PT85317B

PT85317B - Processo para a obtencao de imunotoxinas por acoplamento dum anticorpo com uma proteina tricosantina ou tricoquirina

Info

Publication number: PT85317B
Application number: PT85317A
Authority: PT
Inventors: Pierre Casellas; Luigi Barbieri; Fiorenzo Stirpe
Original assignee: Sanofi Sa
Priority date: 1986-07-15
Filing date: 1987-07-13
Publication date: 1990-04-30
Also published as: DK369287A; PT85317A; DK369287D0; ZA875176B; EP0255424A1; JPS63146831A; FR2601679B1; US4981953A; DE3773077D1; GR3003097T3; IL83183A0; AU614263B2; FR2601679A1; KR880001299A; IL83183A; AU7556487A; EP0255424B1; ES2040269T3; ATE67507T1; NZ221065A

Description

MEMÓRIA DESCRITIVA

Resumo

O presente invento diz respeito a um processo para a obtenção de uma imunotoxina tendo a fórmula estatística que se segue

P' - W - A¹ (I)

SANOFI, S.A.

PROCESSO PARA A OBTENÇÃO DE IMUNOTOXINAS POR ACOPLAMENTO

DUM ANTICORPO COM UMA PROTEÍNA TRICOSANTINA OU TRICOQUIRINA em que P’ representa o radical de uma proteína que é um anticorpo P ou fragmento de anticorpo P, R' é o radical de uma proteína A que é tricosantina ou tricoquirina e W representa uma estrutura covalente bivalente contendo pelo menos um grupo tioéster ou um grupo di-sulfureto.

processo de preparação consiste, por exemplo em se fazer reagir em solução aquosa e â temperatura ambiente uma proteína P^ que ê, por exemplo, tricosantina (ou tricoquirina) ou um anticorpo (ou fragmento de anticorpo), com um grupo tiol livre, com uma proteína P₂, diferente de Pp que pode ter os significados dados para Pp e com um agrupamento capaz de se ligar ao tiol livre de Pp de modo a formar uma ligação tioéter ou di-sulfureto.

ϊ

Ο presente invento tem como objectivo a obtenção de produtos que pertencem â classe das imunotoxinas, obtidas por ligação covalente entre, por um lado a tricosantina ou a tricoquirina tal e qual ou modificada convencionalmente (aqui a seguir designada pelo simbolo

A) e, por outro lado um anticorpo ou fragmento de anticorpo utilizado sob a forma natural ou correctamente modificado (aqui a seguir designado pelo simbolo P), possuindo a capacidade de reconhecer selectivamente um antigénio transportado pelas células alvo a serem destruídas. A ligação entre as duas proteínas pode ser realizada quer por intermédio de uma ligação di-sulfureto quer por intermédio de uma ligação tioéter.

Assim, o presente invento tem como objectivo, a obtenção de uma imunotoxina por ligação de um anticorpo P com a tricosantina ou a tricoquirina proteínas extraídas da planta Trichosanthes kírilowii, tendo a fórmula estatística que se segue:

P’ - W - A’ (I) na qual P' representa o radical de uma proteina que é um anticorpo ou um fragmento de anticorpo tal e qual ou convencionalmente modificado quimicamente, privada de pelo menos uma das suas funções próprias e no qual os outros grupos funcionais são eventualmente bloqueados. A' representa o radical de uma protéina que é a tricosantina ou a tricoqui_ rina tal e qual ou convencionalmente modificada quimicamente, privada de pelo menos uma das suas funções próprias e na qual os outros grupos funcionais são eventualmente bloqueados e W representa uma estrutura covalente contendo pelo menos um grupo tioéter ou um grupo di-sulfureto do qual um dos átomos de enxofre é ou escolhido entre os das cisteí-4nas de P e A, ou está ligado às funções próprias de P e/ou de A por estruturas de espaçamento transportando-o um grupo funcional ligado às ditas funções próprias de P e/ou A.

Por ligação tioéter entre duas proteínas entende-se uma ligação do tipo:

o

na qual Z, Y e E são tal como foram atrás definidos.

De um modo preferencial, o presente invento refere-se a uma imunotoxina com a fórmu la estatística:

J

P* - W' - A¹ (II) na qual P¹ e A¹ são tal como foram definidos atrás e W' representa uma estrutura covalente escolhida entre:

(a) um agrupamento com a fórmula

(b) um agrupamento com a fórmula:

(c) um agrupamento com a fórmula:

-Z'-Y¹-E¹-S-S-(E-Y-Z )_n- (d) um agrupamento com a fórmula:

-S-S-(E-Y-Z )_nem que:

- Z e Z¹ idênticos ou diferentes representam as funções próprias das proteínas A e P, escolhidas entre o ãtomo de oxigénio provenientes do hidroxilo de um dos resíduos de tirosina; o grupo carbonilo proveniente de um dos carboxilos terminais ou dos carboxilos livres dos ácidos aspárticos e/ou glutâmicos de A e de P; o grupo proveniente da estrutura dialdeidica obtida após oxidação da estrutura glu cidica de P ou em tal circunstancia de A pelo ácido periódico; e o grupo -NH- proveniente de uma das aminas terminais de A e de P ou de uma das aminas em posição ápsilon de um dos resíduos de lisina;

- Y e Y‘ representam grupos comprometidos¹numa ligação covalente com qualquer uma das funções Z e Z¹ das proteínas A e p;

- E e E¹ representam estruturas de espaçamento inertes;

- n representa zero ou 1.

As imunotoxinas do presente invento são preparadas pelas fórmulas (I) e (II) atrás indicadas sob uma forma simplificada, mas é tomado em consideração que podem neles existir várias estruturas W ou W' ligadas a uma mesma molécula de P e/ou A, e portanto vários A ligados a um único P e reciprocamente; o número de pontes depende do processo de ligação e do número de funções próprias de P e de A.

Assim, as fórmulas estatísticas I e II representam também estes produtos e as suas misturas, que correspondem â fórmula P¹ (W-A¹) m na qual m é um número inteiro ou fracconado, inferior ou superior a 1.

Por exemplo, se uma imunotoxina é formada por ligação da tricosantina ou da tricoquirina com o anticorpo P (por exemplo o anticorpo T101) por intermédio de uma estrutura covalente bivalente tendo um grupo di-sulfureto do qual um enoxfre é o de uma cisteína da tricosantina ou da tricoquirina e o outro está ligado aos oxigénios fenólicos das tirosinas do anticorpo P por um grupo oxopropí1ico, ela terá a formula estatística:

p¹(o-co-ch₂-ch₂-s-s-a*)_t na qual t representa o número das tirosinas do anticorpo (por exemplo do anticorpo T101) intervenientes na ligação.

A imunotoxina assim obtida corresponde a um produto com a fórmula (II), em que:

- P’ é tal como foi atrás definido, nomeadamente o radical do anticorpo T101 privado de t funções fenólicas das suas tirosinas;

- A¹ é tal como foi atrás definido, nomeadamente o radical da tricosantina ou da tricoquirina privado da função tiol de uma das suas cisteínas;

- W¹ é o agrupamento (c): -Z¹ -Y¹E¹-S-S-(E-Y-Z) - em que Z¹ é o oxigénio dos hidroxilos fenólicos intervenientes na ligação, Y é -CO-, E é a estrutura de espaçamento inerte -Cl-^-Cl·^- e n é zero.

Particularmente preferidas são as imunotoxinas formadas por uma ou várias estruturas contendo a tricosantina ou a tricoquirina e um anticorpo P, representadas pela fórmula estatística:

P'(W - A')_m (III)

-8na qual P', W' e A' são tal como foram definidos atrás e m representa o número de funções próprias da proteína P que intervêm na ligação. 0 número m varia entre 0,3 e 12, de pre ferencia entre 0,5 e 10.

A expressão m varia entre 0,3 e 12, de preferencia entre 0,5 e 10 significa que o valor de m é estatístico porque na população das moléculas de anticorpos a ligação não se produz de uma forma homogénea. 0 número m pode pois não ser inteiro.

valor de m depende nomeadamente dos anticorpos utilizados, mais particularmente do seu peso molecular.

Assim, se como anticorpo P de partida se utilizar um fragmento Fab ou Fab’> o valor de m poderá variar entre 0,3 e cerca de 2; se se utilizar um fragmento F(ab')?, m poderá variar entre 0,5 e cerca de 4; para um anticorpo do tipo IgG; o valor de m variará entre 0,5 e 6; em fim, para um anticorpo IgG, o valor de m poderá variar entre 1 e 12.

E contudo preferível que o grau de substituição sobre o anticorpo P seja tal que conduza a um valor de m não inferior a 0,5 e não superior a 10.

Mais geralmente, as estruturas (I) e (II) atrás referidas representam fórmulas estatísticas escritas de um modo simplifiçado, como foi especificado atrás.

De um modo análogo, as fórmulas (IV), (V) e (VI) referidas a seguir são igualmente estatísticas - quando, em caso de necessidade, n é 1 - porque os reagentes de ligação são preparados a partir de populações de proteínas P^ e P₂ que possuem todas exac

-9tamente as mesmas propriedades que as que foram atrás tomadas em consideração para o anticorpo P, quer estas proteínas Pl e P2 sejam elas mesmas o anticorpo P ou a proteína extraída de Trichosanthes kirilowii.

As imunotoxinas de fórmula estatística

P' (NH-C0-CH₂CH₂-S-S-CH-C0-NH-TK*)_m (11 Ia)

CH₂C00H na qual P' e m são como atrás definidos e TK¹ ê o radical da tricoquirina tal qual, privado de funções amina, e as imunotoxinas de fórmula estatística

P¹(nh-co-ch₂ch₂-s-s-ch₂ch₂-co-o-tk)_m (Illb) na qual P¹ e m são como atrás definidos e TK é o radical da tricoquirina tal qual, privado de funções hidroxilo fenólico são particularmente activas.

De acordo com um outro dos seus aspectos, o presente invento refere-se a um processo para a preparação de uma imunotoxina tendo a estrutura (I) atrás referida, caracterizado por se fazer reagir em solução aquosa e â temperatura ambiente uma proteína Pj, que é indiferentemente quer a tricosantina quer a tricoquirina eventual

mente modificadas, quer um anticorpo ou fragmento de anticorpo, portadora de pelo menos um grupo, tiol livre ligado â referida proteína directamente ou por intermédio de uma estrutura de espaçamento com uma proteína P₂, diferente de Pp que é indiferentemente quer a tricosantina quer a tricoquirina eventualmente modificadas, quer um anticorpo ou fragmento de anticorpo, portadora de um agrupamento capaz de ligação com o tiol livre da proteína PI de modo a formar uma ligação tioéter ou di-sulfureto.

De acordo com um aspecto preferencial, o presente invento refere-se a um processo para a preparação de uma imunotoxina tendo a estrutura (II) na qual P¹, W¹ e A¹ são tal como foram definidos atrás, caracterizado por se fazer reagir em solução aquosa e â temperatura ambiente uma proteína com a fórmula:

Pj'-(Z-Y-E)_n-SH (IV) com uma proteína com a fórmula estatística:

P₂'-Ζ'-Υ'-Ε'-θ (V) em que Pj * e P?¹ representam os radicais das proteínas Pj e P₂ ligados às funções próprias das referidas proteínas em que os radicais de uma das proteínas Pj ou P₂ provenientes da abertura das estruturas glucídicas dos anticorpos ou de fragmentos de anticorpos ou na circunstancia da proteína A por acção do ácido periódico, Ζ, Z', Y, Y¹, E e E¹ são tal como foram definidos atrás e G representa um grupo:

i

ou um grupo -S-S-X, em que X é um grupo activador.

Tanto P como A são pois proteínas que apresentam indiferentemente:

(1) a ou as funções tiol que participam na ligação;

(2) um ou vários agrupamentos funcionais capazes de reagir com as funções tiol atrás referidas para formar uma ligação disulfureto ou tioéter.

De acordo com o presente invento as referidas funções tiol e agrupamentos funcionais são os das proteínas P ou A nativas, ou então são introduzidas artificialmente.

Por razões de clareza precisa-se aqui a seguir o significado dos simbolos utilizados para designar as proteínas atrás referidas ou os seus radicais e das expressões utilizadas para designar os diferentes símbolos.

símbolo P representa uma proteína escolhida entre qualquer anticorpo ou fragmento de anticorpo ou qualquer imunoglobulina ou fragmento de imuno-12globulina ou qualquer molécula que deriva das anteriores por modificação artificial de um qualquer dos seus agrupamentos funcionais, incluindo estruturas glucidicas que elas transportem, na condição de que a proteína assim escolhida permaneça capaz de reconhecer selectivamente um dado anticorpo â superfície das células portadoras desse antigénio e nomeadamente das células cancerosas.

simbolo A representa uma proteína que é a tricosantina ou a tricoquirina tal como pode ser directamente obtida a partir de Trichosantes Kirilowii ou qualquer molécula que deriva destas proteínas por modificação artificial de qualquer agrupamento funcional transportado por estes mesmos proteínas na condição da proteína assim escolhida apresentar ainda a propriedade de inibir a sintese proteica ribosómica das células eucariontes, tal como se pode por em evidencia num modelo de estudo acelular.

simbolo P' representa um radical derivado da proteína P atrás referida, tal e qual ou convenientemente modificada quimicamente, privada de uma ou de várias funções próprias e cujos outros grupos funcionais são eventualmente bloqueados.

simbolo A¹ representa um radical derivado da proteína A atrás referida tal e qual ou convenientemente modificada quimicamente privada de uma ou de várias funções próprias e cujos outros grupos funcionais são eventualmente bloqueados.

simbolo Pj representa uma das proteínas A e P tal como foram atrás definidas que transporta funções tiol livres, ligadas à referida proteína directamente ou por intermédio de uma estrutura de espaçamento .

símbolo P?, diferente de P_p representa uma das proteínas A. e P tal como foram atrás definidas, que transporta um ou vários agrupamentos funcionais capazes de reagir com os tiois livres.

símbolo Pj¹ representa o radical da proteína Pj que transporta próprias funções da protéina Pj nomeadamente as funções SH (da cisteina), NH₂(terminal da proteína ou na posição épsilon das lisinas), OH (das tirosinas), COOH (dos ácidos asparticos e glutâmicos) ou o radical da proteína Pp proveniente da abertura das estruturas glucídicas por acção do ácido periódico quando PI designa um anticorpo ou fragmento de anticorpo ou, dado o caso a proteína A.

simbolo P2 ¹ representa o radical da proteína P₂ que transporta grupos funcionais caracteristicos NH₂ (terminal da proteína ou na posição épsilon das lisinas), OH (das tirosinas), COOH (dos ácidos aspárticos e glutâmicos).

Por exemplo, Pj'-SH representa a proteína Pj (que pode ser indiferentemente o anticorpo ou o fragmento de anticorpo P ou a tricosantina ou tricoquirina) na qual os grupos SH das cisteinas são livres e os outros grupos funcionais são eventualmente bloqueados.

Do mesmo modo, Pj’-C0representa a proteína Pj, na qual o seu grupo carboxílico, terminal ou os grupos carboxílicos dos seus ácidos glutâmicos e aspárticos são ligados com um agrupamento que traz um grupo SH introduzido artificialmente.

Além disso, P₂'-NH- re presenta P₂ (que pode ser indiferentemente o anticorpo ou fragmento de anticorpo P ou a tricosantina ou tricoquirina)

na qual o seu grupo amino terminal ou os grupos amino das suas lisinas estão ligados a um agrupamento susceptível de ligação com o tiol da proteína Pp

A expressão estrutura de espaçamento inerte tal como é aqui utilizada para E e E¹designa um radical orgânico bivalente inerte em relação aos reagentes utilizados no processo, tal como um grupo alquileno de cadeia linear ou ramificada contendo de 1 a 15 átomos de carbono, que pode conter uma ou várias duplas ligações ou que pode ser interrompido por átomos de oxigénio ou que pode ser substituido por um ou vários grupos funcionais inertes, tais como grupos metoxi, grupos carboxilos livres ou esterifiçados, grupos dialquilamino, grupos carbamatos. A mesma expressão designa igualmente um grupo arileno contendo de 6 a 15 átomos de carbono que pode ser substituido por um ou vários grupos funcionais inertes tal como foi aqui atrás indicado para o grupo alquileno.

A expressão grupo funcional capaz de se ligar de um modo covalente tal como é aqui utilizada para Y e Y^! designa todos os agrupamentos susceptiveis de reagir com as funções próprias das proteínas Pj e P£ para dar uma ligação covalente. Assim, por exemplo, os grupos -CO- são grupos funcionais convenientes susceptíveis de se ligar às aminas livres, aos tiois e aos hidroxilos fenólicos das proteínas. Do mesmo modo, o grupo -NH- é um grupo funcional conveniente susceptível de se ligar aos grupos carboxílicos livres das proteínas. 0 grupo =N- é um grupo funcional conveniente, susceptível de se ligar aos dois átomos de carbono das estruturas glucídicas das proteínas Pj ou P£ após oxidação com os iões periodato quando Pj θ Pz representa um anticorpo ou fragmento de anticorpo.

A expressão função própria das proteínas tal como é aqui utilizada para Z, 1' e Z. designa os radicais provenientes dos grupos caracteristicos

dos ácidos aminados que formam as proteínas Pj e P? tais como o átomo de oxigénio que provem dos hidroxilos dos ácidos aminados tirosina e eventualmente serina. o grupo carbonilo que provem do carboxilo terminal ou dos carboxilos livres dos ácidos aspártico e glutâmico, provindo o grupo -NH- da amina terminal das proteínas ou das lisinas, provindo o ãtomo de enxofre do tiol da cisteina. A mesma expressão designa igualmente o grupo que provem da estrutura dialdeidica obtida após oxidação de uma das estruturas .glucidicas das protej_ nas Pj ou P^ por tratamento com os iões periodato quando Pj ou P₂ representa um anticorpo ou fragmento de anticorpo.

A expressão radical activador, tal como é aqui utilizado para X, designa um agrupamento ligado a uma ponte -S-S- capaz de reagir com um tiol livre para formar um di-sulfureto com libertação de X-SH. Radicais activadore provenientes são os grupos piridil-2- e piridi1-4? não substituídos ou substituídos por um ou vários halogénios ou radicais alquilo, carboxilo, alcoxicarbonilo; o grupo fenilo não substituído ou, de preferencia, substituído por um ou vários halogénios ou grupos nitro, alcoxi, carboxilo ou alcoxicarbonilo; ou um grupo alcoxicarbonilo tal como metoxicarbonilo.

As expressões alquilo e alcoxi designa grupos contendo até 5 átomos de carbono.

A expressão alquileno designa agrupamentos alifáticos saturados, de cadeia linear ou ramificada contendo até 10 átomos de carbono podendo ser substituídos por um ou vários grupos funcionais inertes tais como os grupos alcoxicarbonilo.

A tricosantína é uma proteína que inativa os ribosomas (RIP) extraída das raizes de Trichosanthes Kiriloxii descrita em Nature 195 (1.2). 321 (1986). Por extracção das sementes de Trichosanthes Kiriloxii

-16obtem-se uma nova RIP excepcionalmente potente, diferente da tricosantina. Esta nova RIP, denominada, tricoquirina, tem as características que se seguem:

- G1icoproteina tendo um peso molecular 28.000+

3.000, determinado por electroforese sobre gel de poliacrilamida em presença de SDS (sulfato dodecilo de sódio).

- com ponto isoeléctrico 9

- com conteúdo em açucares neutros : 1,1 a 1,5% em peso dos quais 0,3 a 1,2% de manose.

- composições em ácidos aminados: número de resíduos por mole de proteína + 20%:

Lis	: 17.3	; His	: 1,	1 ;	Arg	: 6.7 ;	Asx	22.8
T re	: 18.9	; Ser	: 23	.5;	Glx	:21.6 ;	Pro	8.0 ;
Gli	: 16.0	; Ala	: 21	.1;	1/2 Cis	: 1.9 ;
Vai	: 12.5	; Met	: 3.	05;	Ile	;15.8 ;	Leu	24.3;
Tir	: 12.1	; Fen	: 10	.1;	Trp	: n .d.

tal que Asx é o conjunto de resíduos de ácido aspártico e de asparagina

Glx é o conjunto dos resíduos de ácido glutâmico e de glutamina 1/2 Cis é o resíduo de cisteina nativa sob a forma de ácido cisteico determinado quando da análise e n.d. é não determinado.

- com sequencia amino-terminal:

10

Asp-Va1-Ser-Fe-Ser-Leu-Ser-Gli-G1i16

Tre-Ala-Ser-Tir-Glu-Lis

A composição em ácidos aminados é determinada por aquecimento a 105°C durante 24 horas sob azoto em presença de ácido clorídrico 6N, fenol a 1% e 2-mercaptoetanol a 1%. Os ácidos aminados são derivados pelo feni1isotiocianato (PITC) em meio alcalino. As feniltio-hidantoinas (PTH) assim obtidos são analisadas por CLEP sobre fase inversa. A cisteina foi determinada após oxidação da proteina com o ácido perfórmico (J. Biol.Chem. 238, 235-237 (1963)).

A sequencia amino-terminal é determinada com um microsequenciador comercializado por Applied Biosynthesis, a partir de 5 nmoles de proteina solubilizados numa solução de ácido acético a 10%. As PTH dos aminoácidos são analisados por CLEP sobre fase inversa.

-18A tricoquirina é obtida por um processo caracteristico por se extrair das sementes moídas de TRichosanthes kirilowii com água em presença de um tampão com pH 6,5-7,5, por se eliminar o material insolúvel, por se fraccionar o extracto bruto por cromatografia sobre uma resina permutadora de iões fracamente ácida, fazendo-se a eluição com uma solução tampão contendo cloreto de sódio com um pH de 7,2-7,7 isolando-se a fracção contendo a proteína inibidora a purificando-a.

Por exemplo, as sementes de T, kirilowii, de preferencia após descortição, são esmagadas e extraídas com água contendo um electrolito, por exemplo cloreto de sódio, e um tampão, por exemplo um tampão fosfato, com um pH próximo da neutralidade. As substancias insolúveis são eliminadas por exemplo por centrifugação e as substancias com peso molecular baixo são eliminadas da solução por diálise por exemplo contra tampão fosfato. 0 extracto dialisado é então submetido a um fracconamento, por exemplo por cromatogafia sobre uma resina permutadora de iões fracamente ácida tal como a celulose carboximetí1ica. A eluição pode ser realizada utilizando um gradiente linear de concentração por exemplo uma solução aquosa de 0 a 0,3 M de cloreto de sódio. Normalmente, são eluidos 4 picos principais e o pico IV é eluido por uma concentração em cloreto de sódio de 0,03 a 0,11 M contendo a maior parte da tricoqui rina .

A purificação da tricoquirina pode ser realizada por filtração sobre gel de por exemplo sobre uma coluna de Sephadex (marca registada).

A tricoquirina pode ser ligada aos anticorpos ou framentos de anticorpos por intermédio de um agente de ligação apropriado de acordo com o processo atrás descrito.

A tricoquirina inibe as sin teses proteicas num lisado de reticulocitos com uma de 1,5-4 nano.g/ml. Sobre as células intactas, o efeito é de longe inferior, com uma DI^q que pode variar de 7 a mais de 100 micro.g/ml, de acordo com a celulose examinada.

quadro I mostra o efeito da tricoquirina sobre várias células, nomeadamente a DI_5Q(micro.g/ml e em M. 10“⁷) da inibição da sintese proteica; esta é determinada aplicando o método descrito em J.Biol. Chem. 259, 9359-9354 (1984).

Quadro 1

Célula	: DI_5Qmicro.g/ml :	Μ. 10⁷
Fibroblastros humanos	3,9 :	1,3
Células TG	: 7,5 :	2,5
Células NB 100 (neuroblastoma)	: 10,3 :	3,4
Células JAR (coriocarcinoma)	: 16,3 :	5,4
Células HeLa	: 45,0 :	15,0
M 4039 (melanoma)	9,9 :	3,3

A preparação de anticorpos monoclonais dirigidos contra células cancerosas foi largamente mencionada na bibliografia cientifica e muitos destes anticorpos estão agora disponíveis comercialmente.

A ligação química entre a tricosantina ou a trícoquirina e o anticorpo (ou fragmento de anticorpo) pode ser realizada de acordo com o processo do presente invento por modos operatórios que:

preservam as actividades biológicas respectivas dos dois componentes do conjugado:

o anticorpo e a tricosantina ou a trícoquirina,

- asseguram ao processo uma reproductibi1 idade satisfatória e um bom rendimento da ligação,

- permitem regular o valor da relação toxina/anticorpo no conjugado obtido,

- conduzem a um produto estável e solúvel na água.

Entre os modos operatórios que respondem a estas caracteristicas, deve previlegiar-se os que preparam uma ou várias funções tiol para o estabelecimento da ligação entre as 2 proteinas.

Com efeito, estas funções tiol prestam-se particularmente bem ao estabelecimento, quer de ligações di-sulfureto, quer de ligações tioéter que tanto umas como as outras satisfazem as condições gerais atrás referidas.

Estes modos operatórios são descritos nas patentes dos EUA N⁹ 4.340.535 e na Patente Europeia N⁹ 169.111.

De um modo geral, para a boa condução das reacções de ligação entre proteínas tendo em vista eliminar especialmente as reticulações anárquicas, é importante que uma das proteínas a ligar e apenas ela transporte a ou as funções tiol a produzir, enquanto que a outra proteina e apenas ela transporte uma ou varias funções susceptíveis de reagir com os tiois em meio aquoso com um pH compreendido entre 5 e 9 e a uma temperatura que não ultrapassa 30°C, para fornecer uma ligação covalente estável e definida.

As características das proteínas PI e P2 utilizadas como produtos de partida são ilustrados em detalhe aqui a. seguir. A estrutura de espaçamen E pode ser substituida pelas estruturas preferenciais R a R8 que apenas são mencionadas a título de exemplo.

to

Caso da proteína P^

Sendo esta proteina em todos os casos a que transporta a ou as funções tiol que vão participar na ligação, a situação apresenta-se de um modo diverso de acordo com a natureza desta proteina Pp

A) A proteína Pj transporta naturalmente um ou vários radicais tiol utilizáveis para permitir a ligação à proteina

P₂; trata-se particularmente do caso em que a proteina Pj é o fragmento de anticorpo conhecido sob a denominação de F(ab)¹tal como é classicamente obtido por proteolise limitada do anticorpo em presença de pepsina, seguida por uma redução da (ou das) pontes di-sulfureto entre cadeias pesadas.

Trata-se igualmente do caso em que a proteina Pj é a tricosantina ou a tricoquirina ou um derivado de uma destas toxinas em que pelo menos um dos agrupamentos tiol transportado pelos resíduos cisteina da toxina nativa é livre e acessível à ligação química.

Em todos os casos, a proteina Pj portadora do seu (ou dos seus) agrupamento(s) tiol natural(ais) pode ser utilizada neste estado para o passo de ligação.

B) A proteina Pj não transporta naturalmente radicais tiol utilizáveis para permitir a ligação â proteina P₂;

- trata-se nomeadamente do caso da proteina P^ ser uma imunoglobulina nativa, um anticorpo inteiro ou um fragmento de anticorpo e nomeadamente um dos fragmentos correntemente denominados F(ab)'2 ou F(ab);

- um outro caso em que a proteina Pj não transporta naturalmente uma Pj ê a tricosantina ou a tricoquirina em que cada um dos resíduos da cisteina é ou bloquedo por alquilação, ou inacessível à modificação química.

Em todos os casos, será então conveniente introduzir artificialmente sobre todas as moléculas uma ou várias funções tiol aptas a permitirem a 1 igação.

Podem ser utilizadas de preferencia três tipos de reacções para introduzir funções tiol:

- 0 primeiro tipo de reacção é a acção do anidrido S-acetil_ mercaptosuccínico que é capaz de acilar funções aminadas da proteína. Poder-se-á em seguida libertar as funções tiol por eliminação do radical acetilo protector, por acção da hidroxil amina, tal como foi descrito (Archives of Biochemistry and Biophysics, 119, 41-49, (1967)). Poder-se-á mesmo, no caso em que a (ou as) função(ões) tiol assim introduzida(s) sob forma protegida devem reagir ulteriormente com um radical di-sulfureto misto activado, dispensar a desprotecção prévia pela hidroxilamina; com efeito, a reacção de formação da ligação di-sulfureto utilizando os reagentes que constituem o assunto do presente invento produz-se tanto com o radical S-acetilo como com o tiol livre.

Outros métodos descritos na bibliografia cientifica podem também ser utilizados por introdução de funções tiol sobre a proteína a modificar.

Uma proteína Pj modificada particularmente vantajosa é um S-acetilmercaptosuccinoi1 tricoquirina obtido por tratamento da tricoquirina com o anidrido S-acetilmercaptosuccínico, assim como o derivado mercag tosuccinoilo correspondente preparado por acção da hidroxilamina sobre o derivado S-acetilo.

Esta tricoquirina modificada pode ser representada pela fórmula

ΤΚ° - (CO - ÇH- s - Q)p

CH₂C00H na qual TK° representa o radical da tricoquirina, Q representa o hidrogénio ou o grupo acetilo e p pode variar entre 0,2 e 3, de preferencia entre 0,4 e 1.

2-0 segundo tipo de reacção consiste em fazer reagir a proteína pelos seus agrupamentos carboxílicos com uma molécula diaminada simétrica apresentando uma ponte di-sulfureto com a fórmula

HgN-Rj-S-S-Rj-NHg na qual Rj é um grupo alifâtico comportando de 2 a 5 átomos de carbono.

Â reacção faz-se de preferencia com a cistamina /“Rj = 7 em presença de um agente de ligação, tal como uma carbodiimida e nomeadamente um derivado solúvel na água como a etil-1 (dimetilamino-3 propil)-3 carbodiimida, e conduz â formação, de acordo com as estequi_ ometrias produzidas , de um dos derivados que se seguem ou da mistura dos dois:

P^J-CO-NH-R^S-S-R^Nl^ (Ia) ' -CO-NH-R₁-S-S-R₁-NH-CO-P^' (lb) .

Um tal produto de reacção pode ser então utilizado de duas maneiras:

a) Se nas fórmulas Ia e lb a proteína Pj' é o radical da proteína Pj que é a tricosantina ou a tricoquirina ou um dos seus derivados, o meio reaccional obtido é submetido sem fraccionamento à acção de um redutor, tal como o mercapto-2 etanol, o que conduz ã obtenção de um derivado proteico único com a fórmula geral:

Pj'-CONH-Rj-SH produto assim obtido é então purificado por diãlise ou filtração sobre gel.

b) Se nas fórmulas Ia e lb, o radical Pj' ê o radical da proteína Pj constituído por um anticorpo ou um dos seus fragmentos, o meio reaccional obtido será utilizado tal e qual para a ligação utilizando então um método de permuta tiol/di-sulfureto por exemplo o descrito por Gilliland et Colier (Câncer Research, 40, 3564, (1980)).

3-0 terceiro tipo de reacção consiste em utilizar motivos (radicais) glucidicos naturalmente presentes sobre os anticorpos para fixar o radi cal portador do tiol que se pretende introduzir. A proteí na é então submetida a uma oxidação pelos iões periodato a fim de fazer aparecer funções aldeido sobre os motivos (radi cais) glucidicos. A reação é interrompida pela adição de um reagente que consome o periodato restante, por exemplo um excesso de etileno glicol e os subprodutos são eliminados por diálise ou por meio de qualquer, outro tratamento apro priado. 0 produto obtido é tratado por uma molécula diaminada simétrica que apresenta uma ponte di-sulfureto com a fórmula geral

HgN-Rj-S-S-Rj-NH₂ na qual Rj é um grupo alifático comportando de 2 a 5 átomos de carbono. Os produtos de adição formados são então reduzidos em aminas secundárias ou terciárias por acção de um hidreto metálico conveniente, nomeadamente o borohidreto de sódio. A reacção faz-se de preferencia com a cistamina / /Rj=-(CH₂)₂- / e conduz à formação, de acordo com as estequiometrias produzidas, de um dos derivados que se seguem ou da mistura dos dois:

-27ΟΗ

CH

OH lia

OH

OH !

OH z^CK\ ^pi

CH

OH

Ilb meio reaccional poderá então ser tratado exactamente como foi atrás indicado para os produtos caracterizados pelas estruturas Ia ou Ib, em que Pj¹ representa um anticorpo ou fragmento de anticorpo.

Nos dois últimos tipos de reacção a introdução artificial de agrupamentos tiol atrás descritos (os que utilizam um reagente di-sulfureto diaminado simétrico), é preferível que a proteina Pj produzida não possua grupos SH livres.

Pode assim introduzir-se na tricosantina ou na tricoquirina em ou vários radicais metj. lo por mole. A proteina·assim modificada conserva a integralidade das suas propriedades biológicas e nomeadamente a sua capacidade para inibir a sintese proteica ribosómica nas células eucariontes.

No caso dos anticorpos ou fragmentos de anticorpos e mais geralmente de todas as substancias do primeiro grupo tal como foi definido anteri

-28ormente que não possuem agrupamentos SH naturalmente livres, será conveniente proceder a uma metilação redutora, por exemplo de acordo com o método de MEANS et FEENEY; pode-se assim habitualmente introduzir várias dezenas de radicais metilo por mole de anticorpos sem modificar a sua capacidade para reconhecer selectivamente um antigénio na superfície de células portadoras deste antigénio.

CASO DA PROTEÍNA P_?

Esta proteína é em todos os casos a que transporta um ou vários agrupamentos funcionais capazes de reagir com os tiois da proteína Pj para formar uma ligação quer di-sulfureto, quer tioéter. Estes agrupamentos funcionais, sempre introduzidos artificialmente sobre a proteína P_2> diferem na medida em que se procura obter uma junção por ligação di-sulfureto ou por ligação tioéter e são escolhidos tal como é aqui indicado a seguir.

A) Caso da ligação di-sulfureto.

A preparação do conjugado pode então ser representada pelo esquema:

-29P,’-(_Z-Y-E)_n-SH ₊ P₂.’-_Z’-Y'-E’-S-S-X Ρ·. ’-(Ζ-Υ-Ε) -S-S-Ε’-Υ'-Ζ'-Ρ ' + X-SH

Λ η ι

A proteína Ρ₂ ¹ substituída por um átomo de enxofre activado é obtida a partir da própria proteína P₂ ou da proteína P₂ correctamente protegida, por substituição com o auxílio de um reagente ele proprio portador de um átomo de enxofre activado de acordo com o esquema:

+ L-Y¹-R-S-S-X

P ’-Ζ'-Υ'-R-S-S-X no qua1:

- P₂ designa a proteína a substituir;

- L-Y' representa uma fupção que permite a fixação eovalente do reagente sobre a proteína.

agrupamento funcional L-Y' é uma função capaz de se ligar de um modo eovalente com uma qualquer das funções transportadas pelas cadeias laterais dos aminoácidos constituídos da proteína a substituir. Entre

estas destacam-se particularmente

a) As funções aminadas terminais das cadeias peptídicas ou as funções aminadas laterais dos radicais lisilo contidos na proteina.

Neste caso, L-Y' poderá principalmente representar:

- um grupo carboxílico que poderá ligar-se âs funções aminadas da proteina em presença de um agente de junção tal como uma carbodiimida e especialmente um derivado solúvel na água como a etil-1 (dimetilamino-3 propil )-3 carbodiimida;

- um cloreto de ácido carboxílico que é susceptível de reagir directamente com as funções aminadas para as oscilar;

- um éster dito activado tal como um éster de orto- ou paranitro ou dinitro-fenilo ou ainda um éster de N-hidroxi succini. mida que pode reagir directamente com as funções aminadas para as acilar;

- um anidrido interno de um diácido carboxílico tal como, por exemplo, o anidrido succínico que reage expontaneamente com as funções aminas para criar ligações amidas;

um agrupamento imidoéster,

.NH
-C X °^RZ	(L = OR₂, Y = -(C=NH)-)

em que R₂ é um grupo alquilo, que reage com os grupos aminados da proteína P₂ de acordo com a reacção:

H i

N

----> P '-NH-C-R + R OH

7. J 2 em que Rg representa o grupo -R-S-SX;

b) as funções fenol dos radicais tirosilo contidos na proteína.

Neste caso L-Y’ poderá principalmente representar um agrupamento imidazolil-1 carbonilo, que reage com os grupos fenol da proteína de acordo com a reacção:

> P ' OCO-R

L 4

em que o 1-imidazolilo é L, o grupo CO é Y' e R^ é o grupo

-R-S-S-X.

radical -S-S-X indica um di-sulfureto mixto activado capaz de reagir com um radical tiol livre. Em particular, neste di-sulfureto mixto, X pode rá indicar um grupo piridil-2 ou piridil-4, eventualmente substituído por um ou por vários radicais alquilo, halogénio ou carboxílico. X pode indicar também um grupo fenilo de preferencia substituído por um ou por vários grupos nitro ou carboxílico. X pode ainda representar um grupo alcoxicarbonilo, tal como o grupo metoxicarbonilo.

radical R indica a estrutura de espeçamento (indicada como E na fórmula geral II atrás referida) capaz de transportar simultaneamente os substituintes Y' e S-S-H. 0 radical R deverá ser escolhido de modo a não comportar funções susceptíveis de interferir no decurso de reacções ulteriores com os reagentes utilizados e os produtos sintetizados·. Em particular, o grupo R pode ser um grupo -(CHg) com n compreendido entre 1 e 10, ou ainda um grupo:

ch I

CH I no qual Rg indica o hidrogénio ou um grupo alquilo tendo de 1 a 8 átomos de carbono e Rg indica um substituinte inerte em relação aos reagentes utilizados ulteriormente, tal como um grupo carbamato

em que Ry indica um grupo alquilo linear ou ramificado tendo de 1 a 5 átomos de carbono e especialmente o grupo terciobuti lo.

A reacção do composto L-Y¹-R-S-S-X com a proteína Pp é efectuada em fase líquida homogénea mais frequentemente na água ou numa solução tampão. Quando a solubilidade dos reagentes o exige, é possível acre£ centar ao meio reaccional um solvente orgânico miscível com a água numa concentração final que pode atingir 20% em volume quando se trata de um álcool terciário, tal como o butanol terciário ou 10% em volume quando se trata de dimetiIformamida ou do tetrahidrofurano.

A reacção é realizada à temperatura ambiente durante um periodo de tempo variando entre alguns minutos e algumas horas. Após o que, uma diálise ou uma filtração sobre gel permite eliminar os produtos de fraca massa molecular e, em particular, os excessos de reagentes. Este processo permite introduzir um certo número de agrupamentos substituintes por mole de proteína habitualmente compreendidos entre 1 a 15.

Ao utilizar esses compostos a junção com a proteína Pj é realizada colocando em presença as duas proteínas em solução aquosa com um pH compreendido entre 6 e 8, a uma temperatura que não ultrapasse 30°C, durante um periodo de tempo que varia entre 1 hora e 24 horas. A solução aquosa obtida é eventualmente dialisada para eliminar os produtos de fraca massa molecular, podendo em segui-34da o conjugado ser purificado por diversos métodos conhecidos .

B) Caso da ligação tioéster.

A preparação do conjugado consiste então em fazer reagir P₁’-(Z-Y-E)_n-SH com a proteína P₂ sobre a qual terá sido préviamente introduzido um ou vários radicais maleimida.

A reacção é então representada pelo esquema que se segue citado como exemplo:

S-(E-Y-Z)_nPl‘ no qual:

- Rg representa uma estrutura de espaçamento, alifática ou aromática comportando de 1 a 15 átomos de carbono, inerte em relação a reagentes utilizados ulteriormente;

- Z¹ representa grupos variáveis de acordo com o tipo de agrupamento funcional da proteína P₂ que intervem na junção. Assim Z¹ = oxigénio no caso de um éter sobre o fenol de um residuo tirosilo:

- Z' = NH no caso de da junção de um agrupamento carboxílico activado sobre um agrupamento aminado da proteína;

- Z' = NH-CH₂ no caso da reacção de uma clorometilcetona sobre um agrupamento aminado da proteína.

A proteína P₂ substituída pelo ou pelos grupos maleimida é obtida a partir da própria proteína P₂ ou da proteína P₂ correctamente protegida, por substituição de funções convenientes da proteína com o auxílio de um reagente ele proprio portador do agrupamento maleimida.

Entre estas funções convenientes, deve destacar-se particularmente:

a) As funções aminadas terminais das cadeias peptídicas ou as funções aminadas laterais dos resíduos lisilo contidos na proteína. Neste caso, o reagente portador do radical maleimida poderá ser:

- quer um reagente com a fórmula geral:

na qual L-CO- representa:

. quer um grupo carboxilico, sendo então a reacção efectuada apôs activação da função carboxílica em presença de um agente de junção, tal como uma carbodiimida e nomeadamente um deriva^ do solúvel na âgua, tal como a 1-eti1-3-(3-dimeti1amino propil) carbodiimida, quer um éster dito activado tal como um éster de ortoou para- nitro ou dinitrofenilo, ou ainda um éster de N-hidro xissuccinimida que reage directamente com as funções aminadas para as acilar,

A preparação desses reagentes é especialmente descrita em Helvetica Chimica Acta 58, 531-541 (1975). Encoritram-se comercialmente disponíveis outros reagentes da mesma classe.

- quer um reagente com a fórmula geral:

capaz de reagir com os agrupamentos aminados da proteina P2 de acordo com 0 esquema:

b) As funções fenol dos radicais tirosilo contidos na proteina. Naste caso, 0 reagente portador do radical maleimida poderá ser um reagente com a fórmula geral:

reagindo com os grupos fenol da proteína de acordo com a reacção:

-N

+ p 'OH l

A reacção dos reagentes portadores de maleimída com a proteína P₂ é efectuada em fase líquida homogénea mais frequentemente em água ou numa solução tampão. Quando a solubilidade dos reagentes o exige, é possível acrescentar ao meio reaccional um solvente orgânico miscível com a água numa concentração final que pode atingir 20% em volume quando se trata de um álcool terciário tal

como o butanol terciário ou 10% em volume quando se trata da dimetiIformamida ou do tetrahidrofurano.

A reacção é efectuada â temperatura ambiente durante um período de tempo que varia entre alguns minutos e algumas horas. Após o que, uma diálise ou uma filtração sobre gel permite eliminar os produtos de fraca massa molecular e, em particular, os excessos de reagentes. Este processo permite introduzir um certo numero de agrupamentos substituintes por mole de proteina habitualmente compreendido entre 1 e 15.

Ao utilizar tais compostos a junção com a proteina P₂ ê realizada colocando em presença de dois derivados proteicos em solução aquosa com um pH compreendido entre 6 e 8, az uma temperatura que não ultrapasse 30°C., durante um período de tempo variando entre 1 hora e 24 horas. A solução obtida é eventualmente dializada para eliminar os produtos de fraca massa molecular, podendo em seguida o conjugado ser purificado por meio de diversos métodos conhecidos.

Entre os compostos do presente invento, são particularmente convenientes os que têm a fórmula (II) na qual W' representa um dos agrupamentos (a), (b), (c) e (d) atrás referidos, em que E e E¹ representam um grupo -(CH₂)p-sçndo p um número inteiro de 2 a 7 ou um grupo:

-CHch₂cooh

Assim derivados de proteina particularmente interessantes são representados pela fórmula estatística:

P₂ - 0 - CO - E - G (VI) em que:

- P₂ representa o radical de uma proteina escolhida entre:

qualquer anticorpo ou fragmento de anticorpo ou qualquer imunoglobulina ou fragmento de imunoglobulina ou qualquer molécula que deriva das anteriores por modificação artificial de um qualquer dos seus grupos funcionais;

. a tricosantina ou a tricoquirina ou qualquer molécula que derive das referidas toxinas por modificação artificial de qualquer um dos seus agrupamentos funcionais;

sendo o referido radical a proteina privada de um ou de vários grupos hidroxilos fenólicos das tirosinas;

- o átomo de oxigénio é o dos grupos hidroxilos fenólicos que faltam no radical P₂;

- E e G tal como foram atrás definidos.

Particularmente preferidos são os compostos com a fórmula (VI) na qual E representa um grupo “(^CH2^p”’ ^em P um número inteiro de 2 a 7 ou um

grupo:

-CHI

CH₂COOH e G é um agrupamento com estrutura -S-S-X, em que X é um radical activador escolhido entre os grupos 2-piridilo e

4-piridilo não substituídos ou substituídos por um ou por vários halogéneos por radicais alquilo, carboxilo, alcoxicarbonilo, o grupo fenilo não substituído ou substituído por um ou por vários halogéneos ou por grupos nitro, alcoxi, carboxilo ou alcoxicarbonilo, ou um grupo alcoxicarbonilo.

Os produtos com a fórmula (VI) são preparados fazendo reagir um produto com a fórmula P2-OH, na qual P₂ é tal como foi atrás definido e sendo o grupo hidroxilo o hidroxilo fenólico que falta nas tirosinas do radical P2, com um composto com a fórmula (VII) a seguir:

[=“\

N-CO-E-G (VII) a uma temperatura de 10 a 40°C num solvente aquoso contendo eventualmente um solvente orgânico miscível com a água, tal como por exemplo um solvente etéreo como 0 dioxano ou 0 tetra h idrofurano.

Os exemplos que se seguem permitem compreender melhor o invento sem limitar o seu âmbito.

anticorpo monoclonal

AT15E, é dirigido contra o antigénio Thy 1.2 dos linfocitos murinos. Este anticorpo é o descrito em Journal of Immunology 122, 2491-8 (1979) e foi obtido a partir do hibridoma descrito em Hybridoma 1 (1), 13-17 (1981).

Nos exemplos, a tricoquirina é designada pela abreviatura TK.

Exemplo 1

Isolamento da tricoquirina

A) Extracto bruto

Sementes de Tricosanthes Kirilowii (1,2 kg) são esmagadas num aparelho Ultraturrax com 8 volumes de solução de cloreto de sódio 0,14 M contendo tampão fosfato 5mM, pH 7,5 A extraeção é realizada durante uma noite a 4°C sob agitação magnética.

Após eliminação dos resíduos grosseiros,procede-se a uma centrifugação a 10,000 g a 0°C durante 45 minutos. 0 produto flutuante é decantado a frio para aliminar as gorduras solidificadas sendo em seguida as proteínas precipitadas por adição de sulfato de amónio até â saturação. Após centrifugação tal como foi atrás indicado, o produto precipitado é levado de novo a suspensão em 1 litro de solução aquosa 0,14 M de cloreto de sódio contendo tampão fosfato 5mM, pH 7,5. 0 produto não dissolvido é eliminado por centrifugação nas mesmas condições que foram atrás referidas. 0 produto flutuante é feito passar sobre uma coluna de Sephadex G 25 coarse (grosseiro) 95 cm X 10 cm) equilibrada com o tampão fosfato 5mM, pH 7,0 â temperatura ambiente e eluida â velocidade de 3 1/hora. E recolhido o primeiro pico.

Β) Cromatografia de permuta de iões

Os extractos combinados de 2 operações (provenientes originalmente de 2,4 kg de semente são adicionados a cloreto de sódio até uma concentração final de 30 mM e passados sobre uma coluna (17,5 cm X 5 cm) de CM-Sepharose Fast Flow equilibrada com tampão fosfato 30mM, pH 7,0. 0 produto não fixado é eluido com o mesmo tampão.

A proteina ligada é eluida por um gradiente contendo de 30 a 110 mM de cloreto de sódio no mesmo tampão fosfato (volume 20 litros). São recolhidas fracções de 400 ml à velocidade de 1,2 litros por hora. A absorvência a 280 nm e a condutividade do eluente são controlados. As fracções que revelam uma actividade inibidora da síntese proteica são reunidas (3,6 1) e acidificadas para um pH 5,8 pelo ácido acético. Passa-se a solução sobre uma coluna de S-Sepharose Fast Flow (6,6 cm x 5 cm) equilibrada com o tampão acetato de sódio 10 mM, pH 4,5 . Após lavagem com o mesmo tampão, a proteina fixada é eluida por tampão fosfato 20 mM, pH 7,5 contendo cloreto de sódio 0,5 M.

A fracção correspondente ao pico contendo a proteina (200 ml) é recolhida e dialisada contra 3 vezes 50 1 de água destilada sendo em seguida liofilizada. Obtém-se assim 380 mg de trícoquirina.

C) Filtração sobre gel

A tricoquirina atrás obtida é dissolvida em 50 ml de solução de cloreto de sódio 0,14M. Elimina-se um produto insolúvel por centrifugação a 20,000 g durante 30 minutos. 0 produto flutuante é feito passar uma coluna de Sephadex G 50 coarse (grosseiro) (95 cm x 5 cm) equilibrada com o tampão fosfato 5 mM, pH 7,0 a 4°C Faz-se a eluição â velocidade de 60 ml/hora. A solução correspondente ao pico que contém a proteina é recolhida, dialisada e liofilizada tal como foi atrás indicado.

Obtém-se assim 267 mg de tricoquirina purificada.

Exemplo 2

S-Acetilmercaptosuccinoi1 tricoquirina mercaptosuccinoi1 tricoqui rina

A 5,8 mg de tricoquirina (0,215 micromole) dissolvida em 6 ml de tampão fosfato 125 mM pH 7 (ou seja 0,973 mg/ml cerca de 0,036 micromole/ml) são adicionados 100 microlitros de uma solução de anidrido S-acetilmercaptosuccínico (SAMSA) a 10,5 mg/ml (60,33 micromo les/ml em dimetilformamida. A incubação dura uma hora sendo em seguida o meio reaccional purificado do excesso de reagente

-46por diálise contra tampão fosfato 125 mM pH 7. Obtém-se assim 5,7 ml de uma solução de S-acetilmercaptosuccinoi1 tricoquirina a 0,948 mg/ml. Por acção da hidroxilamina e de acordo com o método de ELLMAN (Methods in Enzymology 25, 457. (1972) obtem-se o mercaptosuccinoi1 tricoquirina contendo 0,7 grupos SH livres por mole de tricoquirina (dosagem espectrofotométrica). Examinada por electroforese em gradiente de poliacrilamida esta proteína modificada apresenta uma única banda de peso molecular próximo de 28.000 + 3.000 idêntica â da proteína nativa.

Exemplo 3

Conjugado obtido por reacção entre o anticorpo AT15E (Anti-THY 1.2) a mercaptosuccinoi1 tricoquirina

A) Preparação do anticorpo AT15 modificado.

anticorpo AT15E é um anticorpo monoclonal dirigido contra o antigénio Thy 1.2 dos linfocitos murinos. Este anticorpo é o que é descrito em Journal of Immunology 122, 2491-8 (1979) e foi obtido a partir do hibridoma descrito em Hybridoma 1(1); 13-17(1981

Α 3,7 ml de uma solução de anticorpo AT15E a 3,55 mg/ml (ou seja 0,087 micromole) num tampão borato 0,1 M pH 8,8 acrescentam-se 25 microlitros de uma solução de 3-N-succinimidi1-3-(2-piridi1 di-sulfanil) propionato a 5,5 mg/ml em etanol.

A incubação dura 30 minutos sendo em seguida eliminado o excesso de reagente por diálise contra tampão fosfato 125 mM pH 7. Após diálise a solução proteica é centrifugada e obtém-se 3,3 ml de uma solução a 3,4 mg/ml. Por doseamento espectrofotométrico a 343 nm da piridi no-2-tiona libertada por troca com o 2-mercapto-etanol verifica-se que se obteve um anticorpo transportando 3,2 agrupameii tos di-sulfureto mixto activado por mole de anticorpo.

B) Preparação da imunotoxina (conjugada).

A 1,9 ml da solução de anticorpo activado anteriormente obtido (ou seja 0,043 micro mole) acrescentam-se 5 ml da solução de tricoquirina modifTA· cada anteriormente obtida (ou seja 0,183 micromole) e incuba-se 20 horas a 25°C em presença de 350 microlitros de uma solução molar de cloridrato de hidroxilamina. A solução é centrifugada e depois purificada por filtração sobre coluna de Sephadex G200 com medição da densidade óptica do efluente a 280 nm. 0 reagrupamento das fracções contendo ao mesmo tempo o anticorpo e a TK conduz a 20 ml de uma solução de imunotoxina a 0,215 mg/ml (ou seja 4,3 mg). Esta solução contém 0,045 mg/ml de tricoquirina modificada ligada ao anticorpo.

-48A taxa de ligação média nesta preparação é de 1,5 TK por mole de anticorpo.

conjugado assim obtido tem a fórmula (Illa) atrás referido na qual:

- P¹ é o radical do anticorpo AT15E privado de tensões amina, e

- m é 1,5

TESTES DE ACTIVIDADE DAS IMUNOTOXINAS

Uma das propriedades da tricoquirina é a de inibir a síntese das proteínas nas células eucariotas. Os testes realizados são pois testes de inibição da síntese proteica:

- quer sobre um modelo acelular, quer sobre um modelo celular.

Α) Ο modelo acelular protocolo in vitro utiliza fracções subcelulares de figado de rato convenientemente complementadas e capazes de incorporar a 14C-fenilalanina em presença de um ARN mensageiro artificial, o ácido poliuridilico.

modo operatório utilizado para preparar as fracções subcelulares e para medir a incorporação de 14C-fenilalanina é uma adaptação do método descrito em Biochimica et Biophysica Acta 312, 618-615 (1973), produzindo ao mesmo tempo uma fracção microsomal e uma fracção de citosol dos hapatocitos de rato. A amostra contendo a tricoquirina é introduzida sob a forma de uma solução convenientemente diluida num tampão tris-HCl 50 mM pH 7,6 contendo 2-mercapto-etanol a 0,2% e soro da albumina bovina a 15 microgramas/ml. A partir dos dados da contagem calcula -se, em relação a um meio testemunha sem inibidor, a percent£ gem de inibição da incorporação de 14C-fenilalanina para cada meio reaccional.

conjunto dos valores obtidos permite determinar a concentração de tricoquirina (ou CI₅₀) que inibe 50% da incorporação da 14C-fenilalanina nas condições do ensaio, terminou-se assim que a Cl que a da /1itro. tante de

Para a tricoquirina nativa, de₅₀ é igual a 7,10^_1ϊ M, enquanto tricoquirina modificada é de 8 a 10.10^ mole/

A modificação não conduz pois a uma perda imporactividade da tricoquirina.

*

Β) Citotoxicidade específica da imunotoxina tricoquirina sobre modelo celular.

A actividade biológica da tricoquirina é a de inibir a sintese proteica celular dos sistemas aucariontes. A técnica utilizada produz um modelo celular no qual se mede o efeito das substancias estudadas sobre a incorporação de 14C-leucina nas células cancerosas em cultura. As células utilizadas pertencem â linhagem celular T2, proveniente de uma leucemia T de ratinho que exprime o antigénio de superfície Thy 1.2 . As células são incubadas em presença da substancia a estudar em diferentes concentrações e em seguida, no fim da incubação, procede -se à medição da taxa de incorporação de 14C-leucina pelas células assim tratadas.

Esta medida é efectuada de acordo com uma técnica adaptada por processo descrito em Journal of Biological Chemistry 249(11), 3557-3562, (1974), utilizando o marcador 14C-leucina para a determinação da taxa da sintese proteica. A determinação da radioactividade da incorporada é efectuada aqui sobre células inteiras isoladas por filtração.

A partir destas determinações, podem traçar-se as curvas efeitos doses apresentando em abcissa a concentração molar em tricoquirina das substancias estudadas e em ordenada a incorporação de 14C-leucina expressa em percentagens da incorporação das células testemunhas na ausência de qualquer substancia que afecte a sintese proteica.

-51Pode assim determinar-se para cada substancia estudada a concentração que inibe 50% da incorporação de 14C-leucina ou concentração inibidora 50 (CI_5Q). 0 Quadro 2 representa os valores de CI₅₀ obtidos na mesma experiencia com a imunotoxina com tricoquirina por um lado, a tricoquirina não ligada por outro lado

QUADRO 2

Produtos	Concentração inibidora 50
IT com tricoquirina	: 2 x 10¹⁰ M
Tricoquirina	2 x IO'⁶ _M

52Pode verificar-se que a IT com tricoquirina tem uma actividade citotâxica muito forte que é mais de 10.000 vezes superior â da tricoquirina não ligada .

Exemplo 4

Conjugado obtido por reacção entre o anticorpo AT15E (Anti-Thy 1.2) e o 3-(2-piridi1-di-sulfani1 )propionato de tricoquirina

A. Preparação do anticorpo modificado.

A 20,1 mg de uma solução de anticorpo AT15E a 4,02 mg/ml (ou seja 0,134 micromoles) são acrescentados 50 microlitros de uma solução de anidrido S-acetilmercaptosuccinico (SAMSA) a 35 mg/ml em dimetilformamida. 0 meio reaccional é incubado 2 horas e 30 a 10°C sendo em seguida purificado do excesso de reagente por diálise contra tampão fosfato 125 mM pH 7.

Obtém-se 4,5 ml de uma solução a 3,7 mg/ml.

A 4,5 ml desta solução de anticorpo são acrescentados 200 microlitros de uma solução

de cloridrato de hidroxilamina 1 M. Após uma incubação de 2 horas a 25°C o meio reaccional é purificado por diálise da hidroxilamina contra tampão fosfato 125 mM pH 7.

Por doseamento espectrofotométrico dos agrupamentos SH libertados pelo método de Ellmann verifica-se que se obteve uma IgG transportando 3,8 agrupamentos SH por mole de anticorpos.

B) Preparação do reagente de ligação

Trata-se da imidazolida derivada do ácido (piridil-2 di-sulfani1)-3 propiónico cujo método de preparação foi já descrito no requerimento da Patente Europeia N^s 169.111.

215 mg de ácido 3-(2-piridil- di-sulfani1)propionico são dissolvidos em 0,5 ml de tetra-hidrofurano. A esta solução são acrescentados 203 mg de CDI (carbonil diimidazol). A mistura é agitada 15 minutos a 25°C. Observa-se uma libertação gasosa de C0₂· 0 meio reaccional é utilizado directamente e imedia tamente sem purificação.

C) Modificação da tricoquirina

A 5 mg de TK em 5 ml de tampão fosfato 125 mM pH 7 (ou seja 0,185 micromoles) são acrescentados 18,5 microlitros da solução do reagente de ligação em THF. Deixa-se a mistura incubar 15 minutos a 25°C sendo em seguida o meio reaccional purificado do excesso de reagente por diálise contra tampão fosfato 125 mM pH 7. Após centrifugação (15 mn 15.000 RPM) obtém-se

4,4 ml de uma solução de TK modificada a 0,94 mg/ml.

Por doseamento espectrofotométrico a 343 nm da piridina tiona-2 libertada por troca com o mercapto-2 etanol verifica-se que se obteve uma TK (TQ) transportando 0,6 agrupamento activador por mole de TK (TQ).

D) Preparação da imunotoxina

A 0,5 ml da solução de anti_ corpos obtida anteriormente (ou seja 0,012 micromoles) acrescentam-se 1,8 ml da solução de TK (TQ) (ou seja 0,063 micromoles). Deixa-se a mistura incubar 20 horas a 30°C.

meio reaccional é purificad por doseamento sobre uma coluna ACA44, comercializada por

IBF-Rhome-Poulenc, e a eluição é seguida por medição da densidade óptica do efluente a 280 nm. A eluição é realizada com o auxílio do tampão PBS (fosfato salino). Obtém-se

6,6 ml de uma solução de imunotoxina a 0,146 mg/ml (ou seja

-550,966 mg). Esta solução contém 0,022 mg/ml de TK (TQ) modificada. A taxa de junção média desta preparação é de uma TK (TQ) por mole de anticorpo.

conjugado assim obtido tem a fórmula (Illb) atrás referida na qual:

- P' é o radical do anticorpo AT15E privado de funções amina , e

- m é 1.

E) Teste de actividade da imunotoxina obtida.

A medição da actividade citotóxica da imunotoxina é realizada de acordo com o mesmo processo que o descrito no exemplo 3.

quadro 3 representa os valores de obtidos na mesma experiencia com a imunotoxina com tricoquirina conjugada pelas tirosinas por um lado, a tricoquirina não ligada por outro.

Produtos .Concentração inibidora 50

IT na tricoquirina : 3 χ 10“^θ Μ

Tricoquirina 3 χ 10“ Μ

Pode verificar-se que a IT preparada pela conjugação de anticorpo a,nti Thy 1.2 â tricoquirina pelos seus resíduos tirosina tem uma actividade citotóxica muito forte que é 10.000 vezes superior â da tricoquirina não ligada.

-57Exemplo 5

Conjugado obtido por reacção entre o anticorpo anti-Thy 1.2 AT15E substituído por um agrupamento di-sulfureto activo e a TK (TQ) sobre a qual se introduziu um tiol

A) Preparação da TK (TQ) modificada.

A 7,25 mg de TK (TQ) dissolvida em 8,5 ml de tampão fosfato 125 mM pH 7 (ou seja 0,853 mg/ml) são adicionados 168 microlitros de uma solução aquosa de dimetil 3.3 ditiobispropionimidato (DTBP). A incubação dura 1 hora a 28°C e em seguida o meio reaccional é purificado do excesso de reagente por diálise contra tampão fosfato 125 mM pH 7. A ponte di-sulfureto do DTBP fixado â proteina é em seguida reduzido para o mercapto-2-etanol (com a concentração final de 1 por cento durante 1 hora a 30°C).

Prossegue-se a diálise contra tampão fosfato 125 mM pH 7 como anteriormente. Após centrifugação, Obtém-se 7 ml de uma solução de TK (TQ) modificada a 0,794 mg/ml. Sobre este produto o método de Ellman permite dosear 0,6 agrupamento SH livre por mole de proteina.

-58B) preparação do anticorpo modificado.

A 3 ml de uma solução de anticorpo AT15E a 4 mg/ml em tampão borato 0,1 M pH 8,8 são acrescentados 21 microlitros de uma solução contendo 5,2 mg de 3 propionato de N-succinimidi1 3(piridil-2-di-sulfanilo) dissolvido em 1 ml de etanol. A incubação dura 1/2 hora a 28°C sendo em seguida eliminado o excesso de reagente por diálise contra tampão fosfato 125 mM pH 7. Após diálise a solução proteica é centrifugada e obtém-se 2,3 ml de uma solução a 3 mg/ml.

Por dosagem espectrofotométrica a 343 nm da piridinotiona-2 libertada por permuta com o mercapto-2-etanol, verifica-se que se obteve um anticorpo transportando 3,8 agrupamentos di-sulfureto mixtos activados por mole de anticorpo.

C) Preparação da imunotoxina

A 2 ml da solução de anti corpo modificada anteriormente obtida, acrescentam-se 5,4 ml da solução de TK (TQ) modificada obtida em A) e incuba-se durante 6 horas a 28°C. A solução é centrifugada e depois purificada por filtração sobre uma coluna de Sephacryl S200 HR com medição da densidade óptica do efluente a 280 nm.

-590 reagrupamento das fracções contendo ao mesmo tempo o anticorpo e a TK (TQ) conduz a 14 ml de uma solução de imunotoxina a 0,09 mg/ml. A taxa de junção média desta preparação é de 1,5 mole de TK (TQ) por mole de anticorpo.

conjugado assim obtido tem a fórmula (III) atrás referida na qual:

- P' é o radical do anticorpo AT15E privado de funções amina

-W' é um agrupamento -Z^!-Y'-E^!-S-S-(Ε-Ύ-Ζ) - em que

Z' é NH

Y' é CO

E' é CH₂CH₂

E é CH₂CH₂

Y é C=NH

Z é NH n é 1

- A¹ é o radical da trícoquirina tal qual privado de funções amina, e m é 1,5.

D) Teste de actividade da imunotoxina obtida

A medição da actividade da imunotoxina é realizada de acordo com o mesmo processo que foi descrito no exemplo 3. 0 quadro 4 representa os valores de obtidos na mesma experiencia com a imunotoxina com tricoquirina preparada tal como foi atrás referi do por um lado e a tricoquirina não ligada por outro.

Quadro 4

Produtos

Concentração inibidora 50

IT na Tricoquirina .

8-10 x 10^-11 M

Tricoqui rina x IO'⁶ M

-61Pode verificar-se que a IT tem uma actividade citotóxica muito forte que é 30.000 vezes superior ã da tricoquirina não ligada.

Esta nova classe de imunotoxinas pode ser utilizada para o tratamento das afecções cancerosas ou não para as quais as células alvo a des.truír seriam reconhecidas pelo anticorpo ou o fragmento de anticorpo utilizado para a preparação da imunotoxina.

As modalidades óptimas de administração assim como a duração do tratamento deverão ser determinadas em cada caso em função do indivíduo e da natureza da afecçao a tratar.

Os produtos fisiológicamente activos do invento podem ser formulados para a administração por qualquer via conveniente. Mais frequentemente o principio activo será administrado por injecção e será formulado num líquido estéril apirogénico. de preferencia água que pode conter sais fisiologicamente aceitáveis tais como tampões ou cloreto de sódio de modo a obter uma solução isotónica.

Para um tratamento antitumoral. a dose diária de tricosantina ou tricoquirina como conjugado está de preferencia compreendida entre I e lOOmg. vantajosamente entre 5 e 50mg e por exemplo cerca de 10 mg.

As unidades/de dosagem contendo a tricosantina ou a tricoquirina sob a forma de conjugado. por exemplo ampolas para injecção. deverão pois conter habitualmente de 1 a 100 mg de conjugado de tricoquirina ou de tricosantina.

Pode verificar-se que a IT tem uma actividade citotóxica muito forte que é 30.000 vezes superior â da tricoquirina não ligada.

Esta nova classe de imunotoxinas pode ser utilizada para o tratamento das afecções cancerosas ou não para as quais as células alvo a destruir seriam reconhecidas pelo anticorpo ou o fragmento de anticorpo utilizado para a preparação da imunotoxina. As modalidades óptimas de administração assim como a duração do tratamento deverão ser determinadas em cada caso em funções do indivíduo e da natureza da afecção a tratar.

Os produtos fisiológicamente activos do invento podem ser formulados para a administração por qualquer via conveniente. Mais frequentemente o principio activo será administrado por injecção e será formulado num líquido estéril apirogénicode preferencia água que pode conter sais fisiológicamente aceitáveis tais como tampões ou cloreto de sódio de modo a obter uma solução isotónica.

Para um tratamento antitumoral. a dose diária de tricosantina ou de tricoquirina como conjugado está de preferencia compreendida entre 1 e 100 mg. vantajosamente entre 5 e 50 mg e por exemplo cerca de 10 mg.

As unidades de dosagem contendo a tricosantina ou a tricoquirina sob a forma de conjugado, por exemplo ampolas para injecção. deverão pois conter habitualmente de I a 100 mg de conjugado de tricoquirina ou de tricosantina.

Claims

l^â, - Processo para a obtenção de uma imunotoxina tendo a fórmula estatística que se segue:

REIVINDICAÇOES

P^: -W - A¹ (I) na qual

P’ representa o radical de uma proteina que é um anticorpo ou um fragmento de anticorpo tal qual ou convenientemente modificados quimicamente, privada de uma ou várias funções próprias e na qual os outros grupos funcionais são eventualmente bloqueados ; A^; representa o radical de uma proteina A que é a tricosantina ou a tricoquirina tal e qual ou convenientemente modificada quimicamente, privada de uma ou de várias funções próprias e na qual os outros grupos funcionais são eventualmente bloqueados e W representa uma estrutura covalente bivalente contendo pelo menos um grupo tioéter ou um grupo di-sulfureto. em que. um dos átomos de enxofre é ou o das cisteinas de P e A, ou está ligado às funções próprias de P e/ou A por estruturas de espaçamento transportando um grupo funcional ligado às referidas funções próprias de P e/ou de A; caracterizado por se fazer reagir em solução aquosa e â temperatura ambiente uma proteina Pp que é indiferentemente quer a tricosantina quer a tricoquirina eventualmente modificadas, quer um anticorpo ou fragmento de anticorpo, portadora de pelo menos um grupo tiol livre ligado à referida proteina Pj directamente ou por intermédio de uma estrutura de espaçamento, com uma proteina P?. diferente de Pj , que é indiferentemente ou a tricosantina ou a tricoquirina modificadas eventualmente, quer um anticorpo ou fragmento de anticorpo, portador de um agrupamento capaz de ligação com o tiol livre da proteína Pj. de modo a formar uma ligação tioéter ou di-sulfureto.
2^â. - Processo de acordo com a reivindicação 1. caracterizado por A^: ser o radical da tricoquirina tal e qual ou convenientemente modificada quimicamente.
3^â. - Processo para a obtenção duma imunotoxina tendo a fórmula estatística seguinte:

P^: - W' - A^: (II) na qual P' e A' sao tais como definido na reivindicação 1 e W’ representa uma estrutura covelente escolhida entre:

a) um agrupamento de fórmula:

O

b) um agrupamento de fórmula:

o o

c) um agrupamento de fórmula:

-Z^:-Y=_E^!-S-S-(E-Y-Z)_n-

d) um agrupamento da fórmula

-S-S-(E-Y-Z)_n em que:

- Z e Z . idênticos ou diferentes, representam as funções próprias das proteínas A e P. escolhidas entre o átomo de oxigénio proveniente do hidroxilo de um dos resíduos de tirosina; o grupo carbonilo proveniente de um dos carboxilos terminais ou dos carboxilos livres dos ácidos aspárticos e/ou glutâmicos de A e de Ρ; o grupo proveniente da estrutura dialdeidica obtida após oxidação da estrutura glicfdica de P ou de A através do acido per-iódico; e o grupo -NHproveniente de uma das aminas terminais de A e de P ou de uma das aminas em posição apsilon de um dos resíduos de

-66lisina;

- Y e Y' representam grupos envolvidos numa ligação covalente com uma qualquer das funções Z e Z' e as proteínas A e P;

- E e E¹ representam as estruturas de espaçamento inertes;

- n representa zero ou 1;

caracterizado por se fazer reagir, em solução aquosa e â temperatura ambiente, uma proteína Pp que é. indiferentemente, quer a tricosantina ou a tricoquirina eventualmente modificadas. quer um anticorpo ou fragmento de anticorpo, portador de pelo menos, um grupo tiol livre ligado à referida proteína Pj, directamente ou pelo intermediário de uma estrutura de espaçamento, com uma proteína P?· diferente de Pp que é, indiferentemente, quer a tricosantina ou a tricoquirina. eventualmente modificadas, quer um anticorpo ou fragmento de anticorpo, portador de um agrupamento capaz de acoplamento com o tiol livre, de modo a formar uma ligação tioéter ou di-sulfureto.
4^S. - Processo para a obtenção de uma imunotoxina tendo a fórmula estatística seguinte :

P^! (W'-A^!) na qual W' é tal como definido na reivindicação 3 e m varia entre 0.3 e 12; P- e A^r são tal como definido na reivindicação 1. caracterizado por se fazer reagir, em solução aquosa e â temperatura ambiente, uma proteína Pp que é. indiferentemente. quer a tricosantina ou a tricoquirina eventualmente modificadas, quer um anticorpo ou fragmento de anticorpo.portador de pelo menos, um grupo tiol livre ligado â referida proteina Pj. directamente ou pelo intermediário de uma estrutura de espaçamento, com uma proteína P₂. diferente de Pj, que é. indiferentemente, quer a tricosantina ou a tricoquirina, eventualmente modificadas, quer um anticorpo ou f fragmento de anticorpo, portador de um agrupamento capaz de acoplamento com o tiol livre, de modo a formar uma ligação tio éter ou di-sulfureto.
5^â. - Processo de acordo com a reivindicação 4. para a obtenção duma imunotoxina tendo a fórmula estatística seguinte p -(nh-co-ch₂-ch₂-s-s-ch-conh-tk’ )_m i

CH₂-C00H na qual

Ρ¹ e m são tal como definido na reivindicação 4. e TK' e o radical tricoquirina tal qual, privado de funções amino, caracterizado por se fazer reagir, em solução aquosa e à temperatura ambiente, uma proteína Pj. que é um anticorpo ou fragmento de anticorpo, portador de pelo menos um grupo tiol livre ligado à referida proteína Pj directamente ou pelo intermediário de uma estrutura de espaçamento, com uma proteína P₂ que é a mercapto-succinoil-tricoquirina.
6^â. - Processo de acordo com a reivindicação 4, para a obtenção duma imunotoxina tendo a fórmula estatística seguinte:

p^!-(nh-co-ch₂-ch₂-s-s-ch₂-ch₂-co-o-tk)_m (Illt) na qual

P^: e m são tal como definido na reivindicação 4 e TK é o radical da tricoquirina tal qual, privado de funções hidroxilo fenólicas. caracterizado por se fazer reagir, em solução aquosa e à temperatura ambiente, uma proteína Pj. que é um anticorpo ou fragmento de anticorpo, portador de pelo menos, um.grupo tiol livre ligado â referida proteína Pj. directamente ou pelo intermediário de uma estrutura de espaçamento com uma proteína P₂. que é o 3-(2-piridi1-di-sulfanil )-propionato de tricoquirina.

73. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 4. caracterizado por a proteína A ser a tricoquirina modificada de fórmula:

TK°-(CO-CH-S-Q) í ^P ch₂-cooh na qual TK° representa o radical de tricoquirina. Q representa hidrogénio ou o grupo acetilo e p varia entre 0. 2 e 3.
8^ã. - Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 6. caracterizado por se utilizar como proteína Pj e P? um derivado de proteínas de fórmula estatística:

P₂-0-C0-E-G (VI) na qual:

- P₂ representa o radical de uma proteína escolhida entre:

. todo o anticorpo ou fragmento de anticorpo ou toda a imunoglobulina ou fragmento de imunoglobulina ou toda a molécula que deriva das precedentes por modificação artificial de um qualquer dos seus grupos funcionais:

a tricosantina ou a tricoquirina ou toda a molécula derivada das referidas proteínas por modificação artificial de um qualquer dos seus agrupamentos funcionais:

sendo o referido radical a proteína privada de um ou de vários grupos hidroxilo fenólicos das tirosinas;

. o átomo de oxigénio é o dos grupos hidroxilo fenólicos que faltam no radical P“₂;

- E é tal como definido na reivindicação 3. e

G representa um grupo ou um grupo -S-S-X. em que.

X é um grupo activador.
9^â„ - Processo para obtenção de derivados de proteína de fórmula estatística

P₂ - 0 - CO - E - G (VI) na qual P₂. E e G sao tal como definido na reivindicação 8. caracterizado por se fazer reagir um produto da fórmula: P₂-0H. na qual P₂ é tal como definido anteriormente e em que o grupo hidroxilo e o hidroxilo fenólico que falta nas tirosinas do radical P₂. com um composto da fórmula (VII) seguinte:

(VII) na qual

E e G são tal como definidos anteriormente a uma temperatura de 10 a 40°C. num solvente aquoso contendo eventualmente um

-71solvente orgânico miscível com a água, tal como, por exemplo, um solvente etéreo como o dioxano ou o tetra-hidrofurano.