ES2708699T3 - Determinación de la masa intacta de compuestos de agentes conjugados con proteínas - Google Patents

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Abstract

Un método para la detección o la determinación de una masa de un compuesto de conjugado de un anticuerpo y un fármaco, que comprende: (a) proporcionar un compuesto de conjugado de un anticuerpo con un fármaco en una sal volátil y libre de una sal no volátil, en donde el compuesto de conjugado de un anticuerpo con un fármaco tiene de uno a ocho restos de fármaco conjugados en los disulfuros intercatenarios reducidos, está asociado no covalentemente y no desnaturalizado, y mantiene su estructura de anticuerpo bivalente intacta. (b) introducir el compuesto de conjugado de un anticuerpo con un fármaco de la etapa a) en un espectrómetro de masas; y posteriormente (c) establecer directamente la masa de la estructura bivalente intacta del compuesto de conjugado de un anticuerpo con un fármaco mediante espectrometría de masas.

Description

DESCRIPCION
Determinacion de la masa intacta de compuestos de agentes conjugados con protelnas
Antecedentes de la invencion
Los conjugados de anticuerpos con farmacos (ADC) son compuestos para el suministro dirigido de su carga util a una diana. En muchos casos, la diana es un antlgeno asociado a un tumor (TAA) y la carga util es un farmaco.
Existen varias clases de anticuerpos que incluyen IgG1 e IgG2. La estructura de un anticuerpo IgG1 e IgG2 incluye dos cadenas pesadas (HC) y 2 cadenas ligeras (LC). Las dos cadenas pesadas y las dos cadenas ligeras se presentan como un complejo que comprende un anticuerpo intacto. Cada anticuerpo IgG1 tiene 12 enlaces disulfuro intracatenarios y 4 intercatenarios creados mediante la oxidacion de sus cistelnas respectivas en cada cadena del anticuerpo. Existen dos enlaces disulfuro entre la cadena pesada y la cadena ligera y dos enlaces disulfuro entre la cadena pesada y cadena pesada. La reduccion completa de los enlaces disulfuro intercatenarios de un anticuerpo IgG1 da como resultado que el complejo de anticuerpo se mantenga mediante interacciones no covalentes.
La reduccion completa de los enlaces disulfuro intracatenarios de un anticuerpo IgG1 da lugar a ocho tioles accesibles para la conjugacion con un farmaco, en general mediante un enlazador. Variando los parametros de reduccion, se pueden obtener isomeros de anticuerpo con desde 0 a 8 tioles disponibles para la conjugacion. Por ejemplo, reduciendo una IgG1 con DTT se pueden obtener anticuerpos con 2, 4, 6, u 8 tioles accesibles. Los ADN completamente reducidos se mantienen juntos por interacciones no covalentes, tales como enlaces de hidrogeno, enlaces ionicos, hidrofobia e interacciones de van der Waals, y se separaran en cadenas ligera y pesada en condiciones de desnaturalizacion (por ejemplo, en cromatografla de fase inversa). Los ADC no reducidos completamente se mantienen juntos por interacciones covalentes y no covalentes. Las partes de ADC no reducidas completamente que se mantienen juntas por medios covalentes tambien se pueden separar en condiciones desnaturalizantes.
Los ADC de IgG1 completamente cargados tienen una molecula de farmaco unida a cada cistelna que producen los disulfuros intercatenarios de un anticuerpo con un total de ocho farmacos por anticuerpo. Los a Dc parcialmente cargados tienen en general 2, 4, o 6 moleculas de farmaco unidas a los restos de cistelna. Tambien se observan ADC cargados parcialmente que tienen 1, 3, y 5 moleculas de farmaco unidas a los restos de cistelna. Aunque la masa de los fragmentos constituyentes de los ADC cargados se ha ensayado por espectrometrla de masas (MS), sigue existiendo un problema en el campo con el que se relaciona la presente invencion con respecto al ensayo de la masa del ADC intacto cargado.
Aunque las tecnicas para la medicion directa de la masa de un ADC intacto cargado no estan disponibles, se conocen distintos medios indirectos para la medicion de la masa de los ADC cargados. Por ejemplo, la masa de un ADC se ha medido uniendo una muestra (por ejemplo, un ADC) a una columna cromatografica llquida de alta presion. De fase inversa calentada (rp-HPLC) en presencia de poco o ningun disolvente organico que contiene tambien normalmente un acido de emparejamiento ionico (por ejemplo, acido trifluoroacetico) y que permite que se laven las sales no volatiles y los tensioactivos de la muestra (a lo que se hace referencia comunmente como desalado). En este ejemplo, la protelna se eluye de la columna de rp-HPLC aumentando el contenido organico del disolvente hasta el punto en el que las interacciones entre los dominios proteicos hidrofobos y la superficie de la columna de rp-HPLC se destruyen mediante un disolvente organico no polar. Un efecto no deseable de esta tecnica es que se destruye la estructura proteica sometiendo las muestras proteicas al calor, acido y disolventes organicos, cualquiera de los cuales puede desnaturalizar las protelnas y destruir la estructura proteica. Cuando los complejos proteicos no covalentes se someten a una rp-HPLC se separan en sus entidades covalentes que los constituyen. En el caso de un anticuerpo IgG1 con 8 farmacos unidos a las cistelnas intercatenarios, el desalado en una columna de rp-HPLC da como resultado la completa disociacion del ADC en las cadenas pesadas con 3 farmacos por cadena y las cadenas ligeras con 1 farmaco por cadena. Aunque la masa de los fragmentos constituyentes se puede determinar por tecnicas de espectrometrla de masas (MS), las tecnicas para la determinacion de las masas de la entidad intacta no existen en el campo al que pertenece la presente invencion.
Las tecnicas de MS actuales carecen de la medicion de la masa de ADC intactos debido, en parte, al hecho de que estas tecnicas dan lugar a la desnaturalizacion proteica y/o consumen demasiado tiempo para los usos que se contemplan en el presente documento. Virtualmente, todos los metodos de MS con ionizacion y electropulverizacion nativa (ESI) de las protelnas especifican que este procedimiento deberla llevarse a cabo a escala de nanopulverizador (con un caudal de 100 a 500 nanolitros/minuto) para minimizar la destruccion de la estructura proteica que se producirla por la cubierta calentada y la desolvatacion de gases que se utilizan para la ESI convencional. El procedimiento de manejo de la muestra para la medicion de la masa nativa de un ADC que utiliza tecnicas de MS-ESI con nanopulverizador convencionales consume mucho tiempo y no es adecuado para un alto rendimiento. Sin incluir el tiempo para desglicosilar el anticuerpo, se tarda al menos una hora por muestra para obtener una medicion de masa.
Lazar et al., Rapid Communications in Mass Spectrometry 2005,19(13):1806-1814 expone una MS-ESI para el analisis de anticuerpos recombinantes e inmunoconjugados, incluyendo la preparacion de la muestra y el desalado de la muestra. Wakankar et al., MABS 2011, 3(2): 161-172 revisa los metodos anallticos utilizados para la caracterizacion de los ADC, tales como espectrometrla de masas proteica y electroforesis de capilaridad.
Ademas, los metodos conocidos anteriormente para analizar los ADC unidos a los cisteinilos intercatenarios tampoco son adecuados para la espectrometrla de masas en llnea (por ejemplo, HIC) o dan como resultado la disociacion desnaturalizante de las cadenas pesada y ligera conjugadas durante la separacion cromatografica y la posterior medicion de masa (por ejemplo, rp-HPLC). Por lo tanto, existe una necesidad en el campo al que pertenece la presente invencion de metodos para la determinacion de rutina y rapida de la masa intacta de un a Dc unido a cistelnas.
Sorprendentemente, la presente invencion cumple esta necesidad as! como otras necesidades no satisfechas en el campo proporcionando metodos, dispositivos, y sistemas para detectar la masa de un conjugado de agentes proteicos asociados no covalentemente.
Breve sumario de la invencion
En un aspecto, la invencion proporciona un metodo para la deteccion o determinacion de una masa de compuesto conjugado de anticuerpo farmaco. El metodo incluye las etapas de proporcionar un compuesto de conjugado anticuerpo farmaco en una sal volatil y liebre de una sal no volatil, en el que el compuesto de conjugado anticuerpo farmaco tiene de uno a ocho restos de farmaco conjugados a los disulfuros intercatenarios reducidos, se asocia no covalentemente y no esta desnaturalizado, y mantiene su estructura de anticuerpo bivalente intacta; la introduccion del compuesto de conjugado anticuerpo farmaco en un espectrometro de masas; y establecer directamente la masa de la estructura bivalente intacta del compuesto de conjugado anticuerpo farmaco por espectrometrla de masas. Breve descripcion de los dibujos
La Figura 1 muestra las estructuras de IgG1 de distintos ADC representativos con una MR de 0 a 8 incluyendo los isomeros producidos por conjugation de un anticuerpo con un agente que es, en un aspecto, un farmaco, en otro aspecto, un marcador, y en otro aspecto mas, una toxina. Los enlaces disulfuro entre las subunidades del anticuerpo (denominado mAb en la Figura) (MR = 0) estan unidos a farmacos en el ADC que da como resultado en especies unidos a farmacos 2LC-2HC asociados no covalentemente.
La Figura 2 muestra la MS no procesada ni desglosada asociada con la medicion de la masa de mAb-A desglicosilado en condiciones desnaturalizantes y no desnaturalizantes. Los datos de la MS no procesados y no desglosados obtenidos en las condiciones desnaturalizantes se muestran en los paneles A y C, respectivamente, y los datos de la MS no procesados y desglosados obtenidos en condiciones no desnaturalizantes se muestran en los paneles B y D, respectivamente. Los iones evidentes entre 200 y 3500 m/z del panel B que es la region en la que el anticuerpo desnaturalizado serla evidente se deben a la presencia de PNGasa F que se utilizo para la desglicosilacion y el detergente no ionico Tween-80.
La Figura 3 muestra la MS no procesada y desglosada asociada a la medicion de masa de un maleimidocaproil monometil auristatina F desglicosilada (mcMMAF), conjugado ADC-A en condiciones desnaturalizantes y no desnaturalizantes. Los datos de MS no procesados y desglosados obtenidos en condiciones desnaturalizantes se muestran en los paneles A y C, respectivamente, y los datos de la MAS no procesados y desglosados obtenidos en condiciones no desnaturalizantes se muestran en los paneles B y D, respectivamente. Los multiples iones cargados para el ADC-A se indican con corchetes en el panel B y los artefactos del desglose presentes en los paneles C y D se indican con asteriscos.
La Figura 4 muestra un espectro de masas desglosado para un maleimidocaproil monometil auristatina F (mcMMAF) desglicosilado conjugado ADC-A y el material parental correspondiente, mAb-A. Las estructuras de ADC asociadas no covalentemente se muestran encima del ion correspondiente en la MS.
La Figura 5 muestra un espectro de masas desglosado para un mc-Val-Cit-PAB monometil auristatina E (vcMMAE) desglicosilada conjugado ADC-B y el material parental correspondiente, mAb-B Las estructuras ADC asociadas no covalentemente se muestran encima del ion correspondiente en la MS.
La Figura 6 muestra los niveles relativos de las relaciones molares de vcMMAF por IgG1 ADC-A (panel A) y vcMMAE por IgG1 ADC-B (panel B), como se determino por cuantificacion basada en MS para los espectros de masas desglosados y por integration de UV de las especies separadas por BIC.
La Figura 7 muestra una comparacion de los cromatogramas de los analisis de SEC de columna dual del ADC desalado y el material de partida correspondiente.
La Figura 8 muestra el porcentaje relativo de vcMMAE por concentracion de sales para los conjugados que tiene valore de MR de 0, 2, 4, 6, y 8.
La Figura 9 los resultados de una caracterizacion de separacion de un ADN mcMMAF por HIC (panel A), seguido por un analisis de las fracciones recolectadas por SEC-MS (panel B).
La Figura 10 muestra un analisis de las fracciones individuales de la separacion por HIC que muestra que la posicion de la union con el farmaco en las cadenas polipeptldicas de la ADC se puede evaluar por la masa de los fragmentos disociados utilizando SEC-MS.
La Figura 11 muestra una medicion de masas por MS desglosada para un conjugado de protelna con un agente que tiene una MR = 0, 2, 4, 6, u 8.
La Figura 12 muestra una medicion de masas por MS desglosadas para un conjugado de protelna con un agente que tienen una MR = 0, 2, 4 o 6.
Descripcion detallada de la invencion
I. General
La presente divulgacion expone metodos para detectar la masa de un compuesto de conjugado de protelna con un agente asociado no covalentemente. Estos metodos incluyen las etapas de: (a) proporcionar un compuesto de conjugado de protelna con un agente en una matriz; (b) introducir el compuesto de conjugado de protelna con un agente eluldo en un espectrometro de masas; y (c) establecer directamente la masa del compuesto de conjugado de protelna con un agente por espectrometrla de masas. En realizaciones adicionales, se aplica un medio de separacion en condiciones no desnaturalizantes para el compuesto de conjugado de protelna con un agente de la matriz para efectuar la separacion del compuesto de conjugado de agente proteico de la matriz. En algunas de estas realizaciones, el compuesto de conjugado de protelna con un agente esta sustancialmente no desnaturalizado. En realizaciones adicionales mas, el compuesto de conjugado de protelna con un agente no desnaturalizado se eluye del compuesto de medio de separacion en una sal volatil.
II. Definiciones
A menos de que se defina otra cosa, todos los terminos de la tecnica, notaciones y otros terminos cientlficos o terminologla utilizada en el presente documento tienen la intencion de tener los significados que entienden comunmente los expertos en la tecnica a la que pertenece la presente invencion. En algunos casos, los terminos con los significados entendidos comunmente se definen en el presente documento por claridad y/o por facilidad de referencia, y la inclusion de dichas definiciones del presente documento no beberla interpretarse necesariamente que represente una diferencia sustancial sobre lo que se entiende en general en la tecnica. Muchas de estas tecnicas y procedimientos descritos o referenciados en el presente documento se entienden bien y se emplean comunmente utilizando una metodologla convencional por los expertos en la tecnica. Segun sea apropiado, los procedimientos que implican el uso de kits disponibles en el mercado y los reactivos se llevan a cabo en general de acuerdo con los protocolos y/o parametros definidos por el fabricante a menos de que ese senale otra cosa.
Cuando se utilizan en el presente documento nombres comerciales, se pretende que se incluya independientemente la formulacion del producto del nombre comercial, el farmaco genetico, y los ingredientes farmaceuticos activos del producto de nombre comercial.
Como se utiliza en el presente documento, la abreviatura “MR” se refiere al numero de moleculas de farmaco conjugado con, por ejemplo, la protelna o el anticuerpo. Por ejemplo, MR = 0 significa que se han conjugado cero moleculas de farmaco a una protelna determinada o un anticuerpo determinado. MR = 8 significa que hay ocho moleculas de farmaco conjugadas con una protelna determinada o un anticuerpo determinado. MR puede incluir 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 y 8.
A menos de que se establezca otra cosa, los siguientes terminos y frases como se utilizan en el presente documento tienen la intencion de tener los siguientes significados:
Como se utiliza en el presente documento, el termino “ADC” se refiere a un conjugado de farmaco anticuerpo. La porcion de anticuerpo del ADC tiene especificidad por un antlgeno. Los antlgenos de interes incluyen pero no se limitan a CD30, CD40, CD19, CD33, y CD70.
Como se utiliza en el presente documento, el termino “protelna” se refiere a compuestos que comprenden uno o mas polipeptidos normalmente plegados en una forma tridimensional, y que pueden facilitar una funcion biologica.
Como se utiliza en el presente documento, el termino “polipeptido” se refiere a un pollmero de aminoacidos y su equivalente y no se refiere a una longitud de producto especlfica; por lo tanto “peptidos” y “protelnas” se incluyen en la definicion de polipeptido. tambien esta incluido en la definicion de protelnas “anticuerpos” como se define en el presente documento. Una “region de polipeptido” se refiere a un segmento de un polipeptido, cuyo segmento puede contener, por ejemplo, uno o mas dominios o motivos (por ejemplo, una region polipeptldica de un anticuerpo puede contener, por ejemplo, una o mas CDR).
Como se utiliza en el presente documento, el termino “fragmento” se refiere a una porcion de un polipeptido que tiene normalmente al menos 20 aminoacidos contiguos o al menos 50 aminoacidos contiguos del polipeptido.
Como se utiliza en el presente documento, la frase “protelna asociada no covalentemente” se refiere a una protelna en la que al menos una asociacion covalente entre las cadenas del polipeptido se ha alterado y que mantiene su estructura terciaria o cuaternaria. Por ejemplo, en referencia a un ADC, una protelna asociada no covalentemente es una protelna que se somete a reduccion de sus enlaces disulfuro intercatenarios mientras que mantiene su estructura intacta (es decir, las dos cadenas pesadas se mantienen asociadas con las dos cadenas ligeras). Los ADC estan compuestos de interacciones covalentes y no covalentes. Las interacciones covalentes se mantienen en algunos ADC, por ejemplo, los ADC que tienen 2, 4, o 6 cargas farmacologicas. En un ejemplo de un ADC que tiene 2 cargas farmacologicas, el ADC tiene disulfuros intercatenarios covalentes entre ambas cadenas pesadas y una entre la cadena ligera y la cadena pesada con el otro de cadena ligera con la cadena pesada como una estructura no covalente. De la misma manera, en un ejemplo de un ADC cargado con 4 farmacos, tambien esta compuesto de interacciones covalentes y no covalentes entre las cadenas pesada y ligera.
Como se utiliza en el presente documento, la frase “compuesto de conjugado de protelna con un agente” se refiere a un compuesto que incluye una protelna conjugada con un agente. La protelna puede ser, pero no se limita a, un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, una protelna de fusion con Fc, o un complejo proteico no covalente. En algunos aspectos la protelna puede ser un anticuerpo. En otro aspecto, la protelna es un fragmento de anticuerpo. En otros aspectos la protelna puede ser una protelna de fusion con Fc. En otros aspectos adicionales, la protelna puede estar compuesta de un complejo de subunidades no unidas por enlaces covalentes. Ejemplos de estos tipos de protelnas son hemoglobina, que es un conjunto tetramerico de 2 cadenas alfa y 2 cadenas beta asociadas no covalentemente, Concanavalina A que es un tetramero, y el receptor estrogenico que es un dlmero. Las protelnas de fusion con Fc implican el injerto de una protelna funcional o un dominio proteico en un Fc dimerico de manera que los monomeros de Fc se unen por restos de cistelna en la region bisagra del Fc. La protelna puede tener una estructura cuaternaria que no se mantenga unida por enlaces covalentes sino solo por interacciones no covalentes. Un ejemplo es la hemoglobina que esta compuesta por 4 subunidades que se pueden disociar en condiciones desnaturalizantes. Las cistelnas de la hemoglobina se pueden conjugar con farmacos, pero, al contrario que los anticuerpos, las cistelnas no participan actualmente en la union covalente de la estructura de subunidades.
Como se utiliza en el presente documento, el termino “agente” se refiere a un farmaco, un marcador, toxina o similares.
Como se utiliza en el presente documento, el termino “matriz” se refiere al contexto o medio en el que la protelna o compuesto de conjugado de un agente con una protelna esta presente. Por ejemplo, una “matriz” incluye tampones de formulacion, suero biologico, tensioactivos, excipientes, o medios de cultivo celular.
Como se utiliza en el presente documento, la frase “condicion no desnaturalizante” se refiere a una condicion en la que las protelnas (por ejemplo, anticuerpos) no pierden sus estructuras secundaria, terciaria o cuaternaria. Las condiciones no desnaturalizantes incluyen la ausencia de calor en exceso del nivel que causarla un despliegue termico (por ejemplo, 50 °C o mas) y extremos de pH (por ejemplo, por debajo de un pH 5 y por encima de un pH 8). Como se utiliza en el preste documento, la frase “protelna no desnaturalizada” significa una protelna (por ejemplo un anticuerpo) que ha mantenido su estructura secundaria, terciaria, y, cuando sea aplicable, cuaternaria.
Como se utiliza en el presente documento, la frase “protelna reducida” (por ejemplo, un anticuerpo) se refiere a una protelna en la que sus enlaces disulfuro intercatenarios se han roto.
Como se utiliza en el presente documento, la frase “protelna desnaturalizada” (por ejemplo un anticuerpo) es en la cual la protelna ha perdido su estructura secundaria, terciaria o cuaternaria.
Como se utiliza en el presente documento, el termino “sustancialmente” significa un se refiere a la fase llquida movil que se 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, o 10 % de la cantidad medida por los niveles relativos de las relaciones molares como se determina en la cuantificacion basada en MS a partir del espectro de masas desglosado y por la integracion por UV de las especies separadas por HIC, cuyas protelnas (por ejemplo, anticuerpos) no estan desnaturalizadas siguiendo la etapa de separation en el medio (por ejemplo, por SEC).
Como se utiliza en el presente documento, el termino “eluyente” se refiere a la fase llquida movil que disocia los analitos a partir de una fase estacionaria en columna de cromatografla. Los analitos incluyen, pero no se limitan a, compuestos de interes que se van a medir.
Como se utiliza en el presente documento, el termino “directamente” se refiere al contexto para el establecimiento de la masa de una proteina (incluyendo un compuesto de conjugado de un agente con una proteina) que incluye la medicion de la masa del conjunto cuaternario completo, por ejemplo, la entidad intacta, tal como un complejo con anticuerpo.
Como se utiliza en el presente documento, el termino “indirectamente” significa la medicion de la masa de la proteina (incluyendo un compuesto de conjugado de proteina con un agente) midiendo las masas de las subunidades que comprenden el conjunto cuaternario, por ejemplo, las cadenas pesadas y ligeras de un anticuerpo, y sumando en conjunto las masas para llegar a un numero para la entidad intacta.
“Desalado” se refiere a la separacion de una muestra proteica (incluyendo un compuesto de conjugado de proteina con un agente) de las sales no volatiles, excipientes y/o tensioactivos.
Una “sal volatil” se refiere a una sal que entra en fase gaseosa a la presion del entorno ambiental (1 atmosfera). Las sales volatiles incluyen, por ejemplo, formato amonico, acetato amonico, carbonato amonico.
Un “tensioactivo” incluye, pero no se limita a, compuestos no volatiles de la matriz. Por ejemplo, los tensioactivos incluyen detergentes no ionicos o zwiteronicos, tales como polisorbato 20 (“Tween 20”) y polisorbato 80 (“Tween 80”).
Un “agente caotropico” se refiere a un producto quimico que desestabiliza los enlaces hidrogeno, fuerzas de van der Waals y las interacciones hidrofobas entre las proteinas y entre subdominios de una proteina y posteriormente da como resultado la desnaturalizacion. Los compuestos a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, guanidina-HCl, urea, y otros compuestos conocidos por el experto en la tecnica.
Un “excipiente” incluye compuestos tales como azucares y polioles, por ejemplo, sacarosa, trealosa y sorbitol.
“Espectrometria de masas” (MS) es una tecnica analitica que se utiliza para medir la relacion de masa respecto a la carga de particulas cargadas. Se puede utilizar para deducir la estructura primaria de las proteinas.
“Cromatografia Kquida” o “LC” se refiere a un metodo de separacion de mezclas. La mezcla se disuelve en un fluido llamado fas movil que la transporta a traves de una estructura llamada fase estacionaria. En el caso de la cromatografia por exclusion de tamano (SEC) los distintos constituyentes de la mezcla viajan a diferentes velocidades, haciendo que se separen. La separacion se basa en la particion diferencial entre las fases estacionaria y movil.
“Cromatografia de exclusion por tamano” (SEC) se refiere a un metodo de cromatografia en el que las moleculas se separan por su tamano y no por otro parametro de separacion tal como el peso molecular o la polaridad. Se aplica a grandes moleculas tales como proteinas. En la cromatografia de exclusion por tamano, las sales se utilizan primariamente como fase movil. En algunos casos, tambien pueden estar presentes en la fase movil agentes organicos y caotropicos. La fase estacionaria habitualmente es, pero no se limita a, una de las siguientes, poliestireno reticulado, derivado de silice, acrilico, acrilico hidroxilado, acrilico, de agarosa, o una estructura de polihidroxietil-aspartamida. El armazon de resina se puede derivar con cualquiera numero de especies y la eleccion del agente de derivacion esta dirigida normalmente por una necesidad de reducir interacciones moleculares no deseadas entre el analito que se va a separar y la columna que se emplearia en un metodo de separacion basado en un parametro de separacion distinto del tamano del compuesto.
Como se utiliza en el presente documento la frase “tampon de SEC volatil compatible con espectrometria de masas” se refiere a la fase movil de una SEC que es compatible para su uso en una MS.
Como se utiliza en el presente documento, el termino “anticuerpo” se refiere en su sentido mas amplio a un anticuerpo, como se utiliza en el campo relevante al que pertenece la presente invencion, y especificamente cubre anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecificos (por ejemplo, anticuerpo biespecificos), y fragmentos de anticuerpo. Los anticuerpos pueden ser murinos, humanos, humanizados, quimericos, o derivados de otras especies.
Como se utiliza en el presente documento, el termino “anticuerpo” tambien se refiere a una molecula de inmunoglobulina de longitud completa o una parte inmunologicamente activa de una molecula de inmunoglobulina de longitud completa, es decir, una molecula que contiene un sitio de union al antigeno que se une a un antigeno inmunoespecificamente de una diana de interes o una parte de la misma, dichas dianas incluyen, pero no se limitan a, celulas cancerosas, o celulas que producen anticuerpos autoinmunitarios asociados con una enfermedad autoinmunitaria. La inmunoglobulina desvelada en el presente documento puede ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, e IgA), clase (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) o subclases de la molecula de inmunoglobulina.
Como se utilizan en el presente documento, los terminos “fragmentos de anticuerpo” incluyen, pero no se limitan a, una parte de un anticuerpo de longitud completa, generalmente la region de union al antlgeno o variable de la misma. Ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen Fab, Fab', F(ab')2 y Fv; Fc, Fc medios (1/2 Fc), diacuerpos; anticuerpo lineales, fragmentos producidos por una biblioteca de expresion de Fab, anticuerpos anti-idiotlpicos (anti-Id), CDR (region determinante de complementariedad), ECD (dominio extracelular), y fragmentos de union al epltopo de cualquiera de los anteriores que se una inmunoespeclficamente a antlgenos celulares del cancer, antlgenos vlricos, o antlgenos microbianos; moleculas de anticuerpo de cadena sencilla; y anticuerpos multiespeclficos formados por fragmentos de anticuerpos.
Como se utiliza en el presente documento, un “anticuerpo intacto” se refiere a un anticuerpo que incluye los dominios VH y VL, as! como los dominios constantes completos de cadena pesada y ligera y se mantienen asociadas mediante al menos una interaccion no covalente. Un “fragmento de anticuerpo intacto” incluye una pare de un anticuerpo de longitud completa que se mantiene asociada mediante al menos una interaccion no covalente. La expresion “enlace disulfuro intercatenario”, en el contexto de un anticuerpo, se refiere a un enlace disulfuro entre dos cadenas pesadas, o una cadena pesada y una ligera.
La expresion “enlace disulfuro intracatenario”, en el contexto del anticuerpo, se refiere a un enlace disulfuro formado a partir de 2 restos de cistelna en la misma cadena polipeptldica.
La expresion “tiol intercatenario” se refiere a un grupo tiol, de una cadena pesada y ligera de anticuerpo que puede participar en la formacion de un enlace disulfuro intercatenario.
La expresion “anticuerpo monoclonal” o “mAb” como se utiliza en el presente documento se refiere a un anticuerpo obtenido de una poblacion de anticuerpos sustancialmente homogeneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la poblacion son identicos excepto por posibles mutaciones de origen natural que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente especlficos, estando dirigidos contra un unico sitio antigenico. Adicionalmente, al contrario que con las preparaciones de anticuerpos policlonales que incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epltopos), cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un unico determinante en el antlgeno.
Los anticuerpo monoclonales del presente documento incluyen especlficamente anticuerpos “quimericos” en los que una parte de la cadena pesada y/o ligera es identica u homologa con secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenece a una clase o subclase particular de anticuerpo, mientras que el resto de la cadena(s) es(son) identicas u homologas a secuencias correspondientes en los anticuerpos derivados de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpo, as! como a fragmentos de dichos anticuerpos. El anticuerpo intacto puede tener una o mas “funciones efectoras” que se refieren a las actividades que se pueden atribuir a la region Fc (una secuencia nativa de la region Fc o una secuencia de aminoacidos de una region variante de Fc) de un anticuerpo. Ejemplos de funciones efectoras de anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, union a C1q; citotoxicidad dependiente de complemento; union al receptor de Fc; citotoxicidad mediada por celulas dependiente de anticuerpos (ADCC); fagocitosis; y regulacion negativa de receptores de superficie celular (por ejemplo, el receptor de celulas B; BCR).
El anticuerpo puede ser una protelna de fusion de un anticuerpo, o un fragmento funcionalmente activo del mismo. Por ejemplo, en anticuerpo se puede fusionar mediante un enlace covalente (por ejemplo, un enlace peptldico), en el extremo N o el extremo C respecto a una secuencia de aminoacidos de otra protelna (o parte de la misma, tal como al menos una parte de 10, 20 o 50 aminoacidos de la protelna) que no es el anticuerpo. El anticuerpo o fragmento del mismo puede estar unido covalentemente a la otra protelna en el extremo N del dominio constante.
La expresion “protelna de fusion” como se utiliza en el presente documento puede referirse tambien en el contexto de fisiones de dominio de union-Ig en el que el dominio de union puede ser, por ejemplo, un ligando, un dominio extracelular de un receptor, un peptido, un peptido no de origen natural o similar, a condicion de que el dominio de union no incluya un dominio variable de un anticuerpo. Como las protelnas y anticuerpos descritos en el presente documento, la parte de Ig de la protelna de fusion debe comprender al menos un enlace disulfuro reducible. En un aspecto. El dominio Ig sera la region Fc de un anticuerpo. Ejemplos de protelnas de fusion dominio-Ig incluye el etanercept que es una protelna de anticuerpo de sNTFRII con la region Fc (Pat. de EE. UU. N.° 5.605.690), alefarcept que es una protelna de fusion de LFA-3 expresado en las celulas presentadoras de antlgeno con la region Fc (Pat de EE. UU. N.° 5.914.111), una protelna de fusion del antlgeno-4 asociado al linfocito T citotoxico (CTLA-4) con la region Fc (J. Exp. Med. 181:1869 (1995)), una protelna de fusion de interleucina 15 con la region Fc (J. Immunol. 160:5742 (1998)), una protelna de fusion del factor VII con la region Fc (Proc. Natl. Acad. Sci. LISA 98:12180 (2001)), una protelna de fusion de interleucina 10 con la region Fc (J. Immunol. 154:5590 (1995)), una protelna de fusion de interleucina 2 con la region Fc (J. Immunol. 146:915 (1991)), una protelna de fusion de CD40 con la region Fc (Surgery 132:149 (2002)), una protelna de fusion de Flt-3 (tirosina cinasa tipo fms) con la region Fc del anticuerpo (Acta. Haeraato. 95:218 (1996)), una protelna de fusion de OX40 con, la region Fc del anticuerpo (J. Leu. Biol. 72:522 (2002)), y protelnas de fusion con otras moleculas de CD (por ejemplo, CD2, CD30 (TNFRSF8), CD95 (Fas), CD106 (VCAM-1), CD137), moleculas de adhesion (por ejemplo, ALCAM (molecula de adhesion celular de leucocito activado), cadherinas, ICAM(molecula de adhesion intercelular)-1, ICAM-2, ICAM-3), receptores de citocinas (por ejemplo, interleucina-4R, interleucina-5R, interleucina-6R, interleucina-9R, interleucina-10R, interleucina-12R, interleucina-13R alfa 1, interleucina-13R alfa 2, interleucina-15R, interleucina-21Ralfa), quimiocinas, moleculas de senal que inducen la muerte celular (por ejemplo, B7-H1, DR6 (receptor mortal 6), PD-1 (muerte programada-1), TRAILR1), moleculas co-estimulantes (por ejemplo, B7-1, B7-2, B7-H2, ICOS (coestimulante inducible)), factores de crecimiento (por ejemplo, ErbB2, ErbB3, ErbB4, HGFR), factores inductores de diferenciacion (por ejemplo, B7-H3), factores activadores (por ejemplo, NKG2D), moleculas de transferencia de senal (por ejemplo, gpBO), BCMA, y TACI.
La abreviatura “MMAE” se refiere a monometil auristatina E.
La abreviatura “MMAF” se refiere a dovalina-valina-dolaisoleucina-dolaprolina-fenilalanina, a la que tambien se hace referencia como monometil auristatina F.
El termino “marcador” significa un resto que puede unirse covalentemente a una anticuerpo y que funciona para: (i) proporcionar una senal detectable; (ii) interactuar con un segundo marcador para modificar la senal detectable proporcionada por el primer o segundo marcador, por ejemplo FRET (transferencia de energla en resonancia de fluorescencia); (iii) estabilizar las interacciones o aumentar la afinidad de union con el antlgeno o el ligando; (iv) afectar la movilidad, por ejemplo, la movilidad electroforetica, o la permeabilidad celular, por carga, hidrofobia, forma u otros parametros flsicos, o (v) proporcionar un resto de captura, para modular la afinidad del ligando, la union anticuerpo/antlgeno, o la formacion de complejos ionicos.
Los anticuerpos se pueden conjugar con cualquier resto marcador que pueda unirse covalentemente al anticuerpo mediante el tiol de la cistelna. Para las aplicaciones diagnosticas, el anticuerpo normalmente se marcara con un resto detectable.
El “farmaco” o “resto farmacologico” puede ser cualquier farmaco citotoxico, citostatico o inmunomodulador (por ejemplo, inmunosupresor). En muchos casos, los farmacos se conjugan al anticuerpo mediante un enlazador. Por ejemplo, se describen enlazadores en las Patentes de EE. UU. N.° 7.754.681; 7.375078; 7.829.531; 7.659.241; 7.851.437; 7.829.531; 7.659.241; 7.498.298; 7.994.135; 7.964.567 y 7.964.567; cada una de las cuales se incorpora en el presente documento por referencia en su totalidad y para todos los fines. En un aspecto, el enlazador es valina-Citrulina (“Val-Cit” o “vc”). En otro aspecto, el enlazador es maleimidocaproil (“mc”).
II. Metodos
Se hara referencia ahora en detalle a ciertas realizaciones.
Un experto en la tecnica reconocera que se podrlan utilizar muchos metodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento, en la practica de la presente divulgacion. La presente divulgacion no se limita a los metodos y materiales descritos.
En algunas realizaciones, la presente divulgacion proporciona metodos para la deteccion de una masa de un compuesto de complejo de protelna con un agente. En ciertas realizaciones los metodos incluyen las siguientes etapas: (a) proporcionar un compuesto de conjugado de una protelna con un agente no desnaturalizado y asociado no covalentemente en una sal volatil y libre de una sal no volatil; (b) introducir el compuesto de conjugado de una protelna con un agente en un espectrometro de masas; y (c) establecer directamente la masa del compuesto de conjugado de una protelna con un agente mediante espectrometrla de masas.
En algunas realizaciones, la presente divulgacion proporciona metodos para la deteccion de una masa de un compuesto de conjugado de una protelna con un agente asociado no covalentemente. En ciertas realizaciones, los metodos incluyen las siguientes etapas: (a) proporcionar un compuesto de conjugado de una protelna con un agente en una sal volatil y libre de una sal no volatil; (b) introducir el compuesto de conjugado de una protelna con un agente en un espectrometro de masas; y (c) establecer directamente la masa del compuesto de conjugado de una protelna con un agente por espectrometrla de masas.
En algunos de los metodos descritos en el presente documento, los metodos incluyen adicionalmente la aplicacion de un medio de separation en condiciones no desnaturalizantes para el compuesto de conjugado de una protelna con un agente para efectuar la separacion del compuesto de conjugado de una protelna con un agente de una matriz, por el que el compuesto de conjugado de una protelna con un agente esta sustancialmente no desnaturalizado. En otras realizaciones los metodos incluyen la etapa de introducir un medio de separacion en condiciones no desnaturalizantes para el compuesto del conjugado de una protelna y un agente para efectuar la separacion del compuesto de conjugado de una protelna con un agente de una matriz, de manera que el compuesto de conjugado de una protelna con un agente esta sustancialmente no desnaturalizado.
En algunas realizaciones de los metodos descritos en el presente documento, el metodo incluye la elucion del medio de separacion de un compuesto de conjugado de una proteina con un agente. En ciertas realizaciones, las condiciones no desnaturalizantes incluyen un tampon de SEC volatil compatible con espectrometrias de masas. En algunas realizaciones adicionales, la sal volatil incluye formato amonico, acetato amonico. En ciertas otras realizaciones, la sal volatil es acetato amonico. En otras realizaciones, la sal volatil es carbonato amonico. En ciertas otras realizaciones, la sal volatil es una mezcla de las sales volatiles que se exponen en el presente documento.
En algunas realizaciones, la presente divulgacion proporciona metodos, descritos en el presente documento, en el que la matriz incluye una sal volatil, un tensioactivo, o un tampon.
En realizaciones adicionales de los metodos expuestos en el presente documento, la presente divulgacion proporciona metodos que incluyen la cuantificacion de la distribucion relativa de compuestos de conjugados de una proteina con un agente por intensidad ionica desglosada. En algunas de estas realizaciones, los metodos incluyen la cuantificacion de la distribucion relativa de los compuestos de conjugado de proteina con un agente. En algunas de estas realizaciones, los metodos incluyen el desglose de la intensidad de un ensayo descrito en el presente documento con el fin de cuantificar la distribucion relativa de los compuestos de conjugado de una proteina con un agente.
En realizaciones adicionales de los metodos expuestos en el presente documento, el compuesto de conjugado de una proteina con un agente incluye un conjugado de un anticuerpo con un farmaco.
En realizaciones adicionales de los metodos expuestos en el presente documento, la matriz incluye una formulacion.
En ciertas realizaciones, la matriz es una formulacion.
En realizaciones adicionales de los metodos expuestos en el presente documento, el medio de separacion incluye una cromatografia de exclusion por tamano (SEC). En ciertas realizaciones, el medio de separacion es la cromatografia de exclusion por tamano (SEC)A. En ciertas realizaciones descritas en el presente documento, los metodos incluyen la etapa de separacion de conjugados de una proteina con un agente, que se exponen en el presente documento, mediante cromatografia de exclusion por tamano.
En realizaciones adicionales de los metodos expuestos en el presente documento, el agente incluye un farmaco, una toxina, o un marcador. En algunas realizaciones, el agente es un farmaco. En algunas otras realizaciones, el agente es una toxina. En algunas otras realizaciones, el agente es un marcador. En ciertas realizaciones, el agente es una combinacion de cualquiera de los agentes expuestos en el presente documento.
En realizaciones adicionales de los metodos expuestos en el presente documento, la SEC incluye una columna de silice, poliestireno-divinilbenceno o polihidroxietil-aspartamida. En algunas realizaciones, la SEC incluye una columna de silice. En algunas otras realizaciones, la SEC incluye una columna de poliestireno-divinilbenceno. En algunas otras realizaciones, la SEC incluye una columna de polihidroxietil-aspartamida.
En realizaciones adicionales de los metodos expuestos en el presente documento, las condiciones no desnaturalizantes incluyen una temperatura de 50 °C. En ciertas realizaciones, la temperatura de las condiciones no desnaturalizantes no es mayor de 50 °C En algunas realizaciones, la temperatura de las condiciones no desnaturalizantes es una temperatura ambiente. La temperatura ambiente incluye, pero no se limita a, temperaturas de 20-24 °C.
En realizaciones adicionales de los metodos expuestos en el presente documento, la espectrometria de masas se lleva a cabo en una ESI-MS. En otras realizaciones, la espectrometria de masas se lleva a cabo en un espectrometro de masa unido a otro dispositivo tal como un cromatografo o boquilla de pulverizador para el suministro de la muestra que se va a analizar en la MS.
En realizaciones adicionales de los metodos expuestos en el presente documento, la concentracion de la sal volatil es de 50 a 400 mM. En algunas realizaciones, la concentracion de la sal volatil de 50 mM. En algunas realizaciones, la concentracion de sales es de 400 mM. En algunas realizaciones, la concentracion de la sal volatil es de 50, 55,
60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180,
185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355, 360, 365, 370, 375, 380, 385, 390, 395, o 400 mM. En algunas realizaciones, la concentracion de la sal volatil es aproximadamente 50 a aproximadamente 400 mM. En este contexto, aproximadamente se refiere a un valor que esta entre un 10 % del valor modificado por la palabra aproximadamente. Por ejemplo, aproximadamente 50 mM, incluye 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, y 55 mM.
Por ejemplo, aproximadamente 400 mM incluye 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, y 440 mM. En algunas realizaciones, la concentracion de la sal volatil es aproximadamente 50 a aproximadamente 300 mM. En algunas realizaciones, la concentracion de sal volatil es aproximadamente 50 mM a aproximadamente 200 mM. En algunas realizaciones, la concentracion de la sal volatil es aproximadamente de 50 a aproximadamente 100 mM. En algunas realizaciones, la concentracion de la sal volatil es aproximadamente de 100 a aproximadamente 400 mM. En alguna realizacion, la concentracion de la sal volatil es aproximadamente de 200 a aproximadamente 400 mM. En algunas realizaciones la concentracion de sal volatil es aproximadamente 300 a aproximadamente 400 mM. En algunas realizaciones la concentracion de sal volatil es aproximadamente 50 a aproximadamente 100 mM. En algunas realizaciones, la concentracion de la sal volatil es de aproximadamente 50 a aproximadamente 200 mM. En algunas realizaciones, la concentracion de la sal volatil es aproximadamente 50 a aproximadamente 300 mM. En algunas realizaciones, la concentracion de la sal volatil es de aproximadamente 50 a aproximadamente 350 mM.
En realizaciones adicionales de los metodos que se exponen en el presente documento, el compuesto de conjugado de una protelna con un agente se introduce inmediatamente en el espectrometro de masas.
En algunas realizaciones de los metodos que se exponen en el presente documento, el compuesto eluldo de conjugado de una protelna con un agente se introduce continuamente en el espectrometro de masas. En ciertas realizaciones, el medio de separation es una columna de HIC que se ejecuta en condiciones no desnaturalizantes.
En otras realizaciones, la SEC es una columna de polihidroxietil-A.
En algunas realizaciones de los metodos que se exponen en el presente documento, el tamano de la columna de SEC es de 0,1 a 7,8 mm de diametro interno y de 100 a 300 mm de longitud.
En realizaciones adicionales de los metodos que se exponen en el presente documento, los metodos incluyen la etapa de tratamiento del compuesto de conjugado con una protelna con un agente con un reactivo desglicosilante.
En ciertas realizaciones, el reactivo desglicosilante es PNGasa F. En otras realizaciones, el agente desglicosilante incluye un tratamiento enzimatico con una exoglicosidasa, un tratamiento con una endoglicosidasa o un tratamiento enzimatico que haga una escision entre el 1° y 2° restos de N-acetilglucosamina en los N-glicanos.
En algunas de las realizaciones descritas en el presente documento, el tratamiento con exoglicosidasa incluye la sialidasa o beta-galactosidasa.
En realizaciones adicionales de los metodos expuestos en el presente documento, el tratamiento enzimatico que escinde entre el 1° y el 2° resto de N-acetilglucosamina de los N-glicanos incluye Endo-F1, F2 o F3.
En algunas realizaciones adicionales de los metodos expuestos en el presente documento, el pH de la sal volatil es de 5,5 a 7,0. En otras realizaciones, los metodos descritos en el presente documento incluyen la etapa en la que el pH de la sal volatil es 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, o 7,0. En algunas realizaciones de los metodos expuestos en el presente documento, el pH de la sal volatil es 6,0. En algunas realizaciones de los metodos expuestos en el presente documento, el pH de la sal volatil es 6,5. En algunas realizaciones de los metodos expuestos en el presente documento, el pH de la sal volatil es 7,0.
En realizaciones adicionales de los metodos expuestos en el presente documento, los metodos incluyen la cuantificacion del compuesto no desnaturalizado de conjugado de una protelna y un agente mediante espectrometrla de masas.
En algunas realizaciones de los metodos expuestos en el presente documento, el compuesto no desnaturalizado de conjugado de una protelna y un agente incluye un fragmento de cadena pesada o cadena ligera de anticuerpo. En alguna de estas realizaciones, el fragmento de cadena pesada o cadena ligera de anticuerpo incluye adicionalmente uno o mas farmacos.
En realizaciones adicionales de los metodos expuestos en el presente documento, el anticuerpo del conjugado de anticuerpo y farmaco es un fragmento de anticuerpo.
En realizaciones adicionales de los metodos que se exponen en el presente documento, el fragmento de anticuerpo se selecciona de entre un fragmento Fab, Fab', F(ab')2, Fv, diacuerpo, anticuerpo lineal, o molecula de anticuerpo de cadena sencilla. En algunas de las realizaciones descritas en el presentes documento, el anticuerpo se selecciona de entre el grupo que consiste en un anticuerpo anti-CD30, anti-CD40, Anti-CD19, anti-CD33 o Anti-CD70. En otras realizaciones, el anticuerpo del conjugado de un anticuerpo con un farmaco es un anticuerpo humanizado. En algunas realizaciones el anticuerpo del conjugado de un anticuerpo con un farmaco incluye un anticuerpo humanizado.
En realizaciones adicionales de los metodos expuestos en el presente documento, el farmaco es un maitansinoide.
En algunas otras realizaciones, el farmaco es una auristatina. En ciertas realizaciones, el farmaco es MMAE. En algunas realizaciones, el farmaco es MMAF.
En realizaciones adicionales de los metodos expuestos en el presente documento, la masa del compuesto de conjugado de una protelna y un agente se mide en 7,5 Da. En otras realizaciones la masa del compuesto de conjugado de una protelna y un agente se mide en 25 Da. En ciertas realizaciones, la masa del compuesto de conjugado de una protelna y un agente se mide en 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9, 10,0, 10,1, 10,2, 10,3, 10,4, 10,5, 10,6, 10,7, 10,8, 10,9, 11,0, 11,1, 11,2, 11,3, 11,4, 11,5, 11,6, 11,7, 11,8, 11,9, 12,0, 12,1, 12,2, 12,3, 12,4, 12,5, 12,6, 12,7, 12,8, 12.9, 13,0, 13,1, 13,2, 13,3, 13,4, 13,5, 13,6, 13,7, 13,8, 13,9, 14,0, 14,1, 14,2, 14,3, 14,4, 14,5, 14,6, 14,7, 14,8, 14.9, 15,0, 15,1, 15,2, 15,3, 15,4, 15,5, 15,6, 15,7, 15,8, 15,9, 16,0, 16,1, 16,2, 16,3, 16,4, 16,5, 16,6, 16,7, 16,8, 16.9, 17,0, 17,1, 17,2, 17,3, 17,4, 17,5, 17,6, 17,7, 17,8, 17,9, 18,0, 18,1, 18,2, 18,3, 18,4, 18,5, 18,6, 18,7, 18,8, 18.9, 19,0, 19,1, 19,2, 19,3, 19,4, 19,5, 19,6, 19,7, 19,8, 19,9, 20,0, 20,1, 20,2, 20,3, 20,4, 20,5, 20,6, 20,7, 20,8, 20.9, 21,0, 21,1, 21,2, 21,3, 21,4, 21,5, 21,6, 21,7, 21,8, 21,9, 22,0, 22,1, 22,2, 22,3, 22,4, 22,5, 22,6, 22,7, 22,8, 22.9, 23,0, 23,1, 2, 23,3, 23,4, 23,5, 23,6, 23,7, 23,8, 23,9, 24,0, 24,1, 24,2, 24,3, 24,4, 24,5, 24,6, 24,7, 24,8, 24,9, 25,0, 25,1, 25,2, 25,3, 25,4, 25,5, 25,6, 25,7, 25,8, o 25,9 Da.
En realizaciones adicionales de los metodos que se exponen en el presente documento, la masa del compuesto de conjugado de una proteina con un agente se mide en 8,0 Da. En realizaciones adicionales de los metodos que se exponen en el presente documento, la masa del compuesto de conjugado de una proteina con un agente se mide en 9.0 Da. En realizaciones adicionales de los metodos que se exponen en el presente documento, la masa del compuesto de conjugado de una proteina con un agente se mide en 10,0 Da. En realizaciones adicionales de los metodos que se exponen en el presente documento, la masa del compuesto de conjugado de una proteina con un agente se mide en 11,0 Da. En realizaciones adicionales de los metodos que se exponen en el presente documento, la masa del compuesto de conjugado de una proteina con un agente se mide en 12,0 Da. En realizaciones adicionales de los metodos que se exponen en el presente documento, la masa del compuesto de conjugado de una proteina con un agente se mide en 13,0 Da. En realizaciones adicionales de los metodos que se exponen en el presente documento, la masa del compuesto de conjugado de una proteina con un agente se mide en 14,0 Da. En realizaciones adicionales de los metodos que se exponen en el presente documento, la masa del compuesto de conjugado de una proteina con un agente se mide en 15,0 Da. En realizaciones adicionales de los metodos que se exponen en el presente documento, la masa del compuesto de conjugado de una proteina con un agente se mide en 16.0 Da. En realizaciones adicionales de los metodos que se exponen en el presente documento, la masa del compuesto de conjugado de una proteina con un agente se mide en 17,0 Da. En realizaciones adicionales de los metodos que se exponen en el presente documento, la masa del compuesto de conjugado de una proteina con un agente se mide en 18,0 Da. En realizaciones adicionales de los metodos que se exponen en el presente documento, la masa del compuesto de conjugado de una proteina con un agente se mide en 19,0 Da. En realizaciones adicionales de los metodos que se exponen en el presente documento, la masa del compuesto de conjugado de una proteina con un agente se mide en 20,0 Da. En realizaciones adicionales de los metodos que se exponen en el presente documento, la masa del compuesto de conjugado de una proteina con un agente se mide en 21,0 Da. En realizaciones adicionales de los metodos que se exponen en el presente documento, la masa del compuesto de conjugado de una proteina con un agente se mide en 22,0 Da. En realizaciones adicionales de los metodos que se exponen en el presente documento, la masa del compuesto de conjugado de una proteina con un agente se mide en 23.0 Da. En realizaciones adicionales de los metodos que se exponen en el presente documento, la masa del compuesto de conjugado de una proteina con un agente se mide en 24,0 Da. En realizaciones adicionales de los metodos que se exponen en el presente documento, la masa del compuesto de conjugado de una proteina con un agente se mide en 25,0 Da.
En realizaciones adicionales de los metodos que se exponen en el presente documento, la masa del compuesto de conjugado de una proteina con un agente se mide en 100 ppm del valor teorico. En otras realizaciones, la masa del compuesto de conjugado de una proteina con un agente se mide en 80, 90, 100, 110, 120, o 130 ppm del valor teorico.
La presente divulgacion expone metodos para el ensayo de masa nativa intacta de conjugados de una proteina con un agente. La presente divulgacion tambien expone metodos para la determinacion de la masa nativa intacta de conjugados de una proteina con un agente.
La presente divulgacion expone un metodo para la detection de la masa de un compuesto de conjugado de una proteina con un agente asociados no covalentemente proporcionando un compuesto de conjugado de una proteina con un agente no desnaturalizado en una sal volatil y libre de sales no volatiles; introduciendo el compuesto de conjugado de una proteina con un agente en un espectrometro de masas; y estableciendo directamente la masa del compuesto de conjugado de una proteina con un agente por espectrometria de masas.
La presente divulgacion proporciona metodos en los que el conjugado de una proteina con un agente se introduce en un espectrometro de masas. En mas de estas realizaciones, la masa del compuesto de conjugado de una proteina con un agente intacto se mide directamente. En una de estas realizaciones, el compuesto de conjugado de una proteina con un agente es no desnaturalizado y en formato amonico. En algunas de estas realizaciones, el compuesto de conjugado de una proteina con un agente es no desnaturalizado y en acetato amonico. En otras de estas realizaciones el compuesto de conjugado de una proteina con un agente es no desnaturalizado y en carbonato amonico. En algunas de estas realizaciones, el compuesto de conjugado de una proteina con un agente es un compuesto de conjugado de un anticuerpo con un agente que es no desnaturalizado y en carbonato amonico. En alguna de estas realizaciones, el compuesto de conjugado de una proteina con un agente es un compuesto de conjugado de un anticuerpo con un agente que no esta desnaturalizado y en carbonato amonico. En algunas de estas realizaciones, el compuesto de conjugado de una proteina con un agente es un compuesto de conjugado de un anticuerpo con un agente que es no desnaturalizado y en formato amonico. En algunas de estas realizaciones, el compuesto de conjugado de una proteina con un agente es un compuesto de conjugado de anticuerpo con un agente que es no desnaturalizado y en acetato amonico.
La presente divulgacion proporciona metodos en los que un conjugado de una protelna con una agente se introduce en un espectrometro de masas. En mas de estas realizaciones, la masa del compuesto de conjugado de una protelna con un agente intacto se mide directamente. En algunas de otras realizaciones, el compuesto de conjugado de una protelna y un agente es un compuesto de conjugado de un fragmento de anticuerpo con un agente, que no esta desnaturalizado y en carbonato amonico. En alguna de estas realizaciones, el compuesto de conjugado de una protelna con un agente es un compuesto de conjugado de un fragmento de anticuerpo con un agente que no esta desnaturalizado y en formato amonico. En algunas de estas realizaciones, el compuesto de conjugado de una protelna con un agente es un compuesto de conjugado de un fragmento de anticuerpo con un agente que no esta desnaturalizado y en acetato amonico.
La presente divulgacion proporciona metodos en los que el conjugado de una protelna con un agente se introduce en un espectrometro de masas. En mas de estas realizaciones, la masa del compuesto de conjugado de una protelna con un agente intacto se mide directamente. En algunas de estas realizaciones, el compuesto de conjugado de una protelna con un agente es no desnaturalizado. En algunas de estas realizaciones, el conjugado de una protelna con un agente esta en formato amonico y el agente es un farmaco. En algunas de estas realizaciones, el conjugado de una protelna y un agente esta en formato amonico y el agente es un farmaco. En algunas realizaciones, el conjugado de una protelna con un agente esta en carbonato amonico y el agente es un farmaco. En cualquiera de estas realizaciones, el farmaco incluye MMAE o MMAF.
En realizaciones relacionadas, los metodos descritos en el presente documento proporcionan que el compuesto de conjugado de una protelna con un agente es un compuesto de conjugado de un anticuerpo con un agente que es no desnaturalizado. En algunas de estas realizaciones, el conjugado de una protelna con un agente esta en carbonato amonico y el agente es un farmaco. En algunas de estas realizaciones, el conjugado de una protelna con un agente esta en formato amonico y el agente es un farmaco. En algunas de estas realizaciones, el conjugado de una protelna con un agente esta en acetato amonico y el agente es un farmaco. En algunas realizaciones, el farmaco incluye, pero no se limita a MMAE o MMAF. En cualquiera de estas realizaciones, el farmaco incluye MMAE. En alguna de estas realizaciones, el farmaco es MMAF.
La presente divulgacion proporciona metodos en los que el conjugado de una protelna con un agente se introduce en un espectrometro de masas. En mas de estas realizaciones, la masa del compuesto de conjugado de una protelna con un agente intacto se mide directamente. En algunas de estas realizaciones, el compuesto de conjugado de una protelna con un agente es no desnaturalizado. En algunas realizaciones, el conjugado de una protelna con un agente esta en formato amonico y el agente es una toxina. En algunas otras realizaciones, el conjugado de una protelna con un agente esta en carbonato amonico y el agente es una toxina. En algunas realizaciones, el conjugado de una protelna con un agente esta en acetato amonico y el agente es una toxina. En alguna de estas realizaciones, el agente es una toxina. En cualquiera de estas realizaciones, el agente es un farmaco.
La presente divulgacion proporciona metodos en los que el conjugado de protelna con un agente se introduce en un espectrometro de masas. En mas de estas realizaciones, la masa del compuesto de conjugado de una protelna con un agente intacto se mide directamente. En alguna de estas realizaciones, el compuesto de conjugado de una protelna con un agente es un compuesto de conjugado de un anticuerpo con un agente que no esta desnaturalizado. En algunas realizaciones, la concentracion de sal es entre 50 y 400 mM. En algunas de estas realizaciones, el agente es un farmaco. En algunas de estas realizaciones, el conjugado de una protelna con un agente esta en carbonato amonico, acetato amonico, o formato amonico.
En cualquiera de las realizaciones expuestas en el presente documento, los metodos pueden incluir la etapa en la que el compuesto de conjugado se introduce en un espectrometro de masas, y la masa del conjugado del anticuerpo con un agente intacto se mide directamente.
La presente divulgacion proporciona metodos en el que el conjugado de una protelna con un agente se introduce en un espectrometro de masas En mas de estas realizaciones, la masa del compuesto de conjugado de una protelna y un agente intacto se mide directamente. En algunas realizaciones, el compuesto de conjugado de una protelna con un agente es un compuesto de conjugado de una protelna con un agente que no esta desnaturalizado. En realizaciones relacionadas, el conjugado de protelna con un agente esta en acetato amonico, carbonato amonico, o en formato amonico. En algunas realizaciones, la concentracion de sales esta entre 50 y 400 mM. En algunas realizaciones, la concentracion de sal es de 200 mM. En otras realizaciones relacionadas, el agente es un farmaco. En otras realizaciones, el pH del tampon esta entre 5,0 y 7,0. En cualquiera de estas realizaciones el agente puede ser un farmaco.
En otro aspecto de los metodos descritos en el presente documento, el compuesto de conjugado de una protelna con un agente es un compuesto de conjugado de un anticuerpo con un agente que no esta desnaturalizado y en formato amonico; la concentracion de sal es de 200 mM; el agente es un farmaco; y el pH del tampon esta entre 5,0 y 7,0. En algunas de estas realizaciones, el conjugado de protelna con un agente esta en carbonato amonico, acetato amonico, o en formato amonico.
En otro aspecto, el compuesto de conjugado de una protelna con un agente que no esta desnaturalizado y en acetato amonico. En algunas realizaciones, la concentracion de sal es de 200 mM; el pH del tampon esta entre 5,0 y 7,0; y el agente es un farmaco.
En otro aspecto de los metodos del presente documento, el compuesto de conjugado de una protelna con un agente es un compuesto de conjugado de un anticuerpo con un agente que no esta desnaturalizado, la concentracion de sales es de 200 mM; el agente es un farmaco; y el pH del tampon es 6,5. En algunas de estas realizaciones, el conjugado de una protelna con un agente esta en carbonato amonico, acetato amonico, o en formato amonico. En algunas de estas realizaciones, el agente incluye un farmaco, en el que el farmaco es un farmaco descrito en el presente documento.
En un aspecto de la presente divulgacion el compuesto de conjugado de una protelna con un agente esta no desnaturalizado, se aplica un medio de separacion en condiciones no desnaturalizantes para el compuesto de conjugado de una protelna con un agente en una matriz para efectuar la separacion del compuesto de conjugado de una protelna con un agente de la matriz. En algunas realizaciones, el compuesto de conjugado de una protelna con un agente esta sustancialmente no desnaturalizado, el conjugado se introdujo en un espectrometro de masas, y la masa de compuesto de conjugado de una protelna con un agente intacto se mide directamente. En algunas de estas realizaciones, el conjugado de una protelna con un agente esta en carbonato amonico, acetato amonico, o formato amonico.
La presente divulgacion proporciona metodo en los que un conjugado de una protelna con un agente se introduce en un espectrometro de masas. En mas de estas realizaciones, la masa del compuesto de conjugado de una protelna con un agente intacto se mide directamente. En otro aspecto de los metodos expuestos en el presente documento, el c compuesto de conjugado de una protelna con un agente esta no desnaturalizado, y se aplica un medio de separacion en condiciones no desnaturalizantes para el compuesto de conjugado de una protelna con un agente en una matriz para efectuar la separacion del compuesto de conjugado de una protelna con un agente de la matriz, por lo que el compuesto de conjugado de una protelna con un agente esta sustancialmente no desnaturalizado. En algunas de estas realizaciones, el compuesto de conjugado de una protelna con un agente esta en carbonato amonico. En algunas de estas realizaciones, el compuesto de conjugado de una protelna con un agente esta en acetato amonico. En realizaciones relacionadas, se aplica un medio de separacion en condiciones no desnaturalizantes para el conjugado de protelna en una matriz para efectuar la separacion del compuesto de conjugado de una protelna con un agente de la matriz. En realizaciones relacionadas, el medio de separacion es SEC.
En cualquiera de los metodos anteriores, los metodos puede incluir que el compuesto de conjugado de una protelna con un agente es no desnaturalizado, se aplica un medio de separacion en condiciones no desnaturalizantes para el compuesto de conjugado de una protelna con un agente en una matriz para efectuar la separacion del compuesto de conjugado de una protelna con un agente de la matriz, por lo que el compuesto de conjugado de una protelna con un agente esta sustancialmente no desnaturalizada, y el medio de separacion es HlC en condiciones no desnaturalizante. En realizaciones relacionadas, el conjugado de una protelna con un agente esta en carbonato amonico. En realizaciones relacionadas, el conjugado de una protelna con un agente esta en acetato amonico. En realizaciones relacionadas, el conjugado de protelna con un agente esta en formato amonico.
En cualquiera de los metodos anteriores, los metodos pueden incluir que el compuesto de conjugado de una protelna con un agente es no desnaturalizado, se aplica un medio de separacion en condiciones no desnaturalizantes para el compuesto de conjugado de una protelna con un agente en una matriz para efectuar la separacion del compuesto de conjugado de una protelna con un agente de la matriz, por lo que el compuesto de conjugado de una protelna con un agente esta sustancialmente no desnaturalizado, y el medio de separacion es HlC en condiciones no desnaturalizantes. En realizaciones relacionadas, el conjugado de una protelna con un agente esta en carbonato amonico, formato amonico, o en acetato amonico, En cualquiera de los metodos descritos en el presente documento el medio de separacion puede incluir la SEC.
En otro aspecto de los metodos anteriores, el compuesto de conjugado de una protelna con un agente es un compuesto de conjugado de un anticuerpo con un agente, es no desnaturalizado, se aplica un medio de separacion en condiciones no desnaturalizantes para el compuesto de conjugado de un anticuerpo y un agente en una matriz para efectuar la separacion del compuesto de complejo de un anticuerpo con un agente de la matriz, por lo que el compuesto de conjugado de un anticuerpo con un agente esta sustancialmente no desnaturalizado, y el medio de separacion es SEC. En realizaciones relacionadas, el conjugado de protelna con un agente esta en carbonato amonico, en formato amonico, o en acetato amonico.
En un aspecto de los metodos en los que el conjugado de una protelna con un agente se introduce en un espectrometro de masas, y la masa del compuesto de conjugado de un anticuerpo con un agente intacto se mide directamente, el compuesto de conjugado de una protelna con un agente es un compuesto de un conjugado de anticuerpo con un agente, es no desnaturalizado, se aplica un medio de separacion en condiciones no desnaturalizantes para el compuesto de conjugado de un anticuerpo y un agente en una matriz para efectuar la separacion del compuesto de complejo de un anticuerpo con un agente de la matriz, por lo que el compuesto de conjugado de un anticuerpo con un agente esta sustancialmente no desnaturalizado, y el medio de separacion es HIC en condiciones no desnaturalizantes. En realizaciones relacionadas, el conjugado de proteina con un agente esta en carbonato amonico, en formato amonico, o en acetato amonico.
En un aspecto de los metodos en los que el conjugado de proteina se introduce en un espectrometro de masas, y la masa del compuesto de conjugado de un anticuerpo con un agente intacto se mide directamente, el compuesto de conjugado de una proteina con un agente es un compuesto de un conjugado de anticuerpo con un agente, es no desnaturalizado, se aplica un medio de separacion en condiciones no desnaturalizantes para el compuesto de conjugado de un anticuerpo y un agente en una matriz para efectuar la separacion del compuesto de complejo de un anticuerpo con un agente de la matriz, por lo que el compuesto de conjugado de un anticuerpo con un agente esta sustancialmente no desnaturalizado, y el medio de separacion es HIC en condiciones no desnaturalizantes. En realizaciones relacionadas, el conjugado de proteina con un agente esta en carbonato amonico, en formato amonico, o en acetato amonico. En realizaciones relacionadas, el medio de separacion es SEC y el espectrometro de masas es un ESI-MS.
En un aspecto de los metodos anteriores, el compuesto de conjugado de una proteina con un agente es un compuesto de conjugado de un anticuerpo con un agente, es no desnaturalizado, se aplica un medio de separacion en condiciones no desnaturalizantes para el compuesto de conjugado de un anticuerpo y un agente en una matriz para efectuar la separacion del compuesto de complejo de un anticuerpo con un agente de la matriz, por lo que el compuesto de conjugado de un anticuerpo con un agente esta sustancialmente no desnaturalizado, y el medio de separacion es SEC, el conjugado se introduce en un espectrometro de masas, el espectrometro de masas es un ESI-MS, y la masa del compuesto de conjugado de un anticuerpo con un agente intacto se mide directamente. En realizaciones relacionadas, el conjugado de proteina con un agente esta en carbonato amonico, en formato amonico, o en acetato amonico.
En otro aspecto de los metodos anteriores, el compuesto de conjugado de una proteina con un agente es un compuesto de un conjugado de anticuerpo con un agente, es no desnaturalizado, se aplica un medio de separacion en condiciones no desnaturalizantes para el compuesto de conjugado de un anticuerpo y un agente en una matriz para efectuar la separacion del compuesto de complejo de un anticuerpo con un agente de la matriz, por lo que el compuesto de conjugado de un anticuerpo con un agente esta sustancialmente no desnaturalizado, y el medio de separacion es SEC. En realizaciones relacionadas, el conjugado de proteina con un agente esta en carbonato amonico, en formato amonico, o en acetato amonico.
En un aspecto de los metodos anteriores, el compuesto de conjugado de una proteina con un agente es un compuesto de un conjugado de anticuerpo con un agente, el conjugado es no desnaturalizado, se aplica un medio de separacion en condiciones no desnaturalizantes para el compuesto de conjugado de un anticuerpo y un agente en una matriz para efectuar la separacion del compuesto de complejo de un anticuerpo con un agente de la matriz, por lo que el compuesto de conjugado de un anticuerpo con un agente esta sustancialmente no desnaturalizado, y el medio de separacion es HIC en condiciones no desnaturalizantes, el conjugado se introduce en un espectrometro de masas y el espectrometro de masas es un ESI-MS. En realizaciones relacionadas, el conjugado de proteina con un agente esta en carbonato amonico, en formato amonico, o en acetato amonico.
En cualquiera de los metodos descritos en el presente documento, los metodos pueden incluir la etapa en la que la masa del compuesto de conjugado de un anticuerpo con un agente intacto se mide directamente. En cualquiera de los metodos descritos en el presente documento, el conjugado de proteina con un agente puede estar presente en carbonato amonico, en formato amonico, o en acetato amonico.
En otro aspecto de los metodos anteriores, el compuesto de conjugado de una proteina con un agente es un compuesto de un conjugado de anticuerpo con un agente, es no desnaturalizado, se aplica un medio de separacion en condiciones no desnaturalizantes para el compuesto de conjugado de un anticuerpo y un agente en una matriz para efectuar la separacion del compuesto de complejo de un anticuerpo con un agente de la matriz, por lo que el compuesto de conjugado de un anticuerpo con un agente esta sustancialmente no desnaturalizado, y el medio de separacion es HIC en condiciones no desnaturalizantes. En realizaciones relacionadas, el conjugado de proteina con un agente esta en carbonato amonico, en formato amonico, o en acetato amonico. En realizaciones relacionadas, el espectrometro de masas es un ESI-MS. En algunas otras realizaciones relacionadas, el conjugado de una proteina con un agente se introduce continuamente en un espectrometro de masas.
En cualquiera de los metodos descritos en el presente documento en el que el conjugado de una proteina con un agente se introduce en un espectrometro de masas, el conjugado se puede introducir de manera continua. En cualquiera de los metodos descritos en el presente documento en el que el conjugado de una proteina con un agente se introduce en un espectrometro de masas, el conjugado se puede introducir continuamente.
En otro aspecto de los metodos anteriores, el compuesto de conjugado de una proteina con un agente es un compuesto de un conjugado de anticuerpo con un agente, es no desnaturalizado, se aplica un medio de separacion en condiciones no desnaturalizantes para el compuesto de conjugado de un anticuerpo y un agente en una matriz para efectuar la separacion del compuesto de complejo de un anticuerpo con un agente de la matriz, por lo que el compuesto de conjugado de un anticuerpo con un agente esta sustancialmente no desnaturalizado, y el medio de separacion es SEC, y el espectrometro de masas es un ESI-MS. En realizaciones relacionadas, el conjugado de protelna con un agente esta en carbonato amonico, en formato amonico, o en acetato amonico.
En un aspecto de los metodos anteriores, el compuesto de conjugado de una protelna con un agente es un compuesto de un conjugado de anticuerpo con un agente, es no desnaturalizado, se aplica un medio de separacion en condiciones no desnaturalizantes para el compuesto de conjugado de un anticuerpo y un agente en una matriz para efectuar la separacion del compuesto de complejo de un anticuerpo con un agente de la matriz, por lo que el compuesto de conjugado de un anticuerpo con un agente esta sustancialmente no desnaturalizado, y el medio de separacion es HIC en condiciones no desnaturalizantes. En realizaciones relacionadas, el conjugado de protelna con un agente esta en carbonato amonico, en formato amonico, o en acetato amonico.
En cualquiera de los metodos descritos en el presente documento, el espectrometro de masas puede incluir un ESI-MS.
En otro aspecto de los metodos anteriores, el compuesto de conjugado de una protelna con un agente es un compuesto de un conjugado de anticuerpo con un agente, es no desnaturalizado, se aplica un medio de separacion en condiciones no desnaturalizantes para el compuesto de conjugado de un anticuerpo y un agente en una matriz para efectuar la separacion del compuesto de complejo de un anticuerpo con un agente de la matriz, por lo que el compuesto de conjugado de un anticuerpo con un agente esta sustancialmente no desnaturalizado, y el medio de separacion es SEC, y el espectrometro de masas es ESI-MS. En realizaciones relacionadas, el conjugado de protelna con un agente esta en carbonato amonico, en formato amonico, o en acetato amonico.
La presente divulgacion proporciona metodos en los que el medio de separacion es SEC, el conjugado de protelna se introduce en un espectrometro de masas, el espectrometro de masas es un ESI-MS, y la masa del compuesto de un conjugado de anticuerpo con un agente intacto se mide directamente y la masa del compuesto de un conjugado de anticuerpo con un agente se cuantifica. En otro aspecto, el compuesto de conjugado de una protelna con un agente es un compuesto de un conjugado de anticuerpo con un agente, que no esta desnaturalizado se aplica un medio de separacion en condiciones no desnaturalizantes para el compuesto de conjugado de un anticuerpo y un agente en una matriz para efectuar la separacion del compuesto de complejo de un anticuerpo con un agente de la matriz, por lo que el compuesto de conjugado de un anticuerpo con un agente esta sustancialmente no desnaturalizado En realizaciones relacionadas, el conjugado de protelna con un agente esta en carbonato amonico, en formato amonico, o en acetato amonico. En otras realizaciones relacionadas, el medio de separacion es HIC en condiciones no desnaturalizantes.
En un aspecto, el compuesto de conjugado de una protelna con un agente es un compuesto de un conjugado de anticuerpo con un agente, el conjugado de una protelna con un agente es no desnaturalizado, se aplica un medio de separacion en condiciones no desnaturalizantes para el compuesto de conjugado de un anticuerpo y un agente en una matriz para efectuar la separacion del compuesto de complejo de un anticuerpo con un agente de la matriz, por lo que el compuesto de conjugado de un anticuerpo con un agente esta sustancialmente no desnaturalizado, y el medio de separacion es SEC, la columna de SEC es de silicio, poliestireno-divinilbenceno o polihidroxietilaspartamida, y el compuesto de un conjugado de anticuerpo con un agente se introduce en un espectrometro de masas, y la masa del compuesto de un conjugado de anticuerpo con un agente intacto se mide directamente. En realizaciones relacionadas, el conjugado de protelna con un agente esta en carbonato amonico, en formato amonico, o en acetato amonico.
En un aspecto de los metodos anteriores, el compuesto de conjugado de una protelna con un agente es un compuesto de un conjugado de anticuerpo con un agente, el conjugado de una protelna con un agente es no desnaturalizado, se aplica un medio de separacion en condiciones no desnaturalizantes para el compuesto de conjugado de un anticuerpo y un agente en una matriz para efectuar la separacion del compuesto de complejo de un anticuerpo con un agente de la matriz, por lo que el compuesto de conjugado de un anticuerpo con un agente esta sustancialmente no desnaturalizado, y el medio de separacion es SEC. En realizaciones relacionadas la columna de SEC es de sllice. En realizaciones relacionadas, el conjugado de protelna con un agente esta en carbonato amonico, en formato amonico, o en acetato amonico. En otras realizaciones relacionadas, la SEC incluye poliestireno-divinilbenceno.
En cualquiera de los metodos del presente documento en los que el conjugado de anticuerpo con un agente se introduce en un espectrometro de masas, y la masa del compuesto de conjugado de un anticuerpo con un agente intacto se mide directamente, los metodos pueden incluir adicionalmente que el compuesto de conjugado de una protelna con un agente es un compuesto de un conjugado de anticuerpo con un agente, es no desnaturalizado, se aplica un medio de separacion en condiciones no desnaturalizantes para el compuesto de conjugado de un anticuerpo y un agente en una matriz para efectuar la separacion del compuesto de complejo de un anticuerpo con un agente de la matriz, por lo que el compuesto de conjugado de un anticuerpo con un agente esta sustancialmente no desnaturalizado, y el medio de separacion es SEC, y la columna de SEC es de polihidroxietil-aspartamida. En realizaciones relacionadas, el conjugado de protelna con un agente esta en carbonato amonico, en formato amonico, o en acetato amonico.
En cualquiera de los metodos del presente documento en los que el conjugado de anticuerpo con un agente se introduce en un espectrometro de masas, y la masa del compuesto de conjugado de un anticuerpo con un agente intacto se mide directamente, los metodos pueden incluir adicionalmente los siguientes aspectos. En otro aspecto, el compuesto de conjugado de una protelna con un agente es un compuesto de un conjugado de anticuerpo con un agente, es no desnaturalizado, se aplica un medio de separation en condiciones no desnaturalizantes para el compuesto de conjugado de un anticuerpo y un agente en una matriz para efectuar la separacion del compuesto de complejo de un anticuerpo con un agente de la matriz, por lo que el compuesto de conjugado de un anticuerpo con un agente esta sustancialmente no desnaturalizado, y el medio de separacion es SEC, y la columna de SEC es de polihidroxietil-aspartamida. En realizaciones relacionadas, el conjugado de protelna con un agente esta en carbonato amonico, en formato amonico, o en acetato amonico.
En realizaciones relacionadas, el compuesto de conjugado de una protelna con un agente es un compuesto de un conjugado de anticuerpo con un agente, el conjugado de una protelna con un agente opcionalmente esta desglicosilado, el conjugado de una protelna con un agente no esta desnaturalizado, se aplica un medio de separacion en condiciones no desnaturalizantes para el compuesto de conjugado de un anticuerpo y un agente en una matriz para efectuar la separacion del compuesto de complejo de un anticuerpo con un agente de la matriz, por lo que el compuesto de conjugado de un anticuerpo con un agente esta sustancialmente no desnaturalizado, el medio de separacion es s Ec , y la columna de SEC es de sllice, poliestireno-divinilbenceno o polihidroxietilaspartamida. En realizaciones relacionadas, el conjugado de protelna con un agente esta en carbonato amonico, en formato amonico, o en acetato amonico.
En otro aspecto de los metodos en los que el conjugado de anticuerpo con un agente se introduce en un espectrometro de masas, y la masa del compuesto de conjugado de un anticuerpo con un agente intacto se mide directamente, los metodos pueden incluir los siguientes aspectos. En otro aspecto, el compuesto de conjugado de una protelna con un agente es un compuesto de un conjugado de anticuerpo con un agente, el conjugado de una protelna con un agente en un compuesto de un conjugado de anticuerpo con un agente esta desglicosilado, el conjugado de una protelna con un agente es no desnaturalizado, se aplica un medio de separacion en condiciones no desnaturalizantes para el compuesto de conjugado de un anticuerpo y un agente en una matriz para efectuar la separacion del compuesto de complejo de un anticuerpo con un agente de la matriz, por lo que el compuesto de conjugado de un anticuerpo con un agente esta sustancialmente no desnaturalizado, el medio de separacion es SEC, y la columna de SEC es de sllice, poliestireno-divinilbenceno o polihidroxietil-aspartamida. En realizaciones relacionadas el compuesto de conjugado de una protelna con un agente es un compuesto de un conjugado de anticuerpo con un agente, es no desnaturalizado. En realizaciones relacionadas, el conjugado de protelna con un agente esta en carbonato amonico y la concentration de carbonato amonico esta entre 50 y 400 mM. En otras realizaciones, el conjugado de protelna con una agente esta en formato amonico y la concentracion de formato amonico esta entre 50 y 400 mM.
En cualquiera de los metodos descritos en el presente documento, los metodos pueden proporcionar que el conjugado de una protelna con un agente esta en carbonato amonico y la concentracion de carbonato amonico esta entre 50 y 400 mM. En cualquiera de los metodos descritos en el presente documento, los metodos pueden proporcionar que el conjugado de una protelna con un agente esta en acetato amonico y la concentracion de acetato amonico esta entre 50 y 400 mM. En cualquiera de los metodos descritos en el presente documento, los metodos pueden proporcionar que el conjugado de una protelna con un agente esta en formato amonico y la concentracion del formato amonico esta entre 50 y 400 mM.
En otro aspecto de los metodos en los que el conjugado de protelna se introduce en un espectrometro de masas, y la masa del compuesto de conjugado de un anticuerpo con un agente intacto se mide directamente, los metodos pueden incluir los siguientes aspectos. En un aspecto el medio de separacion tiene condiciones no desnaturalizantes para el compuesto de conjugado de un anticuerpo y un agente en una matriz y se aplica para efectuar la separacion del compuesto de complejo de un anticuerpo con un agente de la matriz, por lo que el compuesto de conjugado de un anticuerpo con un agente esta sustancialmente no desnaturalizado, el medio de separacion es SEC. En realizaciones relacionadas la columna de SEC es de sllice, poliestireno-divinilbenceno o polihidroxietil-aspartamida. En cualquiera de los metodos descritos en el presente documento, los metodos pueden proporcionar que el conjugado de una protelna con un agente este en carbonato amonico y la concentracion de carbonato amonico sea de entre 50 y 400 mM. En cualquiera de los metodos descritos en el presente documento, los metodos pueden proporcionar que el conjugado de una protelna con un agente este en acetato amonico y la concentracion de acetato amonico sea de entre 50 y 400 mM. En cualquiera de los metodos descritos en el presente documento, los metodos pueden proporcionar que el conjugado de una protelna con un agente este en formato amonico y la concentracion de formato amonico sea de entre 50 y 400 mM.
En realizaciones relacionadas, el compuesto de conjugado de una protelna con un agente es un compuesto de un conjugado de anticuerpo con un agente, el conjugado de una protelna con un agente es no desnaturalizado, se aplica un medio de separacion en condiciones no desnaturalizantes para el compuesto de conjugado de un anticuerpo y un agente en una matriz para efectuar la separacion del compuesto de complejo de un anticuerpo con un agente de la matriz, por lo que el compuesto de conjugado de un anticuerpo con un agente esta sustancialmente no desnaturalizado, y el medio de separacion es SEC, y la columna de SEC es de sllice, poliestireno-divinilbenceno o polihidroxietil-aspartamida. En realizaciones relacionadas, el conjugado de protelna con una agente esta en formato amonico a una concentracion de entre 50 y 400 mM y el pH es de 6,5, el conjugado de protelna con un agente esta en carbonato amonico a una concentracion de entre 50 y 400 mM y el pH de 6,5, o el conjugado de protelna con un agente esta en acetato amonico a una concentracion de entre 50 y 400 mM y el pH de 6,5. En otras realizaciones relacionadas, el conjugado de protelna con un agente esta en formato amonico a una concentracion de 250 mM y el pH de 6,5, el conjugado de protelna con un agente esta en carbonato amonico a una concentracion de 250 mM y el pH de 6,5, o el conjugado de protelna con un agente esta en acetato amonico a una concentracion de 250 mM y el pH de 6,5.
En cualquiera de los metodos descritos en el presente documento, los metodos pueden incluir opcionalmente que el conjugado de protelna con un agente esta en formato amonico a una concentracion de 50 mM y el pH de 6,5, el conjugado de protelna con un agente esta en carbonato amonico a una concentracion de 50 mM y el pH de 6,5, o el conjugado de protelna con un agente esta en acetato amonico a una concentracion de 50 mM y el pH de 6,5.
En cualquiera de los metodos descritos en el presente documento, los metodos pueden incluir opcionalmente que el conjugado de protelna con un agente esta en formato amonico a una concentracion de 150 mM y el pH de 6,5, el conjugado de protelna con un agente esta en carbonato amonico a una concentracion de 150 mM y el pH de 6,5, o el conjugado de protelna con un agente esta en acetato amonico a una concentracion de 150 mM y el pH de 6,5.
En cualquiera de los metodos descritos en el presente documento, los metodos pueden incluir opcionalmente que el conjugado de protelna con un agente esta en formato amonico a una concentracion de 250 mM y el pH de 6,5, el conjugado de protelna con un agente esta en carbonato amonico a una concentracion de 250 mM y el pH de 6,5, o el conjugado de protelna con un agente esta en acetato amonico a una concentracion de 250 mM y el pH de 6,5.
En cualquiera de los metodos descritos en el presente documento, los metodos pueden incluir opcionalmente que el conjugado de protelna con un agente esta en formato amonico a una concentracion de 400 mM y el pH de 6,5, el conjugado de protelna con un agente esta en carbonato amonico a una concentracion de 400 mM y el pH de 6,5, o el conjugado de protelna con un agente esta en acetato amonico a una concentracion de 400 mM y el pH de 6,5.
En otro aspecto de los metodos del presente documento en los que el compuesto de un conjugado de anticuerpo con un agente se introduce en un espectrometro de masas, la masa del compuesto de un conjugado de anticuerpo con un agente intacto se mide directamente, y el espectrometro de masas es un ESI-MS, los metodos pueden incluir los siguientes aspectos. En un aspecto, el compuesto de conjugado de una protelna con un agente es un compuesto de un conjugado de anticuerpo con un agente y no esta desnaturalizado. En realizaciones relacionadas, el conjugado de protelna con un agente esta en formato amonico a una concentracion de 250 mM y el pH de 6,5, el conjugado de protelna con un agente esta en carbonato amonico a una concentracion de 250 mM y el pH de 6,5, o el conjugado de protelna con un agente esta en acetato amonico a una concentracion de 250 mM y el pH de 6,5.
En otro aspecto de los metodos del presente documento en los que el compuesto de un conjugado de anticuerpo con un agente se introduce en un espectrometro de masas, la masa del compuesto de un conjugado de anticuerpo con un agente intacto se mide directamente, y el espectrometro de masas es un ESI-MS, los metodos pueden incluir los siguientes aspectos. En un aspecto, el compuesto de conjugado de una protelna con un agente es un compuesto de un conjugado de anticuerpo con un agente, el conjugado de una protelna con un agente no esta desnaturalizado, se aplica un medio de separacion en condiciones no desnaturalizantes para el compuesto de conjugado de un anticuerpo y un agente en una matriz para efectuar la separacion del compuesto de complejo de un anticuerpo con un agente de la matriz, por lo que el compuesto de conjugado de un anticuerpo con un agente esta sustancialmente no desnaturalizado, y el medio de separacion es SEC, y la columna de SEC es de polihidroxietil-aspartamida. En realizaciones relacionadas el conjugado de protelna con un agente esta en formato amonico a una concentracion de 250 mM y el pH de 6,5, el conjugado de protelna con un agente esta en carbonato amonico a una concentracion de 250 mM y el pH de 6,5, o el conjugado de protelna con un agente esta en acetato amonico a una concentracion de 250 mM y el pH de 6,5.
En otro aspecto de los metodos del presente documento en los que el compuesto de un conjugado de anticuerpo con un agente se introduce en un espectrometro de masas, la masa del compuesto de un conjugado de anticuerpo con un agente intacto se mide directamente, y el espectrometro de masas es un ESI-MS, los metodos pueden incluir los siguientes aspectos. En un aspecto, el compuesto de conjugado de una protelna con un agente es un compuesto de un conjugado de anticuerpo con un agente y no esta desnaturalizado, se aplica un medio de separacion en condiciones no desnaturalizantes para el compuesto de conjugado de un anticuerpo y un agente en una matriz para efectuar la separacion del compuesto de complejo de un anticuerpo con un agente de la matriz, por lo que el compuesto de conjugado de un anticuerpo con un agente esta sustancialmente no desnaturalizado, y el medio de separacion es SEC, y la columna de SEC es de polihidroxietil-aspartamida. En realizaciones relacionadas el conjugado de protelna con un agente esta en formato amonico a una concentracion de 250 mM y el pH de 6,5, el conjugado de protelna con un agente esta en carbonato amonico a una concentracion de 250 mM y el pH de 6,5, o el conjugado de protelna con un agente esta en acetato amonico a una concentracion de 250 mM y el pH de 6,5.
En algunos metodos del presente documento en los que el compuesto de un conjugado de anticuerpo con un agente esta sustancialmente no desnaturalizado, el medio de separacion es SEC, y la columna de SEC es de polihidroxietilaspartamida. En realizaciones relacionadas el conjugado de protelna con un agente esta en formato amonico a una concentracion de 250 mM y el pH de 6,5, el conjugado de protelna con un agente esta en carbonato amonico a una concentracion de 250 mM y el pH de 6,5, o el conjugado de protelna con un agente esta en acetato amonico a una concentracion de 250 mM y el pH de 6,5.
En otro aspecto de los metodos del presente documento en los que el compuesto de un conjugado de anticuerpo con un agente se introduce en un espectrometro de masas, la masa del compuesto de un conjugado de anticuerpo con un agente intacto se mide directamente, y el espectrometro de masas es un ESI-MS, los metodos pueden incluir los siguientes aspectos. En un aspecto de un metodo descrito en el presente documento, el compuesto de conjugado de una protelna con un agente es un compuesto de un conjugado de anticuerpo con un agente, el agente es un farmaco, se aplica un medio de separacion en condiciones no desnaturalizantes para el compuesto de conjugado de un anticuerpo y un agente en una matriz para efectuar la separacion del compuesto de complejo de un anticuerpo con un agente de la matriz, por lo que el compuesto de conjugado de un anticuerpo con un agente esta sustancialmente no desnaturalizado, el medio de separacion es SEC, y la columna de SEC es de polihidroxietilaspartamida. En realizaciones relacionadas el conjugado de protelna con un agente esta en formato amonico a una concentracion de 250 mM y el pH de 6,5, el conjugado de protelna con un agente esta en carbonato amonico a una concentracion de 250 mM y el pH de 6,5, o el conjugado de protelna con un agente esta en acetato amonico a una concentracion de 250 mM y el pH de 6,5.
En algunas realizaciones, los metodos descritos en el presente documento incluyen la rapida determinacion de la masa intacta de los compuestos de conjugado de una protelna con un agente asociados no covalentemente. En una realizacion un compuesto de un conjugado de anticuerpo con un agente de cadenas pesadas (HC) y cadenas ligeras (LC) estan presentes como un complejo como resultado de la reduccion del anticuerpo y la conjugacion posterior de un farmaco en los restos de cistelna intercatenarios. Los metodos descritos en el presente documento pueden incluir la etapa de analizar el ADC utilizando condiciones de desalacion nativas, en las que la estructura bivalente e intacta del ADC se mantiene. Realizaciones adicionales incluyen la etapa en la que la masa del ADC desalado se determina posteriormente utilizando condiciones de desolvatacion e ionizacion. En algunas de estas realizaciones, las condiciones de desolvatacion e ionizacion son condiciones convencionales de desolvatacion e ionizacion.
Los metodos descritos en el presente documento pueden incluir el analisis de ADC con cisteinilos unidos presentando un metodo de medicion de masa y desalacion basado en cromatografla de exclusion por tamano (SEC) semi-nativa. El metodo puede incluir tambien la medicion de la masa intacta de los ad con cistelnas intercatenarias unidas, y la cuantificacion de la distribucion relativa de especies con farmacos unidos por intensidad ionica desglosada. El metodo descrito en el presente documento se puede adaptar para la determinacion de masas de ADC de alto rendimiento.
El metodo descrito en el presente documento puede incluir la etapa opcional de desglicosilacion del ADC. La etapa de desglicosilacion puede incluir el uso de PNGasa F u otros compuestos conocidos por el experto en la tecnica. Los metodos descritos en el presente documento pueden incluir la etapa de eliminacion de la heterogeneidad de glicanos. En ciertas realizaciones, los metodos proporcionan una intensidad de senal mejorada, aumentada o mayor de cada especie de farmaco cargado. En realizaciones adicionales, los metodos incluyen la etapa de cuantificacion. La presente divulgacion proporciona metodos en los que la desglicosilacion permite una mejor precision de masas debido a una intensidad de senal de MS aumentada.
Ademas de la desglicosilacion opcional, el metodo del presente documento puede incluir una etapa de un medio de separacion. La etapa del medio de separacion incluye distintas tecnicas cromatograficas, por ejemplo SEC o HIC. En esta etapa el ADC se intercambia de un sistema de tampon a una sal volatil que soporta la carga positiva de aminoacidos basicos para la medicion de la masa. En algunas de estas realizaciones, se eliminan las seles no volatiles, tensioactivos y tampones del ADC. En otras realizaciones, la etapa cromatografica se lleva a cabo utilizando la SEC en condiciones no desnaturalizantes, mientras se permite un intercambio de tampon del ADC en una sal volatil.
El metodo que se expone en el presente documento puede incluir una etapa de espectrometrla de masas. En ciertos aspectos, la MS puede ser inmediatamente a continuacion de la etapa de medio de separacion. En otros aspectos, puede haber etapas de intervencion entre la etapa de medio de separacion y la de MS. En otros aspectos mas, la etapa de MS puede ser continua a continuacion de la etapa de medio de separacion. En la etapa de MS, la masa del ADC se mide. Adicionalmente, los metodos expuestos en el presente documento pueden proporcionar que se determina la carga cuantitativa de farmaco mediante una MS de abundancia de iones. En un aspecto, la MS se lleva a cabo en un a TOF-MS, una Q-TQF, FTICR, Orbitrap, o MS de trampa de iones de alta resolucion. En esta etapa, la masa se mide con un espectrometro de masas de alta resolucion y los datos de multiple carga (m/z) se desglosa a espectro de masas de carga cero. Las especies cargadas de farmacos individuales se cuantifican basandose en la intensidad ionica del espectro desglosado que es un producto de la intensidad de los datos en bruto sin procesar. Los datos de ESI-MS en bruto de las protelnas se visualiza normalmente como una serie de iones cargados en los que una unica especie molecular puede tener varios iones asociados con ella y cada uno de los iones relacionados se diferenciara en el numero de cargas positivas. El desglose de los datos en bruto se refiere a que el procedimiento de determination del numero de cargas de cada ion se lleva a cabo y se convierten todos los iones relacionados en un espectro de masas de carga cero que representa en peso molecular de las especies que se estan analizando. Cada ion en los datos en brutos que se relaciona con una especie particular en el espectro de masas desglosado tiene una medida de intensidad o abundancia asociada con el, y la abundancia de todos los iones asociados con una especie en particular constituye de esta manera una aproximacion de la abundancia de esta especie en la muestra que se analiza. Cuando se cuantifican las especies, la abundancia de una especie particular en una muestra se compara con la suma de la abundancia de todas las especies relacionadas en la muestra dando as! una medida de la abundancia molar relativa de esa especie en particular. La cuantificacion de esta manera asume en ciertos casos, que todas las especies tienen aproximadamente una eficacia de ionization equivalente.
III. Farmacocinetica
Es necesario el control de los niveles circulantes de un agente terapeutico para las determinaciones farmacocineticas (PK) en un mamlfero, que incluyen la semivida, aclaramiento, area bajo la curva (AUC), y volumen de distribution, para establecer los llmites de seguridad/toxicidad y regimen de dosificacion apropiados (Welling, P. (1997) Pharmacokinetics Processes, Mathematics, and Applications, 2a Ed., American Chemical Society, Washington, D.C.). La biodisponibilidad es la extension hasta la cual el compuesto administrado alcanza la circulation general a partir de la forma de dosis administrada, habitualmente se expresa como un porcentaje de la dosis administrada. La semivida de un compuesto es el tiempo necesario para la elimination del 505 de la concentration pico en el plasma del compuesto por excretion o biotransformacion (metabolismo) El Indice terapeutico expresa la selectividad del compuesto entre la actividad terapeutica deseada y los efectos secundarios toxicos no deseados. Las mediciones farmacocineticas aclaran la absorcion, distribucion, metabolismo, y excrecion (ADME) de los conjugados de un anticuerpo con un farmaco (ADC).
IV. Carga del farmaco
El numero medio de farmacos por anticuerpos en las preparaciones de ADC a partir de las reacciones de conjugation se puede caracterizar por los metodos de la presente divulgation. Los metodos pueden determinar la cantidad de farmaco unido por anticuerpo (carga) de un ADC y la distribucion de restos de farmaco o fragmentos tales como una cadena pesada y una cadena ligera.
V. Administracion de conjugados de anticuerpo con un farmaco
Los ADC se pueden poner en contacto con, o administrarse en, fuentes biologicas por cualquier via apropiada a la afeccion que se va a tratar. El ADC se administrara normalmente a un mamlfero por via parenteral, por ejemplo, en infusion, subcutanea, intramuscular, intravenosa, intradermica, intratecal y epidural.
VI. Farmacos adecuados para su uso en los metodos descritos en el presente documento
Los farmacos a modo de ejemplo para la conjugacion con un anticuerpo incluyen farmacos o agentes citotoxicos particularmente los que se utilizan en la terapia del cancer. Dichos farmacos incluyen, en general, agentes que danan el ADN, anti-metabolitos, productos naturales y sus analogos. Las clases a modo de ejemplo de agentes citotoxicos incluyen los inhibidores enzimaticos, tales como los inhibidores de dihidrofolato reductasa, e inhibidores de timidilato sintasa, intercaladores de ADN, cortadores de ADN, inhibidores de topoisomerasa, familia de farmacos de antraciclina, farmacos de la vinca, las mitomicinas, las bleomicinas, nucleosidos citotoxicos, familia de farmacos de pteridina, dinenos, podofilotoxinas, las dolastinas, los maitansinoides, inductores de diferenciacion, y taxoles. Los restos farmacologicos ejemplores incluyen, pero no se limitan a: auristatinas (tales como MMAF y MMAE), metotrezato, metopterina, diclorometotrexato, 5-fluorouracilo, 6-mercaptopurina, arabinosido de citosina, melfalan, leurosina, leurosidelna, actinomicina, daunorrubicina, doxorrubicina, mitomicina C, mitomicina A, maitansinoides, carmomicina, aminopterina, talisomicina, podofilotoxina, y derivados de la podofilotoxlna tales como etoposido o fosfato de etoposido, vinblastina, vincristina, vindesina, taxol, taxotero, acido retinoico, acido butlrico, camptotecina, caliqueamicina, espiramicina, enedinas, y sus derivados y analogos.
El resto farmacologico de un ADC tambien puede incluir dolastatina y sus analogos peptldicos y derivados, las auristatinas (Pat. de EE. UU. N.° 5.635.483; 5.780.588). Se ha demostrado que las dolastatinas y auristatinas interfiere con la dinamica de microtubulos, hidrolisis de GTP, y division nuclear y celular (Woyke et al (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12):3580-3584) y tienen actividades anticancer (Pat. de EE. u nts Chemother. 42:2961-2965). En alUg. N.° 5.663.149) y antifungicas (Pettit et al (1998) Antimicrob. Age unas realizaciones, el farmaco es una auristatina, un agente anti-tubulina. El resto farmacologico de dolastatina o auristatina se puede unir al anticuerpo mediante el extremo N (amino) o el extremo C (carboxilo) del resto farmacologico peptldico (documento WO 02/088172). Las variantes de auristatina E se desvelan en la Pat. de EE. UU. N.° 5.767.237 y Pat. de EE. UU. N.° 6.124.431.
Los inmunoconjugados de MMAE y MMAF, su slntesis y estructura se desvelan en las Patentes de EE. UU. N.° 7.851.437; 7.829.531; 7.659.241; 7.498.298; 7.994.135; 7.964.567; cada una de las cuales se incorpora en el presente documento por referenda en su totalidad y para todos los fines. Las auristatinas incluyen pero no se limitan a la auristatina E y derivados de la misma. AFP, AEB, AEVB, MMAF, y MMAE son ejemplos de auristatnica que se pueden utilizar en el presente documento.
VII. Formulaciones farmaceuticas
Las formulaciones farmaceuticas de los ADC terapeuticos se preparan normalmente para su administracion parenteral, por ejemplo, en embalada intravenosa, inyeccion intratumoral como un vehlculo parenteral farmaceuticamente aceptable y en una forma de dosificacion unitaria inyectable. Un conjugado de un anticuerpo con un farmaco (ADC) que tenga el grado deseado de pureza se mezcla opcionalmente con diluyentes, vehlculos, excipientes o estabilizantes farmaceuticamente aceptables (Remington's Pharmaceutical Sciences (1980) 16a edicion, Osol, A. Ed.),en forma de una formulacion liofilizada o una solucion acuosa.
Los diluyentes, vehlculos, excipientes y estabilizadores aceptables son no toxicos para los receptores de la fuente biologica a las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen tapones tales como de fosfato, citrato y otros acidos organicos; antioxidantes que incluyen el acido ascorbico y la metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencil amonio, cloruro de hexametonio, cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol bencllico o butllico; alquil parabenos tales como el metil o propil parabeno; catecol, resorcinol, ciclohexanol,; 3-pentanol; y m-cresol); polipeptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 restos); protelnas, tales como seroalbumina, gelatina, o inmunoglobulinas; pollmeros hidrofilos tal como polivinilpirrolidona, aminoacidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, o lisina; monosacaridos, disacaridos, y otros carbohidratos incluyendo goma guar y dextrinas; azucares tales como glucosa, manosa, sacarosa, manitol, trealosa o sorbitol; agentes quelantes tal como EDTA; contraiones formadores de sales tal como socio; complejos metalicos (por ejemplo, complejos de Zn-protelna); y/o surfactantes no ionicos tal como TWEEN™, p Lu Ro NICS™ o polietilenglicol (PEG).
VIII. Desglicosilacion
La etapa opcional de desglicosilacion se emplea para reducir la heterogeneidad que resulta de la extension variable de restos de acido sialico y galactosa en los N-glicanos. La heterogeneidad del extremo N de glicanos se puede reducir con un tratamiento enzimatico con exoglicosidasa (por ejemplo, sialidasa y beta-galactosidasa, respectivamente) o por tratamiento con una endoglicosidasa con enzimas que eliminan el N-glicano del resto de Asn ocupado (por ejemplo, PNGasa-F) o enzimas que escinden entre el 1° y el 2° resto de N-acetilglucosamina en los N-glicanos (por ejemplo, Endo-F1, F2 o F3).
En un aspecto, la manera mas simple y mas eficaz de reducir la heterogeneidad de los N-glicanos es digerir con PNGasa-F. La etapa de desglicosilacion es opcional ya que la cuantificacion es aun posible dejando los glicanos intactos. Sin embargo, el espectro de MS se complica innecesariamente y sera necesario un espectrometro de masas de alto final para una cuantificacion reproducible.
IX. Cromatograffa
La retirada de sales no volatiles y tensioactivos ionicos y no ionicos de las muestras proteicas se produce antes de la medicion de masa. En una realizacion, el ADC se introduce en el espectrometro de masas y esta libre de sales no volatiles. En otra realizacion, el ADC se introduce en el espectrometro de masas y esta sustancialmente libre de sales no volatiles. En otra realizacion mas, el ADC se introduce en el espectrometro de masas y esta libre de sales no volatiles, con la excepcion de tensioactivos, por ejemplo, Las tecnicas de desalado de a Dc unido a cistelna deben mantener la estructura proteica nativa intacta mientras se eliminan tambien las sales no ionicas y los tensioactivos. Los tipos de columna cromatografica que pueden desalar y conservar la estructura nativa en sistemas de tampon compatibles con MS incluyen la exclusion por tamano (SE) y columnas HIC. Se preve que se pueden utilizar las columnas que no estan marcadas como columnas SEC, por ejemplo, las columnas HIC, en un modo tipo SEC. Las columnas se ejecutarlan, por ejemplo, en tampon de acetato amonico isocratico. La columna opera de dicha manera que prohlbe que entre la protelna en los poros del medio cromatografico mientras que permite que las sales no volatiles entren en los poros del medio cromatografico causando as! que la protelna se eluya primero en las condiciones del movil y las sales se eluyen despues. La migracion de las sales no volatiles esta retardada con respecto a la migracion de la protelna.
Las columnas SEC emplean un medio cromatografico que se compone normalmente de una fase estacionaria de sllice, poliestireno-divinilbenceno o polihidroxietil-aspartamida en forma de parflculas que varlan de tamano des 1,7 a 20 micrometres de diametro con tamanos de poro que varlan desde 60 a 2000 angstroms. En un aspecto, los poros tienen 60, 80, 100, 120, 150, 200, 300, 500, 1000, 2000, o 4000 A. En un aspecto, se puede utilizar cualquier material empaquetado en una columna SEC y tamanos de columna que pueden ser desde 0,1 a 7,8 mm de diametro interno y 50 a 600 mm de longitud. Los tamanos de columna pueden ser de 0,1, 0,15, 0,3, 0,5, 1, 2,0, 2,1, 3,0, 4,0, 4,6 o 7,8 mm. Las longitudes de columna pueden ser 50, 100, 150, 200, 250, 300 mm.
Esta clase de columnas elimina las sales no volatiles y tensioactivos de las protelnas debido a la inmensa diferencia de tamano de una con respecto a la otra. Especlficamente, las sales de molecula pequena y los tensioactivos interaction (por ejemplo, entran en los poros de las partlculas cromatograficas que hace que estas especies que se van a retrasar en su pasaje a traves de la columna mientras que las protelnas de tamano suficiente no interaction con la estructura porosa de las partlculas y as! se eluyen bien entes las sales no volatiles y tensioactivos. Otro aspecto de un sistema de desalacion es la eleccion de una sal tampon y el pH y la concentracion de la sal. La sal tampon deberla ser volatil para evitar la cristalizacion y corrosion de la entrada de MS. Las sales volatiles tampon de MS que se utilizan comunmente son formato amonico/acido formico y acetato amonico/acido acetico (por ejemplo, pares de acido/base). Por ejemplo, las columnas se podrlan lavar con acetato amonico a pH 7 y se titulan a un pH de 6,5 con acido acetico. En un aspecto, la sal es acetato amonico.
La concentracion de las sales es entre 50 y 400 mM. En un aspecto, la concentracion de sal es de 200 mM En otro aspecto, la concentracion de sal es de 250 mM. El pH del tampon esta entre 5,0 y 7,0. En un aspecto, el pH es desde 5,5 a 7,0. En otro aspecto, el pH es 6,5. En otro aspecto mas, el pH es 7,0. Un experto en la tecnica entiende que el intervalo de pH se preve que darla como resultado datos de masas utiles (por ejemplo, se pueden obtener datos utiles de masas a un pH de 7,5 u 8,0).
La desnaturalizacion y la fragmentation consiguientes de un ADC puede evitarse si se produce el analisis en ausencia de disolventes organicos y reactivos acidos de emparejamiento. En un aspecto, 200 mM de acetato amonico a un pH de 6,5, utilizados en conjuncion con una columna poli hidroxietil-A proporciona la desalacion de un mAb IgG1 desglicosilada.
X. Espectrometrfa de masas
En un procedimiento de MS, se carga una muestra en el instrumento de MS. La muestra contiene un compuesto de conjugado de una protelna con un agente. La muestra se ioniza con un acido o base para la ionization de MS negativa o positiva, respectivamente. La muestra entra en el curso como una pulverization fina o gotlculas. La muestra que contiene gotlculas esta desolvatada (evaporada) con un gas secante calentado. El tamano de las gotlculas disminuye hasta el punto en el que las moleculas proteicas cargadas positivamente hacen que las gotlculas exploten en gotlculas mas pequenas debido a repulsiones electrostaticas. Este procedimiento se repite muchas veces en una segunda division hasta que tenga iones proteicos en fase gaseosa verdadera que posteriormente entran en el espectrometro de masas para la determination de la masa. A este procedimiento se hace referencia normalmente como ionizacion por electropulverizacion (ESI). La relation de masa respecto a carga (m/z) de los iones moleculares se determinan y estos datos en bruto se procesan adicionalmente (se desglosan) con el software especlfico del vendedor para dar lugar a una masa molecular de carga cero del analito de interes. La MS se utiliza para estudiar la farmacocinetica, identifica una protelna o pequenas moleculas desconocidas y caracteriza las modificaciones y degradaciones post-traduccionales que se producen en las protelnas. La instrumentation ESI tlpica incluye agua Xevo Q-TOF, Agilent 6510 Q-TOF.
Los datos espectrometricos se utilizan para confirmar la estructura primaria de las protelnas. La confirmation de la estructura primaria se obtiene cuando la masa medida experimentalmente de una protelna coincide con la masa teorica, que se determina de la secuencia de aminoacidos esperada, con un umbral de error determinado. La medicion de masa intacta del os mAb recombinantes se puede llevar a cabo utilizando espectrometros de masas con tiempo de vuelo disponibles en el mercado. Los procedimientos de desalado tlpicos que utilizando sistemas de disolvente desnaturalizantes a menudo dan lugar a datos experimentales de masa para los mAb que estan en 50 ppm (aproximadamente 7,5 Da) del valor teorico. En otros aspectos, los datos de masas estan aproximadamente en 25 Da. La desalacion nativa de mAb y ADC utilizando SEC-MS en un sistema de tampon de acetato amonico da como resultado eficacias de ionizacion menores debido a que menos restos basicos estan cargados positivamente en un tampon de pH neutro. Los datos en bruto de intensidad menor pueden resultar en una desviacion mayor de la masa mediad experimentalmente de la masa teorica. No obstante los datos experimentales obtenidos en ADC desalados utilizando SEC-MS descritos en el presente documento dan lugar a datos de masa que estan en 50 ppm (aproximadamente 7,5 Da) del valor teorico y siempre menos de 100 ppm. El alto grado de precision de masa indica que el ADC esta completamente desalada ya que los aductos de sal comunes que pueden asociarse potencialmente con la protelna aumentarlan la masa en al menos 18 Da (la masa de un ion amonio). Las estrategias convencionales para medir la masa de los ADC con subunidades unidas covalentemente implican la desalacion mediante tecnicas fuera de llnea tal como filtration en centrlfuga, uso unico de cartuchos de geles de penetration y dialisis seguido por MS con nanopulverizador del ADC desalado. La desaduccion incompleta de la muestra es bastante comun utilizando esta estrategia y puede dar como resultado los datos de masa que se desvla del valor teorico por hasta 5000 ppm.
Con la elucion de la protelna, por ejemplo, un ADC, de la columna de SEC en una sal volatil, por ejemplo, acetato amonico, la protelna se introduce en el espectrometro de masas utilizando fuentes de ESI analltica disponibles capaces de desolvatar e ionizar protelnas en un tampon que esta fluyendo entre 1 y 1000 microlitros/minuto. Los caudales se pueden determinar por el operador y pueden depender del diametro de columna. Por ejemplo, una columna de 0,1 mm podrla operarse con un caudal de 1 microlitro/min y una de 7,8 mm se pueden operar a alrededor de 1000 microlitros/min. Este caudal permite una determinacion de la masa mucho mas rapida. La tension capilar, velocidad de flujo de gases (desolvatacion y cubierta) y las tensiones en cono se deberlan fijar en valores que sean suficientes para desolvatar (por ejemplo, evaporar el disolvente) el ADC pero lo suficientemente suave para minimizar la fragmentacion en curso del ADC en cadenas pesadas y ligeras unidas a un farmaco. Cuando la estructura plegada nativa del ADC se mantiene, entonces es evidente que los datos en bruto como una envoltura de carga entre 4800 y 7000 m/z. Si la estructura nativa no se mantiene entonces es evidente que una poblacion de ADC significativa que tiene una envoltura de carga entre 2000 y 4000 m/z. Los datos en bruto de la medicion por MS dl ADC se convierte en un espectro de masas de carga cero utilizando un software de desglose (por ejemplo, desglose de entropla maxima Agilent MassHunter) y las abundancias de cada especie de farmaco se cuantifica dividiendo la abundancia de iones de una especie de farmaco unida particular por el total de abundancia de iones (sumada la abundancia de todas las especies de farmaco unidas). La medicion de masas de protelnas intactas se lleva a cabo en instrumentos con tiempo de vuelo y tiempo de vuelo tetrapolar (TOF y QTOF, respectivamente) pero tambien se puede llevar a cabo por resonancia de ciclotron ionica transformada de Fourier (FT-ICR) y espectrometros de masas orbitrap. En un aspecto, este trabajo se podrla llevar a cabo en u espectrometros de masas con desorcion ionizacion de matriz asistida por laser (MALDI) y espectrometros de masas con trampa de iones de alta resolucion.
Al contrario que la presente divulgacion, previamente cada fraccion recolectada previamente de la etapa de cromatografla se introdujo individualmente en la MS. Ensayando la masa de cada fraccion constituyente de los compuestos y conjugados, la suma de la masa de todos los picos recolectados se calculo para determinar la masa total. Como se expone en el presente documento, la presente divulgacion proporciona metodos que analizan los ADC intactos directamente por MS.
XI. Espectrometrfa de masas con ionizacion por electropulverizador
Las masas de compuestos de relativamente alto peso molecular tales como los anticuerpos se pueden detectar a relaciones masa respecto a carga (m/z) que se determinan facilmente por la mayorla de los espectrometros de masas (los intervalos tlpicos de m/z) de hasta 2000, hasta 3000, hasta 8000). La espectrometrla de masas con ionizacion por electro pulverizador ESI-MS, en particular, es adecuada para compuestos cargados, polares o basicos y para el analisis de compuestos marcados multiples con llmites de deteccion excelentes. El ESI permite as! la deteccion y caracterizacion de grandes biomoleculas, tales como conjugados de un anticuerpo con un farmaco con un peso molecular (PM) de 150.000 o mas.
XII. Sistemas
En algunas realizaciones, la presente divulgacion proporciona un sistema configurado para llevar a cabo un metodo descrito en el presente documento. En algunas de estas realizaciones, los sistemas incluyen un espectrometro de masas.
En ciertas realizaciones, el espectrometro de masas se configura para llevar a cabo un metodo descrito en el presente documento e incluye un medio para la deteccion de una masa de un conjugado de una protelna con un agente asociado no covalentemente. En ciertas realizaciones, el medio incluye un espectrometro de masas. En algunas realizaciones, los sistemas incluyen adicionalmente medios para proporcionar un compuesto de conjugado de una protelna con un agente no desnaturalizado en una sal volatil y libre de una sal no volatil. En realizaciones adicionales, los sistemas incluyen medios para la introduccion del compuesto de conjugado de una protelna con un agente en un espectrometro de masas. En mas realizaciones adicionales, los sistemas incluyen medios para el establecimiento de la masa directamente del compuesto de conjugado de una protelna con un agente por espectrometrla de masas.
XIII. Ejemplos
Los siguientes ejemplos ejemplifican la invencion y no se pretende que la limiten.
Materiales
Conjugados de un anticuerpo con un farmaco - Los anticuerpos monoclonales recombinantes se expresaron en celulas CHO y se purificaron de acuerdo con procedimientos convencionales descritos en Shukia, A et al, (2007) J Chromatogr B Analyt Techno! Biomed Life Sci 848, 28-39. La conjugacion de restos de cistelna en el mAb con Val-Cit monometil auristantina E (vcMMAE) o maleimidocaproil monometil auristatina F (mcMMAF) se llevo a cabo de acuerdo con procedimientos establecidos descritos en Sun, M. et al, (2005) Bioconjug Chem 16, 1282-1290. Laos anticuerpos se desglicosilaron anadiendo 1 pl de PNGasa F (New England Biolabs, Ipswich, MA) por 100 pg de anticuerpo o ADN y se incubaron a 37 °C durante al menos 4 horas.
Ejemplo 1
Cromatografla de SEC-MS - Los mAb y ADC se separaron en una columna de polihidroxietil-A (PolyLC, Columbia, MD) con dimensiones de 2,1 x 200 mm y que contenla partlculas de 5 micrometres con poros de 300 A. La columna se equilibro en 200 mM de acetato amonico, pH 6,5-7,0 para el analisis de masas no desnaturalizantes o un 30 % de acetonitrilo, un 0,2 % de acido formico para el analisis de masas desnaturalizante (control). El caudal se mantuvo a 0,1 ml/min durante la ejecucion y el mAb o ADC se eluyo entre 3,5 y 4,5 min. El flujo y la composicion de tampon se mantuvo siguiendo la elucion del mAb o ADC y el tiempo de ciclo total era de 10 min por ejecucion.
Espectrometrfa de masas - Los datos del espectro de masas para los mAb y ADC se adquirieron en un Agilent 6510 QTOF (Agilent, Santa Clara, CA) en modo ESI positivo en el intervalo de 1000-8000 m/z. La temperatura del gas secante era de 350 °C y un caudal para el gas de secado y una presion de gas del nebulizador que era de 12 l/h y 35 psi, respectivamente. La tension capilar, de la RF fragmentadora y octopolar se fijaron en 5000, 450 y 350, respectivamente. Los datos en bruto se convirtieron en espectro de masas de carga cero con un algoritmo de desglose de entropla maxima con el software de estacion de trabajo MassHunter version B.03.01.
Cromatografia de interaccion hidrofobica (HIC) - Los ADC con vcMMAE y mcMMAF se separaron por HIC de acuerdo con los metodos descritos en McDonagh, C. F. et al, (2006) Protein Eng Des Sel 19, 299-307. La cuantificacion de las especies de carga de farmacos se determino por integracion de UV a 280 nm. En la Figura 6, se utilizando los datos de la HIC como una comparacion de los porcentajes relativos de ADC MR0-8 determinados a partir del metodo de datos de masas intactos descritos en el presente documento.
Ademas de la Figura 6, la Tabla 1 muestra el area de abundancia ionica y los valores del area de UV HIC por MR, de especies cargadas de farmacos individuales.
Tabla 1
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Una comparacion de los datos en bruto de MS obtenidos de la muestra del mAb de control desalado en presencia de un 30 % de acetonitrilo, un 0,2 % de acido formico con respecto a la muestra de mAb/acetato amonico desalada indicaba que la primera condicion desnaturalizaba completamente el anticuerpo como se evidenciaba por la cubierta de carga, que se observaba entre 3000 y 4000 m/z, mientras que el acetato amonico desalado daba como resultado una cubierta de carga observada entre 4800 y 6800 m/z (Fig. 2, paneles A y B respectivamente). Los iones evidentes entre 200 y 3500 m/z en el panel B es la region en el que el anticuerpo desnaturalizado serla evidente son debidos a la presencia de PNGasa F que se utilizo para la desglicosilacion y el detergente no ionico Tween-80. La masa desglosada del anticuerpo determinada por cualquier metodo estaba en 10 ppm del valor teorico (Fig. 2, paneles C y D).
El conjugado de mcMMAF de mAb-A descrito anteriormente tambien se analizo utilizando los metodos de desalacion cromatograficos desnaturalizantes y no desnaturalizantes. La desalacion del ADC en presencia de un 30 % de acetonitrilo, un 0,2 % de acido formico resultaba en una envoltura de carga entre 1500 y 4000 m/z (Fig. 3, panel A). La MS desglosada estaba dominada por fragmentos de anticuerpo unidos incluyendo 1LC con 1 farmaco, 1LC1HC con 2 farmacos, 2HC con dos farmacos y 1LC2HC con un farmaco y 2LC 2HC con 0 farmacos (Fig. 3, panel C). Las condiciones de control no mostraban evidencia de la presencia de ADC-A intactos. La mismas region m/z en la MS de ADC desalado en acetato amonico (Fig. 3, panel B) tambien se desgloso y la fragmentacion observada del ADC era mucho menor y solamente se observaron 1LC con 1 farmaco y 1LC1HC con 2 farmacos. Solo se observaban multiples iones cardados para ADC-A en los datos en bruto para la muestra desalada de acetato amonico y se indica que el area entre corchetes en la Fig. 3, panel B.
El analisis de los ADC mcMMAF y vcMMAE por el mismo metodo de desalacion de acetato amonico descrito en el presente documento anteriormente resultaba en una distribucion de especies con masas consistentes con, el mAb con incorporacion de 0-8 farmacos. El espectro de masas intacto del conjugado de ADC-A con mcMMAF y el material parental (mAb-A) se muestran en la Fig. 4. Las intensidades ionicas relativas de las especies cargadas de un farmaco individual se cuantificaron por la abundancia ionica asociada con el espectro de masas desglosado. Una comparacion de las cantidades relativas de ADC MR 0-8 determinada a partir de los datos de masas intacta y de un metodo ortogonal, HIC, se muestran en la Fig. 6, panel A. Se obtuvieron resultados similares en los analisis del conjugado ADC-B con vcMMAE y el material parental (mAb-B) y se muestran en la Fig. 5. La comparacion de las cantidades relativas de ADC MR 0-8 se determinaron a partir de los datos de masa intactos y por HIC se muestran en la Fig. 6, panel B.
Ejemplo 2
Cromatografia de exclusion por tamano - las muestras de ADC se analizaron fuera de llnea mediante una columna de SEC dual. Dos columnas de 7,8 mm x 30 cm de TSK gel G3000SWXL empaquetada con partlculas de 5 pm con poros de 250 A. (Tosoh, JPN) se conectaron en serie. Las muestras de ADC se separaron utilizando una fase movil que consistla en 200 mM de acetato amonico, pH 7 con un caudal de 0,8 ml/min. La absorbancia a 280 nm se utilizo para la deteccion de absorbancia debida a la interferencia de fondo de la fase movil a longitudes de onda mas bajas.
El efecto del metodo de desalacion en la disociacion de subunidades de ADC se evaluo recolectando el ADC de la columna de desalacion, por SEC de columna dial. En referencia a la Figura 7, la comparacion de los cromatogramas del analisis de SEC en columna dual del ADC desalado y el material de partida correspondiente indicaba que no habla un aumento de la disociacion como consecuencia del metodo de desalacion.
Ejemplo 3
Experimento - La columna PHEA SEC se equilibro en tampon de acetato amonico a distintas concentraciones de sal que variaban de 50 mM a 400 mM. El ADC-B desglicosilado se analizo por SEC MS operada con unas concentraciones de sales en la fase movil descritas anteriormente y los niveles relativos de MR0- MR8 se cuantificaron basandose en la intensidad ionica desglosada descrita previamente.
Resultados - A una concentracion de sal de 50 mM los niveles de MR2 y MR6 parecen estar sobre y bajorepresentados con respecto a los niveles observados en todas las otras concentraciones de sal. Esto sugerirla que la concentracion de acetato amonico de la fase movil de SEC-MS deberla estar por encima de 50 mM y que la concentracion de sal de acetato amonico de la fase movil entre 100 y 400 mM no produce resultados ampliamente dispares con respecto a la distribucion de MR relativa.
La Figura 8 ilustra que el cambio de concentracion del acetato amonico en la fase movil no tiene impacto en la distribucion relativa de formas de farmaco cargado individuales cuando la concentracion de sal esta entre 100 y 400 mM.
Ejemplo 4
Experimento - El ADC-C es una molecula de IgG1 conjugada con mc-MMAF. Las distintas formas de (farmaco cargadas se separaron y purificaron mediante cromatografia de HIC (Fig. 9A). Las fracciones purificadas, as! como el material de partida del ADC-C (antes de la separacion con HIC) se evaluaron posteriormente por SEC-MS como se habla descrito anteriormente (Fig. 9B).
Resultados - Los resultados de la SEC-MS son consistentes con los datos ortogonales (separacion LCMS de las cadenas ligera y pesada reducidas) demostraba que los picos A-F corresponden con distintas formas de farmacos cargados de ADC-C (Fig. 9B). Los picos de la HIC Cy D tienen la misma masa nominal y la mas es consistente con especies MR4. El desglose de los datos en bruto en el intervalo de m/z bajo de 1500-4000 (Fig. 10) indica que el pico C esta compuesto primariamente por MR4 con farmacos incorporados en el Fab de anticuerpo como se evidencia por el dlmero LC y HC unidos a farmacos con 2 farmacos. Un analisis similar del pico D de HIC indica que esta compuesto primariamente de MR4 con farmacos incorporados en la bisagra del anticuerpo como se evidencia por la hC-LC covalente con 2 farmacos. Basandose en la informacion obtenida del analisis de las cadenas de anticuerpo disociadas, es posible determinar las identidades de los isomeros posicionales de MR4 separados por HIC en los picos Cy D.
La Figura 9 muestra los resultados de una caracterizacion de la separacion de un ADC con mcMMAF por HIC (panel A), seguido por el analisis de las fracciones recolectadas por SEC-MS (panel B). En la Figura 20, un analisis de las fracciones individuales de la separacion por HIC muestra que la posicion de la union del farmaco en las cadenas polipeptldicos de ADC se pueden evaluar por la masa de los fragmentos disociados utilizando SEC-MS.
Ejemplo 5
Cromatografia SEC-MS de micro flujo - Los ADC se separaron utilizando una columna de polihidroxietil-A (PolyLC, Columbia, MD) con dimensiones de 0,3 x 150 mm, que contienen particulas de 5 micrometros con poros de 300 A. La columna se equilibro con 200 mM de acetato amonico, pH 6,5-7,0 para el analisis de masas no desnaturalizante. La cantidad de carga de muestra en la columna variaba de 2,5 pg a 50 ng. Utilizando un dispositivo de pulverizador microflujo ESI y un controlador de LC de microflujo de retroalimentacion positiva, se mantuvo el caudal a 1,0 pl/min durante 25 min en un gradiente de 200 mM de acetato amonico isocratico, con una elucion de ADC observada entre 15,5 y 19,5 minutos.
Espectrometrfa de masas - Los datos espectrales de masas para ADC se adquirieron utilizando un Agilent 6510 QTOF (Agilent, Santa Clara, CA) en una ESI en modo positivo entre 1000-8000 m/z. La temperatura de gas secante era de 350 °C con presiones de gas de secado y nebulizador fijadas en 5,0 l/h y 15 psi, respectivamente. Todos los demas ajustes de Ms eran identicas a los experimentos a escala analitica excepto los optimizados para la interfase microflujo/microESI incluyendo la tension capilar y las tensiones de separador que se fijaron en 3000 y 300 voltios respectivamente. Los datos en bruto se convirtieron a unidades de masa neutras utilizando un algoritmo de desglose de entropia maxima con el software de estacion de trabajo MassHunter version B.03.01.
Mientras el caudal menor retrasaba el tiempo de elucion en comparacion con el metodo analitico, el limite de deteccion aumentaba drasticamente, en las cuatro especies de farmaco cargadas pudiendose visualizar hasta los 50 ng de ADC desglicosilado en la columna. Como ejemplo, para la inyeccion de 500 ng de ADC (Vease la Figura 11) el MRD es comparable al observado el metodo SEC y analisis HIC a escala analitica. La precision de masa/error de masa observados tambien esta sustancialmente por debajo de las especificaciones fraccionadas.
Ejemplo 6
Estabilidad del plasma/Purificacion por afinidad del ADC - El plasma de ratas Sprague Dawley hembras filtrado con K2EDTA se incubo con MabSelect para agotar la IgG endogena. El ADC se anadio en el plasma de rata deficiente en IgG a 1 mg/ml, se hicieron alicuotas y se almacenaron a 37 °C. Las alicuotas se retiraron del almacenamiento a 37 °C y se almacenaron a -80 °C a los puntos de tiempo especificados (0, 6 horas, 1 dia, 2 dias, 4 dias, 7 dias) hasta el analisis. Se unieron entonces 500 pl del ADC de 1 mg/ml al MabSelect, se lavaron en 1 x PBS pH 7,4 tres veces, se eluyeron en 100 pl de tampon de elucion de IgG, y se neutralizaron en 1 M de Tris pH 8 (1:10 v/v).
Cromatografia SEC-MS microflujo - Se separaron los ADC utilizando una columna de polihidroixetil-A (PolyLC, Columbia, MD) con dimensiones de 0,3 x 150 mm, que contenian particulas de 5 micrometres con poros de 300 A. La columna se equilibro con 200 mM de acetato amonico, pH 6,5-7,0 para el analisis de masas no desnaturalizante. Utilizando un dispositivo de controlador LC microflujo con retroalimentacion positiva y un pulverizador de microflujo en ESI, se mantuvo el caudal a 1,0 pl/mi durante los 85 minutos de gradiente de acetato amonico 200 mM isocratico, con una elucion observada entre 15,5 y 19,5 minutos. Aproximadamente se inyecto 1 Hg de ADC para cada adquisicion.
Espectrometrfa de masas - Los datos espectrales de masas para ADC se adquirieron utilizando un Agilent 6510 QTOF (Agilent, Santa Clara, CA) en una ESI en modo positivo entre 1000-8000 m/z. La temperatura de gas secante era de 350 °C con presiones de gas de secado y nebulizador fijadas en 5,0 l/h y 15 psi, respectivamente. Todos los demas ajustes de Ms eran identicas a los experimentos a escala analitica excepto los optimizados para la interfase microflujo/microESI incluyendo la tension capilar y las tensiones de separador que se fijaron en 3000 y 300 voltios respectivamente. Los datos en bruto se convirtieron a unidades de masa neutras utilizando un algoritmo de desglose de entropia maxima con el software de estacion de trabajo MassHunter version B.03.01.
El re-equilibrado de la columna se extendio a una hora despues de cada inyeccion ADC purificado del plasma para reducir la interferencia de cualquier contaminante biologico. Esta aumentaba la senal respecto al ruido y la resolution de los picos de ADC. Los datos desglosados para el punto de tiempo cero es como se esperaba, solo con las especies cargadas pares observadas. Segun aumentan los tiempos de incubation, aparecian las especies impares cargadas y aumentaban en abundancia a lo largo del tiempo (vease la Figura 12). Aunque los picos de ADC al inicio de la incubacion eran los esperados, a lo largo del tiempo las colas de los picos aumentaban. Esto es debido a la heterogeneidad de la muestra total. Especificamente, cada sitio de farmaco cargado esta en competition con someterse a una adicion de Michal inversa o la abertura del anillo de maleimida. Esto se ha confirmado utilizando un analisis de masas reducido. La disminucion en el MRD observado a lo largo del tiempo refleja la perdida de farmaco en el plasma de rata deficiente a IgG a 37 °C.
Cuando haya un conflicto entre la presente solicitud y una referencia proporcionada en el presente documento, la presente solicitud dominara.

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Un metodo para la detection o la determination de una masa de un compuesto de conjugado de un anticuerpo y un farmaco, que comprende:
(a) proporcionar un compuesto de conjugado de un anticuerpo con un farmaco en una sal volatil y libre de una sal no volatil, en donde el compuesto de conjugado de un anticuerpo con un farmaco tiene de uno a ocho restos de farmaco conjugados en los disulfuros intercatenarios reducidos, esta asociado no covalentemente y no desnaturalizado, y mantiene su estructura de anticuerpo bivalente intacta.
(b) introducir el compuesto de conjugado de un anticuerpo con un farmaco de la etapa a) en un espectrometro de masas; y posteriormente
(c) establecer directamente la masa de la estructura bivalente intacta del compuesto de conjugado de un anticuerpo con un farmaco mediante espectrometrla de masas.
2. El metodo de la reivindicacion 1, en el que el compuesto de conjugado de un anticuerpo con un farmaco esta presente en una distribution de compuestos de conjugados de un anticuerpo con un farmaco en una matriz; comprendiendo el metodo adicionalmente la aplicacion de un medio de separation en condiciones no desnaturalizantes para efectuar la separacion de los compuestos de conjugados de un anticuerpo con un farmaco y la matriz, en donde los compuestos de conjugados de un anticuerpo con un farmaco separados estan asociados sustancialmente no covalentemente y no desnaturalizados,
en donde la matriz comprende opcionalmente una sal no volatil, un tensioactivo, un tampon o una formulation, y en donde el medio de separacion opcionalmente comprende una columna de HIC o SEC ejecutada en condiciones no desnaturalizantes.
3. El metodo de la reivindicacion 2 que comprende adicionalmente la cuantificacion por intensidad ionica desglosada de la distribucion relativa de los compuestos de conjugados de un anticuerpo con un farmaco separados.
4. El metodo de la reivindicacion 1 en el que la sal volatil comprende formato amonico, acetato amonico o carbonato amonico.
5. El metodo de la reivindicacion 2, en el que las condiciones no desnaturalizantes comprenden un tampon de SEC volatil compatible con la espectrometrla de masas o una temperatura no mayor de 50 °C.
6. El metodo de la reivindicacion 2, en el que el medio de separacion comprende una columna de cromatografla de exclusion por tamano (SEC), en el que la columna SEC es una columna de sllice poliestireno-divinilbenceno o polihidroxietil aspartamida.
7. El metodo de las reivindicaciones 1 o 2, en el que el farmaco es un maitansinoide, una auristatina, monometil auristatina E (MMAE) o monometil auristatina F (MMAF).
8. El metodo de la reivindicacion 1, en el que la espectrometrla de masas se lleva a cabo por ESI-MS.
9. El metodo de la reivindicacion 1, en el que la concentration de la sal volatil varla desde 50 a 400 mM, y opcionalmente en el que el pH proporcionado por la sal volatil es de 5,5 a 7,0.
10. El metodo de la reivindicacion 2, en el que los compuestos de conjugados de un anticuerpo con un farmaco se introducen inmediatamente en el espectrometro de masas, o en el que los compuestos de conjugados de un anticuerpo con un farmaco se introducen continuamente en el espectrometro de masas.
11. El metodo de la reivindicacion 6, en el que el medio de la SEC comprende una columna de polihidroxietil-A opcionalmente en el que el tamano de la columna de SEC es de 0,1 a 7,8 mm de diametro interno y 100 a 300 mm de longitud.
12. El metodo de la reivindicacion 1, que comprende adicionalmente la etapa de tratamiento del compuesto de conjugado de un anticuerpo con un farmaco con un reactivo desglicosilante,
en el que el reactivo desglicosilante comprende PNGasa F
o en el que el agente desglicosilante comprende opcionalmente un tratamiento enzimatico con una exoglicosidasa, un tratamiento con una endoglicosidasa o un tratamiento enzimatico que escinda entre el 1° y el 2° restos de N-acetilglucosamina de los N-glicanos,
en el que el tratamiento enzimatico con una exoglicosidasa comprende opcionalmente una sialidasa o una betagalactosidasa,
o en el que el tratamiento enzimatico que escinde entre el 1° y el 2° restos de N-acetilglucosamina de los N-glicanos comprende Endo-F1, F2 o F3.
13. El metodo de la reivindicacion 1, en el que el anticuerpo del conjugado de un anticuerpo con un farmaco es un anticuerpo humanizado.
14. El metodo de la reivindicacion 1, en el que el anticuerpo del conjugado de un anticuerpo con un farmaco se selecciona de entre el grupo que consiste en un anticuerpo anti-CD30, anti-CD40, anti-CD19, anti-CD33 y anti-CD70.
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