FI95204C

FI95204C - Menetelmä metyylitritioyhdisteiden kohdennettujen johdannaisten valmistamiseksi

Info

Publication number: FI95204C
Application number: FI884984A
Authority: FI
Inventors: William James Mcgahren; Martin Leon Sassiver; George A Ellestad; Philip R Hamann; Lois M Hinman; Janis Upeslacis
Original assignee: American Cyanamid Co
Priority date: 1987-10-30
Filing date: 1988-10-28
Publication date: 1996-01-10
Also published as: HK131897A; NO176480C; EP0313874A3; IE883261L; AU2449488A; NO176480B; FI884983A0; JP2720933B2; NO884834D0; NO884833D0; FI91262B; KR970011385B1; DK602488D0; ATE104309T1; JP2820256B2; NO884834L; NO173506C; ZA888127B; DE3889063T2; ATE112172T1

Description

1 95204

Menetelmä metyylitritloyhdistelden kohdennettujen johdannaisten valmistamiseksi

Keksinnön kohteena on menetelmä terapeuttisesti 5 käyttökelpoisten kaavan CH3SSS-W mukaisten yhdisteiden kohdennettujen johdannaisten valmistamiseksi, joilla johdannaisilla on kaava

Tu-(Z-Sp-SS-W)B

10 (Y)n_.

ja CH3SSS-W on LL-E33288-sarjan syöpälääkeantibiootti.

Antibakteeristen ja syöpälääkeaineiden sukua, joka tunnetaan yhteisesti LL-E33288 -kompleksina, selostetaan 15 ja esitetään patenttivaatimuksissa yhteishaussa olevassa US-patenttihakemuksessa, jonka sarjanumero on 009 321 ja joka on jätetty 30.1.1987, ja niitä käytetään valmistettaessa kaksi rikkiä sisältävää syöpälääkeainetta, jotka ovat lähtöaineita keksinnön mukaisille syöpälääkeaineiden 20 suunnatuille muodoille.

Hakemuksessa, jonka sarjanumero on 009 321, kuvataan LL-E33288 -kompleksia, sen komponentteja, LL-Ε33288αχΒΓ, LL-E332880!1, LL-E33288a2Br, LL-E33288a2\ LL-E33288a1Br, LL-E33288a3I, LL-E33288a4Br, 1,1^332888^, ’ 25 LL-E332888!1, LL-E3328882Br, LL-E33 288821, LL-ESSZeeY/1, LL-E33288Y!1, ja LL-E33288Ö!1, sekä menetelmiä niiden valmistamiseksi aerobisella fermentoinnilla, käyttäen hyväksi uutta Micromonospora echinospora ssp calchensis -sukua tai sen luonnollista tai johdettua mutanttia. Sarjanume-30 rossa 009 321 tuodaan myös esille ehdotetut rakenteet joillekin edellä nimetyistä komponenteista. Nämä edotetut ja keksinnön mukaisessa menetelmässä käytetyt rakenteet esitetään taulukossa 1.

2 95204

Taulukko 1

Ehdotetut rakenteet CH3-SSS-W:lle (jos W on substi-tuentti, joka on kiinnittynyt alla olevaan CH3-SSS -osaan) 5 * Η0·ιιΐ/^^ ίο ORj CH, o CH*0'Y^r^CO-\ *', jv'v A'· ΕΗ,οΑΑμ-" R«tJS'^s,0CHJ Qä^^N^-OCH, OCH, ΊΓ CH» y/v\r R#0 >Λ|ν - "-ch&a -·

20 * OCH® Π och*1)H

0 >ΛΛΛ

Merkitseminen R·) R2 R3 R4 Rs Rg Ry X

LL-E33288e2l Är^ R^ H H CjHg “Ί

LL-E33288a3I Ar1 H H R4. I

I ! 25 LL-E33288JJ!1 A»', R2· H R4· (CHj^CH I

LL-E33288y1i Rj. H R4> CjHj I

LL*E33288S1 * Art R2· H R4* CH3 1 LL-E33288P1Br Ar., Rj. H R4. (CH3)2CH Br LL-E33288y1Bi> Ar., Rj. H R4. CjHg Br UL-E33288a2Br Rj. H H CjHg Br LL-E33288a38r Ar., H H R4. Br 30 « ·*' Antibiootteja, joita voidaan patenttivaatimuksissa esitettyjen lisäksi käyttää syöpälääkeantibiootteina ovat mm.

1) Esperamisiini BBM-1675, uusi luokka potentiaali-35 siä syöpälääkeantibiootteja. I. Fysikaalis-kemialliset -

P

3 95204 tiedot ja osittainen rakenne. M. Konishi, et ai., J. Antibiotics, 38, 1 605 (1985). Uusi syöpälääkeantibioottikomp-leksi, M. Konishi, et ai., GB-patenttihakemus 2 141 425A, 15.5.1984.

5 2) Uudet syöpälääkeantibiootit, FR-900405 ja FR- 900406.1. Luokitus ja tuottava kanta, M. Iwami, et ai., J. Antibiotics 38, 835 (1985). Uudet syöpälääkeantibiootit FR-900404 ja FR-900406.il. Valmistus, eristys, tunnistus ja syöpälääkevaikutus, S. Kiyoto, et ai., J. Antibiotics, 10 38, 340 (1985).

3) PD 114759 ja PD 115028, uusia syöpälääkeantibi-ootteja, jotka ovat ilmiömäisen potentiaalisia. I. Eristys ja tunnistaminen. R.H. Bunge, et ai., J. Antibiotics, 37, 1 566 (1984). Uusien syöpälääkeantibioottien PD 114759 ja 15 vastaavien johdannaisten biologiset ja biokemialliset vai kutukset . E.W. Fry et ai., Investigational New Drugs, 4, 3 (1986).

4) Uudet antibioottikompleksit CL-1577A, CL-1577B, joita tuottaa Streptomyces sp. ATCC 39363. EP-patenttiha- 20 kemus 132 082 A2.

5) CL-1577D ja CL1577E -antibioottiset syöpälääke-yhdisteet, niiden valmistus ja käyttö. US-patentti 4 539 203.

6) CL-1724 -antibioottiyhdisteet, niiden valmistus : : 25 ja käyttö. US-patentti 4 554 162.

Kaikki tieto, joka koskee yhdisteitä BBM-1665, FR-900405, FR-900406, PD 114759, PD 115028, CL-1577A, CL-1577D, CL-1577E ja CL-1724, jotka sisältyvät edellä oleviin lainauksiin, liitetään tähän viitteellä. Edellä mai-30 nittujen syöpälääkeaineantibioottien fysikaaliset ominai- " . suudet osoittavat, että ne ovat kaikki identtisiä tai hy vin samanlaisia esperamiinien rakenteisiin verrattaessa, ja kaikissa on metyylitritio-funktionaalinen ryhmä.

Kuten edellä esille tuoduista rakenteista on näh-35 tävissä, LL-E33288 -kompleksin αχ-, α2-, α3-, α4-, β^, β2-, 4 95204

Yl- ja δ-komponenteissa on kunkin rakenteessa metyylitri-tioryhmä. Edellä mainittujen antibioottien metyylitritio-ryhmälle suoritetaan korvausreaktio erilaisilla tiolin sisältävillä orgaanisilla molekyyleillä, jolloin muodostuu 5 uusi luokka syövänvastaisia ja antibakteerisia aineita.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle terapeuttisesti käyttökelpoisten kaavan CH3SSS-W mukaisten yhdisteiden kohdennettujen johdannaisten valmistamiseksi, joilla on kaava

10 Tu-(Z-Sp-SS-W)B

jossa CH3SSS-W on syöpälääkeantibiootti LL-E33288a1Br, -(¾1, -af*. -Oj1, -α3“Γ, -a4Br, -8^, -flj1, -82Br, -B2\ -YlBr, -γΛ 15 -δι1, Tu on monoklonaalinen vasta-aine, Y on proteiinin si vuketjun aminoryhmä tai aldehydi, joka on peräisin Tu:n hiilihydraattiradikaaleista, Sp on suora- tai haaraketjui-nen kahdenarvoinen C2.5-radikaali tai kahdenarvoinen aryyli-tai heteroaryyli-C2.5-alkyyliradikaali ja n on kokonaisluku 20 1 - 100, on tunnusomaista se, että a) saatetaan CH3SSS-W reagoimaan yhdisteen kanssa, jolla on kaava Q-Sp-SH, jossa kaavassa Q on karboksyyli-ryhmä, -C0NHNH2 tai -NHCSNHNH2, asetonitriilissä yhden ekvivalentin kanssa trietyyliamiinia ja/tai yhden ekvivalen-• · 25 tin kanssa etikkahappoa -10 - -30 °C:ssa 1-48 tuntia, eristetään välituote, jolla on kaava Q-Sp-SS-W, jossa Q, Sp ja H ovat kuten edellä määriteltiin, sitten b3) saatetaan yhdiste, jolla on kaava Q-Sp-SS-W, jossa Sp ja H ovat kuten edellä määriteltiin ja Q on kar-.. 30 boksyyliryhmä, reagoimaan kaavan Tu-(Y)n mukaisen molekyy-

Iin kanssa, jossa Y on sivuketjun aminoryhmä ja n on 1 -100, puskurivesiliuoksessa pH:ssa, joka on 6,5 - 9, lämpötilassa 4-40 °C:ssa, joko suoraan tai veteen liukenevan karbodi-imidin läsnäollessa, jolloin muodostuu yhdiste 5 95204

Tu-(Z-Sp-SS-W).

(Y)n-B

jossa Tu, Sp, W, n ja Y ovat kuten edellä määriteltiin, m 5 on 1 - 15 ja Z muodostuu Q:n ja Y:n kovalenttisessa reaktiossa ja se on -CONH-; tai b2) saatetaan kaavan Q-Sp-SS-W mukainen yhdiste, jossa Sp ja H ovat kuten edellä määriteltiin ja Q on kar-boksyyliryhmä, reagoimaan N-hydroksisukkinimidin tai 4-10 nitrofenolin kanssa karboksyyliä aktivoivan aineen, kuten karbodi-imidin läsnäollessa, jolloin muodostuu yhdiste, jolla on kaava Q-Sp-SS-W, jossa Sp ja W ovat kuten edellä määriteltiin ja Q on

O

15 I— /~Λ -αν tai '“^θ)-Ν0> o 20 ja tämä saatetaan reagoimaan kaavan Tu-(Y)n mukaisen molekyylin kanssa, jossa Tu ja n ovat kuten edellä määriteltiin ja Y on sivuketjun aminoryhmä, puskurivesiliuoksessa 6,5 - 9:n pHrssa 4-40 eC:n lämpötilassa, jolloin muodostuu yhdisteitä, joilla on kaava : 25

Tu-(Z-Sp-SS-W).

(Yrjössä Tu, Sp, Y ja n ovat kuten edellä määriteltiin, m on 30 1 - 15 ja Z muodostuu kovalenttisessa reaktiossa, jossa Q

.·· ja Y reagoivat, ja se on -CONH-; tai b3) saatetaan kaavan Q-Sp-SS-W mukainen yhdiste, jossa Sp ja W ovat kuten edellä määriteltiin ja Q on -CONHNH2 tai -NHCSNHNHj, reagoimaan kaavan Tu-(Y)n mukaisen 35 molekyylin kanssa, jossa Tu ja n ovat kuten edellä määri- t 6 95204 teltiin ja Y on aldehydi, joka on peräisin Tu:n hiilihyd-raattiradikaaleista, hapettamalla maa-alkaliperjodaatin läsnäollessa puskurivesiliuoksessa pH:ssa 4,0-6,5, 4 -40 eC:n lämpötilassa, ja n on 1 - 20, jolloin muodostuu 5 yhdiste, jolla on kaava

Tu-iZ-Sp-SS-W).

m»- 10 jossa Tu, Sp, W, Y ja n ovat kuten edellä määriteltiin ja Z muodostuu kovalenttisesta reaktiosta Q:n ja Y:n välillä ja se on -CONHN-CH- tai -NHCSNHN-CH- ja m on 0,1 - 15; tai c) käsitellään viimeksi mainittua yhdistettä, jolla on kaava 15

Tu-iZ-Sp-SS-W).

jossa Tu, Z, Sp, W, Y, n ja m ovat kuten edellä määritel-20 tiin, asetyylihydratsiinilla tai tyrosiinihydratsiinilla puskurivesiliuoksessa pH:ssa, joka on 4,0 - 6,5, lämpötilassa 4 - 40 °C, jolloin muodostuu yhdiste, jolla on kaava

Tu-(Z-Sp-SS-W).

: ·' 25 (i>„

jossa Tu, Sp, W, n ja m ovat kuten edellä määriteltiin ja Y on -CH=NNHCOCH3 tai -CH-NNHCO-CHiNH^-CHV (j\oH

v 3o Vry . ja saatetaan tämä yhdiste reagoimaan natriumsyanoboorihyd- ridin tai natriumboorihydridin kanssa puskurivesiliuoksessa pH:ssa, joka on 4,0 - 6,5, lämpötilassa 4-40 eC, jolloin muodostuu yhdiste, jolla on kaava 7 95204

Tu-(Z-Sp-SS-W)e (Ϋ)η-.

jossa Tu, Sp, W, m ja n ovat kuten edellä määriteltiin, Z on -CONHNHCHj- tai NHCSNHNHCH2- ja 5 /^\

Y on -CHjNHNHCOCHj tai -CH2NHNHCOCH (NH2) CHV i ) Y-OH

On havaittu, että taulukossa 1 lueteltujen yhdisteiden korvausreaktiota, joka on esitetty kaaviossa I, 10 voidaan käyttää välikkeen (Sp) liittämiseen, ja tämä on hyvin harkittu valinta, jonka avulla on mahdollista liittää kohdeyksiköt edellä nimettyjen patenttien ja hakemusten mukaisiin yhdisteisiin.

15 Q-Sp-SH v

CH3SSS-W ' * Q-Sp-SS-W

Kaavio I

20 jossa Sp ja W ovat kuten edellä on määritelty.

Niin kauan kuin reaktiokaaviosta I saatava tuote sisältää vähintään yhden funktionaalisen ryhmän, joka voidaan muuttaa kohdeyksiköksi (Tu) tai on sen kanssa suoraan reaktiivinen, voidaan johtaa edellä nimettyjen patenttien * 25 ja hakemusten mukaisten syöpälääkeantibioottlen kohdistet tuja muotoja,kuten alla olevassa kaaviossa II esitetään:

Tu-(Y)n

30 Q-Sp-SS-W —— -^Tu-(Z-Sp-SS-W)B

<Y)n-

Kaavio II

35 jossa Q, Sp, W, Tu, Y, Z, n ja m ovat kuten edellä on määritelty.

e 95204 5

Esimerkkinä ja edellä olevaan kaavioon II viitaten, Ε-33288γ1Ι:η 3-merkaptopropionihappojohdannaista (Q on C02H,

Sp on -CH2CH2-), kun se muutetaan aktivoituun hydroksisuk- kinimidimuotoonsa (Q on C02Su, Sp on -CH2-CH2-), voidaan 5 käyttää siten, että se saatetaan reagoimaan lysiiniradi- kaalien E-aminoryhmien kanssa (esim. Tu on monoklonaalinen vasta-aine, Y on -NH2, jossa n on 50 - 100 saatavilla ole-* vista lysiiniradikaaleista), pH:ssa, joka on 7,0 - 9,5, puskurivesiliuoksessa, lämpötilassa, joka on 4 °C - 40 °C, 10 ja näin saadaan antibioottien, jotka ovat kiinnittyneet mielivaltaisiin kohtiin pitkin proteiinin selkärankaa, kohdistettuja muotoja (Tu on monoklonaalinen vasta-aine, Z on -NHCO-, Sp on -CH2CH2-, m on 1 - 10). Vain osa tarjolla olevista lysiiniradikaaleista substituoidaan tällä taval-15 la, koska suuri substituenttimäärä ja säilynyt vasta-aine-immunoreaktiivisuus eivät yleensä sovi yhteen. Samoja mielivaltaisesti substituoituja immunokonjugaatteja voidaan valmistaa myös 3-merkaptopropionihappo johdannaisesta, käyttäen muita karboksyyliryhmiä aktivoivia aineita, kuten 20 eri karbodi-imidejä, tai vastaavia asyyliatsideja. Vaihtoehtoisesti Ε-33288γ1Ι:η 3-merkaptopropionyylihydratsiini-johdannaisessa (Q on H2NNHC0-, Sp on -CH2CH2-), kun sen saatetaan reagoimaan perjodaattihapetetun vasta-aineen kanssa (Tu on monoklonaalinen vasta-aine, Y on -CHO, n on 1 - • ' * 25 15), kuten kuvataan US-patentissa 4 671 958, pH:ssa, joka on 4 - 7, puskurivesiliuoksessa, lämpötilassa, joka on 4 °C - 40 °C, vain sen aldehydifunktionaalinen ryhmä reagoi (peräisin lohkaisureaktiosta, jossa reagoivat hiilihydraattien vicdiolit, jotka sijaitsevat vasta-aineiden . 30 Fc-osassa), jolloin muodostuu monoklonaalisia vasta-aine- konjugaatteja, jotka sisältävät lääkeaineen substituoi-tuneena tiettyihin kohtiin proteiinin selkärangassa (Tu on monoklonaalinen vasta-aine, Z on -CH-NNHCO-, Sp on -CH2CH2-, m on 0,5 - 10). Jotta reagoimattomat aldehydiryh-35 mät vasta-aineessa voitaisiin suojata ja siten välttää ristiinsitoutuminen, sekä myös stabiloida hydrolyyttisesti 9 95204 labiilit Schiffin emässidokset, on edullista (joskaan ei olennaista) saattaa jälkimmäinen konjugaatti reagoimaan ensin yhdisteen, kuten asetyylihydratsidin tai tyrosiini-hydratsidin kanssa, sitten suorittaa pelkistys natrium-5 syanoborohydridillä tai natriumborohydridillä, jolloin muodostuu esillä olevan keksinnön mukaisia stabiloituja rakenteita (Tu on monoklonaalinen vasta-aine, Z on -CH2NHNHCO-, Sp on -CH2CH2-, m on 0,5 - 10). Muut aldehydi-reaktiiviset ryhmät, jotka ovat osana lääkeainerakennetta, 10 kuuluvat esillä olevaan keksinnön mukaiseen menetelmään, ja niiden avulla muodostetaan kaavion 11 tuotteet. Tällaisia funktionaalisia ryhmiä ovat edullisesti, joskaan ne eivät rajoitu tähän, sellaiset, jotka reagoivat aldehydien kanssa happamissa vesiliuoksissa. Proteiinilysiinien reak-15 tiivisuus emäksisissä olosuhteissa on riittävän suuri, joten niiden amiinit kilpailevat kaavion II tuotteiden kanssa monoklonaalisen vasta-aineen tarjolla olevista aldehy-deistä. Vaihtoehtoisia aldehydireaktiivisia ryhmiä ovat esimerkiksi semikarbatsidi- tiosemikarbatsidi- ja O-subs-20 tituoitu hydroksyyliamiini -funktionaaliset ryhmät.

Sarja taulukossa 1 lueteltujen yhdisteiden kohdistetuista muodoista ei rajoitu sarjaan, joka on esitetty kaaviossa II. Kohdenryhmä (Tu) voidaan ensiksi modifoida siten, että sisältää tioliryhmän, ja se saatetaan sitten

• I

• 25 reagoimaan taulukon I yhdisteiden kanssa alla olevan kaa vion m mukaisesti:

Tu(Y) + Q-Sp-S-P -» Tu-(Z-Sp-SH) i m (Y) m n—m 30 <

CH3-SSS-W

«r

Tu-(Z-Sp-SS-W) i m (Y)n m n-m

Kaavio III

35 10 95204 t jossa Tu, Y, Q, Sp, W, n ja n ovat kuten edellä määriteltiin, ja P on vety tai 2-(pyridyylitio), sillä edellytyksellä, että kun Y on tioli, joka on peräisin Tu:n amino-happoradikaalin selkärangasta, Z-Sp ovat yhdessä kovalent-5 tinen sidos.

Esimerkkinä ja viitaten edellä olevaan kaavioon III, monoklonaalinen vasta-aine voidaan saattaa reagoimaan 3- (2-ditiopyridyyli Jpropionihappo-hydroksisukkinimidieste-rin kanssa, jolloin proteiinia muunnellaan lysiiniradikaa-10 lien kautta (Tu on monoklonaalinen vasta-aine, Y on NH2, n on 50 - 100, Q on -C02Su, Sp on -CH2-CH2-, P on 2-pyridyyli-tio). Suorittamalla sen jälkeen pelkistys esimerkiksi di-tiotreitolilla, muodostuu välituote (Tu on monoklonaalinen vasta-aine, Z on -NHCO-, Sp on CH2CH2, m on 1 - 15), joka 15 voidaan sitten saattaa reagoimaan taulukon 1 mukaisten yhdisteiden kanssa, jolloin saadaan esillä olevia immunokon-jugaatteja. Vastaavasti 2-iminotiolaani voidaan saattaa reagoimaan monoklonaalisen vasta-aineen kanssa, jolloin tioliryhmät liitetään suoraan proteiinin pintaan, eikä 20 pelkistysvaihetta tarvita (Tu on monoklonaalinen vasta-aine, Z = -NHCO-, Sp - -(CH2)3-, m - 1 - 15), ja tämä välituote voidaan saattaa reagoimaan taulukon 1 mukaisten yhdisteiden kanssa kuten edellä. Vaihtoehtoisesti sulfhyd-ryyliryhmiä, jotka kuuluvat luonnostaan monoklonaalisten 25 vasta-aineiden rakenteeseen, kun ne ovat dimeerisessä muodossa kystiiniradikaaleina, voidaan käyttää, ja ne ottavat osaa kaavion III reaktioon suoraan. Luonnolliset monoklonaaliset vasta-aineet suorittavat tällaisille sulfhydryy-leille tunnetusti sekä entsymaattisen hajoittamisen sekä . 30 pelkistyksen (Tu on Fab'-fragmentti, Z-Sp on sidos, Y on « “ SH), mutta monoklonaalisten vasta-aineiden geneettisesti muunnellut rakenteet, jotka sisältävät parittomia kys-tiiniradikaaleja, ovat samoin mahdollisia.

Esillä olevan keksinnön eräs edullinen suoritusmuo-35 to on proteiini-lääkeainekonjugaatin valmistusmenetelmä, jolla konjugaatilla on kaava: U 95204

Tu-(Z-Sp-SS-W), (^)n, ja joka on valmistettu syöpälääkeaineantibiootista, joka 5 on merkitty L-ESSZeeY^illä (CH3SSS-W), jonka a) ultraviolettispektri on esitetty kuviossa 1; b) protonimagneettiresonanssispektri on esitetty kuviossa 2; c) infrapunaspektri on esitetty kuviossa 3; ja Jcr-10 vaarnalla ditiometyyliosa yhdisteellä, jolla on kaava Q-Sp-SH, jossa Sp on suora- tai haaraketjuinen kahdenar-voinen (C2_5)radikaali tai kahdenarvoinen (C2.5)aryyli-alkyy- li- tai heteroaryylialkyyliradikaali ja Q on karboksyyli-ryhmä, -C02Su, -C0NHNH2, tai ja näin muodostuu välituote, jolla on yleinen kaava Q-Sp-SS-W, jossa Q, Sp ja W ovat kuten edellä määriteltiin, 20 saattamalla Q-Sp-SS-W reagoimaan kaavan Tu-(Y)„ mukaisen molekyylin kanssa, ja kaavassa Tu on monoklonaalinen vasta-aine, jossa ilmenee edullista reaktiivisuutta ihmisen tuumoriin liittyvän antigeenin kanssa, Y on vastaaineessa oleva sivuketju-aminoryhmä tai aldehydi, joka on saatu 25 hapettamalla vasta-aineen hiilihydraattiryhmiä, ja n on kokonaisluku 1 - 100, ja näin muodostuu yhdiste, jolla on kaava

Tu-(Z-Sp-SS-W)B

30 (Y)n_B

• « .

jossa Tu, Y, Sp, W ja n ovat kuten edellä määriteltiin, ja Ζ muodostetaan kovalenttisessa reaktiossa, jossa reagoivat ryhmät Q ja Y suoraan tai myöhemmän pelkistyksen jälkeen, 35 ja Ζ on -CONH-, 12 95204 ί -nhcoch2-ch <?Η2,0#1 co2h 5 ja m on 1 - 15.

Muutamia erilaisia monoklonaalisia vasta-aineita (MoAb) käytetään esimerkkeinä metyylitritio-syövänvastais-ten yhdisteiden kohdistamisesta. MoAb'in Lym 1 ja Lym 2 10 tunnistavat eri antigeenejä kypsistä B-lymfosyyteistä ja niiden tuotelymfomoista. Näiden MoAb'ien tuotto ja tunnistus kuvataan julkaisussa A.L. Epstein, et ai., "Cancer Research" 47, 830 (1987). MoAb B72,3 kohdistuu ensisijaisesti rinta- ja paksunsuolen syöpiin, joskin on havaittu 15 reaktiivisuutta myös haima-, munasarja- ja keuhkosyöpien kanssa. Vasta-ainetta on kuvattu julkaisussa T.L. Klug, et ai., "Int. J. Cancer" 38, 661 (1986). MoAb CT-M-01, joka tunnistaa ensisijaisesti rintakasvaimia, kuvataan EPO-ha-kemuksessa 86 401482.4, joka on jätetty 3.7.1986, ja 20 MAC-68:a tuottaa hybridoman alaklooni, joka tuottaa CT-M-01:ä, ja se tunnistaa sekä rinta- että paksunsuolen syöpiä. Esillä olevien yhdisteiden välituotteita, jotka ovat käyttökelpoisia näille vasta-aineille ja konjungoitu-vat niiden kanssa, kuvataan tutkimusosassa. Ei kuitenkaan * - 25 pidä tulkita, että tämä keksintö rajoittuu edellä mainit tuihin vasta-aineisiin. Sen sijaan menetelmä on riittävän yleinen, niin että sitä voidaan soveltaa kaikkiin vasta-aineisiin, riippumatta niiden luokasta tai isotyypistä, niiden entsymaattisesti johdetuista fragmenteista, niiden . 30 kemiallisesti käsitellyistä ja stabiloiduista fragmenteis- “ > ta, kuten myös niiden kaikkien kuvitelluista ja ihmiskäyt töön sopiviksi tehdyistä vastineista. Myöskään kohdistettavat yksiköt eivät rajoitu vain monoklonaalisiin vasta-aineisiin. Muita proteiineja, kuten myös pieniä molekyyle-35 jä, joita varten kohdekudoksessa on olemassa reseptoreita, kuuluu keksinnön pääkohtiin.

13 95204 Tämän keksinnön menetelmien, joita käytetään tuotettaessa monoklonaalisia vasta-ainekonjugaatteja taulukon 1 mukaisista yhdisteistä, avulla saadaan rakenteita, joilla on hyvä immunoreaktiivisuus kohdesolulinjojen kanssa, 5 kuten seuraavilla in vitro -kokeilla on määritetty:

Kohdesolut

Kaikkia kohdesoluja pidettiin RPMI 1640 -väliaineessa, johon oli lisätty 5 % vasikan sikiön seerumia (FCS), ITS:ä (yhteistutkimus, Kissa# 40351), streptomy-10 siiniä (50 pg/ml), penisilliiniä (50 yksikköä/ml), genta-mysiinisulfaattia (50 pg/ml) ja glutamiinia (0,03 %). Soluja pidettiin kostutetussa 5 % C02-inkubaattorissa 37 °C:ssa.

Immunoreakt ilvisuuskokeet 15 Menetelmä I - Elisa

Sopivia kohdesoluja otettiin talteen soluviljelmästä, ne laskettiin ja suspendoitiin Oulbeccon fosfaattipus-kurisuolaliuokseen (DPBS) optimaalisena konsentraationa testattavalle monoklonaaliselle vasta-aineelle (MoAb). 0,1 20 ml soluja jaettiin tasan steriilin kudosviljelmän 96-ko-loisen polystyreenimaljan kuhunkin koloon. Maljoja sentri-fugoitiin 5 minuuttia nopeudella 1 000 RPM, ja sakan yllä oleva neste poistettiin. Maljoja ilmakuivattiin yön yli, ja niitä voidaan säilyttää 4 °C:ssa korkeintaan 3 kuukaut-* - 25 ta.

Ei-spesifiset sitoutumiskohdat suojattiin lisäämällä 200 μΐ 1 % gelatiinia, joka oli DPBS:ssä, kuhunkin koloon ja inkuboimalla maljaa yksi tunti 37 °C:ssa kosteassa inkubaattorissa. (Kaikki seuraavat inkuboinnit suoritetaan . 30 samanlaisissa olosuhteissa). Maljat pestiin kerran 250 ** - pl:lla 0,05 % TWEEN-20:tä, joka oli DPBS:ssä (pesuliuos), käyttäen automatisoitua ELISA-pesusysteemiä Dynatech'lta (Ultrawash II). Testattavat näytteet laimennettiin siten, että lopulliseksi konsentraatioksi tuli 3 μΐ/ml MoAb-ekvi-35 valentteja 0,1 % gelatiini-DPBSrssä. Kustakin 3 μg/ml:n näytteestä valmistettiin vielä kuusi kolmenkertaista sar- i4 95204 f jalaimennosta, ja 100 μΐ lisättiin sopiviin koloihin kolminkertaisena. Alimmaiseen koloriviin laitettiin vain 100 μΐ 0,1 % gelatiinia taustaksi. Maljoja inkuboitiin 45 minuuttia ja sitten ne pestiin kolme kertaa. Emäksisellä 5 fosfataasilla konjugoituja, affiniteettipuhdistettuja vuo hen anti-hiiri -immunoglobuliineja (Cappel-kissa# 8611-0231) laimennettiin 1:125 0,1 % gelatiinissa, ja 100 μΐ lisättiin kuhunkin koloon. Maljoja inkuboitiin 45 minuuttia ja sitten ne pestiin kolme kertaa. 200 μΐ p-nitro-10 fenyylifosfaattisubstraattiliuosta (katso alla) lisättiin kuhunkin koloon. Kun reaktio oli edennyt huoneenlämpötilassa 45 minuuttia, se pysäytettiin lisäämällä 50 μΐ 3M NaOHra. Kunkin kolon sisällön absorbanssi luettiin 405 nm:ssa automatisoidulla spektrometrillä, jota toimittaa 15 Dynatech (EIA Autoreader # EL-310).

Substraattldietanoliamllnipuskuri (10 %) 97 ml dietanoliamiinia 800 ml vettä 0,2 g NaN3 20 100 mg MgCl2*6H20

Reagenssit liuotettiin sekoittamalla jatkuvasti, ja IM HCl:a lisättiin kunnes pH oli 9,8. Kokonaistilavuus tehtiin 1 litraksi vedellä, ja tämä steriloitiin suodattamalla 0,2 μ-filterin läpi. Puskuria säilytettiin pimeässä * 25 4 °C:ssa. Juuri ennen käyttöä liuotettiin p-nitrofenyyli- fosfaatti (Sigma, Kissa# 104 - 40) 10 % dietanoliamiini-puskuriin (oltava huoneenlämpötilaista), ja näin saatiin lopullinen konsentraatio, joka oli 1 mg/ml.

O. D. -arvojen laskeminen 30 Prosentuaalinen sitominen kullekin näytteelle las kettiin seuraavasti yhtälöstä:

A-B

- x 100 * % sitominen

35 C-B

il iti < Hi»i . i *» „ 95204

Id A = Näytteen keskiarvo-O.D.

B = Taustan keskiarvo-O.D.

C = Keskiarvo-O.D. 3 yg/ml käsittelemättömälle MoAb-seurannalle.

5 Prosentuaalinen sitominen piirrettiin puolilogarit- misen graafisen kaavion ei-logaritmiseen asteikkoon, ja MoAb-konsentraatio piirrettiin logaritmiseen asteikkoon.

k

Kunkin koenäytteen BD50-arvot (se on vasta-aineannos, joka tarvitaan, jotta sitominen tapahtuisi 50 %:sti) saatiin 10 kaaviosta, ja immunoreaktiivisuuden viipymämäärä laskettiin seuraavasta yhtälöstä: BDS0 MoAb-seurannalle - x 100 % immunoreaktiivisuus 15 BDS0 koenäytteelle

Menetelmä 2 - Epäsuora RIA

Sopivat määrät kohdesoluja, jotka olivat 0,2 ml:ssa 10 % FCS-väliainetta, jaettiin tasaisesti 4 ml:n polysty-20 reeniputkiin. Testattavat näytteet laimennettiin konsent- raatioon, joka oli 2 pg/ml MoAb-ekvivalentteja 10 % FCS-väliaineessa. Kustakin 2 pg/ml:n näytteestä valmistettiin viisi kolminkertaista sarjalaimennusta, ja 0,2 ml lisättiin kuhunkin putkeen kaksinkertaisena. Taustanäytteisiin 25 laitettiin vain soluja ja väliainetta. Soluja inkuboitiin 4 °C:ssa yksi tunti, sitten ne pestiin kaksi kertaa (kaikki RIA-pesut suoritettiin 3 ml:n tilavuudella) 2 % FCS väliaineella. Kuhunkin putkeen lisättiin 0,05 ml lampaan F(ab')2 anti-hiiri-IgG [125I]:a (DuPont, Kissa# NEX 30 1620142), joka sisälsi noin 500 000 CPM:ä; soluja inkuboi- v tiin vielä 4 °C:ssa yksi tunti, ne pestiin kerran 25 • i FCS:llä ja kahdesti PBS:llä. Kuhunkin putkeen lisättiin 0,5 ml PBS:ä, soluja pyöritettiin, ne siirrettiin puhtaisiin putkiin ja laskettiin minuutin ajan Packard Gamma 500 35 -laitteessa.

16 95204 r

Kunkin arvon prosentuaalinen sitominen määritettiin ja niistä piirrettiin graafinen kaavio, kuten edeltävässä ELISA-yhtälössä, paitsi että O.D.-yksiköt korvattiin CPM:-llä ja C 1 keskiarvo-CPM 1 pg/ml käsittelemättömälle 5 MoAb-seurannalle. Kunkin näytteen immunoaktiivisuus las kettiin aikaisemmin selostetulla tavalla.

Menetelmä 3 - Suora RIA

Sopivat määrät kohdesoluja, jotka olivat 1 ml:ssa 10 % FCS-väliainetta, jaettiin tasaisesti 4 ml:n polysty-10 reenikoeputkiin, niitä sentrifugoitiin ja saostuman yläpuolella oleva neste poistettiin. Testattavat näytteet laimennettiin siten, että konsentraatioksi tuli 200 pg/ml MoAb-ekvivalentteja 10 % FCS-väliaineessa. Kustakin näytteestä valmistettiin viisi viisinkertaista lisälaimennus-15 sarjaa, ja kuhunkin putkeen lisättiin 0,05 ml kaksinkertaisena. 0,05 ml 125I-MoAb:a lisättiin kuhunkin putkeen (kullekin MoAb:lie ja annokselle määritettiin itsenäisesti optimaalinen määrä). Positiiviset seurantanäytteet sisälsivät soluja, väliainetta ja 125I-MoAb:a. Taustanäytteet 20 sisälsivät ei-spesifisiä soluja, väliainetta ja 125I-MoAb:a.

Soluja inkuboitiin yksi tunti 4 °C:ssa, ne pestiin kerran 2 % FCS-väliaineella, kahdesti PBS:llä, siirrettiin ja laskettiin, kuten edellä mainittiin.

Prosentuaalinen 125l-MoAb:n sitomisen inhibltio las- • 25 kettiin seuraavalla kaavalla:

A-B

- x 100 = % 125I-MoAb sitomisen inhibitio

C-B

30

A » Näytteen keskiarvo-CPM

• ·

B « Taustan keskiarvo-CPM

C - Positiivisen seurannan keskiarvo-CPM.

Piirros sekä prosentuaalinen immunoreaktiivisuus 35 laskettiin kullekin näytteelle aikaisemmin selostetulla tavalla, paitsi että BD50 on itseasiassa BID50 (MoAb-annos, 17 95204 joka tarvitaan, jotta 1J5I-MoAb:n sitominen inhiboituu 50-%:sti).

Huomioita: 1) Putkia pyöritettiin aina voimakkaasti välittö-5 mästi jokaisen reagenssilisäyksen jälkeen RIA:ssa.

2) Sisäinen seurantanäyte, joka vastasi 50 % käsittelemätöntä MoAb-seurantaa, sisältyi kuhunkin kokeeseen, ja sillä varmistettiin, oliko kukin menetelmä kvantitatiivinen ennustettaessa konjugaattien immunoaktiivisuuden 10 viipymää.

Tulokset näistä kokeista on taulukoitu alla taulukkoon 2. 1 ·

P

18 95204

Taulukko 2

MoAb-konjugaattien immunoreaktiivisuus

Ei-spesifiset kon- Käsittelemättömän 5 jugaatit, käyttäen MoAb-seurannan pro- esimerkin 3 tuotet- sentuaalinen immuno- ta sekä seuraavia: Valmistus aktiivisuus_

Lym 1 #1 15 B72.3 #1 70 10 #2 10 E33288Y.I:n 3-merkap-topropionihappodisul-fidianalogin hydrat-sidi (esimerkki 4), joka konjugoitu-25 nut seuraavaan;_

Lym 1 #1 100 #2 87 #3 64 #4 80 20 #5 100

Lym 2 #1 57 #2 85 #3 39 #4 70 25 •' B72.3 #1 100 #2 90 CT-M-01 #1 60 30 MAC-68 #1 40 #2 28 • ·

Hydratsidikonjugaatit, jotka on valmistettu käyttäen esimerkin 5 35 tuotetta sekä:

Lym 1 #1 100 #2 100 19 95204

Esillä olevan keksinnön mukaiset monoklonaaliset vasta-ainekonjugaatit ovat aktiivisia syövänvastaisina aineina. Alla selostettavasta kokeesta,jollatutkitaan solumyrkyn isyyttä in vitro, käy ilmi rakenteiden huomattava 5 edullisuus kohdesolulinjoille, ei-kohdesoluihin verrattuna, ja sen avulla saadaan mitta yhdisteiden kohdistettujen muotojen käyttökelpoisuudesta verrattuna niiden ei-kohdis-tettuihin vastineisiin.

Solumvrkvllisvvskokeet 10 In vitro

Testattavat näytteet laimennettiin siten, että kon-sentraatioksi saatiin 0,2 tai 0,02 pg/ml LL-E32288Y1I-ek-vivalentteja (lähtökonsentraatio riippuu testattavasta so-lulinjasta). Kustakin alkuperäisestä näytelaimennoksesta 15 valmistettiin kolme viisinkertaista lisälaimennosta, ja steriileihin 15 ml:n polystyreeniputkiin lisättiin 0,2 ml.

Kuhunkin kokeeseen sisältyi ainakin yksi samanlainen kon-jugaatti,joka koostui LL-E33288y11:stä, sekä sopimaton MoAb, määritettäessä asiaankuuluvan konjugaatin spesifi-20 syyttä. 105 sopivaa kohdesolua, jotka olivat 0,2 ml:ssa 10 % FCS-väliainetta, jaettiin tasaisesti putkiin ja niitä pyöritettiin. Lisäksi suoritettiin identtinen koe, käyttäen hyväksi sopimattomia soluja kohteina, ja näin varmistettiin edelleen asianmukaisen konjugaatin spesifisyys.

• * 25 MoAb-seurantoihin lisättiin vain ekvivalenttiset määrät

MoAb:a, ja positiivisiin seurantanäytteisiin lisättiin vain 10 % FCS-väliainetta.

Soluja inkuboitiin 37 °C:ssa 7 minuuttia, sitten ne pestiin neljä kertaa 8 ml:11a 2 % FCS-väliainetta. Kuhun-30 kin putkeen lisättiin 0,1 ml 10 % FCS:ä, soluja pyöritettiin, ja kuhunkin steriilin 96-koloisen polystyreeni-ku-dosviljelmämaljan koloon jaettiin tasaisesti 0,2 ml.

Maljoja inkuboitiin kaksi päivää kosteassa 37 °C:n inkubaattorissa 5 % C02:n läsnäollessa. Puolet väliaineesta 35 poistettiin ja korvattiin tuoreella väliaineella, joka si- ί 20 95204 sälsi 2 pCi/ml 3H tymidiiniä (DuPont, NEN, Kissa# NET-027). Inkuboimista jatkettiin 24 tunnin ajan, solut jäädytettiin, sulatettiin ja viljelmä kerättiin talteen PHD-solu-viljelmän keruulaitteella (Cambridge Technology, Inc.)· 5 Kutakin näytettä laskettiin 1 minuutin ajan Beckman LS 5800 -tuikemittarilla kanavalla 1.

Prosentuaalinen kasvun inhibitio laskettiin seuraavasti :

10 Koeearvon keskimääräinen CPM

- x 100 = % kasvu

Väliaineseurannan keskimääräinen CPM

100 - % Kasvu % Inhibitio 15

Prosentuaalinen inhibitio piirrettiin puolilogarit-misen graafisen kaavion ei-logaritmiseen asteikkoon, ja LL-E33288y1I:n konsentraatio piirrettiin logaritmiasteik-koon. Kunkin koenäytteen IC50-arvo (LL-E33288y1I:n kon-20 sentraatio, joka tarvitaan 50 % inhibition saavuttamiseksi) saatiin graafisesta kaaviosta, ja solumyrkynisyyden viipymä laskettiin seuraavasta yhtälöstä: LL-E33288y1I:n IC50 25 - x 100 = % solumyrkyllisyys

Koenäytteen ICS0 » #

Tulokset in vitro -solumyrkyllisyyskokeesta on taulukoitu alla olevaan taulukkoon 3.

*· 21 95204

Taulukko 3

MoAb-konjugaattien solumyrkyllisyys in vitro

MoAb Valmistus Solumyrkyllisyys 5 %E33288T1I % esi merkin tuote

Ei-spesifiset konjugaatit,, * jotka on valmistettu käyttäen esimerkin 3 tuotetta sekä:

Lym 1 #1 0,9 11,3 15 B72.3 #1 0,001 _iti_LJ_3,8 %E33288Y1I % esi merkin yhdis- 4 20 q

Hydrats idikon-jugaatit, jotka on valmistettu käyttäen esimer-25 kin 4 tuotetta sekä:

Lym 1 #1 80 #2 56 191 #3 40 60 30 -—--

Taulukko 3 (jatkuu) 22 95204

MoAb Valmistus Solumyrkyllisyys %E33288Y1I % esi- 5 merkin tuote

Hydratsidikon- jugaatit, jotka on valmisteltu « 2q käyttäen esimerkin 4 tuotetta sekä:

Lym 1 (ei-koh- 0 0 distettuja soluja vas- 25 taan)

Lym 2 #1 29 #2 2 100 #3 2 55 20 B72.3 #1 0 0 #2 0 0 MAC-68 #1 90 25 CTM-01 #1 111 830

%E33288Y1I

Hydratsidikon-30 jugaatit, jotka on valmistettu käyttäen esi- • l merkin 5 tuotetta sekä: 35 Lym 1 #1 300 #2 100 23 95204

Seuraavaa koesysteemiä käytettiin mittaamaan esillä olevan keksinnön mukaisten konjugaattien vaikutus in vivo.

In vivo -kokeet syöpälääkevaikutuksesta lääkeaine-monoklonaalisille vasta-ainekonjugaateille suoritettin 5 käyttäen ihmiskasvaisten ksenograafeja (ihonvärisissä) hiirissä.

Burkitt-lymfooma- (Raji) ja myelooma- (HS Suitan) solut kerättiin talteen soluviljelmistä ja ne istutettiin ihon alle (£ 80 x 106 Raji-soluja tai 40 x 106 HS Sultan-10 soluja) koehiiriin. Kiinteitä kasvaimia, munasarjasyöpiä (CA73, Ovar-3) ja rintasyöpää (MX-1) pantiin kasvamaan hiiriin, ne poistettiin, leikattiin 2 mm3:n paloiksi ja istutettiin ihon alle koehiiriin (5-8 palasta hiirtä kohti).

15 Lääkeaineet, monoklonaaliset vasta-aineet ja lääke- ainemonoklonaaliset vasta-ainekonjugaatit annettiin vatsa-kalvon sisäpuolelle kerran joka kolmas päivä kolmena tai viitenä kokonaisruiskeena, lähtien päivistä 2, 3, 4, 6, 7 tai 8 päivää kasvaimen istutuksen jälkeen. Kasvaimen mit-20 taukset (pituus ja leveys) suoritettiin Fowler ultra CAL II -elektronisella mikrometrillä joka 7. päivä 4 tai 5 viikkoa kasvaimen istuttamisesta. Kasvaimen massa milligrammoina arvioitiin seuraavalla kaavalla: ·* 25 Pituus (mm) x leveys (mm) 2

Kasvaimen kasvun inhibitio laskettiin kullekin koe-30 ryhmälle prosentteina seurannasta [käsiteltyjen (T) keski- ; arvo-mg-määrä jaettuna seurannan keskiarvo-mg-määrällä x .··. 100]. T/C-arvo < 42 % ryhmissä, joissa henkiinjääneiden eläinten määrä £ 65 %, osoittaa aktiivisuuden.

Tulokset tästä kokeesta ilmenevät taulukosta 4.

24 95204

Taulukko 4

In vivo syöpälääketestauksen tulokset

5 Annostus Kasvaimen S/T

(mikrog) koko

MoAb Lääkeaine (T/C) % seuranta E33288Y^I:n 3-mer-kaptopropionihap-podisulfidianalo-gin hydratsidi, joka on konjugoi- tu Lym 2:een 14,5 0,26 12 5/6 ^ Hydratsidi yksinään - 0,26 34 4/6

MoAb Lym 2 yksinään 14,5 - 32 6/6 20 Seos, hydratsidi + MoAb Lym 2 14,5 0,26 20 5/6 käsittely vatsakalvonsisäpuolelle ihmisen melanooma-solu-linjaa H.S. Suitan vastaan 3 ruisketta, lähtien 5. päivästä kasvaimen istutuksesta, annetut mittaukset tehtiin 35.

25 istutuksen jälkeisenä päivänä

Taulukko 4 (jatkoa) 95204

Annostus Kasvaimen S/T

g (mikrog) koko

MoAb Lääkeaine (T/C) % seuranta E33288Y1I;n 3-mer-kaptopropionihappo-10 disulfidianalogin hydratsidi, joka on konjugoitu MAC-68:an 15,5 0,25 39 7/7

Hydratsidi 15 yksinään - 0,25 - 0/6

MoAb MAC-68 yksinään 31 - 78 6/6

Seos, hydratsidi 20 + MoAb MAC-68 15,5 0,25 - 0/6

Melfalan (positiivisena seurantana - 10 43 6/6 käsittely vatsakalvon sisäpuolelle ihmisen munasarjasyöpä-25 linjaa CA73 vastaan, kolme ruisketta, lähtien kolmannesta « päivästä kasvaimen istutuksesta, annetut mittaukset tehtiin 35. istutuksen jälkeisenä päivänä

Taulukko 4 (jatkoa) 26 95204

Annostus Kasvaimen S/T

5 (mikrog) koko

MoAb Lääkeaine (T/C) % seuranta E33288Y^I:n 3-mer-kaptopropionihappo-disulfidianalogin hydratsidi, joka on konjugoitu CT- M-01:een 8,75 0,25 14 4/6

Hydratsidi 15 yksinään - 0,25 - 0/6

MoAb CT-M-01 yksinään 8,75 - 75 5/6

Seos, hydratsidi 20 + MoAb CT-M-01 8,75 0,25 - 0/6

Vinkrystiini (positiivinen seuranta) - 1,0 0 4/4 käsittely vatsakalvon sisäpuolelle ihmisen rintasyöpäsolu- linjaa MX-1 vastaan, kolme ruisketta, lähtien 2. päivästä 25 kasvaimen istutuksesta, annetut mittaukset tehtiin 35.

* - istutuksen jälkeisenä päivänä % • ·

Taulukko 4 (jatkoa) 27 95204

Annostus Kasvaimen S/T

^ (mikrog) koko

MoAb Lääkeaine (T/C) % seuranta E33288Y^1:n 3-mer-kaptopropionihappo-10 disulfidianalogin hydratsidi, joka on konjugoitu B72.3:een 6,2 0,125 62 6/6

Hydratsidi 15 yksinään - 85 6/6

MoAb B72.3 yksinään 6,2 - 96 6/6

Seos, hydratsidi 20 + MoAb B72.3 6,2 0,125 105 5/6

B33288Y1I

(3 käsittelyä) - 0,005 141 5/6

Cis-platina (positiivinen seuranta, ^3 käsittelyä) - 3,0 6 6/6 käsittely vatsakalvon sisäpuolelle ihmisen munasarjansyö-päsolulinjaa OVCAR-3 vastaan, viisi ruisketta, lähtien 4. päivästä kasvaimen istutuksesta (ellei toisin ole mainit-2q tu), annetut mittaukset tehtiin 35. istutuksen jälkeisenä päivänä

Taulukko 4 (jatkoa) 28 95204

Annostus Kasvaimen S/T

5 (mikrog) koko

MoAb Lääkeaine (T/C) % seuranta » ---- - ----- £332881^1^ 3-mer-kaptopropionihappo-disulfidianalogin hydratsidi, joka on konjugoitu Lym l:een 27 0,26 6 3/6

Hydratsidi yksinään - 0,26 72 6/6

MoAb Lym 1 yksinään 27 - 72 6/6

Seos, hydratsidi + MoAb Lym 1 13 0,13 61 4/1 20 - käsittely vatsakalvon sisäpuolelle ihmisen Burkitt-lymfoo- masolulinjaa, Raji TC vastaan, kolme ruisketta, lähtien 7. päivästä kasvaimen istutuksesta, annetut mittaukset tehtiin 28. istutuksen jälkeisenä päivänä 25

Keksintöä kuvataan edelleen seuraavien ei-rajoitt-vien esimerkkien ja kuvien avulla.

Kuvio 1 LL-E33288y1I:na merkityn syöpälääkeanti- : ' 30 biootin ultraviolettispektri

Kuvio 2 LL-E33288y1I:na merkityn syöpälääkeanti- biootin protonimagneettiresonanssispektri Kuvio 3 LL-E33288y1I:na merkityn syöpälääkeanti- biootin infrapunaspektri 29 95204

Esimerkki 1 LL-E33288y1I:n 3-merkaptopropionihappodisulfidiana- logi

Liokseen, jossa oli 90 mg LL-E33288y1I:a 90 ml:ssa 5 asetonitriiliä, lisättiin 10,6 mg 3-merkaptopropionihap-poa, joka oli 1 ml:ssa asetonitriiliä. Liuosta pyöritettiin ja sitten se laitettiin säilöön -20 °C:seen kuudeksi päiväksi. Liuotin poistettiin tyhjössä ja jäännös kromato-grafoltiin 10 ml:11a silikageeliä metyleenikloridissa. Ko-10 lonnia kehitettiin 50 ml:11a metyleenikloridia, 50 ml:11a 4 % metanolia, joka oli metyleenikloridissa ja lopuksi 100 ml:11a 8 % metanolia, joka oli metyleenikloridissa. Haihduttamalla tämä viimeinen fraktio, saatiin jäännös, joka otettiin talteen etyyliasetaattiin, auttaen hiukan aseto-15 nilla, ja se lisättiin tipoittain ylimäärään heksaania. Saostuma otettiin talteen ja kuivattiin, jolloin saatiin 39 mg haluttua tuotetta (FABMS, M + H 1394). Retentioaika C18-käänteisfaasi-HPLC:lla: 18 minuuttia 50 % asetonitrii-Ii/0,1M ammoniumkloridillä. (LL-E33288y1I; 8,0 minuuttia, 20 esterihydrolyysituote: 1,5 minuuttia).

Esimerkki 2

Reaktio, jossa (LL-E33288y11 reagoi 3-merkaptopro-pionihapon p-nitrofenyyliesterin kanssa (A) 3-merkaptopropionihapon p-nitrofenvvliesterin 25 valmistus

Kaupallisesti saatavaa 3-merkaptopropionihappoa, joka oli metyleenikloridissa, joka sisälsi katalyyttisen määrän väkevää rikkihappoa, käsiteltiin isobutyleenillä 20 minuutin ajan. Sitten liuos uutettiin IN natriumbikarbo-. 30 naattiliuoksella, minkä jälkeen metyleenikloridiliuos kui vattiin, käyttäen vedetöntä magnesiumsulfaattia. Sitten liuotetin haihdutettiin värittömäksi liikkuvaksi nesteeksi, jonka NMR- ja massaspektritiedot osoittivat, että kysymyksessä oli S-t-butyylimerkaptopropionihappo, t-butyy-35 liesteri.

30 95204

Tasamäärä tätä esteriä kuumennettiin palautusjääh-dytyslämpötilassa 6N suolahapon kanssa, joka oli dioksaa-nissa, 2,5 tuntia. Liuotin haihdutettiin, lisättiin etyyliasetaattia, ja tämä liuos uutettiin natriumkarbonaatil-5 la. Natriumkarbonaattiuutetta käsiteltiin 6N suolahapolla, kunnes suspension pH oli 2,0. Suspensio uutettiin sitten etyyliasetaatilla, uute kuivattiin vedettömällä magnesium-sulfaatilla ja liuotin haihdutettiin, jolloin saatiin väritöntä nestettä, jonka *H NMR- ja massaspektritiedot 10 osoittivat, että kysymyksessä oli S-t-butyylimerkaptopro-pionihappo.

Tämä yhdiste muutettiin p-nitrofenyyliesteriksi käsittelemällä sitä ekvimolaarisen määrän kanssa p-nitrofe-nolia ja disykloheksyylikarbodi-imidiä tetrahydrofuraanis-15 sa 4 tunnin ajan. Disykloheksyyli-urea -sivutuote poistettiin suodattamalla, ja suodos haihdutettiin öljyksi, joka puhdistettiin ajamalla se neutraalin silikageelin yli, käyttäen seuraavaa liuotinsysteemiä: heksaani:metyleeni-kloridi (50:50). Puhdas p-nitrofenyyliesterijohdannainen 20 oli haalean keltaista, liikkuvaa öljyä.

Vapaa merkaptaani naamioitiin seuraavalla menetelmällä . S-t-butyylimerkaptopropionihappo-p-nitrofenyylies-teri liuotettiin trifluorietikkahappoon, ja pieni moolinen ylimäärä (10 %) elohopea-asetaattia lisättiin. Seosta se-- 25 koitettiin 30 minuuttia, sitten trifluorietikkahappo haih dutettiin ja jäännös otettiin talteen dimetyyliformami-diin. Tätä liuosta käsiteltiin vetysulfidikaasulla 15 minuutin ajan, sitten musta elohopeasulfidi suodatettiin pois ja suodos haihdutettiin redusoidussa paineessa, jol-30 loin eliminoitiin aina 99 % dimetyyliformamidista. Synty-·· nyt heikosti ruskehtava liikkuva neste puhdistettiin neut raalilla silikageelillä, käyttäen heksaani:metyleeniklori-dia (50:50). ^ NMR:n mukaan pääkomponentti sisälsi pienen määrän t-butyylimerkaptojohdannaista. Analyyttinen HPLC, 35 joka suoritettiin kahdella Perkin-Elmer Pecosphere C18-pe- 3i 95204 räkkäiskolonnilla [4,6 x 33 mm ja 4,6 x 83 mm], käyttäen seuraavaa gradienttisysteemiä: 37,5/62,5 - 47,5/52,5 asetoni triiliä ja 0,1M ammoniumasetaattipuskuria pH:ssa 6,5 (etikkahappo), 12 minuutin aikajaksolla, osoitti, että 5 tuote oli 88-%:sti 3-merkaptopropionihapon p-nitrofenyy-liesteriä ja 10 % vähemmän polaarista S-t-butyylimerkapto-propionihappo-p-nitrofenyyliesteriä. Mukana oli myös pieni määrä vapaata p-nitrofenolia.

(B) Reaktio, lossa 3-merkaDtopropionihaDon p-nitro-10 fenwllesterl reagoi LL-E33288v1l:n kanssa 100 mg:n osa LL-E33288Y1I:a liuotettiin 50 ml:an asetonitriiliä. Tähän lisättiin liuos, jossa oli 25,7 mg 3-merkaptopropionihapon p-nitrofenyyliesteriä 1 ml:ssa asetonitriiliä. Reaktio jätettiin -20 °C:seen 48 tunniksi.

15 HPLC osoitti, että reaktio oli päättynyt. Liuos haihdutettiin kuiviin ja jäännös otettiin talteen 4 - 5 ml:an etyyliasetaattia, käyttäen sonikointia liuoksen tehostamiseksi. Seos suodatettiin ja suodos tiputettiin 45 ml:an sekoitettua heksaania. Syntynyt haalean keltainen kiinteä 20 aine otettiin talteen ja kuivattiin redusoidussa paineessa, ja näin saatiin 93 mg LL-E33288v1I:n propionihappojohdannaisen p-nitrofenyyliesteriä, kuten *Η NMR:stä ilmeni. FABMS:11a [M+H]-ioni ilmeni arvolla M/Z = 1 515.

Esimerkki 3 - - 25 LL-E33288Y11:n N-hydroksisukkinimidyyli-3-merkapto- propionaattidisulfidianalogi

Liuokseen, jossa oli 5 mg LL-E33288y1I:n 3-merkap-topropionihappo-disulfidianalogia esimerkistä 1, 0,5 ml:ssa tetrahydrofuraania, lisättiin 0,54 mg N-hydroksi-30 sukkinimidiä, joka oli 0,1 ml:ssa tetrahydrofuraania, ja — , sitten 1,8 mg disykloheksyylikarbodi-imidiä, joka oli 0,2 ml:ssa tetrahydrofuraania. Reaktion annettiin sekoittua huoneenlämpötilassa 4 tuntia, ja sitten se tukahdutettiin suurella ylimäärällä heksaania. Kiinteä aine eristettiin 35 suodattamalla ja liuotettiin etyyliasetaattiin. Syntynyt 32 95204 liuos pestiin kolme kertaa suolaliuoksella, kuivattiin magnesiumsulfaatilla ja haihdutettiin, jolloin saatiin 5 mg haluttua tuotetta kullankeltaisena jauheena, joka käytettiin ilman lisäpuhdistusta. Retentioaika käänteisfaasi-5 Cie-HPLC:11a: 15 minuuttia 40 % asetonitriili/O,IM ammo-niumklorldin vesiliuoksella (lähtöaine, 6,0 minuuttia).

Esimerkki 4 LL-E33288y11:n3-merkaptopropionyylihydratsididisul-fidianalogi 10 5,4 ml:an (3 ekv) vedetöntä hydratsiinia, joka oli 100 ml:ssa palautusjäähdytyslämpötliassa kiehuvaa tetra-hydrofuraania argonatmosfäärissä, lisättiin tipoittain 9,2 ml (83 mmol) metyyli-3-merkaptopropionaattia, joka oli 150 ml:ssa tetrahydrofuraania, kahden tunnin aikana. Liuosta 15 kuumennettiin palautusjäähdytyslämpötliassa vielä kaksi tuntia, se haihdutettiin ja laimennettiin sitten ja haihdutettiin kahdesti 300 ml:sta tolueenia. Tuote laitettiin silikageelinäytteeseen, jossa oli 5 % etyyliasetaatti/klo-roformia, ja sitä eluoitiin täytteestä 20 % metanoli/klo-20 roformilla. Syntynyt 3-merkaptopropionyylihydratsidi oli haalean vaaleanpunaista öljyä, joka kiinteytyi jäähdytettäessä, mutta suli huoneenlämpötilassa.

50 mg:an LL-E33288y1I:a, joka oli 50 ml:ssa aseto-nitriiliä ja -15 °C:ssa, lisättiin 6,6 mg 3-merkaptopro-- 25 pionyylihydratsidia, joka oli 1 ml:ssa tetrahydrofuraania.

Yksi ekvivalentti trietyyliamiinia ja/tai yksi ekvivalentti etikkahappoa lisättiin katalyytiksi. Reaktion annettiin sekoittua 0 eC:ssa yksi tunti, ja liuotin haihdutettiin sitten. Jäännös kromatografoitiin silikageelillä gradien-30 tiliä, jossa oli 10 - 15 % metanolia kloroformissa, ja ·’ näin saatiin 26 mg haluttua tuotetta. Retentioaika kään- teisfaasi-Cie-HPLC:11a: 5,0 minuuttia 41 % asetonitrii- li/0, IM ammoniumkloridin vesiliuoksella.

33 95204

Esimerkki 5 LL-E33288YJ1: n N- [ [ (4-metyylikumarin-7-yyli)amino] -asetyyli]kysteiinihydratsididisulfidianalogi

Seosta, jossa oli 1,0 g (5,7 mmol) 4-metyyli-7-5 aminokumariinia, 3,0 ml etyylibromiasetaattia (5 ekv), 90 mg (0,1 ekv) natriumjodidia ja 30 ml dimetyyliformami-dia, kuumennettiin argonatmosfäärissä 80 °C:ssa 5 tuntia.

Seos jäähdytettiin, laimennettiin etyylieetterillä, pestiin kolme kertaa 50 % suolaliuoksella, kuivattiin magne-10 siumsulfaatilla ja haihdutettiin kuiviin. Käsittelemätön tuote liuotettiin kloroformiin,joka sisälsi 1 % etyyliasetaattia, ja suodatettiin silikageelitäytteen läpi. Uudel-leenkiteyttämällä dietyylieetteristä, joka sisälsi aavistuksen verran kloroformia, saatiin puhdasta N-[(4-metyyli-15 kumarin-7-yyli)amino]asetaattia.

1,96 g:an (7,5 mmol) edellä olevaa esteriä, joka oli 15 ml:ssa metanolia ja 15 ml:ssa tetrahydrofuraania, lisättiin 10 ml IN natriumhydroksidin vesiliuosta. 30 minuutin kuluttua lisättiin 4 ml 10 % suolahapon vesiliuos-20 ta. Orgaaniset liuottimet haihdutettiin ja syntynyt kiteinen tuote suodatettiin ja pestiin kylmällä etanolilla ja sitten eetterillä. Tämä aine liuotettiin 20 ml:an tetra-hydrofuraania ja 4 ml:an dimetyyliformamidia. Disyklohek-syylikarbonyylidi-imidatsolia (1,3 g, 2,2 ekv) lisättiin 25 ja reaktion annettiin sekoittua 15 minuuttia. Sitten lisättiin kysteiinietyyliesterihydrokloridia (1,6 g, 2,5 ekv) ja trietyyliamiinia (1,2 ml). Kolmen tunnin kuluttua tästä reaktion laimennettiin etyylieetterillä, joka sisälsi 5 % metyleenikloridia, ja pestiin kerran 10 % suolaha-30 pon vesiliuoksella ja kahdesti suolaliuoksella. Kun käsittelemätön tuote oli kuivattu magnesiumsulfaatilla ja liuottimet oli haihdutettu, se kiteytettiin liuottamalla kloroformiin, joka sisälsi hyvin pienen määrän etanolia, ja sitten lisäämällä ylimäärä eetteriä. Kiteet suodatet-35 tiin ja kuivattiin, jolloin saatiin puhdasta N-[[(4-metyy-likumarin-7-yyli)amino]asetyyli]kysteiinietyyliesterla .

34 95204

Seosta, jossa oli 5 ml kloroformia, 20 metanolia ja 0,4 ml hydratsiinihydraattia, kuumennettiin palautusjääh-dytyslämpötilaan argonatmosfäärissä. Tähän lisättiin 550 mg N-[[(4-metyylikumarin-7-yyli)amino]asetyyli]kysteiini-5 etyyliesteriä. Kun seosta oli kuumennettu palautusjäähdy- tyslämpötilassa 9 tuntia, se jäähdytettiin ja kiinteä tuote suodatettiin pois ja pestiin kloroformilla ja sitten etyylieetterillä. Käsittelemätön tuote (joka sisälsi tio-lia ja disulfidia) liuotettiin dimetyyliformamidiin, joka 10 sisälsi ditiotreitolia ja trietyyliamiinia. 30 minuutin kuluttua tuote saostettiin ylimäärällä etyylieetteriä ja otettiin talteen suodattamalla. Tämä aine puhdistettiin edelleen uudelleenkiteyttämällä kaasuttomasta asetonitrii-listä, joka sisälsi ditiotreitolia ja aavistuksen verran 15 amiinia, ja näin saatiin puhdasta N-[[(4-metyylikumarin-7-yyli)amino]asetyyli]kysteiinihydratsidia.

12 mg:an 70 %:sti puhdasta LL-E33288y11:a, joka oli 12 ml:ssa asetonitriiliä ja 0 C:ssa, lisättiin 4 mg N-[ [ (4-metyylikumarin-7-yyli) amino] asetyyli]kysteiinihydrat-20 sidia, joka oli 12 ml:ssa dimetyyliformamidia. Kun oli sekoitettu yön yli, lisättiin vielä 2 mg N-[[(4-metyylikuma-rin-7-yyli)amino]asetyyli]kysteiinihydratsidia, joka oli 0,6 ml:ssa dimetyyliformamidia. Reaktiota sekoitettiin 3 päivää 0 °C:ssa, ja se suodatettiin. Asetonitriili haih-• · 25 dutettiin pois ja syntynyt dimetyyliformamidiliuos laimen nettiin ylimäärällä 1:1 heksaani/eetteriä. Tuote eristettiin suodattamalla ja puhdistettiin edelleen kromatogra-fialla silikageelillä, 15 - 20 % gradientilla, jossa oli metanolia kloroformissa, ja näin saatiin 3 mg haluttua 30 tuotetta. Retentioaika käänteisfaasi-Cie-HPLC:lla: 3,5 mi-nuuttia, käyttäen 45 % asetonitriili/0,1 M ammoniumklori-din vesiliuosta.

35 95204

Esimerkki 6 LL-E33288031: n3-merkaptopropionyylihydratsidldisul-fidianalogi 10 mg:an LL-E33288a31:a, joka oli 9 ml:ssa asetonit-5 riiliä ja -15 °C:ssa, lisättiin 6,6 mg 3-merkaptopropio-nyylihydratsidia, joka oli 1 ml:ssa asetonitriiliä. Yksi ekvivalentti trietyyliamiinia ja/tai yksi ekvivalentti etikkahappoa lisättiin katalyytiksi. Reaktion annettiin sekoittua 0 *C:ssa yksi tunti, ja sitten liuotin haihdu-10 tettiin pois. Jäännös kromatografoitiin silikageelillä, gradientilla, jossa oli 10 - 15 % metanolia kloroformissa, ja näin saatiin haluttua tuotetta. Retentioaika käänteis-faasi-C18-HPLC:lla: 3,5 minuuttia systeemissä: 45 % aseto-nitriili/0,1 M ammoniumkloridin vesiliuos.

15 Esimerkki 7

Ei-spesifinen konjugaatio proteeneihin

Esimerkissä 3 kuvattu hydroksisukkinimidiesteri kiinnitettiin kovalenttisesti vasta-aineisiin heikosti emäksisissä olosuhteissa. Seuraava menetelmä on yleinen 20 menetelmä, jota käytettiin tehtäessä taulukossa 5 lueteltuja vasta-ainekonjugaatteja. Vasta-aine, jonka konsent-raatio oli 3-5 mg/ml ja joka oli fosfaattipuskurissa, joka sisälsi 0,1M natriumkloridia, pH 7,5, saatettiin reagoimaan 5 - 20-kertaisen moolisen ylimäärän kanssa tuotet-25 ta esimerkistä 3, samanaikaisesti sekoittaen huoneenlämpötilassa, 1-4 tunniksi. Konjugoitu proteiini suolattiin ulos kromatograafisesti ja aggregoitunut proteiini erotettiin monomeerisesta materiaalista geelisuodatus-HPLC:n avulla. Monomeerifraktiot yhdistettiin ja väkevöitiin.

30 Taulukko 5

Ei-spesifiset konjugaatit, jotka on valmistettu käyttäen esimerkin 3 tuotetta 36 95204

MoAb Lääkeainekuorimitus _M/M_

Lym 1 5,2 B72.3 6,0 B72.3 2,9 5

Esimerkki 8

Paikka-spesifisen konjugaatin valmistus

Yleinen menetelmä kiinnittää lääkeaineiden hydrat-sidijohdannaiset hapetettuihin vasta-aineisiin kuvataan 10 julkaisussa T.J. McKearn, et ai., US-patentti 4 671 958. Menetelmää on käytetty valmistettaessa vastaainekonjugaat-teja esimerkkien 4 ja 5 tuotteista tietyillä muunnoksilla, kuten edellä on kuvattu. Tuotteet näistä reaktioista sekä niiden ominaisuudet esitetään yhteenvetona taulukossa 6.

15 (A) Vasta-aineen hapetus

Vasta-ainetta, jonka konsentraatio oli 5-10 mg/ml dialysoitiin yön yli 200-kertaista 50 mM-natriumasetaatti-puskuritilavuutta, pH 5,5, joka sisälsi 0,1M natriumklori-dia, (Puskuri A), vastaan. Dialyysin jälkeen MoAb hapetet-20 tiin 15 mM - 200 mM perjodihapolla, joka oli 0,2 M nat-riumasetaatissa. Hapetuksen annettiin edetä pimeässä, samanaikaisesti sekoittaen, 4 °C:ssa 45 minuutin ajan, minkä jälkeen hapetettu MoAb suolattiin ulos Sephadex G-25 -ko-‘•v lonnilla, jonka kerrostilavuus oli 2 5. Vasta-aineen ha- 25 pettumisaste määritettiin reaktiolla p-nitrofenyylihydrat-siinin kanssa ja vertaamalla proteiinin absorbanssia 280 mm:ssä p-nitrofenyylihydratsiinin absorbanssiin 395 mm:ssä.

(B) Lääkeaine-hvdratsidlkonluaaatio 30 Hapetettu MoAb saatettiin reagoimaan 25 - 200 -ker taisen moolisen ylimäärän kanssa lääkeaine-hydratsidia. Hydratsidit liuotettiin dimetyyliformamidiin ja lisättiin MoAb:n vesiliuokseen. MoAb:n saostumisen estämiseksi lopullinen lisätty dimetyyliformamiditilavuus ei ollut suu- 37 95204 rempi kuin 10 % koko reaktion tilavuudesta. Reaktion annettiin edetä 3 tuntia huoneenlämpötilassa, samanaikaisesti sekoittaen. Jotta oltaisiin voitu estää reagoimattomien aldehydien ristiinsitoutuminen ja myöhempi aggregoitumi-5 nen, lisättiin salpausainetta, asetyylihydratsidia 100-kertaisena moolisena ylimääränä kolme tuntia lääkeaine-hydratsidin lisäämisen jälkeen. Schiffin emässidoksen, joka on aldehydin ja lääkeaine-hydratsidin (hydratsoni) välillä, stabiloimiseksi tuote tavallisesti pelkistettiin 10 alkyylihydratsiiniksi lisäämällä 10 mM natriumsyanoboro-hydridiä ja reaktion annettiin edetä vielä yksi tunti (konjugaation kokonaisaika - 4 tuntia). Konjugaatti suolattiin ulos kromatograafisesti ja dialysoitiin täydellisesti (minimiaika 48 tuntia) fosfaattipuskuriin, jonka pH 15 oli 6,5, säilyttämistä ja kokeiden suorittamista varten.

Konjugaateista analysoitiin mahdolliset läsnäolevat aggregaatit geelisuodatus-HPLC:11a, ja vapaat hapot kään-teisfaasi-HPLC:lla. Lääkeainekuormitus määritettiin spekt-roskooppisesti, käyttäen ekstinktiokertoimia sekä vasta-20 aineelle että lääkeaineelle arvioitaessa lääkeaineen moolista konsentraatiota konjugaateissa.

• « • · 38 95204

Taulukko 6

Hydratsidikonjugaatit, jotka on valmistettu esimerkin 4 tuotteesta 5 _

MoAb Valmistus Lääkeainekuormitus M/M

Lym 1 #1 1,4 #2 2,4 #3 1,0 10 #4 6,7 #5 3,3

Lym 2 #1 2,9 #2 1,9 15 #3 2,0 #4 2,8 B72.3 #1 2,3 #2 1,3 20 CTM-01 3,1 MAC-68 1,7 25

Hydratsidikonjugaatit, jotka on valmistettu esimer- kin 5 tuotteesta

Lym 1 #1 0,15 #2 0,76 30 • ·

Claims

39 95204
1. Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten kaavan CH3SSS-W mukaisten yhdisteiden kohdennettujen johdan-5 naisten valmistamiseksi, joilla on kaava Tu-(Z-Sp-SS-W). (TO— 10 jossa CHjSSS-W on syöpälääkeantibiootti 11^332880^, -a/, -a2Br, -a2\ -a3Br, -a<Br, -ΒΛ -B2Br, -B3X, -ΥχΒΓ, -Yi1, -6^, Tu on monoklonaalinen vasta-aine, Y on proteiinin sivuketjun aminoryhmä tai aldehydi, joka on peräisin Tu:n hiilihydraattiradikaaleista, Sp on suora- tai haaraketjui-15 nen kahdenarvoinen C2.5-radikaali tai kahdenarvoinen aryyli-tai heteroaryyli-C2.5-alkyyliradikaali ja n on kokonaisluku 1 - 100, tunnettu siitä, että a) saatetaan CH3SSS-W reagoimaan yhdisteen kanssa, jolla on kaava Q-Sp-SH, jossa kaavassa Q on karboksyyli-20 ryhmä, -CONHNH2 tai -NHCSNHNH2, asetonitriilissä yhden ekvivalentin kanssa trietyyliamiinia ja/tai yhden ekvivalentin kanssa etikkahappoa -10 - -30 °C:ssa 1-48 tuntia, eristetään välituote, jolla on kaava Q-Sp-SS-W, jossa Q, Sp ja W ovat kuten edellä määriteltiin, sitten 25 b2) saatetaan yhdiste, jolla on kaava Q-Sp-SS-W, jossa Sp ja H ovat kuten edellä määriteltiin ja Q on kar-boksyyliryhmä, reagoimaan kaavan Tu-(Y)n mukaisen molekyylin kanssa, jossa Y on sivuketjun aminoryhmä ja n on 1 -100, puskuri vesiliuoksessa pH:ssa, joka on 6,5 - 9, lämpö-30 tilassa 4-40 ®C:ssa, joko suoraan tai veteen liukenevan karbodi-imidin läsnäollessa, jolloin muodostuu yhdiste Tu-(Z-Sp-SS-W)„ (Y)n-. 40 95204 jossa Tu, Sp, W, n ja Y ovat kuten edellä määriteltiin, m on 1 - 15 ja Z muodostuu Q:n ja Y:n kovalenttisessa reaktiossa ja se on -CONH-; tai b2) saatetaan kaavan Q-Sp-SS-W mukainen yhdiste, 5 jossa Sp ja W ovat kuten edellä määriteltiin ja Q on kar-boksyyliryhmä, reagoimaan N-hydroksisukkinimidin tai 4-nitrofenolin kanssa karboksyyliä aktivoivan aineen, kuten karbodi-imidin läsnäollessa, jolloin muodostuu yhdiste, jolla on kaava Q-Sp-SS-W, jossa Sp ja H ovat kuten edellä 10 määriteltiin ja Q on O JL- -c°2n tai -co2^0, 15 i 0 ja tämä saatetaan reagoimaan kaavan Tu-(Y)n mukaisen molekyylin kanssa, jossa Tu ja n ovat kuten edellä määriteltiin ja Y on sivuketjun aminoryhmä, puskurivesiliuoksessa 20 6,5 - 9:n pHrssa 4-40 °C:n lämpötilassa, jolloin muodos tuu yhdisteitä, joilla on kaava Tu-(Z-Sp-SS-W). (Ϋ)η-. 25 jossa Tu, Sp, Y ja n ovat kuten edellä määriteltiin, m on 1 - 15 ja Z muodostuu kovalenttisessa reaktiossa, jossa Q ja Y reagoivat, ja se on -C0NH-; tai b3) saatetaan kaavan Q-Sp-SS-W mukainen yhdiste, 30 jossa Sp ja W ovat kuten edellä määriteltiin ja Q on -CONHNH2 tai -NHCSNHNH2, reagoimaan kaavan Tu-(Y)n mukaisen molekyylin kanssa, jossa Tu ja n ovat kuten edellä määriteltiin ja Y on aldehydi, joka on peräisin Turn hiilihyd-raattiradikaaleista, hapettamalla maa-alkaliperjodaatin 35 läsnäollessa puskurivesiliuoksessa pHrssa 4,0-6,5, 4 - 41 95204 40 °C:n lämpötilassa, ja n on 1 - 20, jolloin muodostuu yhdiste, jolla on kaava Tu-(Z-Sp-SS-W)„ 5 (Yr jössä Tu, Sp, W, Y ja n ovat kuten edellä määriteltiin ja Z muodostuu kovalenttisesta reaktiosta Q:n ja Y:n välillä ja se on -CONHN-CH- tai -NHCSNHN-CH- ja m on 0,1 - 15; tai 10 c) käsitellään viimeksi mainittua yhdistettä, jolla on kaava Tu-(Z-Sp-SS-W). (Y in-IS jossa Tu, Z, Sp, W, Y, n ja m ovat kuten edellä määriteltiin, asetyylihydratsiinilla tai tyrosiinihydratsiinilla puskurivesiliuoksessa pH:ssa, joka on 4,0 - 6,5, lämpötilassa 4 - 40 °C, jolloin muodostuu yhdiste, jolla on kaava 20 Tu-(Z-Sp-SS-W). (Yrjössä Tu, Sp, W, n ja m ovat kuten edellä määriteltiin ja Y on -CH*NNHCOCH3 tai -CH-NNHCO-CH( NH2) -CH2-^^^^-QH ja saatetaan tämä yhdiste reagoimaan natriumsyanoboorihyd-ridin tai natriumboorihydridin kanssa puskurivesiliuokses-. 30 sa pH:ssa, joka on 4,0 - 6,5, lämpötilassa 4-40 eC, jol loin muodostuu yhdiste, jolla on kaava Tu-(Z-Sp-SS-W). <Y)„- 42 95204 jossa Tu, Sp, W, m ja n ovat kuten edellä määriteltiin, Z on -CONHNHCH2- tai NHCSNHNHCH2- ja Y on -CH2NHNHCOCH3 tai -CH2NHNHCOCH (NH2 ) CHy^(^^)-OH
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä pro-teiinilääkeainekonjugaatin valmistamiseksi, jolla on kaava Tu-(Z-Sp-SS-W). 10 <*>„.„ ja joka on valmistettu syöpälääkeantibiootista, jota on merkitty LL-E33288Y!1 (CH3SSS-W) :llä ja jonka a) ultraviolettispektri esitetään kuviossa 1; 15 b) protonimagneettispektri esitetään kuviossa 2; ja c) infrapunaspektri esitetään kuviossa 3; tunnettu siitä, että korvataan ditiometyyllosa yhdisteellä, jolla on kaava Q-Sp-SH, jossa Sp on suora- tai haaraketjuinen kah-20 denarvoinen C2.5-radikaali tai kahdenarvoinen aryyli- tai heteroaryyli-C2_5-alkyyliradikaali, Q on tai se voidaan muuttaa myöhemmin karboksyyliryhmäksi tai ryhmäksi -C0NHNH2 tai -C02Yf)>N02 25 jolloin muodostuu välituote, jolla on yleinen kaava Q-Sp-SS-W, jossa Q, Sp ja W ovat kuten edellä määriteltiin, saatetaan Q-Sp-SS-W reagoimaan kaavan Tu-(Y)n mukai-30 sen molekyylin kanssa, jossa Tu on monoklonaalinen vasta-aine, jossa esiintyy edullista reaktiivisuutta ihmiskas-vaimeen liittyneen antigeenin kanssa, Y on vasta-aineen sivuketjun aminoryhmä tai se on aldehydi, joka on saatu hapettamalla vasta-aineen hiilihydraattiryhmiä, ja n on 35 kokonaisluku 1 - 100, jolloin muodostuu yhdiste, jolla on kaava : · «· . *»«· IKX 43 95204 Tu-(Z-Sp-SS-W). (Yrjössä Tu, Sp, W ja n ovat kuten edellä määriteltiin ja Z muodostuu Q:n ja Y:n kovalenttisesta reaktiosta suoraan 5 tai myöhemmän pelkistyksen jälkeen, ja Z on -CONH-, CONHN=CH-, -CONHNHCH2- tai -NHCOCH2-CH (CH2)0<1 10 io2H ja m on 0,1 - 15.
3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että CH3SSSW on LL-E33288YJ1, Q on karboksyyliryhmän 4-nitrofenyyliesteri, Sp on -CH2CH2-, Tu 15 on monoklonaalinen vasta-aine CT-M-01, Y on -NH2, Z on -CONH- ja m on 0,5 - 15.
4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että CH3SSSW on LL-E33288y11, Q on karboksyyliryhmän hydroksisukkinimidiesteri, Sp on
20 -CH2CH2-, Tu on monoklonaalinen vasta-aine MAC-68, Y on -NH2, Z on -CONH- ja m on 0,5 - 15.
5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että CH3SSSW on LL-E33288Y!1, Q on -C0NHNH2, Sp on -CH2CH2-, Tu on monoklonaalinen vasta-aine * 25 Lym 1, Y on -CHO, Z on -CONHNHCH2- ja m on 0,1 - 10.
6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että CH3SSSW on LL-E33288YJ1, Sp on ·. ” ται>- ' NHC0CH2NH^ o ^o Tu on monoklonaalinen vasta-aine B72.3, Y on -CHO, Z on -C0NHNHCH2- ja m on 0,1 - 10. 44 95204
7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että CH3SSSW on LL-E33288Y!1, Sp on 5 τα’2' föcS NHCOCH2NH/,Sv^N"o '^'o *
10 Tu on monoklonaalinen vasta-aine Lym 2, Y on -CHO, Z on -CONHNHCHj- ja m on 0,1 - 10. 45 95204 t