CN110022891A - 恢复肿瘤酸化t细胞的功能 - Google Patents
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Abstract
提供了恢复酸化T细胞功能的方法和组合物。所述方法包括向T细胞施用脲酶。组合物包含脲酶。
Description
发明领域
本发明涉及功能失调的免疫。更具体地，本发明在某些方面涉及恢复酸化T细胞的功能。
发明背景
已经研究了参与癌症生长的肿瘤微环境。
国际专利申请公开第WO 2004/009112号描述了用于抑制哺乳动物对象中癌细胞生长的药物组合物和方法。该组合物包括脲酶，并且与其相关的有效增强酶向癌细胞递送的化学实体(当向对象施用该组合物时)。还公开了增强弱碱性抗肿瘤化合物有效性的方法，评估对象中实体瘤的存在、大小或状况的方法，以及用于治疗对象的癌症的基因治疗组合物。加拿大专利申请第2,493,282号描述了类似的组合物和方法。国际专利申请公开第WO2014/165985号描述了具有治疗和诊断用途的抗体-脲酶缀合物。国际专利申请公开第WO2016/116907号描述了包含基本上不含未缀合的脲酶的抗体-脲酶缀合物的药物组合物。这些上述申请中没有一个描述了T细胞的治疗或显示对接受治疗的对象的免疫系统的任何影响。
国际专利申请公开第WO 2016/090219号描述了抑制抗原呈递细胞中的溴区结构域蛋白以展示免疫抑制性分子PD-L1的较低表达来恢复耐受性T细胞的应性。
Pilon-Thomas等人(Cancer Res，2016,76：1381-1390)描述了用碳酸氢盐单一疗法中和肿瘤酸性损害了小鼠中一些癌症类型的生长，其中它与T细胞浸润增加相关。此外，将碳酸氢盐疗法与抗CTLA-4、抗PD-1或过继性T细胞转移组合在多个模型中改善了抗肿瘤应答。
需要替代疗法来克服或减轻现有技术的至少一些缺陷和/或为公众提供疗法的有用选择。
发明概述
恢复T细胞的功能将有助于免疫系统的修复及其在癌症中的作用。此外，免疫应答的修复有助于治疗诸如实体瘤的肿瘤。通过靶向T细胞，可以间接治疗肿瘤。
根据一方面，存在用于恢复/重新激活由实体肿瘤生长负面影响的T细胞功能的方法。在一些方面，负面影响是由实体瘤酸化提供的。
根据一方面，提供了恢复功能/重新激活酸化T细胞的方法，该方法包括向所述T细胞施用脲酶。在一些方面，该方法还可以包括向癌细胞施用脲酶以降低PD-L1表达，从而减少/最小化对T细胞功能的负面影响。
在一些方面，脲酶降低了T细胞上PD-1的表达。
根据一方面，提供了恢复功能/重新激活T细胞的方法，该方法包括施用脲酶以降低肿瘤细胞上的PD-L1表达，从而恢复/重新激活T细胞功能。
在一些方面，癌细胞对pH敏感。
在一方面，恢复功能包括增加细胞因子的产生。
在一方面，细胞因子包含IL-2。
在一方面，T细胞相对于生理pH是酸化的。
在一方面，T细胞的pH小于约7.2，诸如7.1、7.0、6.9或6.8。
在一方面，T细胞被乳酸盐酸化。
在一方面，乳酸盐由实体瘤产生。
在一方面，T细胞在存在天然的或施用的尿素的情况下。
在一方面，T细胞表达PD-1，任选地，与非酸化T细胞相比，T细胞以高于正常水平的水平表达PD-1。
在一方面，脲酶与靶向部分缀合。
在一方面，靶向部分是抗体。
在一方面，抗体特异性针对肿瘤相关抗原。
在一方面，肿瘤相关抗原是CEACAM6。
在一方面，抗体是AFAIKL2抗体或2A3抗体。
在一方面，T细胞表达PD-1。
在一方面，脲酶抑制PD-1表达和/或激活。
在一方面，该方法还包括施用活性剂。
在一方面，活性剂是PD-1抑制剂、化学治疗剂、放射物、激素或细胞因子(诸如IL-2)。
在一方面，该方法还包括施用免疫疗法，诸如过继性T细胞疗法。
在一方面，以足以将所述酸化T细胞附近的pH增加至生理水平(诸如7.2)的量施用脲酶。
在一方面，以足以降低T细胞上的PD-1表达的量施用脲酶。
在一方面，以不会引起显著的T细胞死亡或伤害的量施用脲酶。
根据一方面，提供了使经受酸化条件的T细胞的IL-2产生正常化的方法，所述方法包括向所述T细胞施用脲酶。
根据一方面，提供了抑制乳酸盐诱导的T细胞对肿瘤细胞的耐受性的方法，所述方法包括向所述T细胞施用脲酶。
根据一方面，提供了治疗癌症的方法，所述方法包括选择患有CEACAM6+和/或PD-L1+癌症的对象并向所述对象施用脲酶。
根据一方面，提供了增加对CEACAM6+和/或PD-L1+癌症的免疫应答的方法，所述方法包括向包含CEACAM6+和/或PD-L1+癌症的对象施用脲酶。
根据一方面，提供了增加T细胞浸润到实体瘤中的方法，其包括：向所述T细胞施用脲酶。
在一方面，恢复功能包括增加细胞因子的产生。
在一方面，细胞因子包含IL-2。
在一方面，T细胞相对于生理pH是酸化的。
在一方面，T细胞的pH小于约7.2，诸如7.1、7.0、6.9或6.8。
在一方面，T细胞被乳酸盐酸化。
在一方面，乳酸盐由实体瘤产生。
在一方面，T细胞在存在天然的或施用的尿素的情况下。
在一方面，T细胞表达PD-1，任选地，与非酸化T细胞相比，T细胞以高于正常水平的水平表达PD-1。
在一方面，脲酶与靶向部分缀合。
在一方面，靶向部分是抗体。
在一方面，抗体特异性针对肿瘤相关抗原。
在一方面，肿瘤相关抗原是CEACAM6。
在一方面，抗体是AFAIKL2抗体或2A3抗体。
在一方面，T细胞表达PD-1。
在一方面，脲酶抑制PD-1表达和/或激活。
在一方面，该方法还包括施用活性剂。
在一方面，活性剂是PD-1抑制剂、化学治疗剂、放射物、激素或细胞因子(诸如IL-2)。
在一方面，该方法与免疫疗法(诸如过继性T细胞疗法)结合。
在一方面，以足以将酸化T细胞附近的pH增加至的生理水平(诸如7.2)的量施用脲酶。
在一方面，以足以降低T细胞上的PD-1表达的量施用脲酶。
在一方面，以不会引起显著的T细胞死亡或伤害的量施用脲酶。
根据一方面，提供了包含脲酶和PD-1抑制剂的组合物。
根据一方面，提供了组合物，其包含脲酶和PD-1抑制剂和/或PDL-1抑制剂，或由脲酶和PD-1抑制剂和/或PDL-1抑制剂组成。
根据一方面，提供了组合物，其包含脲酶和T细胞，或由脲酶和T细胞组成。
在一方面，该组合物用于恢复T细胞功能。
在一方面，该组合物用于增加T细胞的IL-2产生。
根据一方面，提供了脲酶用于恢复酸化T细胞功能的用途。
根据一方面，提供了脲酶用于使经历酸化条件的T细胞的IL-2产生正常化的用途。
根据一方面，提供了脲酶用于抑制乳酸盐诱导的T细胞对肿瘤细胞的耐受性的用途。
根据一方面，提供了脲酶用于治疗患有CEACAM6+和/或PD-L1+癌症的对象的癌症的用途。
根据一方面，提供了脲酶用于增加对CEACAM6+和/或PD-L1+癌症的免疫应答的用途。
根据一方面，提供了脲酶用于增加T细胞浸润到实体瘤中的用途。
从以下详细描述中，本发明的其他特征和优点将变得显而易见。然而，应该理解，在指示本发明的实施方案时的详细描述和具体实施例仅以说明的方式给出，因为从所述详细描述，在本发明的精神和范围内的各种改变和修改对于本领域技术人员而言将变得显而易见。
附图描述
参考附图，从以下的描述将进一步理解本发明，其中：
图1.乳酸对Jurkat细胞增殖的影响。将Jurkat细胞(1×106个细胞/mL)在含有不同量的乳酸(3至24mM)的完全RPMI 1640培养基中孵育1-3天。在台盼蓝染色后使用血细胞计数器进行细胞计数。结果表明，乳酸在浓度≥3mM时阻止Jurkat细胞增殖。当用相同浓度的HCl替换乳酸时，观察到类似的生长抑制曲线(数据未显示)。
图2.乳酸对激活的Jurkat细胞中IL-2释放的影响。通过在含有2μg/mL PHA、50ng/mL PMA和0.75μg/mL离子霉素的完全RPMI培养基中于37℃孵育24小时来激活Jurkat细胞(5×106个细胞/mL)。使用夹心ELISA测量由激活的Jurkat细胞释放的IL-2。发现浓度≥6mM的乳酸导致IL-2产生显著降低(与对照相比，*p<0.05和**p<0.01)。
图3.L-DOS47/尿素对在乳酸处理的培养基中培养的Jurkat细胞的保护作用。将Jurkat细胞(3×106个细胞/mL)在含有6-18mM乳酸的完全RPMI 1640培养基中孵育1天。在台盼蓝染色后使用血细胞计数器进行细胞计数。发现细胞增殖减少20％至50％(空心柱)。L-DOS47(1μg/mL)和尿素(4mM)的添加抑制了乳酸的生长抑制作用并增加了细胞活力(实心柱)。
图4.乳酸处理的Jurkat细胞中IL-2产生的恢复。乳酸抑制用2μg/mL PHA和50ng/mL PMA刺激的Jurkat细胞中的IL-2产生，其通过在含有6mM乳酸的培养基中添加1μg/mL L-DOS47和4mM尿素而部分恢复。在较高的酸浓度(12mM)下，测试的L-DOS47和尿素组合不足以恢复IL-2释放。其中与空白介质相比，*p<0.05且**p<0.005。
图5.乳酸处理的Jurkat细胞中PD-1表达的恢复。通过全细胞ELISA评估Jurkat细胞上PD-1的表达。通过固定化的抗CD3抗体和可溶性抗CD28抗体刺激细胞表达PD-1受体(数据未显示)。乳酸的添加显著降低了PD-1的表达(空心柱，*p<0.05和**p<0.005)，而L-DOS47/尿素的添加大大增强了PD-1的表达(实心柱)。
图6.干扰素γ刺激的肿瘤及其对从激活的Jurkat细胞释放IL-2的影响。用各种浓度的IFNγ刺激BxPC-3和MDA-MB231肿瘤细胞2天。去除原始培养基后，加入激活的Jurkat细胞并与肿瘤细胞在37℃共培养24小时。结果显示IFNγ刺激的肿瘤细胞抑制Jurkat细胞中IL-2的释放高达40％。
图7A-图7B.L-DOS47+尿素处理降低IFNγ刺激的MDA-MB-231乳腺癌细胞上的PD-L1表达。图7(A)如通过流式细胞术(虚线)测定，未处理的MDA-MB-231细胞表达中等水平的PD-L1。用IFNγ处理2天增加PD-L1表达。用L-DOS47和尿素，而不是单独的L-DOS47，进行的额外处理使PD-L1表达显著降低至未处理细胞的水平。与IFNγ处理的细胞相比，***p＝0.0005-0.001。图7(B)使用和读取器，在整个实验过程中连续监测每个样品的pH值。传感器和培养基平衡需要大约4-5小时，因此仅报告在T＝5小时后进行的pH测量。用L-DOS47加尿素处理以剂量依赖性方式增加培养基的pH。仅L-DOS47没有影响。
图8A-图8B.乳酸处理增加IFNγ刺激的MDA-MB-231乳腺癌细胞上的PD-L1表达。图8(A)用12mM乳酸或12mM HCl处理显著增加IFNγ刺激的MDA-MB-231细胞上的PD-L1表达。12mM乳酸钠没有影响。与IFNγ处理的细胞相比，****p＝0.0001。图8(B)用乳酸或HCl处理以剂量依赖性方式降低培养基的pH。乳酸钠的影响甚微。
图9A-图9B.L-DOS47+尿素处理恢复了乳酸和IFNγ处理的MDA-MB-231乳腺癌细胞上的低PD-L1表达。图9(A)用L-DOS47+尿素处理显著降低用IFNγ和12mM乳酸处理的MDA-MB-231细胞上的PD-L1表达。仅L-DOS47没有影响。与用12mM乳酸处理的细胞相比，****p＝0.0001。图9(B)L-DOS47+尿素处理以剂量依赖性方式增加用12mM乳酸处理的细胞培养基的pH。单独的L-DOS47影响甚微。
图10A-图10B.乳酸处理对IFNγ刺激的SKOV-3卵巢癌细胞的PD-L1表达没有影响。图10(A)用12mM乳酸、12mM HCl或12mM乳酸钠处理对IFNγ刺激的SKOV-3细胞上的PD-L1表达没有影响。图10(B)用乳酸或HCl处理以剂量依赖性方式降低培养基的pH。乳酸钠的影响很小。
图11A-图11D.L-DOS47+尿素处理增加活化的CD8+T细胞的IL-2和IFNγ的产生。使用阴性选择方法从供体PBMC纯化CD8+T细胞。在实验开始前，用α-CD3/α-CD28和IL-2激活细胞3天。图11(A)通过流式细胞术评估PD-1水平。激活的T细胞表达PD-1。经L-DOS47±尿素处理，水平相对不变。图11(B)用L-DOS47±尿素处理以剂量依赖性方式增加培养基的pH。图11(C)用L-DOS47±尿素处理显著增加IL-2；以及图11(D)如通过ELISA测量的来自激活的CD8+T细胞的IFN-γ的产生。
图12A-图12D.乳酸增加PD-1表达并减少激活的CD8+T细胞的IFNγ的产生。图12(A)用乳酸或HCl而非乳酸钠处理激活的CD8+T细胞，增加PD-1表达。图12(B)用乳酸或HCl的处理降低了培养基的pH。乳酸钠的效果甚微。图12(C)用HCl处理显著降低IL-2产生，并且用乳酸钠处理显著增加激活的CD8+T细胞的IL-2的产生。用乳酸处理没有效果。与激活的CD8+T细胞相比，****p＝0.0001。图12(D)乳酸和HCl处理均显著损害激活的CD8+T细胞的IFNγ的产生。乳酸钠没有效果。与激活的CD8+T细胞相比，****p＝0.0001。
图13A-图13D.L-DOS47+尿素处理乳酸培养的激活的CD8+T细胞减少PD-1表达，增加IL-2产生并恢复高IFNγ的产生。图13(A)用L-DOS47+尿素处理，但不用单独的L-DOS47处理，降低了乳酸处理的活化CD8+T细胞上的PD-1表达。图13(B)L-DOS47±尿素处理增加了培养基的pH。图13(C)用L-DOS47+尿素处理，但不用单独的L-DOS47处理，显著增加乳酸处理的激活的CD8+T细胞的IL-2的产生。与乳酸处理的激活的CD8+T细胞相比，**p＝0.0014，****p＝0.0001。图13(D)用L-DOS47±尿素处理显著增加乳酸处理的激活的CD8+T细胞的IFNγ的产生。与乳酸处理的激活的CD8+T细胞相比，****p＝0.0001。L-DOS47+4mM尿素使IFNγ的产生恢复至激活的CD8+T细胞产生的水平(在这两组之间未观察到统计学上显著的差异)。
详细描述
由于血液供应减少，实体瘤变得缺血，并且具有异常的代谢过程。因此，乳酸盐水平倾向于在肿瘤内和肿瘤周围高于正常水平，并且pH趋于低。先前已经表明，与肿瘤特异性抗体缀合的脲酶能够提高肿瘤微环境中的pH并减少肿瘤生长。这些效果基于通过将脲酶与肿瘤特异性靶向部分缀合以将脲酶部分直接靶向肿瘤，以直接靶向和治疗肿瘤和癌细胞。
现已显示出，酸性(在肿瘤诱导的酸性方面以及进一步在某些方面，肿瘤产生的乳酸盐)通过抑制细胞因子释放来影响T细胞。这抑制了T细胞攻击肿瘤细胞并引发有效免疫应答的能力，使T细胞对肿瘤具有耐受性。本文描述的数据显示单独或与肿瘤特异性抗体缀合的脲酶能够至少部分地逆转酸性和/或乳酸盐对T细胞细胞因子释放的抑制作用。这恢复了正常的T细胞功能，重新激活针对肿瘤的免疫应答并逆转酸性和/或乳酸盐的致耐受性作用。在肿瘤衍生的酸性方面，这提供了用于处理受酸性负面影响的T细胞的新方法、用途和组合物。
在本发明的方法中，通过使用此类所述的抗体-脲酶缀合物(其在某些方面是L-DOS47)降低肿瘤细胞(在某些方面是酸敏感性肿瘤细胞)上的PD-L1表达以及也在某些方面在CD8+T细胞上的PD-1表达可以进一步恢复T细胞的重新激活和功能。L-DOS47具有与特异性针对人CEACAM6的骆驼科动物单结构域抗体缀合的脲酶。
虽然上述参考文献描述了经由癌细胞靶向直接治疗肿瘤，但本文所述的是治疗(即积极影响)T细胞以产生能够识别和攻击肿瘤细胞的更强的T细胞群(即产生细胞因子并募集更多T细胞)的方法和组合物。
定义
如本文所用的，“治疗”或“疗法”是获得有益的或期望的临床结果的方法。出于本文所述的目的，有益的或期望的临床结果包括但不限于减轻症状、减小疾病程度、稳定(即，不恶化)疾病状态，延迟或减缓疾病进展、改善或缓和疾病状态以及缓解(无论是部分还是全部)，无论是可检测的还是不可检测的。与如果不接受治疗或疗法的预期存活相比，“治疗”和“疗法”还可以意味着延长存活。因此，“治疗”或“疗法”是为改变病症的病理而进行的干预。具体地，治疗或疗法可以直接预防、减缓或以其他方式降低疾病或病症(诸如感染)的病理，或者可以使细胞对其他治疗剂的治疗或疗法更易感。
术语“治疗有效量”、“有效量”或“足够量”是指当向对象(包括哺乳动物，例如人)时，足以实现所期望结果的量，例如有效治疗感染的量。本文所述化合物的有效量可根据诸如对象的疾病状态、年龄、性别和体重等因素而变化。如技术人员所理解的，可以调整剂量或治疗方案以提供最佳治疗应答。
此外，用治疗有效量的对象的治疗方案可以由单次施用组成，或者可替代地包括一系列应用。治疗期的长度取决于多种因素，诸如疾病的严重程度、对象的年龄、试剂的浓度、患者对试剂的应答性，或它们的组合。还应理解，用于治疗的试剂的有效剂量可在特定治疗方案的过程中增加或减少。通过本领域已知的标准诊断测定可以得到剂量的变化并且剂量的变化变得显而易见。在某些方面，可以在用所述疾病或病症(例如感染)的常规疗法治疗之前、期间或之后施用本文所述的化合物。
术语“癌症”意指异常细胞或大量组织。这些细胞或组织的生长超过正常组织或细胞的生长并且与正常组织或细胞的生长不协调，并且在引起改变的刺激停止后以相同的过度方式持续存在。这些肿瘤组织或细胞相对于正常组织或细胞显示缺乏结构组织和协调，这可能导致大量组织或细胞可以是良性的或恶性的。如本文所用的，癌症包括任何赘生物。这包括但不限于黑素瘤、腺癌、恶性神经胶质瘤、前列腺癌、肾癌、膀胱癌、胰腺癌、甲状腺癌、肺癌、结肠癌、直肠癌、脑癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌等。在具体的方面，癌症表达PD-L1和/或CEACAM6。在其他具体方面，癌症是实体瘤。
“肿瘤”或“实体瘤”是指癌细胞的粘性团，包括但不限于半实体和实体瘤、实体瘤转移瘤、血管纤维瘤、晶状体后纤维组织增生症、血管瘤和卡波西氏肉瘤。
术语“抑制”是指活性、应答、病况、疾病或其他生物学参数的降低。这可以包括但不限于完全消除活性、应答、病况或疾病。这还可以包括，例如，与天然或对照水平相比，活性、应答、病况或疾病减少10％。因此，与天然或对照水平相比，减少可以是10、20、30、40、50、60、70、80、90、100％或其间的任何减少量。
更具体地，与癌细胞生长相关的术语“抑制”是指癌细胞增殖和/或迁移速率的任何减慢、癌细胞增殖和/或迁移的停止、或癌细胞的杀伤，使得与未经处理的对照癌细胞的观察或预测的生长速率相比，癌细胞生长速度降低。术语“抑制生长”也可以指癌细胞或肿瘤的大小减少或消失以及其转移潜力的降低。优选地，此类细胞水平的抑制可以减小患者癌症的体积、阻止癌症的生长、降低癌症的侵袭性、或预防或抑制癌症的转移。本领域那些技术人员可以容易地通过各种合适的标记中的任何一种来确定癌细胞生长是否被抑制。
可以通过例如在细胞周期的特定阶段癌细胞停滞(例如在细胞周期的G2/M期停滞)来证明癌细胞生长的抑制。也可以通过直接或间接测量癌细胞或肿瘤大小来证明癌细胞生长的抑制。在人类癌症患者中，此类测量通常使用众所周知的成像方法进行，诸如磁共振成像、计算机轴向断层扫描和X射线。癌细胞生长也可以被间接测定，诸如通过测定循环癌胚抗原、前列腺特异性抗原或与癌细胞生长相关的其他癌症特异性抗原的水平。癌症生长的抑制通常也与对象的延长的存活和/或增加的健康和幸福相关。
除非另有说明，否则状态或病况的“逆转”(“Reversal”或“reverse”)以及功能的“恢复”(“restoration”或“restore”或“reactivate(重新激活)”)包括完全和部分逆转或恢复。在具体方面，逆转和/或恢复/重新激活是指T细胞产生和释放细胞因子(诸如但不限于IL-2)的能力。因此，在一方面，恢复包括针对酸敏感的T细胞(对肿瘤诱导的酸性的负面影响易感的)免疫系统的修复。
术语“脲酶”是指具有尿素酰胺水解酶(E.G.3.5.1.5)的酶活性的酶，其天然存在或通过例如重组核酸技术和/或化学合成获得。脲酶还包括包含整个脲酶、其亚基或片段的融合蛋白，和/或保留多肽的尿素酰胺水解酶活性的具有氨基酸取代、缺失或添加的脲酶。本文所用的截短的脲酶序列是不含从脲酶的氨基或羧基末端开始的完整的脲酶序列的一部分的脲酶的片段。用于分离天然脲酶、用于重组合成脲酶和用于鉴定活性片段和修饰的脲酶多肽的方法详细描述于国际专利申请公开第WO 2004/009112号中，其通过引用整体并入本文。
如本文所用的，术语“靶向部分”是指限定的细胞群或选择的细胞类型结合的分子。靶向部分可以结合存在于靶细胞或细胞群上或靶细胞或细胞群中的受体、寡核苷酸、酶底物、抗原决定簇或其他结合位点。示例性靶向部分是抗体。能够识别表达的抗原的抗体片段和小肽序列也是预期的靶向部分。
术语“对象”、“个体”和“患者”在本文中可互换使用以指代治疗的任何目标。本发明还提供了原位或在其正常位置(position/location)处理肿瘤细胞的方法，例如乳腺或前列腺肿瘤的赘生性细胞。这些原位肿瘤可位于多种宿主内或上；例如，人宿主、犬宿主、猫宿主、马宿主、牛宿主、猪宿主等。可以治疗其中发现肿瘤或肿瘤细胞的任何宿主，并且是根据本发明。因此，对象包括脊椎动物，优选哺乳动物，更优选人类。
与一种或多种其他治疗剂“联合”施用包括以任何顺序同时(同时发生)和连续施用。
术语“药学上可接受的”是指化合物或化合物的组合与药物用途制剂的其余成分相容，并且通常根据既定的政府标准(包括美国食品和药品监督管理局(United StatesFood and Drug Administration)颁布的那些标准)向人类施用是安全的。
术语“药学上可接受的载体”包括但不限于溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂、抗真菌剂、等渗剂和/或吸收延迟剂等。药学上可接受的载体的使用是众所周知的。
本文包括本文所述化合物的药学上可接受的盐、溶剂化物和前药及它们的混合物。
在理解本申请的范围时，冠词“一个/种(a/an)”、“该(the)”和“所述”旨在表示存在一个或多个元素。另外，如本文所使用的术语“包含”及其衍生词旨在是开放式术语，其指定所述特征、元素、组分、组、整数和/或步骤的存在，但不排除存在其他未说明的特征、元素、组分、组、整数和/或步骤。前述内容也适用于具有类似含义的词语，诸如术语“包括”、“具有”及它们的衍生词。
应当理解，描述为“包含”某些组分的任何方面也可以“由......组成”或“基本上由......组成”，其中“由......组成”具有封闭的或限制性的含义，“基本上由......组成”意指包括指定组分，但是排除除了作为杂质存在的材料，由于用于提供组分的过程而存在的不可避免的材料的其他组分，以及为了实现本文所述的技术效果之外的目的而添加的组分。例如，使用短语“基本上由......组成”所限定的组合物包括任何已知的药学上可接受的添加剂、赋形剂、稀释剂、载体等。通常，基本上由一组组分组成的组合物将包含小于5重量％、通常小于3重量％、更通常小于1重量％的未指定组分。
应当理解，本文中所限定为包括的任何组分可以通过附带条件或否定限制从要求保护的发明中明确排除。例如，在某些方面，碳酸氢盐和/或口服缓冲液明确排除在本文所述的组合物和方法之外。在其他方面，肿瘤特异性靶向部分不包括在本文所述的组合物中和/或不与脲酶部分缀合。
此外，无论是否明确说明，本文给出的所有范围包括范围的端点以及还包括任何中间范围点。
最后，如本文所使用的诸如“基本上”、“约”和“大约”的程度术语意指修饰术语的合理偏差量，使得最终结果不会显著改变。这些程度术语应被解释为包括修饰术语至少±5％的偏差，如果该偏差不会否定它修饰的词语的含义。
脲酶
本文所述的组合物和方法包含脲酶。应理解，任何合适的脲酶可用于本文所述的组合物和方法中。例如，WO 2004/009112(通过引用整体并入本文)描述了衍生自许多不同来源的许多不同类型的脲酶。在那个申请中所描述的任何脲酶同样可以用于本申请中。通常，脲酶是杰克豆脲酶。
在一些方面，脲酶用于未与另一部分缀合的用途。可以经由瘤内注射或肿瘤周围/附近的注射将脲酶直接提供给肿瘤环境/肿瘤环境周围。例如，可以将脲酶靶向和/或直接施用于周围的基质。还可以使用基因疗法将脲酶靶向期望的T细胞。
在其他方面，如下文所述，脲酶与靶向部分缀合。在其他方面，脲酶被包封在脂质体中或与纳米颗粒相关。
靶向部分
在某些方面，脲酶通常与靶向部分缀合。靶向部分结合限定的、选定的细胞类型或靶细胞群，诸如癌细胞。在这方面，有用的靶向部分包括例如抗体和抗体片段、肽和激素。对应于已知细胞表面受体的蛋白(包括低密度脂蛋白、转铁蛋白和胰岛素)、纤维蛋白溶解酶、抗HER2、血小板结合蛋白(诸如膜联蛋白)和生物反应调节剂(包括白细胞介素、干扰素、促红细胞生成素和集落刺激因子)也认为是靶向部分。其它的靶向部分详细描述于WO 2004/009112(通过引用并入本文)。在典型方面，靶向部分是经由肿瘤特异性抗原(诸如CEACAM6)将脲酶靶向肿瘤的抗体或其片段。示例性CEACAM6靶向部分描述于国际专利申请公开第WO2016/116907号或第WO2012/040824号(其各自通过引用整体并入本文)。在其他方面，靶向部分可以特异性地经由PD-1靶向T细胞。在其他方面，靶向部分可以经由乳酸盐靶向肿瘤中和/或肿瘤周围的酸性环境。
组合物
本文所述的组合物可以通过本身已知的制备药学上可接受的组合物的方法制备，所述组合物可以被施用于对象，使得有效量的活性物质与药学上可接受的媒介物混合在一起。例如，在Remington's Pharmaceutical Sciences(Remington's PharmaceuticalSciences，第20版，Mack Publishing Company，Easton，Pa，USA，2000)中描述了合适的媒介物。在此基础上，组合物可以包括(尽管不是唯一的)与靶向部分一起或者与靶向部分组合，并且与一种或多种药学上可接受的媒介物或稀释剂相关的脲酶，并且组合物可以被包含在具有与生理液体等渗的合适pH的缓冲溶液中。
在具体的方面，本文所述的组合物可以用于免疫疗法，并且可以包含脲酶(单独或与靶向部分缀合)，用于施用于对象的T细胞。T细胞可以是体内、离体或体外的。在一些方面，将脲酶组合物施用于对象以恢复所述对象中酸化T细胞的功能。
药物组合物包括但不限于冻干粉末、或水性或非水性无菌可注射溶液或混悬液，其还可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和溶质，使组合物与对象的组织或血液基本相容。可存在于此类组合物中的其他组分包括例如水、表面活性剂(诸如吐温)、醇、多元醇、甘油和植物油。临时注射溶液和混悬液可由无菌粉末、颗粒、片剂或浓缩溶液或混悬液制备。药物组合物可以例如但不限于作为冻干粉末提供，所述冻干粉末在向患者施用之前用无菌水或盐水复原。
合适的药学上可接受的载体包括基本上化学惰性和无毒的组合物，其不会干扰药物组合物的生物活性的有效性。合适的药物载体的实例包括但不限于水、盐水溶液、甘油溶液、乙醇、N-(1(2,3-二油酰氧基)丙基)N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)，二油基磷脂酰基-乙醇胺(DOPE)和脂质体。此类组合物应含有治疗有效量的活性剂，以及适量的载体，以提供直接施用于患者的形式。
其他活性剂也可以被包括在本发明的组合物中。在细胞与第一活性剂接触之前、同时或之后，可以在组合物中使用另外的活性剂，例如抗肿瘤剂(对增殖细胞有活性的试剂)。例如，在脲酶靶向肿瘤和/或T细胞和/或酸性环境和/或基质后，它可能具有例如通过pH变化调节或调控肿瘤外部环境的能力。然后，活性剂(例如有利于碱性环境的抗肿瘤剂)将更有效。在某些实施方案中，预期将能够被脲酶酶促加工的底物用作活性剂。优选地，活性剂是脲酶可以利用以形成铵离子(例如尿素)的底物。
示例性抗肿瘤剂包括细胞因子和其他部分，诸如白细胞介素(例如，IL-2、IL-4、IL-6、IL-2等)、转化生长因子-β、淋巴毒素、肿瘤坏死因子、干扰素(例如，γ-干扰素)、集落刺激因子(例如，GM-CSF、M-CSF等)、血管通透因子、凝集素炎症应答启动子(选择素，诸如L-选择素，E-选择素，P-选择素)和蛋白质部分(诸如C1q和NK受体蛋白)。其他合适的抗肿瘤剂包括抑制血管生成并因此抑制转移的化合物。此类试剂的实例包括鱼精蛋白甲羟孕酮、戊聚糖聚硫酸酯、苏拉明、紫杉醇、沙利度胺(thalidomide)、血管抑制素、干扰素α、金属蛋白酶抑制剂、血小板因子4、生长抑素、细胞外基质蛋白凝血酶敏感素(Thromobospondin)。可用于本发明的活性剂的其它代表性和非限制性实例包括长春新碱(vincristine)、长春花碱(vinblastine)、长春地辛(vindesine)、白消安(busulfan)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、螺铂(spiroplatin)、顺铂(cisplatin)、卡铂(carboplatin)、甲氨蝶呤、阿霉素、丝裂霉素、博来霉素、阿糖胞苷、阿拉伯糖基腺嘌呤(arabinosyl adenine)、巯嘌呤、米托坦(mitotane)、甲基苄肼、更生霉素(放线菌素D)、道诺霉素、盐酸多柔比星、紫杉醇、普卡霉素、氨鲁米特(aminoglutethimide)、雌莫司汀(estramustine)、氟他胺(flutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)、醋酸甲地孕酮、他莫昔芬(tamoxifen)、睾内酯、曲洛司坦(trilostane)、安丫啶(m-AMSA)、天冬酰胺酶(L-天冬酰胺酶)、依托泊苷(etoposide)、血液制品(诸如血卟啉类)或前述的衍生物。活性剂的其他实例包括遗传物质，诸如天然或合成来源的核酸、RNA和DNA，包括重组RNA和DNA。编码某些蛋白质的DNA可用于治疗许多不同类型的疾病。例如，可以提供肿瘤坏死因子或白细胞介素-2基因来治疗晚期癌症；可以提供胸苷激酶基因来治疗卵巢癌或脑肿瘤；可以提供白细胞介素-2来治疗神经母细胞瘤、恶性黑素瘤或肾癌。预期用于本发明的另外的活性剂描述于美国专利第6,261,537号中，其通过引用整体并入本文。用于检测此类试剂的抗肿瘤剂和筛选在Monga,M.和Sausville,E.A.(2002)Leukemia 16(4):520-6中进行了综述。
在某些实施方案中，活性剂是弱碱性抗肿瘤化合物，其效力通过实体瘤中较高的细胞内/较低细胞外pH梯度而降低。示例性的弱碱性抗肿瘤化合物包括多柔比星(doxorubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、米托蒽醌(mitoxanthrone)、表柔比星(epirubicin)、丝裂霉素(mitomycin)、博来霉素(bleomycin)、长春花生物碱类(诸如长春花碱和长春新碱)、烷化剂(诸如环磷酰胺)和盐酸二氯甲胺二乙胺，和抗肿瘤嘌呤和嘧啶衍生物。
在一方面，该组合物包括脲酶，并且基本上缺乏任何细胞因子，诸如肿瘤坏死因子和/或干扰素。在该实施方案中，单独的脲酶，或除细胞因子以外的活性剂，通常与小分子抗肿瘤剂组合，对于帮助恢复正常T细胞功能是有效的。因此，在这方面，组合物可以或可以不与待治疗的对象中存在的内源或天然细胞因子一起起作用，但所施用的组合物不含额外的外源细胞因子。
在其他方面，另外的活性剂是PD-1抑制剂。
PD-1抑制剂可以包括针对PD-1的抗体，诸如纳武单抗(nivolumab)和pembrolizumab。
试剂盒
在另一方面，本发明提供了使用本文所述方法恢复T细胞功能的试剂盒。试剂盒包括含有一种或多种活性剂的容器。试剂盒可另外包括用于实施本发明的方法的本文所述的任何其他组分。此类组分包括但不限于药物组分、靶向部分、成像剂、清除剂、基因疗法组分等。
试剂盒可任选地包括含有指导(即方案)的说明材料，其公开了用于恢复T细胞功能的活性剂的使用。因此，在一实施方案中，试剂盒包括含有活性剂，优选脲酶的药物组合物，以及教导向对象施用组合物的说明材料，用于治疗对象的癌症。在一个实施方案中，说明材料教导以下述量向对象施用脲酶组合物：当通过直接注射将组合物施用进肿瘤时，所述量取决于肿瘤的大小并且每mm3肿瘤0.1至100个国际单位脲酶活性，以及当肠道外向对象施用组合物而不是直接注射进肿瘤中时，100-100,000个国际单位/kg国际单位脲酶活性/kg对象体重的量。
在另一个实施方案中，该说明材料教导将脲酶组合物施用于同时接受弱碱性抗肿瘤化合物的对象，所述抗肿瘤化合物的效力通过实体瘤中较高的细胞内/较低的细胞外pH梯度实体瘤中而降低，其中脲酶的量有效减少或逆转实体瘤中较高的细胞内/较低细胞外pH梯度。
可选地，说明材料教导将脲酶组合物施用于含有或疑似含有实体瘤的对象，所述实体瘤在有效将脲酶定位于对象肿瘤附近的T细胞的条件下产生酸化T细胞的酸性环境，用能够检测对象组织中细胞外pH变化以及在所述施用后鉴定对象内显示细胞外pH升高的组织区域的诊断工具询问对象。虽然说明材料通常包括书面或印刷材料，但它们不限于此。本发明考虑了能够存储此类说明并将它们传送给最终用户的任何介质。此类介质包括但不限于电子存储介质(例如，磁盘、磁带、盒式磁带、芯片)、光学介质(例如CD ROM)等。此类介质可以包括提供此类说明材料的因特网站点的地址。
治疗方法
如本文所述，单独的脲酶或与靶向部分缀合的脲酶可用于恢复T细胞功能、降低T细胞耐受性、增加T细胞浸润到实体瘤中、和/或促进T细胞释放细胞因子。
预期本文所述的组合物可与癌症的常规治疗(诸如手术、化学疗法、激素疗法、放射物和/或免疫疗法)组合使用，从而在某些方面产生加性或协同治疗模式。本文的组合物可与过继性T细胞疗法联合使用，由此从患者收集T细胞并在实验室中生长，然后将其返回给患者以帮助免疫系统对抗疾病。也被称为细胞过继性免疫疗法。
在某些方面，本文所述的组合物可以例如通过肠胃外、静脉内、皮下、皮内、肌肉内、颅内、眶内、眼内、心室内、囊内、脊柱内、脑池内、腹膜内、鼻内、直肠内、喷雾或口服给药施用。通常，本文所述的组合物通过皮下、肌肉内或皮内给药。更典型地，本文所述的组合物通过注射施用。
如上所述，在某些方面，本文所述的组合物可以与癌症的常规治疗组合、同时或相继施用。在适当时，可以将这些组合物与此类常规治疗一起配制。例如，可以在常规治疗之前施用组合物，使得癌细胞和/或T细胞对常规治疗更易感。
可以以任何合适的量使用本文所述的组合物，但通常以包含以下浓度的激动剂的剂量提供：约0.001μM至约1000μM，诸如约0.001μM、约0.01μM、约0.1μM、约1μM、约10μM、或约100μM至约0.01μM、约0.1μM、约1μM、约10μM、约100μM或约1000μM。可替代地，本文所述的组合物可以以如下剂量施用：诸如约0.001mg/kg至约1000mg/kg、诸如约0.001mg/kg、约0.01mg/kg、约0.1mg/kg、约1mg/kg、约10mg/kg、或约100mg/kg至约0.01mg/kg、约0.1mg/kg、约1mg/kg、约10mg/kg、约100mg/kg或约1000mg/kg。
在其他方面，其中将脲酶组合物在肿瘤附近注射和/或直接注射到肿瘤中，示例性剂量是每mm3肿瘤0.1至1,000个国际单位脲酶活性。例如，并且假设实现了肿瘤中脲酶的相对均匀分布，0.5至5个国际单位的剂量可能是合适的。注射针的放置可以通过传统的图像引导技术(例如荧光镜检查)来引导，使得医生可以相对于靶区域或靶组织观察针的位置。此类引导工具可以包括超声、荧光镜检查、CT或MRI。
根据本发明的一个方面，通过能够检测对象癌组织区域内pH变化的工具监测肿瘤组织，可以在脲酶直接注射到肿瘤附近期间或之后监测施用的脲酶剂量的有效性或分布。此类工具可以包括可直接插入肿瘤的pH探针，或可视化工具，诸如磁共振成像(MRI)--计算机断层扫描(CT)或荧光镜检查。MRI检查可以在没有其他成像剂的情况下进行，仅仅基于作为pH函数的组织磁性的差异，CT或荧光检查成像可能需要额外的pH敏感成像剂，其不透明度受组织培养基pH的影响。此类试剂是本领域技术人员所熟知的。
在任何脲酶注射之前，肿瘤组织可以通过其相对于周围正常组织的较低pH来显现。因此，正常组织可具有约7.2的正常pH，而肿瘤组织可低0.1至0.4或更多的pH单位。换言之，在注射任何脲酶之前，肿瘤组织的程度可以通过其较低的pH来限定。施用脲酶后，具有脲酶的肿瘤区域的pH将开始上升，并且可以通过将得到的图像与早期的预先给药图像进行比较来鉴定。
通过以这种方式检查组织，可以监测pH的变化程度和受影响的组织范围。基于该检查，医生可以向该部位施用另外的组合物，和/或可以在肿瘤部位内的其他区域施用组合物。可以重复该程序，直到在整个实体瘤区域上实现所期望的pH变化程度，例如0.2至0.4个pH单位。
可以通过合适的间隔重复(例如每周或每周两次)通过直接注射给药直至观察到所期望的终点，优选肿瘤块的显著或完全消退。如上所述，通过在治疗过程中观察治疗组织的pH变化，可以监测治疗功效。因此，在每次额外注射之前，可以观察组织的pH以确定当前存在的肿瘤范围，之后可以使用组织pH的变化来监测向组织施用的新剂量的脲酶组合物。
当通过除直接注射以外的方法肠胃外施用脲酶时，脲酶的示例性剂量是100-100,000个国际单位/kg脲酶活性/kg对象体重。如本文所述，该方法中的脲酶组合物优选包括用于将脲酶靶向癌细胞和/或T细胞和/或酸性微环境(例如，实体瘤的位点)的靶向剂，或用于在肿瘤部位选择性地隔绝脲酶(例如以脂质体形式)的靶向剂。
可替代地，用本文所述的组合物治疗可以发生一次或可以重复数次。例如，取决于疾病状态，治疗可以每天、每周、每月、每年或它们的组合发生。例如，可以每小时、每天或每周向对象施用若干剂量以治疗活跃的癌症。一旦癌症减慢或进入缓解期，可以例如每月、每三个月、每六个月或每年提供后续维持剂量。
在一方面，以有效地将肿瘤液的细胞外pH升高至少0.1个pH单位(例如0.1至0.5个pH单位或更多)的量将脲酶或含有脲酶的组合物施用于实体瘤或实体瘤附近。在某些实施方案中，将流体的细胞外pH升高至至少pH7.0、pH7.2或更高，以恢复酸化的T细胞功能。
可以如上所述施用脲酶，例如，直接施用于对象的肿瘤中或肠胃外施用，而不是通过直接注射施用以恢复酸化的T细胞功能。同样如上所述，通过使用用于可视化肿瘤pH的成像工具或通过直接肿瘤pH的测量确定肿瘤组织中和肿瘤组织周围的pH变化以及这些变化的范围，可以监测通过施用脲酶产生的pH的变化。可以确定T细胞增殖和细胞因子的产生中的变化。
在该方法中施用的剂量可以小于脲酶是唯一抗肿瘤剂时所需的剂量，只要注射的量足以产生所期望的肿瘤pH升高。可替代地，该方法可以包括施用治疗量的脲酶以及治疗量或亚治疗量的抗癌化合物或其他活性剂。可以理解，该方法可以允许给予低于抗癌化合物或其他活性剂的正常剂量，因为脲酶可以增强化合物的治疗效果，并且因为脲酶本身有助于治疗效果。在某些方面，产生更大的功效和更少的副作用。
在一方面，如上所述的化学实体也可以与活性剂缔合以增强活性剂的递送。在该实施方案中，活性剂可以通过任何方法施用，例如肠胃外给药，而不是直接注射。
实施例
给出以下实施例是为了说明本公开的各个方面。它们并不意味着以任何方式限制本公开。本领域技术人员将理解，本公开内容非常适于实现所述目标并获得所提到的目的和优点，以及本文固有的任何目标、目的和优点。本发明的实施例(连同本文所述的方法)目前代表优选的方面。它们是示例性的，并不旨在作为对本公开范围的限制。本领域技术人员将想到包含在由权利要求的范围所限定的本公开的精神内的变型和其他用途。考虑到形式的变化和等同物的替代，因为情况可能表明或提供权宜之计。尽管本文已采用特定术语，但此类术语旨在描述性意义而非出于限制的目的。
引言
由于血液供应减少，实体瘤变得缺血和代谢过程异常。因此，乳酸盐水平倾向于在肿瘤内和肿瘤周围高于正常水平，并且pH趋于低。酸性微环境是癌症进展的关键，因为它促进癌细胞的侵袭性和转移行为。此外，它通过抑制局部免疫效应细胞的增殖和细胞毒性活性来保护癌细胞遭受免疫疗法。本文描述了使用脲酶(在某些方面为抗体-脲酶缀合物L-DOS47)恢复T细胞功能的新方法。
L-DOS47目前正在进行用于治疗非小细胞肺癌的I/II期测试。它通过将脲酶与特异性针对人CEACAM6的骆驼科单结构域抗体缀合而制备。免疫缀合物特异性地靶向并递送脲酶至表达CEACAM6的癌细胞，其中脲酶将尿素转化为细胞毒性氨。氨原位增加了肿瘤微环境的pH。
在该研究中，L-DOS47被用于增加模拟体外肿瘤微环境的酸化培养基的细胞外pH，并检测对人T类淋巴母细胞系Jurkat克隆E6-1的影响。
实施例1-乳酸对Jurkat细胞增殖的影响
材料
1.含有5％FBS、Glutamax和抗生素的改良RPMI-1640培养基
2.乳酸，6.03M
3.台盼蓝溶液，含0.4％(w/v)的PBS溶液
步骤
1.制备补充有1.5至24mM乳酸的培养基；
2.制备Jurkat细胞，将500μL/孔的细胞(最终细胞数为9.3×105个细胞/孔)加入到含有1mL培养基的相应孔中；
3.将板在37℃和5％CO2下孵育；
4.在第1天、第2天和第3天，从每个孔中取出80μL细胞培养物，并通过添加20μL台盼蓝溶液对细胞计数。
结果
首先，确定为了通过使用L-DOS-47将乳酸处理的培养基的pH恢复到生理水平，在实验中需要包括多少尿素。通过L-DOS47的脲酶部分水解尿素产生氨[(NH2)2CO+H2O→CO2+2NH3]，其转化为铵离子并在水性介质中增加pH[NH3+H2O→NH4 ++OH-]。
下表1中的数据显示，在1μg/mL L-DOS47存在下，2-4mM的尿素足以恢复经乳酸处理的RMPI 1640培养基(补充有5％热灭活的FBS和GlutaMax)的pH，以在37℃和5％CO2下孵育18小时后，达到生理水平。
表1.在L-DOS47存在下尿素对pH的影响。
接下来，测量乳酸对Jurkat细胞增殖的影响。将Jurkat细胞(1×106个细胞/mL)在含有不同量的乳酸(3至24mM)的完全RPMI 1640培养基中孵育1-3天。在台盼蓝染色后使用血细胞计数器进行细胞计数。结果表明，乳酸在浓度≥3mM时阻止Jurkat细胞增殖(图1)。当用相同浓度的HCl替换乳酸时，观察到类似的生长抑制曲线(数据未显示)。
实施例2-乳酸对激活的Jurkat细胞中IL-2释放的影响
材料
1.含有5％热灭活FBS(HIFBS)、Glutamax和抗生素的改良RPMI-1640培养基
2.细胞刺激试剂：
佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)，5μg/mL，Abcam cat#AB120297
离子霉素，1mg/mL DMSO，Abcam cat#AB120116-2
植物血凝素(PHA)，2mg/mL，Sigma cat#L8754)
3.乳酸，6.03M
步骤
1.制备Jurkat细胞，最终细胞浓度为5×106个细胞/mL；
2.将3、2、1或0.5μL乳酸加入到含有1mL细胞培养物的相应孔中，终浓度分别为18、12、6和3mM；
3.向孔中加入1.25μL的PHA(终浓度：2.5μg/mL)、10μL PMA(终浓度：50ng/mL)和0.75μL离子霉素(终浓度0.75μg/mL)；
4.将板在37℃下孵育24小时；
5.将细胞培养物转移到Eppendorf管中并在7000rpm下离心10min以收集上清液；
6.进行ELISA以确定Jurkat细胞释放的IL-2的量。
IL-2ELISA材料
1.牛血清白蛋白(BSA)，Roche REF10735086001
2.人IFN-γDuoSet ELISA，R&D Systems，Cat#DY285：
-人IL-2捕获抗体，Part#840104
-人IL-2检测抗体，Part#840105
-人IL-2标准，Part#840106
-链霉亲和素-HRP，Part#893975
3.ELISA板，96孔EIA/RIA板，Costar 3590
4.TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺，Aldrich，860336-1G)
5.二甲基亚砜，Sigma，D8418-50ml
6.过氧化氢，30％，Fisher H325-500
7.PBS，pH 7.2-7.4
8.洗涤缓冲液：含0.05％20的PBS，pH 7.2-7.4
9.封闭缓冲液：含3％BSA的PBS，pH7.2-7.4，0.2μm过滤
10.试剂稀释剂：含0.1％BSA、0.05％吐温20的PBS，0.2μm过滤。
11.乙酸盐-柠檬酸盐缓冲液：称取14.7g柠檬酸三钠，并溶于500ml水中。使用冰醋酸将pH调节至4.5
12.TMB储备溶液：称取93.0mg TMB溶于4ml DMSO中，在黑暗中储存(在室温下稳定1个月)
13.底物溶液：仅在使用前，在15ml螺旋盖管中混合6.0ml显色剂A(H2O2)和6.0ml显色剂B(四甲基联苯胺)。
14.终止溶液：2N H2SO4。将5.6ml H2SO4(36N)稀释至100ml水中。Lot#1160330ST
15.人IL-2标准储备溶液(60ng/mL)。向IL-2小瓶的小瓶中加入0.500ml试剂稀释剂。盖上盖子，轻轻翻转小瓶以溶解蛋白质。储存在4℃
16.小鼠抗人IL-2捕获抗体储备溶液(480μg/mL)：用0.5mL PBS重构每个小瓶。储存在4℃
17.生物素化的山羊抗人IL-2检测抗体原液(6.0μg/mL)：用1.0mL试剂稀释剂重构每个小瓶。盖上盖子，轻轻翻转小瓶以溶解蛋白质。储存在4℃
IL-2 ELISA步骤
1.制备捕获抗体工作溶液(4μg/ml)：向50ml螺旋盖管中的16.0ml PBS中加入0.133ml小鼠抗人IL-2捕获抗体储备溶液(480μg/ml)并涡旋混合。
2.通过添加100μl/孔捕获抗体工作溶液来包被板。用塑料薄膜覆盖板并在4℃孵育过夜。(室温：13:30-16:00，然后16:00-第二天8:30，4℃)。
3.第二天早上，抽吸每个孔，并通过用300μl洗涤缓冲液填充每个孔来洗涤每个孔。该过程重复两次，总共洗涤三次。完成每个步骤的液体去除以获得良好的性能。最后一次洗涤后，通过抽吸除去任何剩余的洗涤缓冲液。
4.通过向每个孔中加入200μL/孔的封闭缓冲液来封闭板。将板在室温下轻轻振荡(～100rpm)孵育2小时(8:50-11:00)。
5.如步骤3中那样重复抽吸/洗涤以制备用于添加样品的板。
6.在封闭期间，通过在1.0ml Eppendorf管中用1000pg/ml的第一标准浓度2倍连续稀释至试剂稀释剂中制备IL-2工作标准溶液用于7点标准曲线。为了制备1000pg/ml标准品，将16.7μL的60ng/mL标准品稀释至1.50mL试剂稀释缓冲液，并涡旋。为2个板制备两组。
7.相应地将每个样品稀释在试剂稀释剂中。
8.根据板的布局，将100μL/孔的每种标准品和样品工作溶液移液到孔中。
9.用塑料薄膜覆盖平板，并在室温下轻轻振荡(～100rpm)孵育1.5小时(11:30-13:00)。
10.如步骤3中那样重复抽吸/洗涤。
11.制备检测抗体工作溶液(100ng/ml)：向50ml螺旋盖管中的16.0ml试剂稀释剂中加入0.266ml生物素化山羊抗人IL-2检测抗体储备溶液和320μl正常山羊血清并涡旋混合。
12.加入100μL/孔的检测抗体工作溶液；将板用塑料薄膜覆盖，并在室温下轻轻振荡(～100rpm)孵育1.5小时。
13.如步骤3中那样重复抽吸/洗涤。
14.制备链霉亲和素-HRP工作溶液(40x稀释)：向50ml螺旋盖管中的16.0ml试剂稀释剂中加入0.400ml链霉亲和素-HRP储备溶液并涡旋混合。
15.向每个孔中加入100μL链霉亲和素-HRP的工作稀释液。覆盖板并在室温下轻轻振荡(～100rpm)孵育20分钟。
16.如步骤3中那样重复抽吸/洗涤。
17.底物工作溶液的制备：将18.0ml乙酸盐-柠檬酸盐(100mM，pH4.5)缓冲液，将2.0ml DMSO和0.200mL TMB与40.0μl H2O2(30％)混合，并避免光直接照射在板上。
18.向每个孔中加入100μL底物溶液，并在室温下振荡(～200rpm)孵育30分钟。时间取决于颜色的发展，通常在10至60分钟。在添加终止溶液之前检查OD。避免光直接照射在板上。
19.向每个孔中加入100μL终止溶液。轻轻敲打板以确保充分混合。
20.立即测定每个孔的光密度，使用酶标仪将信号OD设定为450nm和背景OD设定为570nm。从450nm处的读数中减去570nm处的读数。
结果
通过在含有2.5μg/mL PHA、50ng/mL PMA和0.75μg/mL离子霉素的完全RPMI培养基中于37℃孵育24小时来活化Jurkat细胞(5×106个细胞/mL)。使用夹心ELISA测量由激活的Jurkat细胞释放的IL-2。如图2所示，发现浓度≥6mM的乳酸导致IL-2产生显著降低(与对照相比，*p<0.05和**p<0.01)。
实施例3-L-DOS47/尿素对在乳酸处理的培养基中培养的Jurkat细胞的保护作用
材料
1.含有5％FBS、Glutamax和抗生素的改良RPMI-1640培养基
2.乳酸，6.03M
3.L-DOS47(2128-101,1.89mg/mL)
4.尿素，2.6M
5.PBS，10mM、pH 7.4
6.台盼蓝溶液，含0.4％(w/v)的PBS
步骤
1.在完全培养基中以3×106个细胞/mL制备Jurkat细胞；
2.将1.0mL/孔的细胞培养物加入24孔培养板中；
3.将板在37℃孵育过夜；
4.第二天早上，制备42μg/mL的L-DOS47，并以25μL/孔加入相应的孔中至终浓度为1μg/mL；
5.然后，制备168mM的尿素，并以25μL/孔加入相应的孔中至终浓度为4mM；
6.通过轻轻涡旋板混合孔的内容物；
7.将乳酸加入相应的孔中至终浓度为6、12或18mM；
8.通过轻轻涡旋板混合孔的内容物；
9.将板在37℃和5％CO2下孵育过夜；
10.从每个孔中取出60μL细胞培养物并加入20μL台盼蓝溶液以进行细胞计数。
结果
将Jurkat细胞(3×106个细胞/mL)在含有6至18mM乳酸的完全RPMI 1640培养基中孵育1天。在台盼蓝染色后使用血细胞计数器进行细胞计数。如图3所示，发现细胞增殖减少20％至50％(空心柱)。加入L-DOS47(1μg/mL)和尿素(4mM)抑制了乳酸的生长抑制作用并增加了细胞活力(实心柱)。
实施例4-在乳酸处理的Jurkat细胞中恢复IL-2的产生
材料
1.含有5％HIFBS、Glutamax和抗生素的改良RPMI-1640培养基
2.细胞刺激试剂：
佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)，5μg/mL，Abcam cat#AB120297
植物血凝素(PHA)，2mg/mL，Sigma cat#L8754)
3.乳酸，6.03M
4.L-DOS47(2128-101,1.89mg/mL)
5.尿素，2.6M
6.台盼蓝溶液，含0.4％(w/v)的PBS
步骤
1.在HIFBS培养基中以4×106个细胞/mL制备Jurkat细胞；
2.将0.5mL/孔的细胞培养物加入到两个24孔培养板中；
3.将板在37℃和5％CO2下孵育过夜；
4.第二天早上，制备15μg/mL的L-DOS47，并以40μL/孔加入相应的孔中至终浓度为1μg/mL；
5.然后，制备60mM的尿素，并以40μL/孔加入相应的孔中至终浓度为4mM；
6.通过轻轻涡旋板混合孔的内容物；
7.将乳酸以1.2或2.4μL/孔加入相应的孔中至终浓度为6或12mM；
8.通过轻轻涡旋板混合孔的内容物；
9.制备分别为60和1.5μg/mL的PHA和PMA的混合物，并将20μL/孔的溶液分别加入到相应的孔中至终浓度为2.0μg/mL和50ng/mL；
10.将板在37℃和5％CO2下孵育24小时；
11.将来自每个孔的细胞培养物转移到Eppendorf管中，并以7000rpm离心10分钟以收集上清液；
12.进行ELISA以确定Jurkat细胞释放的IL-2的量。
结果
乳酸抑制用2μg/mL PHA和50ng/mL PMA刺激的Jurkat细胞中的IL-2产生，其通过在含有6mM乳酸的培养基中添加1μg/mL L-DOS47和4mM尿素而部分恢复(图4)。在较高的酸浓度(12mM)下，测试的L-DOS47和尿素组合不足以恢复IL-2释放。有趣地是，在没有乳酸的天然培养基中，添加L-DOS47/尿素似乎可使IL-2产生减少约20％，然而这在统计学上并不相当显著(p＝0.0622)。其中与空白培养基相比，*p<0.05且**p<0.005。
实施例5-在乳酸处理的Jurkat细胞中恢复PD-1表达
材料
1.含有5％HIFBS、Glutamax和抗生素的改良RPMI-1640培养基
2.抗CD3抗体，1mg/L
3.抗CD28抗体，0.5mg/mL
4.乳酸，6.03M
5.L-DOS47(2128-101,1.89mg/mL)
6尿素，2.6M
7.台盼蓝溶液，含0.4％的PBS
8.Trustain fcx，BioLegend 422301
9.生物素-抗PD-1Ab，0.5mg/mL，Biolegend 329934
10.链霉亲和素-AP，1mg/mL
11.四硝基苯磷酸二钠盐六水合物，Fluka(用量：1mg/ml)
12.二乙醇胺底物缓冲液，5X浓缩物
13.缓冲液A，0.05％BSA/PBS
14.多聚甲醛，20％
15.PBS，10mM，pH 7.4
16.含5％BSA的PBS
17.TBS-T：含0.05％吐温-20的TBS溶液
18.缓冲液B：含0.05％BSA和0.05％吐温-20的PBS
步骤
1.用0.5mL/孔的抗CD3抗体(PBS中10μg/mL)包被12孔板，并在37℃下孵育1小时；
2.用2mL PBS洗涤板1次；
3.在含有2μg/mL抗CD28抗体的培养基中以5×106个细胞/mL制备Jurkat细胞；
4.在培养基中制备L-DOS47/尿素溶液(4μg/mL，以及0、8、16mM)；
5.在培养基中制备乳酸溶液(0、24、48mM)；
6.向相应孔中加入1mL/孔的细胞混合物，0.5mL/孔L-DOS47溶液(终浓度1μg/mLL-DOS47，含2或4mM尿素)和0.5mL/孔LA溶液(终浓度6和12mM)；
7.将板在37℃和5％CO2下孵育3天；
8.从每个孔中取出80μL细胞培养物，并通过加入20μL台盼蓝溶液进行细胞计数；
9.将细胞密度在PBS中调整至8×106个/mL，并将100μL/孔的细胞样品一式三份加入96孔板中；
10.将板以400g离心5分钟；
11.通过缓慢加入100μL/孔的3％多聚甲醛/PBS固定细胞，并在室温下孵育15分钟；
12.用PBS洗涤板2次；
13.在4℃o/n下用200μL/孔的3％BSA封闭板。
14.用TBS-T洗涤板1次；
15.通过在4℃下加入Trustain fcx(50μL/mL，100μL/孔)30分钟来阻断Fc结合；
16.用TBS-T洗涤板2次；
17.加入100μL/孔的生物素抗PD-1Ab(在缓冲液B中1：1000)；
18.将板在室温下轻轻振荡孵育1.5小时；
19.用TBS-T洗涤板3次；
20.加入100μl/孔抗小鼠IgG-AP(缓冲液B中1：5000)；
21.将板在室温下轻轻振荡孵育1小时；
22.用TBS-T洗涤板3次；
23.在二乙醇胺缓冲液中制备1mg/ml、100μl/孔AP底物，并加入以及在室温下振荡孵育1小时；
24.用酶标仪读取OD405。
结果
通过全细胞ELISA评估Jurkat细胞上的PD-1表达。通过固定化的抗CD3抗体和可溶性抗CD28抗体刺激细胞以表达PD-1受体(数据未显示)。图5显示添加乳酸显著降低PD-1表达(空心柱，*p<0.05和**p<0.005)，而添加L-DOS47/尿素极大地增强了PD-1表达(实心柱)。
实施例6-干扰素γ-刺激的肿瘤及其对激活的Jurkat细胞释放IL-2的影响
材料
1.含有5％HIFBS、Glutamax和抗生素的改良RPMI-1640培养基
2.干扰素γ，0.1mg/mL
3.PBS，10mM，pH 7.4
4.细胞刺激试剂：
佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)，5μg/mL，Abcam cat#AB120297
植物血凝素(PHA)，2mg/mL，Sigma cat#L8754)
步骤
1.在完全培养基中以2×105个细胞/mL制备BxPC-3和MDA-MB231细胞；
2.将400μL/孔的细胞培养物接种到含有200μL/孔培养基的24孔培养板中；
3.以1/4x稀释度制备12至0.75ng/mL的IFNγ，并以120μL/孔加入相应的孔中至终浓度为2至0.125ng/mL；
4.将板轻轻涡旋以混合孔中的内容物；
5.将板在37℃下孵育2天；
6.在HIFBS培养基中以4×106个细胞/mL制备Jurkat细胞；
7.清空孔并加入0.5mL/孔Jurkat细胞；
8.制备分别为22和0.55μg/mL的PHA和PMA的混合物，并向相应的孔中加入50μL/孔的溶液至终浓度分别为2.0μg/mL和50ng/mL；
9.以1/4x稀释度从112至7ng/mL制备IFNγ，并以10μL/孔加入相应的孔中至终浓度为2至0.125ng/mL；
10.将板在37℃下孵育24小时；
11.第二天早上，将细胞培养物从每个孔转移到Eppendorf管中，并以7000rpm离心10分钟以收集上清液；
12.进行ELISA以确定Jurkat细胞释放的IL-2的量。
结果
用各种浓度的IFNγ刺激BxPC-3和MDA-MB231肿瘤细胞2天。去除原始培养基后，加入激活的Jurkat细胞并与肿瘤细胞在37℃共培养24小时。图6中的结果显示IFNγ刺激的肿瘤细胞抑制Jurkat细胞中IL-2释放多达40％。
实施例7通过MDA-MB-231和SKOV-3细胞检查乳酸、HCl、乳酸钠和/或L-DOS47+/-尿
素对PD-L1表达的影响(图7-图10中所示)
材料
1.含有5％HIFBS、Glutamax和抗生素的改良RPMI-1640培养基
2.乳酸，6.03N
3.L-DOS47(2128-101,1.89mg/mL)
4.尿素，2.6M
5.乳酸钠，在PBS中为3M
6.生物素抗PD-L1Ab，0.5mg/mL，Biolegend
7.PE-链霉亲和素，0.2mg/mL，Biolegend 405204
8.多聚甲醛，20％
9.DPBS(1.47mM KH2PO4、8.06mM Na2HPO4、2.67mM KCl和138mM NaCl、0.5mM EDTA，pH 7.4)
10.FACS染色缓冲液：(含有0.02％NaN3和0.1％BSA的DPBS)
11.12x 75mL聚苯乙烯管
12.非酶细胞解离溶液
13.干扰素γ，0.1mg/mL
14.HCl
15.BSA，5％
16.Hydrodish HD24-带有集成pH传感器的24孔板
步骤
1.在完全培养基中以2×105个细胞/mL制备MDA-MB231或SKOV-3细胞
2.将细胞培养物接种到24孔Hydrodish板中并在37℃下孵育2天
3.去除培养基并加入0.6mL/孔HIFBS培养基
4.制备10ng/mL的IFNγ，并以100μL/孔加入相应的孔中至终浓度为1ng/mL
5.将板轻轻涡旋以混合孔中的内容物
6.制备10μg/mL的L-DOS47，并以100μL/孔加入相应的孔中至终浓度为1μg/mL
7.制备20、40和80mM的尿素，并以100μL/孔加入相应的孔中至终浓度为2,4和8mM。
8.制备60和120mM的乳酸、HCl或乳酸钠，并以100μL/孔加入相应的孔中至终浓度分别为6和12mM。
9.将板轻轻涡旋以混合孔中的内容物
10.将24孔板置于37℃和5％CO2的培养箱内的SDR上2天；监测pH变化
11.从每个孔中移出培养基
12.用1mL DPBS冲洗孔
13.在室温下用0.3mL/孔非酶促细胞解离溶液分离细胞10分钟(如果观察到细胞簇，则通过18号针头将样品注射3-5次以解离细胞簇)
14.将样品从每个孔转移至含有0.3mL FACS染色缓冲液的离心管中
15.将细胞混合并以300×g离心5分钟
16.将细胞重悬于0.5mL FACS染色缓冲液中
17.在20μL细胞悬浮液上进行细胞计数
18.在FACS染色缓冲液中将细胞密度调整至～1×105个细胞/100μL，并将120μL/孔转移至圆底96孔板用于染色。
19.将板以300×g离心3分钟，用多通道移液管弃去上清液
20.加入50μL/孔的生物素抗PD-L1抗体(在FACS染色缓冲液中1：100)
21.在冰上孵育30分钟。
22.通过以300x g离心3分钟，用100μL/孔FACS染色缓冲液将板洗涤3次。每
23.加入50μL/孔PE-链霉亲和素(在FACS染色缓冲液中1：1500)
24.用锡箔覆盖平板并在冰上孵育30分钟
25.如上述步骤22，将板洗涤3次
26.通过在100μL/孔的含1％多聚甲醛的PBS中重悬最后一次洗涤的细胞沉淀来固定细胞。
27.用锡箔覆盖板并在冰上孵育30分钟
28.如上述步骤22，将板洗涤2×
29.用锡箔覆盖板并在2-8℃下储存
30.用Guava流式细胞仪和FCS Express软件分析板
实施例8-通过激活的CD8+T细胞检查乳酸、HCl、乳酸钠和/或L-DOS47+/-尿素对
PD-1表达的影响(结果显示在图11-图13中)
CD8+T细胞的制备和激活
材料
1.含有10％FBS、Glutamax和抗生素的改良RPMI-1640培养基
2.EasySep人CD8+T细胞富集试剂盒(Stemcell，cat#19053)
3.人Leukopak PBMC(Bioreclamation IVT，Lot#BRH1239929；5.97x107个细胞/小瓶)
4.Dynabeads人T激活剂CD3/CD28(Life Technologies，Cat#11131D)
5.DPBS(1.47mM KH2PO4、8.06mM Na2HPO4、2.67mM KCl和138mM NaCl、0.5mM EDTA，pH 7.4)
6.EasySep缓冲液-含有2％FBS和2mM EDTA(不含Ca2+/Mg2+)的DPBS
7.人IL-2,106U/mL，0.1mg/mL，Cedarlane CL101-02
步骤
(A)PMBC细胞的制备：
1.从液氮中移出PMBC管并用70％乙醇擦拭
2.通过松开盖子释放管的压力，然后重新拧紧
3.将细胞在37℃下快速解冻
4.将1mL预热的培养基加入细胞中，将细胞悬浮液转移至50mL的锥形管中
5.用1mL培养基冲洗冷冻管
6.加入～10×原始小瓶体积的培养基
7.将小瓶在室温下以220g离心10min
8.用移液管去除上清液，留下少量
9.缓慢加入15mL EasySep缓冲液以重悬沉淀
10.将小瓶在室温下以220g离心10min
11.去除除2mL上清液之外的所有上清液并重悬细胞沉淀
(B)CD8+T细胞的制备：
1.对细胞计数并以5x107个细胞/mL重悬→(细胞计数＝1.45x108个/mL，总体积1.6mL)[加入3mL→5x107个细胞/mL]
2.将细胞加入12mL聚苯乙烯管中(终体积＝4.6mL)
3.在50μL/mL样品中加入富集混合物(总加入体积＝230μL)
4.将细胞混合并在室温下孵育10分钟
5.将磁性颗粒涡旋30秒
6.以150μL/mL样品添加磁性颗粒(总加入体积＝690μL)
7.将管在室温下孵育5分钟
8.将管置于磁铁中并在室温下孵育5分钟
9.将富集的细胞悬浮液倒入新管中
10.进行细胞计数(＝6.63x106个细胞/mL，总计＝5.3mL或3.37x107个细胞)
(C)T细胞激活：
1.将Dynabeads涡旋>30秒
2.将660μL Dynababads转移到管中
3.加入一当量体积的EasySep缓冲液或至少1mL并混合(涡旋5秒)
4.将管置于磁体上1分钟并弃去上清液
5.将洗过的Dynabeads重悬于与初始体积(660μL)相同体积的培养基中。
6.通过与洗涤过的Dynabeads混合激活T细胞
7.加入30U/mL IL-2用于T细胞扩增(总体积＝15mL；加入450μL IL-2)
8.将细胞在37℃和5％CO2下孵育
实施例9-检查乳酸、HCl、乳酸钠和/或L-DOS47+/-尿素对CD8+T细胞的PD-1表达、
IL-2产生和IFNγ产生的影响
材料
1.含有10％HIFBS、谷氨酸和抗生素的改良RPMI-1640培养基
2.抗CD3抗体，1mg/mL，Cedarlane#CLANT144-2
3.抗CD28抗体，0.5mg/mL，BioLegend 302902
4.乳酸，6.03N
5.乳酸钠，在PBS中为3M
6.HCl，6N
7.L-DOS47(Lot#2128-101)，1.7mg/mL
8.尿素，2.6M
9.生物素抗PD-1Ab，0.5mg/mL，Biolegend 329934
10.生物素-小鼠IgG1同种型对照，0.1mg/mL，Cedarlene Cat#CLCMG115
11.生物素-L-DOS47，Lot#170803、1.67mg/mL
12.生物素-HPU(脲酶)，Lot#170803、1.25mg/mL
13.PE-链霉亲和素，0.2mg/mL，Biolegend 405204
14.多聚甲醛，20％
15.具有Ca2+和Mg2+的DPBS(含有0.90mM CaCl2、0.49mM MgCl2、2.7mM KCl和138mMNaCl的10mM PBS，pH 7.4)
16.染色缓冲液：(具有Ca2+和Mg2+的DPBS，含有0.02％NaN3和2％FBS)
17.12x 75mL聚苯乙烯管
18.Hydrodish HD24-带有集成pH传感器的24孔板
步骤
1.将Hydrodish HD24板用0.5mL/孔的抗CD3抗体(在PBS中为10μg/mL)包被，并在室温下孵育6小时
2.对来自含有激活的CD8+T细胞(使用Dynabeads；用磁铁去除Dynabeads)的细颈瓶中的细胞计数，并在培养基中将细胞密度调整至1×106个细胞/mL
3.制备120mM的乳酸
4.制备120mM的HCl
5.制备120mM的乳酸钠
6.制备10μg/mL的L-DOS47
7.制备20和40mM的尿素
8.从孔中去除缓冲液
9.加入0.5mL CD8+T细胞，然后加入0.1mL抗CD28Ab(15μg/mL)、0.1mL L-DOS47和/或尿素、0.1mL LA或HCl、和/或0.1mL乳酸钠溶液至适当的孔
10.将板在37℃和5％CO2下孵育2天；通过将24孔板置于培养箱内的SDR上来监测pH变化
11.将样品从24孔板转移至微量离心管中，将细胞以350×g离心5分钟，然后去除上清液并冷冻用于IL-2和IFNγELISA测定。
流式细胞术分析
12.将细胞重悬于0.5mL染色缓冲液中，以100μL/孔转移至圆底96孔板进行染色。
13.将板以350g离心4min，用多通道移液管弃去上清液
14.将50μL/孔的生物素抗PD-1抗体(染色缓冲液中1：100)、生物素-LDOS47(1:80)，生物素-脲酶(1:70)和同种型对照(1:20)将)加入相应的孔中
15.混合并在冰上孵育30min。
16.用100μL/孔的染色缓冲液通过在350g离心4分钟将板洗涤3次
17.以50μL/孔加入PE-链霉亲和素(在染色缓冲液中1：1500)并将细胞重新悬浮。
18.用锡箔覆盖板并在冰上孵育30min
19.如上述步骤16，将板洗涤3×
20.通过将最后一次洗涤的细胞沉淀重悬于50μL/孔的含1％多聚甲醛的PBS中来固定细胞。
21.用锡箔覆盖板并在室温下孵育15min
22.从孔中去除缓冲液，将细胞重悬于100μL/孔染色缓冲液中
23.将细胞混合，用锡箔覆盖板并在2-8℃下储存
24.第二天，向每个孔中加入100μL/孔染色缓冲液
25.混合细胞并使用Guava流式细胞仪收集每个孔的数据
26.使用FCS Express软件分析数据
ELISA测定细胞上清液中的IL-2浓度
材料：
1.NaCl，EMD，SX0425-5(FW 58.44)
2.KCl，EMD，PX1405-5(FW 74.55)
3.KH2PO4，EMD 1565-5(FW136.09)
4.Na2HPO4，Fisher Scientific S375-212(FW141.96)
5.Tris碱，Fisher Scientific，B154-1(FW121.14)
6.牛血清白蛋白(BSA)，Roche REF10735086001
7.H2SO4，Fluka 17025(FW98.07，d1.83,96％，17.9M)
8.人IL-2DuoSet ELISA，R&D Systems，Cat#DY202：
a.人IL-2捕获抗体，Part#840104
b.人IL-2检测抗体，Part#840105
c.人IL-2标准物，Part#840106
d.链霉亲和素-HRP，Part#893975
9.底物溶液A和B，R&D Systems，目录号#DY999
10.ELISA板，96孔EIA/RIA板，Costar 3590
11.底物溶液A和B，R&D Systems，目录号#DY999
12.TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺，Aldrich，860336-1G)
13.二甲基亚砜，Sigma，D8418-50ml
14.过氧化氢，30％，Fisher H325-500
15.柠檬酸三钠，Sigma H325-500
16.冰醋酸，BDH 3098-3.8LP
17.酶标仪，Molecular Device-2
18.样品：细胞培养上清液
缓冲液和溶液：
1.PBS：137mM NaCl、2.7mM KCl、8.1mM Na2HPO4、1.5mM KH2PO4，pH 7.2-7.4，0.2μm过滤。在1L烧杯中称取8.01g NaCl、0.201g KCl、1.15g Na2HPO4、0.204g KH2PO4。将盐溶解在950ml水中。将pH调节至7.2-7.4。将缓冲液转移至1L容量瓶中。顶部到1L标记。通过0.22um圆盘过滤器过滤。
2.洗涤缓冲液：含0.05％20的PBS，pH7.2-7.4。将0.50ml吐温20加入1L瓶中的1L PBS中，并翻转瓶子直至表面活性剂溶解并混合。
3.封闭缓冲液：含3％BSA的PBS，pH7.2-7.4，0.2μm过滤。将1.5g BSA溶于50.0mLPBS中。储存在4℃。
4.试剂稀释剂：含0.1％BSA、0.05％吐温20的PBS，0.2μm过滤。将0.50g BSA和250μl吐温20溶解在500ml PBS中。充分混合，用0.22μm过滤器过滤至0.5L瓶。储存在4℃。
5.醋酸-柠檬酸盐缓冲液：称重2.1g柠檬酸一水合物，溶于500ml水中，加入0.625ml冰醋酸。使用5N NaOH将pH调节至4.5。
6.TMB储备溶液：称取93.0mg TMB溶于4ml DMSO中，在黑暗中储存(在室温下稳定1个月)
7.底物溶液：仅在使用前，将8.0ml显色剂A(H2O2)和8.0ml显色剂B(四甲基联苯胺)混合在50ml螺旋盖管中。
8.终止溶液：2N H2SO4。将5.6ml H2SO4(36N)稀释至100ml水中。
9.人IL-2标准储备溶液(60ng/mL)。向IL-2小瓶的小瓶中加入0.500ml试剂稀释剂。盖上盖子，并轻轻翻转小瓶以溶解蛋白质。储存在4℃。
10.小鼠抗人IL-2捕获抗体储备溶液(480μg/mL)：用0.5mL PBS重构每个小瓶。储存在4℃。
11.生物素化山羊抗人IL-2检测抗体原液(6.0μg/mL)：用1.0mL试剂稀释剂重构每个小瓶。盖上盖子并轻轻翻转小瓶以溶解蛋白质。储存在4℃。
步骤：
1.制备捕获抗体工作溶液(4μg/ml)：向50ml螺旋盖管中的16.0ml PBS中加入0.133ml小鼠抗人IL-2捕获抗体储备溶液(480μg/ml)并涡旋混合。
2.通过添加100μl/孔捕获抗体工作溶液来包被板。用塑料薄膜覆盖板并在4℃孵育过夜。
3.第二天早上，抽吸每个孔，并通过用300μl洗涤缓冲液填充每个孔来洗涤每个孔，以及完全去除液体。该过程重复两次，总共洗涤三次。最后一次洗涤后，通过抽吸除去任何剩余的洗涤缓冲液。
4.通过向每个孔中加入200μL/孔的封闭缓冲液来封闭板。将板在室温下轻轻振荡(～100rpm)孵育2小时
5.如步骤3中那样重复抽吸/洗涤步骤。然后将板准备好用于加入样品。
6.在在封闭期间，通过在1.0ml Eppendorf管中用1000pg/ml的第一标准浓度2倍连续稀释至试剂稀释剂中制备IL-2工作标准溶液用于7点标准曲线。为了制备1000pg/ml标准品，将16.7μL 60ng/mL标准品稀释至1.50mL试剂稀释缓冲液，并涡旋。
7.通过将25uL上清液与475uL试剂稀释剂混合，将每个样品稀释20倍。
8.在步骤5中洗涤后，根据板布局，将100.0ul/孔的每种标准品和样品工作溶液移液到孔中。
9.用塑料薄膜覆盖板，在室温下轻轻振荡(～100rpm)孵育1.5小时
10.如步骤3中那样重复抽吸/洗涤。
11.制备检测抗体工作溶液(100ng/ml)：向50ml螺旋盖管中的16.0ml试剂稀释剂中加入0.266ml生物素化山羊抗人IL-2检测抗体储备溶液和320μl正常山羊血清并涡旋混合。
12.加入100μL/孔的检测抗体工作溶液；用塑料薄膜覆盖板。将板在室温下轻轻振荡(～100rpm)孵育1.5小时
13.重复步骤3中的抽吸/洗涤。
14.制备链霉亲和素-HRP工作溶液。40x稀释：向50ml螺旋盖管中的16.0ml试剂稀释剂中加入0.400ml链霉抗生物素蛋白-HRP储备溶液并涡旋混合。
15.向每个孔中加入100μL链霉亲和素-HRP的工作稀释液。盖上板并在室温下轻轻振荡(～100rpm)孵育20分钟。
16.重复步骤3中的抽吸/洗涤。
17.向每个孔中加入100μL底物溶液。将板在室温下振荡(～200rpm)孵育30分钟。时间取决于颜色的发展，通常在10至60min。在添加终止溶液之前检查OD。避免将板置于直射光下。
18.向每个孔中加入100μL终止溶液。轻轻敲打板以确保充分混合。
19.立即测定每个孔的光密度，使用酶标仪将信号OD设定为450nm和背景OD设定为570nm。从450nm处的读数中减去570nm处的读数以校正板中的光学缺陷
20.确定标准曲线的最佳拟合，并使用该方程来内推每个样品的IL-2浓度。
ELISA测定细胞上清液中的IFNγ浓度
1.仪器和材料：
1.1.读板器：Spectra Max M2，Molecular Devices
1.2.NaCl，EMD，SX0425-5(FW 58.44)
1.3.KCl，EMD，PX1405-5(FW 74.55)
1.4.KH2PO4，EMD 1565-5(FW136.09)
1.5.Na2HPO4，Fisher Scientific S375-212(FW141.96)
1.6.Tris碱，Fisher Scientific，BP154-1(FW121.14)
1.7.牛血清白蛋白(BSA)，Roche REF10735086001
1.8.H2SO4，Fluka 17025(FW98.07，d1.83,96％，17.9M)
1.9.正常山羊血清，Sigma，G9023-10ml
1.10.人IFN-γDuoSetELISA，R&D Systems，Cat#DY285：
1.10.1.人IFN-γ捕获抗体，240μg/小瓶，Part#840101，工作浓度4.00μg/ml
1.10.2.人IFN-γ检测抗体，12.0μg/小瓶，Part#840102，工作浓度200ng/ml
1.10.3.人IFN-γ标准品，32.5ng/小瓶，Part#840103
1.10.4.链霉亲和素-HRP，Part#893975，工作浓度40倍稀释
1.11.底物溶液A和B，R&D Systems，目录号#DY999
1.12.TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺，Aldrich，860336-1G)
1.13.二甲基亚砜，Sigma，D8418-50ml
1.14.过氧化氢，30％，Fisher H325-500
1.15.柠檬酸三钠，Sigma H325-500
1.16.冰醋酸，BDH 3098-3.8LP
1.17.ELISA板，96孔EIA/RIA板，Costar 3590
1.18.样品：细胞培养上清液
2.缓冲液和溶液：
2.1.PBS：137mM NaCl、2.7mM KCl、8.1mM Na2HPO4、1.5mM KH2PO4，pH7.2-7.4，0.2μm过滤。在1L烧杯中称取8.01g NaCl、0.201g KCl、1.15g Na2HPO4、0.204g KH2PO4。将盐溶解在950ml水中。将pH调节至7.2-7.4。将缓冲液转移至1L容量瓶中。顶部到1L标记。通过0.22um圆盘过滤器过滤。
2.2.洗涤缓冲液：含0.05％20的PBS，pH7.2-7.4。将0.50ml吐温20加入1L瓶中的1L PBS中，并翻转瓶子直至表面活性剂溶解并混合。
2.3.封闭缓冲液：含3％BSA的PBS，pH7.2-7.4，0.2μm过滤。将1.5g BSA溶于50.0mLPBS中。用0.22μm过滤器过滤并储存在4℃。
2.4.试剂稀释剂：含0.1％BSA、0.05％吐温20的PBS，0.2μm过滤。将0.50g BSA和250μl吐温20溶解在500ml PBS中。充分混合，用0.22μm过滤器过滤至0.5L瓶。储存在4℃。
2.5.醋酸-柠檬酸盐缓冲液：称重2.1g柠檬酸一水合物，溶于500ml水中，加入0.625ml冰醋酸。使用5N NaOH将pH调节至4.5。
2.6.TMB储备溶液：称取58.0mg TMB溶于5ml DMSO中，在黑暗中储存(在室温下稳定1个月)
2.7.底物溶液：仅在使用前，将8.0ml显色剂A(H2O2)和8.0ml显色剂B(四甲基联苯胺)混合在50ml螺旋盖管中。
2.8.终止溶液：2N H2SO4。将5.6ml H2SO4(36N)稀释至100ml水中。
2.9.人IFN-γ标准储备溶液(60ng/mL)。向IFN-γ的小瓶中加入0.500ml试剂稀释剂。盖上盖子，并轻轻翻转小瓶以溶解蛋白质。储存在4℃。
2.10.小鼠抗人IFN-γ捕获抗体储备溶液(480μg/mL)：用0.5mL PBS重构每个小瓶。制备6个等分试样，在0.6ml的微量离心管中83.3μl/每个。储存在4℃。
2.11.生物素化山羊抗人IFN-γ检测抗体原液(12.0μg/mL)：用1.0mL试剂稀释剂重构每个小瓶。盖上盖子并轻轻翻转小瓶以溶解蛋白质。制备6个等分试样，在0.6ml的微量离心管中166.0μl/每个。储存在4℃。
3.程序
3.1.制备捕获抗体工作溶液(4.00μg/ml)：向50ml螺旋盖管中的16.0ml PBS中加入133.0μl小鼠抗人IFN-γ捕获抗体储备溶液(480μg/ml)并涡旋混合(在20分钟内使用)。
3.2.通过添加100μl/孔捕获抗体工作溶液来包被2块板。用塑料薄膜覆盖板并在4℃孵育过夜。
3.3.第二天早上，完全抽吸每个孔，并通过用300μl洗涤缓冲液填充每个孔来洗涤每个孔。该过程重复两次，总共洗涤三次。最后一次洗涤后，通过抽吸除去任何剩余的洗涤缓冲液。
3.4.通过向每个孔中加入200μL/孔的封闭缓冲液来封闭板。将板在室温下轻轻振荡(～100rpm)孵育2小时
3.5.如步骤3中那样重复抽吸/洗涤步骤。然后将板准备好用于加入样品。
3.6.在在封闭期间，通过在1.5ml Eppendorf管中用1000pg/ml的第一标准浓度2倍连续稀释至试剂稀释剂中制备IFN-γ工作标准溶液用于7点标准曲线。
3.7.通过将25uL上清液与475uL试剂稀释剂混合，将每个样品稀释20倍。
3.8.在步骤3.5中洗涤后，根据板布局将100.0ul/孔的每种标准品和样品工作溶液移液到孔中。
3.9.用塑料薄膜覆盖板，在室温下轻轻振荡(～100rpm)孵育1.5小时
3.10.如步骤3.3中那样重复抽吸/洗涤。
3.11.制备检测抗体工作溶液(200ng/ml)：向50ml螺旋盖管中的16.0ml试剂稀释剂中加入0.266ml生物素化山羊抗人IFN-γ检测抗体储备溶液和160μl山羊血清并涡旋混合。在使用前将板在室温下孵育至少1小时。
3.12.加入100μL/孔的检测抗体工作溶液；用塑料薄膜覆盖板。将板在室温下轻轻振荡(～100rpm)孵育1.5小时
3.13.重复步骤3.3中的抽吸/洗涤。
3.14.向每个孔中加入100μL链霉亲和素-HRP的工作稀释液。盖上板并在室温下轻轻振荡(～100rpm)孵育20分钟。避免将板置于直射光下。
3.15.重复步骤3.3中的抽吸/洗涤。
3.16.制备底物工作溶液：将9.0ml乙酸盐-柠檬酸盐(100mM，pH 5.0)缓冲液、1.0ml DMSO和0.25mL TMB(58mg，在5.0ml DMSO中)和20.0μl H2O2(30％)混合
3.17.向每个孔中加入100μL底物溶液并将板在室温下振荡(～200rpm)孵育20分钟。时间取决于颜色的发展，通常在10至60min。在添加终止溶液之前检查OD。避免将板置于直射光下。
3.18.向每个孔中加入100μL终止溶液。轻轻敲打板以确保充分混合。
3.19.立即测定每个孔的光密度，使用酶标仪将信号OD设定为450nm和背景OD设定为570nm。从450nm处的读数中减去570nm处的读数以校正板中的光学瑕疵
3.20.确定标准曲线的最佳拟合，并使用该方程来内推每个样品的IFN-γ浓度。
如本文所示，酸性微环境对激活的Jurkat细胞具有数种免疫抑制作用，包括抑制T细胞增殖、IL-2产生和细胞表面PD-1的表达。
向培养基中添加L-DOS47和尿素提高了细胞外pH，并且还部分恢复了Jurkat细胞增殖、IL-2产生和PD-1表面表达的水平。
用IFNγ预处理的肿瘤细胞也抑制激活的Jurkat细胞的IL-2产生。
用乳酸处理MDA-MB-231乳腺癌细胞降低了培养基的pH并增加了PD-L1的表达。用L-DOS47+尿素处理将PD-L1表达降低至未处理细胞上观察到的水平。
PD-L1水平在类似处理的SKOV-3卵巢癌细胞上未改变。
激活的原代CD8+T细胞表达PD-1并分泌IL-2和IFNγ。与乳酸一起孵育增加PD-1表达，对IL-2产生几乎没有影响，并且显著损害IFNγ的产生。
用L-DOS47+尿素处理乳酸培养的CD8+T细胞增加IL-2产生，降低PD-1表达并将IFNγ产生恢复至未处理的激活细胞上观察到的水平。
L-DOS47处理代表了通过分别降低T细胞和肿瘤细胞上PD-1和PD-L1的表达来减少酸诱导的免疫抑制性PD-1/PD-L1相互作用的新方法。
以上公开内容总体上描述了本发明。尽管本文已采用特定术语，但这些术语旨在描述性意义而非出于限制的目的。
以上引用的所有出版物、专利和专利申请均通过引用整体并入本文，其程度如同每个单独的出版物、专利或专利申请被具体和单独地指出通过引用整体并入。
尽管这里已经详细描述了本发明的优选实施方案，但是本领域技术人员将理解，在不脱离本发明的精神或所附权利要求的范围的情况下，可以对其进行变化。
Claims (61)
1.用于恢复酸化T细胞功能的方法，所述方法包括向所述T细胞施用脲酶。
2.如权利要求1所述的方法，其中恢复功能包括增加细胞因子的产生。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述细胞因子包括IL-2。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述T细胞相对于生理pH是酸化的。
5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述T细胞的pH小于约7.2、小于约7.1、小于约7.0、小于约6.9、或小于约6.8。
6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述T细胞被乳酸盐酸化。
7.如权利要求6所述的方法，其中乳酸盐由实体瘤产生。
8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述T细胞在存在天然的或施用的尿素的条件下。
9.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述T细胞表达PD-1，任选地，与非酸化T细胞相比，所述T细胞以高于正常水平的水平表达PD-1。
10.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述脲酶与靶向部分缀合。
11.如权利要求10所述的方法，其中靶向部分是抗体。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述抗体特异性针对肿瘤相关抗原。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述肿瘤相关抗原是CEACAM6。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述抗体是AFAIKL2抗体或2A3抗体。
15.如权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述T细胞表达PD-1。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述脲酶抑制PD-1表达和/或激活。
17.如权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述脲酶抑制癌细胞上的PD-L1表达。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述癌细胞是酸敏感的。
19.如权利要求1至18中任一项所述的方法，其还包括施用活性剂。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述活性剂是PD-1抑制剂、化学治疗剂、放射物、激素、诸如IL-2的细胞因子，以及它们的组合。
21.如权利要求1至20中任一项的方法，其与诸如过继性T细胞疗法的免疫疗法结合。
22.如权利要求1至21中任一项所述的方法，其中以足以将所述酸化T细胞附近的pH增加至诸如7.2的生理水平的量施用所述脲酶。
23.如权利要求1至22中任一项所述的方法，其中以足以降低所述T细胞上的PD-1表达的量施用所述脲酶。
24.如权利要求1至23中任一项所述的方法，其中以不会引起显著的T细胞死亡或伤害的量施用所述脲酶。
25.使经受酸化条件的T细胞的IL-2产生正常化的方法，所述方法包括向所述T细胞施用脲酶。
26.抑制乳酸盐诱导的T细胞对肿瘤细胞的耐受性的方法，所述方法包括向所述T细胞施用脲酶。
27.治疗癌症的方法，所述方法包括选择患有CEACAM6+和/或PD-L1+癌症的对象并向所述对象施用脲酶。
28.增加对CEACAM6+和/或PD-L1+癌症的免疫应答的方法，所述方法包括向包含CEACAM6+和/或PD-L1+癌症的对象施用脲酶。
29.增加T细胞浸润到实体瘤中的方法，其包括向所述T细胞施用脲酶。
30.如权利要求25至29中任一项所述的方法，其中所述方法增加细胞因子的产生。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述细胞因子包括IL-2。
32.如权利要求25至31中任一项所述的方法，其中所述T细胞相对于生理pH是酸化的。
33.如权利要求25至32中任一项所述的方法，其中所述T细胞的pH小于约7.2，例如7.1、7.0、6.9或6.8。
34.如权利要求25至33中任一项所述的方法，其中所述T细胞被乳酸盐酸化。
35.如权利要求34所述的方法，其中乳酸盐由实体瘤产生。
36.如权利要求25至35中任一项所述的方法，其中所述T细胞在存在天然的或施用的尿素的条件下。
37.如权利要求25至36中任一项所述的方法，其中所述T细胞表达PD-1，任选地，与非酸化T细胞相比，所述T细胞以高于正常水平的水平表达PD-1。
38.如权利要求25至37中任一项所述的方法，其中所述脲酶与靶向部分缀合。
39.如权利要求38所述的方法，其中所述靶向部分是抗体。
40.如权利要求39所述的方法，其中所述抗体特异性针对肿瘤相关抗原。
41.如权利要求40所述的方法，其中所述肿瘤相关抗原是CEACAM6。
42.如权利要求41所述的方法，其中所述抗体是AFAIKL2抗体或2A3抗体。
43.如权利要求25至42中任一项所述的方法，其中所述T细胞表达PD-1。
44.如权利要求43所述的方法，其中所述脲酶抑制PD-1表达和/或激活。
45.如权利要求25至44中任一项所述的方法，其还包括施用活性剂。
46.如权利要求45所述的方法，其中所述活性剂是PD-1抑制剂、化学治疗剂、放射物、激素或诸如IL-2的细胞因子。
47.如权利要求25至46中任一项所述的方法，其还包括施用免疫疗法，诸如过继性T细胞疗法。
48.如权利要求25至47中任一项所述的方法，其中以足以将所述酸化T细胞附近的pH增加至诸如7.2的生理水平的量施用所述脲酶。
49.如权利要求25至48中任一项所述的方法，其中以足以降低所述T细胞上的PD-1表达的量施用所述脲酶。
50.如权利要求25至49中任一项所述的方法，其中以不会引起显著的T细胞死亡或伤害的量施用所述脲酶。
51.组合物，其包含脲酶以及PD-1抑制剂和/或PDL-1抑制剂，或由脲酶以及PD-1抑制剂和/或PDL-1抑制剂组成。
52.组合物，其包含脲酶和T细胞，或由脲酶和T细胞组成。
53.如权利要求51或52所述的组合物，其用于恢复T细胞功能。
54.如权利要求51至53中任一项所述的组合物，其用于增加T细胞的IL-2产生。
55.脲酶用于恢复酸化T细胞功能的用途。
56.脲酶用于下调癌细胞上PD-L1表达以重新激活T细胞的用途。
57.脲酶用于使经受酸化条件的T细胞的IL-2产生正常化的用途。
58.脲酶用于抑制乳酸盐诱导的T细胞对肿瘤细胞的耐受性的用途。
59.脲酶用于治疗患有CEACAM6+和/或PD-L1+癌症的对象的癌症的用途。
60.脲酶用于增加对CEACAM6+和/或PD-L1+癌症的免疫应答的用途。
61.脲酶用于增加T细胞浸润到实体瘤中的用途。
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