KR20210091752A - 여과 가능한 듀오카마이신 함유 항체-약물 접합체 조성물 및 관련 방법 - Google Patents

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Abstract

듀오카마이신계 항체-약물 접합체는, 물과 아세토니트릴의 용매 시스템을 함유하고 30% 내지 60% 아세토니트릴을 갖는 조성물에서 비접합형의 듀오카마이신 링커-약물로부터 용이하게 분리될 수 있다.

Description

여과 가능한 듀오카마이신 함유 항체-약물 접합체 조성물 및 관련 방법
본 발명은 듀오카마이신(duocarmycin) 함유 항체-약물 접합체(ADC) 및 임의적으로 비접합형의 듀오카마이신 링커-약물을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 특히, 조성물은 비접합형의 듀오카마이신 링커-약물(존재한다면)로부터의 ADC의 손쉬운 여과 및 분리를 허용한다.
본 발명은 조성물의 제조 및 듀오카마이신 함유 ADC 배치(batch)의 승인 방법에 관한 것이다.
모노클로날 항체(mAb)는 약학 산업에서 가장 중요한 작용제 중 하나이다. mAb는 또한 다양한 세포독성 약물에 접합되어 항체-약물 접합체 또는 "ADC"를 형성하고 있다. 일반적으로, 링커가 세포독성 약물을 mAb에 연결한다. 이에, ADC는 모노클로날 항체, 링커 및 세포독성 약물을 포함한다. 링커-약물은 표면-노출된 라이신(P. M. LoRusso et al., Clinical Cancer Research, 2011, 17 (20), 6437-6447) 또는 쇄간 디설파이드 결합의 환원을 통해 생성된 유리 시스테인(J. Katz et al., Clinical Cancer Research, 2011, 17 (20), 6428-6436; P. D Senter et al., Nature Biotechnology 2012, 30 (7), 631-637)의 측쇄를 이용하여 항체에 접합될 수 있다. 대안으로, 접합은 돌연변이된 mAb의 적절한 위치에서 조작된 시스테인 잔기의 측쇄를 통한 부위 특이적 접합일 수 있다(C. R. Behrens and B. Liu, MAbs, 2014, 6(1), 46-53).
듀오카마이신은 ADC에서 세포독성 약물로서 사용되어져 왔다 (W02008/083312, W02010/062171, WO2011/133039, WO2015/177360). 스트렙토마이세스(Streptomyces) 종의 배양액으로부터 최초 단리된 듀오카마이신은, 듀오카마이신 A, 듀오카마이신 SA, 및 CC-1065를 포함하는 항종양 항생제의 패밀리의 멤버이다. 듀오카마이신은 DNA의 마이너 그루브에 결합하고, 이어서 DNA의 비가역적 알킬화를 야기한다. 이것은 핵산 구조를 파괴하여 결국 종양 세포 사멸로 이어진다.
최근에, 듀오카마이신 함유 ADC 예컨대 트라스투주맙 듀오카마진(trastuzumab duocarmazine)(SYD985, 트라스투주맙 vc-seco-DUBA)이, 전임상 및 임상 개발에 들어갔다 (M.M.C. van der Lee et al., Molecular Cancer Therapeutics, 2015, 14(3), 692-703; J. Black et al., Molecular Cancer Therapeutics, 2016, 15 (8), 1900-1909; ClinicalTrials.gov NCT02277717). 잠재적인 항종양 활성을 기반으로 추가 듀오카마이신 함유 ADC가 조사될 것으로 기대된다.
ADC의 제조를 위한 산업적 프로세스에 있어, mAb에 링커-약물의 접합 후 다양한 정제 단계가 수행된다. 이러한 바이오치료제 분자의 배치(batch)간 재현성을 보장하기 위해 품질 관리 절차가 수행된다. 독성으로 인해, ADC 조성물에서 엄격하게 제어되어야하는 불순물 중 하나는 유리 링커 약물; 즉, 비접합형의 링커-약물의 함량이다.
유리 링커-약물 함량의 결정을 위해, 유리 링커-약물에 비해 ADC의 농도를 먼저 감소시킨 다음 유리 링커-약물의 양을 측정하는 것이 빈번하게 수행되고 있다. 그렇지 않으면, ADC의 고농도로 인해, 링커 약물의 매우 낮은 함량을 결정하는 것이 어려워진다. 실제로, ADC의 양은 대략 10 mg/ml일 수 있지만 유리 링커-약물의 양은 일반적으로 10 μg/ml 미만이고, 종종 0.2 μg/ml 또는 0.1 μg/ml와 같이 매우 적다. ADC의 과잉은 종종 일반적인 크로마토그래피 분석 기술에서 유리 링커-약물의 매우 작은 함량(있다면)을 은폐시키며; 예를 들어, 이러한 매우 낮은 농도는 유리 링커-약물이 다른 성분에 의해 왜곡되고/거나, 그렇지 않으면 검출 한계 아래에 있게 한다.
따라서, 통상적으로, 유리 링커-약물 함량은 잔여 수성 샘플로부터 ADC를 분리한 다음 (유리) 링커-약물의 존재에 대해 잔여 샘플을 분석하여 결정할 수 있다. 예를 들면, 약 30 kDa의 분자량 컷오프를 갖는 필터로 원심 여과를 사용하여 수성 샘플을 직접 여과하면 종종 ADC는 필터 상에 남아있으면서 유리 링커-약물을 함유하는 여과액을 얻을 수 있다 (WO2015/095953의 194면, 카텝신 B 링커 절단 분석 참조). 대안으로, 유리 링커-약물은, 샘플을 콜드 메탄올로 처리하고 이를 원심분리함으로써 ADC로부터 분리되며, 이에 ADC는 침강할 것이지만 비접합형의 링커-약물은 상청액에 잔류할 것이다 (L. Chen et al., MAbs, 2016, 8(7), 1210-1223 참조).
그러나, 본 발명자들은 듀오카마이신 링커-약물이 비정상적인 어려움을 나타내는 것을 발견했다. 당업계에 개시된 전형적인 여과 과정 또는 직접적인 침강은 듀오카마이신 함유 ADC로부터 유리 듀오카마이신 링커-약물을 적절하게 분리하지 못했다. 예를 들면, 여과 프로세스에서 유리 듀오카마이신 링커-약물은 여과액으로 필터를 통과하지 않고 대신에 듀오카마이신 함유 ADC와 함께 필터 상에 머무르는 경향이 있다. 이로 인해 불충분한 양의 유리 링커-약물이 여과액에서 포획되고 유리 링커-약물 함량의 결정을 부정확하게 한다. 이에, 듀오카마이신 함유 ADC로부터 유리 듀오카마이신 링커-약물을 분리하는 방법에 대한 필요성이 존재한다. 마찬가지로, 듀오카마이신 함유 ADC 및 듀오카마이신 링커-약물(존재한다면)을 포함하는 샘플에서 듀오카마이신 링커-약물을 검출하고 정량하는 방법에 대한 필요성이 존재한다.
본 발명은 여과를 통한 듀오카마이신 함유 ADC로부터 비접합형의 듀오카마이신 링커-약물의 분리를 아세토니트릴이 지원할 수 있다는 발견에 부분적으로 기초한다.
따라서, 본 발명의 제1 양태는 (a) 물과 아세토니트릴을 함유하는 용매 시스템; (b) 산; (c) 식 (I)의 항체-약물 접합체; 및 임의적으로 (d) 비접합형의 듀오카마이신 링커-약물을 포함하는 조성물에 관한 것이다:
Ab-(L-D)m (I),
여기서, Ab는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고, L-D는 듀오카마이신 링커-약물이고, m은 1 내지 12의 평균 DAR을 나타내며;
상기 조성물은 30% 내지 60%(v/v)의 상기 아세토니트릴, 바람직하게는 35% 내지 55%의 상기 아세토니트릴을 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태는, (i) 식 (I)의 항체-약물 접합체의 수용액 또는 동결건조 생성물로서, 임의적으로 비접합형의 듀오카마이신 링커-약물을 더 포함하는 상기 수용액 또는 동결건조 생성물을, (ii) 물, 아세토니트릴, 및 산을 포함하는 희석 매체와 배합하여 조성물을 형성하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다:
Ab-(L-D)m (I),
여기서, Ab는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고, L-D는 듀오카마이신 링커-약물이고, m은 1 내지 12의 평균 DAR을 나타내며, 상기 조성물은 30% 내지 60% (v/v), 바람직하게는 35% 내지 55%의 상기 아세토니트릴을 포함한다.
본 발명의 추가 양태는 하기 단계를 포함하는, 항체-약물 접합체 배치를 출시/승인하는 방법에 관한 것이다:
1) 항체-약물 접합체 배치로부터 샘플을 수득하는 단계로서, 상기 배치는 듀오카마이신 링커-약물과 접합된 항체, 및 임의적으로, 비접합형의 듀오카마이신 링커-약물을 포함하는 것인 단계;
2) 상기 샘플을, 물, 아세토니트릴, 및 산을 포함하는 희석 매체와 배합하여, 30% 내지 60%(v/v), 바람직하게는 35% 내지 55%의 상기 아세토니트릴을 포함하는 여과 가능한 조성물을 형성하는 단계;
3) 상기 여과 가능한 조성물을 여과하여, 상기 항체-약물 접합체를 실질적으로 함유하지 않은 여과액을 수득하는 단계;
4) 상기 여과액을 분석하여, 상기 여과액이 상기 비접합형의 듀오카마이신 링커-약물을 소정 수준 미만으로 함유하고 있는지를 결정하는 단계; 및
5) 상기 비접합형의 듀오카마이신 링커-약물이 상기 소정 수준 미만이면 상기 항체-약물 접합체 배치를 출시/승인하는 단계.
도 1은 실시예 1에 따른 비접합형의 듀오카마이신 링커-약물, vc-seco-DUBA의 크로마토그램을 도시한다.
도 2는 실시예 2의 크로마토그램을 도시하며, 여기서 트라스투주맙 듀오카마진 배치의 샘플이 분석되고 검출 가능한 유리 듀오카마이신 링커-약물이 없는 것으로 밝혀져 출시/승인 조건을 충족하는 배치였다.
도 3은 실시예 3의 3개의 크로마토그램을 도시하며, 여기서 아세토니트릴의 백분율은 크로마토그램이 내려감에 따라 증가하여 상단 크로마토그램은 30% 아세토니트릴을 사용하여 형성되었고, 중간 크로마토그램은 40% 아세토니트릴을 사용하여 형성되었으며, 하단 크로마토그램은 55% 아세토니트릴을 사용하여 형성되었다.
본 발명은 (a) 물과 아세토니트릴을 함유하는 용매 시스템; (b) 산; (c) 식 (I)의 항체-약물 접합체; 및 임의적으로 (d) 비접합형의 듀오카마이신 링커-약물을 포함하는 조성물에 관한 것이다:
Ab-(L-D)m (I),
여기서, Ab는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고, L-D는 듀오카마이신 링커-약물이고, m은 1 내지 12의 평균 약물-대-항체 비(DAR)를 나타내며;
상기 조성물은 30% 내지 60%(v/v), 바람직하게는 35% 내지 55%의 상기 아세토니트릴을 포함한다.
본 발명에 사용된 용매 시스템은 물과 아세토니트릴을 함유한다. 본원에서 사용되는 용어 "용매 시스템"은, 비접합형의 듀오카마이신 링커-약물을 용해시킬 수 있는 용매의 혼합물을 지칭한다. 전형적으로, 용매 시스템은 물과 아세토니트릴로 구성되지만, 일부 실시양태에서는 추가 용매가 존재할 수 있다. 예를 들면, 다른 수혼화성 유기 용매 예컨대 C1-C6 알콜(예를 들어, 메탄올 또는 에탄올) 또는 폴리올이 임의적으로 존재할 수 있다. 일반적으로, 임의의 추가 용매는 조성물의 20% (v/v) 미만; 전형적으로, 10% 미만; 및 종종 5% 미만을 구성한다. 일반적으로 용매 시스템은 물과 아세토니트릴로 이루어진다. 물은 품질에 있어 특별히 제약은 없지만, 실질적인 이유로 인해, 비교적 순수한 물, 예컨대 DI 수 및 더 바람직하게는 Milli-Q 수가 유리하게 사용된다.
아세토니트릴은 30% 내지 60% (v/v)의 농도로 사용된다. 60%를 초과하는 농도는 필터를 통해 듀오카마이신 함유 ADC가 너무 많이 누출되는 경향이 있다. 이러한 누출은 여과액이 저농도의 유리 링커-약물에 비해 너무 높은 ADC 농도를 갖도록 하여 유리 링커-약물의 양의 정확한 결정을 방해; 예를 들어 마스킹한다. 일반적으로, 샘플 중의 ADC의 1.0% 초과가 여과액으로 통과할 때 누출량이 너무 높으며, 전형적으로 0.5% 이하가 허용 가능하다. 종종, 누출이 있을 때, 여과액으로 들어가는 ADC의 양은 0.3% 이하, 더 빈번하게는 0.2% 이하, 일반적으로는 0.1% 이하이다. 한편, 30% 미만의 아세토니트릴의 농도는 불충분한 분리를 야기하는 경향이 있으며; 즉, 비접합형의 듀오카마이신 링커-약물(대부분)이 필터를 통과하지 못해 분리가 되지 않는다. 이론에 의해 구속되기를 원하는 것은 아니지만, 본 발명자들은 듀오카마이신 링커-약물(비접합형)과 듀오카마이신 함유 ADC 간의 소수성 상호작용이 분리를 방해하거나 지연시킨다는 이론을 세웠다. 용매 시스템의 일부로 충분한 양의 아세토니트릴을 추가하면 이러한 힘을 충분히 극복하여 여과에 의한 분리를 보다 쉽게 허용할 수 있다. 너무 많은 아세토니트릴을 첨가하지 않음으로써, 필터에 대한 손상이 방지되고 듀오카마이신 함유 ADC의 누출이 최소화되거나 방지된다. 더욱이, 30% 내지 60%(v/v)의 농도의 아세토니트릴은 ADC, 항체 또는 듀오카마이신 링커-약물의 안정성에 영향을 미치지 않는다. 이에, 본 발명자들은 놀랍게도, 유리 듀오카마이신 링커-약물이, 물, 산 및 30% 내지 60% (v/v), 바람직하게는 35% 내지 55%, 가장 바람직하게는 40%의 농도의 아세토니트릴을 포함하는 조성물에 배치될 때 용이하게 그리고 효율적으로 여과될 수 있음을 밝혀내었다.
본 발명에 사용하기에 적합한 산은 유기 산 또는 무기 미네랄 산이다. 전형적으로, 본 발명에 사용되는 산은 트리플루오로아세트산, 포름산 및 염산으로 이루어진 군에서 선택된다. 산의 양은 중요하지 않으며, 다만 조성물이 단지 약하게나마 산성이면 된다. 전형적으로, 산은 조성물이 pH 7 미만이도록 사용된다. 조성물은 0.01% 내지 5% (v/v), 또는 0.05% 내지 2%, 또는 0.05% 내지 1.5%, 또는 0.1% 내지 1%의 농도의 산을 가질 수 있다.
ADC 함량은 본 발명의 조성물에서 특별히 제한이 없다. 전형적으로, 조성물은 0.1 내지 100 mg/ml, 보다 전형적으로 0.5 내지 50 mg/ml, 일반적으로 1.0 내지 10 mg/ml의 농도의 ADC를 함유한다. 비접합형의 (유리) 듀오카마이신 링커-약물의 양은 전형적으로 0 내지 100 μg/ml, 보다 전형적으로 0 내지 10 μg/ml, 및 종종 0 내지 1 μg/ml이다. 다수의 실시양태에서, ADC 농도는 유리 듀오카마이신 링커-약물의 농도보다 적어도 1,000배 더 높다.
조성물은 추가 성분을 함유할 수 있다. 예를 들면, 버퍼 및/또는 염, 예컨대 컬럼 크로마토그래피 또는 UF/DF에서 일반적으로 사용되는 것들, 또는 당 예컨대 만니톨 및/또는 의약품으로도 알려진 최종 투여 제형에 존재할 수 있는 다른 부형제.
식 (I)의 ADC에서, Ab는 임의의 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 예를 들어, F(ab')2 또는 Fab' 단편, 단일쇄(sc) 항체, scFv, 단일 도메인(sd) 항체, 디아바디, 또는 미니바디일 수 있다. 일반적으로, 항체 또는 이의 임의의 항원 결합 단편은 치료 활성을 갖는 것이지만, ADC 분야에 공지된 바와 같이 이러한 독립적인 효능이 반드시 필요한 것은 아니다. 항체는 임의의 이소타입 예컨대 IgG, IgA 또는 IgM 항체일 수 있다. 바람직하게는, 항체는 IgG 항체, 더 바람직하게는 IgG1 또는 IgG2 항체이다. 항체는 키메라, 인간화 또는 인간일 수 있다. 바람직하게는, 항체는 인간화된 것이다. 더욱 더 바람직하게는, 항체는 인간화 또는 인간 IgG 항체, 가장 바람직하게는 인간화 또는 인간 IgG1 모노클로날 항체(mAb)이다. 바람직하게는, 상기 항체는 κ(카파) 경쇄, 즉, 인간화 또는 인간 IgG1-κ 항체를 갖는다.
명확성을 위해, "인간화" 항체는 비-인간 종, 흔히 마우스, 래트 또는 래빗으로부터의 항체에서 유래한 항원-결합 상보성 결정 영역(CDR)을 가지지만, 적어도 부분적으로 인간인 프레임워크를 갖는 항체를 지칭한다. 예를 들어, 비-인간 CDR은 중쇄(HC) 및 경쇄(LC)의 가변 영역의 인간 프레임워크(프레임워크 영역(FR) FR1, FR2, FR3 및 FR4) 내에 위치할 수 있으며; 즉, 완전 인간 프레임워크가 비-인간 CDR을 지지한다. 그러나, 인간 FR에서 선택된 아미노산은, 예를 들어 낮은 면역원성을 유지하면서 결합 친화도를 개선하기 위해 상응하는 비-인간 프레임워크 아미노산으로 교환될 수 있다. 나아가, 비-인간 프레임워크는 대부분 유지될 수 있으며, 비-인간 종 FR의 선택된 아미노산만이 항체의 결합 친화도를 유지하면서 면역 원성을 감소시키기 위해 상응하는 인간 아미노산으로 교환될 수 있다. 이러한 모든 옵션은 본 발명의 목적을 위해 "인간화" 가변 영역인 것으로 간주된다. 이에, 인간화 가변 영역은 인간 불변 영역과 조합되어 인간화 항체를 형성한다.
이들 항체는 재조합, 합성 또는 당업계에 공지된 다른 적합한 방법에 의해 생산될 수 있다.
항체는 단일특이성(즉, 하나의 항원에 대해 특이적임; 이러한 항원은 종간에 공통적이거나 종간에 유사한 아미노산 서열을 가질 수 있음) 또는 이중특이성(즉, 한 종의 서로 다른 두 항원에 대해 특이적임)일 수 있고, 아넥신 Al, B7H4, CA6, CA9, CA15-3, CA19-9, CA27-29, CA125, CA242 (암 항원 242), CCR2, CCR5, CD2, CD19, CD20, CD22, CD30 (종양 괴사 인자 8), CD33, CD37, CD38 (시클릭 ADP 리보스 하이드롤라제), CD40, CD44, CD47 (인테그린 관련 단백질), CD56 (신경 세포 접착 분자), CD70, CD74, CD79, CD115 (콜로니 자극 인자 1 수용체), CD123 (인터류킨-3 수용체), CD138 (신데칸 1), CD203c (ENPP3), CD303, CD333, CEA, CEACAM, CLCA-1 (C-형 렉틴-유사 분자-1), CLL-1, c-MET (간세포 성장 인자 수용체), Cripto, DLL3, EGFL, EGFR, EPCAM, EPh (예, EphA2 또는 EPhB3), ETBR (엔도텔린 타입 B 수용체), FAP, FcRL5 (Fc 수용체-유사 단백질 5, CD307), FGFR (예, FGFR3), FOLR1 (폴레이트 수용체 알파), GCC (구아닐릴 시클라제 C), GPNMB, HER2, HMW-MAA (고분자량 흑색종 관련 항원), 인테그린 α (예, ανβ3 및 ανβ5), IGF1R, TM4SF1(또는 L6 항원), 루이스(Lewis) A 유사 카보하이드레이트, 루이스 X, 루이스 Y (CD174), LIV1, 메소텔린 (MSLN), MN (CA9), MUC1, MUC16, NaPi2b, 넥틴-4, PD-1, PD-L1, PSMA, PTK7, SLC44A4, STEAP-l, 5T4 항원 (또는 TPBG, 영양막 당단백질), TF (조직 인자, 트롬보플라스틴, CD 142), TF-Ag, Tag72, TNFR, TROP2 (종양 관련 칼슘 신호 변환기 2), VEGFR 및 VLA로 이루어진 군에서 선택된 표적에 결합하는 적어도 하나의 HC 및 LC 가변 영역을 포함한다.
적합한 항체의 예는 블리나투모맙(blinatumomab)(CD19), 에프라투주맙(epratuzumab)(CD22), 이라투무맙(iratumumab) 및 브렌툭시맙(brentuximab)(CD30), 바다스툭시맙(vadastuximab)(CD33), 테툴루맙(tetulumab) (CD37), 이사툭시맙(isatuximab)(CD38), 비바투주맙(bivatuzumab)(CD44), 로르보투주맙(lorvotuzumab)(CD56), 보르세투주맙(vorsetuzumab)(CD70), 밀라투주맙(milatuzumab)(CD74), 폴라투주맙(polatuzumab)(CD79), 로발피투주맙(rovalpituzumab)(DLL3), 푸툭시맙(futuximab)(EGFR), 오포르투주맙(oportuzumab)(EPCAM), 파를레투주맙(farletuzumab)(FOLR1), 글렘바투무맙(glembatumumab)(GPNMB), 트라스투주맙(trastuzumab) 및 페르투주맙(pertuzumab)(HER2), 에타라시주맙(etaracizumab)(인테그린), 아네투맙(anetumab)(메소텔린), 판코맙(pankomab)(MUC1), 엔포르투맙(enfortumab)(넥틴-4), 및 H8, A1, 및 A3 (5T4 항원)을 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 식 (I)의 화합물의 Ab는 항-HER2 항체이며, 보다 바람직한 Ab는 항-HER2 항체 트라스투주맙이다.
본 발명의 맥락에서, 식 (I)의 화합물의 -L-D는 임의의 듀오카마이신 링커-약물 모이어티일 수 있다. 듀오카마이신 모이어티는 바람직하게는 하기 식 중 하나로 표시된다:
Figure pct00001
여기서,
R1, R2, 및 R3은 독립적으로 H, OH, SH, NH2, N3, NO2, NO, CF3, CN, C(O)NH2, C(O)H, C(O)0H, 할로겐, Ra, SRa, S(O)Ra, S(O)2Ra, S(O)ORa, S(O)2ORa, OS(O)Ra, OS(O)2Ra, OS(O)0Ra, OS(O)20Ra, ORa, NHRa, N(Ra)Rb, +N(Ra)(Rb)Rc, P(O)(ORa)(ORb), 0P(O)(ORa)(0Rb), SiRaRbRc, C(O)Ra, C(O)0Ra, C(O)N(Ra)Rb, OC(O)Ra, OC(O)ORa, OC (O)N(Ra)Rb, N(Ra)C(O)Rb, N(Ra)C(O)0Rb, N(Ra)C(O)N(Rb)Rc, 및 수용성 기로부터 선택되며, 여기서 Ra, Rb, 및 Rc는 독립적으로 H 및 임의적으로 치환된 (CH2CH2O)aaCH2CH2 X 1 Ra1, C1-15 알킬, C1-15 헤테로알킬, C3-15 시클로알킬, C1-15 헤테로시클로알킬, C5-15 아릴, 또는 C1-15 헤테로아릴로부터 선택되고, 이때 aa는 1 내지 1000에서 선택되고, X 1 은 O, S, 및 NRb1에서 선택되며, Rb1 및 Ra1은 독립적으로 H 및 C1-3 알킬에서 선택되고, 추가로, Ra, Rb, 및/또는 Rc에서 임의적인 치환기 중 하나 이상은 임의적으로 수용성 기일 수 있고 Ra, Rb, 및 Rc 중 2 이상은 임의적으로 하나 이상의 결합에 의해 결합되어 하나 이상의 임의적으로 치환된 카보사이클 및/또는 헤테로사이클을 형성할 수 있다.
링커 모이어티(-L-)는 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 약물을 부착시키기 위한 임의의 공지된 또는 적합한 모이어티일 수 있다. 일반적으로, 링커는 당업계에 공지된 바와 같이 특정 조건하에 절단 가능하여 항체로부터 약물을 방출시킨다.
항체(또는 이의 단편)에 결합하게 될 링커의 말단은 전형적으로, 비교적 온화한 조건하에 Ab의 천연 또는 비천연 아미노산과 반응할 수 있는 작용기를 함유한다. 이러한 반응기는 본원에서 반응성 모이어티(RM)로서 지칭된다. 반응성 모이어티의 예는, 카바모일 할라이드, 아실 할라이드, 활성 에스테르, 무수물, α-할로 아세틸, α-할로 아세트아미드, 말레이미드, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 디설파이드, 티올, 히드라진, 히드라지드, 술포닐 클로라이드, 알데히드, 메틸 케톤, 비닐 설폰, 할로 메틸, 및 메틸 설포네이트를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, RM은 하기와 같다:
Figure pct00002
여기서,
X 5 는 -Cl, -Br, -I, -F, -OH, -O-N-석신이미드, -O-(4-니트로페닐), -O-펜타플루오로페닐, -O-테트라플루오로페닐, -O-C(O)-R4, 및 -O-C(O)-0R4에서 선택되고;
X 6 은 -Cl, -Br, -I, -O-메실, -O-트리플릴, 및 -O-토실에서 선택되고;
R4는 분지형 또는 비분지형 C1-C10 알킬 또는 아릴이다.
듀오카마이신 링커-약물은 접합된 형태(-L-D)로 또는 "유리" 링커-약물로도 지칭되는 비접합 형태(L-D)로 표현될 수 있다. 따라서, 하기 식 (II) 및 (IV)는 각각 접합형 및 비접합형의 바람직한 듀오카마이신 링커-약물을 나타낸다. 마찬가지로, 식 (III) 및 (V)는 각각 접합형 및 비접합형의 대안적인 바람직한 듀오카마이신 링커-약물을 나타낸다:
Figure pct00003
Figure pct00004
여기서,
n은 0-3이고,
R5는 하기로부터 선택되고:
Figure pct00005
y는 1-16이고,
R6은 하기로부터 선택된다:
Figure pct00006
접합된 형태를 위한 식 (III) 및 비접합 형태를 위한 식 (V)로 표시된 대안적인 듀오카마이신 링커-약물은 이하에 제시된다:
Figure pct00007
여기서,
V 1 은 조건적으로 절단 가능한 또는 조건적으로 변형 가능한 모이어티이며, 화학적, 광화학적, 물리적, 생물학적, 또는 효소적 프로세스에 의해 절단 또는 변형될 수 있으며; Z는 듀오카마이신 유도체이고, n은 0, 1, 2, 또는 3이며; p는 0 또는 1이다.
바람직하게는, Z는 앞서 기술된 (또는 정의된) 바와 같은 하기 식의 듀오카마이신 모이어티이다:
Figure pct00008
본 발명에 사용하기 위한 이러한 듀오카마이신 모이어티(예, Z)의 구체적인 예는 하기를 포함한다:
Figure pct00009
Figure pct00010
듀오카마이신 링커-약물의 특히 바람직한 종은 이하에서 접합된 형태:
Figure pct00011
와 상응하는 비접합 형태(즉, vc-seco-DUBA):
Figure pct00012
로서 도시된다.
간결함을 위해, 듀오카마이신 링커-약물의 이하의 종은 단지 접합된 형태로 도시되지만, 당업자에 의해 이해되고 있는 바와 같이 상응하는 비접합 형태가 또한 고려되는 것으로 이해되어야 한다:
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
본 발명의 조성물은 유리 듀오카마이신 링커-약물로부터 듀오카마이신 함유 ADC의 단순한 여과를 통해 분리를 촉진하는데 유용하다. 이러한 분리는 다량의 ADC의 부담없이 매우 소량의 유리 링커-약물에 대한 여과액의 분석을 허용한다. 넓은 의미에서, 본 발명의 조성물은 ADC 조성물 중의 유리 링커-약물의 존재 및/또는 양에 대한 체크를 보다 정확하고 편리하며 실용적이게 한다.
유리 듀오카마이신 링커-약물의 양에 대한 검출 및/또는 정량화는 강력한 ADC 정제 공정의 개발, ADC 원약 또는 의약품의 품질 관리, 및 원약 또는 의약품의 안정성 테스트를 포함하여 몇몇 응용에 이르기까지 다양한 용도로 유용할 수 있다. ADC의 대부분의 제약 분야에서, 의도는 유리 링커-약물이 거의 또는 전혀 존재하지 않는 것임을 이해해야 한다. 듀오카마이신 약물은 강력하다. 항체, 또는 이의 항원 결합 단편에 접합되면, 듀오카마이신 약물은 항체-표적 부위에 세포독성 페이로드로서 전달된다. 그러나, 유리 듀오카마이신 링커-약물로서, 무작위로 건강한 세포가 파괴될 수 있고; 이에 유리 듀오카마이신 링커-약물의 양을 낮은 수준으로 엄격하게 제어할 필요가 있다. 듀오카마이신 함유 ADC에 상당한 양의 유리 듀오카마이신 링커-약물을 공급하면 환자에게 허용할 수 없는 위험을 초래할 수 있다. 따라서, 유리 듀오카마이신 링커-약물은 정제 프로토콜이 모든 유리 링커-약물을 희망적으로 제거했기 때문에 본 발명의 여과 가능한 조성물에 단지 임의적으로 존재한다. 존재 여부에 관계없이, ADC 조성물 중에 유리 듀오카마이신 링커-약물의 부재를 확인하고/거나 (존재한다면) 이의 양을 매우 낮은 검출 수준까지 정량화 할 수있는 방법을 갖는 것이 중요하다.
본 발명의 조성물은, 용매, 산, 및 ADC를 배합하는 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 성분의 첨가 순서 및 순차적 또는 동시 수행 여부는 제한되지 않는다. 빈번하게는, 그러나, 본 발명의 여과 가능한 조성물을 형성하기 위해, 수용액 또는 동결건조 생성물 형태의 ADC를, 물, 아세토니트릴, 및 산을 함유하는 희석 매체와 배합한다.
따라서, 본 발명의 또 다른 양태는 식 (I)의 ADC의 수용액(또는 동결건조 생성물)로서, 임의적으로 상응하는 비접합형의 듀오카마이신 링커-약물을 더 포함하는 수용액(또는 동결건조 생성물)을, (ii) 물, 아세토니트릴, 및 산을 포함하는 희석 매체와 배합하여, 30% 내지 60% (v/v), 바람직하게는 35% 내지 55%의 상기 아세토니트릴을 포함하는 본 발명의 여과 가능한 조성물을 형성하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다:
Ab-(L-D)m (I).
ADC의 수용액은 다양한 소스로부터 나올 수 있다. 예를 들면, ADC 수용액은, 링커-약물을 항체(또는 이의 항원 결합 단편)에 접합하는 접합 반응이 일어나는 반응 매체로부터, 또는 후속의 정제된 또는 단리된 접합 반응 생성물, 즉, 정제된 형태의 듀오카마이신 ADC, 예를 들어, 동결건조 생성물로부터 도출될 수 있다.
이들 ADC 수용액 중의 임의적인 유리 듀오카마이신 링커-약물은 전형적으로 미반응된 링커-약물이다. 접합 반응은 종종 몰 과잉의 링커-약물을 사용하기 때문에, 임의의 유리 듀오카마이신 링커-약물의 제거를 보장하기 위한 정제가 종종 사용된다.
따라서, 이러한 소스의 수용액은 접합 반응의 정도를 모니터링하거나 정제 프로토콜을 평가하기 위한 것일 수 있다.
ADC 수용액의 또 다른 소스는 최종 ADC 원약 또는 의약품으로부터 샘플을 추출하는 것이다. ADC는 전형적으로 주사 가능한 조성물로서 전달되며, 이에 의약품뿐만 아니라 원약이 종종 수용액의 형태이다. 이러한 수용액 중의 유리 듀오카마이신 링커-약물은, 존재한다면, 유리 듀오카마이신 링커-약물의 정제 동안 불완전한 제거 및/또는 ADC로부터 듀오카마이신 링커-약물의 의도하지 않은 절단으로 인해 발생할 수 있다. 이러한 소스는 시간 경과에 따른 ADC 조성물의 안정성을 결정하거나 모니터링하기 위한, 예를 들어 저장 조건 하에서 유리 링커-약물이 형성/절단되지 않는지 확인하기 위한 안정성 테스트 및/또는 참조 샘플로부터의 것일 수 있다.
대안으로, 원약 또는 의약품은 동결건조 형태("동결건조 생성물")일 수 있다. 동결건조 생성물은 전형적으로 물로 재구성되어 ADC 수용액을 형성한다. 이러한 재구성된 액체 조성물의 전부 또는 일부가 ADC 수용액으로서 작용할 수 있다. 또 다른 옵션은 중간 재구성 수용액을 제조하지 않고 동결건조 생성물을 본 발명의 희석 매체와 직접 배합하는 것이다.
당업자가 이해하고 있는 바와 같이, ADC 수용액은, 용액의 다양한 소스를 고려하여, 추가 성분, 예컨대 버퍼, 염, 당(예, 만니톨), 동결건조 케이킹제, 등을 함유할 수 있다. 게다가, 동결건조 생성물은 완충제, 동결보호제, 계면활성제, 안정제 등과 같은 추가 성분을 함유할 수 있다.
단일 희석 매체를 ADC 수용액 또는 동결건조 생성물에 추가하는 것은 본 발명의 여과 가능한 조성물을 형성하기 위한 편리한 방법이다. 희석 매체는, 물, 아세토니트릴, 및 산을, 원하는 아세토니트릴 농도, 예를 들어 30% 내지 60% (v/v), 바람직하게는 35% 내지 55%, 가장 바람직하게는 40%를 형성하기에 충분한 양으로 포함한다. 원하는 아세토니트릴 농도를 형성하기 위해 충분한 양의 희석 매체를 첨가함으로써, 본 발명의 여과 가능한 조성물은 단일 단계로 형성된다.
본 발명의 조성물은 ADC를 실질적으로 함유하지 않은 여과액을 형성하기 위해 필터를 통해 여과될 수 있다. 본 발명에서 사용시, 용어 "실질적으로 함유하지 않은"은, 본 발명의 조성물에 존재하는 ADC의 양을 1% 이하로 포함하는 여과액을 지칭한다. 전형적으로, 이 양은 0.5% 이하, 보다 전형적으로 0.2% 이하, 종종 0.1% 이하이다. 명확성을 위해, 본 발명의 조성물이 2.5 mg/ml의 ADC를 함유한다면, 1% 또는 0.025 mg/ml 이하의 ADC가 여과액에 존재할 수 있다.
당업자가 이해하고 있는 바와 같이, 필터는 항체 또는 항원-결합 단편의 분자량보다 3 내지 6배 더 작은 분자량 컷오프를 갖는다. 실제로, 필터는 1 내지 100 kDa, 더 바람직하게는 3kDa 내지 50kDa, 더욱 더 바람직하게는 10 내지 30 kDa 범위의 분자량 컷오프를 갖는다. 식 (I)의 ADC에 대해서는 10 kDa의 분자량 컷오프를 갖는 필터가 특히 바람직하다.
여과 기술은 특별히 제한이 없지만; 일반적으로 원심 여과가 가장 편리한 것으로 고려된다. 중력 여과를 사용할 수 있지만 완료하는 데 더 많은 시간이 걸린다. 다양한 상업용 원심 여과 장치가 알려져 있으며 이용 가능하다. 예를 들면, PALL 코포레이션은 Nanosep® (Omega) 및 Microsep® 원심분리 장치를 제조한다. 이러한 장치는 여과되는 샘플의 부피 사이즈에 있어 상이하다. 본 발명의 경우, 보다 작은 Nanosep® 사이즈가 종종 바람직하다 (예, 0.5 mL의 부피). 전형적으로, 원심분리의 지속시간은 10 내지 30분이고, 속도는 12,000 내지 15,000 g이다.
상응하는 유리 듀오카마이신 링커-약물로부터 ADC의 분리를 허용하는 임의의 적합한 필터 재료가 본 발명에서 사용될 수 있으며, 당업자에 의해 결정될 수 있다. 일부 필터 재료는 유기 용매(아세토니트릴)가 필터에 손상을 줄 수 있다는 점에서 다른 재료보다 더 견고하다. 이러한 손상으로 인해 필터 재료가 분리에 적합하지 않게 될 수 있으며, 예를 들어, 필터를 통해 ADC가 너무 많이 누출되도록하는 구멍이나 새는 곳이 발생할 수 있다. 시판용 필터 재료는 전형적으로 변성 나일론, 친수성 폴리프로필렌, 폴리에테르설폰 재료, 또는 변성 폴리에테르설폰 재료로 제조된 멤브레인을 포함한다. 본 발명의 목적상, 바람직한 필터 재료는 변성 폴리에테르설폰 재료, 예컨대 PALL Corp로부터 입수 가능한 시판용 Nanosep® Omega 필터 매체를 포함한다.
여과가 이루어지기 전에, 조성물을 균질화하는 것이 유용할 수 있다. 균질화는 조성물 내에서 아세토니트릴의 균일한 분포를 허용하는 임의의 적합한 장치로 수행될 수 있다. 균질화는 유리 듀오카마이신 링커-약물로부터 듀오카마이신 함유 ADC의 단순한 여과를 통한 분리를 더욱 촉진할 수 있다.
본 발명의 조성물이 필터에 적용된 후, 필터를 통해 나오는 액체, 즉 "여과액"은 실질적으로 식 (I)의 ADC를 함유하지 않을 것이다. 그런 다음 여과액을 듀오카마이신 링커-약물에 대해 분석하여, 존재한다면, 그리고 임의적으로, 여과액에 존재하는 농도를 결정할 수 있다. 임의의 적합한 기법이 사용될 수 있다. 전형적으로, (액체) 크로마토그래피 프로세스, 예컨대 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 또는 초고성능 액체 크로마토그래피(UPLC)가 사용된다. 전형적으로, 이용되는 크로마토그래피는 역상이며; 예컨대, 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC) 또는, 더 바람직하게는, 역상 초고성능 액체 크로마토그래피(RP-UPLC)이다. 당업자에게 알려진 바와 같이, 컬럼 패킹 재료, 이동상, 사용할 구배, 및 일반적인 로딩/결합 조건 및 용출 조건을 포함한 적합한 크로마토그래피 조건을 선택하는 것은 일상적인 기술의 문제이다. 비접합형의 듀오카마이신 링커-약물의 검출을 위해, 임의의 적합한 검출기가 본 발명에 사용될 수 있다. 전형적으로, UV 검출기가 사용된다. 유리하게는, UV 검출기와 결합된 UPLC가 소량의 비접합형의 듀오카마이신 링커-약물을 포함하는 샘플의 분석을 위한 우수한 솔루션을 제공한다.
상기 여과액에 존재하는 비접합형의 듀오카마이신 링커-약물(존재한다면)의 양의 측정(정량 측정)은 전형적으로 수용액에 함유된 유리 듀오카마이신 링커-약물의 양과 상관된다. 실질적으로 ADC를 함유하지 않은 여과액을 얻기 위해 여과 공정에서 본 발명의 조성물을 사용함으로써, 크로마토그래피 분리 및 검출은, 유리 링커-약물의 정량 한계가 0.2 μg/mgADC, 또는 그 미만일 수 있다. 즉, 정량 측정을 오리지널 ADC 수용액, 예컨대, 원약과 상관지음으로써, 유리 링커-약물의 양은, ADC 1 mg당 적어도 0.2 μg까지 측정될 수 있다. 실제로, 정량 한계는 그 보다 낮은, 예컨대 0.1 μg/mg 또는 0.01 μg/mg, 등일 수 있다.
본 발명의 특별한 적용은, 하기 단계를 포함하는, ADC 배치의 출시/승인 방법에 관한 것이다:
1) ADC 배치로부터 샘플을 수득하는 단계로서, 상기 배치는 듀오카마이신 링커-약물과 접합된 항체, 및 임의적으로, 비접합형의 듀오카마이신 링커-약물을 포함하는 것인 단계;
2) 상기 샘플을, 물, 아세토니트릴, 및 산을 포함하는 희석 매체와 배합하여, 30% 내지 60%(v/v), 바람직하게는 35% 내지 55%의 상기 아세토니트릴을 포함하는 여과 가능한 조성물을 형성하는 단계;
3) 상기 여과 가능한 조성물을 여과하여, 상기 ADC를 실질적으로 함유하지 않은 여과액을 수득하는 단계;
4) 상기 여과액을 분석하여, 상기 여과액이 상기 비접합형의 듀오카마이신 링커-약물을 소정 수준 미만으로 함유하고 있는지를 결정하는 단계; 및
5) 상기 비접합형의 듀오카마이신 링커-약물이 상기 소정 수준 미만이면 상기 ADC 배치를 출시/승인하는 단계.
본원에서 사용시, 용어 "항체-약물 접합체 배치" 또는 "ADC 배치"는, 모든 처리 단계를 완료하여 정제된 형태이고 임의적으로 부형제 예컨대 비경구 제제 또는 동결건조 생성물에 적합한 부형제를 함유하는 ADC의 상업적 규모의 생산을 의미한다. 실제로, ADC에 대한 배치 사이즈는 일반적으로 적어도 30 L이다. EMA, FDA 등과 같은 규제 당국은 다양한 순도 및 품질 표준을 충족하기 위해 이러한 상업용 의약품 배치를 요구한다. ADC의 경우, 순도 표준 중 하나는 유리 링커 약물의 양이다. 상기 방법은, 본 발명의 조성물과, 유리 링커-약물(있다면)의 존재를 더 잘 검출하기 위해 유리 듀오카마이신 링커-약물로부터 듀오카마이신 ADC를 분리하는데 있어서 이의 유리한 용도를 포함한다. 따라서, 여과액을, 일반적으로 RP-UPLC에 의해 분석하여, 비접합형의 듀오카마이신 링커-약물의 양이 규제 한계(즉, "소정 수준") 미만인지 결정한다. 소정 수준은 일반적으로 매우 낮으며, 종종, ADC의 양에 대해 0.2 μg/mg, 바람직하게는 0.1 μg/mg, 더 바람직하게는 0.02 μg/mg의 유리 듀오카마이신 링커-약물의 최대 양을 요구한다. 소정 수준의 결정은 수치 또는 검출 한계(LOD) 테스트로 행해질 수 있다. 후자의 경우에, 검출 한계는 소정 수준 이하일 수 있으며, 이에 음의 결과(유리 링커-약물 없음)는 소정 수준을 충족하는 (소정 수준 미만)인 것으로 간주된다. 정량 한계(LOQ)를 사용하여 유사한 전략을 사용할 수 있으며, 여기서 유리 링커-약물의 존재는 관찰되지만 정량 한계 미만이다. 정량 한계가 소정 수준 이하이기 때문에, 정량 한계 아래의 임의의 검출량은 소정 수준 미만으로 간주된다. 어느 경우든, 양이 소정 한계 미만이므로 수치가 결정되지 않더라도 배치가 승인될 수 있다.
샘플에서 비접합형의 듀오카마이신 링커-약물의 양이 소정 수준 미만인 것으로 나타나면, ADC 배치를 판매, 배송, 환자에 의한 사용 등을 위해 출시하거나 승인할 수 있다. 본 발명의 문맥상 용어 "출시/승인"은 적어도 유리 듀오카마이신 링커-약물 요건과 관련하여 ADC 배치의 충족을 의미한다. 유리 듀오카마이신 링커-약물이 소정 수준을 초과하는 샘플은 임상 시험에 출시하기에 적합하지 않거나 상업용 의약품으로 승인될 수 없다(판매 또는 사용 자격이 없음). 이러한 배치는 출시되거나 승인되지 않는다. 일반적으로, 의약품은 여러 품질 측정을 통과해야 하며 그 중 하나라도 실패하면 최종 출시 또는 승인이 차단된다. 따라서, 본 발명의 맥락에서 사용되는 출시/승인은 유리 듀오카마이신 링커-약물 함량과 관련하여 ADC 제품 배치의 출시 또는 승인을 얻는 것을 의미하며 반드시 배치의 최종 또는 종국적인 출시 및/또는 승인을 의미하지는 않는다.
전술한 발명은 여과액이 비접합형의 듀오카마이신 링커-약물을 함유하는지 여부를 결정하기 위해 상세히 설명되었지만, 다른 불순물을 결정하기 위해 유사한 방법이 적용될 수 있다는 것은 당업자에게 명백하다. 특히, 상기 조성물 및 이의 여과는 듀오카마이신 링커-약물 관련 불순물을 측정할 수 있는 샘플을 제공하는 데 유용하다. 본 발명에서 사용된 용어 "듀오카마이신 링커-약물 관련 불순물"은, 듀오카마이신 함유 ADC 원약 및 의약품의 합성, 정제 및 저장 동안 듀오카마이신 링커-약물의 분해로 인해 발생할 수 있는 불순물을 의미한다. 분자량이 2,000 Da 미만(일반적인 링커-약물의 분자량)인 이러한 저분자 불순물은 또한 독성을 유발할 수 있으며, 이에, 규제 당국은 이러한 불순물 중 하나 이상에 대해 최대 임계치(또는 소정 수준)을 설정할 수 있다. 본 발명의 방법으로 이들 불순물의 존재 및 정량적 측정이 확립될 수 있다.
하기의 실시예는 본 발명의 범위를 설명하기 위한 것이며 이에 의해 제한되지 않는다.
실시예
재료 및 방법
트라스투주맙 듀오카마진(SYD985) 및 링커-약물 vc-seco-DUBA(SYD980)를, WO2011/133039에 기재된 재료 및 절차를 이용하여 수득했다. 시약, 용매 및 버퍼는 상업적 공급업체로부터 조달되었다.
샘플 및 블랭크 샘플은 이하에 기재된 바와 같이 준비되었다.
샘플 준비 또는 블랭크 준비
듀오카마이신 함유 ADC(10 mg/mL) 및 임의의 비접합형의 일부 듀오카마이신 링커-약물을 포함하는 샘플 100 μL를 피펫을 이용하여 취하고 이를 10K 필터(Nanosep® Omega 원심분리 장치) 상에 도입했다. Milli-Q 수 및 0.13% 포름산 중의 53%의 아세토니트릴의 용액을 포함하는 희석 매체 300 μL를 필터 상에 추가했다. 샘플 및 희석 매체를 필터 상에서 (예, 볼텍스를 사용하여) 균질화하고 14,000 g에서 15분간 원심분리하여 여과액을 (예, 볼텍스를 사용하여) 균질화하고 HPLC 바이알로 옮겼다.
블랭크 준비는 상술한 것과 동일한 절차에 따랐지만, 듀오카마이신 함유 ADC 및 비접합형의 듀오카마이신 링커-약물을 포함하는 샘플 대신에 100 μL의 Milli-Q 수가 사용되었다.
외부 표준 샘플 준비
외부 표준 샘플이, 샘플 중의 비접합형의 듀오카마이신 링커-약물의 농도를 계산하기 위해 사용되었다. 외부 표준 샘플은 0.25 μg/mL의 비접합형의 듀오카마이신 링커-약물을 갖도록 준비되었다.
RP-UPLC
분석 목적을 위해 10 μL의 HPLC 바이알 샘플 또는 HPLC 블랭크 바이알 샘플을, 0.5 mL/min의 유속 및 45℃의 컬럼 온도에서 이소부틸 측쇄 및 TMS 엔드캡핑을 갖는 옥타데실 (C18) 유도 실리카의 역상 초고성능 액체 크로마토그래피(RP-UPLC) 컬럼(Kinetex 1.7 ㎛, XB-C18 100 Å, 100x2.1 mm, Phenomenex) 상에 주입했다. 용출 방법은 하기 표 1에 나타낸다. 이동상 A의 조성은 Milli-Q 수 중의 0.1% 포름산이고, 이동상 B의 조성은 아세토니트릴/메탄올 50/50 V/V 중의 0.1% 포름산이었다. 10 mm 분석 셀을 가진 UV-검출기가 장착된 역상 고성능 액체 크로마토그래피(UPLC) 시스템이 사용되었다. 흡광도가 325 nm에서 측정되었다. Waters Empower 소프트웨어를 사용하여 피크 면적을 결정했다. 비접합형의 듀오카마이신 링커-약물의 양은 식 (VI)를 이용하여 정량되었다:
Figure pct00016
CL-D는 샘플 중의 비접합형의 듀오카마이신 링커-약물의 농도이고, AL-D는 샘플 중의 비접합형의 듀오카마이신 링커-약물의 피크 면적이며, Cstd는 외부 표준 중의 비접합형의 듀오카마이신 링커-약물의 농도이고, N은 샘플의 희석 계수이고, Astd는 외부 표준 중의 비접합형의 듀오카마이신 함유 링커-약물의 평균 (적어도 3회 실행의 평균) 피크 면적이다.
듀오카마이신 관련 불순물의 양은 식 (VII)을 이용하여 계산된다:
Figure pct00017
Ci는 샘플 중의 듀오카마이신 관련 불순물의 농도이고, Ai는 샘플 중의 듀오카마이신 관련 불순물의 피크 면적이고, Cstd는 외부 표준 중의 비접합형의 듀오카마이신 링커-약물의 농도이고, N은 샘플의 희석 계수이고, Astd는 앞서 정의된 바와 같고, RRFi는 듀오카마이신 관련 불순물의 상대 반응 계수이다.
Figure pct00018
실시예 1 - 외부 표준 샘플
비접합형의 듀오카마이신 링커-약물 vc-seco-DUBA(SYD980)(0.25 μg/mL)를 앞서 논의한 RP-UPLC 방법을 사용하여 분석했다. 도 1은 이렇게 얻어진 크로마토그램을 나타낸다. 도 1은 6.205분에서 비접합형의 듀오카마이신 링커-약물(vc-seco-DUBA)에 상응하는 선명한 피크를 보여준다.
실시예 2 - ADC의 분석
트라스투주맙 듀오카마진 배치로부터의 샘플을 상기 샘플 제조 절차에 따라 처리하고 앞서 논의한 RP-UPLC 방법으로 분석했다. 얻어진 크로마토그램은 비접합형의 링커-약물 vc-seco-DUBA의 부존재를 나타내었다. 도 2는 이렇게 얻어진 크로마토그램을 나타내며, 6.2분 또는 그 부근에서 어떠한 피크도 검출되지 않았다. 분석은, 샘플 중의 유리 듀오카마이신 링커-약물의 양이 검출 한계 미만이고 이에 소정 수준 미만인 것으로 결정했다 (즉, 패스/페일 검출 시험). 이에, 배치의 출시/승인이 적절했다.
실시예 3 - 조성물의 비교
트라스투주맙 듀오카마진(10 mg/mL) 및 vc-seco-DUBA(0.25 μg/mL)를 포함하는 샘플 100 μL를 10K 필터(Nanosep® Omega 원심분리 장치) 상에 도입했다. 필터 상에 다른 퍼센티지로 사용된 물, 아세토니트릴(ACN) 또는 메탄올(MeOH)과 다양한 퍼센티지의 산(포름산, 트리플루오로아세트산(TFA), 또는 염산)을 포함한 희석 매체(300 μL)를 첨가했다. 샘플과 희석 매체를 필터 상에서 균질화하고 14,000 g에서 15분간 원심분리했다. 여과액을 균질화하고 HPLC 바이알로 옮겼다. 여과액 중의 vc-seco-DUBA(SYD980, 즉, 비접합형의 듀오카마이신 링커-약물)의 양을, 표 1에 제시된 구배 프로그램을 사용하여 RP-UPLC-UV에 의해 검출하고, 식 (VI)을 이용하여 정량했다. 결과가 표 2에 요약되어 있다.
Figure pct00019
제1 실험 시리즈는, 아세토니트릴이 비접합형의 듀오카마이신 링커-약물 vc-seco-DUBA로부터 트라스투주맙 듀오카마진의 단순한 여과를 통해 분리를 촉진한다는 것을 보여준다. vc-seco-DUBA의 최적의 회수율은 40%의 아세토니트릴을 포름산 또는 트리플루오로아세트산과 조합하여 이용했을 때 얻어졌다. 아세토니트릴 대신에 메탄올을 이용했을 때는 vc-seco-DUBA의 회수가 얻어질 수 없었다.
제2 실험 시리즈는, 아세토니트릴의 양의 증가가 vc-seco-DUBA 회수에 유익하다는 것을 보여주며, 회수율이 12%(25%의 아세토니트릴에서)에서 90%(50% 아세토니트릴에서)에 이른다. 아세토니트릴이 적어도 30%이면 얻어진 회수율은 허용 가능하다. 도 3은 실험 5(30% ACN), 실험 1(40% ACN), 및 실험 10(55% ACN) 각각으로부터 얻어진 크로마토그램을 내림차순으로 도시한다. 그래프에서 알 수 있듯이, 회수되는 유리 듀오카마이신 링커-약물의 양에 상응하는 대략 6.2분의 피크는 ACN의 퍼센티지가 증가할수록 증가한다.
제3 실험 시리즈는 산의 종류 또는 양의 영향을 추가로 조사했다. 결과는 산의 종류나 양이 중요하지 않고 조성물의 pH가 7 미만이면 충분함을 나타낸다.

Claims (15)

  1. (a) 물과 아세토니트릴을 함유하는 용매 시스템; (b) 산; (c) 식 (I)의 항체-약물 접합체, 및 임의적으로 (d) 비접합형의 듀오카마이신 링커-약물을 포함하는 조성물로서,
    Ab-(L-D)m (I),
    여기서, Ab는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고, L-D는 듀오카마이신 링커-약물이고, m은 1 내지 12의 평균 DAR을 나타내며;
    상기 조성물은 30% 내지 60%(v/v), 바람직하게는 35% 내지 55%의 상기 아세토니트릴을 포함하는 것인 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 상기 비접합형의 듀오카마이신 링커-약물을 더 포함하는 것인 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항체-약물 접합체는 0.1 내지 100 mg/ml, 바람직하게는 0.5 내지 50 mg/ml, 더 바람직하게는 1.0 내지 10 mg/ml의 농도로 함유되는 것인 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 산은 0.01% 내지 5%(v/v), 바람직하게는 0.05% 내지 2%, 더 바람직하게는 0.05% 내지 1.5%, 가장 바람직하게는 0.1% 내지 1%의 농도로 함유되는 것인 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 산은 트리플루오로아세트산, 포름산, 및 염산으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비접합형의 듀오카마이신 링커-약물은 식 (IV)로 표시되는 것인 조성물:
    Figure pct00020

    여기서, n은 0-3이고; R5는
    Figure pct00021

    로부터 선택되며;
    y는 1-16이고;
    R6은 하기로부터 선택된다:
    Figure pct00022
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비접합형의 듀오카마이신 링커-약물은 하기 식으로 표시되는 것인 조성물:
    Figure pct00023
    .
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Ab는 IgG 항체 또는 이의 항원 결합 단편인 조성물.
  9. (i) 임의적으로 비접합형의 듀오카마이신 링커-약물을 더 포함하는, 식 (I)의 항체-약물 접합체의 수용액 또는 동결건조 생성물을, (ii) 물, 아세토니트릴, 및 산을 포함하는 희석 매체와 배합하여 조성물을 형성하는 단계를 포함하는 방법으로서,
    Ab-(L-D)m (I),
    여기서, Ab는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고, L-D는 듀오카마이신 링커-약물이고, m은 1 내지 12의 평균 DAR을 나타내며, 상기 조성물은 30% 내지 60%(v/v), 바람직하게는 35% 내지 55%의 상기 아세토니트릴을 포함하는 것인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 3 kDa 내지 50 kDa 범위 내의 분자량 컷오프를 갖는 필터를 통해 상기 조성물을 여과하여, 상기 항체-약물 접합체를 실질적으로 함유하지 않은 여과액을 형성하는 단계를 더 포함하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 여과는 원심 여과인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 필터는 변성 폴리에테르설폰, 바람직하게는 나노셉 오메가(Nanosep Omega) 필터 매체를 포함하는 것인 방법.
  13. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 여과액을, 상기 비접합형의 듀오카마이신 링커-약물을 단리하기에 적합한 크로마토그래피 분리 공정에 적용하는 단계, 및 존재하는 경우, 상기 여과액 중에 존재하는 상기 비접합형의 듀오카마이신 링커-약물의 양을 측정하는 단계를 더 포함하는 방법.
  14. 항체-약물 접합체 배치(batch)를 출시/승인하는 방법으로서,
    1) 항체-약물 접합체 배치로부터 샘플을 수득하는 단계로서, 상기 배치는 듀오카마이신 링커-약물과 접합된 항체, 및 임의적으로, 비접합형의 듀오카마이신 링커-약물을 포함하는 것인 단계;
    2) 상기 샘플을, 물, 아세토니트릴, 및 산을 포함하는 희석 매체와 배합하여, 30% 내지 60%(v/v), 바람직하게는 35% 내지 55%의 상기 아세토니트릴을 포함하는 여과 가능한 조성물을 형성하는 단계;
    3) 상기 여과 가능한 조성물을 여과하여, 상기 항체-약물 접합체를 실질적으로 함유하지 않은 여과액을 수득하는 단계;
    4) 상기 여과액을 분석하여, 상기 여과액이 상기 비접합형의 듀오카마이신 링커-약물을 소정 수준 미만으로 함유하고 있는지를 결정하는 단계; 및
    5) 상기 비접합형의 듀오카마이신 링커-약물이 상기 소정 수준 미만이면 상기 항체-약물 접합체 배치를 출시/승인하는 단계
    를 포함하는, 항체-약물 접합체 배치를 출시/승인하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 소정 수준은, 항체-약물 접합체 1 mg당 0.2 μg 또는 그 미만인 샘플 중의 듀오카마이신 링커-약물의 농도에 상응하는 것인 방법.
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