SK284270B6 - Substituovaný disulfid, jeho konjugát s nosičom a spôsoby prípravy tohto disulfidu a konjugátu - Google Patents

Abstract

Zlúčeniny všeobecného vzorca Q-Sp-SS-W, v ktorom Q, Sp a W majú špecifické významy, a ich konjugáty s nosičom všeobecného vzorca (Y)n-m-Tu-(Z-Sp-SS-W)m, v ktorom jednotlivé symboly majú špecifické významy, spôsoby prípravy substituovaných disulfidov a ich konjugátov s nosičom. Uvedené látky sú disulfidové analógy protinádorových a antibakteriálnych účinných látok, ktoré sú známe pod spoločným označením LL-E33288.ŕ

Description

Vynález sa týka disulfidových zlúčenín zložiek α·, a₂, a₃, ^α4, β i, β₂, Y, δ a pseudoglykónových zložiek komplexu LL-33288 a ich derivátov, ako aj disulfidových zložiek antibiotík BBM-1675, FR-900405, FR-900406, PD114759, PD115028, CL-1577A, CL-1577B, CL-1577D, CL-1577E a CL-1724 a ich derivátov, pripravených reakciou antibiotika s nesubstituovaným alebo substituovaným alkylmerkaptánom. Tieto disulfidové zlúčeniny sú účinné protinádorové látky.

Vynález sa rovnako týka konjugátov účinnej látky s nosičom uvedených disulfidových analógov, pripravených z uvedených látok. Nosičovou časťou konjugátu je mono- alebo polyklonálna protilátka, jej fragmenty, chemicky alebo geneticky manipulované homológy alebo rastové faktory alebo steroidy. Vynález sa rovnako týka spôsobov prípravy uvedených substituovaných disulfídov a uvedených konjugátov.

Doterajší stav techniky

Skupina antibakteriálno a protinádorovo účinných látok, známa pod spoločným označením komplex LL-E33288, je opísaná v európskej patentovej prihláške 0182152A3. Táto skupina látok sa používa na prípravu disulfidových protinádorovo účinných látok, pričom niektoré z nich sú východiskovými látkami pre nosičové formy protinádorových látok podľa vynálezu. Európska patentová prihláška 0182152A3 opisuje komplex LL-E33288 a jeho zložky, najmä LL-E33288a!-Br, LL-E33288a_rI, LL-E33288a₂-Br, LL-E33288(X₂-I, LL-E33288a₃-Br, LL-E33288a₃-I, LL-E33288a₄-Br, LL-E33288p_rBr, LL-Ε33288β₁-Ι, LL-E33288p₂-Br, LL-E332883₂-I, LL-E33288y_rBr, LL-E3 3288y_rI, LL-E33288Ô,-I, ako aj spôsoby ich prípravy aerobnou fermentáciou s použitím nového kmeňa Micromonospora echinospora ssp. calichensis alebo jeho prirodzených, alebo odvodených mutantov. Uvedená európska patentová prihláška rovnako uvádza navrhnuté štruktúry pre niektoré z uvedených zložiek. Tieto navrhnuté štruktúry sú uvedené v nasledujúcej tabuľke 1.

Tabuľka 1

Navrhnuté štruktúry pre látky CH₃-SSS-W izolované z prírodných

OR,

OCH,

Ar, ·

Označenie	Ri	r2	Rs	R4	r5	Rfi	r7	X
E33288a2’	Ar]	Rľ	H	H	c2h5			I
E33288a3'	ΑΓ1	H	H	Rľ				I
Ε33288β1’	Arl	Rľ	H	Rľ	(CH3)2CH			I
Ε33288γι'	Ari	Rľ	H	Rľ	c2h5			I
Ε332886δ,’	Ari	Rľ	H	R4'	ch3			I
Ε33288β!ΒΓ	Ari	Rľ	H	Rľ	(CH3)2CH			Br
Ε33288γι ΒΓ	Ar|	Rľ	H	Rľ	c2h5			Br
Ε33288α2 ΒΓ	Ar]	Rľ	H	H	c2h5			Br
Ε33288α3 ΒΓ	Arl	H	H	Rľ				Br
Esperamicin Α|	ch3	Rľ	Rľ		(CH3)2CH	H	Ar2
Esperamicin Α2	ch3	Rľ	Rľ		(ch3)2ch	Ar2	H
Esperamicin Alb	ch3	Rľ	Rľ		ch3ch2	H	Ar2

Ďalšie zložky komplexu LL-E33288 sú opísané v európskej patentovej prihláške 027485A2. Rovnako tieto zložky sú vhodné na prípravu disulfidových derivátov a nosičových foriem protinádorovo účinných látok podľa vynálezu. Uvedená patentová prihláška opisuje LL-E33288bróm a jód-pseudoglykóny radu, ktorý bol pripravený chemickou cestou. Táto prihláška rovnako opisuje dihydrode riváty, ktoré je možné pripraviť zo všetkých uvedených protinádorovo účinných antibiotík redukciou ketoskupiny na uhlíku Cn na hydroxylovú skupinu s použitím borohydridu sodného. Štruktúry navrhnuté pre tieto zložky sú uvedené v ďalej zaradenej tabuľke 2. Ďalšie zložky skupiny protinádorových antibiotík LL-E33288 sú opísané v patente US 5 079 233. Rovnako tieto zložky sú vhodné na prípravu nosičových foriem protinádorových látok podľa vynálezu. Táto prihláška opisuje N-acylderiváty niektorých zložiek komplexu LL-E33288, ktoré boli pripravené chemickou cestou. Rovnako navrhnuté štruktúry týchto derivátov sú uvedené v nasledujúcej tabuľke 2.

Tabuľka 2

Navrhnuté štruktúry pre látky CH₃-SSS-W navrhnuté chemickou cestou od zlúčenín z tabuľky 1 (všeobecným substituentom W je zvyšok pripojený ku skupine CHj-SSS-)

Tabuľka 2 (pokračovanie)

Označenie	R|	r2	r3	R4	Rs	Rľ	Rý R7	Rs	Rq	X
Dihydro LL-E33288a2'	A-ri	Rľ	H	H	c2h5	H		OH	H	I
N-Acyl LL-E33288a2'	Arj	Rľ	H	H	c2h5	RCO			=0	I
Dihydro LL-E33288a3'	Ari	H	H	Rľ				OH	H	I
Dihydro LL-E332883i'	Är!	Rľ	H	Rľ	(CH3)2CH	H		OH	H	I
N-Acyl LL-E33288P,·	Ari	Rľ	H	Rľ	(CH3)2CH	RCO			=0	I
Dihydro LL-E33288y!'	Arj	Rľ	H	Rľ	c2h5	H		OH	H	I
N-Acyl LL-E33288yľ	Ar,	Rľ	H	Rľ	c2h5	RCO			=0	I
Dihydro LL-E332888,'	Ar(	r2'	H	Rľ	ch3	H		OH	H	I
N-Acyl LL-E3328881·	Ar,	Rľ	H	Rľ	ch3	RCO			=O	I
lodo LL-E33288	Αη	H	H	H					=0	I
pseudoaglycone										I
Dihydro-lodo LL-E33288	Ar,	H	H	H				OH	H	I
pseudoaglycone
Dihydro ΙΧ-Ε33288β,ΒΓ	Ar,	Rľ	H	Rľ	(CH3)2CH	H		OH	H	Br
N-Acyl LL-E33288P,Br	Αη	Rľ	H	Rľ	(CHj)2CH	RCO			=0	Br
Dihydro LL-E33288y1 Br	Ar!	Rľ	H	Rľ	c2h5	H		OH	H	Br
N-Acyl LL-E332887!Br	Ar,	Rľ	H	Rľ	c2h5	RCO			=0	Br
Dihydro LL-E33288a2 Br	Αη	Rľ	H	H	c2h5	H		OH	H	Br
N-Acyl LL-E33288ct2 Br	Αη	Rľ	H	H	c2h5	RCO			=0	Br
Dihydro-E33288a1 Br	Αη	H	H	Rľ				OH	H	Br
Bromo LL-E33288	Αη	H	H	H					-0	Br
pseudoaglycone
Dihydro-bromo LL-E33288	Ar!	H	H	H				OH	H	Br
pseudoaglycone
N-Acetyl Esperamicin A!	ch3	R,'	R3'		(CH3)2CH	CH3CO	H Ar2
N-Acetyl Esperamicin A2	ch3	Rľ	Rľ		(CH3)2CH	CH3CO	Ar2H
N-Acetyl Esperamicin Alb	ch3	Rľ	Rľ		ch,ch2	CH,CO	HAr2

R znamená atóm vodíka alebo rozvetvenú, alebo priamu alkylovú skupinu obsahujúcu 1 až 10 uhlíkových atómov, alkylénovú skupinu obsahujúcu 1 až 10 uhlíkových atómov, arylovú skupinu, heteroarylovú skupinu alebo arylalkylovú skupinu, v ktorej alkylový zvyšok obsahuje 1 až 5 uhlíkových atómov, alebo heteroarylalkylovú skupinu, v ktorej alkylový zvyšok obsahuje 1 až 5 uhlíkových atómov, pričom všetky tieto skupiny môžu byť prípadne substituované aspoň jedným substituentom zo skupiny zahrnujúcej hyd roxylovú skupinu, aminovú skupinu, karboxylovú skupinu, atóm halogénu, alkoxylovú skupinu obsahujúcu 1 až 3 uhlíkové atómy a tioalkoxylovú skupinu obsahujúcu 1 až 5 uhlíkových atómov.

V rámci vynálezu sú použiteľné aj niektoré ďalšie protinádorové a antibakteriálne zlúčeniny, najmä:

1. Esperamycín BBM-1675, predstavujúci novú skupinu vysoko účinných protinádorových antibiotík, pričom fyzikálnochemické vlastnosti a rapciálna štruktúra týchto látok je opísaná M. Konisni-m a kol. v J. Antibiotics, 38, 1605 (1985) a zodpovedajúci nový protinádorový antibiotický komplex opísal Konishi a kol. v patentovej prihláške GB 2 141 542A,

2. nové protinádorové antibiotiká opísané v patentových dokumentoch FR-900405 a FR-900406, pričom taxonómia produkčného kmeňa bola opísaná M. Iwami-m a kol. v J. Antibiotics 38, 835 (1985) a produkcia, izolácia, charakterizácia a protinádorová účinnosť bola opísaná S. Kiyoto-em a kol. v J. Antibiotics, 38, 340 (1985),

3. PD 114759 a PD 1150 28, predstavujúce nové protinádorové antibiotiká s fenomenálnou potenciou, pričom izolácia a charakterizácia týchto látok bola opísaná R. H. Bunge-m a kol., v J. Antibiotics, 37, 1566 (184) a biologická a biochemická účinnosť nového protinádorového antibiotika PD 114759 a jeho derivátov bola opísaná D. W. Fry-om a kol. v Investigational New Drugs, 4, 3 (1986),

4. nové antibiotické komplexy CL-1577A, CL-1577B produkovanej kmeňom Streptomyces sp. ATCC 39363 a opísané v európskej patentovej prihláške 0 132 082-A2,

5. antibiotické protinádorové zlúčeniny CL-1577D a Cl-1577E, ktoré sú spoločne s ich produkciou a použitím opísané v patente US 4 539 203,

6. antibiotické zlúčeniny CL-1724, ktoré sú spoločné s ich produkciou a použitím opísané v patente US 4 554 162,

7. nové protinádorové antibiotiká BBM-1675-A3 a BBM-1675-A4, získané fermentáciou Actinomadura verrucosospora, kmeňov H964-92 (ATCC 39334) alebo AB27Y (ATCC 39638) a opísaná v patente US 4 675 187 a

8. nové N-acetyl-esparamicínové deriváty A_lľ A₂ a A,_b s antimikrobiálnou a protinádorovou účinnosťou, opísané v európskej patentovej prihláške 289 030.

Celkové štruktúry esperamicínov A_b A₂ a A_+b (komplex BBM-1675) a ich N-acetylových derivátov už boli opísané a sú uvedené v uvedených tabuľkách 1 a 2. Fyzikálne charakteristiky ostatných uvedených protinádorových antibiotík ukazujú, že všetky tieto látky majú podobnú alebo dokonca rovnakú štruktúru ako uvedené esperamicíny a že všetky obsahujú funkčnú metyltritioskupinu.

Z uvedených štruktúr zložiek a_b α₂, α₃, α₄, β,, β₂₎ y_b δ a pseudoglykónových zložiek komplexu LL-33288, ich N-acylových homológov, ako aj zo štruktúr antibiotík BBM1675, FR-900405, FR-900406, PD114759, PD115028, CL1577A, CL-1577B, CL-1577D, CL-1577E a CL-1724 a ich N-acylových homológov je zrejmé, že každá z týchto látok obsahuje vo svojej štruktúre metyltritioskupinu.

Podstata vynálezu

Teraz bolo novo zistené, že reakciou ľubovoľného z uvedených antibiotík s nesubstituovaným alebo substituovaným alkyl- alebo arylmerkaptánom sa dosiahne vytesnenie metylpertiolátového aniónu z trisulfidového zvyšku za vzniku stabilného disulfidu podľa nasledujúcej reakčnej schémy I. Ostatné zlúčeniny, ktoré môžu byť podrobené tejto transformácii, sú opísané v európskej patentovej prihláške publikovanej pod číslom 0313874A2.

Reakčná schéma I

Q-Sp-SH

CH₃-SSS-W ------------ Q-Sp-SS-W

Predmetom vynálezu je substituovaný disulfid všeobecného vzorca Q-Sp-SS-W, odvodený od zlúčenín CH₃SSS-W, označovaných ako LL-E33288a_rBr, LL-E33288a_rI, LL-E33288a₂-Br, LL-33288a₂-I, LL-E33288a,-Br, LL-E33

288a3-I, LL-E33288a₄-Br, LL-E33288p_rBr, LL-E33288p_rl, LL-E33288p₂-Br, LL-E33288p₂-I, LL-E33288Y_rBr, LL-Ε33288γ!-Ι a LL-E332888₁-I, od ich jód- alebo bróm pseudoglykónov a ich dihydro- alebo N-acyl-homológov, od látok BBM-1675, FR-900405, FR-900406 a od ich antibiotík PD114759, PD115028, CL-1577A, CL-1577B, CL-1577D, CL-1577E a CL-1724 alebo ich N-acetylhomológov, pričom v uvedenom všeobecnom vzorci

W znamená

Ri znamená

alebo CH₃ R₂ znamená

alebo H,

R₃ znamená

alebo H,

R₄ znamená

alebo H

R₆ alebo R₇ znamená H alebo

R₅ znamená metylovú skupinu, etylovú skupinu alebo skupinu (CH₃)₂CH,

R₈ znamená hydroxylovú skupinu,

R₉ znamená atóm vodíka alebo

R₈ a R₉ spolu znamenajú karbonylovú skupinu,

X znamená atóm jódu alebo atóm brómu,

R₅ znamená atóm vodíka alebo skupinu RCO, v ktorej

R znamená atóm vodíka alebo rozvetvenú alkylovú skupinu, ktorá obsahuje 1 až 10 uhlíkových atómov alebo alkylénovú skupinu, obsahujúcu 1 až 10 uhlíkových atómov, a rylovú skupinu obsahujúcu 6 až 11 uhlíkových atómov alebo heteroarylovú skupinu zvolenú z množiny zahŕňajúcej furylovú skupinu, tienylovú skupinu, N-metylpyrolylovú skupinu, pyridylovú skupinu, N-metylimidazolylovú skupinu, oxazolylovú skupinu, pyrimidinylovú skupinu, chinolylovú skupinu, izochinolylovú skupinu, N-metylkarbazolylovú skupinu, aminokumarinylovú skupinu a fenazinylovú skupinu alebo arylalkylovú skupinu, v ktorej arylový zvyšok obsahuje 6 až 11 uhlíkových atómov a alkylový zvyšok obsahuje 1 až 5 uhlíkových atómov, alebo heteroarylalkylovú skupinu, v ktorej je heteroarylový zvyšok zvolený z uvedenej množiny a alkylový zvyšok obsahuje 1 až 5 uhlíkových atómov, pričom uvedené skupiny môžu byť pripadne substituované aspoň jedným substituentom, zvoleným z množiny, ktorá zahŕňa hydroxylovú skupinu, aminovú skupinu, karboxylovú skupinu, halogén, nitro-skupinu, alkoxy-skupínu, obsahujúcu 1 až 3 uhlíkové atómy a alkyltio-skupinu, obsahujúcu 1 až 5 uhlíkových atómov,

Sp znamená priamu alebo rozvetvenú dvojvalenčnú alkylovú skupinu, obsahujúcu 1 až 18 atómov uhlíka, dvojvalenčnú arylovú skupinu, ktorá obsahuje 6 až 11 atómov uhlíka alebo dvojvalenčnú heteroarylovú skupinu, zvolenú z množiny zahŕňajúcej furylovú skupinu, tienylovú skupinu, N-metylpyrolylovú skupinu, piridylovú skupinu, N-metylimidazolylovú skupinu, oxazolylovú skupinu, pyrimidinylovú skupinu, chinolylovú skupinu, izochinolylovú skupinu, N-metylkarbazolylovú skupinu, aminokumarinylovú skupinu a fenazinylovú skupinu alebo dvojvalenčnú cykloalkylovú skupinu obsahujúcu 3 až 18 atómov uhlíka, dvojvalenčnú arylalkylovú skupinu, v ktorej arylový zvyšok obsahuje 6 až 11 atómov uhlíka a alkylový zvyšok obsahuje 1 až 18 atómov uhlíka, alebo heteroarylalkylovú skupinu, v ktorej alkylový zvyšok obsahuje 1 až 18 atómov uhlíka a heteroarylový zvyšok znamená zvyšok zvolený z množiny zahŕňajúcej furylovú skupinu, tienylovú skupinu, N-metylpyrolylovú skupinu, pyridylovú skupinu, N-metylimidazolylovú skupinu, oxazolylovú skupinu, pyrimidinylovú skupinu, chinolylovú skupinu, izochinolylovú skupinu, N-metylkarbazolylovú skupinu, aminokumarinylovú skupinu a fenazinylovú skupinu, alebo dvojvalenčnú alkenylovú alebo alkinylovú skupinu obsahujúcu 2 až 18 atómov uhlíka, pričom Sp môže byť dodatočne substituovaný amino-skupinou, alkylaminoskupinou , obsahujúcou 1 až 10 atómov uhlíka, arylamino-skupinou, obsahujúcou 6 až 11 atómov uhlíka, heteroarylamino-skupinou, v ktorej heteroarylový zvyšok znamená zvyšok zvolený z množiny zahŕňajúcej furylovú skupinu, tienylovú skupinu, N-metylpyrolylovú skupinu, pyridylovú skupinu, N-metylimidazolylovú skupinu, oxazolylovú skupinu, pyrimidinylovú skupinu, chinolylovú skupinu, izochinolylovú skupinu, N-metylkarbazolylovú skupinu, aminokumarinylovú skupinu a fenazinylovú skupinu, karboxylovú skupinu, alkoxyskupinu, obsahujúcu 1 až 3 atómy uhlíka, hydroxy-skupinu , tiolovú skupinu alebo alkyltio-skupinu obsahujúcu 1 až 5 atómov uhlíka,

Q znamená atóm halogénu, aminovú skupinu, alkylaminovú skupinu obsahujúcu 1 až 10 uhlíkových atómov, dialkylaminovú skupinu, v ktorej každý alkylový zvyšok obsahuje 1 až 10 atómov uhlíka, arylaminovú skupinu, v ktorej arylový zvyšok obsahuje 6 až 11 atómov uhlíka, heteroarylaminovú skupinu, v ktorej je heteroarylový zvyšok zvolený z uvedenej množiny, piperidinovú skupinu, pyrolidinovú skupinu, piperazinovú skupinu, karboxylovú skupinu, nitrofenyloxykarbonylovú skupinu, skupinu -CHO, alkoxyskupinu, obsahujúcu 1 až 3 uhlíkové atómy, hydroxylovú skupinu, tiolovú skupinu, dikarboxyalkylovú skupinu, v ktorej alkylový zvyšok obsahuje 1 až 5 atómov uhlíka, skupinu -CONHNHj, skupinu -HCONHNHj, skupinu

CSNHNH₂, skupinu -NHCSNHNH₂ oxykarbonylovú skupinu alebo skupinu -ONH_2> pričom v prípade, žeje uvedený substituovaný disulfid odvodený od zlúčenín CH₃-SSS-W, zahŕňajúcich LL-E33288a_rBr, LL-E33288a_rI,

LL-E33288a₂-Br, LL-E33288a₂-I, LL-E33288a₃-Br, LL-E33288a₃-I, LL-E33288a₄-Br, LL-E33288P|-Br, LL-Ε33288β,-Ι, LL-E33288p₂-Br, Ι±-Ε33288β₂-Ι, LL-E33288y_rBr, LL-E33288YJ-I, LL-E33288ô_rI, BBM-1675, FR-900405, FR-900406, PD114759, PRI 15028, CL-1577A, CL-1577B, CL-1577D, CL-1577E alebo CL-1724, potom Q neznamená atóm halogénu, aminovú skupinu, alkylamínovú skupinu, dialkylaminovú skupinu, arylaminovú skupinu, heteroarylaminovú skupinu, piperidinovú skupinu, pyrolidinovú skupinu, piperazinovú skupinu alebo karboxylovú skupinu.

Výhodne je predmetom vynálezu uvedený substituovaný disulfid všeobecného vzorca Q-Sp-SS-W, v ktorom W znamená

och₃

R₂ znamená alebo H,

R4 znamená

alebo H,

R₅ znamená metylovú skupinu, etylovú skupinu alebo skupinu (CH₃)₂CH,

X znamená atóm jódu alebo atóm brómu,

R₅' znamená atóm vodíka alebo skupinu RCO, v ktorej

R znamená atóm vodíka, metylovú skupinu alebo monosubstituovanú arylovú skupinu, ktorá obsahuje 6 až 11 atómov uhlíka

Sp a Q majú uvedené významy.

Predmetom vynálezu je rovnako konjugát uvedeného substituovaného disulfidu s nosičom, ktorý má všeobecný vzorec

Tu-tZ-Sp-SS-W)^ v ktorom

W a Sp majú uvedené významy.

Tu znamená monokolonálnu protilátku alebo jej fragmenty, alebo jej chemicky, alebo geneticky modifikované homológy,

Y znamená aminovú skupinu, karboxylovú skupinu alebo tiolovú skupinu, tvoriacu bočný reťazec protilátky Tu, aldehydovú skupinu odvodenú od glykoproteínových cukro vých zvyškov protilátky Tu, amidoalkyltioskupinu, v ktorej alkylový zvyšok obsahuje 2 až 18 uhlíkových atómov, skupinu -CH₂NHNHCOCH₃ alebo skupinu

Z znamená skupiny -CONH-, -CONHN=CH-, -CONNHCH₂-, -NHCONHN=CH-, -NHCONHNHCH₂-, -NHCSNHN=CH-, -NHCSNHNHCH₂-, -ON=CH-, -NH-, -NHCH₂-, -N=CH-, -CO₂-, -NHCH₂CO₂-, -SS-,

alebo

-NIICOCH₇ -čh

CO H kde x = 0 alebo 1, n znamená celé číslo od 1 do 100 a m znamená 0,1 až 15.

Výhodne je predmetom vynálezu uvedený konjugát substituovaného disulfidu s nosičom všeobecného vzorca

Tu-(Z-Sp-SS-W)_m

I (7)n-m v ktorom

W má uvedený význam,

Sp znamená priamu alebo rozvetvenú dvojvalenčnú alkylovú skupinu, obsahujúcu 2 až 10 uhlíkových atómov alebo dvojvalenčnú arylalkylovú skupinu, v ktorej arylový zvyšok obsahuje 6 až 11 atómov uhlíka a alkylový zvyšok obsahuje 2 až 5 uhlíkových atómov alebo heteroarylalkylovú skupinu, v ktorej alkylový zvyšok obsahuje 2 až 5 uhlíkových atómov a heteroarylový zvyšok má významy uvedené v nároku 1, pričom Sp môže byť dodatočne substituovaný amino-skupinou, heteroarylamino-skupinou, v ktorej má heteroarylový zvyšok významy uvedené v nároku 1, hydroxy-skupinou alebo tiolovou skupinou,

Tu znamená monoklonálnu protilátku, ktorá má preferenčnú reaktivitu s ľudským nádorovým antigénom,

Y znamená aminovú skupinu tvoriacu bočný reťazec protilátky Tu alebo aldehydovú skupinu odvodenú od glykoproteínových cukrových zvyškov protilátky Tu,

Z znamená skupinu -CONH-, skupinu CONHN=CH-, skupinu -CONHNHCH₂- alebo skupinu

I -KHCOCh\-CH

I (CH, )

I 2 x

CO₂H kde x znamená 0 alebo 1, m znamená 0,1 až 15, n znamená celé číslo od 1 do 100.

Predmetom vynálezu je rovnako spôsob prípravy uvedeného substituovaného disulfidu, ktorého podstata spočíva v tom, že sa zlúčenina všeobecného vzorca CH₃SSS-W, kde W má uvedený význam, uvedie do reakcie so substituovaným merkaptánom všeobecného vzorca Q-Sp-SH, v ktorom Q a Sp majú uvedené významy, v acetonitrile alebo v zmesi acetonitrilu a tetrahydrofuránu alebo acetonitrilu a dimetylformamidu pri teplote -20 až 40 °C počas 1 hodiny až 6 dní.

Výhodne sa reakcia uskutočňuje v prítomnosti jedného ekvivalentu terciámej amínovej bázy a jedného ekvivalentu organickej karboxylovej kyseliny.

Predmetom vynálezu je rovnako spôsob prípravy uvedeného konjugátu substituovaného disulfidu s nosičom všeobecného vzorca

Tu-(z-s_P-ss-w)_{m ;} v ktorom Sp, W, Tu, n a m majú uvedené významy,

Y znamená aminovú alebo karboxylovú skupinu tvoriacu bočný reťazec protilátky Tu a Z znamená skupinu -CONH-, skupinu -NH-, skupinu -N=CH, skupinu -CO₂- alebo skupinu

-nhcoch,-ch

CO,H, i 2 kde X = 0 alebo 1, ktorého podstata spočíva v tom, že sa uvedie do reakcie zlúčenina všeobecného vzorca Q-Sp-SS-W, v ktorom Sp a W majú uvedené významy a Q znamená atóm halogénu, aminovú skupinu, alkylamínovú skupinu, karboxylovú skupinu, karboxaldehydovú skupinu, hydroxylovú skupinu alebo skupinu anhydridu alkyldikarboxylovej kyseliny, v ktorej alkylový zvyšok obsahuje 4 alebo 5 uhlíkových atómov, s molekulou látky všeobecného vzorca Tu-(Y)_n, v ktorom Tu, Y a n majú uvedený význam, vo vodnom pufri s hodnotou pH 6,5 až 9 pri teplote 4 až 40 °C buď priamo, alebo v prítomnosti vo vode rozpustného karbodiimidu.

Predmetom vynálezu je tiež spôsob prípravy uvedeného konjugátu substituovaného disulfidu s nosičom všeobecného vzorca ľu-fz-sp-ss-w) ^n-n v ktorom Sp, W, Tu, n a m majú uvedené významy, Y znamená aminovú skupinu tvoriacu bočný reťazec protilátky Tu a Z znamená skupinu -CONH-, ktorého podstata spočíva v tom, že sa zlúčenina všeobecného vzorca Q-Sp-SS-W, v ktorom Sp a W majú uvedené významy a Q znamená karboxylovú skupinu, uvedie do reakcie s N-hydroxysukcinimidom, 2,3,5,6-tetrafluórfenolom, pentafluórfenolom alebo 4-nitrofenolom v prítomnosti činidla aktivujúceho karboxylovú skupinu, akým je karboximid, pri vzniku zlúčeniny všeobecného vzorca Q-Sp-SS-W, v ktorom Sp a W majú uvedené významy a Q znamená

alebo

potom sa získaná zlúčenina uvedie do reakcie s molekulou látky všeobecného vzorca Tu-(Y)_n, v ktorom Tu, Y a n majú uvedené významy, vo vodnom pufrovanom roztoku s hodnotou pH 6,5 až 9 a pri teplote 4 až 40 °C.

Predmetom vynálezu je ďalej spôsob prípravy konjugátu substituovaného disulfidu s nosičom všeobecného vzorca

Tu-(z-sp-ss-w)_{m t} v ktorom Tu, Z, Sp, W, Y, m a n majú uvedené významy, ktorého podstata spočíva v tom, že sa zlúčenina všeobecného vzorca Q-Sp-SS-W, v ktorom Sp a W majú uvedené významy a Q znamená skupinu -CONHNH₂, uvedie do reakcie s kyselinou dusitou vo vodnom roztoku acetonitrilu za vzniku zlúčeniny všeobecného vzorca Q-Sp-SS-W, v ktorom Sp a W majú uvedené významy a Q znamená skupinu -CON₃, a hneď sa táto zlúčenina uvedie do reakcie so zlúčeninou všeobecného vzorca Tu-(Y)„, v ktorom Tu, Y a n majú uvedené významy.

Predmetom vynálezu je rovnako spôsob prípravy uvedeného konjugátu substituovaného disulfidu s nosičom všeobecného vzorca ľu-(z-sp-ss-w)_m, ^Y,in-z.

v ktorom Tu, Sp, W, n a m majú uvedené významy, Z znamená

-SS-,

.0'

-s

'3

O o ² a Y znamená tiolovú skupinu, tvoriacu bočný reťazec protilátky Tu alebo amidoalkyltio-skupinu, v ktorej alkylový zvyšok obsahuje 2 až 18 uhlíkových atómov, ktorého podstata spočíva v tom, že sa zlúčenina všeobecného vzorca Q-Sp-SS-W, v ktorom Sp a W majú uvedený význam a Q znamená hydroxylová skupinu, uvedie do reakcie s anhydridom kyseliny α-halogénoctovej za vzniku zodpovedajúcej zlúčeniny, v ktorej Q znamená ot-halogénacetyloxy-skupinu, a potom sa α-halogénacetyloxy-Sp-SS-W alebo zlúčenina všeobecného vzorca Q-Sp-SS-W, v ktorom Sp a W majú uvedené významy a Q znamená

-SS

-CO

alebo

-CH

O

O uvedie do reakcie s molekulou látky všeobecného vzorca Tu-(Y)_n, v ktorom Tu má uvedený význam, Y znamená tiolovú skupinu, tvoriacu bočný reťazec protilátky Tu alebo amidoalkyltio-skupinu, v ktorej alkylový zvyšok obsahuje 2 až 18 uhlíkových atómov, zavedenú na amínovú funkciu protilátky Tu s použitím hydroxysukcinimidesteru kyseliny 3-(2-ditiopyridyl)propiónovej a následnou redukciou ditiotreitolom alebo amidoalkyltio-skupinu zavedenú na aminovú funkciu protilátky Tu s použitím 2-iminotiolanu, a n znamená 1 až 10, vo vodnom pufrovanom roztoku s hodnotou pH 4,4 až 7 a pri teplote 4 až 40 °C.

Predmetom vynálezu je tiež spôsob prípravy uvedeného konjugátu substituovaného disulfidu s nosičom všeobecného vzorca

Tu-(Z-Sp-SS-W)_a

I v ktorom Sp, W a Tu majú uvedené významy, Y znamená aldehydovú skupinu odvodenú od glykoproteinových cukrových zvyškov protilátky Tu, Z znamená skupinu -ON=CH-, skupinu -N=CH-, skupinu -CONHN=CH-, skupinu -NHCONHN=CH- alebo skupinu -NHCSNHN=CH-, n znamená 1 až 20 a m znamená 0,1 až 15, vyznačujúci sa tým, že sa zlúčenina všeobecného vzorca Q-Sp-SS-W, v ktorom Sp a W majú uvedené významy a Q znamená skupinu NH₂, skupinu -CONHNH₂, skupinu NHCONHNH₂, skupinu NHCSNHNHj alebo skupinu -ONH₂, uvedie do reakcie s molekulou látky všeobecného vzorca Tu-(Y)_n, v ktorom má Tu uvedený význam a Y znamená aldehydovú skupinu odvodenú od glykoproteinových cukrových zvyškov protilátky Tu, v prítomnosti jodistanu kovu alkalických zemín vo vodnom pufri pri hodnote pH 4 až 6,6 pri teplote 4 až 40 °C.

Predmetom vynálezu je rovnako spôsob prípravy uvedeného konjugátu substituovaného disulfidu s nosičom všeobecného vzorca

Tu-(Z-Sp-sS-w)_m, (^γ)η-πι v ktorom Tu, Z, Sp, W, m a n majú predchádzajúce uvedené významy, Z znamená skupinu -NH-CH₂-, skupinu -CONHNHCH₂-, skupinu -NHCONHNHCHj- alebo skupinu -NHCSNHNHCH₂-, a Y znamená skupinu -CH₂NHNHCOCH₃ alebo skupinu

ktorého podstata spočíva v tom, že zlúčenina všeobecného vzorca pJ-(Z-Sp-SS-W)_m; <*)___ n-m v ktorom Tu, Z, Sp, W, Y, n a m majú významy uvedené pre túto zlúčeninu, uvedie do reakcie s acetylhydrazínom alebo tyrozinhydrazínom vo vodnom pufri pri pH 4 až 6, 5 za teploty 4 až 40 °C za vzniku zlúčeniny všeobecného vzorca

m >

v ktorom Tu, Z, Sp, W, n a m majú uvedené významy a Y znamená skupinu -CH=NHHCOCH₃ alebo skupinu

-CH-NNHCO-CH(NHj)-CHj a potom sa táto zlúčenina uvedie do reakcie s kyanobórohydridom sodným alebo bórohydridom sodným vo vodnom pufri pri pH 4 až 6,5 pri teplote 4 až 40 °C.

Transformácia zlúčenín uvedených v tabuľkách 1 a 2 na zodpovedajúce disulfidy môže byť uskutočnená veľkým počtom organických látok obsahujúcich tiolovú skupinu za vzniku nových protinádorových a antibakteriálnych činidiel. Okrem toho môžu byť získané produkty ďalej transformované zavedením nových bočných reťazcov, pričom sa získajú ďalšie nové zlúčeniny, majúce biologickú účinnosť.

Okrem toho, že zlúčeniny podľa vynálezu môžu byť použité ako protinádorové a antibakteriálne činidlá, sú tieto zlúčeniny tiež použiteľné na vyhodnocovanie nových protirakovinných prístupov v celulámej úrovni. Prírodné odvodené antibiotiká, opísané v uvedených patentových prihláškach a patentoch, neobsahujú dostatočne silné chromofomé jednotky na to, aby ich intraceluláma lokalizácia mohla byť adekvátne opísaná. V prípade, že sa natívne tritiometylové deriváty uvedú v reakciu so zlúčeninami obsahujúcimi tiolovú skupinu, ktoré navyše obsahujú chromofomú jednotku, ktorá absorbuje alebo emituje svetlo v oblastiach elektromagnetického spektra a nie je clonená celulámymi chromoforami, potom sa takto získa vhodný biochemický nástroj pre štúdium štiepenia dvojreťazcovej DNA a celulámej lokalizácie tejto triedy zlúčenín. Do rozsahu vynálezu patrí aj zavedenie rádioizotopov (radičné značenie) do získaných produktov reakciou podľa reakčnej schémy 1. Tak napríklad, ak sa E-33288 γ_χ-Ι uvedie v reakciu so 7-(27

SK 284270 Β6

-tioctylamino)-4-metylkumarínom, získa sa derivát, ktorý po ožiarení ultrafialovým svetlom javí intenzívnu fluorescenciu, čo umožňuje lokalizáciu tejto zlúčeniny v bunkovom mechanizme.

V tomto uskutočnení vynálezu sa zlúčeniny uvedené v tabuľkách 1 a 2 transformujú organickými látkami obsahujúcimi tiolovú skupinu podľa reakčnej schémy I na nové zlúčeniny, ktoré sú navyše použiteľné ako molekulárne sondy, pričom vo všeobecnom vzorci týchto zlúčenín Q-Sp-SS-W

W, R, Rj, R₂, Rj, R4, R5, R₆, R7, Rg, Rj, R₂', R3', R4', R5', Ar, Ar₂ a X majú významy uvedené v tabuľkách 1 a 2, Sp znamená priamu alebo rozvetvenú dvojmocnú skupinu obsahujúcu 1 až 18 uhlíkových atómov, dvojmocnú arylovú alebo heteroarylovú skupinu, dvojmocnú cykloalkyl- alebo heterocykloalkylovú skupinu, dvojmocnú aryl- alebo heteroarylalkylovú skupinu obsahujúcu 1 až 18 uhlíkových atómov, dvojmocnú cykloalkyl- alebo heterocykloalkylalkylovú skupinu obsahujúcu 1 až 18 uhlíkových atómov a dvojmocnú nenasýtenú alkylovú skupinu obsahujúcu 2 až 18 uhlíkových atómov a

Q znamená nesubstituované alebo substituované jadro dibenzooxazínu, rhodaminu, karbostyrilu, kumarínu, fluoresceínu alebo akridinu, alebo substituent obsahujúci ako časť svojej štruktúry rádioizotop ³H, ¹⁴C, ^3BS alebo ³²P.

Rovnako bolo zistené, že vytesnenie metyltritio-jednotky zlúčenín uvedených v tabuľkách 1 a 2, ilustrované reakčnou schémou I, môže byť použité na zavedenie dištančnej jednotky (Sp, spacer), ktorej rozumná voľba uľahčí zavedenie cielených jednotiek do štruktúry disulfidového derivátu podľa vynálezu. Zavedenie cielených jednotiek do iných disulfidových derivátov je opísané v uverejnenej európskej patentovej prihláške 0313873Al (uverej. 3. 5. 1989). Podľa reakčnej schémy I sa takto zlúčeniny všeobecného vzorca CH3SSS-W, kde CH₃SSS-W značia protinádorové antibiotikum rocykloalkylalkylovú skupinu obsahujúcu 1 až 18 uhlíkových atómov alebo dvojmocnú alebo trojmocnú nenasýtenú alkylovú skupinu obsahujúcu 2 až 18 uhlíkových atómov, pričom v prípade, že Sp značí trojmocnú skupinu, potom môže byť táto skupina navyše substituovaná aminovou skupinou, alkylaminovou skupinou, arylaminovou skupinou, heteroarylaminovou skupinou, karboxylovou skupinou, nižšou alkoxylovou skupinou, hydroxyskupinou, tiolovou skupinou alebo nižšou alkyltio-skupinou, s výhradou pozostávajúcou v tom, že keď CH₃-SSS-W je tvorené materským protinádorovým antibiotikom LL-E33288a,-Br, LL-E33288a_rI, LL-E33288a₂-Br,

LL-E33288a₂-I, LL-E33288a₃-Br, LL-E33288a_rI, LL-E33288a₄-Br,

LL-E33288p,-Br,

LL-E33288p_rI,

LL-E332883₂-Br,

LL-E33288P₂-I,

LL-E33288y_rBr,

LL-E33288y_rI,

LL-E33288Ô,-I,

BBM-1675,

FR-900405,

FR-900406,

PD114759,

PRI 15028,

CL-1577A,

CL-1577B,

CL-1577D, CL-1577E alebo

CL-1724, potom Sp nemôže byť dvojmocnou skupinou, a

Q znamená alebo môže byť nasledovne prevedený na atóm halogénu, aminovú skupinu, alkylaminovú skupinu, karboxylovú skupinu, karboxyaldehydovú skupinu, hydroxy-skupinu, tiolovú skupinu, α-halogcnacetyloxy-skupinu, nižšiu alkyl-dikarboxylovú skupinu, skupinu -CONHNH₂, skupinu -NHCONHNHj, skupinu -NHCSNHNH₂, skupinu

LL-E33288a_rBr,

LL-E33288a_rI,

LL-E33288a₂-Br,

LL-E33288a₂-I,

LL-E33288ct₃-Br,

LL-E33288Pi-Br,

LL-E33288P,-I,

LL-E332883,-Br,

LL-E33288p₂-I,

LL-E33288Y|-Br,

-ONH₂, skupinu -CON₃ alebo skupiny

r 1 s výhradou pozostávajúcou v tom, že keď Sp znamená

LL-E33288a₃-I,

LL-E33288a₄-Br,

LL-E33288y_rI,

LL-E33288ô_rI, jód alebo brómpseudoaglykóny, ich dihydro- alebo N-acetylové analógy,

BBM-1675, CL-1577A,

JoťS

NHCOCH₌NH

FR-900405,

FR-900406,

CL-1577B,

CL-1577D,

PD114759, CL-1577E,

PD115028, CL-1724 alebo ich A-acetylové analógy, najskôr uvedú v reakciu so zlúčeninou všeobecného vzorca Q-Sp-SH za vzniku medziproduktu

Q-Sp-SS-W a W má význam uvedený v tabuľkách 1 a 2.

Pokiaľ produkt z reakčnej schémy I obsahuje aspoň jednu funkčnú skupinu, ktorá môže byť prevedená na cielenú jednotku (Tu, targeting uniť) alebo ktorá priamo reaguje s cielenou jednotkou, potom môže byť cielená forma protinádorových antibiotík z uvedených patentov a patentových prihlášok získaná spôsobom, ktorý je ilustrovaný nasledujúcou reakčnou schémou II:

TU-(Y)_n

Q-Sp-SS-W--------------------*

Tu-(Z-Sp-SS-W) v ktorom

Sp znamená priamu alebo rozvetvenú dvojmocnú alebo trojmocnú skupinu obsahujúcu 1 až 18 uhlíkových atómov, dvojmocnú alebo trojmocnú arylovú alebo heteroarylovú skupinu, dvojmocnú alebo trojmocnú cykloalkylovú alebo heterocykloalkylovú skupinu obsahujúcu 3 až 18 uhlíkových atómov, dvojmocnú alebo trojmocnú aryl- alebo heteroarylalkylovú skupinu obsahujúcu 1 až 18 uhlíkových atómov, dvojmocnú alebo trojmocnú cykloalkyl- alebo hetev ktorom

Q, Sp a W majú uvedené významy,

Tu znamenajú mono- alebo polyklonálnu protilátku, jej fragmenty, jej chemicky alebo geneticky manipulované analógy alebo rastové faktory, alebo steroidy,

Y znamená bočnú aminovú skupinu, karboxylovú skupinu alebo tiolovú skupinu proteínov, aldehyd odvodený od uhľohydrátových zvyškov alebo amidoalkyltio-skupinu, n znamená celé číslo od 1 do 100,

Z je vytvorený kovalentnou reakciou skupín Q a Y priamo alebo po nasledujúcej redukcii a

Z skupinu -CONH-, skupinu -CONHN=CH-, skupinu -CONHNHCHj-, -NHCONHN=CH-, -NHCONHNHCH₂-, skupinu NHCSNHN=CH-, skupinu -NHCSNHNHCH₂, skupinu -ON=CH-, skupinu -NH-, skupinu -NHCH₂-, skupinu -N=CH-, skupinu -CO₂-, skupinu NHCH₂CO₂-, -SS-, skupinu

a m znamená 0,1 až 15.

Ako príklad vzťahujúci sa k uvedenej reakčnej schéme II sa dá uviesť, že deriváty kyseliny 3-merkaptopropionovej N-acetyl-E-33288y_rJ (Q=CO₂H, Sp=-CH₂CH₂-) v prípade, že sú prevedené na ich aktivovanú hydroxysukcinimidovú formu (Q=CO₂Su, Sp=-CH₂-CH₂-), môžu byť použité k reakcii s niektorou z ε-aminových skupín lyzínových zvyškov (napr. Tu= monoklonálna protilátka, Y=-NH₂, kde n=50-100, z dostupných lyzínových zvyškov) pri pH 7,0 až 9,5 vo vodných pufrovaných roztokoch za teploty 4° až 40 °C, pričom sa získajú cielené formy antibiotík pripojené k náhodným miestam pozdĺž základného proteínového reťazca (Tu=monoklonálna protilátka, Z=-NHCO-, Sp= =-CH₂CH₂-, m=l až 10). Týmto spôsobom je substituovaný iba zlomok dostupných lyzínových zvyškov, pretože vysoký stupeň substitúcie nie je všeobecne považovaný za kompatibilný so zachovaním protilátkovej imunoreaktivity.

Ten istý náhodne substituovaný imunokonjugát môže byť rovnako pripravený z derivátov kyseliny 3-merkaptopropionovej s použitím ďalších činidiel aktivujúcich karboxylovú skupinu, akými sú rôzne karbodiimidy alebo zodpovedajúce acylazidy.

Alternatívne 3-merkaptopripionylhydrazidový derivát N-acetyl-LL-E3332885_rJ(Q=H₂NNHCO-, Sp=-CH₂CH₂-) v prípade, že je uvedený do reakcie s jodistanom oxidovanou protilátkou (Tu=monoklonálna protilátka, Y=-CHO, n=l až 15), ako je to opísané v patente US 4 671 958, pri pH 4 až 7 v puffovanom vodnom roztoku za teploty 4° až 40 °C, reaguje iba na úrovni aldehydovej funkcie (odvodenej zo štiepenia vic-diolov uhľohydrátových zvyškov situovaných na Fc časti protilátok) za vzniku monoklonálnych protilátkových konjugátov, obsahujúcich účinnú látku substituovanú v špecifických miestach pozdĺž hlavného reťazca proteínu (Tu=monoklonálna protilátka, Z=-CH=NNHCO-, Sp=-CH₂CH₂-, m=0,5 až 10).

S cieľom blokovať nezreagované aldehydové skupiny na protilátke a teda aj s cieľom zabrániť zosieťovaniu a stabilizácii hydrolyticky labilných väzieb Schiffovej bázy je výhodné (aj keď však nie nevyhnutné) uviesť posledný uvedený konjugát do reakcie najskôr so zlúčeninou, ako je acetylhydrazid alebo tyrozínhydrazid, a potom podrobiť redukcii kyanoborohydridom sodným alebo borohydridom sodným za vzniku stabilizovaných konštruktov podľa vynálezu (Tu=monoklonálna protilátka, Z=-CH₂NHNHCO-, Sp=-CH₂CH₂-, m=0,5 až 10). Na účely získania produktov spôsobom podľa reakčnej schémy II sa podľa vynálezu používajú aj ďalšie skupiny reagujúce s aldehydom, tvoriace súčasť konštruktu účinnej látky. Takýmito funkčnými skupinami sú výhodne, aj keď nie výlučne, skupiny, ktoré reagujú s aldehydom za kyslých vodných podmienok. Reaktivita proteínových lyzínov je za bázických podmienok natoľko vysoká, že ich amíny súperia s produktmi reakčnej schémy II o dostupnej aldehydovej funkcii monoklonálnej protilátky. Alternatívnymi skupinami reagujúcimi s aldehydom sú napríklad semikarbazidové skupiny, tiosemikarbazidové funkcie a O-substituované hydroxylaminové funkcie.

Vytvorenie cielených foriem zlúčenín uvedených v tabuľkách 1 a 2 nie je obmedzené na sekvenciu uvedenú v reakčnej schéme II. Cielená jednotka (Tu) môže byť najskôr modifikovaná tak, aby obsahovala tiolovú skupinu, nato sa uvedie v reakciu so zlúčeninami uvedenými v tabuľkách 1 a 2 spôsobom uvedeným v nasledujúcej reakčnej schéme III:

Tu(Y)_n + Q-sp-s-P---- Tu-(z-sp-sH)_m

CH -SSS-W

Tu-fZ-Sp-SS-W)^ (Y) ' rx—m v ktorom Tu, Y, Q, Sp, W, n a m majú uvedený význam a P značí atóm vodíka alebo 2-(pyridyltio)-skupinu s výhradou pozostávajúcou v tom, že keď Y značí tiol odvodený od aminokyselinového zvyšku hlavného reťazca Tu, potom ZSp spolu značí kovalentnú väzbu.

Ako príklad vzťahujúci sa k reakčnej schéme III sa dá uviesť, že monoklonálna protilátka môže byť uvedená v reakciu s esterom kyseliny 3-(2-ditiopyridyl)propiónovej a hydroxysukcinimidu na účely modifikácie proteínu lyzínovými zvyškami (Tu=monoklonálna protilátka, Y=NH , n=50 až 100, Q=-CO₂Su, Sp=-CH₂-CH₂-, P=2-pyridyltio). Nasledujúcou redukciou, uskutočnenou napríklad ditiotreitolom, sa získa medziprodukt (Tu=monoklonálna protilátka, Z=-NHCO-, Sp=-CH₂CH₂-, m = 1 až 15), ktorý môže byť uvedený v reakciu so zlúčeninami z tabuliek 1 a 2 za vzniku požadovaných imunokonjugátov.

Obdobne môže byť 2-iminotiolan uvedený v reakciu s monoklonálnou protilátkou na účely priameho zavedenia tiolových skupín na povrch proteínu, bez toho, aby pritom bolo nevyhnutné uskutočniť redukčný stupeň (Tu=monoklonálna protilátka, Z=-NHCO-, Sp=(CH₂)₃-, m=l až 15) a tento medziprodukt môže byť uvedený v reakciu so zlúčeninami z tabuliek 1 a 2.

Alternatívne sa môžu priamo zúčastniť reakcie podľa reakčnej schémy III sulhydrylové skupiny inherentne v štruktúre monoklonálnych protilátok v dimémej forme ako cystinové zvyšky. Takéto sulhydryly sa tradične podrobujú kombinácii enzymatickej digescii a redukcii natívnych monoklonálnych protilátok (Tu=Fab-fragment, Z-Sp=väzba, Y=SH), aj keď je treba rátať s použitím geneticky modifikovaných konštruktov monoklonálnych protilátok obsahujúcich nepárové cystinové zvyšky.

Výhodným uskutočnením cielených derivátov podľa vynálezu je konjugát proteín-účinná látka všeobecného vzorca:

Tu-(Z-Sp-SS-W) l » ,

C Y) ' ' n—tm ktorý sa pripraví zo skupiny protinádorových antibiotík označených ako LL-E33288 (CH₃SSS-W) postupom, ktorý zahrnuje:

vytesnenie ditiometylového zvyšku zlúčeninou všeobecného vzorca Q-Sp-SH, v ktorom

Sp znamená priamu alebo rozvetvenú dvojmocnú alebo trojmocnú skupinu obsahujúcu 2 až 10 uhlíkových atómov alebo dvojmocnú, alebo trojmocnú arylalkylovú alebo hete roarylalkylovú skupinu obsahujúcu 2 až 5 uhlíkových atómov, pričom v prípade, že Sp značí trojmocnú skupinu, môže byť táto skupina navyše substituovaná aminovou skupinou, heteroarylaminovou skupinou, hydroxy-skupinou alebo tiolovou skupinou a

Q znamená karboxylovú skupinu, nižšiu alkyldikarboxylanhydridovú skupinu, CO₂Su, -CONHNH₂ alebo skupinu ^C0=’^<@^{> N}°= za vzniku medziproduktu všeobecného vzorca Q-Sp-SS-W, v ktorom Q, Sp a W majú uvedený význam, a reakciu uvedeného medziproduktu všeobecného vzorca Q-Sp-SS-W so zlúčeninou všeobecného vzorca Tu-(Y)_n, v ktorom Tu znamená monoklonálnu protilátku, ktorá má preferenčnú reaktivitu s ľudským antigénom združeným s nádorom, Y znamená bočnú aminoskupinu protilátky alebo aldehyd získaný oxidáciou uhľohydrátovej skupiny protilátky a n znamená celé číslo od 1 do 100, za vzniku zlúčeniny všeobecného vzorca

TU-(Z-Sp-SS-W) i ” ’ (Y) ' ' n —xn v ktorom Tu, Y, Sp, W a n majú uvedený význam a Z je vytvorené kovalentnou reakciou skupín Q a Y, a to priamo alebo po nasledovnej redukcii a Z znamená skupinu CONH-, -CONHN=CH-, skupinu -CONHNHCH₂- alebo skupinu

I

-NHCOCH -CH (Óh )

I 3'0,1’ CO H m znamená 0,1 až 15.

Na účely príkladnej ilustrácie cielenia metyltritioprotirakovinných zlúčenín je použitá množina odlišných monoklonálnych protilátok (MoAb, monclonal antibodies). Monoklonálne protilátky Lym 1 a Lym 2 indikujú rôzne antigény na zrelých B-lymfocytoch a ich produkčných lymfómoch. Produkcia a charakteristiky týchto monoklonálnych protilátok sú opísané A. L. Epsteinom a kol., v „Cancer Research“, 47, 830 (1987). Monoklonálne protilátky B72.3 sú cielené prevažne na karcinómy prsníka a tračníka, aj keď bola rovnako opísaná ich reaktivita proti karcinómom pankreasu, vaječníkov a pľúc. Táto monoklonálna protilátka bola opísaná T. L. Klug-om a kol. v „Int. J. Cancer“, 38, 661 (1986). Monoklonálna protilátka CT-M-01, ktorá je cielená prevažne na nádory prsníka, je opísaná v európskej patentovej prihláške 86 401482.4 (podaná 3. 7. 1986), zatiaľ kým monoklonálna protilátka MAC-68 je produkovaná subklonovaním hybridomu, ktorý produkuje monoklonálnu protilátku CT-M-01, a indikuje tak karcinómy prsníka, ako aj karcinómy tračníka.

Medziprodukty uvažovaných zlúčenín a konjugáty s týmito protilátkami sú opísané v ďalej uvedenej príkladovej časti. Je však treba uviesť, že tento patent sa neobmedzuje iba na uvedené protilátky. Opísaná metodika je dostatočne všeobecná na to, aby mohla byť použitá pre všetky protilátky, a to bez ohľadu na ich triedu alebo izotop, na ich enzy maticky odvodené fragmenty, ich chemicky manipulované a stabilizované fragmenty, ako aj na ich respektíve chimerické alebo humanizované analógy.

Ani cielené jednotky (Tu) nie sú obmedzené iba na monoklonálne protilátky. Ako cielené jednotky patria do rozsahu vynálezu aj ostatné proteíny, ako aj malé molekuly, pre ktoré na cieľovom vstupe existujú zodpovedajúce receptory.

Zlúčeniny podľa vynálezu všeobecného vzorca Q-Sp-SS-W sú účinné ako antibakteriálne činidlá. Ich antibakteriálna účinnosť proti gram-pozitívnym a gram-negatívnym baktériám môže byť stanovená štandardnou agarovou zrieďovacou metódou.

Miiller-Hintonov agar obsahujúci vždy dvakrát menšie koncentrácie antibiotík sa rozleje do Petriho misiek. Povrch agaru sa zaočkuje pomocou Steeroveho replikačného zariadenia 1 až 5 x 10⁴ bakteriálnych jedincov tvoriacich kolónie. Ako minimálna inhibičná koncentrácia (MIC) pre daný bakteriálny kmeň sa zaznačí najnižšia koncentrácia testovanej zlúčeniny, ktorá inhibuje rast bakteriálneho kmeňa po asi 18 hodinách inkubácie pri teplote približne 36 °C.

Opísané disulfidové zlúčeniny sú účinné protinádorové činidlá.

Na testovanie zlúčenín na účely stanovenia ich spôsobilosti vo funkcii antineoplastických činidiel boli ústavom National Cancer Inštitúte vyvinuté niektoré testovacie systémy in vivo. Tieto testovacie systémy boli opísané v „Cancer Chemotherapy Reports“, časť III., zv. 3, č. 2 (1972), Geran a kol. Tieto testovacie systémy boli kodifikované ako štandardné sereenové testy, ktoré majú byť všeobecne používané v oblasti testovania protinádorových činidiel. Pre zlúčeniny podľa vynálezu sú z týchto testov významné nasledujúce testy: lymfocytová leukémia P388, melanotický melanóm B16, leukémia Ll210 a adenokarcinóm 26 tračníka. Tieto neoplazmy sú použité na testovanie vo forme transplantovateľných nádorov pri myšiach. Výrazná protinádorová účinnosť, preukázaná pri týchto testoch percentickým zvýšením strednej doby prežitie ošetrených pokusných zvierat (T) oproti kontrolným pokusným zvieratám, je ukazovateľom obdobných výsledkov dosiahnuteľných v prípade ľudskej leukémie a ľudských tuhých nádorov.

Test na lymfocytnú leukémiu P 388

Použité pokusné zvieratá sú myšacie samičky BDF|. V každej testovacej skupine je päť alebo šesť myši. Nádorový transplantát bol aplikovaný intraperitoneálnou injekciou 0,5 ml zriedenej ascitnej tekutiny obsahujúcej 1 x 10⁶ buniek lymfocytnej leukémie P388. Táto aplikácia bola uskutočnená v deň nula. Testované zlúčeniny sa podávajú intraperitoneálne v 0,5 ml sterilného, apyrogénneho fyziologického roztoku v deň 1, 5 a 9 (vzhľadom na inokuláciu nádoru) v uvedených dávkach. Myši boli zvážené a počet myší, ktoré prežili, bol zaznačený ku 30 dňom. Z výsledkov sa vyráta stredný čas prežitia a pomer času prežitia ošetrených myší (T) a kontrolných myší (C). Hodnoty T/C vyššie alebo rovnajúce sa 125 sú považované za hodnoty, ktoré svedčia o významnej protinádorovej účinnosti. Získané výsledky sú uvedené v nasledujúcej tabuľke 3.

Tabuľka 3

Test na lymfocytnú leukémiu P388

Zlúčenina	Dávka (mg/kg)	Stredný čas prežitia (dni)	T/CxlOO (%)
Kyselina 3-merkapto-propionová-disulfid-LL-E33288-Y1-I(z príkladu 1)	0,005		145
	0,0025		125
4-Nitrofenylester kyseliny 3-merkapto-propionovej, disulfid-LL-	0,010		135
-E33288-YrI(z príkladu 2)	0,005		185
	0,0025		150
	0,00125		130
3-Merkaptopropionyl-hydraziddisulfid-LL-E33288Yi-I (z príkladu 4)	0,005	18,0	164
	0,0025	25,0	186
	0,00125	19,0	173
	0,0006	15,5	141
Kontrolný pokus	-	11,0	-
3-Merkaptopropionyl-hydraziddisulfid-LL-E33288oc3-I (z príkladu 6)	0,040	15,0	136
	0,020		123
Kontrolný pokus	-	11,0	-
3-Merkaptopropionyl-hydraziddisulfid-N-acetyl LL-E33288yi-I (z pnkladu 7)	0,080	21,0	175
	0,040	18,0	150
	0,020	15,0	125
Kontrolný pokus	-	12,0	-
3-Merkaptopropionyl-hydraziddisulfid-LL-E33288a2-I	0,010	26,5	230
(z príkladu 8)	0,005	21,0	183
	0,0025	18,5	161
	0,00125	18,5	161
Kontrolný pokus	-	11,5	-
3-Merkaptobutyryl hydraziddisulfid-LL-E33288Yx-I (z príkladu 10)	0,005	28,5	190
	0,0025	23,0	153
	0,00125	21,0	140
	0,0006	19,5	130
Kontrolný pokus	-	15,0	-
3-Mcrkaptoizovaieryl-hydraziddisulfid-LL-E3 3 288γrI	0,010	26,5	252
(z príkladu 11)	0,005	18,0	171
	0,0025	17,0	162
	0,00125	16,0	152
	0,0006	13,0	124
	0,0003	14,0	133
Kontrolný pokus	-	10,5	-
4-Merkaptodihydrocin-namylhydraziddisulfid-LL-E33288y1-I	0,005	24,0	200
(z príkladu 12)	0,0025	28,0	233
	0,00125	25,5	213
	0,0006	18,5	154
	0,0003	17,5	146
Kontrolný pokus	-	12,0	-
N-Acetyl-3-merkaptovale-rylhydraziddisulfid-LL-E33288Y1-l	0,32		118
(z príkladu 13)	0,16		205
	0,08		166
	0,04		133
	0,02		117
N-Acetyl-3-merkaptobutyryl hydraziddisulfíd-LL-E33288Y1-I	0,32		142
(z príkladu 14)	0,16		135
	0,08		115
	0,04		102
	0,02		109
N-Acetyl-p-merkapto-dihydrocinnamoyl-hydraziddisulfid-LL-	0,32		75
-Ε33288γι-Ι (z príkladu 15)	0,16		150
	0,08		209
	0,04		150
	0,02		146

Test na melanotický melanóm B16

Ako pokusné zvieratá sa pri tomto teste používajú myšacie samičky BDF1. V každej testovacej skupine je 5 alebo 6 pokusných zvierat. Jednogramové množstvo nádoru (melanotický melanóm B16) sa homogenizuje v 10 ml chladného vyváženého roztoku a 0,5 ml alikvot takto získaného homogenizátu sa intraperitoneálne implantuje každej z pokusných myší. Testované zlúčeniny sa podávajú intraperitoneálne v dňoch 1 až 9 (vzhľadom na deň 0, kedy bol implantovaný nádor) v uvedených dávkach. Myši sa zvážia a zaznačí sa počet myší, ktoré prežili k 60 dňom. Z týchto údajov sa vyráta pomer času prežitia ošetrených myší (T) k času prežitia kontrolných myší (C). Ak sa stanoví hodnota T/C vyššia alebo rovnajúca sa 125 pre niektorú zlúčeninu, potom je táto testovaná zlúčenina považovaná za účinnú látku s významnou protinádorovou účinnosťou.

Spôsob podľa vynálezu, použitý na prípravu konjugátov na báze monoklonálnej protilátky zo zlúčenín uvedených v tabuľkách 1 a 2 všeobecného vzorca

Tu-(Z-Sp-SS-W)

I (Y) ' * n —m poskytuje konštrukty, ktoré si zachovávajú dobrú imunoreaktivitu s cieľovými bunkovými radmi, čo je preukázané nasledujúcimi testami in vitro.

Cieľové bunky

Všetky cieľové bunky boli prechovávané v prostredí RPMI 1640 obohatenom fetálnym teľacím sérom (FCS), ITS (Collaborative Research, Cat 40351), streptomycínom (50 pg/ml), penicilínom (50 jedn./ml), gentamycínsulfátom (50 pg/ml) a glutaminom (0,03 %). Bunky sa prechovávajú vo zvlhčovanom inkubátore (5 % CO₂) pri teplote 37 °C.

I. Imunoreakčné testy Metóda I - Elisa

Príslušné cieľové bunky sa izolujú z kultivačného prostredia, zrátajú a suspendujú v Dulbecco-vo fosfátom pufrovanom fyziologickom roztoku (DPBS) v koncentrácii, ktorá je optimálna pre testovanú monoklonálnu protilátku (MoAb). Do každej jamky 96 jamkovej polystyrénovej sterilnej kultivačnej platne sa zavedie 0,1 ml alikvot buniek. Platne sa potom odstred’ujú počas 5 minút pri 1000 otáčkach za minútu, nato sa supematanty jednotlivých jamôk odstránia vytrepaním. Platne sa potom sušia cez noc na vzduchu a môžu byť potom skladované pri teplote 4 °C počas 3 mesiacov.

Nešpecifické väzobné miesta sa blokujú pridaním 200 μί 1 % želatíny v DPBS do každej jamky a platňa sa inkubuje počas 1 hodiny pri teplote 37 °C vo zvlhčovanom inkubátore (všetky nasledujúce inkubácie sa uskutočnia za rovnakých podmienok). Platne sa potom raz premyjú 250 pl 0,05 % Tweenu-20 v DPBS (premývací roztok) s použitím automatického premývacieho systému Elisa od Dynatech (Ultrawash II).

Vzorky určené na testovanie sa zriedia na finálnu koncentráciu 3 pg/ml monoklonálnej protilátky v 0,1 % roztoku želatíny v DPBS. Z každých 3 pg/ml vzorky sa pripraví ďalších šesť prahových sériových zriedení a každé zriedenie (každé zriedenie sa použije trikrát) sa zavedie do príslušných jamôk kultivačnej platne. Do spodného radu jamôk sa zavedie ako slepý pokus iba 100 μί 0,1 % roztoku želatíny. Platne sa potom inkubujú počas 45 minút, nato sa trikrát premyjú. Purifikované kozie antimurinné imunoglobulíny s konjugovanou afinitou k alkalickej fosfatáze (Cappel Cat 8611-0231) sa zriedia v pomere 1 : 125 v 0,1 % roztoku želatíny a do každej jamky platne sa pridá 100 μί tohto zriedenia. Platne sa inkubujú počas 45 minút, nato sa trikrát premyjú. Potom sa do každej jamky pridá 200 μί p-nitrofenylfosfátového substrátového roztoku (pozri nižšie). Po 45 minútach pri teplote okolia sa reakcia zastaví pridaním 50 μί 3M roztoku hydroxidu sodného. V automatickom spektrometre od firmy Dynatech (EIA Autoreader EL-310) sa potom odráta absorbancia obsahu každej jamky pri vlnovej dĺžke 405 nm.

Substrátový dietanolaminový pufor (10 %) ml dietanolaminu,

800 ml vody, 0,2 g NaN₃ a 100 mg hexahydrátu chloridu horečnatého.

Jednotlivé zložky sa rozpustia za nepretržitého miešania, nato sa k získanému roztoku pridá IM kyselina chlorovodíková až k dosiahnutiu hodnoty pH 9,8. Celkový objem sa potom doplní vodou na 1 liter a roztok sa sterilizuje filtráciou cez filter 0,2 pm filter. Tento pufor sa skladuje v tme pri teplote 4 °C. Bezprostredne pred použitím sa v 10 % dictanolaminovom pufri (pri teplote okolia) rozpustí p-nitrofenylfosfát (Sigma, Cat 104-40) k dosiahnutiu finálnej koncentrácie 1 mg/ml.

Výpočet hodnôt zachovanej imunoreaktivity z hodnôt optickej hustoty (OD)

Percentická väzba každej vzorky sa vyráta podľa nasledujúcej rovnice:

A-B

----- x 100= percentická väzba,

C-B v ktorej

A značí priemernú optickú hustotu vzorky,

B značí priemernú optickú hustotu slepého pokusu a C značí priemernú optickú hustotu 3 pg/ml nemanipulovanej kontrolnej monoklonálnej protilátky.

Percentická väzba sa potom vynesie na nelogaritmickej stupnici scmilogaritmického grafu a na logaritmickej stupnici sa vynesie koncentrácia monoklonovanej protilátky. Z tohto grafu sa odvodí hodnota BD (t. j. požadovaná dávka protilátky k dosiahnutiu 50 % väzby) pre každú testovanú vzorku a miera zachovania imunoreaktivity sa vyráta podľa nasledujúcej rovnice

BD_ee kontrolnej monoklonálnej protilátky percentická miera

............. _x ioo= zachovanej imunoBD_bq testovenej vzorky reaktivity

Metóda 2 - Nepriame stanovenie RIA

Príslušné množstvo cieľových buniek v 0,2 ml 10 % FCS-prostredí sa zavedú do 4 ml polystyrénových skúmaviek. Vzorky určené k testovaniu sa zriedia na koncentráciu 2 pg/ml ekvivalentov monoklonálnej protilátky v 10 % prostredí FCS. Z každého 2 pg/ml vzorky sa pripraví päť trojnásobných sériových zriedení a 0,2 ml každého zriedenia (každé zriedenie vždy dvakrát) sa zavedie do zodpovedajúcej skúmavky. Na účely slepého pokusu sa do niektorých skúmaviek zavedú iba bunky a uvedené prostredie. Bunky sa inkubujú pri teplote 4 °C počas jednej hodiny, nato sa dvakrát premyjú 2 % prostredím FCS (všetky premytia RIA sa uskutočnia 3 ml objemu). Do každej skúmavky sa potom pridá 0,05 ml ovčieho F(ab')₂-animurinného imunoglobulínu IgG značeného ^l25J (DuPont, Cat NEX 162-0142) vykazujúceho približne 500 000 rozpadu za minútu. Bunky sa potom inkubujú ešte hodinu pri teplote 4 °C, raz premyjú 2 % FCS a dvakrát PBS. Do každej skúmavky sa pridá 0,5 ml PBS, bunky sa rozvíria, prevedú do čistých skúmaviek a merajú počas 1 minúty počítačom Packard Gamma 500.

Percentická väzba sa stanoví a vynesie do grafu rovnako ako v predchádzajúcej metóde Elisa s výnimkou pozostávajúcou v tom, že optická hustota je nahradená počtom rozpadov za minútu a že C značí priemerný počet rozpadov 1 pg/ml nemanipulovanej kontrolnej monoklonálnej protilátky. Percentická miera zachovanej imunoreaktivity každej vzorky sa vyráta rovnako ako v predchádzajúcom prípade.

Metóda 3 - Nepriame stanovenie RIA

Príslušné množstvo cieľových buniek v 1 ml 10 % prostredí FCS sa alikvotné rozdelí do 4 ml polystyrénových testovacích skúmaviek, skúmavky sa odstredia a supematant sa odleje. Vzorky určené na testovanie sa zriedia na koncentráciu 200 pg/ml monoklonálnej protilátky v 10 % prostredí FCS. Z každého 200 pg/ml vzorky sa pripraví päť trojnásobných sériových zriedení a 0,05 ml tohto zriedenia sa vždy zavedie (každé zriedenie dvakrát) do príslušnej skúmavky. Do každej skúmavky sa potom pridá 0,05 ml monoklonálnej protilátky značenej rádioizotopom ¹²⁵J (¹²⁵J-MoAb). Optimálne množstvo sa individuálne stanoví pre každú MoAb a šaržu. Pozitívne kontrolné vzorky obsahujú bunky, prostredie a ^l25J-MoAb. Vzorky slepého pokusu obsahujú nešpecifické bunky, prostredie a ^l25J-MoAb. Bunky sa potom inkubujú počas 1 hodiny pri teplote 4 °C, raz premyjú 2 % prostredím FCS, dvakrát premyjú PBS, prevedú do čistých skúmaviek a zmerajú rovnako ako v predchádzajúcom prípade.

Percentická inhibícia väzby ^l25J-MoAb, každej vzorky sa vyráta podľa nasledujúceho vzorca

A-B

-----x 100 = percentická inhibícia väzby ¹²⁵J-MoAb,

C-B v ktorom

A značí priemerný počet rozpadov za minútu vzorky, B značí priemerný počet rozpadov za minútu slepého pokusu a

C značí ho priemerný počet rozpadov za minútu pozitívneho kontrolnej vzorky.

Vynesenie výsledkov do grafu a výpočet zachovanej percentickej imunoreaktivity sa uskutoční rovnako ako v predošlom prípade s výnimkou pozostávajúcou v tom, že BD je teraz B1D_5O (t. j. dávka monoklonálnej protilátky potrebná k dosiahnutiu 50 % inhibície väzby ^l23J-MoAb).

Poznámky:

1. Bezprostredne po pridaní každého činidla pri stanoveniach RIA boli skúmavky vždy intenzívne pretrepané.

2. Do každého súboru stanovenia bola začlenená vnútorná kontrolná vzorka zahrnujúca 50 % nemanipulovanej kontrolnej monoklonálnej protilátky na účely zistenia, či každá metóda je kvantitatívna v rámci predbežného určenia zachovania imunoreaktivity konjugátu.

Výsledky uvedených stanovení sú zhrnuté v nasledujúcej tabuľke 4.

Tabuľka 4

Imunoreaktivita konjugátu monoklonálnej látky

Preparát í	Imunoreaktivita v percentách vztiahnutá na imunoreaktivitu nemoiifikovanej kontrolnej monoklonálnei protilátky (=100 %) %
Nešpecifické konjugáty na báze: 3-merkaptopropionylhydraziddisulfidu zlúčeniny LL-E33288-a3-I (príklad 6) konjugovaného s: Lym 1 CT-M-01	78 81
3-merkaptopropionylhydrazid-disulfidu zlúčeniny N-acetyl-LL- -E3 3288δΙ-Ι (príklad 7) konjugovaného s: Lym 1 CT-M-01 B72.3	82 100 100
3-merkaptopropionylhydrazid-disulfidu zlúčeniny LL-E33288a2-I (príklad 8) konjugovaného s: CT-M-01	56
3-merkaptopropionylhydrazid-disulfidu zlúčeniny N-acetyl-LL- -E33288-pseudoaglykónu (príklad 9) konjugovaného s: CT-M-01	50
3-merkaptobutyrylhydrazid-disulfidu zlúčeniny LL-E33288SrI (príklad 10) konjugovaného s: Lym-1	73
3-merkaptoizovalerylhydrazid-disulfidu zlúčeniny LL-E33288ô|-1 (príklad 11) konjugovaného s: Lym 1	64
p-merkaptodihydrocmnamyl-hydraziddisulfidu zlúčeniny LL-E332885rI (príklad 12) konjugovaného s: Lym-1	61
Konjugáty na báze monoklonálnej protilátky podľa vynálezu sú účinné ako protirakovinné činidlá. Opísané testy na stanovenie cytotoxicity in vitro preukazujú výraznú preferenciu opísaných konštruktov pre cieľové bunkové rady v porovnaní s necieľovými bunkovými radmi a demonštrujú mieru využiteľnosti cielených foriem týchto zlúčenín v porovnaní s ich nedelenými analógami.	Test stanovujúci cytotoxicitu in vitro Vzorky určené na testovanie sa zriedia na koncentráciu 0,2 alebo 0,02 pg/ml materskej účinnej látky (východisková koncentrácia je závislá od bunkového radu a účinnosti materskej účinnej látky). Z každého pôvodného zriedenia vzorky sa pripravia tri alebo štyri ďalšie päťnásobné zriedenia a 0,2 ml tohto zriedenia sa vždy zavedie do 15 ml sterilnej polystyrénovej skúmavky. Na účely stanovenia špeci-

fickosti príslušného konjugátu sa do každého stanovenia zahrnie aspoň jeden obdobný konjugát tvorený materskou účinnou látkou a nepríslušnou (pre dané bunky necielenou) monoklonálnou protilátkou.

10⁵ príslušných cieľových buniek v 0,2 ml 10 % prostredia FCS sa alikvotné rozdelí do skúmaviek a pretrepe sa. Okrem toho sa uskutoční rovnaký test s použitím nepríslušných cieľových buniek na účely ďalšieho potvrdenia špecifickosti príslušného konjugátu. Kontrolné vzorky monoklonálnej protilátky obsahujú iba ekvivalentné množstvo monoklonálnej protilátky a pozitívne kontrolné vzorky obsahujú iba 10 % prostredia FCS.

Bunky sa inkubujú pri teplote 37 °C počas 7 minút, nato sa štyrikrát premyjú 8 ml 2 % prostredia FCS. Do každej skúmavky sa pridá 0,1 ml 10 % prostredia FCS, skúmavky sa pretrepú a vždy 0,2 ml obsahu skúmavky sa zavedie do jamky 96-jamkovej sterilnej kultivačnej platne.

Platne sa potom inkubujú počas 2 dní vo zvlhčovanom inkubátore (5 % CO ) pri teplote 37 °C. Polovica prostredia sa odstráni a nahradí čerstvým prostredím obsahujúcim 2 pCi/ml³ -H-tymidínu (DuPont, NEN, Cat.NET-027). V inkubácii sa pokračuje počas 24 hodín, nato sa bunky zmrazia, ponechajú opäť rozmraziť a izolujú z inkubačného prostredia s použitím zariadenia pre izoláciu buniek PHD (Camridge Technology, Inc.). Každá vzorka sa potom premeria v priebehu 1 minúty na kanále 1 Beckmanova scintilačného počítača LS 5800.

Percentická inhibícia rastu sa vyráta nasledujúcim spôsobom:

Priemerný počet rozpadov za minútu testovanej vzorky ------------------------------------- x 100 « percentický Priemerný počet rozpadov za minútu nárast kontrolnej vzorky

100 - percentický nárast = percentická inhibícia

Uvedená percentická inhibícia sa vynesie na nclogaritmickej stupnici semilogaritmického grafu, zatiaľ kým na logaritmickej stupnici sa vynesie koncentrácia materskej účinnej látky. Hodnota IC₅o (koncentrácia materskej účinnej látky nevyhnutná k dosiahnutiu 50 % inhibície) pre každú testovanú vzorku sa odvodí z uvedeného grafu a miera zachovanej cytotoxicity sa vyráta z nasledujúcej rovnice:

IC_bo materskej účinnej látky

------------- . .. . x iqo » zachovaná cytotoxicita (í) ic_8e testovanej vzorky

Získané výsledky sú uvedené v nasledujúcej tabuľke 5.

Tabuľka 5

Cytotoxicita in vitro konjugátov MoAb

	MoAb	Cytotoxicita
Hydrazidový konjugát pripravený s použitím produktu z príkladu 6 s:	Lym 1	% LL-E33288a3-I 500
	CT-M-01	300
Hydrazidový konjugát pripravený za použitia produktu z príkladu 7 s :	Lym 1	% N-acetyl-LL-E3 3 288δχ-Ι 400
	CT-M-01	700
Hydrazidový konjugát pripravený s použitím produktu z príkladu 8 s :	CT-M-01	% produkt z príkladu 8 -18
Hydrazidový konjugát pripravený s použitím produktu z príkladu 9 s:	CT-M-01	% produkt z príkladu 9 100
Hydrazidový konjugát pripravený s použitím produktu z príkladu 10 s:		% produkt z príkladu 10
	Lym 1	400
Hydrazidový konjugát pripravený s použitím produktu z príkladu 11 s:	Lym 1	% produkt z príkladu 11 320
Hydrazidový konjugát pripravený s použitím produktu z príkladu 12 s:	Lym 1	% produkt z príkladu 12 560

Na účely stanovenia účinnosti konjugátov podľa vynálezu in vivo bol použitý nasledujúci testový model.

Testy in vivo stanovujúce protinádorovú účinnosť konjugátov účinná látka-monoklonálna protilátka boli uskutočnené s použitím ľudských nádorových štepov pri athymických (holých) myšiach. Bunky Burkittova lymfomu(Raji) a myelomu(HS Sultán) sa izolujú z kultivačných buniek, nato sa subkutánne zaočkujú (80x10^s Raji-buniek alebo 40x10⁶ HS Sultan-buniek) pokusným myšiam. Pri athymických myšiach sa propagujú pevné nádory, karcinómy vaječníkov (CA73, Ovcar-3), karcinóm prsníka (MX-1) a karcinóm tračníka (LS174T. Tieto sa potom odpreparujú, narežú na fragmenty s veľkosťou 2 mm³ a subkutánne implantujú pokusným myšiam (5 až 8 fragmentov na každú myš).

Účinné látky, monoklonálne protilátky a konjugáty účinná látka-monoklonálna protilátka sa podávajú intraperitoneálne vždy raz za tri dni celkom v troch alebo piatich injekciách počínajúc 2., 3., 4., 6., 7. alebo 8. deň po implantácii nádoru. Meranie nádorov (dĺžka a šírka nádoru) sa uskutoční pomocou Fowlerova elektronického posuvného meradla Ultra CAL II každý siedmy deň počas 4 až 6 týždňov po implantácii nádoru. Hmota nádoru v miligramoch sa vyráta z nasledujúceho vzorca:

Dĺžka (mm) x šírka (mm) Hmota nádoru (mg) = ----------------------2

Pre každú testovanú skupinu sa vyráta inhibícia rastu nádoru v percentách vzhľadom na kontrolnú skupinu (priemerný počet mg pri ošetrených pokusných zvieratách

SK 284270 Β6 (T) delený priemerným počtom mg pri kontrolných zvieratách (C) x 100). Za hodnotu nevyhnutnú k demonštrovaniu účinnosti je považovaná hodnota T/C menšia alebo rovna júca sa 42 % v skupinách s aspoň 65 % prežijúcich pokusných zvierat.

Výsledky tohto testu sú zahrnuté v nasledujúcej tabuľke 6.

Tabuľka 6

Test na protinádorovú účinnosť in vivo

Veľkosť nádoru (T/C)

Dávka (pg)

MoAb	, v Účinná látka	/o na Kuiiuuiiiu o/1 skupinu
Hydrazid 3-merkaptopropio-nyldisulfidu LL-E333288
α,-Ι konjugovaný s Lym 1	28	0,75	1,3	6/6
samotná LL-E33288a3-I	-	0,75	365	6/6
samotný hydrazid	-	0,75	330	6/6
samotná MoAb	28	-	68	6/6
intraperitoneálna aplikácia proti ľudskému Burkittovu lymfomu bunkového radu Raji TC; tri injekcie počínajúc siedmy deň po
implantácii nádoru; uvedené merania sa uskutočnia 28. deň po implantácii
Hydrazid 3-merkaptopropio-nyldisulfídu LL-E333288
α,-I konjugovaný s CT-M-01	83	2,0	0,02	0/6
samotná LL-E33288a3-I	-	2,0	-	0/6
samotná CT-M-01 d	83	-	75	5/6
vincristine (pozitívna kontrola)	-	20	1,2	5/5
intraperitoneálna aplikácia proti ľudskému nádoru prsníka bunkového radu MX01; tri injekcie počínajúc druhý deň po implantá-
cii nádoru; uvedené merania sa uskutočnia 35. deň po implantácii
Hydrazid N-//(4-metyl-kumarín-7-yl)amino/ace-tyl/cy-
steindisulfidu LL-E33 288δ,-I konjugovaný s Lym 1	50	0,22	23	7/7
samotný hydrazid	-	0,22	228	4/7
samotná MoAb Lym 1	50	-	61	7/7
zmes hydrazidu plus MoAb Lym 1	50	0,22	56	7/7
intraperitoneálna aplikácia proti ľudskému Burkittovu lymfomu bunkového radu Raji TC; tri injekcie počínajúc siedmy deň po
implantácii nádoru; uvedené merania sa uskutočnia 35. deň po implantácii
Hydrazid 3-merkaptopropio-nyldisulfidu N-acetyl-LL-
-Ε33288δ1-Ι konjugovaný s CT-M-01	125	1,0	0	6/6
samotný hydrazid	-	2,0	71	3/6
Zmes N-acetyl-LL-E33288 ôrI plus MoAb CT-M-01	125	1,0	5	1/6
N-acetyl-LL-E33288 8rI	-	1,0	46	2/6
intravenózna aplikácia proti ľudskej rakovine prsníka bunkového	radu MX-1	; tri injekcie počínajúc druhý deň po implantácii ná-
doru; uvedené merania sa uskutočnia 42. deň po implantácii
Hydrazid 3-merkaptopropio-nyldisulfidu N-acetyl LL-
-Ε33288δι-Ι konjugovaný s Lym 1	37	1,0	11	6/6
samotný hydrazid	-	1,0	517	6/6
samotná N-acetyl-LL-E332886·-!	-	0,5	226	6/6
samotná MoAb Lym 1	37	-	178	6/6
intravenózna aplikácia proti Burkittovu lymfomu bunkového radu Raji TC; tri injekcie počínajúc siedmy deň po implantácii ná-
doru; uvedené merania sa uskutočnia 35. deň po implantácii
Hydrazid 3-merkaptopropio-nyldisulfidu N-acetyl-LL-
-E33288ôj-I konjugovaný s B72,3	127	2,7	61	6/6
samotná N-acetyl-LI.-E33288d1-I	-	2,0	32	1/6
samotná B72,3	127	-	125	6/6
vincristin (pozitívna kontrola)	-	20	23	6/6
intravenózna aplikácia proti ľudskej rakovine tračnika bunkového radu LS174T; tri injekcie počínajúc ôsmy deň po implantácii
nádoru; uvedené merania sa uskutočnia 21. deň po implantácii
Hydrazid 3-merkaptopropio-nyldisulfidu N-acetyl LL-
-E33 288δ.-I konjugovaný s CT-M-01	112	2,7	40	5/6
samotná N-acetyl-LL-E33288ôrI	-	2,0	32	1/6
vincristin (pozitívna kontrola)	-	20	23	6/6
intravenózna aplikácia proti ľudskému karcinómu tračnika bunkového radu LS174T; tri injekcie počínajúc ôsmy deň po implan-
tácii nádoru; uvedené merania sa uskutočnia 21. deň po implantácii
Hydrazid 3-merkaptopropio-nyldisulfidu LL-E33288a2-				2
I konjugovaný s CT-M-01	242	1,0	0,33	/6
samotný hydrazid	-	1,0	-	0/6

intravenózna aplikácia proti ľudskej rakovine prsníka bunkového radu MX-1; tri injekcie počínajúc druhý deň po implantácii nádoru; uvedené merania sa uskutočnia 35. deň po implantácii

Prehľad obrázkov na výkresoch

Vynález je bližšie ilustrovaný na pripojených výkresoch, na ktorých

- obr. 1 znázorňuje ultrafialové spektrum protinádorového antibiotika označeného ako N-acetyl-LL-E33288-y|-I,

- obr. 2 znázorňuje infračervené spektrum protinádorového antibiotika označeného ako N-acetyl-LL-E33288-Yi-I,

- obr. 3 znázorňuje protónové nukleárne magnetickorezonančné spektrum protinádorového antibiotika označeného ako N-acetyl-LL-E33288-y_rl,

- obr. 4 znázorňuje ^l3C-nukleáme magnetickorezonančné spektrum protinádorového antibiotika označeného ako N-acetyl-LL-E33288-y₁-I,

- obr. 5 znázorňuje ultrafialové spektrum protinádorového antibiotika označeného ako jód-LL-E33288-pseudoaglykón,

- obr. 6 znázorňuje infračervené spektrum protinádorového antibiotika označeného ako N-acetyl-LL-E33288-pseudoaglykón,

- obr. 7 znázorňuje protónové nukleárne magnetickorezonančné spektrum protinádorového antibiotika označeného ako jód-LL-E33288-pseudoaglykón a

- obr. 8 znázorňuje ’³C-nukleáme magnetickorezonančné spektrum protinádorového antibiotika označeného ako jód-LL-E3 3288-pseudoaglykón.

V nasledujúcej časti opisu bude vynález bližšie objasnený pomocou konkrétnych príkladov jeho uskutočnenia.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

3-Merkaptopropionyldisulfid zložky 1.Ε-Ε33288γ,-Ι

K roztoku 90 mg LL-E3 3 288γ-Ι v 90 ml acetonitrilu sa pridá 10,6 mg kyseliny 3-merkaptopropionovej v 1 ml acetonitrilu. Získaný roztok sa dôkladne premieša a potom skladuje pri teplote -20 °C počas 6 hodín. Rozpúšťadlo sa odoženie za vákua a zvyšok sa chromatografuje na stĺpci silikagélu s použitím elučného činidla tvoreného najskôr 50 ml metylénchloridu, potom 50 ml 4 % metanolu v metylénchloridu a nakoniec 100 ml 8 % metanolu v metylénchloride. Po odparení tejto poslednej frakcie sa získa zvyšok, ktorý sa vyberie etylacetátom s malým množstvom acetónu a získaný podiel sa po kvapkách pridá k prebytku hexánu. Vylúčená zrazenina sa izoluje a vysuší, pričom sa získa 39 mg požadovaného produktu (hmotové spektrum/ionizácia rýchlymi atómami/: M+H 1394).

Príklad 2 p-Nitrofenyl-3-merkaptopropionyldisulfid zložky LL-E33288y,-I

Stupeň A

Príprava p-nitrofenylesteru kyseliny 3-merkaptopropionovej

Komerčne dostupná kyselina 3-merkaptopropionová v metylénchloride obsahujúcom katalytické množstvo koncentrovanej kyseliny sírovej sa uvedie v reakciu s izobutylénom počas 20 minút. Roztok sa potom extrahuje IN roztokom hydrogenuhličitanu sodného po predchádzajúcom vysušení metylénchloridového roztoku nad bezvodým síranom horečnatým. Roztok sa potom odparí, aby sa získala bezfarebná mobilná kvapalina, ktorej nukleárne magnetickorezonančné spektrum a hmotové spektrum dokazujú, že ide o terc, butylester kyseliny S-terc.butylmerkaptopropi on ovej.

Alikvotný podiel tohto esteru sa zohrieva na teplotu varu pod spätným chladičom s 6N kyselinou chlorovodíkovou v dioxáne počas 2,5 hodiny. Rozpúšťadlo sa potom odparí, pridá sa etylacetát a získaný roztok sa extrahuje uhličitanom sodným. Natrium-karbonátový extrakt sa potom zlučuje s 6N kyselinou chlorovodíkovou až k dosiahnutiu pH suspenzie 2,0. Táto suspenzia sa potom extrahuje etylacetátom, extrakt sa vysuší nad bezvodým síranom horečnatým, zbaví rozpúšťadla a týmto spôsobom sa získa bezfarebná kvapalina, ktorej ’H-nukleáme magnetickorezonančné spektrum dokazuje spoločne s hmotovým spektrom, že ide o kyselinu S-terc. butylmerkaptopropionovú.

Táto kyselina sa potom prevedie na p-nitrofenylester reakciou s ekvimolámymi množstvami p-nitrofenolu a dicyklohexylkardodimidu v tetrahydrofuráne počas 4 hodín. Dicyklohexylmočovinový vedľajší produkt sa odstráni filtráciou a filtrát sa odparí na olejovom kúpeli. Získaný olejovitý produkt sa chromatografuje na účely prečistenia na neutrálnom silikagéli s použitím elučnej sústavy tvorenej zmesou hexánu a metylénchloridu v objemovom pomere 50 : 50. Čistý p-nitrofenylesterový derivát je žltkastý pohyblivý olej.

Voľný merkaptán sa odmaskuje nasledujúcim postupom. Kyselina S-t-butylmerkaptopropionová vo forme p-nitrofenylesteru sa rozpustí v kyseline trifluóroctovej a k získanému roztoku sa potom pridá mierny molámy prebytok (10 %) octanu ortuťnatého. Získaná zmes sa potom mieša počas 30 minút, kyselina trifluóroctová sa odparí a zvyšok sa vyberie dimetylformamidom. Tento roztok sa uvedie do styku so sírovodíkom počas 15 minút, nato sa čierny sírnik ortuťnatý odfiltruje a filtrát sa odparí pri zníženom tlaku na účely odstránenia až 99 % dimetylformamidu. Získaná svetlohnedá mobilná kvapalina sa prečistí chromatografiou na neutrálnom silikagéli s použitím elučnej sústavy tvorenej zmesou hexánu a metylénchloridu v objemovom pomere 50 : 50. 'H-nukleáme magnetickorezonančné spektrum ukazuje, že hlavná zložka obsahuje malé množstvo terc, butylmerkapto-derivátu. Analytická vysokotlaková kvapalinová chromatografia na dvoch tandemovo usporiadaných stĺpcoch Perkin-Elmer Pecosphere C₁₈ (4,6x33 mm a 4,6x83 mm) s použitím elučnej sústavy tvorenej gradientovým systémom acetonitrilu a 0,1 M amoniumacetátového pufra pH 6,5 (kyselina octová) v objemovom pomere 37,5/62,5 až 47,5/52,5 v rozpätí 12 minút ukazuje, že produkt obsahuje 88 % p-nitrofenyl-esteru kyseliny 3-merkaptopropionovej a 10 % menej polámejšieho p-nitrofenylesteru kyseliny S-t-butylmerkaptopropionovej. Je tu rovnako prítomné malé množstvo voľného p-nitrofenolu.

Stupeň B

Reakcia p-nitrofenylesteru kyseliny 3-merkaptopropionovej so zložkou LL-E33288y_rI

100 mg podiel zložky LL-E33288y,-I sa rozpustí v 50 ml acetonitrilu. K takto získanému roztoku sa pridá roztok 25,7 mg p-nitrofenylesteru kyseliny 3-merkaptopropionovej v 1 ml acetonitrilu. Reakcia sa uskutoční pri teplote 20 °C počas 48 hodín. Dokončenie reakcie sa preukáže vysokotlakovou kvapalinovou chromatografiou. Roztok sa odparí do sucha, zvyšok sa vyberie 4 až 5 ml etylacetátu, pričom sa na získanie roztoku použije ultrazvuk. Zmes sa potom sfiltruje a filtrát sa potom nakvapká do 45 ml miešaného hexánu. Rezultujúci žltkastý pevný podiel sa izoluje a vysuší pri zníženom tlaku, pričom sa získa 93 mg p-nitrofenylesteru kyseliny propiónovej vo forme derivátu so zložkou LL-E33288yi-J, čo bolo preukázané lH-nukleárnym magnetickorezonančným spektrom. Pri hmotovej spektroskopii (ionizácia rýchlymi atómami) je (M+H) ión indikovaný pri m/z= 1515.

Retenčný čas na reverznej fáze C_]f! pri HPLC s použitím 50 % acetonitrilu v 0,lM vodnom roztoku octanu a mónneho: 18 minút (LL-E33288ô_rl: 8,0 min., esterový hydrolyzný produkt: 1,5 min.).

Príklad 3

N-Hydrosukcinimidyl-3-merkaptopropionátdisulfid zložky LL-E3 3 288γ,-Ι

K roztoku 5 mg 3-merkaptopropionyldisulfidového analógu zložky LL-E33288yi-I z európskej patentovej prihlášky v 0,5 ml tetrahydrofuránu sa pridá 0,45 mg N-hydroxysukcinimidu v 0,1 ml tetrahydrufuránu a potom 1,8 mg dicyklohexylkarbodiimidu v 0,2 ml tetrahydrofuránu. Reakčná zmes sa potom mieša pri teplote okolia počas 4 hodín, nato sa reakcia ukončí pridaním prebytku hexánu. Pevný podiel sa izoluje filtráciou a rozpustí v etylacetáte. Rezultujúci roztok sa premyje trikrát soľankou, vysuší nad síranom horečnatým a odparí, pričom sa získa 5 mg požadovaného produktu vo forme žltohnedého prášku, ktorý sa použije bez ďalšieho čistenia. Retenčný čas na reverznej fáze pri HPLC s použitím elučnej sústavy tvorenej 40 % acetonitrilom v 0,lM vodnom roztoku octanu amónneho: 15 minút (východisková látka: 6,0 minút).

Príklad 4

3-Merkaptopropionylhydraziddisulfid zložky LL-E33288y,-I

K 5,4 ml (3 ekv.) bezvodého hydrazínu v 100 ml tetrahydrofuránu zohrievaného na teplotu varu pod spätným chladičom sa pod atmosférou argónu po kvapkách pridá 9,2 ml (83 mmolu) metyl-3-merkaptopropionátu v 50 ml tetrahydrofuránu v priebehu dvoch hodin. Roztok sa potom zohrieva na teplotu varu ešte počas dvoch hodín, odparí a potom zriedi a dvakrát odparí z 300 ml toulénu. Získaný produkt sa potom nanesie v 5 % etylacetátu v chloroforme na stĺpec silikagélu a eluuje 20 % metanolom v chloroforme. Rezultujúci 3-merkaptopropionylhydrazid je ružovkastý olej, ktorý pri ochladení tuhne a pri teplote okolia opäť sa topí.

K 50 mg zložky LL-E3 3288y_rI v 50 ml acetonitrilu sa pri -15 °C pridá 6,6 mg 3-merkaptopropionylhydrazidu v 1 ml tetrahydrofuránu. Pridá sa jeden ekvivalent trietylamínu alebo jeden ekvivalent trietylamínu a jeden ekvivalent kyseliny octovej. Reakčná zmes sa mieša pri teplote 0 °C počas jednej hodiny, nato sa rozpúšťadlo odparí. Zvyšok sa chromatografuje na silikagéli s použitím elučnej sústavy tvorenej 10 až 15 % (gradient) metanolu v chloroforme, pričom sa získa 26 mg požadovaného produktu. Hmotové spektrum (ionizácia rýchlymi atómami): m/z=1408 (M+H); retenčný čas na referznej fáze C₁₈pri HPLC: 5 minút (41 % acetonitril v 0,1 M vodnom roztoku octanu amónneho).

Príklad 5 N-//(4-Metylkumarín-7-yl)amino/acetyľcysteinhydraziddisulfid zložky LL-E33288yi-I

Zmes 1,0 g (5,7 mmolu) 4-metyl-7-aminokumarínu, 3,0 ml etylbrómacetátu (5 ekv.), 90 mg (0,1 ekv.) jodidu sodného a 30 ml dimetylformamidu sa zohrieva pod atmosférou argónu na teplotu 80 °C počas 5 hodín. Reakčná zmes sa potom ochladí, zriedi dietyléterom, trikrát premyje 50 % soľankou, vysuší nad síranom horečnatým a odparí do sucha. Surový produkt sa rozpustí v chloroforme obsahujúcom 1 % etylacetátu a sfiltruje cez stĺpec silikagélu. Rekryštalizáciou z dietyléteru obsahujúceho stopy chloroformu sa získa čistý etyl-N-/(4-metylkumarín-7-yl)amino/acetát.

K 1,96 g (7,5 mmolu) uvedeného esteru v 15 ml metanolu a 15 ml tetrahydrofuránu sa pridá 10 ml IN vodného roztoku hydroxidu sodného. Po 30 minútach sa pridá 4 ml 10 % vodného roztoku kyseliny chlorovodíkovej. Organické rozpúšťadlá sa odparia a získaný kryštalický produkt sa odfiltruje a premyje chladným etanolom a potom éterom.

Tento produkt sa rozpustí v 20 ml tetrahydrofuránu a 4 ml dimetylformamidu. Pridá sa dicyklohexylkarbonyldiimidazol (1,3 g, 2,2 ekv.) a reakčná zmes sa mieša počas 15 minút. Potom sa pridajú cisteinetylesterhydrochlorid (1,6 g, 2,5 ekv.) a trietylamín (1,2 ml). Po ďalších troch hodinách sa reakčná zmes zriedi dietyléterom obsahujúcim 5 % metylénchloridu a raz premyje 10 % vodným roztokom kyseliny chlorovodíkovej a potom dvakrát soľankou. Po vysušení nad síranom horečnatým a odparení rozpúšťadiel sa surový produkt rekryštalizuje rozpustením v chloroforme obsahujúcom minimálne množstvo etanolu a pridaním prebytku éteru. Vylúčené kryštály sa odfiltrujú a vysušia, pričom sa získa čistý N-//(4-metylkumarín-7-yl)amino/acetyl/ cysteinetylester.

Zmes 5 ml chloroformu, 20 ml metanolu a 0,4 ml hydrazínhydrátu sa zohrieva na teplotu varu pod spätným chladičom a pod atmosférou argónu. Pridá sa 550 mg N-//(4-metyl kumarín-7-yl)amino/acetyl/cysteinctylesteru. Po 9 hodinovom zohrievaní na teplotu varu pod spätným chladičom sa reakčná zmes ochladí a pevný produkt sa odfiltruje a premyje chloroformom a potom etyléterom. Surový produkt (ktorý obsahuje tiol a disulfid) sa rozpustí v dimetylformamide obsahujúcom ditiotreitol a trietylamín. Po 30 minútach sa produkt vyzráža prebytkom dietyléteru a izoluje filtráciou. Tento materiál sa ďalej prečistí rekryštalizáciou z odplyňovaného acetonitrilu obsahujúceho ditiotreitol a stopy trietylamínu, pričom sa získa čistý N-//(4-mctylkumarín-7-yl)amino/acetyl/cystemhydrazid.

K 12 mg LL-E3 3 288γι-Ι v 12 ml acetonitrilu sa pri teplote 0 °C pridá 4 mg N-//(4-metylkumarín-7-yl)amino/acetyl/cysteinhydrazidu v 1,2 ml dimetylformamidu. Po celonočnom miešaní sa pridá ďalších 2 mg N-//(4-metylkumarín-7-yl)amino/ acetyl/cysteinhydrazidu v 0,6 ml dimetylformamidu. Reakčná zmes sa mieša počas 3 dní pri teplote 0 °C a sfiltruje. Acetonitril sa odparí a získaný dimetylformamidový roztok sa zriedi prebytkom zmesi hexánu a éteru v objemovom pomere 1:1. Produkt sa izoluje filtráciou a ďalej sa prečistí chromatografiou na silikagéli s použitím elučnej sústavy s 15 až 20 % gradientom metanolu v chloroforme, pričom sa získajú 3 mg požadovaného produktu. Retenčný čas na reverznej fáze C₁₈ pri HPLC: 3,5 min. s použitím 45 % acetonitrilu v 0,1 M vodnom roztoku octanu amónneho (LL-E33288ó-J: 15,5 min. v rovnakom elučnom systéme).

Príklad 6

3-Merkaptopropionylhydraziddisulfid zložky LL-E3 3 288a₃-I

K 10 mg LL-E33288a₃-I v 9 ml acetonitrilu sa pri teplote -15 °C pridá 6,6 mg 3-merkaptopropionhydrazidu v 1 ml acetonitrilu. Potom sa pridá jeden ekvivalent trietylamínu alebo jeden ekvivalent trietylamínu a jeden ekvivalent kyseliny octovej. Reakčná zmes sa mieša pri teplote 0 °C počas jednej hodiny, nato sa rozpúšťadlo odparí. Zvyšok sa chromatografuje na silikagéli, pričom sa ako elučná sústava použije 10 až 15 % (gradient) metanol v chloroforme. Z patričnej frakcie eluátu sa získa požadovaný produkt. Hmotové spektrum (ionizácia rýchlymi atómami): m/g=1251 (M+H), retenčný čas na reverznej fáze C₁₈ pri HPLC: 2,1 min. s použitím elučnej sústavy tvorenej 45 % acetonitrilom v 0,1 M vodnom roztoku octanu amónneho (LL-E33288a₅-I: 5,7 min. v rovnakej elučnej sústave.

Príklad 7

3-Merkaptopropionylhydraziddisulfid zložky N-acetyl-LL-Ε33288_γι-Ι

K 10 mg LL-E33288yi-I v 10 ml acetonitrilu sa pri teplote -15 °C pridá 1,5 mg 3-merkaptopropionhydrazidu v μΐ acetonitrilu. Potom sa pridá jeden ekvivalent trietylamínu. Reakčná zmes sa mieša pri teplote 0 °C počas dvoch hodín, nato sa rozpúšťadlo odparí. Zvyšok sa chromatografuje na silikagéli, s použitím elučnej sústavy tvorenej 10 až 15 % (gradient) metanolu v chloroforme. Hmotové spektrum (ionizácia rýchlymi atómami): m/z=1450 (M+H), retenčný čas na reverznej fáze C_]8 pri HPLC: 2,5 min. s použitím 50 % acetonitrilu v 0,05M vodnom roztoku dihydrogenfosforečnanu amónneho (N-acetyl-LL-ESSŽSS/rl: 6,6 min. v rovnakej elučnej sústave.

Príklad 8

3-Merkaptopropionylhydraziddisulfid zložky LL-E33288a₂-I

K 10 mg LL-E33288a₂-I v 10 ml acetonitrilu sa pri teplote -15 °C pridá 1,5 ekvivalentu 3-merkaptopropionhydrazidu v 1 ml acetonitrilu. Potom sa pridá jeden ekvivalent trietylamínu. Reakčná zmes sa mieša pri teplote 0 °C počas jednej hodiny, nato sa rozpúšťadlo odparí. Zvyšok sa chromatografuje na silikagéli, s použitím elučnej sústavy tvorenej 5 až 15 % metanolom v chloroforme (gradient). Z patričnej frakcie eluátu sa získa požadovaný produkt. Hmotové spektrum (ionizácia rýchlymi atómami): m/z=1248 (M+H), retenčný čas na reverznej fáze pri HPLC: 2,6 min. s použitím 58 % acetonitrilu v 0,05M vodnom roztoku dihydrogenfosforečnanu amónnom (N-acetylLL-E33288ct₂-I: 7,5 min. v rovnakej elučnej sústave.

Príklad 9

3-Merkaptopropionylhydraziddisulfid zložky jód -LL-E33288-pseudoaglykón

K 10 mg jód- LL-E3 3288-pseudoaglykónu v 9 ml acetonitrilu sa pri teplote -15 °C pridá 1,5 ekvivalentu 3-merkaptopropionhydrazidu v 1 ml acetonitrilu. Ako katalyzátor sa pridá jeden ekvivalent trietylamínu. Reakčná zmes sa potom mieša pri teplote 0 °C počas jednej hodiny, nato sa rozpúšťadlo odparí. Zvyšok sa chromatografuje na silikagéli, s použitím elučnej sústavy tvorenej 10 až 15 % (gradient) metanolom v chloroforme. Z patričnej frakcie eluátu sa získa požadovaný produkt. Hmotové spektrum (ionizácia rýchlymi atómami): m/z=1091 (M+H), retenčný čas na reverznej fáze C₁₈ pri HPLC: 2,8 min. s použitím 50 % acetonitrilu v 0,05M dihydrogenfosforečnanu amónnom (jód-LL-E3 3288-pseudoalykón: 7,9 min. v rovnakej elučnej sústave).

Príklad 10

3-Merkaptobutyrylhydraziddisulfid zložky LL-E3 3 288γ,-Ι

K 17,2 g (0,2 molu) kyseliny krotónovej sa pridá 18 ml (0,26 molu) kyseliny tiooctovej. Táto zmes sa zohrieva na teplotu varu pod spätným chladičom a pod atmosférou argónu počas 6 hodín. Prebytok kyseliny tiooctovej sa odstráni pri zníženom tlaku (vodná výveva) a rezultujúci olej sa rozpustí v 100 ml absolútneho etanolu obsahujúceho 200 μΐ koncentrovanej kyseliny sírovej. Reakčná zmes sa potom zohrieva na teplotu varu pod spätným chladičom počas 10 hodín, nato sa jej objem redukuje za podtlaku vodnej vývevy. Pridá sa hexán a získaný roztok sa postupne premyje dvoma dávkami nasýteného vodného roztoku hydrogenuhličitanu sodného a jednou dávkou vody. Tento roztok sa potom vysuší nad síranom horečnatým, sfiltruje a zbaví rozpúšťadla, pričom sa získa olejovitý produkt. Tento surový produkt sa rozpustí v 250 ml metanolu obsahujúceho 12 ml hydrazínu a získaná zmes sa zohrieva na teplotu varu pod spätným chladičom pod atmosférou argónu počas 10 hodín. Objem reakčnej zmesi sa potom zníži, nato sa rýchlo destiluje v guľôčkovom destilačnom prístroji a ponechá vykryštalizovať v zmesi chloroformu a hexánu na získanie 3-merkaptobutyrylhydrozidu.

K 5 mg LL-E332 88γι-Ι v 10 ml acetonitrilu sa pri teplote -15 °C pridá 1,5 ekvivalentu 3-merkaptopropionylhydrazidu v 1 ml acetonitrilu. Pridá jeden ekvivalent trietylamínu.

Reakčná zmes sa mieša pri teplote 0 “C počas jednej hodiny a rozpúšťadlo sa odparí. Zvyšok sa chromatografuje na silikagéli, s použitím elučnej sústavy tvorenej 10 až 15 % metanolom v chloroforme (gradient). Z patričnej frakcie eluátu sa získa požadovaný produkt. Hmotové spektrum (ionizácia rýchlymi atómami): m/e=1422 (M+H), retenčný čas na reverznej fáze C₁₈ pri HPLC: 3,5 min. s použitím 43 % acetonitrilu v 0,05M vodnom roztoku dihydrogenfosforečnanu amónnom (LL-E33288/,-I: 13,4 min. v rovnakej elučnej sústave).

Príklad 11

3-Merkaptoizovalerylhydraziddisulfid zložky LL-E33288y,-1

K 10 g (0,1 molu) kyseliny 3,3-dimetylakrylovej sa pridá 9 ml (0,13 molu) kyseliny tiooctovej. Táto zmes sa zohrieva na teplotu varu pod spätným chladičom a pod atmosférou argónu počas 6 hodín. Prebytok kyseliny tiooctovej sa odstráni pri zníženom tlaku (vodná výveva) a rezultujúci olej sa rozpustí v absolútnom etanole obsahujúcom 200 μΐ koncentrovanej kyseliny sírovej. Táto reakčná zmes sa zohrieva na teplotu varu pod spätným chladičom počas 34 hodín, nato sa pridá 16 ml hydrazínu. Rezultujúca zmes sa zohrieva na teplotu varu pod spätným chladičom a pod atmosférou argónu počas 24 hodín. Objem reakčnej zmesi sa redukuje a zvyšok sa rozpustí v zmesi soľanky a nasýteného vodného roztoku hydrogenuhličitanu sodného. Produkt sa extrahuje niekoľkými objemami chloroformu. Zlúčené chloroformové frakcie sa vysušia nad síranom horečnatým, sfiltrujú a zbavia rozpúšťadla, pričom sa získa olejovitý produkt. Tento olej sa prečistí okamihovou chromatografiou s použitím gradientu metanolu v chloroforme ako elučnej sústavy a potom rekryštalizáciou zo zmesi chloroformu a hexánu, pričom sa získa 3-merkaptoizovalerylhydrazid.

K 15 mg LL-E3 3288/,-1 v 5 ml acetonitrilu sa pri teplote -15 °C pridá 1,5 ekvivalentu 3-merkaptoizovalerylhydrazidu v 100 μΐ acetonitrilu. Ako katalyzátor sa pridá jeden ekvivalent trietylamínu. Reakčná zmes sa potom mieša pri teplote okolia počas troch hodín, nato sa rozpúšťadlo odparí. Zvyšok sa chromatografuje na silikagéli, s použitím elučnej sústavy tvorenej 10 až 15 % metanolom v chloroforme (gradient), pričom sa z príslušnej frakcie eluátu získa požadovaný produkt. Hmotové spektrum (ionizácia rýchlymi atómami): m/z=1436 (M+H), retenčný čas na reverznej fáze C_]8 pri HPLC: 3,9 min. s použitím 43 % acetonitrilu v 0,05M vodnom roztoku dihydrogenfosforečnanu amónneho (LL-E33 288/,-I: 13,4 min. v rovnakej elučnej sústave.

Príklad 12 p-Merkaptodihydrocinnamoylhydraziddisulfid zložky LL-Ε33288γ,-1

K 500 mg (2,75 mmolu) kyseliny p-merkaptodihydroškoricovej sa pridá 15 ml metanolu obsahujúceho jednu kvapku koncentrovanej kyseliny sírovej. Reakčná zmes sa zohrieva na teplotu varu pod spätným chladičom počas 5 hodín, nato sa ochladí na teplotu okolia. Pridá sa hydrazin (1,5 ml) a získaná zmes sa zohrieva na teplotu varu pod spätným chladičom a pod atmosférou argónu počas 2 hodín, nato sa potom mieša pri teplote okolia počas 10 hodín. Na účely redukcie všetkých disulfidov prítomných v reakč nej zmesi sa pridá 200 mg ditiothreitolu a reakčná zmes sa ochladí na teplotu -15 °C. Získané kryštály sa odfiltrujú, premyjú zmesou éteru a metanolu, nato sa vysušia vo vákuovej sušiarni 50 °C, 10 hodín), pričom sa získa p-merkaptodihydrocinnamoylhydrazid.

K 25 mg LL-E33288y_rI v 25 ml acetonitrilu sa pri teplote -15 °C pridá 1,5 ekvivalentu p-merkaptodihydrocinnamoyl hydrazidu v 1 ml acetonitrilu. Reakčná zmes sa mieša pri teplote 0 °C počas desať hodín, nato sa rozpúšťadlo odparí. Zvyšok sa chromatografúje na silikagéli, s použitím elučnej sústavy tvorenej 10 až 15 % metanolom v chloroforme (gradient), nato sa z patričnej frakcie eluátu získa požadovaný produkt. Hmotové spektrum (ionizácia rýchlymi atómami): m/z=1484 (M+H), retenčný čas na reverznej fáze C₎₈ pri HPLC: 5,4 min. s použitím 43 % acetonitrilu v 0,05 M vodnom roztoku dihydrogenfosforečnanu amónneho (LL-E33288yi-I: 13,4 min. v rovnakej elučnej sústave.

Príklad 13

3-Merkaptoizovalerylhydraziddisulfid zložky N-acetyl-LL-E33288y_rI

K 20 mg N-acetyl-LL-E33288y₁-I v 15 ml acetonitrilu sa pri teplote -15 °C pridajú 3 ekvivalenty 3-merkaptoizovalerylhydrazidu v 6,2 ml acetonitrilu. Pridá sa jeden ekvivalent trietylamínu. Reakčná zmes sa mieša pri teplote okolia počas dvoch hodín, nato sa rozpúšťadlo odparí. Zvyšok sa chromatografúje na silikagéli, s použitím elučnej sústavy tvorenej 10 až 15 % metanolom v chloroforme (gradient), nato sa z patričnej frakcie eluátu získa požadovaný produkt. Retenčný čas na reverznej fáze pri HPLC: 2,5 min. s použitím 50 % acetonitrilu v 0,05M vodnom roztoku dihydrogenfosforečnanu amónneho (N-acetyl-LL-E33288y_rI: 6,6 min. v rovnakej elučnej sústave.

Príklad 14

3-Merkaptobutyrylhydraziddisulfid zložky N-acetyl-LL-E33288y_rI

K 10 mg N-acetyl-LL-E33288y_rI v 7,5 ml acetonitrilu sa pri teplote -15 °C pridajú 3 ekvivalenty 3-merkaptobutyrylhydrazidu v 5 ml acetonitrilu. Pridá sa jeden ekvivalent trietylamínu. Reakčná zmes sa mieša pri teplote okolia počas desiatich hodín, nato sa rozpúšťadlo odparí. Zvyšok sa chromatografúje na silikagéli, s použitím elučnej sústavy tvorenej 10 až 15 % metanolom v chloroforme (gradient), pričom sa získa požadovaný produkt. Retenčný čas na reverznej fáze C_lg pri HPLC: 7,3 min. s použitím 43 % acetonitrilu v 0,05M vodnom roztoku dihydrogenfosforečnanu amónnom (N-acetyl-LL-E33288yi-I: 5,6 min. v rovnakej elučnej sústave.

Príklad 15 p-Merkaptodihydrocinnamoylhydraziddisulfid zložky N-acetyl-LL-ESSžSSyrl

K 10 mg N-acetyl-LL-E33288yi-I v 7,5 ml acetonitrilu sa pri teplote -15 °C pridajú 3 ekvivalenty 3-merkaptodihydrocinnamoylhydrazidu v 2 ml acetonitrilu. Pridá sa jeden ekvivalent trietylamínu. Reakčná zmes sa mieša pri teplote okolia počas dvoch hodín, nato sa rozpúšťadlo odparí. Zvyšok sa chromatografúje na silikagéli, s použitím elučnej sústavy tvorenej 10 až 15 % metanolom v chloroforme (gradient), nato sa z patričnej frakcie eluátu získa požadovaný produkt. Retenčný čas na reverznej fáze C₁₈ pri HPLC: 7,3 min. s použitím 43 % acetonitrilu v 0,05M vodnom roztoku dihydrogenfosforečnanu amónnom (N-acetyl-LL-E33288y_rI: 5,6 min. v rovnakej elučnej sústave.

Príklad 16

Nešpecifická konjugácia s proteínmi

Hydroxysukcinimidester opísaný v príklade 3 sa kovalentne pripojí k protilátkam za mierne alkalických podmienok. V nasledujúcej časti opisu bude uvedený všeobecný postup, ktorý bol použitý na prípravu konjugátov s protilátkami uvedenými v tabuľke Ί. Protilátka s koncentráciou 3 až 5 mg/ml fosfátového pufra obsahujúceho 0,1 M chloridu sodného, pH 7,5, sa uvedie v reakciu s 5 až 20-násobným molámym prebytkom produktu z príkladu 3. Táto reakcia sa uskutoční za miešania, pri teplote okolia a počas 1 až 4 hodín. Konjugovaný proteín sa potom chromatograficky odsolí a agregovaný proteín sa oddelí od monomémeho materiálu gélovou filtráciou HPLC. Monoméma frakcia sa zlúči a zahustí.

Tabuľka 7

Nešpecifické konjugáty pripravené s použitím produktu z príkladu 3

MoAb Obsah účinnej látky (M/M)

Lym 1	5,2
B72,3	6,0
B72,3	2,9

Príklad 17

Príprava lokálne špecifického konjugátu

Všeobecný postup na pripojenie hydrazidových derivátov účinných látok k oxidovaným protilátkam je opísaný T. J. McKeam-om a kol. v patente US 4 671 958. Tento postup bol použitý na prípravu konjugátov protilátok odvodených od produktov z príkladov 4 až 15, pričom boli zavedené opísané špecifické modifikácie. Produkty týchto reakcii a ich vlastností sú zahrnuté v zaradenej tabuľke 7.

A) Oxidácia protilátky

Protilátka s koncentráciou 5 až 10 mg/ml sa cez noc dialyzuje proti 200-násobnému objemu 50mM nátriumacetátového pufra, pH 5,5 obsahujúceho 0,lM chloridu sodného (pufor A). Po dialýze sa MoAb oxiduje 15mM až 200mM kyselinou jodistou v 0,2M octanu sodnom. Oxidačná reakcia sa uskutočňuje bez svetla, za miešania pri teplote 4 °C počas 45 minút, nato sa oxidovaná protilátka MoAb odsolí na aspoň päťnásobnom objeme Sephadexu G-25. Stupeň oxidácie protilátky sa stanoví reakciou s p-nitrofenylhydrazínom a porovnaním absorbancie proteínu pri 280 mm a p-nitrofenylhydrazínu pri 395 mm.

B) Konjugácia s hydrazidom účinnej látky

Oxidovaná protilátka MoAb sa uvedie do reakcie s 10 až 200-násobným molárnym prebytkom hydrazidu účinnej látky. Hydrazidy boli rozpustené v dimetylformamide a získané roztoky boli pridané k vodnému roztoku protilátky MoAb. Na účely zabránenia precipitácie MoAb, nepresahuje finálny objem pridaného dimetylformamidu 10 % z celkového reakčného objemu. Reakcia sa uskutočňuje za miešania počas 3 hodín pri teplote okolia. Na účely zabránenia zosieťovania nezreagovaných aldehydov a nasledovnej agrcgácii sa ako blokačné činidlo pridá 3 hodiny po prídavku hydrazidu účinnej látky 100-násobný molámy prebytok acetylhydrazidu. Na účely stabilizácie väzby typu Schiffova báza medzi aldehydom a hydrazidom účinnej látky (hydrazón) sa produkt zvyčajne redukuje na alkylhydrazín pridaním lOmM kyanborohydridu sodného. Reakcia prebieha počas jednej hodiny (celkový čas konjugácie: 4 hodiny). Získaný konjugát sa chromatograficky odsolí a potom dôkladne dialyzuje (minimálne 48 hodín) do fosfátového pufra na účely skladovania a testovania.

Tieto konjugáty sa potom analyzujú na prítomnosť agregátov gélovou filtráciou HPLC a na prítomnosť voľnej účinnej látky HPLC s reverznou fázou. Obsah účinnej látky v konjugáte sa stanoví spektroskopicky s použitím extin kčných koeficientov protilátky a účinnej látky, čím sa stanoví moláma koncentrácia protilátky v konjugáte.

Získané výsledky sú uvedené v nasledujúcej tabuľke 7.

Tabuľka 7

MoAb	Príprava	Obsah účinnej látky (M/M)
Hydrazidové konjugátv pripravené z produktu z príkladu 4
CTM-01	1	3,1
	2	2,3
	3	2,9
MAC-68	1	1,7
	2	3,1
Hvdrazidové koniueátv pripravené z produktu z príkladu 5	3	2,4
Lym	1	0,15
	2	0,76
Hvdrazidové koniugátv pripravené z produktu z príkladu 6	3	3,2
Lym 1		3,0
CT-M-01	1	2,4
Hvdrazidové koniugátv pripravené z produktu z príkladu 7	2	2,9
Lym 1		3,0
Lym 2		2,4
B72.3	1	2,1
	2	2,4
CT-M-01	1	1,6
	2	3,6
	3	2,5
Hvdrazidové koniugátv pripravené z produktu z príkladu 8	4	2,4
CT-M-01 Hvdrazidové koniugátv pripravené z produktu z príkladu 9		4,8
CT-M-01 Hvdrazidové koniugátv pripravené z produktu z príkladu 10		3,0
Lym 1 Hydrazidové konjugáty pripravené z produktu z príkladu 11		3,7
Lym 1 Hvdrazidové koniugátv pripravené z produktu z príkladu 12		6,2
Lym 1		3,5

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (12)

1. Substituovaný disulfid všeobecného vzorca Q-Sp-SS-W, odvodený od zlúčenín CH₃SSS-W, označovaných ako LL-E33288a|-Br, LL-E33288a_rI, LL-E33288a₂-Br, LL-33288a₂-I, LL-E33288a₃-Br, LL-E33288a₃-I, LL-

-E33288a₄-Br, LL-E33288p_rBr, LL-E332883_rI, LL-Ε33288β₂-Β_Γ, LL-E33288p₂-I, LL-E33288y_rBr, LL-E33288yj-I a LL-E332886_rI, od ich jód- alebo bróm pseudoglykónov a ich dihydro- alebo N-acyl-homológov, od látok BBM-1675, FR-900405, FR-900406 a od ich antibiotík PD114759, PD115028, CL-1577A, CL-1577B, CL-1577D, CL-1577E a CL-1724 alebo ich N-acetylhomológov pričom v uvedenom všeobecnom vzorci W znamená alebo CH₃ R₂ znamená alebo H,

R₃ znamená alebo H, R, znamená kde

R, znamená alebo H,

R§ alebo R₇ znamená H alebo

R_s znamená metylovú skupinu, etylovú skupinu alebo skupinu (CH₃)₂CH,

R₈ znamená hydroxylovú skupinu,

Rg znamená atóm vodíka alebo

R_s a Rg spolu znamenajú karbonylovú skupinu,

X znamená atóm jódu alebo atóm brómu,

R₅' znamená atóm vodíka alebo skupinu RCO, v ktorej

R znamená atóm vodíka alebo rozvetvenú alkylovú skupinu, ktorá obsahuje 1 až 10 uhlíkových atómov alebo alkylénovú skupinu, obsahujúcu 1 až 10 uhlíkových atómov, arylovú skupinu obsahujúcu 6 až 11 uhlíkových atómov alebo heteroarylovú skupinu zvolenú z množiny zahŕňajúcej furylovú skupinu, tienylovú skupinu, N-metylpyrolylovú skupinu, pyridylovú skupinu, N-metylimidazolylovú skupinu, oxazolylovú skupinu, pyrimidinylovú skupinu, chinolylovú skupinu, izochinolylovú skupinu, N-metylkarbazolylovú skupinu, aminokumarinylovú skupinu a fenazinylovú skupinu alebo arylalkylovú skupinu, v ktorej arylový zvyšok obsahuje 6 až 11 uhlíkových atómov a alkylový zvyšok obsahuje 1 až 5 uhlíkových atómov, alebo heteroarylalkylovú skupinu, v ktorej je heteroarylový zvyšok zvolený z uvedenej množiny a alkylový zvyšok obsahuje 1 až 5 uhlíkových atómov, pričom uvedené skupiny môžu byť prípadne substituované aspoň jedným substituentom, zvoleným z množiny, ktorá zahŕňa hydroxylovú skupinu, aminovú skupinu, karboxylovú skupinu, halogén, nitroskupinu, alkoxy-skupinu, obsahujúcu 1 až 3 uhlíkové atómy a alkyltio-skupinu, obsahujúcu 1 až 5 uhlíkových atómov,

Sp znamená priamu alebo rozvetvenú dvojvalenčnú alkylovú skupinu, obsahujúcu 1 až 18 atómov uhlíka, dvojvalenčnú arylovú skupinu, ktorá obsahuje 6 až 11 atómov uhlíka alebo dvojvalenčnú heteroarylovú skupinu, zvolenú z množiny zahŕňajúcej furylovú skupinu, tienylovú skupinu, N-metylpyrolylovú skupinu, piridylovú skupinu, N-metylimidazolylovú skupinu, oxazolylovú skupinu, pyrimidinylovú skupinu, chinolylovú skupinu, izochinolylovú skupinu, N-metylkarbazolylovú skupinu, aminokumarinylovú skupinu a fenazinylovú skupinu alebo dvojvalenčnú cykloalkylovú skupinu obsahujúcu 3 až 18 atómov uhlíka, dvojvalenčnú arylalkylovú skupinu, v ktorej arylový zvyšok obsahuje 6 až 11 atómov uhlíka a alkylový zvyšok obsahuje 1 až 18 atómov uhlíka, alebo heteroarylalkylovú skupinu, v ktorej alkylový zvyšok obsahuje 1 až 18 atómov uhlíka a heteroarylový zvyšok znamená zvyšok zvolený z množiny zahŕňajúcej furylovú skupinu, tienylovú skupinu, N-metylpyrolylovú skupinu, pyridylovú skupinu, N-metylimidazolylovú skupinu, oxazolylovú skupinu, pyrimidinylovú skupinu, chinolylovú skupinu, izochinolylovú skupinu, N-metylkarbazolylovú skupinu, aminokumarinylovú skupinu a fenazinylovú skupinu, alebo dvojvalenčnú alkenylovú, alebo alkinylovú skupinu obsahujúcu 2 až 18 atómov uhlíka, pričom Sp môže byť dodatočne substituovaný aminoskupinou, alkylaminoskupinou , obsahujúcou 1 až 10 atómov uhlíka, arylamino-skupinou, obsahujúcou 6 až 11 atómov uhlíka, heteroarylamino-skupinou, v ktorej heteroarylový zvyšok znamená zvyšok zvolený z množiny zahŕňajúcej furylovú skupinu, tienylovú skupinu, Nmetylpyrolylovú skupinu, pyridylovú skupinu, N metylimidazolylovú skupinu, oxazolylovú skupinu, pyrimidinylovú skupinu, chinolylovú skupinu, izochinolylovú skupinu, N-metylkarbazolylovú skupinu, aminokumarinylovú skupinu a fenazinylovú skupinu, karboxylovú skupinu, alkoxyskupinu, obsahujúcu 1 až 3 atómy uhlíka, hydroxyskupinu , tiolovú skupinu alebo alkyltio-skupinu obsahujúcu 1 až 5 atómov uhlíka,

Q znamená atóm halogénu, aminovú skupinu, alkylaminovú skupinu obsahujúcu 1 až 10 uhlíkových atómov, dialkylaminovú skupinu, v ktorej každý alkylový zvyšok obsahuje 1 až 10 atómov uhlíka, arylaminovú skupinu, v ktorej arylový zvyšok obsahuje 6 až 11 atómov uhlíka, heteroarylaminovú skupinu, v ktorej je heteroarylový zvyšok zvolený z uvedenej množiny, piperidinovú skupinu, pyrolidinovú skupinu, piperazinovú skupinu, karboxylovú skupinu, nitrofenyloxykarbonylovú skupinu, skupinu -CHO, alkoxyskupinu, obsahujúcu 1 až 3 uhlíkové atómy, hydroxylovú skupinu, tiolovú skupinu, dikarboxyalkylovú skupinu, v ktorej alkylový zvyšok obsahuje 1 až 5 atómov uhlíka, skupinu -CONHNH₂, skupinu -HCONHNH₂, skupinu -CSNHNH₂, skupinu -NHCSNHNH₂ oxykarbonylovú skupinu alebo skupinu -ONH₂, pričom v prípade, že je uvedený substituovaný disulfid odvodený od zlúčenín CH₃-SSS-W, zahŕňajúcich LL-E33288a_rBr, LL-E33288cti-I, LL-E33288a₂-Br, LL-E33288a₂-I, LL-E33288a₃-Br, LL-E33288a₃-I, LL-E33288a₄-Br, LL-E33288p_rBr, LL-E33288p_rI, LL-E33288p₂-Br, LL-E33288p₂-I, LL-E33288Yi-Br, LL-E33288y,-I, LL-E33288ô,-I, BBM-1675, FR-900405, FR-900406, PD114759, PRI 15028, CL-1577A, CL-1577B, CL-1577D, CL-1577E alebo CL-1724, potom Q neznamená atóm halogénu, aminovú skupinu, alkylaminovú skupinu, dialkylaminovú skupinu, arylaminovú skupinu, heteroarylaminovú skupinu, piperidinovú skupinu, pyrolidinovú skupinu, piperazinovú skupinu alebo karboxylovú skupinu.

2. Substituovaný disulfid podľa nároku 1 všeobecného vzorca Q-Sp-SS-W, v ktorom W znamená kde

R] znamená

OCH,

R₂ znamená alebo H,

R₄ znamená alebo H,

R₅ znamená metylovú skupinu, etylovú skupinu alebo skupinu (CH₃)₂CH,

X znamená atóm jódu alebo atóm brómu,

R₅' znamená atóm vodíka alebo skupinu RCO, v ktorej

R znamená atóm vodíka, metylovú skupinu alebo monosubstituovanú arylovú skupinu, ktorá obsahuje 6 až 11 atómov uhlíka a Sp a Q majú významy uvedené v nároku 1.

3. Konjugát substituovaného disulfídu podľa nároku 1 s nosičom, ktorý má všeobecný vzorec

Tu-(Z-Sp-SS-W)

I ^m (Y) n-m v ktorom

W má význam uvedený v nároku 1,

Sp má význam uvedený v nároku 1,

Tu znamená monokolonálnu protilátku alebo jej fragmenty, alebo jej chemicky, alebo geneticky modifikované homoló g^y,

Y znamená aminovú skupinu, karboxylovú skupinu alebo tiolovú skupinu, tvoriacu bočný reťazec protilátky Tu, aldehydovú skupinu odvodenú od glykoproteínových cukrových zvyškov protilátky Tu, amidoalkyltio-skupinu, v ktorej alkylový zvyšok obsahuje 2 až 18 uhlíkových atómov, skupinu -CH₂NHNHCOCH₃ alebo skupinu

-CHjNHNHCOCH(NHj)CH₂

Z znamená skupiny -CONH-, -CONHN=CH-,-CONHNHCH₂-, -NHCONHN=CH-, -NHCONHNHCH₂-, -NHCSNHN=CH-, -NHCSNHNHCHj-, -ON=CH-, -NH-, -NHCH₂-, -N=CH-, -CO₂-, -NHCH₂CO₂-, -SS-, o

-nucoch₂

CO h kde x = 0 alebo 1, n znamená celé číslo od 1 do 100 a m znamená 0,1 až 15.

4. Konjugát substituovaného disulfídu s nosičom podľa nároku 3 všeobecného vzorca

Tu-(Z-Sp-SS-W) ra · v ktorom

W má význam uvedený v nároku 3,

Sp znamená priamu alebo rozvetvenú dvoj valenčnú alkylovú skupinu, obsahujúcu 2 až 10 uhlíkových atómov alebo dvojvalenčnú arylalkylovú skupinu, v ktorej arylový zvyšok obsahuje 6 až 11 atómov uhlíka a alkylový zvyšok obsahuje 2 až 5 uhlíkových atómov alebo hetero-arylalkylovú skupinu, v ktorej alkylový zvyšok obsahuje 2 až 5 uhlíkových atómov a heteroarylový zvyšok má významy uvedené v nároku 1, pričom Sp môže byť dodatočne substituovaný amino-skupinou, heteroarylamino-skupinou, v ktorej má heteroarylový zvyšok významy uvedené v nároku 1, hydroxy-skupinou alebo tiolovou skupinou,

Tu znamená monoklonálnu protilátku, ktorá má preferenčnú reaktivitu s ľudským nádorovým antigénom,

Y znamená aminovú skupinu tvoriacu bočný reťazec protilátky Tu alebo aldehydovú skupinu odvodenú od glykoproteínových cukrových zvyškov protilátky Tu, Z znamená skupinu -CONH-, skupinu CONHN=CH-, skupinu -CONHNHCH₂- alebo skupinu

I -NHCOCH₂-CH co₂B kde x znamená 0 alebo 1, m znamená 0,1 až 15, n znamená celé číslo od 1 do 100.

5. Spôsob prípravy substituovaného disulfídu podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že sa zlúčenina všeobecného vzorca CH₃SSS-W podľa nároku 1, kde W má význam uvedený v nároku 1, uvedie do reakcie so substituovaným merkaptánom všeobecného vzorca Q-Sp-SH, v ktorom Q a Sp majú významy uvedené v nároku 1, v acetonitrile alebo v zmesi acetontrilu a tetrahydrofuránu alebo acetonitrilu a dimetylformamidu pri teplote -20 až 40 °C počas 1 hodiny až 6. dní.

6. Spôsob podľa nároku 5, vyznačujúci sa tým, že sa reakcia uskutočňuje v prítomnosti jedného ekvivalentu terciámej amínovcj bázy a jedného ekvivalentu organickej karboxylovej kyseliny.

7. Spôsob prípravy konjugátu substituovaného disulfídu s nosičom podľa nároku 3 všeobecného vzorca

TU-(Z-Sp-SS-W) , I m (Y) n-m v ktorom Sp, W, Tu, n a m majú významy definované v nároku 3,

Y znamená aminovú alebo karboxylovú skupinu tvoriacu bočný reťazec protilátky Tu a Z znamená skupinu -CONH-, skupinu -NH-, skupinu -N=CH, skupinu -CO₂- alebo skupinu i -NHCOCH₂-CH (CH ) _V

1 4 X

CO H, t z kde x = 0 alebo 1, v y z n a č u j ú c i sa tým, že sa uvedie do reakcie zlúčenina všeobecného vzorca Q-Sp-SS-W, v ktorom Sp a W majú uvedené významy a Q znamená atóm halogénu, aminovú skupinu, alkylaminovú skupinu, karboxylovú skupinu, karboxaldehydovú skupinu, hydroxylovú skupinu alebo skupinu anhydridu alkyldikarboxylovej kyseliny, v ktorej alkylový zvyšok obsahuje 4 alebo 5 uhlíkových atómov, s molekulou látky všeobecného vzorca Tu-(Y)_n, v ktorom Tu, Y a n majú uvedený význam, vo vodnom pufri s hodnotou pH 6,5 až 9 pri teplote 4 až 40 °C buď priamo, alebo v prítomnosti vo vode rozpustného karbodiimidu.

8. Spôsob prípravy konjugátu substituovaného disulfídu s nosičom podľa nároku 3 všeobecného vzorca

Tll-(Z-Sp-SS-W) > i » v ktorom Sp, W, Tu, n a m majú významy uvedené v nároku 3, Y znamená aminovú skupinu tvoriacu bočný reťazec protilátky Tu a Z znamená skupinu -CONH-, vyznačujúci sa tým, že sa zlúčenina všeobecného vzorca Q-Sp-SS-W, v ktorom Sp a W majú uvedené významy a Q znamená karboxylovú skupinu, uvedie do reakcie s N-hydroxysukcinimidom, 2,3,5,6-tetrafluórfenolom, pentafluórfenolom alebo 4-nitrofenolom v prítomnosti činidla aktivujúceho karboxylovú skupinu, akým je karboximid, pri vzniku zlúčeniny všeobecného vzorca Q-Sp-SS-W, v ktorom Sp a W majú uvedené významy a Q znamená alebo potom sa získaná zlúčenina uvedie do reakcie s molekulou látky všeobecného vzorca Tu-(Y)_n, v ktorom Tu, Y a n majú uvedené významy, vo vodnom pufŕovanom roztoku s hodnotou pH 6,5 až 9 a pri teplote 4 až 40 °C.

9. Spôsob prípravy konjugátu substituovaného disulfidu s nosičom podľa nároku 3 všeobecného vzorca

Tu-(Z-Sp-SS-W) i m , v ktorom Tu, Z, Sp, W, Y, m a n majú významy uvedené v nároku 3, vyznačujúci sa tým, že sa zlúčenina všeobecného vzorca Q-Sp-SS-W, v ktorom Sp a W majú uvedené významy a Q znamená skupinu -CONHNH₂, uvedie do reakcie s kyselinou dusitou vo vodnom roztoku acetonitrilu za vzniku zlúčeniny všeobecného vzorca Q-Sp-SS-W, v ktorom Sp a W majú uvedené významy a Q znamená skupinu -CON₃, a hneď sa táto zlúčenina uvedie do reakcie so zlúčeninou všeobecného vzorca Tu-(Y)_n, v ktorom Tu, Y a n majú uvedené významy.

10. Spôsob prípravy konjugátu substituovaného disulfidu s nosičom podľa nároku 3 všeobecného vzorca

Tu-(Z-Sp-SS-W)_{m t} v ktorom Tu, Sp, W, n a m majú uvedené významy, Z znamená a Y znamená tiolovú skupinu, tvoriacu bočný reťazec protilátky Tu alebo amidoalkyltio-skupinu, v ktorej alkylový zvyšok obsahuje 2 až 18 uhlíkových atómov, vyznačujúci sa tým, že sa zlúčenina všeobecného vzorca Q-Sp-SS-W, v ktorom Sp a W majú uvedený význam a Q znamená hydroxylovú skupinu, uvedie do reakcie s anhydridom kyseliny a-halogénoctovcj za vzniku zodpovedajúcej zlúčeniny, v ktorej Q znamená a-halogénacetyloxy-skupinu, a potom sa a-halogénacetyloxy-Sp-SS-W alebo zlúčenina všeobecného vzorca Q-Sp-SS-W, v ktorom Sp a W majú uvedené významy a Q znamená uvedie do reakcie s molekulou látky všeobecného vzorca Tu-(Y)_n, v ktorom Tu má uvedený význam, Y znamená tiolovú skupinu, tvoriacu bočný reťazec protilátky Tu alebo amidoalkyltio-skupinu, v ktorej alkylový zvyšok obsahuje 2 až 18 uhlíkových atómov, zavedenú na aminovú funkciu protilátky Tu s použitím hydroxysukcinimidcsteru kyseliny 3-(2-ditiopyridyl)propiónovej a následnou redukciou ditiotreitolom alebo amidoalkyltio-skupinu zavedenú na aminovú funkciu protilátky Tu s použitím 2-iminotiolanu, a n znamená 1 až 10, vo vodnom pufŕovanom roztoku s hodnotou pH 4,4 až 7 a pri teplote 4 až 40 °C.

11. Spôsob prípravy konjugátu substituovaného disulfidu, s nosičom podľa nároku 3 všeobecného vzorca

Tu-(Z-Sp-SS-W) ,

I m (Y)„ m n-m v ktorom Sp, W a Tu majú významy uvedené v nároku 3, Y znamená aldehydovú skupinu odvodenú od glykoproteinových cukrových zvyškov protilátky Tu, Z znamená skupinu -ΟΝ-CH-, skupinu -N=CH-, skupinu -CONHN=CH-, skupinu -NHCONHN=CH- alebo skupinu -NHCSNHN=CH-, n znamená 1 až 20 a m znamená 0,1 až 15, vyznačujúci sa tým, že sa zlúčenina všeobecného vzorca Q-Sp-SS-W, v ktorom Sp a W majú uvedené významy a Q znamená skupinu -NH₂, skupinu -CONHNH₂, skupinu NHCONHNH₂, skupinu -NHCSNHNH₂ alebo skupinu -ONH₂, uvedie do reakcie s molekulou látky všeobecného vzorca Tu-(Y)_n, v ktorom má Tu uvedený význam a Y znamená aldehydovú skupinu odvodenú od glykoproteínových cukrových zvyškov protilátky Tu, v prítomnosti jodistanu kovu alkalických zemín vo vodnom pufri pri hodnote pH 4 až 6,6 pri teplote 4 až 40 °C.

12. Spôsob prípravy konjugátu substituovaného disulfidu s nosičom podľa nároku 3 všeobecného vzorca u-(Z-Sp-SS-W) , m ’ n-m v ktorom Tu, Sp, W, m a n majú významy uvedené v nároku 11, Z znamená skupinu -NH-CH₂-, skupinu -CONHNHCH₂-, skupinu -NHCONHNHCH₂- alebo skupinu -NHCSNHNHCH₂-, a Y znamená skupinu -CH₂NHNHCOCH₃ alebo skupinu

-ch₂«hnhcoch(nh₂)ch₂ vyznačujúci sa tým, že sa zlúčenina všeobecného vzorca

Tu-(Z-Sp-SS-W)

I m ’ (Y)_n _ n-m v ktorom Tu, Z, Sp, W, Y, n a m majú významy uvedené pre túto zlúčeninu v nároku 11, uvedie do reakcie s acetyl hydrazínom alebo tyrozinhydrazínom vo vodnom pufri pri pH 4 až 6,5 za teploty 4 až 40 °C za vzniku zlúčeniny všeobecného vzorca v ktorom Tu, Z, Sp, W, n a m majú uvedené významy a Y znamená skupinu -CH=NHHCOCH₃ alebo skupinu

-CH-NNHCO-CH(NH₂)-CH₂ a potom sa táto zlúčenina uvedie do reakcie s kyanoborohydridom sodným alebo bórohydridom sodným vo vodnom pufri pri pH 4 až 6,5 pri teplote 4 až 40 °C.