DK174739B1

DK174739B1 - Bærer-lægemiddelkonjugater og deres fremstiling

Info

Publication number: DK174739B1
Application number: DK198806025A
Authority: DK
Inventors: William James Mcgahren; Martin Leon Sassiver; George A Ellestad; Philip R Hamann; Lois M Hinman; Janis Upeslacis
Original assignee: American Cyanamid Co
Priority date: 1987-10-30
Filing date: 1988-10-28
Publication date: 2003-10-13
Also published as: HK131897A; NO176480C; EP0313874A3; IE883261L; AU2449488A; NO176480B; FI884983A0; JP2720933B2; NO884834D0; NO884833D0; FI91262B; KR970011385B1; DK602488D0; ATE104309T1; JP2820256B2; NO884834L; NO173506C; ZA888127B; DE3889063T2; ATE112172T1

Description

DK 174739 B1 I

Den foreliggende opfindelse angår bære-lægemiddel- H

konjugater af de disulfid analoge af a1( oi2< “3- a4' I

β2 , i i og δ komponenter af LL-E33288-komplekserne samt de di- H

sulfidanaloge af BBM-1675, FR-900405, FR-900406, PD-114759, H

5 PD-115028, CL-1577A, CL-1577B, CL-1577D, CL-1577E og CL- H

1724 antitumor antibiotika. Bæredelen af konjugatet er et H

mono- eller polychlonalt antistof, deres fragmenter, kemisk H

eller genetisk manipulerede modparter, vækstfaktorer, eller H

stereoider. Opfindelsen angår endvidere en fremgangsmåde til H

10 fremstilling af bære-lægemiddelkonjugaterne. H

Beskrivelse af tegningerne. H

Fig. 1: det ultraviolette spektrum af det antitumor H

antibiotikum, der betegnes som LL-E33288;. H

Fig. II: det protonmagnetiske resonansspektrum af H

15 det antitumor antibiotikum, der betegnes som LL-E33288;. H

Fig. III: det infrarøde spektrum af det antitumor. H

antibiotikum, der betegnes som LL-E33288j. H

Beskrivelse af opfindelsen. H

Den familie af antibakterielle og antitumor midler, H

20 som samlet er kendt som LL-E33288-komplekset, er kendt fra H

den verserende US-patentansøgning nr. 9 321 og anvendes til H

at fremstille de disvovl-antitumormidler, som er udgangs- H

materialer for målformer for de her omhandlede tumormidler. H

Fra US-patentansøgning nr. 9 321 er kendt LL-E33288- H

25 komplekset, komponenterne deraf, nemlig LL-E33288a^Br, H

LL-E33288a1I, LL-E33288a2Br, LL-E33288a2I/ LL-E33288a3Br, H

LL-E33288a3I, LL-E33288a4Br, LL-E33288fi1Br, LL-E33288S!1, H

LL-E33288S2Br, LL-E33288fi2I, LL-E33288;1Br, LL-E33288i^ og H

LL-E332886J1 og fremgangsmåder til produktion deraf ved 30 hjælp af aerobisk fermentation ved anvendelse af en hidtil

ukendt stamme af Mikromonospora echinospora ssp calichensis H

eller naturlige eller afledte mutanter deraf. Fra US patent- H

ansøgning nr. 9 321 er ligeledes kendt foreslåede strukturer H

for nogle af de ovenfor nævnte komponenter. Disse foreslåede H

35 strukturer er gengivet i tabel I.

I DK 174739 B1 I 2

I Tabel I

I Foreslåede strukturer for CH3-SSS-W

I hvor W er den substituent, der er I 5 bundet til CH3-SSS- nedenfor I 73

I CH,SSST

I RiS c«, n X Λ0CHj I ™ M"^V° I or2 I CH3 o 0Η30ν^^όο-<> I Ar’= Ara" c^°^n^xn'"h I RiO^Y^OCH, 0Λ. OCHj I och3 i I R.0 ^ I ". -«Æsa "·- i£Z~7 0CH3 ^ och3 o >sv\r I Betegnelse Ri R2 R3 R4 RS R6 R7 x I LL-E33288021 ArJ R^ Η H C2Hg ί

I LL-E33288a3l Ari Η H R4, I

LL-E33288P!1 Ar., Rr H ”4- (CH^CH I

I LL-E33288y1i A^ R2· H R4* C2H5 1 LL*E3328851I A^ R2> H R4t CH3 i I LL-E33288piBr Ar1 R2« H R4· iCH3)2CH Br I LL-E33288Y1Br Art Rg, H R4< CjHg Br I LL-E33288a2Br Ar-j R2· H H c2Hs Br LL-E33288a3Br Ar-, R H R4· Br I Esperamlcln At CH3 Rg, R3, (CH3)2CH H Ar2 i

I Esperamlcln A2 CH3 R2, R3, (CH3)2CH Ar2 H

I Esperamlcln A1fa CH3 R2, R3> CH3CH2 H Ar2

DK 174739 B1 I

Visse andre antibiotika er anvendelige i den her H

omhandlede opfindelse, nemlig:

1) Esperamicin BBM-1675, en hidtil ukendt klasse af H

potente antitumor antibiotika, I. Physioco-chemical data H

5 and partial structure. M. Konishi, et. al., J. Antibiotics, H

38, 1605 (1985). A new antitumor antibiotic complex, Μ. Η

Konishi, et. al., GB-patentansøgning nr. 2 141 425 A. H

2) Hidtil ukendte antitumor antibiotika, FR-900405 I

og FR-900406, I. Taxonomy of the producing strain. M. Iwami, Η

10 et. al. , J. Antibiotics 38, 835 (1985) . New antitumor an- H

tibiotics, FR-900405 and FR-900406. II. Production, isola- I

tion, characterization and antitumor activity. S. Kiyoto, et. H

al., J. Antibiotics, 38/ 340 (1985).

3) PD 114759 og PD 115028, hidtil ukendte antitumor I

15 antibiotika med fænomenal potens. I. Isolation and chara- H

cterization. R.H. Bunge, e_t. al., J. Antibiotics, .37, 1566 H

(1984). Biological and biochemical activities of the novel H

antitumor antibiotic PD 114759 and related derivatives. H

D.W. Fry et. al.., Investigational New Drugs, 4, 3 (1986). H

20 4) Hidtil ukendt antibiotisk kompleks CL-1577A, CL- H

1577B produceret af Streptomyces sp. ATCC 39363. EP-patent- I

ansøgning nr. 132 082, A2. H

5) CL-1577D og CL-1577E antibiotiske antitumorfor- I

bindeiser, deres produktion og anvendelse. US-patentskrift H

25 nr. 4 539 203.

6) CL-1724 antibiotiske forbindelser, deres fremstil- H

ling og anvendelse. US-patentskrift nr. 4 554 162. H

De fuldstændige strukturer fra esperamicinerne A^,

A2 og A-Lk (BBM-1675 komplekset) er refereret, og de er in- H

30 kluderet i tabel I. De fysiske egenskaber for de ovennævnte H

antitumor antibiotika tyder på, at de alle har den samme H

struktur som esperamicinerne, eller har en struktur, som er H

meget lig med esperamicinernes, og at de alle indeholder en H

methyltrithio funktionel gruppe. H

35 Som det fremgår af de ovennævnte strukturer, indehol- H

der oi2/ «3, a4, β1# β2/ i i og δ komponenterne af LL- H

I DK 174739 B1 I E33288*-komplekset samt BBM-1675, FR-900405, FR-900406, PD-

I 114759, PD—115028, CL-1577A, CL-1577B, CL-1577D, CL-1577E

I og CL-1724 antibiotikaene hver en methyltrithiogruppe i I deres struktur. Methyltrithio-gruppen i de ovennævnte an- I 5 tibiotika er genstand for fortrængning med mange forskellige I thiolholdige organiske molekyler, hvilket resulterer i dan- I nelsen en hidtil ukendt klasse af anticancermidler og an- I tibakterielle midler.

I Det er nu erkendt, at fortrængningen af methyltrithio- I 10 enheden i de forbindelser, der er angivet i tabel I, og som I vist i reaktionsskema I, kan anvendes til indføre en "spacer" I (Sp). Et velovervejet valg deraf muliggør indføringen af målrettede ("targeting") enheder i forbindelserne fra de I T,. ovennævnte patenter og ansøgninger.

I Q-Sp-SH

20 CH3SSS-W -> Q-Sp-SS-W

I Reaktionsskema I

idet Sp er en ligekædet eller forgrenet divalent Ci_ig-grup- I pe, divalente aryl- eller heteroarylgrupper, divalente C3_ I 25 ig-cycloalkyl- eller -heterocycloalkyl-grupper, divalente I aryl- eller heteroaryl-alkyl-C^.^g-grupper, divalente cyclo- alkyl- eller heterocycloalkyl-alkyl-C1..13-grupper eller I divalente umættede C2_i8“alkylgrupper, Q er eller kan senere omdannes til halogen, amino, alkylamino, carboxyl, carboxal- I 30 dehyd, hydroxy, thiol, α-halogenacetyloxy, lavere alkyldicar- boxyl, -conhnh2, -nhconhnh2, -nhcsnhnh2, -onh2, -con3, I o OFF.

I ^— "Vs )p( I 35 -C0^^J ' \Q} ' -COr^ ' I F yF “CH CH3 ! I „

I F F

DK 174739 B1 I

og w er som vist i tabel I ovenfor. I

så længe som produktet fra reaktionsskema I indeholder H

mindst én funktionel gruppe, som kan omdannes til, eller I

som er direkte reaktiv med, en målrettet enhed (‘'targeting I

5 unit"), (Tu), kan man danne målrettede former af antitumor- I

antibiotikaene fra de ovennævnte patentskrifter og ansøgnin- I

ger, som vist i reaktionsskema II nedenfor: I

10 Tu-(Y)n I

Q-Sp-SS-W -> Tu-(Z-Sp-SS-W)m

15 (Y)n-m I

Reaktionsskema II H

idet Q, Sp og W er som ovenfor defineret, Tu er et mono-

eller polyklonalt antistof, fragmenter deraf, kemisk eller H

20 genetisk manipulerede modparter deraf, vækstfaktorer eller H

steroider, Y er en sidekæde-amino-, -carboxy- eller -thiol- H

-gruppe af et protein, et aldehyd, afledt af carbohydratres- H

ter, eller en amidalkylthiogruppe, n er et helt tal fra 1 I

til 100, Z er dannet ud fra covalent reaktion mellem grup- I

25 perne Q og Y direkte eller efter senere reduktion, og Z er H

-CONH-, -C0NHN=CH-, -C0NHNHCH2-, -NHCONHN=CH-, -NHCONHNH- I

CH2, -NHCSNHN=CH-, -NHCSNHNHCH2-, -ON=CH-, -NH-, -nhch2-, I

-N=CH-, -C02-, -NHCH2C02-, -SS-, I

R -S —\ o2c- .0 I I

-S—I \ i N I -s-V CH^ -NHC0CH2-CH

[of < ~_X or (CH > . I

^ Koch2- ι0;η°^ I

og m er 0,1-15. H

Som et eksempel og med henvisning til reaktionsskema H

40 II ovenfor kan man anvende 3-mercaptopropionsyrederivatet af H

Ε-33288Ύ11 (Q=C02H, Sp=-CH2CH2-), når det er omdannet til H

I DK 174739 B1 I 6 I dets aktiverede hydroxysuccinimidform (Q=C02Su, Sp=-CH2- I -CH2-), til at reagere med nogle af lysinresternes e-amino- I grupper (eksempelvis Tu=monoklonalt antistof, Y=-NH2, idet I n er 50-100, fra tilgængelige lysingrupper) , ved en pH-værdi, I 5 der ligger mellem 7,0 og 9,5, i vandige pufrede opløsninger I ved temperaturer, der ligger mellem 4 og 40°C, hvorved man I får målrettede former af antibiotikaene, bundet til vilkår- I lige steder langs med proteingrundkæden (Tu=monoklonalt I antistof, Z=-NHCO-, Sp=-CH2CH2-, m=l-10). Kun en brøkdel af I 10 de tilgængelige lysinrester substitueres på denne måde, I eftersom højt indhold generelt ikke anses for at være kom- I patibelt med at konservere antistofimmunreaktiviteten. Man I kan ligeledes fremstile de samme vilkårligt substituerede I immunokonjugater ud fra 3-mercaptopropionsyrederivatet ved I 15 anvendelse af andre carboxylgruppeaktiverende midler, såsom I forskellige carbodiimider eller det tilsvarende acylazid.

I Alternativt reagerer et 3-mercaptoproopionyl-hydrazid-derivat I af Ε-33288Ϊ!1 (Q=H2NNHCO-, Sp=-CH2CH2-), når det reageres I med et periodat-oxideret antistof (Tu=monoklonalt antistof, I 20 Y=-CH0, n=l-15), beskrevet i US-patentskrift nr. 4.671.598, I ved en pH-værdi, der ligger mellem 4 og 7, i en puf ret vandig I opløsning ved en temperatur, der ligger mellem 4 og 40°C, I kun ved aldehydfunktionaliteten (afledt af spaltning af I vic-dioler af carbohydratrester beliggende på Fc-delen af I 25 antistofferne) til dannelse af monoklonale antistofkonjugater I indeholdende lægemidlet, substitueret på specifikke steder I langs med proteinets grundkæde (Tu=monoklonalt antistof, I Z=-CH=NNHCO-, Sp=-CH2CH2-, m=0,5-10). For at undgå at blokere I uomsatte aldehydgrupper på antistoffet og således undgå I 30 tværbinding samt stabilisere de hydrolytisk labile Schiff's- I base-bindinger foretrækker man (skønt det ikke er nødvendigt) at omsætte det sidstnævnte konjugat først med en forbindelse, I såsom acetylhydrazid eller tyrosinhydrazid, og derpå reducere I med natriumcyanoborhydrid eller natriumborhydrid, hvorved I 35 man får de stabiliserede konstruktioner ifølge opfindelsen I (Tu=monoklonalt antistof, Z=-CH2NHNHCO-, Sp=-CH2CH2-, m=0,5-

DK 174739 B1 I

10). Opfindelsen angår ligeledes andre aldehydreaktive grup- I

per som del af lægemiddelkonstruktionen til dannelse af I

produkterne fra reaktionsskema II. Sådanne funktionelle I

grupper er fortrinsvis, skønt ikke begrænsede til, grupper, I

5 som reagerer med aldehyder under sure vandige betingelser. I

Reaktiviteten af proteinlysiner under basiske betingelser I

er tilstrækkelig høj således, at deres aminer konkurrerer I

med produkterne fra reaktionsskema II om tilgængelige al- I

dehyder af det monoklonale antistof. Alternative aldehyd-

10 reaktive grupper er eksempelvis semicarbazidet, thiosemica- I

rbazidet og de O-substituerede hydroxylantigen-funktionali- I

teter. H

Kombinationer af målformer af de forbindelser, der H

er opført i tabel I, er ikke begrænset til den sekvens, der H

15 er skitseret i reaktionsskema II. Man kan først modificere I

målenheden (Tu) til at indeholde en thiolgruppe, som derpå I

omsættes med forbindelserne fra tabel I i overensstemmelse H

med reaktionsskema III nedenfor; I

Tu(Y)n + Q-Sp-S-P -> Tu-(z-Sp-SH)m I

25 (Y)n"m I

ch3-sss-w I

Tu-(Z-Sp-SS-W)m I

Reaktionsskema III H

35 idet Tu, Y, Q, Sp, w, n og m er som ovenfor defineret, og P H

er hydrogen eller 2-(pyridylthio), med det forbehold, at H

når Y er en thiol, afledt fra en grundkæde-aminosyregruppe H

fra Tu, er Z-Sp tilsammen en kovalent binding. H

Som et eksempel og med henvisninger til reaktionsskema H

40 III ovenfor kan man omsætte et monoklonalt antistof med 3- H

(2-dithiopyridyl)propionsyre-hydroxysucciniraidester for at H

modificere proteinet ved hjælp af lysingrupper (Tu=monoklo- H

nalt antistof, Y=NH2, n=50-100, Q=-C02Su, SP=-CH2-CH2-, I

I DK 174739 B1 I 8 I P=2-pyridylthio). Efter reduktion med eksempelvis dithiotrei- I tol dannes der et mellemprodukt (Tu=monoklonalt antistof, I Z=-NHCO-, Sp=-CH2CH2-, m=l-15), som kan omsættes med forbin- I delserne fra tabel I til dannelse af de her omhandlede immu- I 5 nokonjugater. På lignende måde kan man omsætte 2-iminothiolan I med et monoklonalt antistof for direkte at indføre thiolgrup- I per på overfladen af proteinet, uden at der kræves et reduk- I tionstrin (Tu=monoklonalt antistof, Z=-NHCO-, Sp=-(CH2)3”, i I m=l-15), og dette mellemprodukt kan omsættes med forbindel- I 10 serne fra tabel 1 som ovenfor. Alternativt kan man anvende I sulfhydrylgrupper, der er iboende i de monoklonale antistof- I fers struktur i dimer form som cysteingrupper, til direkte I at deltage i reaktionen fra reaktionsskema III. Sådanne I sulfhydryler eksponeres traditonelt ved en kombination af I 15 enzymatisk nedbrydning og reduktion af native monoklonale I antistoffer (tu=Fab·-fragment, Z-Sp=binding, Y=SH), men I opfindelsen angår ligeledes anvendelsen af genetisk ændrede I konstruktioner af monoklonale antistoffer indeholdende upar- I rede cysteingrupper.

I 20 En foretrukken udførelsesform for den foreliggende I opfindelse er et protein-lægemiddelkonjugat med formlen I Tu-(Z-Sp-SS-W)m I i I 25 (Y)n_m I fremstillet ud fra det antitumor-antibiotikum, som har beteg- I nelsen LL-E33288TT-I1 (CH3SSS-W) med I a) et ultraviolet spektrum vist i fig. 1, I 30 b) et proton-spektrum som vist i fig. 2, I c) et infrarødt spektrum som vist i fig. 3, og I idet dithiomethyldelen fortrænges med en forbindelse med I formlen Q-Sp-SH, hvori Sp er ligekædede eller forgrenede I divalente C2_5~grupper eller divalente C2_5-arylalkyl- eller I 35 -heteroarylalkyl-grupper, og Q er carboxyl, lavere alkyl- I dicarboxyl-anhydrid, -C02Su, -C0NHNH2 eller I "C02

DK 174739 B1 I

hvorved man får et mellemprodukt med den almene formel Q-

Sp-SS-w, idet Q, Sp og W er som ovenfor defineret, I

ved at omsætte Q-Sp-SS-W med et molekyle med formlen I

Tu-(Y)n, idet Tu er et monoklonalt antistof, som viser pre- H

5 ferencereaktivitet med et humant tumor-forbundet antigen, Y H

er en sidekædeaminogruppe på antistoffet eller et aldehyd, H

dannet ved oxidation af carbohydratgrupperne i antistoffet, H

og n er et helt tal fra 1 til 100, hvorved man får en forbin- I

delse med formlen H

Tu-(Z-Sp-SS-W)m I

15 idet Tu, Y, Sp, W og n er som ovenfor defineret, og Z er H

dannet ud fra covalent omsætning mellem grupperne Q og Y H

direkte eller efter senere reduktion, og Z er -CONH-, CON- H

HN=CH-, -CONHNHCH2-, eller I

-nhcoch2-ch I

(CH2)0#i I

25 C02H I

og m er 1-15. H

Man anvender flere forskellige monoklonale antistoffer H

("antibodies"), (MoAb'er) til at eksemplificere målretning H

30 af methyltrithio-anticancerforbindelserne. MoAb'erne Lym 1 H

og Lym 2 genkender forskellige antigener på modne B-lym- H

phocytter og deres produkt lymphomaerne. Produktionen og H

egenskaberne af disse MoAb'er er beskrevet af A.L. Epstein, H

et. al., "Cancer Research" 47, 830 (1987). MoAb B72.3 er H

35 først og fremmest rettet mod carcinomer i bryst og tyktarm, H

skønt man ligeledes konstateret reaktivitet med bugspytkir- H

tel-, æggestok- og lungecarcinomer. Antistoffet er beskrevet H

af T.L. Klug, et. al., "Int. J. Cancer" 38, 661 (1986). I

MoAb CT-M-01, som først og fremmest genkender brysttumorer, H

40 er beskrevet i EP-ansøgning nr. 86 401.482.4, og MAC-68 H

produceres af en subklon af hybridomaet, som producerer CT- H

I DK 174739 B1 I 10 I -M-01, og genkender både bryst- og tarmcarcinomer. Mellempro- dukter af de her omhandlede forbindelser, der er anvendelige I til, og konjugater med disse antistoffer er beskrevet i I eksemplerne. Det bør imidlertid ikke fortolkes således, at I 5 dette patentskrift er begrænset til eller begrænset af de I ovennævnte antistoffer. I stedet for er metoden tilstrækkelig I generel til, at den kan anvendes til alle antistoffer uanset I klassen eller isotypen deraf, deres enzymatisk-afledte frag- I menter, deres kemisk manipulerede og stabiliserede fragmenter I 10 samt deres hhv. chimpanse- og humaniserede modparter. Målen- I hederne er heller ikke kun begrænset til monoklonale anti- stoffer. Andre proteiner samt små molekyler, for hvilke der I på målvæv foreligger receptorer, ligger indenfor den forelig- I gende opfindelses ramme som målentiteter.

I 15 De her omhandlede fremgangsmåder, der anvendes til fremstilling af monoklonale antistofkonjugater ud fra forbin- I delserne fra tabel I, giver konstruktioner, som bevarer god I immunoreaktivitet med målcellelinier, bestemt ved de følgende I in vitro analyser: I 20 Målceller I Alle målceller holdes i RPMI 1640 medier, suppleret I med 5% føtal kalveserum (FCS), ITS (Collaborative Research, katalog nr. 4 0351) , 50 μg streptomycin pr. ml, 50 enheder I penicillin pr. ml, 50 μg gentamycinsulfat pr. ml og 0,03% I 25 glutamin. Cellerne holdes i en fugtiggjort 5% C02 inkubator I ved 37°C.

I I. Immunoreaktivitetbestemmelser I Fremgangsmåde I - Elisa I Passende målceller høstes, tælles og suspenderes i I 30 Dulbecco's phosphatpufret saltvandsopløsning (DPBS) ved en I optimal koncentration for det monoklonale antistof (MoAb), I der undersøges. 0,1 ml celler sættes i en portion til hver I brønd af en 96's brønds steril vævskulturplade af polystyren.

I Pladerne centrifugeres i 5 minutter ved 1000 opm, og den I 35 ovenstående væske fjernes hurtigt. Pladerne lufttøres natten I over og kan opbevares ved 4°C i op til 3 måneder.

DK 174739 B1 I

Ikke-specifikke bindingssteder blokeres ved tilsætning H

af 200 μΐ 1% gelatine DPBS pr. brønd og ved at inkubere H

pladen i 1 time ved 37°C i en fugtig inkubator. (Alle senere H

inkubationer foretages under lignende betingelser. Pladerne H

5 vaskes én gang med 250 μΐ 0,05% Tween-20 i DPBS {vaskeopløs- H

ning) under anvendelse af det automatiserede ELISA-vaskesy- I

stem fra Dynatech (Ultrawash II). De prøver, der skal under- H

søges, fortyndes til en slutkoncentration på 3 μg MoAb-æk- H

vivalenter pr. ml i 0,1% gelatine DPBS. Seks yderligere 3 H

10 ganges rækkefortyndinger fremstilles ud fra hver gang 3 μg I

prøve pr. ml, og der sættes 100 μΐ til passende brønde in H

triplo. Den nederste række brønde får kun 100 μΐ 0,1% gela- H

tine som baggrund. Pladerne inkuberes i 45 minutter og vaskes H

derpå 3 gange. Alkalisk phosphatase konjugerede affinitets- H

15 rensede gede-anti-muse-immunglobuliner (Cappel katalog nr. H

8611-0231) fortyndes i forholdet 1:125 i 0,1% gelatine, og I

der sættes 100 μΐ til hver brønd. Pladerne inkuberes i 45 H

minutter og vaskes derpå 3 gange. Der sættes 200 μΐ p-nitro- H

phenylphosphatsubstrat-opløsning (jvf. nedenfor) til hver H

20 brønd. Efter 45 minutter ved stuetemperatur standses reak- H

tionen ved tilsætning af 50 μΐ 3M natriumhydroxid-opløsning. H

Absorbansen af indholdet i hver brønd aflæses ved 405 nm i H

det automatiserede spektrofotometer fra Dynatech (EIA Auto- I

reader nr. EL-310). H

25 Substrat diethanolaminpuffer (10%) H

97 ml diethanolamin H

800 ml vand H

0,2 g NaN3 I

100 mg MgCl2'6H20 I

30 Reagenserne opløses ved kontinuert omrøring, og der H

tilsættes 1M saltsyre, indtil pH-værdien er 9,8. Hele rumfan- H

get suppleres op til 1 liter med vand og filtersteriliseres H

med et 0,2 μτη filter. Pufferen opbevares i mørke ved 4°C. H

Umiddelbart før anvendelse opløses p-nitrophenylphosphat H

35 (Sigma, katalog nr. 104-40) i en 10% diethanolaminpuffer I

(skal foregå ved stuetemperatur) til en slutkoncentration H

I DK 174739 B1 I 12 I på 1 mg pr. ml.

I Beregning af værdier for optisk densitet I Den procentvise binding af hver prøve beregnes ved I 5 hjælp af den følgende ligning: I x 100 % binding

I 10 C~B

I A = Gns. O.D. af prøve I B = Gns. O.D. af baggrund I C = Gns. O.D. af 3 μg/ml umanipuleret MoAb kontrol I Den procentvise binding plottes på den ikke-logarit- I 15 miske skala på semilogaritmisk kurvepapir, og MoAb-koncentra- I tionen plottes på den logaritmiske skala. BD50 (dvs. den I dosis antistof, der er nødvendig for at give 50%'s binding) I for hver prøve udledes af kurven, og størrelsen af immunore- I aktivitetsretentionen beregnes ved hjælp af den følgende I 20 ligning: I j^.50- MoAb kontrol ioø _ % bevaret immunoaktivitet I 25 BD50 af prøve

I Fremgangsmåde 2 - Indirekte RIA

I Passende mængder målceller i 0,2 ml 10% FCS-medium I sættes portionsvis til 4 ml polystyrenprøveglas. Prøver, I 30 der skal undersøges, fortyndes til en koncentration på 2 μg I MoAb-ækvivalenter pr. ml i 10% FCS-medium. Der fremstilles I fem 3 ganges række fortyndinger ud fra hver gang 2 μg prøve I pr. ml, og der sættes 0,2 ml til hvert prøveglas in duplo.

I Baggrundsprøver får kun celler og medium. Cellerne inkuberes I 35 ved 4°C i 1 time og vaskes derpå 2 gange (al RIA-vask udføres I med et rumfang på 3 ml) med 2% FCS-medium. Der sættes 0,05 I ml fåre-F(ab1)2-anti-muse-IgG [125I] (DuPont, Katalog nr.

I NEX 162-014) indeholdende ca. 500.000 CPM'er til hvert prøve- I glas. Cellerne inkuberes i yderligere 1 time ved 4°C, vaskes I 40 1 gang med 2% FCS og 2 gange med PBS. Der sættes 0,5 ml I PBS til hvert prøveglas, cellerne omhvirvles, overføres til I rene prøveglas og tælles i 1 minut i Packard Gamma 500.

I Den procentvise binding for hver værdi bestemmes og I overføres i kurveform ligesom den ovennævnte ELISA-ligning

DK 174739 B1 I

med den undtagelse, at de optiske densitetsenheder erstattes H

med CPM'er, og at C = gennemsnits-CPM'er for 1 μg umanipule- H

ret MoAb-kontrol pr. ml. Den procentvise immunoreaktivitet, H

som bevares for hver prøve, beregnes som ovenfor omtalt. H

5 Fremgangsmåde 3 - Direkte RIA H

Hensigtsmæssige mængder målceller i 1 ml 10% FCS- H

medium sættes portionsvis til 4 ml1 s polystyrenreagensglas, H

centrifugeres, og den ovenstående væske kastes bort. De H

prøver, der skal undersøges, fortyndes til en koncentration H

10 på 200 ^g MoAb-ækvivalenter pr. ml i 10% FCS-medium. Der H

fremstilles fem yderligere 5 ganges rækkefortyndinger ud H

fra hver gang 200 μg prøve pr. ml, og der sættes 0,05 ml H

til hvert glas in duplo. Der sættes 0,05 ml 125I-MoAb til H

hvert glas (den optimale mængde bestemmes særskilt for hvert H

15 MoAb og portion). Positive kontrolprøver indeholder celler, H

medium og 125I-MoAb. Baggrundsprøver indeholder uspecifikke H

celler, medium og 125I-MoAb. Cellerne inkuberes i 1 time H

ved 4°C, vaskes én gang med 2% FCS-medium, 2 gange med PBS, H

overføres og tælles som nævnt ovenfor. H

20 Den procentvise 12^I-MoAb-bindingsinhibering af hver H

prøve beregnes ved hjælp af den følgende ligning: H

25 x 100 = % 125I-MoAb bindingsinhibering H

A = Gns. CPM'er fra prøve H

B = Gns. CPM'er fra baggrund H

C = Gns. CPM'er fra positiv kontrol H

30 Plotningen og procent bevaret immunoreaktivitet for H

hver prøve beregnes som ovenfor omtalt med den undtagelse, H

at BD50 faktisk er BID50 (den dosis MoAb, som er nødvendig H

for at give 50%'s inhibering af bindingen af l^I-MoAb) . H

Noter;

35 1) Glassene omhvirvles hver gang kraftigt umiddelbart I

efter tilsætning af hvert enkelt reagens i RIA'erne. H

2) En intern kontrolprøve, som er lig med 50% af den H

umanipulerede MoAb-kontrol, inkluderes i hvert sæt analyser H

for at bekræfte, om hver enkelt fremgangsmåde er kvantitativ H

40 ved forudsigelse af konjugaternes immunoreaktivitetsreten- H

I DK 174739 B1 I 14 I tion.

I Resultaterne fra disse bestemmelser er angivet i I tabelform i tabel II nedenfor.

I 5

I Tabel II

I Immunoreaktivitet af MoAb-koniuqater I Uspecifikke konjugater I 10 idet der anvendes pro- Immunoreaktivitet I duktet fra eksempel 3 Præparat i % af umodificeret I sammen med: nr. Moab kontrol I Lym 1 1 15 I 15 I B72.3 1 70 I 2 10 I Hydrazid af 3-mercap- I 20 topropionsyre-disul- I fid-analog af I E33288I21 (eksempel 4), I konjugeret til: I Lym 1 1 100 I 25 2 87 I 3 64 I 4 80 I 5 100 I 30 Hydrazid af 3-mercapto- I propionsyre-disulfid- I analog af £33288 ^1 (ek- I semoel 4. konjugeret til: I Lym 2 1 57 I 35 2 85 I 3 39 I 4 70 I B72.3 1 100 I 40 2 90 I CT-M-91 1 60 I MAC-68 1 40 I 45 2 28

Hydrazid-konjugater I fremstillet ved anven- I delse af produktet fra I 50 eksempel 5 sammen med: I Lym 1 1 100 I 2 100

DK 174739 B1 I

De monoklonale antistofkonjugater ifølge opfindelsen H

er virksomme som anticancermidler. Den nedenfor beskrevne H

bestemmelse til vurdering af in vitro cytotoksicitet viser H

konstruktionernes dramatiske preference for målcellelinier H

5 i modsætning til ikke-målcellelinier og giver et mål for H

anvendeligheden af målrettede former af forbindelserne, H

sammenlignet med deres ikke-målrettede modparter.

Cvtotoksicitetsbestemmelse H

In vitro H

10 Prøver, der skal undersøges, fortyndes til en kon- H

centration på 0,2 eller 0,02 μg LL-E33288i^-ækvivalenter H

pr. ml (udgangskoncentrationen er afhængig af den cellelinie, H

der skal undersøges) . Der fremstilles tre yderligere 5 ganges H

fortyndinger fra hver oprindelig prøvefortynding, og der H

15 sættes 0,2 ml til sterile 15 ml's polystyrenprøveglas. Der H

inkluderes i hver bestemmelse mindst ét lignende konjugat H

bestående af LL-E33288jog et irrelevant MoAb til bestem- H

melse af specificiteten af det relevante konjugat. Der sættes H

portionsvis 105 passende målceller i 0,2 ml 10% FCS-medium H

20 til prøveglassene, og der omhvirvles. Desuden udføres en H

identisk prøve ved anvendelse af irrelevante celler som mål H

til yderligere at bekræfte specificiteten af relevant kon- H

jugat. MoAb-kontroller får kun ækvivalente mængder MoAb, og H

positive kontrolprøver får kun 10% FCS-medium. H

25 Cellerne inkuberes ved 37°C i 7 minutter og vaskes H

derpå 4 gange med 8 ml 2% FCS-medium. Der sættes 0,1 ml 10% H

FCS til hvert glas, cellerne omhvirvles, og der sættes por- H

tionsvis 0,2 ml til hver brønd i en steril 35 brønds vævs- H

kulturplade af polystyren. H

30 Pladerne inkuberes i 2 dage i en fugtiggjort 37°C H

varm inkubator med 5% C02 - Halvdelen af mediet fjernes og H

erstattes med frisk medium indeholdende 2 /iCi/ml 3H-thymidin H

(DuPont, NEN, Katalog nr. NET-027). Inkubationen fortsættes H

i 24 timer, cellerne fryses ned, tøs op og høstes med en H

35 PHD-cellehøster (Cambridge Technology, Inc.). Hver prøve H

tælles i 1 minut i en Beckman LS 5800 scintillationstæller H

I DK 174739 B1 I 16 I på kanal 1.

I Den procentvise vækstinhibering beregnes som følger: I 5 flis.;, CPM af forsøgsværdi_ = % k

I Gns. CPM af kontrolmedium x 1UU * væKSU

I 100 - % vækst = Inhibering I 10 I Den procentvise inhibering plottes på den ikke-loga- I ritmiske skala på et semilogaritmisk kurvepapir og LL-E33- I 288;^-koncentrationen plottes på den logaritmiske skala.

I IC5o-værdien (den koncentration af LL-E33288;, der er I 15 nødvendig for at give 50% inhibering) for hver prøve udledes I af kurven, og størrelsen af cytotoksicitetsretentionen bereg- I nes ved hjælp af den følgende ligning: I 20 ICqn af LL-E33288 H1 ^ I T/^au „c -u- x 100 = % bevaret cytotoksicitet

IC5Q a*- prøve J

I Resultaterne fra in vitro cytoksicitetsbestemmelsen I er angivet i tabelform nedenfor.

DK 174739 B1 I

Tabel III H

In vitro cvcotoksicitet af MoAb-koniuaater H

Moab Præparat nr. Cvtotoksicitet H

% produkt fra H

LL-E33288t1^1 eksempel 1 H

Uspecifikke kon- H

10 jugater fremstil- H

let ved anvendelse

af produkt fra ek- H

sempel 3 sammen med: Lym 1 0,9 11,3

15 B72.3 1 0,001 I

2 1,4 3,8

LL-E33288U21 % produkt fra H

20 eksempel 4

Hydrazidkonjuga- H

ter fremstillet H

ved anvendelse af H

produkt fra eksem- H

25 pel 4 sammen med: H

Lym 11 80 H

2 56 191 3 40 60

Lym 1 (nr. 3 mod 0 0 30 ikke-målret-

tede celler) H

Lym 2 1 29 H

2 2 100

35 3 2 55 H

B72.3 100

40 MAC-68 1 90 H

CTM-01 1 111 830 I

45 LL-E3328801I I

Hydrazidkonjuga- H

' ter fremstillet H

ved anvendelse af H

produkt fra eksem- H

50 pel 5 sammen med:

Lym 1 1 300 H

I DK 174739 B1 I 18 I Det følgende analysesystem anvendes til måling af in I vivo-aktiviteten af konjugaterne ifølge opfindelsen.

I In_vivo-afprøvninger for antitumorvirkning på lægemid- I del-monoklonale antistof-konjugater udføres ved anvendelse I 5 af humane tumor xenotransplantationer i athymiske (nøgne) I mus.

I Burkitt lymphom (Raji)- og myelom (HS Sultan)-celler I høstes fra dyrkningskolber og inokuleres subkutant (:> 80 x I 10*> Raji-celler eller 40 x 10^ HS Sultan-celler) i forsøgs- I 10 mus. Faste tumorer, æggestokscarcinomer (CA73, Ovcar-3) og I brystcarcinom (MX-1) propageres i athymiske mus, fjernes, I skæres i stykker på 2 mm·^ og implanteres subcutant i forsøgs- I mus (5-8 fragmenter pr. mus).

I Lægemidler, monoklonale antistoffer og lægemiddel- I 15 monoklonale antistofkonjugater indgives intraperitonealt én I gang hver 3. dag med i alt 3 eller 5 injektioner, idet man I starter på dag 2, 3, 4, 6, 7 eller 8 efter tumorimplanta- I tionen. Tumormålinger (længden og bredden af tumoren) udføres I ved hjælp af en Fowler ultra CAL II elektronisk skydelære I 20 hver 7. dag i 4 eller 5 uger efter tumorimplantation. Tumor- I masse i mg vurderes ud fra formlen: I Længde (mm) x Bredde (mm) I 25 2 I Tumorvækstinhibering beregnes for hver forsøgsgruppe I i procent i forhold til en kontrol [gennemsnitsantal mg for I de behandlede (B) delt med gennemsnitsantal mg for kontrollen I 30 (K) x 100] . En B/K-værdi s 42% i grupper med antal over- I levende dyr, som er højere end eller lig med 65%, anses for I at være nødvendig for at påvise virkning.

I Resultaterne fra denne bestemmelse fremgår af tabel I iv· I 35

DK 174739 B1 I

Tabel IV I

In vivo antitumorforsøcrsresultater H

Dosis (meg) Tumorstørrelse S/T

5 Læge- H

MoAb middel (B/K)%kontrol I

Hydrazid af 3-mercaptopro- 14,5 0,26 12 5/6 H

pionsyre-disulfid-analog af H

10 LL-E33288U1·*· konjugeret til H

Lym 2 H

Hydrazid alene 0,26 34 4/6 H

15 MoAb Lym 2 alene 14,5 - 32 6/6 H

Blanding, hydrazid + H

MoAb Lym 2 14,5 0,26 20 5/6 H

20 ip behandling mod human melanom cellelinie H.S. Sultan, H

3 injektioner, der starter på dag 5 efter tumor-implantation, H

angivne målinger foretaget på dag 35 post-implantation H

25 Hydrazid af 3-mercaptopro- 15,5 0,25 39 7/7 H

pionsyre-disulfid-analog af H

LL-E33288U1^ konjugeret til H

MAC-68

30 Hydrazid alene - 0,25 - 0/6 H

MoAb MAC-68 alene 31 - 78 6/6 I

Blanding, hydrazid + 15,5 0,25 - 0/6 H

35 MoAb MAC-68 H

Melphalan (som positiv - 10 43 6/6 H

kontrol) H

40 ip behandling mod human æggestokscancer linie CA73, H

3 injektioner, der starter på dag 3 efter tumor-implantation, H

angivne målinger foretaget på dag 35 post-implantation H

I DK 174739 B1 I 20 i I Tabel IV (ftyrt-ftati I In vivo antitumorforsøgsresultater

I Dosis (mca) Tumorstorrelse S/T

I 5 Læge- I MoAb middel (B/K)%kontrol I Hydrazid af 3-mercaptopro- 8,75 0,25 14 4/6 I pionsyre-disulfid-analog af I 10 LL~E33288U1^ konjugeret til I CT-M-01 I Hydrazid alene - 0,25 - 0/6 I 15 MoAB CT-M-01 alene 8,75 - 75 5/6 I Blanding, hydrazid + I MoAb CT-M-01 8,75 0,25 - 0/6 I 20 Vincristine (positiv - 1,0 0 4/4 I kontrol) I ip behandling mod human brystcancer cellelinie MX-1, I 3 injektioner, der starter på dag 2 efter tumor-implantation I 25 angivne målinger foretaget på dag 35 post-implantation I Hydrazid af 3-mercaptopro- - 0,125 85 6/6 I pionsyre-disulfid-analog af I 30 LL-E33288U-j^ konjugeret til I B72.3 I Hydrazid alene - 0,125 85 6/6 I 35 MoAb B72.3 alene 6,2 - 96 6/6 I Blanding, hydrazid + 6,2 0,125 105 5/6 I MoAb B72.3 I 40 LL-E33288U11 - 0,005 141 5/6 I (3 behandlinger)

Cis-platin (positiv - 3,0 6 6/6 I kontrol, 3 behandlinger) I 45 _ I ip behandling mod human æggestokscellelinie OVCAR-3, I 5 injektioner, der starter på dag 4 efter tumor-implantation I (medmindre andet er angivet), angivne målinger foretaget på I dag 35 post-implantation I 50 ____

DK 174739 B1 I

Tabel IV (fortsat) H

In vivo antitumorforsagsresultater H

Dosis (mcg) Tumorstørrelse S/T H

5 Læge- H

MoAb middel (B/K) %kontrol H

Hydrazid af 3-mercaptopro- 27 0,26 6 6/6

pionsyre-disulfid-analog af H

10 LL-E33288U1I konjugeret til H

Lym 1

Hydrazid alene 0,26 72 6/6 I

15 MoAb Lym 1 alene 27 - 72 6/6

Blanding, hydrazid + H

MoAb Lym 1 13 0,13 61 4/6 H

20 ip behandling mod human Burkitt-lymphomcellelinier Raji TC, H

3 injektioner, der starter på dag 7 efter tumor-implantation, H

angivne målinger foretaget på dag 28 post-implantation H

I DK 174739 B1 I 22 I Opfindelsen beskrives yderligere i forbindelse med I de følgende ikke-begrænsende eksempler.

I Eksempel 1 I 5 3-Mercapbopropionsvredisulfidanaloo af LL-E33288; I Til en opløsning af 90 mg LL-E33288i11 i 90 ml ace- I tonitril sættes der 10,6 mg 3-mercaptopropionsyre i 1 ml I acetonitril. Opløsningen omhvirvles og opbevares derpå ved- I 20°C i 6 dage. Opløsningsmidlet fjernes i vakuum, og rema- I 10 nensen chromatograferes over 10 ml silicagel i methylenchlo- I rid. Søjlen elueres med 50 ml methylenchlorid, 50 ml 4% I methanol i methylenchlorid og til slut 100 ml 8% methanol i I methylenchlorid. Ved inddampning af den sidste fraktion fås I en remanens, som tages op i ethylacetat ved hjælp af lidt I 15 acetone og dråbevis sættes til et overskud af hexan. Ud- I fældningen opsamles og tørres, hvorved man får 39 g af det I ønskede produkt (FABMS, M+H 1394). Retentionstiden på C^g- I "reverse phase" HPLC: med 50% acetonitril/0,1 M vandigt I ammoniumchlorid. (LL-E33288i i1: 8,0 minutter, esterhydroly- I 20 seprodukt: 1,5 minutter).

Eksempel 2 I Reaktion af LL-E33288 i ]_* med p-nitrophenylesteren af 3-mer- I captopropionsyre I 25 --- I (A) Fremstilling af p-nitrophenylester af 3-mercaptopro- I pionsyre I Kommerciel 3-mercaptopropionsyre i methylenchlorid I indeholdende en katalytisk mængde koncentreret svovlsyre I 30 behandles med isobutylen i 20 minutter. Opløsningen ekstra- I heres derpå med IN natriumhydrogencarbonat-opløsning, hvor- I efter methylenchloridopløsningen tørres ved anvendelse af I vandfrit magnesiumsulfat. Opløsningen inddampes derpå til I en farveløs mobil væske, som ved hjælp af NMR og massespek- I 35 trale data påvises at være S-t-butylmercaptopropionsyre, t- I -butylesteren.

I En portion af denne ester tilbagesvales med 6N salt-

DK 174739 B1 I

syre i dioxan i 2,5 timer. Opløsningsmidlet bortdampes, der H

tilsættes ethylacetat, og denne opløsning ekstraheres med H

natriumcarbonat. Natriumcarbonatekstrakten behandles med 6N H

saltsyre, indtil pH-værdien af suspensionen er 2,0. Suspen- H

5 sionen ekstraheres derpå med ethylacetat, ekstrakten tørres H

over vandfrit magnesiumsulfat, og opløsningsmidlet bortdampes H

til dannelse af en farveløse væske, som ved hjælp af ’H-NMR H

og massespektrale data påvises at være S-t-butylmercaptopro- H

pionsyre. H

10 Denne forbindelse omdannes til p-nitrophenylesteren H

ved behandling med ækvimolære mængder p-nitrophenol og di- H

cyclohexylcarbodiimid i tetrahydrofuran i 4 timer. Dicyclo- H

hexyl-urinstof-biproduktet fjernes ved filtrering, og filtra- H

tet inddampes til en olie, som renses ved at passere over H

15 neutralt silicagel ved anvendelse af opløsningsmiddelsystemet H

hexan/methylenchlorid i forholdet 50:50. Det rene p-nitrophe- H

nylesterderivat er en blegt gul, mobil olie. H

Den frie mercaptan demaskeres ved den følgende frem- H

gangsmåde. S-t-butylmercaptopropoionsyre-p-ntriphenylesteren H

20 opløses i trifluoreddikesyre, og der tilsættes et lille H

molært overskud (10%) af mercuriacetat. Blandingen omrøres H

i 30 minutter, derefter bortdampes trifluoreddikesyren, og H

remanensen tages op i dimethylformamid. Denne opløsning H

behandles med hydrogensulfidgas i 15 minutter, derefter H

25 skilles det sorte mercurisulfid fra ved filtrering, og fil- H

tratet inddampes under formindsket tryk til fjernelse af op H

til 99% af dimethylformamidet. Den fremkomne let brunlige H

mobile væske renses over neutralt silicagel ved anvendelse H

af hexan/methylenchlorid i forholdet 50:50. Den største H

30 komponent indeholder, påvist ved hjælp af -*-H NMR en lille H

mængde af t-butylmercaptoderivatet. Analytisk HPLC over to H

Perkin-Elmer Pecosphere C]_8~søjler efter hinanden [4,6 x 33 I

mm og 4,6 x 83 mm] ved anvendelse af et gradientsystem fra H

37,/62,5 til 47,5/52,5 af acetonitril og 0,1M ammoniumace- I

35 tatpuffer ved pH-værdi lig med 6,5 (eddikesyre) over et H

tidsrum på 12 minutter viser, at produktet for 88%'s ved- I

I DK 174739 B1 I 24 I kommende er p-nitrophenylesteren af 3-mercaptopropionsyre I og for 10%'s vedkommende den mindre polære S-t-butylmercapto- I propionsyre-p-nitrophenylester. Der er ligeledes en lille I mængde fri p-nitrophenol til stede.

I 5 (B) Reaktion af p-nitrophenylester af 3-mercaptopro- I pionsyre med LL-E33288 i-i1 LI_ I En portion på 100 mg 1.1^33288^1 opløses i 50 ml I acetonitril. Til denne sættes en opløsning af 25,7 mg p- I 10 nitrophenylester af 3-mercaptopropionsyre i 1 ml acetonitril.

I Reaktionsblandingen henstår ved -20°C i 48 timer. HPLC viser, I at reaktionen er tilendebragt. Opløsningen inddampes til I tørhed, og remanensen tages op i 4-5 ml ethylacetat ved I anvendelse af lydbehandling til at bevirke opløsning. Blan- I 15 dingen filtreres, og filtratet dryppes til 45 ml omrørt I hexan. Det fremkomne blegt gule faste stof opsamles og tørres I under formindsket tryk, hvorved man får 93 mg af p-nitrophe- I nylesteren af propionsyrederivatet af LL-E33288 \ , konsta- I teret ved hjælp af en 1H-NMR. Ved FABMS viser [M+H]-ionen I 20 sig ved M/Z = 1515.

Eksempel 3 I N- Hydroxy succ in i mi dy 1 - 3 -mercaptopropionat-di sulfid-analog I af LL-E33288 i τ1 I 25 -1- I Til en opløsning af 5 mg af den 3 - me reap topr opionsyre- I -disulfid-analoge af LL-E33288I-L1 fra eksempel 1 i 0,5 ml I tetrahydrofuran sættes der 0,5 mg N-hydroxysuccinimid i 0,1 I ml tetrahydrofuran og derpå 1,8 mg dicyclohexylcarbodiimid I 30 i 0,2 ml tetrahydrofuran. Man lader reaktionsblandingen I omrøre ved stuetemperatur i 4 timer, og derefter læskes den I med et stort overskud hexaner. Det faste stof isoleres ved I filtrering og opløses i ethylacetat. Den fremkomne opløsning I vaskes 3 gange med saltvand, tørres med magnesiumsulfat og I 35 inddampes, hvorved man får 5 mg af det ønskede produkt som I et gulligbrunt pulver, som anvendes uden yderligere rensning.

I Retentionstid på "reverse phase" C^g HPLC: 15 minutter med

DK 174739 B1 I

40% acetonitril/0,1 M vandigt ammoniumchlorid (udgangsmateri- H

ale: 6,0 minutter). H

Eksempel 4 H

5 3-Mercaptopropionyl-hydrazid-disulfid-analog af H

LL-E33288i-i 1 I

______lz_;_

Til 5,4 ml (3 ækvivalenter) vandfrit hydrazin i 100 H

ml tilbagesvalende tetrahydrofuran under argon sættes der H

10 dråbevis 9,2 ml (83 mmol) methyl-3-mercaptopropionat i 50 H

ml tetrahydrofuran i løbet af 2 timer. Opløsningen tilbage- H

svales yderligere 2 timer, inddampes og fortyndes derpå og H

inddampes 2 gange fra 300 ml toluen. Produktet påføres på H

en prop af silicagel med 5% ethylacetat/chloroform og elueres H

15 fra proppen med 20% methanol/chloroform. Det fremkomne 3- H

-mercaptopropionyl-hydrazid er en blegt lyserød olie, som H

størkner, når den afkøles, men smelter ved stuetemperatur. H

Til 50 mg LL-E33288i1I i 50 ml acetonitril ved -15°C sættes H

der 6,6 mg 3-mercaptopropionyl-hydrazid i 1 ml tetrahydrofu- H

20 ran. Der tilsættes 1 ækvivalent triethylamin og/eller 1 H

ækvivalent eddikesyre som katalysator. Man lader reaktions- H

blandingen omrøre ved 0°C i 1 time, og opløsningsmidlet H

bortdampes derpå. Remanensen chromatograferes på silicagel H

med 10-15% methanol i chloroform gradient, hvorved man får H

25 26 mg af det ønskede produkt. Retentionstiden på reverse H

phase Cig HPLC: 5 minutter i 41% acetonitril/0,1 M vandigt H

ammoniumchlorid. H

Eksempel 5 H

30 N- [ [(4-Methyl-kumarin-7-yl)amino] acetyl]cystein-hydrazid- H

disulf id-analog af LL-E33288 i _ I

En blanding af 1,0 g (5,7 mmol) 4-methyl-7-aminokuma- H

rin, 3,0 ml ethylbromacetat (5 ækvivalenter), 90 mg (0,1 H

35 ækvivalent) natriumiodid og 30 ml dimethylformamid opvarmes H

under argon ved 80°C i 5 timer. Blandingen afkøles, fortyndes

med ethylether, vaskes 3 gange med 50% saltvand, tørres med H

I DK 174739 B1 I 26 I magnesiumsulfat og inddampes til tørhed. Det rå produkt I opløses i chloroform indeholdende 1% ethylacetat og filtreres I gennem en prop af silicagel. Ved omkrystallisering fra di- I ethylether indeholdende et spor af chloroform fås rent ethyl- I 5 -N-[(4-methyl-kumarin-7-yl)amino]acetat.

I Til 1,96 g (7,5 mmol) af den ovennævnte ester i 15

I ml methanol og 15 ml tetrahydrofuran sættes der 10 ml IN

I vandigt natriumhydroxid. Efter 30 minutters forløb tilsættes I der 4 ml 10% saltsyre. De organiske opløsningsmidler bortdam- I 10 pes, og det fremkomne krystallinske produkt filtreres og I vaskes med kold ethanol og derefter ether. Dette materiale I opløses i 20 ml tetrahydrofuran og 4 ml dimethylformamid.

I Der tilsættes 1,3 g (2,2 ækvivalenter) dicyclohexylcarbonyl- I diimidazol, og man lader reaktionsblandingen omrøre i 15 I 15 minutter. Der tilsættes derefter 1,6 g (2,5 ækvivalenter) cy- I steinethylester·hydrochlorid og 1,2 ml triethylamin. Efter I yderligere 3 timers forløb fortyndes reaktionsblandingen I med ethylether indeholdende 5% methylenchlorid og vaskes 1 I gang med 10% saltsyre og 2 gange med saltvand. Efter tørring I 20 med magnesiumsulfat og bortdampning af opløsningsmidlerne I krystalliseres det rå produkt ved opløsning i chloroform I indeholdende en minimal mængde ethanol og derpå tilsætning I af et overskud af ether. Krystallerne skilles fra ved fil- I trering og tørres, hvorved man får ren N-I[(4-methylkumarin- I 25 7-yl)amino]acetyl]cystein-ethylester.

I En blanding af 5 ml chloroform, 20 ml methanol og I 0,4 ml hydrazinhydrat opvarmes til tilbagesvaling under I argon. Til dette sættes der 550 mg N-[[(4-methyl-kumarin-7- I -yl)amino]acetyl]cystein-ethylester. Efter tilbagesvaling i I 30 9 timer afkøles blandingen, og det faste produkt skilles I fra ved filtrering og vaskes med chloroform og derefter I ethylether. Det rå produkt (som indeholder thiol og disulfid) I opløses i dimethylformamid indeholdende dithiothreitol og I triethylamin. Efter 30 minutters forløb udfældes med produk- I 35 tet med overskydende ethylether og opsamles ved filtrering.

I Dette materiale renses yderligere ved omkrystallisering fra

DK 174739 B1 I

afgasset acetonitril indeholdende dithiothreitol og et spor H

af triethylamin, hvorved man får rent N-[[(4-methyl-kumarin- H

7-yl)-amino]acetyl]cystein-hydra2id. H

Til 12 mg af 70% rent LL-E33288i11 i 12 ml acetonitril H

5 ved 0°C sættes der 4 mg N- [ t (4-methyl-kumarin-7-yl)amino] ace- Η

tyl]cystein-hydrazid i 1,2 ml dimethylformamid. Efter omrø- H

ring natten over tilsættes der yderligere 2 mg N- [ [ (4-methyl- H

kumarin-7-yl) amino] acetyl] cystein-hydrazid i 0,6 ml dimethyl- H

formamid. Reaktionsblandingen omrøres i 3 dage ved 0°C og H

10 filtreres. Acetonitrilet bortdampes, og den fremkomne dime- H

thylformamidopløsning fortyndes med et overskud af hexaner/- H

ether i forholdet 1:1. Produktet isoleres ved filtrering og H

renses yderligere ved chromatografi på silicagel med en 15- H

-20 gradient af methanol i chloroform, hvorved man får 3 mg H

15 af det ønskede produkt. Retentionstiden på reverse phase Η

HPLC: 3,5 minutter ved anvendelse af 45% acetonitril/0,1 H

M vandigt ammoniumchlorid. H

Eksempel 6 H

20 3-Mercaptopropionyl-hydrazid-disulfid-analog af H

LL-E33288a31 I

Til 10 mg LL-E33288a31 i 9 ml acetonitril ved -15°C I

sættes der 6,6 mg 3-mercaptopropionyl-hydrazid i 1 ml aceto- H

25 nitril. Der tilsættes 1 ækvivalent triethylamin og/eller 1 H

ækvivalent eddikesyre som katalysator. Man lader reaktions- H

blandingen omrøre ved 0°C i 1 time, og opløsningsmidlet H

bortdampes derpå. Remanensen chromatograferes på silicagel H

med en 10-15 methanol i chloroform gradient, hvorved man H

30 får det ønskede produkt. Retentionstiden på "reverse phase" Η

C18 HPLC: 3,5 minutter i systemet 45% acetonitril/0,1 Μ H

vandigt ammoniumchlorid. H

Eksempel 7 H

35 Uspecifik konjugation til proteiner H

Hydroxysuccinimidesteren, beskrevet i eksempel 3, H

bindes covalent til antistoffer under let basiske betingel- H

I DK 174739 B1 I 28 I ser. Det følgende er en generel fremgangsmåde, der anvendes I til at fremstille de i tabel V angivne antistofkonjugater.

I Antistof ved en koncentration på 3-5 mg pr. ml i phosphatpuf- I fer indeholdende 0,1M natriumchlorid, pH-værdi = 7,5, omsæt - I 5 tes med et 5-20 gange molært overskud af produktet fra eksem- I pel 3 under omrøring ved stuetemperatur fra 1-4 timer. Det I konjugerede protein afsaltes chromatografisk, og aggregeret I protein skilles fra monomert materiale ved gelfiltrerings- I -HPLC. Monomere fraktioner samles og koncentreres.

I 10

I Tabel V

I Uspecifikke konjugater fremstillet ved anvendelse af produk- I tet fra eksempel 3 I 15 MoAb Lægemiddelindhold

I M/M

I Lym 1 5,2 I 20 B72.3 6,0 I B72.3 2,9 1 25 Eksempel 8 I Stedsspecifik koniugatpræparat I Den generelle fremgangsmåde til at binde hydrazidde- I rivater af lægemidler til oxiderede antistoffer er beskrevet I i T.J. McKearn, et al. , i US-patentskrift nr. 4.671.958.

I 30 Fremgangsmåden er blevet anvendt til at fremstille antistof- I konjugater ud fra produkterne fra eksempel 4 og 5 med speci- I fikke modifikationer som nedenfor beskrevet. Produkterne I fra disse reaktioner og deres egenskaber er opsummerede i I tabel VI.

I 35 (A) Antistofoxidation Antistof ved en koncentration fra I 5 til 10 mg pr. ml dialyseres natten over mod et 200 gange I så stort rumfang af 50 mM natriumacetatpuffer, pH-værdi = I 5,5, indeholdende 0,1M natriumchlorid (puffer A) . Efter I dialyse oxideres MoAb med fra 15 mM til 200 mM periodsyre i I 40 0,2M natriumacetat. Oxidationen tillades at forløbe i mørke I under omrøring ved 4°C i 45 minutter, hvorefter det oxiderede

DK 174739 B1 I

MoAb afsaltes på en a 5 lags-volumen Sephadex G25-søjle. H

Oxidationsgraden af antistoffet vurderes ved reaktion med H

p-nitrophenylhydrazin og sammenligning af absorbans af pro- H

teinet ved 280 mm i forhold til p-nitrophenylhydrazin ved H

5 395 mm. H

(B) Lægemiddel-hydrazid-koniugation Det oxiderede MoAb H

omsættes med fra 25 til 200 gange molært overskud af lægemid- H

delhydrazid. Hydraziderne opløses i dimethylformamid og H

sættes til den vandige opløsning af MoAb. For at undgå ud- H

10 fældning af MoAb overskrider slutrumfanget af det tilsatte H

dimethylformamid ikke 10% af det samlede reaktionsvolumen. H

Man lader reaktionen foregå i 3 timer ved stuetemperatur H

under omrøring. For at hindre tværbinding af uomsatte al- H

dehyder og senere aggregering tilsættes der et blokeringsmid- H

15 del, acetylhydrazid, i et 100 gange molært overskud 3 timer H

efter tilsætning af lægemiddelhydrazidet. For at stabilisere H

Schiff's basebindingen mellem aldehyd og lægemiddelhydrazid H

(en hydrazon) reduceres produktet almindeligvis til et alkyl- H

hydrazin ved tilsætning af 10 mM natriumcyanoborhydrid, H

20 idet man lader reaktionen foregå i mere end 1 time (den H

samlede konjugationstid - 4 timer). Konjugatet afsaltes H

chromatografisk og dialyseres udtømmende (minimumstid 48 H

timer) til en phosphatpuffer med en pH-værdi på 6,5 til H

opbevaring og afprøvning. H

25 Konjugater analyseres for tilstedeværelse af aggrega- H

ter ved gelfiltrerings-HPLC og for frit lægemiddel ved "re- H

verse phase" HPLC. Lægemiddel indhold bestemmes spektroskopisk H

ved anvendelse af ekstinktionskoefficienterne for både anti- H

stoffet og lægemidlet for at anslå molære koncentrationer H

30 af lægemiddel i konjugater. H

I DK 174739 B1 I 30

I Tabel VI

I Hvdrazidkorhuqater fremstillet ud fra produktet fra I eksempel 4

I 5 Moab Præparat nr. Lægemiddelindhold M/M

I Lym 1 1 1,4 I 2 2,4 I 3 1,0 I 4 6,7 I 10 5 3,3 I Lym 2 1 2,9 I 2 1,9 I 3 2,0 I 15 4 2,8 I B72.3 1 2,3 I 2 1,3 I 20 CTM-01 3,1 I MAC-68 1,7 I Hvdrazidkoniugater fremstillet ud fra produktet fra I 25 eksempel 5 1

Lym 1 1 0,15 I 2 0,76

Claims

1. Bærer-lægemiddelkonjugat med formlen I Tu-(Z-Sp-SS-W)m I fremstillet ud fra en forbindelse med formlen CH3SSS-W, I idet CH3SSS-W er et antitumorantibiotikum, betegnet som LL- H 10 £332880(3^, o^1, a2Br, α2τ, a3Br, o^1, a4Br, ØiBr, βχ1, I 02Br, jS21, Ί XBr / 111, δχ1, BBM-1675, FR-900405, FR-900406, I PD 114759, PD 115028, CL-1577A, CL-1577B, CL-1577D, CL-1577E eller CL-1724, kendetegnet ved, at man omsætter H CH3SSS-W med en forbindelse med den almene formel Q-Sp-SH, I 15 idet Sp er en ligekædet eller forgrenet divalent Cj^g-grup- H pe, divalente aryl- eller heteroarylgrupper, divalente C3_ H Ig-cyoloalkyl- eller -heterocycloalkyl-grupper, divalente H aryl- eller heteroaryl-alkyl-Ci-xg-grupper, divalente cyclo- alkyl- eller heterocycloalkyl-alkyl-Ci^g-grupper eller H 20 divalente umættede C2-ig-alkylgrupper, Q er eller kan senere H omdannes til halogen, amino, alkylamino, carboxyl, carboxal- I dehyd, hydroxy, thiol, α-halogenacetyloxy, lavere alkyldicar- I boxyi, -conhnh2, -nhconhnh2, -nhcsnhnh2, -onh2, -con3, I o OFF I Vi V Μ I -”’\J ' LØ ' !>' ·”Κ2> · I θ' :0 F/ F I F ' , F -CH CH I „ . -&·; I hvorved man får et mellemprodukt med formlen Q-Sp-SS-W, I I DK 174739 B1 I 32 I hvori Q, Sp, og W er som ovenfor defineret, idet man omsætter I Q-Sp-SS-W med et molekyle med formlen Tu-(Y)n, idet Tu er I defineret som et mono- eller polyklonalt antistof, fragmenter I deraf, kemisk eller genetisk manipulerede modparter deraf, I 5 vækstfaktorer eller steroider, Y er en sidekæde-amino-, I -carboxy- eller -thiol-gruppe af et protein, et aldehyd, I afledt af carbohydratrester, eller en amidalkylthiogruppe, I n er et helt tal fra 1 til 100, hvorved man får en forbin- I delse med formlen I 10 I Tu-(Z-Sp-SS-W)m I (Y)n-m I idet Tu, Y, Sp, W og n er som ovenfor defineret, og Z er I 15 dannet ud fra covalent reaktion mellem grupperne Q og Y I direkte eller efter senere reduktion, og Z er -CONH-, I -CONHN=CH-, -CONHNHCH2-, -NHCONHN=CH-, -NHCONHNH- I ch2, -nhcsnhn=ch-, -nhcsnhnhch2-, -on=ch-, -nh-, -nhch2-, I -N=CH-, -C02-, -NHCH2C02-, -SS-, I 20 I β “S —v OjC- .0 I I -s—-1/ VNO -S-i-\ CH3 -NHC0CH2-CH 13- tor - IX ” 7=v, I 25 "^0 o 2 C02H I og m er 0,1-15. I 30 2. Et protein-lægemiddelkonjugat med formlen 1 Tu-(Z-Sp-SS-W)ffi I i I (Y)n-m I 35 I fremstillet ud fra det antitumor-antibiotikum, som har beteg- I nelsen LL-E33288-T(CH3SSS-W) med I a) et ultraviolet spektrum vist i fig. 1, I b) et proton magnetisk resonans-spektrum som vist i DK 174739 B1 I fig. 2, c) et infrarødt spektrum som vist i fig. 3, og I idet dithiomethyldelen fortrænges med en forbindelse med H formlen Q-Sp-SHf hvori Sp er ligekædede eller forgrenede H 5 divalente C2_5-grupper eller divalente C2_5-arylalkyl- eller H -heteroarylalkyl-grupper, og Q er eller kan senere omdannes H til carboxyl, lavere alkyldicarboxyl-anhydrid, _CONHNH2 eller H

10 -C02^O)-«2 I hvorved man får et mellemprodukt med den almene formel Q- H Sp-SS-W, idet Q, Sp og W er som ovenfor defineret, 15 ved at omsætte Q-Sp-SS-W med et molekyle med formlen H Tu-(Y)n, idet Tu er et monoklonalt antistof, som viser pre- H ferencereaktivitet med et humant tumor-forbundet antigen, Y H er en sidekædeaminogruppe på antistoffet eller et aldehyd, H dannet ved oxidation af carbohydratgrupperne i antistoffet, H 20 og n er et helt tal fra 1 til 100, hvorved man får en forbin- I delse med formlen H Tu-(Z-Sp-SS-W)m H 25 (Y)n-m I idet Tu, Y, Sp, W og n er som ovenfor defineret, og Z er H dannet ud fra covalent omsætning mellem grupperne Q og Y direkte eller efter senere reduktion, og Z er -CONH-, CON- H

30 HN=CH-, -C0NHNHCH2-, eller I -NHC0CH2-CH I 35 (CH2)0,1 I C02H I og m er 1-15. H

3. Forbindelse ifølge krav 1, kendetegnet I ved, at CH3SSW er LL-E33288-r1I, Q er 4-nitrophenylesteren I DK 174739 B1 I 34 I af en carboxy 1 gruppe, Sp er -CH2CH2-, Tu er det monoklonale I antistof CT-M-01, Y er -NH2, Z er -CONH- og m er 0,5-15.

4. Forbindelse ifølge krav 1, kendetegnet I ved, at CH3SSSW er LL-E33288TT!1, Q er hydroxysuccinimid- I 5 esteren af en carboxylgruppe, Sp er -CH2CH2-, Tu er det I monoklonale antistof MAC-68, Y er -NH2, Z er -CONH- og m er I 0,5-15.

5. Forbindelse ifølge krav 1,kendetegnet I ved, at CH3SSSW er 1,1,^33288-^1, Q er -CONHNH2, Sp er- I 10 CH2CH2-, Tu er det monoklonale antistof Lym 1, Y er -CHO, Z I er -CONHNHCH2-, og m er 0,1-10.

6. Forbindelse ifølge krav 1, kendetegnet I ved, at CH3SSSW er LL-E332887-L1, Sp er Τ'"’- ^οΤΧ ; I NHC0CH2NH^ ^0 O! I 20 I Tu er det monoklonale antistof B72.3, Y er -CHO, Z er I -C0NHNHCH2-, og m er 0,1-10.

7. Forbindelse ifølge krav 1, kendetegnet I ved, CH3SSSW er LL-E332887!1, Sp er I 25 I T'c“r JPxL I NHC0CH2NH'/^^X0 ^0 I 30 Tu er det monoklonale antistof Lym 2, Y er -CHO, Z er -CON- I HNHCH2- og m er 0,1-10.

8. Fremgangsmåde til fremstilling af de målrettede I 35 derivater DK 174739 B1 I Tu-(Z-Sp-SS-W)m I fremstillet ud fra en forbindelse med formlen CH3SSS-W, H 5 idet CH3SSS-W er et antitumorantibiotikum, betegnet som H LL-E332880f^®r, Οίχ·^, a2^ · Qig^, <*4^r> βχ®Γ, βχ^, I fi2Br, β2Τ» 'lBr' 'I1' δΐτ· BBM-1675, FR-900405, FR-900406, I PD 114759, PD 115028, CL-1577A, CL-1577B, CL-1S77D, CL-1577E I eller CL-1724, kendetegnet ved, at man omsætter I

10 CH3SSS-W med en forbindelse med formlen Q-Sp-SH, idet Sp er I en ligekædet eller forgrenet divalent Cx-x8“9ruPPe/ divalent I aryl- eller heteroarylgruppe, divalent C3_^g-cycloalkyl- H eller -heterocycloalkyl-gruppe, divalent aryl- eller he- I teroaryl-alkyl-Cx_xg-gruppe, divalent cycloalkyl- eller H 15 heterocycloalkyl-alkyl-Οχ_χ8-gruppe eller divalent umættet H C2_ig-alkylgruppe, Q er halogen, amino, alkylamino, carboxyl, H carboxaldehyd, hydroxy, thiol, α-haloacetyloxy, lavere alkyl- I dicarboxylanhydrid, -CONHNH2, -NHC0NHNH2, -NHCSNHNH2, -0NH2, I 20 eller I 25. acetonitril i nærværelse af 1 ækvivalent triethylamin H og/eller 1 ækvivalent eddikesyre med fra -10 til -30°C il- H 48 timer, idet man isolerer mellemproduktet med formlen Q- I -Sp-SS-W, hvori Q, Sp og W er som ovenfor defineret, derpå H omsætter forbindelsen med formlen Q-Sp-SS-W, hvori Sp og W H 30 er som ovenfor defineret, og Q er halogen, amino, alkylamino, H carboxyl, carboxyaldehyd, hydroxy eller lavere alkyl-dicarb- oxylsyreanhydrid, med et molekyle med formlen Tu-(Y)n, idet I Tu er et mono- eller polyklonalt antistof, fragmenter deraf, I kemisk eller genetisk manipulerede modparter deraf, vækstfak- I 35 torer eller steroider, Y er en sidekæde amino- eller car- H boxyfunktionalitet, n er 1-100, i vandig puffer ved en pH- H værdi, der ligger mellem 6,5 og 9, ved 4-40°C, enten direkte H I DK 174739 B1 I 36 I eller i nærvær af et vandoploseligt carbodiimid, til dannelse I af forbindelsen I Tu-(Z-Sp-SS-W)m I 5 00n-m I idet Tu, Sp, W, n og Y er som ovenfor defineret, m er 1-15 I og Z er dannet ved covalent reaktion af grupperne Q, og γ I er -CONH-, -NH-, I 10 I i I -nhcoch2-ch I (CH2)o,1 I 15 I I C02H I -N=CH- eller -co2-, eller I idet man omsætter forbindelsen med formlen Q-Sp-SS-W, hvori I 20 Sp og W er som ovenfor defineret, og Q er en carboxylsyre, I med N-hydroxysuccinimid, 2,3,5,6-tetrafluorphenol, penta- I fluorphenol eller 4-nitrophenol i nærvær af et carboxylak- I tiverende middel, såsom carbodiimid, til dannelse af en I forbindelse med formlen Q-Sp-SS-W, hvori Sp og Vf er som I 25 ovenfor defineret, og Q er I F F F F I ~C°2N\ ' ~C°r\Q) ' ~C02~\QVF- ' I 30 0 F F F F I eller -C0i(o)^02 I 35 1 med et molekyle med formlen Tu-(Y)n, I idet Tu og n er som ovenfor defineret, og Y er en sidekæde- I 40 aminogruppe, i en vandig puf ret opløsning ved en pH-værdi, DK 174739 B1 I der ligger mellem 6,5 og 9, ved en temperatur, der ligger H mellem 4 og 40°C, til dannelse a£ forbindelser med formlen H Tu-iZ-Sp-SS-W)^ I (Y)n-m I idet Tu, Sp, Y og n er som ovenfor defineret, m er 1-15, og H Z er dannet ved covalent reaktion mellem Q og Y og er defi- I 10 neret som -CONH-, eller H idet man omsætter en forbindelse med formlen Q-Sp-SS-W, H idet Sp og W er som ovenfor defineret, og Q er -CONHNH2, I med salpetersyrling i vandigt acetonitril til dannelse af H en forbindelse med formlen Q-Sp-SS-W, idet Sp og W er som H 15 ovenfor defineret, og Q er -C0N3, med en forbindelse med H formlen Tu-(Y)n, idet Tu, Y og n er som ovenfor defineret, H hvorved man får en forbindelse med formlen H Tu-(Z-Sp-SS-W)ro I (Y)n-m I idet Tu, Z, Sp, W, m, Y og n er som ovenfor defineret, eller ved at omsætte en forbindelse med formlen Q-Sp-SS-W, idet I Sp og W er som ovenfor defineret, og Q er hydroxy, med et H 25 α-halogeneddikesyreanhydrid, hvorved man får en forbindelse, I hvori Q er α-halogenacetyloxy, og omsætte α-halogenacetyloxy- I -Sp-SS-W eller en forbindelse med formlen Q-Sp-SS-W, idet I Sp og W er som ovenfor defineret, og Q er H -SVS -cor\^NvJI "CH2wCH3 I LO) ' en« I med et molekyle med formlen Tu-(Y)n, idet Tu er som ovenfor I defineret, Y er en sidekædethiol af et protein eller en H amidoalkylthiogruppe, indført på en amin af Tu, ved anven- I DK 174739 B1 I 38 I delse af reagenser, såsom 3-(2-dithiopyridyl)propionsyre- I -hydroxy-succinimidester, fulgt af reduktion med et middel, I såsom dithiothreitol, eller en amidalkylthiogruppe, indført I på en amin i Tu ved anvendelse af 2-iminothiolan, og n er I 5 1-10, under vandige pufrede betingelser ved en pH-v*rdi, I der ligger mellem 4,5 og 7, ved en temperatur, der ligger I mellem 4 og 40’C, hvorved man får en forbindelse med form- I len: I Tu-(Z-Sp-SS-W)m I 10 I I (Y)n-m I hvori Tu, Sp, H og n er som ovenfor defineret, og Z er dannet I ved covalent reaktion mellem grupperne Q og Y, og Z er I 15 P·' I -S-η-1/ "S·^ N °2C- P I Λ ^N\l -s-,—f en« Q; ® - ¢,, I 20 0 I og n er 0,1-10, eller I idet man omsætter en forbindelse med formlen Q-Sp-SS-W, I 25 hvori Sp og W er som ovenfor defineret, og Q er -NH2, I -CONHNH2, -NHCONHNH2, -NHCSNHNH2 eller -0NH2, med et molekyle I med formlen Tu-(Y)n, idet Tu er som ovenfor defineret, Y er I et aldehyd, dannet ud fra carbohydratrester på Tu ved oxida- I tion i nærvær af et jordalkalimetalperiodat i en vandig I 30 puffer ved en pH-værdi, der ligger mellem 4,0 og 6,5, ved I 4-40’C, og n er 1-20, hvorved man får en forbindelse med I formlen: I Tu-(Z-Sp-SS-W)m I i I 35 <Y)n_m I idet Tu, Sp, W, Y og n er som ovenfor defineret, og Z er I dannet ved en covalent reaktion af Q, og Y og er -0N=CH-, I -N=CH-, -C0NHN=CH-, -NHCONHN=CH- eller -NHCSNHN=CH-, og m DK 174739 B1 I er 0,1-15, eller ved at behandle forbindelsen umiddelbart H herover med formlen H Tu-(Z-Sp-SS-W)m 5 (Y)n-m I hvori Tu, Z, Sp, W, Y, n og m er som umiddelbart ovenfor H defineret, med acetylhydrazin eller tyrosin-hydrazin i en vandig puffer ved en pH-værdi, der ligger mellem 4,0 og fl 6,5, ved 4-40*C til dannelse af en forbindelse med formlen I

10 Tu-(Z-Sp-SS-W)m I (Y)n-m I hvori Tu, Z, Sp, W, n og m er som umiddelbart ovenfor defi- H neret, og Y er -CH=NNHCOCH3 eller I -CH=NNHC0-CH(NH2)-CH2 -^Ο^—ΟΗ,1 I 20 idet man omsætter denne forbindelse med natriumcyanoborhydrid I eller natriumborhydrid i en vandig puffer ved en pH-værdi H fra 4,0 til 6,5 ved en temperatur på 4-40°C, hvorved man I får en forbindelse med formlen Tu-(Z-Sp-SS-W)m I idet Tu, Sp, W, m og n er som ovenfor defineret, Z er I -nh-ch2-, -conhnhch2-, -nhconhnhch2- eller -nhcsnhnhch2-, I og Y er -CH2NHNHCOCH3 eller I -CH2NHNHCOCH(NH2)CH2 ^o)-OH I

9. Anvendelse af onkolytisk mængde af forbindelserne I med formlen I I DK 174739 B1 I 40 I TU-(Z-Sp-SS-W)m I i I (Y)n-m I fremstillet ud fra en forbindelse med den almene formel I 5 CH3SSS-W, idet CH3SSS-W er et antitumor-antibiotikum med I betegnelsen LL-E33288a3Br, a^1, ct2Br, a2*, tt3Br, <*3*, I ØiBr, Øl1, 02Br, 021' -l1, il1, BBM-1675, FR-900405, I FR-900406, PD 114759, PD 115028, CL-1577A, CL-1577B, CL- I 1577D, CL-1577E eller CL-1724, idet man omsætter CH3SSS-W I 10 med en forbindelse med den almene formel Q-Sp-SH, idet Sp I er en ligekædet eller forgrenet divalent Ci_ig-gruppe, di- I valent aryl- eller heteroarylgruppe, divalent C3_3g-cyclo- I alkyl- eller -heterocycloalkyl-gruppe, divalent aryl- eller I heteroaryl-alkyl-Cx^ig-gruppe, divalent cycloalkyl- eller I 15 heterocycloalkyl-alkyl-Ci^g-gruppe eller divalent umættede I C2_18-alkylgruppe, Q er eller kan senere omdannes til halo- I gen, amino, alkylamino, carboxyl, carboxaldehyd, hydroxy, I thiol, o-halogenacetyloxy, lavere alkyldicarboxyl, -CONHNH2, I -nhconhnh2, -nhcsnhnh2, -onh2, -con3, I 20 I 0V OFF y-\ -svs K h ^yJ' TØ ’ IL^" "coy2( I 25 0 0 F F I F F 35 I til fremstilling af et mellemprodukt med formlen Q-Sp-SS-W, DK 174739 B1 I idet Q, Sp og W er som ovenfor defineret, idet man omsætter Q-Sp-SS-W med et molekyle med formlen Tu-(Y)n idet Tu er fl defineret som et mono- eller polyklonalt antistof, fragmenter H deraf, kemisk eller genetisk manipulerede modparter deraf, H 5 vækstfaktorer eller steroider, Y er en sidekæde-amino-,- H carboxy- eller -thiol-gruppe af et protein, et aldehyd, I afledt af carbohydratrester, eller en amidalkylthiogruppe, H n er et helt tal fra 1 til 100, til fremstilling af en for- I bindelse med formlen

10 Tu-(Z-Sp-SS-W)ffi I idet Tu, Y, Sp, W og n er som ovenfor defineret, og Z er H dannet ud fra covalent reaktion mellem grupperne Q og Y I 15 direkte eller efter senere reduktion, og Z er -CONH-, H -C0NHN=CH-, -CONHNHCH2-, -NHCONHN=CH-, -NHCONHNH- I ch2, -nhcsnhn=ch-, -nhcsnhnhch2-, -on=ch-, -nh-, -nhch2-, I -N=CH-, -C02-, -NHCH2C02-, -SS-, I 20 /? -S-v °2C_ /? 1 I _S_^_U -S-]-\ CH3 -NHCOCH2-CH roj X °r I ^ \1 k- I og m er 0,1-15, H til fremstilling af et farmaceutisk præparat til inhibering H 30 af væksten af tumorer i pattedyr. H

10. Anvendelse af en effektiv onkolytisk mængde af et H protein-lægemiddelkonjugat med formlen H Tu-(Z-Sp-SS-W)m I 35 (Y)n-m I fremstillet ud fra det antitumor-antibiotikum, som har beteg- H nelsen LL-E33288-r(CH3SSS-W) med H I DK 174739 B1 I 42 I a) et ultraviolet spektrum vist i fig. 1, I b) et proton magnetisk resonans-spektrum som vist i I fig. 2, I c) et infrarødt spektrum som vist i fig. 3, og I 5 idet dithiomethyldelen fortrænges med en forbindelse med I formlen Q-Sp-SH, hvori Sp er ligekædede eller forgrenede I divalente C2-5"9ruPPer eller divalente C2_5-aryl- eller- I heteroarylalkyl-grupper, og Q er eller kan senere omdannes I til carboxyl, lavere alkyldicarboxyl-anhydrid, _CONHNH2 I 10 eller I ~c°2~^0^~ n02 I 15 hvorved man får et mellemprodukt med den almene formel ΟΙ Sp-SS-W, idet Q, Sp og W er som ovenfor defineret, Ved at omsætte Q-Sp-SS-W med et molekyle med formlen I Tu-(Y)n, idet Tu er et monoklonalt antistof, som viser pre- I ferencereaktivitet med et humant tumor-forbundet antigen, Y I 20 er en sidekædeaminogruppe på antistoffet eller et aldehyd, I dannet ved oxidation af carbohydratgrupperne i antistoffet, og n er et helt tal fra 1 til 100, hvorved man får en forbin- I delse med formlen I Tu-(Z-Sp-SS-W)m

25 I I (^n-m I idet Tu, Y, Sp, W og n er som ovenfor defineret, og Z er dannet ud fra covalent omsætning mellem grupperne Q og Y I 30 direkte eller efter senere reduktion, og Z er -CONH-, CON- I HN=CH-, -CONHNHCH2-, eller -nhcoch2-ch I 35 i I <CH2>0,1 I co2H I 40 og m er 1-15, til fremstilling af et farmaceutisk præparat I til in vivo indgift på et antigent sted i pattedyr.