JPS6069034A - 免疫毒素、免疫毒素を含有する薬剤及び免疫毒素の生体外使用方法 - Google Patents
免疫毒素、免疫毒素を含有する薬剤及び免疫毒素の生体外使用方法Info
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- JPS6069034A JPS6069034A JP59132851A JP13285184A JPS6069034A JP S6069034 A JPS6069034 A JP S6069034A JP 59132851 A JP59132851 A JP 59132851A JP 13285184 A JP13285184 A JP 13285184A JP S6069034 A JPS6069034 A JP S6069034A
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- C07K—PEPTIDES
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- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
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- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、特にヒトの癌の化学的治療用医薬に係る。
より詳細には、本発明の目的は、既知の免疫毒素をであ
りながら、特に腫瘍細胞を認識する特異性を有する免疫
グロブリンと、細胞毒素を有する細菌又は植物起源の毒
素のような以下毒素と称する高細胞毒性剤との混合剤を
提供することである。
りながら、特に腫瘍細胞を認識する特異性を有する免疫
グロブリンと、細胞毒素を有する細菌又は植物起源の毒
素のような以下毒素と称する高細胞毒性剤との混合剤を
提供することである。
より詳細には、本発明の目的は、多数の腫瘍細胞に対し
て高特異性を有しており且つ腫瘍細胞内への迅速なイン
ターナリゼイション（ｉｎｔｅｒｎａｌｌ−ｓａｔｉｏ
ｎ）が可能な免疫毒素、ｉｎ ｖｉｔｒｏで腫瘍細胞の
破壊用に用いる前記免疫毒素の使用方法、及び前記免疫
毒素を有効成分として含有する医薬を提供することであ
る。
て高特異性を有しており且つ腫瘍細胞内への迅速なイン
ターナリゼイション（ｉｎｔｅｒｎａｌｌ−ｓａｔｉｏ
ｎ）が可能な免疫毒素、ｉｎ ｖｉｔｒｏで腫瘍細胞の
破壊用に用いる前記免疫毒素の使用方法、及び前記免疫
毒素を有効成分として含有する医薬を提供することであ
る。
特にヒトの癌の化学的治療は、使用される薬剤の特異性
の欠如により患者にはしばしば耐え難いような毒性が生
じるという点て一般に制約されている。従って、特に免
疫毒素型の混合剤を生成するごとにより高特異性の薬剤
を得るべく多くの研究が為されており、例えばこのよう
な研究は、“Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎｓ：Ａ ｎｅｗ
ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅ−ｒａ
ｐｙ”Ｅ．Ｓ．ＶＩＴＥＴＴＡ ｅｔ ｃｏｌｌ．Ｓｅ
ｉｅｎｃｅ２１９．６４４，１９８３中に開示されてい
る、。
の欠如により患者にはしばしば耐え難いような毒性が生
じるという点て一般に制約されている。従って、特に免
疫毒素型の混合剤を生成するごとにより高特異性の薬剤
を得るべく多くの研究が為されており、例えばこのよう
な研究は、“Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎｓ：Ａ ｎｅｗ
ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅ−ｒａ
ｐｙ”Ｅ．Ｓ．ＶＩＴＥＴＴＡ ｅｔ ｃｏｌｌ．Ｓｅ
ｉｅｎｃｅ２１９．６４４，１９８３中に開示されてい
る、。
しかしながら、ごの場合、
−処理すべき腫瘍細胞の非特異性抗原を認識する抗体を
使用しており、 −文献中に開示されている実験によると免疫毒素の細胞
内インターナリゼイション速度か極めて近い（１６〜３
０時間） という２つの主要因により結果か制限されている。
使用しており、 −文献中に開示されている実験によると免疫毒素の細胞
内インターナリゼイション速度か極めて近い（１６〜３
０時間） という２つの主要因により結果か制限されている。
この場合、従来の活性実験は本質的にｉｎ ｖｉｔｒｏ
て行なわれているものと見做す。
て行なわれているものと見做す。
本発明の目的は、悪性細胞と正常細胞との識別能に著し
く優れ、ｉｎ ｖｉｖｏで悪性細胞のみに毒素を迅速且
つ好活性でインターナライズし得る免疫毒素を提供する
ことにより、上記欠点の少なくとら一部を解消すること
にある。
く優れ、ｉｎ ｖｉｖｏで悪性細胞のみに毒素を迅速且
つ好活性でインターナライズし得る免疫毒素を提供する
ことにより、上記欠点の少なくとら一部を解消すること
にある。
より詳細には、本発明の免疫毒素は、動物細胞内への毒
素のインターナラインヨンが可能な条件下で、下記構造
。
素のインターナラインヨンが可能な条件下で、下記構造
。
Ｇａｌα（１→４）Ｇａｌβ（１→４）Ｇｌｃβ（１→
Ｉ）セラミドを有するクロポトリアオシルセラミド又は
セラミドトリヘクソシルに対して特異的であり毒素と結
合した抗体、好ましくは単クローン性抗体から本質的に
構成される。
Ｉ）セラミドを有するクロポトリアオシルセラミド又は
セラミドトリヘクソシルに対して特異的であり毒素と結
合した抗体、好ましくは単クローン性抗体から本質的に
構成される。
既知のようにある種の癌細胞、特に特定のＢＵＲＫＩＴ
Ｔ細胞は、Ｐ式血液型抗原の前駆体である物質Ｐｋと同
一の構造を有する中性糖脂質を表面に有する。糖脂質は
、グロボトリアオシルセラミド（ｇｌｏｂｔｒｉａｏｓ
ｙｌｃｅｒａｍｉｄｅ）又は以下ＣＴＨと称するセラミ
ドトリヘクソシル（ｃｅｒａｍｉｄｅｔｒｉｈｅｘｏｓ
ｙｌｅ）〔Ｅ．Ｎｕｄｅｌｍａｎ ｅｔ ｃｏｌｌ．，
Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２２０． ｐ．５０８５１１，（
１９８３）〕である。
Ｔ細胞は、Ｐ式血液型抗原の前駆体である物質Ｐｋと同
一の構造を有する中性糖脂質を表面に有する。糖脂質は
、グロボトリアオシルセラミド（ｇｌｏｂｔｒｉａｏｓ
ｙｌｃｅｒａｍｉｄｅ）又は以下ＣＴＨと称するセラミ
ドトリヘクソシル（ｃｅｒａｍｉｄｅｔｒｉｈｅｘｏｓ
ｙｌｅ）〔Ｅ．Ｎｕｄｅｌｍａｎ ｅｔ ｃｏｌｌ．，
Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２２０． ｐ．５０８５１１，（
１９８３）〕である。
他方本発明によると、動物細胞内への毒素のインターナ
リゼイションが可能な条件下で、毒素に結合したＣＴＨ
の単クローン性特異性抗体を含む免疫毒素は、表面にＣ
ＴＨを有する細胞内に従来の種々の免疫毒素より著しく
迅速に毒素をインターナライズされ得、免疫毒素の治療
活性は従来の免疫毒素よりも優れていた。
リゼイションが可能な条件下で、毒素に結合したＣＴＨ
の単クローン性特異性抗体を含む免疫毒素は、表面にＣ
ＴＨを有する細胞内に従来の種々の免疫毒素より著しく
迅速に毒素をインターナライズされ得、免疫毒素の治療
活性は従来の免疫毒素よりも優れていた。
これらの２つの結果は極めて驚くべきものであり本発明
の目的を満足するか、従来技術の免疫毒素の各作用メカ
ニズムを考慮すると本発明の免疫毒素の効果は更に顕著
であり、従来の免疫学的方法では表面で検出し得なかっ
た特異性抗原を大量に有する細胞（例えばＢＵＲＫＩＴ
Ｔリンパ肉腫細胞）のみならず一連の腫瘍細胞をも死滅
させることか可能である。
の目的を満足するか、従来技術の免疫毒素の各作用メカ
ニズムを考慮すると本発明の免疫毒素の効果は更に顕著
であり、従来の免疫学的方法では表面で検出し得なかっ
た特異性抗原を大量に有する細胞（例えばＢＵＲＫＩＴ
Ｔリンパ肉腫細胞）のみならず一連の腫瘍細胞をも死滅
させることか可能である。
本文中、毒素なる語は、本発明の免疫毒素を用いて細胞
中に侵入させ得る投与量で細胞を死滅させ得るに十分な
毒性を有しており、非特異性固定ザイトを含まないかあ
るいは除去されているあらゆる分子の意である。好まし
くは、選択される毒素は例えばリシンＡ鎖、ゲロニン（
ｇｅｌｏｎｉｎｅ）、アブリン又はジフテリアトギンン
Ａ鎖のような植物又は細菌起源の毒素であり得る。
中に侵入させ得る投与量で細胞を死滅させ得るに十分な
毒性を有しており、非特異性固定ザイトを含まないかあ
るいは除去されているあらゆる分子の意である。好まし
くは、選択される毒素は例えばリシンＡ鎖、ゲロニン（
ｇｅｌｏｎｉｎｅ）、アブリン又はジフテリアトギンン
Ａ鎖のような植物又は細菌起源の毒素であり得る。
抗体と毒素とは、それらの各特性、特に構造及び治療上
の使用方法に適合し得る全手段により結合させられる。
の使用方法に適合し得る全手段により結合させられる。
又、本発明は上記免疫毒素の製法にも及ぶ、。
本発明の好適具体例によると、抗体と毒素とは少なくと
も１個の共有結合により結合させられろ。
も１個の共有結合により結合させられろ。
この場合の工程は、好ましくは単クローン性抗体と毒素
との相補的反応基の各性質に従って選択された縮合剤の
存在下で前記反応基を縮合反応させることから成る。
との相補的反応基の各性質に従って選択された縮合剤の
存在下で前記反応基を縮合反応させることから成る。
例えば、相補浩かそれぞれカルボシキル基とアミン基、
例えばＮ−シクロヘキシル−Ｎ’−（β−（Ｎ−メチル
モルフォリノ）エチルカルボジイミドｐ−トルエン−ス
ルフォネートと（３−メチル）−アミノプロピル−カル
ボジイミドクロロハイドレート又はジシクロヘキシルカ
ルボジイミドとである時、縮合剤はカルボジイミドであ
り得る。
例えばＮ−シクロヘキシル−Ｎ’−（β−（Ｎ−メチル
モルフォリノ）エチルカルボジイミドｐ−トルエン−ス
ルフォネートと（３−メチル）−アミノプロピル−カル
ボジイミドクロロハイドレート又はジシクロヘキシルカ
ルボジイミドとである時、縮合剤はカルボジイミドであ
り得る。
出発時の相補基がそれぞれスルフヒドリル基とアミン基
とである時、縮合剤は６−マレイミドカプロン酸−アシ
ル−Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド エステル又はＮ
−スクシンイミジル ３−（２ ピリジル ジヂオ）
プロビオネート（ＳＰＤＰ）てあり得る。
とである時、縮合剤は６−マレイミドカプロン酸−アシ
ル−Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド エステル又はＮ
−スクシンイミジル ３−（２ ピリジル ジヂオ）
プロビオネート（ＳＰＤＰ）てあり得る。
反応条件は後述の実施例中で言及する文献に示される条
件に特に合致する。
件に特に合致する。
同様にヨーロッパ特許出願第００６３９８８号中に開示
の技術も参考にした。
の技術も参考にした。
本発明の別の具体例によると、単クローン性抗体と毒素
とはリポソームにより結合させられる。
とはリポソームにより結合させられる。
より詳細には、この場合、選択された毒素はリポソーム
中に封入され、リポソーム自体は選択された単クローン
性抗体に特に例えばＳＰＤＰによる共有結合を介して結
合させられる。〔Ｊ．ＢｉＯＬ．Ｃｈｅｍ．２５５．８
０１５−８０１８（１９８０）；Ｎａｔｕｒｅ．Ｖｏｌ
．２９３，Ｎｏ．５８２９，ｐ．２２６−８．（１９８
１）；及びＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｕｐｒａ−ｍｏｌ
ｃｃｕｌａｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｃｅｌｌ
ｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ−ｔｒｙ，１６．ｐ．２
４３−２５８（１９８１）参照。〕単クローン性特異抗
体は、従来の各産生方法に従い、特異性抗体産生に必要
な遺伝情報を有する脾臓細胞と、連続的且つ強力な培養
増殖に適したミエローマ細胞とを融合させて得たハイブ
リトーマから単クローン性抗体を産生し、次いで従来技
術に従い所望のクローンを選択するごとにより得られる
。
中に封入され、リポソーム自体は選択された単クローン
性抗体に特に例えばＳＰＤＰによる共有結合を介して結
合させられる。〔Ｊ．ＢｉＯＬ．Ｃｈｅｍ．２５５．８
０１５−８０１８（１９８０）；Ｎａｔｕｒｅ．Ｖｏｌ
．２９３，Ｎｏ．５８２９，ｐ．２２６−８．（１９８
１）；及びＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｕｐｒａ−ｍｏｌ
ｃｃｕｌａｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｃｅｌｌ
ｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ−ｔｒｙ，１６．ｐ．２
４３−２５８（１９８１）参照。〕単クローン性特異抗
体は、従来の各産生方法に従い、特異性抗体産生に必要
な遺伝情報を有する脾臓細胞と、連続的且つ強力な培養
増殖に適したミエローマ細胞とを融合させて得たハイブ
リトーマから単クローン性抗体を産生し、次いで従来技
術に従い所望のクローンを選択するごとにより得られる
。
本発明の別の具体例によると、使用される脾臓細胞は、
ＣＴＨ抗原を有する悪性細胞、例えばＢＵＲＫＩＴＴ細
胞て免疫された動物、例えばラットから得られる〔ＷＩ
ＥＬＳ Ｊ．ｅｔ ｃｏｌｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：６４８５−８（１９
８１）参照〕。
ＣＴＨ抗原を有する悪性細胞、例えばＢＵＲＫＩＴＴ細
胞て免疫された動物、例えばラットから得られる〔ＷＩ
ＥＬＳ Ｊ．ｅｔ ｃｏｌｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：６４８５−８（１９
８１）参照〕。
所望の抗体を産生ずるハイブリドーマの選択か容易な点
において有益な本発明の別の具体例によると、動物の免
疫はＣＴＨ抗原を有する悪性細胞ですく、ＣＴＨを高分
子量分子又は高分子担体と特に結合させることにより得
られる免疫原による。
において有益な本発明の別の具体例によると、動物の免
疫はＣＴＨ抗原を有する悪性細胞ですく、ＣＴＨを高分
子量分子又は高分子担体と特に結合させることにより得
られる免疫原による。
ＣＴＨは動物細胞から単離されるかあるいは合成され得
る〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２０．ｐ．５０８−５１１（１
９８３）掲載のＥ．ＮＵＤＥＬＭＡＮ ｅｔ Ｃｏｌｌ
の論文参照〕。
る〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２０．ｐ．５０８−５１１（１
９８３）掲載のＥ．ＮＵＤＥＬＭＡＮ ｅｔ Ｃｏｌｌ
の論文参照〕。
使用され得る担体分子又は高分子担体は、例えば破傷風
アナトキシン、オボアルブミン、血清ア′ルブミン、ヘ
モシアニン等の天然タンパク質である。
アナトキシン、オボアルブミン、血清ア′ルブミン、ヘ
モシアニン等の天然タンパク質である。
合成高分子担体は、例えばポリリジン又はポリ（Ｄ，Ｌ
−アラニン）−ポリ（Ｌ リジン）である。
−アラニン）−ポリ（Ｌ リジン）である。
文献の記載によると、他の型として一般に分子量か２０
，０００より大の高分子担体を使用することもてきる。
，０００より大の高分子担体を使用することもてきる。
ＣＴＨと選択される高分子担体との結合は、例えばＦＲ
ＡＮＴＺ ｅｔ ＲＯＢＥＲＴＳＯＮによるＩｎｆｅｃ
ｔ．ａｎｄ Ｉｍ−ｍｕｎｉｔｙ、３３．１９３−１９
８（１９８１）中に開示の方法又はＰ．Ｅ．ＫＡＵＦＦ
ＭＡＮによるＡｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎ
ｍｅｎｔａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、０ｃｔｏｂｅ
ｒ １９８１．Ｖｏｌ．４２．Ｎｏ．４，ｐ．６１１−
４中に開示の方法のような既知の方法に従って実施され
得る。
ＡＮＴＺ ｅｔ ＲＯＢＥＲＴＳＯＮによるＩｎｆｅｃ
ｔ．ａｎｄ Ｉｍ−ｍｕｎｉｔｙ、３３．１９３−１９
８（１９８１）中に開示の方法又はＰ．Ｅ．ＫＡＵＦＦ
ＭＡＮによるＡｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎ
ｍｅｎｔａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、０ｃｔｏｂｅ
ｒ １９８１．Ｖｏｌ．４２．Ｎｏ．４，ｐ．６１１−
４中に開示の方法のような既知の方法に従って実施され
得る。
本発明の別の好適具体例によると、本発明の免疫毒素構
造に使用される単クローン性抗体は、２８，ｒｕｅ ｄ
ｅ Ｄｏｃｔｅｕｒ Ｒｏｕｘ，７５７２４ ＰＡＲＩ
Ｓ ＣＥＤＥＸ １５（Ｆｒａｎｃｅ）に所在のＩｎｓ
ｔｉｔｕｔ ＰａｓｔｅｕｒのＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎＮ
ａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ
ｅｓに１９８３年６月２４日付て寄託された受託番号１
２２７のハイブリドーマから産生される単クローン性抗
体３８−１３である。
造に使用される単クローン性抗体は、２８，ｒｕｅ ｄ
ｅ Ｄｏｃｔｅｕｒ Ｒｏｕｘ，７５７２４ ＰＡＲＩ
Ｓ ＣＥＤＥＸ １５（Ｆｒａｎｃｅ）に所在のＩｎｓ
ｔｉｔｕｔ ＰａｓｔｅｕｒのＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎＮ
ａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ
ｅｓに１９８３年６月２４日付て寄託された受託番号１
２２７のハイブリドーマから産生される単クローン性抗
体３８−１３である。
この抗体の製法は特にＪ．ＷＩＩＥＬＳ ｅｔ Ｃｏｌ
ｌ．によりＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ ７８：６４５８ ８（１９８１）中に開示されて
いる。
ｌ．によりＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ ７８：６４５８ ８（１９８１）中に開示されて
いる。
本発明の別の好適具体例によると、免役毒素“３８−１
３−リシンＡ鎖”を得るために、特に共有結合により単
クローン性抗体３８ １３をリシンＡ鎖に結合される。
３−リシンＡ鎖”を得るために、特に共有結合により単
クローン性抗体３８ １３をリシンＡ鎖に結合される。
本発明の別の好適具体例によると、免疫毒素“３８−１
３−ゲロニン”を得るために、特に共有結合により単ク
ローン性抗体３８−１３をゲロニンに結合させる。
３−ゲロニン”を得るために、特に共有結合により単ク
ローン性抗体３８−１３をゲロニンに結合させる。
免役毒素３８−１３−リシンＡ鎖と３８ １３ゲロニン
との製法及びこれらの免疫毒素のｉｎ ｖｉｔｒｏ及び
ｉｎ ｖｉｖｏにおける薬理的考察については実施例を
参照されたい。
との製法及びこれらの免疫毒素のｉｎ ｖｉｔｒｏ及び
ｉｎ ｖｉｖｏにおける薬理的考察については実施例を
参照されたい。
本発明の免疫毒素はＣＴＨ抗原を有する悪性細胞に対し
てｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏにおいて優れた
特異性及び毒性を何する。
てｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏにおいて優れた
特異性及び毒性を何する。
細胞への免疫毒素の固定後、毒素のインターナリゼイシ
ョンが非常に速く行なわれるため、毒性の発現速度は極
めて速く、既知の免疫毒素に必要な時間の１０分の１の
オーダで５０％のタンパク質の合成か阻害された。悪性
細胞に対する本発明の免疫毒素の特に優れた毒素、即ち
優れた治療効果は、インターナリゼイションの速度が非
常に速いので、免役毒素が該当細胞に達する以前にｉｎ
ｖｉｖｏで変質する危険が大幅に減少するためである
と仮定できる。
ョンが非常に速く行なわれるため、毒性の発現速度は極
めて速く、既知の免疫毒素に必要な時間の１０分の１の
オーダで５０％のタンパク質の合成か阻害された。悪性
細胞に対する本発明の免疫毒素の特に優れた毒素、即ち
優れた治療効果は、インターナリゼイションの速度が非
常に速いので、免役毒素が該当細胞に達する以前にｉｎ
ｖｉｖｏで変質する危険が大幅に減少するためである
と仮定できる。
更に本発明の免疫毒素の顕著な特徴として、従来の免疫
技術（例えば補体依存細胞毒素法び細胞フルオログラフ
ィにより測定される蛍光抗体間接法）を使用する場合、
抗体３８−１３が認識し得ない腫瘍系統細胞内のタンパ
ク質の合成を阻害し、この細胞を死滅させることが可能
である。
技術（例えば補体依存細胞毒素法び細胞フルオログラフ
ィにより測定される蛍光抗体間接法）を使用する場合、
抗体３８−１３が認識し得ない腫瘍系統細胞内のタンパ
ク質の合成を阻害し、この細胞を死滅させることが可能
である。
本発明の免疫毒素特定の悪性細胞、例えばＩｎｔ．ｊ．
Ｃａｎｃｅｒ ２９．６５３−６５８，１９８２中でＪ
．ＷｉＥＬＳｅｔ Ｃｏｌｌ．により規定されたＲＡＭ
ＯＳ，ＤＡＵＤＩ，Ｐ３ＨＲＩ，ＲＡＪＩ型のＢＣＲＫ
ＩＴＴ細胞及び少量のＣＴＨ抗原を含む他のヒト腫瘍細
胞又は形質転換細胞、例えばＪ．ＷＩＥＬＳ ｅｔ Ｃ
ｏｌｌによりＩｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ２９，６５３
６５８、（１９８２）中に規定されたＫ５６２（慢性
骨髄性白血病）、Ｐｒｉｅｓｓ、ＩＧＲＯＶ（卵巣腫瘍
起源のヒト系統）及びＭＯＬＴ−４（Ｔ白血病）のよう
なヒト系統をｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏて死
滅させるために使用され得る。
Ｃａｎｃｅｒ ２９．６５３−６５８，１９８２中でＪ
．ＷｉＥＬＳｅｔ Ｃｏｌｌ．により規定されたＲＡＭ
ＯＳ，ＤＡＵＤＩ，Ｐ３ＨＲＩ，ＲＡＪＩ型のＢＣＲＫ
ＩＴＴ細胞及び少量のＣＴＨ抗原を含む他のヒト腫瘍細
胞又は形質転換細胞、例えばＪ．ＷＩＥＬＳ ｅｔ Ｃ
ｏｌｌによりＩｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ２９，６５３
６５８、（１９８２）中に規定されたＫ５６２（慢性
骨髄性白血病）、Ｐｒｉｅｓｓ、ＩＧＲＯＶ（卵巣腫瘍
起源のヒト系統）及びＭＯＬＴ−４（Ｔ白血病）のよう
なヒト系統をｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏて死
滅させるために使用され得る。
ｉｎ ｖｉｖｏての使用は経静脈又は経部位であり得る
。使用すべき投与量は本質的に施療患者とその病理的状
態に依存する。例えば免役毒素は１日当たり５〜ｌ００
ｍｇの割合で経静脈投与され得る。
。使用すべき投与量は本質的に施療患者とその病理的状
態に依存する。例えば免役毒素は１日当たり５〜ｌ００
ｍｇの割合で経静脈投与され得る。
特に、生物材料、例えば骨髄から悪性細胞を除去し、放
射線の全身照射を受けた患者に自己移植により再注入す
る場合、本発明の免疫毒素は、好ましくは特に ｕ特に
１０−８〜１０−７のオーダの濃度で非常に短いインキ
ュベーション時間（３０分のオーダ）でｉｎ ｖｉｔｒ
ｏで使用され得る。
射線の全身照射を受けた患者に自己移植により再注入す
る場合、本発明の免疫毒素は、好ましくは特に ｕ特に
１０−８〜１０−７のオーダの濃度で非常に短いインキ
ュベーション時間（３０分のオーダ）でｉｎ ｖｉｔｒ
ｏで使用され得る。
ｉｎ ｖｉｖｏでの有効投与量は毒素投与量より著しく
小さく（マウス体内試験）、従って本発明の免疫毒素は
極めて良好な治療指数を有すると言える。
小さく（マウス体内試験）、従って本発明の免疫毒素は
極めて良好な治療指数を有すると言える。
本発明は以下の非限定的な実施例により更によく理解さ
れよう。
れよう。
実施例は、単クローン性抗体３８−１３を含む本発明の
２種類の免疫毒素の生成と、この免疫毒素を用いたｉｎ
ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの薬理試験の結果につ
いて示している。
２種類の免疫毒素の生成と、この免疫毒素を用いたｉｎ
ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの薬理試験の結果につ
いて示している。
まず、文献中に開示されている前記単クローン性抗体の
製法と主な活性につうて簡単に述べる。
製法と主な活性につうて簡単に述べる。
参考：単クローン性抗体３８−１３の製法と主特性：Ｃ
ＴＨ抗原を有するＤＡＵＤＩアフリカ産系統ＢＵＲＫＩ
ＴＴ細胞て免疫されたＬＥＷＩＳラットの脾臓リンパ球
とマウス形質細胞腫細胞ＳＰ２０／Ａｇ１４との雑種形
成により、ラットの１ｇＭである前記抗体を生成した。
ＴＨ抗原を有するＤＡＵＤＩアフリカ産系統ＢＵＲＫＩ
ＴＴ細胞て免疫されたＬＥＷＩＳラットの脾臓リンパ球
とマウス形質細胞腫細胞ＳＰ２０／Ａｇ１４との雑種形
成により、ラットの１ｇＭである前記抗体を生成した。
抗体の抗ＢＵＲＫＩＴＴ特異性は、補体依存微量細胞毒
性法と蛍光抗体間接法とにより確認されている（Ｊ．Ｗ
ＩＥＬＳ ｅｔ Ｃｏｌｌ． Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．， ＵＳＡ， １９８１， ７８．
６４８５−６４８８参照）。培養形成されたヒト腫瘍
系統において、単クローン性抗体３８−１３はＥＰＳＴ
ＥＩＮ−ＢＡＲＲウィルスゲノムを含むか又は含まない
ＢＵＲＫＩＴＴ腫瘍起源の系統と反応するか、他のヒト
腫瘍系統とは反応しない。特に、抗体３８−１３は、正
常Ｂリンパ球がｉｎ ｖｉｔｒｏでＥＰＳＴＥＩＮ−Ｂ
ＡＲＲウィルスの感染を受けて形成されるリンパ芽球系
統細胞を認識しない（Ｊ． ＷＩＥＬＳ ｅｔ Ｃｏｌ
ｌ． Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ， １９８２，２
９．６５３ ６５８）。従来研究されてきている免疫毒
素で使用される抗体は細胞表面のタンパク質を認識して
いるが、抗体３８ １３がＢＵＲＫＩＴＴ細胞表面で認
識する抗原は中性糖脂質であり、培地中の高濃度（０．
１Ｍ）のガラクトースにより該当細胞への抗体の固定が
阻害されるため、抗体は前記抗原の糖質部分と反応する
ものと思われる（Ｍ． ＬＩＰＩＮＳＫＩ． ｅｔ Ｃ
ｏｌｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ， １９８２，１２
９， ２３０１ ２３０４）。中性糖脂質は、前出の構
造を有するグロボトリアオシルセラミド又はセラミドト
リヘクソシル（ＣＴＨ）である（Ｅ．ＮＵＤＥＬＭＡＮ
ｅｔＣｏｌｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９３３．
２２０，５０８−５１１）。
性法と蛍光抗体間接法とにより確認されている（Ｊ．Ｗ
ＩＥＬＳ ｅｔ Ｃｏｌｌ． Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．， ＵＳＡ， １９８１， ７８．
６４８５−６４８８参照）。培養形成されたヒト腫瘍
系統において、単クローン性抗体３８−１３はＥＰＳＴ
ＥＩＮ−ＢＡＲＲウィルスゲノムを含むか又は含まない
ＢＵＲＫＩＴＴ腫瘍起源の系統と反応するか、他のヒト
腫瘍系統とは反応しない。特に、抗体３８−１３は、正
常Ｂリンパ球がｉｎ ｖｉｔｒｏでＥＰＳＴＥＩＮ−Ｂ
ＡＲＲウィルスの感染を受けて形成されるリンパ芽球系
統細胞を認識しない（Ｊ． ＷＩＥＬＳ ｅｔ Ｃｏｌ
ｌ． Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ， １９８２，２
９．６５３ ６５８）。従来研究されてきている免疫毒
素で使用される抗体は細胞表面のタンパク質を認識して
いるが、抗体３８ １３がＢＵＲＫＩＴＴ細胞表面で認
識する抗原は中性糖脂質であり、培地中の高濃度（０．
１Ｍ）のガラクトースにより該当細胞への抗体の固定が
阻害されるため、抗体は前記抗原の糖質部分と反応する
ものと思われる（Ｍ． ＬＩＰＩＮＳＫＩ． ｅｔ Ｃ
ｏｌｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ， １９８２，１２
９， ２３０１ ２３０４）。中性糖脂質は、前出の構
造を有するグロボトリアオシルセラミド又はセラミドト
リヘクソシル（ＣＴＨ）である（Ｅ．ＮＵＤＥＬＭＡＮ
ｅｔＣｏｌｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９３３．
２２０，５０８−５１１）。
抗体３８−１３は位置異性体：Ｇａｌα（１→３）、Ｇ
ａｌ…と反応しないので、前記抗原に対して顕著な立体
特異性を示す。ＣＴＨは、Ｐ式血液型抗原の前駆体であ
る物質Ｐｋと同一の構造を有する。この中間物質Ｐｋが
特定の悪性細胞例えばＢＵＲＫＩＴＴ細胞に蓄積すると
、この細胞中の物質Ｐの合成連鎖の特定の酵素は、各実
験的腫瘍系統に生じるような機能異常を起こすことがあ
る。
ａｌ…と反応しないので、前記抗原に対して顕著な立体
特異性を示す。ＣＴＨは、Ｐ式血液型抗原の前駆体であ
る物質Ｐｋと同一の構造を有する。この中間物質Ｐｋが
特定の悪性細胞例えばＢＵＲＫＩＴＴ細胞に蓄積すると
、この細胞中の物質Ｐの合成連鎖の特定の酵素は、各実
験的腫瘍系統に生じるような機能異常を起こすことがあ
る。
実施例１： 免疫毒素３８−１３−リシンＡ鎖使用した
リシンは、細胞に非特異性に固定するポリペプチド（Ｂ
鎖）に毒性ポリペプチド（Ａ鎖）を結合させて成る植物
起源毒素である（Ｅ．Ｓ．ＶＩＴＥＴ−ＴＡ ｅｔ Ｃ
ｏｌｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９．ｐ．６４４−６５
０，１９８３参照）。
リシンは、細胞に非特異性に固定するポリペプチド（Ｂ
鎖）に毒性ポリペプチド（Ａ鎖）を結合させて成る植物
起源毒素である（Ｅ．Ｓ．ＶＩＴＥＴ−ＴＡ ｅｔ Ｃ
ｏｌｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９．ｐ．６４４−６５
０，１９８３参照）。
実施例中、リシンはＬＵＧＮＩＥＲ ｅｔ Ｃｏｌｌ．
， Ｃ．Ｒ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｐａｒｉｓ ２７３：
７０４−７０７，１９７１に記載の方法に従ってＲｉｃ
ｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ種子から抽出及び精製した
。Ａ鎖とＢ鎖との分離は、Ｆ．Ｋ．ＪＡＮＳＥＮｅｔ
Ｃｏｌｌ．，Ｉｍｍｕｎｏ１．Ｒｅｖ．６２：１８５
２１６；１９８２に記載の方法に従った。
， Ｃ．Ｒ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｐａｒｉｓ ２７３：
７０４−７０７，１９７１に記載の方法に従ってＲｉｃ
ｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ種子から抽出及び精製した
。Ａ鎖とＢ鎖との分離は、Ｆ．Ｋ．ＪＡＮＳＥＮｅｔ
Ｃｏｌｌ．，Ｉｍｍｕｎｏ１．Ｒｅｖ．６２：１８５
２１６；１９８２に記載の方法に従った。
５０％硫酸アンモニウムによる沈降と、リン酸ナトリウ
ム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ８．０，ＮａＣｌ ０．５Ｍ
，ＮａＮｏ ０．０２％）に溶解させたＳｅｐｈａｒｏ
ｓｅ ６Ｂカラム（市販名）での濾過とにより単クロー
ン性抗体３８１３を精製した。
ム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ８．０，ＮａＣｌ ０．５Ｍ
，ＮａＮｏ ０．０２％）に溶解させたＳｅｐｈａｒｏ
ｓｅ ６Ｂカラム（市販名）での濾過とにより単クロー
ン性抗体３８１３を精製した。
Ｊ．ＣＡＲＬＳＳＯＮ ｅｔ Ｃｏｌｌ．がＢｉｏｃｈ
ｅｍ Ｊ．１７３、７２７７３７；（１９７８）中で記
載している方法に従い、異種二価性結合剤としてＮ−ス
クシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネ
ート（ＳＰＤＰ）を使用して、リシンＡ鎖を単クローン
性抗体３８ １３に結合させた。
ｅｍ Ｊ．１７３、７２７７３７；（１９７８）中で記
載している方法に従い、異種二価性結合剤としてＮ−ス
クシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネ
ート（ＳＰＤＰ）を使用して、リシンＡ鎖を単クローン
性抗体３８ １３に結合させた。
還元後、遊離した２−チオピリドンを測定し、１ｇＭに
より結合させられたリシンＡ鎖の分子数を決定した（Ｔ
．ＳＴＵＣＨＢＵＲＹ，Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｊ．１５１，
４１７−４３２．（１９７５））。免疫毒素３８−１３
−リシンＡ鎖は１ｇＭ当たり約１０個のリシンＡ鎖分子
を含んでいた。
より結合させられたリシンＡ鎖の分子数を決定した（Ｔ
．ＳＴＵＣＨＢＵＲＹ，Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｊ．１５１，
４１７−４３２．（１９７５））。免疫毒素３８−１３
−リシンＡ鎖は１ｇＭ当たり約１０個のリシンＡ鎖分子
を含んでいた。
実施例２：免疫毒素３８−１３−ゲロニンＧｅｌｏｎｉ
ｕｍ ｍｕｌｔｉｆｌｏｒｕｍ種子からゲロニンを生成
し、Ｆ．ＳＴＩＲＰＥ ｅｔ Ｃｏｌｌ．がＪ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ，２５５，６９４７−６９５３，（１９８
０）中に記載している方法に従って精製した。
ｕｍ ｍｕｌｔｉｆｌｏｒｕｍ種子からゲロニンを生成
し、Ｆ．ＳＴＩＲＰＥ ｅｔ Ｃｏｌｌ．がＪ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ，２５５，６９４７−６９５３，（１９８
０）中に記載している方法に従って精製した。
Ｐ．Ｅ．ＴＨＯＲＰＥ ｅｔ Ｃｏｌｌ．がＥｕｒｏｐ
．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１６，４４７−４５４，（１
９８１）中に記載している方法に従い、実施例１と同様
に単クローン性抗体３８−１３を精製し、結合剤として
ＳＰＤＰを使用してゲロニンと結合させた。
．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１６，４４７−４５４，（１
９８１）中に記載している方法に従い、実施例１と同様
に単クローン性抗体３８−１３を精製し、結合剤として
ＳＰＤＰを使用してゲロニンと結合させた。
実施例１と同様の方法で測定した結果、得られた免疫毒
素は１ｇＭ当たり約１０個のゲロニンを含んでいた。
素は１ｇＭ当たり約１０個のゲロニンを含んでいた。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験：
各実験系で免疫毒素３８−１３−リシンＡ鎖と３８−１
３−ゲロニンとを使用した。これらの免疫毒素は、ＢＵ
ＲＫＩＴＴ ＲＡＭＯＳ細胞に対して高毒素を示した。
３−ゲロニンとを使用した。これらの免疫毒素は、ＢＵ
ＲＫＩＴＴ ＲＡＭＯＳ細胞に対して高毒素を示した。
免疫毒素３８−１３−リンンＡ鎖は、精製リノンＡ鎖の
５０００分の１の濃度でタンパク質の合成（標識化アミ
ノ酸の取り込みにより測定）を阻害することができる。
５０００分の１の濃度でタンパク質の合成（標識化アミ
ノ酸の取り込みにより測定）を阻害することができる。
従って前記免疫毒素は実際にＲＡＭＯＳ細胞に対して純
粋リシンと同程度の毒素を有する（５０％のタンパク質
合成阻害率が得られる濃度は、精製Ａ鎖の場合１０−６
Ｍ、免疫毒素３８−１３−リシンＡ鎖及び純粋リシンの
場合５×１０−１０Ｍであった）。
粋リシンと同程度の毒素を有する（５０％のタンパク質
合成阻害率が得られる濃度は、精製Ａ鎖の場合１０−６
Ｍ、免疫毒素３８−１３−リシンＡ鎖及び純粋リシンの
場合５×１０−１０Ｍであった）。
前記免疫毒素の細胞毒性反応には主に２つの特徴かある
。
。
まず反応速度を検討するとＲＡＭＯＳ細胞内のタンパク
質の合成阻害率が５０％に達するのはインキュベーショ
ン後２時間〜２時間３０分であったので、細胞速度反応
は著しく速く、実際に純粋リシンの反応速度に匹敵する
。因みに上述の全免疫毒素の場合、毒性効果が認められ
るまでの最短インキュベーション時間は１６〜３０時間
であった。この高反応速度は、細胞固定後の免疫毒素の
インターナリゼイション時間が非常に短いという事実に
基づいている。
質の合成阻害率が５０％に達するのはインキュベーショ
ン後２時間〜２時間３０分であったので、細胞速度反応
は著しく速く、実際に純粋リシンの反応速度に匹敵する
。因みに上述の全免疫毒素の場合、毒性効果が認められ
るまでの最短インキュベーション時間は１６〜３０時間
であった。この高反応速度は、細胞固定後の免疫毒素の
インターナリゼイション時間が非常に短いという事実に
基づいている。
同様に３８−１３−ゲロニンは、ＲＡＭＯＳ細胞中のタ
ンパク質の合成を著しく阻害し、その活性は非結合ゲロ
ニンの１，０００倍であった。
ンパク質の合成を著しく阻害し、その活性は非結合ゲロ
ニンの１，０００倍であった。
非結合抗体３８−１３の固定と同様に、上記免疫毒素の
活性はガラクトースにより容易に抑制し得る。
活性はガラクトースにより容易に抑制し得る。
結合体の毒性効果を抑制するには、媒質に０．１ＭのＤ
−ガラクトースを付加すれば十分である。
−ガラクトースを付加すれば十分である。
従って、従来の免疫技術（補体依存細胞毒性法、細胞フ
ルオログラフィにより測定される蛍光抗体間接法）を使
用する場合、これらの免疫毒素は、タンパク質の合成を
阻害し且つ抗体３８−１３に認識され得ない腫瘍細胞系
統を死滅させるごとが可能であった。これらの免疫毒素
はＥＰＳＴＥＩＮ−ＢＡＲＲウィルスを含んでおり且つ
ＢＵＲＫＩＴＴ細胞以外のリンパ芽球系統Ｐｒｉｅｓｓ
、ヒト白血病系統Ｋ５６２及びマウス白血病Ｌ１２１０
に対して毒性であった。この毒性は、一般の免疫方法で
検出するには不十分であり且つ細胞中に数個の免疫毒素
の分子を導入するに十分な数の抗原ザイトか抗体３８−
１３に認識され、この抗原サイトに免疫毒素か固定され
ろためであると考えられろ。実際に、系統発生面で完全
に識別され得るこれらの系統における免疫毒素の毒性は
、抗体３８−１３を特定の細胞に固定する場合と同様に
濃度０．１Ｍのガラクトースにより抑制するごとか可能
であった。更に、同様の生化学的結合方法に従い生成さ
れ、同様に精製され、１ｇＭ１３．６抗ＴＮＰの非単ク
ローン性抗体を含んでおり且つ１ｇＭにより約１０個の
リシンＡ鎖を付加された免疫毒素は、ＴＮＰハプテンを
もたない細胞に対して何等毒性効果を示さなかった。
ルオログラフィにより測定される蛍光抗体間接法）を使
用する場合、これらの免疫毒素は、タンパク質の合成を
阻害し且つ抗体３８−１３に認識され得ない腫瘍細胞系
統を死滅させるごとが可能であった。これらの免疫毒素
はＥＰＳＴＥＩＮ−ＢＡＲＲウィルスを含んでおり且つ
ＢＵＲＫＩＴＴ細胞以外のリンパ芽球系統Ｐｒｉｅｓｓ
、ヒト白血病系統Ｋ５６２及びマウス白血病Ｌ１２１０
に対して毒性であった。この毒性は、一般の免疫方法で
検出するには不十分であり且つ細胞中に数個の免疫毒素
の分子を導入するに十分な数の抗原ザイトか抗体３８−
１３に認識され、この抗原サイトに免疫毒素か固定され
ろためであると考えられろ。実際に、系統発生面で完全
に識別され得るこれらの系統における免疫毒素の毒性は
、抗体３８−１３を特定の細胞に固定する場合と同様に
濃度０．１Ｍのガラクトースにより抑制するごとか可能
であった。更に、同様の生化学的結合方法に従い生成さ
れ、同様に精製され、１ｇＭ１３．６抗ＴＮＰの非単ク
ローン性抗体を含んでおり且つ１ｇＭにより約１０個の
リシンＡ鎖を付加された免疫毒素は、ＴＮＰハプテンを
もたない細胞に対して何等毒性効果を示さなかった。
従って、本発明の免疫毒素はｉｎ ｖｉｔｒｏで各種起
源の腫瘍細胞に対して活性である。
源の腫瘍細胞に対して活性である。
一般に免疫毒素３８−１３−リシンＡ鎖及び３８−１３
−ゲロニンは、大量のＣＴＨ抗原を含むＢＵＲＫＩＴＴ
細胞〔Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ２９，６５３−６５
８（１９８２）中でＪ．ＷＩＥＬＳ ｅｔ Ｃｏｌｌ．
により規定されたＲＡＭＯＳ，ＤＡＵＤＩ，Ｐ３ＨＲＩ
，ＲＡＪＩ系統〕を１０−８Ｍのオーダの濃度て、他の
ヒト腫瘍又は形質転換細胞、例えばに５６２＋＋（慢性
骨髄性白血病）、Ｐｒｉｅｓｓ、ＩＧＲＯＶ（卵巣腫瘍
起源のヒト系統）、ＭＯＬＴ−４（Ｔ白血病）を１０−
８Ｍ以下の濃度で死滅させることが可能てあった。
−ゲロニンは、大量のＣＴＨ抗原を含むＢＵＲＫＩＴＴ
細胞〔Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ２９，６５３−６５
８（１９８２）中でＪ．ＷＩＥＬＳ ｅｔ Ｃｏｌｌ．
により規定されたＲＡＭＯＳ，ＤＡＵＤＩ，Ｐ３ＨＲＩ
，ＲＡＪＩ系統〕を１０−８Ｍのオーダの濃度て、他の
ヒト腫瘍又は形質転換細胞、例えばに５６２＋＋（慢性
骨髄性白血病）、Ｐｒｉｅｓｓ、ＩＧＲＯＶ（卵巣腫瘍
起源のヒト系統）、ＭＯＬＴ−４（Ｔ白血病）を１０−
８Ｍ以下の濃度で死滅させることが可能てあった。
ｉｎ ｖｉｖｏ考察
マウス白血病細胞Ｌ１２１０はｉｎ ｖｉｔｒｏでは同
一の濃度範囲で免疫毒素３８−１３−リシンＡ鎖及び３
８−１３−ゲロニンに感受性なので、この免疫毒素の治
療活性試験をｉｎ ｖｉｖｏで実施することができた。
一の濃度範囲で免疫毒素３８−１３−リシンＡ鎖及び３
８−１３−ゲロニンに感受性なので、この免疫毒素の治
療活性試験をｉｎ ｖｉｖｏで実施することができた。
白血病は殆どの抗腫瘍物質に対して極めて低抗性の高い
実験的腫瘍である。ヒト臨床における活性と実験系統に
対する活性との間には非常に良好な相関関係かある（Ｊ
．Ｍ．ＶＥＮＤＩＴＴＩ，“Ｒｅｌｅｖａｎｃｅ ｏｆ
ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｂｌｅ ａｎｉｍａｌ ｔｕｍ
ｏｒ ｓｙｓｔｅｍｓ ｔｏ ｔｈｅｓｅｌｅｃｔｉｏ
ｎ ｏｆ ｎｅｗ ａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ ｃｌｉｎｉ
ｃａｌ ｔｒｉａｌｉｎ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃ
ａｌ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｃｈｅｍｏｔ
ｈｅｒａｐｙ”Ｔｈｅ ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ
Ｔｅｘａｓ ｅｄ．ＷＩＬＬＩＡＭＳａｎｄ ＷＩＬＫ
ＩＮＳ、ｐｕｂｌ．１９７５ Ｈａｌｔｉｍｏｒｅ Ｕ
ＳＡ参照）のて、白血病はヒト臨床に使用可能な物質を
選択するのに使用されている。他方、マウスの白血病Ｌ
１２１０である実験的腫瘍は、例えばＣ．Ｃ．ＺＵＢＲ
ＯＤがＰｒｏｃ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９，１
９７２，ｐ．１０４２ １０４７中に記載しているよう
に、ヒト治療用全抗腫瘍化合物を評価するために一般に
使用されている。このように実験的に生成された腫瘍系
統は、試験化合物の活性を非常に正確に算定することが
可能であり、従って、例えばＲ．Ｅ．ＳＫＩＰＰＥＲ
ｅｔ Ｃｏｌｌ．がＣａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ
，Ｒｅｐ．３５．１９６４，ｐ．１１１１及び４５，１
９６５．ｐ．５２８中に記載している方法に従い、各化
合物の活性間の客観比較が可能である。
実験的腫瘍である。ヒト臨床における活性と実験系統に
対する活性との間には非常に良好な相関関係かある（Ｊ
．Ｍ．ＶＥＮＤＩＴＴＩ，“Ｒｅｌｅｖａｎｃｅ ｏｆ
ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｂｌｅ ａｎｉｍａｌ ｔｕｍ
ｏｒ ｓｙｓｔｅｍｓ ｔｏ ｔｈｅｓｅｌｅｃｔｉｏ
ｎ ｏｆ ｎｅｗ ａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ ｃｌｉｎｉ
ｃａｌ ｔｒｉａｌｉｎ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃ
ａｌ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｃｈｅｍｏｔ
ｈｅｒａｐｙ”Ｔｈｅ ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ
Ｔｅｘａｓ ｅｄ．ＷＩＬＬＩＡＭＳａｎｄ ＷＩＬＫ
ＩＮＳ、ｐｕｂｌ．１９７５ Ｈａｌｔｉｍｏｒｅ Ｕ
ＳＡ参照）のて、白血病はヒト臨床に使用可能な物質を
選択するのに使用されている。他方、マウスの白血病Ｌ
１２１０である実験的腫瘍は、例えばＣ．Ｃ．ＺＵＢＲ
ＯＤがＰｒｏｃ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９，１
９７２，ｐ．１０４２ １０４７中に記載しているよう
に、ヒト治療用全抗腫瘍化合物を評価するために一般に
使用されている。このように実験的に生成された腫瘍系
統は、試験化合物の活性を非常に正確に算定することが
可能であり、従って、例えばＲ．Ｅ．ＳＫＩＰＰＥＲ
ｅｔ Ｃｏｌｌ．がＣａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ
，Ｒｅｐ．３５．１９６４，ｐ．１１１１及び４５，１
９６５．ｐ．５２８中に記載している方法に従い、各化
合物の活性間の客観比較が可能である。
実験値が良好な別の腫瘍は、ＬＥＷＩＳマウス肺腫瘍で
あった（前出のＪ．ＶＥＮＤＩＴＴＩ ｅｔ Ｃｏｌｌ
．の論文参照）。
あった（前出のＪ．ＶＥＮＤＩＴＴＩ ｅｔ Ｃｏｌｌ
．の論文参照）。
実際には２種類の試験を行なった。
ｌ）ｉｎ ｖｉｔｒｏ−ｉｎ ｖｉｖｏ試験腫瘍細胞（
ＬＥＷＩＳ又はＬ１２１０）を３０分間ｉｎ ｖｉｔｒ
ｏでインキュベートした。
ＬＥＷＩＳ又はＬ１２１０）を３０分間ｉｎ ｖｉｔｒ
ｏでインキュベートした。
ＬＥＷＩＳ細胞の場合、免疫毒素濃度は０．２ｍｌの細
胞２×１０６個に対して０．５×１０−７Ｍであった。
胞２×１０６個に対して０．５×１０−７Ｍであった。
Ｌ１２１０細胞の場合、免疫毒素濃度は０．２ｍｌ中の
１０５個の細胞に対して０．５×１０−８Ｍであった。
１０５個の細胞に対して０．５×１０−８Ｍであった。
同一の条件下で免疫毒素を介在させずに対照細胞をイン
キュベートした。
キュベートした。
次に、細胞を１０匹のマウス群（ＬＥＷＩＳ細胞はＣ５
７Ｂｌａｃｋ及びＬ１２１０細胞はＤＢＡ／２）に注射
した。動物の生存を測定した。腫瘍細胞がｉｎ ｖｉｔ
ｒｏ処理により死滅している場合、被注射動物の腫瘍は
発展せず動物は生存し続けたが、対照動物は腫瘍細胞の
注人数に応じて一定の期間を経た後、全て死亡した。
７Ｂｌａｃｋ及びＬ１２１０細胞はＤＢＡ／２）に注射
した。動物の生存を測定した。腫瘍細胞がｉｎ ｖｉｔ
ｒｏ処理により死滅している場合、被注射動物の腫瘍は
発展せず動物は生存し続けたが、対照動物は腫瘍細胞の
注人数に応じて一定の期間を経た後、全て死亡した。
実験によると、ＬＥＷＩＳ細胞を注射された対照動物は
２０．５±０．７日後に死亡した。免疫毒素インキュベ
ート細胞を注入された全動物は４５日を経てもなお存在
し続けた。
２０．５±０．７日後に死亡した。免疫毒素インキュベ
ート細胞を注入された全動物は４５日を経てもなお存在
し続けた。
Ｌ１２１０細胞の場合、Ｌ１２１０細胞を注入された対
照動物は９．０±０．２６日後に死亡した。免疫毒素イ
ンキュベータ細胞を注入された全動物は４５日を経ても
なお生存し続けた。
照動物は９．０±０．２６日後に死亡した。免疫毒素イ
ンキュベータ細胞を注入された全動物は４５日を経ても
なお生存し続けた。
本発明の免疫毒素の非常に短い間（３０分）のインキュ
ベーション後に、多数の腫瘍細胞（１０５〜１０６個）
をｉｎ ｖｉｔｒｏで死滅させることができた。従って
この免疫毒素は、放射線の全身照射又は化学的冶療薬の
大量投与を受けた患者に自己移植により移植さえる以前
に骨髄中に存在する腫瘍細胞をｉｎｖｉｔｒｏで死滅さ
せるために使用することができる。
ベーション後に、多数の腫瘍細胞（１０５〜１０６個）
をｉｎ ｖｉｔｒｏで死滅させることができた。従って
この免疫毒素は、放射線の全身照射又は化学的冶療薬の
大量投与を受けた患者に自己移植により移植さえる以前
に骨髄中に存在する腫瘍細胞をｉｎｖｉｔｒｏで死滅さ
せるために使用することができる。
２）ｉｎ ｖｉｖｏ試験
白血病細胞Ｌ１２１０を経腹腔接種したマウスを使用し
た。腫瘍接種から１時間後に半分のマウスに１回投与量
の被試験免疫毒素を経腹腔注射により接種し、残りの半
分のマウスは対照群として等量の非活性溶媒を注射した
。マウスは偶然に各実験群に分かれた。
た。腫瘍接種から１時間後に半分のマウスに１回投与量
の被試験免疫毒素を経腹腔注射により接種し、残りの半
分のマウスは対照群として等量の非活性溶媒を注射した
。マウスは偶然に各実験群に分かれた。
第１回目の慣例実験で毒性による死亡率を測定し、非致
死量を決定した。
死量を決定した。
本分野の使用慣例に従い、腫瘍細胞接種後４５日以上生
存した動物を治癒と見做した。
存した動物を治癒と見做した。
各投与量（非致死量、ＬＤ５０及びＬＤ１０）で化合物
の１個を単独に注射した際の毒性による死亡率を決定し
、非致死量の被試験化合物のみを注射した動物群の生存
率を算定することができた。
の１個を単独に注射した際の毒性による死亡率を決定し
、非致死量の被試験化合物のみを注射した動物群の生存
率を算定することができた。
既知のＭＡＮＮ−ＷＨＩＴＥＹ及びＷＩＬＣＯＸＯＮの
方法に従い、対照群の結果との比較により実験結果を統
計的に分析して生存率を計算したた。処理による白血病
細胞の死滅率は、場合に応して、生存細胞がない時には
平均生存の増加、あるいは生存している細胞の率に基づ
いて、前出のＨ．Ｅ．ＳＫＩＰＰＥＲ ｅｔ Ｃｏｌｌ
．の方法で計算した。
方法に従い、対照群の結果との比較により実験結果を統
計的に分析して生存率を計算したた。処理による白血病
細胞の死滅率は、場合に応して、生存細胞がない時には
平均生存の増加、あるいは生存している細胞の率に基づ
いて、前出のＨ．Ｅ．ＳＫＩＰＰＥＲ ｅｔ Ｃｏｌｌ
．の方法で計算した。
結果
免疫毒素に耐えられる最大投与量は、マウス１匹当たり
５００μｇであった。
５００μｇであった。
この結果は極めて注目すべきものである。本発明の免疫
毒素は、今日実施されている微量免疫分析方法により検
出し得るに十分な量の上述の抗原を表面に有する腫瘍細
胞に対してのみならず、微量分析方法では検出し得ない
割合で前記抗原を有する腫瘍細胞に対しても、極めて広
いｉｎ ｖｉｔｒｏ殺腫瘍活性スペクトルを有しており
、この活性はｉｎｖｉｖｏでも同様に顕著である。従っ
て、本発明の免疫毒素は、ヒト起源ＢＵＲＫＩＴＴリン
パ肉腫細胞のように遺伝的に離れた腫瘍細胞と、マウス
の腫瘍細胞１．１２１０とに対して殺腫瘍活性を有する
ため、抗腫瘍活性スペクトルが広い。従って、本発明の
免疫毒素は、宿主生体に毒性を及ぼすことなく広い範囲
で投与し得るという点に於いて、腫瘍細胞と正常細胞と
の識別能に非割に優れでいる。
毒素は、今日実施されている微量免疫分析方法により検
出し得るに十分な量の上述の抗原を表面に有する腫瘍細
胞に対してのみならず、微量分析方法では検出し得ない
割合で前記抗原を有する腫瘍細胞に対しても、極めて広
いｉｎ ｖｉｔｒｏ殺腫瘍活性スペクトルを有しており
、この活性はｉｎｖｉｖｏでも同様に顕著である。従っ
て、本発明の免疫毒素は、ヒト起源ＢＵＲＫＩＴＴリン
パ肉腫細胞のように遺伝的に離れた腫瘍細胞と、マウス
の腫瘍細胞１．１２１０とに対して殺腫瘍活性を有する
ため、抗腫瘍活性スペクトルが広い。従って、本発明の
免疫毒素は、宿主生体に毒性を及ぼすことなく広い範囲
で投与し得るという点に於いて、腫瘍細胞と正常細胞と
の識別能に非割に優れでいる。
代理人弁思士今 村 ル
第１頁の続き
Ｉｎｔ、Ｃ１，４識別記号 庁内整理番号０発 明 者
シモーヌ・ジュンカ・ フランス国、ネφベネフイス
９
シモーヌ・ジュンカ・ フランス国、ネφベネフイス
９
Claims (9)
- （１）動物細胞内へ毒素のインターナリゼイションをし
得るように、下記の構造。 Ｇａｌα（１→４）Ｇａｌβ（１→４）Ｇｌｃβ（１→
ｌ）セラミドを有するグロボトリアオンルセラミド又は
セラミドトリヘクソンルに対して特異的であり毒素と結
合した抗体、好ましくは単クローン性抗体から本質的に
構成されることを特徴とする免疫毒素。 - （２）抗体と毒素とは、少なくとも１個の共有結合によ
り結合されていることを特徴とする特許請求の範囲第１
項に記載の免疫毒素。 - （３）特異性抗体は、パリのＩｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓ
ｔｅｕｒのＣｏ１１ｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌ
ｄｅ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓに受託番号１２
２７で寄託されたハイブリドーマから産生される抗体３
８−１３であるごとを特徴とする特許請求の範囲第１項
又は第２項に記載の免疫毒素。 - （４）毒素は、リリンＡ鎖又はゲロニンであることを特
徴とする特許請求の範囲第１項乃至第３項のいずれかに
記載の免疫毒素。 - （５）単クローン性抗体３８−１３をリンンＡ鎖と特に
共有結合により結合することにより得られる免疫毒素。 - （６）単クローン性抗体３８−１３をゲロニンと特に共
有結合により結合することにより得られろ免疫毒素。 - （７）薬剤ベヒクルに結合された特許請求の範囲第１項
乃至第６項のいずれかに記載の少なくとも１個の免疫毒
素を活性物質として含有することを特徴とする薬剤組成
物。 - （８）生体内で腫瘍細胞の防御又は破壊用に使用される
ことを特徴とする特許請求の範囲第１項乃至第６項のい
ずれかに記載の免疫毒素。 - （９）生物材料を、特許請求の範囲第１項乃至第６項の
いずれかに記載の免疫毒素とインキュベートすることを
特徴とする生物材料から悪性細胞を生体外で除去する方
法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8310587 | 1983-06-27 | ||
| FR8310587A FR2547731A1 (fr) | 1983-06-27 | 1983-06-27 | Immunotoxine antitumorale, preparations pharmaceutiques la contenant et son utilisation in vitro |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6069034A true JPS6069034A (ja) | 1985-04-19 |
Family
ID=9290205
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59132851A Pending JPS6069034A (ja) | 1983-06-27 | 1984-06-27 | 免疫毒素、免疫毒素を含有する薬剤及び免疫毒素の生体外使用方法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0130132A1 (ja) |
| JP (1) | JPS6069034A (ja) |
| FR (1) | FR2547731A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6480299A (en) * | 1986-06-13 | 1989-03-27 | Oncogen | Ligand and method for enhancing propagation of b-cells |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6482586B1 (en) | 1996-11-22 | 2002-11-19 | Hospital For Sick Children Research And Development Limited Partnership | Hybrid compositions for intracellular targeting |
| FR2766193B1 (fr) | 1997-07-18 | 2001-09-14 | Inst Curie | Polypeptide chimerique comprenant le fragment b de la toxine shiga et des peptides d'interet therapeutique |
| US20020081307A1 (en) | 1998-05-15 | 2002-06-27 | Allan M. Green | Verotoxin b subunit for immunization |
| WO2000061183A2 (en) * | 1999-04-09 | 2000-10-19 | Hsc Research And Development Limited Partnership | Verotoxin treatment of lymphomas |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5616418A (en) * | 1979-07-20 | 1981-02-17 | Teijin Ltd | Antitumor protein complex and its preparation |
| FR2466252A2 (fr) * | 1979-10-03 | 1981-04-10 | Clin Midy | Nouveaux produits ayant notamment des proprietes anticancereuses a base de chaine a de la ricine et d'une proteine |
| EP0044167A3 (en) * | 1980-07-14 | 1982-04-21 | The Regents Of The University Of California | Antibody targeted cytotoxic agent |
| US4356117A (en) * | 1980-10-23 | 1982-10-26 | U.S. Govt., Dept. Of Health & Human Services | Chemical modifications of proteins which induce new receptor specificities and therefore elicit new effects in cells |
| FR2504010B1 (fr) * | 1981-04-15 | 1985-10-25 | Sanofi Sa | Medicaments anticancereux contenant la chaine a de la ricine associee a un anticorps antimelanome et procede pour leur preparation |
| FR2516794B1 (fr) * | 1981-11-20 | 1985-10-25 | Sanofi Sa | Nouveaux medicaments anticancereux pour le traitement des leucemies t constitues de la chaine a de la ricine et d'un anticorps monoclonal specifique |
-
1983
- 1983-06-27 FR FR8310587A patent/FR2547731A1/fr active Pending
-
1984
- 1984-06-27 JP JP59132851A patent/JPS6069034A/ja active Pending
- 1984-06-27 EP EP84401369A patent/EP0130132A1/fr not_active Withdrawn
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6480299A (en) * | 1986-06-13 | 1989-03-27 | Oncogen | Ligand and method for enhancing propagation of b-cells |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR2547731A1 (fr) | 1984-12-28 |
| EP0130132A1 (fr) | 1985-01-02 |
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