JP5797210B2 - 抗体をスクリーニングするための方法 - Google Patents
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Description
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される:
(項目1)
抗体スクリーニングアッセイに用いるための抗体コンジュゲートを作製するための方法であって、
第1及び第2の抗体含有試料を供給するステップであって、ここで、該第1の試料に存在する抗体の実質的にすべてが同じ配列のものであり、かつ該第2の試料に存在する抗体の実質的にすべてが同じ配列のものであるという条件で、該第1及び第2の抗体含有試料が抗体量及び抗体配列に関して様々である、ステップと、
該抗体を固体支持体上に固定して、固定化抗体を含む第1及び第2の試料を供給するステップと、
該固定化抗体の還元性ジスルフィド結合を完全に還元して、還元した固定化抗体を含む第1の試料及び還元した固定化抗体を含む第2の試料を供給するステップであって、ここで、該還元が該還元性ジスルフィド結合に対して選択的である、ステップと、
該還元した固定化抗体を、キャッピング剤、薬物又は薬物−リンカー及び必要に応じて検出剤と反応させて、固定化抗体コンジュゲートを供給するステップであって、ここで、該キャッピング剤、薬物又は薬物−リンカー及び任意選択の検出剤が反応性チオールと選択的に反応し、該キャッピング剤、薬物又は薬物−リンカー及び任意選択の検出剤がモル過剰で供給され、該キャッピング剤、薬物又は薬物−リンカー及び任意選択の検出剤の比率が、所望のレベルの薬物負荷を達成するように選択される、ステップと、
該抗体コンジュゲートを溶出して、第1及び第2の抗体薬物コンジュゲート組成物を供給するステップと
を含む方法。
(項目2)
前記還元性ジスルフィド結合が、前記抗体の天然に存在する鎖間ジスルフィド結合である、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記第1及び第2の抗体含有試料中の前記抗体が同じ数の前記還元性ジスルフィド結合を有し、前記還元した固定化抗体を同じ比率の前記キャッピング剤、薬物又は薬物−リンカー及び任意選択の検出剤と接触させる、項目1又は2に記載の方法。
(項目4)
前記第1及び第2の抗体含有試料中の前記抗体が異なる数の還元性ジスルフィド結合を有し、前記還元した固定化抗体を異なる比率のキャッピング剤、薬物又は薬物−リンカー及び任意選択の検出剤と接触させる、項目1又は2に記載の方法。
(項目5)
前記還元した固定化抗体を検出剤と反応させる、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目6)
前記検出剤が蛍光団であり、得られる抗体コンジュゲート組成物が抗体当たり約3個の蛍光団の平均蛍光団負荷を有する、項目5に記載の方法。
(項目7)
前記抗体コンジュゲートの溶出後に、前記抗体コンジュゲート組成物中に存在する抗体の実際量又は相対量を決定する、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目8)
固定化の前の前記抗体含有試料中に存在する前記抗体が不純である、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目9)
固定化、還元、コンジュゲーション及び溶出の前の前記抗体含有試料中に存在する前記抗体の量が既知でない、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目10)
前記抗体含有試料が前記試料に存在する1μg〜100μgの抗体を有する、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目11)
前記抗体含有試料が前記試料に存在する1μg〜50μgの抗体を有する、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目12)
前記抗体含有試料が前記試料に存在する1μg〜20μgの抗体を有する、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目13)
前記抗体含有試料中の前記抗体が同じ種からのものである、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目14)
前記キャッピング剤、薬物又は薬物−リンカー及び検出剤がマレイミド基を含む、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目15)
試料間の薬物−リンカー負荷が実質的に均一である、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目16)
前記抗体コンジュゲート組成物が抗体当たり約4個の薬物−リンカーの平均薬物−リンカー負荷を有する、項目15に記載の方法。
(項目17)
前記抗体含有試料が細胞培養上清試料である、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目18)
前記細胞培養上清が非精製ハイブリドーマ細胞培養上清である、項目17に記載の方法。
(項目19)
前記細胞培養上清が非精製CHO細胞培養上清である、項目17に記載の方法。
(項目20)
抗体産生に用いた細胞培養培地の実質的にすべてがIgG枯渇培地であった、項目17、18又は19のいずれか一項に記載の方法。
(項目21)
前記固体支持体を前記細胞培養上清に加える、項目17、18、19又は20のいずれか一項に記載の方法。
(項目22)
前記抗体コンジュゲートの活性についてアッセイするステップをさらに含む、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目23)
前記抗体コンジュゲート組成物を構成する前記抗体間の比較を、対応する前記抗体コンジュゲートの活性に基づいて行うステップを含む、項目22に記載の方法。
(項目24)
前記活性が細胞傷害性である、項目23に記載の方法。
(項目25)
ハイスループットスクリーニングアッセイに用いるための抗体コンジュゲートを作製するための方法であって、
複数のハイブリドーマクローンから産生される定量化されていない抗体を含む未精製ハイブリドーマ上清の複数の試料を供給するステップであって、ここで、該複数の該試料の大多数において各試料に存在する抗体の実質的にすべてが単一ハイブリドーマクローンからのものであるという条件で、該複数の試料が抗体量及び抗体配列に関して様々である、ステップと、
該定量化されていない抗体を固体支持体上に固定して、固定化抗体を含む複数の試料を供給するステップと、
該固定化抗体の鎖間ジスルフィドを完全に還元して、還元した固定化抗体を含む複数の試料を供給するステップと、
該還元した固定化抗体を、キャッピング剤、薬物又は薬物−リンカー及び検出剤と反応させて、固定化抗体コンジュゲートを供給するステップであって、ここで、該キャッピング剤、薬物又は薬物−リンカー及び検出剤が反応性チオールと選択的に反応し、該キャッピング剤、薬物又は薬物−リンカー及び任意選択の検出剤がモル過剰で供給され、該キャッピング剤、薬物又は薬物−リンカー及び検出剤の比率が、所望のレベルの薬物負荷を達成するように選択される、ステップと、
該固体支持体から該固定化抗体コンジュゲートを溶出して、複数の抗体コンジュゲート組成物を供給するステップと
を含む方法。
(項目26)
前記抗体コンジュゲート組成物中に存在する前記抗体の実際量又は相対量を決定するステップと、前記抗体コンジュゲートの活性をアッセイするステップと、該アッセイの結果及び該抗体コンジュゲート組成物中に存在する該抗体の実際量又は相対量に基づいて、所望の特性を有する抗体を選択するステップとをさらに含む、項目25に記載の方法。
(項目27)
抗体産生のために用いた細胞培養培地の実質的にすべてがIgG枯渇培地であった、項目25又は26に記載の方法。
(項目28)
1μg〜100μgの抗体がハイブリドーマ上清の各試料中に存在する、項目25又は26又は27に記載の方法。
(項目29)
1μg〜50μgの抗体がハイブリドーマ上清の各試料中に存在する、項目28に記載の方法。
(項目30)
1μg〜20μgの抗体がハイブリドーマ上清の各試料中に存在する、項目29に記載の方法。
(項目31)
前記検出剤が蛍光標識である、項目25から30のいずれか一項に記載の方法。
(項目32)
前記キャッピング剤、薬物又は薬物−リンカー及び検出剤がマレイミド基を含む、項目25から31のいずれか一項に記載の方法。
(項目33)
抗体スクリーニングアッセイに用いるための抗体コンジュゲートを作製するための方法であって、
抗体量及び抗体配列に関して様々である、複数の抗体含有試料を、該複数の該抗体含有試料の大多数において、単一試料に存在する該抗体の実質的にすべてが同じ配列のものであるという条件で、供給するステップと、
該抗体を固体支持体上に固定して、固定化抗体を含む複数の試料を供給するステップと、
該固定化抗体の還元性ジスルフィド結合を完全に還元して、還元した固定化抗体を含む複数の試料を供給するステップであって、ここで、該還元が還元性ジスルフィド結合に対して選択的である、ステップと、
該還元した固定化抗体を、キャッピング剤、薬物又は薬物−リンカー及び必要に応じて検出剤と反応させて、固定化抗体コンジュゲートを含む複数の試料を供給するステップであって、ここで、該キャッピング剤、薬物又は薬物−リンカー及び任意選択の検出剤が反応性チオールと選択的に反応し、該キャッピング剤、薬物又は薬物−リンカー及び任意選択の検出剤がモル過剰で供給され、該キャッピング剤、薬物又は薬物−リンカー及び任意選択の検出剤の比率が、所望のレベルの薬物負荷を達成するように選択される、ステップと、
前記抗体コンジュゲートを溶出して、複数の抗体コンジュゲート組成物を供給するステップと
を含む方法。
(項目34)
抗体スクリーニングアッセイに用いるための抗体コンジュゲートを作製するための方法であって、
抗体量及び抗体配列に関して様々である、複数の抗体含有試料を、該複数の該抗体含有試料の大多数において、単一試料に存在する該抗体の実質的にすべてが同じ配列のものであるという条件で、供給するステップと、
該抗体を固体支持体上に固定して、固定化抗体を含む複数の試料を供給するステップと、
該固定化抗体の還元性ジスルフィド結合を完全に還元して、還元した固定化抗体を含む複数の試料を供給するステップであって、ここで、該還元が還元性ジスルフィド結合に対して選択的である、ステップと、
該還元した固定化抗体をキャッピング剤及び検出剤と反応させて、固定化抗体コンジュゲートを含む複数の試料を供給するステップであって、ここで、該キャッピング剤及び検出剤が反応性チオールと選択的に反応し、該キャッピング剤及び検出剤がモル過剰で供給され、該キャッピング剤及び検出剤の比率が、所望のレベルのキャッピング剤及び/又は検出剤負荷を達成するように選択される、ステップと、
該抗体コンジュゲートを溶出して、複数の抗体コンジュゲート組成物を供給するステップと
を含む方法。
(項目35)
抗体薬物コンジュゲートに用いるための抗体を選択するための方法であって、
抗体量及び抗体配列に関して様々である、複数の抗体含有試料を、該複数の該抗体含有試料の大多数において、単一試料に存在する該抗体の実質的にすべてが同じ配列のものであるという条件で、供給するステップと、
該抗体を固体支持体上に固定して、固定化抗体を含む複数の試料を供給するステップと、
該固定化抗体の還元性ジスルフィド結合を完全に還元して、還元した固定化抗体を含む複数の試料を供給するステップであって、ここで、該還元が還元性ジスルフィド結合に対して選択的である、ステップと、
該還元した固定化抗体をキャッピング剤、薬物又は薬物−リンカー及び必要に応じて検出剤と反応させて、固定化抗体コンジュゲートを含む複数の試料を供給するステップであって、ここで、該キャッピング剤、薬物又は薬物−リンカー及び任意選択の検出剤が反応性チオールと選択的に反応し、該キャッピング剤、薬物又は薬物−リンカー及び任意選択の検出剤がモル過剰で供給され、該キャッピング剤、薬物又は薬物−リンカー及び任意選択の検出剤の比率が、所望のレベルの薬物負荷を達成するように選択される、ステップと、
該抗体コンジュゲートを溶出して、遊離抗体コンジュゲートを含む複数の抗体コンジュゲート組成物を供給するステップと、
該抗体コンジュゲートの活性についてアッセイするステップと、
該アッセイの結果に基づいて抗体を選択するステップと
を含む方法。
(項目36)
抗体薬物コンジュゲートに用いるための抗体を選択するための方法であって、
抗体量及び抗体配列に関して様々である、複数の抗体含有試料を、該複数の該抗体含有試料の大多数において、単一試料に存在する抗体の実質的にすべてが同じ配列のものであるという条件で、供給するステップと、
該抗体を固体支持体上に固定して、固定化抗体を含む複数の試料を供給するステップと、
該固定化抗体の還元性ジスルフィド結合を完全に還元して、還元した固定化抗体を含む複数の試料を供給するステップであって、ここで、該還元が還元性ジスルフィド結合に対して選択的である、ステップと、
該還元した固定化抗体をキャッピング剤及び検出剤と反応させて、固定化抗体コンジュゲートを含む複数の試料を供給するステップであって、ここで、該キャッピング剤及び検出剤が反応性チオールと選択的に反応し、該キャッピング剤及び検出剤がモル過剰で供給され、該キャッピング剤及び検出剤の比率が、所望のレベルのキャッピング剤及び/又は検出剤負荷を達成するように選択される、ステップと、
該抗体コンジュゲートを溶出して、遊離抗体コンジュゲートを含む複数の抗体コンジュゲート組成物を供給するステップと、
該抗体コンジュゲートの活性についてアッセイするステップと、
該アッセイの結果に基づいて抗体を選択するステップと
を含む方法。
「抗体」という用語は、本明細書で用いているように、(a)免疫グロブリンポリペプチド及び免疫グロブリンポリペプチドの免疫学的に活性な部分、すなわち、免疫グロブリンファミリーのポリペプチド若しくはそのフラグメント又は(b)標的抗原に免疫特異的に結合するそのような免疫グロブリンポリペプチド若しくはフラグメントの保存的に置換された誘導体を意味する。本発明に用いる抗体(抗体フラグメントを含む)は、(i)標的抗原に免疫特異的に結合する抗原結合部位、(ii)少なくとも1つの還元性ジスルフィド結合(例えば、鎖間ジスルフィド結合)及び(iii)固相に可逆的に結合することができるドメインを含む。いくつかの実施形態において、抗体は、全長Fc領域を含み、固相への結合は、Fc領域を介してなされる。いくつかの実施形態において、抗体は、抗体の1つ以上のFcドメインを含み、固相への結合は、1つ以上のFcドメインを介してなされる。いくつかの実施形態において、固相に可逆的に結合することができるドメインは、Fc領域ではなく、例えば、アフィニティタグなどの抗体上の工学技術で作製されたドメインである。抗体という用語は、非フコシル化又は低いコアフコシル化を有する抗体を含む。抗体は、例えば、Harlow & Lane、Antibodies: A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press、1988年)に一般的に記載されている。完全な抗体構造の基本的単位は、4つのポリペプチド、すなわち、非共有結合及びジスルフィド結合の両方により結合した2つの同一の低分子量(「軽」)鎖及び2つの同一の高分子量(「重」)鎖の複合体である。抗体のクラス及びサブクラスは、そのイソタイプである。抗体は、例えば、それらの天然の四量体(2軽鎖及び2重鎖)であってよく、公知のイソタイプIgG、IgA、IgM、IgD及びIgE並びにそれらのサブタイプ、例えば、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、IgG4並びにマウスIgG1、IgG2a、IgG2b及びIgG3のいずれかであってよい。抗体は、好ましくはモノクローナルである。
ADCとしての又はコンジュゲートしていない抗体(すなわち、裸の抗体)としてのそれらの能力に基づいて、抗体を直接的にスクリーニングする方法を発明した。試料中に存在する抗体の濃度の影響を受けず、抗体の不均質(heterogeneous)集団の個々の抗体の活性の比較を可能にする、少量の抗体に適用できる標識技術を開発した。
抗体コンジュゲートを作製するための本明細書に記載する方法は、融合タンパク質スクリーニングアッセイに用いるための融合タンパク質を作製するためにも用いることができる。「融合タンパク質」という用語は、結合ドメイン−Ig融合物を指すために本明細書において用いるものであり、ここで、結合ドメインは、例えば、リガンド、受容体の細胞外ドメイン、ペプチド、非天然ペプチド又は同様なものであり得る。ただし、結合ドメインは、抗体の可変ドメインを含まない。本明細書に記載する抗体と同様に、融合タンパク質のIg部分は、少なくとも1つの還元性ジスルフィド結合及び固相に結合することができるドメインを含まなければならない。1つの態様において、Igドメインは、抗体のFc領域である。ドメイン−Ig融合タンパク質の例は、sTNFRIIとFc領域との融合タンパク質であるエタネルセプト(米国特許第5,605,690号)、抗原提示細胞上で発現したLFA−3とFc領域との融合タンパク質であるアレファセプト(米国特許第5,914,111号)、細胞傷害性Tリンパ球関連抗原4(CTLA−4)とFc領域との融合タンパク質(J. Exp. Med.、181巻、1869頁(1995年))、インターロイキン15とFc領域との融合タンパク質(J. Immunol.、160巻、5742頁(1998年))、第VII因子とFc領域との融合タンパク質(Proc. Natl. Acad. Sci. USA、98巻、12180頁(2001年))、インターロイキン10とFc領域との融合タンパク質(J. Immunol.、154巻、5590頁(1995年))、インターロイキン2とFc領域との融合タンパク質(J. Immunol.、146巻、915頁(1991年))、CD40とFc領域との融合タンパク質(Surgery、132巻、149頁(2002年))、Flt−3(fms様チロシンキナーゼ)と抗体Fc領域との融合タンパク質(Acta. Haemato.、95巻、218頁(1996年))、OX40と抗体Fc領域との融合タンパク質(J. Leu. Biol.、72巻、522頁(2002年))及び他のCD分子(例えば、CD2、CD30(TNFRSF8)、CD95(Fas)、CD106(VCAM−I)、CD137)との融合タンパク質、接着分子(例えば、ALCAM(活性化白血球細胞接着分子)、カドヘリン、ICAM(細胞内接着分子)−1、ICAM−2、ICAM−3)、サイトカイン受容体(例えば、インターロイキン−4R、インターロイキン−5R、インターロイキン−6R、インターロイキン−9R、インターロイキン−10R、インターロイキン−12R、インターロイキン−13Rアルファ1、インターロイキン−13Rアルファ2、インターロイキン−15R、インターロイキン−21Rアルファ)、ケモカイン、細胞死誘発シグナル分子(例えば、B7−H1、DR6(デス(death)受容体6)、PD−1(プログラム死−1)、TRAIL R1)、共刺激分子(例えば、B7−1、B7−2、B7−H2、ICOS(誘導性共刺激物質))、成長因子(例えば、ErbB2、ErbB3、ErbB4、HGFR)、分化誘導因子(例えば、B7−H3)、活性化因子(例えば、NKG2D)並びにシグナル伝達分子(例えば、gpl30)、BCMA及びTACIなどである。
抗体がそれらの天然の折りたたみ構造を保持する条件下では、TCEPは、水溶性試薬に接近できない免疫グロブリンドメインの鎖内ジスルフィドを還元せずに鎖間ジスルフィドを容易に還元することは、十分に認識されている。抗体がプロテインGアフィニティ媒体に結合している場合、鎖間ジスルフィドに対するこの選択性は、変化しないままである。これを図1に示す。この図にはプロテインG固定化マウス抗体を10mM TCEPで還元した後、過剰のmc−MMAFをコンジュゲートしたもののクロマトグラムを示す。これらのクロマトグラムを従来の溶液化学によりTCEPで還元し、mc−MMAFと反応させた同じ抗体のクロマトグラムと重ね合わせた。標準溶液法と固相法との同等な結果は、抗体の反応性がプロテインGアフィニティ媒体への結合により著しく変化しないことを示すものである。この特徴は、最も豊富な抗体における還元性ジスルフィドの数に対して過剰な量のTCEPを用いることによって、存在する各抗体の量に無関係に抗体の大規模パネルをすべて同じ数の反応性チオールに還元することを可能にするものである。どのような量の抗体が存在し得るかという知識がない場合、理論上最も豊富な抗体は、アフィニティ樹脂の容量(樹脂1μL当たりの抗体μg)に樹脂床の容積(μL)を乗じたものと定義することができる。
図2は、プロテインGに固定化し、過剰のTCEPで完全に還元したマウスIgG1にN−エチルマレイミド(NEM)との混合物として加えた場合の、マレイミド薬物mcMMAFの負荷の程度を示す。図に、この実施例において0.4の平均mcMMAFモル分率を有するコンジュゲート(薬物負荷4)が望ましい場合にマレイミド混合物中のmcMMAFのモル分率が0.53でなければならないような、NEMと比べてmcMMAFの反応性がわずかに低いことが示されている。各コンジュゲートにおけるmcMMAFの負荷は、薬物負荷に基づいて重鎖と軽鎖を効率よく分離する、PLRP−Sカラムを用いた逆相クロマトグラフィーにより決定した。mcMMAFの疎水性により、mcMMAFコンジュゲーションの程度が増加した種についてのより遅い保持時間がもたらされる(図3)。mcMMAFとNEMとの混合物をこの比率で調製し、マウス抗体の小パネルに加えて、異なるIgGイソ型にわたるこの比率の一般性を評価した。下表に示すように、両方が5個の鎖間ジスルフィドを有するマウスIgG1及びIgG2aは、PLRP−Sクロマトグラフィーにより決定したとき3.9から4.2の間のmcMMAF薬物負荷レベルを示した。6個の鎖間ジスルフィドを有するマウスIgG2bは、完全な還元に起因する、抗体当たりの反応性チオールの数がより大きい結果として、対応するより大きい平均mcMMAF負荷を示した。この結果は、特定の負荷レベルが望まれる場合に還元性抗体のジスルフィドの数に応じてマレイミド混合物を調整することの重要性を示すものである。
コンジュゲートに存在する薬物及び蛍光団の両方を含む混合コンジュゲートを制御できる方法で調製することができる。蛍光団の存在は、抗体の大パネルから得られるコンジュゲートのより感度の高い定量を可能にし、或いは当パネルについて実施される結合アッセイ又は他のアッセイについてのリポーター基となり得る。Alexa Fluor(登録商標)647及びmcMMAFの所望の平均負荷を有する抗体コンジュゲートのパネルを作製するために、Alexa Fluor(登録商標)647マレイミドをmcMMAF及びNEMとともにマレイミドの混合物に含めることができる。Alexa Fluor647の標的負荷レベルを評価するために、Alexa Fluor647マレイミド及びmcMMAFの二成分混合物を用いて一連のマウスIgG1コンジュゲートを調製した。これらのコンジュゲート上のmcMMAFの平均負荷をPLRP−Sクロマトグラフィーにより決定し、完全に還元されたマウスIgG1上の総コンジュゲーション部位は10であるので、Alexa Fluor(登録商標)647の負荷を(10−mcMMAF負荷)と計算した。次にこれらのコンジュゲートの蛍光出力を、蛍光プレートリーダーを用いて決定し、Alexa Fluor(登録商標)647の負荷の関数としてプロットした(図4)。図4では、蛍光が負荷レベルの増加とともに抗体当たり約2.5から約3個の蛍光団に対応する最大値まで急激に増加し、その後はさらなる蛍光団の負荷に伴って間断なく減少することが示される。蛍光団の負荷の増加に伴う蛍光出力のこの低下は、おそらく、抗体の還元ジスルフィドにコンジュゲートしたときの蛍光団の密な空間的近接によって生ずる自己消光に起因する。この結果に基づいて、抗体当たり約3個の蛍光団負荷を選択した。この負荷レベルでは、蛍光出力が最大となる(蛍光アッセイにおける最大感度をもたらす)だけでなく、蛍光団負荷の関数としての蛍光の変動も最小となる。これは、抗体パネルにわたる蛍光団負荷の小さい変動が蛍光出力の大きい差をもたらさないという、コンジュゲートの濃度を定量化するために蛍光を用いる場合に重要な点を保証する。
実施例3に記載したように、抗体当たりの蛍光団の具体例としての数は約3である。抗体含有試料がマウスIgG1及びIgG2aイソ型を含むものであり、蛍光団についての所望の負荷レベルが3であると仮定すると、AF647マレイミド及びmcMMAFの適切な混合物を調製することにより、7の薬物負荷レベルを達成することができる。しかし、N−エチルマレイミド(NEM)のようなキャッピング試薬を含めることにより、より低いレベルの薬物負荷を達成することができる。したがって、AF647及びmcMMAF負荷の所望のレベル(2つの合計がマウスIgG1又はIgG2aについて10以下であるという条件で)を達成するために、AF647、mcMMAF及びNEMの三成分混合物を適切な比率で調製することができる。所望の負荷レベルを達成するために必要なこれらの3つの試薬の正確な混合物を決定するために、それらの相対的な反応性を決定した。これは、mcMMAF:NEM及びAF647:NEMの1:1混合物を調製し、これらの混合物をプロテインG上に固定化した完全に還元したマウスIgG1と反応させることによって行った。得られたAF647コンジュゲートにおける蛍光団負荷のレベルを、図5を参照することによりその650nm/280nm吸光度比から決定し、一方、得られた薬物コンジュゲートにおけるmcMMAF負荷をPLRPクロマトグラフィーにより決定した。これらのデータを下表に示す。抗体におけるモル分率は、還元マウスIgG1にコンジュゲートするマレイミドの総数である10で割った各試薬(AF647又はmcMMAF)の負荷であり、NEMモル分率は、1から試薬のモル分率を差し引いたものであり、相対的反応性は、試薬のモル分率とNEMのモル分率との比である。この解析においては、NEMに相対的反応性値1を割り当てる。
mcMMAF、AF647、マレイミド及びNEMの溶液を0.43:0.43:0.14の比率で調製し、本方法により抗体のパネルをコンジュゲートするために用いた。これらの抗体は、マウス免疫付与キャンペーンから得られた新たに融合させたハイブリドーマを用いた1.5mLのウシIgG枯渇ハイブリドーマ培養培地から生成させた。得られた混合コンジュゲートの薬物及び蛍光団負荷の一貫性を決定するために、試料の1枚の96ウエルプレートを分析に供した。蛍光団負荷は、吸光度プレートリーダーで測定した各試料の650nm/280nm吸光度比により、図5に示す直線関係を参照して決定した。得られたデータを、各試料が生成したコンジュゲートの量に対してプロットして図6に示す。データは、少なくとも2.5μgのコンジュゲートを生成した試料についてのみ示す。その理由は、これより低い量は、ベースラインを有意に上回る280nm吸光度値をもたらさなかったからである。この2.5μg閾値に適合した65の試料がプレート上に存在しており、それらを図6に示す。図においてわかるように、負荷は、抗体当たりの蛍光団として2から4の間に散在しており、計算平均値が3.26、変動係数が10.2%である。3.26の平均負荷は、目標負荷3から10%未満異なっている。重要なことに、観測された蛍光団負荷レベルの範囲は、自己消光現象のために蛍光が著しく変化しない蛍光対負荷曲線(図4)の領域内に入っていた。換言すれば、抗体当たり2、3又は4個の蛍光団を有する抗体間の観測される蛍光の差は、20%未満であると予想される。mcMMAF負荷は、PLRPクロマトグラフィーにより決定した。mcMMAF−AF647−NEM抗体コンジュゲートの試料PLRPクロマトグラムを図7に示す。この図は、タンパク質を含むピークのすべてを検出するための280nmと少なくとも1つのAlexa Fluor(登録商標)647を含むピークを検出するための620nmの2つの分析波長のオーバーレイである。この図においてわかるように、NEMを含む軽鎖(2.2分)はAlexa Fluor(登録商標)647を含む軽鎖(2.5分)からわずかに分離されているが、両方ともmcMMAFを含む軽鎖(3.8分)から十分に分離されており、これにより、PLRPカラムはmcMMAF負荷に基づいて種を十分に分離するが、AF647負荷には基づかないことが示される。軽鎖は、TCEP処理によって還元される1つのシステインのみを含むので、これらは、存在する唯一の軽鎖種であり、NEM及びmcMMAFピークは、それらがAF647を含まないので、620nmでの吸光度を有さない。重鎖ピーククラスターは、4個の利用可能なチオールを含み、各ピークが単一種でないという事実のため、より複雑である。例えば、mcMMAFの2コピーを有する重鎖に対応するピーク(7.7分)は、2AF647、2NEM又は1AF647及び1NEMも含む重鎖種の集合であり、これらの様々な種は、PLRPカラムにより分離されない。分離のこのような特徴は、AF647又はNEMの存在による影響を受けずにmcMMAFの負荷を厳密に評価するためにこれらのデータを用いることを可能にするものである。この方法を用いて、mcMMAFの負荷レベルをハイブリドーマ上清のプレートからの34個の試料について決定し、各試料が生成したコンジュゲートの量に対して図8にプロットする。図においてわかるように、負荷は、抗体当たりmcMMAFの4から6コピーの間に散在しており、計算平均値は4.51、変動係数は7.75%である。4.51の平均負荷は、正確に4.5の目標レベルである。図においてわかるように、5より大きい負荷レベルを有する3つの域外値が存在しており、これらの試料のPLRPクロマトグラムは、mcMMAFの5コピーを有する重鎖種を含み、これは、これらの抗体の重鎖上にさらなる還元性ジスルフィドの存在を示すものであり(例として図9参照)、これらの抗体がマウスIgG2bイソ型であることが示唆される。したがって、これらの試料に認められたより高い負荷は、他の抗体と比較してmcMMAFの不釣り合いな負荷に起因するのではなく、むしろ、これらの抗体は、20%多くの利用可能なチオール(10個でなく12個)を有し、したがって、20%より高いレベルで各試薬を負荷されると予想されよう。これらの3つを解析から除外し、10個の利用可能なチオールを有する抗体のみを考慮する場合、31個の抗体の平均mcMMAF負荷は4.42であり、変動係数は3.45%となる。これらの結果は、可変のイソ型の抗体のパネルにわたる、また新たに融合させたハイブリドーマのパネルの可変の量での、本方法によって達成された試薬負荷(mcMMAF及びAF647)の一貫性を示している。
ハイブリドーマ上清を5mL丸底チューブ中で4.5mL溶液として調製した。150μLプロテインG樹脂スラリー(Millipore ProSep−G)をそれぞれに加えた。チューブにキャップをし、5℃で一夜回転させた。2つの対照チューブも調製し、1つはウシIgG枯渇増殖培地(ブランクとするため)を含み、1つは100μgの対照抗体をスパイクした同じ培地を含んでいた。
新たに融合させたハイブリドーマをHAT及び蛍光標識抗マウスIgG(Genetix)を含むメチルセルロース培地(Genetix)中でプレート培養した。クローン性IgG産生コロニーを選択し、HSFM(InVitrogen)+IgG枯渇クローニング因子(Roche)を含む96Wプレート中に沈積させた。100ng/mlのCy5標識抗マウス二次抗体(Jackson Labs)を含む均質アッセイ中で、非精製ハイブリドーマ培養上清の4倍希釈物を、標的腫瘍細胞とともにインキュベートした。腫瘍細胞へのハイブリドーマの結合をFMAT8200(Applied Biosystems)を用いて検出し、陽性ウエルを2mlのHSFM(InVitrogen)+IgG枯渇クローニング因子を含む48Wディッシュ中に拡大した。48Wの消滅した(extinguished)上清からの抗体を固相精製及びコンジュゲーションに用いた。
140μLのこの溶液を15mLのPBS/EDTAに溶解し、150μLを洗浄済みプレートの各ウエルに加えた。次いで、プレートを上記のように15分間振とうし、次に振とう機から取り出し、500×gで2分間遠心分離した。樹脂を500μLのPBSで4回洗浄し、毎回の洗浄後に真空ろ過した。最終洗浄後に、さらに500μLのPBSを加え、500×gで3分間の遠心分離により除去した。
クローニング因子は、マウスB細胞との融合の後のハイブリドーマ細胞系を拡大する際に培地成分として一般的に用いられる。クローニング因子は、健常成長細胞の上清から採取される重要な細胞メディエーターを含み、これらは、新たなハイブリドーマ融合物が回復して、より頑健に成長し始めることを促進する。クローニング因子を構成する健常成長細胞から採取された上清は、培地成分として、ウシアルブミン、IgG及び他の血清タンパク質を含むと思われるウシ血清を含むと考えられる。少量の夾雑IgGでさえ抗体の定量的回収及び得られるADCの定量に影響を与え得るため、この場合に問題となるものはウシIgGである。
Claims (35)
- 抗体スクリーニングアッセイに用いるための抗体コンジュゲートを作製するための方法であって、
第1及び第2の抗体含有試料を供給するステップであって、ここで、該第1の試料に存在する抗体の実質的にすべてが同じ配列のものであり、かつ該第2の試料に存在する抗体の実質的にすべてが同じ配列のものであるという条件で、該第1及び第2の抗体含有試料が抗体量及び抗体配列に関して様々である、ステップと、
該抗体を固体支持体上に固定して、固定化抗体を含む第1及び第2の試料を供給するステップと、
該固定化抗体の鎖間ジスルフィド結合を完全に還元して、還元した固定化抗体を含む第1の試料及び還元した固定化抗体を含む第2の試料を供給するステップであって、ここで、該還元が該鎖間ジスルフィド結合に対して選択的である、ステップと、
該還元した固定化抗体を、キャッピング剤、薬物又は薬物−リンカー及び必要に応じて検出剤と反応させて、固定化抗体コンジュゲートを供給するステップであって、ここで、該キャッピング剤、薬物又は薬物−リンカー及び任意選択の検出剤が反応性チオールと選択的に反応し、該キャッピング剤、薬物又は薬物−リンカー及び任意選択の検出剤がモル過剰で供給され、該キャッピング剤、薬物又は薬物−リンカー及び任意選択の検出剤の比率が、所望のレベルの薬物負荷を達成するように選択される、ステップと、
該抗体コンジュゲートを溶出して、第1及び第2の抗体薬物コンジュゲート組成物を供給するステップと
を含む方法。 - 前記第1及び第2の抗体含有試料中の前記抗体が同じ数の前記鎖間ジスルフィド結合を有し、前記還元した固定化抗体を同じ比率の前記キャッピング剤、薬物又は薬物−リンカー及び任意選択の検出剤と接触させる、請求項1に記載の方法。
- 前記第1及び第2の抗体含有試料中の前記抗体が異なる数の鎖間ジスルフィド結合を有し、前記還元した固定化抗体を異なる比率のキャッピング剤、薬物又は薬物−リンカー及び任意選択の検出剤と接触させる、請求項1に記載の方法。
- 前記還元した固定化抗体を検出剤と反応させる、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記検出剤が蛍光団であり、得られる抗体コンジュゲート組成物が抗体当たり約3個の蛍光団の平均蛍光団負荷を有する、請求項4に記載の方法。
- 前記抗体コンジュゲートの溶出後に、前記抗体コンジュゲート組成物中に存在する抗体の実際量又は相対量を決定する、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 固定化の前の前記抗体含有試料中に存在する前記抗体が不純である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 固定化、還元、コンジュゲーション及び溶出の前の前記抗体含有試料中に存在する前記抗体の量が既知でない、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗体含有試料が前記試料に存在する1μg〜100μgの抗体を有する、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗体含有試料が前記試料に存在する1μg〜50μgの抗体を有する、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗体含有試料が前記試料に存在する1μg〜20μgの抗体を有する、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1の抗体含有試料中の前記抗体および前記第2の抗体含有試料中の前記抗体が同じ種からのものである、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記キャッピング剤、薬物又は薬物−リンカー及び検出剤がマレイミド基を含む、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 試料間の薬物−リンカー負荷が実質的に均一である、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗体コンジュゲート組成物が抗体当たり約4個の薬物−リンカーの平均薬物−リンカー負荷を有する、請求項14に記載の方法。
- 前記抗体含有試料が細胞培養上清試料である、請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞培養上清が非精製ハイブリドーマ細胞培養上清である、請求項16に記載の方法。
- 前記細胞培養上清が非精製CHO細胞培養上清である、請求項16に記載の方法。
- 抗体産生に用いた細胞培養培地の実質的にすべてがIgG枯渇培地であった、請求項16、17又は18のいずれか一項に記載の方法。
- 前記固体支持体を前記細胞培養上清に加える、請求項16、17、18又は19のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗体コンジュゲートの活性についてアッセイするステップをさらに含む、請求項1〜20のいずれか一項に記載の方法。
- 第1および第2の前記抗体コンジュゲート組成物を構成する前記抗体間の比較を、対応する前記抗体コンジュゲートの活性に基づいて行うステップを含む、請求項21に記載の方法。
- 前記活性が細胞傷害性である、請求項22に記載の方法。
- ハイスループットスクリーニングアッセイに用いるための抗体コンジュゲートを作製するための方法であって、
複数のハイブリドーマクローンから産生される定量化されていない抗体を含む未精製ハイブリドーマ上清の複数の試料を供給するステップであって、ここで、該複数の該試料の大多数において各試料に存在する抗体の実質的にすべてが単一ハイブリドーマクローンからのものであるという条件で、該複数の試料が抗体量及び抗体配列に関して様々である、ステップと、
該定量化されていない抗体を固体支持体上に固定して、固定化抗体を含む複数の試料を供給するステップと、
該固定化抗体の鎖間ジスルフィドを完全に還元して、還元した固定化抗体を含む複数の試料を供給するステップと、
該還元した固定化抗体を、キャッピング剤、薬物又は薬物−リンカー及び検出剤と反応させて、固定化抗体コンジュゲートを供給するステップであって、ここで、該キャッピング剤、薬物又は薬物−リンカー及び検出剤が反応性チオールと選択的に反応し、該キャッピング剤、薬物又は薬物−リンカー及び任意選択の検出剤がモル過剰で供給され、該キャッピング剤、薬物又は薬物−リンカー及び検出剤の比率が、所望のレベルの薬物負荷を達成するように選択される、ステップと、
該固体支持体から該固定化抗体コンジュゲートを溶出して、複数の抗体コンジュゲート組成物を供給するステップと
を含む方法。 - 前記抗体コンジュゲート組成物中に存在する前記抗体の実際量又は相対量を決定するステップと、前記抗体コンジュゲートの活性をアッセイするステップと、該アッセイの結果及び該抗体コンジュゲート組成物中に存在する該抗体の実際量又は相対量に基づいて、所望の特性を有する抗体を選択するステップとをさらに含む、請求項24に記載の方法。
- 抗体産生のために用いた細胞培養培地の実質的にすべてがIgG枯渇培地であった、請求項24又は25に記載の方法。
- 1μg〜100μgの抗体がハイブリドーマ上清の各試料中に存在する、請求項24又は25又は26に記載の方法。
- 1μg〜50μgの抗体がハイブリドーマ上清の各試料中に存在する、請求項27に記載の方法。
- 1μg〜20μgの抗体がハイブリドーマ上清の各試料中に存在する、請求項28に記載の方法。
- 前記検出剤が蛍光標識である、請求項24から29のいずれか一項に記載の方法。
- 前記キャッピング剤、薬物又は薬物−リンカー及び検出剤がマレイミド基を含む、請求項24から30のいずれか一項に記載の方法。
- 抗体スクリーニングアッセイに用いるための抗体コンジュゲートを作製するための方法であって、
抗体量及び抗体配列に関して様々である、複数の抗体含有試料を、該複数の該抗体含有試料の大多数において、単一試料に存在する該抗体の実質的にすべてが同じ配列のものであるという条件で、供給するステップと、
該抗体を固体支持体上に固定して、固定化抗体を含む複数の試料を供給するステップと、
該固定化抗体の鎖間ジスルフィド結合を完全に還元して、還元した固定化抗体を含む複数の試料を供給するステップであって、ここで、該還元が鎖間ジスルフィド結合に対して選択的である、ステップと、
該還元した固定化抗体を、キャッピング剤、薬物又は薬物−リンカー及び必要に応じて検出剤と反応させて、固定化抗体コンジュゲートを含む複数の試料を供給するステップであって、ここで、該キャッピング剤、薬物又は薬物−リンカー及び任意選択の検出剤が反応性チオールと選択的に反応し、該キャッピング剤、薬物又は薬物−リンカー及び任意選択の検出剤がモル過剰で供給され、該キャッピング剤、薬物又は薬物−リンカー及び任意選択の検出剤の比率が、所望のレベルの薬物負荷を達成するように選択される、ステップと、
前記抗体コンジュゲートを溶出して、複数の抗体コンジュゲート組成物を供給するステップと
を含む方法。 - 抗体スクリーニングアッセイに用いるための抗体コンジュゲートを作製するための方法であって、
抗体量及び抗体配列に関して様々である、複数の抗体含有試料を、該複数の該抗体含有試料の大多数において、単一試料に存在する該抗体の実質的にすべてが同じ配列のものであるという条件で、供給するステップと、
該抗体を固体支持体上に固定して、固定化抗体を含む複数の試料を供給するステップと、
該固定化抗体の鎖間ジスルフィド結合を完全に還元して、還元した固定化抗体を含む複数の試料を供給するステップであって、ここで、該還元が鎖間ジスルフィド結合に対して選択的である、ステップと、
該還元した固定化抗体をキャッピング剤及び検出剤と反応させて、固定化抗体コンジュゲートを含む複数の試料を供給するステップであって、ここで、該キャッピング剤及び検出剤が反応性チオールと選択的に反応し、該キャッピング剤及び検出剤がモル過剰で供給され、該キャッピング剤及び検出剤の比率が、所望のレベルのキャッピング剤及び/又は検出剤負荷を達成するように選択される、ステップと、
該抗体コンジュゲートを溶出して、複数の抗体コンジュゲート組成物を供給するステップと
を含む方法。 - 抗体薬物コンジュゲートに用いるための抗体を選択するための方法であって、
抗体量及び抗体配列に関して様々である、複数の抗体含有試料を、該複数の該抗体含有試料の大多数において、単一試料に存在する該抗体の実質的にすべてが同じ配列のものであるという条件で、供給するステップと、
該抗体を固体支持体上に固定して、固定化抗体を含む複数の試料を供給するステップと、
該固定化抗体の鎖間ジスルフィド結合を完全に還元して、還元した固定化抗体を含む複数の試料を供給するステップであって、ここで、該還元が鎖間ジスルフィド結合に対して選択的である、ステップと、
該還元した固定化抗体をキャッピング剤、薬物又は薬物−リンカー及び必要に応じて検出剤と反応させて、固定化抗体コンジュゲートを含む複数の試料を供給するステップであって、ここで、該キャッピング剤、薬物又は薬物−リンカー及び任意選択の検出剤が反応性チオールと選択的に反応し、該キャッピング剤、薬物又は薬物−リンカー及び任意選択の検出剤がモル過剰で供給され、該キャッピング剤、薬物又は薬物−リンカー及び任意選択の検出剤の比率が、所望のレベルの薬物負荷を達成するように選択される、ステップと、
該抗体コンジュゲートを溶出して、遊離抗体コンジュゲートを含む複数の抗体コンジュゲート組成物を供給するステップと、
該抗体コンジュゲートの活性についてアッセイするステップと、
該アッセイの結果に基づいて抗体を選択するステップと
を含む方法。 - 抗体を選択するための方法であって、
抗体量及び抗体配列に関して様々である、複数の抗体含有試料を、該複数の該抗体含有試料の大多数において、単一試料に存在する抗体の実質的にすべてが同じ配列のものであるという条件で、供給するステップと、
該抗体を固体支持体上に固定して、固定化抗体を含む複数の試料を供給するステップと、
該固定化抗体の鎖間ジスルフィド結合を完全に還元して、還元した固定化抗体を含む複数の試料を供給するステップであって、ここで、該還元が鎖間ジスルフィド結合に対して選択的である、ステップと、
該還元した固定化抗体をキャッピング剤及び検出剤と反応させて、固定化抗体コンジュゲートを含む複数の試料を供給するステップであって、ここで、該キャッピング剤及び検出剤が反応性チオールと選択的に反応し、該キャッピング剤及び検出剤がモル過剰で供給され、該キャッピング剤及び検出剤の比率が、所望のレベルのキャッピング剤及び/又は検出剤負荷を達成するように選択される、ステップと、
該抗体コンジュゲートを溶出して、遊離抗体コンジュゲートを含む複数の抗体コンジュゲート組成物を供給するステップと、
該抗体コンジュゲートの活性についてアッセイするステップと、
該アッセイの結果に基づいて抗体を選択するステップと
を含む方法。
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