JP2017502085A - Ｃｙｓ連結された抗体−薬物コンジュゲートの精製方法 - Google Patents

Ｃｙｓ連結された抗体−薬物コンジュゲートの精製方法 Download PDF

Info

Publication number
JP2017502085A
JP2017502085A JP2016563254A JP2016563254A JP2017502085A JP 2017502085 A JP2017502085 A JP 2017502085A JP 2016563254 A JP2016563254 A JP 2016563254A JP 2016563254 A JP2016563254 A JP 2016563254A JP 2017502085 A JP2017502085 A JP 2017502085A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
antibody
column
linked
cysteine
mixture
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP2016563254A
Other languages
English (en)
Other versions
JP6419844B2 (ja
Inventor
ロー・デ、ガイ
ベルステゲン、ルード・マルティン
コーマンズ、ルーディー・ジェラルドゥス・エリザベス
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Byondis BV
Original Assignee
Synthon Biopharmaceuticals BV
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=49911439&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=JP2017502085(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Synthon Biopharmaceuticals BV filed Critical Synthon Biopharmaceuticals BV
Publication of JP2017502085A publication Critical patent/JP2017502085A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP6419844B2 publication Critical patent/JP6419844B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/21—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates
    • A61K31/215—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids
    • A61K31/22—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids of acyclic acids, e.g. pravastatin
    • A61K31/223—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids of acyclic acids, e.g. pravastatin of alpha-aminoacids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/44—Antibodies bound to carriers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6889—Conjugates wherein the antibody being the modifying agent and wherein the linker, binder or spacer confers particular properties to the conjugates, e.g. peptidic enzyme-labile linkers or acid-labile linkers, providing for an acid-labile immuno conjugate wherein the drug may be released from its antibody conjugated part in an acidic, e.g. tumoural or environment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/32—Bonded phase chromatography
    • B01D15/325—Reversed phase
    • B01D15/327—Reversed phase with hydrophobic interaction
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/20—Partition-, reverse-phase or hydrophobic interaction chromatography

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

本発明は、非結合抗体の量が１０〜４０重量％の範囲にある、システイン連結された抗体−薬物コンジュゲートの混合物を、分析疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を使用して精製する方法に関する。混合物は、０．２〜１．５Ｍの塩水溶液を使用して分取ＨＩＣカラムに装入され、非結合抗体が流通画分に集められた後、システイン連結された抗体−薬物コンジュゲートの精製された混合物が、０〜１００ｍＭの塩水溶液を使用して溶離される。

Description

発明の分野
本発明は、システイン（Ｃｙｓ）連結された抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の混合物、特に、非結合抗体の量が１０〜４０重量％の範囲にある混合物の精製方法に関する。
このようなＣｙｓ連結ＡＤＣは、新たな標的がん治療において重要な役割を担うといえる。したがって、Ｃｙｓ連結ＡＤＣの混合物を精製するための工業（分取）規模の方法を手にすることは、このようなＡＤＣのさらなる商業的成功にとって重要な要件である。
発明の背景
近年では、多数のＡＤＣが前臨床および臨床開発に入っており、ここ数年で、２種のＡＤＣが市場での取引を承認されている。リンカー−薬物を（モノクローナル）抗体（ｍＡｂ）に結合させる、より最近の開発は別として、（前）臨床開発中のＡＤＣの大部分および現在市場取引されている２種のＡＤＣにおける薬物は、リシン残基のＮ原子またはシステイン残基のＳ原子の何れかを介して抗体に連結されている。市場取引されている製品であるＫａｄｃｙｌａ（登録商標）またはａｄｏ−トラスツズマブエムタンシン（Ｒｏｃｈｅ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ ＩｍｍｕｎｏＧｅｎ）は、リシン連結されたＡＤＣの一例であり、Ａｄｃｅｔｒｉｓ（登録商標）またはブレンツキシマブベドチン（Ｓｅａｔｔｌｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ／Ｔａｋｅｄａ Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ）は、システイン連結されたＡＤＣの一例である。現在、（前）臨床開発中のＡＤＣの１つは、薬物デュオカルマイシンがシステイン残基を介してトラスツズマブに結合されている、以下に示す式（ＩＩ）のシステイン連結ＡＤＣである。
ストレプトマイセス属（Streptomyces）の種の培養ブロスから最初に単離されたデュオカルマイシンは、デュオカルマイシンＡ、デュオカルマイシンＳＡ、およびＣＣ−１０６５を包含する抗腫瘍抗生物質のファミリーのメンバーである。これらの極めて強力な薬剤は、副溝にあるアデニンのＮ３位において配列選択的にＤＮＡをアルキル化して、アポトーシス細胞死機構に行きつく事象のカスケードを開始する能力から、その生物学的活性を得ているとされる。
Ｃｙｓ連結ＡＤＣを作製するために、抗体は通常、部分的に還元されて、１つ以上の鎖間ジスルフィド結合が、２つ以上の遊離システイン残基に変換される。次いで、遊離システイン残基のチオールまたはスルフヒドリル（ＳＨ）基が、引き続いてリンカー−薬物分子と結合されて、Ｃｙｓ連結ＡＤＣが生成される。通常、この結合プロセスによって、０、２、４、６、および８つのリンカー−薬物が積載された抗体からなる、ランダムな不均質混合物が得られる。薬物の抗体に対する平均比（ＤＡＲ）が小さいほど、反応混合物中の非結合抗体（ＤＡＲ０）の量は多くなる。
薬物積載は、たとえば、Ｋ．Ｊ．Ｈａｍｂｌｅｔｔら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １０（２００４）７０６３〜７０７０に記載されているように、ＡＤＣの抗腫瘍活性に影響を及ぼすことが知られている。薬物積載は、凝集のようなＣＭＣ（化学、製造、および品質管理）特性にも影響を及ぼす。
出願人によるＷＯ２０１１／１３３０３９は、ＤＮＡアルキル化剤であるＣＣ−１０６５の一連の新規な類似体およびその抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を開示している。例１５に、１．１モル当量の還元剤を使用して、ｍＡｂあたり２つの遊離チオール基を生じさせる、いくつかのトラスツズマブ−デュオカルマイシンコンジュゲートの調製が記載されている。失活させた後、ＡＤＣを、ｒ−プロテインＡカラムを使用して精製して、平均ＤＡＲがおよそ２であるリンカー−薬物コンジュゲートを得ている。
先行技術は、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）の、多くのモノクローナル抗体（ｍＡｂ）精製方法における洗練化（polishing）工程としての使用を開示している。このクロマトグラフィー方式は、凝集体除去に特に有用であり、この方式により、他のプロセス関連不純物、たとえば、宿主細胞タンパク質、ＤＮＡ、内毒素、浸出プロテインＡ、内因性ウイルスのクリアランスが良好になると記載されている。
ＨＩＣは、システイン連結ＡＤＣについてＤＡＲおよび薬物積載分布を（分析的に）求めるための十分に確立された方法でもある（Ｌａｕｒｅｎｔ Ｄｕｃｒｙ（編）、Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１０４５（２０１３） ２７５〜２８３）。Ｊｕｎ Ｏｕｙａｎｇによる、この書籍の第１７章には、２７６頁の図２に、Ｃｙｓ連結ＡＤＣ（すなわち、ＭＣ−ＶＣ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＥ）の典型的なＨＩＣクロマトグラムが示されている。塩濃度が漸減し、有機改質剤が漸増する勾配を用いた溶離が、薬物積載種のカラム保持に強い影響を与え、最も疎水性でない未結合形態（すなわち、非結合抗体、ＤＡＲ０）が最初に溶離され、最も疎水性である、８つのリンカー−薬物を有する抗体（ＤＡＲ８）が最後に溶離されると記載されている。２７９頁の表２のデータには、３．６の重量平均ＤＡＲで、Ｃｙｓ連結ＡＤＣの混合物が、非結合抗体を４．７％しか含有しないことが示されている。
ＵＳ４７７１１２８は、特に、有毒なリボソーム不活化タンパク質であるリシンＡに結合させた免疫グロブリン（抗体）について、ＨＩＣを使用して毒素コンジュゲートを単離および精製する方法を記載している。この方法は、未結合のリシンＡおよび凝集体をサイズクロマトグラフィー（すなわち、サイズ排除クロマトグラフィー、ＳＥＣ）でまず除去した後、疎水性ゲルクロマトグラフィー（すなわち、ＨＩＣ、Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−４Ｂを使用、体積７０ｍｌ）にかけるものであり、コンジュゲート混合物は、イオン強度が漸減する塩溶液での溶離によって分離されていた。結合されていない免疫グロブリンは、最初に溶離されていた。サイズ工程と後続のクロマトグラフィーによる分離工程の両方で使用された緩衝液は、約２０〜４０ｍｌ／ｈの流量で塩化ナトリウム（１Ｍ）を含有した。例１を参照のこと。別の態様では、第一のカラム体積のリン酸緩衝液／塩化ナトリウム（１．５Ｍ）溶液を約０．１３ｍｌ／ｈの流量で用い、未結合免疫グロブリンが除去され（例２を参照のこと）、１０〜６０体積％の有機溶媒（すなわち、例２では６０体積％のグリセロール）を含有する第二のカラム体積のリン酸緩衝液を用いて免疫コンジュゲートが取り出される、「高速流」クロマトグラフィーによる分離および精製（すなわち、Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−４Ｂを使用、カラム直径１ｃｍ、体積３．１４ｍｌ）が示されている。
先行技術で開示されている方法の主な欠点は、工業規模の方法に望ましくもなければ許容もされない、有機溶媒が使用されることである。
出願人が知る限り、先行技術において対処されていない問題は、ＡＤＣ精製方法の規模拡大である。
先行技術を再検討したところ、Ｃｙｓ連結ＡＤＣの混合物を精製する新たな方法が求められていることは明らかである。特に、時には４０重量％もの、比較的多い量の非結合抗体を含有するのが通常である、平均ＤＡＲが約２〜３であるＣｙｓ連結ＡＤＣの混合物の精製方法を、工業的分取規模で、いくつものクロマトグラフィー工程を使用する必要なく手にすることが望ましいことになる。
本発明は、システイン（Ｃｙｓ）連結された抗体−薬物コンジュゲートの混合物、特に、非結合抗体の量が１０〜４０重量％の範囲にある、平均ＤＡＲが約２〜３である混合物を精製する新たな方法に関する。
一側面において、本発明は、非結合抗体の量が１０〜４０重量％の範囲にある、システイン連結された抗体−薬物コンジュゲートの混合物の精製方法であって、
ａ．０．２〜１．５Ｍの塩水溶液中に混合物を用意することと、
ｂ．前記溶液を分取疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムに装入することと、
ｃ．非結合抗体を含有する、流通画分を収集することと、
ｄ．前記カラムを０．２〜１．５Ｍの塩水溶液で洗浄しながら、流通画分を収集することと、
ｅ．前記カラムを０〜１００ｍＭの塩水溶液で溶離して、システイン連結された抗体−薬物コンジュゲートの精製された混合物を得ること
とを含む精製方法を提供する。
本発明の特に好ましい態様では、システイン連結された抗体−薬物コンジュゲートの混合物は、式（ＩＩ）のものである。
式中、
Ａｂは、トラスツズマブであり、
ｑは、０〜８の範囲である。
図１は、還元剤の量がＤＡＲ種の分布に及ぼす影響の一例を示す。１．０当量の還元剤を使用するとき、非結合トラスツズマブ抗体ＤＡＲ０のパーセンテージは、約２０重量％である。 図２は、式（ＩＩ）によるシステイン連結された抗体−薬物コンジュゲートの混合物の、例３の精製による分取規模でのＨＩＣ精製の前後の分析ＨＩＣクロマトグラムを示す。 図３は、式（ＩＩ）によるシステイン連結された抗体−薬物コンジュゲートの混合物の、例４の精製による分取規模でのＨＩＣ精製の前後の分析ＨＩＣクロマトグラムを示す。
発明の詳細な説明
本発明によれば、非結合抗体の量が１０〜４０重量％の範囲にある、システイン連結された抗体−薬物コンジュゲート（Ｃｙｓ連結ＡＤＣ）の混合物が、疎水性相互作用クロマトグラフィーによって、非結合抗体（ＤＡＲ０）、および結合反応が完了した後に失活させるのが通常である非結合リンカー−薬物から、有利に精製できることが見出された。本発明による方法は、
ａ．０．２〜１．５Ｍの塩水溶液中に混合物を用意することと、
ｂ．前記溶液を分取疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムに装入することと、
ｃ．非結合抗体を含有する、流通画分を収集することと、
ｄ．前記カラムを０．２〜１．５Ｍの塩水溶液で洗浄しながら、流通画分を収集することと、
ｅ．前記カラムを０〜１００ｍＭの塩水溶液で溶離して、システイン連結された抗体−薬物コンジュゲートの精製された混合物を得ることと
とを含む。
本明細書の文脈では、「塩」は、「緩衝」（塩）を意味しない。本発明の方法に従って使用するのに適する塩および緩衝液の例は、以下に示される。本発明の方法では、緩衝塩水溶液を使用することが有利である。
本発明の方法によれば、水溶液だけが使用され、したがって、工程ａ、ｂ、ｄ、またはｅの何れにおいても、追加の有機溶媒は使用されない。明確に述べると、工程ｅは、塩なしで実施することができる。
請求項に係る方法は、２〜８つのリンカー−薬物を積載した抗体、非結合リンカー−薬物、および不純物、通常は凝集体からなる混合物が、カラム充填材料に結合するが、非結合抗体は、装入条件下で結合せず、カラムから洗い流され／カラムを流通するのを可能にする、カラム装入条件下で、Ｃｙｓ連結ＡＤＣの混合物を、塩水溶液中にて、ＨＩＣカラム充填材料と接触させるものである。より低濃度の塩水溶液で溶離すると、カラム充填材料に結合したままであり／カラムに留まっている、非結合リンカー−薬物および不純物から、Ｃｙｓ連結ＡＤＣが分離される。
装入（工程ｂ）および洗浄（工程ｄ）に使用する塩水溶液は、同じでも、異なってもよい。装入（工程ｂ）と洗浄（工程ｄ）に使用する塩水溶液が同じであることが有利である。
当業者に知られているとおり、またＵＳ２０１０００６９６１７の段落［００５７］に記載されているとおり、ＨＩＣカラムに関する最適な装入／結合および溶離条件は、いくつかの要素に左右される。したがって、たとえば、抗体、リンカー、および薬物の相違により、異なるＡＤＣ混合物の個々の保持特性は様々であるため、本発明によるＨＩＣカラムの操作条件を個別調整／最適化することが望ましくなる。この最適化は、主として、たとえば、具体的な何れかのＡＤＣのＤＡＲ２種の（相対）疎水性を求めることにより、精製しようとするＡＤＣ混合物の疎水性を明らかにし、カラム充填材料の（疎水性）を選択するものである。最適化はさらに、装入／結合用塩水溶液濃度、溶離用塩水溶液濃度、任意の緩衝塩の濃度、およびｐＨを選択／最適化するものでもある。
本発明による式（Ｉ）および（ＩＩ）のＣｙｓ連結ＡＤＣの混合物は、リンカー−薬物が、システイン残基のＳ原子を介して抗体に結合されている、すなわち、混合物は、システイン連結された抗体−薬物コンジュゲートである。通常、システイン残基は、抗体（Ａｂ）の重鎖および／または軽鎖に存在し、鎖間ジスルフィド結合を形成する、天然のシステイン残基である。本発明は、Ａｂ、より特段にはｍＡｂの鎖間ジスルフィド結合を介してリンカー−薬物が結合されているＡＤＣ化合物の精製に、特に注目している。たとえば、ＩｇＧ１抗体は、通常、４つすべてが抗体のヒンジ領域にある、４つの鎖間ジスルフィド結合を有しており、ジスルフィド結合が（部分的に）還元された後、リンカー−薬物が、遊離チオール基にランダムに取り付けられる。
本発明による式（Ｉ）および（ＩＩ）のＣｙｓ連結ＡＤＣ化合物の混合物は、当業者によく知られている方法および手順に従って得ることができる。鎖間ジスルフィド結合を介した結合は、前記ジスルフィド結合を完全または部分的に還元した後に行うことができる。このような化合物の調製に適する方法は、出願人によるＷＯ２０１１／１３３０３９の記述および例において見ることができる。特に、ＷＯ２０１１／１３３０３９の例１５には、トラスツズマブを部分的に還元して、ｍＡｂあたり２つの遊離チオール基を生じさせ、いくつかのリンカー−薬物と結合させて、平均ＤＡＲがおよそ２であるＡＤＣとしたことが記載されている。ＷＯ２００５／０８４３９０の例７および８には、抗体にリンカー−薬物ｖｃＭＭＡＥを（部分的に）積載するための、部分的還元、部分的還元／部分的再酸化、および完全還元戦略が記載されている。
本発明に従って精製される、システイン連結された抗体−薬物コンジュゲート（Ｃｙｓ連結ＡＤＣ）の混合物は、１０〜４０重量％の範囲、より特段には１０〜３５重量％の範囲、さらにより特段には１５〜３５重量％の範囲にある量の非結合抗体を含有する。結合後に存在する非結合抗体の量が減少すると、それと共に平均薬物対抗体比（ＤＡＲ）が増加することは当業界でよく知られている。一例として、本発明者らは、１．５当量より多い還元剤を使用して、モノクローナル抗体トラスツズマブの鎖間ジスルフィド架橋を還元すると、コンジュゲートの混合物中に１０重量％未満の非結合抗体（ＤＡＲ０）しか存在しないことを見出した。１．０当量の還元剤を使用するとき、最大でおよそ５０重量％の量のＤＡＲ２がコンジュゲートの混合物中に存在し、非結合抗体（ＤＡＲ０）トラスツズマブのパーセンテージは、約２０重量％である（図１を参照されたい）。還元剤：ｍＡｂの比によるＤＡＲ種の分布は、使用する反応物および反応条件に応じて様々となることを留意されたい。
本発明による方法は、平均ＤＡＲを約２〜３、より特段には２．６〜２．９、さらにより特段には２．７〜２．９にするように努めるとき、特に有利である。
本発明の方法に従って使用することになる分取ＨＩＣカラムは、市販品として入手可能であるどんな分取カラムでもよい。そのようなカラムおよび／または適切なカラム充填材料の供給元の例として、Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、およびＭｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅが挙げられる。
前記ＨＩＣカラムには、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ ｐｒｏｐｙｌ（Ｍｅｒｃｋ）、Ｆｒａｃｔｒｏｇｅｌ ＥＭＤ ｐｈｅｎｙｌ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、Ｂｕｔｙｌ−Ｓ ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、Ｏｃｔｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、Ｃａｐｔｏ Ｏｃｔｙｌ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、Ｃａｐｔｏ Ｂｕｔｙｌ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、Ｃａｐｔｏ Ｐｈｅｎｙｌ ＩｍｐＲｅｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、Ｃａｐｔｏ Ｂｕｔｙｌ ＩｍｐＲｅｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＰＰＧ−６００Ｍ（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ Ｈｅｘｙｌ−６５０（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ Ｂｕｔｙｌ−６５０（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ Ｐｈｅｎｙｌ−６５０（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ Ｅｔｈｅｒ−６５０（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｍａｃｒｏｐｒｅｐ ｔ−Ｂｕｔｙｌ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、Ｍａｃｒｏｐｒｅｐ ｐｈｅｎｙｌ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ Ｂｕｔｙｌ（ＪＮＣ Corporation）、Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ Ｐｈｅｎｙｌ（ＪＮＣ Corporation）、またはＰｏｒｏｓ ＨＰ２（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を充填することができる。
前記ＨＩＣカラムには、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅの樹脂であるＢｕｔｙｌ−Ｓ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＦＦ）、Ｃａｐｔｏ Ｏｃｔｙｌ、Ｏｃｔｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、Ｃａｐｔｏ Ｂｕｔｙｌ、Ｂｕｔｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、もしくはＣａｐｔｏ Ｂｕｔｙｌ ＩｍｐＲｅｓ、またはＴｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅの樹脂であるＴｏｙｏｐｅａｒｌ ＰＰＧ−６００Ｍを充填することが有利である。種々のカラム充填材料／樹脂の相対疎水性および他の多くの特徴は、供給元から入手することのできる、前記樹脂に関する案内書から導き出すことができる。本発明の方法によれば、ＨＩＣカラムには、Ｂｕｔｙｌ−Ｓ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ ＦＦ、Ｃａｐｔｏ Ｂｕｔｙｌ、Ｂｕｔｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ ＦＦ、Ｃａｐｔｏ Ｂｕｔｙｌ ＩｍｐＲｅｓ、またはＴｏｙｏｐｅａｒｌ ＰＰＧ−６００Ｍを充填することが好ましく、Ｂｕｔｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ ＦＦ、Ｃａｐｔｏ Ｂｕｔｙｌ ＩｍｐＲｅｓ、またはＴｏｙｏｐｅａｒｌ ＰＰＧ−６００Ｍを充填することがより好ましく、Ｂｕｔｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ ＦＦまたはＴｏｙｏｐｅａｒｌ ＰＰＧ−６００Ｍを充填することが最も好ましい。
通常、本発明の方法によれば、カラム床高さは、約２０〜２５ｃｍであり、約２０ｃｍであることが有利であり、カラムに対する圧力は、２バール未満に保たれる。
カラム寸法は、ＨＩＣカラムへ装入することが所望または要求されるＡＤＣ材料の量によって決定づけられる。当業者にはよく知られているように、装入することのできるＡＤＣ材料の量は、カラム内径およびカラム長さに伴って増加する。
本発明の方法に従って使用される分取ＨＩＣカラムは通常、直径が、４．０〜２，０００ｍｍ、好ましくは１５〜２，０００ｍｍ、より好ましくは８０〜２，０００ｍｍ、最も好ましくは４００〜２，０００ｍｍの範囲にある。カラムの直径が大きいほど、より多くのＡＤＣ材料をカラムの上部に装入することができる。カラム装入および洗浄条件は、非結合抗体（ＤＡＲ０）がカラムを流通するように選択されるので、カラムの収容力が増すことが有利である。たとえば、Ｃｙｓ連結ＡＤＣの混合物中に存在する非結合抗体の量が３０重量％である場合、本発明による精製方法では、前記カラムの装入をおよそ３０％多く見込んでおく。
本発明の方法に従って使用される分取カラムに装入されるＡＤＣ材料の量は通常、カラム充填材料に対して５〜５０ｇ／Ｌの範囲、好ましくは５〜４０ｇ／Ｌ、より好ましくは１０〜４０ｇ／Ｌ、さらにより好ましくは３０〜４０ｇ／Ｌの範囲にある。
本発明の方法によれば、有利なことに、２０〜２，０００ｇのバッチ量を精製することができ、本請求項に係るＨＩＣ精製方法は、ＧＭＰ（Good Manufacturing Practice、医薬品の製造および品質管理に関する基準）ＡＤＣ材料の工業規模生産に適するものになる。
カラム直径および長さとは別に、カラム充填材料の平均粒径（ｄ50,体積、累積体積分布の粒径中央値）も関係がある。
本発明の方法によれば、選択された粒径によって、最小の流量で良好な分離が可能になる。本発明の方法によれば、カラム充填材料は、粒径が３０〜１８０μｍの範囲にある。カラム充填材料は、粒径が３５〜１００μｍの範囲にあることが好ましく、カラム充填材料は、粒径が４５〜９０μｍの範囲にあることがより好ましい。
本発明の方法によれば、流量は、５０〜３００ｃｍ／ｈの範囲にある。流量は、好ましくは８０〜２５０ｃｍ／ｈ、より好ましくは１００〜２２０ｃｍ／ｈ、最も好ましくは約１００〜１１０ｃｍ／ｈの範囲である。
本発明の方法によれば、工程ｅにおける溶離は、通常方式（すなわち、溶離の際の流れが、装入および洗浄の際の流れと同じ方向である）または逆方式（すなわち、溶離の際の流れが、装入および洗浄の際の流れと逆方向である）の何れかで実施される。Ｃｙｓ連結ＡＤＣの精製混合物の逆方式の溶離は、ＡＤＣの（結合反応）混合物を、たとえば、前記（結合反応）混合物を、請求項に係る精製方法の適用前に（たとえば活性炭素）濾過にかけることにより、未結合リンカー−薬物から精製する場合に特に有利である。
塩水溶液の塩は、チオシアン酸カリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化アンモニウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、および硫酸アンモニウムからなる群から選択されることが有利である。塩は、塩化ナトリウムまたは硫酸アンモニウムであることが好ましい。塩は、硫酸アンモニウムであることがより好ましい。
本発明の方法によれば、装入（工程ｂ）および洗浄（工程ｄ）用の塩水溶液の塩は、溶離（工程ｅ）用の塩水溶液の塩と同じでも異なってもよい。工程ｂ、ｄ、およびｅに同じ塩を使用することが有利である。
本発明の方法によれば、カラム装入（工程ｂ）およびカラム洗浄（工程ｄ）用の塩水溶液は、濃度が０．２〜１．５Ｍである。好ましくは、塩水溶液は、濃度が０．２〜１．０Ｍ、より好ましくは０．４５〜０．９Ｍ、最も好ましくは０．５５〜０．９Ｍである。
本発明の方法によれば、カラム溶離（工程ｅ）用の塩水溶液は、濃度が０〜１００ｍＭである。好ましくは、塩水溶液は、濃度が０〜９０ｍＭ、より好ましくは０〜８０ｍＭ、さらにより好ましくは０〜７０ｍＭ、最も好ましくは０〜５５ｍＭである。
本発明の方法によれば、塩水溶液は、緩衝液をさらに含有することが好ましい。塩水溶液は、濃度が０ｍＭであるとき（工程ｅ）、緩衝液を含有することが有利である。緩衝液は、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸アンモニウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、クエン酸アンモニウム、およびこれらの混合物からなる群から選択されることが有利である。緩衝液は、リン酸塩、酢酸塩、もしくはクエン酸塩、またはその混合物、たとえば、クエン酸塩−リン酸塩緩衝液であることが好ましい。緩衝液は、リン酸ナトリウムまたは酢酸ナトリウムであることがより好ましい。
本発明の方法によれば、カラム装入（工程ｂ）、洗浄（工程ｄ）および溶離（工程ｅ）用の緩衝液は、濃度が０〜１００ｍＭ、好ましくは０〜５０ｍＭ、より好ましくは２０〜３０ｍＭである。緩衝塩水溶液は、本発明の方法の全工程（工程ａ〜ｅ）で使用することが有利である。
本発明の方法に従って有利に使用される緩衝塩水溶液は、好ましくは、約４〜約８、より好ましくは約５〜約７、最も好ましくは約５．０〜約５．５のｐＨに緩衝される。
本発明の方法によるＡＤＣの疎水性相互作用クロマトグラフィーは、Ｃｙｓ連結ＡＤＣの精製混合物の分離および単離を実現するために、非結合抗体、８つまでのリンカー−薬物を積載する抗体、非結合リンカー−薬物、および不純物、すなわち凝集体の、疎水性の性質の差を利用している。抗体、ＡＤＣ、リンカー−薬物、または不純物の疎水性が強いほど、そのカラム充填材料との相互作用は大きくなる。
本発明の方法によれば、システイン連結された抗体−薬物コンジュゲートの混合物に含まれる所望のＡＤＣの疎水性は、分析ＨＩＣカラムでの保持時間を、基準、すなわち、市販品として入手可能なｍＡｂであるトラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）、Ｒｏｃｈｅ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）の保持時間と比較して割り出すことにより測定される。疎水性を測定するには、０．８Ｍ硫酸アンモニウム中に最終濃度１ｍｇ／ｍＬのシステイン連結された抗体−薬物コンジュゲートを含むＡＤＣサンプルを調製し、使用する分析ＨＩＣカラムは、ＴＳＫｇｅｌ Ｂｕｔｙｌ−ＮＰＲカラム（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）とする。１００％の緩衝液Ｃ（２５ｍＭのリン酸ナトリウム、１．５Ｍの硫酸アンモニウム、ｐＨ６．９５）から１００％の緩衝液Ｄ（２５ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ６．９５、２０％のイソプロパノール）への直線勾配を使用して、ＡＤＣサンプルを、０．４ｍｌ／分で２０分間で溶離し、ＡＤＣサンプルにおけるＤＡＲ２種の保持時間を、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））を基準として２１４ｎｍの吸光度で測定する。
本発明の方法によれば、前の段落に記載の分析ＨＩＣカラムおよび方法を使用すると、ＤＡＲ２ Ｃｙｓ連結ＡＤＣ種は、相対疎水性が、０．１〜０．６、特に０．２〜０．５、より特段には０．２〜０．４５の範囲にあり、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））は、保持時間（Ｒｔ）が６．７分である。
本発明による方法は、式（Ｉ）のシステイン連結された抗体−薬物コンジュゲートの混合物を精製するのに特に適する。
式中、
Ａｂは、抗体であり、
Ｌは、
から選択される連結基であり、
Ｖ1は、天然および／または非天然アミノ酸の、条件により切断可能なジペプチドであり、
ＣＬは、
から選択される環化リンカーであり、
ここで、ｎは、１〜１６の整数であり、
Ｒは、Ｈ、ＣＨ3、ＣＨ2ＣＨ3、ＯＣＨ3、ＯＣＨ2ＣＨ3、ＣＦ3、ＯＣＦ3、Ｃｌ、Ｆから選択され、
ｑは、０〜８の範囲であり、
ＤＢは、
から選択されるＤＮＡ結合性部分である。
このようなＣｙｓ連結ＡＤＣの混合物は、出願人によるＷＯ２０１０／０６２１７１およびＷＯ２０１１／１３３０３９に詳細に記載されている。
本発明の方法によれば、天然および／または非天然アミノ酸の、条件により切断可能なジペプチドは、フェニルアラニルリシン、バリルリシン、バリルアラニン、アラニルリシン、バリルシトルリン、Ｎ−メチルバリルシトルリン、フェニルアラニルシトルリン、イソロイシルシトルリン、トリプトファニルリシン、トリプトファニルシトルリン、フェニルアラニルアルギニン、フェニルアラニルアラニン、フェニルアラニル−Ｎ9−トシルアルギニン、フェニルアラニル−Ｎ9−ニトロアルギニン、ロイシルリシン、ロイシルシトルリン、およびフェニルアラニル−Ｏ−ベンゾイルトレオニンからなる群から選択することが有利である。ジペプチドは、フェニルアラニルリシン、バリルリシン、またはバリルシトルリンであることが好ましい。
本発明の方法によれば、Ａｂは、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２２抗体、抗ＣＤ３０抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＣＤ５６抗体、抗ＣＤ７０抗体、抗ＣＤ７４抗体、抗ＣＤ１３８抗体、抗ＣＬＬ−ｌ抗体、抗５Ｔ４抗体、抗ＣＤ３０３抗体、抗Ｔａｇ７２抗体、抗Ｌｅｗｉｓ Ａ様炭水化物抗体、抗ＥｐｈＢ３抗体、抗ＨＭＷ−ＭＡＡ抗体、抗ＣＤ３８抗体、抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体、抗ＥｐｈＡ２抗体、抗ＧＰＮＭＢ抗体、抗インテグリン抗体、抗ＭＮ抗体、抗ＨＥＲ２抗体、抗ＰＳＭＡ抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＣＤ２０３ｃ抗体、抗ＳＬＣ４４Ａ４抗体、抗ネクチン４抗体、抗メソセリン抗体、抗ＣＤ４４抗体、抗ＣＤ７９抗体、抗ＦｃＲＬ５抗体、抗ＭＵＣ１６抗体、抗ＮａＰｉ２ｂ抗体、抗ＳＴＥＡＰ−１抗体、抗ＥＴＢＲ抗体、抗ＴＦ抗体、抗ＭＵＣ１抗体、抗ＨＧＦＲ抗体、抗ＣＤ３７抗体、抗ＦＯＬＲ１抗体、抗ＣＥＡＣＡＭ抗体、抗ＴＲＯＰ２抗体、抗ＧＣＣ抗体、抗Ｌｅｗｉｓ Ｙ抗体、抗ＬＩＶ１抗体、抗ＤＬＬ３抗体、および抗ＥＰＣＡＭ抗体からなる群から選択される。抗体は、好ましくは、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）である。
本発明の方法によれば、Ａｂまたは好ましくはｍＡｂは、抗ＨＥＲ２抗体である。抗体は、抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体、特にトラスツズマブまたはそのバイオ後続品であることがより好ましい。
本発明の方法の具体的な態様では、式（ＩＩ）によるＣｙｓ連結ＡＤＣの混合物は、抗体トラスツズマブまたはそのバイオ後続品を使用して調製され、この抗体を、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ、抗体１モルあたり１．１モル当量）で還元し、式（ＩＩＩ）のリンカー−薬物（遊離チオール基あたり１．３モル当量）と反応させる。結合は、通常、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）またはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中、好ましくはＤＭＡｃ中で実施される。
本発明の方法のある特定の態様では、結合反応混合物を、Ｎ−アセチルシステイン原液（リンカー−薬物コンジュゲートあたり１モル当量）で処理して、式（ＩＩＩ）の非結合リンカー−薬物の反応性基をブロックする。
本発明の方法のある特定の態様では、結合反応混合物を濾過工程にかけて、式（ＩＩＩ）のリンカー−薬物の不溶性余剰分を除去する。反応混合物をカラムに装入する前に、余分なリンカー−薬物を除去すると、カラムの収容力は増大する。当業者によく知られているフィルターを使用することができる。通常、濾過工程は、プレフィルターに続いて、絶対孔径定格のフィルターを使用するものである。適切なプレフィルターは、活性炭を含有するデプスフィルターである。好ましいのは、ＺｅｔａＣａｒｂｏｎ ＳＬＰ（３Ｍ）などのフィルターである。
適切な絶対孔径フィルターは、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、酢酸セルロース（ＣＡ）、または二フッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）製である。好ましいフィルターは、通常は絶対孔径が０．２μｍである、ＰＶＤＦまたはＰＥＳフィルターである。
本発明の方法のある特定の態様では、結合反応混合物は、ｐＨ６．０〜６．５で最終濃度を２０〜３０ｍＭのリン酸ナトリウムおよび０．５５〜０．６５Ｍの硫酸アンモニウムに調整した、リン酸ナトリウムおよび硫酸アンモニウム（緩衝液Ａ）を使用して、ＨＩＣカラム精製用に調製される。
本発明の方法の代替的な態様では、結合反応混合物は、ｐＨ５．０〜５．５で、最終濃度を２０〜３０ｍＭの酢酸ナトリウムおよび０．５５〜０．９Ｍの硫酸アンモニウムに調整した、酢酸ナトリウムおよび硫酸アンモニウム（緩衝液Ａ）を使用して、ＨＩＣカラム精製用に調製される。
本発明の方法の具体的な態様では、方法は、ＨＩＣカラム（８ｃｍ×２０ｃｍ、Ｂｕｔｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ）を使用するものであり、３カラム体積の緩衝液Ａ（２０〜３０ｍＭのリン酸ナトリウム、０．５５〜０．６５Ｍの硫酸アンモニウム、ｐＨ６．０〜６．５）によって、１００ｃｍ／ｈの流量でまず平衡化した後、緩衝液Ａ中の結合反応混合物をカラムに装入し（工程ｂ）、非結合抗体を含有する流通画分を収集する（工程ｃ）。
工程ｄは、ＨＩＣカラムを、３カラム体積の同じ緩衝液Ａ（２０〜３０ｍＭのリン酸ナトリウム、０．５５〜０．６５Ｍの硫酸アンモニウム、ｐＨ６．０〜６．５）によって１００ｃｍ／ｈの流量で洗浄しながら、流通画分を収集し、それによって、残りの量の非結合抗体を除去するものである。
工程ｅは、ＨＩＣカラムを、３カラム体積の緩衝液Ｂ（２０〜３０ｍＭのリン酸ナトリウム、４５〜５５ｍＭの硫酸アンモニウム、ｐＨ６．０〜６．５）によって１００ｃｍ／ｈの流量で溶離して、Ｃｙｓ連結ＡＤＣの精製された混合物を得るものである。前記の溶離は、通常方式または逆方式（上文で説明したとおり）の何れかで実施することができる。
本発明の方法の別の具体的な態様では、方法は、ＨＩＣカラム（１ｃｍ×２０ｃｍ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＰＰＧ−６００Ｍ）を使用するものであり、３カラム体積の緩衝液Ａ（２０〜３０ｍＭの酢酸ナトリウム、０．５５〜０．９Ｍの硫酸アンモニウム、ｐＨ５．０〜５．５）によって、１００ｃｍ／ｈの流量でまず平衡化した後、緩衝液Ａ中の結合反応混合物をカラムに装入し（工程ｂ）、非結合抗体を含有する流通画分を収集する（工程ｃ）。
装入後、ＨＩＣカラムを、３カラム体積の同じ緩衝液Ａ（２０〜３０ｍＭの酢酸ナトリウム、０．５５〜０．９Ｍの硫酸アンモニウム、ｐＨ５．０〜５．５）によって１００ｃｍ／ｈの流量で洗浄しながら、流通画分を収集し、それによって、残りの量の非結合抗体を除去する。
工程ｅは、ＨＩＣカラムを、３カラム体積の緩衝液Ｂ（２０〜３０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０〜５．５）によって５０〜１００ｃｍ／ｈの流量で溶離して、Ｃｙｓ連結ＡＤＣの精製された混合物を得るものである。前記の溶離は、通常方式または逆方式（上文で説明したとおり）の何れかで実施することができる。
結果として、Ｃｙｓ連結ＡＤＣの混合物が精製されて、所望のＤＡＲ２およびＤＡＲ４種が主に得られる。上記条件下では、ＤＡＲ６およびＤＡＲ８種のほとんど、非結合リンカー−薬物、ならびになんらかの凝集体不純物がＨＩＣカラムに残存する。ＨＩＣカラムを注入用水（ＷＦＩ）で洗浄することにより、ＤＡＲ６およびＤＡＲ８種ならびに非結合リンカー−薬物をカラムから溶離させることができる。
本発明による方法は、式（ＩＩ）のシステイン連結された抗体−薬物コンジュゲートの混合物を精製するのに特に適する。
式中、
Ａｂは、トラスツズマブであり、
ｑは、０〜８の範囲である。
本発明によるＣｙｓ連結ＡＤＣの混合物の精製方法を使用して、前記のＡＤＣ混合物から非結合抗体が著しく除去される結果として、平均ＤＡＲは増加する。たとえば、以下で例３に示すとおり、式（ＩＩ）によるＣｙｓ連結ＡＤＣ化合物の平均ＤＡＲは、ＨＩＣ精製後に、１．７５から２．５に増加する。
ＨＩＣ精製後、精製されたＣｙｓ連結ＡＤＣの緩衝液は、通常、凍結乾燥緩衝液に変更され、Ｃｙｓ連結ＡＤＣは、引き続いて、従来の方法および設備を使用して凍結乾燥されて、凍結乾燥ケーキが得られる。
［実施例］
例１
式（ＩＩＩ）の化合物のリンカー−薬物溶液の調製
アイソレーター（グローブボックス）防護環境において、十分な量の式（ＩＩＩ）の化合物の固体を秤量してボトルに入れた。固体を１００％ＤＭＡｃに溶解させて、濃度をおよそ２０ｍＭとした。次いで、換気フード下で、ボトルをアイソレーターから取り出し、換気フード下で、室温で保管し、光からは保護した。
正確な濃度を求めた後、リンカー−薬物溶液を４０ｍＭに希釈した。
例２
リンカー−薬物のトラスツズマブとの結合
抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体（ｍＡｂ）であるトラスツズマブを、式（ＩＩＩ）のリンカー−薬物に結合させて、式（ＩＩ）のシステイン連結された抗体−薬物コンジュゲートの混合物を得た。
取扱いはすべて、換気フード下で継続的に撹拌しながら行った。
結合させる直前に、トラスツズマブを４．２ｍＭのヒスチジン、５０ｍＭのトレハロース、０．０１％のポリソルベート２０、ｐＨ６に溶かした６０ｍｇ／ｍＬの溶液を、還元緩衝液（４．２ｍＭのヒスチジン、５０ｍＭのトレハロース、３ｍＭのＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、および１ｍＭのＴＣＥＰ、ｐＨ６）と２：１で混合した。ＴＣＥＰは、還元剤であり、トラスツズマブ１当量に対して１．１５モル当量のモル比で加えて、ｍＡｂあたり２つの遊離チオール基を生じさせる。室温で６０分間インキュベートした後、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）溶液（１００％）および式（ＩＩＩ）のリンカー−薬物（ＤＭＡｃ中１０ｍＭ、ｍＡｂに対して２．２当量）を、ＤＭＡｃの最終濃度が２．５％ｖ／ｖになるように加えた。
終夜結合させた後、混合物を活性炭フィルター（ＺｅｔａＣａｒｂｏｎ ＳＬＰ、３Ｍ）に続いて０．２μｍのポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）フィルターで濾過して、式（ＩＩＩ）のリンカー−薬物の不溶性余剰分を除去した。
図２Ａおよび３Ａに、得られた、２つの異なるバッチの結合反応混合物の、分析ＨＩＣカラム（以下に記載する）でのクロマトグラムを示す。検出可能なＤＡＲ８はなかった。平均ＤＡＲは、１．７５と算出された。
例３
ＨＩＣを使用する精製
クロマトグラフィー工程はすべて、室温で実施した。
上記で得られた結合反応混合物を、リン酸ナトリウム（８４ｍＭ）および硫酸アンモニウム（２．２１Ｍ）からなる緩衝液と、２体積の結合反応混合物に対して１体積の緩衝液の比で混合して、ｐＨ６．５で、最終濃度をリン酸ナトリウム（２６ｍＭ）および硫酸アンモニウム（０．６２Ｍ）にすることにより、ＨＩＣカラム精製用に準備した。
８ｃｍ×２０ｃｍ分取カラムに、Ｂｕｔｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を充填した。カラムを、３カラム体積の緩衝液Ａ（２６ｍＭのリン酸ナトリウム、０．６２Ｍの硫酸アンモニウム、ｐＨ６．５）によって、１００ｃｍ／ｈの流量で平衡化した。結合反応混合物を、カラム充填材料／樹脂あたり１０ｇ／Ｌまでカラムに装入した。流量を１００ｃｍ／ｈに設定した。こうした条件下では、非結合抗体（すなわち、トラスツズマブ）は、カラムに結合せず／流通し、３カラム体積の緩衝液Ａ（２６ｍＭのリン酸ナトリウム、０．６２Ｍの硫酸アンモニウム、ｐＨ６．５）によって、１００ｃｍ／ｈの流量で、カラムからさらに洗い流された。装入と洗浄の流通画分を収集し、合わせた。システイン連結された抗体−薬物コンジュゲートのＤＡＲ２およびＤＡＲ４種の溶離は、３カラム体積の緩衝液Ｂ（２５ｍＭのリン酸ナトリウム、５０ｍＭの硫酸アンモニウム、ｐＨ６．２）によって、１００ｃｍ／ｈの流量で溶離することにより実現した。こうした条件下では、いくらかの残された非結合リンカー−薬物およびほとんどのＤＡＲ６システイン連結抗体−薬物コンジュゲートがカラムに残った。カラムを、２カラム体積の注入用水（ＷＦＩ）によって、１００ｃｍ／ｈの流量で洗浄すると、いくらかの残された非結合リンカー−薬物およびほとんどのＤＡＲ６システイン連結抗体−薬物コンジュゲートが溶離された。
図２Ｂに、分取規模でのＨＩＣ精製後の分析ＨＩＣカラム（以下に記載する）での結合反応混合物のクロマトグラムを示す。検出可能なＤＡＲ０はなかった。平均ＤＡＲは、２．５０と算出された。
例４
ＨＩＣを使用する代替精製
クロマトグラフィー工程はすべて、室温で実施した。
上記で得られた結合反応混合物の別個のバッチを、酢酸ナトリウム（７５ｍＭ）および硫酸アンモニウム（２．４Ｍ）からなる緩衝液と、２体積の結合反応混合物に対して１体積の緩衝液の比で混合して、ｐＨ５．３で、最終濃度を酢酸ナトリウム（２５ｍＭ）および硫酸アンモニウム（０．８Ｍ）にすることにより、ＨＩＣカラム精製用に準備した。
１ｃｍ×２０ｃｍ分取カラムに、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＰＰＧ−６００Ｍ（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を充填した。カラムを、３カラム体積の緩衝液Ａ（２５ｍＭの酢酸ナトリウム、０．８Ｍの硫酸アンモニウム、ｐＨ５．３）によって１００ｃｍ／ｈの流量で平衡化した。結合反応混合物を、カラム充填材料／樹脂に対して３５ｇ／Ｌまでカラムに装入した。流量を１００ｃｍ／ｈに設定した。こうした条件下では、非結合抗体（すなわち、トラスツズマブ）は、カラムに結合せず／流通し、３．５カラム体積の緩衝液Ａ（２５ｍＭの酢酸ナトリウム、０．８Ｍの硫酸アンモニウム、ｐＨ５．３）によって、１００ｃｍ／ｈの流量で、カラムからさらに洗い流された。装入と洗浄の流通画分を収集し、合わせた。システイン連結された抗体−薬物コンジュゲートのＤＡＲ２およびＤＡＲ４種の溶離は、３．５カラム体積の緩衝液Ｂ（２５ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．３）によって、１００ｃｍ／ｈの流量で溶離することにより、実現した。こうした条件下では、いくらかの残された非結合リンカー−薬物およびほとんどのＤＡＲ６システイン連結抗体−薬物コンジュゲートがカラムに残った。カラムを、２カラム体積の４０％イソプロパノールによって、１００ｃｍ／ｈの流量で洗浄すると、いくらかの残された非結合リンカー−薬物およびほとんどのＤＡＲ６システイン連結抗体−薬物コンジュゲートが溶離された。
図３Ｂに、分取規模でのＨＩＣ精製後の分析ＨＩＣカラム（以下に記載する）での結合反応混合物のクロマトグラムを示す。検出可能なＤＡＲ０はなかった。平均ＤＡＲは、２．８０と算出された。
例５
分析ＨＩＣを使用する分析
システイン連結された抗体−薬物コンジュゲートの分析を、分析疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）によって行った。１０μＬのシステイン連結された抗体−薬物コンジュゲートを９０μＬの０．８９Ｍ硫酸アンモニウム水溶液で希釈して、最終濃度を、０．８Ｍの硫酸アンモニウム中に１ｍｇ／ｍＬのシステイン連結された抗体−薬物コンジュゲートとすることにより、サンプルを調製した。１０μＬのサンプルをＴＳＫｇｅｌ Ｂｕｔｙｌ−ＮＰＲカラム（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に注入した。溶離方法は、０．４ｍｌ／分で２０分間の、１００％の緩衝液Ｃ（２５ｍＭのリン酸ナトリウム、１．５Ｍの硫酸アンモニウム、ｐＨ６．９５）から１００％の緩衝液Ｄ（２５ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ６．９５、２０％のイソプロパノール）への直線勾配からなるものとした。ＰＤＡ検出装置およびＥｍｐｏｗｅｒソフトウェアを備えたＷａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ Ｈ−Ｃｌａｓｓ ＵＰＬＣシステムを使用した。吸光度を２１４ｎｍで測定し、システイン連結された抗体−薬物コンジュゲートの保持時間を求めた。
上述のとおりに調製したトラスツズマブ／Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）のサンプルでも同じ分析方法を適用し、保持時間を２１４ｎｍで測定した。
例６
相対疎水性の算定
ＤＡＲ２システイン連結抗体−薬物コンジュゲート種の相対疎水性は、Ｃｙｓ連結ＡＤＣの混合物中の前記ＤＡＲ２種の保持時間（Ｒｔ）とトラスツズマブ／Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）の保持時間を使用し、次式：
［Ｒｔ（ＤＡＲ２）−Ｒｔ（トラスツズマブ／Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））］／Ｒｔ（トラスツズマブ／Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））
を使用して算出した。
トラスツズマブ／Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）の保持時間が６．７分であったとき、式（ＩＩ）のシステイン連結された抗体−薬物コンジュゲートのＤＡＲ２種は、上述の分析ＨＩＣカラムにおいて、９．６分の保持時間および０．４の相対疎水性を示した。

Claims (14)

  1. 非結合抗体の量が１０〜４０重量％の範囲にある、システイン連結された抗体−薬物コンジュゲートの混合物の精製方法であって、
    ａ．０．２〜１．５Ｍの塩水溶液中に前記混合物を用意することと、
    ｂ．前記溶液を分取疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムに装入することと、
    ｃ．非結合抗体を含有する、流通画分を収集することと、
    ｄ．前記カラムを０．２〜１．５Ｍの塩水溶液で洗浄しながら、前記流通画分を収集することと、
    ｅ．前記カラムを０〜１００ｍＭの塩水溶液で溶離して、システイン連結された抗体−薬物コンジュゲートの精製された混合物を得ること
    とを含む精製方法。
  2. 前記カラムに、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ ｐｒｏｐｙｌ、Ｆｒａｃｔｒｏｇｅｌ ＥＭＤ ｐｈｅｎｙｌ、Ｂｕｔｙｌ−Ｓ ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、Ｏｃｔｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、Ｃａｐｔｏ Ｏｃｔｙｌ、Ｃａｐｔｏ Ｂｕｔｙｌ、Ｃａｐｔｏ Ｐｈｅｎｙｌ ＩｍｐＲｅｓ、Ｃａｐｔｏ Ｂｕｔｙｌ ＩｍｐＲｅｓ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＰＰＧ−６００Ｍ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ Ｈｅｘｙｌ−６５０、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ Ｂｕｔｙｌ−６５０、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ Ｐｈｅｎｙｌ−６５０、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ Ｅｔｈｅｒ−６５０、Ｍａｃｒｏｐｒｅｐ ｔ−Ｂｕｔｙｌ、Ｍａｃｒｏｐｒｅｐ ｐｈｅｎｙｌ、Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ Ｂｕｔｙｌ、Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ Ｐｈｅｎｙｌ、またはＰｏｒｏｓ ＨＰ２が充填される、請求項１に記載の方法。
  3. 前記カラムが、４．０〜２，０００ｍｍ、好ましくは１５〜２，０００ｍｍの範囲の直径を有する、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記カラムへの装入が、カラム充填材料に対して５〜５０ｇ／Ｌ、好ましくは５〜４０ｇ／Ｌの範囲にある、請求項１から３の何れか一項に記載の方法。
  5. カラム充填材料が、３０〜１８０μｍの範囲の平均粒径を有する、請求項１から４の何れか一項に記載の方法。
  6. 前記塩水溶液の塩が、チオシアン酸カリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化アンモニウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、および硫酸アンモニウムからなる群から選択され、前記塩は、好ましくは、塩化ナトリウムまたは硫酸アンモニウムである、請求項１から５の何れか一項に記載の方法。
  7. 前記塩水溶液が、緩衝液をさらに含有する、請求項１から６の何れか一項に記載の方法。
  8. 前記緩衝液が、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸アンモニウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、クエン酸アンモニウム、およびこれらの混合物からなる群から選択され、前記緩衝液は、好ましくは、リン酸ナトリウムまたは酢酸ナトリウムである、請求項７に記載の方法。
  9. 前記塩水溶液が、約４〜約８のｐＨに緩衝される、請求項７または８に記載の方法。
  10. 工程ｅにおける前記溶離が逆方式で実施される、請求項１から９の何れか一項に記載の方法。
  11. 前記ＤＡＲ２システイン連結抗体−薬物コンジュゲートが、本明細書で定めるとおりの条件下、ＴＳＫｇｅｌ Ｂｕｔｙｌ−ＮＰＲ分析ＨＩＣカラムで測定したとき、トラスツズマブ／Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎを基準として０．１〜０．６の範囲の相対疎水性を有する、請求項１から１０の何れか一項に記載の方法。
  12. システイン連結された抗体−薬物コンジュゲートの前記混合物が、式（Ｉ）のもの
    ［式中、
    Ａｂは、抗体であり、
    Ｌは、
    から選択される連結基であり、
    Ｖ1は、天然および／または非天然アミノ酸の、条件により切断可能なジペプチドであり、
    ＣＬは、
    から選択される環化リンカーであり、
    ここで、ｎは、１〜１６の整数であり、
    Ｒは、Ｈ、ＣＨ3、ＣＨ2ＣＨ3、ＯＣＨ3、ＯＣＨ2ＣＨ3、ＣＦ3、ＯＣＦ3、Ｃｌ、Ｆから選択され、
    ｑは、０〜８の範囲であり、
    ＤＢは、
    から選択されるＤＮＡ結合性部分である］である、請求項１から１１の何れか一項に記載の方法。
  13. 前記Ａｂが、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２２抗体、抗ＣＤ３０抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＣＤ５６抗体、抗ＣＤ７０抗体、抗ＣＤ７４抗体、抗ＣＤ１３８抗体、抗ＣＬＬ−ｌ抗体、抗５Ｔ４抗体、抗ＣＤ３０３抗体、抗Ｔａｇ７２抗体、抗Ｌｅｗｉｓ Ａ様炭水化物抗体、抗ＥｐｈＢ３抗体、抗ＨＭＷ−ＭＡＡ抗体、抗ＣＤ３８抗体、抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体、抗ＥｐｈＡ２抗体、抗ＧＰＮＭＢ抗体、抗インテグリン抗体、抗ＭＮ抗体、抗ＨＥＲ２抗体、抗ＰＳＭＡ抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＣＤ２０３ｃ抗体、抗ＳＬＣ４４Ａ４抗体、抗ネクチン４抗体、抗メソセリン抗体、抗ＣＤ４４抗体、抗ＣＤ７９抗体、抗ＦｃＲＬ５抗体、抗ＭＵＣ１６抗体、抗ＮａＰｉ２ｂ抗体、抗ＳＴＥＡＰ−１抗体、抗ＥＴＢＲ抗体、抗ＴＦ抗体、抗ＭＵＣ１抗体、抗ＨＧＦＲ抗体、抗ＣＤ３７抗体、抗ＦＯＬＲ１抗体、抗ＣＥＡＣＡＭ抗体、抗ＴＲＯＰ２抗体、抗ＧＣＣ抗体、抗Ｌｅｗｉｓ Ｙ抗体、抗ＬＩＶ１抗体、抗ＤＬＬ３抗体、および抗ＥＰＣＡＭ抗体からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
  14. システイン連結された抗体−薬物コンジュゲートの前記混合物が、式（ＩＩ）のもの
    ［式中、
    Ａｂは、トラスツズマブであり、
    ｑは、０〜８の範囲である］である、請求項１から１３の何れか一項に記載の方法。
JP2016563254A 2014-01-10 2015-01-09 Ｃｙｓ連結された抗体−薬物コンジュゲートの精製方法 Active JP6419844B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP14150789 2014-01-10
EP14150789.7 2014-01-10
PCT/EP2015/050304 WO2015104359A2 (en) 2014-01-10 2015-01-09 Method for purifying cys-linked antibody-drug conjugates

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2017502085A true JP2017502085A (ja) 2017-01-19
JP6419844B2 JP6419844B2 (ja) 2018-11-07

Family

ID=49911439

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2016563254A Active JP6419844B2 (ja) 2014-01-10 2015-01-09 Ｃｙｓ連結された抗体−薬物コンジュゲートの精製方法

Country Status (22)

Country Link
US (1) US10266606B2 (ja)
EP (1) EP3092010B1 (ja)
JP (1) JP6419844B2 (ja)
KR (1) KR102323301B1 (ja)
CN (1) CN105899235B (ja)
AU (1) AU2015205574B2 (ja)
CA (1) CA2935456C (ja)
CL (1) CL2016001741A1 (ja)
CY (1) CY1120595T1 (ja)
DK (1) DK3092010T3 (ja)
ES (1) ES2687225T3 (ja)
HR (1) HRP20181525T1 (ja)
LT (1) LT3092010T (ja)
MX (1) MX2016009068A (ja)
MY (1) MY177390A (ja)
PL (1) PL3092010T3 (ja)
PT (1) PT3092010T (ja)
RU (1) RU2680404C2 (ja)
SG (1) SG11201605605SA (ja)
TR (1) TR201810856T4 (ja)
WO (1) WO2015104359A2 (ja)
ZA (1) ZA201604531B (ja)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9901567B2 (en) 2007-08-01 2018-02-27 Syntarga B.V. Substituted CC-1065 analogs and their conjugates
CA2796712C (en) 2010-04-21 2017-02-28 Syntarga B.V. Novel conjugates of cc-1065 analogs and bifunctional linkers
JP6224268B2 (ja) 2014-01-10 2017-11-01 シントン・バイオファーマシューティカルズ・ビー．ブイ．Ｓｙｎｔｈｏｎ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｂ．Ｖ． 子宮内膜癌の治療において使用するためのデュオカルマイシンａｄｃ
PL3092010T3 (pl) 2014-01-10 2019-01-31 Synthon Biopharmaceuticals B.V. Sposób oczyszczania połączonych cysteiną koniugatów przeciwciało-lek
MX368396B (es) 2014-01-10 2019-10-01 Synthon Biopharmaceuticals Bv Conjugados de anticuerpo-farmaco (adc) de duocarmicina que muestran actividad antitumoral in vivo mejorada.
KR102419766B1 (ko) 2014-05-22 2022-07-13 비온디스 비.브이. 항체에 대한 링커 약물의 부위 특이적 접합 및 그 결과로 얻어지는 adc
LT3152191T (lt) 2014-06-05 2019-08-26 Synthon Biopharmaceuticals B.V. Pagerintas duokarmicino provaistų gavimo būdas
LT3292149T (lt) 2015-05-04 2022-03-10 Cytomx Therapeutics, Inc. Aktyvinami antikūnai prieš cd71 ir jų naudojimo būdai
EP3442574A4 (en) 2016-04-15 2019-12-11 MacroGenics, Inc. NOVEL B7-H3 BINDING MOLECULES, THEIR ANTIBODY-MEDICINAL CONJUGATES AND METHODS OF USE
CA3050085A1 (en) 2017-01-20 2018-07-26 Juno Therapeutics Gmbh Cell surface conjugates and related cell compositions and methods
AU2018250336A1 (en) 2017-04-07 2019-09-26 Juno Therapeutics, Inc. Engineered cells expressing prostate-specific membrane antigen (PSMA) or a modified form thereof and related methods
KR20210038904A (ko) 2018-07-25 2021-04-08 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 항체-약물 콘쥬게이트의 효과적인 제조 방법
CN109336967A (zh) * 2018-11-09 2019-02-15 杭州奕安济世生物药业有限公司 基于混合填料的抗体纯化方法
CN114007737A (zh) * 2019-07-03 2022-02-01 默克专利股份公司 抗体药物缀合物纯化

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2013525347A (ja) * 2010-04-21 2013-06-20 シンタルガ・ビーブイ Ｃｃ−１０６５類似体の新規の複合体および二官能性リンカー

Family Cites Families (87)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1238907A (en) 1984-02-21 1988-07-05 Robert C. Kelly 1,2,8,8a-tetrahydrocyclopropa¬c|pyrrolo(3,2-e)- indol-4(5h)-ones and related compounds
US4771128A (en) 1986-10-10 1988-09-13 Cetus Corporation Method of purifying toxin conjugates using hydrophobic interaction chromatography
JP2598819B2 (ja) 1986-12-19 1997-04-09 ジ・アップジョン・カンパニー 新規なｃｃ‐１０６５同族体
US5541339A (en) 1988-09-12 1996-07-30 The Upjohn Company CC-1065 analogs having two CPI subunits
MX9203460A (es) 1988-09-12 1992-09-01 Upjohn Co Nuevos analogos cc-1065 que tienen dos subunidades cpi.
CA2078118C (en) 1990-04-25 1999-11-16 Paul A. Aristoff Cc-1065 analogs
JPH05268205A (ja) 1992-03-19 1993-10-15 Fujitsu Ltd クロック切換え回路
CA2076465C (en) 1992-03-25 2002-11-26 Ravi V. J. Chari Cell binding agent conjugates of analogues and derivatives of cc-1065
JP3514490B2 (ja) 1992-08-21 2004-03-31 杏林製薬株式会社 トリフルオロメチルピロロインドールカルボン酸エステル誘導体及びその製造方法
AU689566B2 (en) 1994-04-01 1998-04-02 Kyowa Hakko Kogyo Co. Ltd. DC-89 derivatives
JPH07309761A (ja) 1994-05-20 1995-11-28 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd デュオカルマイシン誘導体の安定化法
US5502068A (en) 1995-01-31 1996-03-26 Synphar Laboratories, Inc. Cyclopropylpyrroloindole-oligopeptide anticancer agents
US5646298A (en) 1995-06-07 1997-07-08 Procoron, Inc. Cyclopropylindole prodrugs
GB9516943D0 (en) 1995-08-18 1995-10-18 Cancer Soc Auckland Div Nz Inc Novel cyclopropylindoles and their secoprecursors,and their use as prodrugs
US6548530B1 (en) 1995-10-03 2003-04-15 The Scripps Research Institute CBI analogs of CC-1065 and the duocarmycins
ES2244991T3 (es) 1996-03-08 2005-12-16 The Scripps Research Institute Analogosmcbi de cc-1065 y las duocarmicinas.
US5843937A (en) 1996-05-23 1998-12-01 Panorama Research, Inc. DNA-binding indole derivatives, their prodrugs and immunoconjugates as anticancer agents
WO1997045411A1 (en) 1996-05-31 1997-12-04 The Scripps Research Institute Analogs of cc-1065 and the duocarmycins
WO1998011101A2 (en) 1996-09-12 1998-03-19 Cancer Research Campaign Technology Limited Condensed n-aclyindoles as antitumor agents
WO1998025900A1 (fr) 1996-12-13 1998-06-18 Shionogi & Co., Ltd. Composes presentant une activite antitumorale
GB9625913D0 (en) 1996-12-13 1997-01-29 Cancer Soc Auckland Div Nz Inc Novel cyclopropylindoles and their seco precursors,and their use as prodrugs
JP2002503228A (ja) 1997-05-22 2002-01-29 ザ スクリップス リサーチ インスティテュート デュオカルマイシンおよびｃｃ−１０６５の類似体
US6262271B1 (en) 1997-10-14 2001-07-17 The Scripps Research Institute ISO-CBI and ISO-CI analogs of CC-1065 and the duocarmycins
US20030036629A1 (en) 1997-12-12 2003-02-20 Barry Foster Novel tgf-beta protein purification methods
EP1280771B1 (de) 2000-05-02 2004-10-13 Tietze, Lutz F., Prof. Dr. Neue prodrugs von 6-hydroxy-2,3-dihydro-1h-indolen, 5-hydroxy-1,2-dihydro-3h-pyrrolo 3,2-e]indolen und 5-hydroxy-1,2-dihydro-3h-benzo e]indolen sowie von 6-hydroxy-1,2,3,4-tetrahydro-benzo f]chinolin-derivaten für eine selektive krebstherapie
WO2001083482A1 (en) 2000-05-03 2001-11-08 The Scripps Research Institute Dna alkylating agent and activation thereof
US6660742B2 (en) 2000-09-19 2003-12-09 Taiho Pharmaceutical Co. Ltd. Compositions and methods of the use thereof achiral analogues of CC-1065 and the duocarmycins
EP1363908A4 (en) 2001-01-24 2004-05-06 Auckland Uniservices Ltd ANTI-CANCER COMPLEXES 2,3-DIHYDRO-1H-PYRROLO 3,2-F] COBALT AND CHROME QUINOLINE
JP4862120B2 (ja) 2001-02-22 2012-01-25 ユニヴァーシティ オブ ブラッドフォード 腫瘍治療のためのプロドラッグとしてのベンズ−インドールおよびベンゾ−キノリン誘導体
ES2299560T3 (es) 2001-02-22 2008-06-01 University Of Bradford Derivados de pirrolindol y de pirroloquinolina como profarmacos para el tratamiento de tumores.
US7179921B2 (en) 2001-02-22 2007-02-20 School Of Pharmacy, University Of London Indoline and tetrahydro-quinolines as prodrugs for tumour treatment
EP1243276A1 (en) 2001-03-23 2002-09-25 Franciscus Marinus Hendrikus De Groot Elongated and multiple spacers containing activatible prodrugs
IL154183A0 (en) 2001-05-31 2003-07-31 Medarex Inc Cytotoxins, prodrugs, linkers and stabilizers useful therefor
JP2005502703A (ja) 2001-09-07 2005-01-27 ザ スクリプス リサーチ インスティテュート Ｃｃ−１０６５およびデュオカルマイシンのｃｂｉ類似体
WO2003026577A2 (en) 2001-09-24 2003-04-03 Seattle Genetics, Inc. P-amidobenzylethers in drug delivery agents
US6756397B2 (en) 2002-04-05 2004-06-29 Immunogen, Inc. Prodrugs of CC-1065 analogs
US7235578B2 (en) 2002-05-17 2007-06-26 Auckland Uniservices Limited Processes for preparing 3-substituted 1-(chloromethyl)-1,2-dihydro-3H-[ring fused indol-5-yl-(amine-derived)] compounds and analogues thereof, and to products obtained therefrom
AU2003294210A1 (en) 2002-07-31 2004-05-04 Seattle Genetics, Inc Anti-cd20 antibody-drug conjugates for the treatment of cancer and immune disorders
US7705045B2 (en) 2002-11-14 2010-04-27 Syntarga, B.V. Prodrugs built as multiple self-elimination-release spacers
DK1592457T3 (da) 2003-01-27 2012-10-22 Endocyte Inc Folat-vinblastin-konjugat som lægemiddel
US20070037739A1 (en) 2003-02-03 2007-02-15 Medlogics Device Corporation Compounds useful in coating stents to prevent and treat stenosis and restenosis
DE602004027888D1 (de) 2003-02-20 2010-08-12 Seattle Genetics Inc Anti-cd70 antikörper-arzneimittelkonjugate und ihr
WO2004101767A2 (en) 2003-05-13 2004-11-25 The Scripps Research Institute Cbi analogues of the duocarmycins and cc-1065
WO2005032594A2 (en) 2003-10-03 2005-04-14 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Alkylators linked to polyamides as dna binding agents
US7282590B2 (en) 2004-02-12 2007-10-16 The Research Foundation Of State University Of New York Drug conjugates
US7837980B2 (en) 2004-03-02 2010-11-23 Seattle Genetics, Inc. Partially loaded antibodies and methods of their conjugation
US20050265925A1 (en) 2004-04-21 2005-12-01 Samuel Zalipsky Releasable linkage and compositions containing same
US20050239864A1 (en) 2004-04-23 2005-10-27 Yuqiang Wang Novel tumor-selective chemotherapeutic agents
DE602005022239D1 (de) * 2004-04-23 2010-08-19 Conjuchem Biotechnologies Inc Festphase zur Verwendung in einem Verfahren zur Reinigung von Albuminkonjugaten
US7517903B2 (en) 2004-05-19 2009-04-14 Medarex, Inc. Cytotoxic compounds and conjugates
EP1765409A2 (en) 2004-06-30 2007-03-28 Novartis AG Conjugates of antibody and duocarmycin derivatives as antitumor agents
WO2006012527A1 (en) 2004-07-23 2006-02-02 Endocyte, Inc. Bivalent linkers and conjugates thereof
US20100041617A1 (en) 2004-09-27 2010-02-18 Jane Trepel Modulating mxa expression
NZ536107A (en) 2004-10-22 2007-06-29 Auckland Uniservices Ltd Nitrobenzindoles and their use in cancer therapy
US20090111805A1 (en) 2005-02-24 2009-04-30 Pfizer Inc. Bicyclic heteroaromatic derivatives useful as anticancer agents
US7714016B2 (en) 2005-04-08 2010-05-11 Medarex, Inc. Cytotoxic compounds and conjugates with cleavable substrates
EP1909846B1 (en) 2005-08-05 2018-12-26 Syntarga B.V. Triazole-containing releasable linkers, conjugates comprising the same and processes for their preparation
AU2006294554B2 (en) 2005-09-26 2013-03-21 E. R. Squibb & Sons, L.L.C. Antibody-drug conjugates and methods of use
WO2007051081A1 (en) 2005-10-26 2007-05-03 Medarex, Inc. Methods and compounds for preparing cc-1065 analogs
WO2007059404A2 (en) 2005-11-10 2007-05-24 Medarex, Inc. Duocarmycin derivatives as novel cytotoxic compounds and conjugates
MX2008009956A (es) 2006-02-02 2008-12-12 Syntarga Bv Analogos de cc-1065 solubles en agua y sus conjugados.
EP1832577A1 (en) 2006-03-07 2007-09-12 Sanofi-Aventis Improved prodrugs of CC-1065 analogs
NZ578354A (en) 2006-12-14 2012-01-12 Medarex Inc Antibody-partner molecule conjugates that bind cd70 and uses thereof
TWI412367B (zh) 2006-12-28 2013-10-21 Medarex Llc 化學鏈接劑與可裂解基質以及其之綴合物
JP2010519310A (ja) 2007-02-21 2010-06-03 メダレックス インコーポレイテッド 単一のアミノ酸を有する化学リンカーおよびその複合体
WO2009017394A1 (en) 2007-08-01 2009-02-05 Syntarga B.V. Substituted cc-1065 analogs and their conjugates
US9901567B2 (en) 2007-08-01 2018-02-27 Syntarga B.V. Substituted CC-1065 analogs and their conjugates
WO2009026274A1 (en) 2007-08-22 2009-02-26 Medarex, Inc. Site-specific attachment of drugs or other agents to engineered antibodies with c-terminal extensions
US8377981B2 (en) 2007-11-13 2013-02-19 The Scripps Research Institute CBI derivatives subject to reductive activation
CL2008003526A1 (es) 2007-11-30 2010-01-11 Medarex Inc Conjugado de anticuerpo-molécula asociada que comprende un anticuerpo monoclonal humano anti b7-h4/08e/b7x/b7s1/bl-cam/b3/leu-14/lyb-8 humana; composición que lo comprende; método in vitro de inhibición de célula tumoral que expresa b7-h4/08e/b7x/b7s1/bl-cam/b3/leu-14/lyb-8; y uso para tratar cancer.
US20090162372A1 (en) 2007-11-30 2009-06-25 Medarex, Inc. Fibronectin ed-b antibodies, conjugates thereof, and methods of use
TW200930407A (en) 2007-11-30 2009-07-16 Medarex Inc Conjugates of anti-RG-1 antibodies
AU2008334076A1 (en) 2007-11-30 2009-06-11 Bristol-Myers Squibb Company Monoclonal antibody partner molecule conjugates directed to protein tyrosine kinase 7 (PTK7)
SG189811A1 (en) 2008-04-30 2013-05-31 Immunogen Inc Cross-linkers and their uses
NZ571028A (en) 2008-09-03 2011-01-28 Auckland Uniservices Ltd Nitrobenzindole compounds and their use in cancer treatment
US20100069617A1 (en) 2008-09-12 2010-03-18 Ge Healthcare Bio-Sciences Ab Enhanced protein aggregate removal by mixed mode chromatography on hydrophobic interaction media in the presence of protein-excluded zwitterions
CA2737496A1 (en) 2008-09-17 2010-03-25 Endocyte, Inc. Folate receptor binding conjugates of antifolates
PT2344478T (pt) 2008-11-03 2017-11-28 Syntarga Bv Análogos de cc-1065 e seus conjugados
US8507195B2 (en) 2009-08-20 2013-08-13 The Regents Of The University Of Colorado MiRNAs dysregulated in triple-negative breast cancer
EP2380909A1 (en) 2010-04-26 2011-10-26 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. PTK-7 protein involved in breast cancer
WO2012143523A1 (en) 2011-04-20 2012-10-26 Genmab A/S Bispecifc antibodies against her2
ES2708699T3 (es) 2011-09-29 2019-04-10 Seattle Genetics Inc Determinación de la masa intacta de compuestos de agentes conjugados con proteínas
CN104334189A (zh) 2011-10-14 2015-02-04 霍夫曼-拉罗奇有限公司 Her2二聚化抑制剂帕妥珠单抗的用途和包含her2二聚化抑制剂帕妥珠单抗的制品
EP2814512A1 (en) 2012-02-16 2014-12-24 UCL Business Plc. Lysosome-cleavable linker
PL3092010T3 (pl) 2014-01-10 2019-01-31 Synthon Biopharmaceuticals B.V. Sposób oczyszczania połączonych cysteiną koniugatów przeciwciało-lek
MX368396B (es) 2014-01-10 2019-10-01 Synthon Biopharmaceuticals Bv Conjugados de anticuerpo-farmaco (adc) de duocarmicina que muestran actividad antitumoral in vivo mejorada.
JP6224268B2 (ja) 2014-01-10 2017-11-01 シントン・バイオファーマシューティカルズ・ビー．ブイ．Ｓｙｎｔｈｏｎ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｂ．Ｖ． 子宮内膜癌の治療において使用するためのデュオカルマイシンａｄｃ

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2013525347A (ja) * 2010-04-21 2013-06-20 シンタルガ・ビーブイ Ｃｃ−１０６５類似体の新規の複合体および二官能性リンカー

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HAMBLETT, K.J. ET AL.: ""Effects of Drug Loading on the Antitumor Activity of a Monoclonal Antibody Drug Conjugate"", CLIN. CANCER RES., vol. 10, no. 20, JPN6017019856, 15 October 2004 (2004-10-15), pages 7063 - 7070, XP002726047, ISSN: 0003744475, DOI: 10.1158/1078-0432.CCR-04-0789 *
KATHERINE, C. ET AL.: "TRISULFIDE MODIFICATION IMPACTS THE REDUCTION STEP IN ANTIBODY-DRUG CONJUGATION PROCESS", BIOCONJUG. CHEM., vol. 24, no. 7, JPN5017000121, 17 July 2013 (2013-07-17), pages 1154 - 160, XP055123130, ISSN: 0003744476, DOI: 10.1021/bc4000299 *
OUYANG，J.: ""DRUG-TO-ANTIBODY RATIO (DAR) AND DRUG LOAD DISTRIBUTION BY HYDROPHOBIC INTERACTION CHROMATOGRAPHY A", ANTIBODY-DRUG CONJUGATES, vol. 1045, JPN5017000118, 2013, US, pages 275 - 283, XP008170017, ISSN: 0003744473, DOI: 10.1007/978-1-62703-541-5_17 *
SUN, M.M.C. ET AL.: ""Reduction-Alkylation Strategies for the Modification of Specific Monoclonal Antibody Disulfides"", BIOCONJUG. CHEM., vol. 16, no. 5, JPN6017019855, September 2005 (2005-09-01), pages 1282 - 1290, ISSN: 0003744474 *

Also Published As

Publication number Publication date
CL2016001741A1 (es) 2017-05-12
SG11201605605SA (en) 2016-08-30
MX2016009068A (es) 2016-09-28
DK3092010T3 (en) 2018-08-27
ES2687225T3 (es) 2018-10-24
US10266606B2 (en) 2019-04-23
WO2015104359A2 (en) 2015-07-16
LT3092010T (lt) 2018-10-25
WO2015104359A3 (en) 2015-09-11
CA2935456A1 (en) 2015-07-16
CY1120595T1 (el) 2019-12-11
US20160324979A1 (en) 2016-11-10
CN105899235A (zh) 2016-08-24
AU2015205574B2 (en) 2019-08-15
KR20160106721A (ko) 2016-09-12
CA2935456C (en) 2018-09-18
AU2015205574A1 (en) 2016-07-07
HRP20181525T1 (hr) 2018-11-16
EP3092010A2 (en) 2016-11-16
KR102323301B1 (ko) 2021-11-09
PL3092010T3 (pl) 2019-01-31
RU2016132634A3 (ja) 2018-09-05
RU2680404C2 (ru) 2019-02-21
CN105899235B (zh) 2019-08-30
EP3092010B1 (en) 2018-07-11
ZA201604531B (en) 2018-07-25
RU2016132634A (ru) 2018-02-16
TR201810856T4 (tr) 2018-08-27
PT3092010T (pt) 2018-09-28
JP6419844B2 (ja) 2018-11-07
MY177390A (en) 2020-09-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6419844B2 (ja) Ｃｙｓ連結された抗体−薬物コンジュゲートの精製方法
KR102359192B1 (ko) 친화성 크로마토그래피 세정 완충액
JP6061853B2 (ja) 活性ポリペプチドまたは免疫複合体の精製方法
Azevedo et al. Integrated process for the purification of antibodies combining aqueous two-phase extraction, hydrophobic interaction chromatography and size-exclusion chromatography
ES2688348T3 (es) Solución y método de lavado para cromatografía de afinidad
KR102356757B1 (ko) 단백질 정제
CA2733782A1 (en) Methods for purifying antibodies using protein a affinity chromatography
TW201840580A (zh) 純化抗體的方法
CN107446044B (zh) 一种纯化抗体的方法及所用缓冲液
KR20190043601A (ko) 항체를 정제하는 방법
CN106029682B (zh) 等电点低的抗体的纯化方法
EP3318571B1 (en) Ion exchange chromatography with improved selectivity for the separation of polypeptide monomers, aggregates and fragments by modulation of the mobile phase
US20160347833A1 (en) Antibody process
ES2377125T3 (es) Procedimiento de purificación de proteínas
JP6553515B2 (ja) 免疫複合体の製造方法
JPS6254086B2 (ja)
WO2024058201A1 (ja) 放射性医薬組成物の中間体の製造方法、放射性医薬組成物の中間体の精製用キット
AU2011282774B9 (en) Method for purifying active polypeptides or immunoconjugates

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20160906

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20170606

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20170906

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20180227

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20180911

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20181010

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 6419844

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

S533 Written request for registration of change of name

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533

R350 Written notification of registration of transfer

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250