CZ293228B6 - Substituovaný disulfid, jeho konjugát s nosičem a způsoby přípravy tohoto disulfidu a konjugátu - Google Patents

Abstract

Substituovaný disulfid obecného vzorce Q-Sp-SS-W, odvozený od sloučenin CH.sub.3.n.SSS-W, označovaných jako LL-E 33 288alfa.sub.1.n.-Br, LL-E 33 288alfa.sub.1.n.-I, LL-E 33 288alfa.sub.2.n.-Br, LL-E 33 288alfa.sub.2.n.-I, LL-E 33 288alfa.sub.3.n.-Br, LL-E 33 288alfa.sub.3.n.-I, LL-E 33 288alfa.sub.4.n.-Br, LL-E 33 288beta.sub.1.n.-Br, LL-E 33 288beta.sub.1.n.-I, LL-E 33 288beta.sub.2.n.-Br, LL-E 33 288beta.sub.2.n.-I, LL-E 33 288gama.sub.1.n.-Br, LL-E 33 288gama.sub.1.n.-I a LL-E 33 288delta.sub.1.n.-I, od jejich jod- nebo brom-pseudoglykonů a jejich dihydro- nebo N-acyl-homologů, od látek BBM-1675, FR-900 405 a FR-900 406 a od antibiotik PD 114 759, PD 115 028, CL-1577 A, CL-1577 B, CL-1577 D, CL-1577 E a CL-1724 nebo jejich N-acetylhomologů. Konjugáty tohoto disulfidu s nosičem a způsobů přípravy uvedeného disulfidu a konjugátu. Uvedené sloučeniny jsou disulfidové analogy protinádorových a antibakteriálních účinných látek známých pod společným označením LL-E 33 288.ŕ

Description

Substituovaný disulfid, jeho konjugát s nosičem a způsoby přípravy tohoto disulfidu a konjugátu

Oblast techniky

Vynález se týká disulfidových sloučenin složek alfai, alfa?, alfa₃, alfa4, betai, beta₂, gama, delta a pseudoglykonových složek komplexu LL-33 288 a jejich derivátů, jakož i disulfidových složek antibiotik BBM-1675, FR-900 405, FR-900 406, PD 114 759, PD 115 028, CL-1577 A, CL-1577 B, CL-157 D, CL-1577 E a CL-1724 ajejich derivátů, připravených reakcí antibiotika s nesubstituovaným nebo substituovaným alkylmerkaptanem. Tyto disulfidové sloučeniny jsou účinnými protinádorovými látkami.

Vynález se rovněž týká konjugátu účinné látky s nosičem uvedených disulfidových analogů, připravených z výše uvedených látek. Nosičovou částí konjugátu je mono- nebo polyklonální protilátka, její fragmenty, chemicky nebo geneticky manipulované homology nebo růstové faktory nebo steroidy. Vynález se rovněž týká způsobů přípravy uvedených substituovaných disulfidů a uvedených konjugátů.

Dosavadní stav techniky

Skupina antibakteriálně a protinádorově účinných látek, známá pod společným označením komplex LL-E 33 288, je popsána v evropské patentové přihlášce 0 182 152. Tato skupina látek se používá pro přípravu disulfidových protinádorově účinných látek, přičemž některé z nich jsou výchozími látkami pro nosičové formy protinádorových látek podle vynálezu. Evropské patentová přihláška 0 182 152 popisuje komplex LL-E 33 288 a jeho složky, zejména LL-E 33 288alfai-I, LL-E 33 288-alfa₂-BR, LL-E 33 288alfa₃-I, LL-E 33 288alfa₃-Br, LL-E 33 288alfa₃-I, LL-E 33 288alfa4-Br, LL-E 33 288beta,-Br, LL-E 33 288beta!-I, LL-E 33 288beta₂-Br, LL-E 33 288beta₂-I, LL-E 33 288gama,-Br, LL-E 33 288gama,-I a LL-E 33 288deltai~I, jakož i způsoby jejich přípravy aerobní fermentací za použití nového kmene Micromonospora echinispora ssp. calichensis nebo jeho přirozených nebo odvozených mutantu. Uvedená evropská patentová přihláška rovněž uvádí navržené struktury pro některé z výše uvedených složek. Tyto navržené struktury jsou uvedeny v následující tabulce 1.

Tabulka 1

Navržené struktury pro látky CH₃-SSS-W izolované z přírodních zdrojů (obecným substituentem W je zbytek připojený ke skupině CH₃-SSS-)

OCHi

Designation	Ri	r2	r3	R4	r5
EE 33 288(¾1	Αη	r2-	H	H	c2h5
EE 33 288(¾1	Αγι	H	H	Rť
EE 33 288β1 Ι	Αγι	Rr	H	R4·	(CH3),CH
EE 33 288711	Αη	Ry	H	Ry	c2h5
EE 33 2885/	Ari	r2-	H	R('	ch3
EE 33 288β]ΒΓ	Αη	r2.	H	Ry	(CH3)2CH
EE 33 288yiBr	Αγι	Ry	H	Ry	c2h5
EE 33 288a2 Br	Ari	r2-	H	H	c2h5
EE 33 288a3 Br	Αγι	H	H	R4·
Esperamicin A]	ch3	Ry	r3.		(CH3)2CH
Esperamicin A2	ch3	Ry	Ry		(CH3)2CH
Esperamicin A]b	ch3	Ry	Ry		ch3ch2

R« R7

H Ar,

Ar, H

H Ar,

X

I

I

I

I

I Br Br Br Br

Další složky komplexu LL-E 33 288 jsou popsány v evropské patentové přihlášce 027 485. Rovněž tyto složky jsou vhodné pro přípravu disulfidových derivátů a nosičových forem protinádorově účinných látek podle vynálezu. Uvedená patentová přihláška popisuje LL-E 33 288brom- a jod-pseudoglykony řady, která byla připravena chemickou cestou. Tato přihláška rovněž popisuje dihydroderiváty, které je možno připravit ze všech výše uvedených protinádorově účinných antibiotik redukcí ketoskupiny na uhlíku Cn na hydroxylovou skupinu za použití borohydridu sodného. Struktury navržené pro tyto složky jsou uvedeny v dále zařazené tabulce 2. Další složky skupiny protinádorových antibiotik LL-E 33 288 jsou popsány v patentu US 5 079 233. Rovněž tyto složky jsou vhodné pro přípravu nosičových forem protinádorových látek podle vynálezu. Tato přihláška popisuje N-acylderiváty některých složek komplexu LL-E 33 288, které byly připraveny chemickou cestou. Rovněž navržené struktury těchto derivátů jsou uvedeny v následující tabulce 2.

Tabulka 2

Navržené struktury pro látky CH₃-SSS-W odvozené chemickou cestou od sloučenin z tabulky 1 (obecným substituentem W je zbytek připojený ke skupině CH3-SSS)

-2CZ 293228 B6

Μ

OCH

Designation________________

Dihydro LL-E33 288a₂’ Ύ-Acyl LL-E33 288a₂‘ Dihydro LL-E33 288a₃‘ Dihydro LL-E33 288β,’ Y-Acyl LL-E33 288(3/ Dihydro LL-E33 288γ/ Ύ-Acyl LL-E33 288γ,' Dihydro LL-E33 2885/ jV-Acyl LL-E33 2885/

Iodo LL-E33 288 pseudoaglycone Dihydro-lodo LL-E33 288 pseudoaglycone

Dihydro LL-E33 288β,^Br Ύ-Acyl LL-E33 288β ,^Br Dihydro LL-E33 288y,^Br Λ-Acyl LL-E33 288y,^Br Dihydro LL-E33 288a2^Br A-Acyl LL-E33 288a2^Br Dihydro LL-E33 288a₃ ^Br Bromo LL-E33 288 pseudoaglycone Dihydro-bromo LL-E33 288 pseudoaglycone

Υ-Acetyl Esperamicin Ai JV-Acetyl Esperamicin A₂ Á-Acetyl Esperamicin A_1B ^0C^ OH

Ri	Ri	r3	R» R?	r5·	Ré	R7 Rg	r9	X
Ar,	r2.	H	H C2H5	H		OH	H	I
Ar,	r2.	H	H C2H5	RCO		=0		I
Ar,	H	H	R4-			OH	H	I
Ar,	Rr	H	R,. (CH3)2CH	H		OH	H	I
Ar,	r2.	H	R4. (CH3)3CH	RCO		=0		I
Ar,	r2.	H	R,’ C2Hj	H		OH	H	I
Ar,	r2·	H	R4. c2h5	RCO		=0		I
Ar,	Rr	H	R,. CH3	H		OH	H	I
Ar,	r2.	H	R4· ch3	RCO		=0		I
Ar,	H	H	H			=0		1
Ar,	H	H	H			OH	H	I
Ar,	r2.	H	R4- (CH3)2CH	H		OH	H	Br
Ar,,	r2.	H	R4· (CH3)2CH	RCO		=0		Br
Ar,	r2·	H	R4. c2h5	H		OH	H	Br
Ar,	r2.	H	R4. C2H5	RCO		=O		Br
Ar,	r2.	H	H C2H5	H		OH	H	Br
Ar,	Rr	H	H C2H5	RCO		=0		Br
Ar,	H	H	Rr			OH	H	Br
Ar,	H	H	H			=0		Br
Ar,	H	H	H			OH	H	Br
ch3	r2.	Ry	(CH3),CH	CH3CO	H	Ar2
ch3	r2·	r3.	(CH3)2CH	CH3CO	Ar2	H
ch3	r2·	r3-	ch3ch.	CH3CO	H	Ar2

R znamená atom vodíku nebo rozvětvenou nebo přímou alkylovou skupinu obsahující 1 až 10 uhlíkových atomů, alkylenovou skupinu obsahující 1 až 10 uhlíkových atomů, arylovou 5 skupinu, heteroarylovou skupinu nebo arylalkylovou skupinu, ve které alkylový zbytek obsahuje 1 až 5 uhlíkových atomů, nebo heteroarylalkylovou skupinu, ve které alkylový zbytek obsahuje 1 až 5 uhlíkových atomů, přičemž všechny tyto skupiny mohou být případně substituované alespoň jedním substituentem ze skupiny zahrnující hydroxylovou skupinu, aminovou skupinu, karboxylovou skupinu, atom halogenu, alkoxylovou skupinu obsahující ίο 1 až 3 uhlíkové atomy a thioalkoxylovou skupinu obsahující 1 až 5 uhlíkových atomů.

V rámci vynálezu jsou použitelné i některé další protinádorové a antibakteriální sloučeniny, zejména:

-3CZ 293228 B6

1) Esperamycin BBM-1 675, představující novou skupinu vysoce účinných protinádorových antibiotik, přičemž fyzikálně-chemické vlastnosti a rapciální struktura těchto látek je popsána M. Konishi-m a kol. v J. Antibiotics, 38, 1605(1985) a odpovídající nový protinádorový antibiotický komplex popsal Konishi a kol. v patentové přihlášce GB 2 141 542 A,

2) nová protinádorová antibiotika popsaná v patentových dokumentech FR-900 405 a FR-900 406, přičemž taxonomie produkčního kmene byla popsána M. Iwami-m a kol. v J. Antibiotics 38, 835(1985) a produkce, izolace, charakterizace a protinádorová účinnost byla popsána S. Kiyoto-em a kol. v J. Antibiotics, 38, 340(1985),

3) PD 114 759 a PD 115 028, představující nová protinádorová antibiotika s fenomenální potencí, přičemž izolace a charakterizace těchto látek byla popsána R. H. Bunge-m a kol. v J. Antibiotics, 37, 1566(1984) a biologická a biochemická účinnost nového protinádorového antibiotika PD 114 759 a jeho derivátů byla popsána D. W. Fryem a kol. v Investigational New Drugs, 4,3(1986),

4) nové antibiotické komplexy CL-1577 A, CL-1577 B produkované kmenem Streptomyces sp. ATCC 39 363 a popsané v evropské patentové přihlášce 0 132 082.

5) antibiotické protinádorové sloučeniny CL-1577 D a Cl—1577 E, které jsou společně s jejich produkcí a použitím popsané v patentu US4539203,

6) antibiotické sloučeniny CL-1724, které jsou společné s jejich produkcí a použitím popsané v patentu US 4 554 162,

7) nová protinádorová antibiotika BBM-1675-A3 a BBM-1675-A4, získaná fermentací Actinomadura verrucosospora, kmenů H964-92(ATCC 39 334) nebo AB27Y (ATCC 39 638) a popsaná v patentu US 4 675 187 a

8) nové A-acetyl-esperamicinové deriváty A_b A₂ a A_!b a antimikrobiální a protinádorovou účinností, popsané v evropské patentové přihlášce 289 030.

f

Úplné struktury esperamicinů A_b A₂ a A_lb (komplex BBM-1 675) a jejich N-acetylových derivátů již byly popsané a jsou uvedeny ve výše uvedených tabulkách 1 a 2. Fyzikální charakteristiky ostatních výše uvedených protinádorových antibiotik ukazují, že všechny tyto látky mají podobnou nebo dokonce stejnou strukturu jako uvedené esperamiciny a že všechny obsahují funkční methyltrithioskupinu.

Z výše uvedených struktur složek alfa_b alfa₂, alfa₃, alfa₄, beta_b beta₂, gamai a delta a pseudoglykonových složek komplexu LL-E 33 288, jejich A-acylových homologů, jakož i ze struktur antibiotik BBM-1675, FR-900 405, FR-900 406, PD 114 759, PD 115 028, CL-1577 A, CL-1 577 B, CL-1577 D, CL-1577 E a CL-1724 a jejich A-acylových homologů je zřejmé, že každá z těchto látek obsahuje ve své struktuře methyltrithioskupinu.

Podstata vynálezu

Nyní bylo nově zjištěno, že reakcí libovolného z výše uvedených antibiotik s nesubstituovaným nebo substituovaným alkyl- nebo arylmerkaptanem se dosáhne vytěsnění methylperthiolátového aniontů z trisulfidového zbytku za vzniku stabilního disulfidu podle následujícího reakčního schématu I:

-4CZ 293228 B6

Reakční schéma I

Q-Sp-SH

CHj-SSS-W -> Q-Sp-SS-W.

Ostatní sloučeniny, které mohou být podrobeny této transformaci, jsou popsané v evropské patentové přihlášce publikované pod číslem 0 313 874.

Předmětem vynálezu takto je substituovaný disulfid obecného vzorce Q-Sp-SS-W, odvozený od sloučenin CH₃SSS-W, označovaných jako LL-E 33 288alfai~Br, LL-E 33 288alfaj—I, LL-E 33 288alfa₂-Br, LL-E 33 288alfa₂-I, LL-E 33 288alfa₃-Br, LL-E 33 288alfa₃-I, LL-E 33 288aIfa4-Br, LL-E 33 288betai-Br, LL-E 33 288beta]I, LL-E 33 288beta₂-Br, LL-E 33 288beta₂-I, LL-E 33 288gama]-Br, LL-E 33 288gama|-I a LL-E 33 288deltai-1, od jejich jod- nebo brom-pseudoglykonů a jejich dihydro- nebo ýV-acyl-homologů, od látek BBM-1675, FR-900 405 a FR-900 406 a od antibiotik PD 114 759, PD 115 028, CL-1577 A, CL-1577B, CL-1577 D, CL-1577 E a CL-1724 nebo jejich A-acetylhomologů, přičemž v uvedeném obecném vzorci

W znamená

kde

Ri znamená nebo CH₃

R₂ znamená nebo H,

-5CZ 293228 B6

R₃ znamená nebo H,

R4 znamená

nebo H,

Re nebo R₇ znamená H nebo

R₅ znamená methylovou skupinu, ethylovou skupinu nebo skupinu (CH₃)₂CH,

Rg znamená hydroxylovou skupinu,

R₉ znamená atom vodíku nebo

Rg a R₉ dohromady znamenají karbonylovou skupinu,

X znamená atom jodu nebo atom bromu,

R₅' znamená atom vodíku nebo skupinu RCO, ve které

R znamená atom vodíku nebo rozvětvenou alkylovou skupinu obsahující 1 až 10 uhlíkových atomů nebo alkylenovou skupinu obsahující 1 až 10 uhlíkových atomů, arylovou skupinu obsahující 6 až 11 uhlíkových atomů nebo heteroarylovou skupinu zvolenou z množiny zahrnující furylovou skupinu, thienylovou skupinu, Ύ-methylpyrrolylovou skupinu, pyridylovou skupinu, A-methylimidazolylovou skupinu, oxazol

-6CZ 293228 B6 ylovou skupinu, pyrimidinylovou skupinu, chinolylovou skupinu, izochinolylovou skupinu, Λ-methylkarbazolylovou skupinu, aminokumarinylovou skupinu a fenazinylovou skupinu nebo arylalkylovou skupinu, ve které arylový zbytek obsahuje 6 až 11 uhlíkových atomů a alkylový zbytek obsahuje 1 až 5 uhlíkových atomů, nebo heteroarylalkylovou skupinu, ve které je heteroarylový zbytek zvolen zvýše uvedené množiny a alkylový zbytek obsahuje 1 až 5 uhlíkových atomů, přičemž uvedené skupiny mohou být případně substituované alespoň jedním substituentem zvoleným z množiny zahrnující hydroxylovou skupinu, aminovou skupinu, karboxylovou skupinu, halogen, nitro-skupinu, alkoxy-skupinu obsahující 1 až 3 uhlíkové atomy a alkylthio-skupinu obsahující 1 až 5 uhlíkových atomů,

Sp znamená přímou nebo rozvětvenou dvouvalenční alkylovou skupinu obsahující 1 až 18 uhlíkových atomů, dvouvalenční arylovou skupinu obsahující 6 až 11 uhlíkových atomů nebo dvouvalenční heteroarylovou skupinu zvolenou z množiny zahrnující furylovou skupinu, thienylovou skupinu, A-methylpyrrolylovou skupinu, pyridylovou skupinu, A-methylimidazolylovou skupinu, oxazolylovou skupinu, pyrimidinylovou skupinu, chinolylovou skupinu, izochinolylovou skupinu, Λ-methylkarbazolylovou skupinu, aminokumarinylovou skupinu a fenazinylovou skupinu nebo dvouvalenční cykloalkylovou skupinu obsahující 3 až 18 uhlíkových atomů, dvouvalenční arylalkylovou skupinu, ve které arylový zbytek obsahuje 6 až 11 uhlíkových atomů a alkylový zbytek obsahuje 1 až 18 uhlíkových atomů, nebo heteroarylalkylovou skupinu, ve které alkylový zbytek obsahuje 1 až 18 uhlíkových atomů a heteroarylový zbytek znamená zbytek zvolený z množiny zahrnující furylovou skupinu, thienylovou skupinu, A-methylpyrrolylovou skupinu, pyridylovou skupinu, A-methylimidazolylovou skupinu, oxazolylovou skupinu, pyrimidinylovou skupinu, chinolylovou skupinu, izochinolylovou skupinu, A-methylkarbazolylovou skupinu, aminokumarinylovou skupinu a fenazinylovou skupinu, nebo dvouvalenční alkenylovou nebo alkinylovou skupinu obsahující 2 až 18 uhlíkových atomů, přičemž Sp může být dodatečně substituován amino-skupinou, alkylamino-skupinou obsahující 1 až 10 uhlíkových atomů, arylamino-skupinou obsahující 6 až 11 uhlíkových atomů, heteroarylamino-skupinou, ve které heteroarylový zbytek znamená zbytek zvolený z množiny zahrnující furylovou skupinu, thienylovou skupinu, TV-methylpyrrolylovou skupinu, pyridylovou skupinu, A-methylimidazolylovou skupinu, oxazolylovou skupinu, pyrimidinylovou skupinu, chinolylovou skupinu, izochinolylovou skupinu, A-methylkarbazolylovou skupinu, aminokumarinylovou skupinu a fenazinylovou skupinu, karboxylovou skupinu, alkoxyskupinou obsahující 1 až 3 uhlíkové atomy, hydroxy-skupinou, thiolovou skupinou nebo alkylthio-skupinou obsahující 1 až 5 uhlíkových atomů,

Q znamená atom halogenu, aminovou skupinu, alkylaminovou skupinu obsahující 1 až uhlíkových atomů, dialkylaminovou skupinu, ve které každá alkylový zbytek obsahuje 1 až 10 uhlíkových atomů, arylaminovou skupinu, ve které arylový zbytek obsahuje 6 až uhlíkových atomů, heteroarylaminovou skupinu, ve které je heteroarylový zbytek zvolen zvýše uvedené množiny, piperidinovou skupinu, pyrrolidinovou skupinu, piperazinovou skupinu, karboxylovou skupinu, nitrofenyloxykarbonylovou skupinu, skupinu -CHO, alkoxy-skupinu obsahující 1 až 3 uhlíkové atomy, hydroxylovou skupinu, thiolovou skupinu, dikarboxyalkylovou skupinu, ve které alkylový zbytek obsahuje 1 až 5 uhlíkových atomů, skupinu -CONHNH₂, skupinu -NHCONHNH₂, skupinu -CSNHNH₂, skupinu -NHCSNHNH₂, oxykarbonylovou skupinu nebo skupinu -ONH₂, přičemž v případě, že je uvedený substituovaný disulfid odvozen od sloučenin CH₃-SSS-W, zahrnujících LL-E 33 288alfa,-Br, LL-E 33 288alfai-I, LL-E 33 288alfa₂-Br, LL-E 33 288alfa2-I, LL-E 33 288alfa₃-Br, LL-E 33 288alfa₃-I, LL-E 33 288alfa4-Br, LL-E 33 288betai-Br, LL-E 33 288beta]-I, LL-E 33 288beta₂-Br, LL-E 33 288beta₂-I, LL-E 33 288gama!-Br, LL-E 33 288gama,-I, LL-E 33 288deltai-I, BBM-1675, FR-900 405, FR-900 406, PD 114 759, PR 115 028, CL-1577 A, CL-1577 B, CL-1577 D, CL-1577 E nebo CL-1724, potom Q neznamená atom halogenu, aminovou skupinu, alkylaminovou skupinu,

-7CZ 293228 B6 dialkylaminovou skupinu, arylaminovou skupinu, heteroarylaminovou skupinu, piperidinovou skupinu, pyrrolidinovou skupinu, piperazinovou skupinu nebo karboxylovou skupinu.

Zejména se vynález týká výše uvedeného substituovaného disulfidu obecného vzorce Q-Sp-SS-W, ve kterém

W znamená

kde

Ri znamená

R₂ znamená nebo H,

Ri znamená

nebo H,

R₅ znamená methylovou skupinu, ethylovou skupinu nebo skupinu (CH₃)₂CH,

X znamená atom jodu nebo atom bromu,

-8CZ 293228 B6

R₅' znamená atom vodíku, nebo skupinu RCO, ve které

R znamená atom vodíku, methylovou skupinu nebo monosubstituovanou arylovou skupinu obsahující 6 až 11 uhlíkových atomů a

Sp a Q mají výše uvedené významy.

Vynález se rovněž týká konjugátu výše uvedeného substituovaného disulfidu s nosičem, mající obecný vzorec

Tu-(Z-Sp-SS-W) ^c m (Y) n-m ve kterém

W má výše uvedený význam,

Sp má výše uvedený význam,

Tu znamená monoklonální protilátku nebo její fragmenty nebo její chemicky nebo geneticky modifikované homology,

Y znamená aminovou skupinu, karboxylovou skupinu nebo thiolovou skupinu tvořící boční řetězec protilátky Tu, aldehydovou skupinu odvozenou od glykoproteinových cukerných zbytků protilátky Tu, amidoalkylthio-skupinu, ve které alkylový zbytek obsahuje 2 až 18 uhlíkových atomů, skupinu -CH2NHNHCOCH3 nebo skupinu

-CH₂NHNHCOCH(NH₂}CH₂ —\O /— OH

Z znamená skupiny -CONH-, -CONHN=CH-, -CONHNHCH₂-, -NHCONHN=CH-, -NHCONHNHCH₂-, -NHCSNHN=CH-, -NHCSNHNHCH2-, -ON=CH- -NH-NHCH2-, -N=CH-, -CO2-, -NHCH2CO2-, -SS-,

nebo

-NHCOCW-, -Íh

I (CH )

I ^2x co₂h

-9CZ 293228 B6 kde x = O nebo 1, n znamená celé číslo od 1 do 100 a m znamená 0,1 až 15.

Zejména se vynález týká výše uvedeného konjugátu s nosičem obecného vzorce

Tu-tZ-Sp-SS-W)^ ve kterém

W má výše uvedený význam,

Sp znamená přímou nebo rozvětvenou dvouvalenční alkylovou skupinu obsahující 2 až 10 uhlíkových atomů nebo dvouvalenční arylalkylovou skupinu, ve které arylový zbytek 15 obsahuje 6 až 11 uhlíkových atomů a alkylový zbytek obsahuje 2 až 5 uhlíkových atomů nebo heteroarylalkylovou skupinu, ve které alkylový zbytek obsahuje 2 až 5 uhlíkových atomů a heteroarylový zbytek má výše uvedené významy, přičemž Sp může být dodatečně substituován amino-skupinou, heteroarylamino-skupinou, ve které má heteroarylový zbytek výše uvedené významy, hydroxy-skupinou nebo thiolovou skupinou,

Tu znamená monoklonální protilátku, která vykazuje preferenční reaktivitu s lidským nádorovým antigenem,

Y znamená aminovou skupinu tvořící boční řetězec protilátky Tu nebo aldehydovou skupinu 25 odvozenou od glykoproteinových cukerných zbytků protilátky Tu,

Z znamená skupinu -CONH-, skupinu -CONHN=CH-, skupinu -CONHNHCH₂- nebo skupinu

-nhcoch₇-ČH

I (CH,)

I ^2x CO H kde x znamená 0 nebo 1, m znamená 0,1 až 15, n znamená celé číslo od 1 do 100.

Vynález se rovněž týká způsobu přípravy výše uvedeného substituovaného disulfidu obecného vzorce Q-Sp-SS-W, jehož podstata spočívá v tom, že se výše definovaná sloučenina obecného vzorce CH₃SSS-W uvede v reakci se substituovaným merkaptanem obecného vzorce Q-Sp-SH, ve kterém Q a Sp mají výše uvedené významy, v acetonitrilu nebo ve směsi acetonitrilu 40 a tetrahydrofuranu nebo acetonitrilu a dimethylformamidu při teplotě -20 až 40 °C po dobu

-10CZ 293228 B6 hodiny až 6 dnů. Výhodně se tato reakce provádí v přítomnosti jednoho ekvivalentu terciární aminové báze a jednoho ekvivalentu organické karboxylové kyseliny.

Vynález se dále týká způsobu přípravy výše definovaného konjugátu substituovaného disulfidu s nosičem obecného vzorce

Tu-(Z-Sp-SS-W)_m ve kterém Sp, W, Tu, n a m mají výše uvedené významy, Y znamená aminovou nebo karboxylovou skupinu tvořící boční řetězec protilátky Tu a Z znamená skupinu -CONH-, skupinu -NH-, skupinu -N=CH, skupinu -CO₂- nebo skupinu

-NHCOCH., -ČH

I (CH }

I ^2x

CO H kde x = 0 nebo 1, jehož podstata spočívá v tom, že se uvede v reakci sloučenina obecného vzorce Q-Sp-SS-W, ve kterém Sp a W mají výše uvedené významy a Q znamená atom halogenu, aminovou skupinu, alkylaminovou skupinu, karboxylovou skupinu, karboxaldehydovou skupinu, hydroxylovou skupinu nebo skupinu anhydridu alkyldikarboxylové kyseliny, ve které alkylový zbytek obsahuje 4 nebo 5 uhlíkových atomů, s molekulou látky obecného vzorce Tu-(Y)_n, ve kterém Tu, Y a n mají výše uvedený význam, ve vodném pufru s hodnotou pH 6,5 až 9 při teplotě 4 až 40 °C buď přímo, nebo v přítomnosti ve vodě rozpustného karbodiimidu.

Vynález se rovněž týká způsobu přípravy výše uvedeného konjugátu substituovaného disulfidu s nosičem obecného vzorce

Tu-(Z-Sp-SS-W (Y) n-m ve kterém Sp, W, Tu, n a m mají výše uvedené významy, Y znamená aminovou skupinu tvořící boční řetězec protilátky Tu a Z znamená skupinu -CONH-, jehož podstata spočívá v tom, že se sloučenina obecného vzorce Q-Sp-SS-W, ve kterém Sp a W mají výše uvedené významy a Q znamená karboxylovou skupinu, uvede v reakci s TV-hydroxysukcinimidem, 2,3,5,6-tetrafluorfenolem, pentafluorfenolem nebo 4-nitrofenolem v přítomnosti činidla aktivujícího karboxylovou skupinu, jakým je karbodiimid, za vzniku sloučeniny obecného vzorce Q-Sp-SS-W, ve kterém Sp a W mají výše uvedené významy a Q znamená

-11 CZ 293228 B6

y	F	F
-c°2y	-C02~<		-C02-(O)-F
0	FZ	F	F^ F
nebo	coKo	y
načež se získaná sloučenina uvede v reakci	s molekulou	látky obecného vzorce Tu-(Y)n, v

kterém Tu, Y a n mají výše uvedené významy, ve vodném pufrovaném roztoku při hodnotě pH 6,5 až 9 a při teplotě 4 až 40 °C.

Vynález se dále týká způsobu přípravy výše definovaného konjugátu substituovaného disulfidu s nosičem obecného vzorce

Tu-(Z-Sp-SS-W)_m ve kterém Tu, Z, Sp, W, Y, m a n mají výše uvedené významy, jehož podstata spočívá v tom, že se sloučenina obecného Q-Sp-SS-W, ve kterém Sp a W mají výše uvedené významy a Q znamená skupinu -CONHNH₂, uvede v reakci s kyselinou dusitou ve vodném roztoku acetonitrilu za vzniku sloučeniny obecného vzorce Q-Sp-SS-W, ve kterém Sp a W mají výše uvedené významy a Q znamená skupinu -CON₃, načež se tato sloučenina uvede v reakci se sloučeninou obecného vzorce Tu-(Y)_n, ve kterém Tu, Y a n mají výše uvedené významy.

Vynález se také týká způsobu přípravy výše definovaného konjugátu obecného vzorce

Tu-(Z-Sp-SS-W)_m ve kterém Tu, Sp, W, n a m mají výše uvedené významy, Z znamená

-SS-,

a Y znamená thiolovou skupinu tvořící boční řetězec protilátky Tu nebo amidoalkylthio-skupinu, ve které alkylový zbytek obsahuje 2 až 18 uhlíkových atomů, jehož podstata spočívá v tom, že se

-12CZ 293228 B6 sloučenina obecného vzorce Q-Sp-SS-W, ve kterém Sp a W mají výše uvedený význam a Q znamená hydroxylovou skupinu, uvede v reakci s anhydridem kyseliny alfa-halogenoctové za vzniku odpovídající sloučeniny, ve které Q znamená alfa-halogenacetyloxy-skupinu, načež se alfa-halogenacetyloxy-Sp-SS-W nebo sloučenina obecného vzorce Q-Sp-SS-W, ve kterém Sp a W mají výše uvedené významy a Q znamená

t

-CO nebo

-CH

CH uvede v reakci s molekulou látky obecného vzorce Tu-(Y)_n, ve kterém Tu má výše uvedený význam, Y znamená thiolovou skupinu tvořící boční řetězec protilátky Tu nebo amidoalkylthioskupinu, ve které alkylový zbytek obsahuje 2 až 18 uhlíkových atomů, zavedenou na aminovou funkci protilátky Tu za použití hydroxysukcinimidesteru kyseliny 3-{2-dithiopyridyl)propionové a následnou redukcí dithiothreitolem, nebo amidoalkylthio-skupinu zavedenou na aminovou funkci protilátky Tu za použití 2-iminothiolanu, a n znamená 1 až 10, ve vhodném pufrovaném roztoku při hodnotě pH 4,5 až 7 a při teplotě 4 až 40 °C.

Vynález se rovněž týká způsobu přípravy výše definovaného konjugátu substituovaného disulfidu s nosičem obecného vzorce

Tu-(Z-Sp-SS-W)_m

ve kterém Sp, W a Tu mají výše uvedené významy, Y znamená aldehydovou skupinu odvozenou od glykoproteinových cukerných zbytků protilátky Tu, Z znamená skupinu -ON=CH-, skupinu -N=CH-, skupinu -CONHN=CH-, skupinu -NHCONHN=CH- nebo skupinu -NHCSNHN=CH-, n znamená 1 až 20 a m znamená 0,1 až 15, jehož podstata spočívá v tom, že se sloučenina obecného vzorce Q-Sp-SS-W, ve kterém Sp a W mají výše uvedené významy a Q znamená skupinu -NH₂, skupinu -CONHNH₂, skupinu -NHCONHNH₂, skupinu -NHCSNHNH₂ nebo skupinu -ONH₂, uvede v reakci s molekulovou látky obecného vzorce Tu-(Y)_n, ve kterém Tu má výše uvedený význam a Y znamená aldehydovou skupinu odvozenou od glykoproteinových cukerných zbytků protilátky Tu, v přítomnosti jodistanu kovu alkalických zemin ve vodném pufru při hodnotě pH 4 až 6,5, při teplotě 4 až 40 °C.

Vynález se konečně týká způsobu přípravy výše definovaného konjugátu substituovaného disulfidu s nosičem obecného vzorce

Tu-(Z-Sp-SS-W)_m

ve kterém Tu, Sp, W, m a n mají posledně uvedené významy, Z znamená skupinu -NH-CHr-, skupinu -CONHNHCH₂-, skupinu -NHCONHNHCH₂- nebo skupinu -NHCSNHNHCH₂a Y znamená skupinu -CH₂NHNHCOCH₃ nebo skupinu

-13CZ 293228 B6

CHjNHNHCOCH(NH₂)CH₂

jehož podstata spočívá v tom, že se sloučenina obecného vzorce

Tu-(Z-Sp-SS-W)_m ve kterém Tu, Z, Sp, W, Y, n a m mají posledně uvedené významy, uvede v reakci s acetylhydrazinem nebo tyrosinhydrazinem ve vodném pufru při pH 4 až 6,5 při teplotě 4 až 40 °C za vzniku sloučeniny obecného vzorce

Tu-(Z-Sp-SS-W)_m

-ch₂nhnhcoch(nh₂)CH

ve kterém Tu, Z, Sp, W, n a m mají posledně uvedené významy a Y znamená skupinu -CH=NHHCOCH₃ nebo skupinu

OH t

načež se tato sloučenina uvede v reakci s kyanoborohydridem sodným nebo borohydridem sodným ve vodném pufru při pH 4 až 6,5 při teplotě 4 až 40 °C.

Transformace sloučenin uvedených v tabulkách 1 a 2 na odpovídající disulfidy může být provedena značným počtem organických látek obsahujících thiolovou skupinu za vzniku nových protinádorových a antibakteriálních činidel. Kromě toho mohou být získané produkty dále transformovány zavedením nových bočních řetězců, přičemž se získají další nové sloučeniny, vykazující biologickou účinnost.

Kromě toho, že sloučeniny podle vynálezu mohou být použity jako protinádorová a antibakteriální činidla, jsou tyto sloučeniny také použitelné pro vyhodnocování nových protirakovinných přístupů v celulámí úrovni. Přírodně odvozená antibiotika, popsaná ve výše uvedených patentových přihláškách a patentech, neobsahují dostatečně silné chromofomí jednotky ktomu, aby jejich intracelulámí lokalizace mohla být adekvátně popsána. V případě, že se nativní trithiomethylové deriváty uvedou v reakci se sloučeninami obsahujícími thiolovou skupinu, které navíc obsahují chromofomí jednotku, která absorbuje nebo emituje světlo v oblastech elektromagnetického spektra a není cloněná celulámími chromofory, potom se takto získá vhodný biochemický nástroj pro studium štěpení dvouřetězcové DNA a celulámí lokalizace této třídy sloučenin. Do rozsahu vynálezu spadá i zavedení radioizotopů (radiační značení) do získaných produktů reakcí podle reakčního schématu 1. Tak například, jestliže se E-33 288 gamai-I uvede v reakci se 7-(2-thioethylamino)-4-methylkumarine, získá se derivát, který po ozáření ultrafialovým světle jeví intenzivní fluorescenci, což umožňuje lokalizaci této sloučeniny v buněčném ústrojí.

V tomto provedení vynálezu se sloučeniny uvedené v tabulkách 1 a 2 transformují organickými látkami obsahujícími thiolovou skupinu podle reakčního schématu I na nové sloučeniny, které jsou navíc použitelné jako molekulární sondy, přičemž v obecném vzorci těchto sloučenin Q-Sp-SS-W

- 14CZ 293228 B6

W, R, R_b R₂, R_3j R4, R₅, Ró, R7, Rs, R9, R2', R3', Ró Rs', Ar_b Ar₂ a X mají významy uvedené v tabulkách 1 a 2,

Sp znamená přímou nebo rozvětvenou dvojmocnou skupinu obsahující 1 až 18 uhlíkových atomů, dvojmocnou arylovou nebo heteroarylovou skupinu, dvojmocnou cykloalkyl- nebo heterocykloalkylovou skupinu, dvojmocnou aiyl- nebo heteroarylalkylovou skupinu obsahující laž 18 uhlíkových atomů, dvojmocnou cykloalkyl- nebo heterocykloalkylalkylovou skupinu obsahující 1 až 18 uhlíkových atomů a dvojmocnou nenasycenou alkylovou skupinu obsahující 2 až 18 uhlíkových atomů a

Q znamená nesubstituovaná nebo substituované jádro dibenzooxazinu, rhodaminu, karbostyrilu, kumarinu, fluoresceinu nebo akridinu nebo substituent obsahující jako část své struktury radioizotop ³H, ^l4C, ³⁵S nebo ³²P.

Rovněž bylo zjištěno, že vytěsnění methyltrithio-jednotky sloučenin uvedených v tabulkách 1 a 2, ilustrované reakčním schématem I, může být použito k zavedení distanční jednotky (Sp,spacer), jejíž rozumná volba usnadní zavedení cílených jednotek do struktury disulfidového derivátu podle vynálezu. Zavedení cílených jednotek do jiných disulfidových derivátů je popsáno ve zveřejněné evropské patentové přihlášce 313 873 zvěř. 3.5.1989. Podle reakčního schématu*se takto sloučeniny obecného CH₃SSS-W, kde CH₃SSS-W znamená protinádorové antibiotikum

LL-E 33 288alfai-Br,

LL-E 33 288alfai-I,

LL-E 33 288alfa₂-Br,

LL-E 33 288alfa₂-I,

LL-E 33 288alfa₃-Br,

LL-E 33 288alfa₃-I,

LL-E 33 288alfa4-Br,

LL-E 33 288betai-Br,

LL-E 33 288beta,-I,

LL-E 33 288betar-Br,

LL-E 33 288beta₂-I,

LL-E 33 288gama!-Br,

LL-E 33 288gama]-I,

LL-E 33 288deltai-I, jod- nebo brompseudoaglykony, jejich dihydro- nebo A-acetylové analogy,

BBM-1675,

FR-900 405,

FR-900 406,

PD114 759,

PD115 028,

CL-1577 A,

CL-1577 B,

CL-1577 D,

CL-1577 E,

CL-1724, nebo jejich A-acetylové analogy, nejdříve uvedou v reakci se sloučeninou obecného vzorce Q-Sp-SH za vzniku meziproduktu Q-Sp-SS-W

Φ ve kterém

-15CZ 293228 B6

Sp znamená přímou nebo rozvětvenou dvojmocnou nebo trojmocnou skupinu obsahující 1 až uhlíkových atomů, dvojmocnou nebo trojmocnou arylovou nebo heteroarylovou skupinu, dvojmocnou nebo trojmocnou cykloalkylovou nebo heterocykloalkylovou skupinu obsahující 3 až 18 uhlíkových atomů, dvojmocnou nebo trojmocnou aryl- nebo heteroarylalkylovou skupinu obsahující 1 až 18 uhlíkových atomů, dvojmocnou nebo trojmocnou cykloalkylnebo heterocykloalkylalkylovou skupinu obsahující 1 až 18 uhlíkových atomů nebo dvojmocnou nebo trojmocnou nenasycenou alkylovou skupinu obsahující 2 až 18 uhlíkových atomů, přičemž v případě, že Sp znamená trojmocnou skupinu, potom může být tato skupina navíc substituována aminovou skupinou, alkylaminovou skupinou, arylaminovou skupinou, heteroarylaminovou skupinou, karboxylovou skupinou, nižší alkoxylovou skupinou, hydroxyskupinou, thiolovou skupinou nebo nižší alkylthio-skupinou, s výhradou spočívající v tom, že když CH₃-SSS-W je tvořeno mateřským protinádorovým antibiotikem

LL-E 33 288alfai-Br,

LL-E 33 288alfai-I,

LL-E 33 288alfar-Br,

LL-E 33 288alfa₂-I,

LL-E 33 288alfa₃-Br,

LL-E 33 288alfa₃-I,

LL-E 33 288alfa4-Br,

LL-E 33 288betai-Br,

LL-E 33 288betai-I,

LL-E 33 288beta₂-Br,

LL-E 33 288beta₂-I,

LL-E 33 288gama_t-Br,

LL-E 33 288gamai-I,

LL-E 33 288delta|-I,

BBM-1675,

FR-900 405, FR-900 406, PD 114 759, PR 115 028, CL-1577 A, CL-1577 B, CL-1577 D, CL-1577 E nebo CL-1724, potom Sp nemůže být dvojmocnou skupinou, a

Q znamená nebo může být následně převede na atom halogenu, aminovou skupinu, alkylaminovou skupinu, karboxylovou skupinu, karboxaldehydovou skupinu, hydroxyskupinu, thiolovou skupinu, alfa-halogenacetyloxy-skupinu, nižší alkyldikarboxylovou skupinu, skupinu -CONHNH₂, skupinu -NHCONHNH₂, skupinu -NHCSNHNH₂, skupinu -ONH₂, skupinu -CON₃, nebo skupiny

N^0

-16CZ 293228 B6

a W má význam uvedený v tabulkách 1 a 2.

Pokud produkt z reakčního schématu I obsahuje alespoň jednu funkční skupinu, která může být převedena na cílenou jednotku (Tu, targeting unit) nebo která přímo reaguje s cílenou jednotkou, potom může být cílená forma protinádorových antibiotik z výše uvedených patentů a patentových přihlášek získána způsobem, který je ilustrován následujícím reakčním schématem II:

Tu—(Y)_n

Q-Sp-SS-W-----------------------> Tu-(Z-Sp-SS-W)_m (Y)n-m ve kterém

Q, Sp a W mají výše uvedené významy,

Tu znamená mono- nebo polyklonální protilátku, její fragmenty, její chemicky nebo geneticky manipulované analogy nebo růstové faktory nebo steroidy,

Y znamená boční aminovou skupinu, karboxylovou skupinu nebo thiolovou skupinu proteinu, aldehyd odvozený od uhlohydrátových zbytků nebo amidoalkylthio-skupinu, n znamená celé číslo od 1 do 100,

Z je vytvořen kovalentní reakcí skupin Q a Y přímo nebo po následné redukci a

Z skupinu -CONH-, skupinu -CONHN=CH-, skupinu -CONHNHCH₂-, -NHCONHN=CH~, -NHCONHNHCH₂- skupinu -NHCSNHN=CH-, skupinu -NHCSNHNHCH₂, skupinu -ON=CH-, skupinu -NH-, skupinu -NHCHt-, skupinu -N=CH-, skupinu -CO₂-, skupinu NHCH₂CO₂-, -SS-, skupinu

- 17CZ 293228 B6 a

m znamená 0,1 až 15.

Jako příklad vztahující se kvýše uvedenému reakčnímu schématu II lze uvést, že deriváty kyseliny 3-merkaptopropionové N-acetyl-E-33288gama]-J (Q=CO₂H, Sp= -CH₂CH₂-) v případě, že jsou převedeny na jejich aktivovanou hydroxysukcinimidovou formu (Q = CO₂Su, Sp = —CH₂—CH₂ ^—), mohou být použity k reakci s některou z e-aminových skupin lysinových zbytků (např. Tu = monoklonální protilátka, Y = -NH₂, kde n = 50-100, z dostupných lysinových zbytků) při pH 7,0 až 9,5 ve vodných pufrovaných roztocích při teplotě 4 až 40 °C. přičemž se získají cílené formy antibiotik připojené k nahodilým místům podél základního proteinového řetězce (Tu = monoklonální protilátka, Z =-NHCO-, Sp= -CH₂CH₂-, m = 1 až 10. Tímto způsobem je substituován pouze zlomek dostupných lysinových zbytků, neboť vy soký stupeň substituce není obecně považován za kompatibilní se zachováním protilátkové imunoreaktivity.

Tentýž nahodile substituovaný imunokonjugát může být rovněž připraven z derivátů kyseliny 3-merkaptopropionové za použití dalších činidel aktivujících karboxylovou skupinu, jakými jsou různé karbodiimidy nebo odpovídající acylazidy.

Alternativně 3-merkaptopropionylhydrazidový derivát rV-acetyl-LL-E 33 288 delta]-J (Q = H₂NNHCO-, Sp - -CH₂CH₂-) v případě, že je uveden v reakci s jodistanem oxidovanou protilátkou (Tu = monoklonální protilátka, Y = -CHO, η = 1 až 15), jak je to popsáno v patentu US 4 671 958, při pH 4 až 7 v pufrovaném vodném roztoku při teplotě 4 až 40 °C, reaguje pouze v úrovni aldehydové funkce (odvozené ze štěpení vic-diolů uhlohydrátových zbytků situovaných na Fc části protilátek) za vzniku monoklonálních proti látkových konjugátů, obsahujících účinnou látku substituovanou ve specifických místech podél hlavního řetězce proteinu (Tu= monoklonální protilátka, Z = -CH=NNHCO-, Sp = -CH₂CH₂-, m = 0,5 až 10).

Za účelem blokování nezreagovaných aldehydových skupin na protilátce a tedy i za účelem zabránění zesíťování a stabilizace hydrolyticky labilních vazeb Schiffovy báze je výhodné (i když nikoliv nezbytné) uvést posledně uvedený konjugát v reakci nejdříve se sloučeninou, jakou je acetylhydrazid nebo tyrosinhydratid, a potom podrobit redukci kyanoborohydridem sodným nebo borohydridem sodným za vzniku stabilizovaných konstruktů podle vynálezu (Tu = monoklonální protilátka, Z = -CH₂NHNHCO-, Sp = -CH₂CH₂-, m = 0,5 až 10). Za účelem získání produktů způsobu podle reakčního schématu II se podle vynálezu používají i další skupiny reagující s aldehydem, tvořící součást konstruktu účinné látky. Takovými funkčními skupinami jsou výhodně, i když nikoliv výlučně, skupiny, které reagují s aldehydem za kyselých vodných podmínek. Reaktivita proteinových lysinů je za bazických podmínek natolik vysoká, že jejich aminy soupeří s produkty reakčního schématu II o dostupné aldehydové funkce monoklonální protilátky. Alternativními skupinami reagujícími s aldehydem jsou například semikarbazidové skupiny, thiosemikarbazidové funkce a O-substituované hydroxylaminové funkce.

Vytvoření cílených forem sloučenin uvedených v tabulkách 1 a 2 není omezeno na sekvenci uvedenou v reakčním schématu II. Cílená jednotka (Tu) může být nejdříve modifikována tak, aby obsahovala thiolovou skupinu, načež se uvede v reakci se sloučeninami uvedenými v tabulkách 1 a 2 způsobem uvedeným v následujícím reakčním schématu III:

-18CZ 293228 B6

Tu(Y) + Q-Sp-S-P n

Tu-(Z-Sp-SH) (Y) n-m

CH^-SSS-W

Ψ

Tu-(Z-Sp-SS-W)

I n-m ve kterém Tu, Y, Q, Sp, W, n a m mají výše uvedený význam a P znamená atom vodíku nebo 2-(pyridylthio)-skupinu svýhradou spočívající vtom, že když Y znamená thiol odvozený od aminokyselinového zbytku hlavního řetězce Tu, potom Z-Sp dohromady znamená kovalentní vazbu.

Jako příklad vztahující se k reakčnímu schématu III lze uvést, že monoklonální protilátka může být uvedena v reakci s esterem kyseliny 3-(2-dithiopyridyl)propionové a hydroxysukcinimidu za účelem modifikace proteinu lysinovými zbytky (Tu = monoklonální protilátka, Y = NH₂, n = 50 až 100, Q = -CO₂Su, Sp = -CH₂-CHr-, P = 2—pyridylthio). Následující redukcí, provedenou například dithiothreitolem, se získá meziprodukt (Tu = monoklonální protilátka, Z = -NHCO-, Sp = -CH₂CH₂-, m = 1 až 15), který může být uveden v reakci se sloučeninami z tabulek 1 a 2 za vzniku požadovaných imunokonjugátů.

Obdobně může být 2-iminothiolan uveden v reakci s monoklonální protilátkou za účelem přímého zavedení thiolových skupin na povrch proteinu, aniž by přitom bylo nezbytné provést redukční stupeň (Tu = monoklonální protilátka, Z = -NHCO-, Sp = (CH₂)₃-, m = 1 až 15) a tento meziprodukt může být uveden v reakci se sloučeninami z tabulek 1 a 2.

Alternativně se mohou přímo zúčastnit reakce podle reakčního schématu III sulhydrylové skupiny inherentní ve struktuře monoklonálních protilátek v dimemí formě jako cystinové zbytky. Takové sulhydryly se tradičně podrobují kombinaci enzymatické digesce a redukce nativních monoklonálních protilátek (Tu = Fab-fragment, Z-Sp = vazba, Y = SH), i když je třeba počítat s použitím geneticky modifikovaných konstruktů monoklonálních protilátek obsahujících nepárové cystinové zbytky.

Výhodným provedením cílených derivátů podle vynálezu je konjugát protein-účinná látka obecného vzorce:

Tu-(Z-Sp-SS-W)_m který se připraví ze skupiny protinádorových antibiotik označených jako LL-E 33 288 (CH₃SSS-W) postupem, který zahrnuje:

vytěsnění dithiomethylového zbytku sloučeninou obecného vzorce Q-Sp-SH, ve kterém

-19CZ 293228 B6

Sp znamená přímou nebo rozvětvenou dvojmocnou nebo trojmocnou skupina obsahující 2 až uhlíkových atomů nebo dvojmocnou nebo trojmocnou arylalkylovou nebo heteroarylalkylovou skupinu obsahující 2 až 5 uhlíkových atomů, přičemž v případě, že Sp znamená trojmocnou skupinu, může být tato skupina navíc substituována aminovou skupinou, heteroarylaminovou skupinou, hydroxy-skupinou nebo thiolovou skupinou a

Q znamená karboxylovou skupinu, nižší alkyldikarboxylanhydridovou skupinu, -CO₂Su, -CONHNH₂ nebo skupinu

za vzniku meziproduktu obecného vzorce Q-Sp-SS-W, ve kterém Q, Sp a W mají výše uvedený význam, a reakci uvedeného meziproduktu obecného vzorce Q-Sp-SS-W se sloučeninou obecného vzorce Tu-(Y)_n, ve kterém Tu znamená monoklonální protilátku, která vykazuje preferenční reaktivitu s lidským antigenem sdruženým s nádorem, Y znamená boční aminoskupinu protilátky nebo aldehyd získaný oxidací uhlohydrátové skupiny protilátky a n znamená celé číslo od 1 do 100, za vzniku sloučeniny obecného vzorce

Tu-(Z-Sp-SS-W)_m ve kterém Tu, Y, Sp, W a n mají výše uvedený význam a Zje vytvořeno kovalentní reakcí skupin Q a Y a to přímo nebo po následné redukci a Z znamená skupinu -CONH-, -CONHN=CH-, skupinu -CONHNHCH₂- nebo skupinu

a m znamená 0,1 až 15.

Za účelem příkladné ilustrace cílení methyltrithio-protirakovinných sloučenin je použito množiny odlišných monoklonálních protilátek (MoAb, monoclonal antibodies). Monoklonální protilátky Lym 1 a Lym 2 indikují různé antigeny na zralých B-lymfocytech ajejich produkčních lymfomech. Produkce a charakteristiky těchto monoklonálních protilátek jsou popsaném A. L. Epsteinem a kol. v „Cancer Research“, 47, 830 (1987). Monoklonální protilátky B72.3 jsou cílené převážně na karcinomy prsu a tračníku, i když byla rovněž popsána jejich reaktivita vůči karcinomům slinivky, vaječníkú a plic. Tato monoklonální protilátka byla popsána T. L. Klug-em a kol. v „Int. J. Cancer“, 38, 661 (1986). Monoklonální protilátka CT-M-01, která je cílena převážně na nádory prsu, je popsána v evropské patentové přihlášce 86 401482.4 (podané 3. 7. 1986), zatímco monoklonální protilátka MAC-68 je produkována subklonováním hybridomu, který produkuje monoklonální protilátku CT-M-01, a indikuje jak karcinomy prsu, tak i karcinomy tračníku.

Meziprodukty uvažovaných sloučenin a konjugáty s těmito protilátkami jsou popsané v dále uvedené příkladové části. Je však třeba uvést, že tento patent se neomezuje pouze na výše uvedené protilátky. Popsaná metodika je dostatečně obecná k tomu, aby mohla být použita pro všechny protilátky, a to bez ohledu na jejich třídu nebo izotyp, na jejich enzymaticky odvozené

-20CZ 293228 B6 fragmenty, jejich chemicky manipulované a stabilizované fragmenty, jakož i na jejich respektivní chimérické nebo humanizované analogy.

Ani cílené jednotky (Tu) nejsou omezeny pouze na monoklonální protilátky. Jako cílené jednotky spadají do rozsahu vynálezu i ostatní proteiny, jakož i malé molekuly, pro které na cílovém vstupu existují odpovídající receptory.

Sloučeniny podle vynálezu obecného vzorce Q-Sp-SS-W jsou účinné jako antibakteriální činidla. Jejich antibakteriální účinnost vůči gram-pozitivním a gram-negativním bakteriím může být stanovena standardní agarovou zřeďovací metodou.

Muller-Hintonův agar obsahující vždy dvakrát menší koncentrace antibiotik se rozlije do Petriho misek. Povrch agaru se zaočkuje pomocí Steerova replikačního zařízení 1 až 5 x 10⁴ bakteriálních jedinců tvořících kolonie. Jako minimální inhibiční koncentrace (MIC) pro daný bakteriální kmen se zaznamená nejnižší koncentrace testované sloučeniny, která inhibuje růst bakteriálního kmene po asi 18 hodinách inkubace při teplotě přibližně 36 °C.

Výše popsané disufidové sloučeniny jsou účinnými protinádorovými činidly.

Pro testování sloučenin za účelem stanovení jejich způsobilosti ve funkci antineoplastických činidel byly ústavem National Cancer Institute vyvinuty některé testovací systémy in vivo. Tyto testovací systémy byly popsány v „Cancer Chemotherapy Reports“, část III, sv. 3, č. 2 (1972), Geran a kol.. Tyto testovací systémy byly kodifikovány jako standardní screenové testy, které mají být obecně používané v oblasti testování protinádorových činidel. Pro sloučeniny podle vynálezu jsou z těchto testů významné následující testy: lymfocytová leukemie P388, melanotický melanom B16, leukémie L1210 a adenokarcinom 26 tračníku. Tyto neoplasmy jsou použity pro testování ve formě transplantovatelných nádorů u myší. Výrazná protinádorová účinnost, prokázaná při těchto testech procentickým zvýšením střední doby přežití ošetřených pokusných zvířat (T) oproti kontrolním pokusným zvířatům, je ukazatelem obdobných výsledků dosažitelných v případě lidské leukémie a lidských tuhých nádorů.

Test na lymfocytní leukémie P 388

Použitými pokusnými zvířaty jsou myší samičky BDF], V každé testovací skupině je pět nebo šest myší. Nádorový transplantát byl aplikován intraperitoneální injekcí 0,5 ml zředěné ascitní tekutiny obsahující 1 x 10⁶ buněk lymfocitní leukemie P388. Tato aplikace byla provedena v den nula. Testované sloučeniny se podávají intraperitoneálně v 0,5 ml sterilního, apyrogenního fyziologického roztoku v den 1, 5 a 9 (vzhledem k inokulaci nádoru) v uvedených dávkách. Myši byly zváženy a počet přeživších myší byl zaznamenán ke 30 dnům. Z výsledků se vypočte střední doba přežití a poměr doby přežití ošetřených myší (T) a kontrolních myší (C). Hodnoty T/C vyšší nebo rovné 125 jsou považovány za hodnoty svědčící o významné protinádorové účinnosti. Získané výsledky jsou uvedeny v následující tabulce 3.

-21 CZ 293228 B6

Tabulka 3

Test na lymfocytní leukémii P388

Sloučenina	Dávka (mg/kg)	Střední doba přežití (dny)	T/CxlOO (%)
Kyselina 3-
-merkapto-propionová-	0,005		145
disulfid-LL-E 33 288-	0,0025		125
-gamai-I (z příkladu 1)
4-Nitrofenylester kyše-	0,010		135
liny 3-merkapto-propio-	0,005		185
nové, disulfid-LL-E 33 288-	0,0025		150
-gamai-I (z příkladu 2)	0,00125		130
3-Merkaptopropionyl-	0,005	18,0	164
hydraziddisulfíd-	0,0025	25,0	186
-LL-E 33 288gamai-I	0,00125	19,0	173
(z příkladu 4)	0,0006	15,5	141
Kontrolní pokus	—	11,0	_
3-Merkaptopropionyl-	0,040	15,0	136
hydraziddisulfíd-	0,020		123
-LL-E 33 288alfa3-I
(z příkladu 6)
Kontrolní pokus	—	11,0	—
3-Merkaptopropionyl-	0,080	21,0	175
hydraziddisulfíd-N-ace-	0,040	18,0	150
tyl-LL-E 33 288gamai-I	0,020	15,0	125
(z příkladu 7)
Kontrolní pokus	—	12,0
3-Merkaptopropionyl-	0,010	26,5	230
hydraziddisulfíd-	0,005	21,0	183
-LL-E 33 288alfa2-I (z př. 8)	0,0025	18,5	161
	0,00125	18,5	161
Kontrolní pokus	-	11,5	-
3-Merkaptobutyryl-	0,005	28,5	190
hydraziddisulfíd-	0,0025	23,0	153
-LL-E 33 288gamai-I	0,00125	21,0	140
(z příkladu 10)	0,0006	19,5	130
Kontrolní pokus	—	15,0	—
3-Merkaptoizovaleryl-	0,010	26,5	252
hydraziddisulfíd-	0,005	18,0	171
-LL-E 33 288gamai-I	0,0025	17,0	162
(z příkladu 11)	0,00125	16,0	152
	0,0006	13,0	124
	0,0003	14,0	133
Kontrolní pokus	—	10,5	—

-22CZ 293228 B6

Tabulka 3 - pokračování

Test na lymfocytní leukémii P388

Sloučenina	Dávka (mg/kg)	Střední doba přežití (dny)	T/CxlOO (%)
4-Merkaptodihydrocin-	0,005	24,0	200
namylhydraziddisulfid-	0,0025	28,0	233
-LL-E 33 288gamai~I	0,00125	25,5	213
(z příkladu 12)	0,006	18,5	154
	0,003	17,5	146
Kontrolní pokus		12,0	—
jV-Acetyl-3-merkaptovale-	0,32		118
rylhydraziddisulfid-	0,16		205
-LL-E 33 288gamai-I	0,08		166
(z příkladu 13)	0,04		133
	0,02		117
A-Acetyl-3-merkaptobuty-	0,32		142
rylhydraziddisulfid-LL-	0,16		135
-E 33 288gamai-I	0,08		115
(z příkladu 14)	0,04		102
	0,02		109
TV-Acetyl-p-merkaptodi-	0,32		75
hydrocinnamoylhydrazid-	0,16		150
disulfid-LL-E 33 288gamai-	0,08		209
I (z příkladu 15)	0,04		150
	0,02		146

Test na melanotický melanom B16

Jako pokusná zvířata se při tomto testu používají myší samičky BDF1. V každé testovací skupině je 5 nebo 6 pokusných zvířat. Jednogramové množství nádoru (melanotický melanom B16) se homogenizuje v 10 ml chladného vyváženého fyziologického roztoku a 0,5 ml elikvot takto získaného homogenizátu se intraperitoneálně implantuje každé z pokusných myší. Testované sloučeniny se podávají intraperitoneálně ve dnech 1 až 9 vzhledem ke dnu 0, kdy byl implantován nádor) v uvedených dávkách. Myší se zváží a zaznamená se počet přeživších myší k 60 dnům. Z těchto údajů se vypočte poměr doby přežití ošetřených myší (T) k době přežití kontrolních myší (C). Jestliže se stanoví hodnota T/C vyšší nebo rovná 125 pro některou sloučeninu, potom je tato testovaná sloučenina považována za účinnou látku s významnou protinádorovou účinností.

Způsob podle vynálezu, použitý pro přípravu konjugátů na bázi monoklonální protilátky ze sloučenin uvedených v tabulkách 1 a 2 obecného vzorce

poskytuje konstrukty, které si zachovávají dobrou imunoreaktivitu s cílovými buněčnými řadami, což je prokázáno následujícími testy in vitro.

-23CZ 293228 B6

Cílové buňky

Všechny cílové buňky byly přechovávány v prostředí RPMI 1640 obohaceném fetálním telecím sérem (FCS), ITS (Collaborative Research, Cat 40351), streptomycinem (50 pg/ml), penicilinem (50 jedn./ml), gentamycinsulfátem (50 pg/ml) a glutaminem (0,03 %). Buňky se přechovávají ve zvlhčovaném inkubátoru (5 % CO₂) při teplotě 37 °C.

I. Imunoreakční testy

Metoda I - Elisa

Příslušné cílové buňky se izolují z kultivačního prostředí, spočítají a suspendují v Dulbeccově fosfátem pufrovaném fyziologickém roztoku (DPBS) v koncentraci, která je optimální pro testovanou monoklonální protilátku (MoAb). Do každé jamky 96 jamkové polystyrénové sterilní kultivační plotny se zavede 0,1 ml alikvot buněk. Plotny se potom odstřeďují po dobu 5 minut při 1000 otáčkách za minutu, načež se supematanty jednotlivých jamek odstraní vytřepáním. Plotny se potom suší přes noc na vzduchu a mohou být potom skladovány při teplotě 4 °C po dobu 3 měsíců.

Nespecifická vazebná místa se blokují přidáním 200 μΐ 1% želatiny v DPBS do každé jamky a plotna se inkubuje po dobu 1 hodiny při teplotě 37 °C ve zvlhčovaném inkubátoru (všechny následující inkubace se provádí za stejných podmínek). Plotny se potom jednou promyjí 250 μΐ 0,05% Tweenu-20 v DPBS (promývací roztok) za použití automatického promývacího systému Elisa od Dynatech (Ultrawash II).

Vzorky určené k testování se zředí na finální koncentraci 3 pg/ml monoklonální protilátky v 0,1% roztoku želatiny v DPBS. Z každého 3 pg/ml vzorku se připraví dalších šest prahových sériových zředění a každé zředění (každé zředění se použije třikrát) se zavede do příslušných jamek kultivační plotny. Do spodní řady jamek se zavede jako slepý pokus pouze 100 μΐ 0,1% roztoku želatiny. Plotny se potom inkubují po dobu 45 minut, načež se třikrát promyjí. Purifikované kozí antimurinní imunoglobuliny s konjugovanou afinitou k alkalické fosfatáze (Cappel Cat 8611-0231) se zředí v poměru 1:125 v 0,1% roztoku želatiny a do každé jamky plotny se přidá 100 μΐ tohoto zředění. Plotny se inkubují po dobu 45 minut, načež se třikrát promyjí. Potom se do každé jamky přidá 200 μΐ />-nitrofenylfosfátového substrátového roztoku (viz níže). Po 45 minutách při okolní teplotě se reakce zastaví přidáním 50 μΐ 3M roztoku hydroxidu sodného. V automatickém spektrofotometru od firmy Dynatech (EIA Autoreader EL-310) se potom odečte absorbance obsahu každé jamky při vlnové délce 405 nm.

Substrátový diethanolaminový pufr (10%) ml diethanolaminu,

800 ml vody,

0,2 g NaN₃ a

100 mg hexahydrátu chloridu hořečnatého.

Jednotlivé složky se rozpustí za nepřetržitého míchání, načež se k získanému roztoku přidá 1M kyselina chlorovodíková až k dosažení hodnoty pH 9,8. Celkový objem se potom doplní vodou na 1 litr a roztok se sterilizuje filtrací přes filtr 0,2 pm filtr. Tento pufr se skladuje v temnu při teplotě 4 °C. Bezprostředně před použitím se v 10% diethanolaminovém pufru (při okolní teplotě) rozpustí p-nitrofenylfosfát (Sigma, Cat 104-40) k dosažení finální koncentrace 1 mg/ml.

Výpočet hodnot zachované imunoreaktivity z hodnot optické hustoty (OD)

-24CZ 293228 B6

Procentická vazba každého vzorku se vypočte podle následující rovnice:

A-B

--- x 100 = Procentická vazba, C-B ve které

A znamená průměrnou optickou hustotu testovaného vzorku,

B znamená průměrnou optickou hustotu slepého pokusu a

C znamená průměrnou optickou hustotu 3 pg/ml nemanipulované kontrolní monoklonální protilátky.

Procentická vazba se potom vynese na nelogaritmické stupnici semilogaritmického grafu a na logaritmické stupnici se vynese koncentrace monoklonované protilátky. Z tohoto grafu se odvodí hodnota BD₅o (tj. požadovaná dávka protilátka k dosažení 50% vazby) pro každý testovaný vzorek a míra zachování imunoreaktivity se vypočte podle následující rovnice:

BD50 kontrolní monoklonální protilátky ----------------------------------- x 100 = Procentická míra zachované BD50 testovaného vzorku imunoreaktivity.

Metoda 2 - Nepřímé stanovení RIA

Příslušná množství cílových buněk v 0,2 ml 10% FCS-prostředí se zavedou do 4 ml polystyrénových zkumavek. Vzorky určené k testování se zředí na koncentraci 2 pg/ml ekvivalentů monoklonální protilátky v 10% prostředí FCS. Z každého 2 pg/ml vzorku se připraví pět trojnásobných sériových zředění a 0,2 ml každého zředění (každé zředění vždy dvakrát) se zavede do odpovídající zkumavky. Za účelem slepého pokusu se do některých zkumavek zavedou pouze buňky a uvedené prostředí. Buňky se inkubují při teplotě 4°C po dobu jedné hodiny, načež se dvakrát promyjí 2% prostředím FCS (všechna promytí RIA se provádí 3 ml objemy). Do každé zkumavky se potom přidá 0,05 ml ovčího F(ab')2-animurinního imunoglobulinu IgG značeného ^I25J (DuPont, Cat NEX 162-0142) vykazujícího přibližně 500 000 rozpadu za minutu. Buňky se potom inkubují ještě hodinu při teplotě 4 °C, jednou promyjí 2% FCS a dvakrát PBS. Do každé zkumavky se přidá 0,5 ml PBS, buňky se rozvíří, převedou do čistých zkumavek a měří po dobu 1 minuty počítačem Packard Gamma 500.

Procentická vazba se stanoví a vynese do grafu stejně jako v předcházející metodě Elisa s výjimkou spočívající v tom, že optická hustota je nahražena počtem rozpadů za minutu a že C znamená průměrný počet rozpadů 1 pg/ml nemanipulované kontrolní monoklonální protilátky. Procentická míra zachované imunoreaktivity každého vzorku se vypočte stejně jako v předcházejícím případě.

Metoda 3 - přímé stanovení RIA

Příslušná množství cílových buněk v 1 ml 10% prostředí FCS se alikvotně rozdělí do 4 ml polystyrénových testovacích zkumavek, zkumavky se odstředí a supematant se slije. Vzorky určené k testovaní se zředí na koncentraci 200 pg/ml monoklonální protilátky v 10% prostředí FCS. Z každého 200 μβ vzorku se připraví pět dalších pětinásobných sériových zředění a 0,05 ml tohoto zředění se vždy zavede (každé zředění dvakrát) do příslušné zkumavky. Do každé zkumavky se potom přidá 0,05 ml monoklonální protilátky značené radioizotopem ¹²⁵J (¹²⁵JMoAb). Optimální množství se individuálně stanoví pro každou MoAb a šarži. Pozitivní kontrolní vzorky obsahují buňky, prostředí a ^12SJ-MoAb. Vzorky slepého pokusu obsahují nespecifické buňky, prostředí a ¹²⁵J-MoAb. Buňky se inkubují po dobu jedné hodiny při teplotě

-25CZ 293228 B6 °C, jednou promyjí 2% prostředím FCS, dvakrát promyjí PBS, převedou do čistých zkumavek a změří gama-počítačem stejně jako v předcházejícím případě.

Procentická inhibice vazby ¹²⁵J-MoAb každého vzorku se vypočte podle následujícího vzorce:

A-B x 100 = Procentická inhibice vazby ^l25J-MoAb,

C-B ve kterém

A znamená průměrný počet rozpadů za minutu vzorku,

B znamená průměrný počet rozpadů za minutu slepého pokusu a

C znamená průměrný počet rozpadů za minutu pozitivního kontrolního vzorku.

Vynesení výsledků do grafu a výpočet zachované procentické imunoreaktivity se provádí stejně jako v předešlém případě s výjimkou spočívající vtom, že BD₅₀ je nyní BID₅₀ (tj. dávka monoklonální protilátky potřebná k dosažení 50% inhibice vazby ¹²’J-MoAb).

Poznámky:

1) Bezprostředně po přidání každého činidla při stanoveních RIA byly zkumavky vždy intenzivně protřepány.

2) Do každého souboru stanovení byl začleněn vnitřní kontrolní vzorek zahrnující 50 % nemanipulované kontrolní monoklonální protilátky za účelem zjištění, zda každá metoda je kvantitativní v rámci předběžného určení zachování imunoreaktivity konjugátu.

Výsledky uvedených stanovení jsou shrnuty v následující tabulce 4.

Tabulka 4

Imunoreaktivita konjugátu monoklonální protilátky

Preparát	Imunoreaktivita v procentech vztažená na imunoreaktivitu nemodifikované kontrolní monoklonální protilátky (= 100 %) (%)
Nespecifické koniugátv na bázi: 3-merkaptopropionylhydraziddisulfidu sloučeniny LL-E 33 288-alfa3-I (příklad 6) konjugovaného s: Lym 1	78
CT-M-01	81
3-merkaptopropionylhydraziddisulfidu sloučeniny Á-acetyl-LL-E 33 288deltai-1 (příklad 7) konjugovaného s:
Lym 1	82
CT-M-01	100
B72.3	100
3-merkaptopropionylhydraziddisulfidu sloučeniny LL-E 33 288alfa2-I (příklad 8) konjugovaného s: CT-M-01	56

-26CZ 293228 B6

Tabulka 4 - pokračování
Preparát	Imunoreaktivita v procentech vztažená na imunoreaktivitu nemodifikované kontrolní monoklonální protilátky (= 100 %) (%)
3-merkaptopropionylhydraziddisulfidu sloučeniny jod-LL-E 33 288-pseudoaglykonu (příklad 9) konjugovaného s: CT-M-01	50
3-merkaptobutyrylhydraziddisulfidu sloučeniny LL-E 33 288delta!-I (příklad 10) konjugovaného s: Lym-1	73
3-merkaptoizovalerylhydraziddisulfidu sloučeniny LL-E 33 288deltai—I (příklad 11) konjugovaného s: Lym-1	64
p-merkaptodihydrocinnamylhydraziddisulfid sloučeniny LL-E 33 288deltaj—I (příklad 12) konjugovaného s: Lym-1	61

Konjugáty na bázi monoklonální protilátky podle vynálezu jsou účinné jako protirakovinná činidla. Níže popsané testy pro stanovení cytotoxicity in vitro prokazují výraznou preferenci popsaných konstruktů pro cílové buněčné řady ve srovnání s necitovými buněčnými řadami a demonstrují míru využitelnosti cílených forem těchto sloučenin ve srovnání s jejich nedlenými analogy.

Test stanovující cytotoxicitu in vitro

Vzorky určené k testování se zředí na koncentraci 0,2 nebo 0,02 pg/ml mateřské účinné látky (výchozí koncentrace je závislá na buněčné řadě a účinnosti mateřské účinné látky). Z každého původního zředění vzorku se připraví tři nebo čtyři další pětinásobná zředění a 0,2 ml tohoto zředění se vždy dovede do 15 ml sterilní polystyrénové zkumavky. Za účelem stanovení specifičnosti příslušného konjugátu se do každého stanovení zahrne alespoň jeden obdobný konjugát tvořený mateřskou účinnou látkou a nepříslušnou (pro dané buňky nedlenou) monoklonální protilátkou.

10⁵ příslušných cílových buněk v 0,2 ml 10% prostředí FCS se alikvotně rozdělí do zkumavek a protřepe. Kromě toho se provádí stejný test za použití nepříslušných cílových buněk za účelem dalšího potvrzení specifičnosti příslušného konjugátu. Kontrolní vzorky monoklonální protilátky obsahují pouze ekvivalentní množství monoklonální protilátky a pozitivní kontrolní vzorky obsahují pouze 10% prostředí FCS.

Buňky se inkubují při teplotě 37 °C po dobu 7 minut, načež se čtyřikrát promyjí 8 ml 2% prostředí FCS. Do každé zkumavky se přidá 0,1 ml 10% prostředí FCS, zkumavky se protřepou a vždy 0,2 ml obsahu zkumavky se zavede do jamky 96-jamkové sterilní kultivační plotny.

Plotny se potom inkubují po dobu 2 dnů ve zvlhčovaném inkubátoru (5 % CO₂) při teplotě 37 °C. Polovina prostředí se odstraní a nahradí čerstvým prostředím obsahujícím 2 pCi/ml ³-H-thymidinu (DuPont, NEN, Cat.NET-027. V inkubaci se pokračuje po dobu 24 hodin, načež se buňky zmrazí, ponechají opět rozmrazit a izolují z inkubačního prostředí za použití zařízení

-27CZ 293228 B6 pro izolaci buněk PHD (Cambridge Technology, lne.). Každý vzorek se potom proměří v průběhu 1 minuty na kanálu 1 Beckntanova scintilačního počítače LS 5800.

Procentická inhibice růstu se vypočte následujícím způsobem:

Průměrný počet rozpadů za minutu testovaného vzorku -------------------------------------------------- x 100 = Procentický nárůst Průměrný počet rozpadů za minutu kontrolního vzorku

100 - procentický nárůst = procentická inhibice.

Uvedená procentická inhibice se vynese na nelogaritmické stupnici semilogaritmického grafu, zatímco na logaritmické stupnici se vynese koncentrace mateřské účinné látky. Hodnota IC₅o (koncentrace mateřské účinné látky nezbytné k dosažení 50% inhibice) pro každý testovaný vzorek se odvodí z uvedeného grafu a míra zachované cytotoxicity se vypočte z následující rovnice:

IC50 mateřské účinné látky ------------------------x 100 = zachovaná cytotoxicita (%).

IC50 testovaného vzorku

Získané výsledky jsou uvedeny v následující tabulce 5.

Tabulka 5

Cytotoxicita in vitro konjugátů MoAb

	MoAb	Cytotoxicita
Hydrazidový konjugát připravený za použití produktu z příkladu 6 s;	Lym 1 CT-M-01	% LL-E 33 288alfa3-I 500 300
Hydrazidový konjugát připravený za použití produktu z příkladu Ί s:	Lym 1 CT-M-01	% jV-acetyl- -LL-E 33 288delta(-I 400 700
Hydrazidový konjugát připravený za použití produktu z příkladu 8 s:	CT-M-01	% produkt z příkladu 8 -18
Hydrazidový konjugát připravený za použití produktu z příkladu 9 s:	CT-M-01	% produkt z příkladu 9 100
Hydrazidový konjugát připravený za použití produktu z příkladu 10 s:	Lym 1	% produkt z příkladu 10 400
Hydrazidový konjugát připravený za použití produktu z příkladu 11 s:	Lym 1	% produkt z pří- kladu 11 320

-28CZ 293228 B6

Tabulka 5 - pokračování

	MoAb	Cytotoxicita
Hydrazidový konjugát
připravený za použití produktu		% produkt z pří-
z příkladu 12 s:		kladu 12
	Lym 1	560

Za účelem stanovení účinnosti konjugátů podle vynálezu in vivo byl použit následující testový model.

Testy in vivo stanovující protinádorovou účinnost konjugátů účinná látka-monoklonální protilátka byly provedeny za použití lidských nádorových štěpů u athymických (lysých) myší. Buňky Burkittova lymfomu(Raji) a myelomu (HS Sultán) se izolují z kultivačních buněk, načež se subkutánně zaočkují (80 x 10⁶ Raji-buněk nebo 40 x 10⁶ HS Sultan-buněk) pokusným myším. U athymických myší se propagují pevné nádory, karcinomy vaječníků (CA73, Ovcar-3), karcinom prsu (MX-1) a karcinom tračníku (LS174T). Tyto se potom odpreparují, nařežou na fragmenty o velikosti 2 mm³ a subkutánně implantují pokusným myším (5 až 8 fragmentů na každou myš).

Účinné látky, monoklonální protilátky a konjugáty účinná látka-monoklonální protilátka se podávají intraperitoneálně vždy jednou za tři dny celkem ve třech nebo pěti injekcích počínaje 2., 3., 4., 6., 7. nebo 8. den po implantaci nádoru. Měření nádorů (délka a šířka nádoru) se provádí pomocí Fowlerova elektronického posuvného měřítka Ultra CAL II každý sedmý den po dobu 4 až 6 týdnů po implantaci nádoru. Hmota nádoru v miligramech se vypočte z následujícího vzorce:

Délka (mm) x Šířka (mm)

Hmota nádoru (mg) = --------------------2

Pro každou testovou skupinu se vypočte inhibice růstu nádoru v procentech vzhledem ke kontrolní skupině/průměmý počet mg u ošetřených pokusných zvířat (T) dělený průměrným počtem mg u kontrolních zvířat (C) x 100/. Za hodnotu nezbytnou k demonstrování účinnosti je považována hodnota T/C menší nebo rovná 42 % ve skupinách s alespoň 65 % přeživších pokusných zvířat.

Výsledky tohoto testu jsou shrnuty v následující tabulce 6.

Tabulka 6

Test na protinádorovou účinnost in vivo

	Dávka (pg)	Velikost nádoru - (T/C) v % na kontrolní skupinu	S/T
MoAb	Účinná látka
Hydrazid 3-merkaptopropionyldisulfídu LL-E 33 2-88alfa3-I konjugovaný s
Lym 1	28	0,75	1,3	6/6
Samotná LL-E 33 288alfa3-I	-	0,75	365	6/6
samotný hydrazid	-	0,75	330	6/6
samotná MoAb	28	-	68	6/6

-29CZ 293228 B6

Tabulka 6 - pokračování

Dávka (pg) Velikost nádoru S/T

---. ----pp;—rjvr— (T/C) v % na MoAb Ucinna latka , . , , .

_______________________________________________________________kontrolní skupinu_____________ intraperitoneální aplikace proti lidskému Burkittovu lymfomu buněčné řady Ráji TC; tri injekce počínaje sedmý den po implantaci nádoru; uvedená měření se provádí 28. den po implantaci

Hydrazid 3-merkaptopropionyldisulfidu LL-E 33 2-88alfa3-I konjugovaný s CT-M-01	83	2,0	0,02	0/6
samotná LL-E 33 288-alfa3-I	-	2,0	—	0/6
samotná CT-M-01	83	-	75	5/6
vincristine (pozitivní kontrola)	-	20	1,2	5/5
intraperitoneální aplikace proti lidskému nádoru prsu buněčné řady MX01; tři injekce počínaje druhý den po implantaci nádoru; uvedená měření se provádí 35. den po implantaci

Hydrazid N-//(4-methylkumarin-7-yl)amino/acetyl/cysteindisulfídu LL-E 33 288 deltai-I konjugovaný s Lym 1	50	0,22	23 7/7
samotný hydrazid	-	0,22	228 4/7
samotná MoAb Lym 1	50	-	61 7/7
směs hydrazidu plus MoAb Lym 1	50	0,22	56 ΊΠ
intraperitoneální aplikace proti lidskému Burkittovu lymfomu buněčné řady Ráji Tc; tři injekce počínaje sedmý den po implantaci nádoru; uvedená měření se provádí 35. den po implantaci

Hydrazid 3-merkaptopropionyldisulfidu TV-acetyl-LL-E 33 288deltaj-1 konjugovaný s CT-M-01	125	1,0 0	6/6
samotný hydrazid	-	2,0 71	3/6
Směs TV-acetyl-LL-E 33 2-
88deltaj-1 plus MoAb
CT-M-01	125	1,0 5	1/6
A-acetyl-LL-E 33 288deltaj-I	-	1,0 46	2/6
intravenózní aplikace proti lidské rakovině prsu	buněčné řady MX-1; tři injekce počínaje druhý
den po implantaci nádoru; uvedená měření se provádí 42. den po implantaci

Hydrazid 3-merkaptopropionyldisulfídu TV-acetyl-LL-E 33 288deltai—I konjugovaný s Lym 1	37	1,0 11	6/6
samotný hydrazid	-	1,0 517	6/6
samotná A-acetyl-LL-E-
-33 288delta!-I	-	0,5 226	6/6
samotná MoAb Lym 1	37	178	6/6
intravenózní aplikace proti Burkittovu lymfomu buněčné řady Ráji TC; tři	injekce počínaje
7. den po implantaci nádoru; uvedená měření se provádí 35. den po implantaci

-30CZ 293228 B6

Tabulka 6 - pokračování

	Dávka (pg)	Velikost nádoru - (T/C) v % na kontrolní skupinu	S/T
MoAb	Účinná látka
Hydrazid 3-merkaptopropionyldisulfidu A-acetyl-LL-E 33 288deltai—I konjugovaný s B72,3	127	2,7	61	6/6
samotná V-acetyl LL-E- -33 288delta,-I		2,0	32	1/6
samotná B72,3	127	-	125	6/6
vincristin (pozitivní kontrola)		20	23	6/6

intravenózní aplikace proti lidské rakovině tračníku buněčné řady LS174T; tři injekce počínaje osmý den po implantaci nádoru; uvedená měření se provádí 21. den po implantaci

Hydrazid 3-merkaptopropionyldisulfídu V-acetyl-LL-E 33 288deltai-I konju-

govaný s CT-M-01	112	2,7	40	5,6
samotná V-acetyl-LL-E 33 288delta!-I		2,0	32	1/6
vincristin (pozitivní kontrola)	-	20	23	6/6

intravenózní aplikace proti lidskému karcinomu tračníku buněčné řady LS174T; tři injekce počínaje osmý den po implantaci nádoru; uvedená měření se provádí 21, den po implantaci

Hydrazid 3-merkaptopropionyldisulfidu LL-E 33 2-88alfa₂-I konjugovaný s CT-M-01_________________________24___________1,0_____________0,33___________2/6 samotný hydrazid____________________-____________1,0_______________2____________0/6 intravenózní aplikace proti lidské rakovině prsu buněčné řady MX-1; tři injekce počínaje druhý den po implantaci nádoru; uvedená měření se provádí 35. den po implantaci

Přehled obrázků na výkresech

Vynález je blíže ilustrován na připojených výkresech, na kterých

- obr. 1 znázorňuje ultrafialové spektrum protinádorového antibiotika označeného jako TV-acetyl-LL-E 33 288-gamai-I,

- obr. 2. znázorňuje infračervené spektrum protinádorového antibiotika označeného jako V-acetyl-LL-E 33 288-gamai-I,

- obr. 3 znázorňuje protonové nukleární magnetickorezonanční spektrum protinádorového antibiotika označeného jako V-acetyl-LL-E 33 288-gamai-I,

- obr. 4 znázorňuje ¹³C-nukleámí magnetickorezonanční spektrum protinádorového antibiotika označeného jako TV-acetyl-LL-E 33 288-gamai-I,

- obr. 5 znázorňuje ultrafialové spektrum protinádorového antibiotika označeného jako jod-LL-E 33 288-pseudoaglykon,

- obr. 6 znázorňuje infračervené spektrum protinádorového antibiotika označeného jako jod-LL-E 33 288-pseudoaglykon,

-31 CZ 293228 B6

- obr. 7 znázorňuje protonové nukleární magnetickorezonanční spektrum protinádorového antibiotika označeného jako jod-LL-E 33 288-pseudoaglykon a

- obr. 8 znázorňuje ^l3C-nukleámí magnetickorezonanční spektrum protinádorového antibiotika označeného jako jod-LL-E 33 288-pseudoglykon.

V následující části popisu bude vynález blíže objasněn pomocí konkrétních příkladů jeho provedení.

Příklady provedeni vynálezu

Příklad 1

3-Merkaptopropionyldisulfid složky LL-E 33 288gamai-I

K roztoku 90 mg LL-E 33 288gama-I v 90 ml acetonitrilu se přidá 10,6 mg kyseliny 3-merkaptopropionové v 1 ml acetonitrilu. Získaný roztok se důkladně promíchá a potom skladuje při teplotě -20 °C po dobu 6 hodin. Rozpouštědlo se odežene za vakua a zbytek se chromatografuje na sloupci silikagelu za použití elučního činidla tvořeného nejdříve 50 ml methylenchloridu, potom 50 ml 4% methanolu v methylenchloridu a nakonec lOOml 8% methanolu v methylenchloridu. Po odpaření této poslední frakce se získá zbytek, kteiý se vyjme ethylacetátem s malým množstvím acetonu a získaný podíl se po kapkách přidá k přebytku hexanu. Vyloučená sraženina se izoluje a vysuší, přičemž se získá 39 mg požadovaného produktu (hmotové spektrum/ionizace rychlými atomy/: M+H 1394).

Příklad 2 p-Nitrofenyl-3-merkaptopropionyldisulfid složky LL-E 33 288gamai-I

Stupeň A

Příprava p-nitrofenylesteru kyseliny 3-merkaptopropionové

Komerčně dostupná kyselina 3-merkaptopropionová v methylenchloridu obsahujícím katalytické množství koncentrované kyseliny sírové se uvede v reakci s izobutylenem po dobu 20 minut. Roztok se potom extrahuje IN roztokem hydrogenuhličitanu sodného po předcházejícím vysušení methylenchloridového roztoku nad bezvodým síranem hořečnatým. Roztok se potom odpaří k získání bezbarvé mobilní kapaliny, jejíž nukleární magnetickorezonanční spektrum a hmotové spektrum prokazují, že se jedná o terc-butylester kyseliny S-terc-butylmerkaptopropionové.

Alikvotní podíl tohoto esteru se zahřívá na teplotu varu pod zpětným chladičem s 6N kyselinu chlorovodíkovou v dioxanu po dobu 2,5 hodiny. Rozpouštědlo se potom odpaří, přidá se ethylacetát a získaný roztok se extrahuje uhličitanem sodným. Natriumkarbonátový extrakt se potom slučuje s 6N kyselinou chlorovodíkovou až k dosažení pH suspenze 2,0. Tato suspenze se potom extrahuje ethylacetátem, extrakt se vysuší nad bezvodým síranem hořečnatým, zbaví rozpouštědla a tímto způsobem se získá bezbarvá kapalina, jejíž *H-nukleámí magnetickorezonanční spektrum prokazuje společně s hmotovým spektrem, že se jedná o kyselinu Á-Zerc-butylmerkaptopropionovou.

Tato kyselina se potom převede na p-nitrofenylester reakcí s ekvomolámími množstvími p-nitrofenolu a dicyklohexylkarbodiimidu v tetrahydrofuranu po dobu 4 hodin. Dicyklohexylmočovinový vedlejší produkt se odstraní filtrací a filtrát se odpaří na olejové lázni. Získaný

-32CZ 293228 B6 olejovitý produkt se chromatografuje za účelem přečištění na neutrálním silikagelu za použití eluční soustavy tvořené směsí hexanu a methylenchloridu v objemovém poměru 50:50. Čistý p-nitrofenylesterový derivát je nažloutlým pohyblivým olejem.

Volný merkaptan se odmaskuje následujícím postupem. Kyselina S-/-butylmerkaptopropionová ve formě p-nitrofenylesteru se rozpustí v kyselině trifluoroctové a k získanému roztoku se potom přidá mírný molární přebytek (10%) octanu rtuťnatého. Získaná směs se potom míchá po dobu 30 minut, kyselina trifluoroctová se odpaří a zbytek se vyjme dimethylformamidem. Tento roztok se uvede do styku se sirovodíkem po dobu 15 minut, načež se černý simík rtuťnatý odfiltruje a filtrát se odpaří za sníženého tlaku za účelem odstranění až 99 % dimethylformamidu. Získaná světlehnědá mobilní kapalina se přečistí chromatografii na neutrálním silikagelu za použití eluční soustavy tvořené směsí hexanu a methylenchloridu v objemovém poměru 50:50. 'H-nukleámí magnetickorezonanční spektrum ukazuje, že hlavní složka obsahuje malé množství terc-butylmerkapto-derivátu. Analytická vysokotlaká kapalinová chromatografie na dvou tandemově uspořádaných sloupcích Perkin-Elmer Pecosphere Cig (4,6 x 33 mm a 4,6 x 83 mm) za použití eluční soustavy tvořené gradientovým systémem acetonitrilu a 0,lM amoniumacetátového pufru pH 6,5 (kyselina octová) v objemovém poměru 37,5/62,5 až 47,5/52,5 v rozpětí 12 minut ukazuje, že produkt obsahuje 88 % p-nitrofenylesteru kyseliny 3-merkaptopropionové a 10 % méně polárnějšího p-nitrofenylesteru kyseliny S-/-butylmerkaptopropionové. Je zde rovněž přítomné malé množství volnéhop-nitrofenolu.

Stupeň B

Reakce p-nitrofenylesteru kyseliny 3-merkaptopropionové se složkou LL-E 33 288gamai-I

100 mg podíl složky LL-E 33 288gama!-I se rozpustí v 50 ml acetonitrilu. K takto získanému roztoku se přidá roztok 25,7 mg p-nitrofenylesteru kyseliny 3-merkaptopropionové v 1 ml acetonitrilu. Reakce se provádí při teplotě -20 °C po dobu 48 hodin. Dokončení reakce se prokáže vysokotlakou kapalinovou chromatografii. Roztok se odpaří k suchu a zbytek se vyjme až 5 ml ethylacetátu, přičemž se k získání roztoku použije ultrazvuk. Směs se potom zfiltruje a filtrát se potom nakape do 45 ml míchaného hexanu. Rezultující nažloutlý pevný podíl se izoluje a vysuší za sníženého tlaku, přičemž se získá 93 mg p-nitrofenylesteru kyseliny propionové ve formě derivátu se složkou LL-E 33 288gama]-J, což bylo prokázáno ’Η-nukleámím magnetickorezonančním spektrem. Při hmotové spektroskopii (ionizace rychlými atomy) je /M+H/ iont indikován při m/z = 1515.

Retenční doba na reverzní fázi Cjg při HPLC za použití 50% acetonitrilu v 0,lM vodném roztoku octanu amonného: 18 minut (LL-E 33 288deltai-1: 8,0 min, esterový hydrolyzní produkt:

1,5 min).

Příklad 3

7V-Hydroxysukcinimidyl-3-merkaptopropionátdisulfid složky LL-E 33 288gamai-I

K roztoku 5 mg 3-merkaptopropionyldisulfidového analogu složky LL-E 33 288gamai-I z evropské patentové přihlášky v 0,5 ml tetrahydrofuranu se přidá 0,45 mg A-hydroxysukcinimidu v 0,1 ml tetrahydrofuranu a potom 1,8 mg dicyklohexylkarbodiimidu v 0,2 ml tetrahydrofuranu. Reakční směs se potom míchá při okolní teplotě po dobu 4 hodin, načež se reakce ukončí přidáním zbytku hexanu. Pevný podíl se izoluje filtrací a rozpustí v ethylacetátu. Rezultující roztok se promyje třikrát solankou, vysuší nad síranem hořečnatým a odpaří, přičemž se získá mg požadovaného produktu ve formě žlutohnědého prášku, který se použije bez dalšího čištění. Retenční doba na reverzní fázi při HPLC za použití eluční soustavy tvořené 40% acetonitrilem v 0,1% vodném roztoku octanu amonného: 15 minut (výchozí látka: 6,0 minut).

-33CZ 293228 B6

Příklad 4

3-Merkaptopropionylhydraziddisulfíd složky LL-E 33 288 gamami

K 5,4 ml (3 ekv.) bezvodého hydrazinu ve 100 ml tetrahydrofuranu zahřívaného na teplotu varu pod zpětným chladičem se pod atmosférou argonu po kapkách přidá 9,2 ml (83 mmol) methyl-3merkaptopropionátu v 50 ml tetrahydrofuranu v průběhu dvou hodin. Roztok se potom zahřívá na teplotu varu ještě po dobu dvou hodin, odpaří a potom zředí a dvakrát odpaří z 300 ml toluenu. Získaný produkt se potom nanese v 5% ethylacetátu v chloroformu na sloupec silikagelu a eluuje 20% methanolem v chloroformu. Rezultující 3-merkaptopropionylhydrazid je narůžovělým olejem, který při ochlazení tuhne a při okolní teplotě opět taje.

K 50 mg složky LL-E 33 288gamai-J v 50 ml acetonitrílu se při -15 °C přidá 6,6 mg 3-merkaptopropionylhydrazidu v 1 ml tetrahydrofuranu. Přidá se jeden ekvivalent triethylaminu nebo jeden ekvivalent triethylaminu a jeden ekvivalent kyseliny octové. Reakční směs se míchá při teplotě 0 °C po dobu jedné hodiny, načež se rozpouštědlo odpaří. Zbytek se chromatografuje na silikagelu za použití eluční soustavy tvořené 10 až 15% (gradient) methanolu v chloroformu, přičemž se získá 26 mg požadovaného produktu. Hmotové spektrum (ionizace rychlými atomy): m/z = 1408 (M+H); retenční doba na reverzní fázi C_]8 při HPLC: 5 minut (41% acetonitril v 0,lM vodném roztoku octanu amonného.

Příklad 5

2V-//(4—Methylkumarin-7-yl)amino/acetyl/cysteinhydraziddisulfid složky LL-E 33 288gamai~ J.

Směs 1,0 g (5,7 mmol) 4-methyl-7-aminokumarinu, 3,0 ml ethylbromacetátu (5 ekv.), 90 mg (0,1 ekv.) jodidu sodného a 30 ml dimethylformamidu se zahřívá pod atmosférou argonu na teplotu 80 °C po dobu 5 hodin. Reakční směs se potom ochladí, zředí diethyletherem, třikrát promyje 50% solankou, vysuší nad síranem hořečnatým a odpaří k suchu. Surový produkt se rozpustí v chloroformu obsahujícím 1% ethylacetátu a zfiltruje přes sloupec silikagelu. Rekrystalizací z diethyletheru obsahujícího stopy chloroformu se získá čistý ethyl-/V-/(4-methylkumarin-7-yl)amino/acetát.

K 1,96 g (7,5 mmol) výše uvedeného esteru v 15 ml methanolu a 15 ml tetrahydrofuranu se přidá 10 ml IN vodného roztoku hydroxidu sodného. Po 30 minutách se přidají 4 ml 10% vodného roztoku kyseliny chlorovodíkové. Organická rozpouštědla se odpaří a získaný krystalický produkt se odfiltruje a promyje chladným ethanolem a potom etherem. Tento produkt se rozpustí ve 20 ml tetrahydrofuranu a 4 ml dimethylformamidu. Přidá se dicyklohexylkarbonyldiimidazol (1,3 g, 2,2 ekv.) a reakční směs se míchá po dobu 15 minut. Potom se přidají cisteinethylesterhydrochlorid (1,6 g, 2,5 ekv.) a triethylamin (1,2 ml). Po dalších třech hodinách se reakční směs zředí diethyletherem obsahujícím 5 % methylenchloridu a jednou promyje 10% vodným roztokem kyseliny chlorovodíkové a potom dvakrát solankou. Po vysušení nad síranem hořečnatým a odpaření rozpouštědel se surový produkt rekrystalizuje rozpuštěním v chloroformu obsahujícím minimální množství ethanolu a přidáním přebytku etheru. Vyloučené krystaly se odfiltrují a vysuší, přičemž se získá čistý V-//(4-methylkumarin-7-yI)amino/acetyl/cysteinethylester.

Směs 5 ml chloroformu, 20 ml methanolu a 0,4 ml hydrazinhydrátu se zahřívá na teplotu varu pod zpětným chladičem a pod atmosférou argonu. Přidá se 550 mg 7V-//(4-methylkumarin-7-yl)amino/acetyl/cysteinethylesteru. Po 9 hodinovém zahřívání na teplotu varu pod zpětným chladičem se reakční směs ochladí a pevný produkt se odfiltruje a promyje chloroformem a potom ethyletherem. Surový produkt (který obsahuje thiol a disulfid) se rozpustí v dimethyl-34CZ 293228 B6 formamidu obsahujícím dithiothreitol a triethylamin. Po 30 minutách se produkt vysráží přebytkem diethyletheru a izoluje filtrací. Tento materiál se dále přečistí rekrystalizací zodplyněného acetonitrilu obsahujícího dithiothreitol a stopy triethylaminu, přičemž se získá čistý jV-//(4-methylkumarin-7-yl)amino/acetyl/cysteinhydrazid.

K 12 mg LL-E 33 288gamai-I ve 12 ml acetonitrilu se při teplotě 0 °C přidají 4 mg jV-//(4-methylkumarin-7-yl)amino/acetyl/cysteinhydrazidu v 1,2 ml dimethylformamidu. Po celonočním míchání se přidají další 2 mg N-//(4-methy!kumarin-7-yl)amino/acetyl/cysteinhydrazidu v 0,6 ml dimethylformamidu. Reakční směs se míchá po dobu 3 dnů při teplotě 0 °C a zfiltruje. Acetonitril se odpaří a získaný dimethylformamidový roztok se zředí přebytkem směsi hexanu a etheru v objemovém poměru 1:1. Produkt se izoluje filtrací a dále přečistí chromatografií na silikagelu za použití eluční soustav}· s 15 až 20% gradientem methanolu v chloroformu, přičemž se získají 3 mg požadovaného produktu. Retenční doba na reverzní fázi Cj₈ při HPLC:

3,5 minuty za použití 45% acetonitrilu v 0.1M vodném roztoku octanu amonného (LL-E 33 288deltai—J: 15,5 minuty ve stejném elučním systému).

Příklad 6

3-Merkaptopropionylhydraziddisulfidu složky LL-E 33 288alfa₃—I

K 10 mg LL-E 33 288alfa₃-I v 9 ml acetonitrilu se při teplotě -15 °C přidá 6,6 mg 3-merkaptopropionylhydrazidu v 1 ml acetonitrilu. Potom se přidá jeden ekvivalent triethylaminu nebo jeden ekvivalent triethylaminu a jeden ekvivalent kyseliny octové. Reakční směs se míchá při teplotě 0 °C po dobu jedné hodiny, načež se rozpouštědlo odpaří. Zbytek se chromatografuje na silikagelu, přičemž se jako eluční soustava použije 10 až 15% (gradient) methanol v chloroformu. Z odpovídající frakce eluátu se získá požadovaný produkt. Hmotové spektrum (ionizace rychlými atomy): m/g-1251 (M+H), retenční doba na reverzní fázi C]₈ při HPLC: 2,1 minuty za použití eluční soustavy tvořené 45% acetonitrilem v 0,lM vodném roztoku octanu amonného (LL-E 33 288alfa₅-I: 5,7 minuty ve stejné eluční soustavě).

Příklad 7

3-Merkaptopropionylhydraziddisulfid složky A-acetyl-LL-E 33 288gamai-I

K 10 mg A-acetyl-LL-E 33 288gama]-I v 10 ml acetonitrilu se při teplotě -15 °C přidá

1,5 ekvivalentu 3-merkaptopropionylhydrazidu v 85 μΐ acetonitrilu. Potom se přidá jeden ekvivalent triethylaminu. Reakční směs se potom míchá při teplotě 0 °C po dobu dvou hodin, načež se rozpouštědlo odpaří. Zbytek se chromatografuje na silikagelu za použití eluční soustavy tvořené 10 až 15% (gradient) methanolu v chloroformu. Hmotové spektrum (ionizace rychlými atomy): m/z = 1450 (M+H), retenční doba na reverzní fázi C₎₈ při HPLC: 2,5 minuty za použití 50% acetonitrilu v 0,05M vodném roztoku dihydrogenfosforečnanu amonném (A-acetyl-LL-E 33 288gamai-I: 6,6 minuty ve stejné eluční soustavě).

Příklad 8

3-Merkaptopropionylhydraziddisulfid složky LL-E 33 288alfa₂-I

K 10 mg LL-E 33 288alfa₂-I v 10 ml acetonitrilu se při teplotě -15 °C přidá 1,5 ekvivalentu 3-merkaptopropionylhydrazidu v 1 ml acetonitrilu. Potom se přidá jeden ekvivalent triethylaminu. Reakční směs se míchá při teplotě 0 °C po dobu jedné hodiny, načež se rozpouštědlo odpaří. Zbytek se chromatografuje na sloupci silikagelu za použití eluční soustavy tvořené 5 až 15% methanolem v chloroformu (gradient). Zodpovídající frakce eluátu se získá požadovaný

-35CZ 293228 B6 produkt. Hmotové spektrum (ionizace rychlými atomy): m/z = 1248 (M+H), retenční doba na reverzní fázi při HPLC: 2,6 minuty za použití 58% acetonitrilu v 0,05M vodném roztoku dihydrogenfosforečnanu amonného (LL-E 33 288alfa₂-I: 7,5 minuty ve stejné eluční soustavě).

Příklad 9

3-Merkaptopropionylhydraziddisulfid složky jod-LL-E 33 288-pseudoaglykon.

K. 10 mg jod-LL-E 33 288-pseudoaglykonu v 9 ml acetonitrilu se při teplotě -15 °C přidá

1,5 ekvivalentu 3-merkaptopropionylhydrazidu v 1 ml acetonitrilu. Jako katalyzátor se přidá jeden ekvivalent triethylaminu. Reakční směs se potom míchá při teplotě 0 °C po dobu jedné hodiny, načež se rozpouštědlo odpaří. Zbytek se chromatografuje na silikagelu za použití eluční soustavy tvořené 10 až 15% (gradient) methanolem v chloroformu. Z odpovídající frakce eluátu se získá požadovaný produkt. Hmotové spektrum (ionizace rychlými atomy): m/z= 1091 (M+H), retenční doba na reverzní fázi Ci₈ při HPLC: 2,8 minuty za použití 50% acetonitrilu v 0,05M dihydrogenfosforečnanu amonném (jod-LL-E 33 288-pseudoaglykon: 7,9 minuty ve stejné eluční soustavě).

Příklad 10

3-Merkaptobutyrylhydraziddisulfid složky LL-E 33 288gamai~I

K 17,2 g (0,2 mol) kyseliny krotonové se přidá 18 ml (0,26 mol) kyseliny thiooctové. Tato směs se zahřívá na teplotu varu pod zpětným chladičem a pod atmosférou argonu po dobu 6 hodin. Přebytek kyseliny thiooctové se odstraní za sníženého tlaku (vodní vývěva) a rezultující olej se rozpustí ve 100 ml absolutního ethanolu obsahujícího 200 μΐ koncentrované kyseliny sírové. Reakční směs se potom zahřívá na teplotu varu pod zpětným chladičem po dobu 10 hodin, načež se její objem redukuje za podtlaku vodní vývěvy. Přidá se hexan a získaný roztok se postupně promyje dvěma porcemi nasyceného vodného roztoku hydrogenuhličitanu sodného a jednou porcí vody. Tento roztok se potom vysuší nad síranem hořečnatým, zfiltruje a zbaví rozpouštědla, přičemž se získá olejovitý produkt. Tento surový produkt se rozpustí ve 250 ml methanolu obsahujícího 12 ml hydrazinu a získaná směs se zahřívá na teplotu varu pod zpětným chladičem pod atmosférou argonu po dobu 10 hodin. Objem reakční směsi se potom sníží, načež se rychle destiluje v kuličkovém destilačním přístroji a ponechá vykrystalizovat ze směsi chloroformu a hexanu k získání 3-merkaptobutyrylhydrozidu.

K 5 mg LL-E 33 288gama]-I v 5 ml acetonitrilu se při teplotě -15 °C přidá 1,5 ekvivalentu 3-merkaptopropionylhydrazidu v 1 ml acetonitrilu. Přidá se jeden ekvivalent triethylaminu. Reakční směs se míchá při teplotě 0 °C po dobu jedné hodiny a rozpouštědlo se odpaří. Zbytek se chromatografuje na silikagelu za použití eluční soustavy tvořené 10 až 15% methanolem v chloroformu (gradient). Z odpovídající frakce eluátu se získá požadovaný produkt. Hmotové spektrum (ionizace rychlými atomy): m/e - 1422 (M+H), retenční doba na reverzní fázi C_]8 při HPLC: 3,5 minuty za použití 43% acetonitrilu v 0,05M vodném roztoku dihydrogenfosforečnanu amonném (LL-E 33 288gama]-I: 13,4 minuty ve stejné eluční soustavě).

Příklad 11

3-Merkaptoizovalerylhydraziddisulfid složky LL-E EE 288gamai-I

K 10 g (0,1 mol) kyseliny 3,3-dimethylakrylové se přidá 9 ml (0,13 mol) kyseliny thiooctové. Tato směs se potom zahřívá na teplotu varu pod zpětným chladičem a pod atmosférou argonu po dobu 6 hodin. Přebytek kyseliny thiooctové se odstraní za podtlaku vodní vývěvy a rezultující

-36CZ 293228 B6 olej se rozpustí v absolutním ethanolu obsahujícím 200 μΐ koncentrované kyseliny sírové. Tato reakční směs se zahřívá na teplotu varu pod zpětným chladičem po dobu 34 hodin, načež se přidá 16 ml hydrazinu. Rezultující směs se zahřívá na teplotu varu pod zpětným chladičem a pod atmosférou argonu po dobu 24 hodin. Objem reakční směsi se redukuje a zbytek se rozpustí ve směsi solanky a nasyceného vodného roztoku hydrogenuhličitanu sodného. Produkt se extrahuje několika objemy chloroformu. Sloučené chloroformové frakce se vysuší nad síranem hořečnatým, zfiltrují a zbaví rozpouštědla, přičemž se získá olejovitý produkt. Tento olej se přečistí mžikovou chromatografii za použití gradientu methanolu v chloroformu jako eluční soustavy a potom rekrystalizací ze směsi chloroformu a hexanu, přičemž se získá 3-merkaptoizovalerylhydrazid.

K 15 mg LL-E 33 288gamai-I v 5 ml acetonitrilu se při teplotě -15 °C přidá 1,5 ekvivalentu 3-merkaptoizovalerylhydrazidu ve 100 μΐ acetonitrilu. Jako katalyzátor se přidá jeden ekvivalent triethylaminu. Reakční směs se potom míchá při okolní teplotě po dobu 3 hodin, načež se odpaří rozpouštědlo. Zbytek se chromatografuje na silikagelu za použití eluční soustavy tvořené 10 až 15% methanolem v chloroformu (gradient), přičemž se z příslušné frakce eluátu získá požadovaný produkt. Hmotové spektrum (ionizace rychlými atomy): m/z = 1436 (M+H), retenční doba na reverzní fázi Cu při HPLC: 3,9 minuty za použití 43% acetonitrilu v 0,05M vodném roztoku dihydrogenfosforečnanu amonného (LL-E 33 288gamai-I: 13,4 minuty ve stejné eluční soustavě).

Příklad 12 p-Merkaptodihydrocinnamoylhydraziddisulfid složky LL-E 33 288gamai-I

K 500 mg (2,75 mmol) kyseliny /2-merkaptodihydroskořicové se přidá 15 ml methanolu obsahujícího jednu kapku koncentrované kyseliny sírové. Reakční směs se zahřívá na teplotu varu od zpětným chladičem po dobu 5 hodin, načež se ochladí na okolní teplotu. Přidá se hydrazin (1,5 ml) a získaná směs se zahřívá na teplotu varu pod zpětným chladičem a pod atmosférou argonu po dobu 2 hodin, načež se potom míchá při okolní teplotě po dobu 10 hodin. Za účelem redukce veškerých disulfidů přítomných v reakční směsi se přidá 200 mg dithiothreitolu a reakční směs se ochladí na teplotu -15 °C. Získané krystaly se odfiltrují, promyjí směsí etheru a methanolu, načež se vysuší ve vakuové sušárně 50 °C, 10 hodin), přičemž se získá p-merkaptodihydrocinnamoylhydrazid.

K 25 mg LL-E 33 288gama]-I ve 25 ml acetonitrilu se při teplotě -15 °C přidá 1,5 ekvivalentu /j-merkaptodihydrocinnamoylhydrazidu v 1 ml acetonitrilu. Reakční směs se míchá při teplotě 0 °C po dobu 10 hodin, načež se odpaří rozpouštědlo. Zbytek se chromatografuje na silikagelu za použití eluční soustavy tvořené 10 až 15% (gradient) methanolu v chloroformu, načež se z odpovídající frakce eluátu získá požadovaný produkt. Hmotové spektrum (ionizace rychlými atomy): m/z = 1484 (M+H), retenční doba na reverzní fázi C₎₈ při HPLC: 5,4 minuty za použití 43% acetonitrilu v 0,05M vodném roztoku dihydrogenfosforečnanu amonného (LL-E 33 288gamai-I: 13,4 minuty ve stejné eluční soustavě).

Příklad 13

3-Merkaptoizovalerylhydraziddisulfid složky N-acetyl-LL-E 33 288gamai-I

K 20 mg TV-acetyl-E 33 288gama|-I v 15 ml acetonitrilu se při teplotě -15 °C přidají 3 ekvivalenty 3-merkaptoizovalerylhydrazidu v 6,2 ml acetonitrilu. Přidá se jeden ekvivalent triethylaminu. Reakční směs se míchá při okolní teplotě po dobu dvou hodin, načež se rozpouštědlo odpaří. Zbytek se chromatografuje na silikagelu za použití eluční soustavy tvořené 10 až 15% (gradient) methanolu v chloroformu, načež se zodpovídající frakce eluátu

-37CZ 293228 B6 získá požadovaný produkt. Retenční doba na reverzní fázi Cu při HPLC: 2,5 minuty za použití 50% acetonitrilu v 0,05M vodném roztoku dihydrogenfosforečnanu amonného (A-acetyl-LL-E 33 288gamai-I: 6,6 minuty ve stejné eluční soustavě).

Příklad 14

3-Merkaptobutyrylhydraziddisulfid složky A-acetyl-LL-E 33 288gamai-I

K 10 mg A-acetyl-LL-E 33 288gama]-I v 7,5 ml acetonitrilu se při teplotě -15 °C přidají 3 ekvivalenty 3-merkaptobutyrylhydrazidu v 5 ml acetonitrilu. Přidá se jeden ekvivalent triethylaminu. Reakční směs se míchá při okolní teplotě po dobu 10 hodin, načež se odpaří rozpouštědlo. Zbytek se chromatografuje na silikagelu za použití eluční soustavy tvořené 10 až 15% (gradient) methanolu v chloroformu, přičemž se získá požadovaný produkt. Retenční doba na reverzní fázi Cig při HPLC: 7,3 minuty za použití 43% acetonitrilu v 0,05M vodném roztoku dihydrogenfosforečnanu amonného (A-acetyl-LL-E 33 288gama]-I: 5,6 minuty ve stejné eluční soustavě.

Příklad 15 p-Merkaptodihydrocinnamoylhydraziddisulfidu složky A-acetyl-LL-E 33 288gamai-I

K 10 mg A-acetyl-LL-E 33 288gamai-I v 7,5 ml acetonitrilu se při teplotě -15 °C přidají 3 ekvivalenty p-merkaptodihydrocinnamoylhydrazidu ve 2 ml acetonitrilu. Přidá se jeden ekvivalent triethylaminu. Reakční směs se míchá při okolní teplotě po dobu 2 hodin, načež se odpaří rozpouštědlo. Zbytek se chromatografuje na silikagelu za použití eluční soustavy tvořené 10 až 15% methanolem v chloroformu (gradient), načež se zodpovídající frakce eluátu získá požadovaný produkt. Retenční doba na reverzní fázi C_]8 při HPLC: 7,3 minuty za použití 43% acetonitrilu v 0,05M vodném roztoku dihydrogenfosforečnanu amonného (A-acetyl-LL-E 33 288gamai-I: 5,6 minuty ve stejné eluční soustavě).

Příklad 16

Nespecifická konjugace s proteiny

Hydroxysukcinimidester popsaný v příkladu 3 se kovalentně připojí k protilátkám za mírně alkalických podmínek. V následující části popisu bude uveden obecný postup, který byl použit pro přípravu konjugátu s protilátkami uvedených v tabulce 7. Protilátka s koncentrací 3 až 5 mg/ml fosfátového pufru obsahujícího 0,1 M chloridu sodného, pH 7,5, se uvede v reakci s 5 až 20-násobným molámím přebytkem produktu z příkladu 3. Tato reakce se provádí za míchání, při okolní teplotě a po dobu 1 až 4 hodin. Konjugovaný protein se potom chromatograficky odsolí a agregovaný protein se oddělí od monomemího materiálu gelovou filtrací HPLC. Monomemí frakce se sloučí a zahustí.

Tabulka 7

Nespecifické konjugáty připravené za použití produktu z příkladu 3

MoAb	Obsah účinné látky (M/M)
Lym 1	5,2
B72,3	6,0
B72,3	2,9

-38CZ 293228 B6

Příklad 17

Příprava lokálně specifického konjugátu

Obecný postup pro připojení hydrazidových derivátů účinných látek k oxidovaným protilátkám je popsán T. J. McKeamem a kol. v patentu US 4 671 958. Tento postup byl použit pro přípravu konjugátů protilátek odvozených od produktů z příkladu 4 až 15, přičemž byly zavedeny níže popsané specifické modifikace. Produkty těchto reakcí a jejich vlastnosti jsou shrnuty v dále zařazené tabulce 7.

A) Oxidace protilátky

Protilátka s koncentrací 5 až 10 mg/ml se přes noc dialyzuje proti 200 násobnému objemu 50mM natriumacetátového pufru, pH 5,5 obsahujícího 0,1 M chloridu sodného (pufr A). Po dialýze se MoAb oxiduje 15mM až 200mM kyselinou jodistou v 0,2M octanu sodném. Oxidační reakce se provádí za nepřístupu světla, za míchání při teplotě 4 °C po dobu 45 minut, načež se oxidovaná protilátka MoAb odsolí na alespoň pětinásobném objemu Sephadexu G-25. Stupeň oxidace protilátky se stanoví reakcí s p-nitrofenylhydrazinem a srovnáním absorbance proteinu při 280 mm a/j-nitrofenylhydrazinu při 395 mm.

B) Konjugace s hydrazidem účinné látky

Oxidovaná protilátka MoAb se uvede v reakci s 10 až 200-násobným molámím přebytkem hydrazidu účinné látky. Hydrazidy byly rozpuštěny v dimethylformamidu a získané roztoky byly přidány k vodnému roztoku protilátky MoAb. Za účelem zabránění precipitace MoAb, nepřesahuje finální objem přidaného dimethylformamidu 10 % z celkového reakčního objemu. Reakce se provádí za míchání po dobu 3 hodin při okolní teplotě. Za účelem zabránění zesíťování nezreagovaných aldehydů a následné agregaci se jako blokační činidlo přidá tři hodiny po přídavku hydrazidu účinné látky 100 násobný molámí přebytek acetylhydrazidu. Za účelem stabilizace vazby typu Schiffovy báze mezi aldehydem a hydrazidem účinné látky (hydrazon) se produkt obvykle redukuje na alkylhydrazin přidáním 1 OmM kyanborohydridu sodného. Reakce probíhá po dobu jedné hodiny (celková doba konjugace: 4 hodiny). Získaný konjugát se chromatograficky odsolí a potom důkladně dialyzuje (minimálně 48 hodin) do fosfátového pufru za účelem skladování a testování.

Tyto konjugáty se potom analyzují na přítomnost agregátů gelovou filtrací HPLC a na přítomnost volné účinné látky HPLC s reverzní fází. Obsah účinné látky v konjugátu se stanoví spektroskopicky za použití extinkčních koeficientů protilátky a účinné látky, čímž se stanoví molámí koncentrace protilátky v konjugátu.

Získané výsledky jsou uvedené v následující tabulce 7.

-39CZ 293228 B6

Tabulka 7

MoAb	Příprava	Obsah účinné látky (M/M)
Hydrazidové konjugáty připravené z produktu z příkladu 4
CTM-01	1	3,1
	2	2,3
	o	2,9
MAC-68	1	1,7

3,1

2,4

Hydrazidové konjugáty připravené z produktu z příkladu 5

Lym	1	0,15
	2	0,76
	n	3,2
Hydrazidové konjugáty připravené z produktu z příkladu 6
Lym 1		3,0
CT-M-01	1	2,4
	2	2,9

Hydrazidové konjugáty připravené z produktu z příkladu 7

Lym 1		2,8
Lym 2		1,4
B72.3	1	2,1
	2	2,4
CT-M-01	1	1,6
	2	3,6
	3	2,5
	4	2,4

Hydrazidové konjugáty připravené z produktu z příkladu 8__________

CT-M-01 4,8

Hydrazidové konjugáty připravené z produktu z příkladu 9_________

CT-M-01 3,0

Hydrazidové konjugáty připravené z produktu z příkladu 10

Lym 1	3,7
Hydrazidové konjugáty připravené z produktu z příkladu 11
Lym 1	6,2
Hydrazidové konjugáty připravené z produktu z příkladu 12
Lym 1	3,5

Claims (1)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Substituovaný disulfid obecného vzorce Q-Sp-SS-W, odvozený od sloučenin CH₃SSS-W, označovaných jako LL-E 33 288alfai-1, LL-E 33 288-alfa2-BR, LL-E 33 288alfa₃-1, LL-E 33 288alfa₃-Br, LL-E 33 288alfa₃-I, LL-E 33 288alfa₄-Br, LL-E 33 288beta,-Br, LL-E 33 288beta]-I, LL-E 33 288beta₂-Br, LL-E 33 288beta₂-I, LL-E 33 288gamai-Br, LL-E 33 288gamai-I a LL-E 33 288deltai—I, od jejich jod- nebo brom-pseudoglykonů a jejich dihydro- nebo A-acyl-homologů, od látek BBM-1 675, FR-900 405 a FR-900 406 a od antibiotik PD 114 759, PD 115 028, CL-1577 A, CL-1577 B, CL-1577 D, CL-1577 E a CL-1724 nebo jejich TV-acetylhomologů, přičemž v uvedeném obecném vzorci