FI100105B - Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten kantaja-lääkeainekonjugaatt ien valmistamiseksi, jotka käsittävät antibioottiosan ja monoklonaalis en vasta-aineen - Google Patents

Description

, 100105

Menetelmä terapeuttiset! käyttökelpoisten kantaja-läake-ainekonjugaattien valmistamiseksi, jotka käsittävät anti-bioottiosan ja monoklonaalisen vasta-aineen 5 Keksinnön kohteena on menetelmä antibioottisten LL- E33288-kompleksin alfa2-, alfa3- ja gammaj-, pseudoaglykoni-jäsenien ja niiden johdannaisten disulfidijohdannaisten ja monoklonaalisen vasta-aineen muodostamien konjugaattien valmistamiseksi. Nämä konjugaatit, jotka valmistetaan 10 saattamalla kyseinen antibiootti reagoimaan ei-substituoi- dun tai substituoidun alkyylimerkaptaanin kanssa ja konju-goimalla saatu disulfidiyhdiste monoklonaaliseen vasta-aineeseen, ovat tehokkaita kasvainvastaisia aineita.

Konjugaatin kantaja- (kohdistus-) osuus on mono-15 klonaalinen vasta-aine. Konjugaatin antibioottiosana käy tettyjen yhdisteiden karakteristisiä ominaisuuksia on esitetty oheen liitetyissä kuvioissa seuraavasti.

Kuvio 1 on N-asetyyli-LL-E33288-gamma1I:ksi nimetyn kasvainvastaisen antibiootin ultraviolettispektri.

20 Kuvio 2 on N-asetyyli-LL-E33288-gammaj1:ksi nimetyn kasvainvastaisen antibiootin infrapunaspektri.

1 ; Kuvio 3 on N-asetyyli-LL-E33288-gamma1I:ksi nimetyn */;’ kasvainvastaisen antibiootin protoniydinmagneettisen re- sonanssin spektri.

• :25 Kuvio 4 on N-asetyyli-LL-E33288-gamma1I:ksi nimetyn • · · kasvainvastaisen antibiootin hiili-13-ydinmagneett isen • · « : resonanssin spektri.

Kuvio 5 on jodi-LL-E33288-pseudoaglykoniksi nimetyn j*.jt kasvainvastaisen antibiootin ultraviolettispektri.

30 Kuvio 6 on jodi-LL-E33288-pseudoaglykoniksi nimetyn kasvainvastaisen antibiootin infrapunaspektri.

• · ·* ’* Kuvio 7 on jodi-LL-E33288-pseudoaglykoniksi nimetyn kasvainvastaisen antibiootin protoniydinmagneettinen re- sonanssispektri.

2 100105

Kuvio 8 on jodi-LL-E33288-pseudoaglykoniksi nimetyn kasvainvastaisen antibiootin hiili-13-ydinmagneettinen resonanssispektri.

Kollektiivisesti LL-E33288-kompleksina tunnettujen 5 bakteerivastaisten ja kasvainvastaisten aineiden ryhmää on kuvattu ja ne ovat patenttivaatimusten kohteena EP-hake-musjulkaisussa 0182152A3, joka julkaistiin 28. toukokuuta 1986, ja niitä käytetään kasvainvastaisten disulfidiyhdis-teiden valmistamiseksi, jotka toimivat lähtöaineina tämän 10 keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettavien kasvain vastaisten aineiden kohdistettujen muotojen saamiseksi.

EP-hakemusjulkaisussa 0182152A3 kuvataan LL-E33288-kompleksia, sen jäseniä LL-E33288-alfa^, LL-E33288-alfa1I, LL-E3328 8-alf a2Br, LL-E332 8 8-alf a2x, LL-E33288-alf a3Br, 15 LL-E33288-alfa3I, LL-E33288-alfa4Br, LL-E33288-beta1Br, LL-E33288-beta1I, LL-E33288-beta2Br, LL-E33288-beta2T, LL-E33288-gamma1Br, LL-E33288-gamma1I ja LL-E33288-delta1I, sekä menetelmiä niiden valmistamiseksi aerobisesti fermen-toimalla käyttäen uutta Micromonospora echinospora spp. 20 calichensis -kantaa tai sen luontaisia tai valmistettuja mutantteja. EP-hakemusjulkaisussa 0182152A3 julkistetaan ''··' myös rakenne-ehdotuksia joillekin edellä mainituille jä- senille. Nämä rakenne-ehdotukset on esitetty taulukossa 1.

• · * • · • * * ** • * · • · · • ♦ • · • · · • « · • · · • · · « • · • * • · · • · « » .

Il 3 100105

Taulukko 1:

Rakenne-ehdotuksia luontaisista lähteistä eristetylle CH3-SSS-W:lie (jossa W on jäljempänä esitetty ryhmään CH3-SSS- kiinnittynyt substituentti) 5 R, v/X/V' H°,A° OCH1

AA-o I

*11 \ _ \ JO ^ / X OCH.

o CH, 0 CH^.-yCO-^ - W 1”· - A- 15 5- Ύ^όοη, 0Λ .och, OCH, i ' 1 CH, 2 0 Merkintä R, R2 R3 R4 R5 R6 R7 x

E33288a2‘_ Ar, R2. H H C2H5 I

·· E33288a31_ ΑΓι H H R4. I

Ε33288β11__Αη R2. H R4. (CH3)2CH _ I

E33288Y!1 Ar, R2· H R4. C2H5 I

25 E332886,1 Ar, R2. H R4. CH3 I

Ε33288β,ΒΓ__Ar, R2. H R4. (CH3)2CH____Br E33288y,Br Ar, R2. H R4. C2H5 Br !·:·; E33288a2Br Ar, Rr H H C2H5 Br :·1. E33288a3Br Ar, H H R4, Br * .‘”.30 Esperamisiini A, CH3 R2. Ry (CH3)2CH H Ar2

,,'.; Esperamisiini A2 CH3 R2. R3· (CH3)2CH Ar2 H

.· '. Esperamisiini A,b CH3 R2. R3. CH3CH2 H Ar2 4 100105

Muita LL-E33288-kompleksin jäseniä on kuvattu ja esitetty patenttivaatimusten kohteena EP-hakemusjulkaisussa 027485A2, joka julkaistiin 3. elokuuta, 1988, ja nekin ovat käyttökelpoisia tämän keksinnön mukaisessa menetel-5 massa kasvainvastaisten aineiden disulfidijohdannaisten kohdistettujen muotojen valmistamiseksi. Tässä EP-hakemus-julkaisussa kuvataan sarjan kemiallisesti valmistettuja jäseniä LL-E33288-bromi- ja LL-E33288-jodi-pseudoaglykoni. Kyseisessä hakemusjulkaisussa kuvataan myös dihydrojohdan-10 naisia, joita voidaan saada kaikista edellä mainituista kasvainvastaisista antibiooteista pelkistämällä natriumbo-rohydridillä ketoni asemassa Cu hydroksyyliryhmäksi. Nämä viimemainitut rakenne-ehdotukset on esitetty taulukossa 2.

Edelleen muita kasvainvastaisten antibioottien ryh-15 män LL-E33288 jäseniä kuvataan ja esitetään patenttivaati musten kohteena US-patenttijulkaisussa 5 079 233 (vastaava US-patenttihakemus 30,553-01 tehty tätä hakemusta vastaavan US-patenttihakemuksen kanssa samanaikaisesti), ja myös ne ovat käyttökelpoisia kasvainvastaisten aineiden muiden 20 kohdistettujen muotojen valmistamiseksi tämän keksinnön mukaisella menetelmällä. Mainitussa US-patenttijulkaisussa ; kuvataan usean LL-E33288-kompleksijäsenen kemiallisesti valmistettuja N-asyyli johdannaisia. Samoin nämä rakenne-ehdotukset on esitetty taulukossa 2.

• · · • · • · • ·· • · · • ♦ · • · • · • ·« • · · • · · • · · 1

II

♦ • » • ♦· 5 100105

Taulukko 2:

Rakenne-ehdotuksia CH3-SSS-W:lie, joka on saatu manipuloimalla kemiallisesti taulukon 1 mukaista yhdistettä (W on jäljempänä esitetty ryhmään CH3-SSS- kiinnittynyt subs-tituentti) ?»- I Γ· λογ n0·'-//"”· "·' /-- H H O ----f

CH^S^T / \ Tu * °CH

=* o /Oli4' L "txO-V° ^ .. "·ί« CH, 0 -S ° A*. T Vk 1- B.o^S>c* Χ«Η rv- oc* Ih, och 4h

Merkintä R, R, R3 R4 R5 Rs R6 R7 R8 R, x

..... Dihydro-LL- Ar, Rr H H C2H5 H OH H I

E33288a2'

: N-asyyli-LL- Ar, R2, H H C2H5 RCO I

E33288a2'

Dihydro-LL- Ar, H H R4. OH H I

: ” E33288cc3' • · t

*·.* ‘ Dihydro-LL- Ar, R2. H R4. (CH3)2CH H OH H I

E33288P i1 • · ·

’·. N-asyyli-LL- Ar, R2. H R4. (CH3)2CH RCO I

E33288P,1

•: Dihydro-LL- Ar, R2. H R4. C2H5 H OH H I

E33288y,' 6 100105

Merkintä R, R2 R3 R4 R5 R5. R6 R7 R8 R9 x

Dihydro-LL- Ar, R2. H R4. CH3 H OH H I

E332885,'

N-asyyli-LL- Ar, Rr H R4 CH3 RCO I

E332885,1

lodi LL- Ar, H H H I

E33288 pseu- doaglykoni

Dihydro-lodi Ar, H H H OH H I

LL-E33288 pseudoaglykoni

Dihydro-LL- Ar, Rr H R4 (CH3)2CH H OH H Br E33288p,Br N-asyyli LL- Ar, R, H R4. (CH3)2CH RCO Br Ε33288β,ΒΓ

Dihydro LL- Ar, R2 H R4 C2H5 H OH H Br Ε33288γ,ΒΓ N-asyyli LL- Ar, Rr H R4 C2H5 RCO Br E33288y,Br

Dihydro-LL- Ar, Rr H H C2H5 H OH H Br E33288a,Br N-asyyli LL- Ar, Rr H H C2H5 RCO Br E33288a,Br . ’ Dihydro LL- Ar, H H R4. OH H Br : : E33288a3Br

Bromi-LL- Ar, H H H Br •; " ; E33288 pseu- ... doaglykoni • · *** Dihydro-bromi- Ar, H H H OH H Br LL-E33288 pseu-doaglykoni ··' N-asetyyliespera- CH3 R2· R3 (CH3)2CH CH3 H Ar2

l ** misiini-A, CO

• · «

*.* * N-asetyliespera- CH3 R2 R3 (CH3)2CH CH3 Ar2 H

..’ niisiini-A2 CO

• · N-asetyliespera- CH3 R2· R3. CH3CH2 CH3 H Ar2

misiini-A,b CO

ti 7 100105 joissa rakenteissa R = vety tai haarautunut tai ei-haarautu-nut alkyyli-(Ci-Cjo) - tai alkyleeni-(Cj-C^) -ryhmä, aryyli- tai heteroaryyliryhmä, tai alkyyli-(Cj-Cj)- tai heteroalkyyli-(C2— C5)-ryhmä, joista kukin on valinnaisesti substituoitu yhdellä tai useammalla hydroksyyli-, amino-, karboksyyli-, halogeeni-, (alempi alkoksi) - (¢^-03)-, tai (alempi tioalkoksi) - (Cy-C5) -ryhmällä.

Tietyt muut kasvainvastaiset ja bakteerivastaiset yhdisteet ovat rakenteeltaan läheisiä keksinnön mukaisessa menetelmässä käytettäville, nimittäin seuraavat: 1) "Esperamisiini BBM-1675, joka on uusi luokka tehokkaita kasvainvastaisia antibiootteja. I. Fysikokemialliset tiedot ja osittainen rakenne", M. Konishi, et ai., J.Antibiotics 38 (1985) 1605. "Uusi kasvainvastainen antibioottikompleksi", 5 M. Konishi et ai., GB-hakemusjulkaisu 2 141 425A, 15. toukokuuta, 1984.

2) "Uudet kasvainvastaiset antibiootit, FR-900405 ja FR- 900406.1. Tuottavan kannan taksonomia", M. Iwami, et ai., J.Antibiotics 3_8 (1985) 835. "Uudet kasvainvastaiset anti- 10 biootit FR-900405 ja FR-900406.il. Tuotanto, eristys, karak terisointi ja kasvainvastainen aktiivisuus", S. Kiyoto et ai., J.Antibiotics _38 (1985) 340.

y; 3) "PD-114759 ja PD-115028, uudet kasvainvastaiset anti- biootit, joiden teho on erittäin hyvä. I. Eristys ja karak- 15 terisointi", R.H. Bunge et ai., J.Antibiotics 37 (1984) • · · - 1566. "Uuden kasvainvastaisen antibiootin PD-114759 ja liit- • ·· J.·* : tyvien johdannaisten biologiset ja biokemialliset aktiivi suudet", D.W. Fry et ai., Investigational New Drugs 4^ (1986) : 3.

.'j*.20 4) "Uusi antibioottikompleksi CL-1577A, CL-1577B, jota tuot- taa Streptomyces sp. ATCC 39363", EP-hakemusjulkaisu 0 132 082, A2.

5) "Kasvainvastaiset CL-1577D- ja CL-1577E-antibioottiyhdis-teet, niiden tuotanto ja käyttö", US-patenttijulkaisu . 25 4 539 203.

100105 8 6) "CL-1724-antibioottiyhdisteet, niiden tuotanto ja käyttö", US-patenttijulkaisu 4 554 162.

7) "Uudet kasvainvastaiset antibiootit BBM-1675-A3 ja BBM-1675-A4, jotka saadaan fermentoimalla Actinomadura ver-

5 rucosospora -kantaa H964-92 (ATCC 39334) tai AB27Y (ATCC

39638)", US-patenttijulkaisu 4 675 187.

8) "Uusia N-asetyyli-esperamisiinien Alf A2 ja Alb johdannaisia, joilla on mikrobivastaista ja kasvainvastaista aktiivisuutta", EP-patenttijulkaisu 289 030.

10 Kaikki edeltävissä viitteissä nimikkeitä BBM-1675, FR-900405, FR-900406, PD-114759, PD-115028, CL-1577A, CL- 1577B, CL-1577D, CL-1577E ja CL-1724 koskeva tieto sisällytetään tähän viitteeksi. Esperamisiinien Ax, A2 ja Alb (BBM-1675-kompleksi) ja niitä vastaavien N-asetyylijohdannaisten 15 täydelliset rakenteet on julkistettu ja ne sisältyvät taulu koihin 1 ja 2. Muiden edellä mainittujen kasvainvastaisten antibioottien fysikaaliset ominaispiirteet osoittavat, että niiden kaikkien rakenne on esperamisiineihin nähden identtinen tai hyvin samankaltainen ja että ne kaikki sisältävät 20 funktionaalisen metyylitritioryhmän.

Kuten edellä julkistetuista rakenteista voidaan havaita, LL-E33288-kompleksin alfaj-, alfa2-, alfa3-, alfa4-, beta^, beta2-, gamma!-, delta- ja pseudoaglykonijäsenet, niiden dihydro- ja N-asyylivastineet sekä BBM-1675-, FR-900405-, ' ·' ’'25 FR-900406-, PD-114759-, PD-115028-, CL-1577A-, CL-1577B-, • #>#· CL-1577D-, CL-1577E- ja CL-1724-antibiootit ja niiden N- i i : asyylijohdannaiset kaikki sisältävät rakenteessaan metyylit ritioryhmän .

;·. On havaittu, että jonkin edellä mainitun antibiootin * ,·;·.30 reagoidessa ei-substituoidun tai substituoidun alkyyli- tai • · · aryylimerkaptaanin kanssa metyylipertiolaattianioni syrjäy-ϊ ** tyy trisulfidiosuudesta, jolloin muodostuu stabiili disulfi- di (kaavio I, alla). Muita yhdisteitä, joissa tämä muutos tapahtuu, on kuvattu EP-hakemusjulkaisussa 0313874A2, joka .- -.35 julkaistiin 3. toukokuuta 1989.

li

Kaavio I

9 100105

CH3-SSS-W

Q-Sp-SH

5 ν'

Q-Sp-SS-W

Tämän kaavion mukainen menetelmä on ensimmäisenä vaiheena esillä olevan keksinnön mukaisessa menetelmässä kantaja- lääkeainekon jugaat in valmistamiseksi.

10 Keksinnön mukaisen menetelmän yhden toteutusmuodon mukaisesti valmistetaan kantaja-lääkeainekonjugaatteja, joilla on kaava

Tu-(Z-Sp-SS-W)m 15 (Y)„-m j ossa

Tu on monoklonaalinen vasta-aine; Y on monoklonaalisen vasta-aineen sivuketjun aminoryhmä; n 20 on kokonaisluku 1 - 100; m on 0,1 - 15; CH, A n

:Y: Y

W on V---CH3 .1 \ CCK, 25 0H H'YYV°' ' ::: or2 t :: * jossa

O

• *·« I j. JL

:T: 30 R1 YYY

..* RjO^V^o ch, : *·· OCH3 t » t r2 on R? , .

· tau H; ,..·35 C^fs OCH3 10 100105 R4 tai H; ja 0CH3 5 * R5. on vety tai asetyyliryhmä;

Sp on -CH2-CH2-, -CH2-CH (CH3)-, -CH2-C (CH3) 2- tai -CH2-CH2-fenyleeni-; ja Z on -CONH-, 10 siten, että kaavan CH3-SSS-W mukainen yhdiste, joka on valittu joukosta LL-E33288-a2-I, LL-E33288-a3-I, 1,1,^33288^-1, LL-E33288-Y!-! : n jodipseudoaglykoni ja vastaava N-asyyliyh-diste, saatetaan reagoimaan vastaavasti substituoidun mer-15 kaptaanin kanssa, jolla on kaava

Q-Sp-SH

jossa Sp on edellä määritelty ja Q on -C02H, asetonitriilissä tai asetonitriilin ja tetrahydrofuraanin seoksessa tai ase- tonitriilin ja dimetyyliformamidin seoksessa lämpötilassa - 20 20 - noin +40 °C yhden tunnin - kuuden vuorokauden ajan, edullisesti siten, että läsnä on yksi ekvivalentti tertiää- '! ristä amiiniemästä tai seosta, jonka muodostavat yksi ekvi- « » * . ; valentti tertiääristä amiiniemästä ja yksi ekvivalentti or- ’·’·[ gaanista karboksyylihappoa, kaavan

25 Q-Sp-SS-W

··« mukaisen välituotteen muodostamiseksi, jossa kaavassa Q, Sp »I» V* ja W ovat edellä määritellyt, minkä jälkeen saatu kaavan Q-Sp-SS-W mukainen yhdiste saatetaan reagoimaan N-hydroksisukkinimidin tai 4-nitrofenolin kanssa ;*;*.30 karboksyyliryhmää aktivoivan aineen kuten karbodi-imidin ,,· läsnäollessa kaavan • ·

:tt’* Q-Sp-SS-W

mukaisen yhdisteen saamiseksi, jossa kaavassa Q on li 11 100105 ja Sp ja W ovat edellä määritellyt; ja saatu kaavan Q-Sp-SS-W mukainen yhdiste saatetaan reagoimaan molekyylin kanssa, jolla on kaava 10 Tu- (Y)n jossa Tu, Y ja n ovat edellä määritellyt, vesipitoisessa puskuriliuoksessa pH:ssa 6,5 - 9 ja lämpötilassa 4-40 °C, mainitut raja-arvot mukaanlukien, kaavan 15 Tu-(Z-Sp-SS-W)m (Y)n-n.

mukaisen yhdisteen saamiseksi, jossa kaavassa Tu, Z, Sp, W, Y, n ja m ovat edellä määritellyt.

20 Keksinnön mukaisen menetelmän toisen toteutusmuodon ,·, mukaisesti valmistetaan kantaja-lääkeainekonjugaatteja, joilla on kaava < i « * V\ Tu-(Z-Sp-SS-W)m 25 (Y)n.m t : • · · * · f · * jossa

Tu, m, W ja Sp ovat edellä määritellyt; Y on monoklonaalisen vasta-aineen hiilihydraattiryhmien ha-30 petuksesta peräisin oleva aldehydi, -CH=NNHCOCH3 tai -CHjNHNHCOCH,; • · · n on kokonaisluku 1 - 20; ja Z on -CONHN=CH- tai -CONHNHCH2-, siten, että kaavan CH3-SSS-W mukainen yhdiste joka on valittu jou-35 kosta LL-E33288-a2-I, LL-E33288-a3-I, LL-E33288-Y!-! ja LL- 12 100105 £33288-7^1:11 jodipseudoaglykoni ja vastaava N-asyyliyhdiste, saatetaan reagoimaan vastaavasti substituoidun merkaptaanin kanssa, jolla on kaava

Q-Sp-SH

5 jossa Sp on edellä määritelty ja Q on -CONHNH2, asetonitrii- lissä tai asetonitriilin ja tetrahydrofuraanin seoksessa tai asetonitriilin ja dimetyyliformamidin seoksessa lämpötilassa -20 - noin +40 °C yhden tunnin - kuuden vuorokauden ajan, edullisesti siten, että läsnä on yksi ekvivalentti tertiää-10 ristä amiiniemästä tai seosta, jonka muodostavat yksi ekvi valentti tertiääristä amiiniemästä ja yksi ekvivalentti orgaanista karboksyylihappoa, kaavan

Q-Sp-SS-W

mukaisen välituotteen muodostamiseksi, jossa kaavassa Q on 15 -CONHNH2 ja Sp ja W ovat edellä määritellyt, minkä jälkeen saatu kaavan Q-Sp-SS-W mukainen yhdiste saatetaan reagoimaan molekyylin kanssa, jolla on kaava

Tu-(Y)n jossa Tu on monoklonaalinen vasta-aine, Y on aldehydi, joka 20 on saatu hapettamalla monoklonaalisen vasta-aineen Tu hiili- hydraattiryhmät maa-alkaliperjodaatin läsnäollessa vesipi-"toisessa puskuriliuoksessa pH:ssa 4,0 - 6,5 lämpötilassa 4 -, ; 40 °C, mainitut raja-arvot mukaanlukien, ja n on kokonaislu- \ ku 1 - 20, kaavan 25

Tu- (Z-Sp-SS-W)m «· · I

V! (Y)n-m i\. mukaisen yhdisteen saamiseksi, jossa kaavassa Tu, Sp, W ja m ·"·'«. 30 ovat edellä määritellyt, n on 1 - 20, Y on -CHO ja Z on -CONHN=CH-, ja haluttaessa • » * ” käsitellään näin saatua yhdistettä asetyylihydrat- siinilla vesipitoisessa puskuriliuoksessa pH:ssa 4,0 - 6,5 ja lämpötilassa 4-40 °C, mainitut raja-arvot mukaanlukien, 35 kaavan il 13 100105

Tu-(Z-Sp-SS-W)m (Y)n-m mukaisen yhdisteen saamiseksi, jossa kaavassa Tu, Sp, W ja m ovat edellä määritellyt, n on 1 - 20, Y on -CH=NNHCOCH3 ja Z 5 on -CONHN=CH-, ja haluttaessa saatetaan näin saatu yhdiste reagoimaan natriumsyano-boorihydridin kanssa vesipitoisessa puskuriliuoksessa pH:ssa 4,0 - 6,5 ja lämpötilassa 4-40 °C, mainitut raja-arvot mukaanlukien, kaavan 10 Tu-(Z-Sp-SS-W)m (Y)n-m mukaisen yhdisteen saamiseksi, jossa kaavassa Tu, Sp, W ja m ovat edellä määritellyt, n on 1 - 20, Z on -CONHNHCH2- ja Y on -CH2NHNHCOCH3.

15 Siten antibiootin CH3-SSS-W metyylitritioyksikön syr jäyttämistä kaaviossa I esitetyn mukaisesti voidaan käyttää väliosan (Sp) liittämiseksi, jonka valitseminen edellä määritellyllä tavalla mahdollistaa sen, että ensimmäisessä vaiheessa saatuihin disulfidijohdannaisyhdisteisiin voidaan 20 liittää kohdistusykksikkö Tu. Kohdistusyksiköiden liittämis- , ·, ta muihin disulfidijohdannaisiin on kuvattu EP-hakemusjul kaisussa 0313873A1, joka julkaistiin 3. toukokuuta 1989.

< J I

! Keksinnön mukaisen menetelmän toista vaihetta havain- ‘ nollistaa seuraava kaavio II:

« I

25 Kaavio II

• M

* : » * m ♦ Q-Sp-88-W-TU _\ Tu-(Z-8p-88-W) 7 j n t\. (Y,n-« ·'·'· 30 * · 4 ^ ./ Jos esimerkiksi N-asetyyli-E-33288-gamma!1:n 3-merkap- • «· topropionihappojohdannainen (ks. kaavio II, Q = C02H, Sp = - > :

*;* CH2CH2-) muutetaan aktivoiduksi hydroksisukkinimidikseen (Q

= C02Su, Sp = —CH2—CH2-) , se voidaan saattaa reagoimaan ly-; : 35 siinijäännöksien joidenkin eeta-aminoryhmien kanssa (esim.

14 100105

Tu = monoklonaalinen vasta-aine, Y = -NH2, jolloin n = 50 -100 käytettävissä olevista lysiinijäännöksistä) pH:ssa 7,0 - 9,5 puskuroiduissa vesiliuoksissa lämpötilassa 4° - 40 °C kohdistettujen muotojen tuottamiseksi antibiooteista, jotka 5 kiinnittyvät mielivaltaisiin kohtiin proteiinirungolla (Tu = monoklonaalinen vasta-aine, Z = -NHCO-, Sp = -CH2CH2-, m = 1 - 10) . Vain osa käytettävissä olevista lysiinijäännöksistä korvataan tällä tavalla, koska korkea korvautumisaste ja vasta-aineen immunoreaktiivisuuden 10 säilyttäminen katsotaan yleensä toisensa poissulkeviksi. Sa mat mielivaltaisesti substituoidut immunokonjugaatit voidaan valmistaa 3-merkaptopropionihappojohdannaisesta myös käyttäen muita karboksyyliryhmän aktivoivia aineita kuten erilaisia karbodi-imidejä tai vastaavaa asyyliatsidia. Vaihtoeh-15 toisesti jos N-asetyyli-LL-E33288-gamma1I:n 3-merkaptopro- pionyylihydratsidijohdannainen (Q = H2NNHC0-, Sp = -CH2CH2-) saatetaan reagoimaan perjodaatilla hapetetun vasta-aineen kanssa (Tu = monoklonaalinen vasta-aine, Y = -CHO, n = 1 - 15) kuten kuvattu US-patenttijulkaisussa n:o 4,671,958 20 pH:ssa 4-7 puskuroidussa vesiliuoksessa lämpötilassa 4° - /, 40 CC, se reagoi vain aldehydifunktion kanssa (joka on saatu I I 4 ! pilkkomalla vic-dioleja vasta-aineiden Fc-osuudessa si- • t « , ( jaitsevista hiilihydraattijäännöksistä) , jolloin muodostuu

4 I I

I · I

* ·_ monoklonaalivasta-ainekonjugaatteja, jotka sisältävät lääke-

I I I I I

25 aineen substituoituna spesifisiin kohtiin proteiinirungolla *.··' (Tu = monoklonaalinen vasta-aine, Z = -CH=NNHCO-, Sp = - ·#» *.· · CH2CH2-, m = 0,5 - 10). Vasta-aineen reagoimatta jääneiden aldehydiryhmien salpaamiseksi ja ristikytkeytymisen välttä- 2\. miseksi tällä tavalla sekä hydrolyyttisesti labiilien 30 Schiff-emäskytkentöjen stabiloimiseksi viimemainittu konju- qaatti saatetaan edullisesti (vaikkakaan ei välttämättä) * « ^ ·„* ensin reagoimaan asetyylihydratsidin tai tyrosiinihydratsi- din kaltaisen yhdisteen kanssa, minkä jälkeen se pelkiste- \ . tään natriumsyaaniborohydridillä tai natriumborohydridillä 35 stabiloitujen rakenteiden saamiseksi (Tu = monoklonaalinen vasta-aine, Z = -CH2NHNHCO-, Sp = -CH2CH2-, m = 0,5 - 10) .

III

Il 15 100105

Lukuisia erilaisia monoklonaalisia vasta-aineita (MoAb) käytetään esimerkkeinä syövänvastaisten metyylitri-tioyhdisteiden kohdistamisesta. MoAb:t Lym-1 ja Lym-2 tunnistavat erilaisia antigeenejä kypsien B-imusolujen ja niis-5 tä syntyvien imukudoskasvaimien pinnalta. Näiden monoklonaa- listen vasta-aineiden tuotantoa ja ominaisuuksia kuvaavat A.L. Epstein et ai., Cancer Research (1987) 830. MoAb B72.3 kohdentuu pääasiassa rinnan ja paksusuolen syöpiin, vaikka reaktiivisuutta myös haima-, munasarja- ja keuh-10 kosyöpien suhteen on havaittu. Tätä vasta-ainetta ovat kuvanneet T.L. Klug et ai., Int. J. Cancer (1986) 661.

MoAb:tä CT-M-01, joka tunnistaa ensisijaisesti rintakasvai-mia, kuvataan EP-hakemuksessa 86 401482.4, joka on tehty 3. heinäkuuta, 1986, ja MAC-68:aa tuottaa CT-M-01:tä tuottavan 15 hybridooman alaklooni ja se tunnistaa sekä rinta- että pak susuolensyöpiä. Tämän keksinnön mukaisessa menetelmässä käytettäviä ditiovälituotteita ja niiden käyttöä näiden vasta-aineiden konjugaattien saamiseksi kuvataan jäljempänä esimerkeissä .

20 Tämän keksinnön mukaisessa menetelmässä käytettävät, kaavan Q-Sp-SS-W avulla määritellyt välituotteet ovat aktii-; visia bakteerivastaisina aineina. Niiden in vitro -baktee- * rivastainen aktiivisuus voidaan määrittää gram-positiivisia ja gram-negatiivisia bakteereita vastaan tavanomaista agar- 25 laimennusmenetelmää käyttäen. Mueller-Hinton-agar-agaria, • · · i..,! joka sisältää kulloinkin edellisestä puoleen alenevan pito- • i» : : : isuuden kyseisiä vasta-aineita, kaadetaan petrimaljoihin.

Agar-agar-pinnoille siirrostetaan 1 - 5 x 104 bakteerin pesä- ·.·. < kettä muodostavaa yksikköä käyttäen Steersin toistolaitetta.

30 Yhdisteen alhaisin pitoisuus, joka estää bakteerikannan kas- • · · vun inkuboitaessa noin 18 tunnin ajan noin 36 °C:ssa, rekis- • t : ** teröidään kyseisen kannan minimi-inhibitiopitoisuutena (MIC).

____: Edellä kuvatut disulfidiyhdisteet ovat aktiivisia ,••.35 kasvainvastaisia aineita.

16 100105

Laitos the National Cancer Institute on kehittänyt tiettyjä in vivo -testausjärjestelmiä ja -menettelyitä yhdisteiden testaamiseksi niiden soveltuvuuden syöpävastaisik-si aineiksi määrittämiseksi. Näitä on esitetty lähteessä Ge-5 ran et ai., Cancer Chemotherapy Reports, osa III, 3:2 (1972) . Näistä menettelyistä on muotoutunut vakioseulontako-keita, joita käytetään yleisesti kasvainvastaisten aineiden testaamiseksi. Näistä järjestelmistä erityisen merkityksellisiä ovat imusoluleukemia-P388, tummavärinen melanooma B16, 10 L1210-leukemia ja paksusuoli-26-rauhaskudossyöpä. Näitä syö piä käyttäen testaus suoritetaan siirrettävinä kasvaimina hiirissä. Yleensä merkittävä kasvainvastainen aktiivisuus, joka näiden menettelyiden puitteissa ilmenee käsiteltyjen eläimien keskimääräisten eloonjäänti-aikojen (T) prosentuaa-15 lisena kasvuna verrokkieläimiin (C) verrattuna, viittaa sa mankaltaisiin tuloksiin ihmisen leukemiassa ja kiinteissä kasvaimissa.

Imusoluleukemia-P388-koe

Koe-eläiminä käytettiin naaraspuolisia BDFj-hiiriä 20 kunkin koeryhmän käsittäessä 5 tai 6 hiirtä. Kasvain siir rettiin ruiskuttamalla päivänä 0 vatsaontelon sisäisesti 0,5 ml laimeaa vatsaontelonestettä, joka sisälsi 1 x 106 imuso-' luleukemia-P388-solua. Testattavia yhdisteitä annettiin vat- ·.·.· saontelon sisäisesti 0,5 ml: n tilavuus steriilissä, pyro- 25 geenivapaassa keittosuolaliuoksessa päivinä 1, 5 ja 9 (lass’: kettuna kasvaimen siirtämisestä) ilmoitettu annos. Hiiret punnittiin ja eloonjääneiden lukumäärä merkittiin muistiin säännöllisesti 30 päivän ajan. Laskettiin keskimääräinen ;·. eloonjäänti-aika sekä käsiteltyjen eläinten eloonjäänti-ajan .*.30 (T) suhde verrokkieläinten eloonjäänti-aikaan (C). T/C-arvo- • « · jen, jotka ylittävät tai ovat 125, katsotaan heijastavan : *·· merkittävää kasvainvastaista aktiivisuutta. Tulokset on esi- tetty taulukossa 3.

Taulukko 3

Imusoluleukemia-P388-koe 17 100105

Eloonjäänti

5 Annos (k.a.) T/CxlOO

Yhdiste (mg/kg) (päivää) % LL-E33288-gairana1-I:n 0,005 145 3-merkaptopropioni- 10 happodisulfidi 0,0025 125 (esimerkistä 1) LL-E33288-gamma1-I:n 0,010 135 3-merkaptopropioni- 0,005 185 15 happo-4-nitrofenyyli- esteridisulfidi 0,0025 150 (esimerkistä 2) 0,00125 130 LL-E33288-gamma1-I: n 0,005 18,0 164 20 3-merkaptopropionyyli- 0,0025 25,0 186 hydratsididisulfidi 0,00125 19,0 173 "! (esimerkistä 4) 0,0006 15,5 141 '’· Verrokki - 11,0 25 • · · --" LL-E33288-alfa3-I:n 0,040 15,0 136 : 3-merkaptopropionyyli- 0,020 123 hydratsididisulfidi (esimerkistä 6) « 30 • · ·

Verrokki - 11,0 • · • · · 18 100105

Taulukko 3 (jatkuu)

Imusoluleukemia-P388-koe

Eloonjäänti

5 Annos (k.a.) T/CxlOO

Yhdiste (mg/kg) (päivää) % N-asetyyli-LL-E33288- 0,080 21,0 175 gammani: n 3-merkapto- 0,040 18,0 150 10 propionyylihydratsididi- 0,020 15,0 125 sulfidi (esimerkistä 7)

Verrokki - 12,0 15 LL-E3328 8-alfa2-I: n 0,010 26,5 230 3-merkaptopropionyyli- 0,005 21,0 183 hydratsididisulfidi 0,0025 18,5 161 (esimerkistä 8) 0,00125 18,5 161 20 Verrokki - 11,5 ') LL-E33288-gamma1-I: n 0,005 28,5 190 3-merkaptobutyryyli- 0,0025 23,0 153 hydratsididisulf idi 0,00125 21,0 140 ' ' 25 (esimerkistä 10) 0,0006 19,5 130 • · · • · • · • · · I Verrokki - 15,0 ;\t LL-E33288-gamma1-I: n 3- 0,010 26, 5 252 30 merkaptoisovaleryy- 0,005 18,0 171 lihydratsididisulfidi 0,0025 17,0 162 : ** (esimerkistä 11) 0,00125 16, 0 152 0,0006 13,0 124 0,0003 14,0 133

Verrokki - 10,5 . . 35 il

Taulukko 3 (jatkuu)

Imusoluleukemia-P388-koe 19 100105

Eloonj äänti

5 Annos (k.a.) T/CxlOO

Yhdiste (mg/kg) (päivää) % LL-E33288-gamina1-I: n 4- 0,005 24,0 200 merkaptodihydrokinna- 0,0025 28,0 233 10 moyylihydratsididisulfidi 0,00125 25,5 213 (esimerkistä 12) 0,0006 18,5 154 0,0003 17,5 146 12,0 15 N-asetyyli-LL-E33288- 0,32 118 gamina-L-Itn 3-merkapto- 0,16 205 isovaleryylihydratsididi- 0,08 166 sulfidi 0,04 133 (esimerkistä 13) 0,02 117 20 __ N-asetyyli-LL-E33288- 0,32 142 gamma^Iin 3-merkapto- 0,16 135 butyryylihydratsididi- 0,08 115 '·''' sulfidi 0,04 102 25 (esimerkistä 14) 0,02 109 • · · s : • · · 0· N-asetyyli-LL-E33288- 0,32 75 gamma-L-Iin p-merkapto- 0,16 150 dihydrokinnamoyylihydrat- 0,08 209 30 sididisulfidi 0,04 150 ..· (esimerkistä 15) 0,02 146 « · • · · 20 100105

Tummamelanooma-Bl6-testi

Koe-eläiminä voidaan käyttää naaraspuolisia BDFl-hii-riä koeryhmän sisältäessä 5 tai 6 hiirtä. Yhden (1) gramman erä tummamelanooma-B16-kasvainta homogenoidaan 10 ml:ssa 5 kylmää tasapainoitettua suolaliuosta ja 0,5 ml: n erä homo- genaattia siirretään kunkin koehiiren vatsaonteloon. Testattavia yhdisteitä annetaan vatsaontelon sisäisesti päivinä 1 - 9 (laskettuna kasvaimen siirrostuksesta) mainittu annos. Hiiret punnitaan ja eloonjääneiden lukumäärä merkitään muis-10 tiin säännöllisesti 60 päivän ajan. Laskettiin keskimääräi nen eloonjäänti-aika sekä käsiteltyjen eläinten eloonjäänti-ajan (T) suhde verrokkieläinten eloonjäänti-aikaan (C). T/C-arvojen, jotka ylittävät tai ovat 125, katsotaan osoittavan merkittävää kasvainvastaista aktiivisuutta.

15 Tämän keksinnön mukaisilla menetelmillä kaavan

Tu-(Z-Sp-SS-W)m (Y)n-m 20 avulla määriteltyjen monoklonaalisen vasta-aineen sisältävi en konjugaattien valmistamiseksi saadaan rakenteita, joiden immunoreaktiivisuus kohdesolulinjojen suhteen on hyvä määr-itettynä seuraavilla in vitro -kokeilla: ·'·' Kohdesolut ' ' 25 Kaikkia kohdesoluja säilytettiin RPMI-1640-kasvualus- • · · tässä, jota oli täydennetty 5 %:lla vasikansikiöseerumia : : : (FCS), ITS-valmisteella (Collaborative Research, katalogin:o 40351), streptomysiinillä (50 mikrogrammaa/ml), penisil-liinillä (50 yksikköä/ml), gentamysiinisulfaatilla (50 mik-30 rogrammaa) ja glutamiinilla (0,03 %). Soluja pidettiin kos- tutetussa, 5 %:n hiilidioksidipitoisuuden käsittävässä inku-J ** baattorissa 37 °C:ssa.

Il 21 100105 I. Immunoreaktiivisuusmääritykset

Menettely I - ELISA

Sopivia kohdesoluja otettiin talteen, ne laskettiin sekä lietettiin Dulbeccon fosfaattipuskuroituun suolaliuok-5 seen (DPBS) tutkittavan monoklonaalisen vasta-aineen (MoAb) optimipitoisuuteen. 0,1 ml solulietettä annosteltiin steriilin, polystyreenisen, 96-kuoppaisen kudosviljelmälevyn kuhunkin kuoppaan. Maljojen sisältöä sentrifugoitiin 5 minuutin ajan 1000 kierr./min kierrosnopeudella, minkä jälkeen 10 supernatantti kaadettiin pois. Maljoja kuivattiin ilmassa yön yli, jolloin kuivauksen jälkeen niitä voidaan säilyttää 4 °C:ssa aina 3 kuukauden ajan.

Ei-spesifiset sitoutumiskeskukset salvattiin lisäämällä 200 mikrolitraa l-%:ista gelatiiniliuosta 15 DPBS:ssä kuoppaa kohden ja inkuboimalla maljaa tunnin ajan 37 °C:ssa kosteassa inkubaattorissa. (Kaikki jäljempänä esitetyt inkuboinnit suoritetaan samankaltaisissa olosuhteissa) . Maljat pestiin kerran 250 mikrolitralla 0,05-%:ista Tween-20-valmisteliuosta DPBS:ssä (pesuliuos) käyttäen Dyna-20 tech-valmistajan automaattista ELISA-pesujärjestelmää (Ult rawash II) . Tutkittavat näytteet laimennettiin vastaamaan loppupitoisuutta 3 mikrogrammaa/ml MoAb-ekvivalentteja 0,1 % gelatiini/DPBS : ssä. Kustakin 3 mikrogrammaa/ml sisältävästä ‘ ' näytteestä valmistettiin kuusi (6) 3x-sarjalaimennosta lisää 25 ja valittuihin kuoppiin lisättiin kulloinkin 100 mikrolitraa • · · *...· laimennosta 3x-rinnakkaismäärityksinä. Levyn alarivin kuop- • · · V : piin lisättiin vain 100 mikrolitraa 0,l-%:ista gelatiinili uosta taustan määrittämiseksi. Maljoja inkuboitiin 45 minuu-tin ajan, minkä jälkeen ne pestiin kolmeen (3) kertaan. AI-30 kaliseen fosfataasiin konjugoituja, af f initeettikromatogra- « fisesti puhdistettujavuohen hiirivastaisia immunoglobulii- • · :f ** neja (Cappel, katalogimo 8611-0231) laimennettiin 1:125 0,l-%:iseen gelatiiniliuokseen ja 100 mikrolitraa laimennosta lisättiin kuhunkin kuoppaan. Maljoja inkuboitiin 45 mi-35 nuutin ajan, minkä jälkeen ne pestiin kolmeen (3) kertaan.

22 100105

Sitten kuoppiin lisättiin 200 mikrolitraa p-nitrofenyylifos-faattisubstraattiliuosta (katso alla). Kun oli kulunut 45 minuuttia huoneen lämpötilassa, reaktio keskeytettiin lisäämällä 50 mikrolitraa 3 M natriumhydroksidiliuosta. Kunkin 5 kuoppasisällön absorbanssi luettiin 405 nm:n aallonpituudel la käyttäen valmistajan Dynatech automaattista spektrofoto-metriä (EIA Autoreader, katalogi n:o EL-310).

Substraatin dietanoliamiinipuskuri (10-%:inen) 97 ml dietanoliamiinia 10 800 ml vettä 0,2 grammaa NaN3:ea 100 mg MgCl2.6H20: ta

Reagenssit liuotettiin keskeytyksettä sekoittamalla, minkä jälkeen liuokseen lisättiin 1 N kloorivetyhappoa 15 pH:hon 9,8. Kokonaistilavuus täytettiin vettä lisäämällä 1 litraksi ja liuos suodatussteriloitiin käyttäen 0,2 myyn suodatinta. Puskuria säilytettiin pimeässä 4 °C:ssa. Juuri ennen käyttöä p-nitrofenyylifosfaattia (Sigma, katalogin:o 104 - 40) liuotettiin valmistettuun 0-%:iseen dieta- 20 noliamiinipuskuriin (huoneen lämpötilassa) loppupitoisuuteen 1 mg/ml.

^ O.D.- (optinen tiheys) arvojen laskeminen . ; Kunkin näytteen prosentuaalinen sitoutuminen lasket- ’· ·_ tiin seuraavasta yhtälöstä: 25 »««

x...: A-B

- x 100 = sitoutumis-% • · ♦

* C-B

ti 23 100105 saadaan 50 %:n sitoutuminen) saatiin kuvaajasta, minkä jälkeen säilynyt immunoreaktiivisuus laskettiin seuraavasta yhtälöstä: 5 MoAb-verrokin BDS0 _ x 100 = säil. immunoreaktiivisuus-%

Koenäytteen BD50

Menettely 2 - Epäsuora RIA

10 Sopivat määrät kohdesoluja 0,2 ml:n tilavuudessa 10- %:ista FCS-kasvualustaa annosteltiin 4 ml:n polysty-reeniputkiin. Tutkittavat näytteet laimennettiin pitoisuuteen 2 mikrogrammaa/ml MoAb-ekvivalentteja 10-%:iseen FCS-kasvualustaan. Kustakin 2 mikrogramman/ml näytteestä 15 valmistettiin viisi (5) 3x-sarjalaimennosta ja 0,2 ml kutakin laimennosta lisättiin putkiin 2x-rinnakkaismäärityk-sinä. Taustanäytteisiin lisättiin vain solut ja kasvualusta. Soluja inkuboitiin 4 °C:ssa 1 tunnin ajan, minkä jälkeen ne pestiin kahteen kertaan 2-%:isella FCS-kasvualustalla (kaik-20 ki RIA-pesut suoritettiin käyttäen 3 ml: n tilavuutta). Ku- .·. hunkin putkeen lisättiin 0,05 ml lampaan F(ab')2-anti-hiiri-

IgG-[125I] : tä (Dupont, katalogi n: o NEX 162-0142) , joka sisäl- • · si pitoisuuden noin 500 000 tuiketta/min; soluja inkuboitiin * ", vielä tunnin ajan 4 °C:ssa, minkä jälkeen ne pestiin kerran 25 2-%:isella FCS:llä ja kahdesti PBSzllä. Kuhunkin putkeen • · *···* lisättiin 0,5 ml PBS:ää, solut sekoitettiin vortekssekoitta-

• M

V * jassa ja siirrettiin puhtaisiin putkiin, minkä jälkeen niitä laskettiin 1 minuutin ajan laitteessa Packard Gamma 500. i Kutakin arvoa vastaava sitoutumis-% laskettiin ja 30 sitä vastaava kuvaaja piirrettiin kuten edeltävän ELISA-mää- rityksen yhteydessä lukuunottamatta, että O. D.-yksiköt kor-vattiin tuiketta/min -yksiköillä ja että C oli 1 mikrogramman/ml ei-manipuloitua MoAb-verrokkia keskimääräinen tuiketta/min -arvo. Säilyneen immunoreaktiivisuuden prosentuaali-35 nen osuus laskettiin kustakin näytteestä kuten edellä esi tetty.

24 100105

Menettely 3 - Suora RIA

Sopivat määrät kohdesoluja 1 ml:ssa 10-%:ista FCS-kasvualustaa annosteltiin 4 ml: n polystyreenikoeputkiin, putkien sisältö sentrifugoitiin ja supernatantti heitettiin 5 pois. Tutkittavat näytteet laimennettiin 200 mikrogramman/ml

MoAb-ekvivalenttipitoisuuteen 10-%:iseen FCSkasvualustaan. Kustakin 200 mikrogramman/ml näytteestä valmistettiin vielä viisi (5) 5x-sarjalaimennosta ja 0,05 ml kutakin laimennosta lisättiin putkiin 2x-rinnakkaismäärityksinä. 0,05 ml 10 125I-MoAb:tä lisättiin kuhunkin koeputkeen (optimimäärä määri tetään erikseen kullekin MoAb:lle ja erälle). Positiiviset verrokkinäytteet sisälsivät soluja, kasvualustaa ja 125I-MoAb:tä. Taustaverrokkinäytteet sisälsivät ei-spesifisiä soluja, kasvualustaa ja 125I-MoAb: tä. Soluja inkuboitiin 1 15 tunnin ajan 4 °C:ssa, ne pestiin kerran 2-%:isella FCS-kasvu- alustalla, kahteen kertaan PBS:llä, sekä siirrettiin edelleen ja laskettiin kuten edellä esitetty.

125I-MoAb-sitoutumisen prosentuaalinen inhibitio laskettiin kullekin näytteelle seuraavasta yhtälöstä: 20

A-B

- x 100 = 125-I-MoAb-sitoutumisen inhibitio-%

C-B

i i » I · '·' 25 jossa A on näytteen keskimääräinen tuiketta/min -arvo; B on ' taustan keskimääräinen tuiketta/min -arvo ja C on positiivi-

«M

sen verrokin keskimääräinen tuikett/min -arvo.

« · · '·/ : Kuvaaja ja säilyneen immunoreaktiivisuuden prosent tiluku kullekin näytteelle laskettiin kuten edellä on esi-•'•..30 tetty lukuunottamatta, että BD50 on tässä BID50 (MoAb-annos, }‘j*; joka tarvitaan 125I-MoAb:n sitoumisen 50-%:iseen estymiseen).

%.· Huomautuksia: * ** 1) Putkien sisältöä sekoitettiin tehokkaasti vorteks- • · · ' sekoittajalla välittömästi seuraten kunkin reagenssin li- 35 säystä RIA-näytteisiin.

Il 25 100105 2) Kuhunkin koesarjaan sisällytettiin sisäinen verrokkinäyte, joka vastasi 50 % ei-manipuloidusta MoAb-ver-rokista, jotta varmistettiin kunkin menettelyn kvantitatiivisuus konjugaatin immunoreaktiivisuuden säilymistä 5 ennustettaessa.

Näiden määrityksien tulokset on esitetty alla taulukossa 4.

t t 1 t « · ··1 j : « «« • · · • # · ·· • ·

* M

«<« • · · • « · · m · • · «

Taulukko 4

MoAb-konjugaattien immunoreaktiivisuus 26 100105

Ei-spesifiset konjugaatit Immunoreaktiivisuus-% ei- LL-E33288-alfa3X:n 3-mer- modifioidusta MoAb-verro- 5 kaptopropionihappodisulfi- kista laskettuna: dihydratsidituotteesta (esimerkki 6) konjugoituna seuraaviin:

Lym-1 78 10 CT-M-01 81 N-asestyyli-LL-E332 8 8-gamma!1: n 3- merkaptopro-pionihappodisulfidihydrat-15 sidi (esimerkki 7) konjugoituna seuraaviin:

Lym-1 82 CT-M-01 100 B72.3 100 : 20 V. LL-E33288-alf a,1: n 3-mer- (li i kaptopropionihappodisulfi-*··, dihydratsidi (esimerkki 8) S « V,’. konjugoituna seuraavaan: f · · 25 CT-M-01 56 ·« • · » · · : Jodi-LL-E33288-pseudogly- j·’ koni-3-merkaptopro- *,,, pionihappodisulf idihydrat- 30 sidi (esimerkki 9) konjugoituna seuraavaan: CT-M-01 50 il

Taulukko 4 (jatkuu)

MoAb-konjugaattien immunoreaktiivisuus 27 100105 LL-E33288-gairuna1I: n 3-mer- Immunoreaktiivisuus, % ei-5 kaptobutyryylidisulfidi- modifioidusta MoAb-verro- hydratsidi (esimerkki 10) kista laskettuna: konjugoituna seuraavaan:

Lym-1 73 10 LL-E33288-gamma1I: n 3-mer- kaptoisovaleriaanahappodi-sulfidihydratsidi (esimerkki 11) konjugoituna seuraavaan: 15 Lym-1 64 LL-E33288-gamma1I:n p-mer- kaptodihydrokanelihappodi- .·. sulf idihydratsidi (esi- ,·, 20 merkki 12) • · « '/' konjugoituna seuraavaan:

« 1 I

·;· Lym-1 61 • 1 1 * : Ψ m 4 ·« • ♦ · • · « 25 Tämän keksinnön mukaisesti valmistetut monoklonaali- „ sen vasta-aineen sisältävät konjugaatit ovat aktiivisia syö- pävastaisina aineina. Alla in vitro -sytotoksisuuden määrit-

Xl· ’ tämiseksi kuvattu koe osoittaa dramaattisesti, että kyseiset rakenteet kohdistuvat kohdesolulinjoihin enemmän kuin ei-·"1 30 kohdesoluihin, ja antaa mitan kyseisten yhdisteiden kohdis tettujen muotojen hyödyllisyydelle verrattuna niiden ei-koh-distettuihin vastineisiin.

28 100105

Sytotoksisuusmääritykset

In vitro:

Testattavat näytteet laimennettiin pitoisuuteen 0,2 tai 0,02 mikrogrammaa/ml peruslääke-ekvivalentteja (lähtöpi-5 toisuus on riippuvainen tutkittavasta solulinjasta ja perus lääkkeen tehosta). Kustakin alkuperäisestä näyte-laimennoksesta valmistettiin 3 tai 4 ylimääräistä 5x-laimen-nosta ja 0,2 ml kutakin laimennosta mitattiin 15 ml:n polys-tyreeniputkiin. Ainakin yksi samankaltainen peruslääkkeestä 10 ja merkitystä vailla olevasta MoAb:stä koostuva konjugaatti sisällytettiin kuhunkin määritykseen merkitsevän konjugaatin spesifisyyden mittaamiseksi. Putkiin lisättiin 105 sopivaa kohdesolua lietettyinä 0,2 ml:aan 10-%:ista FCS-kasvualustaa ja sekoitettiin vortekssekoittajalla. Lisäksi suoritettiin 15 sama koe käyttäen merkityksettömiä soluja kohteina merkitys tä omaavan konjugaatin spesifisyyden edelleen varmistamiseksi. MoAb-verrokkeihin lisättiin vain ekvivalenttiset määrät MoAb:tä ja positiivisiin verrokkeihin lisättiin vain ΙΟΙ :ista FCS-kasvualustaa.

20 Soluja inkuboitiin 37 °C:ssa 7 minuutin ajan, minkä /. jälkeen ne pestiin 4 kertaan 8 ml:lla 2-%:ista FCS-kasvu- i * < alustaa. Kuhunkin putkeen lisättiin 0,1 ml 10-%:ista FCS- , , kasvualustaa, soluja sekoitettiin vortekssekoittajalla ja t \ * *' ·' 0,2 ml:n erät mitattiin steriilin, polystyreenisen, 96-kuop- f i 25 paisen kudosviljelmälevyn kuhunkin kuoppaan.

*·· *··.· Levyjä inkuboitiin 2 päivää inkubaattorissa 37 °C:ssa, • »4 V * jossa ilma oli kostutettua ja sisälsi 5 % hiilidioksidia.

Puolet kasvualustasta poistettiin ja korvattiin tuoreella kasvualustalla, joka sisälsi 2 mikrocurie-yksikköä/ml 3H-ty- **•»30 midiiniä (DuPont, NEN, katalogin:o NET-027). Inkubointia 4 jatkettiin 24 tuntia, minkä jälkeen solut jäädytettiin, su- • · str** latettiin ja otettiiin talteen käyttäen PHD-solukerää jää (Cambridge Technology, Inc.). Kutakin näytettä laskettiin 1 minuutin ajan Beckman LS 5800 -tuikelaskijassa käyttäen ka-35 navaa 1.

n 29 100105

Kasvun prosentuaalinen inhibitio laskettiin seuraavasti : Näytteen tuiketta/min -arvo (k.a.)_ x 100 = kasvu-% 5 Alustaverrokin tuiketta/min -arvo (k.a.) 100 - kasvu-% = inhibitio-%

Inhibitio-% merkittiin puolilogaritmipaperin ei-loga-10 ritmiselle akselille ja isäntälääkkeen pitoisuus log-akse- lille. Kuvaajasta saatiin kunkin näytteen IC50-arvo (peruslääkkeen pitoisuus, jolla saadaan 50 %:n inhibitio) ja syto-toksisuuden säilyminen laskettiin kvantitatiivisesti seuraa-vasta yhtälöstä: 15

Isäntälääkkeen ICsn x 100 = säilynyt sytotoksisuus -% Näytteen IC50 20 In vitro -sytotoksisuusmäärityksestä saadut tulokset . on esitetty seuraavassa taulukossa 5.

• · • · · • · · « 1 t • · · • · • · • · · »Il • I · « • · • · • · · · · • ·

Taulukko 5

MoAb-konjugaattien in vitro -sytotoksisuus 30 100105

MoAb Sytotoksisuus 5 Hydratsidikonjugaatti, joka valmistettiin esimerkin 6 tuotteesta

käyttäen seuraavia: % LL-E33288-alfa3I

Lym-1 500 10 CT-M-01 300

Hydratsidikonj ugaatti, joka valmistettiin esimerkin 7 tuotteesta % N-asetyyli-

15 käyttäen seuraavia: LL-E33288-delta1I

Lym-1 400 CT-M-01 700

Hydratsidikonj ugaatti, 20 joka valmistettiin . : : esimerkin 8 tuotteesta % esimerkin 8 : käyttäen seuraavaa: tuote CT-M-01 -18 .···, 25 Hydratsidikonjugaatti, joka valmistettiin • « « esimerkin 9 tuotteesta % esimerkin 9 käyttäen seuraavaa: tuote • " CT-M-01 100 30 _____

Hydratsidikonjugaatti, .***· joka valmistettiin esimerkin 10 tuotteesta % esimerkin 10 35 käyttäen seuraavaa: tuote '···' Lym-1 400

Taulukko 5 (jatkuu)

MoAb-konjugaattien in vitro -sytotoksisuus 31 100105

MoAb Sytotoksisuus 5 Hydratsidikonjugaatti, joka valmistettiin esimerkin 11 tuotteesta % esimerkin 11 käyttäen seuraavaa: tuote

Lym-1 320 10 _

Hydratsidikonjugaatti, joka valmistettiin esimerkin 12 tuotteesta % esimerkin 12 käyttäen seuraavaa: tuote 15 Lym-1 560 Tämän keksinnön mukaisesti valmistettujen konjugaat-tien in vivo -aktiivisuuden mittaamiseksi käytettiin seuraa-20 vaa määritysjärjestelmää.

•, , Lääkeaineen ja monoklonaalisen vasta-aineen muo- : j : dostamien konjugaattien kasvainvastaisen aktiivisuuden in :Y: vivo -kokeet suoritettiin käyttäen ihmisen kasvainsiirteitä

I I

hiirissä, joilta oli kateenkorva poistettu (paljas hiiri).

, ^25 Burkitt-imusolmukesyöpä- (Raji-) ja myelooma- (HS-

Suitan-) solut kerättiin viljelypulloista ja niitä (>/= 80 x • · · 106 Raji-solua tai 40 x 106 HS-Sultan-solua) ruiskutettiin .. ihonalaisesti koehiiriin. Kiinteitä kasvaimia, munasarjasyö- • · *..** pä- (CA73-, Ovcar-3-) , rintasyöpä- (MX-1-) ja paksusuolen- • · · V ‘30 syöpä- (LS174T-) kasvaimia kasvatettiin hiirissä, joilta oli kateenkorva poistettu, kasvaimet poistettiin, leikeltiin 2 mm3:n palasiksi ja istutettiin ihonalaisesti koehiiriin (5 -8 fragmenttia hiirtä kohden).

Lääkeaineita, monoklonaalisia vasta-aineita ja lää-35 keaineen ja monoklonaalisen vasta-aineen muodostamia konju- 32 100105 gaatteja annettiin vatsaontelon sisäisesti joka 3. päivä kaikkiaan 3 tai 5 ruisketta alkaen päivänä 2, 3, 4, 6, 7 tai 8 kasvaimen istutuksen jälkeen. Kasvaimet mitattiin (kasvaimen pituus ja leveys) käyttäen Fowler ultra CAL II -elekt-5 ronista mikrometriä joka 7. päivä 4-6 viikon ajan kasvai men istutuksen jälkeen. Kasvaimen massa mg:oina arvioitiin kaavasta:

Pituus (mm) x Leveys (mm) 10 2

Kasvaimen kasvun inhibitio laskettiin kullekin koeryhmälle prosentteina verrokista seuraavasti: [käsiteltyjen eläinten keskimääräinen tulos mgroina (T)/verrokkien 15 keskimääräinen tulos mg:oina (C)] x 100. Aktiivisuuden osoittamiseksi edellytetään T/C-arvoa <. 42 % ryhmille, joiden koe-eläimistä > 65 % on jäänyt eloon.

Tämän määrityksen tulokset on esitetty taulukossa 6.

i · · I t • · • · · • ·· • · · • · · • · • · • ♦ · • t« • · · • « * « • « • ♦ * « «·· • ·

II

33 100105

Taulukko 6

In vivo -kasvainvastaisen määrityksen tulokset

Annos (pg) Kasvaimen koko S/T 5 MoAb Lääke (T/C) % verrokista LL-E33288-alfa3I: n 28 0,75 1,3 6/6 3-merkaptopropioni-happodisulfidi-hydratsidi konju-10 goituna Lym-l:een LL-E33288-alfa3I - 0,75 365 6/6 (yksinään) 15 Hydratsidi - 0,75 330 6/6 (yksinään)__

MoAb-Lym 28 - 68 6/6 (yksinään) 20 i.p.-käsittely ihmisen Burkitt-imusolmukesyöpäsolulinjaa I *

Raji-TC vastaan; annettiin kolme ruisketta alkaen päivästä 7 kasvaimen siirtämisen jälkeen; esitetyt mittaustulokset ovat V.·' päivältä 28 kasvaimen siirtämisen jälkeen.

25 " • · · LL-E3328 8-alfa3I: n 83 2,0 0,22 6/6 3-merkaptopropioni- ;·. happodisulf idi- * ♦ · *... hydratsidi konjugoi- *. 30 tuna CT-M-01:een • · • · • · · • _ • · · t ? 34 100105

Taulukko 6 (jatkuu)

In vivo -kasvainvastaisen määrityksen tulokset

Annos (pg) Kasvaimen koko S/T 5 MoAb Lääke (T/C) % verrokista LL-E33288-alfa3I - 2,0 - 0/6 (yksinään)

MoAb CT-M-01 83 - 75 5/6 (yksinään) 10 Vinkristiini - 20 1,2 5/5 (positiivinen verrokki) i.p.-käsittely ihmisen rintasyöpäsolulinjaa MX-1 vastaan; 15 annettiin kolme ruisketta alkaen päivästä 2 kasvaimen siir tämisen jälkeen; esitetyt mittaustulokset ovat päivältä 35 kasvaimen siirtämisen jälkeen.

LL-E33288-gamma1I: n 50 0,22 23 7/7 20 N-[[(4-metyylikuma- . rin-7-yyli)amino]- : asetyyli] kysteiini- disulf idihydratsidi i konjugoituna Lym-l:een ... 25 • » _ — ... . — — V1. Hydratsidi - 0,22 228 4/7 • · · • · · * (yksinään) 9 9 11 --- ' — l 1’ MoAb Lym-1 50 - 61 7/7 • « · 30 (yksinään) « • 9 • · « · 9 m i ... i — .···. Seos: 50 0, 22 56 7/7 hydratsidi +

MoAb Lym-1 • 35 ___ 35 100105 i.p.-käsittely ihmisen Burkitt-imusolmukesyöpäsolulinjaa Raji-TC vastaan; annettiin kolme ruisketta alkaen päivästä 7 kasvaimen siirtämisen jälkeen; esitetyt mittaustulokset ovat päivältä 35 kasvaimen siirtämisen jälkeen.

5 _

Taulukko 6 (jatkuu)

Annos (pg) Kasvaimen koko S/T MoAb Lääke (T/C) % verrokista 10 _ N-asetyyli-LL- 125 1,0 0 6/6 E33288-gamma1I: n 3-merkaptopropioni-happodisulfidi-15 hydratsidi konjugoi- tuna CT-M-01:een

Hydratsidi - 2,0 71 3/6 (yksinään) 20 _

Seos: 125 1,0 5 1/6 : : : N-asetyyli-

:V: LL-E33288-gamma1I

+ MoAb CT-M-01 25 t # 1 " N-asetyyli-LL- - 1, 0 46 2/6 E3 32 8 8-gamma!1 4 4 • ]1 i.v.-käsittely ihmisen rintasyöpäsolulinjaa MX-1 vastaan; • « · *·' ’ 30 annettiin kolme ruisketta alkaen päivästä 2 kasvaimen ·*·.. siirtämisen jälkeen; esitetyt mittaustulokset ovat päivältä ,***♦ 42 kasvaimen siirtämisen jälkeen.

35 36 100105

Taulukko 6 (jatkuu)

Annos (pq) Kasvaimen koko S/T MoAb Lääke (T/C) % verrokista 5 _ N-asetyyli-LL- 37 1,0 11 6/6 E33288-gamma1I: n 3-merkaptopropioni-happodisulfidi-10 hydratsidi konjugoi- tuna Lym-l:een

Hydratsidi - 1,0 517 6/6 (yksinään) 15 _ N-asetyyli-LL- - 0,5 226 6/6 E33288-delta1I (yksinään) 20 MoAb Lym-1 37 - 178 6/6 (yksinään) • · · i. v.-käsittely ihmisen Burkitt-imusolmukesyöpäsolulinjaa Raji-TC vastaan; annettiin kolme ruisketta alkaen päivästä 7 25 kasvaimen siirtämisen jälkeen; esitetyt mittaustulokset ovat päivältä 35 kasvaimen siirtämisen jälkeen.

• · « « · e · • · · •

• M

• I I

» < t • • · • · • · · 1 tl · · i : 37 100105

Taulukko 6 (jatkuu)

Annos (uq) Kasvaimen koko S/T MoAb Lääke (T/C) % verrokista 5 _ N-asetyyli-LL- 127 2,7 61 6/6 E3 32 8 8-gamma!1: n 3-merkaptopropioni-happodisulfidi-10 hydratsidi konjugoi- tuna B72.3:een N-asetyyli-LL- - 2,0 32 1/6 E33288-gamma1I 15 (yksinään)

MoAb B72.3 127 - 125 6/6 (yksinään) 20 Vinkristiini - 20 23 6/6 ·// (positiivinen : : : verrokki)

·. i.v.-käsittely ihmisen paksusuolensyöpäsolulinjaa LS174T

^25 vastaan; annettiin kolme ruisketta alkaen päivästä 8 kasvai- *:». men siirtämisen jälkeen; esitetyt mittaustulokset ovat päi- • « · vältä 21 kasvaimen siirtämisen jälkeen.

# · — _^___ t • « • < 1 » · • « • «« * • · · ♦ 1 38 100105

Taulukko 6 (jatkuu)

Annos (pg) Kasvaimen koko S/T MoAb Lääke (T/C) % verrokista 5 __ N-asetyyli-LL- 112 2,7 40 5/6 E33288-gamma1I: n 3-merkaptopropioni-happodisulfidi-10 hydratsidi konjugoi- tuna CT-M-01:een N-asetyyli-LL- 2,0 32 1/6 E33288-delta1I 15 (yksinään)

Vinkristiini - 20 23 6/6 (positiivinen verrokki) 20 _ i. v.-käsittely ihmisen paksusuolensyöpäsolulinjaa LS174T vastaan; annettiin kolme ruisketta alkaen päivästä 8 kasvai-ί’: : men siirtämisen jälkeen; esitetyt mittaustulokset ovat päi- ·; vältä 21 kasvaimen siirtämisen jälkeen.

i .25 _ «·* • «« • · · • ♦ · • · i *..

r • c « • < « • « 9 ·· • 4 • ·· ··« f ? il

Taulukko 6 (jatkuu) 39 100105

Annos (pg) Kasvaimen koko S/T MoAb Lääke (T/C) % verrokista 5 _____ LL-E33288-alfa2I:n 24 1,0 0, 33 2/6 3-merkaptopropioni-happodisulfidi-hydratsidi konjugoi-10 tuna CT-M-01:een

Hydratsidi - 1,0 - 0/6 (yksinään) 15 i.v.-käsittely ihmisen rintasyöpäsolulinjaa MX-1 vastaan; annettiin kolme ruisketta alkaen päivästä 2 kasvaimen siirtämisen jälkeen; esitetyt mittaustulokset ovat päivältä 35 kasvaimen siirtämisen jälkeen.

20 Keksintöä kuvataan edelleen seuraavien ei-rajaavien i esimerkkien avulla.

i • ! ! Esimerkki 1 i i ---- *Vf LL-E33288-gamma1I:n 3-merkaptopropionihappodisulfidi 1' Liuokseen, jossa oli 90 mg LL-E33288-gamma1I: tä 90 % 25 ml:ssa asetonitriiliä, lisättiin 10,6 mg 3-merkaptopro-

• M

pionihappoa 1 mlrssa asetonitriiliä. Liuos vortekssekoitet-

• · I

tiin ja siirrettiin sitten -20 °C:seen 6 päiväksi. Liuotin .. poistettiin tyhjössä kuiviin haihduttamalla ja jäännöksellä 4 suoritettiin kromatografia-ajo käyttäen 10 ml silikageeliä « 9 ' · ‘ 30 metyleenikloridissa. Kolonnia eluoitiin 50 ml:lla mety- f·.. leenikloridia, 50 ml:11a 4 % metanoli/mety- leenikloridilla ·*'*· ja lopuksi 100 ml :11a 8 % metanoli/metyleenikloridilla.

Haihduttamalla tämä viimemainittu fraktio kuiviin saatiin jäännös, joka lietettiin etyyliasetaattiin käyttäen apuna 35 pientä määrää asetonia, minkä jälkeen saatu liete lisättiin 40 100105 tipoittain ylimäärään heksaania. Sakka talteen ottamalla ja kuivaamalla saatiin 39 mg haluttua tuotetta (FABMS, M+H 1394).

Esimerkki 2 5 LL-E33288-gamma1I:n p-nitrofenyyli-3-merkaptopro- pionaattidisulfidi (A) 3-Merkaptopropionihapon p-nitrofenyyliesterin valmistus

Kaupallista 3-merkaptopropionihappoliuosta metylee-10 nikloridissa, joka sisälsi katalyyttisen määrän konsentroi tua rikkihappoa, käsiteltiin isobutyleenillä 20 minuutin ajan. Sitten liuosta uutettiin 1 N natriumbikarbonaattili-uoksella, minkä jälkeen metyleenikloridifaasi erotettiin ja kuivattiin käyttäen kidevedetöntä magnesiumsulfaattia. Sit-15 ten liuos haihdutettiin kuiviin, jolloin saatiin väritön herkkäliikkeinen neste, joka nmr- ja massaspektritietojen mukaan oli haluttu S-t-butyylimerkaptopropionihappo, t-bu-tyyliesteri.

Seosta, jossa oli tietty määrä tätä esteriä ja 6 N 20 kloorivetyhappoa dioksaanissa, keitettiin palautusjääh- dyttäen 2,5 tunnin ajan. Liuotin poistettiin kuiviin haih-. ,·, duttamalla, jäännökseen lisättiin etyyliasetaattia ja saatua ί liuosta uutettiin natriumkarbonaattiliuoksella. Vesifaasi (natriumkarbonaattiliuos) erotettiin ja siihen lisättiin 6 N 25 kloorivetyhappoa kunnes lietteen pH oli 2,0. Sitten lietettä • · *···* uutettiin etyyliasetaatilla, saatu uute kuivattiin kideve- • · · ·* u • · · *·* * dettömällä magnesiumsulfaatilla ja liuotin poistettiin haih duttamalla kuiviin, jolloin saatiin väritön neste, joka 1H- • · ; *· nmr- ja massaspektritietojen mukaan oli S-t-butyylimerkapto-

• t I

:: : 30 propionihappo.

.·[ Tämä yhdiste muutettiin p-nitrofenyyliesteriksi kä- • · · *... sittelemällä sitä ekvimolaarisilla määrillä p-nitrofenolia ja disykloheksyylikarbodi-imidiä tetrahydrofuraanissa 4 tunnin ajan. Muodostunut disykloheksyyliureasivutuote suodatet-35 tiin eroon ja suodos haihdutettiin öljyksi, jota puhdistet-

II

41 100105 tiin käyttämällä se neutraalissa silikageelissä käyttäen liuotinjärjestelmää heksaani/metyleenikloridi (50:50). Puhdas p-nitrofenyyliesterijohdannainen oli heikosti kellertävä, herkkäliikkeinen öljy.

5 Vapaa merkaptaani saatiin seuraavasti. S-t-butyyli- merkaptopropionihappo-p-nitrofenyyliesteri liuotettiin tri-fluorietikkahappoon ja liuokseen lisättiin lievä mooliyli-määrä (10 %:n ylimäärä) elohopea(2)asetaattia. Seosta sekoitettiin 30 minuutin ajan, minkä jälkeen trifluorietikkahappo 10 poistettiin haihduttamalla ja jäännös lietettiin dimetyyli- formamidiin. Saatua liuosta käsiteltiin rikkivetykaasulla 15 minuutin ajan, minkä jälkeen musta elohopea(2)sulfidi suodatettiin eroon ja suodos haihdutettiin alipaineessa aina 99 %:n dimetyyliformamidia poistamiseksi. Saatua ruskehtavaa 15 herkkäliikkeistä nestettä puhdistettiin neutraalissa silika geelissä käyttäen eluenttina heksaani/metyleenikloridia (50:50). Pääasiallisen komponentin osoitettiin ^-nmrtllä sisältävän pienen määrän t-butyylimerkaptojohdannaista. Suorittamalla analyyttinen HPLC-ajo, jossa käytettiin kahta 20 Perkin-Elmer Pecosphere C18-kolonnia peräkkäin [4,6 x 33 mm .·. ja 4,6 x 83 mm] ja gradientti järjestelmää 37,5:62,5 47,5:52,5 asetonitriiliä 0,1 M ammoniumasetaattipuskurissa, ! pH 6,5 (etikkahappo), ja 12 minuutin ajoaikaa, tuotteen osoitettiin koostuvan 88 %:sta 3-merkaptopropionihapon p-25 nitrofenyyliesteriä ja 10 %:sta vähemmän polaarista S-t-bu- • · *··♦* tyylimerkaptopropionihappo-p-nitrofenyyliesteriä. Läsnä oli • · · • · ♦ *.* * myös pieni määrä p-nitrof enolia .

(B) LL-E332288-gamma1I:n ja 3-merkaptopropionihappo-p- • · • '· nitrofenyyliesterin reaktio :^: :30 100 mg:n erä LL-E33288-gamma1I: ää liuotettiin 50 ml:aan asetonitriiliä. Saatuun liuokseen lisättiin liuos, • · · jossa oli 25,7 mg 3-merkaptopropionihapon p-nitrofenyylies-teriä 1 ml:ssa asetonitriiliä. Reaktioseos jätettiin -20 °C:seen 48 tunniksi, jonka ajan kuluttua reaktio oli HPLC:n 35 mukaan mennyt loppuun. Liuos haihdutettiin kuiviin ja jään- 42 100105 nös lietettiin 4-5 ml:aan etyyliasetaattia sonikoimalla liukenemisen edistämiseksi. Seos suodatettiin ja suodos tiputettiin 45 ml:aan sekoitettua heksaania. Saatu lievästi kellertävä kiinteä aine otettiin talteen ja kuivattiin ali-5 paineessa, jolloin saatiin 93 mg LL-E33288-gamma1I:n propio- nihappojohdannaisen p-nitrofenyyliesteriä, mistä varmistuttiin ^-nmrtllä. FABMS:n mukaan [M+H]-ioni esiintyi arvolla m/z 1515.

Retentioaika C18-käänteisfaasi-HPLC-kolonnissa eluoi-10 taessa seoksella 50 % asetonitriili/0,1 M ammoniumasetaatin vesiliuos 18 minuutin ajan oli LL-E33288-delta1I:lie 8,0 min ja esterihydrolyysituotteelle 1,5 min.

Esimerkki 3 LL-E33288-gamma1I:n N-hydroksisukkinimidyyli-3-merkap-15 topropionaatti-disulfidi

Liuokseen, jossa oli 5 mg EPO-hakemusjulkaisun mukaista LL-E33288-gamma1I:n 3-merkaptopropionihappo-disulfi-dianalogia 0,5 ml:ssa tetrahydrofuraania, lisättiin 0,45 mg N-hydroksisukkinimidiä 0,1 ml:ssa tetrahydrofuraania ja sit-20 ten 1,8 mg disykloheksyylikarbodi-imidiä 0,2 ml:ssa tetra- hydrofuraania. Reaktion annettiin edetä huoneen lämpötilassa , .·. 4 tunnin ajan, minkä jälkeen se keskeytettiin lisäämällä • runsas ylimäärä heksaaniseosta. Muodostunut kiinteä aine suodatettiin eroon ja liuotettiin etyyliasetaattiin. Saatu 25 liuos pestiin kolmeen kertaan suolaliuoksella, kuivattiin ;··’ magnesiumsulfaatilla sekä haihdutettiin kuiviin, jolloin • · · *·' * saatiin 5 mg haluttua yhdistettä ruskeana jauheena, jota käytettiin edelleen puhdistamattomana. Retentioaika kään- • · • ’· teisf aasi-C18-HPLC-kolonnissa oli 15 minuuttia eluoitaessa • « t :::30 seoksella 40 % asetonitriili/0,1 M ammoniumasetaatin vesili- uos (lähtöaineen retentioaika oli 6,0 minuuttia).

• 9 9 • » ·

II

43 100105

Esimerkki 4 LL-E33288-gamma1I:n 3-merkaptopropionyylihydratsidi- disulfidi

Liuokseen, jossa oli 5,4 ml (3 ekv.) vedetöntä 5 hydratsiinia 100 ml:ssa tetrahydrofuraania ja jota kei tettiin palautusjäähdyttäen argon-suojakaasussa, lisättiin 2 tunnin aikana tipoittain liuos, jossa oli 9,2 ml (83 mmol) metyyli-3-merkaptopropionaattia 50 ml:ssa tetrahydrofuraania. Liuosta keitettiin palautusjäähdyttäen vielä kahden 10 tunnin ajan, minkä jälkeen se haihdutettiin kuiviin ja jään nöstä käsiteltiin kahdesti 300 ml:11a tolueenia kummallakin kerralla ensin laimentaen ja sitten kuiviin haihduttaen. Saatu tuote panostettiin silikageelitulpalle 5 % etyy- liasetaatti/kloroformia käyttäen, minkä jälkeen se eluoitiin 15 tulpasta 20 % metanoli/kloroformilla. Saatu 3-merkaptopro- pionyylihydratsidi oli lievästi vaalean punertava öljy, joka kiinteytyi jäähtyessään mutta suli huoneen lämpötilassa.

Seokseen, jossa oli 50 mg LL-E33288-gamma1I:tä 50 ml:ssa asetonitriiliä, lisättiin -15°C:ssa 6,6 mg 3-mer-20 kaptopropionyylihydratsidia 1 ml:ssa tetrahydrofuraania.

Seokseen lisättiin yksi ekvivalentti trietyyliamiinia tai yksi ekvivalentti trietyyliamiinia ja yksi ekvivalentti etikkahappoa. Reaktion annettiin edetä 0 °C:ssa tunnin ajan, ' minkä jälkeen liuotin poistettiin kuiviin haihduttamalla.

^25 Jäännöksellä suoritettiin kromatografia-ajo silikageelissä I ♦ ···* käyttäen eluoinnissa gradienttia 10 - 15 % metanoli/kloro- • · · ' formi, jolloin saatiin 26 mg haluttua yhdistettä. FABMS, m/z=1408 (M+H) ; retentioaika käänteisfaasi-C18-HPLC-kolonnis- • * * sa: 5,0 minuuttia eluoitaessa seoksella 41 % asetonitrii- :30 li/0,1 M ammoniumasetaatin vesiliuos.

• · • · • · # 44 100105

Esimerkki 5 LL-E33288-gamma1I:n N- [ [ (4-metyylikumarin-7-yyli) a-mino]asetyyli]kysteiinihydratsididisulfidi Seosta, jossa oli 1,0 g (5,7 mmol) 4-metyyli-7-5 aminokumariinia, 3,0 ml etyylibromiasetaattia (5 ekv.), 90 mg (0,1 ekv.) natriumjodidia ja 30 ml dimetyyliform-amidia, kuumennettiin argon-suojakaasussa 80°C:ssa 5 tunnin ajan. Seos jäähdytettiin, sitä laimennettiin lisäämällä etyylieetteriä, se pestiin kolmeen kertaan 50-%:sella suo-10 laliuoksella, kuivattiin magnesiumsulfaatilla ja haihdutet tiin kuiviin. Saatu raakatuote liuotettiin kloroformiin, joka sisälsi 1 %:n etyyliasetaattia, ja liuos suodatettiin silikageelitulpan läpi. Uudelleenkiteyttämällä dietyylieet-teristä, joka sisälsi jäämäpitoisuuden kloroformia, saatiin 15 puhdasta etyyli-N-[(4-metyylikumarin-7-yyli)amino]asetaat- tia.

Liuokseen, jossa oli 1,96 g (7,5 mmol) edeltävää esteriä 15 ml:ssa metanolia ja 15 ml:ssa tetrahydrofuraania, lisättiin 10 ml natriumhydroksidin 1 N vesiliuosta. 30 mi-20 nuutin kuluttua lisättiin 4 ml kloorivetyhapon 10 % lista vesiliuosta. Orgaaniset liuottimet poistettiin haihduttamal-, ,·, la ja saatu kiteinen tuote suodatettiin ja pestiin kylmällä V etanolilla ja sen jälkeen eetterillä. Saatu materiaali liuo tettiin 20 ml:n tetrahydrofuraania ja 4 ml:n dimetyyliforma-25 midia seokseen. Lisättiin disykloheksyylikarbonyylidi-imi- *·'·' datsolia (1,3 g, 2,2 ekv.) ja reaktion annettiin kestää 15 * minuuttia, minkä jälkeen lisättiin kysteiinietyyliesteri- hydrokloridia (1,6 g, 2,5 ekv.) ja trietyyliamiinia (1,2 • « • *·· ml) . Edelleen kolmen tunnin kuluttua reaktioseosta laimensi : 30 nettiin lisäämällä etyylieetteriä, joka sisälsi 5 % mety- leenikloridia, minkä jälkeen seos pestiin kerran kloorivety- • · · hapon 10-%:isella vesiliuoksella ja kahdesti suolaliuoksella. Kuivauksen magnesiumsulfaatilla sekä liuottimien poiston kuiviin haihduttamalla jälkeen saatu raakatuote kiteytettiin . 35 liuottamalla kloroformiin, joka sisälsi hyvin pienen määrän

II

45 100105 etanolia, ja lisäämällä sitten ylimäärin eetteriä. Kiteet eroon suodattamalla ja sitten kuivaamalla saatiin puhdasta N-[[(4-metyylikumarin-7-yyli)amino]asetyyli]kysteiinietyy-liesteriä. Seosta, jossa oli 5 ml kloroformia, 20 ml 5 metanolia ja 0,4 ml hydratsiinihydraattia, keitettiin palau tus jäähdyttäen argon-suojakaasussa. Seokseen lisättiin 550 mg N-[[(4-metyylikumarin-7-yyli)amino]asetyyli]kysteiini-etyyliesteriä. Seosta keitettiin palautusjäähdyttäen 9 tunnin ajan, minkä jälkeen se jäähdytettiin ja saatu kiinteä 10 tuote suodatettiin eroon ja pestiin ensin kloroformilla ja sitten etyylieetterillä. Raakatuote (joka sisälsi tiolin ja disulfidin) liuotettiin dimetyyliformamidiin, joka sisälsi ditiotreitolia ja trietyyliamiinia. 30 minuutin kuluttua tuote saostettiin lisäämällä ylimäärin etyylieetteriä ja 15 otettiin sitten suodattamalla talteen. Tätä materiaalia puh distettiin edelleen uudelleenkiteyttämällä asetonitriilistä, josta oli kaasut poistettu ja joka sisälsi ditiotreitolia ja jäämäpitoisuuden trietyyliamiinia, jolloin saatiin puhdasta N-[[(4-metyylikumarin-7-yyli)amino]asetyyli]kysteiinihydrat-20 sidia.

.·, Seokseen, jossa oli 12 mg LL-E33288-gamma1I: tä , 12 mlrssa asetonitriiliä, lisättiin 0 °C:ssa 4 mg N-[[(4-me- tyylikumarin-7-yyli)amino]asetyyli]kysteiinihydratsidia 1,2 ml:ssa dimetyyliformamidia. Seosta sekoitettiin yön yli, 25 minkä jälkeen siihen lisättiin vielä 2 mg N-[[(4-me- | · ···' tyylikumarin-7-yyli) amino] asetyyli] kysteiinihydratsidia 0,6 • · · • · · V * mlrssa dimetyyliformamidia. Reaktioseosta sekoitettiin 3 päivän ajan 0 °C:ssa, minkä jälkeen se suodatettiin. Ase- • · • *«· tonitriili poistettiin haihduttamalla ja saatua dimetyyli- i^:*; 30 formamidiliuosta laimennettiin lisäämällä ylimäärin 1:1 hek- ./ saaniseos/eetteri -seosta. Tuote suodatettiin eroon ja sitä • · · puhdistettiin edelleen kromatograf isesti silikageelissä käyttäen eluoinnissa gradienttia 15 - 20 % metanoli/kloro-formi, jolloin saatiin 3 mg haluttua tuotetta. Retentioaika 35 käänteisfaasi-C1B-HPLC-kolonnissa oli 3,5 minuuttia eluoita- 46 100105 essa 45 % asetonitriili/O,1 M ammoniumasetaatin vesiliuoksella (LL-E33288-delta1I:n retentioaika samassa järjestelmässä oli 15,5 min).

Esimerkki 6 5 LL-E33288-alfa3::n 3-merkaptopropionyylihydratsidi- disulfidi

Seokseen, jossa oli 10 mg LL-E33288-alfa3I:tä 9 ml:ssa asetonitriiliä, lisättiin -15 °C:ssa 6,6 mg 3-merkaptopro-pionyylihydratsidia 1 ml:ssa asetonitriiliä. Seokseen lisät-10 tiin yksi ekvivalentti trietyyliamiinia tai yksi ekvivalent ti trietyyliamiinia ja yksi ekvivalentti etikkahappoa. Reaktion annettiin edetä 0 °C:ssa tunnin ajan, minkä jälkeen liuotin poistettiin kuiviin haihduttamalla. Jäännöksellä suoritettiin kromatografia-ajo silikageelissä käyttäen eluoin-15 nissa gradienttia 10 - 15 % metanoli/kloroformi halutun tuotteen saamiseksi. FABMS: m/g-1251 (M+H) , retentioaika käänteisfaasi-C18-HPLC-kolonnissa oli 2,1 minuuttia käytettäessä eluoinnissa järjestelmää 45 % asetonitriili/O,1 M ammoniumasetaatin vesiliuos (LL-E33288-alfa5x:n retentioaika 20 samassa järjestelmässä oli 5,7 min).

Esimerkki 7 . .·. N-asetyyli-LL-E33288-gamma1I:n 3-merkaptopropionyyli- hydratsididisulf idi

Seokseen, jossa oli 10 mg N-asetyyli-LL-E33288- .. 25 gammat:tä 10 ml:ssa asetonitriiliä, lisättiin -15 °C:ssa 1,5 i ekvivalenttia 3-merkaptopropionyylihydratsidia 85 mikrolit- • · · *·* rassa asetonitriiliä. Seokseen lisättiin yksi ekvivalentti trietyyliamiinia. Reaktion annettiin edetä 0 °C:ssa 2 tunnin • · : ’*· ajan, minkä jälkeen liuotin poistettiin kuiviin haihdutta- • · :.· i30 maila. Jäännöksellä suoritettiin kromatografia-ajo silika- :·, geelissä käyttäen eluoinnissa gradienttia 10 - 15 % me-

• M

tanoli/kloroformi halutun tuotteen saamiseksi. FABMS: m/z=1450 (M+H), retentioaika käänteisf aasi-C18-HPLC-ko- lonnissa oli 2,5 minuuttia käytettäessä eluoinnissa järjes-.35 telmää 50 % asetonitriili/O,05 M ammoniumdivetyfosfaatin

(I

47 100105 vesiliuos (N-asetyyli-LL-E33288-gamma1I: n retentioaika samassa järjestelmässä oli 6,6 min).

Esimerkki 8 LL-E33288-alfa2::n 3-merkaptopropionyylihydratsidi- 5 disulfidi

Seokseen, jossa oli 10 mg LL-E33288-alfa2I: tä 10 ml:ssa asetonitriiliä, lisättiin -15 °C:ssa 1,5 ekvivalenttia 3-merkaptopropionyylihydratsidia 1 ml:ssa asetonitriiliä. Seokseen lisättiin yksi ekvivalentti trietyyliamii-10 nia. Reaktion annettiin edetä 0 °C:ssa 1 tunnin ajan, minkä jälkeen liuotin poistettiin kuiviin haihduttamalla. Jäännöksellä suoritettiin kromatografia-ajo silikageelissä käyttäen eluoinnissa gradienttia 5 - 15 % metanoli/kloroformi halutun tuotteen saamiseksi. FABMS: m/z=1248 (M+H), retentioaika 15 käänteisfaasi-C18-HPLC-kolonnissa oli 2,6 minuuttia käytettä essä eluoinnissa järjestelmää 58 % asetonitriili/0,05 M am-moniumdivetyfosfaatin vesiliuos (LL-E33288-alfa2r:n retentioaika samassa järjestelmässä oli 7,5 min).

Esimerkki 9 20 Jodi-LL-E33288-pseudoaglykonin 3-merkaptopropionyy- lihydratsididisulfidi

Seokseen, jossa oli 10 mg jodi-LL-E33288-pseudo-aglykonia 9 mlrssa asetonitriiliä, lisättiin -15 °C:ssa 1,5 ekvivalenttia 3-merkaptopropionyylihydratsidia 1 mlrssa ase-25 tonitriiliä. Seokseen lisättiin yksi ekvivalentti trietyy- J · ···* liamiinia katalysaattoriksi. Reaktion annettiin edetä 0 °Cr- • · · • · · *.* * ssa 1 tunnin ajan, minkä jälkeen liuotin poistettiin kuiviin haihduttamalla. Jäännöksellä suoritettiin kromatografia-ajo • · • ·.. silikageelissä käyttäen eluoinnissa gradienttia 10 - 15 % :T:30 metanoli/kloroformi halutun tuotteen saamiseksi. FABMS: m/z=1091 (M+H) , retentioaika käänteisfaasi-C18-HPLC-ko- • ·· *,,, lonnissa oli 2,8 minuuttia käytettäessä eluoinnissa järjestelmää 50 % asetonitriili/0,05 M ammoniumdivetyfosfaatin vesiliuos (jodi-LL-E33288-pseudoaglykonin retentioaika sam-35 assa järjestelmässä oli 7,9 min).

48 100105

Esimerkki 10 LL-E33288-gamma1I: n 3-merkaptobutyryylihydratsidi- disulfidi 17,2 g:aan (0,2 mol) krotonihappoa lisättiin 18 ml 5 (0,26 mol) tioetikkahappoa. Saatua seosta keitettiin palau tus j äähdyttäen argon-suojakaasussa 6 tunnin ajan. Tioetikka-happoylimäärä poistettiin tyhjöimua käyttäen, minkä jälkeen saatu öljy liuotettiin 100 ml:aan vedetöntä etanolia, joka sisälsi 200 mikrolitraa konsentroitua rikkihappoa. Saatua 10 reaktioseosta keitettiin palautusjäähdyttäen 10 tunnin ajan, minkä jälkeen sen tilavuutta pienennettiin tyhjöimua käyttä en. Lisättiin heksaaniseosta, minkä jälkeen saatu liuos pestiin toisiaan seuraten kahdella erällä kyllästettyä natrium-bikarbonaattiliuosta ja yhdellä erällä vettä. Sitten kysei-15 nen liuos kuivattiin magnesiumsulfaatilla, suodatettiin ja sen tilavuutta pienennettiin kunnes saatiin öljy. Tämä raa-katuote liuotettiin 250 ml:aan metanolia, joka sisälsi 12 ml hydratsiinia, ja saatua seosta keitettiin palautusjäähdyttäen 10 tunnin ajan argon-suojakaasussa. Reaktioseoksen tila-20 vuutta pienennettiin, minkä jälkeen se tislattiin nopeasti , Kugelrohr-laitteessa ja kiteytettiin kloroformin ja heksaa- , nien seoksesta, jolloin saatiin 3-merkaptobutyryylihydratsi- dia.

Seokseen, jossa oli 5 mg LL-E33288-gamma1I: tä 5 mlrssa 25 asetonitriiliä, lisättiin -15 °C:ssa 1,5 ekvivalenttia 3-mer- t : ·" kaptopropionyylihydratsidia 1 mlrssa asetonitriiliä. Seok- • i · *·* seen lisättiin yksi ekvivalentti trietyyliamiinia. Reaktion annettiin edetä 0 °C:ssa 1 tunnin ajan, minkä jälkeen liuotin • · : *·· poistettiin kuiviin haihduttamalla. Jäännöksellä suoritet- • · « *,· < 30 tiin kromatografia-ajo silikageelissä käyttäen eluoinnissa ··. gradienttia 10 - 15 % metanoli/kloroformi halutun tuotteen • ·· *... saamiseksi. FABMS: m/e=1422 (M+H) , retentioaika käänteisfaa- si-C15-HPLC-kolonnissa oli 3,5 minuuttia käytettäessä eluoinnissa järjestelmää 43 % asetonitriili/0,05 M ammoniumdivety-35 fosfaatin vesiliuos (LL-E33288-gamma1I:n retentioaika samassa järjestelmässä oli 13,4 min).

tt 49 100105

Esimerkki 11 LL-E33288-gamma1I:n 3-merkaptoisovaleryylihydratsidi- disulfidi 10 g:aan (0,1 mol) 3,3-dimetyyliakryylihappoa lisät-5 tiin 9 ml (0,13 mol) tioetikkahappoa. Saatua seosta keitet tiin palautusjäähdyttäen argon-suojakaasussa 6 tunnin ajan. Tioetikkahappoylimäärä poistettiin tyhjöimua käyttäen ja saatu öljy liuotettiin 100 ml:aan vedetöntä etanolia, joka sisälsi 200 mikrolitraa konsentroitua rikkihappoa. Saatua 10 reaktioseosta keitettiin palautusjäähdyttäen 34 tunnin ajan, minkä jälkeen siihen lisättiin 16 ml hydratsiinia. Saatua seosta keitettiin palautusjäähdyttäen 24 tunnin ajan argon-suojakaasussa, minkä jälkeen sen tilavuutta pienennettiin ja se liuotettiin suolaliuoksen ja kyllästetyn natriumbikarbon-15 aattiliuoksen seokseen. Tuotetta uutettiin usealla tilavuu della kloroformia. Kloroformifaasit erotettiin, yhdistettiin ja kuivattiin magnesiumsulfaatilla, suodatettiin ja pienennettiin tilavuudeltaan öljyksi. Tätä öljyä puhdistettiin paisuntakromatografisesti käyttäen metanoli/kloroformi-gra-20 dienttia, minkä jälkeen se kloroformi/heksaaneista kiteyttä mällä saatiin 3-merkaptoisovaleryylihydratsidia.

. Seokseen, jossa oli 15 mg LL-E33288-gamma!1: tä 5 ml:- . ssa asetonitriiliä, lisättiin -15°C:ssa 1,5 ekvivalenttia 3- merkaptoisovaleryylihydratsidia 100 mikrolitrassa 25 asetonitriiliä. Seokseen lisättiin yksi ekvivalentti trie- > : *·; tyyliamiinia katalysaattoriksi. Reaktion annettiin edetä 3 • · · *·* * tunnin ajan huoneen lämpötilassa, minkä jälkeen liuotin poistettiin kuiviin haihduttamalla. Jäännöksellä suoritet- • * i *· tiin kromatografia-ajo silikageelissä käyttäen eluoinnissa • · · V · 30 gradienttia 10 - 15 % metanoli/kloroformi halutun tuotteen :·. saamiseksi. FABMS: m/z=1436 (M+H) , retentioaika käänteisfaa- • ·· ··· si-C18-HPLC-kolonnissa oli 3,9 minuuttia käytettäessä eluoin nissa järjestelmää 43 I asetonitriili/0,05 M ammoniumdivety-fosfaatin vesiliuos (LL-E33288-gamma1I:n retentioaika samassa 35 järjestelmässä oli 13,4 min).

50 100105

Esimerkki 12 LL-E33288-gamma1I:n p-merkaptodihydrokinnamoyylihyd- ratsididisulfidi 500 mg:aan (2,75 mmol) p-merkaptodihydrokanelihappoa 5 lisättiin 15 ml metanolia, joka sisälsi 1 tipan konsentroi tua rikkihappoa. Saatua seosta keitettiin palautus jäähdyttäen 5 tunnin ajan, minkä jälkeen se jäähdytettiin huoneen lämpötilaan. Seokseen lisättiin hydratsiinia (1,5 ml) ja saatua seosta keitettiin palautusjäähdyttäen 2 tunnin 10 ajan argon-suojakaasussa, minkä jälkeen sitä sekoitettiin 10 tunnin ajan huoneen lämpötilassa. Seokseen lisättiin 200 mg:n erä ditiotreitolia mahdollisesti läsnäolevien disulfi-dien pelkistämiseksi, minkä jälkeen reaktioseos jäähdytettiin -15 °C:seen. Saadut kiteet suodatettiin eroon, pestiin 15 eetteri/metanoli-seoksella ja kuivattiin sitten tyhjöuunissa (50°/5 mikronia/10 tuntia), jolloin saatiin p-merkaptodihyd-rokinnamoyylihydratsidia.

Seokseen, jossa oli 25 mg LL-E33288-gamma1I:tä 25 ml:ssa asetonitriiliä, lisättiin -15 °C:ssa 1,5 ekvivalenttia 20 p-merkaptodihydrokinnamoyylihydratsidia 1 ml:ssa asetonit- riiliä. Reaktioseosta sekoitettiin 0 °C 10 tuntia, minkä , /, jälkeen liuotin poistettiin haiduttamalla. Jäännöksellä suo- ' ritettiin kromatografia-ajo silikageelissä käyttäen eluoin- nissa gradienttia 10 - 15 % metanoli/kloroformi halutun 25 tuotteen saamiseksi. FABMS: m/z=1484 (M+H), retentioaika i : käänteisfaasi-C18-HPLC-kolonnissa oli 5,4 minuuttia käytet- « · «

*·* * täessä eluoinnissa järjestelmää 43 % asetonitriili/0,05 M

ammoniumdivetyfosfaatin vesiliuos (LL-E33288-gamma1I: n reten- • · • '·· tioaika samassa järjestelmässä oli 13,4 min).

» :*:30 Esimerkki 13

• I. I

N-Asetyyli-LL-E33288-gamma1I:n 3-merkaptoisovaleryy- • ·· *... lihydratsididisulf idi

Seokseen, jossa oli 20 mg N-asetyyli-LL-E33288-gamma^tä 15 ml:ssa asetonitriiliä, lisättiin -15 °C:ssa 3 35 ekvivalenttia 3-merkaptoisovaleryylihydratsidia 6,2 ml:ssa tl 51 100105 asetonitriiliä. Seokseen lisättiin 1 ekvivalentti trietyy-liamiinia. Reaktion annettiin edetä huoneen lämpötilassa 2 tunnin ajan, minkä jälkeen liuotin poistettiin kuiviin haihduttamalla. Jäännöksellä suoritettiin kromatografia-ajo si-5 likageelissä käyttäen eluoinnissa gradienttia 10 - 15 % me- tanoli/kloroformi halutun tuotteen saamiseksi. Retentioaika käänteisfaasi-C18-HPLC-kolonnissa oli 2,5 minuuttia käytettäessä eluoinnissa järjestelmää 50 % asetonitriili/0,05 M am-moniumdivetyfosfaatin vesiliuos (N-asetyyli-LL-E33288-gam-10 ma^in retentioaika samassa järjestelmässä oli 6,6 mn).

Esimerkki 14 N-Asetyyli-LL-E33288-gamma1I: n 3-merkaptobutyryylihyd-ratsididisulfidi

Seokseen, jossa oli 10 mg N-asetyyli-LL-E33288-15 gamma^itä 7,5 ml:ssa asetonitriiliä, lisättiin -15°C:ssa 3 ekvivalenttia 3-merkaptobutyryylihydratsidia 5 ml:ssa asetonitriiliä. Seokseen lisättiin 1 ekvivalentti tri-etyyliamiinia. Reaktion annettiin edetä huoneen lämpötilassa 10 tunnin ajan, minkä jälkeen liuotin poistettiin kuiviin 20 haihduttamalla. Jäännöksellä suoritettiin kromatografia-ajo silikageelissä käyttäen eluoinnissa gradienttia 10 - 15 % metanoli/kloroformi halutun tuotteen saamiseksi. Re-

I < I

!'! tentioaika käänteisf aasi-C18-HPLC-kolonnissa oli 7,3 mi nuuttia käytettäessä eluoinnissa järjestelmää 43 % aseton-25 itriili/0,05 M ammoniumdivetyfosfaatin vesiliuos (N-asetyy- ...* li-LL-E33288-gamma1I: n retentioaika samassa järjestelmässä • « · V * oli 5,6 min) .

Esimerkki 15 j ·.. N-asetyyli-LL-E33288-gamma1I: n p-merkaptodihydro- •*:':30 kinnamoyylihydratsididisulf idi

Seokseen, jossa oli 10 mg N-asetyyli-LL-E33288- • · gamma^:tä 7,5 ml:ssa asetonitriiliä, lisättiin -15°C:ssa 3,0 ekvivalenttia p-merkaptodihydrokinnamoyylihydratsidia 2,0 ml:ssa asetonitriiliä. Seokseen lisättiin 1 ekvivalentti ; ;35 trietyyliamiinia. Reaktion annettiin edetä huoneen lämpöti lassa 2 tunnin ajan, minkä jälkeen liuotin poistettiin kui- 52 100105 viin haihduttamalla. Jäännöksellä suoritettiin kromatogra-fia-ajo silikageelissä käyttäen eluoinnissa gradienttia 10 -15 % metanoli/kloroformi halutun tuotteen saamiseksi. Re-tentioaika käänteisfaasi-C18-HPLC-kolonnissa oli 7,3 mi-5 nuuttia käytettäessä eluoinnissa järjestelmää 43 % aseton- itriili/0,05 M ammoniumdivetyfosfaatin vesiliuos (N-asetyy-li-LL-E33288-gamma1I:n retentioaika samassa järjestelmässä oli 5,6 min).

Esimerkki 16 10 Ei-spesifinen konjugointi proteiineihin

Esimerkissä 3 kuvattu hydroksisukkinimidiesteri kiinnitettiin kovalenttisesti vasta-aineisiin lievästi aikalisissä olosuhteissa. Seuraava on yleismenettely taulukossa 7 lueteltujen vasta-ainekonjugaattien valmistamiseksi. Vasta-15 aineen, joka oli liuotettu pitoisuudeksi 3 -5 mg/ml 0,1 M

natriumkloridia sisältävään fosfaattipuskuriin, pH 7,5, annettiin reagoida 5-20 -kertaisen mooliylimäärän esimerkin 3 tuotetta kanssa samalla sekoittaen huoneen lämpötilassa 1 - 4 tunnin ajan. Konjugoidusta proteiinista poistettiin suo-20 lat kromatografisesti, minkä jälkeen aggregoitunut proteiini erotettiin monomeerisestä materiaalista geelisuodatus-. ,·. HPLCrtä käyttäen. Monomeeriset fraktiot yhdistettiin ja kon- ,· sentroitiin.

i t : « ·« • · » • * « « · « • · ♦ · • «· • m· • · · « · i ·« • · • ·· 1 · 53 100105

Taulukko 7

Esimerkin 3 tuotetta käyttäen valmistetut ei-spesifi-set konjugaatit 5 MoAb Lääkepanos

M/M

Lym-1 5,2 B72.3 6,0 10 B72.3 2,9

Esimerkki 17

Paikkaohjautuvien konjugaattien valmistus Yleismenetelmää lääkkeiden hydratsidijohdannaisten 15 kiinnittämiseksi hapetettuihin vasta-aineisiin kuvaavat T.J.

McKearn, et ai., US-patenttijulkaisussa 4,671,958. Menettelyä sovellettiin vasta-ainekonjugaattien valmistukseen esimerkkien 4-15 mukaisista tuotteista spesifisesti modifioiden alla kuvatun mukaisesti. Näistä reaktioista saadut tuot-20 teet ja niiden ominaispiirteet on esitetty yhteenvetona tau lukossa 7.

, ,·. (A) Vasta-aineen hapettaminen

Vasta-ainetta pitoisuutena 5-10 mg/ml dialysoitiin yön yli 200-kertaista tilavuutta 50 mM natriumase-25 taattipuskuria pH 5,5 vastaan, joka sisälsi 0,1 M natrium- | * ···* kloridia (puskuri A). Dialyysin jälkeen MoAbrtä hapetettiin

V ' liuoksella, jossa oli 15 mM - 200 mM perjodihappoa 0,2 M

natriumasetaattiliuoksessa. Hapettumisen annettiin edetä • * J ">· pimeässä 4°C:ssa sekoittaen 45 minuutin ajan, minkä jälkeen »1’:30 hapetetusta MoAb:stä poistettiin suolat £ 5-kertaisen täyte- j.* ainetilavuuden omaavassa Sephadex G-25 -kolonnissa. Vasta- • ·♦ *... aineen hapettumisaste määritettiin saattamalla se reagoimaan p-nitrofenyylihydratsiinin kanssa ja vertaamalla proteiinin absorbanssia 280 nm:n aallonpituudella p-nitro-.35 fenyylihydratsiinin absorbanssiin 395 nm:n aallonpituudella.

54 100105 (B) Lääkehydratsidin konjugointi

Hapetettu MoAb saatettiin reagoimaan 10 - 200 -kertaisen mooliylimäärän lääkehydratsidia kanssa. Hydratsidit liuotettiin dimetyyliformamidiin ja saadut liuokset lisät-5 tiin MoAb-vesiliuoksiin. MoAb:n saostumisen estämiseksi li sätyn dimetyyliformamidin lopputilavuus ei ylittänyt 10 % kokonaisreaktiotilavuudesta. Reaktion annettiin kestää 3 tunnin ajan huoneen lämpötilassa, jona aikana seosta sekoitettiin. Reagoimatta jääneiden aldehydiryhmien ristireak-10 tioiden ja sittemmän aggregaation estämiseksi seokseen li sättiin salpausainetta, asetyylihydratsidia, 100-kertainen mooliylimäärä 3 tuntia lääkehydratsidin lisäämisen jälkeen. Aldehydin ja lääkehydratsidin välisen (hydratsonin) Schiff-emässidoksen stabiloimiseksi tuote yleensä pelkistettiin 15 alkyylihydratsiiniksi lisäämällä 10 mM natriumsyaaniborohyd- ridiliuosta ja antamalla reaktion kestää vielä tunnin ajan (kokonaiskonjugointi-aika = 4 tuntia). Konjugaatista poistettiin kromatografisesti suolat, minkä jälkeen sitä dia-lysoitiin perusteellisesti (vähintään 48 tunnin ajan) fos-20 faattipuskuria, pH 6,5, vastaan säilytystä ja testausta sil- I mälläpitäen.

Konjugaateista analysoitiin aggregaattien mahdollinen läsnäolo käyttämällä geelisuodatus-HPLC:tä sekä vapaan lääkkeen mahdollinen läsnäolo käyttämällä käänteisfaasi-HPLC:tä . 25 Lääkepanostus määritettiin spektrien avulla käyttäen sekä | *·** vasta-aineen että lääkkeen ekstinktiokertoimia lääkkeen moo- • · * J · * -* lipitoisuuksien konjugaateissa arvioimiseksi.

• » t ·,.

« ·· • t • · · • · * «· 1

II

55 100105

Taulukko 7

Esimerkin 4 tuotteesta valmistetut hydratsidikonju-gaatit

5 MoAb Valmistus Lääkepanostus M/M

CTM-01 n:o 1 3,1 n:o 2 2,3 n : o 3 2,9 10 MAC-6 8 n:o 1 1,7 n : o 2 3,1 n:o 3 2,4

Esimerkin 5 tuotteesta valmistetut hydratsidikonjugaatit 15 Lym-1 n:o 1 0,15 n:o 2 0,76 n: o 3 3,2

Esimerkin 6 tuotteesta valmistetut hydratsidikonjugaatit 20 Lym-1 3,0 CT-M-01 n:o 1 2,4 n:o 2 2,9

Esimerkin 7 tuotteesta valmistetut hydratsidikonjugaatit 25 Lym-1 2,8 t : *·· Lym-2 1,4 *·* : B72.3 n: o 1 2,1 n:o 2 2,4 i * CT-M-01 n: o 1 1,6 <ϊ.30 n:o2 3,6 ··. n: o 3 2,5 > f· "... n: o 4 2,4 56 100105

Esimerkin 8 tuotteesta valmistetut hydratsidikonjugaatit

MoAb Valmistus Lääkepanostus M/M

CT-M-01 4,8 5

Esimerkin 9 tuotteesta valmistetut hydratsidikonjugaatit CT-M-01 3,0

Esimerkin 10 tuotteesta valmistetut hydratsidikonjugaatit 10 Lym-1 3,7

Esimerkin 11 tuotteesta valmistetut hydratsidikonjugaatit Lym-1 6,2 15 Esimerkin 12 tuotteesta valmistetut hydratsidikonjugaatit

Lym-1 3,5 * : ··· • >j · ♦ * · 9 9 f « • f • » t i I w • · · « « ·· • · f 99

Claims (8)

100105

1. Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen kantaja-lääkeainekonjugaatin valmistamiseksi, jolla on kaava 5 Tu-(Z-Sp-SS-W)m j ossa

10 Tu on monoklonaalinen vasta-aine; Y on monoklonaalisen vasta-aineen sivuketjun aminoryhmä; n on kokonaisluku 1 - 100; m on 0,1 - 15; /OÄ o /\T/'\ T won ' y-^-·<\ ch3 n 1 \0CH> °H HNis5?~v0 ηΓ^

20 OR2 jossa CK3 Q 'yVV

25 R,0 ^Y^OCH3 • · · 00 H3 • · • · • · · R2 °n R'ntai H; CjHs OCH3 • · · "... 30 • · · • · « [ **on tai H; ja n..' OCH3 QH 100105 R5. on vety tai asetyyliryhmä; Sp on -CH2-CH2-, -CH2-CH (CH3) -CH2-C (CH3) 2- tai -CH2-CH2-fenyleeni-; ja Z on -CONH-, 5 tunnettu siitä, että kaavan CH3-SSS-W mukainen yhdiste, joka on valittu joukosta LL-E33288-a2-I, LL-E33288-a3-I, LL-E33288-Y:-I, LL-E33288-YX-I: n jodipseudoaglykoni ja vastaava N-asyyliyh-diste, saatetaan reagoimaan vastaavasti substituoidun mer-10 kaptaanin kanssa, jolla on kaava Q-Sp-SH jossa Sp on edellä määritelty ja Q on -C02H, asetonitriilissä tai asetonitriilin ja tetrahydrofuraanin seoksessa tai ase-tonitriilin ja dimetyyliformamidin seoksessa lämpötilassa -15 20 - noin +40 °C yhden tunnin - kuuden vuorokauden ajan, edullisesti siten, että läsnä on yksi ekvivalentti tertiääristä amiiniemästä tai seosta, jonka muodostavat yksi ekvivalentti tertiääristä amiiniemästä ja yksi ekvivalentti orgaanista karboksyylihappoa, kaavan 20 Q-Sp-SS-W mukaisen välituotteen muodostamiseksi, jossa kaavassa Q, Sp ja W ovat edellä määritellyt, minkä jälkeen saatu kaavan Q-Sp-SS-W mukainen yhdiste saatetaan reagoimaan N-hydroksisukkinimidin tai 4-nitrofenolin kanssa 25 karboksyyliryhmää aktivoivan aineen kuten karbodi-imidin ··· ' : läsnäollessa kaavan • · · :T: Q-Sp-SS-w mukaisen yhdisteen saamiseksi, jossa kaavassa Q on » * • · * -3 A O • •‘30 \\ + “ '"'"Cl, o .'•-,35 ja Sp ja W ovat edellä määritellyt; ja 100105 saatu kaavan Q-Sp-SS-W mukainen yhdiste saatetaan reagoimaan molekyylin kanssa, jolla on kaava Tu-(Y)n jossa Tu, Y ja n ovat edellä määritellyt, vesipitoisessa 5 puskuriliuoksessa pH:ssa 6,5 - 9 ja lämpötilassa 4-40 °C, mainitut raja-arvot mukaanlukien, kaavan Ju-(Z-Sp-SS-W)m mn-m 10 mukaisen yhdisteen saamiseksi, jossa kaavassa Tu, Z, Sp, W, Y, n ja m ovat edellä määritellyt.

2. Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen kantaja-lääkeainekonjugaatin valmistamiseksi, jolla on kaava 15 Tu-(Z-Sp-SS-W)m (Y)n-m 20 jossa Tu on monoklonaalinen vasta-aine; Y on monoklonaalisen vasta-aineen hiilihydraattiryhmien hapetuksesta peräisin oleva aldehydi, -CH=NNHCOCH3 tai -CH2NHNHCOCH3; 25. on kokonaisluku 1 - 20; .···. m on 0,1 - 15; in HO-ΊΛγ° :·;> won \N^-o o-txj 0H H ;·. or2 • · · jossa 9*^3 o : ‘‘:3 5 R1 on OCH3 100105 r2 on tai H: CjHs 0€H3

5 R4 on tai H; ja OCH3 (ί,π R5. on vety tai asetyyliryhmä; Sp on -CH2-CH2-, -CH2-CH(CH3)-, -CH2-C (CH3) 2- tai 10 -CH2-CH2-fenyleeni-; ja Z on -CONHN=CH- tai -CONHNHCH2-, tunnettu siitä, että kaavan CH3-SSS-W mukainen yhdiste joka on valittu joukosta LL-E33288-a2-I, LL-E33288-a3-I, LL-E33288-YJ-I ja LL-15 £33288-7^1:0 jodipseudoaglykoni ja vastaava N-asyyliyhdiste, saatetaan reagoimaan vastaavasti substituoidun merkaptaanin kanssa, jolla on kaava Q-Sp-SH jossa Sp on edellä määritelty ja Q on -C0NHNH2, asetonitrii-20 Iissä tai asetonitriilin ja tetrahydrofuraanin seoksessa tai asetonitriilin ja dimetyyliformamidin seoksessa lämpötilassa -20 - noin +40 °C yhden tunnin - kuuden vuorokauden ajan, edullisesti siten, että läsnä on yksi ekvivalentti tertiääristä amiiniemästä tai seosta, jonka muodostavat yksi ekvi-25 valentti tertiääristä amiiniemästä ja yksi ekvivalentti or- gaanista karboksyylihappoa, kaavan • · · •Ti Q-Sp-SS-W mukaisen välituotteen muodostamiseksi, jossa kaavassa Q on j*t -CONHNH2 ja Sp ja W ovat edellä määritellyt, minkä jälkeen • · · *... 30 saatu kaavan Q-Sp-SS-W mukainen yhdiste saatetaan « · * u • · « *. reagoimaan molekyylin kanssa, jolla on kaava ?***· Tu- {Y) n jossa Tu on monoklonaalinen vasta-aine, Y on aldehydi, joka on saatu hapettamalla monoklonaalisen vasta-aineen Tu hiili-35 hydraattiryhmät maa-alkaliperjodaatin läsnäollessa vesipi- 100105 toisessa puskuriliuoksessa pH:ssa 4,0 - 6,5 lämpötilassa 4 -40 °C, mainitut raja-arvot mukaanlukien, ja n on kokonaisluku 1 - 20, kaavan

5 Tu-(Z-Sp-SS-W)m m„-ra mukaisen yhdisteen saamiseksi, jossa kaavassa Tu, Sp, W ja m ovat edellä määritellyt, n on 1 - 20, Y on -CHO ja Z on 10 -C0NHN=CH-, ja haluttaessa käsitellään näin saatua yhdistettä asetyylihydrat-siinilla vesipitoisessa puskuriliuoksessa pH:ssa 4,0 - 6,5 ja lämpötilassa 4-40 °C, mainitut raja-arvot mukaanlukien, kaavan 15 Tu-(Z-Sp-SS-W)m mukaisen yhdisteen saamiseksi, jossa kaavassa Tu, Sp, W ja m 20 ovat edellä määritellyt, n on 1 - 20, Y on -CH=NNHCOCH3 ja Z on -CONHN=CH-, ja haluttaessa saatetaan näin saatu yhdiste reagoimaan natriumsyano-boorihydridin kanssa vesipitoisessa puskuriliuoksessa pH:ssa 4,0 - 6,5 ja lämpötilassa 4-40 °C, mainitut raja-arvot 25 mukaanlukien, kaavan • · • · · :T; Tu-(Z-SP-SS-W)m (Y> n-» * · * » • · ^...^30 mukaisen yhdisteen saamiseksi, jossa kaavassa Tu, Sp, W ja m ovat edellä määritellyt, n on 1 - 20, Z on -CONHNHCH2- ja Y • · : ’·· on -CH2NHNHCOCH3. 100105