337) (22,3 mL: correspondiente a 500 mg, concentración: 22.4 mg/mL; tampón de 25 mM de histidina) se colocó en un recipiente de reacción de vidrio, al que se añadió además un tampón de 25 mM de histidina (27 mL, pH 5,0). A la presente solución de reacción, se añadió una solución acuosa de EDTA 0,5 M (0,034 mL; 5 equivalentes en base al anticuerpo) y, a continuación, una solución acuosa de polisorbato 20 de 0,1 g/mL (0,050 mL; 0,01% en base al anticuerpo). A continuación, se añadió a la mezcla de reacción una solución acuosa de hidrogenofosfato disódico 0,3 M, de forma que la mezcla se ajustó a pH 7,12. Bajo agitación a 22°C, se añadió a la mezcla de reacción una solución acuosa de clorhidrato de tris(2-carboxietil)fosfina de 1,00 mg/mL (2,12 mL; 2,15 equivalentes por molécula de anticuerpo simple), y la mezcla obtenida se agitó durante 3 horas para dar lugar a una temperatura interna de 22°C a 25°C, de forma que se redujeran los disulfuros entre cadenas del anticuerpo.
(ii) Conjugación del anticuerpo con el enlace intermedio del fármaco
La solución obtenida en lo anterior (i) se enfrió, y una solución acuosa de acetona al 50% de 6,15 mg/mL (2,77 mL; 4,8 equivalentes por molécula de anticuerpo único) del compuesto obtenido en el Ejemplo 2 se añadió entonces a la solución de reacción a una temperatura interna de 11°C a 13°C bajo agitación durante 20 minutos. La mezcla obtenida se agitó a la misma temperatura que la descrita anteriormente durante 20 minutos, de forma que se permitió que el intermediario enlazador del fármaco se uniera al anticuerpo. Posteriormente, se añadió a la mezcla de reacción una solución acuosa de N-acetilcisteína 50 mM (0,206 mL; 3 equivalentes por cada molécula de anticuerpo), y la mezcla obtenida de este modo se agitó de nuevo a la misma temperatura descrita anteriormente durante 20 minutos. La reacción del fármaco enlazador intermedio se dio por terminada, y el pH de la mezcla de reacción se ajustó entonces a pH 5,0 mediante el uso de una solución acuosa de ácido acético al 10%.
(Mi) Depuración
Mediante el uso de Pellicon XL (Millipore Japón, 50 cm2), se hizo circular la solución obtenida en el punto (ii) anterior, mientras se añadía a la misma un tampón de histidina 10 mM (pH 5,0) mediante el uso de una bomba de rodillo, y se llevó a cabo una operación de lavado hasta que la cantidad de agua descargada llegó a 600 mL, de forma que se eliminaron las sustancias de bajo peso molecular. A continuación, la solución restante se concentró para obtener 22,7 mL de una solución que contenía una composición de ADC de anticuerpo anti-HER2 humanizado.
(iv) Evaluación de las propiedades
El número medio de fármacos unidos se midió de la misma manera que la operación común A descrita en el Ejemplo 3-1, (iv). En el caso del anticuerpo humanizado anti-HER2 (trastuzumab), en base a su secuencia de aminoácidos, se utilizó el número 26150 como valor estimado para el coeficiente de absorción molar de la cadena ligera, y el número 81290 como valor estimado para el coeficiente de absorción molar de la cadena pesada.
La concentración del anticuerpo resultó ser de 20,39 mg/mL, el rendimiento del anticuerpo resultó ser de 462 mg (90%), y el número medio de fármacos unidos (n) por molécula de anticuerpo individual, que se midió por medio de la operación común A, resultó ser de 3,9. En la Figura 21 se muestra el cromatógrafo HPLC que representa la relación de áreas de pico (%) de cada cadena.
El valor del área del número de fármacos ligados se midió de la misma manera que la operación común B descrita en el Ejemplo 3-1, (iv). La condición de distribución del número de drogas ligadas fue la siguiente: D0: 3,6%, D2: 26,1%, D4-1: 34,1%, D4-2: 13,6%, D6: 17,6%, y D8: 5,0% (Figura 22).
(Ejemplo 7-2) Producción de composición de ADC de anticuerpo anti-HER2 humanizado de acuerdo con el procedimiento de la presente invención
(i) Reducción de anticuerpos
Un anticuerpo humanizado anti-HER2 (trastuzumab; Patente de EE.UU. N° 5821337) (22,3 mL: correspondiente a 500 mg, concentración: 22,4 mg/mL; tampón de 25 mM de histidina) se colocó en un recipiente de reacción de vidrio, al que se añadió además un tampón de 25 mM de histidina (25 mL, pH 5,0). A la presente solución de reacción, se añadió una solución acuosa de EDTA 0,5 M (0,034 mL; 5 equivalentes en base al anticuerpo) y, a continuación, una solución acuosa de polisorbato 20 de 0,1 g/mL (0,050 mL; 0,01% en base al anticuerpo). A continuación, se añadió a la mezcla de reacción una solución acuosa de hidrogenofosfato disódico 0,3 M, de forma que la mezcla se ajustó a pH 7,13, y después se enfrió la mezcla. Bajo agitación, se añadió a la mezcla de reacción una solución acuosa de clorhidrato de tris(2-carboxietil)fosfina de 1,00 mg/mL (2,37 mL; 2,40 equivalentes por molécula única de anticuerpo) a una temperatura interna de 0°C a 1°C, y la mezcla obtenida se agitó a continuación a una temperatura interna de 0°C a 1°C durante 6 horas, de forma que se redujeran los disulfuros entre cadenas del anticuerpo.
(ii) Conjugación del anticuerpo con el enlace intermedio del fármaco
Se añadió una solución acuosa de acetona al 50% de 6,14 mg/mL (2,84 mL; 4,9 equivalentes por molécula de anticuerpo única) del compuesto obtenido en el Ejemplo 2 a la solución obtenida en el inciso (i) anterior a una temperatura interna de 0°C a 2°C bajo agitación durante 10 minutos. La mezcla obtenida se agitó a la misma temperatura que la descrita anteriormente durante 40 minutos, de forma que se permitió que el intermediario enlazador del fármaco se uniera al anticuerpo. Posteriormente, se añadió a la mezcla de reacción una solución acuosa de N-acetilcisteína 50 mM (0,206 mL; 3 equivalentes por cada molécula de anticuerpo), y la mezcla obtenida de este modo se agitó de nuevo a la misma temperatura descrita anteriormente durante 50 minutos. La reacción del fármaco enlazador intermedio se dio por terminada, y el pH de la mezcla de reacción se ajustó entonces a pH 5,0 mediante el uso de una solución acuosa de ácido acético al 10%.
(iii) Depuración
Mediante el uso de Pellicon XL (Millipore Japón, 50 cm2), se hizo circular la solución obtenida en el punto (ii) anterior, mientras se añadía a la misma un tampón de histidina 10 mM (pH 5,0) mediante el uso de una bomba de rodillo, y se llevó a cabo una operación de lavado hasta que la cantidad de agua descargada llegó a 600 mL, de forma que se eliminaron las sustancias de bajo peso molecular. A continuación, la solución restante se concentró para obtener 21,7 mL de una solución que contenía una composición de ADC de anticuerpo anti-HER2 humanizado.
(iv) Evaluación de las propiedades
El número medio de fármacos unidos se midió de la misma manera que la operación común A descrita en el Ejemplo 3-1, (iv). En el caso del anticuerpo humanizado anti-HER2 (trastuzumab), en base a su secuencia de aminoácidos, se utilizó el número 26150 como valor estimado para el coeficiente de absorción molar de la cadena ligera, y el número 81290 como valor estimado para el coeficiente de absorción molar de la cadena pesada.
La concentración del anticuerpo resultó ser de 21,2 mg/mL, el rendimiento del anticuerpo resultó ser de 459 mg (89%), y el número medio de fármacos unidos (n) por molécula de anticuerpo única, que se midió por medio de la operación común A, resultó ser de 4,0. En la Figura 23 se muestra el cromatógrafo HPLC que representa la relación de áreas de pico (%) de cada cadena.
El valor del área del número de fármacos ligados se midió de la misma manera que la operación común B descrita en el Ejemplo 3-1, (iv). La condición de distribución del número de drogas ligadas fue la siguiente: D0: 2,8%, D2: 23,8%, D4-1: 55,2%, D6: 15,0%, y D8: 3.3%
(Figura 24).
(v) Resultados
El número medio de fármacos unidos en la composición de ADC de anticuerpo humanizado anti-HER2 producida por el procedimiento convencional (Ejemplo 7-1) fue de 3,9, y el contenido de D4-1 en la misma fue del 34,1%. Por otra parte, el número medio de fármacos unidos en la composición de ADC de anticuerpo humanizado anti-HER2 producida por el procedimiento de la presente invención (Ejemplo 7-2) fue de 4,0, y el contenido de D4-1 en la misma fue del 55,2%.
(Ejemplo de prueba 1) Eficacia terapéutica de la composición de conjugado anticuerpo-fármaco
Ratones: ratones hembra BALB/c-nu/nu de 5 a 6 semanas de edad (Charles River Laboratories International, Inc.) fueron aclimatados en condiciones SPF durante 4 a 7 días, antes de su utilización para los experimentos. Los ratones fueron alimentados con un pienso sólido esterilizado (FR-2, Funabashi Farms Co., Ltd) y agua del grifo esterilizada (preparada al añadir una solución de hipoclorito de sodio de 5-15 ppm al agua del grifo).
Expresión de medida y cálculo: El eje mayor y el eje menor de un tumor se midieron dos o más veces por semana, mediante el uso de calibradores digitales electrónicos (CD-15C, Mitutoyo Corp.), y a continuación se calculó el volumen (mm3) del tumor. La expresión de cálculo aplicada es la siguiente.
Volumen tumoral (mm3) = 1/2 x eje mayor (mm) x [eje menor (mm)]2
Se suspendió en una solución salina normal una línea celular de adenocarcinoma pancreático humano CFPAC-1 (4 x 106 células), adquirida a ATCC. A continuación, la solución obtenida se implantó por vía subcutánea en las hembras de ratón BALB/c-nu/nu (Día 0), y los ratones se dividieron aleatoriamente en grupos el Día 11. Después de completar el agrupamiento, la composición de ADC de anticuerpo humanizado anti-TRoP2 producida de acuerdo con el procedimiento convencional (Ejemplo 3-1) y la composición de ADC de anticuerpo humanizado anti-TROP2 producida de acuerdo con el procedimiento de la presente invención (Ejemplo 3-2) se administraron cada una a los ratones, vía vena caudal, a una dosis de 0,3 mg/kg, 1 mg/kg, o 3 mg/kg. Todas las composiciones de conjugado anticuerpo-fármaco se diluyeron con solución salina tamponada con acetato (pH 5,5) (Nacalai Tesque, Inc.) y, a continuación, la solución obtenida se administró en una cantidad líquida de 10 mL/kg a cada ratón. Se determinó la eficacia terapéutica, mediante el uso de indicador la dosis mínima capaz de provocar la regresión del volumen tumoral (dosis de regresión). La dosis de regresión de la composición de ADC de anticuerpo humanizado anti-TROP2 producida por el procedimiento convencional fue de 1 mg/kg, mientras que la dosis de regresión de la composición de a Dc de anticuerpo humanizado anti-TROP2 producida por el procedimiento de la presente invención también fue de 1 mg/kg (Figura 19). De este modo, se demostró que la composición de conjugado anticuerpo-fármaco producida por el procedimiento de producción de la presente invención tiene una eficacia terapéutica equivalente a la de la composición de conjugado anticuerpo-fármaco producida por el procedimiento de producción convencional.
(Ejemplo de prueba 2) Seguridad de la composición del conjugado anticuerpo-fármaco
La composición de ADC de anticuerpo humanizado anti-TROP2 producida de acuerdo con el procedimiento convencional (Ejemplo 3-1) y la composición de ADC de anticuerpo humanizado anti-TROP2 producida de acuerdo con el procedimiento de la presente invención (Ejemplo 3-2) se administraron cada una a monos cynomolgus de especies cruzadas a intervalos de una vez cada tres semanas, un total de tres veces. Se observó a los monos hasta el día siguiente a la administración final, y se analizó la dosis máxima que no proporcionó toxicidad grave (HNSTD). Como resultado, la HNSTD de la composición de ADC de anticuerpo humanizado anti-TROP2 producida por el procedimiento convencional fue de 10 mg/kg, mientras que la HNSTd de la composición de ADC de anticuerpo humanizado anti-TROP2 producida por el procedimiento de la presente invención fue de 30 mg/kg. Por lo tanto, se demostró que la composición conjugada anticuerpo-fármaco producida por el procedimiento de producción de la presente invención tiene una seguridad más excelente que la de la composición conjugada anticuerpo-fármaco producida por el procedimiento de producción convencional.
(Consideración 1)
A partir de los resultados de los Ejemplos 3, 4, 6 y 7, el número medio de fármacos unidos en la composición de conjugado anticuerpo-fármaco producida por el procedimiento de producción convencional, y el número medio de fármacos unidos en la composición de conjugado anticuerpo-fármaco producida por el procedimiento de producción de la presente invención, resultaron ser ambos de 3,5 a 4,5. Por otra parte, el contenido de conjugados anticuerpofármaco en los que cuatro enlazadores del fármaco están unidos a tioles intercadena pesados-ligeros, en la composición de conjugado anticuerpo-fármaco producida por el procedimiento de producción convencional fue del 35% o menos, mientras que el mismo contenido descrito anteriormente en la composición de conjugado anticuerpofármaco producida por el procedimiento de producción de la presente invención fue del 50% o más. Como tal, se demostró que una composición de conjugado anticuerpo-fármaco en la que el número medio de fármacos unidos es de 3,5 a 4,5, y el contenido de conjugados anticuerpo-fármaco en los que cuatro enlazadores de fármacos están unidos a tioles de intercadena pesada-luz es del 50% o más, se puede producir selectivamente mediante el uso del procedimiento de producción de la presente invención.
(Consideración 2)
A partir de los resultados del Ejemplo de Prueba 2, se demostró que la composición de conjugado anticuerpo-fármaco producida por el procedimiento de producción de la presente invención tiene una seguridad que es más excelente que la de la composición de conjugado anticuerpo-fármaco producida por el procedimiento de producción convencional.
A partir de los resultados anteriormente mencionados, se demostró que la composición de conjugado anticuerpofármaco (una composición de conjugado anticuerpo-fármaco en la que el número medio de fármacos unidos es de 3,5 a 4,5....5, y el contenido de conjugados anticuerpo-fármaco en los que cuatro enlazadores de fármaco están unidos a tioles de cadena intermedia pesados-ligeros es del 50% o más) tiene una seguridad más excelente que la de la composición de conjugado anticuerpo-fármaco producida por el procedimiento de producción convencional (una composición de conjugado anticuerpo-fármaco en la que el número medio de fármacos unidos es de 3,5 a 4,5, y el contenido de conjugados anticuerpo-fármaco en los que cuatro enlazadores de fármaco están unidos a tioles de cadena intermedia pesados-ligeros es del 35% o menos).
Lista de secuencias Texto libre
SEC ID NO: 1: Secuencia de nucleótidos de la cadena pesada del anticuerpo humanizado anti-TROP2 (hTINA1-H1)
SEC ID NO: 2: Secuencia de aminoácidos de la cadena pesada del anticuerpo humanizado anti-TROP2 (hTINA1-H1)
SEC ID NO: 3: Secuencia de nucleótidos de la cadena ligera del anticuerpo humanizado anti-TROP2 (hTINA1-L1) SEC ID NO: 4: Secuencia de aminoácidos de la cadena ligera del anticuerpo humanizado anti-TROP2 (hTINA1-L1)
SEC ID NO: 5: La secuencia de aminoácidos del anticuerpo anti-TROP2 (TINA1) CDRH1
SEC ID NO: 6: La secuencia de aminoácidos del anticuerpo anti-TROP2 (TINA1) CDRH2
SEC ID NO: 7: La secuencia de aminoácidos del anticuerpo anti-TROP2 (TINA1) CDRH3
SEC ID NO: 8: La secuencia de aminoácidos del anticuerpo anti-TROP2 (TINA1) CDRL1
SEC ID NO: 9: La secuencia de aminoácidos del anticuerpo anti-TROP2 (TINA1) CDRL2
SEC ID NO: 10: La secuencia de aminoácidos del anticuerpo anti-TROP2 (TINA1) CDRL3
SEC ID NO: 11: Secuencia de nucleótidos de la cadena pesada del anticuerpo humanizado anti-CD98 (hM23-H1) SEC ID NO: 12: Secuencia de aminoácidos de la cadena pesada del anticuerpo humanizado anti-CD98 (hM23-H1)
SEC ID NO: 13: Secuencia de nucleótidos de la cadena ligera del anticuerpo humanizado anti-CD98 (hM23-L1) SEC ID NO: 14: Secuencia de aminoácidos de la cadena ligera del anticuerpo humanizado anti-CD98 (hM23-L1) SEC ID NO: 15: La secuencia de aminoácidos del anticuerpo anti-CD98 (m 23) CDRH1
SEC ID NO: 16: La secuencia de aminoácidos del anticuerpo anti-CD98 (M23) CDRH2
SEC ID NO: 17: La secuencia de aminoácidos del anticuerpo anti-CD98 (M23) CDRH3
SEC ID NO: 18: La secuencia de aminoácidos del anticuerpo anti-CD98 (M23) CDRL1
SEC ID NO: 19: La secuencia de aminoácidos del anticuerpo anti-CD98 (M23) CDRL2
SEC ID NO: 20: La secuencia de aminoácidos del anticuerpo anti-CD98 (M23) CDRL3
SEC ID NO: 21: La secuencia de nucleótidos del cebador EG-Inf-F
SEC ID NO: 22: La secuencia de nucleótidos del cebador EG1-Inf-R
SEC ID NO: 23: La secuencia de nucleótidos del cebador CM-LKF
SEC ID NO: 24: La secuencia de nucleótidos del cebador KCL-Inf-R
SEC ID NO: 25: Secuencia de aminoácidos de la cadena pesada del anticuerpo humanizado anti-B7-H3 (M30-H1) SEC ID NO: 26: Secuencia de aminoácidos de la cadena ligera del anticuerpo humanizado anti-B7-H3 (M30-L4) SEC ID NO: 27: La secuencia de aminoácidos del anticuerpo anti-B7-H3 (M30) CDRH1
SEC ID NO: 28: La secuencia de aminoácidos del anticuerpo anti-B7-H3 (M30) CDRH2
SEC ID NO: 29: La secuencia de aminoácidos del anticuerpo anti-B7-H3 (M30) CDRH3
SEC ID NO La secuencia de aminoácidos del anticuerpo anti-B7-H3 (M30) CDRL1 SEC ID NO 31 La secuencia de aminoácidos del anticuerpo anti-B7-H3 (M30) CDRL2
SEC ID NO 32 La secuencia de aminoácidos del anticuerpo anti-B7-H3 (M30) CDRL3
SEC ID NO 33 La secuencia de aminoácidos de la cadena pesada del anticuerpo humanizado anti-HER2 SEC ID NO 34 La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera del anticuerpo humanizado anti-HER2

Claims (16)

REIVINDICACIONES
1. Un procedimiento para producir una composición conjugada anticuerpo-fármaco, que comprende:
(i) una etapa de reacción de un anticuerpo con un agente reductor en un tampón para reducir los disulfuros entre cadenas; y
(ii) una etapa de reacción de los productos intermedios del enlazador del fármaco con el anticuerpo que tiene grupos tiol obtenidos en la etapa (i), en la que
el anticuerpo tiene isotipo IgG1,
el agente reductor es tris(2-carboxietil)fosfina o una sal del mismo,
el agente reductor se utiliza en una cantidad de 2 a 3 equivalentes molares por molécula de anticuerpo, el tampón comprende un agente quelante, y el agente quelante es ácido etilendiaminotetraacético, el tiempo de reacción en la etapa (i) es de 5 a 10 horas,
la temperatura de reacción en la etapa (i) es de 0°C a 1°C,
el enlace intermedio del fármaco es
Figure imgf000036_0001
en el que -GGFG- representa un residuo tetrapéptido formado por glicina-glicina-fenilalanina-glicina, y el número medio de fármacos unidos en la composición de conjugado anticuerpo-fármaco producida es de 3,5 a 4,5, y el contenido de los conjugados anticuerpo-fármaco en los que cuatro enlazadores de fármacos están unidos a tioles de intercadena pesada-ligera, en la composición de conjugado anticuerpo-fármaco producida es del 50% o más.
2. El procedimiento de producción de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el número medio de fármacos unidos en la composición de conjugado anticuerpo-fármaco producida es de 4,0 a 4,1.
3. El procedimiento de producción de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que la sal de tris(2-carboxietil)fosfina es clorhidrato de tris(2-carboxietil)fosfina.
4. El procedimiento de producción de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el tampón es un tampón de histidina.
5. El procedimiento de producción de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el anticuerpo es un anticuerpo anti-TROP2, un anticuerpo anti-CD98, un anticuerpo anti-B7-H3, o un anticuerpo anti-HER2.
6. El procedimiento de producción de acuerdo con la reivindicación 5, en el que el anticuerpo es un anticuerpo anti-TROP2.
7. El procedimiento de producción de acuerdo con la reivindicación 6, en el que el anticuerpo anti-TROP2 conserva CDRH1 consistente en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID NO: 5 (TAGMQ), CDRH2 consistente en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID NO: 6 (WINTHSGVPKYAe Df KG), CDRH3 consistente en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID NO: 7 (SGFGSSYWYFDV), CDRL1 consistente en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID NO: 8 (KASQDVSTAVA), CDRL2 consistente en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID NO: 9 (SASYRYT), y CDRL3 consistente en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID NO: 10 (QQHYITPLT).
8. El procedimiento de producción de acuerdo con la reivindicación 6, en el que el anticuerpo anti-TROP2 consiste en una cadena pesada que consiste en una secuencia de aminoácidos que consiste en residuos de aminoácidos en las posiciones 20 a 470 de SEC ID NO: 2, y una cadena ligera consistente en una secuencia de aminoácidos consistente en residuos de aminoácidos en las posiciones 21 a 234 de SEC ID NO: 4.
9. El procedimiento de producción de acuerdo con la reivindicación 8, en el que se elimina el residuo de lisina en el extremo carboxilo de la cadena pesada del anticuerpo anti-TROP2.
10. El procedimiento de producción de acuerdo con la reivindicación 5, en el que el anticuerpo es un anticuerpo anti-B7-H3.
11. El procedimiento de producción de acuerdo con la reivindicación 10, en el que el anticuerpo anti-B7-H3 conserva CDRH1 consistente en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID NO: 27 (NYVMH), CDRH2 consistente en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID NO: 28 (YINPYNDDVKYNe Kf KG), CDRH3 consistente en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID NO: 29 (WGYYGSPLYYFDY), CDRL1 consistente en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID NO: 30 (RASSRLIYMH), CDRL2 consistente en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID NO: 31 (ATSNLAS), y CDRL3 consistente en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID NO: 32 (QQWNSNPPT).
12. El procedimiento de producción de acuerdo con la reivindicación 10, en el que el anticuerpo anti-B7-H3 consiste en una cadena pesada que consiste en una secuencia de aminoácidos que consiste en residuos de aminoácidos en las posiciones 20 a 471 de SEC ID NO: 25, y una cadena ligera consistente en una secuencia de aminoácidos consistente en residuos de aminoácidos en las posiciones 21 a 233 de SEC ID NO: 26.
13. El procedimiento de producción de acuerdo con la reivindicación 12, en el que se elimina el residuo de lisina en el extremo carboxilo de la cadena pesada del anticuerpo anti-B7-H3.
14. El procedimiento de producción de acuerdo con la reivindicación 5, en el que el anticuerpo es un anticuerpo anti-HER2.
15. El procedimiento de producción de acuerdo con la reivindicación 14, en el que el anticuerpo anti-HER2 consiste en una cadena pesada que consiste en una secuencia de aminoácidos que consiste en residuos de aminoácidos en las posiciones 1 a 449 de SEC ID NO: 33, y una cadena ligera consistente en una secuencia de aminoácidos consistente en residuos de aminoácidos en las posiciones 1 a 214 de SEC ID NO: 34.
16. El procedimiento de producción de acuerdo con la reivindicación 14, en el que el anticuerpo anti-HER2 consiste en una cadena pesada formada por una secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID NO: 33, y una cadena ligera consistente en una secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID NO: 34.
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Families Citing this family (54)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TW201909926A (zh) * 2017-08-04 2019-03-16 大陸商江蘇恆瑞醫藥股份有限公司 Ｂ７ｈ３抗體－藥物偶聯物及其醫藥用途
CA3073383C (en) * 2017-08-23 2023-10-31 Daiichi Sankyo Company, Limited Antibody-drug conjugate preparation and lyophilization for same
EP3677589A4 (en) * 2017-08-31 2021-04-21 Daiichi Sankyo Company, Limited IMPROVED PROCESS FOR PREPARING ANTIBODY-ACTIVE CONJUGATE
SG11202011243XA (en) * 2018-05-28 2020-12-30 Daiichi Sankyo Co Ltd Treatment of her2-mutated cancer by administering anti-her2 antibody-drug conjugate
BR112021001194A2 (pt) 2018-07-25 2021-04-27 Daiichi Sankyo Company, Limited métodos para produzir um conjugado anticorpo-fármaco e para produzir uma composição farmacêutica
JP7406488B2 (ja) 2018-07-27 2023-12-27 第一三共株式会社 抗体－薬物コンジュゲートの薬物部位を認識する蛋白質
KR20210042120A (ko) * 2018-08-06 2021-04-16 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 항체-약물 콘주게이트와 튜불린 저해제의 조합
JPWO2020040245A1 (ja) 2018-08-23 2021-09-02 第一三共株式会社 抗体薬物複合体の感受性マーカー
CA3111397A1 (en) * 2018-09-06 2020-03-12 Daiichi Sankyo Company, Limited Novel cyclic dinucleotide derivative and antibody-drug conjugate thereof
CA3122946A1 (en) 2018-12-11 2020-06-18 Daiichi Sankyo Company, Limited Combination of antibody-drug conjugate with parp inhibitor
CA3124330A1 (en) 2018-12-21 2020-06-25 Daiichi Sankyo Company, Limited Combination of antibody-drug conjugate and kinase inhibitor
KR20210125034A (ko) * 2019-02-15 2021-10-15 우시 바이올로직스 아일랜드 리미티드 동질성이 개선된 항체-약물 콘쥬게이트의 제조방법
KR20210143237A (ko) * 2019-03-25 2021-11-26 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 항체-피롤로벤조디아제핀 유도체 컨쥬게이트
PL3946464T3 (pl) 2019-03-29 2022-12-19 Medimmune Limited Związki i ich koniugaty
CN113939318A (zh) 2019-05-29 2022-01-14 第一三共株式会社 抗体-药物缀合物的制剂
US20220411436A1 (en) * 2019-09-18 2022-12-29 Sichuan Baili Pharmaceutical Co., Ltd Camptothecin derivative and conjugate thereof
AU2021298251A1 (en) 2020-06-24 2023-02-02 Astrazeneca Uk Limited Combination of antibody-drug conjugate and ATR inhibitor
WO2021260582A1 (en) 2020-06-24 2021-12-30 Astrazeneca Uk Limited Combination of antibody-drug conjugate and aurora b inhibitor
US20230233540A1 (en) 2020-06-24 2023-07-27 Astrazeneca Uk Limited Combination of antibody-drug conjugate and cdk9 inhibitor
US20230256110A1 (en) 2020-06-24 2023-08-17 Astrazeneca Uk Limited Combination of antibody-drug conjugate and atm inhibitor
WO2021260583A1 (en) 2020-06-24 2021-12-30 Astrazeneca Uk Limited Combination of antibody-drug conjugate and dna-pk inhibitor
JPWO2022014698A1 (es) 2020-07-17 2022-01-20
CN116348115A (zh) 2020-10-09 2023-06-27 阿斯利康(英国)有限公司 抗体-药物缀合物和parp1选择性抑制剂的组合
CN116916919A (zh) 2020-11-11 2023-10-20 第一三共株式会社 抗体-药物缀合物与抗SIRPα抗体的组合
US20230398230A1 (en) 2020-11-12 2023-12-14 Daiichi Sankyo Company, Limited Treatment of mesothelioma by administration of anti-b7-h3 antibody-drug conjugate
WO2022099762A1 (zh) * 2020-11-12 2022-05-19 博瑞生物医药（苏州）股份有限公司 一种抗体偶联物中间体及其制备方法
CA3173511A1 (en) 2021-04-29 2023-10-28 Hui Zhang Preparation method and application of antibody drug conjugate
EP4351564A1 (en) 2021-06-11 2024-04-17 Gilead Sciences, Inc. Combination mcl-1 inhibitors with anti-cancer agents
AU2022290855A1 (en) 2021-06-11 2023-12-07 Gilead Sciences, Inc. Combination mcl-1 inhibitors with anti-body drug conjugates
WO2023032994A1 (ja) 2021-08-31 2023-03-09 富士フイルム株式会社 化合物及びこれを用いた標識生体物質
WO2023032996A1 (ja) 2021-08-31 2023-03-09 富士フイルム株式会社 化合物及びこれを用いた標識生体物質
WO2023032995A1 (ja) 2021-08-31 2023-03-09 富士フイルム株式会社 化合物及びこれを用いた標識生体物質
WO2023068226A1 (ja) * 2021-10-18 2023-04-27 第一三共株式会社 抗ｃｄ３７抗体－薬物コンジュゲート
WO2023076983A1 (en) 2021-10-28 2023-05-04 Gilead Sciences, Inc. Pyridizin-3(2h)-one derivatives
WO2023077030A1 (en) 2021-10-29 2023-05-04 Gilead Sciences, Inc. Cd73 compounds
WO2022078524A2 (en) * 2021-11-03 2022-04-21 Hangzhou Dac Biotech Co., Ltd. Specific conjugation of an antibody
TW202329936A (zh) 2021-11-18 2023-08-01 英商阿斯特捷利康英國股份有限公司 抗體-藥物結合物與parp1選擇性抑制劑之組合
WO2023122581A2 (en) 2021-12-22 2023-06-29 Gilead Sciences, Inc. Ikaros zinc finger family degraders and uses thereof
WO2023122615A1 (en) 2021-12-22 2023-06-29 Gilead Sciences, Inc. Ikaros zinc finger family degraders and uses thereof
TW202339805A (zh) 2021-12-28 2023-10-16 英商阿斯特捷利康英國股份有限公司 抗體-藥物結合物及atr抑制劑之組合
WO2023126822A1 (en) 2021-12-28 2023-07-06 Astrazeneca Uk Limited Combination of antibody-drug conjugate and rasg12c inhibitor
TW202340168A (zh) 2022-01-28 2023-10-16 美商基利科學股份有限公司 Ｐａｒｐ７抑制劑
CN114702593B (zh) * 2022-03-11 2023-12-08 苏州思萃免疫技术研究所有限公司 一种抗folr1/vegf的全人双特异性抗体及其筛选方法和应用
WO2023175483A1 (en) 2022-03-16 2023-09-21 Astrazeneca Uk Limited A scoring method for an anti-trop2 antibody‑drug conjugate therapy
EP4245756A1 (en) 2022-03-17 2023-09-20 Gilead Sciences, Inc. Ikaros zinc finger family degraders and uses thereof
WO2023201268A1 (en) 2022-04-13 2023-10-19 Gilead Sciences, Inc. Combination therapy for treating tumor antigen expressing cancers
WO2023205719A1 (en) 2022-04-21 2023-10-26 Gilead Sciences, Inc. Kras g12d modulating compounds
TW202400140A (zh) 2022-04-27 2024-01-01 日商第一三共股份有限公司 抗體-藥物結合物與ezh1及/或ezh2抑制劑之組合
WO2023218378A1 (en) 2022-05-11 2023-11-16 Daiichi Sankyo Company, Limited Combination of an antibody specific for a tumor antigen and a cd47 inhibitor
US20240116928A1 (en) 2022-07-01 2024-04-11 Gilead Sciences, Inc. Cd73 compounds
WO2024018489A1 (en) * 2022-07-22 2024-01-25 Dr. Reddy’S Laboratories Limited Method for selective reduction of disulfide bonds in an immunoglobulin
WO2024023750A1 (en) 2022-07-28 2024-02-01 Astrazeneca Uk Limited Combination of antibody-drug conjugate and bispecific checkpoint inhibitor
WO2024041541A1 (en) * 2022-08-22 2024-02-29 Suzhou Bioreinno Biotechnology Limited Company A novel thiol reductant, method and use thereof
WO2024041545A1 (en) * 2022-08-22 2024-02-29 Suzhou Bioreinno Biotechnology Limited Company A novel thiol reductant, preparation method and use thereof

Family Cites Families (107)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1989006692A1 (en) 1988-01-12 1989-07-27 Genentech, Inc. Method of treating tumor cells by inhibiting growth factor receptor function
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
US5183884A (en) 1989-12-01 1993-02-02 United States Of America Dna segment encoding a gene for a receptor related to the epidermal growth factor receptor
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
ATE185601T1 (de) 1990-07-10 1999-10-15 Cambridge Antibody Tech Verfahren zur herstellung von spezifischen bindungspaargliedern
US5658920A (en) 1991-01-16 1997-08-19 Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd. Substituted 1H,12H-benz-[DE]pyrano[3',4':6,7] indolizino[1,2-B]quinoline-10,13(9H,15H)-dione compound
JP3008226B2 (ja) 1991-01-16 2000-02-14 第一製薬株式会社 六環性化合物
DE122004000008I1 (de) 1991-06-14 2005-06-09 Genentech Inc Humanisierter Heregulin Antikörper.
DK0605522T3 (da) 1991-09-23 2000-01-17 Medical Res Council Fremgangsmåde til fremstilling af humaniserede antistoffer
ATE463573T1 (de) 1991-12-02 2010-04-15 Medimmune Ltd Herstellung von autoantikörpern auf phagenoberflächen ausgehend von antikörpersegmentbibliotheken
CA2131151A1 (en) 1992-03-24 1994-09-30 Kevin S. Johnson Methods for producing members of specific binding pairs
JP3359955B2 (ja) 1992-07-16 2002-12-24 第一製薬株式会社 抗腫瘍剤
US6214345B1 (en) 1993-05-14 2001-04-10 Bristol-Myers Squibb Co. Lysosomal enzyme-cleavable antitumor drug conjugates
GB9313509D0 (en) 1993-06-30 1993-08-11 Medical Res Council Chemisynthetic libraries
WO1995015388A1 (en) 1993-12-03 1995-06-08 Medical Research Council Recombinant binding proteins and peptides
JPH08337584A (ja) 1995-04-10 1996-12-24 Dai Ichi Seiyaku Co Ltd 縮合六環式アミノ化合物、これを含有する医薬及びその製法
US6504029B1 (en) 1995-04-10 2003-01-07 Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd. Condensed-hexacyclic compounds and a process therefor
SG50747A1 (en) 1995-08-02 1998-07-20 Tanabe Seiyaku Co Comptothecin derivatives
CA2192725C (en) 1995-12-28 2004-04-20 Kenji Tsujihara Camptothecin derivatives
JPH1095802A (ja) 1995-12-28 1998-04-14 Tanabe Seiyaku Co Ltd カンプトテシン誘導体
US5968511A (en) 1996-03-27 1999-10-19 Genentech, Inc. ErbB3 antibodies
TW527183B (en) 1996-06-06 2003-04-11 Daiichi Seiyaku Co Drug complex
TW409058B (en) 1996-06-06 2000-10-21 Daiichi Seiyaku Co Method for preparation of a drug complex
JPH1192405A (ja) 1997-09-19 1999-04-06 Dai Ichi Seiyaku Co Ltd 薬物複合体
JPH11171280A (ja) 1997-12-10 1999-06-29 Japan Radio Co Ltd ディスク・メディア格納ボックス
EP2261229A3 (en) 1998-04-20 2011-03-23 GlycArt Biotechnology AG Glycosylation engineering of antibodies for improving antibody-dependent cellular cytotoxicity
JP4560210B2 (ja) 1998-05-22 2010-10-13 第一三共株式会社 薬物複合体
EP1619210A1 (en) 1998-10-30 2006-01-25 Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd. DDS compounds and method for assaying the same
EP2270148A3 (en) 1999-04-09 2011-06-08 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Method for controlling the activity of immunologically functional molecule
DK2283866T3 (en) 1999-06-25 2015-05-18 Genentech Inc METHODS OF TREATMENT USING ANTI-ERBB ANTIBODY-MAYTANSINOID CONJUGATES
JP2002060351A (ja) 2000-03-22 2002-02-26 Dai Ichi Seiyaku Co Ltd 水酸基を有する薬物を含むｄｄｓ化合物
EP1298145A4 (en) 2000-06-29 2004-12-08 Daiichi Seiyaku Co DDS CONNECTION AND METHOD FOR PRODUCING THE SAME
BR0112417A (pt) 2000-07-13 2003-07-01 Daiichi Seiyaku Co Composições farmacêuticas contendo composto dds
ES2639222T5 (es) 2000-10-06 2023-11-24 Kyowa Kirin Co Ltd Células que producen unas composiciones de anticuerpo
EP1283053A1 (en) 2001-08-09 2003-02-12 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Inhibitors of HER3 activity
TWI313609B (en) 2001-08-21 2009-08-21 Mitsubishi Tanabe Pharma Corp Pharmaceutical composition for inhibiting the metastasis or preventing the recurrence of malignant tumor
MXPA04004184A (es) 2001-11-01 2005-01-25 Uab Research Foundation Combinaciones de anticuerpos selectivos para un receptor de ligando que induce apoptosis relacionada al factor de necrosis tumoral y otros agentes terapeuticos.
JP2005511627A (ja) 2001-11-20 2005-04-28 シアトル ジェネティクス，インコーポレーテッド 抗ｃｄ３０抗体を使用する免疫学的疾患の治療
US8877901B2 (en) 2002-12-13 2014-11-04 Immunomedics, Inc. Camptothecin-binding moiety conjugates
US9745380B2 (en) 2002-03-01 2017-08-29 Immunomedics, Inc. RS7 antibodies
DE60325184D1 (de) 2002-03-01 2009-01-22 Immunomedics Inc Rs7 antikörper
AU2003288467A1 (en) 2002-12-13 2004-07-09 Immunomedics, Inc. Immunoconjugates with an intracellularly-cleavable linkage
US20040202666A1 (en) 2003-01-24 2004-10-14 Immunomedics, Inc. Anti-cancer anthracycline drug-antibody conjugates
MXPA06009701A (es) 2004-02-26 2007-03-26 Inotek Pharmaceuticals Corp Derivados de isoquinolina y metodos de uso de los mismos.
JP4942643B2 (ja) 2004-03-02 2012-05-30 シアトル ジェネティックス， インコーポレイテッド 部分的に付加された抗体およびそれらの結合体化方法
BRPI0510909A2 (pt) 2004-05-19 2008-12-16 Medarex Inc composto de ligaÇço fÁrmaco-ligante citotàxico, formulaÇço farmacÊutica, mÉtodo para matar uma cÉlula e mÉtodo para retardar ou interromper o crescimento de tumor
MXPA06014065A (es) 2004-06-01 2007-01-31 Genentech Inc Conjugados de droga-anticuerpo y metodos.
ES2521140T3 (es) 2004-07-22 2014-11-12 Genentech, Inc. Composición de anticuerpos de HER2
US8802820B2 (en) 2004-11-12 2014-08-12 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
JP2008521828A (ja) 2004-11-29 2008-06-26 シアトル ジェネティックス， インコーポレイテッド 操作された抗体およびイムノコンジュゲート
CN101141981A (zh) 2005-01-21 2008-03-12 健泰科生物技术公司 Her抗体的固定剂量给药
DE102005009084A1 (de) 2005-02-28 2006-08-31 Ktb Tumorforschungsgesellschaft Mbh Proteinbindende Anthrazyklin-Peptid-Derivate und diese enthaltende Arzneimittel
DE102005009099A1 (de) 2005-02-28 2006-08-31 Ktb Tumorforschungsgesellschaft Mbh Proteinbindende Camptothecin-Peptid-Derivate und diese enthaltende Arzneimittel
US7833979B2 (en) 2005-04-22 2010-11-16 Amgen Inc. Toxin peptide therapeutic agents
AR056857A1 (es) 2005-12-30 2007-10-24 U3 Pharma Ag Anticuerpos dirigidos hacia her-3 (receptor del factor de crecimiento epidérmico humano-3) y sus usos
US20080131428A1 (en) 2006-02-24 2008-06-05 Arius Research, Inc. Cytotoxicity mediation of cells evidencing surface expression of TROP-2
WO2007140371A2 (en) 2006-05-30 2007-12-06 Genentech, Inc. Antibodies and immunoconjugates and uses therefor
ZA200809776B (en) 2006-05-30 2010-03-31 Genentech Inc Antibodies and immunoconjugates and uses therefor
ITMI20061473A1 (it) 2006-07-26 2008-01-27 Indena Spa Derivati della camptotecina ad attivita antitumorale
CN101687838A (zh) 2006-12-21 2010-03-31 先灵公司 抑制ksp驱动蛋白活性的吡咯并[3,2-a]吡啶衍生物
KR101598229B1 (ko) 2007-02-16 2016-02-26 메리맥 파마슈티컬즈, 인크. Ｅｒｂｂ3에 대한 항체 및 이의 용도
CN101687021B (zh) 2007-03-22 2013-04-17 斯隆-凯特琳癌症研究院 单克隆抗体8h9的应用
AU2008311698C1 (en) 2007-10-11 2014-03-06 Daiichi Sankyo Company, Limited Antibody targeting osteoclast-related protein Siglec-15
AU2009205104B2 (en) 2008-01-18 2013-11-21 National University Corporation University Of Toyama Reaction Device, Reaction Method and Method of Synthesizing cDNA
IL295449A (en) * 2008-01-31 2022-10-01 Genentech Inc and fusion antibody-drug-cd79b engineered antibodies cysteine-
JP5769616B2 (ja) 2008-04-30 2015-08-26 イミュノジェン・インコーポレーテッド クロスリンカーおよびそれらの使用
ES2544971T3 (es) 2008-05-13 2015-09-07 Genentech, Inc. Análisis de conjugados de fármacos y anticuerpos mediante espectrometría de masas con captura por afinidad basada en esferas
KR20110112301A (ko) 2008-11-18 2011-10-12 메리맥 파마슈티컬즈, 인크. 인간 혈청 알부민 링커 및 그 콘쥬게이트
DK3912643T3 (da) 2009-02-13 2022-10-17 Immunomedics Inc Immunokonjugater med en intracellulært-spaltelig binding
MY152033A (en) 2009-04-09 2014-08-15 Daiichi Sankyo Co Ltd Anti-siglec-15 antibody
BR112012001395A2 (pt) 2009-07-22 2019-09-24 Enzon Pharmaceuticals Inc metodo para tratar um câncer her2 positivo em um mamifero metodo para aumentar os efetivos de antagonistas do receptor her2 em um mamifero apresentando um cancêr her2 positivo metodo para inibir o crescimento ou proliferação de células her2 positivas em um mamifero
WO2011021397A1 (ja) 2009-08-20 2011-02-24 国立大学法人千葉大学 コルヒチン誘導体
KR20130029460A (ko) 2009-09-04 2013-03-22 내셔날 유니버시티 코포레이션 유니버시티 오브 토야마 표적 유전자 유래 배열을 포함한 연결 ｄｎａ 단편의 특이적 제작 방법
WO2011038159A2 (en) 2009-09-24 2011-03-31 Seattle Genetics, Inc. Dr5 ligand drug conjugates
PT2719708T (pt) 2009-11-13 2018-01-16 Daiichi Sankyo Europe Gmbh Material e métodos para tratamento ou prevenção de doenças associadas a her-3
WO2011068845A1 (en) 2009-12-02 2011-06-09 Immunomedics, Inc. Combining radioimmunotherapy and antibody-drug conjugates for improved cancer therapy
JP5797210B2 (ja) 2010-03-02 2015-10-21 シアトル ジェネティックス， インコーポレイテッド 抗体をスクリーニングするための方法
KR20130062931A (ko) 2010-05-13 2013-06-13 인디애나 유니버시티 리서치 앤드 테크놀로지 코퍼레이션 핵 호르몬 수용체 활성을 나타내는 글루카곤 슈퍼패밀리 펩티드
US9062100B2 (en) 2010-05-17 2015-06-23 Livtech, Inc. Anti-human TROP-2 antibody having anti-tumor activity in vivo
EP2571525A4 (en) 2010-05-18 2016-04-27 Cerulean Pharma Inc Compositions and methods for treating autoimmune and other diseases
EP2594589A1 (en) 2010-06-10 2013-05-22 Sapporo Medical University ANTI-Trop-2 ANTIBODY
RS56599B1 (sr) * 2010-06-15 2018-02-28 Genmab As Konjugati humanog antitela sa lekom protiv tkivnog faktora
MX2013000491A (es) 2010-07-12 2013-02-26 Covx Technologies Ireland Ltd Conjugados de anticuerpos multifuncionales.
WO2012019024A2 (en) 2010-08-04 2012-02-09 Immunogen, Inc. Her3-binding molecules and immunoconjugates thereof
CA2815154A1 (en) 2010-08-06 2012-02-09 U3 Pharma Gmbh Use of her3 binding agents in prostate treatment
KR102504750B1 (ko) 2010-09-29 2023-03-02 어젠시스 인코포레이티드 191p4d12 단백질에 결합하는 항체 약물 컨쥬게이트(ａｄｃ)
US20130330350A1 (en) 2010-11-09 2013-12-12 Medimmune, Llc Antibody Scaffold For Homogenous Conjugation
WO2012074757A1 (en) 2010-11-17 2012-06-07 Genentech, Inc. Alaninyl maytansinol antibody conjugates
EP2703485B1 (en) 2011-03-30 2018-12-26 National University Corporation University Of Toyama Method for selecting plasma cells and plasmablasts, and method for producing target antigen-specific antibody
WO2012147713A1 (ja) * 2011-04-25 2012-11-01 第一三共株式会社 抗ｂ７－ｈ３抗体
BR112014011331A2 (pt) 2011-11-11 2017-04-25 Rinat Neuroscience Corp anticorpos específicos para trop-2 e seus usos
US9427464B2 (en) 2011-11-22 2016-08-30 Chiome Bioscience Inc. Anti-human TROP-2 antibody having an antitumor activity in vivo
JP2015505850A (ja) 2011-12-14 2015-02-26 シアトル ジェネティックス， インコーポレイテッド 新規な抗体薬物コンジュゲート（ａｄｃ）およびそれらの使用
US11147852B2 (en) * 2011-12-23 2021-10-19 Pfizer Inc. Engineered antibody constant regions for site-specific conjugation and methods and uses therefor
US20130280282A1 (en) 2012-04-24 2013-10-24 Daiichi Sankyo Co., Ltd. Dr5 ligand drug conjugates
AU2013274078A1 (en) 2012-06-14 2015-01-29 Ambrx, Inc. Anti-PSMA antibodies conjugated to nuclear receptor ligand polypeptides
KR102090849B1 (ko) 2012-07-04 2020-03-19 에프. 호프만-라 로슈 아게 공유 결합된 항원-항체 접합체
KR20230142808A (ko) 2012-10-11 2023-10-11 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 글리신아미드 화합물의 제조 방법
ES2782248T3 (es) 2012-10-19 2020-09-11 Daiichi Sankyo Co Ltd Conjugado de anticuerpo y fármaco producido por la unión a través de un enlazador que tiene estructura hidrófila
SG11201504887TA (en) * 2012-12-21 2015-07-30 Bioalliance Cv Hydrophilic self-immolative linkers and conjugates thereof
CN105051032B (zh) 2013-01-03 2017-08-15 赛特瑞恩股份有限公司 抗体‑连接子‑药物偶联物、其制法及包含其的抗癌药物组合物
KR102535900B1 (ko) 2013-12-25 2023-05-26 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 항 trop2 항체-약물 컨쥬게이트
SI3101032T1 (sl) 2014-01-31 2019-02-28 Daiichi Sankyo Company, Limited Konjugat zdravila s protitelesci ANTI-HER2
KR20220025946A (ko) * 2014-03-21 2022-03-03 애브비 인코포레이티드 항-ｅｇｆｒ 항체 및 항체 약물 접합체
JP2017114763A (ja) 2014-03-26 2017-06-29 第一三共株式会社 抗ｃｄ９８抗体−薬物コンジュゲート
MY195180A (en) 2014-04-10 2023-01-11 U3 Pharma Gmbh Anti-HER3 Antibody-Drug Conjugate
WO2015155976A1 (ja) 2014-04-10 2015-10-15 第一三共株式会社 抗ｈｅｒ２抗体－薬物コンジュゲート

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