JPH0725701B2 - 長期作用型免疫毒素および製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 修飾された糖タンパク質（又はグリコペプチド）から誘
導され、かつタンパク質の合成を阻害するポリペプチド
型の成分に共有結合した少くとも一種の抗体を含有する
薬効のある新しい分子に関する。

米国特許第4,340,535号並びにフランス国特許第81/0759
6号及び同第81/21836号は、包含体と呼ばれる抗ガン生
成物の製法を開示している。この生成物は、破壊される
細胞についている抗原を標的とする抗体又は抗体断片
と、リシンのＡ鎖を共有結合によってカップリングする
ことにより得られる。この種の生成物は今まで免疫毒素
という包括的な名称によって称されてきたが、本発明に
おいても同様である。ところでリシンのＡ鎖を含有する
既に公知の免疫毒素に類似する包含体は知られている。
これは抗ガン剤として適しているが、特にゲロニウムマ
ルティフロルム（欧州生化学ジャーナル“1981年、第11
6号、447−454頁及び“ガン研究"1984年、第44号、129
−133頁）から抽出されたゲロニン、又はモモルジカカ
ランティス（MOM、米国特許第4,368,149号）から抽出さ
れた阻害剤のようなリボソームを不活性化する他のグリ
コペプチドと、抗体又は抗体断片を共有結合によってカ
ップリングさせることにより得られる。

上述のリボソーム（GPIRという略号を使う。）を不活性
にし、またリシンのＡ鎖と同じような性質を有する糖タ
ンパク質は20,000〜30,000の分子量を有する（“ガン・
サーベイ"1982年、第１巻、489−520頁）。

本明細書で用いる“リボソームを不活性化する糖タンパ
ク質”は、リボソームを不活性化し、その結果真核細胞
におけるタンパク質の合成を阻害する巨大な分子量の糖
類単位を有する物質を指す。その他にも同じ不活性化特
性を有するならば、その物質の何らかの断片でもよい。
リボソームを不活性化する前記糖タンパク質は天然のも
のであるか、又は遺伝子型がこの目的のために修飾され
た細胞から生合成によって誘導して得られる。

これら免疫毒性はアンモニウム塩、種々のアミンのよう
なアジュパント物質又はモネンジン若しくはナイジェリ
シンのようなある種のカルボキシルイオノフォアーなど
様々な物質によって強化される。

しかしながら免疫毒素の治療効果は、活性化されている
ものであってもそうでなくても、その免疫毒素がその抗
体部分を通して活性な形態で、破壊される標的細胞上に
生体内局在化することができるという条件（いかなる免
疫毒素活性の発現においても必須の条件）でのみ十分発
揮される。標的細胞上に局在化される免疫毒素の効力
は、まず第一に血流及び細胞外液にある免疫毒素が活性
な形態で一定の時間内に標的細胞に十分な濃度で到達
し、目的とする抗原を高い割合で捕捉する能力に依存す
る。

多くの研究によって免疫毒素が様々な動物の静脈内に注
射された場合の血漿からの消失キネティックスが確立さ
れた。その結果注射後には生物学的に活性な免疫毒素の
血漿中の濃度は急速に低下することがわかった。

ヒトのＴリンパ球の抗原T65を標的とするモノクロナル
抗体とリシンのＡ鎖をジスルフィド結合を含む連鎖でカ
ップリングさせて得られる免疫毒素についてウサギを使
ったモデルで調べたところ、注射直後に血流中に存在す
る免疫毒素は、30分後にはその97％が、17時間後にはそ
の99.9％が消失した。この免疫毒素の急速な消失によっ
てその細胞障害力は減じられる。というのは、免疫毒素
と破壊される細胞について標的細胞との恒久的な結合が
妨げられるからである。さらに免疫毒素の血漿からの消
失キネティックスを対応する非包含抗体と比較してみた
ところ、この抗体は血漿中に相対的に長い時間高い濃度
で留まることがわかった。実際どんなに高度に免疫毒素
を精製しても、常に一定量の非包含体は残留する。免疫
毒素と非包含抗体の消失速度の違いから、最初はごく少
ない割合でしかない非包含抗体は、徐々にその割合が増
え、数時間後には半数を超える割合になる。そのため抗
体は徐々に、免疫毒素が標的に結合する際の強力なアン
タゴニストになる。

従って血漿中の免疫毒素を高い割合で存続させることは
標的である抗原が結合される割合と持続時間を増加さ
せ、その結果免疫毒素の治療効果を増進することを意味
する。

リシンのＡ鎖を含有する免疫毒素の生体内局在化につい
て、免疫毒素を放射標識し、特定の標的をもたない動物
に注射して実験したところ、包含体は注射後数分で肝臓
に特異的に局在化した。同じ実験をカップリングしない
形態のリシンのＡ鎖について行ったところ、同様な結果
が得られた。これは免疫毒素に含まれる細胞毒性サブユ
ニットが肝臓と結合することを強く示唆する。

リシンのＡ鎖はそのポリオサン基が、マンノース残基と
Ｎ−アセチルコサミン残基からなる糖タンパク質であ
る。そしてそのうちのいくつかのマンノース基は、末端
に位置する（“農芸生物化学"1978年、第42巻、501
頁）。またこれら末端に位置するマンノース残基を含む
糖タンパク質を識別する受容体は肝臓内にあることが発
見された。これらの受容体（クッパー細胞中に存す
る。）はこれらを代謝する細胞と結合することによって
血液中から消失する。これに関してはβ−グルクロニダ
ーゼとリボヌクレアーゼＢの場合について詳しい報告が
ある（“生物化学と生物物理“1978年、188号、418頁、
“酵素学の進歩”マイスター編、ニューヨーク、1974年
および“小児科学研究"1977年、第11巻、816頁）。

これらを総合すると、リシンのＡ鎖を含有する免疫毒素
の急速な消失は、リシンのＡ鎖のマンノース残基が肝細
胞特にクッパー細胞によって認知されるためと説明でき
る。

動物の静脈内に注射した後の他のGPIR、例えばゲロニン
又はMOM、についての血漿からの消失キネティックスの
研究が進められた結果、リシンのＡ鎖についてはGPIRの
血漿中濃度は注射後急速に大部分消失することがわかっ
た。ウサギについて公知（“生化学ジャーナル"1980
年、225号、6947−6953頁）の方法によって精製したゲ
ロニンを注射したところ、注射直後に血流中に存在した
ゲロニンは、その１時間後には93％、24時間後には99.9
9％が消失した。

糖タンパクに含有されるものを含む炭水化物構造の、過
ヨード酸塩による酸化は、２つの隣接する炭素原子は第
１又は第２ヒドロキシル基を有する場合には、炭素鎖の
分割を生ぜしめる。２つの隣接するヒドロキシル基が第
２ヒドロキシル基の場合には、GPIRに存在する場合のよ
うに、酸化は、その間に分割が生ずる炭素原子に２つの
アルデヒド基を生成する。

本明細書において、「過ヨード酸塩」なる語はIO▲^- ₄▼
イオンを示し、この語は「メタペリオデート」の名で文
献にも見出される。

リボソームを不活性化する糖タンパクの炭水化物ユニッ
トが過ヨード酸イオンによる酸化によって変性されるな
らば、生物活性を保持する特性と生体内で血流から極め
てゆっくり除去される特性の２つの特性を有する、リボ
ソームを不活性化する新しい糖タンパクが得られること
がわかった。

また、これらの新しい遅延作用を有し、リボソームを不
活性化する糖タンパクが抗体と結合すると、生じた結合
体は抗毒素の公知の生物特性を保持し、遅い血漿除去運
動機能を示すこともわかった。

従って、本発明は、その自然な形で用いられ又は変性さ
れた抗体又は抗体フラグメントと、遅延作用を有しリボ
ソームを不活性化する糖タンパクとの共有結合によって
得られた、抗毒素のクラスに属する生成物に関する。

明確を期するため、種々のタンパク又はそれらの基を示
す記号、および種々の記号を示す表現の意味について以
下に説明する。

記号Ｐは、任意の抗体又は抗体フラゲメント、任意の免
疫グロブリン又は免疫グロブリンフラグメント、又はそ
れらの官能基の変性により上記のものから誘導された分
子からなる群から選択されたタンパクを意味し、このよ
うにして選択されたタンパクが、その抗原を有する細胞
特に標的細胞の表面において、与えられた抗原を選択的
に認識し得る限りにおいて、上記タンパクを有する炭水
化物構造を含む。出発タンパクは、天然のものでも、そ
のゼノタイプがこの目的のために変性された細胞から誘
導された生物合成されたものでもよい。

記号GPIR−1aは、遅延作用を有し、リボソームを不活性
化するタンパクを表わすが、このタンパクは、そのチオ
ール基が任意に保護されている。リボソームを不活性化
する糖タンパクを、過ヨード酸アルカリ金属の水溶液に
より、光がない状態で０〜15℃で0.2〜24時間処理する
ことにより、また必要ならばそのチオール基の保護を除
去することによって得られたものである。また、そのタ
ンパクは、もしこのようにして選ばれたタンパクが、細
胞研究モデルで示し得るように、ユーカリ細胞における
リボソームタンパクの合成を阻止し得る特性を保持する
ならば、このタンパクが有する官能基の変性により上記
糖タンパクから誘導された分子を含む。抗毒素において
は、１部のGPIR−1aは細胞毒素性サブユニットとしても
示されている。

記号Ａ−1aは、遅延作用を有し、リボソームを不活性化
する糖タンパクを示すが、この糖タンパクは、そのシス
テイン171および257のチオール基の少なくとも１つが任
意に保護されているリシンのＡ鎖を過ヨード酸アルカリ
金属の水溶液により光の不存在下で０〜15℃で0.2〜24
時間処理することにより、また必要に応じて上記チオー
ル基の脱保護により得られる。

記号Ｐ′は、上記タンパクＰ又はそれぞれ化学的に変性
したものから誘導されたラジカルを表わし、そこからそ
れ自体の基の１つ又はそれ以上が除去され、また他の官
能基が任意に保護されているものである。

記号GPIR−1a′は上記タンパクGPIR−1a又はそれを化学
的に変性したものから誘導されたものを表わし、そこか
らそれ自体の基の１つ以上が除去され、他の官能基が任
意に保護されているものである。

記号Ａ−1a′は、そのシスティン171および257のチオー
ル基の少なくとも１つが除去された、タンパクＡ−1aか
ら誘導されたラジカルを表わす。

記号P₁は、上記タンパクGPIR−1aおよびＰの１つを表わ
し、それは上記タンパクに直接又はスペース構造を介し
て結合された遊離チオール基を有する。

記号P₂は、タンパクGPIR−1aおよびＰのうちの一方であ
るがP₁とは異なるものであり、遊離チオールと反応し得
る１種以上の官能基を有するものである。

記号P₁′はタンパクP₁に属する基に結合したタンパクP₁
のラジカルを表わし、特に、（システィンの）SH基、
（タンパクの末端位置又はリシンのイプシロン位置にあ
る）NH₂基、（チロシンの）OH基、又は（アルパルチン
酸又はグルタミン酸の）COOH基であり、又はP₁が抗体又
は抗体フラグメントである場合にのみ、公知の方法によ
り過ヨード酸との反応により炭水化物構造の開始部から
発生するタンパクP₁のラジカルである。

記号P₂′は、特徴的官能基（タンパクの末端位置にある
か又はリシンのイプシロン位置にある）NH₂、（チロシ
ンの）OH又は（アスパラチン酸およびグルタミン酸）の
COOHに結合されたタンパクP₂のラジカルを表わす。

例えば、P₁,−SHは（抗体又は抗体フラグメントＰ又は
タンパクGPIR−1aであり得る）タンパクP₁を表わすが、
このタンパクP₁は、システィンのSH基が遊離しており、
他の官能基は任意に保護されているものである。

同様に、P₁,−CO−は、その末端カルボキシル基又はそ
のグルタミン酸およびアスパラチン酸のカルボキシル基
が、SH基を導入する基と結合されているタンパクP₁を表
わす。

P₂,−NH−は（抗体又は抗体フラグメントＰ又はタンパ
クGPIR−1aであり得る）タンパクP₂を表わすが、このタ
ンパクP₂は、その末端アミノ基又はそのリシンのアミノ
基がタンパクP₁のチオールと連結し得る基に結合してい
るものである。

「不活性スペーシング構造」なる語は、このプロセスに
用いる反応体に対し不活性な２価の有機ラジカルを示
し、例えば１〜15の炭素原子を有する直鎖又は側鎖アル
キレン基であり、１つ以上の二重結合を含んでもよく、
また酸素原子によって中断されていてもよく、あるいは
またメトキシ基、遊離の又はエステル化されたカルボキ
シル基、ジアルキルアミン基又はカルパメート基のよう
な１種以上の不活性官能基によって置換されているもの
であってもよい。同じ語はまた、上でアルキレン基につ
いて示したように、１種以上の不活性官能基によって置
換され得る６〜15の炭素原子を有するアリレン基をも示
す。

ここでＹおよびＹ′に関して用いられている「共有結合
し得る官能基」という表現は、共有結合を形成するため
にタンパクP₁およびP₂に属する基と反応し得るいかなる
基をも意味する。−CO−基および−（Ｃ＝NH）−基は、
タンパクの遊離アミン、チオールおよびフェノール性水
酸基と結合し得る適当な官能基である。同様に、−NH−
基もタンパクの遊離カルボキシル基と結合し得る適当な
官能基である。＝Ｎ−基は過ヨウ素酸イオンによる酸化
のあとにタンパクP₁およびP₂の糖鎖の２つの炭素原子と
結合し得る適当な官能基である。ただしそれは、P₁およ
びP₂が抗体または抗体断片である場合に限る。

ここでＺ及びＺ′として示されている「蛋白質に属する
基」なる表現は、蛋白質P₁及びP₂を形成するアミノ酸の
特有な基から作られたラジカルを示す。例示すれば、チ
ロシンやセリンアミノ酸の水酸基から生ずる酸素原子、
アスパラギン酸やグルタミン酸の末端カルボキシルや遊
離カルボキシルから生じたカルボキシル基、蛋白質の末
端アミノから生じた−NH−基（例えばリジン）あるいは
システィンのチオールから生じた硫黄原子がある。同様
に、この表現は、過ヨウ素酸イオンの処理により、蛋白
質P₁及びP₂の炭水化物構造の一つを酸化した後得られる
ジアルデヒド構造から生じた基を示す。しかしこの場
合、P₁及びP₂は抗体又は抗体断片である。

ここでＸで示される「活性ラジカル」なる用語は−Ｓ−
Ｓ−プリッジに結合された基を示し、これは遊離チオー
ルと反応してＸ−SHを解放した二硫化物を形成する。適
切な活性ラジカルはピリジン−２−イル及びピリジン−
４−イル基で、これらは置換されていないもの、あるい
は１又は２以上のハロゲン又はアルキル基、カルボキシ
ル基、アルコキシカルボニル基によって置換されたもの
である。フェニル基は置換されていないもの又は好まし
くは１又は２以上のハロゲン基又はニトロ基、アルコキ
シル基、カルボキシル基又はアルコキシカルボニル基に
よって置換されたものである。

「アルキル」及び「アルコキシ」という用語は、５炭素
原子以下を含む基を示す。

「アルキレン」なる用語は、炭素原子10以下を含む直鎖
又は分枝した飽和脂肪族基を示す。これらは１又は２以
上の不活性官能基（例えばアルコキシカルボニル基）に
よって置換されたものでもよい。

とくにこの発明は、イムノトキシンのクラスに属する生
産物に関する。そしてこれらは、一方では抗体又は抗体
断片に共有結合して得られその自然の形又は適切に修正
されて（シンボルＰ）使用され、これは所定のターゲッ
トセルによって選ばれた抗原を選択的に認識する能力を
持っている。他方、これらは長期活性のグリコプロティ
ンを有しており、これはリボソームを不活性化するもの
で、リボソームを不活性化するグリコプロティンの処理
によって得られる。そのチオール基は、過ヨウ素酸のア
ルカリ金属化物の水溶液で選択的に保護される。その期
間は、0.2〜24時間、温度０〜15℃、光のない状態であ
る。そしてチオール基をブロッキングしないことによ
り、（シンボルGPIR−la）を用いた場合、２つの蛋白質
の結合は２硫化物の結合又はチオエーテル結合のいずれ
かを介して有効となる。

抗体Ｐを長期活性グルコプロティン（これはリボソー
ム、GPIR−laを不活性とする）と結合させて形成された
イムノトキシは、次の統計的な式で示される。

Ｐ′−Ｗ−GPIR−la′ Ｉ ここでＰ′は蛋白質の基を示し、この蛋白質は抗体又は
抗体断片Ｐであり、あるいはこれらを適宜化学的に修正
したものである。また他の官能基は必要によりブロック
されており、GPIR−la′はGPIR−laやこれを適宜化学的
に修正した蛋白質のラジカルを示す。他の官能基は必要
によりブロックされ、Ｗはチオエチル基又は二硫化基を
含む２価の共有構造で、これらの基では硫黄原子はＰ及
びGPIR−laのシスティンのそれであり、あるいはＰ及び
／又はGPIR−laに属する上記基に結合して官能基を持た
せた空間（spacing）構造によって、Ｐ及び／又はGPIR
−laに属する基に結合している。

２つの蛋白質間のチオエーテル結合は、以下のタイプの
結合として理解される。

ここでZ,Y及びＥは以下に定義される。

この発明は、好ましくは下記の統計的な式で示すイムノ
トキシンに関する。

Ｐ′−Ｗ′−GPIR−la′ II ここで、Ｐ′及びGPIR−la′は、先に定義した通りであ
る。Ｗ′は以下（ａ）〜（ｄ）から選ばれた共有構造で
ある。

（ｃ） −Ｚ−Ｙ−Ｅ−Ｓ−Ｓ−（Ｅ′−Ｙ′−Ｚ′）
ｎ− （ｄ） −（Ｚ′−Ｙ′−Ｅ′）ｎ−Ｓ−Ｓ−Ｅ−Ｙ−
Ｚ− これらの式で、Ｚ及びＺ′は、蛋白質GPIR−la及びＰに
属する基を示し、チロシン残滓（residues）の一つのヒ
ドロキシルから生じる酸素原子、GPIR−la及びＰのアス
パラギン酸及び／又はグルタミン酸の末端カルボキシル
又は遊離カルボキシルの１つから生じるカルボキシル
基、GPIR−la及びＰの末端アミンの１つ又はリジン残滓
の１つのエプシロン位置のアミンの１つから生じる−NH
−基から選ばれるものであり、更に上記共有構造（ｂ）
及び（ｃ）中のＺについてのみ、公知の方法でＰの炭水
化物構造の一つを過ヨウ素酸で酸化させた後得られるジ
アルデヒド構造から生じる基である。

Ｙ及びＹ′は、蛋白質GPIR−la及びＰのＺ及びＺ′基の
任意の一つと共有結合可能な官能基を示す。

Ｅ及びＥ′は不活性空間構造を示し、ｎは０又は１であ
る。

イムノトキシンは上述の式Ｉ及びIIによって簡単に表現
できる。しかし、２価共有構造−Ｗ−又は−Ｗ′は少な
くとも１分子のＰ及び少なくとも１分子のGPIR−laに結
合される。蛋白質Ｐ及びGPIR−laとの結合数は、結合操
作中に含まれる上記蛋白質にある基の数による。

例えば、リシン自体のサブユニットＡを抗体Ｐ（例えば
抗体T101）に結合してイムノトキシンを形成する際、２
硫化基を持つ２価の共有構造を経て行なう場合（ここで
２硫化基の一方の硫黄はリシンの長期活性Ａ鎖のシステ
ィン257に属し、他方の硫黄はオキシプロピル基によっ
て抗体Ｐのチロシンのフェノール酸素と結合してい
る。）、下記統計的な式を有する。

Ｐ′（Ｏ−CO−CH₂−CH₂−Ｓ−Ｓ−Ａ−la′）ｔ ここでｔは結合中に含まれる抗体（例えば抗体T101）中
のチロシンの数を示す。

得られたイムノトキシンは、式IIの生産物に対応してい
る。この式中、 Ｐ′は上述した通りであるが、とくに結合中に含まれて
いるチロシンのフェノール基を除去した抗体T101のラジ
カルである。

Ａ−la′はシスティン257のチオール基を除去したリシ
ンの長期活性Ａ鎖のラジカルである。

Ｗは下記の（ｃ）基である。

−Ｚ−Ｙ−Ｅ−Ｓ−Ｓ−（Ｅ′−Ｙ′−Ｚ′）ｎ− ここでＺは結合中に含まれるフェノールハイドロキシル
の酸素であり、Ｙは−CO−,Eは不活性空間構造−CH₂−C
H₂,nは０である。

特に好適なイムノトキシンはリシンの長期活性サブユニ
ットＡと単一抗体Ｐとを含む１又は２以上の構造物によ
って形式されたもので、下式で示される。

Ｐ′（Ｗ′−Ａ−la′）ｍ III ここでＰ′,W′及びＡ−la′は上述した通りである。ｍ
は結合中に含まれる蛋白質Ｐに属する基の数を示す。ｍ
の数は0.3〜12、好ましくは0.5〜10の範囲で変化する。

「ｍの数は0.3〜12、好ましくは0.5〜10の範囲で変化す
る。」とは、ｍの値は統計的な値であるということであ
る。なぜなら、抗体分子の中では結合は均一には生じな
いためである。従ってｍは整数ではない。

ｍの値はとくに使用される抗体により、更には抗体の分
子量による。

従って断片Fab又はFab′を最初の抗体Ｐとして使用する
と、ｍの値は0.3と約２の間で変化する。断片Ｆ（a
b′）_２を使用すると、ｍは0.5と約４の間で変化する。
IgGタイプの抗体では、ｍは0.5と約６との間で変化す
る。抗体IgMではｍは１と約12の間で変化する。

しかし、好ましくは抗体Ｐの置換の程度は、ｍが0.5以
上であり、10を超えないのがよい。

一般に、上述の構造式Ｉ及びIIは、簡略式に記載された
一般式を示す。

同様に以下の式IV,V及びIXはｎが１のときはいつも統計
的な式である。なぜなら結合反応体は蛋白質P₁及びP₂中
から選択され、これら蛋白質は全て抵抗Ｐとして上述の
如く考慮されるものとしてまったく同じ性質を有してい
る。この場合蛋白質P₁及びP₂は抗体Ｐ又は蛋白質GPIR−
la自体であることを問わない。

この発明の他の態様としては抗体と、リボソーム不活性
化糖タンパクとの間にジスルフィド又はチオエーテル型
の共有結合を有する長期作用型免疫毒素の製造方法であ
って、糖タンパク（そのチオール基を適宜保護して）を
過ヨウ素酸アルカリ金属塩の水溶液で０〜15℃で、光の
不存在下で0.2〜24時間処理して得るようにしたことを
特徴とする方法を提供する。

本発明の好ましい態様は上記構造Ｉの免疫毒素の製造方
法であって、タンパクP₁（リボソーム不活性化長期作用
型糖タンパク、GPIR−la又は抗体もしくは抗体断片であ
って、遊離チオール基が直接又は介在原子団を介して結
合したもの）を水溶液中、室温でタンパクP₂（P₁と異な
り、リボソーム不活性化長期作用型糖タンパク、GPIR−
la又は抗体もしくは抗体断片であってタンパクP₁の遊離
チオール基と結合し得る基を有するもの）と反応させ、
チオエーテル又はジスルフィド結合を形成させることを
特徴とする方法を提供するものである。

本発明の特に好ましい態様は上記構造IIの免疫毒素の製
造方法であって、Ｐ′,W′およびGPIR−la′が上記定義
のものからなるもので、下記一般式のタンパク、すなわ
ち一般式、 P₁′−（Ｚ−Ｙ−Ｅ）nSH のタンパクを一般式、 P₂′−Ｚ′−Ｙ′−Ｅ′−Ｇ のタンパクと反応させることを特徴とする免疫毒素の製
造方法、 （ただし、式中P₁′およびP₂′はこれらタンパクに属す
る基に結合されたタンパクP₁およびP₂のラジカル、又は
P₁およびP₂が抗体もしくは抗体断片であるときは過ヨウ
素酸との反応により糖鎖核の開鎖により生じたタンパク
P₁およびP₂のラジカル、Z,Z′,Y,Y′,E,E′は前記同
様、Ｇは 又は−Ｓ−Ｓ−Ｘ （ただし、Ｘは活性化基）である） を提供するものである。

したがって上記ＰおよびGPIR−1aは下記の基を適宜含む
タンパクである、 （１） 結合に関与するチオール基又はその他の基、 （２） 上記チオール基と反応しジスルフィド又はチオ
エステル結合を形成し得る１以上の官能基。

本発明によれば上記チオール基および官能基は天然のタ
ンパクＰ又はGPIR−1a、又はこれらを人工的に導入した
ものである。

リボソームを不活性化し、過ヨウ素酸塩で酸化するため
に出発物質として用いられる糖タンパクはすべてGPIR、
たとえばリシンＡ鎖であり、これらはそれ自体、細胞毒
性が極めてわずかである。なぜならばこれらは細胞に付
着することができない。他方、特定の細胞を認識する抗
体と結合したのちは、この抗体が目標細胞を認識したと
きはこれら細胞に対し細胞毒性が極めて大きいものとな
る。

代表的な出発化合物は、リシンのＡ鎖、ゲローニン及び
モモルディカ カランティス（MOM）からの抽出操作に
より得られた抽出物質である。

過ヨウ素酸イオンとの酸化に用いる出発物質として有用
な他のGPIR類は、以下の通りである。

・ディアンチン30（Dianthin30） ディアントゥス カリョフィルス（Dianthus Caryophyl
lus）から ・ディアンチン32（Dianthin32） ディアントゥス カリョフィルス（Dianthus Caryophyl
lus）から ・アグロスティンＡ（Agrostin A） アグロステーマ ジターゴ（Agrostemma githago）から ・アグロスティンＢ（Agrostin B） アグロステーマ ジターゴ（Agrostemma githago）から ・アグロスティンＣ（Agrostin C） アグロステーマ ジターゴ（Agrostemma githago）から ・HCI フラ クレピタンス（Hura crepitans）から ・アスパラグス オフィチナリス阻害剤 アスパラグス オフィチナリス（Asparagus officinali
s）から この目的のために遺伝子型を修飾した細胞で生合成的に
生産された同じ物質も、また適当な化合物である。

上記GPIR類のフラグメントは、もしそれらが元のGPIRを
特徴付ける不活性リボソームの全部または一部の性質を
保持しているとするならば、同様に出発物質として用い
ることができる。

リシンの天然のＡ鎖のうち、チオール基の少なくとも一
つが保護されているものは好ましい出発物質である。

リシンの純粋のＡ鎖の製造については、米国特許第4340
535号に記載されている。ゲローニン及びMOMについても
記載されている。

出発物質におけるチオール基の保護は、そのチオール基
が抗体との結合に用いられるものである場合にのみ必要
とされる。例えばチロシンのフェノール性水酸基のよう
な他の感応基が結合に用いられる場合には、前記の保護
は行なわれない。

保護のためのブロッキングは、SH基を、引続いて還元反
応またはチオール／ジスルフィド変換反応で除去できる
ような官能基で置換することができるような試薬、例え
ば2,2−ジニトロ−5,5−ジベンゾジ安息香酸（DTNB）、
或いは３−（ピリジン−２−イル−ジスルファニル）プ
ロピオン酸等との反応によって行なわれる。このような
試薬が存在しない条件下では、Ａ鎖中の遊離チオール基
は酸化反応中に消失していまい、たとえ２−メルカプト
エタノールのような還元剤との反応によっても全体的に
再生することはできない。過剰のブロック剤は透析によ
り除去する。

リボソームを不活性化する糖蛋白（そのチオール基がブ
ロックされたもの）は、次いで過ヨウ素酸イオンとの酸
化を受ける。他方、もし細胞毒サブユニットがチオール
を含まず、或いはチオールまたはチオール類が結合に用
いられないならば、上記のブロッキングは行なわれな
い。

過ヨウ素酸による酸化反応はpH3〜７、好ましくは５〜
6.5の酸性下で実施される。過ヨウ素酸塩は過剰に用い
る。より望ましくは、過ヨウ素酸アルカリ金属塩の濃度
が、酸化さるべきビチナルジオールの濃度よりも高くな
るようにする。例えば、細胞毒サブユニット濃度１〜10
mg/mlに対し、過ヨウ素酸ナトリウム濃度は10〜50mMが
適している。処理は０〜15℃、好ましくは１〜５℃の暗
所において、0.2〜24時間行なう。

残存する過ヨウ素酸塩を消費する試薬、例えば過剰のエ
チレングリコールの添加によって反応を停止させ、副生
成物を透析により除去する。反応終了時に得られた生成
物は、通常の手法により単離する。

もし出発物質のチオール基がブロックされていれば、公
知の方法でブロッキングを解除する。例えば２−メルカ
プリエタノールのように、ブロックされる前のチオール
基を遊離させ得る還元剤と反応させればよい。これによ
り、リボソームを不活性化する糖蛋白に新規な持続作用
が与えられ、これは抗体と結合して免疫毒素を得るため
に用いることができる。

リシンのＡ鎖の場合、この方法で得られる新しい分子
（以下記号Ａ−１で表わす）は、次の主要な性質を有し
ている。

・分子量は、天然のＡ鎖の分子量とそれほど変らない。
ポリアクリルアミドによる電気泳動で観察する限り、こ
の修飾反応は極く少量の蛋白質の重合体を生成するだけ
で、分解生成物は何等生じない。

・遊離チオール基の比率は、0.7/molよりも大きい。

・リシンのＡ鎖を基準とした兎抗体に対する免疫反応特
性は、天然のＡ鎖のそれと区別できない。

・無細胞系における蛋白合成の阻害活性は、等量の天然
Ａ鎖で生じるものの50％より大きい。

・最後に、兎に約0.4mg/Kg体重の投与量で一回静脈注射
した後、静注後23時間での血流中における長期作用型Ａ
鎖（Ａ−１）の血漿レベルは、投与時における血漿レベ
ルの10％よりも大きい（天然Ａ鎖の場合のこの時点での
値は0.015％であるから、血漿レベルの上昇因子は500倍
よりもかなり大きい）。同様に、ゲローニングの場合に
過ヨウ素酸酸化により得られる分子は次の主要な性質を
有している。

・分子量は、天然のゲローニンの分子量とそれほど変ら
ない。

・抗ゲローニン兎抗体に対する免疫反応特性は、天然の
ゲローニンの反応特性と区別できない。

・最後に、兎に約0.3mg/Kg体重の投与量で一回静脈注射
した後、静注後24時間での血流中における修飾ゲローニ
ンの血漿レベルは、投与時における血漿レベルの３％よ
りも大きい（天然ゲローニンの場合のこの時点での値は
0.01％であるから、血漿レベルの上昇因子は200倍より
も大きい）。

リボソームを不活性化する長期作用型糖蛋白から結合
体、即ち免疫毒素を調製するには、米国特許第4340535
号に記載されている方法のなかから適当に選択した方法
を用いればよい。もし、選択した細胞毒サブユニット
が、結合に適した少なくとも一つのチオール基を天然に
含んでいるならば、この基は活性化されたジスルフィド
基をもった抗体または抗体フラグメントとの反応に好適
に用いられる。もし、選択した細胞サブユニットが、結
合に適したチオール基を天然には含んでいないならば、
過ヨウ素酸イオンとの酸化処理の後、遊離チオールをも
った少なくとも一つの官能基を公知の何等かの方法で人
為的に前記サブユニットに導入し、上記の結合反応を続
行する。

前記官能基の導入は、過ヨウ素酸イオンとの酸化処理の
前、または酸化処理の後のどの段階で行なってもよい。
但し、酸化処理の前に行なう場合には、酸化処理の間は
チオール基をブロックしておき、酸化処理の後にそのブ
ロックを解除する必要がある。

ヒトの癌細胞に対するモノクローナル抗体の調製につい
ては、既に科学文献で広く報告されており、また現在で
は多数のこれら抗体が商業的に入手可能である。

本発明の方法において、GPIR−1aと抗体（または抗体フ
ラグメント）との化学的な結合は、結合体の二つの成分
（抗体およびGPIR−1a）の夫々の生物学的活性を保持
し、満足すべき再現性および良好な収率で結合体が得ら
れ、また得られた結合体中におけるGPIR−1a/抗体の比
率制御を可能とすると共に、更には安定且つ水溶性の生
成物に導くような方法で行なうことができる。

これらの特徴に対応した方法の中で、二つの蛋白の間の
結合形成において、１または２以上のチオール基を含む
ものを優先すべきである。事実、これらのチオール基
は、ジスルフィド結合またはチオエーテル結合の形成に
特に適し、両者共に上記の一般的条件を満たす。

同時に免疫毒素の調製についても以下の特徴を有してい
る。

・リシンのＡ鎖と抗体との間の共有結合は、ジスルフィ
ド基を含んでいる。

・ジスルフィド結合を形成している硫黄原子の一つは、
常に、リシンＡ鎖の257位置にでのシスティン残基に属
する硫黄原子である。

・また、リシンのＡ鎖を抗体に結合するリンクは、抗体
のNH₂側基またはペプチド鎖の末端基に結合しており、
抗体とリシンＡ鎖とのカップリングにより形成される。
これらについては、米国特許第4340535号に詳細に記載
されている。

同じ方法が、同様の特徴を有し、且つ抗体または抗体フ
ラグメントとGPIR−1aとの結合で形成される免疫毒素類
の調製にも適用できる。

抗体または抗体フラグメントとGPIR−1aとの結合、及び
異なった官能基におけるジスルフィドまたはチオエーテ
ル型の共有結合により形成される免疫毒素類の調製につ
いて、以下に詳細に説明する。

一般的に、特に交叉結合の乱れを排除して蛋白間にうま
く結合反応を行なうためには、安定で且つ明確に定まっ
た共有結合が形成されるように、結合されるべき一方の
蛋白（一方のみ）は使用されるチオールまたはチオール
基だけを有し、他方の蛋白はpH5〜９、30℃を超えない
温度の水性媒質中においてチオール類と反応し得る１ま
たは２以上の基のみを有することが重要である。

以下に詳細に説明するように、蛋白P₁およびP₂の特徴は
出発物質として用いられる。Ｅの立体構造は、より好ま
しい構造Ｒ〜R_B（これは実施例としてのみ与えられる）
に置代えることができる。

I.タンパクP₁ このタンパクは、どんな場合も結合に関与する１つか１
つ以上のチオール基を有しているので、生じる状況はタ
ンパクP₁の性質に応じて異なる。

（Ａ） 天然の状態でタンパクP₁は、タンパクP₂との結
合に関与する１つ以上のチオール基を有している。この
ことは特に次のような場合に言える。すなわち、タンパ
クP₁が、ペプシンの存在下で抗体を限定分解し、続いて
高分子間のジスルフィド結合を還元して通常得られるよ
うなＦ（ab）′として知られる抗体断片である場合であ
る。このことは、タンパクP₁がリシンのＡ鎖またはＡ鎖
の誘導体である場合にもあてはまる。この場合、天然リ
シンの171番目のシスティン残基および257番目のシステ
ィン残基に付いている少なくとも１つのチオール基が未
結合であって化学結合を生じやすい。これらすべての場
合において、天然のチオール基を有するタンパクP₁はこ
のような状態で結合工程に使用される。

（Ｂ） 天然の状態でタンパクP₁は、タンパクP₂との結
合に関与するチオール基を有していない。このことは特
に次のような場合に言える。すなわち、タンパクP₁が天
然の免疫グロブリンであって、抗体全体か抗体の断片特
に通常Ｆ（ab）′またはＦ（ab）と呼ばれる断片の１つ
である場合、天然の状態でタンパクP₁が結合に関与する
１つのチオール基を持たない場合のいま１つの例は、こ
のタンパクP₁が、２つのシスティン残基それぞれがアル
キル化により保護されているか、または化学修飾を受け
ないリシンのＡ鎖である場合である。全ての場合におい
て、結合を可能にする１つ以上のチオール基をそのよう
な分子に導入することが妥当といえる。

３つの型の反応がチオール基を導入するために好ましく
用いられる。

（１） 最初の型の反応は、Ｓ−アセチルメルカプトコ
ハク酸無水物との反応である。この酸無水物は、タンパ
クのアミノ基のアセチル化を可能にする。その後当該チ
オール基をヒドロキシアミンと反応させることによって
アセチル保護基を除くことができる。この方法はすでに
アーチブズ・オブ・バイオケミストリー・アンド・バイ
オフィジクス（Archives of Biochemistry and Biophys
ics）、119,41−49（1967）に記載されている。このよ
うな保護基が導入されたチオール基を続いて活性型ジス
ルフィド基と反応させる場合、ヒドロキシアミンによっ
て前もって保護基をはずさなくて済む可能性がある。事
実、この発明の物質を形成する反応体を使ってジスルフ
ィド結合を形成する反応は、遊離チオール基を使った場
合と同様にＳ−アセチル基を使っても生じる。

文献に記載されている他の方法も、修飾されるタンパク
にチオール基を導入するために使うことができる。

（２） 第２の型の反応はタンパクをカルボキシル基を
介して以下に示すジスルフィド構造を有する対称的なジ
アミノ分子と反応させることである。

H₂N−R₁−Ｓ−Ｓ−R₁−NH₂ 上式中、R₁は炭素数２から５の脂肪族原子団である。こ
の反応では、カルボジイミド特に１−エチル−３ジメチ
ルアミノプロピル−３−カルボジイミドのような水溶性
の誘導体の如きカップリング剤の存在下でシスタミン
〔R₁＝−（CH₂）_２−〕と反応させ、用いた化学量論量
に応じて次に示す誘導体の１つか双方の混合物を形成さ
せることが好ましい。

P₁′−CO−NH−R₁−Ｓ−Ｓ−R₁−NH₂ （Ia） P₁′−CO−NH−R₁−Ｓ−Ｓ−R₁−NH−CO−P₁ （Ib） この型の反応生成物は次の２つの工程のいずれかに供さ
れる。

（ａ） 式IaまたはIbにおいて、タンパクP₁がリシンの
Ａ鎖またはその誘導体の１種ならば、得られた反応溶液
は分別せずに２−メルカプトエタノールのような還元剤
との反応に供せられる。それによって次式の１種類のタ
ンパク誘導体が得られる。

P₁′−CONH−R₁−SH こうして得られた生成物は続いて透析かゲル濾過により
精製される。

（ｂ） 式IaおよびIbにおいて、ラジカルP₁′が抗体ま
たはその断片の１種から成る、タンパクＰのラジカルな
らば、得られた反応溶液はそのままカップリングに用い
られ、その場合チオール／ジスルフィド交換法が用いら
れる。この交換法は、例えばギリランド（Gilliland）
とコリエール（Collier）によってキャンサー・リサー
チ（Cancer Reserch）,40,3564（1980）に記載されてい
る。

（３） 第３の反応は、導入しようとするチオールを有
するラジカルを固定するために糖鎖単位を使うことであ
る。この糖鎖単位は天然の状態で抗体に存在しているも
のである。続いてタンパクは、糖鎖単位にアルデヒド基
を生じさせるために過ヨウ素酸で酸化される。過剰のエ
チレングリコールを加えて反応を停止させ、副産物と過
剰の反応体を透析により除いた後、得られた成生物を次
の一般式を有対称なジアミノ分子で処理する。

H₂N−R₁−Ｓ−Ｓ−R₁−NH₂ 上式中R₁は炭素数２ないし５の脂肪族量である。得られ
た付加生成物は、続いて金属水素化物（特には、水素化
ホウ素ナトリウム）との反応により第２または第３アミ
ンに還元される。この反応はシスタミン〔R₁＝−（C
H₂）_２−〕を用いて実施することが好ましく、用いた化
学量論量に応じて次式の誘導体の１方かその両方の混合
物が形成される。

得られた反応液を、IaまたはIbの構造式で表わされる生
成物であってP₁′が抗体または抗体断片であるものに関
して上記したとおりの処理を行なってもよい。

チオール基を人工的に導入（対称なジアミノジスルフィ
ド反応体を使うタイプ）するための上に述べた後二者の
反応において、タンパクP₁は遊離SH基または遊離アミノ
基を持たないことが好ましい。Ａ鎖とその誘導体の場合
には、Ｎ−エチルマレイミドまたはヨード酢酸のような
チオール基に対する通常の試薬との反応により天然のチ
オール基をアルキル化し、およびミィーンズ（MEANS）
およびフィーニー（FEENEY）によってバイオケミストリ
ー（Biochemistry）7,2192（1968）に記載された還元的
メチル化法に従って天然のNH₂基をメチル化することに
より常に遊離のチオール基を持たなくさせ得る。このよ
うにして天然リシンのＡ鎖に１モル当り６個までのメチ
ル基を導入することができる。このようにして修飾され
たタンパクには、生物学的な特性（特には、真核細胞の
リポソームにおけるタンパク合成を阻害する能力）が備
わっている。抗体または抗体断片さらに第１群のすべて
の物質の場合には、前記したようにそれらは天然の遊離
SH基を持たないので、還元的メチル化を例えばミーンズ
およびフィーニーの方法により実施するほうがよい。こ
のようにして通常抗体１モル当り数十のメチル基を導入
することができる。その場合抗体の細胞表面上の抗原を
認識する能力を変化させない。

II タンパクP₂ あらゆる場合、このタンパクは、タンパクP₁のチオール
基と反応してジスルフィドまたはチオエーテル結合を形
成し得る１つ以上の官能基を有するタンパクである。こ
れらの官能基は、常にタンパクP₂に人工的に導入される
が、それがジスルフィド結合によりカップリングされる
のかチオエーテル結合によりカップリングされるのかに
応じて異なっている。具体的には以下に記載する。

（１） ジスルフィド結合 この場合、包含体の調製は以下の式で表わされる。

P₁′−（Ｚ−Ｙ−Ｅ）ｎ−SH＋P₂′−Ｚ′−Ｙ′−Ｅ′
−Ｓ−Ｓ−Ｘ→ P₁′−（Ｚ−Ｙ−Ｅ）ｎ−Ｓ−Ｓ−Ｅ′−Ｙ′−Ｚ′−
Ｐ▲^′ _２▼＋Ｘ−SH. 活性イオウ原子により置換されるタンパクP₂はタンパク
P₂または適切に保護されたタンパクP₂からそれ自体活性
イオウ原子を有する試薬による置換により得られる。こ
れは次の式で示される。

P₂＋Ｌ−Ｙ′−Ｒ−Ｓ−Ｓ−Ｘ→P₂′−Ｚ′−Ｙ′−
Ｒ′−Ｓ−Ｓ−Ｘ 上式中、P₂は置換されるべきタンパクを示し、Ｌ−Ｙ′
は試薬をタンパクに共有結合させる基を示す。官能基Ｌ
−Ｙ′は、置換されるべきタンパクの構成アミノ酸の側
鎖に付いているいずれか１つの基と共有結合し得る基で
ある。これらの基の中で、特に次のものが選び出せる。

（ａ） ペプチド鎖の末端アミノ基またはタンパクに含
まれるリシン残基のアミノ基。この場合、Ｌ−Ｙ′は特
に次のように表わせる。

・カルボジイミド、特に１−エチル−３−ジメチルアミ
ノプロピル−３−カルボジイミドの如き水溶性誘導体の
ようなカップリング剤の存在下でタンパクのアミノ基と
結合し得るカルボキシル基。

・アミノ基と直接反応して、それをアシル化し得るカル
ボン酸塩化物。

・オルト−またはパラ−ニトロフェニルまたは−ジニト
ロフェニルエステル、またはＮ−ヒドロキシコハク酸イ
ミドエステルのようないわゆる「活性型」エステル。こ
れはアミノ基と直接反応して、それをアシル化し得る。

・コハク酸無水物のようなジカルボン酸の内部無水物。
これはアミノ基と自然に反応して、アミド結合を形成さ
せる。または ・イミドエステル基 上式中、R₂はアルキル基で、次式のようにタンパクP₂の
アミノ基と反応する。

上式中、R₃はＲ−Ｓ−SX基を示す。

（ｂ） タンパクに含まれるチロシン残基のフェノール
基。この場合、Ｌ−Ｙ′は特にイミダゾール−１−イル
カルボニル基を示すことがある。それは次の式に従って
タンパクのフェノール基と反応する。

上式中、Ｌがイミダゾール−１−イルで、Ｙ′がCO基
で、R₄が−Ｒ−Ｓ−Ｓ−Ｘ基である。−Ｓ−Ｓ−Ｘは遊
離チオール基と反応し得る活性型ジスルフィドを示す。
特に、このジスルフィドにおいて、Ｘは１つ以上のアル
キル、ハロゲンまたはカルボキシ基で置換されているこ
とのあるピリジン−２−イルまたはピリジン−４−イル
基を指すことがある。Ｘもまた１つ以上のフェニル基ま
たはカルボキシル基で好ましくは置換されているフェノ
ール基を指すことがある。またはＸはメトキシカルボニ
ル基のようなアルコキシカルボニル基を指すこともあ
る。

Ｒ基は、置換基Ｙ′およびＳ−Ｓ−Ｘを同時に結合し得
る介在分子（前式中のＥのような）を示す。それは、後
の反応において、使用される反応物質と合成される生成
物を妨害するような基を含まないようなものでなければ
ならない。特に、Ｒ基は−（CH₂）−でもあり得（ｎは
１ないし10）、また次の基でもあり得る。

上式中、R₆は水素または炭素数１ないし８のアルキル基
を指し、R₅は続いて使われる次式のカルカルバメイト基
のような反応体に不活性な置換基を指す。

上式中、R₇は炭素数１から５の直鎖または分枝アルキル
基、特に第３ブチル基を示す。化合物Ｌ−Ｙ′−Ｒ−Ｓ
−Ｓ−ＸとタンパクP₂との反応は均質な液相、最も一般
的には水または緩衝液中で進行する。反応体の溶解性を
高めるには、水に可溶性の有機溶媒を反応溶液に加える
ことができる。その最終濃度を、第３ブタノールのよう
な第３アルコールの場合には容量比で20％までにするこ
とができ、ジメチルホルムアミドまたはテトラヒドロフ
ランの場合には容量比で10％までにすることができる。

反応を、室温にて数分から数時間の時間をかけて実施す
る。その後、低分子量の生成物および特には過剰の反応
体を透析またはゲル濾過によって除去することができ
る。この方法により、タンパク１モルあたり１ないし15
の置換基を導入することが可能となる。そのような化合
物を用いる場合、タンパクP₁とのカップリングは、pH6
から８の溶液中にて30℃を越えない温度で、１時間から
24時間かけておこなう。低分子量の生成物を除くために
適宜、得られた水溶液を透析する。ついで包含体を既知
の方法の変法により精製できる。

（２） チオエーテル結合 この場合、包含体をP₁′−（Ｚ−Ｙ−Ｅ）ｎ−SHと前も
って１つ以上のマレイミド基を導入しておいたタンパク
P₂とを反応させることにより調製する。１例として、反
応を次の式で示す。

上式中、R₈は炭素数１ないし15の脂肪族または芳香族介
在分子を示す。それは、続いて使用される反応体に対し
て不活性である。Ｚは、結合に関与するタンパクP₂の官
能基の種類に従って変化し得る基を示す。すなわち、Ｚ
は、酸素（チロシン残基（チロシル基）のフェノール基
のエステルの場合）、NH（タンパクのアミノ基と活性型
カルボキシル基のカップリングの場合）またはNH−CH₂
（タンパクのアミノ基とクロロメチルケトンの場合）で
ある。

マレイミドで置換されたタンパクP₂は、それ自体マレイ
ミド基を有する試薬によってタンパクの適当な基を置換
することによって、タンパクP₂自体からまたは適当に保
護されたタンパクP₂から得られる。これらに適した基の
うち、特に次のものが選ばれる。

ａ） ペプチド鎖の末端アミノ基またはタンパクに含ま
れるリシン残基（リシル基）の側鎖アミノ基。この場
合、マレイミド基を有する試薬は次のようなものがあ
る。

ア） 次の一般式の試薬 上式中、Ｌ−CO−は次のとおりである。

・カルボキシル基。その場合、カルボジイミドのような
カップリング剤および特には１−エチル−３−ジメチル
アミノプロピル−３−カルボジイミドのような水溶性誘
導体の存在下でカルボキシル基を活性化したのち、反応
が進行する。

・またはオルト−若しくはパラ−ニトロフェニルまたは
ジニトロフェニルエステルまたはＮ−ヒドロキシコハク
酸イミドエステル。

これは直接アミノ基と反応し、それをアシル化する。こ
のような試薬の調製は、特にヘルベティカ・ケミカ・ア
クタ（Helvetica Chimica Acta）,58,531−541（1975）
に記載されている。同じようなクラスの他の薬剤は市販
品として手に入る。

イ） 次の一般式の試薬 これは次の反応式に従ってタンパクP₂のアミノ基と反応
し得る。

ｂ） タンパクに含まれるチロシン残基のフェノール
基。この場合、マレイミド基を有する試薬は次の一般式
で示される。

これは次の反応式に従ってタンパクのフェノール基と反
応する。

マレイミドを有する試薬とタンパクP₂との反応は均質な
液相、最も一般的には水または緩衝液中で進行する。反
応体の溶解性を高めるには、水に可溶性の有機溶媒を反
応溶液に加えることができる。その最終濃度を、第３ブ
タノールのような第３アルコールの場合には容量比で20
％までにすることができ、ジメチルホルムアミドまたは
テトラヒドロフランの場合には容量比で10％までにする
ことができる。反応は室温にて数分から数時間かけてお
こなう。

そののち、低分子量生成物、特に過剰の反応物を透析、
又はゲル濾過により取り除く。

この方法により、通常、タンパク１モル当り１〜13の置
換基を導入することができる。

このような化合物を用いる場合、タンパク質Ｐとのカッ
プリングは、２つのタンパク質をpH6〜８の水溶液中に3
0℃以下の温度で１ないし24時間かけて溶解することに
よっておこなう。得られた溶液を、所望に応じて透析し
て低分子量生成物を除去し、抱合体を種々の既知の手法
によって精製する。

式 （ここで、ＥおよびＧは上記の通り）で示される化合物
は、式 Ｇ−Ｅ−COOH VII （ここで、ＧおよびＥは上記の通り）で示される化合物
を、有機溶媒中10ないし40℃の温度で、式 で示されるカルボニルジイミダゾールと反応させること
によって得られる。

式VIの化合物は、タンパク質GPIR−1aおよびＰのチロシ
ンの水酸基とのカップリング用試薬として特に有用であ
る。

この発明は、また、統計式 GPIR−1a″−Ｏ−CO−Ｅ−Ｇ IX （ここで、 GPIR−1a″は、タンパク質GPIR−1aの残基もしくはその
官能基のいずれか１つを修飾することによってGPIR−1a
から誘導された分子であって、チロシンのフェノール水
酸基が１つ以上除去されているものを表し、 酸素原子は、残基GPIR−1a″から離脱した上記フェノー
ル水酸基に属するものを表し、および ＥおよびＧは上記の通りである）で示される新規生成物
にも関する。

特に好ましい化合物は、式IXで示される化合物であって
Ｅが、基CH₂ｐ（ここで、ｐは２ないし７の整数）
または基 であり、かつＧが式−Ｓ−Ｓ−Ｘ（ここで、Ｘは、１つ
以上のハロゲン、アルキル基、カルボキシル基、アルコ
キシカルボニル基、１つ以上のハロゲン、ニトル、アル
コキシ、カルボキシルもしくはアルコキシカルボニルで
置換されもしくは置換されていないフェニル基もしくは
アルコキシカルボニル基でそれぞれ置換されまたは置換
されていないピリジン−２−イルおよびピリジン−４−
イルよりなる群の中から選ばれた活性基であるものであ
る。

式IXの生成物は、式 GPIR−1a″−OH （ここで、GPIR−1a″は上記の通り、および水酸基は残
基GPIR−1a″のチロシンから脱離するフェノール水酸基
である）で示される化合物を、場合に応じて水混和性有
機溶媒（例えばジオキサンやテトラヒドロフランのよう
なエーテル系溶媒）を含有する水系溶媒中、10ないし40
℃の温度で、式VIの化合物と反応させることによって得
られる。

GPIR−1aがリシンの長期作用型Ａ鎖である場合、得られ
た免疫毒素IT（Ａ−1a）の性質は以下の通りである。

（１） 抗体１モル当りの修飾Ａ鎖のモル数で表現され
る平均カップリング度は、通常、0.5ないし５であり、
特に１ないし３である。

（２） ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によってIT
（Ａ−1a）を分離すると、抗体の分子量とは30000ダル
トンづつ連続的に異なる分子量を有する生成物に相当す
る一連のバンドに分れる。

（３） サイトフルオロメトリーによって、抗体は活性
化およびカップリング反応中にどのような実質的な劣化
をも受けていないことおよび抱合体自体の内部において
それが指向された抗原をなお認識し得ることが示され得
る。

（４） 修飾された抗体とカップリングしたＡ鎖の、タ
ンパク質合成に対する阻害活性は、２−メルカプトエタ
ノールの存在下において無細胞モデルで測定すると、全
体的に保持されている。

免疫毒素IT（Ａ−1a）の細胞毒性活性は、活性化剤の存
在下において標的抗原を有する細胞について細胞モデル
中でのタンパク合成試験で測定したとき、標的抗原を持
たない細胞について同一条件でおこなったときよりも10
00倍以上大きい。例えば、ジスルフィド架橋を含む結合
によってリシンの修飾Ａ鎖を、ある種のヒト白血病細胞
表面に存在する抗原T65に指向される単一クローン抗体
（抗体T101で表示）とカップリングして得た免疫毒素
（IT（Ａ−1a）で表示）は、陰性T65細胞に対してより
も約105倍陽性T65細胞に対して細胞毒性である。

免疫毒素IT（Ａ−1a）の細胞毒性効率は、クローン原性
（clonogenic）試験で測定したとき、相応する通常のIT
類について得られたものと同等である。例えば、10mMの
塩化アンモニウムの存在下に10^-11Mもの低い投与量でIT
（Ａ−1a）は初期値の99.999％のオーダーの特異的サイ
トリダクション（cytoreduction）に至る。この結果
は、同じ抗体およびリシンの非修飾Ａ鎖で形成されたIT
T101について得たものと同一である。

Ａ鎖として換算してIT（Ａ−1a）をウサギに0.4mg/Kg体
重のオーダーで血管内投与した後、投与から23時間後の
血液流に存在するIT（Ａ−1a）の血漿中レベルは、同一
条件で測定した通常のITの血漿中レベルよりも10ないし
200倍高い。かくして、ウサギが関与する典型的な例に
おいて、投与23時間後の血液流中のIT（Ａ−1a）の血漿
中レベルは、時間０のときに存在するレベルの７％であ
り、同一時間における通常のIT T101の場合の0.05％と
比べて、140倍であることがわかる。

これによって、薬理的性質に関して新たな性質が付与さ
れた修飾免疫毒素が得られるものである。

さらに詳細には、細胞毒性サブユニットを適当に修飾す
ることによって、免疫毒素の特異的細胞毒性に、これを
阻害することなく、新たな固有の性質すなわち遅延され
た血漿中における消失キネティックスを示す能力を付与
できるのである。

以下、この発明の実施例を記載する。

実施例 １ この実施例は過ヨウ素酸ナトリウムで修飾したリシンＡ
鎖を静脈注射した場合の消失の遅延性を証明するための
ものである。

Ｉ 過ヨウ素酸ナトリウムによるリシンＡ鎖の修飾 （１） DTNBを用いた天然SHのブロッキング リシンＡ鎖を米国特許No.4,340,535に記載されている方
法で製造、精製した。2,2′−ジニトロ−5,5′−ジチオ
２安息香酸（DTNB）の溶液20当量、すなわち、pH7の125
mMリン酸塩緩衝液に溶かしたDTNBの0.1M溶液、385μ
（この溶液は水酸化ナトリウムでpH:7に調節した）を、
PBS緩衝液に溶かした5.6mg/mlの割合で含むシリンＡ鎖1
0ml溶液に加えた（りん酸塩については20mM,NaClについ
ては150mMのpH:7の緩衝液）。培養は20℃で20分間続け
た。この溶液を４℃でPBS緩衝液を用いて透析し、チオ
ール基をブロッキングしたＡ鎖を53mgを5mg/mlの割合で
含む溶液として得た。

（２） ブロッキングされたＡ鎖の過ヨウ素酸塩による
酸化 過ヨウ素酸ナトリウムの0.5M水溶液120μを、1M酢酸
でpH:6に調製したブロッキング済みＡ鎖を5mg/ml含む溶
液6ml中に加えた。培養は暗所で４℃で16時間おこなっ
た。酸化反応停止はエチレングリコールの1M水溶液620
μを加えることによりおこなった。培養後、20℃で15
分間、反応媒体を４℃でPBS緩衝液で透析した。この過
ヨウ素酸塩による酸化によりタンパク質のわずかな析出
を得た。これを30分間、10,000×Ｇで遠心分離し除去
し、酸化およびブロッキングされたＡ鎖を3.4mg/mlの濃
度で24mg得た。

（３） チオール基のブロッキング解放 ２−メルカプトエタノールを還元剤として最終濃度１％
で酸化、ブロッキング化Ａ鎖（PBS緩衝液中に3.4mg/ml
含む）6mlに加えた。培養を20℃で１時間おこない、つ
いでこの溶液を４℃でPBS緩衝液を用いて透析した。そ
の結果酸化されたＡ鎖を2.8mg/mlの濃度で19mg得た。

DTNB法（Enzymology,1972,25,457Academic Press）を用
い、この修飾されたＡ鎖が１モル当り0.70の遊離チオー
ル基を有することが判明した。この修飾Ａ鎖の分子量は
ドデシルサルフェートの存在下でのポリアクリルアミド
勾配電気泳動により30,000±3,000であることが判明し
た。

多糖単位が酸化されたＡ鎖を、タンパク質合成の抑止に
おける酵素活性および薬理学的特性について研究した。

II 持続性Ａ鎖の酵素活性の非細胞モデルによる測定 抑止活性を実施例１の方法で測定した。その結果、酸化
Ａ鎖のIC₅₀は３×10^-10モル／であり、対照Ａ鎖のIC
₅₀は1.2×10^-10モル／であった。したがって修飾によ
るＡ鎖の活性損失は認められなかった。

III 持続性Ａ鎖（Ａ−La）の薬理効果 このＡ鎖をラビットに耳を介して静脈投与した。このＡ
鎖投与量は0.415mg/Kgであった。血液サンプルをヘパリ
ン上に間隔をおいて採取した。この血漿を下記にRIM−
１の記号で示したラジオイムノアッセイテストで分析し
た。

この方法はＡ鎖を修飾することなしに判定し得る利点を
有する。この判定をマイクロ滴定プレートを用いておこ
なった。このプレートの蓋体には過吸収剤スパイクが設
けられていて、これがベース中の穴に浸入するようにな
っている。これらのスパイクは固体相からなるものであ
る。リシンのＡ鎖を示し、親和性クロマトグラフィで精
製された雌羊抗体（以下にAc1の記号で示す）をこの固
体相上に吸収させた。この目的のため、PBS緩衝液中に1
0μg/mlを含むAc1の溶液を上記穴に分けて注入した。上
記スパイクを４℃で24時間、Ac1溶液と最初に接触さ
せ、ついで20℃で３時間、胎児ウシ血清と接触させ、全
ての固定部位を飽和させた。この飽和した免疫吸収剤を
20℃、３時間、種々の濃度の血漿サンプル、又は既知の
濃度のＡ鎖溶液と接触させ、目盛曲線を作成した。PBS
緩衝液で洗浄後、この免疫吸収剤をリシンＡ鎖を示す雌
羊抗体（親和クロマトグラフィで精製し、放射能ラベル
を施したもの、以下Ac2と記す）と20℃で２時間接触さ
せた。このAc2の放射能ラベルはクロラミンＴの存在下
でヨウ素125を用い、GreenwoodおよびHunterの方法（Bi
ochem.J.,1963,89,114）でおこなった。このラベルした
Ac2抗体は５〜10マイクロキューリー／μｇを示した。
このラベル化Ac210⁶cpmを200μとして、0.1％ウシ血
清アルブミンを含むPBS緩衝液中に導入した。PBS緩衝液
中で洗浄ののち、上スパイクを取りはずし、結合したAc
2の量を放射能測定により計量した。サンプル中のＡ鎖
の濃度は、異なる既知の濃度でＡ鎖を導入することによ
って作られた目盛曲線に対して参照することにより測定
した。持続性Ａ鎖を動物に注射した際、同じＡ鎖を用い
相当する目盛曲線を作成した。

この方法で測定された血漿中のＡ鎖の濃度は再現性があ
り、信頼できるものである。この探知しきい値は1ng/ml
である。各実験間の再現性の検討の結果、変化関数が１
〜200ng/mlの濃度について10％以下であった。

これらの実験の結果は曲線で示され、時間は横軸に、零
時の血漿濃度理論値に対する記録された生成物の血漿濃
度の％をlogスケールで縦軸に示した。この値、すなわ
ち、“相対血漿濃度”（RPC）は下記の式で計算され
る。

血漿量は動物の体重の1Kg当り36mlで考えられている。

第１図は天然リシンＡ鎖を静脈注射した場合の血漿にお
ける消失曲線を時間の関数として示したものである。こ
の曲線（１）は２つの相を示している。第１にこの天然
リシンＡ鎖を注射後３時間で血漿中に残る率はわずか0.
1％（投与量に対して）であり、血液から急激に消失す
ることを示している。第２の相においてはこの消失がよ
りゆるやかである。

しかし、多糖単位が酸化されたＡ鎖においては、この消
失性は著るしく改められる。すなわち、Ａ鎖製品の大部
分が消失するもととなる第１の消失相は著るしく抑制さ
れ、その結果、Ａ鎖の血漿における残留レベルが著るし
く増大する。注射20時間後では酸化Ａ鎖の濃度は修飾さ
れていないＡ鎖（曲線２）の場合の600倍にもなる。

実施例 ２ この実施例は、酸化処理時間が酸化Ａ鎖の薬物動態学的
性質に及ぼす重要性を検討するものである。

過ヨウ素酸ナトリウムによる処理時間を変えた以外は実
施例２の手法を用いて６種の酸化Ａ鎖の製剤を調製し
た。処理時間は次の通りであった。すなわち、０（エチ
レングリコールを用いて反応を直ちに停止）、20分、40
分、2.5時間、４時間、および18時間であった。

これら６種の製剤をウサギに注射し、23時間経過後のＡ
鎖の血漿中相対濃度を実施例１の手法により測定した。

結果を第２図に示す。この結果から、１）Ａ鎖の血漿中
濃度の増加は、確かに、過ヨウ素酸塩による酸化に基づ
くこと（反応を直ちに停止したときは、Ａ鎖の血漿中濃
度は生のＡ鎖についてのものと同一であるからであ
る）、および２）最適の効果を得るためには、反応処理
時間を比較的長くすることが必要であることがわかる。

実施例 ３ 本実施例においては生のゲロニンを動物に静脈注射した
場合のその急消失と過ヨウ素酸ナトリウムによって変性
させたゲロニンを同様に注射した後のそのゆっくりとし
た消失について説明する。

１） 過ヨウ素酸ナトリウムによるゲロニンの修飾 ゲロニンをゲロニウムムルチフロールム（Geloniummult
iflorum）から生化学ジャーナル，第255巻,6947−6953
頁、1980年に述べてある方法で抽出し、精製した。実施
例２でリシンＡ鎖について述べたのと同じ方法で酸化反
応を行った。しかしチオール基のDTNBによるマスクは行
っていない。

実際ゲロニンの天然のチオール基を用いてゲロニンと抗
体をカップリングさせることはあまり行なわれていない
ので、チオール基は、酸化後、ガン研究（Cancer Re
s.），第44巻、129−133頁、1984年において説明された
技術を用いて人工的に導入した。過ヨウ素酸ナトリウム
0.5M水溶液21μを1ml当たり1mgのゲロニンを含む溶液
1mlにリン酸緩衝溶液中で加え、1M酢酸でpHを６にし
た。これを暗所で16時間４℃に保った。反応は1Mエチレ
ングリコール水溶液を105μ加えて終結させた。これ
を20℃で４分間保温した後、反応物を４℃でリン酸緩衝
液中において透析した。30分間10,000×ｇで遠心分離に
かけると、ここから濃度2.5mg/mlの酸化ゲロニン2.9mg
が得られた。

リシンＡ鎖と同じように、ゲロニンの基本的な特性はリ
ボソームの60Sサブユニットの分解によって真核細胞に
おけるタンパク質合成を阻害することである（バイオケ
ミカルジャーナル，第207巻,505〜509頁,1982年）。ゲ
ロニンの場合にも過ヨウ素酸酸化による修飾は、活性の
損失を生じさせないことがわかった。

II ゲロニンにおける薬物動態学的特性の維持生の、或
いは上述の手続で修飾されたゲロニンをうさぎの耳の血
管から一回注射した。投与したゲロニンの量は0.3ない
し0.4mg/Kgであった。ヘパリンの存在下で血液を時々採
取した。血漿は以下RIM−２と略称する放射線免疫試験
を用いて分析した。

この試験はRIM−１試験と同じ技術を用いる。ただしAc1
溶液が本例ではアフィニティークロマトグラフィーで精
製された抗ゲロニンウサギ抗体溶液である。Ac2抗体はR
IM−１試験と同じ抗体を放射性同位体で標識したもので
ある。同一標本中の生のゲロニンと修飾したゲロニンの
濃度をそれぞれ標本とは異った既知の濃度の検量線と比
較することによって決定した。放射標識の技術はRIM−
１で説明したものと同じである。RIM−２試験はRIM−１
試験と同等の信頼性と再現性を示した。本実験の結果は
実施例２でリシンのＡ鎖について示したものと同じ方法
で示す。

図３は生の及び修飾したゲロニンを静脈注射した場合の
血漿中濃度曲線を時間の関数として表わしている。生の
ゲロニンは99.99％が24時間で消失したことから、生の
リシンＡ鎖と同じように血中から非常に急速に消失する
ことがわかる（曲線１）。ゲロニンのポリサッカリド単
位が酸化されている場合は曲線形が大きく違う。投与24
時間後に酸化したゲロニンの濃度は生のゲロニンの300
倍ある（曲線２）。

従ってこれらの結果はリシンＡ鎖と同じように、過ヨウ
素酸酸化はゲロニンの消失を測るのに用いられる糖類
を、この機能を妨げる程度にまで修飾することを示して
いる。

実施例 ４ リシンＡ鎖を活性化されたジスルフィド基で置換し人間
のＴ細胞を阻害する抗体と反応させた抱合体を準備す
る。

ａ） 人間のＴ細胞を阻害する抗体（T101抗体） この抗体は免疫学ジャーナル（Journal of Immunolog
y）第125（２）巻,725−737頁、1980年において説明さ
れた方法によって準備した。

ｂ） 酸化されたリシンのＡ鎖 リシンのＡ鎖は実施例２で説明した方法によって準備し
た。

Ｉ） 人間のＴ細胞を阻害する活性化抗体 １−エチル−３−ジメチルアミノプロピル−３−カルボ
ジイミドを1ml当り60.3mg含む溶液20μを３−（ピリ
ジニル−２−ジスファニル）プロピオン酸を1ml当り20m
g含む溶液100μにtert−ブタノール中で加え、混合物
を３分間室温で放置した。こうして得られた溶液68μ
を、1ml当り抗体8.9mgを含む溶液2mlにリン酸緩衝液中
で加えた。この混合物を15分間30℃で撹拌し、その後４
℃下でリン酸緩衝液において透析した。次いでタンパク
質溶液を遠心分離し、活性化抗体を7.9mg/mlの濃度で15
mg得た。２−メルカプトエタノールとの交換反応によっ
て放出されたピリジン−２−チオンの343nmのおける吸
収をみると、この抗体は1mol当り3.8個の活性化された
混合ジスルフィド基を有していることがわかった。

II） 持続作用のあるリシンＡ鎖を含有する免疫毒素の
準備 修飾されたＡ鎖を1ml当り2.87mg含む溶液2.46mlと上述
の方法によって得られた活性化抗体の溶液1.5mlを準備
し（濃度7.9mg/ml:即ち活性化抗体を11.8mg含む）、こ
の混合物を20℃で20時間放置した。この溶液を遠心分離
にかけ、セファデックスG100を用いて過し、精製し
た。溶出物の光学密度を280nmで測定した。抗体とＡ鎖
の両方を含む分画を合わせると免疫毒素を1ml当り0.7mg
含む溶液15ml（即ち免疫毒素は10.5mg）が得られた。こ
の溶液は抗体とカップリングされた酸化Ａ鎖を1ml当り
0.14mg含有する。

従ってこの方法による平均カップリング度は抗体1molに
つき酸化Ａ鎖1.2molである。

上記の方法で得た酸化されたリシンＡ鎖を含む免疫毒素
IT（Ａ−La）T101について、その薬物動態学的特性と標
的細胞に対する細胞毒性を調べた。

実施例 ５ 本実施例においては、持続作用をもつリシンＡ鎖を含む
免疫毒素（IT（Ａ−La）T101と略す）の血漿中濃度がゆ
っくりと減少するという性質を獲得することを示す。

Ｉ 方法 実施例４で説明した手続で準備された抱合体をうさぎの
耳の血管に一度注射した。投与された量はＡ鎖について
体重1Kg当たり0.415mgである。ヘパリンの存在下で血液
を時々採血した。血漿を放射線免疫試験（RIM−３と略
す）によって（２箇所）分析した。

この試験はRIM−１と同じ技術を用いて行われた。但しA
c2溶液は本試験においてはRIM−１の技術を用いてアフ
ィニティークロマトグラフィーによって精製され、放射
標識されたマウスのIgGを阻害するヤギの抗体である。
このサンプルにおける修飾された免疫毒素の濃度は既知
の異った濃度から導いた検量線を用いて決定した。RIM
−３試験はRIM−１と同じ信頼性及び再現性を有する。

比較対照のため、生のリシンＡ鎖を活性化されたジスル
フィド基で置換した抗体の反応から得られたITT101抱合
体と同じ条件下で比較例の試験を行った。この抱合体の
準備と細菌毒性はフランス国特許出願第2,516,794号で
説明した方法によって行った。これらの実験結果は実施
例２でカップリングされていないＡ鎖について行ったの
と同じ方法で示した。

II 結果 図４は静脈注射されたITT101及びIT（Ａ−La）T101の血
漿中濃度曲線を示している。投与24時間後にIT（Ａ−L
a）T101活性細胞毒素はITT101の140倍になっていた。こ
の事実は酸化されたＡ鎖の薬物動態学的特性は抗体とカ
ップリングされた後も保持されていることを示してい
る。

実施例 ６ 本実施例においてはIT（Ａ−La）T101の標的細胞に対す
る細胞毒素特性の保存について述べる。

リシンＡ鎖の基本的な生物学的特性は細胞中のタンパク
質合成をリボソームの60Sサブユニットの分解によって
阻害することである。

この方法は培養中のガン細胞に¹⁴Cで標識したロイシン
（以下¹⁴C−ロイシンをいう）を取り込ませて研究され
ている物質の効果を測定する細胞系を用いる。

用いられる細胞は、抗原T65を運ぶ人間のＴ白血病から
誘導されるCEM細胞系に属する。この細胞は目的の物質
の存在下で保温した後、細胞への¹⁴C−ロイシンの取り
込みの程度を測定した。この測定には生物化学ジャーナ
ル（Journal of Biological Chemistry）第249巻11号,3
557−3562頁で説明された、タンパク質合成量を測定す
るのに¹⁴C−ロイシンのトレーサーを用いる方法によっ
て行う。取り込まれた放射能はろ過した細胞の全体につ
いて測定した。

定量の基準として線量／効果曲線を描くことができる。
この曲線横軸には目的物質中のＡ鎖のモル濃度、縦軸に
は、タンパク質合成を阻害する物質の存在しない比較細
胞における¹⁴C−ロイシンの取り込み量に対する百分率
をプロットして得られる。

こうしてそれぞれの物質について¹⁴C−ロイシン取り込
み量を50％阻害する濃度または50％阻害濃度（IC₅₀）を
決定することができる。

図５は恒温媒体中で10mM塩化アンモニウムの存在下でIT
（Ａ−La）T101とカップリングされていないＡ鎖につい
て行った同じ実験から曲線を示している。この図をみる
とIT（Ａ−La）T101は同一条件で測定されたカップリン
グも酸化されていないＡ鎖に比べ約８万倍の非常に強い
細胞毒性（IC₅₀＝5.5×1.0^-12M）を有することがわか
る。

実施例 ７ 本実施例はクローン原性試験において確認されたCEM標
的細胞に対するIT（Ａ−La）T101とITT101の細胞毒性的
効能の比較を示す。免疫毒素は標的細胞を一つ一つ破壊
する作用を担う。この作用は感度の高い技術を用いて測
定することができる。コロニー形成阻害試験によれば、
一個の生存細胞を数百万の死んだ細胞から見い出せるた
めこの可能性がある。これは人間のCEMリンパ系に応じ
たゲル媒体における最適な培養条件によって可能にな
る。

I. コロニー形成阻害試験による細胞毒素の測定技術 クローニングに用いられる媒体はケトグルタル酸ナトリ
ウム１ミリmol、オキサロ酢酸ナトリウム１ミリmol、５
％の不活性仔ウシ血清及び10％の不活性ウマ血清が加え
られたRPMI1640である。最初に0.3％の寒天溶液（アガ
ロースVII型、シグマ（SIGMA）研究所製）をペトリ皿の
この媒体中に薄層のようにして用意し、４℃で凝固させ
た。細胞は37℃に保温した0.275％寒天溶液と混ぜ合
せ、それから最初の寒天層上に流し込んで凝固させた。
これに用いた寒天の濃度は、クローニングの効率、コロ
ニーの大きさ及び媒体の均一性の三者を同時に最適化す
る目的で行った予備試験の結果から定めた。恒温に保っ
てから15日後に、自動コロニー計数器（“アルチック",
ダイナテック社，米国）を用いてコロニーを計数した。
クローニング効率、即ち免疫毒素処理で生き残った細胞
の正確な数を決定するには、接種された細胞の数を形成
されたコロニーの数の関数として表す検量線をつくるこ
とが大切である。発明者等はこの検量線から得られるク
ローニング効率は、細胞を免疫毒素処理した場合よくみ
られるように、死んだ細胞が高い割合であっても影響さ
れないことを証明した。

免疫毒素処理は、10％の不活性仔ウシ血清と10ミリmol
の塩化アンモニウムを含むRPMI1640媒体の全量1mlに対
してそれぞれ異った濃度のIT（Ａ−La）T101及びITT101
の免疫毒素を用い、指数的に成長している細胞を保温す
ることによって行う。保温は５％の二酸化炭素を含む雰
囲気下で試験管を水平方向に振ること（ニューブルンス
ウィック社“ジラトリーＧ−2"撹拌器を用いて2500rpm
のペース）によって37℃に保った。生存細胞の数が検量
線によって最大感度範囲で測定できるように寒天溶液と
混合する前に、細胞を洗浄し、それぞれ異った希釈にし
て準備した。結果は次の関係式を用い、クローニング効
率から外挿して生存細胞の絶対数で表した。生存細胞の
絶対数は次式で表わされる。

ここでＣはペトリ皿１皿当りのクローンの数、ｄは細胞
の希釈因子、Ｅは検量線の勾配から求められたクローニ
ング高率である。それぞれの値は３回の試験結果の平均
をとった。

II 結果 図６は塩化アンモニウム10ミリmolの存在下におけるCEM
細胞に対するIT（Ａ−La）T101及びITT101免疫毒素の細
胞毒性曲線を免疫毒素の濃度（Ａ鎖のモル濃度）の関数
として表している。これら２つの毒素の高率は同じオー
ダーの大きさであることは明らかである。細胞数減少の
度合は両者とも大きいが、これは10^-11M程度の低い濃度
においては残存生存細胞の割合は初期値に比べて0.001
％のオーダーになってしまうからである。この効果は高
度に特異的である。何故ならこれらの濃度においてはカ
ップリングされていないＡ鎖と非特異的な免疫毒素は、
これらの細胞に対して効果をもっていないことが証明さ
れたからである。

本実施例によってIT（Ａ−La）T101は従来のITT101と実
質的に同一な特異細胞毒性を有することがわかる。

実施例 ８ 酸化されたＡ鎖の動物の体全体への毒物学的特性（免疫
毒素の毒性は等モル量におけるＡ鎖と同じオーダーの大
きさである）を調べることは重要である。これはチャー
ルズリパーフランスCD1マウスに静脈注射された酸化Ａ
鎖の半数致死量を生のＡ鎖との比較において決定するこ
とによって行われる。

その結果を下表に示す。

上の結果は酸化されたＡ鎖の毒性は生のＡ鎖より低いこ
とを示している。これはＡ鎖が酸化によって修飾される
とＡ鎖の血漿中濃度は著しく増加するけれども、その毒
性は増加するどころか、反対にかなり減少することを意
味している。

従って修飾された細胞毒性サブユニットを包む免疫毒素
は人間の治療薬として使える。これらの修飾された免疫
毒素は、標的細胞が免疫毒素を準備するのに用いられる
抗体によって識別されるようなガンまたはガンでない病
気の治療に用いられる。最適な投与量と治療時間は問題
の病気にかかった患者とその病気の特質に応じて定めら
れるべきである。

より一般的な言葉でいえば、糖質単位が過ヨウ素イオン
によって修飾され、対応する修飾のない抗腫瘍糖タンパ
ク質よりも半減期の長い抗腫瘍糖タンパク質は薬として
有用だということである。

従ってもう一つの特徴によれば、本発明は糖質単位が過
ヨウ素酸イオンの酸化によって修飾されている抗腫瘍糖
タンパク質が注射好ましくは静脈注射に適して形態にな
っている抗腫瘍薬に関する。

【図面の簡単な説明】

第１図ないし第６図は本発明の糖タンパク質の特性を示
す線図である。

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】抗体または抗体フラグメントが、チオエー
   テル基またはジスルフィド基を含む２価の共有結合構造
   を介して糖タンパクに結合された長期in vivo作用型免
   疫毒素であって、 前記糖タンパクはリボソームを不活性化するが、前記免
   疫毒素の標的細胞には結合できず、 また前記糖タンパクは、前記免疫毒素が長期のin vivo
   活性を有するように、酸化された糖鎖単位を含んでいる
   免疫毒素。
2. 【請求項２】特許請求の範囲第１項に記載の免疫毒素で
   あって、前記糖タンパクにおける糖鎖単位の酸化が、過
   ヨウ素酸イオンによって行なわれている免疫毒素。
3. 【請求項３】特許請求の範囲第２項に記載の免疫毒素で
   あって、前記酸化が、光の不存在下において、温度０〜
   15℃で0.2〜24時間、過ヨウ素酸アルカリ金属の水溶液
   を用いて行なわれている免疫毒素。
4. 【請求項４】特許請求の範囲第１項に記載の免疫毒素で
   あって、下記の統計学的な式で現される免疫毒素。 Ｐ′−Ｗ−GPIR−1a′ 但し、 ・Ｐ′は、抗体または抗体フラグメントであるタンパク
   Ｐのラジカルを表し、 ・GPIR−1a′は、リボソームを不活性化するが標的細胞
   には結合できず、且つ前記免疫毒素が長期のin vivo活
   性を有するように酸化された糖鎖単位を含む糖タンパク
   であるタンパクGPIR−1aのラジカルであり、 ・Ｗは、チオエーテル基またはジスルフィド基を含む２
   価の共有結合構造を表し、該チオエーテル基またはジス
   ルフィド基の少なくとも一つの硫黄原子はＰ、GPIR−1a
   又はＰ及びGPIR−1aのシステインに由来するか、或いは
   該チオエーテル基またはジスルフィド基の少なくとも一
   つの硫黄原子は、前記二価の共有結合構造のスペーシン
   グ構造に担持された官能基によって、Ｐ、GPIR−1a又は
   Ｐ及びGPIR−1aに属する官能基に結合されている。
5. 【請求項５】特許請求の範囲第４項に記載の免疫毒素で
   あって、前記糖鎖単位が、光の不存在下において、温度
   ０〜15℃で0.2〜24時間、過ヨウ素酸アルカリ金属の水
   溶液を用いて酸化されている免疫毒素。
6. 【請求項６】特許請求の範囲第４項に記載の免疫毒素で
   あって、前記ＷがＷ′であり、該Ｗ′は下記（ａ）〜
   （ｄ）からなる群から選ばれる二価の共有結合構造であ
   る免疫毒素。 （ａ）次式の基 （ｂ）次式の基 （ｃ）次式の基 Ｚ−Ｙ−Ｅ−Ｓ−Ｓ−（Ｅ′−Ｙ′−Ｚ′）ｎ− （ｂ）次式の基 −（Ｚ′−Ｙ′−Ｅ′）ｎ−Ｓ−Ｓ−Ｅ−Ｙ−Ｚ 但し、 ・ＺおよびＺ′は、タンパクGPIR−1aおよびＰに属する
   官能基であって、チロシン残基の水酸基から生じた酸素
   原子、GPIR−1aおよびＰのアスパラギン酸および／また
   はグルタミン酸の一つの末端カルボキシル基または一つ
   の遊離カルボキシル基から生じたカルボニル基、GPIR−
   1aおよびＰの一つの末端アミンまたは一つのリジン残基
   のε位にある一つのアミンから生じた−NH−基、並びに
   過ヨウ素酸でＰの糖鎖構造を酸化した後に得られたジア
   ルデヒド構造から生じた基（上記二価の共有結合構造
   （ｂ）および（ｃ）におけるＺについてのみ）から選ば
   れるものを表し、 ・ＹおよびＹ′は、タンパクGPIR−1aおよびＰのＺ基ま
   たはＺ′基の何れか一つと共有結合できる官能基を表
   し、 ・ＥおよびＥ′は、不活性なスペーシング構造を表し、 ・ｎは、ゼロまたは１を表す。
7. 【請求項７】特許請求の範囲第６項に記載の免疫毒素で
   あって、下記の統計学的な式で表される免疫毒素。 Ｐ′（Ｗ′−Ａ−1a′）ｍ 但し、 ・Ｐ′は、抗体または抗体フラグメントであるタンパク
   Ｐのラジカルを表し、 ・Ａ−1a′は、リボソームを不活性化する糖タンパクの
   ラジカルであって、リシンのＡ鎖を、そのシステン171
   および257のチオール基の少なくとも一つを保護して、
   光の不存在下において、温度０〜15℃で0.2〜24時間、
   過ヨウ素酸アルカリ金属の水溶液で処理し、次いで前記
   チオール基を脱保護することによって得られたものを表
   し、 ・ｍは、0.3〜12の範囲で変化し、 ・Ｗ′は特許請求の範囲第６項で定義した通りである。
8. 【請求項８】特許請求の範囲第７項に記載の免疫毒素で
   あって、下記の統計学的な式で表される免疫毒素。 Ｐ′（Ｗ′−Ａ−1a′）ｍ 但し、 ・Ｗ′およびＡ−1a′は特許請求の範囲第６項および７
   項で定義した通りであり、 ・Ｐ′は抗体フラグメントFabまたはFab′のラジカルで
   あり、 ・ｍは0.3〜２の範囲で変化する。
9. 【請求項９】特許請求の範囲第７項に記載の免疫毒素で
   あって、下記の統計学的な式で表される免疫毒素。 Ｐ′（Ｗ′−Ａ−1a′）ｍ 但し、 ・Ｗ′およびＡ−1a′は特許請求の範囲第６項および７
   項で定義した通りであり、 ・Ｐ′は抗体フラグメントＦ（ab）２のラジカルであ
   り、 ・ｍは0.5〜４の範囲で変化する。
10. 【請求項１０】特許請求の範囲第７項に記載の免疫毒素
    であって、下記の統計学的な式で表される免疫毒素。 Ｐ′（Ｗ′−Ａ−1a′）ｍ 但し、 ・Ｗ′およびＡ−1a′は特許請求の範囲第６項および７
    項で定義した通りであり、 ・Ｐ′はIgG型抗体のラジカルであり、 ・ｍは0.5〜６の範囲で変化する。
11. 【請求項１１】特許請求の範囲第７項に記載の免疫毒素
    であって、下記の統計学的な式で表される免疫毒素。 Ｐ′（Ｗ′−Ａ−1a′）ｍ 但し、 ・Ｗ′およびＡ−1a′は特許請求の範囲第６項および７
    項で定義した通りであり、 ・Ｐ′はIgM型抗体のラジカルであり ・ｍは１〜12の範囲で変化する。
12. 【請求項１２】特許請求の範囲第２項に記載の長期作用
    型免疫毒素であって、前記糖タンパクのチオール基が、
    前記糖タンパクを過ヨウ素酸塩で処理する前に保護基で
    保護され、過ヨウ素酸塩処理の後に該保護基が除去され
    ている免疫毒素。
13. 【請求項１３】特許請求の範囲第４項に記載の長期作用
    型免疫毒素であって、前記糖タンパクのチオール基が、
    前記免疫毒素の抗体部分における何れかの官能基と同
    様、前記糖タンパクを過ヨウ素酸塩で処理する前に保護
    基で保護され、過ヨウ素酸塩処理の後に該保護基が除去
    されている免疫毒素。
14. 【請求項１４】特許請求の範囲第７項に記載の長期作用
    型免疫毒素であって、前記糖タンパクのチオール基が、
    前記糖タンパクを過ヨウ素酸塩で処理する前に保護基で
    保護され、過ヨウ素酸塩処理の後に該保護基が除去され
    ている免疫毒素。
15. 【請求項１５】抗体または抗体フラグメントが、チオエ
    ーテル基またはジスルフィド基を含む２価の共有結合構
    造を介して糖タンパクに結合された長期in vivo作用型
    免疫毒素であって、前記糖タンパクは、リボソームを不
    活性化するが前記免疫毒素の標的細胞には結合できず、
    且つ前記免疫毒素が長期のin vivo活性を有するように
    酸化された糖鎖単位を含んでいる免疫毒素を製造する方
    法において、 前記抗体または抗体フラグメントを、カップリング条件
    下で、予め上記のように酸化された前記糖タンパクと反
    応させることによって、前記ジスルフィド結合またはチ
    オエーテル結合が、直接またはスペーシング構造を介し
    て形成される方法。
16. 【請求項１６】特許請求の範囲第15項に記載の方法であ
    って、前記糖鎖単位の酸化が、光の不存在下において、
    温度０〜15℃で0.2〜24時間、過ヨウ素酸アルカリ金属
    の水溶液を用いて行なわれる方法。
17. 【請求項１７】特許請求の範囲第15項に記載の方法であ
    って、 前記免疫毒素が下記の統計学的な式で表されるものであ
    り、 Ｐ′−Ｗ−GPIR−1a′ （但し、 ・Ｐ′は、抗体または抗体フラグメントであるタンパク
    Ｐのラジカルを表し、 ・GPIR−1a′は、リボソームを不活性化するが標的細胞
    には結合できず、且つ前記免疫毒素が長期のin vivo活
    性を有するように、光の不存在下において、温度０〜15
    ℃で0.2〜24時間、過ヨウ素酸アルカリ金属の水溶液を
    用いて酸化された糖鎖単位を含む糖タンパクであるタン
    パクGPIR−1aのラジカルであり、 ・Ｗは、チオエーテル基またはジスルフィド基を含む２
    価の共有結合構造を表し、該チオエーテル基またはジス
    ルフィド基の少なくとも一つの硫黄原子はＰ、GPIR−1a
    又はＰ及びGPIR−1aのシステインに由来するか、或いは
    該チオエーテル基またはジスルフィド基の少なくとも一
    つの硫黄原子は前記二価の共有結合構造のスペーシング
    構造に担持された官能基によって、Ｐ、GPIR−1a又はＰ
    及びGPIR−1aに属する官能基に結合されている。） また、前記糖タンパクGPIR−1aまたは前記抗体もしくは
    抗体フラグメントＰであるタンパクP₁（該タンパクP₁に
    直接またはスペーシング構造を介して結合された少なく
    とも一つの遊離チオール基を有する）が、水溶液中にお
    いて室温で、前記糖タンパクGPIR−1aまたは前記抗体も
    しくは抗体フラグメントＰであって且つ前記P₁とは異な
    るタンパクP₂（前記タンパクP₁の遊離チオールと結合で
    きる基を有する）と反応させられて、チオエーテル結合
    またはジスルフィド結合が形成される方法。
18. 【請求項１８】特許請求の範囲第17項に記載の方法であ
    って、 前記ＷがＷ′で、該Ｗ′は下記（ａ）〜（ｄ）からなる
    群から選ばれる二価の共有結合構造であり、 （ａ）次式の基 （ｂ）次式の基 （ｃ）次式の基 −Ｚ−Ｙ−Ｅ−Ｓ−Ｓ−（Ｅ′−Ｙ′−Ｚ′）ｎ− （ｂ）次式の基 −（Ｚ′−Ｙ′−Ｅ′）ｎ−Ｓ−Ｓ−Ｅ−Ｙ−Ｚ− （ここで、 ・ＺおよびＺ′は、タンパクGPIR−1aおよびＰに属する
    官能基であって、チロシン残基の水酸基から生じた酸素
    原子、GPIR−1aおよびＰのアスパラギン酸および／また
    はグルタミン酸の一つの末端カルボキシル基または一つ
    の遊離カルボキシル基から生じたカルボニル基、GPIR−
    1aおよびＰの一つの末端アミンまたは一つのリジン残基
    のε位にある一つのアミンから生じた−NH−基、並びに
    過ヨウ素酸でＰの糖鎖構造を酸化した後に得られたジア
    ルデヒド構造から生じた基（上記二価の共有結合構造
    （ｂ）および（ｃ）におけるＺについてのみ）から選ば
    れるものを表し、 ・ＹおよびＹ′は、タンパクGPIR−1a及びＰのＺ基また
    はＺ′基の何れかと共有結合できる官能基を表し、 ・ＥおよびＥ′は、不活性なスペーシング構造を有し、 ・ｎは、ゼロまたは１を表す。） また、次式IVのタンパクが、水溶液中において室温で、
    次式Ｖのタンパクと反応させされる方法。 Ｐ_１′−（Ｚ−Ｙ−Ｅ−）nSH IV Ｐ_２′−Ｚ′−Ｙ′−Ｅ′−Ｇ Ｖ 但し、 ・Ｐ_１′およびＰ_２′は、上記タンパクIVおよびＶに属
    する基に結合した前記タンパクP₁およびP₂のラジカルを
    表すか、或いは、P₁およびP₂が抗体または抗体フラグメ
    ントのときのみは、過ヨウ素酸との反応による糖鎖核の
    開鎖によって生じたタンパクP₁およびP₂のラジカルを表
    し、 ・Ｇは、基 または−Ｓ−Ｓ−Ｘ（Ｘは活性化基である）を表す。