KR20220144753A - 글리신 기반 링커를 사용한 트랜스글루타미나제 컨쥬게이션 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 미생물 트랜스글루타미나제(MTG)에 의해 항체-페이로드 컨쥬게이트를 생성시키는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 펩티드 구조(N->C 방향으로 표시) Gly-(Aax)m-B-(Aax)n을 포함하거나 갖는 링커를 N-말단 글리신(Gly) 잔기의 N-말단 1차 아민을 통해 항체의 중쇄 또는 경쇄에 포함된 글루타민(Gln) 잔기로 컨쥬게이션하는 단계를 포함한다.
Description
본 발명은 미생물 트랜스글루타미나제에 의해 항체-페이로드 컨쥬게이트(antibody-payload conjugate)를 생성시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 링커, 링커-페이로드 구성물(construct) 및/또는 항체-페이로드 구성물을 추가로 제공한다.
암이나 염증성 질환의 표적 치료를 위한 항체로의 매우 강력한 페이로드 부착에 대해 관심이 증가하고 있다. 이로 인해 생성되는 구성물을 항체-페이로드 컨쥬게이트 또는 항체-약물 컨쥬게이트(ADC)라고 한다.
현재, 7개의 ADC[애드세트리스(Adcetris), 캐싸일라(Kadcyla), 베스폰사(Besponsa), 마일로타그(Mylotarg), 폴리비(Polivy), 패드세브(Padcev), 엔허투(Enhertu)]가 FDA-승인을 받았으며, 이들 모두는 이들의 페이로드가 부위-비특이적(non-site specific) 방식으로 항체에 화학적으로 부착되어 있다. 따라서, 생성된 생성물은 항체와 페이로드 사이의 화학량론적 관계(페이로드-항체 비, 또는 약물 대 항체 비, DAR)와 관련하여, 또한 항체 상의 컨쥬게이션 부위와 관련하여 매우 이질적이다. 각각의 생산된 종은 동일한 의약품이지만, 잠재적으로 다양한 생체 내 약동학적 특성 및 활성을 유발할 수 있는 고유한 특성을 가질 수 있다.
이전의 생체 내 연구[로스파이스(Lhospice) 등, 2015]에서, 부위-특이적 약물 부착은 FDA-승인된 ADC에 비해 현저하게 더 높은 종양 흡수(약 2배(2X))와 비-표적 조직에서 감소된 흡수를 유발했고, 또한 최대 허용 용량은 3배(3X) 이상 더 높았다. 이러한 데이터는 화학량론적으로 잘 정의된 ADC가 화학적으로 변형된 ADC에 비해 개선된 약동학 및 더 나은 치료 지수를 나타냄을 시사한다.
부위-특이적 기술로서, 효소에 의한 컨쥬게이션(enzymatic conjugation)은 이러한 컨쥬게이션 반응이 전형적으로 빠르고 생리학적 조건 하에서 수행될 수 있기 때문에 큰 관심을 받았다. 사용가능한 효소 중에서, 스트렙토마이세스 모바라엔시스(Streptomyces mobaraensis) 종 유래의 미생물 트랜스글루타미나제(MTG)는 항체를 포함한 기능성 모이어티(moiety)의 통상적인 화학적 단백질 컨쥬게이션에 대한 매력적인 대안으로 점점 더 많은 관심을 받고 있다. MTG는 생리학적 조건 하에서 단백질 또는 펩티드의 '반응성' 글루타민과 단백질 또는 펩티드의 '반응성' 라이신 잔기 사이의 아미드 교환(transamidation) 반응을 촉매하는데, 여기에서 후자는 또한 5-아미노펜틸기와 같은 단순한 저분자량 1차 아민일 수 있다[예거(Jeger) 등, 2010, 스트롭(Strop) 등, 2014].
형성된 결합은 각각의 폴리펩티드 또는 단백질의 펩티드-결합 주쇄의 일부를 형성하지 않는 아미드 결합인 이소펩티드(isopeptide) 결합이다. 이는 아실 글루타민-함유 아미노산 공여체 서열의 글루타밀 잔기의 γ-카르복사미드와 본 발명에 따른 아미노 공여체-포함 기질의 1차(1°) 아민 사이에 형성된다.
본 발명자들의 경험뿐만 아니라 다른 사람들의 경험으로 볼 때, MTG는 일반적으로 소수의 글루타민만을 표적으로 하는 바, MTG를 부위-특이적 및 화학량론적 단백질 변형을 위한 매력적인 도구로 만드는 것으로 보인다.
이전에는 글루타민 295(Q295)가 MTG에 의해 저분자량 1차 아민 기질에 특이적으로 표적화되는 다양한 IgG 유형의 중쇄에 있는 유일한 반응성 글루타민으로 확인되었다(예거 등, 2010).
그러나, Q295로의 정량적 컨쥬게이션은 PNGase F를 사용하여 아스파라긴 잔기 297(N297)에서 글리칸 모이어티를 제거한 경우에만 가능했고, 반면 당화된 항체는 효율적으로 컨쥬게이션될 수 없었다(컨쥬게이션 효율 <20%). 이 발견은 민트(Mindt) 등(2008), 예거 등(2010) 및 딕기서(Dickgiesser) 등(2020)의 연구에서도 뒷받침된다.
탈당화(deglycosylation)를 방지하기 위해, 잔기 N297에 점 돌연변이를 삽입하는 것도 가능하며, 이는 비당화(aglycosylation)라고 하는 당화의 제거를 초래한다.
그러나, 두 접근법 모두 상당한 단점이 있다. 효소에 의한 탈당화 단계는 GMP 측면에서 바람직하지 않은데, 이는 고순도 생성물을 보장하기 위해 탈당화 효소(예컨대, PNGase F)와 절단된 글리칸이 모두 배지에서 제거되어야 하기 때문이다.
다른 아미노산에 대한 N297의 치환은 원하지 않는 효과도 갖는데, 이는 CH2 도메인의 전반적인 안정성 및 결과적으로 전체 컨쥬게이트의 효능에 영향을 미칠 수 있기 때문이다. 또한, N297에 존재하는 글리칸은 중요한 면역조절 효과를 갖는데, 이는 글리칸이 항체 의존적인 세포성 세포독성(antibody dependent cellular cytotoxicity, ADCC) 등을 촉발시키기 때문이다. 이러한 면역조절 효과는 탈당화 또는 다른 아미노산에 대한 N297의 치환시 손실된다.
나아가, 서열 삽입이 면역원성을 증가시키고 항체의 전반적인 안정성을 감소시킬 수 있다는 점에서 페이로드 부착을 위한 항체의 유전자 조작(genetic engineering)은 단점을 가질 수 있다.
따라서, 본 발명의 한 목적은 항체, 특히 N297의 사전 탈당화를 필요로 하지 않는 트랜스글루타미나제 기반 항체 컨쥬게이션 접근법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 CH2 도메인에서 N297의 치환 또는 변형을 필요로 하지 않는 트랜스글루타미나제 기반 항체 컨쥬게이션 접근법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 컨쥬게이션의 부위-특이성 뿐만 아니라 화학량론 모두에서 고도로 균질한 컨쥬게이션 생성물의 제조를 가능하게 하는 항체 컨쥬게이션 기술을 제공하는 것이다.
이들 및 추가 목적은 본 발명의 독립항에 따른 방법 및 수단에 의해 충족된다. 종속항은 특정 실시양태와 관련된다.
본 발명은 미생물 트랜스글루타미나제(MTG)에 의해 항체-링커 컨쥬게이트 및/또는 항체-페이로드 컨쥬게이트를 생성하기 위한 방법 및 링커 구조에 관한 것이다. 본 발명 및 본 발명의 특징의 일반적인 이점은 아래에서 상세히 논의될 것이다.
도 1은 본 발명의 한 양태를 도시한다. MTG=미생물 트랜스글루타미나제. 별 기호는 페이로드 또는 연결 모이어티 B를 나타낸다. Gp는 펩티드의 N-말단에 있고 MTG의 기질인 Gly 잔기이다. 이 과정을 통해 N297에서 당화를 유지할 수 있음에 유의한다. B/별 기호가 연결 모이어티인 경우, 실제 페이로드는 여전히 이 모이어티에 컨쥬게이션되어야 한다는 점에 주목한다.
본 명세서의 다른 곳에서 논의된 바와 같이, B/별 기호는 예를 들어 DBCO-함유 페이로드(예를 들어, 독소 또는 형광 염료 또는 DOTA 또는 NODA-GA와 같은 금속 킬레이터)에 대한 변형-촉진된 알킨-아지드 고리화첨가(SPAAC) 클릭-화학 반응에 적합한 생체-직교 기(예를 들어, 아지드/N3-기)와 같은 연결 모이어티이거나 이를 포함할 수 있다. 기능적 모이어티를 항체에 부착시키는 이러한 클릭-화학 기반 "2단계 화학효소적(two-step chemoenzymatic)"-접근 방식은 항체에 비해 낮은 분자 과량(low molecular excess)에서, 전형적으로는 예를 들어 컨쥬게이션 부위당 5당량 이하에서 클릭될 수 있다는 주요 이점을 갖는다[덴러(Dennler) 등, 2014]. 이는 ADC의 비용-효율적인 생성을 가능하게 한다. 또한, 형광 염료에서 금속 킬레이터에 이르기까지 거의 모든 프로브를 이 접근 방식으로 클릭할 수 있다[참조, 스파이처(Spycher) 등, 2017, 덴러 등, 2015].
B/별 기호는 또한 실제 페이로드, 예를 들어 독소일 수 있다. 이러한 실시양태는 생성된 화합물을 한 단계로 신속하게 제조할 수 있게 하여 정제 및 생산을 용이하게 한다.
도 2는 본 발명에 따른 올리고펩티드를 포함하는 링커 펩티드의 예를 보여준다. 서열은 GlyAlaArgLys(N3)(GARK1, 여기에서 K1=Lys(N3))이다. Lys(N3)는 1차 아민이 아지드기(-N-N≡N 또는 -N3)로 대체된 Lys 잔기이다. 본 발명의 명명법에 따르면, Lys(N3) 또는 N3 단독으로 연결 모이어티 B로 간주될 수 있다(이 예에서, N3은 클릭-화학에 적합하다).
펩티드는 Q295 위치에서 천연 IgG1 항체에 효율적으로 컨쥬게이션된다(비-최적화 조건에서 LC-MS 분석으로부터 추정된 바와 같이 약 77.3%).
본 명세서에 도시된 일부 링커 펩티드에서, C-말단의 모이어티는 단순히 N3로 지칭된다는 것을 이해하는 것이 중요하다. 그러나, 이것은 Lys(N3)의 약어로 이해되어야 한다. 예를 들어, GAR(N3)은 펩티드 GlyAlaArgLys(N3) 또는 GARK(N3)에 해당한다. 즉, 6-아지도-L-라이신은 3글자 코드에서 Lys(N3)로 약칭되거나 1글자 코드에서 K(N3) 또는 (N3)로 약칭될 수 있다. 따라서, 펩티드의 일부인 K(N3)은 항상 단일 아미노산 잔기 Lys(N3)와 관련될 뿐 디펩티드 Lys-Lys(N3)에 관련되지는 않는 것으로 이해되어야 한다. 반면에, 디펩티드 Lys-Lys(N3)는 1글자 코드에서 KK(N3)로 지칭된다.
본원에 제시된 상이한 링커 펩티드에서, 측쇄 상의 C-말단 또는 1차 아민은, 달리 나타내더라도 보호될 수 있거나 보호되지 않을 수 있다는 것을 이해하는 것이 또한 중요하다. 보호는 예를 들어 전자의 아미드화 및/또는 후자의 아세틸화에 의해 달성될 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 보호된 링커 펩티드와 보호되지 않은 링커 펩티드 모두가 포함된다.
예를 들어, GARK(N3)는 실제로 C-말단이 보호되거나 보호되지 않는 두 가지 변이체를 포함한다. 하기 구조식은 C-말단이 아미드화에 의해 보호되는 C-말단 Lys(N3) 잔기를 보여준다:
도 3은 천연 IgG1 항체에 대한 작은 주어진 펩티드 라이브러리의 스크리닝 결과를 나타낸다. MTG-반응성 N-말단 아미노산 잔기 또는 유도체(베타-알라닌)를 함유하는 상이한 펩티드를 스크리닝하였다. 알 수 있는 바와 같이, 단일 또는 이중 N-말단 글리신이 가장 효율적으로 작동한다. LC-MS를 분석에 사용했다.
도 4 및 도 5는 링커가 말레이미드-포함 독소 링커 구성물을 컨쥬게이션하기에 적합한 유리 설프히드릴기를 갖는 Cys 잔기를 포함하는 실시양태를 나타낸다.
도 4는 결합 반응을 나타내고, 도 5는 일부 잠재적인 링커 구성물을 나타낸다.
도 6은 본 발명에 따른, 펩티드가 항체(예컨대, IgG의 또는 분자 조작된 Q295)의 Gln에 컨쥬게이션되는 2단계 컨쥬게이션 공정(도 6a) 및 1단계 컨쥬게이션 공정(도 6b)을 도시한다. 하기 표 1은 본원에 사용된 두 가지 용어를 명확히 한다.
[표 1]
1단계 및 2단계 컨쥬게이션
상기 2단계 공정에서, 링커 펩티드는 Gly-(Aax)n-Cys-연결 모이어티이다. Gly 잔기는 미생물 트랜스글루타미나제를 통해 항체의 Gln 잔기에 컨쥬게이션되고, 이어서 연결 모이어티-이 경우 유리 설프히드릴기가 있는 Cys 잔기-는 말레이미드를 통해 페이로드-이 경우 MC/VC/PABDC 링커 구조를 갖는 MMAE 독소-에 컨쥬게이션된다.
1단계 공정에서 링커 펩티드 Gly-(Aax)m은 이미 페이로드에 컨쥬게이션되어 있다. Gly 잔기는 항체의 Gln 잔기에 컨쥬게이션되고, 페이로드는 VC/PABC 구조를 갖는 MMAE 독소로 구성된다. VC 구조의 발린 잔기는 펩티드 결합에 의해 링커 펩티드의 마지막 아미노산에 컨쥬게이션된다.
도 7은 이중-페이로드(dual-payload) 부착에 적합한 링커를 포함하는 링커의 두 가지 예를 보여준다.
도 7a는 아지드(N3)인 제 1 연결 모이어티를 갖는 한편 제 2 연결 모이어티가 테트라진인(둘 모두 생체-직교) 펩티드를 나타낸다. 올리고펩티드의 구조는 GlyAlaArgLys(N3)Lys(테트라진)(GARK1K2, 여기에서 K1=Lys(N3), K2=Lys(테트라진)임)이다.
도 7b는 아지드(N3) 및 Cys-모이어티로부터의 유리 설프히드릴기를 갖는 펩티드를 보여준다. 올리고펩티드의 구조는 GlyAlaArgLys(N3)Cys(GARK1C, 이 때 K1=L ys(N3)임)이다.
각각의 연결 모이어티는 동시에 클릭될 수 있는 생체-직교 호환 가능한 기이다.
따라서, 이들 링커는 2개의 다른 페이로드를 항체의 CH2 도메인의 O295에 컨쥬게이션할 수 있게 한다. 두 번째 페이로드를 사용하면 효능 및 효력(potency)과 관련하여 현재 치료법을 능가하는 완전히 새로운 종류의 항체-페이로드 컨쥬게이트를 개발할 수 있다. 또한 새로운 응용 분야, 예를 들어 영상화 및 치료 또는 수술 중/후 수술을 위한 이중-유형 영상화가 계획된다[아즈다리니아(Azhdarinia A.) 등, Molec Imaging and Biology, 2012 참조]. 예를 들어, 수술 전 양전자 방출 단층촬영(positron emission tomography, PET) 및 수술 절제면의 가이드 설계를 위한 근적외선 형광(near-infrared fluorescent, NIRF)-염료용 분자 조영제(molecular imaging agent)를 포함하는 이중-표지된 항체는 암의 진단, 병기 결정(staging) 및 절제를 크게 향상시킬 수 있다[휴턴(Houghton JL.) 등, PNAS 2015 참조]. PET 및 NIRF 광학 영상화는 보완적 임상 적용을 제공하여, 비침습적 전신 영상화로 각각 수술 중 질병의 위치를 알아내고 종양 절제면을 식별할 수 있다. 그러나, 현재까지 이러한 이중-표지된 프로브의 생성은 적절한 부위-특이적 방법이 부족하기 때문에 어렵고; 화학적 수단에 의해 두 개의 다른 프로브를 부착시키는 것은 프로브의 무작위적인 컨쥬게이션 때문에 분석 및 재현이 거의 불가능하다. 또한, 레벤굿(Levengood M.) 등의 연구(Angewandte Chemie, 2016)에서, 두 가지 다른 아우리스타틴(auristatin) 독소(다른 물리화학적 성질을 가지고 보완적인 항암 활성을 나타내는)가 부착된 이중-약물 표지된 항체는 개별적인 아우리스타틴 성분으로 구성된 ADC에 불응성인(refractory) 세포주 및 이종 이식편 모델에 활성을 부여하였다. 이것은 이중-표지된 ADC가 단일의 종래 ADC 단독보다 암 이질성(heterogeneity) 및 내성을 보다 효과적으로 해결할 수 있음을 시사한다. ADC에 대한 하나의 내성 메커니즘은 암세포로부터의 세포독성 모이어티의 능동적 배출(pumping-out)을 포함하기 때문에, 또 다른 이중-약물 적용은 세포독성 약물의 유출 메커니즘을 특이적으로 차단하는 약물의 추가적이고 동시적인 전달을 포함할 수 있다. 따라서, 이러한 이중-표지된 ADC는 ADC에 대한 암 내성을 종래의 ADC에 비해 보다 효율적으로 극복하는데 도움이 될 수 있다.
알킨 또는 테트라진/트랜스-시클로옥텐이 링커로서 사용되는 유사한 구조가 동일하게 적합하고 본 발명의 범위 및 요지에 포함된다.
본 명세서에 도시된 일부 링커 펩티드에서, C-말단의 모이어티는 단순히 N3로서 지칭된다는 것을 이해하는 것이 중요하다. 그러나, 이는 Lys(N3)의 약어로 이해되어야 한다. 예를 들어, GAR(N3) 또는 GARK(N3)는 실제로 GARK1[여기에서, K1=Lys(N3)임] 또는 GlyAlaArgLys(N3)를 의미한다.
본원에 제시된 상이한 링커 펩티드에서, C-말단은 달리 나타내더라도 보호될 수 있거나 보호되지 않을 수 있다는 것을 이해하는 것이 또한 중요하다. 보호는 C-말단의 아미드화에 의해 달성될 수 있다. 항체로의 링커의 컨쥬게이션은 링커의 N-말단 글리신 잔기의 1차 아민을 통해 달성되기 때문에, 링커의 N-말단은 바람직하게는 보호되지 않는다. 본 발명의 맥락에서, 보호된 링커 펩티드와 보호되지 않은 링커 펩티드 모두가 포함된다. 예를 들어, GARK(N3)는 실제로 a) 위에서 논의한 것처럼 두 말단 모두 보호되지 않거나, b) 위에서 논의한 것처럼 C-말단만 보호되는 두 가지 변이체를 포함한다.
C-말단이 아미드화되는지의 여부에 관한 질문은 컨쥬게이션 조건(완충액, 배지, 다른 반응 성분의 반응성 등)에 의존하는 실제적인 질문이다.
도 8a 및 도 8b는 각각 2개의 아지드 링커 모이어티를 갖는 2개의 가능한 링커 구조를 나타낸다. 도 8a는 GlyGlyAlaArgLys(N3)Lys(N3)(GGARK1K2, 여기에서 K1 및 K2=Lys(N3)임)를 나타낸다. 도 8b는 GlyGlyAlaArgLys(N3)ArgLys(N3)(GGARK1RK2; 여기에서 K1 및 K2=Lys(N3)임)를 나타낸다. 이러한 방식으로 4의 항체 페이로드 비를 얻을 수 있다. 하전된 Arg 잔기의 존재는 용액에서 소수성 페이로드를 유지하는 데 도움이 된다.
본 명세서에 도시된 일부 링커 펩티드에서, C-말단의 모이어티는 단순히 N3으로 지칭된다는 것을 이해하는 것이 중요하다. 그러나, 이것은 Lys(N3)의 약어로 이해되어야 한다. 예를 들어, GAR(N3) 또는 GARK(N3)는 실제로 GARK1[여기에서, K1=Lys(N3)임] 또는 GlyAlaArgLys(N3)를 의미한다.
도 9는 천연 항체로의 MTG-매개 컨쥬게이션에 적합한 추가의 링커를 도시한다. 이들 링커 구조는 제 2 단계에서 기능적 페이로드의 클릭-화학 기반 부착에 적합한 링커 모이어티(아지드, N3), 또는 말레이미드에 부착하기 적합한 티올기를 제공하는 Cys-잔기를 함유한다. 이러한 구조는 화학이 잘 이해되고 단일 아미노산의 빌딩 블록에서 조립되는 펩티드를 기반으로 하기 때문에, 새로운 링커를 빠르고 쉽게 합성하고 평가할 수 있다. 하기 표 2는 개요를 제공한다.
[표 2]
도 10은 IgG1 항체의 경쇄가 컨쥬게이션에 의해 변형되지 않음을 도시한다. IgG1 경쇄의 디콘볼루션된(deconvoluted) LC-MS 스펙트럼이 도시되어 있다.
도 11a는 N3-기능성 링커 GGARK(N3)로 선택적으로 변형된 트라스투주맙 천연 IgG1 중쇄의 디콘볼루션된 LC-MS 스펙트럼을 나타낸다. 스펙트럼으로부터, 관찰된 질량 차이가 예상된 펩티드 질량 이동에 대응하기 때문에, 하나의 펩티드-링커만으로 중쇄가 선택적이고 정량적으로(>95%) 변형된 것을 알 수 있다(Mw 미변형 중쇄=50595 Da, 예상 Mw=51091Da, 측정된 Mw=51092Da).
도 11b는 DBCO-PEG4-Ahx-DM1이 중쇄에 사전 설치된 N3-기능성 링커 GGARK(N3)로 선택적으로 클릭된 트라스투주맙 천연 IgG1 중쇄의 디콘볼루션된 LC-MS 스펙트럼을 나타낸다. 스펙트럼으로부터, 중쇄가 선택적이고 정량적으로(>95%) 클릭되었음을 알 수 있다.
도 11c는 최적화되지 않은 컨쥬게이션 조건 하에서 GGARK(N3)로 변형된 또 다른 IgG1 중쇄의 디콘볼루션된 LC-MS를 보여준다. 컨쥬게이션 비: 83%.
도 12a는 GARK(N3)로 변형된 트라스투주맙 중쇄의 디콘볼루션된 LC-MS를 나타낸다. >95% 컨쥬게이션 효율이 달성되었다.
도 12b는 DBCO-PEG4-Ahx-DM1으로 클릭된 GARK(N3)로 변형된 트라스투주맙 중쇄의 디콘볼루션된 LC-MS에서 >95% 클릭 효율이 달성되어 DAR 2가 포함된 ADC가 생성되었음을 보여준다.
도 13은 다른 번호 체계를 갖는 Ig CH2 도메인의 개요를 보여준다. 본 발명의 목적을 위해, EU 넘버링이 사용된다.
도 14는 유리 1차 아민을 가지는 N-말단 Gly 잔기를 갖는 링커를 항체의 Q295 잔기의 유리 1차 아민에 컨쥬게이션하는 트랜스글루타미나제 반응을 도시한다.
도 15. 페이로드로 표지된 디벤조시클로옥틴에 링커 GlyAlaArgLys(N3)[GARK1, 여기에서 K1=Lys(N3)임]를 컨쥬게이션하기 위한 클릭 화학 반응 도식[변형-촉진 알킨-아지드 고리화 첨가(SPAAC)].
도 16은 각각 비-천연 아미노산을 포함하는, 본 발명의 맥락에서 사용될 수 있는 상이한 펩티드 링커를 나타낸다.
도 17은 본원에 기재된 방법에 따라 항체에 컨쥬게이션될 수 있는 상이한 링커 독소 구성물을 나타낸다. 모든 경우에, Gly 잔기는 트랜스글루타미나제 컨쥬게이션을 위한 1차 아민을 운반한다.
도 17a 이 도면은 소수성 페이로드 메이탄신(May)의 용해도를 증가시키는 역할을 하는 2개의 아르기닌-기를 갖는 절단 불가능한 GGARR-Ahx-May 펩티드-독소 컨쥬게이트를 도시한다. N-말단 글리신 잔기의 1차 아민은 MTG를 통해 항체로 컨쥬게이션하는 역할을 한다. Ahx-스페이서는 May에서 양으로 하전된 아르기닌을 분리하는 역할을 하여, 링커가 절단될 수 없기 때문에 후자가 표적에 보다 효과적으로 결합하도록 돕는다.
도 17b 이 도면은 2개의 아르기닌-기 및 PEG4-스페이서를 갖는 절단 불가능한 GGARR-PEG4-May 펩티드-독소 컨쥬게이트를 나타내며, 이들 3개 모이어티 모두 소수성 페이로드 May의 용해도를 증가시키는 역할을 한다. N-말단 글리신 잔기의 1차 아민은 MTG를 통해 항체에 컨쥬게이션하는 역할을 한다. PEG4는 또한 May에서 양으로 하전된 아르기닌을 분리하는데 도움을 주어, 링커가 절단될 수 없기 때문에 후자가 표적에 보다 효율적으로 결합하도록 돕는다.
도 17c 이 도면은 2개의 아르기닌-기, PEG4-스페이서, PABC-기 및 val-cit 서열(VC)을 갖는 절단가능한 GGARR-PEG4-VC-MMAE 펩티드-독소 컨쥬게이트를 나타낸다. N-말단 글리신 잔기의 1차 아민은 MTG를 통해 항체에 컨쥬게이션하는 역할을 하고, 아르기닌-기 및 PEG4-스페이서는 용해도를 증가시키고, PABC-기 및 val-cit 서열은 독소 방출을 돕는다.
도 17d 이 도면은 PEG-스페이서 및 val-cit 서열이 없는, 2개의 아르기닌-기 및 PABC-기를 갖는 절단가능한 GGARR-MMAE 펩티드-독소 컨쥬게이트를 나타낸다. GGARR-기는 펩티다제에 의해 본질적으로 분해 가능하기 때문에 자기 희생 PABC-모이어티를 통한 독소 방출을 위해 val-cit 서열이 필요하지 않을 수 있으며, 두 개의 아르기닌기가 매우 친수성이므로 PEG 스페이서가 필요하지 않을 수 있어서, 혈액 순환 동안 다른 분자와의 원하지 않는 상호작용을 최소화하기 위해 전체 펩티드-독소 컨쥬게이트를 가능한 한 작게 유지시킨다.
도 18은 실시예 3에 따라 수행된 세포 독성 분석의 결과를 보여준다. 본 발명에 따른 방법으로 생성되고 각각의 링커에 클릭-부착된 May-모이어티를 포함하는 Her-GARK(N3)(P684) 및 Her-GGARK(N3)(P579) N-말단 글리신 ADC는 캐싸일라와 유사한 SK-BR3 세포에 대한 효능을 갖는다. 따라서, 새로운 링커 기술이 제공하는 장점(제조 용이성, 부위 특이성, 안정적인 화학량론, 해당 항체를 탈당화할 필요 없음)은 세포 독성과 관련하여 어떠한 불이익도 가져오지 않는다.
도 19: βAla-Gly-Ala-Arg-Lys(N3)의 구조. ßAla는 구조적으로 글리신과 유사한 ß-알라닌을 지칭한다. 그러나, 상기 링커는 N-말단 글리신을 갖는 GGARK(N3)(실시예 2 참조)에 비해 열등한 컨쥬게이션 효율을 갖는다.
본 명세서의 다른 곳에서 논의된 바와 같이, B/별 기호는 예를 들어 DBCO-함유 페이로드(예를 들어, 독소 또는 형광 염료 또는 DOTA 또는 NODA-GA와 같은 금속 킬레이터)에 대한 변형-촉진된 알킨-아지드 고리화첨가(SPAAC) 클릭-화학 반응에 적합한 생체-직교 기(예를 들어, 아지드/N3-기)와 같은 연결 모이어티이거나 이를 포함할 수 있다. 기능적 모이어티를 항체에 부착시키는 이러한 클릭-화학 기반 "2단계 화학효소적(two-step chemoenzymatic)"-접근 방식은 항체에 비해 낮은 분자 과량(low molecular excess)에서, 전형적으로는 예를 들어 컨쥬게이션 부위당 5당량 이하에서 클릭될 수 있다는 주요 이점을 갖는다[덴러(Dennler) 등, 2014]. 이는 ADC의 비용-효율적인 생성을 가능하게 한다. 또한, 형광 염료에서 금속 킬레이터에 이르기까지 거의 모든 프로브를 이 접근 방식으로 클릭할 수 있다[참조, 스파이처(Spycher) 등, 2017, 덴러 등, 2015].
B/별 기호는 또한 실제 페이로드, 예를 들어 독소일 수 있다. 이러한 실시양태는 생성된 화합물을 한 단계로 신속하게 제조할 수 있게 하여 정제 및 생산을 용이하게 한다.
도 2는 본 발명에 따른 올리고펩티드를 포함하는 링커 펩티드의 예를 보여준다. 서열은 GlyAlaArgLys(N3)(GARK1, 여기에서 K1=Lys(N3))이다. Lys(N3)는 1차 아민이 아지드기(-N-N≡N 또는 -N3)로 대체된 Lys 잔기이다. 본 발명의 명명법에 따르면, Lys(N3) 또는 N3 단독으로 연결 모이어티 B로 간주될 수 있다(이 예에서, N3은 클릭-화학에 적합하다).
펩티드는 Q295 위치에서 천연 IgG1 항체에 효율적으로 컨쥬게이션된다(비-최적화 조건에서 LC-MS 분석으로부터 추정된 바와 같이 약 77.3%).
본 명세서에 도시된 일부 링커 펩티드에서, C-말단의 모이어티는 단순히 N3로 지칭된다는 것을 이해하는 것이 중요하다. 그러나, 이것은 Lys(N3)의 약어로 이해되어야 한다. 예를 들어, GAR(N3)은 펩티드 GlyAlaArgLys(N3) 또는 GARK(N3)에 해당한다. 즉, 6-아지도-L-라이신은 3글자 코드에서 Lys(N3)로 약칭되거나 1글자 코드에서 K(N3) 또는 (N3)로 약칭될 수 있다. 따라서, 펩티드의 일부인 K(N3)은 항상 단일 아미노산 잔기 Lys(N3)와 관련될 뿐 디펩티드 Lys-Lys(N3)에 관련되지는 않는 것으로 이해되어야 한다. 반면에, 디펩티드 Lys-Lys(N3)는 1글자 코드에서 KK(N3)로 지칭된다.
본원에 제시된 상이한 링커 펩티드에서, 측쇄 상의 C-말단 또는 1차 아민은, 달리 나타내더라도 보호될 수 있거나 보호되지 않을 수 있다는 것을 이해하는 것이 또한 중요하다. 보호는 예를 들어 전자의 아미드화 및/또는 후자의 아세틸화에 의해 달성될 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 보호된 링커 펩티드와 보호되지 않은 링커 펩티드 모두가 포함된다.
예를 들어, GARK(N3)는 실제로 C-말단이 보호되거나 보호되지 않는 두 가지 변이체를 포함한다. 하기 구조식은 C-말단이 아미드화에 의해 보호되는 C-말단 Lys(N3) 잔기를 보여준다:
도 3은 천연 IgG1 항체에 대한 작은 주어진 펩티드 라이브러리의 스크리닝 결과를 나타낸다. MTG-반응성 N-말단 아미노산 잔기 또는 유도체(베타-알라닌)를 함유하는 상이한 펩티드를 스크리닝하였다. 알 수 있는 바와 같이, 단일 또는 이중 N-말단 글리신이 가장 효율적으로 작동한다. LC-MS를 분석에 사용했다.
도 4 및 도 5는 링커가 말레이미드-포함 독소 링커 구성물을 컨쥬게이션하기에 적합한 유리 설프히드릴기를 갖는 Cys 잔기를 포함하는 실시양태를 나타낸다.
도 4는 결합 반응을 나타내고, 도 5는 일부 잠재적인 링커 구성물을 나타낸다.
도 6은 본 발명에 따른, 펩티드가 항체(예컨대, IgG의 또는 분자 조작된 Q295)의 Gln에 컨쥬게이션되는 2단계 컨쥬게이션 공정(도 6a) 및 1단계 컨쥬게이션 공정(도 6b)을 도시한다. 하기 표 1은 본원에 사용된 두 가지 용어를 명확히 한다.
[표 1]
1단계 및 2단계 컨쥬게이션
상기 2단계 공정에서, 링커 펩티드는 Gly-(Aax)n-Cys-연결 모이어티이다. Gly 잔기는 미생물 트랜스글루타미나제를 통해 항체의 Gln 잔기에 컨쥬게이션되고, 이어서 연결 모이어티-이 경우 유리 설프히드릴기가 있는 Cys 잔기-는 말레이미드를 통해 페이로드-이 경우 MC/VC/PABDC 링커 구조를 갖는 MMAE 독소-에 컨쥬게이션된다.
1단계 공정에서 링커 펩티드 Gly-(Aax)m은 이미 페이로드에 컨쥬게이션되어 있다. Gly 잔기는 항체의 Gln 잔기에 컨쥬게이션되고, 페이로드는 VC/PABC 구조를 갖는 MMAE 독소로 구성된다. VC 구조의 발린 잔기는 펩티드 결합에 의해 링커 펩티드의 마지막 아미노산에 컨쥬게이션된다.
도 7은 이중-페이로드(dual-payload) 부착에 적합한 링커를 포함하는 링커의 두 가지 예를 보여준다.
도 7a는 아지드(N3)인 제 1 연결 모이어티를 갖는 한편 제 2 연결 모이어티가 테트라진인(둘 모두 생체-직교) 펩티드를 나타낸다. 올리고펩티드의 구조는 GlyAlaArgLys(N3)Lys(테트라진)(GARK1K2, 여기에서 K1=Lys(N3), K2=Lys(테트라진)임)이다.
도 7b는 아지드(N3) 및 Cys-모이어티로부터의 유리 설프히드릴기를 갖는 펩티드를 보여준다. 올리고펩티드의 구조는 GlyAlaArgLys(N3)Cys(GARK1C, 이 때 K1=L ys(N3)임)이다.
각각의 연결 모이어티는 동시에 클릭될 수 있는 생체-직교 호환 가능한 기이다.
따라서, 이들 링커는 2개의 다른 페이로드를 항체의 CH2 도메인의 O295에 컨쥬게이션할 수 있게 한다. 두 번째 페이로드를 사용하면 효능 및 효력(potency)과 관련하여 현재 치료법을 능가하는 완전히 새로운 종류의 항체-페이로드 컨쥬게이트를 개발할 수 있다. 또한 새로운 응용 분야, 예를 들어 영상화 및 치료 또는 수술 중/후 수술을 위한 이중-유형 영상화가 계획된다[아즈다리니아(Azhdarinia A.) 등, Molec Imaging and Biology, 2012 참조]. 예를 들어, 수술 전 양전자 방출 단층촬영(positron emission tomography, PET) 및 수술 절제면의 가이드 설계를 위한 근적외선 형광(near-infrared fluorescent, NIRF)-염료용 분자 조영제(molecular imaging agent)를 포함하는 이중-표지된 항체는 암의 진단, 병기 결정(staging) 및 절제를 크게 향상시킬 수 있다[휴턴(Houghton JL.) 등, PNAS 2015 참조]. PET 및 NIRF 광학 영상화는 보완적 임상 적용을 제공하여, 비침습적 전신 영상화로 각각 수술 중 질병의 위치를 알아내고 종양 절제면을 식별할 수 있다. 그러나, 현재까지 이러한 이중-표지된 프로브의 생성은 적절한 부위-특이적 방법이 부족하기 때문에 어렵고; 화학적 수단에 의해 두 개의 다른 프로브를 부착시키는 것은 프로브의 무작위적인 컨쥬게이션 때문에 분석 및 재현이 거의 불가능하다. 또한, 레벤굿(Levengood M.) 등의 연구(Angewandte Chemie, 2016)에서, 두 가지 다른 아우리스타틴(auristatin) 독소(다른 물리화학적 성질을 가지고 보완적인 항암 활성을 나타내는)가 부착된 이중-약물 표지된 항체는 개별적인 아우리스타틴 성분으로 구성된 ADC에 불응성인(refractory) 세포주 및 이종 이식편 모델에 활성을 부여하였다. 이것은 이중-표지된 ADC가 단일의 종래 ADC 단독보다 암 이질성(heterogeneity) 및 내성을 보다 효과적으로 해결할 수 있음을 시사한다. ADC에 대한 하나의 내성 메커니즘은 암세포로부터의 세포독성 모이어티의 능동적 배출(pumping-out)을 포함하기 때문에, 또 다른 이중-약물 적용은 세포독성 약물의 유출 메커니즘을 특이적으로 차단하는 약물의 추가적이고 동시적인 전달을 포함할 수 있다. 따라서, 이러한 이중-표지된 ADC는 ADC에 대한 암 내성을 종래의 ADC에 비해 보다 효율적으로 극복하는데 도움이 될 수 있다.
알킨 또는 테트라진/트랜스-시클로옥텐이 링커로서 사용되는 유사한 구조가 동일하게 적합하고 본 발명의 범위 및 요지에 포함된다.
본 명세서에 도시된 일부 링커 펩티드에서, C-말단의 모이어티는 단순히 N3로서 지칭된다는 것을 이해하는 것이 중요하다. 그러나, 이는 Lys(N3)의 약어로 이해되어야 한다. 예를 들어, GAR(N3) 또는 GARK(N3)는 실제로 GARK1[여기에서, K1=Lys(N3)임] 또는 GlyAlaArgLys(N3)를 의미한다.
본원에 제시된 상이한 링커 펩티드에서, C-말단은 달리 나타내더라도 보호될 수 있거나 보호되지 않을 수 있다는 것을 이해하는 것이 또한 중요하다. 보호는 C-말단의 아미드화에 의해 달성될 수 있다. 항체로의 링커의 컨쥬게이션은 링커의 N-말단 글리신 잔기의 1차 아민을 통해 달성되기 때문에, 링커의 N-말단은 바람직하게는 보호되지 않는다. 본 발명의 맥락에서, 보호된 링커 펩티드와 보호되지 않은 링커 펩티드 모두가 포함된다. 예를 들어, GARK(N3)는 실제로 a) 위에서 논의한 것처럼 두 말단 모두 보호되지 않거나, b) 위에서 논의한 것처럼 C-말단만 보호되는 두 가지 변이체를 포함한다.
C-말단이 아미드화되는지의 여부에 관한 질문은 컨쥬게이션 조건(완충액, 배지, 다른 반응 성분의 반응성 등)에 의존하는 실제적인 질문이다.
도 8a 및 도 8b는 각각 2개의 아지드 링커 모이어티를 갖는 2개의 가능한 링커 구조를 나타낸다. 도 8a는 GlyGlyAlaArgLys(N3)Lys(N3)(GGARK1K2, 여기에서 K1 및 K2=Lys(N3)임)를 나타낸다. 도 8b는 GlyGlyAlaArgLys(N3)ArgLys(N3)(GGARK1RK2; 여기에서 K1 및 K2=Lys(N3)임)를 나타낸다. 이러한 방식으로 4의 항체 페이로드 비를 얻을 수 있다. 하전된 Arg 잔기의 존재는 용액에서 소수성 페이로드를 유지하는 데 도움이 된다.
본 명세서에 도시된 일부 링커 펩티드에서, C-말단의 모이어티는 단순히 N3으로 지칭된다는 것을 이해하는 것이 중요하다. 그러나, 이것은 Lys(N3)의 약어로 이해되어야 한다. 예를 들어, GAR(N3) 또는 GARK(N3)는 실제로 GARK1[여기에서, K1=Lys(N3)임] 또는 GlyAlaArgLys(N3)를 의미한다.
도 9는 천연 항체로의 MTG-매개 컨쥬게이션에 적합한 추가의 링커를 도시한다. 이들 링커 구조는 제 2 단계에서 기능적 페이로드의 클릭-화학 기반 부착에 적합한 링커 모이어티(아지드, N3), 또는 말레이미드에 부착하기 적합한 티올기를 제공하는 Cys-잔기를 함유한다. 이러한 구조는 화학이 잘 이해되고 단일 아미노산의 빌딩 블록에서 조립되는 펩티드를 기반으로 하기 때문에, 새로운 링커를 빠르고 쉽게 합성하고 평가할 수 있다. 하기 표 2는 개요를 제공한다.
[표 2]
도 10은 IgG1 항체의 경쇄가 컨쥬게이션에 의해 변형되지 않음을 도시한다. IgG1 경쇄의 디콘볼루션된(deconvoluted) LC-MS 스펙트럼이 도시되어 있다.
도 11a는 N3-기능성 링커 GGARK(N3)로 선택적으로 변형된 트라스투주맙 천연 IgG1 중쇄의 디콘볼루션된 LC-MS 스펙트럼을 나타낸다. 스펙트럼으로부터, 관찰된 질량 차이가 예상된 펩티드 질량 이동에 대응하기 때문에, 하나의 펩티드-링커만으로 중쇄가 선택적이고 정량적으로(>95%) 변형된 것을 알 수 있다(Mw 미변형 중쇄=50595 Da, 예상 Mw=51091Da, 측정된 Mw=51092Da).
도 11b는 DBCO-PEG4-Ahx-DM1이 중쇄에 사전 설치된 N3-기능성 링커 GGARK(N3)로 선택적으로 클릭된 트라스투주맙 천연 IgG1 중쇄의 디콘볼루션된 LC-MS 스펙트럼을 나타낸다. 스펙트럼으로부터, 중쇄가 선택적이고 정량적으로(>95%) 클릭되었음을 알 수 있다.
도 11c는 최적화되지 않은 컨쥬게이션 조건 하에서 GGARK(N3)로 변형된 또 다른 IgG1 중쇄의 디콘볼루션된 LC-MS를 보여준다. 컨쥬게이션 비: 83%.
도 12a는 GARK(N3)로 변형된 트라스투주맙 중쇄의 디콘볼루션된 LC-MS를 나타낸다. >95% 컨쥬게이션 효율이 달성되었다.
도 12b는 DBCO-PEG4-Ahx-DM1으로 클릭된 GARK(N3)로 변형된 트라스투주맙 중쇄의 디콘볼루션된 LC-MS에서 >95% 클릭 효율이 달성되어 DAR 2가 포함된 ADC가 생성되었음을 보여준다.
도 13은 다른 번호 체계를 갖는 Ig CH2 도메인의 개요를 보여준다. 본 발명의 목적을 위해, EU 넘버링이 사용된다.
도 14는 유리 1차 아민을 가지는 N-말단 Gly 잔기를 갖는 링커를 항체의 Q295 잔기의 유리 1차 아민에 컨쥬게이션하는 트랜스글루타미나제 반응을 도시한다.
도 15. 페이로드로 표지된 디벤조시클로옥틴에 링커 GlyAlaArgLys(N3)[GARK1, 여기에서 K1=Lys(N3)임]를 컨쥬게이션하기 위한 클릭 화학 반응 도식[변형-촉진 알킨-아지드 고리화 첨가(SPAAC)].
도 16은 각각 비-천연 아미노산을 포함하는, 본 발명의 맥락에서 사용될 수 있는 상이한 펩티드 링커를 나타낸다.
도 17은 본원에 기재된 방법에 따라 항체에 컨쥬게이션될 수 있는 상이한 링커 독소 구성물을 나타낸다. 모든 경우에, Gly 잔기는 트랜스글루타미나제 컨쥬게이션을 위한 1차 아민을 운반한다.
도 17a 이 도면은 소수성 페이로드 메이탄신(May)의 용해도를 증가시키는 역할을 하는 2개의 아르기닌-기를 갖는 절단 불가능한 GGARR-Ahx-May 펩티드-독소 컨쥬게이트를 도시한다. N-말단 글리신 잔기의 1차 아민은 MTG를 통해 항체로 컨쥬게이션하는 역할을 한다. Ahx-스페이서는 May에서 양으로 하전된 아르기닌을 분리하는 역할을 하여, 링커가 절단될 수 없기 때문에 후자가 표적에 보다 효과적으로 결합하도록 돕는다.
도 17b 이 도면은 2개의 아르기닌-기 및 PEG4-스페이서를 갖는 절단 불가능한 GGARR-PEG4-May 펩티드-독소 컨쥬게이트를 나타내며, 이들 3개 모이어티 모두 소수성 페이로드 May의 용해도를 증가시키는 역할을 한다. N-말단 글리신 잔기의 1차 아민은 MTG를 통해 항체에 컨쥬게이션하는 역할을 한다. PEG4는 또한 May에서 양으로 하전된 아르기닌을 분리하는데 도움을 주어, 링커가 절단될 수 없기 때문에 후자가 표적에 보다 효율적으로 결합하도록 돕는다.
도 17c 이 도면은 2개의 아르기닌-기, PEG4-스페이서, PABC-기 및 val-cit 서열(VC)을 갖는 절단가능한 GGARR-PEG4-VC-MMAE 펩티드-독소 컨쥬게이트를 나타낸다. N-말단 글리신 잔기의 1차 아민은 MTG를 통해 항체에 컨쥬게이션하는 역할을 하고, 아르기닌-기 및 PEG4-스페이서는 용해도를 증가시키고, PABC-기 및 val-cit 서열은 독소 방출을 돕는다.
도 17d 이 도면은 PEG-스페이서 및 val-cit 서열이 없는, 2개의 아르기닌-기 및 PABC-기를 갖는 절단가능한 GGARR-MMAE 펩티드-독소 컨쥬게이트를 나타낸다. GGARR-기는 펩티다제에 의해 본질적으로 분해 가능하기 때문에 자기 희생 PABC-모이어티를 통한 독소 방출을 위해 val-cit 서열이 필요하지 않을 수 있으며, 두 개의 아르기닌기가 매우 친수성이므로 PEG 스페이서가 필요하지 않을 수 있어서, 혈액 순환 동안 다른 분자와의 원하지 않는 상호작용을 최소화하기 위해 전체 펩티드-독소 컨쥬게이트를 가능한 한 작게 유지시킨다.
도 18은 실시예 3에 따라 수행된 세포 독성 분석의 결과를 보여준다. 본 발명에 따른 방법으로 생성되고 각각의 링커에 클릭-부착된 May-모이어티를 포함하는 Her-GARK(N3)(P684) 및 Her-GGARK(N3)(P579) N-말단 글리신 ADC는 캐싸일라와 유사한 SK-BR3 세포에 대한 효능을 갖는다. 따라서, 새로운 링커 기술이 제공하는 장점(제조 용이성, 부위 특이성, 안정적인 화학량론, 해당 항체를 탈당화할 필요 없음)은 세포 독성과 관련하여 어떠한 불이익도 가져오지 않는다.
도 19: βAla-Gly-Ala-Arg-Lys(N3)의 구조. ßAla는 구조적으로 글리신과 유사한 ß-알라닌을 지칭한다. 그러나, 상기 링커는 N-말단 글리신을 갖는 GGARK(N3)(실시예 2 참조)에 비해 열등한 컨쥬게이션 효율을 갖는다.
본 발명을 상세하게 기술하기 전에, 본 발명은 이러한 장치 및 방법이 다양할 수 있으므로 기술된 방법의 특정 성분 또는 공정 단계로 제한되지 않는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본 명세서에서 사용된 용어는 오직 특정 실시양태를 기술하기 위한 목적이고, 제한하려는 것이 아니라는 것으로 이해되어야 한다. 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수 형태는 문맥상 명백하게 달리 지시되지 않는 한 단수 및/또는 복수의 지시대상을 포함한다는 점에 유의해야 한다. 또한, 수치로 구분되는 매개변수 범위가 제공되는 경우, 범위는 이러한 제한 값을 포함하는 것으로 간주된다는 점을 이해해야 한다
또한, 본 명세서에 개시된 실시양태는 서로 관련이 없는 개별적인 실시양태로서 이해되도록 의도된 것이 아님을 이해해야 한다. 한 실시양태와 관련하여 논의된 특징은 본 명세서에 도시된 다른 실시양태와 관련하여 또한 개시되도록 의도된다. 한 경우에, 특정 특징이 한 실시양태와 함께 개시되지 않고 또 다른 실시양태와 함께 기술된다면, 그것이 상기 특징이 상기 다른 실시양태와 함께 개시되는 의미가 아님을 반드시 의미하지는 않는다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 당업자는 다른 실시양태에 대해서도 상기 특징을 개시하는 것이 본 출원의 요지이지만, 명료성의 목적을 위해 또한 본 명세서를 관리 가능한 양으로 유지하기 위해 이를 수행하지 않았다는 것을 이해할 것이다.
또한, 본 명세서에 언급된 문서의 내용은 참고로 포함된다. 이것은 특히 표준 또는 일상적인 방법을 공개하는 문서를 의미한다. 이 경우 참고로 포함하는 것은 주로 충분한 가능한 공개를 제공하고 긴 반복을 피하기 위한 목적을 갖는다.
제 1 양태에 따라, 미생물 트랜스글루타미나제(MTG)에 의해 항체-페이로드 컨쥬게이트 또는 항체-링커 컨쥬게이트를 생성하는 방법이 제공되며, 이 방법은 하기 펩티드 구조(N->C 방향으로 도시됨)를 포함하는 링커를 N-말단 글리신(Gly) 잔기의 N-말단 1차 아민을 통해 항체의 중쇄 또는 경쇄에 포함된 글루타민(Gln) 잔기로 컨쥬게이션하는 단계를 포함한다:
Gly-(Aax)m-B-(Aax)n
상기 식에서,
·m은 0 이상 12 이하의 정수이고,
·n은 0 이상 12 이하의 정수이며,
·m + n ≥ 0이고,
·Aax는 아미노산 또는 아미노산 유도체이고,
·B는 페이로드 또는 연결 모이어티이다.
본원에 사용된 용어 "1차 아민"은 화학식 R-NH2의, 2개의 수소 원자로 치환된 아민에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 펩티드 링커는 2개 이상의 연결 모이어티 및/또는 페이로드를 포함할 수 있다. 즉, 링커는 하기 펩티드 구조(N->C 방향으로 표시)를 가질 수 있다:
Gly-(Aax)m-B1-(Aax)n-B2-(Aax)o
상기 식에서,
·m, n 및 o는 0 이상 12 이하의 정수이고,
·m + n + o ≥ 0이며,
·Aax는 아미노산 또는 아미노산 유도체이고,
·B1 및 B2는 페이로드 및/또는 연결 모이어티이며, B1 및 B2는 서로 동일하거나 상이할 수 있다.
다른 실시양태에서, 펩티드 링커는 3개의 연결 모이어티 및/또는 페이로드를 포함할 수 있다. 즉, 링커는 하기 펩티드 구조(N->C 방향으로 표시)를 가질 수 있다:
Gly-(Aax)m-B1-(Aax)n-B2-(Aax)o-B3-(Aax)p
상기 식에서,
·m, n, o 및 p는 0 이상 12 이하의 정수이고,
·m + n + o + p ≥ 0이고,
·Aax는 아미노산 또는 아미노산 유도체이며,
·B1, B2 및 B3은 페이로드 및/또는 연결 모이어티이며, B1, B2 및 B3은 서로 동일하거나 상이할 수 있다.
본 발명은 또한 3개보다 많은 연결 모이어티 및/또는 페이로드, 예를 들어 4, 5 또는 6개의 연결 모이어티 및/또는 페이로드를 포함하는 링커를 포괄하는 것으로 이해되어야 한다. 이 경우, 링커의 펩티드 구조는 2 또는 3개의 연결 모이어티 및/또는 페이로드를 포함하는 링커에 대해 위에서 설명한 것과 동일한 패턴을 따른다.
특정 실시양태에서는, 미생물 트랜스글루타미나제(MTG)에 의해 항체-페이로드 컨쥬게이트를 생성하는 방법이 제공되며, 이 방법은 하기 펩티드 구조(N->C 방향으로 표시됨)를 갖는 링커를 N-말단 글리신(Gly) 잔기의 N-말단 1차 아민을 통해 항체의 중쇄 또는 경쇄에 포함된 글루타민(Gln) 잔기로 컨쥬게이션하는 단계를 포함한다:
Gly-(Aax)m-B-(Aax)n
상기 식에서,
·m은 0 이상 12 이하의 정수이고,
·n은 0 이상 12 이하의 정수이고,
·m + n ≥ 0이며,
·Aax는 임의의 천연 또는 비-천연 발생 L- 또는 D-아미노산, 아미노산 유도체 또는 모방체일 수 있으며,
·B는 페이로드 또는 연결 모이어티이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 미생물 트랜스글루타미나제(MTG)에 의해 항체-페이로드 컨쥬게이트 또는 항체-링커 컨쥬게이트를 생성하는 방법에 관한 것으로, 이 방법은 하기 펩티드 구조(N->C 방향으로 표시됨)를 갖는 링커를 N-말단 글리신(Gly) 잔기의 N-말단 1차 아민을 통해 항체의 중쇄 또는 경쇄에 포함된 글루타민(Gln) 잔기로 컨쥬게이션하는 단계를 포함한다:
Gly-(Aax)m-B-(Aax)n
이 경우에, 모이어티 B는 하나보다 많은 페이로드 및/또는 연결 모이어티를 포함할 수 있음을 이해해야 한다. 예를 들어, B는 (B'-(Aax)o-B'')를 나타낼 수 있으며, 이 때 B' 및 B''는 페이로드 및/또는 연결 모이어티이고, o는 0 이상 12 이하의 정수이다. 다르게는, B는 (B'-(Aax)o-B''-(Aax)p-B''')를 나타낼 수 있으며, 이 때 B', B'' 및 B'''는 페이로드 및/또는 연결 모이어티이고, o 및 p는 0 이상 12 이하의 정수이다.
따라서, 특정 실시양태에서, 본 발명은 링커가 2개 이상의 페이로드 및/또는 연결 모이어티를 포함하는, 본 발명에 따른 방법에 관한 것이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 2개 이상의 페이로드 및/또는 연결 모이어티 B가 서로 상이한, 본 발명에 따른 방법에 관한 것이다.
즉, 본 발명에 따른 링커는 단일 페이로드 또는 연결 모이어티를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 링커는 2개의 연결 모이어티를 포함하고, 여기에서 2개의 연결 모이어티는 동일하다. 다른 실시양태에서, 링커는 2개의 연결 모이어티를 포함하며, 여기에서 2개의 연결 모이어티는 상이하다. 또 다른 실시양태에서, 링커는 2개의 동일하거나 상이한 페이로드를 포함한다. 본 발명은 하나 이상의 페이로드 및 하나 이상의 연결 모이어티를 포함하는 링커를 추가로 포함한다.
예를 들어, 모든 페이로드 또는 연결 모이어티가 첫 번째 Aax 모이어티의 C-말단 카복실기 및 두 번째 Aax 모이어티의 N-말단 아민기와 펩티드 또는 아미드 결합을 형성하는 작용기를 갖지 않기 때문에, 모든 페이로드 또는 연결 모이어티가 사슬내 페이로드 또는 연결 모이어티로 기능할 수 있는 것은 아님을 또한 알아야 한다. 이 경우, 이러한 페이로드 또는 연결 모이어티는 링커의 C-말단 단부에 위치하는 것이 바람직하며, 이 때 이들은 바람직하게는 링커의 C-말단 Aax 모이어티의 카복실기에 부착된다. 페이로드 또는 연결 모이어티가 링커의 사슬내 위치에 있는 경우, 페이로드 또는 연결 모이어티가 아미노산, 아미노산 유도체이거나 또는 구조 -NH-CHR-CO-를 갖는 분자에 부착되는 것이 바람직하다.
바람직한 실시양태에서, m 및/또는 n은 1 이상, 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 7 이상, 8 이상, 9 이상, 10 이상, 또는 11 이상이다. 다른 바람직한 실시양태에서, m 및/또는 n은 12 이하, 11 이하, 10 이하, 9 이하, 8 이하, 7 이하, 6 이하, 5 이하, 4 이하, 3 이하, 2 이하, 또는 1 이하이다. 추가의 바람직한 실시양태에서, m + n은 1 이상, 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 7 이상, 8 이상, 9 이상, 10 이상, 또는 11 이상이다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, m + n은 12 이하, 11 이하, 10 이하, 9 이하, 8 이하, 7 이하, 6 이하, 5 이하, 4 이하, 3 이하, 2 이하, 또는 1 이하이다.
두 범위의 구성원은 다른 것과 조합되어 하한 및 상한이 있는 바람직한 길이 범위를 개시할 수 있다.
따라서, 특정 실시양태에서, 본 발명은 m + n, 및 임의적으로 m + n + o 및 m + n + o + p가 12 이하, 11 이하, 10 이하, 9 이하, 8 이하, 7 이하, 6 이하, 5 이하 또는 4 이하인 본 발명에 따른 방법에 관한 것이다.
본원에 제시된 상이한 링커 펩티드에서, C-말단은 다르게 표시되더라도 보호될 수도 있고 보호되지 않을 수도 있음을 이해하는 것이 중요하다. 보호는 전자의 아미드화에 의해 달성될 수 있다. 본 발명의 맥락에서는, 보호된 링커 펩티드와 보호되지 않은 링커 펩티드 모두가 포함된다.
본 발명자들은 이 공정이 부위-특이적 항체-페이로드 컨쥬게이트를 매우 비용 효율적이고 신속하게(24 내지 36시간, 또는 임의적으로 48시간) 생산하는데 적합하고, 따라서 이러한 분자의 대규모 라이브러리의 생산 및 고 처리량의 스크리닝 시스템에서의 후속 스크리닝을 가능하게 함을 보여주었다.
이에 반해, 유전자(분자) 조작된(engineered) Cys 잔기를 통해 페이로드가 항체에 컨쥬게이션되어 항체 페이로드 컨쥬게이트가 생성되는 Cys 조작 공정은 적어도 약 3 내지 4주가 소요된다.
일반적으로, 상기 방법은 다수의 페이로드를 항체에 컨쥬게이션시킬 수 있다. 각각의 페이로드에 대해, 최적의 임상적 및 비-임상적 특성을 제공하기 위해 적합한 펩티드 링커 구조를 대규모 링커 풀에서 확인할 수 있다. 이는 링커 구조가 고정된 다른 방법에서는 불가능하다. 또한, 본 발명에 따른 방법은 2개 이상의 상이한 페이로드를 포함하는 항체-페이로드 컨쥬게이트를 생성할 수 있게 하는데, 이 때 각각의 페이로드는 부위-특이적 방식으로 항체에 컨쥬게이션된다. 따라서, 본 발명에 따른 방법을 이용하여 신규의 및/또는 우수한 치료 또는 진단 능력을 갖는 항체를 생성시킬 수 있다.
링커는 α-, β-, γ-, δ- 및 ε-아미노산을 비제한적으로 포함하는 임의의 아미노산을 포함할 수 있다. α-아미노산의 경우, 링커는 임의의 천연 발생 L- 또는 D-아미노산을 포함할 수 있다. 천연-발생 L- 또는 D-아미노산은 자연에서 발견될 수 있는 임의의 L- 또는 D-아미노산을 포함한다. 즉, "천연 발생 L- 또는 D-아미노"산 이라는 용어는 천연-발생 단백질의 빌딩 블록으로 사용되는 모든 정규(canonical) 또는 단백질 생성 아미노산을 포함한다. 또한, 용어 "천연 발생 L- 또는 D-아미노"산은 예를 들어 대사 중간체 또는 분해 생성물로서 또는 다른 비-단백질 생성 거대분자의 빌딩 블록으로서 자연에서 발견될 수 있는 모든 비-정규 L- 또는 D-아미노산을 포함한다.
추가로, 링커는 비-천연 발생 L- 또는 D-아미노산을 포함할 수 있다. 비-천연 발생 L- 또는 D-아미노산은 이전에 자연에서 발견되지 않은 구조 H2N-CHR-COOH를 갖는 임의의 분자를 포함한다.
당업자는 L- 또는 D-아미노산이 천연 또는 비-천연 발생인지의 여부를 결정할 때 참조할 자원 및 데이터베이스를 알고 있다. 그러나, 의심스러운 경우, "천연 또는 비-천연 발생 L- 또는 D-아미노산"이라는 용어는 구조 H2N-CHR-COOH를 갖는 임의의 분자의 기원과는 관계없이 이들 분자의 L- 및 D-이성질체를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 링커는 또한 구조 H2N-CR1R2-COOH를 갖는 천연 또는 비-천연 발생, 비-키랄 아미노산을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 링커는 아미노산 유도체를 포함할 수 있다. 아미노산 유도체는 α-아미노기, α-카복실산기 및/또는 아미노산 측쇄의 화학 반응과 같은 하나 이상의 화학 반응에 의해 천연 또는 비-천연 발생 아미노산으로부터 유도된 화합물이다. 즉, 아미노산 유도체라는 용어는 천연 또는 비-천연 발생 L- 또는 D-아미노산으로부터 유도된, -NH-CHR-CO- 구조를 갖는 임의의 분자를 포함한다. 본 발명의 아미노산 유도체가 펩티드-기반 링커의 일부인 것으로 생각되기 때문에, 아미노산 유도체는 천연 또는 비-천연 발생 L- 또는 D-아미노산의 아미노산 측쇄, 또는 아미노산 유도체가 펩티드의 C-말단 단부에 위치하는 경우 천연 또는 비-천연 발생 L- 또는 D-아미노산의 알파-카복실산기의 하나 이상의 화학적 반응에 의해 수득되는 것이 바람직하다. 천연 및 비-천연 발생 아미노산은 아미노산 유도체일 수 있고 그 반대도 마찬가지임에 주목해야 한다.
본 발명의 링커에 포함될 수 있는 비-정규 아미노산, 비-천연 발생 아미노산 및 아미노산 유도체의 예는 α-아미노부티르산, α-아미노이소부티르산, 오르니틴, 히드록시프롤린, 아그마틴, {S)-2-아미노-4-((2-아미노)피리미디닐)부탄산, 알파-아미노이소부티르산, p-벤조일-L-페닐알라닌, t-부틸글리신, 시트루일린, 시클로헥실알라닌, 데스아미노 티로신, L-(4-구아니디노)페닐알라닌, 호모아르기닌, 호모시스테인, 호모세린, 호모라이신, n-포르밀 트립토판, 노르류신, 노르발린, 페닐글리신, (S)-4-피페리딜-(N-아미디노)글리신, 파라벤조일-L-페닐알라닌, 사르코신 및 2- 티에닐 알라닌을 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.
상기 기재된 알파-아미노산 외에, 본 발명의 링커는 또한 하나 이상의 β-, γ-, δ- 또는 ε-아미노산을 포함할 수 있다. 따라서, 특정 실시양태에서, 링커는 모방 펩티드(peptidomimetic)일 수 있다. 모방 펩티드는 2개의 α-아미노산 사이에 형성되는 고전적인 펩티드 결합만을 포함할 수는 없고 알파 아미노산과 β-, γ-, δ- 또는 ε-아미노산 사이에서 또는 두 개의 β-, γ-, δ- 또는 ε-아미노산 사이에서 형성된 하나 이상의 아미드 결합을 추가로 또는 대신 포함할 수 있다. 모방 펩티드이고 α-아미노산과 β-아미노산 사이에 아미드 결합을 포함하는 링커의 예는 도 16(Gly-β-Ala-Arg-Lys(N3))에 도시되어 있다. 따라서, 링커가 펩티드로서 기술되는 본 발명의 임의의 경우에, 링커는 또한 모방 펩티드일 수 있고 따라서 α-아미노산으로만 구성되는 것이 아니라 대신에 하나 이상의 β-, γ-, δ- 또는 ε-아미노산 또는 아미노산으로 분류되지 않는 분자를 포함할 수 있음을 이해해야 한다. 본 발명의 링커에 포함될 수 있는 β-, γ-, δ- 또는 ε-아미노산의 예는 β-알라닌, γ-아미노부티르산, 4-아미노-3-히드록시-5-페닐펜탄산, 4-아미노-3-히드록시-6-메틸헵탄산, 6-아미노헥산산 및 스타틴를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
용어 "D-아미노산"은 천연 발생 아미노산 및 비-천연 발생 아미노산 모두의 D-대응물(counterpart)을 포함하는 것으로 이해된다.
본 발명의 펩티드 링커는 펩티드 기반이기 때문에, 항체-페이로드 컨쥬게이트가 표적 세포 내로 내재화된 후 이들은 숙주 세포 펩티다제에 의해 가수분해될 가능성이 있다. 따라서, 특정 실시양태에서, 링커는 반드시 카텝신(cathepsin) 절단 부위를 포함할 필요는 없다. 따라서, 한 실시양태에서, 펩티드 구조를 포함하거나 갖는 링커는 카텝신에 의해 절단될 수 없다. 이는 특히 카텝신 B를 포함한다. 한 추가 실시양태에서, 펩티드 구조를 포함하거나 갖는 링커는 발린-알라닌 모티프 또는 발린-시트룰린 모티프를 포함하지 않는다. 그러나, 본 발명은 또한 발린-알라닌 또는 발린-시트룰린과 같은 카텝신 절단 부위를 포함하는 링커도 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 비-정규 또는 D-아미노산을 포함하는 링커는 숙주 세포 펩티다제에 의해 효율적으로 절단되지 않을 수 있다. 이 경우, 링커의 카텝신 절단 부위는 숙주 세포 내로 내재화된 후 페이로드의 방출을 개선할 수 있다. 링커는 필요하다면 표적 세포 내부에서 페이로드의 효율적인 방출을 허용하는 다른 모티프 또는 자기-희생(self-immolative) 기를 추가로 포함할 수 있다.
ADC 링커에 사용되지만 Lys 잔기가 없는 하나의 전형적인 디펩티드 구조는 브렌툭시맙 베도틴(Brentuximab Vedotin)에서 제공되고 두보칙(Dubowchik) 및 파이어스톤(Firestone)의 문헌(2002)에서 논의된 바와 같은 발린-시트룰린 모티프이다. 이 링커는 카텝신 B에 의해 절단되어 질병 부위에서 독소를 방출할 수 있다. 이는 예를 들어 SGN-CD33A에서 제공되는 발린-알라닌 모티프에도 동일하게 적용된다.
하나의 추가적인 실시양태에서, 링커는 폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜 유도체를 포함하지 않는다.
폴리에틸렌 글리콜(PEG)은 산업 제조에서 의약에 이르기까지 다양한 용도로 사용되는 폴리에테르 화합물이다. PEG는 또한 분자량에 따라 폴리에틸렌 옥사이드(PEO) 또는 폴리옥시에틸렌(POE)으로도 알려져 있다. PEG의 구조는 일반적으로 H-(O-CH2-CH2)n-OH로 표현된다. 그러나, 본 발명의 링커는 PEG 또는 PEG-유도체를 포함할 수 있음을 이해해야 한다.
따라서, B가 페이로드 또는 연결 모이어티일 수 있기 때문에 본 발명에 따른 방법은 하기 표 3에 나타낸 바와 같이 두 가지 주요 실시양태를 갖는다는 것을 이해하는 것이 중요하다.
| 링커 펩티드 | 공정 유형 | 단계 |
| Gly-(Aax)m-페이로드-(Aax)n | 1단계 컨쥬게이션 | 단계 1: 페이로드를 포함하는 링커와 항체의 Gln 잔기와의 컨쥬게이션 |
| Gly-(Aax)m-연결 모이어티-(Aax)n | 2단계 컨쥬게이션 | 단계 1: 연결 모이어티를 포함하는 링커와 항체의 Gln 잔기와의 컨쥬게이션 단계 2: 페이로드와 연결 모이어티와의 컨쥬 게이션 |
즉, 특정 실시양태에서, 페이로드는 화학적 합성에 의해 링커에 연결된다. 따라서, 링커는 Gly-(Aax)m-페이로드 또는 Gly-(Aax)m-페이로드-(Aax)n 구조를 가질 수 있다. 예를 들어, 페이로드는 화학적 합성에 의해 펩티드의 C-말단에 연결될 수 있다. 따라서, 특정 실시양태에서 링커는 구조 Gly-Ala-Arg-페이로드, Gly-Ala-Arg-Arg-페이로드, Gly-Gly-Ala-Arg-페이로드, Gly-Gly-Ala-Arg-Arg-페이로드 또는 Gly-Gly-Gly-페이로드를 가질 수 있다.
본 발명의 한 추가 실시양태에 따르면, 항체는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상이다:
·IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY
·IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA, 및/또는
·표적 결합 특성을 유지하고 CH2 도메인을 포함하는 이의 단편 또는 재조합 변이체.
항체는 바람직하게는 모노클로날 항체이다.
항체는 인간 기원일 수 있지만, 마찬가지로 마우스, 래트, 염소, 당나귀, 햄스터 또는 토끼에서 유래할 수 있다. 컨쥬게이트가 치료용인 경우, 쥣과 또는 토끼 항체는 임의적으로 키메라화 또는 인간화될 수 있다.
CH2 도메인을 포함하는 항체의 단편 또는 재조합 변이체는 예를 들어 하기와 같다:
·단순한 중쇄 도메인으로 구성된 항체 형식(상어 항체/IgNAR(VH-CH1-CH2-CH3-CH4-CH5)2 또는 낙타류 항체/hcIgG(VH-CH2-CH3)2)
·scFv-Fc(VH-VL-CH2-CH3)2
·Fc 도메인 및 하나 이상의 수용체 도메인을 포함하는 Fc 융합 펩티드.
항체는 또한 이중 특이성(bispecific)(예컨대, DVD-IgG, crossMab, 첨부된 IgG - HC 융합) 또는 이중 파라토프(biparatopic)일 수 있다. 개요에 대해서는 브링크만(Brinkmann)과 콘터만(Kontermann)의 문헌(2017)을 참조한다.
따라서, 특정 실시양태에서, 본 발명은 항체가 IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 또는 IgY 항체, 또는 그의 단편 또는 재조합 변이체이고, 이 때 그의 단편 또는 재조합 변이체가 표적 결합 특성을 유지하고 CH2 도메인을 포함하는, 본 발명에 따른 방법에 관한 것이다.
바람직한 실시양태에서, 항체는 IgG 항체이다. 즉, 항체는 바람직하게는 잔기 N297에서 당화된 IgG 항체일 수 있다. 다르게는, 항체는 바람직하게는 잔기 N297의 글리칸이 효소 PNGase F로 절단된 탈당화된 항체일 수 있다. 또한, 항체는 바람직하게는 잔기 N297이 비-아스파라긴 잔기로 대체된 비당화된 항체일 수 있다. 항체를 탈당화하는 방법 및 비당화된 항체를 생성하는 방법은 당업계에 공지되어 있다.
본원에서 논의된 바와 같이, 잔기 N297에서 당화된 IgG 항체는 당화되지 않은 항체에 비해 몇 가지 이점을 갖는다. 또한, 본 발명의 링커는 잔기 N297에서 당화된 항체에 예상외로 높은 효율로 컨쥬게이션될 수 있음이 입증되었다. 따라서, 훨씬 더 바람직한 실시양태에서, 항체는 CH2 도메인의 잔기 N297(EU 넘버링)에서 당화된 IgG 항체이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 (a) 페이로드 또는 연결 모이어티 B를 포함하는 링커가 분자 조작에 의해 항체의 중쇄 또는 경쇄 내로 도입된 Gln 잔기에 컨쥬게이션되거나, (b) 페이로드 또는 연결 모이어티 B를 포함하는 링커가 항체의 Fc 도메인의 Gln 잔기에 컨쥬게이션되는, 본 발명에 따른 방법에 관한 것이다.
본 발명의 한 추가 실시양태에 따르면, 페이로드 또는 연결 모이어티는 분자 조작에 의해 항체의 중쇄 또는 경쇄 내로 도입된 Gln 잔기에 컨쥬게이션된다.
본원에 사용된 용어 "분자 조작"은 핵산 서열을 조작하기 위한 분자 생물학 방법의 이용을 지칭한다. 본 발명 내에서, 분자 조작은 항체의 중쇄 또는 경쇄에 Gln 잔기를 도입하기 위해 이용될 수 있다. 일반적으로, Gln 잔기를 항체의 중쇄 또는 경쇄에 도입하기 위한 2가지 상이한 전략이 본 발명 내에서 구상된다. 첫째, 항체의 중쇄 또는 경쇄의 단일 잔기를 Gln 잔기로 치환시킬 수 있다. 둘째, 2개 이상의 아미노산 잔기로 구성된 Gln-함유 펩티드 태그를 항체의 중쇄 또는 경쇄에 통합시킬 수 있다. 이를 위해, 중쇄 또는 경쇄의 내부 위치에서, 즉 중쇄 또는 경쇄의 기존 아미노산 잔기 2개 사이에서 또는 이들을 치환함으로써 펩티드 태그를 통합하거나, 또는 항체의 중쇄 또는 경쇄의 N- 또는 C-말단 단부에 펩티드 태그를 융합(부착)할 수 있다.
첫 번째 경우에, 생성되는 항체가 미생물 트랜스글루타미나제에 의해 본 발명의 링커와 컨쥬게이션될 수 있다면 항체의 중쇄 또는 경쇄의 임의의 아미노 잔기는 Gln 잔기로 치환될 수 있다. 특정 실시양태에서, 항체는 IgG 항체의 CH2 도메인의 아미노산 잔기 N297(EU 넘버링)이 치환된, 특히 치환이 N297Q 치환인 항체이다. N297Q 돌연변이를 포함하는 항체는 항체의 중쇄당 하나보다 많은 링커에 컨쥬게이션될 수 있다. 예를 들어, N297Q 돌연변이를 포함하는 항체는 4개의 링커에 컨쥬게이션될 수 있는데, 여기에서 하나의 링커는 항체의 첫 번째 중쇄의 잔기 Q295에 컨쥬게이션되고, 하나의 링커는 항체의 첫 번째 중쇄의 잔기 N297Q에 컨쥬게이션되고, 하나는 링커는 항체의 두 번째 중쇄의 잔기 Q295에 컨쥬게이션되고, 하나의 링커는 항체의 두 번째 중쇄의 잔기 N297Q에 컨쥬게이션된다. 당업자는 IgG 항체의 잔기 N297을 Gln 잔기로 교체하면 비당화 항체가 생성된다는 것을 알고 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 분자 조작에 의해 항체의 중쇄 또는 경쇄 내로 도입된 Gln 잔기가 (a) 항체의 중쇄 또는 경쇄 내로 통합되거나 또는 (b) 항체의 중쇄 또는 경쇄의 N- 또는 C-말단 단부에 융합된 펩티드에 포함되는, 본 발명에 따른 방법에 관한 것이다.
따라서, 항체의 단일 아미노산 잔기를 치환하는 대신, 트랜스글루타미나제에 대해 접근가능한 Gln 잔기를 포함하는 펩티드 태그를 항체의 중쇄 또는 경쇄 내로 도입할 수 있다. 이러한 펩티드 태그를 항체의 중쇄 또는 경쇄의 N- 또는 C-말단에 융합할 수 있다. 바람직하게는, 트랜스글루타미나제-접근가능한 Gln 잔기를 포함하는 펩티드 태그를 항체의 중쇄의 C-말단에 융합시킨다. 훨씬 더 바람직하게는, 트랜스글루타미나제-접근가능한 Gln 잔기를 포함하는 펩티드 태그를 IgG 항체의 중쇄의 C-말단에 융합시킨다. 항체 중쇄의 C-말단에 융합될 수 있고 미생물 트랜스글루타미나제의 기질로 작용할 수 있는 여러 펩티드 태그는 WO 2012/059882 호, WO 2016/144608 호, WO 2016/100735 호, WO 2016/096785 호 및 스테펜(Steffen) 등의 문헌(JBC, 2017) 및 말레세빅(Malesevic) 등의 문헌(Chembiochem, 2015)에 기재되어 있다.
항체의 중쇄 또는 경쇄에 도입될 수 있는, 특히 항체의 중쇄의 C-말단에 융합될 수 있는 예시적인 펩티드 링커는 LLQGG, LLQG, LSLSQG, GGGLLQGG, GLLQG, LLQ, GSPLAQSHGG, GLLQGGG, GLLQGG, GLLQ, LLQLLQGA, LLQGA, LLQYQGA, LLQGSG, LLQYQG, LLQLLQG, SLLQG, LLQLQ, LLQLLQ, LLQGR, EEQYASTY, EEQYQSTY, EEQYNSTY, EEQYQS, EEQYQST, EQYQSTY, QYQS, QYQSTY, YRYRQ, DYALQ, FGLQRPY, EQKLISTEEDL, LQR 및 YQR이다.
당업자는 예를 들어 샘브룩(Sambrook, Joseph)의 문헌[(2001). Molecular cloning : a laboraty manual. Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press]에 기술된 바와 같은 분자 클로닝 방법에 의해 항체의 아미노산 잔기를 치환하거나 펩티드 태그를 항체에 도입하는 방법을 알고 있다.
본 발명의 한 추가 실시양태에 따르면, 페이로드 또는 연결 모이어티는 항체의 Fc 도메인 내의 Gln에 컨쥬게이션된다.
즉, 본 발명의 링커는 미생물 트랜스글루타미나제에 대한 기질로서 작용할 수 있는 항체의 Fc 도메인 내의 임의의 Gln 잔기에 컨쥬게이션될 수 있다.
전형적으로, 본원에서 사용되는 용어 Fc 도메인은 IgA, IgD 및 IgG의 마지막 2개의 불변 영역 면역글로불린 도메인(CH2 및 CH3), 및 IgE, IgY 및 IgM의 마지막 3개의 불변 영역 도메인(CH2, CH3 및 CH4)을 지칭한다. 즉, 페이로드 또는 연결 모이어티 B를 포함하는 링커는 항체의 CH2, CH3 및 적용 가능한 경우 CH4 도메인에 컨쥬게이션될 수 있다.
본 발명의 한 추가 실시양태에 따르면, 페이로드 또는 연결 모이어티는 항체의 CH2 도메인의 Gln 잔기 Q295(EU 넘버링)에 컨쥬게이션된다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 항체의 Fc 도메인 내의 Gln 잔기가 IgG의 CH2 도메인의 Gln 잔기 Q295(EU 넘버링)인, 본 발명에 따른 방법에 관한 것이다.
Q295가 IgG 유형 항체에서 극도로 보존된 아미노산 잔기임을 이해하는 것이 중요하다. 이는 인간 IgG1, 2, 3, 4뿐만 아니라 토끼 및 래트 항체에서도 보존된다. 따라서, Q295를 사용할 수 있다는 것은 항체가 흔히 인간 기원이 아닌 치료용 항체-페이로드 컨쥬게이트 또는 진단용 컨쥬게이트를 만드는데 상당한 이점이다. 따라서, 본 발명에 따른 방법은 매우 다양하고 광범위하게 적용 가능한 도구를 제공한다. IgG형 항체 중에 Q295 잔기가 극도로 보존되어 있지만, 마우스 IgG2a 또는 IgG2b와 같은 일부 IgG형 항체에는 이 잔기가 없다. 따라서, 본 발명의 방법에 사용되는 항체는 바람직하게는 CH2 도메인의 잔기 Q295(EU 넘버링)를 포함하는 IgG형 항체인 것으로 이해되어야 한다.
또한, 페이로드 부착을 위해 Q295를 사용하여 조작된 컨쥬게이트가 우수한 약동학 및 효능을 나타내고(로스피스 등. 2015) 분해되기 쉬운 불안정한 독소도 운반할 수 있는 것으로 나타났다[도리왈스카(Dorywalska) 등. 2015]. 따라서, 동일한 잔기가 변형되지만 당화된 항체이기 때문에 이 부위-특이적 방법으로도 유사한 효과가 나타날 것으로 예상된다. 당화는 전반적인 ADC 안정성에 추가로 기여할 수 있으며, 언급된 접근법에서와 같이 글리칸 모이어티의 제거는 덜 안정한 항체를 생성하는 것으로 나타났다[젱(Zheng) 등. 2011].
본 발명의 하나의 다른 실시양태에 따르면, 페이로드 또는 연결 모이어티가 컨쥬게이션되는 항체는 당화된다.
전형적인 IgG 형태의 항체는 CH2 도메인의 N297 위치(Asp-X-Ser/Thr-모티프) 에서 N-당화된다.
따라서, 특정 실시양태에서, 본 발명은 항체의 Fc 도메인 내의 Gln 잔기가 CH2 도메인의 잔기 N297(EU 넘버링)에서 당화된 IgG 항체의 CH2 도메인의 Gln 잔기 Q295(EU 넘버링)인, 본 발명에 따른 방법에 관한 것이다.
트랜스글루타미나제에 의한 CH2 Gln 잔기로의 링커의 컨쥬게이션을 논의하는 문헌에서는 작은 저분자량 기질이 중점적으로 논의되었다. 그러나, 선행 기술 문헌에서는 이러한 컨쥬게이션을 달성하기 위해 N297 위치에서의 탈당화 단계 또는 비당화된 항체의 사용이 필요하다고 항상 기재되어 있다(WO 2015/015448 호; WO 2017/025179 호; WO 2013/092998 호).
그러나, 매우 놀랍게도, 모든 예상과 달리, 당화된 항체의 Q295로의 부위-특이적 컨쥬게이션은 위에서 논의된 올리고펩티드 구조를 사용함으로써 실제로 효율적으로 가능하다.
Q295가 천연 상태에서 당화되는 N297에 매우 가깝지만, 특정 링커를 사용하는 본 발명에 따른 방법은 여전히 그에 대한 링커 또는 페이로드의 컨쥬게이션을 허용한다.
그러나, 도시된 바와 같이, 본 발명에 따른 방법은 Q295의 사전 효소에 의한 탈당화, 비당화된 항체의 사용, 다른 아미노산에 대한 N297의 치환, 또는 당화를 방지하기 위한 T299A 돌연변이의 도입을 필요로 하지 않는다.
이 두 가지 점은 제조 측면에서 상당한 이점을 제공한다. 효소에 의한 탈당화 단계는 GMP 측면에서 바람직하지 않은데, 왜냐하면 탈당화 효소(예컨대, PNGase F)와 절단된 글리칸 둘 다를 배지에서 제거해야 하기 때문이다.
또한, 페이로드 부착을 위한 항체의 유전자 조작이 필요하지 않으므로, 면역원성을 증가시키고 항체의 전체 안정성을 감소시킬 수 있는 서열 삽입을 피할 수 있다.
다른 아미노산에 대한 N297의 치환도 원치 않는 효과를 나타내는데, 이는 전체 Fc 도메인의 전반적인 안정성[수베디(Subedi) 등, 2015]과 전체 컨쥬게이트의 효능에 영향을 끼쳐, 항체 응집 증가 및 용해도 감소로 이어질 수 있으며(젱 등. 2011), 이는 PBD와 같은 소수성 페이로드에 특히 중요하기 때문이다. 또한, N297에 존재하는 글리칸은 항체 의존성 세포 독성(ADCC) 등을 유발하기 때문에 중요한 면역조절 효과를 갖는다. 이들 면역조절 효과는 탈당화 또는 비당화 항체를 수득하는 상기 논의된 임의의 다른 접근법 중 하나에서 손실된다. 또한, 확립된 항체의 임의의 서열 변형은 조절 문제를 야기할 수 있는데, 이는 종종 허용되고 임상적으로 검증된 항체가 ADC 컨쥬게이션의 출발점으로 사용되기 때문에 문제가 된다.
따라서, 본 발명에 따른 방법은 부위 특이적 페이로드 결합을 갖는 화학량론적으로 잘 정의된 ADC를 쉽고 단점 없이 만들 수 있게 한다.
상기 관점에서, 본 발명의 방법은 바람직하게 항체의 CH2 도메인의 잔기 Q295(EU 넘버링)에서 IgG 항체의 컨쥬게이션에 이용되는 것으로 언급되며, 이 때 항체는 CH2 도메인의 잔기 N297(EU 넘버링)에서 당화된다. 그러나, 본 발명의 방법은 또한 잔기 Q295 또는 항체의 임의의 다른 적합한 Gln 잔기에서 탈당화되거나 또는 비당화된 항체의 컨쥬게이션을 포함하는 것으로 명백히 언급되는데, 이 때 Gln 잔기는 내인성 Gln 잔기 또는 분자 조작에 의해 도입된 Gln 잔기일 수 있다.
본 발명은 또한 IgA, IgE, IgM, IgD 또는 IgY 항체와 같은 IgG 항체 이외의 다른 이소형(isotype)의 항체의 컨쥬게이션을 포함한다. 이들 항체의 컨쥬게이션은 내인성 Gln 잔기, 예를 들어 항체의 Fc 도메인 내의 내인성 Gln 잔기, 또는 분자 조작에 의해 항체에 도입된 Gln 잔기에서 일어날 수 있다.
일반적으로, 당업자는 항체의 링커가 컨쥬게이션되는 위치를 결정하는 방법을 알고 있다. 예를 들어, 컨쥬게이션 부위는 항체-페이로드 컨쥬게이트의 단백질 분해 소화 및 생성된 단편의 LC-MS/MS 분석에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 샘플은 사용 설명서에 따라 GlycINATOR[제노비스(Genovis)]로 탈당화되고, 이후에 각각 트립신 골드[질량 분석 등급, 프로메가(Promega)]로 소화될 수 있다. 따라서, 1㎍의 단백질을 37℃에서 하룻밤동안 50ng 트립신과 함께 배양할 수 있다. LC-MS/MS 분석은 시냅트(Synapt)-G2 질량 분석기[워터스(Waters)]에 연결된 나노어퀴티(nanoAcquity) HPLC 시스템을 사용하여 수행할 수 있다. 이를 위해 100ng 펩티드 용액을 어퀴티 UPLC 시메트리(Symmetry) C18 트랩 컬럼(워터스, 부품 번호 186006527)에 로딩하고, 1% 완충액 A(물, 0.1% 포름산) 및 99% 완충액 B(아세토니트릴, 0.1% 포름산)에서 5μL/분의 유속으로 3분동안 트래핑(trapped)할 수 있다. 그런 다음 25분 이내에 완충액 B 3% 내지 65%의 선형 구배를 이용하여 펩티드를 용출시킬 수 있다. 데이터는 양의 극성 및 50 내지 2000m/z 질량 범위에서 분해능 모드로 수집할 수 있다. 다른 기기 설정은 모세관 전압 3,2kV, 샘플링 콘 40V, 추출 콘 4.0V, 소스 온도 130℃, 콘 가스 35L/h, 나노 유동 가스 0.1바(bar) 및 퍼지 가스 150L/h일 수 있다. 질량 분석기는 [Glu1]-피브리노펩티드(Fibrinopeptide)로 보정될 수 있다.
추가로, 당업자는 항체-페이로드 구성물의 약물-대-항체(DAR) 비 또는 페이로드-대-항체 비를 결정하는 방법을 알고 있다. 예를 들어, DAR은 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 또는 LC-MS에 의해 결정될 수 있다.
소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)의 경우에는, 샘플을 0.5M 황산암모늄으로 조정하고, 1mL/분 및 30℃에서 20분에 걸쳐 A(1.5M 황산암모늄, 25mM 트리스 HCl, pH 7.5)에서 B(20% 이소프로판올, 25mM 트리스 HCl, pH 7.5)로의 전체 구배를 이용하여 MAB PAK HIC 부틸 컬럼[5㎛, 4.6×100mm, 써모 사이언티픽(Thermo Scientific)]을 통해 평가할 수 있다. 전형적으로는, 40μg 샘플을 사용할 수 있으며, 신호는 280nm에서 기록할 수 있다. 상대 HIC 체류 시간(HIC-RRT)은 ADC DAR 2 종의 절대 체류 시간을 각각의 비컨쥬게이션된 mAb의 체류 시간으로 나눔으로써 계산할 수 있다.
LC-MS DAR 측정을 위해, ADC를 NH4HCO3로 최종 농도 0.025mg/mL까지 희석시킬 수 있다. 이어서, 이 용액 40μL을 실온에서 5분 동안 1μL TCEP(500mM)로 환원시킨 다음, 10μL 클로로아세트아미드(200mM)를 첨가하여 알킬화한 다음, 암소에서 37℃에서 하룻밤동안 배양할 수 있다. 역상 크로마토그래피의 경우, 소프트웨어 크로멜레온(Chromeleon)과 함께 디오넥스(Dionex) U3000 시스템을 사용할 수 있다. 시스템에는 70℃로 가열된 RP-1000 컬럼[1000Å, 5μm, 1.0×100mm, 세팍스(Sepax)]과 214nm의 파장으로 설정된 UV 검출기가 장착될 수 있다. 용매 A는 0.1% 포름산을 포함하는 물로 구성될 수 있고, 용매 B는 0.1% 포름산을 포함하는 85% 아세토니트릴을 포함할 수 있다. 환원되고 알킬화된 샘플을 컬럼에 로딩하고 14분 동안에 걸쳐 용매 B 30 내지 55%의 구배에 의해 분리할 수 있다. 액체 크로마토그래피 시스템은 DAR 종의 식별을 위해 시냅트-G2 질량 분석기에 연결될 수 있다. 질량 분석기의 모세관 전압은 3kV로, 샘플링 콘은 30V로 설정될 수 있고, 추출 콘은 최대 5V 값으로 추가될 수 있다. 소스 온도는 150℃, 탈용매 온도는 500℃로, 콘 가스는 20l/h로, 탈용매 가스는 600l/h로 설정될 수 있으며, 1초 스캔 시간으로 600 내지 5000Da 질량 범위에서 포지티브 모드로 획득할 수 있다. 기기는 요오드화나트륨으로 보정할 수 있다. 스펙트럼의 디콘볼루션은 수렴될 때까지 매스링크스(MassLynx)의 맥스엔트1(MaxEnt1) 알고리즘으로 수행될 수 있다. 크로마토그래피 피크에 DAR 종을 할당한 후, 역상 크로마토그램의 적분된 피크 면적에 기초하여 DAR을 계산할 수 있다.
본 발명의 하나의 추가적인 실시양태에 따르면, 링커의 순 전하는 중성 또는 양전하이다.
펩티드의 순 전하는 일반적으로 중성 pH(7.0)에서 계산된다. 가장 간단한 접근 방식에서 순 전하는 양으로 하전된 아미노산 잔기(Arg 및 Lys 및 임의적으로는 His)의 수와 음으로 하전된 아미노산 잔기(Asp 및 Glu)의 수를 더함으로써 결정되며, 두 그룹의 차이를 계산한다. 링커가 비-정규 아미노산을 포함하는 경우, 당업자는 중성 pH에서 비-정규 아미노산의 전하를 결정하는 방법을 알고 있다.
본 발명의 한 추가 실시양태에 따르면, 링커는 음으로 하전된 아미노산 잔기를 포함하지 않는다.
바람직하게는, 올리고펩티드는 음으로 하전된 아미노산 잔기 Glu 및 Asp 또는 음으로 하전된 비-정규 아미노산을 포함하지 않는다.
본 발명의 한 추가 실시양태에 따르면, 링커는 양으로 하전된 아미노산 잔기를 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에 따르면, 링커는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 2개 이상의 아미노산 잔기를 포함한다:
·라이신 또는 라이신 유도체 또는 라이신 모방체,
·아르기닌, 및/또는
·히스티딘.
특정 실시양태에서, 링커는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함한다:
·라이신 또는 라이신 유도체 또는 라이신 모방체,
·아르기닌, 및
·히스티딘.
특정 실시양태에서, 링커는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함한다:
·라이신,
·아르기닌, 및
·히스티딘.
특정 실시양태에서, 링커는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함한다:
·아르기닌, 및
·히스티딘.
특정 실시양태에서, 링커는 적어도 하나의 아르기닌 잔기를 포함한다.
표 8은 음, 중성 및 양의 순 전하를 갖는 링커가 본 발명의 방법으로 당화된 항체에 컨쥬게이션될 수 있음을 보여준다. 특히, 양으로 하전된 아르기닌 잔기를 포함하는 링커는 고효율로 당화된 항체에 컨쥬게이션될 수 있다.
즉, 특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 링커는 중성 또는 양의 순 전하를 갖는다. 특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 링커는 중성 또는 양의 순 전하를 갖고, 적어도 하나의 아르기닌 및/또는 히스티딘 잔기를 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 링커는 중성 또는 양의 순 전하를 갖고, 적어도 하나의 아르기닌 잔기를 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 링커는 라이신 잔기를 포함하지 않는다. 특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 링커는 중성 또는 양의 순 전하를 가지며, 라이신 잔기를 포함하지 않는다.
표 8은 아미노산 서열 Gly-[Gly/Ala]-Arg-B를 갖는 링커가 당화된 항체에 효율적으로 컨쥬게이션될 수 있음을 추가로 보여준다. 따라서, 특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 링커는 서열 Gly-[Gly/Ala]-Arg-B 또는 Gly-[Gly/Ala]-Arg-B-(Aax)n을 갖는다.
특정 실시양태에서, 하나 이상의 연결 모이어티 B를 포함하는 링커는 GDC, GRCD, GRDC, GGDC, GGCD, GGEC, GGK(N3)D, GGRCD, GGGDC, GC, GRC, GGRC, GRAC, GARC, GGHK(N3), GGK(N3)RC, GARK(N3) 및 GGARK(N3)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직한 실시양태에서, 하나 이상의 연결 모이어티 B를 포함하는 링커는 GGK(N3)D, GGRCD, GC, GRC, GGRC, GARC, GGK(N3)RC, GARK(N3) 및 GGARK(N3)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 보다 바람직한 실시양태에서, 하나 이상의 연결 모이어티 B를 포함하는 링커는 GGRCD, GC, GGRC, GARC, GGK(N3)RC, GARK(N3) 및 GGARK(N3)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 가장 바람직한 실시양태에서, 하나 이상의 연결 모이어티 B를 포함하는 링커는 GC, GGRC, GARC 및 GGARK(N3)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 연결 모이어티 B를 포함하는 링커는 GGGK(N3)이다.
본 발명의 한 추가 실시양태에 따르면, 항체는 항체의 CH2 도메인에 Asn 잔기 N297(EU 넘버링)을 포함한다.
본 발명의 한 추가 실시양태에 따르면, N297 잔기는 당화된다.
본 발명의 한 추가 실시양태에 따르면, 페이로드 또는 연결 모이어티 B를 포함하는 링커는 Gln 잔기의 아미드 측쇄에 컨쥬게이션된다. 즉, 항체의 Gln 잔기의 아미드 측쇄가 이소펩티드 결합을 통해 링커의 N-말단 아미노기에 컨쥬게이션된다.
본 발명의 한 추가 실시양태에 따르면, 미생물 트랜스글루타미나제는 스트렙토마이세스 종, 구체적으로는 우선적으로 천연 효소에 대해 80%의 서열 상동성을 갖는 스트렙토마이세스 모바라엔시스(Streptomyces mobaraensis)로부터 유래된다. 따라서, MTG는 천연 효소일 수 있거나 천연 효소의 조작된 변이체일 수 있다. 도 8에 나타낸 바와 같이, 당화된 항체의 컨쥬게이션에 최적화되지 않은 천연 MTG 변이체를 사용하여 높은 컨쥬게이션 효율을 얻었다.
이러한 미생물 트랜스글루타미나제 중 하나는 제디라(Zedira)(독일)로부터 구입할 수 있다. 이는 대장균(E. coli)에 의해 재조합적으로 생산된다. 스트렙토마이세스 모바라엔시스 트랜스글루타미나제는 서열 번호 48에 기술된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는다. 다른 아미노산 서열을 갖는 스트렙토마이세스 모바라엔시스 MTG 변이체가 보고되었으며, 또한 본 발명에 포함된다(서열 번호: 28 및 49).
또 다른 실시양태에서, 미생물 트랜스글루타미나제 스트렙토마이세스 라다카눔(Streptomyces ladakanum)[이전에는 스트렙토버티실리움 라다카눔(Streptoverticillium ladakanum)으로 알려짐]이 사용되고 있다. 스트렙토마이세스 라다카눔 트랜스글루타미나제(미국 특허 US 6,660,510 B2 호)는 서열 번호 27에 기술된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는다.
상기 트랜스글루타미나제는 모두 서열 변형될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 서열 번호 27, 28, 48 및 49와 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 트랜스글루타미나제가 사용될 수 있다.
또 다른 적합한 미생물 트랜스글루타미나제는 액티바(ACTIVA) TG라 불리고, 아지노모토(Ajinomoto)로부터 구입가능하다. 제디라의 트랜스글루타미나제와 비교하여, 액티바 TG는 4 N 말단 아미노산이 없지만 유사한 활성을 갖는다
본 발명의 맥락에서 사용될 수 있는 추가의 미생물 트랜스글루타미나제는 킬리스젝(Kieliszek) 및 미지위츠(Misiewicz)의 문헌(2014), WO 2015/191883 A1 호, WO 2008/102007 A1 호 및 US 2010/0143970 호에 개시되어 있고, 이의 내용은 본 명세서에서 참고로 완전히 포함된다.
특정 실시양태에서는, 항체로의 링커의 컨쥬게이션을 위해 미생물 트랜스글루타미나제의 돌연변이 변이체를 사용한다. 즉, 본 발명의 방법에 사용되는 미생물 트랜스글루타미나제는 서열번호 27 또는 29에 기재된 스트렙토마이세스 모바라엔시스 트랜스글루타미나아제의 변이체일 수 있다. 특정한 실시양태에서, 서열 번호: 29에 기재된 스트렙토마이세스 모바라엔시스 트랜스글루타미나제는 돌연변이 G250D를 포함한다. 특정 실시양태에서, 서열 번호: 29에 기재된 바와 같은 재조합 스트렙토마이세스 모바라엔시스 트랜스글루타미나제는 돌연변이 G250D 및 E300D를 포함한다. 특정 실시양태에서, 서열 번호: 29에 기재된 바와 같은 재조합 스트렙토마이세스 모바라엔시스 트랜스글루타미나제는 돌연변이 D4E 및 G250D를 포함한다. 특정 실시양태에서, 서열 번호: 29에 기재된 바와 같은 재조합 스트렙토마이세스 모바라엔시스 트랜스글루타미나제는 돌연변이 E120A 및 G250D를 포함한다. 특정 실시양태에서, 서열 29에 기재된 재조합 스트렙토마이세스 모바라엔시스 트랜스글루타미나제는 돌연변이 A212D 및 G250D를 포함한다. 특정 실시양태에서, 서열 번호: 29에 기재된 재조합 스트렙토마이세스 모바라엔시스 트랜스글루타미나제는 돌연변이 G250D 및 K327T를 포함한다.
링커와 항체의 효율적인 컨쥬게이션을 허용하는 임의의 농도로 미생물 트랜스글루타미나제를 컨쥬게이션 반응에 첨가할 수 있다. 특정 실시양태에서는, 미생물 트랜스글루타미나제를 100U/mL 미만, 90U/mL 미만, 80U/mL 미만, 70U/mL 미만, 60U/mL 미만, 50U/mL 미만, 40U/mL 미만, 30U/mL 미만, 20U/mL 미만, 10U/mL 미만 또는 7U/mL 미만의 농도로 컨쥬게이션 반응에 첨가할 수 있다.
본 발명에 따른 방법은 미생물 트랜스글루타미나제의 사용을 포함한다. 그러나, 비-미생물 기원의 트랜스글루타미나제 활성을 포함하는 효소에 의해 동등한 반응을 수행할 수 있다는 점에 유의해야 한다. 따라서, 또한 비-미생물 기원의 트랜스글루타미나제 활성을 포함하는 효소로 본 발명에 따른 항체-페이로드 컨쥬게이트를 생성시킬 수 있다.
효율적인 컨쥬게이션을 얻기 위해 링커를 몰 과량으로 항체에 첨가하는 것이 바람직하다. 즉, 특정 실시양태에서는, 항체에 비해 5물 당량 과량, 10몰 당량 과량, 20몰 당량 과량, 30몰 당량 과량, 40몰 당량 과량, 50몰 당량 과량, 60몰 당량 과량, 70몰 당량 과량, 80몰 당량 과량, 90몰 당량 과량 또는 100몰 당량 과량의 펩티드 링커와 항체를 혼합한다.
본 발명에 따른 방법은 바람직하게는 6 내지 8.5 범위의 pH에서 수행된다. 실시예 1 및 2는 컨쥬게이션 효율이 pH 7.6에서 가장 높다는 것을 보여준다. 따라서, 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 6 내지 8.5 범위의 pH, 보다 바람직하게는 7 내지 8 범위의 pH에서 항체에 대한 링커의 컨쥬게이션을 달성하는, 본 발명에 따른 방법에 관한 것이다. 가장 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 pH 7.6에서 항체에 대한 링커의 컨쥬게이션을 달성하는, 본 발명에 따른 방법에 관한 것이다.
본 발명의 방법은 본 발명의 방법을 이용한 항체에 대한 링커 또는 링커-페이로드 구성물의 컨쥬게이션에 적합한 임의의 완충액에서 수행할 수 있다. 본 발명의 방법에 적합한 완충액은 제한 없이 트리스, MOPS, HEPES, PBS 또는 비스트리스(BisTris)를 포함한다. 추가로, 완충액은 본 발명의 방법을 수행하기에 적합한 임의의 염 농도를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법에 사용되는 완충액은 ≤ 150mM, ≤ 140mM, ≤ 130mM, ≤ 120mM, ≤ 110mM, ≤ 100mM, ≤ 90mM, ≤ 80mM, ≤ 70mM, ≤ 60mM, ≤ 50mM, ≤ 40mM, ≤ 30mM, ≤ 20mM, ≤ 10mM 또는 1mM의 염 농도를 가질 수 있다. 특정 실시양태에서, 완충액은 염을 함유하지 않을 수 있다.
최적의 반응 조건(예: pH, 완충액, 염 농도)은 페이로드마다 다를 수 있으며 어느 정도까지는 링커 및/또는 페이로드의 물리화학적 특성에 따라 달라질 수 있음에 유의해야 한다. 그러나, 당업자는 본 발명의 방법을 수행하기에 적합한 반응 조건을 확인하기 위해 과도한 실험을 필요로 하지 않는다.
본 발명의 하나의 추가적인 실시양태에 따르면, 연결 모이어티 B는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상이다:
·생체 직교 마커 기, 또는
·가교를 위한 기타 비-생체-직교 엔티티(entity).
본 발명의 특정한 실시양태에서, 연결 모이어티 B는 하기를 포함한다:
·생체 직교 마커 기, 또는
·가교를 위한 비-생체-직교 엔티티.
용어 "생체 직교 마커 기"는 천연 생화학적 과정을 방해하지 않고 살아있는 시스템 내에서 화학 반응이 일어날 수 있게 하는 반응성 기를 지칭하기 위해 슬레튼(Sletten) 및 버토지(Bertozzi)(2011)에 의해 확립되었다. "가교를 위한 비-생체-직교 엔티티"는 제 1 작용기를 포함하거나 이로 구성된 임의의 분자일 수 있으며, 이 때 제 1 작용기는 상용성 제 2 작용기를 포함하는 페이로드에 화학적으로 또는 효소에 의해 가교될 수 있다. 가교 반응이 비-생체-직교 반응인 경우에도, 링커에 페이로드를 가교시키는 것 외에 항체에 추가적인 변형을 도입하지 않는 것이 바람직하다. 상기 관점에서, 연결 모이어티 B는 "생체 직교 마커 기" 또는 "비-생체-직교 엔티티"로 구성될 수 있거나, 또는 "생체 직교 마커 기" 또는 "비-생체-직교 엔티티"를 포함할 수 있다. 예를 들어, 연결 모이어티 Lys(N3)의 경우, 전체 Lys(N3) 및 아지드기 단독 모두가 본 발명 내에서 생체 직교 마커 기로 보여질 수 있다.
본 발명의 하나의 추가 실시양태에 따르면, 생체 직교 마커 기 또는 비-생체-직교 엔티티는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상이다:
·-N-N≡N 또는 -N3
·Lys(N3)
·테트라진
·알킨
·DBCO
·BCN
·노르보렌
·트랜스시클로옥텐
·-RCOH(알데히드),
·아실트리플루오로보레이트,
·-SH, 및
·시스테인.
이들 기는 예를 들어 표 4에 표시된 임의의 결합 반응에 참여할 수 있다.
| 결합 파트너 1 | 결합 파트너 2 | 반응 유형 |
| -N-N≡N | 시클로옥틴 유도체(예를 들어, DIFO, BCN, DIBAC, DIBO, ADIBO/DBCO) | SPAAC |
| -N-N≡N | 알킨 | CuAAC |
| -N-N≡N | 트리아릴포스핀 | 스타우딩거 라이게이션 (Staudinger ligation) |
| 테트라진 | 시클로프로펜 노르보렌 시클로옥틴 (BCN) |
테트라진 라이게이션 |
| 예컨대 Cys 잔기의 -SH | 말레이미드 | 티올-말레이미드 컨쥬게이션 |
| 아민 | N-히드록시석신이미드 | |
-O-카바모일히드록실아민 |
아실트리플루오로보레이트 |
KAT-라이게이션(포타슘 아실-트리플루오로보레이트) |
| -Rx-S-S-Ry | Rz-SH + 환원제(예컨대, TCEP, DTT) | 직접 디설피드 생체 켠쥬게이션 |
| -CHO(알데히드) | HIPS-프로브 |
히드라지노-이소-픽텟-스펭글러 (Hydrazino-iso-Pictet-Spengler)(HIPS) |
| -CHO(알데히드) | N-피롤릴 알라닌 유도체 | 피롤릴 알라닌 픽텟-스펭글러 (PAPS) |
| -CHO(알데히드) | R1-N-N-R2 HO-N-R1 H2N-CHR1-CH2-SH |
히드라존-라이게이션 옥심-라이게이션 티아졸리딘-라이게이션 |
| 말레이미드 | 예컨대 Cys 잔기의 -SH | 티올-말레이미드 컨쥬게이션 |
상기 표 4에서, 상기 연결 모이어티는 "결합 파트너 1" 또는 "결합 파트너 2"로 불리는 것일 수 있거나 이를 포함할 수 있다.
본 발명의 한 추가 실시양태에 따르면, 연결 모이어티 B는 유리 설프히드릴 기를 갖는 Cys 잔기이다.
이러한 Cys 잔기(또는 유도체)의 유리 설프히드릴기는 말레이미드-포함 링커 독소 구성물을 그에 컨쥬게이션시키기 위해 사용될 수 있다. 컨쥬게이션 반응 및 일부 잠재적인 링커 구성물에 대한 자세한 내용은 도 5를 참조한다.
말레이미드 링커를 포함하는 독소가 자주 사용되었으며, 애드세트리스(Adcetris)와 같이 의료 당국에서도 승인되었다. 따라서, MMAE 독소를 포함하는 약물은 (i) p-아미노벤질 스페이서, (ii) 디펩티드 및 (iii) 말레이미도카프로일 링커를 포함하는 링커에 컨쥬게이션되며, 이는 구성물을 항체의 Cys 잔기의 유리 설프히드릴기에 대한 구성물의 컨쥬게이션을 가능하게 한다.
따라서, 본 발명에 따른 링커에 Cys-잔기를 제공하면, 항체-페이로드 컨쥬게이트를 생성하기 위해 기성품 독소-말레이미드 구성물을 사용할 수 있거나, 또는 더 일반적으로는 Cys-말레이미드 결합 화학의 장점을 완전히 이용할 수 있다는 이점을 갖는다. 동시에, 탈당화될 필요가 없는 기성 항체를 사용할 수 있다.
특정 실시양태에서, Cys 잔기는 C-말단이거나 펩티드 링커에서 쇄 내에 있다.
또 다른 실시양태에서, 연결 모이어티 B는 아지드기를 포함한다. 당업자는 6-아지도-리신(Lys(N3)) 또는 4-아지도-호모알라닌(Xaa(N3))과 같은, 본 발명에 따른 링커에 혼입될 수 있는 아지드기를 포함하는 분자를 알고 있다. 아지드기를 포함하는 연결 모이어티는 변형-촉진 아지드-알킨 고리화 첨가(SPAAC), 구리-촉매된 아지드-알킨 고리화 첨가(CuAAC) 또는 스타우딩거 라이게이션과 같은 다양한 생체-직교 반응에서 기질로 사용될 수 있다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, DBCO와 같은 시클로옥텐 유도체를 포함하는 페이로드는 SPAAC에 의해 아지드기를 포함하는 링커에 연결될 수 있다(도 15 참조).
또 다른 실시양태에서, 연결 모이어티 B는 테트라진을 포함한다. 당업자는 본 발명에 따른 링커에 혼입될 수 있는 테트라진-포함 분자, 바람직하게는 테트라진기를 포함하는 아미노산 유도체를 알고 있다(예를 들어, 도 7a 참조). 테트라진을 포함하는 연결 모이어티는 생체-직교 테트라진 라이게이션에서 기질로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 시클로프로펜, 노르보렌 또는 시클로옥틴기를 포함하는 페이로드, 예를 들어 비시클로[6.1.0]노닌(BCN)은 테트라진기를 포함하는 링커에 연결될 수 있다.
본 발명은 2개의 상이한 생체-직교 마커 기 및/또는 비-생체-직교 엔티티를 포함하는 링커를 추가로 포함한다. 예를 들어, 본 발명에 따른 링커는 Lys(N3) 또는 Xaa(N3)와 같은 아지드-포함 연결 모이어티, 및 시스테인과 같은 설프히드릴-포함 연결 모이어티을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 링커는 Lys(N3) 또는 Xaa(N3)와 같은 아지드-포함 연결 모이어티, 및 테트라진-변형 아미노산과 같은 테트라진-포함 연결 모이어티를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 링커는 시스테인과 같은 설프히드릴-포함 연결 모이어티 및 테트라진-변형 아미노산과 같은 테트라진-포함 연결 모이어티를 포함할 수 있다. 2개의 상이한 생체-직교 마커 기 및/또는 비-생체-직교 엔티티를 포함하는 링커는 이들이 2개의 별개의 페이로드를 수용할 수 있고 따라서 하나보다 많은 페이로드를 포함하는 항체-페이로드 컨쥬게이트를 생성할 수 있다는 이점을 갖는다.
본 발명의 하나의 추가적인 실시양태에 따르면, B가 연결 모이어티인 경우, 실제 페이로드를 연결 모이어티에 연결하는 추가 단계를 수행하게 된다.
아지드와 시클로옥틴 사이의 1,3-양극성 고리화 첨가[구리-비함유 클릭 화학이라고도 함, 배스킨(Baskin) 등(2007)], 니트론과 시클로옥틴 사이의 1,3-양극성 고리화 첨가[닝(Ning) 등(2010)], 알데히드 및 케톤으로부터의 옥심/히드라존 형성[야레마(Yarema) 등(1998)], 테트라진 라이게이션[블랙맨(Blackman) 등(2008)], 이소니트릴-기반 클릭 반응[스톡만(Stockmann) 등(2011)], 및 가장 최근에는 쿼드리시클란(quadricyclane) 라이게이션[슬레튼(Sletten) 및 버토지(Bertozzi)(JACS, 2011)], 구리(I)-촉매 아지드-알킨 고리화 첨가[CuAAC, 콜브(Kolb) 및 샤플리스(Sharpless)(2003)], 변형-촉진 아지드-알킨 고리화 첨가[SPAAC, 아가드(Agard) 등(2004)], 또는 변형-촉진 알킨-니트론 고리화 첨가[SPANC, 맥켄지(MacKenzie) 등(2014)]를 비롯한, 생체-직교성 요구 사항을 충족하는 다수의 화학적 라이게이션 전략이 개발되었다.
이러한 모든 문서는 충분한 공개를 제공하고 긴 반복을 피하기 위해 본원에 참조로 포함된다.
페이로드는 바람직하게는 상기 링커가 미생물 트랜스글루타미나제에 의해 항체의 Gln 잔기에 컨쥬게이션된 후 본 발명에 따른 링커의 생체-직교 마커 기 또는 비-생체-직교 엔티티에 연결됨을 알아야 한다. 그러나, 본 발명은 또한 제 1 단계에서 페이로드가 연결 모이어티를 포함하는 링커에 연결되고, 제 2 단계에서 생성된 링커-페이로드 구성물이 미생물 트랜스글루타미나제에 의해 항체에 컨쥬게이션된 항체-페이로드 컨쥬게이트를 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 페이로드가 클릭-반응, 예를 들어 상기 언급된 클릭 반응 중 임의의 하나를 통해 항체-링커 컨쥬게이트의 연결 모이어티 B에 연결되는, 본 발명에 따른 방법에 관한 것이다. 바람직한 실시양태에서, 클릭 반응은 SPAAC이다.
본 발명의 하나의 추가적인 실시양태에 따르면, 페이로드 B는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상이다:
·독소
·사이토카인
·성장인자
·방사성 핵종
·호르몬
·항바이러스제
·항균제
·형광 염료
·면역조절제/면역자극제
·반감기 증가 모이어티
·용해도 증가 모이어티
·중합체-독소 컨쥬게이트
·핵산
·비오틴 또는 스트렙타비딘 모이어티
·비타민
·표적 결합 모이어티, 및
·소염제.
반감기 증가 모이어티는 예를 들어 PEG-모이어티(폴리에틸렌글리콜 모이어티; PEG화), 기타 중합체 모이어티, PAS 모이어티(프롤린, 알라닌 및 세린을 포함하는 올리고펩티드; PAS화), 또는 혈청 알부민 결합제이다. 용해도 증가 모이어티는 예를 들어 PEG-모이어티(PEG화) 또는 PAS 모이어티(PAS화)이다.
중힙체-독소 컨쥬게이트는 많은 페이로드 분자를 운반할 수 있는 중합체이다. 이러한 컨쥬게이트는 종종 예를 들어 예컨대 머사나 쎄라퓨틱스(Mersana therapeutics)에 의해 판매되는 플렉시머(fleximer)라고도 한다.
핵산 페이로드의 한 예는 멀티셀 테크놀로지즈, 인코포레이티드(MultiCell Technologies, Inc.)에서 개발한, 종양 용해 및 면역 활성화 특성을 갖는 매우 작은 비-코딩 이중 스트랜드 RNA인 MCT-485이다.
소염제는 예를 들어 표적 특이적 항체에 컨쥬게이션될 때 예컨대 자가면역 질환에 의해 유발된 염증을 개선할 수 있는 소염 사이토카인이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "형광 염료"는 제 1 파장의 빛을 흡수하고 제 1 파장보다 긴 제 2 파장을 방출하는 염료를 의미한다. 특정 실시양태에서, 형광 염료는 650 내지 900nm의 파장에서 광을 방출하는 근적외선 형광 염료이다. 이 영역에서는 조직 자가형광이 더 낮고, 더 적은 형광 소멸은 최소한의 배경 간섭으로 깊은 조직 침투를 향상시킨다. 따라서, 근적외선 형광 영상화를 이용하여 본 발명의 항체-페이로드 컨쥬게이트에 의해 결합된 조직을 수술 중에 가시적으로 만들 수 있다. "근적외선 형광 염료"는 당업계에 공지되어 있으며 시판되고 있다. 특정 실시양태에서, 근적외선 형광 염료는 IRDye 800CW, Cy7, Cy7.5, NIR CF750/770/790, DyLight 800 또는 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 750일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "방사성 핵종"은 예를 들어 Y, In, Tb, Ac, Cu, Lu, Tc, Re, Co, Fe 등(예컨대, 90Y, 111In, 67Cu, 77Lu, 99Tc, 161Tb, 225Ac 등)과 같은 방사성 금속의 양으로 하전된 이온을 포함하는 의학적으로 유용한 방사성 핵종에 관련된다. 방사성 핵종은 킬레이트제에 포함될 수 있다. 또한, 방사성 핵종은 치료용 방사성 핵종 또는 하기에 논의되는 바와 같이 영상화 기술에서 조영제로 사용될 수 있는 방사성 핵종일 수 있다. 방사성 핵종 또는 방사성 핵종을 포함하는 분자는 당업계에 공지되어 있고 시중에서 구입가능하다.
본원에 사용된 용어 "독소"는 세포 또는 유기체에 유독한 임의의 화합물에 관한 것이다. 따라서, 독소는 예를 들어 소분자, 핵산, 펩티드 또는 단백질일 수 있다. 구체적인 예는 신경독, 괴사독소, 혈독소 및 세포독소이다. 본 발명의 하나의 추가적인 실시양태에 따르면, 독소는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상이다:
·피롤로벤조디아제핀(PBD)
·아우리스타틴(예: MMAE, MMAF)
·메이탄시노이드(메이탄신, DM1, DM4, DM21)
·듀오카르마이신
·튜불리신
·에네디엔(예: 칼리케아미신)
·PNU, 독소루비신
·피롤계(pyrrole-based) 키네신 스핀들 단백질(KSP) 억제제
·칼리케아미신
·아마니틴(예: α-아마니틴), 및/또는
·캄프토테신(예: 엑사테칸, 데룩스테칸)
특정 실시양태에서, 페이로드는 아우리스타틴이다. 본원에 사용된 용어 "아우리스타틴"은 유사분열 억제제의 부류를 지칭한다. 아우리스타틴 유도체도 "아우리스타틴"이라는 용어의 정의에 포함된다. 아우리스타틴의 예는 아우리스타틴 E(AE), 모노메틸 아우리스타틴 E(MMAE), 모노메틸 아우리스타틴 F(MMAF) 및 돌라스타틴의 합성 유사체를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
특정 실시양태에서, 페이로드는 메이탄시노이드이다. 본 발명의 맥락에서, 용어 "메이탄시노이드"는 원래 아프리카 관목인 메이테누스 오바투스(Maytenus ovatus)로부터 단리된 고 세포독성 약물 부류, 및 추가로 메이탄시놀(메이탄시놀) 및 천연 메이탄시놀의 C-3 에스테르(미국 특허 제 4,151,042 호); 합성 메이탄시놀의 C-3 에스테르 유사체[쿱찬(Kupchan) 등, J. Med. Chem. 21: 31-37, 1978; 히가시데(Higashide) 등, Nature 270: 721-722, 1977; 카와이(Kawai) 등, Chem. Farm. Bull. 32: 3441-3451; 및 미국 특허 제 5,416,064 호]; 단순 카복실산의 C-3 에스테르(미국 특허 제 4,248,870 호; 제 4,265,814 호; 제 4,308,268 호; 제 4,308,269 호; 제 4,309,428 호; 제 4,317,821 호; 제 4,322,348 호; 및 제 4, 331,598 호); 및 N-메틸-L-알라닌의 유도체를 갖는 C-3 에스테르(미국 특허 제 4,137,230 호; 제 4,260,608 호; 및 카와이 등, Chem. Pharm Bull. 12: 3441, 1984)를 가리킨다. 본 발명의 방법에 사용될 수 있거나 본 발명의 항체-페이로드 컨쥬게이트에 포함될 수 있는 예시적인 메이탄시노이드는 DM1, DM3, DM4 및/또는 DM21이다.
특정 실시양태에서, 독성 페이로드 분자는 듀오카르마이신이다. 적합한 듀오카르마이신은 예를 들어 듀오카르마이신 A, 듀오카르마이신 B1, 듀오카르마이신 B2, 듀오카르마이신 CI, 듀오카르마이신 C2, 듀오카르마이신 D, 듀오카르마이신 SA, 듀오카르마이신 MA 및 CC-1065일 수 있다. "듀오카르마이신"이라는 용어는 또한 아도젤레신, 비젤레신, 카르젤레신, KW-2189 및 CBI-TMI와 같은 듀오카르마이신의 합성 유사체를 지칭하는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명의 의미에서 독소는 또한 약물 유출(efflux) 수송체의 억제제일 수 있다. 독소 및 약물 유출 수송체의 억제제를 포함하는 항체-페이로드 컨쥬게이트는 세포 내로 내재화될 때 약물 유출 수송체의 억제제가 세포 외부로의 독소의 유출을 방지하는 이점을 가질 수 있다. 본 발명 내에서 약물 유출 수송체는 P-당단백질일 수 있다. P-당단백질의 일반적인 약리학적 억제제에는 하기가 포함된다: 아미오다론(amiodarone), 클라리스로마이신(clarithromycin), 시클로스포린(ciclosporin), 콜히친(colchicine), 딜티아젬(diltiazem), 에리트로마이신(erythromycin), 펠로디핀(felodipine), 케토코나졸(ketoconazole), 란소프라졸(lansoprazole), 오메프라졸(omeprazole) 및 기타 양성자-펌프 억제제, 니페디핀(nifedipine), 파록세틴(paroxetine), 레세르핀(reserpine), 사퀴나비르(saquinavir), 세르트랄린(sertraline), 퀴니딘(quinidine), 타목시펜(tamoxifen), 베라파밀(verapamil) 및 둘록세틴(duloxetine). 엘라크리다르(Elacridar)와 CP 100356은 다른 일반적인 P-gp 억제제이다. 조수퀴다르(Zosuquidar)와 타리퀴다르(tariquidar)도 이를 염두에 두고 개발되었다. 마지막으로, 발스포다르(valspodar) 및 레버산(reversan)은 이러한 약제의 다른 예이다.
비타민은 엽산, 폴라신(folacin) 및 비타민 B9를 비롯한 폴레이트로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
표적 결합 모이어티는 단백질 또는 비-단백질 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 또는 소분자일 수 있다. 한 실시양태에서, 이러한 표적 결합 모이어티는 scFv 형상 항체, Fab 단편, F(ab)2 단편, 나노바디(nanobody), 아피바디(affibody), 디아바디(diabody), VHH 형상 항체, 또는 DARPIN을 포함하는 항체 모방체이다.
페이로드는 클릭 반응과 같은 임의의 적합한 반응에 의해 링커의 연결 모이어티에 연결될 수 있거나, 또는 화학적 합성에 의해 링커에 부착될 수 있음을 이해해야 한다.
본 발명의 하나의 추가적인 실시양태에 따르면, 링커는 2개 이상의 연결 모이어티 B를 갖는다.
이러한 실시양태에서, 항체-페이로드 컨쥬게이트는 예를 들어 4의 항체 대 페이로드 비로 생성될 수 있다(각각의 Q295 잔기에 컨쥬게이션된 2개의 페이로드를 가짐).
본 발명의 하나의 추가 실시양태에 따르면, 둘 이상의 연결 모이어티 B는 서로 상이하다.
이러한 실시양태에서, 제 1 연결 모이어티는 예를 들어 아지드(N3)이거나 이를 포함할 수 있는 반면, 제 2 연결 모이어티는 테트라진이거나 이를 포함할 수 있다. 따라서, 이러한 올리고펩티드 링커는 2개의 상이한 페이로드를 항체의 2개의 Gln 잔기, 즉 항체의 2개의 CH2 도메인의 Q295 잔기에 컨쥬게이션시킬 수 있다.
이러한 방식으로, 2+2의 항체 페이로드 비를 얻을 수 있다. 두 번째 페이로드를 사용하면 효능 및 효력과 관련하여 현재의 치료적 접근 방식을 능가하는 완전히 새로운 종류의 항체 페이로드 컨쥬게이트를 개발할 수 있다.
이러한 실시양태는 특히, 예를 들어 DNA 및 미세소관과 같은 세포 내의 2개의 상이한 구조체를 표적화하는 것을 허용한다. 일부 암은 예를 들어 미세소관 독소와 같은 한 약물에 내성을 가질 수 있기 때문에, DNA-독소는 여전히 암세포를 죽일 수 있다.
다른 실시양태에 따르면, 동일한 시간에 동일한 조직에서 방출될 때에만 완전히 강력한 2개의 약물이 사용될 수 있다. 이것은 항체가 건강한 조직에서 부분적으로 분해되거나 한 약물이 조기에 소실되는 경우 표적을 벗어난 독성을 감소시킬 수 있다.
또한, 이중-표지 프로브는 비-침습적 영상화 및 치료 또는 수술 중/수술 후 영상화/수술에 사용될 수 있다. 그러한 실시양태에서는, 비-침습적 영상화에 의해 종양 환자를 선택할 수 있다. 이어, 외과의 또는 로봇이 모든 암 조직을 식별하는 데 도움이 되는 다른 조영제(예: 형광 염료)를 사용하여 종양을 외과적으로 제거할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 전술한 단계 중 어느 하나에 따른 방법으로 생성된 항체-페이로드 컨쥬게이트가 제공된다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 하기 펩티드 구조(N->C 방향으로 표시됨)를 포함하는 링커가 제공된다:
Gly-(Aax)m-B-(Aax)n
상기 식에서,
Gly는 N-말단 1차 아민을 포함하고,
·m은 0 이상 12 이하의 정수이고,
·n은 0 이상 12 이하의 정수이며,
·m + n ≥ 0이고,
·Aax는 아미노산 또는 아미노산 유도체이고,
·B는 페이로드 또는 연결 모이어티이다.
여기에서, 링커는 링커의 N-말단 Gly의 N-말단 1차 아민을 통해 미생물 트랜스글루타미나제에 의해 항체에 컨쥬게이션될 수 있다.
상기 링커는 N-말단 글리신(Gly) 잔기의 N-말단 1차 아민을 통해 트랜스글루타미나제 효소에 의해 항체의 중쇄 또는 경쇄에 포함된 글루타민(Gln) 잔기에 컨쥬게이션되기에 적합하다.
일반적으로, 본 발명의 방법에 따라 위에서 논의된 이점 및 실시양태도 또한 이러한 양태, 즉 물질의 조성물로서의 링커에 적용된다. 따라서, 이들 실시양태는 물질의 조성물로서의 링커와 함께 개시되는 것으로 간주되어야 한다.
본원에 제시된 상이한 링커 펩티드에서, C-말단은 달리 도시되더라도 보호될 수도 있고 보호되지 않을 수도 있음을 이해하는 것이 중요하다. 보호는 아미드화에 의해 달성될 수 있다. 본 발명의 맥락에서는, C-말단에서 보호된 링커 펩티드 및 보호되지 않은 링커 펩티드가 포함된다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 링커가 2개 이상의 페이로드 및/또는 연결 모이어티 B를 포함하는, 본 발명에 따른 링커에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 링커는 2개 이상의 연결 모이어티 및/또는 페이로드를 포함할 수 있다. 즉, 링커는 하기 펩티드 구조(N->C 방향으로 표시)를 가질 수 있다:
Gly-(Aax)m-B1-(Aax)n-B2-(Aax)o
상기 식에서,
·m, n 및 o는 0 이상 12 이하의 정수이고,
·m + n + o ≥ 0이고,
·Aax는 아미노산 또는 아미노산 유도체이고,
·B1 및 B2는 페이로드 및/또는 연결 모이어티이며, 이 때 B1 및 B2는 서로 동일하거나 다를 수 있다.
여기에서, 링커는 링커의 N-말단 Gly의 N-말단 1차 아민을 통해 미생물 트랜스글루타미나제에 의해 항체에 컨쥬게이션될 수 있다.
다른 실시양태에서, 링커는 3개의 연결 모이어티 및/또는 페이로드를 포함할 수 있다. 즉, 링커는 하기 펩티드 구조(N->C 방향으로 표시)를 가질 수 있다:
Gly-(Aax)m-B1-(Aax)n-B2-(Aax)o-B3-(Aax)p
상기 식에서,
·m, n, o 및 p는 0 이상 12 이하의 정수이고,
·m + n + o + p ≥ 0이며,
·Aax는 아미노산 또는 아미노산 유도체이고,
·B1, B2 및 B3은 페이로드 및/또는 연결 모이어티이며, 이 때 B1, B2 및 B3은 서로 동일하거나 다를 수 있다.
여기에서, 링커는 링커의 N-말단 Gly의 N-말단 1차 아민을 통해 미생물 트랜스글루타미나제에 의해 항체에 컨쥬게이션될 수 있다.
본 발명은 또한 3개보다 많은 연결 모이어티 및/또는 페이로드, 예를 들어 4, 5 또는 6개의 연결 모이어티 및/또는 페이로드를 포함하는 링커를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 이 경우, 링커의 펩티드 구조는 2 또는 3개의 연결 모이어티 및/또는 페이로드를 포함하는 링커에 대해 위에서 설명한 것과 동일한 패턴을 따른다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 하기 펩티드 구조(N->C 방향으로 표시됨)를 갖는 링커에 관한 것이다:
Gly-(Aax)m-B-(Aax)n
상기 식에서,
·m은 0 이상 12 이하의 정수이고,
·n은 0 이상 12 이하의 정수이며,
·m + n ≥ 0이며,
·Aax는 아미노산 또는 아미노산 유도체이고,
·B는 페이로드 또는 연결 모이어티이다.
여기에서, 링커는 링커의 N-말단 Gly의 N-말단 1차 아민을 통해 미생물 트랜스글루타미나제에 의해 항체에 컨쥬게이션될 수 있다.
이 경우에, 모이어티 B는 하나보다 많은 페이로드 및/또는 연결 모이어티를 포함할 수 있음을 이해해야 한다. 예를 들어, B는 (B'-(Aax)o-B'')를 나타낼 수 있으며, 여기에서 B' 및 B''는 페이로드 및/또는 연결 모이어티이고, o는 0 이상 12 이하의 정수이다. 다르게는, B는 (B'-(Aax)o-B''-(Aax)p-B''')를 나타낼 수 있으며, 여기에서 B', B'' 및 B'''는 페이로드 및/또는 연결 모이어티이고, o 및 p는 0 이상 12 이하의 정수이다.
바람직한 실시양태에서, m 및/또는 n은 1 이상, 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 7 이상, 8 이상, 9 이상, 10 이상, 또는 11 이상이다. 다른 바람직한 실시양태에서, m 및/또는 n은 12 이하, 11 이하, 10 이하, 9 이하, 8 이하, 7 이하, 6 이하, 5 이하, 4 이하, 3 이하, 2 이하, 또는 1 이하이다. 추가의 바람직한 실시양태에서, m + n은 1 이상, 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 7 이상, 8 이상, 9 이상, 10 이상, 또는 11 이상이다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, m + n은 12 이하, 11 이하, 10 이하, 9 이하, 8 이하, 7 이하, 6 이하, 5 이하, 4 이하, 3 이하, 2 이하, 또는 1 이하이다.
두 범위의 구성원은 다른 것과 결합되어 하한 및 상한이 있는 바람직한 길이 범위를 개시할 수 있다.
따라서, 특정 실시양태에서, 본 발명은 m+n이 12 이하, 11 이하, 10 이하, 9 이하, 8 이하, 7 이하, 6 이하, 5 이하 또는 4 이하인 본 발명에 따른 링커에 관한 것이다.
추가 실시양태에서, 링커는 카텝신 B에 의해 절단될 수 없고/없거나, 링커는 발린-알라닌 모티프 또는 발린-시트룰린 모티프를 포함하지 않고/않거나, 링커는 폴리에틸렌글리콜 또는 폴리에틸렌글리콜 유도체를 포함하지 않는다.
한 실시양태에 따르면, 연결 모이어티 B는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상이다:
·생체 직교 마커 기,
·가교를 위한 기타 비-생체-직교 엔티티.
특정 실시양태에서, 링커의 하나 이상의 연결 모이어티 B는 하기를 포함하거나 하기로 이루어진다:
·생체 직교 마커 기; 또는
·가교를 위한 비-생체-직교 엔티티.
하나의 실시양태에 따르면, 상기 생체 직교 마커 기 또는 비-생체-직교 엔티티는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상이다:
·-N-N≡N 또는 -N3
·Lys(N3)
·테트라진
·알킨
·DBCO
·BCN
·노르보렌
·트랜스시클로옥텐
·-RCOH(알데히드),
·아실트리플루오로보레이트,
·-SH, 및
·시스테인.
추가의 실시양태에서, 링커의 순 전하는 중성 또는 양이고/이거나, 링커는 음으로 하전된 아미노산 잔기를 포함하지 않고/않거나, 링커는 양으로 하전된 아미노산 잔기를 포함하고/하거나, 링커는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 둘 이상의 아미노산 잔기를 포함한다:
·라이신,
·아르기닌, 및/또는
·히스티딘.
특정 실시양태에서, 링커는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함한다:
·라이신,
·아르기닌, 및
·히스티딘.
특정 실시양태에서, 링커는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함한다:
·아르기닌, 및
·히스티딘.
즉, 특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 링커는 중성 또는 양의 순 전하를 갖는다. 특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 링커는 중성 또는 양의 순 전하를 갖고, 적어도 하나의 아르기닌 및/또는 히스티딘 잔기를 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 링커는 라이신 잔기를 포함하지 않는다. 특정 실시양태에서, 링커는 중성 또는 양의 순 전하를 갖고, 라이신 잔기를 포함하지 않는다.
하나의 실시양태에 따르면, 1차 아민기는 미생물 트랜스글루타미나제(MTG)의 기질로서 작용하기에 적합하다.
한 추가 실시양태에 따르면, 링커는 미생물 트랜스글루타미나제(MTG)에 의해 항체-페이로드 컨쥬게이트를 생성하는데 적합하다.
하나의 추가적인 실시양태에 따르면, 링커는 하기로부터 선택된다:
a) 표 5에 표시된 목록, 및/또는
b) 서열 번호 1 내지 25 중 어느 하나.
특정 실시양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 링커에 관한 것으로, 여기에서 링커는 표 5에 나타낸 바와 같은 목록으로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 양태에 따라, 적어도 하기를 포함하는 링커-페이로드 구성물이 제공되며, 이 때 상기 구성물에서 링커 및/또는 페이로드는 임의적으로는 결합 동안 화학적으로 변형되어 공유 결합 또는 비-공유 결합을 허용하여 상기 구성물을 형성한다:
a) 상기 기재내용에 따른 링커, 및
b) 하나 이상의 페이로드.
특정 실시양태에서는, 적어도 하기를 포함하는 링커-페이로드 구성물이 제공되며, 이 때 하나 이상의 페이로드는 링커에 공유 결합 또는 비-공유 결합된다:
a) 상기 기재내용에 따른 링커, 및
b) 하나 이상의 페이로드.
특정 실시양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 링커-페이로드 구성물에 관한 것으로, 이 때 상기 구성물에서, 하나 이상의 페이로드는 클릭 반응으로 링커의 연결 모이어티 B에 공유 결합된다. 즉, 하나 이상의 페이로드는 SPAAC, 테트라진 라이게이션 또는 티올-말레이미드 컨쥬게이션과 같은(이들로 국한되지 않음) 위에서 논의된 임의의 클릭 반응에 의해 연결 모이어티 B에 부착될 수 있다.
링커 내의 연결 모이어티와 페이로드 사이의 클릭 반응 외에, 페이로드는 당업계에 공지된 임의의 효소에 의한 또는 비-효소적 반응에 의해 링커에 공유 결합될 수 있다. 이를 위해 페이로드는 링커의 C-말단 또는 링커의 아미노산 측쇄에 결합될 수 있다.
특정 실시양태에서, 페이로드는 화학적 합성에 의해 링커에 연결된다. 당업자는 화학적 합성에 의해 페이로드를 펩티드 링커에 연결하는 방법을 알고 있다. 예를 들어, 아민-포함 페이로드, 또는 티올-포함 페이로드(예컨대, 메이탄신 유사체), 또는 히드록실-함유 페이로드(예를 들어, SN-38 유사체)는 화학적 합성에 의해 펩티드 링커의 C-말단에 부착되어 예컨대 도 17에 도시된 링커를 수득할 수 있다. 그러나, 당업자는 페이로드를 화학적 합성에 의해 아미노산 또는 아미노산 유도체의 측쇄 또는 C-말단에 연결하는데 이용될 수 있는 추가 반응 및 반응성 기를 알고 있다. 화학적 합성에 의해 페이로드를 펩티드 링커에 연결하는데 이용될 수 있는 전형적인 반응은 펩티드 연결, 활성화된 에스테르 연결(NHS 에스테르, PFP 에스테르), 클릭 반응(CuAAC, SPAAC), 마이클 부가(티올 말레이미드 컨쥬게이션)를 포함하지만, 이들로 국한되지는 않는다. 펩티드로의 페이로드의 연결은 선행 기술, 예를 들어 코스토플러스(Costoplus) 등의 문헌(ACS Med Chem, 2019), 손지니(Sonzini) 등의 문헌(Bioconj Chem, 2019), 보데로(Bodero) 등의 문헌(Belstein, 2018), 눈스(Nunes) 등의 문헌(RSC Adv, 2017), 도로니나(Doronina) 등의 문헌(Bioconj Chem, 2006), 나카다(Nakada) 등의 문헌(Bioorg Med Chem, 2016) 및 딕기서(Dickgiesser)등의 문헌(Bioconj Chem, 2020)에 의해 폭넓게 기재된 바 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 링커-페이로드 구성물에 관한 것으로, 이 때 상기 구성물에서, 링커 및/또는 페이로드는 임의적으로는 결합 동안 화학적으로 변형되어 공유 결합 또는 비-공유 결합을 허용하여 상기 구성물을 형성한다.
두 개 이상의 페이로드가 사용되는 경우, 후자는 서로 동일하거나 다를 수 있다.
하나의 실시양태에서, 페이로드는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상이다:
·독소
·사이토카인
·성장 인자
·방사성 핵종
·호르몬
·항바이러스제
·항균제
·형광 염료
·면역조절제/면역자극제
·반감기 증가 모이어티
·용해도 증가 모이어티
·중합체-독소 컨쥬게이트
·핵산
·비오틴 또는 스트렙타비딘 모이어티
·비타민
·표적 결합 모이어티, 및
·소염제,
·단백질 분해제(PROTAC).
또 다른 실시양태에서, 독소는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상이다:
·피롤로벤조디아제핀(PBD)
·아우리스타틴(예: MMAE, MMAF)
·메이탄시노이드(메이탄신, DM1, DM4, DM21)
·듀오카르마이신
·튜불리신
·엔디엔(예: 칼리케아미신)
·PNU, 독소루비신
·피롤계 키네신 스핀들 단백질(KSP) 억제제
·칼리케아미신
·아마니틴(예: α-아마니틴), 및/또는
·캄프토테신(예: 엑사테칸, 데룩스테칸).
본 발명의 또 다른 양태에 따라, 하기를 포함하는 항체-페이로드 컨쥬게이트가 제공된다:
a) 상기 기재내용에 따른 하나 이상의 링커-페이로드 구성물, 및
b) 중쇄 또는 경쇄에 하나 이상의 Gln 잔기를 포함하는 항체.
여기에서, 상기 컨쥬게이트에서, 링커-페이로드 구성물 및/또는 항체는 임의적으로는 컨쥬게이션 동안 화학적으로 변형되어 공유 또는 비-공유 컨쥬게이션을 허용하여 상기 컨쥬게이트를 형성한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 하기를 포함하는 항체 페이로드 컨쥬게이트에 관한 것이다:
a) 상기 기재내용에 따른 하나 이상의 링커-페이로드 구성물, 및
b) 중쇄 또는 경쇄에 하나 이상의 Gln 잔기를 포함하는 항체.
여기에서, 링커-페이로드 구성물은 링커-페이로드 구성물에 포함된 N-말단 글리신 잔기의 N-말단 1차 아민을 통해 항체의 중쇄 또는 경쇄에 있는 Gln 잔기의 아미드 측쇄에 컨쥬게이션된다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 컨쥬게이션이 미생물 트랜스글루타미나제(MTG)로 달성된, 본 발명에 따른 항체-페이로드 컨쥬게이트에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 컨쥬게이션이 링커-페이로드 구성물의 형성 전 또는 후에 달성된, 본 발명에 따른 항체-페이로드 컨쥬게이트에 관한 것이다. 즉, 본 발명은 제 2 단계에서 하나 이상의 페이로드가 링커의 연결 모이어티에 연결되기 전에 제 1 단계에서 링커가 항체에 컨쥬게이션된 항체-페이로드 컨쥬게이트를 포함한다. 그러나, 본 발명은 또한 제 1 단계에서 하나 이상의 페이로드가 링커의 연결 모이어티에 연결되고, 이어서 제 2 단계에서 생성된 링커-페이로드 구성물이 항체에 컨쥬게이션된 항체-페이로드 컨쥬게이트도 포함한다. 추가로, 하나 이상의 페이로드를 화학적 합성에 의해 펩티드 링커에 부착시킬 수 있고, 생성된 링커-페이로드 구성물을 1-단계 반응에서 항체에 컨쥬게이션시킬 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 항체가 IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 또는 IgY 항체, 또는 그의 단편 또는 재조합 변이체인 항체-페이로드 컨쥬게이트에 관한 것이고, 이 때 그의 단편 또는 재조합 변이체는 표적 결합 특성을 유지하고 CH2 도메인을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 항체가 IgG 항체인, 본 발명에 따른 항체-페이로드 컨쥬게이트에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 항체가 당화된 항체, 탈당화된 항체 또는 비당화된 항체인, 본 발명에 따른 항체-페이로드 컨쥬게이트에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 당화된 항체가 CH2 도메인의 잔기 N297(EU 넘버링)에서 당화된 IgG 항체이거나, 또는 당화된 항체가 IgG 항체의 CH2 도메인의 잔기 N297(EU 넘버링)과 상동인 잔기에서 당화된 상이한 이소형의 항체인, 본 발명에 따른 항체-페이로드 컨쥬게이트에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 (a) 링커-페이로드 구성물이 분자 조작에 의해 항체의 중쇄 또는 경쇄 내로 도입된 Gln 잔기에 컨쥬게이션되거나, 또는 (b) 링커-페이로드 구성물이 항체의 Fc 도메인 내의 Gln 잔기에 컨쥬게이션되는, 본 발명에 따른 항체-페이로드 컨쥬게이트에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 항체의 Fc 도메인 내의 Gln 잔기가 IgG 항체의 CH2 도메인의 Gln 잔기 Q295(EU 넘버링) 또는 상이한 이소형 항체의 상동성 Gln 잔기인, 본 발명에 따른 항체-페이로드 컨쥬게이트에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 항체의 Fc 도메인 내의 Gln 잔기가 CH2 도메인의 잔기 N297(EU 넘버링)에서 당화된 IgG 항체의 CH2 도메인의 잔기 Gln Q295(EU 넘버링)인, 본 발명에 따른 항체-페이로드 컨쥬게이트에 관한 것이다.
본 발명의 방법의 항체 또는 본 발명의 항체-페이로드 컨쥬게이트는 임의의 항체, 바람직하게는 임의의 IgG 유형 항체일 수 있다. 예를 들어, 항체는 제한 없이 브렌툭시맙(Brentuximab), 트라스투주맙(Trastuzumab), 젬투주맙(Gemtuzumab), 이노투주맙(Inotuzumab), 아벨루맙(Avelumab), 세툭시맙(Cetuximab), 리툭시맙(Rituximab), 다라투무맙(Daratumumab), 페르투주맙(Pertuzumab), 베돌리주맙(Vedolizumab), 오크렐리주맙(Ocrelizumab), 토실리주맙(Tocilizumab), 우스테키누맙(Ustekinuxmab), 골리무맙(Golimumab), 오비누투주맙(Obinutuzumab), 폴라투주맙(Polatuzumab) 또는 엔포르투맙(Enfortumab)일 수 있다.
즉, 특정 실시양태에서, 본 발명은 항체가 브렌툭시맙인 본 발명에 따른 항체-페이로드 컨쥬게이트에 관한 것이다. 추가의 실시양태에서, 본 발명은 항체가 트라스투주맙인 본 발명에 따른 항체-페이로드 컨쥬게이트에 관한 것이다. 추가적인 실시양태에서, 본 발명은 항체가 젬투주맙인 본 발명에 따른 항체-페이로드 컨쥬게이트에 관한 것이다. 추가의 실시양태에서, 본 발명은 항체가 이노투주맙인 본 발명에 따른 항체-페이로드 컨쥬게이트에 관한 것이다. 추가의 실시양태에서, 본 발명은 항체가 아벨루맙인 본 발명에 따른 항체-페이로드 컨쥬게이트에 관한 것이다. 추가적인 실시양태에서, 본 발명은 항체가 세툭시맙인 본 발명에 따른 항체-페이로드 컨쥬게이트에 관한 것이다. 추가적인 실시양태에서, 본 발명은 항체가 리툭시맙인 본 발명에 따른 항체-페이로드 컨쥬게이트에 관한 것이다. 추가의 실시양태에서, 본 발명은 항체가 다라투뭄밥인 본 발명에 따른 항체-페이로드 컨쥬게이트에 관한 것이다. 추가의 실시양태에서, 본 발명은 항체가 페르투주맙인 본 발명에 따른 항체-페이로드 컨쥬게이트에 관한 것이다. 추가의 실시양태에서, 본 발명은 항체가 베돌리주맙인 본 발명에 따른 항체-페이로드 컨쥬게이트에 관한 것이다. 추가의 실시양태에서, 본 발명은 항체가 오크렐리주맙인 본 발명에 따른 항체-페이로드 컨쥬게이트에 관한 것이다. 추가적인 실시양태에서, 본 발명은 항체가 토실리주맙인 본 발명에 따른 항체-페이로드 컨쥬게이트에 관한 것이다. 추가적인 실시양태에서, 본 발명은 항체가 우스테키누맙인 본 발명에 따른 항체-페이로드 컨쥬게이트에 관한 것이다. 추가의 실시양태에서, 본 발명은 항체가 골리무맙인 본 발명에 따른 항체-페이로드 컨쥬게이트에 관한 것이다. 추가의 실시양태에서, 본 발명은 항체가 오비누투주맙인 본 발명에 따른 항체-페이로드 컨쥬게이트에 관한 것이다. 추가의 실시양태에서, 본 발명은 항체가 폴라투주맙인 본 발명에 따른 항체-페이로드 컨쥬게이트에 관한 것이다. 추가적인 실시양태에서, 본 발명은 항체가 엔포르투맙인 본 발명에 따른 항체-페이로드 컨쥬게이트에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 분자 조작에 의해 항체의 중쇄 또는 경쇄 내로 도입된 Gln 잔기가 비당화된 IgG 항체의 CH2 도메인의 N297Q(EU 넘버링)인, 본 발명에 따른 항체-페이로드 컨쥬게이트에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 분자 조작에 의해 항체의 중쇄 또는 경쇄 내로 도입된 Gln 잔기가 (a) 항체의 중쇄 또는 경쇄에 통합되거나 (b) 항체의 중쇄 또는 경쇄의 N- 또는 C-말단 단부에 융합된 펩티드에 포함되는, 본 발명에 따른 항체-페이로드 컨쥬게이트에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 Gln 잔기를 포함하는 펩티드가 항체의 중쇄의 C-말단 단부에 융합된, 본 발명에 따른 항체-페이로드 컨쥬게이트에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 Gln 잔기를 포함하는 펩티드가 LLQGG, LLQG, LSLSQG, GGGLLQGG, GLLQG, LLQ, GSPLAQSHGG, GLLQGGG, GLLQGG, GLLQ, LLQLLQGA, LLQGA, LLQYQGA, LLQGSG, LLQYQG, LLQLLQG, SLLQG, LLQLQ, LLQLLQ, LLQGR, EEQYASTY, EEQYQSTY, EEQYNSTY, EEQYQS, EEQYQST, EQYQSTY, QYQS, QYQSTY, YRYRQ, DYALQ, FGLQRPY, EQKLISEEDL, LQR 또는 YQR로 이루어진 군으로부터 선택되는, 본 발명에 따른 항체-페이로드 컨쥬게이트에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 항체-페이로드 컨쥬게이트가 하나 이상의 독소를 포함하는, 본 발명에 따른 항체-페이로드 컨쥬게이트에 관한 것이다.
즉, 본 발명의 항체-페이로드 컨쥬게이트는 하나 이상의 링커에 컨쥬게이션된 항체를 포함하고, 여기에서 하나의 링커는 하나 이상의 독소를 포함한다. 특정 실시양태에서, 항체-페이로드 컨쥬게이트는 2개의 링커를 포함하고, 이 때 항체의 각각의 중쇄는 각각 하나의 링커에 컨쥬게이션된다. 특정 실시양태에서, 항체-페이로드 컨쥬게이트는 4개의 링커를 포함하고, 이 때 항체의 각각의 중쇄는 각각 2개의 링커에 컨쥬게이션된다. 이러한 경우, 각 링커는 독소와 같은 하나 이상의 페이로드를 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체-페이로드 컨쥬게이트는 2개의 링커를 포함하고, 이 때 각각의 링커는 하나의 페이로드, 예를 들어 독소를 포함한다. 다른 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체-페이로드 컨쥬게이트는 2개의 링커를 포함하고, 여기에서 각각의 링커는 2개의 페이로드, 예를 들어 하나의 독소 및 하나의 다른 페이로드, 또는 2개의 동일하거나 상이한 독소를 포함한다. 항체-페이로드 컨쥬게이트가 2개의 링커를 포함하는 실시양태에서, 링커는 IgG 항체의 두 중쇄의 잔기 Q295에 컨쥬게이션되는 것이 바람직하다. 훨씬 더 바람직하게는, 항체는 잔기 N297에서 당화된 IgG 항체이다.
특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체-페이로드 컨쥬게이트는 4개의 링커를 포함하고, 여기에서 각각의 링커는 하나의 페이로드, 예를 들어 독소를 포함한다. 다른 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체-페이로드 컨쥬게이트는 4개의 링커를 포함하고, 이 때 각각의 링커는 2개의 페이로드, 예를 들어 하나의 독소 및 하나의 다른 페이로드, 또는 2개의 동일하거나 상이한 독소를 포함한다. 항체-페이로드 컨쥬게이트가 4개의 링커를 포함하는 실시양태에서, 링커는 IgG 항체의 두 중쇄의 잔기 Q295 및 N297Q에 컨쥬게이션되는 것이 바람직하다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 항체-페이로드 컨쥬게이트가 2개의 상이한 독소를 포함하는, 본 발명에 따른 항체-페이로드 컨쥬게이트에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체-페이로드 컨쥬게이트는 2개의 상이한 독소를 포함한다. 즉, 특정 실시양태에서, 항체-페이로드 컨쥬게이트는 2개의 링커를 포함할 수 있고, 이 때 각각의 링커는 2개의 상이한 독소를 포함한다. 2개의 상이한 독소를 포함하는 항체-페이로드 컨쥬게이트는 증가된 세포독성 활성을 가질 수 있다는 이점이 있다. 이러한 증가된 세포독성 활성은 2개의 상이한 세포 메커니즘을 표적으로 하는 2개의 독소를 결합함으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 항체-페이로드 컨쥬게이트는 세포 분열을 억제하는 제 1 독소를 포함할 수 있고, 제 2 독소는 DNA의 복제 및/또는 전사를 방해하는 독소이다.
따라서, 특정 실시양태에서, 본 발명은 제 1 독소가 세포 분열을 억제하는 독소이고 제 2 독소가 DNA의 복제 및/또는 전사를 방해하는 독소인, 본 발명에 따른 항체-페이로드 컨쥬게이트에 관한 것이다.
유사분열 억제제 또는 스핀들 독과 같은 세포 분열을 억제하는 독소는 세포의 유사분열 분열을 억제하거나 방지할 수 있는 물질이다. 스핀들 독은 스핀들이라고 알려진 염색체의 중심체 영역을 연결하는 단백질 실에 영향을 주어 세포 분열을 방해하는 독이다. 스핀들 독은 스핀들 어셈블리 체크포인트(spindle assembly checkpoint; SAC)에서 세포 분열의 유사분열 단계를 방해하여 새로운 세포의 생성을 효과적으로 중단시킨다. 유사분열 스핀들은 조절 단백질과 함께 복제된 염색체를 적절하게 분리하는 활동에서 서로 보조하는 미세소관(중합된 튜불린)으로 구성된다. 유사분열 스핀들에 영향을 미치는 특정 화합물은 고형 종양 및 혈액 악성 종양에 대해 매우 효과적인 것으로 입증되었다.
빈카 알칼로이드(vinca alkaloid)와 탁산(taxane)의 두 가지 특정 계열의 유사분열 억제제는 미세소관 역학의 교반에 의해 세포 분열을 방해한다. 빈카 알칼로이드는 튜불린이 미세소관으로 중합되는 것을 억제함으로써 작용하여, 세포 주기 내에서 G2/M 정지를 일으켜 결국 세포 사멸을 초래한다. 대조적으로, 탁산은 해중합에 대해 미세소관을 안정화함으로써 유사분열 세포 주기를 정지시킨다. 새로운 화학요법의 표적이 될 수 있는 다수의 다른 스핀들 단백질이 존재하지만, 튜불린-결합제는 임상에서 사용되는 유일한 유형이다. 운동 단백질 키네신에 영향을 미치는 약제가 임상 시험에 돌입하고 있다. 또 다른 유형인 파클리탁셀(paclitaxel)은 기존 미세소관 내의 튜불린에 부착하여 작용한다. 본 발명 내에서 세포 분열을 억제하는 바람직한 독소는 MMAE 및 MMAF와 같은 아우리스타틴 및 DM1, DM3, DM4 및/또는 DM21과 같은 메이탄시노이드이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 독소 중 하나 이상이 아우리스타틴 또는 메이탄시노이드인, 본 발명에 따른 항체-페이로드 컨쥬게이트에 관한 것이다.
DNA 분자의 정확한 복제 및/또는 전사를 방지하고 암 치료에 적합한 것으로 밝혀진 여러 약제가 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 새로 형성된 DNA 및/또는 RNA 분자에 잘못 통합된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드 유사체와 같은 항대사물질이 당업계에 알려져 있으며, 세스멧지스(Tsesmetzis) 등의 문헌[Cancers (Basel), 2018, 10(7): 240]에 요약되어 있다. DNA의 복제 및/또는 전사를 방해하는 것으로 알려진 다른 독소는 듀오로마이신이다.
따라서, 특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체-페이로드 컨쥬게이트는 2개의 상이한 독소를 포함하며, 이 때 제 1 독소는 듀오로마이신이고, 제 2 페이로드는 아우리스타틴 또는 메이탄시노이드이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 항체-페이로드 컨쥬게이트가 2개의 상이한 아우리스타틴을 포함하는, 본 발명에 따른 항체-페이로드 컨쥬게이트에 관한 것이다.
두 가지 상이한 독소를 포함하는 항체-페이로드 컨쥬게이트의 한 가지 주요 이점은 항체-페이로드 컨쥬게이트가 독소 중 하나의 작용 메커니즘을 벗어난 표적 세포에 대해 여전히 작용할 수 있고/있거나 항체-페이로드 컨쥬게이트가 더 높은 이종 종양에 대한 효능을 가질 수 있다는 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 항체-페이로드 컨쥬게이트가 독소 및 약물 유출 수송체의 억제제를 포함하는, 본 발명에 따른 항체-페이로드 컨쥬게이트에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 항체-페이로드 컨쥬게이트가 독소 및 용해도 증가 모이어티를 포함하는, 본 발명에 따른 항체-페이로드 컨쥬게이트에 관한 것이다.
즉, 항체-페이로드 컨쥬게이트는 2개의 페이로드를 포함할 수 있는데, 여기에서 제 1 페이로드는 독소이고 제 2 페이로드는 용해도 증가 모이어티이다. 도 9의 구조 5는 라이신 측쇄에 연결된 용해도 증가 모이어티를 포함하는 펩티드 링커를 나타낸다. 따라서, 도 9의 구조 5에 나타낸 링커의 아지드기에 독소를 클릭함으로써 독소 및 용해도 증가 모이어티를 포함하는 항체-페이로드 컨쥬게이트를 얻을 수 있다. 다르게는, 링커의 아지드-포함 연결 모이어티에 독소를 클릭함으로써, 또한 동일한 링커의 시스테인 측쇄에 말레이미드-포함 용해도 증가 모이어티를 클릭함으로써, 항체-링커 컨쥬게이트를 수득할 수 있다. 다르게는, 독소 및/또는 용해도 증가 모이어티를 화학적 합성에 의해 링커에 부착시킬 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 항체-페이로드 컨쥬게이트가 독소 및 면역자극제를 포함하는, 본 발명에 따른 항체-페이로드 컨쥬게이트에 관한 것이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 문맥에 따라 "면역자극제"라는 용어는 항원에 대한 대상체의 면역 반응을 증가시키는 화합물을 포함한다. 면역자극제의 예는 면역 자극제(immune stimulant) 및 면역 세포 활성화 화합물을 포함한다. 본 발명의 항체-페이로드 컨쥬게이트는 리간드를 인식하고 항원 제시를 향상시키도록 면역 세포를 프로그래밍하는 것을 돕는 면역자극제를 함유할 수 있다. 면역 세포 활성화 화합물은 톨-유사(Toll-like) 수용체(TLR) 작용제를 포함한다. 이러한 작용제는 병원체 관련 분자 패턴(PAMP), 예를 들어 세균-유래 면역조절제(일명 위험 신호)와 같은 감염-모방 조성물, 및 손상 관련 분자 패턴(DAMP), 예컨대 스트레스를 받거나 손상된 세포를 모방한 조성물을 포함한다. TLR 작용제는 핵산 또는 지질 조성물(예를 들어, 모노포스포릴 지질 A(MPLA))을 포함한다. 한 예에서, TLR 작용제는 시토신-구아노신 올리고뉴클레오티드(CpG-ODN)와 같은 TLR9 작용제, PEI-CpG-ODN과 같은 폴리(에틸렌이민)(PEI)-축합 올리고뉴클레오티드(ODN), 또는 이중 스트랜드 데옥시리보핵산(DNA)을 포함한다. 다른 예에서, TLR 작용제는 TLR3 작용제, 예컨대 폴리이노신-폴리시티딜산(폴리(I:C)), PEI-폴리(I:C), 폴리아데닐산-폴리우리딜산(폴리(A:U)), PEI- 폴리(A:U) 또는 이중 스트랜드 리보핵산(RNA)을 포함한다. 다른 예시적인 백신 면역자극 화합물은 지질다당류(LPS), 케모카인/사이토카인, 진균 베타-글루칸(예: 렌티난), 이미퀴모드(imiquimod), CRX-527, 및 OM-174를 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 항체-페이로드 컨쥬게이트가 2개의 상이한 면역자극제를 포함하는, 본 발명에 따른 항체-페이로드 컨쥬게이트에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 적어도 하나의 면역자극제가 TLR 작용제인, 본 발명에 따른 항체-페이로드 컨쥬게이트에 관한 것이다.
본원에 사용된 용어 "TLR 작용제"는 직접 리간드로서 또는 내인성 또는 외인성 발생을 통해 간접적으로 TLR 신호전달 경로를 통해 신호전달 반응을 유발할 수 있는 분자를 지칭한다. TLR 수용체의 작용제 리간드는 (i) 실제 TLR 수용체의 천연 리간드, 또는 TLR 수용체에 결합하고 이에 공동-자극 신호를 유도하는 능력을 보존하는 그의 기능적으로 동등한 변이체, 또는 (ii) TLR 수용체에 대한 작용제 항체, 또는 TLR 수용체, 보다 구체적으로는 상기 수용체의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하고 이 수용체 및 관련 단백질에 의해 조절되는 면역 신호의 일부를 유도할 수 있는 그의 기능적으로 동등한 변이체이다. 결합 특이성은 인간 TLR 수용체에 대한 것일 수 있거나 상이한 종의 인간 수용체와 상동성인 TLR 수용체에 대한 것일 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 항체-페이로드 컨쥬게이트가 방사성 핵종 및 형광 염료를 포함하는, 본 발명에 따른 항체-페이로드 컨쥬게이트에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 항체-페이로드 컨쥬게이트에 관한 것으로, 여기에서 방사성 핵종은 단층촬영, 특히 단일-광자 방출 컴퓨터 단층촬영(SPECT) 또는 양전자 방출 단층촬영(PET)에 사용하기에 적합한 방사성 핵종이며, 형광 염료는 근적외선 형광 염료이다.
본 명세서에서 사용되는 "방사성 핵종"이라는 용어는 방사능 핵종(radioactive nuclide), 방사성 동위원소(radioisotope) 또는 방사능(radioactive) 동위원소와 동일한 의미를 갖는다.
방사성 핵종은 바람직하게는 양전자 방출 단층촬영(PET), 단일 광자 방출 컴퓨터 단층촬영(SPECT), SPECT 및/또는 PET의 하이브리드 또는 이들의 조합과 같은 핵의학 분자 영상화 기술(들)에 의해 검출가능하다. 단일 광자 방출 컴퓨터 단층 촬영(SPECT)은 평면 신티그래피(PS)를 포함한다.
SPECT 및/또는 PET의 하이브리드는 예를 들어 SPECT/CT, PET/CT, PET/IRM 또는 SPECT/IRM이다.
SPECT 및 PET는 대상체의 신체에 도입된 방사성 핵종의 농도(또는 흡수)에 대한 정보를 획득한다. PET는 양전자-방출 방사성 핵종에 의해 간접적으로 방출되는 감마선 쌍을 감지하여 이미지를 생성한다. PET 분석 결과 관심 영역(예컨대, 뇌, 유방, 간 등)에 걸쳐 신체의 일련의 얇은 슬라이스 이미지가 생성된다. 이러한 얇은 슬라이스 이미지는 검사 영역의 3차원 표현으로 조합될 수 있다. SPECT는 PET와 유사하지만 SPECT에 사용되는 방사성 물질은 PET에 사용되는 것보다 붕괴 시간이 길고 이중 감마선 대신 단일 감마선을 방출한다. SPECT 이미지는 PET 이미지보다 덜 민감하고 덜 상세하지만, SPECT 기술은 PET보다 훨씬 저렴하고 입자 가속기의 근접성을 필요로 하지 않는 이점을 제공한다. 실제 임상용 PET는 SPECT보다 더 높은 감도와 더 나은 공간 분해능을 나타내고, 높은 광자 에너지로 인해 정확한 감쇠 보정의 이점을 나타내며; 따라서, PET는 SPECT보다 더 정확한 정량적 데이터를 제공한다. 평면 신티그래피(PS)는 동일한 방사성 핵종을 사용한다는 점에서 SPECT와 유사하다. 그러나, PS는 2D 정보만 생성한다.
SPECT는 국소 방사선 추적자 흡수의 컴퓨터-생성 이미지를 생성시키는 반면, CT는 인체의 X선 밀도에 대한 3D 해부학 이미지를 생성한다. SPECT/CT 결합 영상화는 단일 검사에서 얻은 SPECT의 기능 정보와 CT의 해부학적 정보를 순차적으로 제공한다. CT 데이터는 단일 광자 방출 데이터의 신속한 최적 감쇠 보정에도 사용된다. 비정상적 및/또는 생리학적 추적자 흡수 영역을 정확하게 파악함으로써, SPECT/CT는 감도와 특이성을 향상시킬 뿐만 아니라, 정확한 선량계측 추정을 달성하고 중재 절차를 안내하거나 외부 빔 방사선 요법의 표적 부피를 더 잘 한정하는데 도움이 될 수 있다. 단일 광자 방출 방사선 추적자를 사용한 감마 카메라 영상화는 대부분의 절차를 나타낸다.
방사성 핵종은 테크네튬-99m(99mTc), 갈륨-67(67Ga), 갈륨-68(68Ga), 이트륨-90(90Y), 인듐-111(111In), 레늄-186(186Re), 플루오르-18(18F), 구리-64(64Cu), 테르븀-149(149Tb) 또는 탈륨-201(201TI)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 방사성 핵종은 분자에 포함되거나 킬레이트제에 결합될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따라, 상기 기재내용에 따른 링커, 상기 기재내용에 따른 링커-페이로드 구성물, 및/또는 상기 기재내용에 따른 항체-페이로드 컨쥬게이트를 포함하는 약학 조성물이 제공된다.
본 발명의 또 다른 양태에 따라, 상기 기재내용에 따른 항체-페이로드 컨쥬게이트, 또는 상기 기재내용에 따른 약학 조성물, 및 하나 이상의 추가적인 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 의약품이 제공된다.
약학적으로 허용되는 담체는 활성 성분 이외의 약학 제형의 성분으로서 대상체에게 무독성인 성분을 지칭한다. 약학적으로 허용되는 담체는 완충액, 부형제, 안정화제 또는 보존제를 포함하지만, 이들로 한정되지는 않는다.
본원에 기재된 항체-페이로드 컨쥬게이트의 약학 제형은, 원하는 순도를 갖는 이러한 컨쥬게이트를 하나 이상의 임의적인 약학적으로 허용되는 담체와 혼합함으로써 동결건조 제형 또는 수용액 형태로 제조된다(Flemington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Oslo, A. Ed. (1980)). 약학적으로 허용되는 담체는 일반적으로 사용되는 용량 및 농도에서 수용자에게 무독성이며, 하기를 포함하지만 이들로 국한되지는 않는다: 포스페이트, 시트레이트 및 기타 유기산과 같은 완충액; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 산화방지제; 보존제(예컨대, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤잘코늄 클로라이드; 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역 글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 라이신과 같은 아미노산; 단당류, 이당류, 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 비롯한 기타 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트제; 슈크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨과 같은 당류; 나트륨과 같은 염-형성 대이온; 금속 착체(예를 들어, Zn 단백질 착체); 및/또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 비이온성 계면활성제. 본 명세서에서 예시적인 약학적으로 허용되는 담체는 간질 약물 분산제, 예컨대 가용성 중성-활성 히알루로니다제 당단백질(sHASEGP), 예를 들어 인간 가용성 PH-20 히알루로니다제 당단백질, 예컨대 rHuPH20[하일레넥스(HYLENEX)®, 박스터 인터내셔널, 인코포레이티드(Baxter International, Inc.)]을 추가로 포함한다. rHuPH20을 포함하는 특정한 예시적인 sHASEGP 및 사용 방법은 미국 특허 공보 제 2005/0260186 호 및 제 2006/0104968 호에 기재되어 있다. 한 양태에서는, sHASEGP가 콘드로이티나제와 같은 하나 이상의 추가적인 글리코사미노글리카나제와 조합된다.
한 실시양태에서, 본 발명은 치료 및/또는 진단에 사용하기 위한, 본 발명에 따른 항체-페이로드 컨쥬게이트, 본 발명에 따른 약학 조성물 또는 본 발명에 따른 의약품에 관한 것이다.
즉, 본 발명의 항체-페이로드 컨쥬게이트는 대상체의 치료, 또는 대상체의 질병 또는 상태 진단에 사용될 수 있다. 개체 또는 대상체는 포유류이다. 포유류에는 가축(예: 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류(예: 인간 및 원숭이와 같은 비인간 영장류), 토끼 및 설치류(예: 마우스 및 래트)가 포함되지만, 이들로 국한되지는 않는다. 특정 실시양태에서, 개체 또는 대상체는 인간이다.
본 발명의 또 다른 양태에 따라, 상기 기재내용에 따른 약학 조성물 또는 상기 기재내용에 따른 제품은 신생물성 질환, 신경계 질환, 자가면역 질환, 염증성 질환 또는 감염성 질환을 앓고 있고/있거나, 이러한 질환이 발병될 위험이 있고/있거나, 이러한 질환으로 진단을 받은 환자의 치료 또는 예방, 또는 이러한 상태의 예방을 위해(의약 제조용) 제공된다.
바람직하게는, 본 발명은 신생물성 질환을 앓고 있는 환자의 치료에 사용하기 위한, 본 발명에 따른 항체-페이로드 컨쥬게이트, 본 발명에 따른 약학 조성물 또는 본 발명에 따른 의약품에 관한 것이다.
본원에 사용된 용어 "신생물성 질환"은 제어되지 않는 비정상적인 세포 성장을 특징으로 하는 상태를 지칭한다. 신생물성 질환에는 암이 포함된다. 암의 예는 암종, 림프종, 모세포종, 육종 및 백혈병을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 이러한 암의 보다 구체적인 예는 유방암, 전립선암, 결장암, 편평세포암, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 난소암(ovarian cancer), 자궁경부암(cervical cancer), 위장관암, 췌장암, 교모세포종, 간암(liver cancer), 방광암, 간암(hepatoma), 결장직장암, 자궁경부암(uterine cervical cancer), 자궁내막암, 침샘암, 신장암, 외음부암, 갑상선암, 간암(hepatic carcinoma), 피부암, 흑색종, 뇌암, 난소암, 신경모세포종, 골수종, 각종 두경부암, 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 유잉(Ewing) 육종 및 말초 신경 표피종을 포함한다. 바람직한 암은 간암, 림프종, 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 유잉 육종 및 말초 신경 표피종을 포함한다.
즉, 본 발명의 항체-페이로드 컨쥬게이트는 바람직하게는 암 치료에 사용된다. 이와 같이, 특정 실시양태에서, 항체-페이로드 컨쥬게이트는 종양 세포 상에 존재하는 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다. 특정 실시양태에서, 항원은 종양 세포 표면 상의 항원이다. 특정 실시양태에서, 종양 세포 표면 상의 항원은 항체-페이로드 컨쥬게이트가 항원에 결합할 때 항체-페이로드 컨쥬게이트와 함께 세포 내로 내재화된다.
항체-페이로드 컨쥬게이트가 암 치료에 사용되는 경우, 항체-페이로드 컨쥬게이트가, 항체-약물 컨쥬게이트가 결합하는 종양 세포를 사멸시키거나 증식을 억제할 가능성이 있는 하나 이상의 페이로드를 포함하는 것이 바람직하다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 페이로드는 항체-페이로드 컨쥬게이트가 종양 세포 내로 내재화된 후에 그의 세포독성 활성을 나타낸다. 특정 실시양태에서는, 적어도 하나의 페이로드가 독소이다.
본 발명의 또 다른 양태에 따라, 상기 기재내용에 따른 항체-페이로드 컨쥬게이트, 상기 기재내용에 따른 약학 조성물, 또는 상기 기재내용에 따른 제품을, 신생물성 질환의 치료 또는 예방이 필요한 환자에게 투여함을 포함하는, 신생물성 질환의 치료 또는 예방 방법이 제공된다.
염증성 질환은 자가면역 질환일 수 있다. 감염성 질환은 세균 감염 또는 바이러스 감염일 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 수술 전, 수술 중 및/또는 수술 후 영상화에 사용하기 위한, 본 발명에 따른 항체-페이로드 컨쥬게이트, 본 발명에 따른 약학 조성물 또는 본 발명에 따른 의약품에 관한 것이다.
즉, 본 발명에 따른 항체-페이로드 컨쥬게이트는 영상화에 사용될 수 있다. 이를 위해, 항체-페이로드 컨쥬게이트가 특정 표적 분자, 세포 또는 조직에 결합하는 동안 이들이 가시화될 수 있다. 특정 페이로드를 가시화하기 위한 상이한 기술이 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, 페이로드가 방사성 핵종인 경우, 항체-페이로드 컨쥬게이트가 결합하는 분자, 세포 또는 조직은 PET 또는 SPECT에 의해 가시화될 수 있다. 페이로드가 형광 염료인 경우, 항체-페이로드 컨쥬게이트가 결합하는 분자, 세포 또는 조직은 형광 영상화에 의해 가시화될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체-페이로드 컨쥬게이트는 2개의 상이한 페이로드, 예를 들어 방사성 핵종 및 형광 염료를 포함한다. 이 경우, 항체-페이로드 컨쥬게이트가 결합하는 분자, 세포 또는 조직은 2가지 상이한 및/또는 상보적인 영상화 기술, 예를 들어 PET/SPECT 및 형광 영상화를 이용하여 가시화될 수 있다.
항체-페이로드 컨쥬게이트는 수술 전 및/또는 수술 후 영상화에 사용될 수 있다.
수술 전 영상화는 특정 질환이나 상태를 진단할 때 특정 표적 분자, 세포 또는 조직을 가시적으로 만들고 임의적으로는 수술에 대한 지침을 제공하기 위해 수술 전에 수행될 수 있는 모든 영상화 기술을 포함한다. 수술 전 영상화는 종양 상의 항원에 특이적으로 결합하고 방사성 핵종을 포함하는 페이로드에 컨쥬게이션된 항체를 포함하는 항체-페이로드 컨쥬게이트를 사용함으로써 수술을 수행하기 전에 PET 또는 SPECT에 의해 종양을 가시화하는 단계를 포함할 수 있다.
수술 중 영상화는 특정 표적 분자, 세포 또는 조직을 가시화하여 수술에 대한 지침을 제공하기 위해 수술 중에 수행될 수 있는 모든 영상화 기술을 포함한다. 특정 실시양태에서, 근적외선 형광 염료를 포함하는 항체-페이로드 컨쥬게이트를 사용하여 근적외선 형광 영상화에 의해 수술 동안 종양을 가시화할 수 있다. 수술 중 영상화를 통해 외과의는 수술 중 특정 조직, 예를 들어 종양 조직을 식별할 수 있으므로, 종양 조직을 완전히 제거할 수 있다.
수술 후 영상화는 특정 표적 분자, 세포 또는 조직을 가시화하고 수술 결과를 평가하기 위해 수술 후에 수행할 수 있는 모든 영상화 기술을 포함한다. 수술 후 영상화는 수술 전 수술과 유사하게 수행될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 2개 이상의 상이한 페이로드를 포함하는 항체-페이로드 컨쥬게이트에 관한 것이다. 예를 들어, 항체-페이로드 컨쥬게이트는 방사성 핵종 및 근적외선 형광 염료를 포함할 수 있다. 이러한 항체-페이로드 컨쥬게이트는 PET/SPECT에 의한 영상화 및 근적외선 형광 영상화에 사용될 수 있다. 이러한 항체의 장점은 PET 또는 SPECT에 의해 수술 전후의 종양과 같은 표적 조직을 가시화하는데 사용될 수 있다는 것이다. 동시에 근형광 적외선 영상화로 수술 중 종양을 가시화할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 수술 중 영상화-유도 암 수술에 사용하기 위한, 본 발명에 따른 항체-페이로드 컨쥬게이트, 본 발명에 따른 약학 조성물 또는 본 발명에 따른 의약품에 관한 것이다.
상기 언급된 바와 같이, 본 발명의 항체-페이로드 컨쥬게이트는 표적 분자, 세포 또는 조직을 가시화하고 수술 동안 외과의 또는 로봇을 유도하는데 사용될 수 있다. 즉, 항체-페이로드 컨쥬게이트는 예를 들어 근적외선 영상화에 의해 수술 동안 종양 조직을 가시화하고 종양 조직의 완전한 제거를 허용하는데 사용될 수 있다.
상기 컨쥬게이트 또는 제품은 질환을 효율적으로 치료하는 양 또는 투여량으로 인간 또는 동물 대상체에게 투여된다. 다르게는, 상응하는 치료 방법이 제공된다.
본 발명의 항체-페이로드 컨쥬게이트는 비경구, 폐내 및 비강내, 또한 요구되는 경우 국소 치료를 위해 병변내, 자궁내 또는 방광내 투여를 비롯한 임의의 적합한 수단에 의해 투여될 수 있다. 비경구 주입에는 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여가 포함된다. 투여는 임의의 적절한 경로에 의해, 예를 들어 부분적으로 투여가 단기인지 장기인지에 따라 정맥 주사 또는 피하 주사와 같은 주사에 의해 이루어질 수 있다. 단일 투여 또는 다양한 시점에 걸친 다중 투여, 일시(bolus) 투여 및 펄스 주입을 비롯한(이들로 한정되지는 않음) 다양한 투여 스케쥴이 본원에서 고려된다.
본 발명의 항체-페이로드 컨쥬게이트는 본 발명에 일관된 방식으로 제형화, 투약 및 투여될 것이며, 우수한 의료 관행과 일관된 방식으로 제형화, 투약 및 투여될 것이다. 이 맥락에서 고려해야 할 요소에는 치료 중인 특정 장애, 치료 중인 특정 포유동물, 개별 환자의 임상 상태, 장애의 원인, 약제 전달 부위, 투여 방법, 투여 일정, 및 의료 종사자에게 알려져 있는 기타 요인이 포함된다. 항체-페이로드 컨쥬게이트는 문제가 되는 장애를 예방하거나 치료하기 위해 현재 사용되는 하나 이상의 약제와 함께 제형화될 필요는 없지만 임의적으로는 그렇게 제형화된다. 이러한 다른 약제의 유효량은 제형에 존재하는 항체-페이로드 컨쥬게이트의 양, 장애 또는 치료의 유형, 및 상기 논의된 기타 요인에 따라 달라진다. 이들은 일반적으로 본원에 기재된 것과 동일한 투여량 및 투여 경로로, 또는 본원에 기재된 투여량의 약 1 내지 99%로, 또는 경험적으로/임상적으로 적절한 것으로 결정된 임의의 투여량 및 임의의 경로에 의해 사용된다.
질병의 예방 또는 치료를 위해, 본 발명의 항체-페이로드 컨쥬게이트(단독으로 또는 하나 이상의 다른 추가적인 치료제와 조합하여 사용되는 경우)의 적절한 투여량은 치료할 질환의 유형, 항체-페이로드 컨쥬게이트의 유형, 질병의 중증도 및 경과, 항체-페이로드 컨쥬게이트가 예방 또는 치료 목적으로 투여되는지의 여부, 이전 요법, 환자의 임상 병력 및 항체-페이로드 컨쥬게이트에 대한 반응, 및 주치의의 재량에 따라 달라진다. 항체-페이로드 컨쥬게이트는 한번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 환자에게 적합하게 투여된다.
하기 표 5는 본 발명의 맥락에서 사용될 수 있는 상이한 링커 및 이들의 서열 번호를 나타낸다. 의심의 여지를 피하기 위해, 전자 WIPO ST 25 서열 목록과 불일치하는 경우에는, 이 표의 서열이 올바른 것으로 간주된다.
여기에 표시된 일부 링커 펩티드에서 C-말단의 모이어티가 단순히 N3으로 지칭됨을 이해하는 것이 중요하다. 그러나, 이는 Lys(N3)의 약자로 이해되어야 한다. 예를 들어, GARK(N3) 또는 GlyAlaArgLys(N3)는 실제로 GARK1을 의미한다(K1=Lys(N3)).
본원에 제시된 상이한 링커 펩티드에서, C-말단은 달리 표시된다고 하더라도 보호될 수 있거나 보호되지 않을 수 있음을 이해하는 것이 또한 중요하다.
보호는 전자의 아미드화에 의해 달성될 수 있다. 본 발명의 맥락에서는, 보호된 링커 펩티드와 보호되지 않은 링커 펩티드 모두가 포함된다.
예를 들어, GARK(N3)는 C-말단이 보호되거나 보호되지 않는 두 가지 변이체를 포함한다. 다른 한편으로, 예를 들어 GARK(N3)-COOH는 보호되지 않는, 즉 보호되지 않은 C 말단을 갖는 펩티드를 명시적으로 규정한다.
하기 표 5는 본 발명의 맥락에서 포함되고 사용하기에 적합한 일부 링커를 보여준다:
| 3글자 코드 | 1글자 코드 | 연결 모이어티 B | 펩티드 길이 | 양성 아미노산 (Lys/Arg/His)의 수 |
| GlyAlaArgLys(N3) | GARK1, K1=Lys(N3) | Lys(N3) | 4 | 1 |
| GlyAlaArgLys(N3)Lys(테트라진) | GARK1K2, K1=Lys(N3) 및 K2=Lys(테트라진) | Lys(N3) 및 Lys(테트라진) |
5 | 1 |
| GlyAlaArgLys(N3)Cys | GARK1C, K1=Lys(N3) | Lys(N3), Cys-SH | 5 | 1 |
| GlyGlyAlaArgLys(N3)Lys(N3) | GGARK1K2, K1,2=Lys(N3) | Lys(N3) | 6 | 1 |
| GlyGlyAlaArgLys(N3)ArgLys(N3) | GGARK1RK2, K1,2=Lys(N3) | Lys(N3) | 7 | 2 |
| GlyAlaArgXaa(N3) | GARX, X=Xaa(N3), Xaa는 4-아지도-l.호모알라닌임 | Xaa(N3) | 4 | 1 |
| GlyAlaArg[PEG]3(N3) | GAR[PEG]3N3, [PEG]3=트리에틸렌글리콜 | (N3) | 3 | 1 |
| GlyAlaArgCys | GARC | Cys-SH | 4 | 1 |
| GlyGlyAlaArgLys(PEG)nArgLys(N3) | GGARK(PEG)nRK1, K1=Lys(N3) | Lys(N3) | 7 | 2 |
| GlyβAlaArgLys(N3) | GβARK1, K1=Lys(N3) | Lys(N3) | 4 | 1 |
| GlyAla호모ArgLys(N3) | GAhRK1, K1=Lys(N3) | Lys(N3) | 4 | 1 |
| GlyβAla호모ArgLys(N3) | GβAhRK1, K1=Lys(N3) | Lys(N3) | 4 | 1 |
| GlyGlyAlaArgArg-B | GGARR-B | N/A | 5 | 2 |
| GlyArgAlaLys(N3) | GRAK1, K1=Lys(N3) | Lys(N3) | 4 | 1 |
| GlyArgAlaCys | GRAC | Cys-SH | 4 | 1 |
| GlyGlyArgLys(N3) | GGRK1, K1=Lys(N3) | Lys(N3) | 4 | 1 |
| GlyArgLys(N3) | GRK1, K1=Lys(N3) | Lys(N3) | 3 | 1 |
| GlyGlyArgLys(N3)Arg | GGRK1R, K1=Lys(N3) | Lys(N3) | 4 | 1 |
| GlyGlyLys(N3)ArgCys | GGK1RC, K1=Lys(N3) | Lys(N3), Cys-SH |
5 | 1 |
| GlyGlyArgArgLys(N3) | GGRRK1, K1=Lys(N3) | Lys(N3) | 5 | 2 |
| GlyGlyArgLys(N3)Arg | GGRK1R, K1=Lys(N3) | Lys(N3) | 5 | 2 |
| GlyAlaHisLys(N3) | GAHK1, K1=Lys(N3) | Lys(N3) | 4 | 1 |
| GlyGlyHisLys(N3) | GGHK1, K1=Lys(N3) | Lys(N3) | 4 | 1 |
| GlyCys | GC | Cys-SH | 2 | 0 |
| GlyGlyArgCys | GGRC | Cys-SH | 4 | 1 |
| GlyArgCys | GRC | Cys-SH | 3 | 1 |
| GlyGlyArgLys(N3) | GGRK1, K1=Lys(N3) | Lys(N3) | 4 | 1 |
| GlyGlyAlaLysLys(N3) | GGAKK1, K1=Lys(N3) | Lys(N3) | 5 | 1 |
실시예
본 발명이 도면 및 전술한 설명에서 상세하게 예시되고 설명되었지만, 그러한 예시 및 설명은 서술적이거나 예시적이고 한정적이지 않는 것으로 생각되어야 하며; 본 발명은 개시된 실시양태로 제한되지 않는다. 개시된 실시양태에 대한 다른 변형은 도면, 상세한 설명 및 첨부된 청구범위의 연구로부터 청구된 발명을 실시함에 있어 당업자에 의해 이해되고 실행될 수 있다. 청구항에서, "포함하는"이라는 단어는 다른 요소나 단계를 배제하지 않으며, 단수형은 복수를 배제하지 않는다. 특정 수단이 서로 다른 종속항에 인용되어 있다는 단순한 사실이 이러한 수단의 조합이 유리하게 사용될 수 없다는 것을 나타내지는 않다. 청구범위의 참조 부호는 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
본원에 개시된 모든 아미노산 서열은 N-말단에서 C-말단으로 표시되며; 본원에 개시된 모든 핵산 서열은 5'->3'으로 표시된다.
실시예 1: 컨쥬게이션 효율
펩티드는 받은 상태 그대로 사용하고 제조업체의 지시에 따라 적절한 스톡 농도(예: 25mM)로 용해시켰으며, 분취량을 준비하고 -20℃에서 보관하였다. IgG 하위 분류의 두 항체(항체 1: 항 Her2 IgG1, 항체 2: 항 CD38 IgG1)는 다음과 같이 변형시켰다: 1mg/mL의 탈당화되지 않은 항체(약 6.67μM)를 80몰 당량의 펩티드 링커(즉, 약 533μM), 6U/mL MTG 및 완충액과 혼합하였다. 반응 혼합물을 37℃에서 20시간 동안 배양한 다음 환원 조건 하에 LC-MS 분석을 수행하였다.
하기 표 6은 다른 링커와 비교한 본 발명에 따른 링커((*)로 표시함)의 컨쥬게이션 효율을 나타낸다:
| 링커(1글자 코드) | pH6 | pH7.6 | pH8.5 |
| GARK(N3)* | 0 | 77.3 | 34.2 |
| AARK(N3) | 0 | 10.7 | 8.1 |
| SARK(N3) | 0 | 5.2 | 3.6 |
| AGRK(N3) | 3.6 | 22.3 | 14.7 |
N-말단 1차 아민을 제외하고는 다른 1차 아민이 없는 N-말단 Gly 잔기를 포함하는 펩티드가, 다른 펩티드가 마찬가지로 N-말단 1차 아민(그러나 Gly 잔기에는 포함되지 않음)을 포함함에도 불구하고, 당화된 항체의 Q295 잔기와 단연코 최고의 컨쥬게이션 효율을 갖는다는 것을 분명히 볼 수 있다.
실시예 2: 컨쥬게이션 효율
펩티드는 받은 상태 그대로 사용하고 제조업체의 지시에 따라 적절한 스톡 농도(예: 25mM)로 용해시켰으며, 분취량을 준비하고 -20℃에서 보관하였다. IgG 하위 분류의 두 항체(항체 1: 항 Her2 IgG1, 항체 2: 항 CD38 IgG1)를 다음과 같이 변형시켰다: 1mg/mL의 탈당화되지 않은 항체(약 6.67μM)를 80몰 당량의 펩티드 링커(즉, 약 533μM), 6U/mL MTG 및 완충액과 혼합하였다. 반응 혼합물을 37℃에서 20시간 동안 배양한 다음 환원 조건 하에 LC-MS 분석을 수행하였다.
하기 표 7은 본 발명에 따른 링커의 컨쥬게이션 효율을 나타낸다((*로 표시됨) 대 다른 링커 ßAGARK(N3)가 도 19에 도시된다(ßA는 ß-알라닌을 나타냄에 유의)).
| 링커(1글자 코드) | 완충액 1 (pH 6) |
완충액 2 (pH 7.6) |
완충액 3 (pH 8.5) |
완충액 4 (pH 7.6) |
완충액 5 (pH 7.6) |
| βAGARK(N3) | 10 | 57 | 0 | 67 | 63 |
| GGARK(N3)* | 50 | 84 | 0 | 86 | 85 |
N-말단 1차 아민을 제외한 다른 1차 아민이 없는 N-말단 Gly 잔기를 포함하는 펩티드가, N-말단 ß-Ala 잔기를 갖는 구조적으로 유사한 링커와 비교하여, 당화된 항체에서 Q295 잔기와의 컨쥬게이션 효율이 훨씬 더 우수하다는 것이 명백히 보인다.
실시예 3: 세포 독성 분석
세포주 및 배양: MDA-MB-231, 및 SK-BR-3를 ATCC(American Type Culture Collection)에서 얻었고, 표준 세포 배양 프로토콜에 따라 RPMI-1640에서 배양하였다.
SK-BR-3은 1970년에 메모리얼 슬로언-케터링 캔서 센터(Memorial Sloan-Kettering Cancer Center)에 의해 단리된 유방암 세포주로, 특히 HER2 표적화와 관련하여 치료 연구에 사용된다. MDA-MB231 세포는 "기저(basal)" 유형의 인간 유방 선암종으로부터 유래되고, 삼중 음성(ER, PR 및 HER2 음성)이다. 애드세트리스(Adcetris)(브렌툭시맙 베도틴; Brentuximab Vedotin)는 CD30을 표적으로 하는 시판중인 항체 약물 컨쥬게이트이고, 따라서 CD30을 발현하지 않는 세포, 즉 MDA-MB-231, 및 SK-BR-3에 대해 활성이 없을 것으로 예상된다. 캐싸일라(Kadcyla)(트라스투주맙 엠탄신; Trastuzumab emtansine)은 Her2를 표적으로 하는 시판중인 항체 약물 컨쥬게이트이고, 따라서 Her2를 발현하는 세포(예를 들어, SK-BR-3)에 대해 활성이 있을 것으로 예상되며, Her2를 발현하지 않는 세포(예를 들어, MDA-MB-231)에 대해 활성이 없을 것으로 예상된다. p684 및 p579는 N-말단 글리신이 있는 링커(GARK(N3)(P684) 및 GGARK(N3)(P579))를 사용하여 본원에 명시된 링커 기술로 생산된 항체 약물 컨쥬게이트이다. 항체-페이로드 컨쥬게이트를 생성시키기 위해, DBCO 기(아래 참조)에 연결된 May(메이탄신) 분자를 링커의 아지드기에 클릭하였다. 두 컨쥬게이트 모두 탈당화되지 않은 항체를 사용하고 약물 대 항체 비가 2인 Her2를 표적으로 하여 2개의 May(메이탄신) 분자를 보유한다. 헤르셉틴(Herceptin)은 Her2를 표적으로 하는 탈당화되지 않은 비컨쥬게이션 항체이다.
세포 독성 분석: 세포를 웰 당 10,000개 세포의 밀도로 96웰 플레이트(흰 벽, 투명하고 평평한 바닥 플레이트)에 접종하고, 37℃ 및 5% CO2에서 하룻밤동안 배양하였다. 모노클로날 항체(mAb)와 항체-약물 컨쥬게이트(ADC)를 배지에서 10㎍/mL(66.7nM)의 출발 농도에서 1:4로 연속 희석하였다. 세포로부터 배지를 제거하고, mAb/ADC 희석액을 첨가하였다. 배지로 처리된 세포는 100% 생존력에 대한 기준으로만 사용하였다. 세포를 37℃ 및 5% CO2에서 3일동안 항체와 함께 배양하였다.
세포 생존력은 제조업체의 지침에 따라 본원에서 간략하게 설명된 바와 같이 셀 타이터-글로(Cell Titer-Glo)®[프로메가(Promega)]에 의해 평가되었다. 플레이트를 30분동안 실온으로 평형화시켰다. 셀 타이터-글로® 시약은 셀 타이터-글로 완충액을 기질에 첨가하여 제조하였다. 셀 타이터-글로® 시약을 웰당 50μL로 첨가하고, 2분동안 진탕시키면서 실온에서 배양한 후, 실온에서 30분동안 추가로 배양하였다. 누적 시간(integration time) 1초를 사용하여 퍼킨 엘머(Perkin Elmer) 2030 멀티라벨 리더 빅터(Multilabel Reader Victor)TM X3 플레이트 판독기에서 발광을 검출하였다.
데이터는 다음과 같이 처리되었다: 배지로만 처리된 웰의 발광 값을 평균화하고, 100% 생존력에 대한 기준으로 사용하였다. mAb/ADC 처리된 웰의 % 생존력은 하기 수학식을 사용하여 계산되었다:
mAb/ADC 농도의 로그 대 정규화된 % 생존력을 플롯팅하고, 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 7.00를 사용하여 데이터를 핏팅하였다.
도 18에서 볼 수 있는 바와 같이, P684와 P579는 캐싸일라와 동일한 SK-BR3 세포에 대한 효력을 갖는다. 따라서, 새로운 링커 기술에 의해 제공되는 이점(제조 용이성, 부위 특이성, 안정한 화학량론, 항체의 탈당화 불필요)은 세포 독성과 관련하여 어떠한 단점도 갖지 않는다. P684 및 P579의 DAR이 2인 반면 캐싸일라의 평균 DAR이 3.53±0.05인 바, 표적 세포에 더 많은 독소를 전달할 수 있기 때문에, 이는 훨씬 더 중요하다. 다음 표는 효력(IC50)을 보여준다:
실시예 4: 컨쥬게이션 효율
펩티드를 받은 상태 그대로 사용하고, 제조업체 지침에 따라 적절한 스톡 농도(예: 25mM)로 용해시켰으며, 분취량을 준비하고 -20℃에서 보관하였다. 항-Her2 IgG1 항체(트라스투주맙)를 다음과 같이 변형시켰다: 1mg/mL의 탈당화되지 않은 항체(약 6.67μM)를 80몰 당량의 펩티드 링커(즉, 약 533μM), 6U/mL MTG 및 완충액과 혼합하였다. 반응 혼합물을 37℃에서 20시간 동안 배양한 다음 환원 조건 하에 LC-MS 분석을 수행하였다.
하기 표 8은 본 발명의 범위에 속하는 다양한 링커의 컨쥬게이션 효율(CE %)을 나타낸다.
| 서열 | 전하 | C-말단 | 구조식 | MW | CE % |
| GDC | 음 | 아미드화 | C9H16N4O5S1 | 292,31 | 9,7 |
| GRCD | 중성 | 아미드화 | C15H28N8O6S1 | 448,49 | 11,2 |
| GRDC | 중성 | 아미드화 | C15H28N8O6S1 | 448,49 | 4,4 |
| GGDC | 음 | 아미드화 | C11H19N5O6S1 | 349,36 | 25,1 |
| GGCD | 음 | 아미드화 | C11H19N5O6S1 | 349,36 | 49,1 |
| GGEC | 음 | 아미드화 | C12H21N5O6S1 | 363,39 | 23,7 |
| GGK(N3)D | 음 | 아미드화 | C14H24N8O6 | 400,4 | 68,4 |
| GGRCD | 중성 | 아미드화 | C17H31N9O7S1 | 505,54 | 78,8 |
| GGGDC | 음 | 아미드화 | C13H22N6O7S1 | 406,41 | 35,6 |
| GC | 중성 | 아미드화 | C5H10N2O3S1 | 178,21 | 92 |
| GRC | 양 | 아미드화 | C11H23N7O3S1 | 333,41 | 51,7 |
| GGRC | 양 | 아미드화 | C13H26N8O4S1 | 390,46 | 91,4 |
| GRAC | 양 | 아미드화 | C14H28N8O4S1 | 404,49 | 47,7 |
| GARC | 양 | 아미드화 | C14H28N8O4S1 | 404,49 | 88,5 |
| GGHK(N3) | 양 | 아미드화 | C16H26N10O4 | 422,45 | 16,1 |
| GGK(N3)RC | 양 | 아미드화 | C19H36N12O5S1 | 544,63 | 79,5 |
| GARK(N3) | 양 | 아미드화 | C19H37N9O4 | 455,56 | 77,3 |
| AARK(N3) | 양 | 아미드화 | C20H39N9O4 | 469,59 | 10,7 |
| SARK(N3) | 양 | 아미드화 | C20H39N9O5 | 485,59 | 5,2 |
| AGRK(N3) | 양 | 아미드화 | C19H37N9O4 | 455,56 | 22,3 |
| βAGARK(N3) | 양 | 아미드화 | C20H38N12O5 | 526,6 | 57 |
| GGARK(N3) | 양 | 아미드화 | C19H36N12O5 | 512,58 | 84 |
참조문헌
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면책 공고
본 명세서에 표시된 일부 링커 펩티드에서 C-말단의 모이어티는 단순히 N3으로 지칭됨을 이해하는 것이 중요하다. 그러나, 이것은 Lys(N3)의 약자로 이해되어야 한다. 예를 들어, GAR(N3)은 실제로 K1=Lys(N3)인 GARK1 또는 GlyAlaArgLys(N3)를 의미한다.
본원에 도시된 상이한 링커 펩티드에서, C-말단은 달리 표시되더라도 보호될 수 있거나 보호되지 않을 수 있음을 이해하는 것이 또한 중요하다. 보호는 아미드화에 의해 달성될 수 있다. 본 발명의 맥락에서는, 보호된 링커 펩티드와 보호되지 않은 링커 펩티드 모두가 포함된다. 예를 들어, GARK(N3)는 실제로 C-말단이 보호되거나 보호되지 않는 두 가지 변이체를 포함한다.
SEQUENCE LISTING
<110> Paul Scherrer Institut
<120> Transglutaminase conjugation method with a glycine based linker
<130> AD1457 PCT BS
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<170> BiSSAP 1.3.6
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<223> Xaa = Homoarginine
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<223> Xaa is 6-azido-L-lysine (Lys(N3))
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Gly Gly Xaa Arg Cys
1 5
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<223> Xaa is 6-azido-L-lysine (Lys(N3))
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Gly Gly Arg Arg Xaa
1 5
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<223> Xaa is 6-azido-L-lysine (Lys(N3))
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Gly Gly Arg Xaa Arg
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<223> Xaa is 6-azido-L-lysine (Lys(N3))
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Gly Gly His Xaa
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Gly Arg Cys
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<223> Xaa is 6-azido-L-lysine (Lys(N3))
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Gly Gly Arg Xaa
1
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Gly Gly Ala Lys Xaa
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<212> PRT
<213> Streptoverticillium ladakanum
<400> 27
Met His Arg Arg Ile His Ala Val Gly Gln Ala Arg Pro Pro Pro Thr
1 5 10 15
Met Ala Arg Gly Lys Glu Thr Lys Ser Tyr Ala Glu Thr Tyr Arg Leu
20 25 30
Thr Ala Asp Asp Val Ala Asn Ile Asn Ala Leu Asn Glu Ser Ala Pro
35 40 45
Ala Ala Ser Ser Ala Gly Pro Ser Phe Arg Ala Pro Asp Ser Asp Asp
50 55 60
Arg Val Thr Pro Pro Ala Glu Pro Leu Asp Arg Met Pro Asp Pro Tyr
65 70 75 80
Arg Pro Ser Tyr Gly Arg Ala Glu Thr Val Val Asn Asn Tyr Ile Arg
85 90 95
Lys Trp Gln Gln Val Tyr Ser His Arg Asp Gly Arg Lys Gln Gln Met
100 105 110
Thr Glu Glu Gln Arg Glu Trp Leu Ser Tyr Gly Cys Val Gly Val Thr
115 120 125
Trp Val Asn Ser Gly Gln Tyr Pro Thr Asn Arg Leu Ala Phe Ala Ser
130 135 140
Phe Asp Glu Asp Arg Phe Lys Asn Glu Leu Lys Asn Gly Arg Pro Arg
145 150 155 160
Ser Gly Glu Thr Arg Ala Glu Phe Glu Gly Arg Val Ala Lys Glu Ser
165 170 175
Phe Asp Glu Glu Lys Gly Phe Gln Arg Ala Arg Glu Val Ala Ser Val
180 185 190
Met Asn Arg Ala Leu Glu Asn Ala His Asp Glu Ser Ala Tyr Leu Asp
195 200 205
Asn Leu Lys Lys Glu Leu Ala Asn Gly Asn Asp Ala Leu Arg Asn Glu
210 215 220
Asp Ala Arg Ser Pro Phe Tyr Ser Ala Leu Arg Asn Thr Pro Ser Phe
225 230 235 240
Lys Glu Arg Asn Gly Gly Asn His Asp Pro Ser Arg Met Lys Ala Val
245 250 255
Ile Tyr Ser Lys His Phe Trp Ser Gly Gln Asp Arg Ser Ser Ser Ala
260 265 270
Asp Lys Arg Lys Tyr Gly Asp Pro Asp Ala Phe Arg Ser Ala Pro Gly
275 280 285
Thr Gly Leu Val Asp Met Ser Arg Asp Arg Asn Ile Pro Arg Ser Pro
290 295 300
Thr Ser Pro Gly Glu Gly Phe Val Asn Phe Asp Tyr Gly Trp Phe Gly
305 310 315 320
Ala Gln Thr Glu Ala Asp Ala Asp Lys Thr Val Trp Thr His Gly Asn
325 330 335
His Tyr His Ala Pro Asn Gly Ser Leu Gly Cys His Ala Cys Leu Thr
340 345 350
Arg Ala Ser Ser Ala Thr Gly Ser Glu Gly Tyr Ser Asp Phe Asp Arg
355 360 365
Gly Glu Pro Tyr Val Val Ser Pro Ser Pro Ser Pro Arg Met Leu Glu
370 375 380
His Arg Pro Arg Gln Gly Lys Ala Gly Leu Ala
385 390 395
<210> 28
<211> 335
<212> PRT
<213> Streptomyces mobaraensis
<400> 28
Phe Arg Ala Pro Asp Ser Asp Glu Arg Val Thr Pro Pro Ala Glu Pro
1 5 10 15
Leu Asp Arg Met Pro Asp Pro Tyr Arg Pro Ser Tyr Gly Arg Ala Glu
20 25 30
Thr Ile Val Asn Asn Tyr Ile Arg Lys Trp Gln Gln Val Tyr Ser His
35 40 45
Arg Asp Gly Arg Lys Gln Gln Met Thr Glu Glu Gln Arg Glu Trp Leu
50 55 60
Ser Tyr Gly Cys Val Gly Val Thr Trp Val Asn Ser Gly Gln Tyr Pro
65 70 75 80
Thr Asn Arg Leu Ala Phe Ala Phe Phe Asp Glu Asp Lys Tyr Lys Asn
85 90 95
Glu Leu Lys Asn Gly Arg Pro Arg Ser Gly Glu Thr Arg Ala Glu Phe
100 105 110
Glu Gly Arg Val Ala Lys Asp Ser Phe Asp Glu Ala Lys Gly Phe Gln
115 120 125
Arg Ala Arg Asp Val Ala Ser Val Met Asn Lys Ala Leu Glu Asn Ala
130 135 140
His Asp Glu Gly Ala Tyr Leu Asp Asn Leu Lys Lys Glu Leu Ala Asn
145 150 155 160
Gly Asn Asp Ala Leu Arg Asn Glu Asp Ala Arg Ser Pro Phe Tyr Ser
165 170 175
Ala Leu Arg Asn Thr Pro Ser Phe Lys Asp Arg Asn Gly Gly Asn His
180 185 190
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195 200 205
Gly Gln Asp Arg Ser Gly Ser Ser Asp Lys Arg Lys Tyr Gly Asp Pro
210 215 220
Glu Ala Phe Arg Pro Asp Arg Gly Thr Gly Leu Val Asp Met Ser Arg
225 230 235 240
Asp Arg Asn Ile Pro Arg Ser Pro Thr Ser Pro Gly Glu Ser Phe Val
245 250 255
Asn Phe Asp Tyr Gly Trp Phe Gly Ala Gln Thr Glu Ala Asp Ala Asp
260 265 270
Lys Thr Val Trp Thr His Gly Asn His Tyr His Ala Pro Asn Gly Ser
275 280 285
Leu Gly Ala Met His Val Tyr Glu Ser Lys Phe Arg Asn Trp Ser Asp
290 295 300
Gly Tyr Ser Asp Phe Asp Arg Gly Ala Tyr Val Val Thr Phe Val Pro
305 310 315 320
Lys Ser Trp Asn Thr Ala Pro Asp Lys Val Thr Gln Gly Trp Pro
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<223> Xaa is 6-azido-L-lysine (Lys(N3))
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<221> MOD_RES
<222> 5..5
<223> Xaa is 6-azido-L-lysine (Lys(N3))
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Xaa Gly Ala Arg Xaa
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Gly Ala Arg Arg
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Gly Gly Ala Arg
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Gly Gly Ala Arg Arg
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<211> 4
<212> PRT
<213> artificial sequence
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Gly Gly Cys Asp
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<220>
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<223> Xaa is 6-azido-L-lysine (Lys(N3))
<400> 44
Gly Gly Xaa Asp
1
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<211> 5
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> linker sequence
<400> 45
Gly Gly Arg Cys Asp
1 5
<210> 46
<211> 5
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> linker sequence
<400> 46
Gly Gly Gly Asp Cys
1 5
<210> 47
<211> 4
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> linker sequence
<220>
<221> MOD_RES
<222> 4..4
<223> Xaa is 6-azido-L-lysine (Lys(N3))
<400> 47
Gly Gly Gly Xaa
1
<210> 48
<211> 335
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Streptomyces mobaraensis MTG Zedira
<400> 48
Phe Arg Ala Pro Asp Ser Asp Asp Arg Val Thr Pro Pro Ala Glu Pro
1 5 10 15
Leu Asp Arg Met Pro Asp Pro Tyr Arg Pro Ser Tyr Gly Arg Ala Glu
20 25 30
Thr Val Val Asn Asn Tyr Ile Arg Lys Trp Gln Gln Val Tyr Ser His
35 40 45
Arg Asp Gly Arg Lys Gln Gln Met Thr Glu Glu Gln Arg Glu Trp Leu
50 55 60
Ser Tyr Gly Cys Val Gly Val Thr Trp Val Asn Ser Gly Gln Tyr Pro
65 70 75 80
Thr Asn Arg Leu Ala Phe Ala Ser Phe Asp Glu Asp Arg Phe Lys Asn
85 90 95
Glu Leu Lys Asn Gly Arg Pro Arg Ser Gly Glu Thr Arg Ala Glu Phe
100 105 110
Glu Gly Arg Val Ala Lys Glu Ser Phe Asp Glu Glu Lys Gly Phe Gln
115 120 125
Arg Ala Arg Glu Val Ala Ser Val Met Asn Arg Ala Leu Glu Asn Ala
130 135 140
His Asp Glu Ser Ala Tyr Leu Asp Asn Leu Lys Lys Glu Leu Ala Asn
145 150 155 160
Gly Asn Asp Ala Leu Arg Asn Glu Asp Ala Arg Ser Pro Phe Tyr Ser
165 170 175
Ala Leu Arg Asn Thr Pro Ser Phe Lys Glu Arg Asn Gly Gly Asn His
180 185 190
Asp Pro Ser Arg Met Lys Ala Val Ile Tyr Ser Lys His Phe Trp Ser
195 200 205
Gly Gln Asp Arg Ser Ser Ser Ala Asp Lys Arg Lys Tyr Gly Asp Pro
210 215 220
Asp Ala Phe Arg Pro Ala Pro Gly Thr Gly Leu Val Asp Met Ser Arg
225 230 235 240
Asp Arg Asn Ile Pro Arg Ser Pro Thr Ser Pro Gly Glu Gly Phe Val
245 250 255
Asn Phe Asp Tyr Gly Trp Phe Gly Ala Gln Thr Glu Ala Asp Ala Asp
260 265 270
Lys Thr Val Trp Thr His Gly Asn His Tyr His Ala Pro Asn Gly Ser
275 280 285
Leu Gly Ala Met His Val Tyr Glu Ser Lys Phe Arg Asn Trp Ser Glu
290 295 300
Gly Tyr Ser Asp Phe Asp Arg Gly Ala Tyr Val Ile Thr Phe Ile Pro
305 310 315 320
Lys Ser Trp Asn Thr Ala Pro Asp Lys Val Lys Gln Gly Trp Pro
325 330 335
<210> 49
<211> 407
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Streptomyces mobaraensis MTG P81453
<400> 49
Met Arg Ile Arg Arg Arg Ala Leu Val Phe Ala Thr Met Ser Ala Val
1 5 10 15
Leu Cys Thr Ala Gly Phe Met Pro Ser Ala Gly Glu Ala Ala Ala Asp
20 25 30
Asn Gly Ala Gly Glu Glu Thr Lys Ser Tyr Ala Glu Thr Tyr Arg Leu
35 40 45
Thr Ala Asp Asp Val Ala Asn Ile Asn Ala Leu Asn Glu Ser Ala Pro
50 55 60
Ala Ala Ser Ser Ala Gly Pro Ser Phe Arg Ala Pro Asp Ser Asp Asp
65 70 75 80
Arg Val Thr Pro Pro Ala Glu Pro Leu Asp Arg Met Pro Asp Pro Tyr
85 90 95
Arg Pro Ser Tyr Gly Arg Ala Glu Thr Val Val Asn Asn Tyr Ile Arg
100 105 110
Lys Trp Gln Gln Val Tyr Ser His Arg Asp Gly Arg Lys Gln Gln Met
115 120 125
Thr Glu Glu Gln Arg Glu Trp Leu Ser Tyr Gly Cys Val Gly Val Thr
130 135 140
Trp Val Asn Ser Gly Gln Tyr Pro Thr Asn Arg Leu Ala Phe Ala Ser
145 150 155 160
Phe Asp Glu Asp Arg Phe Lys Asn Glu Leu Lys Asn Gly Arg Pro Arg
165 170 175
Ser Gly Glu Thr Arg Ala Glu Phe Glu Gly Arg Val Ala Lys Glu Ser
180 185 190
Phe Asp Glu Glu Lys Gly Phe Gln Arg Ala Arg Glu Val Ala Ser Val
195 200 205
Met Asn Arg Ala Leu Glu Asn Ala His Asp Glu Ser Ala Tyr Leu Asp
210 215 220
Asn Leu Lys Lys Glu Leu Ala Asn Gly Asn Asp Ala Leu Arg Asn Glu
225 230 235 240
Asp Ala Arg Ser Pro Phe Tyr Ser Ala Leu Arg Asn Thr Pro Ser Phe
245 250 255
Lys Glu Arg Asn Gly Gly Asn His Asp Pro Ser Arg Met Lys Ala Val
260 265 270
Ile Tyr Ser Lys His Phe Trp Ser Gly Gln Asp Arg Ser Ser Ser Ala
275 280 285
Asp Lys Arg Lys Tyr Gly Asp Pro Asp Ala Phe Arg Pro Ala Pro Gly
290 295 300
Thr Gly Leu Val Asp Met Ser Arg Asp Arg Asn Ile Pro Arg Ser Pro
305 310 315 320
Thr Ser Pro Gly Glu Gly Phe Val Asn Phe Asp Tyr Gly Trp Phe Gly
325 330 335
Ala Gln Thr Glu Ala Asp Ala Asp Lys Thr Val Trp Thr His Gly Asn
340 345 350
His Tyr His Ala Pro Asn Gly Ser Leu Gly Ala Met His Val Tyr Glu
355 360 365
Ser Lys Phe Arg Asn Trp Ser Glu Gly Tyr Ser Asp Phe Asp Arg Gly
370 375 380
Ala Tyr Val Ile Thr Phe Ile Pro Lys Ser Trp Asn Thr Ala Pro Asp
385 390 395 400
Lys Val Lys Gln Gly Trp Pro
405
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<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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Leu Leu Gln Gly Gly
1 5
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Leu Leu Gln Gly
1
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Leu Ser Leu Ser Gln Gly
1 5
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<212> PRT
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<220>
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Gly Leu Leu Gln Gly
1 5
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1
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1 5 10
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1 5
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Leu Leu Gln Gly Ala
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Leu Leu Gln Tyr Gln Gly Ala
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Leu Leu Gln Gly Ser Gly
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Leu Leu Gln Tyr Gln Gly
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Leu Leu Gln Leu Leu Gln Gly
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Ser Leu Leu Gln Gly
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Leu Leu Gln Leu Gln
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Leu Leu Gln Leu Leu Gln
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<211> 5
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Leu Leu Gln Gly Arg
1 5
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<212> PRT
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Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr
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<212> PRT
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<220>
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Glu Glu Gln Tyr Gln Ser Thr Tyr
1 5
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<212> PRT
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<220>
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Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
1 5
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<211> 6
<212> PRT
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Glu Glu Gln Tyr Gln Ser
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<211> 7
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Glu Glu Gln Tyr Gln Ser Thr
1 5
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<211> 7
<212> PRT
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<220>
<223> Q-Tag 26
<400> 75
Glu Gln Tyr Gln Ser Thr Tyr
1 5
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<211> 4
<212> PRT
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<220>
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Gln Tyr Gln Ser
1
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<211> 6
<212> PRT
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<220>
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<400> 77
Gln Tyr Gln Ser Thr Tyr
1 5
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<211> 5
<212> PRT
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<220>
<223> Q-Tag 29
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Tyr Arg Tyr Arg Gln
1 5
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Asp Tyr Ala Leu Gln
1 5
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<211> 7
<212> PRT
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<220>
<223> Q-Tag 31
<400> 80
Phe Gly Leu Gln Arg Pro Tyr
1 5
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<211> 10
<212> PRT
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<220>
<223> Q-Tag 32
<400> 81
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
1 5 10
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<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Q-Tag 33
<400> 82
Leu Gln Arg
1
<210> 83
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Q-Tag 34
<400> 83
Tyr Gln Arg
1
Claims (84)
- 하기 펩티드 구조(N->C 방향으로 표시)를 포함하는 링커를 N-말단 글리신(Gly) 잔기의 N-말단 1차 아민을 통해 항체의 중쇄 또는 경쇄에 포함된 글루타민(Gln) 잔기로 컨쥬게이션하는 단계를 포함하는, 미생물 트랜스글루타미나제(MTG)에 의해 항체-링커 컨쥬게이트를 생성시키는 방법:
Gly-(Aax)m-B-(Aax)n
상기 식에서,
·m은 0 이상 12 이하의 정수이고,
·n은 0 이상 12 이하의 정수이고,
·m + n ≥ 0이며,
·Aax는 아미노산 또는 아미노산 유도체이고,
·B는 연결 모이어티(moiety)이다. - 제 1 항에 있어서,
상기 링커가 2개 이상의 연결 모이어티 B를 포함하는, 방법. - 제 2 항에 있어서,
2개 이상의 연결 모이어티 B가 서로 상이한, 방법. - 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
하나 이상의 연결 모이어티 B 중 하나 이상이 하기를 포함하는, 방법:
·생체 직교(bioorthogonal) 마커 기, 또는
·가교를 위한 비-생체-직교 엔티티(entity). - 제 4 항에 있어서,
생체 직교 마커 기 또는 비-생체-직교 엔티티가 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인, 방법:
·-N-N≡N 또는 -N3
·Lys(N3)
·테트라진
·알킨
·DBCO
·BCN
·노르보렌
·트랜스시클로옥텐
·-RCOH(알데히드),
·아실트리플루오로보레이트,
·-SH, 및
·시스테인. - a) 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 항체-링커 컨쥬게이트를 생성시키는 단계, 및
b) 페이로드(payload)를 항체-링커 컨쥬게이트의 하나 이상의 연결 모이어티 B에 연결하는 단계
를 포함하는, 항체-페이로드 컨쥬게이트를 생성시키는 방법. - 제 6 항에 있어서,
페이로드를 클릭-반응(click-reaction)을 통해 항체-링커 컨쥬게이트의 연결 모이어티 B에 연결하는, 방법. - 하기 펩티드 구조(N->C 방향으로 표시)를 포함하는 링커를 N-말단 글리신(Gly) 잔기의 N-말단 1차 아민을 통해 항체의 중쇄 또는 경쇄에 포함된 글루타민(Gln) 잔기로 컨쥬게이션하는 단계를 포함하는, 미생물 트랜스글루타미나제(MTG)에 의해 항체-페이로드 컨쥬게이트를 생성시키는, 방법:
Gly-(Aax)m-B-(Aax)n
상기 식에서,
·m은 0 이상 12 이하의 정수이고,
·n은 0 이상 12 이하의 정수이며,
·m + n ≥ 0이며,
·Aax는 아미노산 또는 아미노산 유도체이고,
·B는 페이로드이다. - 제 8 항에 있어서,
상기 링커가 둘 이상의 페이로드 B를 포함하는, 방법. - 제 9 항에 있어서,
둘 이상의 페이로드 B가 서로 상이한, 방법. - 제 6 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
하나 이상의 페이로드가 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법:
·독소
·사이토카인
·성장 인자
·방사성 핵종
·호르몬
·항바이러스제
·항균제
·형광 염료
·면역조절제/면역자극제
·반감기 증가 모이어티
·용해도 증가 모이어티
·중합체-독소 컨쥬게이트
·핵산
·비오틴 또는 스트렙타비딘 모이어티
·비타민
·표적 결합 모이어티, 및
·소염제. - 제 11 항에 있어서,
독소가 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인, 방법:
·피롤로벤조디아제핀(PBD)
·아우리스타틴(예: MMAE, MMAF)
·메이탄시노이드(메이탄신, DM1, DM4, DM21)
·듀오카르마이신
·튜불리신
·에네디엔(예: 칼리케아미신)
·PNU, 독소루비신
·피롤계 키네신 스핀들 단백질(KSP) 억제제
·칼리케아미신
·아마니틴(예: α-아마니틴), 및
·캄프토테신(예: 엑사테칸, 데룩스테칸). - 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 링커가 카텝신에 의해 절단될 수 없는, 방법. - 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 링커가 발린-알라닌 모티프 또는 발린-시트룰린 모티프를 포함하지 않는, 방법. - 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 항체가 IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 또는 IgY 항체, 또는 그의 단편 또는 재조합 변이체이고, 상기 그의 단편 또는 재조합 변이체가 표적 결합 특성을 유지하고 CH2 도메인을 포함하는, 방법. - 제 15 항에 있어서,
상기 항체가 IgG 항체인, 방법. - 제 15 항 또는 제 16 항에 있어서,
상기 항체가 당화된 항체, 탈당화된 항체 또는 비당화된(aglycosylated) 항체인, 방법. - 제 17 항에 있어서,
상기 당화된 항체가 CH2 도메인의 잔기 N297(EU 넘버링)에서 당화된 IgG 항체인, 방법. - 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서,
(a) 페이로드 또는 연결 모이어티 B를 포함하는 링커가 분자 조작(molecular engineering)에 의해 항체의 중쇄 또는 경쇄에 도입된 Gln 잔기에 컨쥬게이션되거나, 또는 (b) 페이로드 또는 연결 모이어티 B를 포함하는 링커가 항체의 Fc 도메인의 Gln 잔기에 컨쥬게이션되는, 방법. - 제 19 항에 있어서,
상기 항체의 Fc 도메인의 Gln 잔기가 IgG 항체의 CH2 도메인의 Gln 잔기 Q295(EU 넘버링)인, 방법. - 제 19 항에 있어서,
분자 조작에 의해 항체의 중쇄 또는 경쇄에 도입된 Gln 잔기가 비당화된 IgG 항체의 CH2 도메인의 N297Q(EU 넘버링)인, 방법. - 제 19 항에 있어서,
분자 조작에 의해 항체의 중쇄 또는 경쇄 내로 도입된 Gln 잔기가 (a) 항체의 중쇄 또는 경쇄 내로 통합되거나 또는 (b) 항체의 중쇄 또는 경쇄의 N- 또는 C-말단 단부에 융합된 펩티드에 포함되는, 방법. - 제 22 항에 있어서,
Gln 잔기를 포함하는 펩티드가 항체의 중쇄의 C-말단에 융합된, 방법. - 제 22 항 또는 제 23 항에 있어서,
Gln 잔기를 포함하는 펩티드가 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법:
·LLQGG,
·LLQG,
·LSLSQG,
·GGGLLQGG,
·GLLQG,
·LLQ,
·GSPLAQSHGG,
·GLLQGGG,
·GLLQGG,
·GLLQ,
·LLQLLQGA,
·LLQGA,
·LLQYQGA,
·LLQGSG,
·LLQYQG,
·LLQLLQG,
·SLLQG,
·LLQLQ,
·LLQLLQ,
·LLQGR,
·EEQYASTY,
·EEQYQSTY,
·EEQYNSTY,
·EEQYQS,
·EEQYQST,
·EQYQSTY,
·QYQS,
·QYQSTY,
·YRYRQ,
·DYALQ,
·FGLQRPY,
·EQKLISEEDL,
·LQR, 및
·YQR. - 제 1 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서,
m + n이 12 이하, 11 이하, 10 이하, 9 이하, 8 이하, 7 이하, 6 이하, 5 이하 또는 4 이하인, 방법. - 제 1 항 내지 제 25항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 링커의 순 전하가 중성 또는 양인, 방법. - 제 1 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 링커가 음으로 하전된 아미노산 잔기를 포함하지 않는, 방법. - 제 1 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 링커가 하나 이상의 양으로 하전된 아미노산 잔기를 포함하는, 방법. - 제 1 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 링커가 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는, 방법:
·라이신,
·아르기닌, 및
·히스티딘. - 제 1 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 있어서,
하나 이상의 페이로드 또는 연결 모이어티 B를 포함하는 링커가 Gln 잔기의 아미드 측쇄에 컨쥬게이션되는, 방법. - 제 1 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 있어서,
미생물 트랜스글루타미나제가 스트렙토마이세스 종, 특히 스트렙토마이세스 모바라엔시스(Streptomyces mobaraensis)로부터 유래되는, 방법. - 제 6 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 생성된, 항체-페이로드 컨쥬게이트.
- Gly가 N-말단 1차 아민을 포함하는 하기 펩티드 구조(N->C 방향으로 표시)를 포함하는 링커로서, 이 때 상기 링커가 미생물 트랜스글루타미나제에 의해 링커의 N-말단 Gly의 N-말단 1차 아민을 통해 항체에 컨쥬게이션될 수 있는 링커:
Gly-(Aax)m-B-(Aax)n
상기 식에서,
·m은 0 이상 12 이하의 정수이며,
·n은 0 이상 12 이하의 정수이고,
·m + n ≥ 0이며,
·Aax는 아미노산 또는 아미노산 유도체이고,
·B는 페이로드 또는 연결 모이어티이다. - 제 33 항에 있어서,
상기 링커가 2개 이상의 페이로드 및/또는 연결 모이어티 B를 포함하는, 링커. - 제 33 항 또는 제 34 항에 있어서,
하나 이상의 연결 모이어티 B 중 하나 이상이 하기를 포함하는, 링커:
·생체 직교 마커 기, 또는
·가교를 위한 비-생체-직교 엔티티. - 제 35 항에 있어서,
생체 직교 마커 기 또는 비-생체-직교 엔티티가 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인, 링커:
·-N-N≡N 또는 -N3
·Lys(N3)
·테트라진
·알킨
·DBCO
·BCN
·노르보렌
·트랜스시클로옥텐
·-RCOH(알데히드),
·아실트리플루오로보레이트,
·-SH, 및
·시스테인. - 제 33 항 또는 제 34 항에 있어서,
하나 이상의 페이로드가 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는, 링커:
·독소
·사이토카인
·성장 인자
·방사성 핵종
·호르몬
·항바이러스제
·항균제
·형광 염료
·면역조절제/면역자극제
·반감기 증가 모이어티
·용해도 증가 모이어티
·중합체-독소 컨쥬게이트
·핵산
·비오틴 또는 스트렙타비딘 모이어티
·비타민
·표적 결합 모이어티, 및
·소염제. - 제 37 항에 있어서,
독소가 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인, 링커:
·피롤로벤조디아제핀(PBD)
·아우리스타틴(예: MMAE, MMAF)
·메이탄시노이드(메이탄신, DM1, DM4, DM21)
·듀오카르마이신
·튜불리신
·에네디엔(예: 칼리케아미신)
·PNU, 독소루비신
·피롤계 키네신 스핀들 단백질(KSP) 억제제
·칼리케아미신
·아마니틴(예: α-아마니틴), 및
·캄프토테신(예: 엑사테칸, 데룩스테칸). - 제 33 항 내지 제 38 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 링커가 카텝신에 의해 절단될 수 없는, 링커. - 제 33 항 내지 제 39 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 링커가 발린-알라닌 모티프 또는 발린-시트룰린 모티프를 포함하지 않는, 링커. - 제 33 항 내지 제 40 항 중 어느 한 항에 있어서,
m + n이 12 이하, 11 이하, 10 이하, 9 이하, 8 이하, 7 이하, 6 이하, 5 이하 또는 4 이하인, 링커. - 제 33 항 내지 제 41 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 링커의 순 전하가 중성 또는 양인, 링커. - 제 33 항 내지 제 42 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 링커가 음으로 하전된 아미노산 잔기를 포함하지 않는, 링커. - 제 33 항 내지 제 43 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 링커가 하나 이상의 양으로 하전된 아미노산 잔기를 포함하는, 링커. - 제 33 항 내지 제 44 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 링커가 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는, 링커:
·라이신,
·아르기닌, 및
·히스티딘. - 제 33 항 내지 제 45 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 링커가 표 5에 나타낸 목록으로부터 선택되는, 링커. - 하나 이상의 페이로드가 링커에 공유 결합 또는 비-공유 결합되는, 적어도 하기를 포함하는 링커-페이로드 구성물(construct):
a) 제 33 항 내지 제 46 항 중 어느 한 항에 따른 링커, 및
b) 하나 이상의 페이로드. - 제 47 항에 있어서,
상기 구성물에서, 하나 이상의 페이로드가 클릭 반응으로 링커의 연결 모이어티 B에 공유 결합된, 링커-페이로드 구성물. - 제 47 항에 있어서,
링커-페이로드 구성물이 화학적 합성에 의해 수득된, 링커-페이로드 구성물. - 제 47 항 내지 제 49 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 구성물에서, 링커 및/또는 하나 이상의 페이로드가 결합 동안 화학적으로 변형되어 공유 결합 또는 비공유 결합을 허용함으로써 상기 구성물을 형성하는, 링커-페이로드 구성물. - a) 제 47 항 내지 제 50 항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 링커-페이로드 구성물, 및
b) 중쇄 또는 경쇄에 하나 이상의 Gln 잔기를 포함하는 항체
를 포함하는 항체-페이로드 컨쥬게이트로서, 이 때
상기 링커-페이로드 구성물이 링커-페이로드 구성물에 포함된 N-말단 글리신 잔기의 N-말단 1차 아민을 통해 항체의 중쇄 또는 경쇄에서 Gln 잔기의 아미드 측쇄에 컨쥬게이션되는, 항체-페이로드 컨쥬게이트. - 제 51 항에 있어서,
상기 컨쥬게이션이 미생물 트랜스글루타미나제(MTG)로 달성된, 항체-페이로드 컨쥬게이트. - 제 51 항 또는 제 52 항에 있어서,
상기 컨쥬게이션이 링커-페이로드 구성물의 형성 전 또는 후에 달성된, 항체-페이로드 컨쥬게이트. - 제 51 항 내지 제 53 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 컨쥬게이트에서, 링커-페이로드 구성물 및/또는 항체가 임의적으로는 컨쥬게이션 동안 화학적으로 변형되어 공유 컨쥬게이션을 허용함으로써 상기 컨쥬게이트를 형성하는, 항체-페이로드 컨쥬게이트. - 제 51 항 내지 제 54 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 항체가 IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 또는 IgY 항체, 또는 그의 단편 또는 재조합 변이체이고, 상기 그의 단편 또는 재조합 변이체가 표적 결합 특성을 유지하고 CH2 도메인을 포함하는, 항체-페이로드 컨쥬게이트. - 제 55 항에 있어서,
상기 항체가 IgG 항체인, 항체-페이로드 컨쥬게이트. - 제 55 항 또는 제 56 항에 있어서,
상기 항체가 당화된 항체, 탈당화된 항체 또는 비당화된 항체인, 항체-페이로드 컨쥬게이트. - 제 57 항에 있어서,
당화된 항체가 CH2 도메인의 잔기 N297(EU 넘버링)에서 당화된 IgG 항체인, 항체-페이로드 컨쥬게이트. - 제 51 항 내지 제 58 항 중 어느 한 항에 있어서,
(a) 링커-페이로드 구성물이 분자 조작에 의해 항체의 중쇄 또는 경쇄 내로 도입된 Gln 잔기에 컨쥬게이션되거나, 또는 (b) 링커-페이로드 구성물이 항체의 Fc 도메인의 Gln 잔기에 컨쥬게이션되는, 항체-페이로드 컨쥬게이트. - 제 59 항에 있어서,
상기 항체의 Fc 도메인 내의 Gln 잔기가 IgG 항체의 CH2 도메인의 Gln 잔기 Q295(EU 넘버링)인, 항체-페이로드 컨쥬게이트. - 제 59 항에 있어서,
분자 조작에 의해 항체의 중쇄 또는 경쇄에 도입된 Gln 잔기가 비당화된 항체의 CH2 도메인의 N297Q(EU 넘버링)인, 항체-페이로드 컨쥬게이트. - 제 59 항에 있어서,
분자 조작에 의해 항체의 중쇄 또는 경쇄에 도입된 Gln 잔기가 (a) 항체의 중쇄 또는 경쇄에 통합되거나 또는 (b) 항체의 중쇄 또는 경쇄의 N- 또는 C-말단 단부에 융합된 펩티드에 포함되는, 항체-페이로드 컨쥬게이트. - 제 62 항에 있어서,
Gln 잔기를 포함하는 펩티드가 항체 중쇄의 C-말단 단부에 융합된, 항체-페이로드 컨쥬게이트. - 제 62 항 또는 제 63 항에 있어서,
Gln 잔기를 포함하는 펩티드가 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는, 항체-페이로드 컨쥬게이트:
·LLQGG,
·LLQG,
·LSLSQG,
·GGGLLQGG,
·GLLQG,
·LLQ,
·GSPLAQSHGG,
·GLLQGGG,
·GLLQGG,
·GLLQ,
·LLQLLQGA,
·LLQGA,
·LLQYQGA,
·LLQGSG,
·LLQYQG,
·LLQLLQG,
·SLLQG,
·LLQLQ,
·LLQLLQ,
·LLQGR,
·EEQYASTY,
·EEQYQSTY,
·EEQYNSTY,
·EEQYQS,
·EEQYQST,
·EQYQSTY,
·QYQS,
·QYQSTY,
·YRYRQ,
·DYALQ,
·FGLQRPY,
·EQKLISEEDL,
·LQR, 및
·YQR. - 제 51 항 내지 제 64 항 중 어느 한 항에 있어서,
항체-페이로드 컨쥬게이트가 하나 이상의 독소를 포함하는, 항체-페이로드 컨쥬게이트. - 제 65 항에 있어서,
항체-페이로드 컨쥬게이트가 독소, 및 약물 유출 수송체의 억제제를 포함하는, 항체-페이로드 컨쥬게이트. - 제 65 항에 있어서,
항체-페이로드 컨쥬게이트가 독소 및 용해도 증가 모이어티를 포함하는, 항체-페이로드 컨쥬게이트. - 제 65 항에 있어서,
항체-페이로드 컨쥬게이트가 독소 및 면역자극제를 포함하는, 항체-페이로드 컨쥬게이트. - 제 65 항에 있어서,
항체-페이로드 컨쥬게이트가 2개의 상이한 독소를 포함하는, 항체-페이로드 컨쥬게이트. - 제 69 항에 있어서,
제 1 독소가 세포 분열을 억제하는 독소이고, 제 2 독소가 DNA의 복제 및/또는 전사를 방해하는 독소인, 항체-페이로드 컨쥬게이트. - 제 65 항 내지 제 70 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 독소 중 하나 이상이 아우리스타틴 또는 메이탄시노이드인, 항체-페이로드 컨쥬게이트. - 제 51 항 내지 제 64 항 중 어느 한 항에 있어서,
항체-페이로드 컨쥬게이트가 2개의 면역자극제를 포함하는, 항체-페이로드 컨쥬게이트. - 제 68 항 내지 제 72 항 중 어느 한 항에 있어서,
하나 이상의 면역자극제가 TLR 작용제인, 항체-페이로드 컨쥬게이트. - 제 51 항 내지 제 64 항 중 어느 한 항에 있어서,
항체-페이로드 컨쥬게이트가 방사성 핵종 및 형광 염료를 포함하는, 항체-페이로드 컨쥬게이트. - 제 74 항에 있어서,
방사성 핵종이 단층촬영, 특히 단일-광자 방출 컴퓨터 단층촬영(SPECT) 또는 양전자 방출 단층촬영(PET)에 사용하기 적합한 방사성 핵종이고, 상기 형광 염료가 근적외선 형광 염료인, 항체-페이로드 컨쥬게이트. - 제 33 항 내지 제 46 항 중 어느 한 항에 따른 링커, 제 47 항 내지 제 50 항 중 어느 한 항에 따른 링커-페이로드 구성물, 및/또는 제 51 항 내지 제 75 항 중 어느 한 항에 따른 항체-페이로드 컨쥬게이트를 포함하는, 약학 조성물.
- 제 51 항 내지 제 75 항 중 어느 한 항에 따른 항체-페이로드 컨쥬게이트 또는 제 76 항에 따른 약학 조성물, 및 하나 이상의 추가적인 약학적으로 허용되는 성분을 포함하는, 의약품.
- 치료 및/또는 진단에 사용하기 위한, 제 51 항 내지 제 75 항 중 어느 한 항에 따른 항체-페이로드 컨쥬게이트, 제 76 항에 따른 약학 조성물 또는 제 77 항에 따른 의약품.
- 신생물성 질환, 신경계 질환, 자가면역 질환, 염증성 질환 또는 감염성 질환을 앓고 있고/있거나, 상기 질환이 발병할 위험이 있고/있거나, 상기 질환으로 진단되는 환자의 치료에 사용하기 위한, 제 51 항 내지 제 75 항 중 어느 한 항에 따른 항체-페이로드 컨쥬게이트, 제 76 항에 따른 약학 조성물 또는 제 77 항에 따른 의약품.
- 신생물성 질환을 앓고 있는 환자의 치료에 사용하기 위한, 제 51 항 내지 제 75 항 중 어느 한 항에 따른 항체-페이로드 컨쥬게이트, 제 76 항에 따른 약학 조성물 또는 제 77 항에 따른 의약품.
- 신생물성 질환, 신경계 질환, 자가면역 질환, 염증성 질환 또는 감염성 질환을 앓고 있고/있거나, 상기 질환이 발병할 위험이 있고/있거나, 상기 질환으로 진단되는 환자 치료용 약제를 제조하기 위한, 제 51 항 내지 제 75 항 중 어느 한 항에 따른 항체-페이로드 컨쥬게이트, 제 76 항에 따른 약학 조성물 또는 제 77 항에 따른 의약품의 용도.
- 제 51 항 내지 제 75 항 중 어느 한 항에 따른 항체-페이로드 컨쥬게이트, 제 76 항에 따른 약학 조성물 또는 제 77 항에 따른 의약품을, 신생물성 질환의 치료 또는 예방이 필요한 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 신생물성 질환을 치료 또는 예방하는 방법.
- 수술 전, 수술 중 또는 수술 후 영상화에 사용하기 위한, 제 51 항 내지 제 75 항 중 어느 한 항에 따른 항체-페이로드 컨쥬게이트, 제 76 항에 따른 약학 조성물 또는 제 77 항에 따른 의약품.
- 수술 중(intraoperative) 영상화-유도 암 수술에 사용하기 위한, 제 51 항 내지 제 75 항 중 어느 한 항에 따른 항체-페이로드 컨쥬게이트, 제 76 항에 따른 약학 조성물 또는 제 77 항에 따른 의약품.
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