JP2820256B2 - メチルトリチオ抗腫瘍剤のターゲテッド形態 - Google Patents
メチルトリチオ抗腫瘍剤のターゲテッド形態Info
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、LL−E33288複合体のα1、α2、α3、α4、
β1、β2、γ、およびδ成分のジサルファイド類似体な
らびにBBM−1675、FR−900405、FR−900406、PD11475
9、PD115028、CL−1577A、CL−1577B、CL−1577D、CL−
1577EおよびCL1724抗腫瘍抗生物質のジサルファイド類
似体のキャリヤー−薬物接合体を記載する。接合体のキ
ャリヤー部分は、モノクローナル抗体、ポリクローナル
抗体、それらの断片、化学的にまたは遺伝子的に操作さ
れた相手、成長因子またはステロイドである。本発明
は、キャリヤー−薬物接合体を使用する方法ならびにそ
れらの調製方法を包含する。
β1、β2、γ、およびδ成分のジサルファイド類似体な
らびにBBM−1675、FR−900405、FR−900406、PD11475
9、PD115028、CL−1577A、CL−1577B、CL−1577D、CL−
1577EおよびCL1724抗腫瘍抗生物質のジサルファイド類
似体のキャリヤー−薬物接合体を記載する。接合体のキ
ャリヤー部分は、モノクローナル抗体、ポリクローナル
抗体、それらの断片、化学的にまたは遺伝子的に操作さ
れた相手、成長因子またはステロイドである。本発明
は、キャリヤー−薬物接合体を使用する方法ならびにそ
れらの調製方法を包含する。
より具体的には、本発明によれば、 式 を有し、上式中、 Ｗは を表し、 ここで、 R1は基 またはCH3であり、 R2は基 またはＨであり、 R3は基 またはＨであり、 R4は基 またはＨであり、 そして、Ｘは臭素またはヨウ素であり、R5は基C2H5、(C
H3)2CHまたはCH3であり、 R6またはR7は基 またはＨであり、 Spは、基−CH2CH2−、二価のアリールまたはヘテロアリ
ール基、二価の（C3−C18）シクロアルキルまたはヘテ
ロシクロアルキル基、二価のアリール−アルキル（C1−
C18）基、二価のシクロアルキル−アルキル（C1−C18）
基、二価の（C2−C18）不飽和アルキル基、あるいは基 であり、 Tuはモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、その断
片、その化学的または遺伝子的に操作された相手あるい
は増殖因子であり、Ｙはタンパク質の側鎖のアミノ、カ
ルボキシ、またはチオール基、炭水化物残基から誘導さ
れたアルデヒド、またはアミドアルキルチオ基であり、
そしてｎは１〜100のいずれかの整数であり、 Ｚは−CONH−、−CONHN＝CH−、−CONHNHCH2−、−NHCO
NHN＝CH−、−NHCONHNHCH2−、−NHCSNHN＝CH−、−NHC
SNHNHCH2−、−ON＝CH−、−NH−、−NHCH2−、−Ｎ＝C
H−、−CO2−、−NHCH2CO2−、−SS−、 または であり、そして ｍは０または１〜15のいずれかの整数であるが、但
し、基(Z-Sp-SS-W)mにおけるｍは１以上の整数である、
ことを特徴とするキャリャーと薬物の複合体（以下、本
明細書では「接合体」という場合あり）および上記式中
のｍが平均値0.1〜15にある複合体の混合物ならびにそ
れらの製造方法および腫瘍抑制剤への使用が提供され
る。
H3)2CHまたはCH3であり、 R6またはR7は基 またはＨであり、 Spは、基−CH2CH2−、二価のアリールまたはヘテロアリ
ール基、二価の（C3−C18）シクロアルキルまたはヘテ
ロシクロアルキル基、二価のアリール−アルキル（C1−
C18）基、二価のシクロアルキル−アルキル（C1−C18）
基、二価の（C2−C18）不飽和アルキル基、あるいは基 であり、 Tuはモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、その断
片、その化学的または遺伝子的に操作された相手あるい
は増殖因子であり、Ｙはタンパク質の側鎖のアミノ、カ
ルボキシ、またはチオール基、炭水化物残基から誘導さ
れたアルデヒド、またはアミドアルキルチオ基であり、
そしてｎは１〜100のいずれかの整数であり、 Ｚは−CONH−、−CONHN＝CH−、−CONHNHCH2−、−NHCO
NHN＝CH−、−NHCONHNHCH2−、−NHCSNHN＝CH−、−NHC
SNHNHCH2−、−ON＝CH−、−NH−、−NHCH2−、−Ｎ＝C
H−、−CO2−、−NHCH2CO2−、−SS−、 または であり、そして ｍは０または１〜15のいずれかの整数であるが、但
し、基(Z-Sp-SS-W)mにおけるｍは１以上の整数である、
ことを特徴とするキャリャーと薬物の複合体（以下、本
明細書では「接合体」という場合あり）および上記式中
のｍが平均値0.1〜15にある複合体の混合物ならびにそ
れらの製造方法および腫瘍抑制剤への使用が提供され
る。
LL−E33288複合体として集合的に知られている、抗菌
剤および抗腫瘍剤の族は、1987年１月30日に提出され
た、同時係属米国特許出願第009,321号（特開昭63−216
494号公報に相当）に記載されており、そして本発明の
抗腫瘍剤のターゲテッド形態（targeted firms）のため
の出発物質である二イオウ抗腫瘍剤を調製するために使
用する。米国特許出願第009,321号は、LL−E33288複合
体、その成分、すなわち、LL−E33288α1 Br、LL−E3328
8α1 I、LL−E33288α2 Br、LL−E33288α2 I、LL−E33288
α3 Br、LL−E33288α3 I、LL−E33288α4 Br、LL−E33288
β1 Br、LL−E33288β1 I、LL−E33288β2 Br、LL−E33288
β2 I、LL−E33288γ1 Br、LL−E33288β1 IおよびLL−E33
288δ1 I、およびマイクロモノスポラ・エキノスポラ種
カリケンシス（Micromonospora echinospora ssp cali
chensis）の新規な菌株またはその天然の突然変異また
は誘導された突然変異を利用する好気的発酵によって、
それらを生産する方法を記載する。なお、より具体的に
は、例えば、上記LL−E33288複合体およびそれらの各構
成成分は、所謂、ブダペスト条約の規定の下に、アメリ
カ合衆国のアグリアルチヤー・リサーチ・サービス・カ
ルチヤー・コレクシヨン［Agricultural Research Serv
ice Culture Collection（NRRL）］の国際寄託当局に寄
託され、それぞれNRRL−15975、NRRL−15839およびNRRL
−18149の受託番号の付された菌株の培養によって得る
ことができる。これらの提案する構造は、下表１に再び
記載する。
剤および抗腫瘍剤の族は、1987年１月30日に提出され
た、同時係属米国特許出願第009,321号（特開昭63−216
494号公報に相当）に記載されており、そして本発明の
抗腫瘍剤のターゲテッド形態（targeted firms）のため
の出発物質である二イオウ抗腫瘍剤を調製するために使
用する。米国特許出願第009,321号は、LL−E33288複合
体、その成分、すなわち、LL−E33288α1 Br、LL−E3328
8α1 I、LL−E33288α2 Br、LL−E33288α2 I、LL−E33288
α3 Br、LL−E33288α3 I、LL−E33288α4 Br、LL−E33288
β1 Br、LL−E33288β1 I、LL−E33288β2 Br、LL−E33288
β2 I、LL−E33288γ1 Br、LL−E33288β1 IおよびLL−E33
288δ1 I、およびマイクロモノスポラ・エキノスポラ種
カリケンシス（Micromonospora echinospora ssp cali
chensis）の新規な菌株またはその天然の突然変異また
は誘導された突然変異を利用する好気的発酵によって、
それらを生産する方法を記載する。なお、より具体的に
は、例えば、上記LL−E33288複合体およびそれらの各構
成成分は、所謂、ブダペスト条約の規定の下に、アメリ
カ合衆国のアグリアルチヤー・リサーチ・サービス・カ
ルチヤー・コレクシヨン［Agricultural Research Serv
ice Culture Collection（NRRL）］の国際寄託当局に寄
託され、それぞれNRRL−15975、NRRL−15839およびNRRL
−18149の受託番号の付された菌株の培養によって得る
ことができる。これらの提案する構造は、下表１に再び
記載する。
ある種の他の抗生物質、すなわち、次のものは本発明
において有用である： １）エスペラマイシン（Esperamaicin）、効力のある抗
腫瘍剤の新規なクラス。Ｉ、物理化学的データおよび部
分的構造。M.コニシ（Knishi）ら、ジャーナル・オブ・
アンチビオチクス（J.Antibiotics）、38、1605（198
5）。新規な抗腫瘍抗生複合体。M.コニシ（Knishi）
ら、英国特許出願GB2,141,425A、1984年５月15日。
において有用である： １）エスペラマイシン（Esperamaicin）、効力のある抗
腫瘍剤の新規なクラス。Ｉ、物理化学的データおよび部
分的構造。M.コニシ（Knishi）ら、ジャーナル・オブ・
アンチビオチクス（J.Antibiotics）、38、1605（198
5）。新規な抗腫瘍抗生複合体。M.コニシ（Knishi）
ら、英国特許出願GB2,141,425A、1984年５月15日。
２）新規な抗腫瘍剤抗生物質、FR−900405およびFR−90
0406.I。産生菌株の分類学。M.イワミ（Iwami）ら、シ
ャーナル・オブ・アンチビオチクス（J.Antibiotic
s）、38、835（1985）。新規な抗腫瘍剤抗生物質、FR−
900405およびFR−900406.II。産生、分離、特性づけお
よび抗腫瘍活性。S.キヨト（Kyoto）ら、ジャーナル・
オブ・アンチビオチクス（J.Antibiotics）、38、340
（1985）。
0406.I。産生菌株の分類学。M.イワミ（Iwami）ら、シ
ャーナル・オブ・アンチビオチクス（J.Antibiotic
s）、38、835（1985）。新規な抗腫瘍剤抗生物質、FR−
900405およびFR−900406.II。産生、分離、特性づけお
よび抗腫瘍活性。S.キヨト（Kyoto）ら、ジャーナル・
オブ・アンチビオチクス（J.Antibiotics）、38、340
（1985）。
３）PD114759およびPD115028、驚くべき効能をもつ抗腫
瘍抗生物質。Ｉ。分離および特性づけ。R.H.ブンゲ（Bu
nge）ら、ジャーナル・オブ・アンチビオチクス（J.Ant
ibiotics）、3７、1566（1984）。新規な抗腫瘍抗生物
質PD114759および関連する誘導体の生物学的および生化
学的活性。D.W.フライ（Fry）ら、インベスチゲイショ
ナル・ニュー・ドラグ（Investigational New Drug）、
4、３（1986）。
瘍抗生物質。Ｉ。分離および特性づけ。R.H.ブンゲ（Bu
nge）ら、ジャーナル・オブ・アンチビオチクス（J.Ant
ibiotics）、3７、1566（1984）。新規な抗腫瘍抗生物
質PD114759および関連する誘導体の生物学的および生化
学的活性。D.W.フライ（Fry）ら、インベスチゲイショ
ナル・ニュー・ドラグ（Investigational New Drug）、
4、３（1986）。
４）ストレプトマイセス（Streptomayces）種ATCC39363
によって生成される新規な抗生物質複合体CL−1577A、C
L−1577B。欧州特許出願0,132,082,A2号。
によって生成される新規な抗生物質複合体CL−1577A、C
L−1577B。欧州特許出願0,132,082,A2号。
５）CL−1577DおよびCL−1577E抗生物質、それらの産生
および使用。米国特許4,539,203号。
および使用。米国特許4,539,203号。
６）CL−1724抗生物質、それらの産生および使用。米国
特許第4,554,162号。
特許第4,554,162号。
上の引用例に記載されるBBM−1675、FR−900405、FR
−900406、PD114759、PD115028、CL−1577A、CL−1577
B、CL−1577D、CL−1577EおよびCL1724に関する情報の
すべては、引用によってここに加える。エスペラマイシ
ン（esperamaicin）A1、A2およびA1b（BBM−1675複合
体）の完全な構造は報告されており、そしてこれらの表
１に含める。上に列挙した抗腫瘍抗生物質の物理的特性
は、それらがすべて同一であり、それらがすべてがメチ
ルトリチオ官能基を含有することを示す。
−900406、PD114759、PD115028、CL−1577A、CL−1577
B、CL−1577D、CL−1577EおよびCL1724に関する情報の
すべては、引用によってここに加える。エスペラマイシ
ン（esperamaicin）A1、A2およびA1b（BBM−1675複合
体）の完全な構造は報告されており、そしてこれらの表
１に含める。上に列挙した抗腫瘍抗生物質の物理的特性
は、それらがすべて同一であり、それらがすべてがメチ
ルトリチオ官能基を含有することを示す。
上に開示する構造から理解できるように、LL−E33288
複合体のα1、α2、α3、α4、β1、β2、γ1、および
δ成分、ならびにBBM−1675、FR−900405、FR−90040
6、PD114759、PD115028、CL−1577A、CL−1577B、CL−1
577D、CL−1577EおよびCL1724抗生物質の各々は、それ
らの構造中にメチルトリチオ上に列挙した抗生物質のメ
チルトリチオ部分を、種々のチオール含有有機分子で置
換すると、新規なクラスの抗癌剤および抗菌剤が得られ
る。
複合体のα1、α2、α3、α4、β1、β2、γ1、および
δ成分、ならびにBBM−1675、FR−900405、FR−90040
6、PD114759、PD115028、CL−1577A、CL−1577B、CL−1
577D、CL−1577EおよびCL1724抗生物質の各々は、それ
らの構造中にメチルトリチオ上に列挙した抗生物質のメ
チルトリチオ部分を、種々のチオール含有有機分子で置
換すると、新規なクラスの抗癌剤および抗菌剤が得られ
る。
表１に列挙したそして反応図Ｉに示すように化合物の
メチルトリチオ単位を使用してスペーサー（Sp）を導入
することができここでそれを賢明に選択すると、上に列
挙した特許および出願の含有中に標的単位（targeting
unit）を導入できることが、今回、発見された。
メチルトリチオ単位を使用してスペーサー（Sp）を導入
することができここでそれを賢明に選択すると、上に列
挙した特許および出願の含有中に標的単位（targeting
unit）を導入できることが、今回、発見された。
式中、Spは直鎖状もしくは分枝鎖状の二価の（C1−
C18）基、例えば−CH2CH2−、二価のアリールまたはヘ
テロアリール基、二価の（C3−C18）シクロアルキルま
たはヘテロシクロアルキル基、二価のアリールまたはヘ
テロアリール−アルキル（C1−C18）基、二価のシクロ
アルキル−アルキル（C1−C18）基またはヘテロシクロ
アルキル−アルキル（C1−C18）基，あるいは基 、または二価の（C2−C18）不飽和アルキル基であり、
Ｑはハロゲン、アミノ、アルキルアミノ、カルボキシ
ル、カルボキシアルデヒド、ヒドロキシ、チオール、α
−ハロアセチルオキシ、低級アルキルジカルボキシル、
−CONHNH2−、−NHCONHNH2、−NHCSNHNH2、−ONH2、−C
ON3、 であるか、あるいは引き続いてそれらに転化でき、そし
てＷは上の表１に示すとおりである。
C18）基、例えば−CH2CH2−、二価のアリールまたはヘ
テロアリール基、二価の（C3−C18）シクロアルキルま
たはヘテロシクロアルキル基、二価のアリールまたはヘ
テロアリール−アルキル（C1−C18）基、二価のシクロ
アルキル−アルキル（C1−C18）基またはヘテロシクロ
アルキル−アルキル（C1−C18）基，あるいは基 、または二価の（C2−C18）不飽和アルキル基であり、
Ｑはハロゲン、アミノ、アルキルアミノ、カルボキシ
ル、カルボキシアルデヒド、ヒドロキシ、チオール、α
−ハロアセチルオキシ、低級アルキルジカルボキシル、
−CONHNH2−、−NHCONHNH2、−NHCSNHNH2、−ONH2、−C
ON3、 であるか、あるいは引き続いてそれらに転化でき、そし
てＷは上の表１に示すとおりである。
反応図Ｉからの生成物が標的単位（Tu）に転化できる
か、あるいは標的単位と直接に反応性である官能基のす
くなくとも１つを含有するかぎり、下の反応図IIに示す
ように、上に記載した特許および出願の抗腫瘍抗生物質
のターゲテッド形態発生させることができる： 式中、Ｑ、Sp、およびＷは上に定義したとおりであり、
Tuはモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、その断
片、その化学的または遺伝子的に操作された相手、成長
因子、またはステロイドであり、Ｙがタンパク質の側鎖
のアミノ、カルボキシ、またはチオール基、炭水化物残
基から誘導されたアルデヒド、またはアミドアルキルチ
オ基であり、そしてｎは１〜100の整数であり、ＺはＱ
およびＹの共有反応から、直接あるいは還元後、形成さ
れ、そしてＺは−CONH−、−CONHN＝CH−、−CONHNHCH2
−、−NHCONHN＝CH−、−NHCONHNHCH2−、−NHCSNHN＝C
H−、−NHCSNHNHCH2−、−ON＝CH−、−NH−、−NHCH2
−、−Ｎ＝CH−、−CO2−、−NHCH2CO2−、−SS−、 または であり、そしてｍは0.1〜15である。
か、あるいは標的単位と直接に反応性である官能基のす
くなくとも１つを含有するかぎり、下の反応図IIに示す
ように、上に記載した特許および出願の抗腫瘍抗生物質
のターゲテッド形態発生させることができる： 式中、Ｑ、Sp、およびＷは上に定義したとおりであり、
Tuはモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、その断
片、その化学的または遺伝子的に操作された相手、成長
因子、またはステロイドであり、Ｙがタンパク質の側鎖
のアミノ、カルボキシ、またはチオール基、炭水化物残
基から誘導されたアルデヒド、またはアミドアルキルチ
オ基であり、そしてｎは１〜100の整数であり、ＺはＱ
およびＹの共有反応から、直接あるいは還元後、形成さ
れ、そしてＺは−CONH−、−CONHN＝CH−、−CONHNHCH2
−、−NHCONHN＝CH−、−NHCONHNHCH2−、−NHCSNHN＝C
H−、−NHCSNHNHCH2−、−ON＝CH−、−NH−、−NHCH2
−、−Ｎ＝CH−、−CO2−、−NHCH2CO2−、−SS−、 または であり、そしてｍは0.1〜15である。
一例として、そして反応図IIを参照すると、LL−E332
88γ1 Iの３−メルカプトプロピオン酸誘導体（Ｑ＝CO
2H、Sp＝−CH2CH2−）は、その活性化されたヒドロキシ
スクシンイミドの形態（Ｑ＝CO2Su、Sp＝−CH2CH2−）
に転化すると、これを使用して、リジン残基（例えば、
Tu＝モノクローナル抗体、Ｙ＝−NH2、ここでｎ＝50〜1
00、利用可能なリジン残基から）のε−アミノ基のある
ものと、水性緩衝液中でpH7.0〜9.5および４℃〜40℃の
温度において反応させて、タンパク質主鎖に沿って不規
則に抗生物質のターゲテッド形態（Tu＝モノクローナル
抗体、Ｚ−−NHお−、Sp＝−CH2CH2−、ｍ＝１〜10）を
生成することができる。この方法において、利用可能な
リジン残基の一部のみが置換されるだけである。なぜな
ら、高い負荷は、一般に、抗体の免疫反応性を保存する
ことと適合しないからである。同一の不規則に置換され
た免疫接合体は、また、他のカルボキシル基活性化剤、
例えば、種々のカーボジイミド、または対応するアシル
アジトを使用して、３−メルカプトプロピオン酸誘導体
から調製できる。あるいは、LL−E33288γ1 Iの３−メル
カプトプロピオニルヒドラジド誘導体（Ｑ＝H2NNHCO
−、Sp＝−CH2CH2−）は、過ヨウ素酸塩で炭水化物残基
が酸化され、アルデヒド基が形成された抗体（Tu＝モノ
クローナル抗体、Ｙ＝−CHO、ｎ＝１〜15）と、米国特
許第4,671,958号に記載されるように、水性緩衝液中に
おいてpH4〜７および４℃〜40℃の温度において反応さ
せると、アルデヒド官能基（抗体のFc部分上に位置する
炭水化物残基のvic−ジオールの開裂から誘導される）
のみと反応して、タンパク質の主鎖に沿って特異的部位
において置換された薬物を含有する、モノクローナル抗
体接合体（Tu＝モノクローナル抗体、Ｚ＝−CH＝NNHCO
−、Sp＝−CH2CH2−、ｍ＝0.5〜10）を生成する。抗体
上の未反応のアルデヒド基を遮断し、こうして架橋を防
止し、ならびに加水分解的に不安定なシッフ塩基の結合
を安定化するために、後者の接合体を、例えば、アセチ
ルヒドラジドまたはチロシンヒドラジドと反応させ、次
いでシアノホウ水素化ナトリウムまたはホウ水素化ナト
リウムで還元して、本発明の安定化された構成体（Tu＝
モノクローナル抗体、Ｚ＝−CH2NHNHCO−、Sp＝−CH2CH
2−、ｍ＝0.1〜10）を生成することが好ましい（が必須
ではない）。他のアルデヒド反応性基は、薬物構成体の
一部として、本発明の範囲内において、反応図IIの生成
物を生成する。このような官能基は、好ましくは、酸性
の水性条件下にアルデヒドと反応するものであるが、こ
れらに限定されない。塩基性条件下におけるタンパク質
リジンの反応性は十分に大きくて、それらのアミンは反
応図IIの生成物と、モノクローナル抗体の利用可能なア
ルデヒドについて競争する。別のアルデイド反応性基
は、例えば、チオセミカルバジド、およびＯ−置換ヒド
ロキルアミン官能基である。
88γ1 Iの３−メルカプトプロピオン酸誘導体（Ｑ＝CO
2H、Sp＝−CH2CH2−）は、その活性化されたヒドロキシ
スクシンイミドの形態（Ｑ＝CO2Su、Sp＝−CH2CH2−）
に転化すると、これを使用して、リジン残基（例えば、
Tu＝モノクローナル抗体、Ｙ＝−NH2、ここでｎ＝50〜1
00、利用可能なリジン残基から）のε−アミノ基のある
ものと、水性緩衝液中でpH7.0〜9.5および４℃〜40℃の
温度において反応させて、タンパク質主鎖に沿って不規
則に抗生物質のターゲテッド形態（Tu＝モノクローナル
抗体、Ｚ−−NHお−、Sp＝−CH2CH2−、ｍ＝１〜10）を
生成することができる。この方法において、利用可能な
リジン残基の一部のみが置換されるだけである。なぜな
ら、高い負荷は、一般に、抗体の免疫反応性を保存する
ことと適合しないからである。同一の不規則に置換され
た免疫接合体は、また、他のカルボキシル基活性化剤、
例えば、種々のカーボジイミド、または対応するアシル
アジトを使用して、３−メルカプトプロピオン酸誘導体
から調製できる。あるいは、LL−E33288γ1 Iの３−メル
カプトプロピオニルヒドラジド誘導体（Ｑ＝H2NNHCO
−、Sp＝−CH2CH2−）は、過ヨウ素酸塩で炭水化物残基
が酸化され、アルデヒド基が形成された抗体（Tu＝モノ
クローナル抗体、Ｙ＝−CHO、ｎ＝１〜15）と、米国特
許第4,671,958号に記載されるように、水性緩衝液中に
おいてpH4〜７および４℃〜40℃の温度において反応さ
せると、アルデヒド官能基（抗体のFc部分上に位置する
炭水化物残基のvic−ジオールの開裂から誘導される）
のみと反応して、タンパク質の主鎖に沿って特異的部位
において置換された薬物を含有する、モノクローナル抗
体接合体（Tu＝モノクローナル抗体、Ｚ＝−CH＝NNHCO
−、Sp＝−CH2CH2−、ｍ＝0.5〜10）を生成する。抗体
上の未反応のアルデヒド基を遮断し、こうして架橋を防
止し、ならびに加水分解的に不安定なシッフ塩基の結合
を安定化するために、後者の接合体を、例えば、アセチ
ルヒドラジドまたはチロシンヒドラジドと反応させ、次
いでシアノホウ水素化ナトリウムまたはホウ水素化ナト
リウムで還元して、本発明の安定化された構成体（Tu＝
モノクローナル抗体、Ｚ＝−CH2NHNHCO−、Sp＝−CH2CH
2−、ｍ＝0.1〜10）を生成することが好ましい（が必須
ではない）。他のアルデヒド反応性基は、薬物構成体の
一部として、本発明の範囲内において、反応図IIの生成
物を生成する。このような官能基は、好ましくは、酸性
の水性条件下にアルデヒドと反応するものであるが、こ
れらに限定されない。塩基性条件下におけるタンパク質
リジンの反応性は十分に大きくて、それらのアミンは反
応図IIの生成物と、モノクローナル抗体の利用可能なア
ルデヒドについて競争する。別のアルデイド反応性基
は、例えば、チオセミカルバジド、およびＯ−置換ヒド
ロキルアミン官能基である。
表１に記載する化合物のターゲテッド形態のアセンブ
リーは、反応図IIに概略的に示す順序に限定されない。
標的単位（Tu）を、まず、チオール基を含有するように
変性し、次いでこれを表１の化合物と、下の反応図III
に示すように、反応させる： 式中、Tu、Ｙ、Ｑ、Sp、Ｗ、ｎ、およびｍは上に定義し
たとおりであり、そしてＰは水素または２−（ピリジル
チオ）であるが、ただしＹがTuの主鎖のアミノ酸残基か
ら誘導されたチオールであるとき、Ｚ−Spは一緒になっ
て共有結合である。
リーは、反応図IIに概略的に示す順序に限定されない。
標的単位（Tu）を、まず、チオール基を含有するように
変性し、次いでこれを表１の化合物と、下の反応図III
に示すように、反応させる： 式中、Tu、Ｙ、Ｑ、Sp、Ｗ、ｎ、およびｍは上に定義し
たとおりであり、そしてＰは水素または２−（ピリジル
チオ）であるが、ただしＹがTuの主鎖のアミノ酸残基か
ら誘導されたチオールであるとき、Ｚ−Spは一緒になっ
て共有結合である。
一例として、そして反応図IIIを参照すると、モノク
ローナル抗体を３−（２−ジチオピリジル）プロピオン
酸ヒドロキシスクシンイミドエステルと反応させて、リ
ジン残基をとおしてタンパク質を変性することができる
（Tu＝モノクローナル抗体、Ｙ＝NH2、ｎ＝50〜100、Ｑ
＝−CO2Su、Sp＝−CH2CH2−、Ｐ＝２−ピロジルチ
オ）。例えば、ジチオスレイトールで還元した後、中間
体が生成し（Tu＝モノクローナル抗体）、Ｚ＝−NHCO
−、Sp＝−CH2CH2−、ｍ＝１〜15）、これは表１の化合
物と反応させて、主題の免疫接合体を生成することがで
きる。同様に、２−イミノチオランをモノクローナル抗
体と反応させて、チオール基をタンパク質の表面上に直
接、還元工程を必要とせずに、導入することができる
（Tu＝モノクローナル抗体、Ｚ＝−NHCO−、Sp＝−(C
H3)3−、ｍ＝１〜15）、そしてこの中間体を前の表１の
化合物と反応させることができる。あるいは、シスチン
残基として二量体の形態のモノクローナル抗体の構造に
固有のスルフヒドリル基を使用して、反応図IIIの反応
に直接参加させることができる。このようなスルフヒド
リルは、酵素の消化および自然モノクローナル抗体（Tu
＝Fab′断片、Ｚ−Sp＝結合、Ｙ＝SH）に遷移的に暴露
されるが、不対シスチン残基を含有するモノクローナル
抗体の遺伝子的に変更された構成体の使用が同様に考え
られる。
ローナル抗体を３−（２−ジチオピリジル）プロピオン
酸ヒドロキシスクシンイミドエステルと反応させて、リ
ジン残基をとおしてタンパク質を変性することができる
（Tu＝モノクローナル抗体、Ｙ＝NH2、ｎ＝50〜100、Ｑ
＝−CO2Su、Sp＝−CH2CH2−、Ｐ＝２−ピロジルチ
オ）。例えば、ジチオスレイトールで還元した後、中間
体が生成し（Tu＝モノクローナル抗体）、Ｚ＝−NHCO
−、Sp＝−CH2CH2−、ｍ＝１〜15）、これは表１の化合
物と反応させて、主題の免疫接合体を生成することがで
きる。同様に、２−イミノチオランをモノクローナル抗
体と反応させて、チオール基をタンパク質の表面上に直
接、還元工程を必要とせずに、導入することができる
（Tu＝モノクローナル抗体、Ｚ＝−NHCO−、Sp＝−(C
H3)3−、ｍ＝１〜15）、そしてこの中間体を前の表１の
化合物と反応させることができる。あるいは、シスチン
残基として二量体の形態のモノクローナル抗体の構造に
固有のスルフヒドリル基を使用して、反応図IIIの反応
に直接参加させることができる。このようなスルフヒド
リルは、酵素の消化および自然モノクローナル抗体（Tu
＝Fab′断片、Ｚ−Sp＝結合、Ｙ＝SH）に遷移的に暴露
されるが、不対シスチン残基を含有するモノクローナル
抗体の遺伝子的に変更された構成体の使用が同様に考え
られる。
本発明の好ましい実施態様は、式 を有し、LL−E33288γ1 I（または、Ｗが上記定義の、式
CH3SSS−Ｗで示される化合物）と表示され、 ａ）第１図に示す紫外線スペクトル ｂ）第２図に示すプロトン核磁気共鳴スペクトル、およ
び ｃ）第３図に示す赤外線スペクトル、 の特徴を有する抗腫瘍抗生物質から調製され、 前記調製の方法は、ジチオメチル部分を、式Ｑ−Sp−
SH（式中、Spは直鎖状もしくは分枝鎖状の二価の（C2−
C5）基または二価のアリールまたはヘテロアリールアル
キル（C2−C5）基であり、そしてＱはカルボキシル、低
級アルキルジカルボキシル無水物、−CONHNH2、または であるか、あるいは引き続いてそれらに転化できる）の
化合物と置換して、式Ｑ−Sp−SS−Ｗ（式中、Ｑ、Spお
よびＷは上に定義したとおりである）の中間体を生成
し、 Ｑ−Sp−SS−Ｗを式Tu−（Ｙ）ｎ（式中、Tuはヒト腫
瘍関連抗原との優先的反応性を示すモノクローナル抗体
であり、Ｙは抗体上の側鎖のアミノ基、または抗体の炭
水化物基の酸化によって派生したアルデヒドであり、そ
してｎは１〜100の整数である）の分子と反応させて、
式 （式中、Tu、Ｙ、Sp、Ｗおよびｎは上に定義したとおり
であり、そしてＺはＱおよびＹの各基が共有結合した生
成物を与える反応から、直接あるいは還元後、形成さ
れ、そしてＺは−CONH−、−CONHN＝CH−、−CONHNHCH2
−、または であり、そしてｍは０または１〜15のいずれかの整数で
あるが、但し、基(Z-Sp-SS-W)mにおけるｍは１以上の整
数である）の化合物またはｍが平均値0.1〜15にある混
合物物を生成することからなる、ことを特徴とする、タ
ンパク質−薬物接合体である。
CH3SSS−Ｗで示される化合物）と表示され、 ａ）第１図に示す紫外線スペクトル ｂ）第２図に示すプロトン核磁気共鳴スペクトル、およ
び ｃ）第３図に示す赤外線スペクトル、 の特徴を有する抗腫瘍抗生物質から調製され、 前記調製の方法は、ジチオメチル部分を、式Ｑ−Sp−
SH（式中、Spは直鎖状もしくは分枝鎖状の二価の（C2−
C5）基または二価のアリールまたはヘテロアリールアル
キル（C2−C5）基であり、そしてＱはカルボキシル、低
級アルキルジカルボキシル無水物、−CONHNH2、または であるか、あるいは引き続いてそれらに転化できる）の
化合物と置換して、式Ｑ−Sp−SS−Ｗ（式中、Ｑ、Spお
よびＷは上に定義したとおりである）の中間体を生成
し、 Ｑ−Sp−SS−Ｗを式Tu−（Ｙ）ｎ（式中、Tuはヒト腫
瘍関連抗原との優先的反応性を示すモノクローナル抗体
であり、Ｙは抗体上の側鎖のアミノ基、または抗体の炭
水化物基の酸化によって派生したアルデヒドであり、そ
してｎは１〜100の整数である）の分子と反応させて、
式 （式中、Tu、Ｙ、Sp、Ｗおよびｎは上に定義したとおり
であり、そしてＺはＱおよびＹの各基が共有結合した生
成物を与える反応から、直接あるいは還元後、形成さ
れ、そしてＺは−CONH−、−CONHN＝CH−、−CONHNHCH2
−、または であり、そしてｍは０または１〜15のいずれかの整数で
あるが、但し、基(Z-Sp-SS-W)mにおけるｍは１以上の整
数である）の化合物またはｍが平均値0.1〜15にある混
合物物を生成することからなる、ことを特徴とする、タ
ンパク質−薬物接合体である。
ある数の異なるモノクローナル抗体（MoAb）を使用し
て、メチルトリチオ抗癌剤化合物のターゲティングを例
示する。MoAbのLym1およびLym2は、成熟Ｂ−リンパ球お
よびそれらの産生物リンパ腫上の異なる抗原を認識す
る。これらのMoAbの産生および特性は、A.L.エプステイ
ン（Epstein）ら、「癌の研究（Cancer Research）、4
7、830（1987）に記載されている。MoAb B72.3は、主と
して、肺および結腸の癌を標的にするが、膵臓、卵巣、
および肺の癌との反応性が、また、認められる。抗体
は、T.L.クルング（Klung）ら、「インターナショナル
・ジャーナル・オブ・キャンサー（Int.J.Cancer）、3
8、661（1986）に記載された。主として乳癌を認識する
MoAb CT−Ｍ−01はEPO出願86 401482.4、1986年７月３
日付出願（欧州特許出願公開第208615号明細書に対
応）、に記載され、そしてMAC−68は、CT−Ｍ−01を産
生するハイブリドーマのサブクローンによって産生さ
れ、そして肺癌および結腸癌の両者を認識する。主題の
有用な化合物の中間体、およびこれらの抗体との接合体
は、実験の節に記載されている。しかしながら、この特
許は前述の抗体に限定されないことに注意すべきであ
る。その代わり、方法は十分に一般的であって、それら
の部類またはアイソタイプ、それらの酵素的に誘導され
る断片、それらの化学的に操作されかつ安定化された断
片、ならびにそれらのそれぞれのキメラおよび人間化さ
れた（humanized）相手に無関係に、すべての抗体に適
用できる。また、標的単位はモノクローナル抗体にのみ
限定されない。たのタンパク質、ならびにそのための受
容体が組織上に存在する小さい分子は、ターゲティング
実在物として本発明の発見の範囲内に入る。
て、メチルトリチオ抗癌剤化合物のターゲティングを例
示する。MoAbのLym1およびLym2は、成熟Ｂ−リンパ球お
よびそれらの産生物リンパ腫上の異なる抗原を認識す
る。これらのMoAbの産生および特性は、A.L.エプステイ
ン（Epstein）ら、「癌の研究（Cancer Research）、4
7、830（1987）に記載されている。MoAb B72.3は、主と
して、肺および結腸の癌を標的にするが、膵臓、卵巣、
および肺の癌との反応性が、また、認められる。抗体
は、T.L.クルング（Klung）ら、「インターナショナル
・ジャーナル・オブ・キャンサー（Int.J.Cancer）、3
8、661（1986）に記載された。主として乳癌を認識する
MoAb CT−Ｍ−01はEPO出願86 401482.4、1986年７月３
日付出願（欧州特許出願公開第208615号明細書に対
応）、に記載され、そしてMAC−68は、CT−Ｍ−01を産
生するハイブリドーマのサブクローンによって産生さ
れ、そして肺癌および結腸癌の両者を認識する。主題の
有用な化合物の中間体、およびこれらの抗体との接合体
は、実験の節に記載されている。しかしながら、この特
許は前述の抗体に限定されないことに注意すべきであ
る。その代わり、方法は十分に一般的であって、それら
の部類またはアイソタイプ、それらの酵素的に誘導され
る断片、それらの化学的に操作されかつ安定化された断
片、ならびにそれらのそれぞれのキメラおよび人間化さ
れた（humanized）相手に無関係に、すべての抗体に適
用できる。また、標的単位はモノクローナル抗体にのみ
限定されない。たのタンパク質、ならびにそのための受
容体が組織上に存在する小さい分子は、ターゲティング
実在物として本発明の発見の範囲内に入る。
表１の化合物からモノクローナル抗体接合体を生成す
るために使用した本発明の方法は、次に生体外アッセイ
によって決定して、標的細胞とのすぐれた免疫反応性を
保持する構成体を生ずる： 標的細胞 すべての標的細胞は、５％の胎児仔ウシ血清（FC
S）、ITS［コラボレイティブ・リサーチ（Collaborativ
e Research）、Cat＃40351］、ストレプトマイシン（50
μg/m1）、ペニシリン（50単位/m1）、ゲンタマイシン
硫酸（50単位/m1）およびグルタミン（0.03％）を補充
したRPMI1640培地中で維持した。細胞は加湿した５％の
CO2中でインキュベーター内で37℃において維持した。
るために使用した本発明の方法は、次に生体外アッセイ
によって決定して、標的細胞とのすぐれた免疫反応性を
保持する構成体を生ずる： 標的細胞 すべての標的細胞は、５％の胎児仔ウシ血清（FC
S）、ITS［コラボレイティブ・リサーチ（Collaborativ
e Research）、Cat＃40351］、ストレプトマイシン（50
μg/m1）、ペニシリン（50単位/m1）、ゲンタマイシン
硫酸（50単位/m1）およびグルタミン（0.03％）を補充
したRPMI1640培地中で維持した。細胞は加湿した５％の
CO2中でインキュベーター内で37℃において維持した。
Ｉ、免疫活性アッセイ 手順Ｉ−エライサ（Elisa） 適当な標的細胞を収穫し、計数し、そしてダルベッコ
（Dulbecco）のリン酸塩緩衝塩類溶液（DPBS）中に、試
験するモノクローナル抗体（MoAb）のために最適な濃度
で、懸濁した。0.1mlのアリコートの細胞を、無菌の組
織培養ポリスチレンの96ウェル（well）平板の各ウェル
に加えた。平板を1,000rpmで５分間遠心し、そして上澄
み液を払いのけた。平板を一夜空気乾燥し、そして４℃
で３ヵ月間まで貯蔵することができる。
（Dulbecco）のリン酸塩緩衝塩類溶液（DPBS）中に、試
験するモノクローナル抗体（MoAb）のために最適な濃度
で、懸濁した。0.1mlのアリコートの細胞を、無菌の組
織培養ポリスチレンの96ウェル（well）平板の各ウェル
に加えた。平板を1,000rpmで５分間遠心し、そして上澄
み液を払いのけた。平板を一夜空気乾燥し、そして４℃
で３ヵ月間まで貯蔵することができる。
非特異的結合部位を、200μl/ウェルの１％のゼラチ
ンをDPBS中に添加することによって遮断し、そして平板
を１時間37℃において加湿したインキュベーター中でイ
ンキュベーションした。（すべての引き続くインキュベ
ーションは同様な条件下に実施する）。平板は、ダイナ
テク（Dynatech）からの自動化ELISA洗浄システム（Ult
rawash II）を使用して、250μｌのDPBS中の0.05％のツ
イーン（TWEEN）−20（洗浄溶液）で１回洗浄した。試
験すべき試料を希釈して、0.1％のゼラチン−DPBS中の
３μl/mlのMoAb当量の最終濃度にした。６つの追加の３
倍の系統的希釈物を各３μg/mlの試料から調製し、そし
て100μｌを３回の反復実験において適当なウェルに添
加した。ウェルの底の列にのみ、100μｌの0.1％のゼラ
チンをバックグラウンドとして加えた。平板を45分間イ
ンキュベーションし、次いで３回洗浄した。アルカリ性
ホスファターゼ接合し、親和精製したヤギ抗マウス免疫
グロブリン（Cappel Cat＃8611−0231）を0.1％のゼラ
チン中で1:125に希釈し、そして100μｌの各ウェルに添
加した。平板を45分間インキュベーションし、次いで３
回洗浄した。200μｌのｐ−ニトロフェニルホスフェー
ト基質溶液（下を参照）を各ウェルに添加した。室温に
おいて45分後、反応を50μｌの3M NaOHの添加により停
止した。ウェルの各々の吸収を405nmにおいてダイナテ
ク（Dynatech）からの自動化分光光度計（EIA Autoread
er ＃ EL−310）において読んだ。
ンをDPBS中に添加することによって遮断し、そして平板
を１時間37℃において加湿したインキュベーター中でイ
ンキュベーションした。（すべての引き続くインキュベ
ーションは同様な条件下に実施する）。平板は、ダイナ
テク（Dynatech）からの自動化ELISA洗浄システム（Ult
rawash II）を使用して、250μｌのDPBS中の0.05％のツ
イーン（TWEEN）−20（洗浄溶液）で１回洗浄した。試
験すべき試料を希釈して、0.1％のゼラチン−DPBS中の
３μl/mlのMoAb当量の最終濃度にした。６つの追加の３
倍の系統的希釈物を各３μg/mlの試料から調製し、そし
て100μｌを３回の反復実験において適当なウェルに添
加した。ウェルの底の列にのみ、100μｌの0.1％のゼラ
チンをバックグラウンドとして加えた。平板を45分間イ
ンキュベーションし、次いで３回洗浄した。アルカリ性
ホスファターゼ接合し、親和精製したヤギ抗マウス免疫
グロブリン（Cappel Cat＃8611−0231）を0.1％のゼラ
チン中で1:125に希釈し、そして100μｌの各ウェルに添
加した。平板を45分間インキュベーションし、次いで３
回洗浄した。200μｌのｐ−ニトロフェニルホスフェー
ト基質溶液（下を参照）を各ウェルに添加した。室温に
おいて45分後、反応を50μｌの3M NaOHの添加により停
止した。ウェルの各々の吸収を405nmにおいてダイナテ
ク（Dynatech）からの自動化分光光度計（EIA Autoread
er ＃ EL−310）において読んだ。
基質のジエタノールアミン緩衝液（10％） 97mlのジエタノールアミン 800mlの水 0.2gのNaN3 100mgのMgCl2・６H2O 試薬を連続的に撹拌しながら溶解し、そしてpHが9.8
になるまで1M HClを添加した。合計の体積を水で１リッ
トルにし、そして0.2μのフィルターで滅菌濾過した。
緩衝液は４℃で暗所に貯蔵した。使用直前に、ｐ−ニト
ロフェニルホスフェート［シグマ（Sigma）、Cat＃ 104
−40）を10％のジエタノールアミン緩衝剤中に溶解して
（室温でなくてはならない）1mg/mlの最終濃度にした。
になるまで1M HClを添加した。合計の体積を水で１リッ
トルにし、そして0.2μのフィルターで滅菌濾過した。
緩衝液は４℃で暗所に貯蔵した。使用直前に、ｐ−ニト
ロフェニルホスフェート［シグマ（Sigma）、Cat＃ 104
−40）を10％のジエタノールアミン緩衝剤中に溶解して
（室温でなくてはならない）1mg/mlの最終濃度にした。
光学密度（O.D.）の計算 試料の各々の結合％は、次の等式から計算した： （Ａ−B/C−Ｂ）×100＝結合％ Ａ＝試験試料の平均の光学密度 Ｂ＝バックグラウンドの平均の光学密度 Ｃ＝３μg/mlの非操作MoAb対照の平均の光学密度 結合％は半対数グラフの非対数目盛り上にプロット
し、そしてMoAb濃度を対数目盛り上にプロットした。試
料の各々のBD50（すなわち、50％の結合を与えるために
必要な抗体の投与量）をグラフから誘導し、そして免疫
活性の保持量を次の等式によって計算した： （MoAb対照のBD50）／（試験試料のBD50）×100＝保持
された免疫活性％ 手順２−間接的RIA 0.2mlの10％のFCS培地中の標的細胞の適当量のアリコ
ートを4mlのポリスチレン管中に入れた。試験すべき試
料を、10％のFCS培地中に２μg/mlのMoAb当量の濃度に
希釈した。５つの３倍の系統的希釈物を各２μg/mlの試
料から調製し、そして0.2mlを反復実験において各管に
添加した。バックグラウンドの試料には、細胞および培
地のみを加えた。細胞を４℃において１時間インキュベ
ーションし、次いで２％のFCS培地で２回洗浄した（す
べてのRIAの洗浄は3mlの体積で実施した）。ほぼ500,00
0cpmを含有する0.05mlのヒツジＦ（ab′）2抗マウスIgG
［125I］（デュポン、Cat＃ NEX 162−0142）を管の各
々に添加した；細胞さらに１時間４℃においてインキュ
ベーションし、２％のFCSで１回洗浄し、そしてPBSで２
回洗浄した。0.5mlのPBSを管の各々に添加し、細胞をか
きまぜ、清浄な管に移し、そしてパッカード・ガンンマ
（Packard Gamma）500で１分間計数した。
し、そしてMoAb濃度を対数目盛り上にプロットした。試
料の各々のBD50（すなわち、50％の結合を与えるために
必要な抗体の投与量）をグラフから誘導し、そして免疫
活性の保持量を次の等式によって計算した： （MoAb対照のBD50）／（試験試料のBD50）×100＝保持
された免疫活性％ 手順２−間接的RIA 0.2mlの10％のFCS培地中の標的細胞の適当量のアリコ
ートを4mlのポリスチレン管中に入れた。試験すべき試
料を、10％のFCS培地中に２μg/mlのMoAb当量の濃度に
希釈した。５つの３倍の系統的希釈物を各２μg/mlの試
料から調製し、そして0.2mlを反復実験において各管に
添加した。バックグラウンドの試料には、細胞および培
地のみを加えた。細胞を４℃において１時間インキュベ
ーションし、次いで２％のFCS培地で２回洗浄した（す
べてのRIAの洗浄は3mlの体積で実施した）。ほぼ500,00
0cpmを含有する0.05mlのヒツジＦ（ab′）2抗マウスIgG
［125I］（デュポン、Cat＃ NEX 162−0142）を管の各
々に添加した；細胞さらに１時間４℃においてインキュ
ベーションし、２％のFCSで１回洗浄し、そしてPBSで２
回洗浄した。0.5mlのPBSを管の各々に添加し、細胞をか
きまぜ、清浄な管に移し、そしてパッカード・ガンンマ
（Packard Gamma）500で１分間計数した。
値の各々の結合％を決定し、そして前のELISA等式の
ようにグラフにしたが、ただし光学密度の代わりにcpm
を使用し、そしてＣ＝１μg/mlの非操作MoAb対照の平均
のcpm。試料の各々に保持された免疫活性％を前述のよ
うにして決定した。
ようにグラフにしたが、ただし光学密度の代わりにcpm
を使用し、そしてＣ＝１μg/mlの非操作MoAb対照の平均
のcpm。試料の各々に保持された免疫活性％を前述のよ
うにして決定した。
手順２−直接のRIA 1mlの10％のFCS培地中の標的細胞の適当量のアリコー
トを4mlのポリスチレン管に入れ、遠心し、そして上澄
み液を廃棄した。試験すべき試料を、10％FCS培地中で2
00μg/mlのMoAb当量の濃度に希釈した。５つの追加の５
倍の系統的希釈物を200μg/mlの試料の各々に添加し、
0.05mlを管の各々に反復実験において添加した。0.05ml
の125I−MoAbを管の各々に添加した（最適量は、MoAbお
よびバッチの各々についてここに決定した）。陽性に対
照試料は、細胞、培地および125I−MoAbを含有した。バ
ックグラウンドの試料は、非特異的細胞、培地および
125I−MoAbを含有した。細胞を１時間４℃においてイン
キュベーションし、２％のFCS培地で１回、PBSで２回洗
浄し、前述のように、移し、そして計数した。
トを4mlのポリスチレン管に入れ、遠心し、そして上澄
み液を廃棄した。試験すべき試料を、10％FCS培地中で2
00μg/mlのMoAb当量の濃度に希釈した。５つの追加の５
倍の系統的希釈物を200μg/mlの試料の各々に添加し、
0.05mlを管の各々に反復実験において添加した。0.05ml
の125I−MoAbを管の各々に添加した（最適量は、MoAbお
よびバッチの各々についてここに決定した）。陽性に対
照試料は、細胞、培地および125I−MoAbを含有した。バ
ックグラウンドの試料は、非特異的細胞、培地および
125I−MoAbを含有した。細胞を１時間４℃においてイン
キュベーションし、２％のFCS培地で１回、PBSで２回洗
浄し、前述のように、移し、そして計数した。
試料の各々の125I−MoAb結合阻害％は、次の式によっ
て計算した： （Ａ−B/C−Ｂ）×100＝125I−MoAb結合の阻害％ Ａ＝試験試料の平均のcpm Ｂ＝バックグラウンドの平均のcpm Ｃ＝陽性の対照の平均のcpm プロットおよび試料の各々が保持した免疫活性％を前
のように計算したが、ただしBD50は実際にBID50（125I
−MoAbの結合の50％阻害を与えるために必要なMoAbの投
与量）である。
て計算した： （Ａ−B/C−Ｂ）×100＝125I−MoAb結合の阻害％ Ａ＝試験試料の平均のcpm Ｂ＝バックグラウンドの平均のcpm Ｃ＝陽性の対照の平均のcpm プロットおよび試料の各々が保持した免疫活性％を前
のように計算したが、ただしBD50は実際にBID50（125I
−MoAbの結合の50％阻害を与えるために必要なMoAbの投
与量）である。
注： １）RIAにおいて各試薬の添加直後、管は激しくかきま
ぜた。
ぜた。
２）非操作MoAb対照の50％に等しい内部対照試料を、ア
ッセイの各組に含めて、各手順が接合体の免疫活性の保
持を予測するとき定量的であるかどうかを確認した。
ッセイの各組に含めて、各手順が接合体の免疫活性の保
持を予測するとき定量的であるかどうかを確認した。
これらのアッセイからの結果を下表２に記載する。
本発明のモノクローナル抗体の接合体は、抗癌剤とし
て活性である。生体外細胞障害性をアッセイするための
下のアッセイは、非標的細胞と反対に、標的細胞系につ
いて構成体の優越性を示し、そしてそれらの非標的相手
と比較して化合物のターゲテッド形態の利用の手段をて
提供する。
て活性である。生体外細胞障害性をアッセイするための
下のアッセイは、非標的細胞と反対に、標的細胞系につ
いて構成体の優越性を示し、そしてそれらの非標的相手
と比較して化合物のターゲテッド形態の利用の手段をて
提供する。
細胞障害性のアッセイ 生体外 試験すべき試料を0.2または0.02μg/mlのLL−E33288
γ1 I当量の濃度に希釈した（出発濃度は試験すべき細胞
系に依存する）。３つの追加の５倍の希釈物をもとの試
料希釈物の各々から調製し、そして0.2mlを無菌の15ml
のポリスチレン管に添加した。LL−E33288γ1 Iおよび無
関係のMoAbから成る少なくとも１つの同様な接合体を、
アッセイに含めて、関連する接合体の特異性を決定し
た。0.2mlの10％FCS培地中の105の適当な標的細胞のア
リコートを管に入れ、そしてかきまぜた。さらに、標的
として、無関係の細胞を利用して同一の試験を実施し
て、関連する接合体の特異性をさらに確認した。MoAb対
照には等しい量のMoAbのみを与え、そして陽性の対照は
10％のFCS培地のみを与えた。
γ1 I当量の濃度に希釈した（出発濃度は試験すべき細胞
系に依存する）。３つの追加の５倍の希釈物をもとの試
料希釈物の各々から調製し、そして0.2mlを無菌の15ml
のポリスチレン管に添加した。LL−E33288γ1 Iおよび無
関係のMoAbから成る少なくとも１つの同様な接合体を、
アッセイに含めて、関連する接合体の特異性を決定し
た。0.2mlの10％FCS培地中の105の適当な標的細胞のア
リコートを管に入れ、そしてかきまぜた。さらに、標的
として、無関係の細胞を利用して同一の試験を実施し
て、関連する接合体の特異性をさらに確認した。MoAb対
照には等しい量のMoAbのみを与え、そして陽性の対照は
10％のFCS培地のみを与えた。
細胞は37℃で７分間インキュベーションし、次いで４
回8mlの２％のFCS培地で洗浄した。0.2mlのFCSを管の各
々に添加し、細胞をかきまぜ、そして0.2mlのアリコー
トを無菌の96ウェルのポリスチレン組織培養平板のウェ
ルの各々に添加した。
回8mlの２％のFCS培地で洗浄した。0.2mlのFCSを管の各
々に添加し、細胞をかきまぜ、そして0.2mlのアリコー
トを無菌の96ウェルのポリスチレン組織培養平板のウェ
ルの各々に添加した。
平板を２日間加湿した37℃のインキュベーター内で５
％のCO2中においてインキュベーションした。培地の半
分を取り出し、そして２μCi/mlの3Hチミジン（デュポ
ン、NEN、Cat＃ NEN−027）を含有する新鮮な培地と交
換した。インキュベーションは24時間実施し、細胞を凍
結し、融解し、そしてPHD細胞収穫装置で［ケンブリッ
ジ・テクノロジー・インコーポレーテッド（Cambrige T
echnology,Inc.）］によって収穫した。試料の各々をベ
ックマン（Beckman）LS 5800シンチレーションカウンガ
ー、チャンネル１、で１分間計数した。
％のCO2中においてインキュベーションした。培地の半
分を取り出し、そして２μCi/mlの3Hチミジン（デュポ
ン、NEN、Cat＃ NEN−027）を含有する新鮮な培地と交
換した。インキュベーションは24時間実施し、細胞を凍
結し、融解し、そしてPHD細胞収穫装置で［ケンブリッ
ジ・テクノロジー・インコーポレーテッド（Cambrige T
echnology,Inc.）］によって収穫した。試料の各々をベ
ックマン（Beckman）LS 5800シンチレーションカウンガ
ー、チャンネル１、で１分間計数した。
増殖の阻害％は、次のようにして計算した： （試験の値の平均のcpm）／（培地対照の平均のcpm）×
100＝増殖％ 100−増殖％＝阻害％ 阻害％を半対数グラフの非対数目盛り上にプロット
し、そしてLL−E33288γ1 I濃度を対数目盛り上にプロッ
トした。試料の各々のIC50（50％の阻害を与えるために
必要なLL−E33288γ1 Iの濃度）をグラフから誘導し、そ
して細胞障害性の保持量を次の等式によって計算した： （LL−E33288γ1 IのIC50）／（試験試料のIC50）×100
＝保持された細胞障害性％ 生体外細胞障害性のアッセイからの結果を、下表３に
記載する。
100＝増殖％ 100−増殖％＝阻害％ 阻害％を半対数グラフの非対数目盛り上にプロット
し、そしてLL−E33288γ1 I濃度を対数目盛り上にプロッ
トした。試料の各々のIC50（50％の阻害を与えるために
必要なLL−E33288γ1 Iの濃度）をグラフから誘導し、そ
して細胞障害性の保持量を次の等式によって計算した： （LL−E33288γ1 IのIC50）／（試験試料のIC50）×100
＝保持された細胞障害性％ 生体外細胞障害性のアッセイからの結果を、下表３に
記載する。
次のアッセイ系を使用して、本発明の接合体の生体内
活性を測定した。
活性を測定した。
薬物−モノクローナル抗体接合体への抗腫瘍剤の活性
について生体内試験は、無胸腺（ヌード）マウスにおけ
るヒト腫瘍の異種移植片（xenograph）を使用して実施
した。
について生体内試験は、無胸腺（ヌード）マウスにおけ
るヒト腫瘍の異種移植片（xenograph）を使用して実施
した。
バーキット（Burkitto）リンパ腫（Raji）および骨髄
腫（HS Sultan）の細胞を培養フラスコから収穫し、そ
して皮下的にマウスに接種した（≧80×106のリンパ腫
細胞または40×る106の骨髄腫細胞）。充実腫瘍、卵巣
腫瘍（CA73、Ovcar−３）および乳癌（MX−１）を無胸
腺マウス中で増殖し、取り出し、２mm3の断片に切断
し、そして試験マウス中に皮下的に移植した（５〜８断
片／マウス）。
腫（HS Sultan）の細胞を培養フラスコから収穫し、そ
して皮下的にマウスに接種した（≧80×106のリンパ腫
細胞または40×る106の骨髄腫細胞）。充実腫瘍、卵巣
腫瘍（CA73、Ovcar−３）および乳癌（MX−１）を無胸
腺マウス中で増殖し、取り出し、２mm3の断片に切断
し、そして試験マウス中に皮下的に移植した（５〜８断
片／マウス）。
薬物、モノクローナル抗体および薬物−モノクローナ
ル抗体接合体を、腫瘍移植後、第２、３、４、６、７ま
たは８日に開始して、３日毎に合計３または５回の注射
によって腹腔内に投与した。腫瘍の測定（腫瘍の長さお
よび幅）は、腫瘍移植後４または５週に７日毎に、フォ
ウラー・ウルトラ（Fowler ultra）CAL II電子カリパー
によって実施した。腫瘍の質量（mg）を次式から推定し
た： （長さ（mm）×幅（mm））/2 腫瘍の増殖の阻害は、各試験群について対照の百分率
に基づいて計算した［処置した（Ｔ）mg/対照（Ｃ）mg
×100を意味する］。T/C値≦42％、群において、≧65％
の生存動物は活性を立証するために必要であると考え
る。
ル抗体接合体を、腫瘍移植後、第２、３、４、６、７ま
たは８日に開始して、３日毎に合計３または５回の注射
によって腹腔内に投与した。腫瘍の測定（腫瘍の長さお
よび幅）は、腫瘍移植後４または５週に７日毎に、フォ
ウラー・ウルトラ（Fowler ultra）CAL II電子カリパー
によって実施した。腫瘍の質量（mg）を次式から推定し
た： （長さ（mm）×幅（mm））/2 腫瘍の増殖の阻害は、各試験群について対照の百分率
に基づいて計算した［処置した（Ｔ）mg/対照（Ｃ）mg
×100を意味する］。T/C値≦42％、群において、≧65％
の生存動物は活性を立証するために必要であると考え
る。
このアッセイにおける結果を表４に要約する。
本発明を次の実施例によってさらに説明する。
実施例１ LL−E33288γ1 Iの３−メルカプトプロピオン酸ジサルフ
ァイド類似体 90mlのアセトニトリル中の90mgのLL−E33288γ1 Iの溶
液に、1mlのアセトニトリル中の10.6mgの３−メルカプ
トプロピオン酸を添加した。この溶液をかきまぜ、次い
で−20℃で６日間貯蔵した。溶媒を真空除去し、そして
残留物を10mlのシリカゲルのクロマトグラフィーに塩化
メチレン中においてかけた。カラムを50mlの塩化メチレ
ン、塩化メチレン中の４％のメタノールの50mlおよび最
後に塩化メチレン中の８％のメタノールの100mlで展開
した。この最後の分画を蒸発させると、残留物が得ら
れ、これを少量のアセトンの助けにより酢酸エチル中に
取り、そして過剰のヘキサン中に滴々添加した。沈澱を
集め、乾燥すると、39mgの所望の生成物が得られた（FA
BMS、Ｍ＋H1394）。C18逆相HPLC上の保持時間:18分、50
％のアセトニトリル/0.1モルの水性塩化アンモニウム。
（LL−E33288γ1 I:8.0分、エステル加水分解生成物:1.5
分） 実施例２ LL−E33288γ1 Iの３−メルカプトプロピオン酸−ｐ−ジ
フェニルエステルとの反応 （Ａ）３−メルカプトプロピオン酸のｐ−ジフェニルエ
ステルの調製 触媒量濃硫酸を含有する塩化メチレン中の商用３−メ
ルカプトピロピオン酸を、イソブチレンで20分間処理し
た。次いでこの溶液を1N重炭酸ナトリウム溶液で抽出
し、その後、塩化メチレン溶液を無水硫酸マグネシウム
で乾燥する。次いでこの溶液を蒸発させると、無色の移
動性液体が得られ、これはNMRおよび質量スペクトルに
よると、ｓ−ｔ−ブチルメルカプトプロピオン、ｔ−ブ
チルエステルであった。
ァイド類似体 90mlのアセトニトリル中の90mgのLL−E33288γ1 Iの溶
液に、1mlのアセトニトリル中の10.6mgの３−メルカプ
トプロピオン酸を添加した。この溶液をかきまぜ、次い
で−20℃で６日間貯蔵した。溶媒を真空除去し、そして
残留物を10mlのシリカゲルのクロマトグラフィーに塩化
メチレン中においてかけた。カラムを50mlの塩化メチレ
ン、塩化メチレン中の４％のメタノールの50mlおよび最
後に塩化メチレン中の８％のメタノールの100mlで展開
した。この最後の分画を蒸発させると、残留物が得ら
れ、これを少量のアセトンの助けにより酢酸エチル中に
取り、そして過剰のヘキサン中に滴々添加した。沈澱を
集め、乾燥すると、39mgの所望の生成物が得られた（FA
BMS、Ｍ＋H1394）。C18逆相HPLC上の保持時間:18分、50
％のアセトニトリル/0.1モルの水性塩化アンモニウム。
（LL−E33288γ1 I:8.0分、エステル加水分解生成物:1.5
分） 実施例２ LL−E33288γ1 Iの３−メルカプトプロピオン酸−ｐ−ジ
フェニルエステルとの反応 （Ａ）３−メルカプトプロピオン酸のｐ−ジフェニルエ
ステルの調製 触媒量濃硫酸を含有する塩化メチレン中の商用３−メ
ルカプトピロピオン酸を、イソブチレンで20分間処理し
た。次いでこの溶液を1N重炭酸ナトリウム溶液で抽出
し、その後、塩化メチレン溶液を無水硫酸マグネシウム
で乾燥する。次いでこの溶液を蒸発させると、無色の移
動性液体が得られ、これはNMRおよび質量スペクトルに
よると、ｓ−ｔ−ブチルメルカプトプロピオン、ｔ−ブ
チルエステルであった。
このエステルのアリコートをジオキサン中の6N塩酸と
ともに2.5時間還流させた。溶媒を蒸発させ、酢酸エチ
ルを添加し、そしてこの溶液を炭酸ナトリウムで抽出し
た。この炭酸ナトリウム抽出液を6N塩酸で、懸濁液のpH
が2.0になるまで、処理した。次いで懸濁液を酢酸エチ
ルで抽出し、抽出液を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、
溶媒を蒸発させると、無色の液体が得られ、その1H NMR
および質量スペクトルのデータはｓ−ｔ−ブチルメルカ
プトプロピオン酸であることを示した。
ともに2.5時間還流させた。溶媒を蒸発させ、酢酸エチ
ルを添加し、そしてこの溶液を炭酸ナトリウムで抽出し
た。この炭酸ナトリウム抽出液を6N塩酸で、懸濁液のpH
が2.0になるまで、処理した。次いで懸濁液を酢酸エチ
ルで抽出し、抽出液を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、
溶媒を蒸発させると、無色の液体が得られ、その1H NMR
および質量スペクトルのデータはｓ−ｔ−ブチルメルカ
プトプロピオン酸であることを示した。
この化合物を等モル量のｐ−ニトロフェノールおよび
ジシクロヘキシルカーボジイミドでテトラヒドロフラン
中において４時間処理することによって、ｐ−ニトロフ
ェノールエステルに転化した。ジシクロヘキシル尿素副
生物を濾過により除去し、そして濾液を蒸発させると、
油が得られ、これを中性シリカゲルに通過させることに
よって精製し、溶媒系ヘキサン：塩化メチレン（50:5
0）で溶離した。純粋なｐ−ニトロフェノールエステル
誘導体は、わずかに黄色の移動性油であった。
ジシクロヘキシルカーボジイミドでテトラヒドロフラン
中において４時間処理することによって、ｐ−ニトロフ
ェノールエステルに転化した。ジシクロヘキシル尿素副
生物を濾過により除去し、そして濾液を蒸発させると、
油が得られ、これを中性シリカゲルに通過させることに
よって精製し、溶媒系ヘキサン：塩化メチレン（50:5
0）で溶離した。純粋なｐ−ニトロフェノールエステル
誘導体は、わずかに黄色の移動性油であった。
遊離のメルカプタンを、次の手順によってアンマスキ
ング（unmask）した。ｓ−ｔ−ブチルメルカプトプロピ
オン酸ｐ−ニトロフェノールエステルをトリフルオロ酢
酸中に溶解し、そしてわずかに過剰量の酢酸第２水銀を
添加した。この混合物を30分間撹拌し、次いでトリフル
オロ酢酸を蒸発させ、そして残留物をジメチルホルムア
ミド中に取った。この溶液を硫化水素ガスで15分間処理
し、次いで黒色の硫化第二水銀を濾過し、そして濾液を
減圧蒸発してジメチルホルムアミドの99％までを排除し
た。得られる褐色がかった移動性液体を中性シリカゲル
で精製し、ヘキサン：塩化メチレン（50:50）で溶離し
た。主要成分は、1H NMRにより、少量のｔ−ブチルメル
カプト誘導体を含有することが示された。並列の２つの
パーキン−エルマーペコスフェアー（Perkin−Elmer Pe
cosphere）［4.6×33mmおよび4.6×83mm］の分析用HPLC
を用い、pH6.5（酢酸）においてアセトニトリルおよび
0.1M酢酸アンモニウム緩衝液の37.5/62.5〜47.5/52.5の
勾配系で12分の間隔で溶離すると、生成物は88％の３−
メルカプトプロピオン酸のｐ−ニトロフェニルエステル
および10％の極性に劣るｓ−ｔ−ゴチルメルカプトプロ
ピオン酸ｐ−ニトロフェニルエステルであった。また、
少量の遊離のｐ−ニトロフェノールが存在した。
ング（unmask）した。ｓ−ｔ−ブチルメルカプトプロピ
オン酸ｐ−ニトロフェノールエステルをトリフルオロ酢
酸中に溶解し、そしてわずかに過剰量の酢酸第２水銀を
添加した。この混合物を30分間撹拌し、次いでトリフル
オロ酢酸を蒸発させ、そして残留物をジメチルホルムア
ミド中に取った。この溶液を硫化水素ガスで15分間処理
し、次いで黒色の硫化第二水銀を濾過し、そして濾液を
減圧蒸発してジメチルホルムアミドの99％までを排除し
た。得られる褐色がかった移動性液体を中性シリカゲル
で精製し、ヘキサン：塩化メチレン（50:50）で溶離し
た。主要成分は、1H NMRにより、少量のｔ−ブチルメル
カプト誘導体を含有することが示された。並列の２つの
パーキン−エルマーペコスフェアー（Perkin−Elmer Pe
cosphere）［4.6×33mmおよび4.6×83mm］の分析用HPLC
を用い、pH6.5（酢酸）においてアセトニトリルおよび
0.1M酢酸アンモニウム緩衝液の37.5/62.5〜47.5/52.5の
勾配系で12分の間隔で溶離すると、生成物は88％の３−
メルカプトプロピオン酸のｐ−ニトロフェニルエステル
および10％の極性に劣るｓ−ｔ−ゴチルメルカプトプロ
ピオン酸ｐ−ニトロフェニルエステルであった。また、
少量の遊離のｐ−ニトロフェノールが存在した。
（Ｂ）３−メルカプトプロピオン酸のｐ−ニトロフェニ
ルエステルとLL−E33288γ1 Iとの反応 LL−E33288γ1 Iの100mgの部分を50mgのアセトニトリ
ル中に溶解した。これに、1mlのアセトニトリル中の25.
7mgの３−メルカプトプロピオン酸のｐ−ニトロフェニ
ルエステルの溶液を添加した。この反応を−20℃で48時
間放置した。HPLCは反応が完結したことを示した。この
溶液を蒸発乾固し、そして残留物を４〜5mlの酢酸エチ
ル中に取り、超音波を使用して溶解を実施した。この混
合物を濾過し、そして濾液を45mlの撹拌したヘキサン中
に滴々入れた。得られたわずかに黄色の固体を集め、そ
して減圧下に乾燥すると、93mgのLL−E33288γ2 Iのプロ
ピオン酸誘導体のｐ−ニトロフェニルエステルが得ら
れ、これは1H NMRによって確立された。FABMSにより、
［Ｍ＋Ｈ］イオンはM/Z＝1515に現れた。
ルエステルとLL−E33288γ1 Iとの反応 LL−E33288γ1 Iの100mgの部分を50mgのアセトニトリ
ル中に溶解した。これに、1mlのアセトニトリル中の25.
7mgの３−メルカプトプロピオン酸のｐ−ニトロフェニ
ルエステルの溶液を添加した。この反応を−20℃で48時
間放置した。HPLCは反応が完結したことを示した。この
溶液を蒸発乾固し、そして残留物を４〜5mlの酢酸エチ
ル中に取り、超音波を使用して溶解を実施した。この混
合物を濾過し、そして濾液を45mlの撹拌したヘキサン中
に滴々入れた。得られたわずかに黄色の固体を集め、そ
して減圧下に乾燥すると、93mgのLL−E33288γ2 Iのプロ
ピオン酸誘導体のｐ−ニトロフェニルエステルが得ら
れ、これは1H NMRによって確立された。FABMSにより、
［Ｍ＋Ｈ］イオンはM/Z＝1515に現れた。
実施例３ LL−E33288γ1 IのＮ−ヒドロキシスクシンイミジニル３
−メルカプトプロピオネートジサルファイド 0.5mlのテトラヒドロフラン中の実施例１からの5mgの
LL−E33288γ1 Iの３−メルカプトプロピオン酸ジサルフ
ァイド類似体の溶液に、0.1mlのテトラヒドロフラン中
の0.45mgのＮ−ヒドロキシスクシンイミドを添加し、次
いでこの反応混合物を室温において４時間撹拌し、次い
で大過剰のヘキサンで急冷した。固体を濾過により分離
し、そして酢酸エチル中に溶解した。生ずる溶液をブラ
インで３回洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、そして
5mgの所望生成物が黄褐色粉末として得られ、これをそ
れ以上精製しないで使用した。C18逆相HPLC上の保持時
間:15分、40％のアセトニトリル/0.1モルの水性塩化ア
ンモニウム。（出発物質:6.0分）。
−メルカプトプロピオネートジサルファイド 0.5mlのテトラヒドロフラン中の実施例１からの5mgの
LL−E33288γ1 Iの３−メルカプトプロピオン酸ジサルフ
ァイド類似体の溶液に、0.1mlのテトラヒドロフラン中
の0.45mgのＮ−ヒドロキシスクシンイミドを添加し、次
いでこの反応混合物を室温において４時間撹拌し、次い
で大過剰のヘキサンで急冷した。固体を濾過により分離
し、そして酢酸エチル中に溶解した。生ずる溶液をブラ
インで３回洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、そして
5mgの所望生成物が黄褐色粉末として得られ、これをそ
れ以上精製しないで使用した。C18逆相HPLC上の保持時
間:15分、40％のアセトニトリル/0.1モルの水性塩化ア
ンモニウム。（出発物質:6.0分）。
実施例４ LL−E33288γ1 Iの３−メルカプトプロピオニルヒドラジ
ドジサルファイド類似体 アルゴンの下で100mlの還流するテトラヒドロフラン
中の5.4ml（３当量）の無水ヒドラジンに、50mlのテト
ラヒドロフラン中の9.2ml（83ミリモル）のメチル３−
メルカプトプロピオネートを２時間かけて滴々添加し
た。この溶液をさらに２時間撹拌し、蒸発し、次いで30
0mlのトルエンから２回希釈および蒸発した。生成物を
シリカゲルのプラグに５％の酢酸エチル／クロロホルム
で適用し、そしてプラグから20％のメタノール／クロロ
ホルムで溶離した。得られる３−メルカプトプロピオニ
ルヒドラジドはわずかにピンク色の油であり、これは冷
却すると固化するが、室温において溶融した。
ドジサルファイド類似体 アルゴンの下で100mlの還流するテトラヒドロフラン
中の5.4ml（３当量）の無水ヒドラジンに、50mlのテト
ラヒドロフラン中の9.2ml（83ミリモル）のメチル３−
メルカプトプロピオネートを２時間かけて滴々添加し
た。この溶液をさらに２時間撹拌し、蒸発し、次いで30
0mlのトルエンから２回希釈および蒸発した。生成物を
シリカゲルのプラグに５％の酢酸エチル／クロロホルム
で適用し、そしてプラグから20％のメタノール／クロロ
ホルムで溶離した。得られる３−メルカプトプロピオニ
ルヒドラジドはわずかにピンク色の油であり、これは冷
却すると固化するが、室温において溶融した。
−15℃において50mlのアセトニトリル中の50mgのLL−
E33288γ1 Iに、1mlのテトラヒドロフラン中の6.6mgの３
−メルカプトプロピオニルヒドラジドを添加した。１当
量のトリエチルアミンおよび／または１当量の酢酸を触
媒として添加した。この反応を０℃において１時間撹拌
し、次いで溶媒を蒸発させた。残留物をシリカゲルのク
ロマトグラフィーにかけ、クロロホルム中の10−15％の
メタノールで溶離して、逆相C18HPLC上の保持時間:41％
のアセトニトリル/0.1モルの塩化アンモニウム中におい
て5.0分。
E33288γ1 Iに、1mlのテトラヒドロフラン中の6.6mgの３
−メルカプトプロピオニルヒドラジドを添加した。１当
量のトリエチルアミンおよび／または１当量の酢酸を触
媒として添加した。この反応を０℃において１時間撹拌
し、次いで溶媒を蒸発させた。残留物をシリカゲルのク
ロマトグラフィーにかけ、クロロホルム中の10−15％の
メタノールで溶離して、逆相C18HPLC上の保持時間:41％
のアセトニトリル/0.1モルの塩化アンモニウム中におい
て5.0分。
実施例５ LL−E33288γ1 IのＮ−［［（４−メチル−クマリン−７
−イル）アミノ］アセチル］システインヒドラジドジサ
ルファイド類似体 1.0g（5.7ミリモル）の４−メチル−７−アミノクマ
リン、3.0mlのエチルブロモアセテート（５当量）、90
μｇ（0.1当量）のヨウ化ナトリウム、および30mlのジ
メチルホルムアミドの混合物をアルゴン下に80℃で５時
間加熱した。この混合物を冷却し、エチルエーテルで希
釈し、50％ブラインで３回洗浄し、硫酸マグネシウムで
乾燥し、そして蒸発乾固した。粗製生成物を１％の酢酸
エチルを含有するクロロホルム中に溶解し、そしてシリ
カゲルのプラグで濾過した。微量のクロロホルムを含有
するジエチルエーテルから再結晶化すると、純粋なエチ
ル［（４−メチルクマリン−７−イル）アミノ］アセテ
ートが得られた。
−イル）アミノ］アセチル］システインヒドラジドジサ
ルファイド類似体 1.0g（5.7ミリモル）の４−メチル−７−アミノクマ
リン、3.0mlのエチルブロモアセテート（５当量）、90
μｇ（0.1当量）のヨウ化ナトリウム、および30mlのジ
メチルホルムアミドの混合物をアルゴン下に80℃で５時
間加熱した。この混合物を冷却し、エチルエーテルで希
釈し、50％ブラインで３回洗浄し、硫酸マグネシウムで
乾燥し、そして蒸発乾固した。粗製生成物を１％の酢酸
エチルを含有するクロロホルム中に溶解し、そしてシリ
カゲルのプラグで濾過した。微量のクロロホルムを含有
するジエチルエーテルから再結晶化すると、純粋なエチ
ル［（４−メチルクマリン−７−イル）アミノ］アセテ
ートが得られた。
15mlのメタノールおよび15mlのテトラヒドロフラン中
の1.96g（7.5ミリモル）の上のエステルに、10mlの1N水
性水酸化ナトリウムを添加した。30分後、4mlの10％の
水性塩酸を添加した。有機溶媒を蒸発させ、得られる結
晶質生成物を濾過し、冷エタノールで洗浄し、次いでエ
ーテルで洗浄した。この物質を20mlのテトラヒドロフラ
ンおよび4mlのジメチルホルムアミド中に溶解した。ジ
シクロヘキシルカルボニルジイミダゾール（1.3g、2.2
当量）を添加し、そして反応混合物を15分間撹拌した。
次いで、システインエチルエステル塩酸塩（1.6g、2.5
当量）およびトリエチルアミン（1.2ml）を添加した。
さらに４時間後、反応を５％の塩化メチレンを含有する
エチルエーテルで希釈し、そして10％の水性塩酸で１
回、そしてブラインで２回洗浄した。硫酸マグネシウム
で乾燥し、そして溶媒を蒸発させた後、粗製生成物を少
量のエタノールを含有するクロロホルム中に溶解し、次
いで過剰のエーテルを添加することによって結晶化し
た。結晶を濾過し、そして乾燥すると、Ｎ−［［（４−
メチル−クマリン−７−イル）アミノ］アセチル］シス
テインエチルエステルが得られた。
の1.96g（7.5ミリモル）の上のエステルに、10mlの1N水
性水酸化ナトリウムを添加した。30分後、4mlの10％の
水性塩酸を添加した。有機溶媒を蒸発させ、得られる結
晶質生成物を濾過し、冷エタノールで洗浄し、次いでエ
ーテルで洗浄した。この物質を20mlのテトラヒドロフラ
ンおよび4mlのジメチルホルムアミド中に溶解した。ジ
シクロヘキシルカルボニルジイミダゾール（1.3g、2.2
当量）を添加し、そして反応混合物を15分間撹拌した。
次いで、システインエチルエステル塩酸塩（1.6g、2.5
当量）およびトリエチルアミン（1.2ml）を添加した。
さらに４時間後、反応を５％の塩化メチレンを含有する
エチルエーテルで希釈し、そして10％の水性塩酸で１
回、そしてブラインで２回洗浄した。硫酸マグネシウム
で乾燥し、そして溶媒を蒸発させた後、粗製生成物を少
量のエタノールを含有するクロロホルム中に溶解し、次
いで過剰のエーテルを添加することによって結晶化し
た。結晶を濾過し、そして乾燥すると、Ｎ−［［（４−
メチル−クマリン−７−イル）アミノ］アセチル］シス
テインエチルエステルが得られた。
5mlのクロロホルム、20mlのメタノール、および0.4ml
のヒドラジン水和物の混合物を、アルゴン下に還流加熱
した。これに、550mgのＮ−［［（４−メチル−クマリ
ン−７−イル）アミノ］アセチル］システインエチルエ
ステルを添加した。９時間還流した後、混合物を冷却
し、固体の生成物を濾過し、そしてクロロホルムで、次
いでエチルエーテルで洗浄した。粗製生成物（これはチ
オールおよびジサルファイドを含有する）、ジチオスレ
イトールおよびゴリエチルアミンを含有するジメチルホ
ルムアミド中に溶解した。30分後、生成物を過剰のエチ
ルエーテルで沈澱させ、そして濾過により集めた。この
物質を、さらに、脱気したジチオスレイトールおよび微
量のトリエチルアミンを含有するアセトニトリルから再
結晶化して、純粋なＮ−［［（４−メチル−クマリン−
７−イル）アミノ］アセチル］システインヒドラジドが
得られた。
のヒドラジン水和物の混合物を、アルゴン下に還流加熱
した。これに、550mgのＮ−［［（４−メチル−クマリ
ン−７−イル）アミノ］アセチル］システインエチルエ
ステルを添加した。９時間還流した後、混合物を冷却
し、固体の生成物を濾過し、そしてクロロホルムで、次
いでエチルエーテルで洗浄した。粗製生成物（これはチ
オールおよびジサルファイドを含有する）、ジチオスレ
イトールおよびゴリエチルアミンを含有するジメチルホ
ルムアミド中に溶解した。30分後、生成物を過剰のエチ
ルエーテルで沈澱させ、そして濾過により集めた。この
物質を、さらに、脱気したジチオスレイトールおよび微
量のトリエチルアミンを含有するアセトニトリルから再
結晶化して、純粋なＮ−［［（４−メチル−クマリン−
７−イル）アミノ］アセチル］システインヒドラジドが
得られた。
０℃において12mlのアセトニトリル中に12mgの70％の
純度のLL−E33288γ1 Iに、1.2mlのジメチルホルムアミ
ド中の4mgのＮ−［［（４−メチル−クマリン−７−イ
ル）アミノ］アセチル］システインヒドラジドを添加し
た。一夜撹拌した後、さらに0.6mlのジメチルホルムア
ミド中の2mgのＮ−［［（４−メチル−クマリン−７−
イル）アミノ］アセチル］システインヒドラジド添加し
た。この反応混合物を０℃において３日間撹拌し、そし
て濾過した。アセトニトリルを蒸発し、そして得られた
ジメチルホルムアミド溶液を過剰の1:1ヘキサン／エー
テルで希釈した。生成物を濾過により単離し、そしてさ
らにシリカゲルのクロマトグラフィーにより精製し、ク
ロロホルム中のメタノールの15−20％の勾配で溶離し
て、3mgの所望生成物を得た。逆相C18HPLC上の保持時
間:45％のアセトニトリル/0.1モルの水性塩化アンモニ
ウムを使用して3.5分。
純度のLL−E33288γ1 Iに、1.2mlのジメチルホルムアミ
ド中の4mgのＮ−［［（４−メチル−クマリン−７−イ
ル）アミノ］アセチル］システインヒドラジドを添加し
た。一夜撹拌した後、さらに0.6mlのジメチルホルムア
ミド中の2mgのＮ−［［（４−メチル−クマリン−７−
イル）アミノ］アセチル］システインヒドラジド添加し
た。この反応混合物を０℃において３日間撹拌し、そし
て濾過した。アセトニトリルを蒸発し、そして得られた
ジメチルホルムアミド溶液を過剰の1:1ヘキサン／エー
テルで希釈した。生成物を濾過により単離し、そしてさ
らにシリカゲルのクロマトグラフィーにより精製し、ク
ロロホルム中のメタノールの15−20％の勾配で溶離し
て、3mgの所望生成物を得た。逆相C18HPLC上の保持時
間:45％のアセトニトリル/0.1モルの水性塩化アンモニ
ウムを使用して3.5分。
実施例６ LL−E33288α3 Iの３−メルカプトプロピオニルヒドラジ
ドジサルファイド類似体 −15℃においてmlのアセトニトリル中の10mgのLL−E3
3288α3 Iに、1mlのアセトニトリル中の6.6mgの３−メル
カプトプロピオニルヒドラジドを添加した。１当量のト
リエチルアミンおよび／または１当量の酢酸を触媒とし
て添加した。この反応混合物を０℃において１時間撹拌
し、次いで溶媒を蒸発した。残留物をシリカゲルのクロ
マトグラフィーにかけ、クロロホルム中の10−15％のメ
タノールの勾配で溶離して所望生成物を得た。逆相C18H
PLC上の保持時間:45％のアセトニトリル/10.1モルの水
性塩化アンモニウムの系中において3.5分。
ドジサルファイド類似体 −15℃においてmlのアセトニトリル中の10mgのLL−E3
3288α3 Iに、1mlのアセトニトリル中の6.6mgの３−メル
カプトプロピオニルヒドラジドを添加した。１当量のト
リエチルアミンおよび／または１当量の酢酸を触媒とし
て添加した。この反応混合物を０℃において１時間撹拌
し、次いで溶媒を蒸発した。残留物をシリカゲルのクロ
マトグラフィーにかけ、クロロホルム中の10−15％のメ
タノールの勾配で溶離して所望生成物を得た。逆相C18H
PLC上の保持時間:45％のアセトニトリル/10.1モルの水
性塩化アンモニウムの系中において3.5分。
実施例７ タンパク質への非特異的接合 実施例３に記載するヒドロキシスクシンイミドエステ
ルを、わずかにアルカリ性条件下に、抗体に共有結合し
た。次に表５に記載する抗体接合体をつくるために使用
した一般手順である。抗体は、0.1モルの塩化ナトリウ
ムを含有するリン酸塩緩衝液、pH7.5、中において３〜5
mg/mlの濃度において、５〜20倍のモル過剰量の実施例
３からの生成物と撹拌しながら、室温において１〜４時
間反応させた。接合したタンパク質をクロマトグラフィ
ー的に脱塩し、そして凝集したタンパク質をモノマーの
物質から濾過HPLCによって分離した。モノマーの分画を
プールし、そして濃縮した。
ルを、わずかにアルカリ性条件下に、抗体に共有結合し
た。次に表５に記載する抗体接合体をつくるために使用
した一般手順である。抗体は、0.1モルの塩化ナトリウ
ムを含有するリン酸塩緩衝液、pH7.5、中において３〜5
mg/mlの濃度において、５〜20倍のモル過剰量の実施例
３からの生成物と撹拌しながら、室温において１〜４時
間反応させた。接合したタンパク質をクロマトグラフィ
ー的に脱塩し、そして凝集したタンパク質をモノマーの
物質から濾過HPLCによって分離した。モノマーの分画を
プールし、そして濃縮した。
実施例７ タンパク質への特異的接合 薬物のヒドラジン誘導体を酸化した抗体に結合するた
めの一般的方法は、T.J.マクカーン（McKearn）ら、米
国特許第4,671,958号に記載されている。この手順は、
実施例４および５の生成物から抗体接合体を、下に記載
するように特別の変更を用いて、調製するために適用し
た。これらの反応からの生成物およびそれらの特性を、
表６に要約する。
めの一般的方法は、T.J.マクカーン（McKearn）ら、米
国特許第4,671,958号に記載されている。この手順は、
実施例４および５の生成物から抗体接合体を、下に記載
するように特別の変更を用いて、調製するために適用し
た。これらの反応からの生成物およびそれらの特性を、
表６に要約する。
（Ａ）抗体の酸化 ５〜10mg/mlの濃度において抗体を、0.1モルの塩化ナ
トリウムを含有する50ミリモルの酢酸ナトリウム緩衝
液、pH5.5、の200倍の体積に対して一夜透析した。透析
後、MoAbを0.2モルの酢酸ナトリウム中の15ミリモル〜2
00モリモルの過ヨウ素酸で酸化した。この酸化を暗所
で、撹拌しながら、４℃において45分間進行させ、その
後酸化したMoAbを≧５床体積のセファデックス（Sephad
ex）Ｇ−25カラムで脱塩した。抗体の酸化の過程は、ｐ
−ニトロフェニルヒドラジンとの反応および280mmにお
けるタンパク質の吸収対395mmにおける吸収の吸収の比
較によって、評価した。
トリウムを含有する50ミリモルの酢酸ナトリウム緩衝
液、pH5.5、の200倍の体積に対して一夜透析した。透析
後、MoAbを0.2モルの酢酸ナトリウム中の15ミリモル〜2
00モリモルの過ヨウ素酸で酸化した。この酸化を暗所
で、撹拌しながら、４℃において45分間進行させ、その
後酸化したMoAbを≧５床体積のセファデックス（Sephad
ex）Ｇ−25カラムで脱塩した。抗体の酸化の過程は、ｐ
−ニトロフェニルヒドラジンとの反応および280mmにお
けるタンパク質の吸収対395mmにおける吸収の吸収の比
較によって、評価した。
（Ｂ）薬物ヒドラジド接合 酸化したMoAbを25〜200倍モル過剰量の薬物ヒドラジ
ドと反応させた。ヒドラジドをジメチルホルムアミド中
に溶解し、そしてMoAbの水溶液に添加した。MoAbの沈澱
を回避するために、ジメチルホルムアミドの最終体積は
合計の反応体積の10％を越えなかった。反応を室温にお
いて３時間、撹拌しながら、進行させた。未反応のアル
デヒドの架橋および引き続く凝集を防止するため、遮断
剤のアセチルヒドラジドを薬物ヒドラジドの添加後３時
間に100倍モル過剰量で添加した。アルデヒドおよび薬
物ヒドラジドの間のシッフ塩基（ヒドラゾン）を安定化
するため、生成物は、一般に、10ミリモルのシアノホウ
水素化ナトリウムを添加し、反応をさらに１時間進行さ
せることによって、アルキルヒドラジンに還元した（合
計の接合時間−４時間）。接合体をクロマトグラフィー
的に脱塩し、そして貯蔵および試験のため、pH6.5のリ
ン酸塩緩衝中に吸尽的に透析した（最小48時間）。
ドと反応させた。ヒドラジドをジメチルホルムアミド中
に溶解し、そしてMoAbの水溶液に添加した。MoAbの沈澱
を回避するために、ジメチルホルムアミドの最終体積は
合計の反応体積の10％を越えなかった。反応を室温にお
いて３時間、撹拌しながら、進行させた。未反応のアル
デヒドの架橋および引き続く凝集を防止するため、遮断
剤のアセチルヒドラジドを薬物ヒドラジドの添加後３時
間に100倍モル過剰量で添加した。アルデヒドおよび薬
物ヒドラジドの間のシッフ塩基（ヒドラゾン）を安定化
するため、生成物は、一般に、10ミリモルのシアノホウ
水素化ナトリウムを添加し、反応をさらに１時間進行さ
せることによって、アルキルヒドラジンに還元した（合
計の接合時間−４時間）。接合体をクロマトグラフィー
的に脱塩し、そして貯蔵および試験のため、pH6.5のリ
ン酸塩緩衝中に吸尽的に透析した（最小48時間）。
接合体は、ゲル濾過HPLCによる凝集物の存在および逆
相HPLCによる遊離薬物について、分析した。薬物の配合
量は、抗体および薬物の両者の吸光係数を使用して、接
合体中の薬物のモル濃度を推定することによって決定し
た。
相HPLCによる遊離薬物について、分析した。薬物の配合
量は、抗体および薬物の両者の吸光係数を使用して、接
合体中の薬物のモル濃度を推定することによって決定し
た。
実施例５の生成物から調製したヒドラジド接合体 Lym1 ＃１ 0.15 ＃２ 0.76 本発明の主な特徴及び態様は以下の通りである。
１、式 を有し、式CH3SSS−Ｗの化合物から調製され、ここでCH
3SSS−ＷはLL−E33288α1 Br、α1 I、2 Br、α2 I、
α3 Br、α3 I、α4 Br、α4 I、β1 Br、β1 I、β2 I、
β2 Br、γ1 Br、γ1 I、δ1 I、BBm−1675、FR−900405、F
R−900406、PD114759、PD115028、CL−1577A、CL−1577
B、CL−1577D、CL−1577E、またはCL−1724と表示され
る抗腫瘍抗生物質であり、 前記調製の方法は、CH3SSS−Ｗを一般式Ｑ−Sp−SH
（式中、Spは直鎖状もしくは分枝鎖状の二価の（C1−C
18）基、二価のアリールまたはヘテロアリール基、二価
の（C3−C18）シクロアルキルまたはヘテロシクロアル
キル基、二価のアリールまたはヘテロアリール−アルキ
ル（C1−C18）基、二価のシクロアルキルアルキルまた
はヘテロシクロアルキル−アルキル（C1−C18）基、ま
たは二価の（C2−C18）不飽和アルキル基であり、Ｑは
ハロゲン、アミノ、アルキルアミノ、カルボキシル、カ
ルボキシアルデヒド、ヒドロキシ、チオール、α−ハロ
アセチルオキシ、低級アルキルジカルボキシル、−CONH
NH2、−NHCONHNH2、−NHCSNHNH2、−ONH2、−CON3、 であるか、あるいは引き続いてそれらに転化できる）の
化合物と反応させて、式Ｑ−Sp−SS−Ｗ（式中、Ｑ、Sp
およびＷは上に定義したとおりである）の中間体を生成
し、 Ｑ−Sp−SS−Ｗを式Tu−（Ｙ）ｎ（式中、Tuはモノク
ローナル抗体、ポリクローナル抗体、その断片、その化
学的または遺伝子的に操作された相手、成長因子、また
はステロイドであり、Ｙはタンパク質の側鎖のアミノ、
カルボキシ、またはチオール基、炭水化物残基から誘導
されたアルデヒド、またはアミドアルキルチオ基であ
り、そしてｎは１〜100の整数である）と反応させて、
式 （式中、Tu、Ｙ、Sp、Ｗおよびｎは上に定義したとおり
であり、そしてＺはＱおよびＹの共有反応から、直接あ
るいは還元後、形成され、そしてＺは−CONH−、−CONH
N＝CH−、−CONHNHCH2−、−NHCONHN＝CH−、−NHCONHN
HCH2−、−NHCSNHN＝CH−、−NHCSNHNHCH2−、−ON＝CH
−、−NH−、−NHCH2−、−Ｎ＝CH−、−CO2−、−NHCH
2CO2−、−SS−、 または であり、そしてｍは0.1〜15である）の化合物を生成す
ることからなる、ことを特徴とする、薬物複合体または
その混合物。
3SSS−ＷはLL−E33288α1 Br、α1 I、2 Br、α2 I、
α3 Br、α3 I、α4 Br、α4 I、β1 Br、β1 I、β2 I、
β2 Br、γ1 Br、γ1 I、δ1 I、BBm−1675、FR−900405、F
R−900406、PD114759、PD115028、CL−1577A、CL−1577
B、CL−1577D、CL−1577E、またはCL−1724と表示され
る抗腫瘍抗生物質であり、 前記調製の方法は、CH3SSS−Ｗを一般式Ｑ−Sp−SH
（式中、Spは直鎖状もしくは分枝鎖状の二価の（C1−C
18）基、二価のアリールまたはヘテロアリール基、二価
の（C3−C18）シクロアルキルまたはヘテロシクロアル
キル基、二価のアリールまたはヘテロアリール−アルキ
ル（C1−C18）基、二価のシクロアルキルアルキルまた
はヘテロシクロアルキル−アルキル（C1−C18）基、ま
たは二価の（C2−C18）不飽和アルキル基であり、Ｑは
ハロゲン、アミノ、アルキルアミノ、カルボキシル、カ
ルボキシアルデヒド、ヒドロキシ、チオール、α−ハロ
アセチルオキシ、低級アルキルジカルボキシル、−CONH
NH2、−NHCONHNH2、−NHCSNHNH2、−ONH2、−CON3、 であるか、あるいは引き続いてそれらに転化できる）の
化合物と反応させて、式Ｑ−Sp−SS−Ｗ（式中、Ｑ、Sp
およびＷは上に定義したとおりである）の中間体を生成
し、 Ｑ−Sp−SS−Ｗを式Tu−（Ｙ）ｎ（式中、Tuはモノク
ローナル抗体、ポリクローナル抗体、その断片、その化
学的または遺伝子的に操作された相手、成長因子、また
はステロイドであり、Ｙはタンパク質の側鎖のアミノ、
カルボキシ、またはチオール基、炭水化物残基から誘導
されたアルデヒド、またはアミドアルキルチオ基であ
り、そしてｎは１〜100の整数である）と反応させて、
式 （式中、Tu、Ｙ、Sp、Ｗおよびｎは上に定義したとおり
であり、そしてＺはＱおよびＹの共有反応から、直接あ
るいは還元後、形成され、そしてＺは−CONH−、−CONH
N＝CH−、−CONHNHCH2−、−NHCONHN＝CH−、−NHCONHN
HCH2−、−NHCSNHN＝CH−、−NHCSNHNHCH2−、−ON＝CH
−、−NH−、−NHCH2−、−Ｎ＝CH−、−CO2−、−NHCH
2CO2−、−SS−、 または であり、そしてｍは0.1〜15である）の化合物を生成す
ることからなる、ことを特徴とする、薬物複合体または
その混合物。
２、式 を有し、LL−E33288γ1 I（CH3SSS−Ｗ）と表示する抗腫
瘍抗生物質から調製され、 ａ）第１図に示す紫外線スペクトル、 ｂ）第２図に示すプロトン磁気共鳴スペクトル、および ｃ）第３図に示す赤外スペクトル、 を有し、 前記調製の方法は、ジチオメチル部分を、式Ｑ−Sp−
SH（式中、Spは直鎖状もしくは分枝鎖状の二価の（C2−
C5）基または二価のアリールまたはヘテロアリールアル
キル（C2−C5）基であり、そしてＱはカルボキシル、低
級アルキルジカルボキシル無水物、−CONHNH2、または であるか、あるいは引き続いてそれらに転化できる）の
化合物と置換して、式Ｑ−Sp−SS−Ｗ（式中、Ｑ、Spお
よびＷは上に定義したとおりである）の中間体を生成
し、 Ｑ−Sp−SS−Ｗを式Tu−（Ｙ）ｎ（式中、Tuはヒト腫
瘍関連抗原との優先的反応性を示すモノクローナル抗体
であり、Ｙは抗体上の側鎖のアミノ基、または抗体の炭
水化物基の酸化によって発生したアルデヒドであり、そ
してｎは１〜100の整数である）の分子と反応させて、
式 （式中、Tu、Ｙ、Sp、Ｗおよびｎは上に定義したとおり
であり、そしてＺはＱおよびＹの共有反応から、直接あ
るいは還元後、形成され、そしてＺは−CONH−、−CONH
N＝CH−、−CONHNHCH2−、または であり、そしてｍは0.1〜15である）の化合物を生成す
ることからなる、ことを特徴とする、タンパク質−薬物
複合体またはその混合物。
瘍抗生物質から調製され、 ａ）第１図に示す紫外線スペクトル、 ｂ）第２図に示すプロトン磁気共鳴スペクトル、および ｃ）第３図に示す赤外スペクトル、 を有し、 前記調製の方法は、ジチオメチル部分を、式Ｑ−Sp−
SH（式中、Spは直鎖状もしくは分枝鎖状の二価の（C2−
C5）基または二価のアリールまたはヘテロアリールアル
キル（C2−C5）基であり、そしてＱはカルボキシル、低
級アルキルジカルボキシル無水物、−CONHNH2、または であるか、あるいは引き続いてそれらに転化できる）の
化合物と置換して、式Ｑ−Sp−SS−Ｗ（式中、Ｑ、Spお
よびＷは上に定義したとおりである）の中間体を生成
し、 Ｑ−Sp−SS−Ｗを式Tu−（Ｙ）ｎ（式中、Tuはヒト腫
瘍関連抗原との優先的反応性を示すモノクローナル抗体
であり、Ｙは抗体上の側鎖のアミノ基、または抗体の炭
水化物基の酸化によって発生したアルデヒドであり、そ
してｎは１〜100の整数である）の分子と反応させて、
式 （式中、Tu、Ｙ、Sp、Ｗおよびｎは上に定義したとおり
であり、そしてＺはＱおよびＹの共有反応から、直接あ
るいは還元後、形成され、そしてＺは−CONH−、−CONH
N＝CH−、−CONHNHCH2−、または であり、そしてｍは0.1〜15である）の化合物を生成す
ることからなる、ことを特徴とする、タンパク質−薬物
複合体またはその混合物。
３、CH3SSSWはLL−E33288γ1 Iであり、Ｑはカルボキシ
ル基の４−ニトロフェニルエステルであり、Spは−CH2C
H2−であり、Tuはモノクローナル抗体CT−Ｍ−01であ
り、Ｙは−NH2であり、Ｚは−CONH−であり、そしてｍ
は0.5〜15である特許請求の範囲第１項記載の複合体ま
たはその混合物。
ル基の４−ニトロフェニルエステルであり、Spは−CH2C
H2−であり、Tuはモノクローナル抗体CT−Ｍ−01であ
り、Ｙは−NH2であり、Ｚは−CONH−であり、そしてｍ
は0.5〜15である特許請求の範囲第１項記載の複合体ま
たはその混合物。
４、CH3SSSWはLL−E33288γ1 Iであり、Ｑはカルボキ
シル基のヒドロキシスクシンイミドエステルであり、Sp
は−CH2CH2−であり、Tuはモノクローナル抗体MAC−68
であり、Ｙは−NH2であり、Ｚは−CONH−であり、そし
てｍは0.5〜15である特許請求の範囲第１項記載の複合
体またはその化合物。
シル基のヒドロキシスクシンイミドエステルであり、Sp
は−CH2CH2−であり、Tuはモノクローナル抗体MAC−68
であり、Ｙは−NH2であり、Ｚは−CONH−であり、そし
てｍは0.5〜15である特許請求の範囲第１項記載の複合
体またはその化合物。
５、CH3SSSWはLL−E33288γ1 Iであり、Ｑは−CONHN2で
あり、Spは−CH2CH2−であり、Tuはモノクローナル抗体
Lym1であり、Ｙは−CHOであり、Ｚは−CONHNHCH2−であ
り、そしてｍは0.1〜10である特許請求の範囲第１項記
載の複合体またはその混合物。
あり、Spは−CH2CH2−であり、Tuはモノクローナル抗体
Lym1であり、Ｙは−CHOであり、Ｚは−CONHNHCH2−であ
り、そしてｍは0.1〜10である特許請求の範囲第１項記
載の複合体またはその混合物。
６、CH3SSSWはLL−E33288γ1 Iであり、Spは であり、Tuはモノクローナル抗体B72.3であり、Ｙは−C
HOであり、Ｚは−CONHNHCH2−であり、そしてｍは0.1〜
10である特許請求の範囲第１項記載の複合体またはその
混合物。
HOであり、Ｚは−CONHNHCH2−であり、そしてｍは0.1〜
10である特許請求の範囲第１項記載の複合体またはその
混合物。
７、CH3SSSWはLL−E33288γ1 Iであり、Spは であり、Tuはモノクローナル抗体Lym2であり、Ｙは−CH
Oであり、Ｚは−CONHNHCH2−であり、そしてｍは0.1〜1
0である特許請求の範囲第１項記載の複合体またはその
混合物。
Oであり、Ｚは−CONHNHCH2−であり、そしてｍは0.1〜1
0である特許請求の範囲第１項記載の複合体またはその
混合物。
８、式CH3SSS-Wの化合物はターゲテッド誘導体またはそ
の混合物 を調製する方法であって、ここでCH3SSS−ＷはLL−E332
88α1 Br、α1 I、α2 Br、α2 I、α3 Br、α3 I、α4 Br、β
1 Br、β1 I、β2 I、β2 Br、γ1 Br、γ1 I、δ1 I、BBm−16
75、FR−900405、FR−900406、PD114759、PD115028、CL
−1577A、CL−1577B、CL−1577D、CL−1577E、またはCL
−1724であり、 前記調製の方法は、CH3SSS−Ｗを式Ｑ−Sp−SH（式
中、Spは直鎖状もしくは分枝鎖状の二価の（C1−C18）
基、二価のアリールまたはヘテロアリール基、二価の
（C3−C18）シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキ
ル基、二価のアリールまたはヘテロアリール−アルキル
（C1−C18）基、二価のシクロアルキルアルキルまたは
ヘテロシクロアルキル−アルキル（C1−C18）基、また
は二価の（C2−C18）不飽和アルキル基であり、Ｑはハ
ロゲン、アミノ、アルキルアミノ、カルボキシル、カル
ボキシルアルデヒド、ヒドロキシ、低級アルキルジカル
ボキシル無水物、−CONHNH2、−NHCONHNH2、−NHCSNHNH
2、−ONH2、または である）の化合物と、１当量のトリエチルアミンの存在
下におよび／または１当量の酢酸の存在下に−10℃〜−
30℃において１〜48時間反応させ、 式Ｑ−Sp−SS−Ｗ（式中、Ｑ、SpおよびＷは上に定義
したとおりである）の中間体を単離し、 式Ｑ−Sp−SS−Ｗ（式中、SpおよびＷは上に定義した
とおりであり、そしてＱはハロゲン、アミノ、アルキル
アミノ、カルボキシル、カルボキシアルデヒド、ヒドロ
キシ、または低級アルキルジカルボン酸無水物である）
の化合物を式Tu−（Ｙ）ｎ（式中、Tuはモノクローナル
抗体、ポリクローナル抗体、その断片、その化学的また
は遺伝子的に操作された相手、成長因子、またはステロ
イドであり、Ｙはタンパク質の側鎖のアミノまたはカル
ボキシ官能性であり、そしてｎは１〜100である）と、
水性緩衝液中でpH6.5〜９において４℃〜40℃におい
て、直接あるいは水溶性カーボジイミドの存在下に反応
させて、式 （式中、Tu、Sp、Ｗ、ｎおよびＹは上に定義したとおり
であり、ｍは１〜15であり、そしてＺはＱおよびＹの共
有反応から形成され、そして−CONH−、−NH−、 −Ｎ＝CH−または−CO2−である）の化合物を生成する
か、あるいは 式Ｑ−Sp−SS−Ｗ（式中、SpおよびＷは上に定義した
とおりであり、そしてＱはカルボン酸である）の化合物
を、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、２、3,5,6−テト
ラフルオロフェノール、ペンタフルオロフェノール、ま
たは４−ニトロフェノールと、カルボキシル活性化剤、
例えば、カーボジイミドの存在下に反応させて、式Ｑ−
Sp−SS−Ｗ（式中、SpおよびＷは上に定義したとおりで
あり、そしてＱは または である）の化合物を生成し、この化合物を式Tu−（Ｙ）
ｎ（式中、Tuおよびｎは上に定義したとおりであり、そ
してＹは側鎖のアミノ基である）の分子と、水性緩衝液
中でpH6.5〜９において４℃〜40℃の温度において、直
接あるいは水溶性カーボジイミドの存在下に反応させ
て、式 （式中、Tu、Sp、Ｙおよびｎは上に定義したとおりであ
り、ｍは１〜15であり、そしてＺはＱおよびＹの間の共
有反応から形成され、そして−CONH−である）の化合物
を生成するか、あるいは 式Ｑ−Sp−SS−Ｗ（式中、SpおよびＷは上に定義した
とおりであり、そしてＱは−CONHNH2である）の化合物
を、亜硝酸と、水性アセトニトリル中で反応させて、式
Ｑ−Sp−SS−Ｗ（式中、SpおよびＷは上に定義したとお
りであり、そしてＱは−CON3である）の化合物を生成
し、この化合物を式Tu−（Ｙ）ｎ（式中、Tu、Ｙおよび
ｎは上に定義したとおりである）の化合物と、反応させ
て、式 （式中、Tu、Ｚ、Sp、Ｗ、ｍ、Ｙ、およびｎは上に定義
したとおりである）の化合物を生成するか、あるいは 式Ｑ−Sp−SS−Ｗ（式中、SpおよびＷは上に定義した
とおりであり、そしてＱはヒドロキシルである）の化合
物を、アルファーハロ酢酸反応させて、Ｑがα−ハロア
セチルオキシである化合物を生成し、そしてα−ハロア
セチルオキシ−Sp−SS−Ｗまたは式Ｑ−Sp−SS−Ｗ（式
中、SpおよびＷは上に定義したとおりであり、そしてＱ
は である）の化合物をTu−（Ｙ）ｎ（式中、Tuは上に定義
したとおりであり、Ｙはタンパク質の側鎖のチオール、
または、試薬、例えば、３−（２−ジチオピリジル）プ
ロピオン酸を使用し、次いで試薬、例えば、ジチオスレ
イトールで還元することによってTuのアミン上に導入さ
れたアミドアルキルチオ基、または２−イミノチオラン
を使用してTuのアミン上に導入されたアミドアルキルチ
オ基であり、そしてｎは１〜10である）の分子と、水性
緩衝北条件にpH4.5〜７および４℃〜40℃の温度におい
て反応させて、式 （式中、Tu、Sp、Ｗおよびｎは上に定義したとおりであ
り、そしてＺはＱ及びＹの共有反応から形成され、そし
て−SS−、 であり、そしてｍは0.1〜10である）の化合物を生成す
るか、あるいは 式Ｑ−Sp−SS−Ｗ（式中、SpおよびＷは上に定義した
とおりであり、そしてＱは−NH2、−CONHNH2、−NHCONH
NH2、−NHCSNHNH2、または−ONH2である）の化合物を、
式Tu−（Ｙ）ｎ（式中、Tuは上に定義したとおりであ
り、Ｙはアルカリ土類過ヨウ素酸塩の存在下に水性緩衝
液中でpH4.0〜6.5および４〜40℃において酸化によって
Tu上の炭水化物残基から発生したアルデヒドであり、そ
してｎは１〜20である）と、反応させて、式 （式中、Tu、Sp、Ｗ、Ｙ、およびｎは上に定義したとお
りであり、そしてＺはＱおよびＹの共有反応から形成さ
れ、そして−ON＝CH−、−Ｎ＝CH−、−CONHN＝CH−、
−NHCONHN＝CH−、または−NHCSNHN＝CH−であり、そし
てｍは0.1〜15である）の化合物を生成するか、あるい
は式 （式中、Tu、Ｚ、Sp、Ｗ、Ｙ、ｎ、およびｍは直ぐ上に
定義したとおりである）の直ぐ上の化合物を、アセチル
ヒドラジンまたはチロシンヒドラジンで、水性緩衝液中
でpH4.0〜6.5および４℃〜40℃において、反応させて、
式 （式中、Tu、Ｚ、Sp、Ｗ、ｎ、およびｍは直ぐ上に定義
したとおりであり、そしてＹは−CH=NNHCOCH3または である）の直ぐ上の化合物を生成するか、そしてこの化
合物をシアノホウ水素化ナトリウムまたはホウ水素化ナ
トリウムと、水性緩衝液中でpH4.0〜6.5および４℃〜40
℃の温度において、反応させて、式 （式中、Tu、Sp、Ｗ、ｍおよびｎは上に定義したとおり
であり、Ｚは−NH−CH2−、−CONHNHCH2−、−NHCONHNH
CH2−、または−NHCSNHNHCH2−であり、そしてＹは−CH
2NHNHCOCH3または である）の化合物を生成する、ことを特徴とする、前記
方法。
の混合物 を調製する方法であって、ここでCH3SSS−ＷはLL−E332
88α1 Br、α1 I、α2 Br、α2 I、α3 Br、α3 I、α4 Br、β
1 Br、β1 I、β2 I、β2 Br、γ1 Br、γ1 I、δ1 I、BBm−16
75、FR−900405、FR−900406、PD114759、PD115028、CL
−1577A、CL−1577B、CL−1577D、CL−1577E、またはCL
−1724であり、 前記調製の方法は、CH3SSS−Ｗを式Ｑ−Sp−SH（式
中、Spは直鎖状もしくは分枝鎖状の二価の（C1−C18）
基、二価のアリールまたはヘテロアリール基、二価の
（C3−C18）シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキ
ル基、二価のアリールまたはヘテロアリール−アルキル
（C1−C18）基、二価のシクロアルキルアルキルまたは
ヘテロシクロアルキル−アルキル（C1−C18）基、また
は二価の（C2−C18）不飽和アルキル基であり、Ｑはハ
ロゲン、アミノ、アルキルアミノ、カルボキシル、カル
ボキシルアルデヒド、ヒドロキシ、低級アルキルジカル
ボキシル無水物、−CONHNH2、−NHCONHNH2、−NHCSNHNH
2、−ONH2、または である）の化合物と、１当量のトリエチルアミンの存在
下におよび／または１当量の酢酸の存在下に−10℃〜−
30℃において１〜48時間反応させ、 式Ｑ−Sp−SS−Ｗ（式中、Ｑ、SpおよびＷは上に定義
したとおりである）の中間体を単離し、 式Ｑ−Sp−SS−Ｗ（式中、SpおよびＷは上に定義した
とおりであり、そしてＱはハロゲン、アミノ、アルキル
アミノ、カルボキシル、カルボキシアルデヒド、ヒドロ
キシ、または低級アルキルジカルボン酸無水物である）
の化合物を式Tu−（Ｙ）ｎ（式中、Tuはモノクローナル
抗体、ポリクローナル抗体、その断片、その化学的また
は遺伝子的に操作された相手、成長因子、またはステロ
イドであり、Ｙはタンパク質の側鎖のアミノまたはカル
ボキシ官能性であり、そしてｎは１〜100である）と、
水性緩衝液中でpH6.5〜９において４℃〜40℃におい
て、直接あるいは水溶性カーボジイミドの存在下に反応
させて、式 （式中、Tu、Sp、Ｗ、ｎおよびＹは上に定義したとおり
であり、ｍは１〜15であり、そしてＺはＱおよびＹの共
有反応から形成され、そして−CONH−、−NH−、 −Ｎ＝CH−または−CO2−である）の化合物を生成する
か、あるいは 式Ｑ−Sp−SS−Ｗ（式中、SpおよびＷは上に定義した
とおりであり、そしてＱはカルボン酸である）の化合物
を、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、２、3,5,6−テト
ラフルオロフェノール、ペンタフルオロフェノール、ま
たは４−ニトロフェノールと、カルボキシル活性化剤、
例えば、カーボジイミドの存在下に反応させて、式Ｑ−
Sp−SS−Ｗ（式中、SpおよびＷは上に定義したとおりで
あり、そしてＱは または である）の化合物を生成し、この化合物を式Tu−（Ｙ）
ｎ（式中、Tuおよびｎは上に定義したとおりであり、そ
してＹは側鎖のアミノ基である）の分子と、水性緩衝液
中でpH6.5〜９において４℃〜40℃の温度において、直
接あるいは水溶性カーボジイミドの存在下に反応させ
て、式 （式中、Tu、Sp、Ｙおよびｎは上に定義したとおりであ
り、ｍは１〜15であり、そしてＺはＱおよびＹの間の共
有反応から形成され、そして−CONH−である）の化合物
を生成するか、あるいは 式Ｑ−Sp−SS−Ｗ（式中、SpおよびＷは上に定義した
とおりであり、そしてＱは−CONHNH2である）の化合物
を、亜硝酸と、水性アセトニトリル中で反応させて、式
Ｑ−Sp−SS−Ｗ（式中、SpおよびＷは上に定義したとお
りであり、そしてＱは−CON3である）の化合物を生成
し、この化合物を式Tu−（Ｙ）ｎ（式中、Tu、Ｙおよび
ｎは上に定義したとおりである）の化合物と、反応させ
て、式 （式中、Tu、Ｚ、Sp、Ｗ、ｍ、Ｙ、およびｎは上に定義
したとおりである）の化合物を生成するか、あるいは 式Ｑ−Sp−SS−Ｗ（式中、SpおよびＷは上に定義した
とおりであり、そしてＱはヒドロキシルである）の化合
物を、アルファーハロ酢酸反応させて、Ｑがα−ハロア
セチルオキシである化合物を生成し、そしてα−ハロア
セチルオキシ−Sp−SS−Ｗまたは式Ｑ−Sp−SS−Ｗ（式
中、SpおよびＷは上に定義したとおりであり、そしてＱ
は である）の化合物をTu−（Ｙ）ｎ（式中、Tuは上に定義
したとおりであり、Ｙはタンパク質の側鎖のチオール、
または、試薬、例えば、３−（２−ジチオピリジル）プ
ロピオン酸を使用し、次いで試薬、例えば、ジチオスレ
イトールで還元することによってTuのアミン上に導入さ
れたアミドアルキルチオ基、または２−イミノチオラン
を使用してTuのアミン上に導入されたアミドアルキルチ
オ基であり、そしてｎは１〜10である）の分子と、水性
緩衝北条件にpH4.5〜７および４℃〜40℃の温度におい
て反応させて、式 （式中、Tu、Sp、Ｗおよびｎは上に定義したとおりであ
り、そしてＺはＱ及びＹの共有反応から形成され、そし
て−SS−、 であり、そしてｍは0.1〜10である）の化合物を生成す
るか、あるいは 式Ｑ−Sp−SS−Ｗ（式中、SpおよびＷは上に定義した
とおりであり、そしてＱは−NH2、−CONHNH2、−NHCONH
NH2、−NHCSNHNH2、または−ONH2である）の化合物を、
式Tu−（Ｙ）ｎ（式中、Tuは上に定義したとおりであ
り、Ｙはアルカリ土類過ヨウ素酸塩の存在下に水性緩衝
液中でpH4.0〜6.5および４〜40℃において酸化によって
Tu上の炭水化物残基から発生したアルデヒドであり、そ
してｎは１〜20である）と、反応させて、式 （式中、Tu、Sp、Ｗ、Ｙ、およびｎは上に定義したとお
りであり、そしてＺはＱおよびＹの共有反応から形成さ
れ、そして−ON＝CH−、−Ｎ＝CH−、−CONHN＝CH−、
−NHCONHN＝CH−、または−NHCSNHN＝CH−であり、そし
てｍは0.1〜15である）の化合物を生成するか、あるい
は式 （式中、Tu、Ｚ、Sp、Ｗ、Ｙ、ｎ、およびｍは直ぐ上に
定義したとおりである）の直ぐ上の化合物を、アセチル
ヒドラジンまたはチロシンヒドラジンで、水性緩衝液中
でpH4.0〜6.5および４℃〜40℃において、反応させて、
式 （式中、Tu、Ｚ、Sp、Ｗ、ｎ、およびｍは直ぐ上に定義
したとおりであり、そしてＹは−CH=NNHCOCH3または である）の直ぐ上の化合物を生成するか、そしてこの化
合物をシアノホウ水素化ナトリウムまたはホウ水素化ナ
トリウムと、水性緩衝液中でpH4.0〜6.5および４℃〜40
℃の温度において、反応させて、式 （式中、Tu、Sp、Ｗ、ｍおよびｎは上に定義したとおり
であり、Ｚは−NH−CH2−、−CONHNHCH2−、−NHCONHNH
CH2−、または−NHCSNHNHCH2−であり、そしてＹは−CH
2NHNHCOCH3または である）の化合物を生成する、ことを特徴とする、前記
方法。
９、式 を有し、一般式CH3SSS−Ｗの化合物から調製され、ここ
でCH3SSS−ＷはLL−E33288α1 Br、α1 I、α2 Br、α2 I、
α3 Br、α3 I、α4 Br、β1 Br、β1 I、β2 I、β2 Br、γ1
Br、γ1 I、δ1 I、BBm−1675、FR−900405、FR−90040
6、PD114759、PD115028、CL−1577A、CL−1577B、CL−1
577D、CL−1577E、またはCL−1724と表示される抗腫瘍
抗生物質であり、 前記調製の方法は、CH3SSS−Ｗを一般式Ｑ−Sp−SH
（式中、Spは直鎖状もしくは分枝鎖状の二価の（C1−C
18）基、二価のアリールまたはヘテロアリール基、二価
の（C3−C18）シクロアルキルまたはヘテロシクロアル
キル基、二価のアリールまたはヘテロアリール−アルキ
ル（C1−C18）基、二価のシクロアルキルアルキルまた
はヘテロシクロアルキル−アルキル（C1−C18）基、ま
たは二価の（C2−C18）不飽和アルキル基であり、Ｑは
ハロゲン、アミノ、アルキルアミノ、カルボキシル、カ
ルボキシルアルデヒド、ヒドロキシ、チオール、α−ハ
ロアセチルオキシ、低級アルキルジカルボキシル、−CO
NHNH2、−NHCONHNH2、−NHCSNHNH2、−ONH2、−CON3、 であるか、あるいは引き続いてそれらに転化できる）の
化合物と反応させて、式Ｑ−Sp−SS−Ｗ（式中、Ｑ、Sp
およびＷは上に定義したとおりである）の中間体を生成
し、 Ｑ−Sp−SS−Ｗを式Tu−（Ｙ）ｎ（式中、Tuはモノク
ローナル抗体、ポリクローナル抗体、その断片、その化
学的または遺伝子的に操作された相手、成長因子、また
はステロイドであり、Ｙはタンパク質の側鎖のアミノ、
カルボキシ、またはチオール基、炭水化物残基から誘導
されたアルデヒド、またはアミドアルキルチオ基であ
り、そしてｎは１〜100の整数である）と反応させて、
式 （式中、Tu、Ｙ、Sp、Ｗおよびｎは上に定義したとおり
であり、そしてＺはＱおよびＹの共有反応から、直接あ
るいは還元後、形成され、そしてＺは−CONH−、−CONH
N＝CH−、−CONHNHCH2−、−NHCONHN＝CH−、−NHCONHN
HCH2−、−NHCSNHN＝CH−、−NHCSNHNHCH2−、−ON＝CH
−、−NH−、−NHCH2−、−Ｎ＝CH−、−CO2−、−NHCH
2CO2、−SS−、 または であり、そしてｍは0.1〜15である）の複合体または混
合物を生成することからなる、生成物の腫瘍細胞崩壊量
を哺乳動物に投与することを特徴とする哺乳動物におけ
る腫瘍の増殖を抑制する方法。
でCH3SSS−ＷはLL−E33288α1 Br、α1 I、α2 Br、α2 I、
α3 Br、α3 I、α4 Br、β1 Br、β1 I、β2 I、β2 Br、γ1
Br、γ1 I、δ1 I、BBm−1675、FR−900405、FR−90040
6、PD114759、PD115028、CL−1577A、CL−1577B、CL−1
577D、CL−1577E、またはCL−1724と表示される抗腫瘍
抗生物質であり、 前記調製の方法は、CH3SSS−Ｗを一般式Ｑ−Sp−SH
（式中、Spは直鎖状もしくは分枝鎖状の二価の（C1−C
18）基、二価のアリールまたはヘテロアリール基、二価
の（C3−C18）シクロアルキルまたはヘテロシクロアル
キル基、二価のアリールまたはヘテロアリール−アルキ
ル（C1−C18）基、二価のシクロアルキルアルキルまた
はヘテロシクロアルキル−アルキル（C1−C18）基、ま
たは二価の（C2−C18）不飽和アルキル基であり、Ｑは
ハロゲン、アミノ、アルキルアミノ、カルボキシル、カ
ルボキシルアルデヒド、ヒドロキシ、チオール、α−ハ
ロアセチルオキシ、低級アルキルジカルボキシル、−CO
NHNH2、−NHCONHNH2、−NHCSNHNH2、−ONH2、−CON3、 であるか、あるいは引き続いてそれらに転化できる）の
化合物と反応させて、式Ｑ−Sp−SS−Ｗ（式中、Ｑ、Sp
およびＷは上に定義したとおりである）の中間体を生成
し、 Ｑ−Sp−SS−Ｗを式Tu−（Ｙ）ｎ（式中、Tuはモノク
ローナル抗体、ポリクローナル抗体、その断片、その化
学的または遺伝子的に操作された相手、成長因子、また
はステロイドであり、Ｙはタンパク質の側鎖のアミノ、
カルボキシ、またはチオール基、炭水化物残基から誘導
されたアルデヒド、またはアミドアルキルチオ基であ
り、そしてｎは１〜100の整数である）と反応させて、
式 （式中、Tu、Ｙ、Sp、Ｗおよびｎは上に定義したとおり
であり、そしてＺはＱおよびＹの共有反応から、直接あ
るいは還元後、形成され、そしてＺは−CONH−、−CONH
N＝CH−、−CONHNHCH2−、−NHCONHN＝CH−、−NHCONHN
HCH2−、−NHCSNHN＝CH−、−NHCSNHNHCH2−、−ON＝CH
−、−NH−、−NHCH2−、−Ｎ＝CH−、−CO2−、−NHCH
2CO2、−SS−、 または であり、そしてｍは0.1〜15である）の複合体または混
合物を生成することからなる、生成物の腫瘍細胞崩壊量
を哺乳動物に投与することを特徴とする哺乳動物におけ
る腫瘍の増殖を抑制する方法。
10、式 を有し、LL−E33288γ1 I（CH3SSS−Ｗ）と表示する抗腫
瘍抗生物質から調製され、 ａ）第１図に示す紫外線スペクトル、 ｂ）第２図に示すプロトン磁気共鳴スペクトル、および ｃ）第３図に示す赤外スペクトル、 を有し、 前記調製の方法は、ジチオメチル部分を、式Ｑ−Sp−
SH（式中、Spは直鎖状もしくは分枝鎖状の二価の（C2−
C5）基または二価のアリールまたはヘテロアリールアル
キル（C2−C5）基であり、そしてＱはカルボキシル、低
級アルキルジカルボキシル無水物、−CONHNH2、または であるか、あるいは引き続いてそれらに転化できる）の
化合物と置換して、一般式Ｑ−Sp−SS−Ｗ（式中、Ｑ、
SpおよびＷは上に定義したとおりである）の中間体を生
成し、 Ｑ−Sp−SS−Ｗを式Tu−（Ｙ）ｎ（式中、Tuはヒト腫
瘍関連抗原との優先的反応性を示すモノクローナル抗体
であり、Ｙは抗体上の側鎖のアミノ基、または抗体の炭
水化物基の酸化によって発生したアルデヒドであり、そ
してｎは１〜100の整数である）の分子と反応させて、
式 （式中、Tu、Ｙ、Sp、Ｗおよびｎは上に定義したとおり
であり、そしてＺはＱおよびＹの共有反応から、直接あ
るいは還元後、形成され、そしてＺは−CONH−、−CONH
N＝CH−、−CONHNHCH2−、または であり、そしてｍは0.1〜15である）の化合物を生成す
ることかなる、タンパク質−薬物複合体またはその混合
物の有効腫瘍細胞崩壊量を哺乳動物に投与することを特
徴とする、抗原部位にことを特徴とするを生体内に要求
する方法。
瘍抗生物質から調製され、 ａ）第１図に示す紫外線スペクトル、 ｂ）第２図に示すプロトン磁気共鳴スペクトル、および ｃ）第３図に示す赤外スペクトル、 を有し、 前記調製の方法は、ジチオメチル部分を、式Ｑ−Sp−
SH（式中、Spは直鎖状もしくは分枝鎖状の二価の（C2−
C5）基または二価のアリールまたはヘテロアリールアル
キル（C2−C5）基であり、そしてＱはカルボキシル、低
級アルキルジカルボキシル無水物、−CONHNH2、または であるか、あるいは引き続いてそれらに転化できる）の
化合物と置換して、一般式Ｑ−Sp−SS−Ｗ（式中、Ｑ、
SpおよびＷは上に定義したとおりである）の中間体を生
成し、 Ｑ−Sp−SS−Ｗを式Tu−（Ｙ）ｎ（式中、Tuはヒト腫
瘍関連抗原との優先的反応性を示すモノクローナル抗体
であり、Ｙは抗体上の側鎖のアミノ基、または抗体の炭
水化物基の酸化によって発生したアルデヒドであり、そ
してｎは１〜100の整数である）の分子と反応させて、
式 （式中、Tu、Ｙ、Sp、Ｗおよびｎは上に定義したとおり
であり、そしてＺはＱおよびＹの共有反応から、直接あ
るいは還元後、形成され、そしてＺは−CONH−、−CONH
N＝CH−、−CONHNHCH2−、または であり、そしてｍは0.1〜15である）の化合物を生成す
ることかなる、タンパク質−薬物複合体またはその混合
物の有効腫瘍細胞崩壊量を哺乳動物に投与することを特
徴とする、抗原部位にことを特徴とするを生体内に要求
する方法。
第１図は,LL−E33288γ1 Iの紫外線スペクトルである。 第２図は、LL−E33288γ1 Iのプロトン磁気共鳴スペクト
ルである。 第３図は、LL−E33288γ1 Iの赤外スペクトルである。
ルである。 第３図は、LL−E33288γ1 Iの赤外スペクトルである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 47/48 Ａ６１Ｋ 31/70 // Ａ６１Ｋ 31/70 Ｃ０７Ｈ 15/203 Ｃ０７Ｈ 15/203 Ｃ０７Ｋ 14/475 Ｃ０７Ｋ 14/475 16/30 16/30 Ｃ１２Ｐ 19/44 Ｃ１２Ｐ 19/44 Ａ６１Ｋ 37/24 (Ｃ１２Ｐ 19/44 Ｃ１２Ｒ 1:29） (72)発明者 ジヨージ・エイ・エレスタツド アメリカ合衆国ニユーヨーク州10965パ ールリバー・エルテイコツクスドライブ 59 (72)発明者 フイリップ・アール・ハマン アメリカ合衆国ニユーヨーク州10923ガ ーナービル・アリスストリート ９ (72)発明者 ロイス・エム・ヒンマン アメリカ合衆国ニユーヨーク州10591ノ ースタリイタウン・ハーウツドアベニユ ー 126 (72)発明者 ジヤニス ウペスラシス アメリカ合衆国ニユーヨーク州10970ポ モナ・ケイムドライブ ３ (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) A61K 39/395 A61K 37/24 A61K 47/48 C07H 15/203 A61K 31/70 C12P 19/44 C07K 16/30 C07K 14/475 ＣＡ（ＳＴＮ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＢＩＯＴＥＣＨＡＢＳ（ＳＴＮ)
Claims (10)
- 【請求項１】式 を有し、上式中、 Ｗは を表し、 ここで、 R1は基 またはCH3であり、 R2は基 またはＨであり、 R3は基 またはＨであり、 R4は基 またはＨであり、 そして、Ｘは臭素またはヨウ素であり、R5は基C2H5、(C
H3)2CHまたはCH3であり、 R6またはR7は基 またはＨであり、 Spは、基−CH2CH2−、二価のアリールまたはヘテロアリ
ール基、二価の（C3−C18）シクロアルキルまたはヘテ
ロシクロアルキル基、二価のアリール−アルキル（C1−
C18）基、二価のシクロアルキル−アルキル（C1−C18）
基、二価の（C2−C18）不飽和アルキル基、あるいは基 であり、 Tuはモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、その断
片、その化学的または遺伝子的に操作された相手あるい
は増殖因子であり、Ｙはタンパク質の側鎖のアミノ、カ
ルボキシ、またはチオール基、炭水化物残基から誘導さ
れたアルデヒド、またはアミドアルキルチオ基であり、
そしてｎは１〜100のいずれかの整数であり、 Ｚは−CONH−、−CONHN＝CH−、−CONHNHCH2−、−NHCO
NHN＝CH−、−NHCONHNHCH2−、−NHCSNHN＝CH−、−NHC
SNHNHCH2−、−ON＝CH−、−NH−、−NHCH2−、−Ｎ＝C
H−、−CO2−、−NHCH2CO2−、−SS−、 または であり、そして ｍは０または１〜15のいずれかの整数であるが、但し、
基(Z-Sp-SS-W)mにおけるｍは１以上の整数である、こと
を特徴とするキャリヤーと薬物の複合体。 - 【請求項２】式 を有し、上式中、Ｗ、Sp、ｎおよびｍは請求項１に定義
した意味を有し、そして Tuはヒト腫瘍関連抗原との優先的反応性を示すモノクロ
ーナル抗体であり、Ｙは抗体上の側鎖のアミノ基、また
は抗体の炭水化物基の酸化によって発生したアルデヒド
であり、そして Ｚは−CONH−、−CONHN＝CH−、−CONHNHCH2−、または である、ことを特徴とするタンパク質と薬物の複合体。 - 【請求項３】請求項１に記載されたキャリヤーと薬物の
複合体または該複合体を特定する式のｍが平均値0.1〜1
5にある混合物の製造方法であって、 式CH3−SSS−Ｗ ［上式中、Ｗは で表され、 ここで、 R1は基 またはCH3であり、 R2は基 またはＨであり、 R3は基 またはＨであり、 R4は基 またはＨであり、 そして、Ｘは臭素またはヨウ素であり、R5は基C2H5、(C
H3)2CHまたはCH3であり、 R6またはR7は基 またはＨである］ の化合物を、式Ｑ−Sp−SH ［上式中、Spは請求項１に定義した意味を有し、そして
Ｑはハロゲン、アミノ、アルキルアミノ、カルボキシ
ル、カルボキシアルデヒド、ヒドロキシ、低級アルキル
ジカルボニル基である］ の化合物とアセトニトリル中のトリエチルアミンおよび
／または酢酸の存在下で反応させ、次いで、こうして得
られた式Ｑ−Sp−SS−Ｗ［式中、Ｑ、SpおよびＷは上記
定義のとおりである］の中間体を、式Tu−（Ｙ）ｎ［式
中、Tu、Ｙおよびｎは請求項１に定義した意味を有す
る］の化合物と、水溶性カルボジイミドの存在する水溶
液中で反応させることを特徴とする請求項１に記載の複
合体のうち、Ｚが−CONH−NH−、−Ｎ＝CH−、−CO2−
または である複合体または混合物の製造方法。 - 【請求項４】請求項１に記載されたキャリヤーと薬物の
複合体または該複合体を特定する式のｍが平均値0.1〜1
5にある混合物の製造方法であって、 式CH3−SSS−Ｗ ［上式中、Ｗは で表され、 ここで、 R1は基 またはCH3であり、 R2は基 またはＨであり、 R3は基 またはＨであり、 R4は基 またはＨであり、 そして、Ｘは臭素またはヨウ素であり、R5は基C2H5、(C
H3)2CHまたはCH3であり、 R6またはR7は基 またはＨである］ の化合物を、式Ｑ−Sp−SH ［上式中、Spは請求項１に定義した意味を有し、そして
Ｑは である］ の化合物とアセトニトリル中のトリエチルアミンおよび
／または酢酸の存在下で反応させ、次いで、こうして得
られた式Ｑ−Sp−SS−Ｗ［式中、Ｑ、SpおよびＷは上記
定義のとおりである］の中間体を、式Tu−（Ｙ）ｎ［式
中、Tu、Ｙおよびｎは請求項１に定義した意味を有す
る］の化合物と、水性溶液中で反応させる、ことを特徴
とする請求項１に記載の複合体のうち、Ｚが−CONH−で
ある複合体または混合物の製造方法。 - 【請求項５】請求項１に記載されたキャリヤーと薬物の
複合体または該複合体を特定する式のｍが平均値0.1〜1
5にある混合物の製造方法であって、 式CH3−SSS−Ｗ ［上式中、Ｗは で表され、 ここで、 R1は基 またはCH3であり、 R2は基 またはＨであり、 R3は基 またはＨであり、 R4は基 またはＨであり、 そして、Ｘは臭素またはヨウ素であり、R5は基C2H5、(C
H3)2CHまたはCH3であり、 R6またはR7は基 またはＨである］ の化合物を、式Ｑ−Sp−SH ［上式中、Spは請求項１に定義した意味を有し、そして
Ｑは基−CON3である］ の化合物とアセトニトリル中のトリエチルアミンおよび
／または酢酸の存在下で反応させ、次いで、こうして得
られた式Ｑ−Sp−SS−Ｗ［式中、Ｑ、SpおよびＷは上記
定義のとおりである］の中間体を、式Tu−（Ｙ）ｎ［式
中、Tu、Ｙおよびｎは請求項１に定義した意味を有す
る］の化合物と、水性溶液中で反応させる、ことを特徴
とする請求項１に記載の複合体または混合物のうち、Ｚ
が−CONH−である複合体または混合物の製造方法。 - 【請求項６】請求項１に記載されたキャリヤーと薬物の
複合体または該複合体を特定する式のｍが平均値0.1〜1
5にある混合物の製造方法であって、 式CH3−SSS−Ｗ ［上式中、Ｗは で表され、 ここで、 R1は基 またはCH3であり、 R2は基 またはＨであり、 R3は基 またはＨであり、 R4は基 またはＨであり、 そして、Ｘは臭素またはヨウ素であり、R5は基C2H5、(C
H3)2CHまたはCH3であり、 R6またはR7は基 またはＨである］ の化合物を、式Ｑ−Sp−SH ［上式中、Spは請求項１に定義した意味を有し、そして
Ｑはヒドロキシル、 である］ の化合物とアセトニトリル中のトリエチルアミンおよび
／または酢酸の存在下で反応させ、式Ｑ−Sp−SS−Ｗ
［式中、Ｑ、SpおよびＷは上記定義のとおりである］の
中間体を得るが、こうして得られた式Ｑ−Sp−SS−Ｗの
中間体のＱがヒドロキシルである場合には、さらにα−
ハロ酢酸無水物と反応させて得た中間体である、α−ハ
ロ酢酸−Sp−SS−Ｗとし、次いで式Tu−（Ｙ）ｎ［式
中、Tuおよびｎは請求項１に定義した意味を有し、そし
てＹは抗体上の側鎖チオール基またはジスルフアイド基
含有二官能性架橋剤を用いてTuのアミン上に導入された
アミドアルキルチオ基である］の化合物と、水性溶液中
で反応させた後、ジチオスレイトールで還元するか、ま
たは２−イミノチオランを用いてTuのアミン上にアミド
アルキルチオ基を導入することを特徴とする請求項１に
記載の複合体のうち、Ｚが−Ｓ−Ｓ−、 である複合体または混合物の製造方法。 - 【請求項７】請求項１に記載されたキャリヤーと薬物の
複合体または該複合体を特定する式のｍが平均値0.1〜1
5にある混合物の製造方法であって、 式CH3−SSS−Ｗ ［上式中、Ｗは で表され、 ここで、 R1は基 またはCH3であり、 R2は基 またはＨであり、 R3は基 またはＨであり、 R4は基 またはＨであり、 そして、Ｘは臭素またはヨウ素であり、R5は基C2H5、(C
H3)2CHまたはCH3であり、 R6またはR7は基 またはＨである］ の化合物を、式Ｑ−Sp−SH ［上式中、Spは請求項１に定義した意味を有し、そして
Ｑは−NH2、−CONHCH3、−NHCONHNH2、−NHCSNHNH2また
は−ONH2である］ の化合物とアセトニトリル中のトリエチルアミンおよび
／または酢酸の存在下で反応させ、次いで、こうして得
られた式Ｑ−Sp−SS−Ｗ［式中、Ｑ、SpおよびＷは上記
定義のとおりである］の中間体を、式Tu−（Ｙ）ｎ［式
中、Tuおよびｎは請求項１に定義した意味を有し、そし
てＹはTu上の炭水化物残基から過ヨウ素酸塩を用いる酸
化反応により生成したアルデヒド基である］と水性溶液
中で反応させることを特徴とする、請求項１に記載の複
合体のうち、Ｚが−ON＝CH−、−Ｎ＝CH−、−CONHN＝C
H−、−NHCONHN＝CH−または−NHCSNHN＝CH−である複
合体または混合物の製造方法。 - 【請求項８】請求項１に記載されたキャリヤーと薬物の
複合体または複合体を特定する式のｍが平均値0.1〜15
にある混合物の製造方法であって、 式 ［式中、Tu、Sp、Ｗ、ｍおよびｎは請求項１に定義した
とおりであり、Ｙ′はCH＝NNHCOH3または であり、そしてＺ′は−Ｎ＝CH−、−CONHN＝CH−、−N
HCONHN＝CH−または−NHCSNHN＝CH−である］の化合物
を、水性溶液中でシアノホウ水素化ナトリウムまたはホ
ウ水素化ナトリウムを用いて還元することを特徴とす
る、請求項１に記載の複合体のうち、Ｚが−NHCH2−、
−CONHNHCH2−、−NHCONHNHCH2−または−NHCSNHNHCH2
−であり、そしてＹが−CH2NHNHCOCH3または である複合体または混合物の製造方法。 - 【請求項９】有効成分として、請求項１に記載のキャリ
ヤーと薬物の複合体または請求項１における式のｍが平
均値0.1〜15を表す複合体の混合物を含んでなる腫瘍抑
制製剤。 - 【請求項１０】有効成分として、請求項２に記載のタン
パク質と薬物の複合体または請求項２における式のｍが
平均値0.1〜15を表す複合体の混合物を含んでなる腫瘍
抑制製剤。
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