PT88882B

PT88882B - Processo para a preparacao de conjugados suporte-droga de agentes antitumor metiltritio

Info

Publication number: PT88882B
Application number: PT88882A
Authority: PT
Inventors: George A Ellestad; William James Mcgahren; Martin Leon Sassiver; Philip R Hamann; Lois M Himann; Janis Upeslacis
Original assignee: American Cyanamid Co
Priority date: 1987-10-30
Filing date: 1988-10-28
Publication date: 1993-01-29
Also published as: HK131897A; NO176480C; EP0313874A3; IE883261L; AU2449488A; NO176480B; FI884983A0; JP2720933B2; NO884834D0; NO884833D0; FI91262B; KR970011385B1; DK602488D0; ATE104309T1; JP2820256B2; NO884834L; NO173506C; ZA888127B; DE3889063T2; ATE112172T1

Description

AMERICAN CYANAMID COMPANY

PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE CONJUGADOS SUPORTE-DROGA DE AGENTES ANTITUMOR METILTRITIO

-2e são preparados a partir de um composto de formula CHgSSS-W em que CH^SSS-W é um antibiótico anti-tumor designado por 1.1.^3328800.,^,0^/, 0Ó₂ ^BrX2^IX3^Brsflú₃ ^Is^₄ ^Br, ^b/’ P2^Bf3 f₂ ^Ij BBM-1675, FR-900405,

FR-900406, PD 114759, PD 115028, CL-1577A , CL-1577B,

CL-1577D, CL-1577E, ou CL-1724, por reacção de CH₃SSS-W com um composto de formula Q-Sp-SH em que Sp é, por exemplo um radical divalente (C-]-C^g) de cadeia linear ou ramifica, da e Q é por exemplo, halogenio, amino ou

para produzir um intermediário de formula Q-Sp-SS-W que é feito reagir com uma molécula de formula Tu-(Y) , em que Tu é por exemplo, um anticorpo mono- ou policlonal, Y ê, por exemplo, um grupo cadeia lateral amino, carboxi, ou tiol de uma proteina, de modo a produzir-se o conjugado atras referido, em que n ê 1 a 100, m é 0,1 a 15 e Z ê formado por reacção covalente de Q e Y e é, por exemplo, -CONH-, CONHN=CH-, ou

-3Este pedido é uma continuação em parte do pedido copendente No. de Serie 07/114940, apresentado em 30 de Outubro de 1987.

Sumario do Invento invento descreve conjugados suportes de droga dos analogos dissulfureto dos componentes

0Ó1 ,(Ϋ2,θ04, pi, J32, <1 e cfdo complexo LL-E33288 bem como os análogos dissulfureto de antibióticos antitumor BBM-1675, FR-900405, FR-900406, PD 114759, PD 115028,

CL-1577A, CL-1577B, CL-1577D, CL-1577E e CL-1724.

A porção suporte do conjugado é um anticorpo mono- ou policlonal, seus fragmentos, contrapartes química ou geneticamente manipuladas, factores de crescimento ou esteróides. 0 invento inclui o método para uso dos conjugados suportes de droga bem como o seu processo de fabrico.

-4Descrição dos Desenhos

Figura I: 0 espectro ultravioleta do antibiótico anti-tumor designado como LL-E33288 Y₁ ¹.

Figura II: 0 espectro de ressonância magnética protónico designado como LL-E 33288/^.

Figura III: 0 espectro infravermelho de antibiótico antitumor designado como LL-E 33288 (^,

Descrição Detalhada do Invento

A familia dos agentesantibacterianos e antitumor, conhecidos colectivamente como o complexo LL-E33288 são descritos e reivindicadas no pedido copendente da patente dos EUA no. de Serie 009321, apresentado em 30 de Janeiro de 1987, e são usados para preparar os agentes antitumor dissulfurados os quais são materiais de partida para as formas objectivo dos agentes antitumor do nosso invento.

pedido No. de Serie 009321 descreve o complexo LL-E33288, os seus componentes, nomeadamente, LL-E33288 oó₁ ^Br, LL-E 33288 οή ¹ ’ LL-33288 ,

LL-E 33288 , LL-33288 °^₃ ^Br , LL-E33288«íg¹, LL-E33288

0é₄ ^Br, LL-E33288 jB₁ ^Brs L L - E3 3 288f _q ¹, L L - E33 288 ₂ ^Br ’

LL-33288 ^¹, LL-E33288 f _j ^Br, LL-E33288 V¹ , e

LL-E33288 ¹, e métodos para a sua produção por fermentação aeróbica utilizando numa nova estirpe de Micromonospora echinospora ssp calichensis ou seus mutantes naturais ou derivados. 0 no. de Serie 009 321 também divulga estrutu ras propostas para alguns dos componentes acima designados. Estas estruturas propostas são reproduzidas na Tabela I.

TABELA I

ESTRUTURAS PROPOSTAS PARA CHg-SSS-W (em que Wêo substituinte ligado ao CHg-SSS- a seguir)

Designação

	^R1	r₂	^r3	r₄	^r5	^r6	R?	X
LL-E33288a₂*	^Af1	r₂.	H	H	^C2^H5			I
LL-E33288O3¹	^ΑΓ1	H	H	^R4’	(CH₃)₂ch			I
LL-E33288P-1¹	^ΑΓ1	r₂.	H	^R4·			I
LL-E33288y-\|¹	^ΑΓ1	r₂.	H	^R4'	^C2^H5			I
LL-E332885·,¹	^ΑΓ1	r₂.	H	^R4*	CHg			I Br
LL-E33288p-\|^Br	^ΑΓ1	r₂.	H	^R4*	(CH₃)₂ch
LL-E332887₁ ^Br	^ΑΓ1	r₂.	H	^R4·	^C2^H5			Br
LL-E33288a₂ ^Br	^ΑΓ1	r₂.	H	H	^C2^H5			Br
LL-E33288a₃ ^Br	^ΑΓ1	H	H	^R4«	(ch₃)₂ch	H	^ΑΓ2	Br
Esperamicina A^	^CH3	r₂.	^R3·
Esperamicina A₂	^CH3	r₂.	^R3·		(ch₃)₂ch	^Ar2	H
Esperamicina A.^	^CH3	r₂.	^R3·		CH₃ ^CH2	H	^Ar2

Certos outros aditivos são úteis no nosso invento designadamente:

1) Esperamicina BBM-1675, numa nova classe de potentes anti bioticos antitumor I. Dados fisico-quimicos e estrutura parcial, M.Konishi et al, Antibiotics, 38, 605 (1985).

Um novo complexo antibiótico antitumor M.Konishi et al, Pedido de Patente do R.V.G.B.2141425A, 15 de Maio de 1984.

-82) Novos antibióticos antitumor, FR-900405 e FR-900406-I. Takonomia da estirpe productora M. Iwami, et al., J. Antibio tics, 38, 835 (1985). Novos antibióticos antitumor FR-900405 e FR-900406. Produção isolamento, caracterização e actividade antitumor, S. Kiyoto et al., J. Antibiotics, 38, 340 (1985).

3) PD 114 759 e PD 115028, novos antibióticos antitumor com potência fenomenal. Isolamento e caracterização R.H. Bunge et al, J. Antibiotics, 37.» 1566 (1984). Actividade biológicas e bioquímicas do novo antibiótico PD 114759 e derivados relacionados D.W. Fry, et al, Investigational New Drugs,4,3 ( 1986).

4) Novo complexo antibiótico CL-1577A, CL-1577B produzido a partir de Streptomyces sp. ATCC 39363. Pedido de patente Europeia 0132082 A₂.

5) Compostos antibiótico antitumoe CL-1577D e CL-1577E, sua produção e uso. Patente U.S. 4539 203.

6) Compostos antibiótico CL-1724, sua produção e uso. Patente dos EUA 4554162. Toda a informação a respeito de BBM-1675, FR-900405, FR-900406, PD114 759 PD 115028,

CL-1577A, CL-1577B, CL-1577D CL-1577E e CL-1724 contida nas citações anteriores é aqui incoeporada para referencia As estruturas completas de espercumicinas Ap A^, e A^ (o complexo BBM-1675) têm sido assinaladas, e estas estão incluídas na Tabela 1. As características fisicas dos antibióticos antitumor acima mencionados indicam que elas são idênticas ou muito semelhantes em estrutura as espermicinas, e contem todas num grupo funcional metiltritio, como se

-9pode observar a partir das estruturas acima divulgadas, os componentes íiZp c/2 5C^g, e cT do complexo

LL_E33288, bem como os antibióticos BBM-1675, FR-900405,

FR-900406, PD 114759, PD115028, CL-1577A, CL-1577B

CL-1577D, CL-1577E e CL-1724 contendo cada um um grupo metn tritio na sua estrutura. A metade metiltritio dos antibio ticos acima designados é submetida a desloca?enti por uma variedade de moléculas organicas contendo tiol originando a formação de uma nova classe de agentes anticancer e anti-bacterianas.

Foi agora descoberta que 0 deslocamento da unidade metiltritio dos compostos listados na Tabela 1 e como descrito no Esquema 1 pode ser usado para in troduzir um espaçador (sp), a escolha judiciosa do qual permite a introdução de unidades objectivo nos compostos das patentes e aplicações acima designadas.

CHgSSS-W

Q-Sp-SH

--—> Q-Sp-SS-W

-10ESQUEMA I em que Sp é um radical (C^-C^) divalente de cadeia linear ou ramificada, radicais divalentes aril ou heteroaril, rad^. cais (C1 -C1g) divalentes cicloalquil ou heterocicloalqui1, radicais (C₁ ^C18^ divalentes aril ou heteroari1-alqui1, radicais(CpC^g) divalentes cicloalquil- ou heterocicloalqui1 -alquil, ou radicais divalentes alquil insaturados

Q é ou pode ser subsequentemente convertido um, halogeneo, amino, alquilamino, carboxil, carboxaldeido, hidroxi, tiol, <^-halo acetiloxi, alqui 1-dicarboxi 1 inferior, C0NHNH₂, -nhconhnh₂, -nhcsnhnh₂, -onh₂, -con₃,

F

-11e W é como se mostra na Tabela 1, anterior.

Desde que o produto do Esquema I contenha pelo menos um grupo funcional o qual pode ser convertido em, ou é directamente reactivo com uma unidade objectivo (Tu) e podemos gerar as formas objectivo dos antibi ticos antitumor das patentes e aplicações acima designadas, como se mostra no Esquema II a seguir:

Q-Sp-SS-W

Tu-(Y)

Tu-(z-Sp-SS-W)

I (Y) n-m

ESQUEMA II em que Q, Sp e W são como acima definidos, Tu é um anticorpo mono ou policlonal, seus fragmentos, suas contrapartes quimica ou geneticamente manipuladas, factores de crescimento ou esteroides; Y é um grupo amino, carboxi ou tiol de cadeia lateral de uma proteína, num aldeido derivado de residuos carbohidrato, ou um grupo amidoalquiItio; n é um inteiro de 1 a 100; Z ê formado a partir da reacção covalente dos grupos Q e Y directamente ou após redução subsequente e Z é

X*

-12-CONH-, -CONHN=CH-, -CONHNHCHp, -NHCONHN=CH-, -NHCONHNH CH₂-, -nhcsnhn=ch-, -nhcsnhnhch₂-, -on=ch-, -nh-, -nhch₂-, -n=ch-, -C0₂- , -NHCH₂C0₂-, -ss-,

Como exemplo, e com referencia ao Esquema II, anterior o acido 3-mercaptopropionico derivado de E-33288 6 , (Q=CO₂H, Sp=-CH₂CH₂), quando convertido na sua forma hidroxisuccinimida activada (Q=C0₂Su, Sp=-CH₂CH₂), pode ser usado para reagir com algum dos grupos E-amino de residuos lisina (e.g) Tu=anticorpo monoclonal,

Y=-NH₂ em que n=50-100 a partir de residuos lisina disponíveis), a um pH entre 7,0 e 9,5 em soluções tamponadas aquo sas a temperaturas entre 4°C e 40°C para produzir formas objectivo dos antibióticos ligados a locais ao acaso juntamente com o esqueleto proteina (Tu= anticorpo monoclonal, 7=-NHC0-, Sp=-CH₂CH₂-, m=1-10). Sómente uma função dos residuos lisina disponíveis são substituídos desta maneira, uma vez que o carregamento elevado não é geralmente conside

X?

-13rado compatível com a presença da imunoreactividade do anti_ corpo. Os mesmos imunoconjugados aleatóriamente substituídos podem também ser prepaardos a partir do derivado do acido 3-mercaptopropionico usando outros agentes activanetes do grupo carboxil tal como uma variedade de carbodiimidas, ou a correspondente acil azida.

Alternativamente, um derivado de 3-mercaptopropionil hidrazida de E-33288^¹, (Q=H₂NHC0-, -Sp=CH₂CH₂-), quando reagiu com um anticorpo periodato, oxidado (Tu= anticorpo monoclonal, Y= -CHO-, n=1-15) como descrito na Patentes U.S. No.4671858 a um pH entre 4 e 7, numa solução tampão aquosa a uma temperatura entre 4°C e 40°C, reage somente na funcionalidade aldeido (derivada da clivagem de vic-diois de resíduos carbohidrato situados sobre a porção Fc dos anticorpos), para gerar conjugados de anticorpo monoclonal contendo a droga substituída nos locais específicos ao longo do esqueleto da proteina ( Tu= anticorpo monoclonal, Z= CH=NNHCO-, Sp=-CH₂CH₂-, m=0,5-10).

A fim de bloquear os grupos, aldeido que nãõ .reagiram sobre o anticorpo, e evitar assim a ligação cruzada , bem como estabilizar as ligações de base Schiff hidrolificamente instável é preferível (embora não essencial) reagir o ultimo conjugado primeiro com um composto tal como acetil hidrazida ou tirosina hidrazida, e a seguir reduzi-lo cianoborohidreto de sodio ou borohidreto de sodio para produzir as construções ou produtos estabilizados deste invento (Tu= anticorpo monoclonal, Z=-CH₂NHNHC0-, Sp=-CH₂CH₂-, m=0,5-10).

Outros grupos aldeido eractivos como parte do produto droga estão dentro do nosso invento para gerar os produtos do Esquema II. Tais grupos funcionais são preferivelmente, embora não limitados aos que,

-14reagem com aldeídos sob condições acidicas aquosas. A reacti vidade das lisinas proteína sob condições basicas é suficientemente grande tal que as suas aminas competem com os produtos do Esquema II para aldeídos disponíveis do anticorpo monoclonal. Grupos aldeído reactivos alternativos são, por exemplo, a semicarbazida a tiosemicarbazida, e as funcionalidades hidroxilamina O-substituidas .

A montagem das formas objectivo dos compostos listados na Tabela 1 não é restringida â sequencia apresentada no Esquema II.

A unidade objectivo (Tu) pode ser primeiro modificada para conter um grupo tiol,’o qual reagiu a seguir com os compostos da Tabela 1 , de acordo com o Esquema III a seguir:

_Tu(Y)_n + Q-Sp-S-P ___Tu- (Z-Sp-SH) (Y) n-m ch₃-sss-w

V

Tu- (Z-Sp-SS-W)_m i

(Y) n-m

-15V, Ρ :

em que Tu, Y, Q, Sp, W, n, e m são como acima definidos, e P é hidrogénio ou 2-(piridiltio), com a condição de que quando Y é um tiol derivado de um esqueleto residuo amino acido de Tu, Z-Sp tomado em conjunto é uma ligação covalente .

Como um exemplo e com referencias ao Esquema III, anterior, um anticorpo monoclonal pode reagir com éster hidroxisuccinimida de acido 3-(2-ditiopiridi1) propionico para modificar a proteina através dos resíduos lisina (Tu=anticorpo monoclonal, Y=NH₂, m=50-100,

Q=-C0₂Su, Sp=-CH₂-CH₂-, P=2-piridiltio). Após a redução com por exemplo, ditiotreitol, é gerado num intermediário (Tu=anticorpo monoclonal, Z=-NHCO-, Sp=-CH₂CH₂-, m=1 a 15) o qual pode reagir com os conjugados da tabela 1 para gerar os imunoconjugados em causa.

Analogamente, o 2-iminotiolano pode reagir com um anticorpo monoclonal para introduzir grupos tiol directamente na superfície da proteina, sem precisar da etapa de redução (Tu= anticorpo monoclonal,

Z=-NHCO-, Sp=(CH₂)₃-, m=1 a 15), e este intermediário pode reagir com os compostos da Tabela 1 como antes.

Alternativamente, os grupos suj^ fidril inerentes dentro da estrutura dos anticorpos monoclonal na forma dimerica e resíduos cistina podem ser usados para participar directamente no Esquema reaccional III como tais sulfidrilos são tradicionalmente expostos por uma combinação de digestão enzimática e redução de redução de anticorpos monoclonal nativos (Tu= fragmento Fab , Z-Sp= ligação, Y=SH), mas o uso de construções de anticorpos

-16monoclonal geneticamente alterados contendo residuos cistina não emparalhâdos e do mesmo modo contemplado.

Uma execução preferida deste invento ê um conjugado de droga proteina de formula

Tu-(Z-Sp-SS-W)_m

Wn-m preparado a partir do antibiótico antitumor designado LL-E 33288^ (CHgSSS-W) tendo

a) espectro ultravioleta como se mostra na Figura I;

b) um espectro de ressonância magnético protonico como se mostra na Figura II;

c) um espectro infravermelho comG se mostra na Figura III.,; e deslocamento da metade ditiometil com um composto de formula Q-Sp-SH, em que Sp é radicais (^“Cg) divalentes de cadeia linear ou ramificada ou radicais (C₂-C₅) divalentes arilalquil ou heteroarilalqui1, e Q ê carboxil, anidrido alquildicarboxil inferior, -C0₂Su, -C0NHNH₂, ou

-17-co

Ο )—^N02 para produzir um intermediário de formula ⁷geral Q-Sp-SS-W, em que Q, Sp e W são como acima definidos, reacção de Q-Sp-SS-W com uma molécula de formula Tu-(Y)_n , em que, Tu é um anticorpo monoclonal o qual exibe reactividade preferencial com um antigene associado a tumor humano, Y é um grupo amino de cadeia lateral no anticorpo, ou um aldeído gerado por oxidação dos grupos carbohidrato do anticorpo, e n é um inteiro de 1 a 100, para produzir um composto de formula

em que Tu, Y, Sp, W e n são como acima definidos, e Z é formado a partir de reacção covalente dos grupos Q e Y dire£ tamente ou após redução subsequente, e Zé -CONH, -C0NHN=CH -C0NHNHCH₂-, ou

-nhcoch₂

(CIÍ„)

0,1 co₂h

-18e m é 1 a 15.

Um numero de diferente anticorpo monoclonal (MoAb's) são usados para exemplificar o objectivo dos compostos anticancro metiltritio. MoAb's Lym 1 e Lym 2 reconhecem antigenes deferentes sobre B-linfócitos madi£ ros., e seus produtos linfomas. A produção e caracteristicas destes MoAb's são descritas por A.L. Epstein, et aml. Câncer Research 47, 830(1987) MoAb¹B 72.3 aponta primáriamente para carcinomas do peito e colon, embora a reactivida_ de com carcinomas pancreaticos, dos ovários, e dos pulmões tenha também sido notado. 0 anticorpo tem sido descrito por T.L. Klug, et al., Int. J. Câncer, 38, 661 (1986).

MoAb CT-M-01 o qual identifica primariamente tumores do peito é descrito na aplicação EPb 86 401482.4 de 3 de Julho de 1986 e MAC-68 ê produzida por um sub-clone do hibridoma o qual produz CT-M-01, e identifica ambos os carcinomas do peito e do colon. Na secção experimental descrevem-se intermediários dos compostos em causa uteis para, e conjugados, com estes anticorpos. Não deve, no entanto, entender-se que esta patente é limitada ou restringida aos anticorpos acima mencionados. Em vez disso, a metodologia é suficientemente geral que pode ser aplicada a todos os anticorpos independentemente da sua classe oi isotopo, seus fragmentos enzimaticamente derivados, seus fragmentos quim£ camente manipulados e estabilizados, bem como as suas contr<a partes quimicas e humanizadas. Nem são as unidades objectivo restringidas somente a anticorpos monoclonal. Outras protej_ nas, bem como pequenas moléculas, para as quais os receptores existem em tecidos objectivo, estão dentro do alcance da nossa descoberta como entidades objectivo.

Os métodos deste invento usados para produzir conjugados de anticorpo monoclonal a partir

-19dos compostos da Tabela 1 originam produtos que retêm boa imunoreactividade com as linhas de células objectivas, como determinado pelos ensaios seguintes in vitro.

Células Objectivo

Todas as células objectivo foram mantidas em meio de RPMI 1640 suplementado com 5% de Soro Fetal de Vitela (FCS), ITS (Collaborative Research, Cat =/=40351 ) estreptomicina (50 pg/ml), penicilina (50 unidades/ml), sulfato de gentamicina (50 yjg/ml) e glutamina (0,03%). As células foram mantidas num incubador de C0₂ humidficado a 5% a 37°C.

I. Ensaios de Imunoreactividade

Procedimento 1

Elisa

Células objectivo apropriadas foram colhidas, contadas e suspensas em Fosfato salino Tamponado de Dulbecco (DPBS) a uma concentração óptima para 0 anticorpo monoclonal (MoAb) a ser testado. Distribuímos 0,1 ml de células em cada buraco, com uma cultura de tecido esteril, de um prato de poliestireno de 96 buracos. Os pra tos foram centrifugados durante 5 minutos a 1000 RPM e a par te sobrenadante foi retirada. Os pratos foram secos por

-20Οχ .

, ar e podem ser armazenados a 4°C até 3 meses.

Os locais de ligação não especi fica foram bloqueadas por adição de 200 |jl de 1% de gelatina em DPBS por buraco e incubamos o prato durante 1 hora a 37oC num incubador húmido. Todas as incubações subsequentes são feitas sob condições analogas). Os pratos foram lavados uma vez com 250 ^il de 0,05% de Tween-20 em DPBS (solução de lavagem), usando o sistema de lavagem automático ELISA da Dymatech (Ultrawash II). As amostras a serem testadas foram diluidas para fazer uma concentração final de 3 jig/ml de qeuivalentes MoAb em 0,1% de gelatina -DPBS. Preparamos mais seis diluições de serie tripla. A linha de fundo dos buracos recebem somente 100 yul de 0,1% de gelatina como passado.

Os pratos foram incubados duraii te 45 minutos e a seguir lavados tres vezes. 0 do conjugado de fosfatase alcalino com afinidade para imunoglobulina anti-rato de cabra purificado (Cappel Cat =/= 861 1-0231 ) foi diluido 1:25 em 0,1% de gelatina e juntamos 100Jul de cada buraco. Os pratos foram incubados durante 45 minutos e a seguir lavados tres vezes. Juntamos a cada buraco 200 yul de solução de substracto de fosfato de p-nitrofenil (ver a seguir). Após 45 minutos â temperatura ambiente a reacção parou pela adição de 50 yul de NaOH 3M. A absorvencia dos teores de cada buraco foi lida a 405 nm no espectrofotometro automático da Dynatech (Autoleitor EIA EL-310).

χ'

-21Substracto de Tampão Dietanolamina (10%) ml de dietanolamina

800 ml de agua

0,2 gramas de NaNg

100 mg de MgClg.ôHgO

Os reagentes foram dissolvidos por agitação continua e juntamios HC1 1M até o pH ser 9,8.

volume total foi levado a 1 litro com água e esterilizado por filtração com um filtro 0,2 ju. 0 tampão foi aromatizado as escuras a 4°C. Imediatamente antes do uso, o fosfato de p - nitrofenil (Sigma, Cat=/= 104-40) foi dissolvido em tampão de 10% de dietanolamina (deve estar â temperatura ambiente) para obtermos uma concentração final de 1 mg/ml.

Calculo dos Valores 0. D.

A percentagem de ligação de cada amostra foi calculada pela equação seguinte:

A-B

100 % de Ligação

C-D

-22χ \ '

Α = 0. D. medio de amostra em teste

B = 0. D. médio do antecedente

C = 0. D. médio de 3 jjg/ml de control MoAb não manipulado

A % de ligação foi colocada na escala não logarítmica de um papel semi-logaritmico e a concentração MoAb foi colocada na escala logarítmica. OBD₅₀ (i.e., e a dose de anticorpo necessária para obtermos 50% de ligação / de cada amostra em etste foi derivada do gráfico e a quantidade de imunoreactividade de retenção foi calculada pela equação seguinte:

ΒΟ^θ de MoAb de control

-x 100% = % de Imunoreactividade

BDçq da amostra do teste retida

Procedimento 2 - RIA Indirecta

Quantidades apropriadas de celu las objectivo em 0,2 ml de 10% de meio FCS foram distribuídas em tubos de 4 ml de poliestireno. As amostras a serem testadas foram diluídas e a uma concentração de 2 jjg/ml de equivalentes MoAb em 10% de meio FCS. Cinco diluições em serie tripla foram preparadas a partir de cada amostra de 2 jjg/ml e juntamos 0,2 ml de cada tubo em duplicado.

As amostras antecedentes recebe ram somente células e meio. As células foram incubadas 4°C durante 1 hora, e a seguir lavadas 2 vezes (todas as lavagems RIA foram feitas com uma volume de 3 ml), com 2% de meio FCS. Juntamos a cada tubo 0,05 ml de ovelha F(ab')₂ antirato IgG / ¹²⁵ I_7 (DuPont, Cat =/= NEX 162-0142) contendo aproximadamente 500,000 CPM's; as células foram incubadas mais uma hora a 4°C, lavadas uma vez com 2% de FCS e duas vezes com PBS. Juntamos 0,5 ml de PBS a cada tubo, as células foram submetidas a um vortex, transferidas para tubos e contadas durante 1 minuto num Packard Gamma 500.

A 1% de ligação de cada valor foi determinada e colocada um gráfico como a equação ELISA anterior, excepto que os CPM foram substituidos por unidades O.D. e C= CPM médio de 1 jjg/ml de MoAb de control não mantida em cada amostra foi calculada como previamente discu t ido.

___

-24Procedimento 3 - RIA directa

Quantidades apropriadas de celu las objectivo em 1 ml de 10% de meio FCS foram distribuídas em tubos de ensaio de 4 ml de poliestireno, centrifugadas e a parte sobrenadaante foi regeitada. As amostras a serem testadas foram diluídas para perfazer uma concentração de 200 ug/ml de equivalentes MoAb em 10% de meio FCS.

Preparamos mais cinco series de diluições quíntuplas apartir de cada amostra de 200 ug/ml e juntamos 0,05 ml a cada tubo em duplicado. Juntamos 0,05 1 25 ml de Ι-MoAb a cada tubo (a quantidade opcional é individualmente determinada para cada MoAb e conjunto). As amostras de control positivo continham células, meio e ¹²⁵I-MoAb.

As amostras anteriores continham células não especificas, meio e ¹²⁵I-MoAb. As células foram incubadas durante 1 hora a 4°C, lavadas uma vez com 2% de meio FCS, duas vezes com PBS, transferidas e contadas como previamente mencionadas.

A % de inibição da ligação 125

Ι-MoAb de cada amostra foi calculada pela formula seguinte:

25Α - Β

- χ 100 = % de inibição da ligação ¹²⁵I-MoAb

C - D

A = CPM¹s médios da amostra

B = CPM's médios do antecedente

C = CPM's médios do control positivo gráfico e a % de imunorecativj. dade retida por cada amostra foi calculada como previamente descrito excepto que o 0BD_5Q é realmente BID_5Q (dose de MoAb necessária para obtermos 50% de inibição da ligação de ¹²⁵I-MoAb).

Notas

1) Os tubos foram sempre rigorosamente agitados imediatamente após a adição de todo o reagente nas RIA.

2) Uma amostra de control interno igualizando 50% de control MoAb não manipulado foi incluida em cada conjunto de ensaios para confirmar se cada processo era quantitativo na predição da retenção de imunoreactividade dos conjugados.

Os resultados destes ensaios são tabulados a seguir na Tabela 2.

-26TABELA 2

Imunoreactividade de conjugados MoAb

Conjugados não específicos	% de Imunoreactivi- dade de MoAb de con
usando o produto do Exemplo 3	Preparação
trol	não modificado
Lym 1	7=1	15
B72.3	7=1	70
	7=2	10

Hidrazida de dissulfureto de acido 3-mercapto propionico analogo de E33288T / (exemplo 4, conjugado para)

7=1	100
7=2	87
7= 3	64
7= 4	80
7= 5	100

-27TABELA 2 (CONT)

Hidrazida de dissulfureto de acido 3-mercaptopropio nico analogo do E 33288 (exemplo 4 conjugado p/:) Preparação

Jo de Imunoreact j. vidade de MoAb de control não modificado

Lym 2

B72.3

CT-M-01

MAC-68

Conjugados Hidrazida preparados usando o produto do Exemplo 5 com :

#1	57
#2	85
#3	39
#4	70
#1	100
#2	90
#1	60
#1	40
#2 ’	28

Lym 1 #1 100 #2 100 s·

-28Os conjugados de anticorpo mono clonal deste invento como agentes anticancro. 0 ensaio de£ crito a seguir para avaliar a citotoxicidade in vitro mostra que a preferencia dramatica dos produtos para as linhas de células objectivo em oposição não objectivo, e for nece uma medida de utilidade de formas objectivo dos compo£ tods comparadas com as suas contrapartidas não objectivo.

Ensaios de citotoxicidade

In vitro

As amostras a serem testadas foram diluídas até uma concentração de 0,2 a 0,02 pg/ml de equivalentes LL-E 33288V (concentração de partida é dependente da linha celular a ser tratada)

Preparamos mais tres diluições quíntuplas a partir de cada diluição de amostra original e juntamos 0,2 ml aos tubos estereis de 15 ml de poliestireno Pelo menos em conjugado analogo formado por LL-E33288 e um MoAb irrelevante foi incluído em cada ensaio para determinar a especificidade do conjugado relevante. Os controlos MoAb receberam somente quantidades equivalentes de MoAb e as amostras de control positivo receberam sómente 10% de meio FCS.

As células foram incubadas a

37°C durante 7 minutos e a seguir lavadas 4 vezes com 8 ml de meio FCS a 2%. Juntamos 0,1 ml de 10% FCS a cada tubo, as células foram agitadas e distribuímos 0,2 ml de cada buraco de um prato de cultura de tecido poliestireno com 96

-29buracos.

Os pratos foram incubados duran te 2 dias num incubador humidificador a 36°C com 5% de C0£. Metade do meio foi removido e substituído com meio fresco contendo 2 juCi/ml de ³H timidina (DuPont NEN, Cat=/= NET-027) A incubação continuou durante 24 horas, as células foram congeladas, derretidas e colhidas por um colhedor de células PHD (Cambridge Technology, Inc)., cada amostra foi contada durante 1 minuto num contador de cintilação Beckman LS 5800 no Canal 1.

A % de inibição de crescimento foi calculada como se segue:

CPM médio do valor de teste

- x 100 = % de crescimento

CPM médio do meio de control

100 - % crescimento = % de Inibição

A % de inibição foi colocada em garfico na escala não logarítmica de um gHfico semi-logaritmico e a concentração LL-E33288 <¹ foi colocada na escala logarítmica.

ICgQ (concentraçaõ de LL-E 33 necessário para obtermos 50% de inibição) de cada amostra de teste foi derivada do gráfico e a quantidade de retenção de citotoxicidade foi calculada pela equação

-30seguinte :

IC₅₍₎ de LL-E33288

IC₅₀ da amostra de teste x 100 = % de citotoxicidade retida

Os resultados do ensaio de cj. totoxicidade in vitro são tabuladas a seguir na Tabela

3.

-31TABELA 3

Citotoxicidade in vitro	de conjugados	MoAb
MoAb	Citotoxicidade %de produto
Conjugados não-especificos preparados usando o produto do Exemplo 3 com:	%E33288q.¹	do Exemplol
1

	Lym 1	#1	.9	11.3
*	B72.3	#1 #2	.001 1.4	3.8

% do produto %Ε33288τ2 do Exemplo

conjugados preparados produto do com	de Hidrazida usando o Exemplo 4
	Lym 1	#1		80
		#2	56	191
		#3	40	60

TABELA 3 (CONT)

Citotoxlcidade in vitro de conjugados MoAb

MoAb Preparação Citotoeicidade % Produto do %E33288g₁ ^I Exemplo 4

conjugados preparados produto do com:	hidrazida usando o Exemplo 4 Lym 1 (/=/ 3 contra célu-	0	0
las das)	não etiqueta)
	Lym 2	#1		29
		#2	2	100
		#3	2	55
	B72.3	#1	0	0
		#2	0	0
»	MAC-68	#1		90
	CTM-01	#1	111	830

%E332887₁ ^I conjugados hidrazida preparados usando o produto do Exemplo 5 com:

Lym 1 #1 300 #2 100

-330 sistema de ensaio seguinte foi usado para medir a actividade in vivo dos conjugados deste invento.

Os testes in vivo para a actividade antitumor sobre os conjugados anticpro da droga monoclo nal foram efectuados usando xenografias de tumor humano em ratos afimicos (nús).

As células limfoma Burkitt (Rajl) e mieloma (Sultan HS) foram colhidas a partir de frascos β

de cultura e subcutâneamente inoculadas (^,80 x 10 células Raji ou 40 χ 10θ células Sultan HS). em ratos em teste.

Tumores solidos, carcinomas dos ovários (CA73, 0vcar-3) e carcinoma do peito (Mx-1) foram propagados em ratos afimicos, removidos cortados em fragmentos de 2 mm e implantados subcutaneamente em ratos em teste (5-8 fragmentos pro ratos).

Drogas anticorpos monoclonal e conjugados de droga anticorpo monoclonal foram administrados intraperitonealmente uma vez cada 3 dias para 3 ou 5 injecções totais principiando no dia 2, 3, 4 6, Ou 7 ou 8 após a implantação do tumor. As medições dos tumores (o comprimento e a largura do tumor foram feitas por meio de um calibrador electronico ultra CALII Fowler cada 7 dias durante 4 ou 5 semanas após a implantação do tumor. A massa do tumor em mg foi estimada a partir da formula:

Comprimento(mm) χ Largura (mm)

A inibição do crescimento do tumor foi calculada para cada grupo em teste numa percentagem de control /média dos mg dos tratados (T) divididos pela media de mg de control (C) χ 100 7.

Um valor T/C 02% em grupos com 6,5% de sobrevivência de animais é considerado necessário para demonstrar a actividade.

Os resultados deste ensaio apare cem na Tabela 4.

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Resultados do teste Antitumor in vivo

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tratamento ip contra H.S.Sultan da linha celular melanoma humana, 3 injecções principiando no dia 5 após implantação do tumor, as medições dadas feitas no dia 35 após a implantação.

-36Resultados do teste Antitumor in vivo

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-40Exemplo 1

Dissulfureto de acido 3-mercaptopropionico Análogo de LL-E33288 V'₁ ¹

A uma solução de 90 mg de

LL-E33288₁ ¹ em 90 ml de acetonitrilo juntou-se 10,6 mg de acido 3-mercaptopropionico em 1 ml de acetonitrilo. A solu ção foi agitada e a seguir armazenada a -20°C durante 6 dias. 0 solvente foi removido in vacuo e o residuo cromato grafado sobre 10 ml de silica gel em cloreto de metileno.

A coluna foi dissolvida em 50 ml de cloreto de metileno, 50 ml de 4% de metanol em cloreto de metileno e finalmente 100 ml de 8% de metanol em cloreto de metileno. A evaporação desta ultima fracção originou um residuo o qual foi processado em acetato de etil com a ajuda de uma pouca de acetona e adicionnada gota a gota a um excesso de hexano.

precipitado foi recolhido e seco, originando 39 mg de produto desejado (FABMS, M+H 1394.).

Tempo de retenção sobre HPLC de fase inversa de (18:18 minutos com 50% de acetonitrilo/ cloreto de amonio e aquoso 0,1M. (LL-E 33288/^.: 8,0 minutos produto de hidrólise do éster : 1,5 minutos).

-41Exemplo 2

Reacção de LL-E33288 com o éster p-nitrofenil de acido 3-mercaptopropionico

A) Preparação de éster p-nitrofenil de acido 3-mercaptopropio nico acido 3-mercaptopropionico comercial em cloreto de metileno contendo uma quantidade catalítica de acido sulfurico concentrado foi tratado com isobutileno duranet 20 minutos. A solução foi a seguir extraída com solução de bicarbonato de sodio 1N, após o que a solução de cloreto de metileno foi seca usando sulfato de magnésio anidro. A solução foi a seguir evaporada até um liquido instável incolor cuja NMR e espectrografia de massa indicou que era ester t-butilico de acido S-T-butilme£ captopropionico.

Uma parte de aliquota deste ester foi refluxada com acido clorídrico 6N que em dioxano durante 2,5 horas. 0 solvente foi evaporado, juntamos acetato de etil e esta' foi extraída com carboneto de sodio. 0 carbonato de sodio extraído foi tratado com acido clorídrico 6N até o pH da suspensão ser 2,0. A suspensão foi a seguir extraída com acetato de teil, o extracto seco sobre sulfato de magnésio e o solvente evaporado até um ι liquido incolor cuja H-NMR e espectrografia de massa indicou que era ácido S-T-butilmercaptopropionico.

Este composto foi convertido em éster p-nitrofenol por tratamento com quantidades equimolares de p-nitrofenol e diciclohexilcarbodiimida em tetrahidrofurano durante 4 horas. 0 sub-produto diciclohexil ureia foi removido por filtração e o filtrado foi evepoardo num óleo o qual foi purificado por' passagem sobre silica gel neutra usando o sistema solvente hexano: cloreto de metileno (50:50). 0 derivado de ester p-nitrofenil puro era vagamente amarelo, óleo instável.

mercaptan livre foi desmascarado pelo processp seguinte. 0 ester p-nitrofenil de acido S-t-butilmercaptopropionico foi dissolvido em acido trifluoro acético e juntamos em acido trifluoroacetico e juntamos um ligeiro excesso molar (10%) de acetato mercúrio. A mistura foi agitada durante 30 minutos, e a seguir o acido trifluoroacetico foi avaporado e o residuo processado em dimetilformamida. Esta solução foi tratada com gás sulfidri. co durante 15 minutos, e aseguir o sulfureto mercurico preto foi filtrado, e o filtrado evaporado sob pressão reduzida para eliminar até 99% de dimetilformamida. 0 liquido ligeiramente castanho instável resultante foi purificado sobre silica gel neutra usando hexano:cloreto de metileno (50:50) componente principal foi mostrado, por H NMR , conter uma pequena quantidade de derivado t-butil mercapto.

I

HPLC analítica sobre duas colunas C^q Perkin-Elmer Pecosphere em tandem /4,6 χ 33 mm, e 4,6 χ 83 mm/ ., usando um sistema gradiente de 37,5/62,5 a 47,5/52,5 de acetonitrilo e tampão de acetato de amonio 0,1M a pH 6,5 (ácido acético) durante uma amplitude de 12 minutos indicou que o produto era 88%. do ester p-nitrofenil

-43de acido 3-mercaptopropionico e 10% de ester p-nitrofenil de acido S-t-butilmercaptopropionico menos polar. Havia também presente uma pequena quantidade de p-nitrofenil presente.

(B) Reacção de ester p- nitrofenil de ácido 3-mercaptopropionico com LL-E33288

Uma porção de 100 mg de

LL-E 33288 foi dissolvida em 50 ml de acetonitrilo.

A isto juntamos uma solução de 25,7 mg de ester p-nitrofenil de acido 3-mercaptopropionico em 1 ml de acetonitrilo.

A reacção foi deixada a -20°C durante 48 horas. HPLC indicou que a reacção estava completa. A solução foi evaporada â secura e o residuo processa do em 4-5 ml de acetato de etil usando sonicação para efectuar a solução. A mistura foi filtrada e o filtrado deitado em 45 ml de hexano agitado. 0 solido vagamente amarelo resultante foi recolhido e seco sob pressão reduzida, originando 93 mg de ester p-nitrofenil de acido propionico derivado de LL-E 33288 ( ¹ como estabelecido por ¹H NMR.

Por FABMS 0 ião /Μ + M 7 apareceu a M/Z = 1515.

-44Exemplo 3

Dissulfureto de N-hidroxisuccinimida 3-mercaptopropionato analogo de LL-E33288

A uma solução de 5 mg de dissuj_ fureto de acido 3-mercaptopropionico analogo de LL-E33288 ¹ do Exemplo 1 em 0,5 ml de tetrahidrofurano juntamos 0,45 mg de N-hidroxisuccinimida em 0,1 ml de tetrahidrofurano e a seguir 1,8 mg de di cidohexi lcarbodi imida em 0,2 ml de tetra hidrofurano. A reacção foi deixada a agitar â temperatura ambiente durante 4 horas e a seguir foi arrefecida com um grande excesso de hexanos. 0 solido foi isolado por filtração e dissolvido em acetato de etil. A solução resultante foi lavada tres vezes com água salgada, seca com sulfato de magnésio, e evaporada ate 5 mg do produto desejado com um pó castanho o qual foi usado sem mais purificação. Tempo de retenção sobre HPLC C_1Q de fase inversa: 15 minutos com 40% de acetonitrilo/cloreto de amonio aquoso 0,1M (material de partida : 6,0 minutos).

Exemplo 4

Dissulfureto de 3-mercaptopropioni1 hidrazida análogo de LL-E33288

A 5,4 ml (3 eq) de hidrzaina anidra em 100 ml de tetrahidrofurano refluxante sob argon juntamos gota a gota 9,2 ml (83 mmol) de 3-mercaptopropiona to de metil em 50 ml de tetrahidrofurano durante 2 horas.

A solução foi refluxada mais 2 horas, evaporada, e a seguir diluida e evaporada duas vezes a partir de 300 ml de tolueno. 0 produto foi aplicado a um tampão de silica gel com 5% de acetato de eti1(cloroformio e eluido do tampão com 20% de metanol/cloroformio. A hidra_ zida 3-mercaptopropioni1 resultante era um óleo ligeiraròente cor de rosa solidificou quando arrefecido mas fundiu â temperatura ambiente.

A 50 mg do LL-E33288 em ml de acetonitrilo a -15°C, juntamos 6,6 mg de 3-mercaptopropionil hidrazida em 1 ml de tetrahidrofurano. Juntamos como catalizador um equivalente de trietilamina e/ou um equivalente de acido acético. A reacção foi deixada a agitar a 0°C durante uma hora e o solvente foi a seguir evaporado. 0 residuo foi cromatografado sobre silica gel com um gradiente de 10-15% de metanol em cloroformio para obtermos 26 mg do produto desejado.

-46Tempo de retenção em HPLC C^g de fase inversa : 5,0 minutos em 41% de acetonitrilo/cloreto de amónio aquoso 0,1M.

Exemplo 5

Dissulfureto de N-/77~4-metil-coumarin-7-i1)amino7acetil7 cisteina hidrazida analogo de LL-E33288 ¹.

Uma mistura de 1,0 g (5,7 mmol) de 4-meti1-7-aminocoumarin, 3,0 ml de bromoacetato de etil (5 eq) 90 mg (0,1 eq.) de iodeto de sodio e 30 ml de dimetilformamida foi aquecida sob argon a 80°C durante 5 horas.

A mistura foi arrefecida, di 1 ui_ da com éter etilico lavada tres vezes com 50% de agua salgada seca com sulfato de magnésio, e evaporada â secura. 0 produto em bruto foi dissolvido em cloroformio contendo 1% de acetato de etil e filtrado através de um tampão de silica gel A recristalização a partir de eter dietílico contendo um traço de cloroformio originou etil N-/7“4-meti1-coumerin-7i 1 )amino7acetato puro.

-47Α 1,96 g (7,5 mmol) de ester anterior em 15 ml de metanol e 15 ml de tetrahidrofurano juntamos 10 ml de hidroxido de sodio aquoso 1N. Após 30 minutos, juntamos 4 ml de acido clorídrico aquoso a 10%. Os solventes orgânicos foram evaporados e o produto cristalino resultante foi filtrado e lavado com etanol frio e a seguir com éter.

Este material foi dissolvido em 20 ml de tetrahidrofurano e 4 ml de dimetilformamida. Junta mos diciclohexilcarbodiimidazol (1,3 g : 2,2 eq) e deixamos agitar a reacção durante 15 minutos. Juntamos a seguir cloreto de ester etil cisteina (1,6 g; 2,5 eq) e trietilamina (1,2 ml). Após mais tres horas, e a reacção foi di 1 ui_ da com éter etílico contendo 5% de cloreto de metileno e lavada uma vez com 10% de acido clorídrico aquoso e duas vezes com agaua salgada. Após secagem com sulfato de magnésio e evaporação dos solventes, o produto em bruto foi crsitalizado por dissolução em clorofórmio contendo uma quantidade minima de etanol, e a seguir juntamos um excesso de eter. Os cristais foram filtrados e secos para obtermos ester etil N-/774-metilcoumarin-7-i1)amino7acetiI7cisteina puro.

Uma amostra de mistura de 5 ml de cloroformio, 20 ml de matnaol e 0,4 ml de hidrato de hidrazina foi aquecida a refluxo sob argon. A esta juntamos 550 mg de ester etil N-/774-metil-coumarin-7-i1)amino7 acetiI7cisteina.

-48Após refíuxar durante 9 horas a mistura foi arrefecida e o produto solido foi filtrado e lavado com cloroformio e a seguir com éter etílico. 0 produto em bruto ( o qual continha tiol e dissulfureto) foi dissolvido em dimetilformamida contendo ditiotreitol e trietil amina. Após 30 minutos o produto foi precipitado com éter etilico em excesso e recolhido por filtração. Este materil foi adicionalmente purificado por recristalização a partir de acetonitrilo desgaseifiçado contendo ditiotreitol.e um traço de trietil amina para obtermos hidrazida N-/77^-4-meti1-coumarin-7-i 1)amino7aceti17cisteina pura.

A 12 mg de LL-E33288 70% puro em 12 ml de acetonitrilo e a 0°C. Juntamos 4 mg de hidrazida N-/77”4-metil-coumarin-7-i1)amino7acetiI7cisteina. em 1,2 ml de dimetilformamida. Após agitação durante a noite juntamos mais 2 mg de hidrazida N-/774-metil-coumarin -7-i1)-amino7acetiI7cisteina em 0,6 ml de dimetilformamida

A reacção foi agitada durante 3 dias a 0^GC e filtrada. 0 acetonitrilo foi evaporado e a solução de dimetilformamida resultante foi diluída com um excesso de 1:1 hexanos/éter. 0 produto foi isolado por filtração e adicionalmente purificado por cromatografia sobre silica gel com um gradiente 15-20% de metanol em cloroformio para obtermos 3 mg do produto desejado.

Tempo de retenção em HPLC Ο^θ de fase inversa: 3,5 minutos usando 45% de acetonitrilo/ cloreto de amonio aquoso 0,1M.

-49Exemplo 6

Dissulfureto de 3-mercaptopropionil hidrazida analogo de LL-E33288 í₁ ¹.

A 10 mg de LL-E33288 /^ em 9ml do acetonitrilo a -15°C, juntamos 6,6 ml de 3-mercaptopropio nil hidrazida em 1 ml de acetonitrilo. Juntamos um equivalente de trietilamina e/ou um equivalente de caido acético como um catalisador. A reacção foi deixada a agitar a 0°C durante uma hora e o solvente foi a seguir evaporado. 0 re siduo foi cromatografado sobre silica gel com gradiente de 10-15% de metanol em cloroformio para obtermos o produto desejado.

Tempo de retenção de HPLC C₁₈de fase inversa: 3,5 minutos no sistema 45% acetonitrilo/ cloreto de amonio aquoso 0,1M.

-50Exemplo 7

Conjugação não-especifica para proteinas éster hidroxisuccinimida descrj. to no Exemplo 3 foi covalentemente ligado a anticorpos sob condições ligeiramente alcalinas. A seguir temos um proces so geral usado para produzir os conjugados anticorpo lista_ dos na Tabela 5. 0 anticorpo a uma concentração, de 3-5 mg /ml em tampão de fosfato contendo cloreto de sodio 0,1M pH 7,5 reagiu com um excesso de 5-20 vezes molar do produto do Exemplo 3 com agitação, â temperatura ambiente durante

1-4 horas. A proteina conjugada foi cromatográficamente desalinizada e a proteina agregada foi separada do material monomérico por HPLC de filtração por gel. As fracções monomericas foram misturadas, e concentradas.

-51TABELA 5

Conjugados não-especificos preparados usando o produto do Exemplo 3

MoAb	Carga de droga M/M
Lym 1	5,2
B 72.3	6,0
B 72.3	2,9

Exemplo 8

Preparação do conjugado de lugar especifico método geral para ligação de derivados de hidrazida de drogas a anticorpos oxidados, é descrito por T.J.McKearn et al., na Patente U.S.No.4671958.

processo foi aplicado para preparar conjugados anticorpo dos produtos dos Exemplos e 5 com modificações especificas como descrito a seguir. Os produtos destas reacções e suas características são resu midas na Tabela 6.

\λ.

-52(A) Oxidação do Anticorpo

Anticorpo a uma concentração de 5 a 10 mg/ml foi dializado durante a noite contra um volu me 200 vezes maior de acetato de sodio tampão 50 mM, pH 5,5 contendo cloreto de sodio 0,1M (Tampão A).

Após diálise, o MoAb foi oxidado com acido periodico 15 mM a 200 mM em acetato de sodio 0,2M A oxidação foi deixada prosseguir âs escuras com agitação, a 4°c durante 45 minutos após cujo tempo o MoAb oxidado foi desalinizado num volume de leito Sephadex G-25 ^5, em coluna. 0 grau de oxidação do anticorpo foi avaliado por reacção com p-nitrofenilhidrazina é comparando a absorvência da proteína a 280 mm em funçãode p-nitrofenilhidrazina a 395 mm.

(B) Conjugação de Droga Hidrazida.

MoAb oxidado reagiu com um excesso molar 25 a 200 vezes superior de droga hidrazida.

As hidrazidas foram dissolvidas em dimetilformamida e adicionadas â solução aquosa de MoAb. Para evitar a precipitação de MoAb, o volume final de dimetilformamida adicionado não excedem 10% do volume total da reacção. A reacção foi deixada prosseguir durante 3 horas â temperatura ambieii te, com agitação.

Para evitar a ligação cruzada de aldeidos que não reagiram e agregaram subsequente, um agente de bloqueio, acetil hidrazida, foi adicionado num excesso molar 100 vezes superior, tres horas após a adição da droga hidrazida. Para estabilizar a ligação da base de Schiff entre o aldeido e a droga hidrazida (uma hidrazona), o produto foi geralmente reduzido uma alquil hidrazina (pela adição de cianoborohidreto de sodio 10 mM, deixando a reacção prosseguir durante mais uma hora (tempo de conjugação total - 4 horas). 0 conjugado foi cromatografado desalinizado e exaustivamente dializado (tampo mínimo 48 horas) em fosfato tampão pH 6,5 para armazenagem e teste.

Os conjugados foram analizados para a presença de agregados por HPLC filtração por gel e para a droga livre por HPLC de fase inversa. 0 carregamento da droga foi determinadp espectroscopicamente usando os coeficientes de extensão de ambos o anticorpo e droga para estimar as concentrações molares da droga em conjugados .

MoÀb Lym 1

TABELA 6

Conjugados hidrazida preparados a partir do produto do Exemplo 4 #1 #2 #3 #4 #5

Lym 2 #1 #2 #3 #4

-54Carregamento de Droga M/M

1.4

2.4 1.0 6.7

3.3

2.9

1.9 2.0 2.8

B72.3 #1 ‘ ²·³ #2 · 1-3

CTM-01 3·¹

MAC-68 t·⁷

Conjugados Hidrazida preparados a partir do produto do Exem pio 5.

Lym 1 #1 #2

0.15

0.76

Claims

REIVINDICAÇÕES

1^â.- Processo para a preparação de um conjugado suporte droga de formula

Tu-(Z-Sp-SS-W) preparado a partir de um composto de formula CH₃SSS-W, am miQ Pf-I ÇÇÇ_1*I & um ωπ+i h i nt i ρλ an+itnmAP rl o c 4 π p q çJq CGITIO

BBM-1675, FR-900405

FR-900406, PD 114759, PD 115028, CL-1577A, CL-1577B,

CL-1577E, ou CL-1577D, ou CL-1724 , caracterizado por compreender:

a reacção de CH₃SSS-W com um composto de formula geral Q-Sp-SH, em que Sp é um radical divalente (C^-C^q) de cadeia linear ou ramificada, radical divalente arilo ou heteroarilo, radical divalente (Cg-C^g) cicloalquilo ou heterocicloalquilo, radical divalente (C^-Cg) aril- ou heteroari l-aj_ quilo, radical divalente (C^-C^g) cicloalquil- ou heterocj_ cloalqui1-alquilo ou radical divalente (C₂-C^g) alquilo insaturado, e Q é, ou pode ser subsequentemente convertido, em, halogeneo, amino, alquilamino, carboxilo, carboxaldej_ do, hidroxi, tiol, oC-haloacetiloxi, alquil inferior-dicar boxilo, -conhnh₂, -nhconhnh₂, -nhcsnhnh₂- , -onh₂,- ·\\

F F para produzir um intermediário de formula Q-Sp-SS-W, em que Q, Sp, e W são como atrás definidos, a reacção de-Q-Sp-SS-W com uma molécula de formula Tu-(Y) , em que Tu é definido como um anticorpo mono- ou policlonal, seus fragmentos, suas contrapartes química ou geneticamente manipuladas, factores de crescimento, ou esteróides; Y é um grupo cadeia lateral amino, carboxi, ou tiol de uma proteina, um derivado, aldeído de residuos hidrato de carbono, ou um grupo amidoalquiltio; e n é um inteiro de 1 a 100 para produzir um composto de formula:

Tu-(Z-Sp-SS-W)

I (¥) n-m

-57em que Tu, Y, Sp, W e n são atrás definidos, e Z é formado a partir da reacção covalente dos grupos Q e Y directamente ou após redução subsequente, e Z é -CONH-, -CONHN=CH-, -C0NHNHCH₂, -nhconhn=ch, -nhconhnhch₂-, -nhcsnhn=ch- , -NHCSNHNHCH₂, -ON=CH-, -NH-, -NHCH₂-, -N=CH-, -C0₂-,

NHCH₂C0₂-, -ss-,
2^ã.- Processo para a preparação de um conjugado de proteina-droga de formula

Tu-(Z-Sp-SS-W) (Y) n-m preparado a partir do antibiótico anti-tumor designado LL-E33288 ₁ ³' (CH₃SSS-W) tendo

600

COMPRIMENTO DE ONDA (nm)

FIGURA I

b) um espectro de ressonância magnético protónico como se mostra na Figura II:

FIGURA II \·

-59c) um espectro infravermelho como se mostra na Figura III:

IV DE LL-E33288

NÚMERO DE ONDA caracterizado por compreender:

FIGURA III o deslocamento da porção ditiometilo com um composto de formula Q-Sp-SS, em que Sp ê um radical divalentes (C₂-Cg) de cadeia linear ou ramificada ou um radical divalente (C₂-Cg) aril- ou heteroarilalquilo, anidrido, alquil inferior-dicarboxi1ico, -C0NHNH₂, ou para produzir um intermediário de formula geral Q-Sp-SS-W, em que Q, Sp, e W são como atrás definidos, a reacção de Q-Sp-SS-W com uma molécula de formula Tu-(Y)_n, em que Tu é um anticorpo monoclonal o qual exibe reactividade de preferencial com um antigénio associado com um tumor humano, ou um aldeído gerado por oxidação dos grupos hidratos de carbono do anticorpo, e n é um inteiro de 1 a 100, para produzir um composto de formula:

Tu-(Z-Sp-SS-W) ι m (Y) n-m em que Tu, Y, Sp, W e n são como atrás definidos, *e Z é formado a partir de reacção covalente dos grupos Q e Y directamente ou após redução subsequente, e Z ê -CONH-, -CONHN=CH, -C0NHNHCH₂, ou

-nhcoch₉-ch ² I ^C02^H e m é 0, 1 a 15.
3^â.- Processo de acordo com a rei vindicação 1, caracterizado por se preparar um composto CHgSSSW é LL-E33288 f¹, Q é o éster de 4-nitrofenilo de um grupo carboxilo, Sp é -^CH2^CH2’ ^{5 Tu é 0 anticor}P° mono

-61clonal CT-M-01 , Y é -NH_2> Z ê -CONH-, e m é 0,5 a 15.
4^â.- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se preparar um composto, em que CHgSSSW é LL-E33288 <₁ ¹, Qéo ester de hidroxi-succinimida de um grupo carboxilo; Sp é -CH₂CH₂, Tu é o anticorpo monoclonal MAC-68, Y é -NH₂, Z é -CONH-, e m é 0,
5 a 15.

δ⁵.- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se preparar um composto em que CHgSSSW é LL-E33288 ¹, Q é -C0NHNH₂, Sp ê -CH₂CH₂

Tu é 0 anticorpo monoclonal Lym 1, Y é -CHO, Z é -C0NHNHCH₂-, e m é 0,1 a 10.

6^â.~ Processo de acordo com a rej vindicação 1, caracterizado por se preparar um composto, em que CH₃SSSW é LL-E33288 ₁ ¹, Sp é

Tu é o anticorpo monoclonal B72.3, e mé 0,1 a 10. Y é -CHO, Z é -CONHNHCH 7^â.- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se preparar um composto, em que CHgSSSW é LL-E33288 Λ,¹, Sp é -ç^h-_Ch₂- [OT } NHCOCH₂NET 0 0 Tu é o anticorpo monoclonal Lym 2, Y é -CHO, τ é -C0NHNHCH₉-, e m é 0,1 a 10. ^á \ 8^a.- Processo para a preparação

dos derivados àlvo

Tu-(Z-Sp-SS-W)_m de compostos de formula CH_RSSS-W, em que CHgSSS-W é um anti Br ,j I Br _d ^T __ ^T

2 ’ 3 ’ 3

BBM-1675, biotico antitumor LL-E33288 , qL ¹, o^>^Br , oC¹, «A^Br , , j Br _R Br _R I β Br , / I / , p₂ ’ 2 ’ ^v 1

Br

-63FR-900405, FR-900406, PD114759, PD115028, CL-1577A,

CL-1577B CL-1577D, CL-1577E, ou CL-1724, caracterizado por compreender:

a reacção de CHgSSS-W com um composto de formula Q-Sp-SH, em que Sp é um radical divalente (C_pC^g) de cadeia linear ou ramificada, radical divalente arilo ou heteroarilo, radical divalente (Cg-C^g) cicloalquilo ou heterocicloalquj_ lo, radical divalente (C^C^) aril- ou heteroari 1-alquilo, radical divalente (y-C^) cicloalquil- ou heterocicloalquil-alquilo ou radical divalente (C₂-C₁₈) alquilo insatura do, e Q é halogeneo, amino, alquilamino carboxilo, carboxal^ deido, hidroxi, anidrido, alquil inferior-dicarboxi1ico, -conhnh₂, -nhconhnh₂, -nhcsnhnh₂, -onh₂ ou

-SS em acetonitrilo na presença de um equivalente de trietilamina e/ou um equivalente de acido acético de -10° a -30°C, durante 1 a 48 horas, o isolamento do intermediário de formula Q-Sp-SS-W, em que Q, Sp, e W são como atras definidos, e a seguir, a reacção do composto de formula Q-Sp-SS-W, em que Sp e W são como atrás definidos e Q é halogeneo, amino, alquilamino, carboxilo, carboxaldeido, hidroxi, ou anidrido alquil inferior dicarboxi1ico com uma molécula de formula Tu-(Y)_n, em que Tu é um anticorpo mono ou policlonal, seus fragmentos, as suas contrapartes quimica ou geneticamente manipuladas, factores de crescimen to, ou esteroides; Y é um grupo funcional cadeia lateral amino ou carboxi; n é 1 a 100, em tampão aquoso a um pH entre 6,5 e 9, de 4° a 40°C ou directamente ou em presença de uma carbodi-imida solúvel de/em água, para gerar o composto

64Tu-(Z-Sp-SS-W) (Y)_nem que Tu, 1-15, e Z Q e Y e é

Sp, W e n e Y são como atrás definidos, m ê é formado a partir da reacção covalente dos grupos -CONH-, -NH-,

-NHCOCH.

'^>0,1 co₂H

-N=CH-, OU -C0₂-, ou' a reacção do composto de formula Q-Sp-SS-W , em que Sp e W são como atrás definidos e Q ê um acido carboxílico, com N-hidroxisuccinimida, 2,3,5,6-tetrafluorofenol, pentafluo rofenol, ou 4-nitrofenol na presença de um agente activador de carboxilo tal como uma carbodi-imida para gerar um composto de formula Q-Sp-SS-W, em que Sp e W são como atrás definidos e Q é .χ com uma molécula de formula Tu-(Y) , onde Tu e n são como atrás definidos, e Y é um grupo cadeia lateral amino, numa solução tampão aquosa a um pH entre 6,5 e 9, a uma temperatura entre 4o e 40°C inclusivé, para gerar compostos de formula:

Tu-(Z-Sp-SS-W) m

(Y) n-m em que Tu, Sp, Yen são como atrás definidos, m é 1 a 15, e Z é formadp a partir da reacção covalente entre Q e Y e é definido como -CONH- ou, a reacção de um composto de formula Q-Sp-SS-W, em que Sp e W são como atrás definidos, e Q é -CONHNHg com acido nitroso em acetonitrilo aquoso para gerar um composto de formula Q-Sp-SS-W, em que Sp e W são como atrás definidos

-66e Q é -CONH₃ com um composto de formula Tu-(Y) , em que Tu, Yen são como atrás definidos para produzir um composto de formula

Tu-(Z-Sp-SS-W) ι m (Y) n-m em que Tu, Z, Sp, W, m, Y e n são como atrás definidos; ou a reacção de um composto de formula Q-Sp-SS-W, em que Sp e W são como atrás definidos e Q ê hidroxi, com um anidrido alfa-haloacetico para produzir um composto em que Q éíZ-haloacetiloxi, a reacção do oô-haloacetiloxi-Sp-SS-W ou um composto de formula Q-Sp-SS-W, em que Sp e W são como atrás definidos e Q é

-ss com uma molécula de formula Tu-(Y)_n, em que Tu é como atrás definido, Y é uma cadeia lateral tiol de uma proteína, ou um grupo amidoalquiltio introduzido numa amina de Tu usando reagentes tal como éster hidroxi-succinimida de acido 3-(2-ditiopiridi1)propionico'seguido por redução com um agente tal como ditiotreitol, ou um grupo amidoalquiltio introduzj, do numa amina de Tu usando 2-iminotiolano, e n é 1 a 10, sob condições de tampão aquoso a um pH entre 4,5 e 7, a uma temperatura entre 4° e 40°C inclusivé, para produzir um composto de formula:

Tu-(Z-Sp-SS-W)_m n-m em que Tu, Sp, W e n são como atrás definidos, eZê formado a partir de uma reacção covalente dos grupos Q e Y-e Z é

e n é 0, 1 a 10;

OU a reacção de um composto de formula Q-Sp~SS-W, em que Sp e W são como atras definidos e Q é -NHg, -CONHNHg,

-68-NHCONHNH₂, -NHCSNHNH₂, ou -0NH₂ com uma molécula de formula Tu-(Y) , em que Tu é como atrás definido, Y é um aldeido gerado a partir de residuos hidrato de carbono sobre Tu por oxidação na presença de um periodato alcalino-terroso, num tampão aquoso a um pH entre 4,0 e 6,5 de 4° a 40°C, inclusívé, e n é 1 a 20 para gerar um composto de formula:

TU-(Z-Sp-SS-W)

I m_n-m em que Tu, Sp, W e Y e n são como atrás definidos e Z-é formado a partir da reacção covalente de Q e Y e é -ON=CH-N=CH-, -CONHN=CH-, -NHCONHN=CH-, OU -NHCSNHN=CH-, e m é 0,1 a 15; ou o tratamento do composto imediatamente atrás de formula:

Tu-(Z-Sp-ssW) (Y) n-m em que Tu, Z, Sp, W, Y, n e m são como imediatamente atrás definidos com acetil hidrazina ou tirosina-hidrazina num tampão aquoso a um pH entre 4,0 e 6,5 de 4° a 40°C, inclusj. vé para gerar um composto de formula:

-69Tu-(Z-Sp-SS-W) m_nem que Tu, Z, Sp, W, n e m são como imediatamente atrás definidos e Y é -CH=NNHC0CH₃, ou

-CH=NNHCO-CH (NH₂) -CH₂ Q / ~~OH e

a reacção deste composto com ciano-boro-hidreto de sodio. ou boro-hidreto de sodio, um tampão aquoso a um pH de 4,0 a 6,5 a uma temperatura de 4°C a 40°C, inclusivé para gerar um composto de formula:

Tu-(Z-Sp-SS-W)

I (Y) n-m em que Tu, Sp, W, m e n são como atrás definidos , Z é

-nh-ch₂, -conhnnch₂-, -nhconhnhch₂, ou -nhcsnhnhch₂, e Y é -CH₂NHNHC0CH₃ ou

-70-ch₂nhnhcoch(nh₂)ch₂ .1 '{ t

i (

9^ã.- Método para a inibição de crescimento de tumores num mamífero caracterizado por compre ender a administração ao mamífero de uma quantidade oncolitica de um produto

Tu-(Z-Sp-SS-W)_m n-m preparado a partir de um composto de formula geral CH₃SSS-W, em que CH₃SSS-W é um antibiótico anti-tumor designado como LL-E33288 *í₁ ^Br, ¹, ^3^θΓ X3¹, <Z₄ ^Br , ,

Ρ₂ ^βΓ, í/, BBM-1675, FR-900,405,

FR-900406 PD 114759, PD 115028, CL-1577A, CL-1577B,

CL-1577D, CD-1577E, ou CL-1724 compreendendo a reacção do CH₃SSS-W com um composto de formula geral Q-Sp-SH, em que Sp é um radical divalente (CpC^) de cadeia linear ou ramificada, radical divalente arilo ou heteroarilo, radical

-71divalente (^C3~^c-|q) cicloalquilo ou heterocicloalquilo, radical divalente aril- ou heteroari1-alquilo, radical divalente (C-j-C^g) cicloalquil- ou heterocicloalquil-alquilo ou radical divalente (C^-C^g), alquilo insaturado, e Q é, ou pode ser subsequentemente convertido em, halogeneo, amino alquilamino, carboxilo, carboxaldeido, hidroxi, tiol, c^-haloacetiloxi,alqui1 inferiordicarboxi1ico, -CONHNl·^, -NHCONHNH₂, -nhcsnhnh₂, -onh₂, -con₃,

F F para produzir um intermediário de formula Q-Sp-SS-W, em que, Q, Sp, e W são como atrás definidos, reacção de Q-Sp-SS-W com uma molécula de formula Tu-(Y)_n, em que Tu é definido como um anticorpo mono- ou policlonal, seus fragmentos, as suas contrapartes química pu geneticamente manipuladas, facto res de crescimento, ou esteroides; Y é um grupo cadeia late

-72ral amino carboxi, ou tiol de uma proteína, um derivado alde do de resíduos hidrato de carbono, ou um grupo amidoalquiltio; e n é um inteiro de 1 a 100, para produzir um composto de formula:

Tu-(Z-Sp-SS-W)_m n-m em que Tu, Y, Sp, W e n são como acima definidos, e Z é formado a partir de uma reacção covalente dos grupos Q e Y directamente ou após subsequentemente redução, e Zé -CONH-, -CONHN=CH-, -CONHNHCH?, -NHCONHN=CH, -NHCONHNHCH -NHCSNHN=CH-;

-N=CH-, -C0₂nhcsnhnhch₂-, , -NHCH₂C0₂-,

-0N=CH-, NH-, -NHCH₂-, SS- , ou

4,

-nhcoch₂-ch ‘ϊ^ο,ι co₂H , sendo a gama de dosagem de composto activo e m é 0,1 a 15 de 0,004 a 0,05 jjg/ml.

Çx.

-7310^ã.- Método para a administraçao in vivo de um composto num local antigenio caracterizado por compreender a administração a um mamífero de uma quantid^ de oncolitica eficaz de um conjugado de proteina-droga de formula

Tu-(Z-Sp-SS-W) i m (Y) n-m preparada a partir do antibiótico anti-tumor designado por LL-E33288 (₁ ¹ (CH₃SSS-W) tendo

a) espectro ultravioleta como se mostra na Figura I: