EA010909B1 - Усовершенствованные цитотоксические агенты, содержащие новые мэйтансиноиды - Google Patents

Усовершенствованные цитотоксические агенты, содержащие новые мэйтансиноиды Download PDF

Info

Publication number
EA010909B1
EA010909B1 EA200501836A EA200501836A EA010909B1 EA 010909 B1 EA010909 B1 EA 010909B1 EA 200501836 A EA200501836 A EA 200501836A EA 200501836 A EA200501836 A EA 200501836A EA 010909 B1 EA010909 B1 EA 010909B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
carbon atoms
alkenyl
methyl
maytansinoid
alkyl
Prior art date
Application number
EA200501836A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200501836A1 (ru
Inventor
Уэйн К. Уиддисон
Рави В. Дж. Чари
Original Assignee
Иммьюноджен, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=33476883&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EA010909(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Иммьюноджен, Инк. filed Critical Иммьюноджен, Инк.
Publication of EA200501836A1 publication Critical patent/EA200501836A1/ru
Publication of EA010909B1 publication Critical patent/EA010909B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D498/00—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D498/12—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms in which the condensed system contains three hetero rings
    • C07D498/16—Peri-condensed systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D491/00—Heterocyclic compounds containing in the condensed ring system both one or more rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms and one or more rings having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by groups C07D451/00 - C07D459/00, C07D463/00, C07D477/00 or C07D489/00
    • C07D491/12—Heterocyclic compounds containing in the condensed ring system both one or more rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms and one or more rings having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by groups C07D451/00 - C07D459/00, C07D463/00, C07D477/00 or C07D489/00 in which the condensed system contains three hetero rings
    • C07D491/14—Ortho-condensed systems
    • C07D491/147—Ortho-condensed systems the condensed system containing one ring with oxygen as ring hetero atom and two rings with nitrogen as ring hetero atom
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/535—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one oxygen as the ring hetero atoms, e.g. 1,2-oxazines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6867—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from a cell of a blood cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
    • A61P33/04—Amoebicides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D491/00—Heterocyclic compounds containing in the condensed ring system both one or more rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms and one or more rings having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by groups C07D451/00 - C07D459/00, C07D463/00, C07D477/00 or C07D489/00
    • C07D491/12—Heterocyclic compounds containing in the condensed ring system both one or more rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms and one or more rings having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by groups C07D451/00 - C07D459/00, C07D463/00, C07D477/00 or C07D489/00 in which the condensed system contains three hetero rings
    • C07D491/14—Ortho-condensed systems
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6807—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug or compound being a sugar, nucleoside, nucleotide, nucleic acid, e.g. RNA antisense
    • A61K47/6809—Antibiotics, e.g. antitumor antibiotics anthracyclins, adriamycin, doxorubicin or daunomycin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Описаны новые тиол- и дисульфидсодержащие мэйтансиноиды, имеющие один или два алкильных заместителя при α-углеродном атоме, несущем атом серы. Кроме того, описаны способы синтеза этих новых мэйтансиноидов и способы присоединения этих новых мэйтансиноидов к связывающимся с клетками агентам. Конъюгаты мэйтансиноидов и связывающихся с клетками агентов используются в качестве терапевтических агентов, которые доставляются специфично к клеткам-мишеням и являются цитотоксическими. Эти конъюгаты обладают чрезвычайно улучшенной терапевтической эффективностью на животных моделях опухолей по сравнению с ранее описанными агентами.

Description

Настоящее изобретение относится к способу получения усовершенствованных цитотоксических конъюгатов, содержащих мэйтансиноиды и связывающиеся с клетками агенты. Эти конъюгаты имеют терапевтическое применение, поскольку они доставляются в специфическую популяцию клеток нацеленным образом. Настоящее изобретение также относится к способу получения мэйтансиноидов, имеющих тиоловую функциональную группу, которые могут быть использованы при получении цитотоксических конъюгатов. Кроме того, настоящее изобретение относится к новым мэйтансиноидам и к новым промежуточным соединениям в синтезе новых мэйтансиноидов.
Уровень техники
Появилось множество сообщений о попытках специфического таргетинга, опухолевых клеток при помощи конъюгатов «моноклональное антитело-лекарственный препарат» (8е1а и др. в книге 1ттипосои)ида1ек, с. 189-216 (С. ^де1, ред. 1987); Ойоке и др., в Тагде1еб Эгидк, с. 1-22 (Е. Оо1бЬегд, ред. 1983); Э|епег и др., в АпйЬобу Меб1а1еб Оейуегу 8ук1етк, с. 1-23 (1. Ноблей, ред. 1988); Р|е1егкх и др., в АпйЬобу Меб1а1еб Оейуегу 8ук1етк, с. 25-53 (1. Ноблей, ред. 1988); Вито1 и др., в АпйЬобу Меб1а1еб Оейуегу 8ук1етк. с. 55-79 (1. Ноблей, ред. 1988)). Цитотоксические лекарственные препараты, такие как метотрексат, даунорубицин, доксорубицин, винкристин, винбластин, мелфалан, митомицин С и хлорамбуцил, были конъюгированы с разнообразными мышиными моноклональными антителами. В некоторых случаях молекулы лекарственного препарата были присоединены к молекулам антитела через промежуточную молекулу носителя, такую как сывороточный альбумин (Оагпей и др., Сапсег Нек. 46:2407-2412 (1986); Ойка\га и др., Сапсег 1ттито1. 1ттипо1йег. 23:81-86 (1986); Епбо и др., Сапсег Нек. 47:1076-1080 (1980)), декстран (ΗιιπνίΙζ и др., Арр1 Вюсйет. 2:25-35 (1980); МапаЬ1 и др., Вюсйет. Рйагтасо1. 34:289-291 (1985); ЭШтап и др., Сапсег Нек. 46:4886-4891 (1986); 8йоуа1 и др., Ргос. Ыаб. Асаб. 8ск 85: 8276-8280 (1988)) или полиглутаминовая кислота (Ткикаба и др., 1. Ыаб Сапе. 1пк1. 73:721-729 (1984); Ка1о и др., 1. Меб. Сйет. 27:1602-1607 (1984); Ткикаба и др., Вг. 1. Сапсег 52:111-116 (1985)).
Для получения таких иммуноконъюгатов было использовано обширное множество линкерных технологий, причем были исследованы расщепляющиеся, а также нерасщепляющиеся линкеры. Однако в большинстве случаев полный цитотоксический потенциал лекарственных препаратов можно было использовать, только если молекулы лекарственного препарата могли высвобождаться из конъюгатов в немодифицированном виде в сайте-мишени.
Один из расщепляющихся линкеров, который был использован для получения конъюгатов антитело-лекарственный препарат, представляет собой кислотно-лабильный линкер на основе цис-аконитовой кислоты, что использует преимущество кислотного окружения в различных внутриклеточных компартментах, таких как эндосомы, встречающиеся в ходе рецепторно опосредованного эндоцитоза, и лизосомы. 8йеп и Нукег разработали этот способ для получения конъюгатов даунорубицина с макромолекулярными носителями (Вюсйет. Вюрйук. Нек. Соттип. 102:1048-1054 (1981)). Уапд и Не1к!е1б использовали ту же самую методику, чтобы получить конъюгат даунорубицина с антителом против меланомы (1. №111 Сапе. 1пк1, 80:1154-1159 (1988)). Кроме того, недавно ЭШшап и др. применили кислотно-лабильный линкер аналогичным образом, для получения конъюгатов даунорубицина с антителом против Т клеток (Сапсег Нек. 48:6097-6102 (1988)).
Тгоие! и др. использовали альтернативный подход, включающий присоединение даунорубицина к антителу через пептидную «ножку» (Ргос. №111. Асаб. 8ск 79:626-629 (1982)). Это было выполнено, исходя из предположения, что из такого конъюгата может высвобождаться свободный лекарственный препарат под действием лизосомальных пептидаз.
Однако при испытаниях цитотоксичности ш уйго было установлено, что для конъюгатов антителолекарственный препарат редко достигается та же самая цитотоксическая эффективность, как для свободных неконъюгированных лекарственных препаратов. Это позволяет предположить, что механизмы, с помощью которых молекулы лекарственного препарата высвобождаются из антител, являются весьма неэффективными. В области иммунотоксинов было продемонстрировано, что конъюгаты, образовавшиеся за счет дисульфидных мостиков между моноклональными антителами и каталитически активными белковыми токсинами, обладают более высокой цитотоксичностью, чем конъюгаты, содержащие другие линкеры. См. статью ЬатЬей и др., 1. Вю1 Сйет. 260:12035-12041 (1985); ЬатЬей и др., в книге «Иммунотоксины» 175-209 (ред. А. Егапке1, 1988); Ойейе и др., Сапсег Нек. 48:2610-2617 (1988). Это объясняется высокой внутриклеточной концентрацией глутатиона, который дает вклад в эффективное расщепление дисульфидной связи между молекулой антитела и токсином. Несмотря на это, имеется только несколько примеров, в которых сообщается о применении дисульфидных мостиков для получения конъюгатов между лекарственными препаратами и макромолекулами. 8йеп и др. описали превращение метотрексата в меркаптоэтиламидное производное, с последующим конъюгированием с поли-Э-лизином через дисульфидную связь (1. Вю1. Сйет. 260:10905-10908 (1985)). Кроме того, в некоторых публикациях описано получение конъюгатов содержащего трисульфид токсичного лекарственного препарата калихеамицина с антителами (Натапп и др., 53 Сапсег Нек. 3336-3342 (1993), Натапп и др., Вюсопщда1е Сйет.,
- 1 010909
13,40-46 (2002), Натапп и др., ВюсопщдаЮ Сйет., 73,47-58 (2002)).
Одной причиной отсутствия конъюгатов связанных дисульфидной связью антител с лекарственными препаратами является недоступность цитотоксических лекарственных препаратов, несущих функциональную группу, содержащую атом серы, которую можно легко использовать для связывания лекарственного препарата с антителом с помощью дисульфидного мостика. Более того, затруднено химическое модифицирование существующих лекарственных препаратов без ухудшения их цитотоксического потенциала.
Мэйтансиноиды представляют собой лекарственные препараты с высокой цитотоксичностью. Впервые мэйтансин был выделен Кирсйап и др. из восточно-африканского кустарника Мау1епи8 §етга1а, и было продемонстрировано, что он обладает в 100-1000 раз большей цитотоксичностью, чем традиционные противораковые хемиотерапевтические агенты, подобные метотрексату, даунорубицину и винкристину (И.8. Ра1. № 3896111). В последующем было установлено, что некоторые микробы также продуцируют мэйтансиноиды, такие как мэйтансинол и С-3 сложные эфиры мэйтансинола (И.8. Ра1. № 4151042). Синтетические С-3 сложные эфиры мэйтансинола и аналогов мэйтансинола также были описаны (Кирсйап и др., 1. Меб. Сйап. 21:31-37 (1978); ШдакЫбе и др., №Шге 270:721-722 (1977); Ка^а1 и др., Сйет. Рйагт. Ви11. 32:3441-3451 (1984)). Примеры аналогов мэйтансинола, из которых были приготовлены С-3 сложные эфиры, включают мэйтансинол с модификациями в ароматическом кольце (например, дехлоро) или в положении С-9, С-14 (например, гидроксилированная метильная группа), С-15, С-18, С-20 и С-4,5, С-3 сложные эфиры мэйтансинола естественного происхождения и синтетические можно подразделить на две группы:
(а) С-3 сложные эфиры с простой карбоновой кислотой (И.8. Ра1. № 4248870; 4265814; 4308268; 4308269; 4309428; 4317821; 4322348; и 4331598), и (й) С-3 сложные эфиры с производными Ν-метил-Ь-аланина (И.8. Ра1. № 4137230; 4260608; 5208020; и Сйет. Рйагт. Ви11. 12:3441 (1984)).
Было обнаружено, что сложные эфиры группы (й) обладают значительно более высокой цитотоксичностью, чем сложные эфиры группы (а).
Мэйтансин представляет собой митотический ингибитор. Известно, что обработка Б1210 клеток мэйтансином ίη νίνο приводит к 67% клеток, накапливающихся в митозе (митотическое деление клеток). Сообщалось, что необработанные контрольные клетки демонстрируют митотический индекс в диапазоне между 3,2 и 5,8% (81ейег и др., 43 С’отрагаЦуе Ьеикет1а Кекеагсй 1975, В1й1. Наета!. 495-500 (1976)). Эксперименты с яйцами морского ежа и икрой моллюсков предполагают, что мэйтансин ингибирует митоз, препятствуя образованию микротрубочек за счет ингибирования полимеризации белка микротрубочек тубулина (К.етй1агб и др., 8с1епсе 189:1002-1005 (1975)).
Обнаружено, что ίη νίίτο суспензии клеток мышиного лейкоза Р388, Ь1210, и ЬУ5178 ингибируются мэйтансином при дозах от 10-3 до 10-1 мкг/мл, причем наиболее чувствительной была линия Р388. Кроме того, было продемонстрировано, что мэйтансин представляет собой активный ингибитор роста ίη νίίτο клеток человеческой носоглоточной карциномы, и описано, что линия СЕМ острого лимфобластного лейкоза человека ингибируется при столь низкой концентрации как 10-7 мкг/мл (\Уо1рег1-0еРП11рре5 и др., Вюсйет. Рйагтасо1. 24:1735-1738 (1975)).
Было продемонстрировано, что мэйтансин также является активным ίη νί\Ό. Показано, что опухолевый рост в системе Р388 лимфоцитарного лейкоза ингибируется более чем в 50-100-кратном диапазоне доз, что позволяет предположить высокий терапевтический индекс; кроме того, значительная ингибирующая активность может быть продемонстрирована в системе мышиного лейкоза Ь1210, в системе человеческой легочной карциномы Льюиса и в системе человеческой меланокарциномы В-16 (Кирсйап, Реб. Ргос. 33:2288-2295 (1974)). Мэйтансиноиды, используемые в конъюгатах со связывающимися с клетками агентами, описаны в патентах и.8. № 5208020 и 5416064 и в статьях Сйап и др., Сапсег Кек., 52: 127-131 (1992) и Ьш и др., Ргос. №И. Асаб. 8ск, 93: 8618-8623 (1996). В этих конъюгатах связывающийся с клетками агент присоединяется с помощью дисульфидных связей к мэйтансиноиду ИМ1 |№-деацетил^'-(3-меркапто-1-оксопропил)мэйтансин, 1, СА8 Штйег: 139504-50-0, фиг. 1]
В указанных выше патентах мэйтансиноидные лекарственные препараты, содержащие ацилированные боковые цепи Ν-метил-Ь-аланина, имеют формулы 2а, 2й
- 2 010909
В формуле 2а 1 представляет собой целое число от 1 до 10. Таким образом, в мэйтансиноидах формулы 2а имеется атом серы, присоединенный к незамещенной метиленовой группе (-СН2-§-). Полагают, что сульфгидрильная группа в таком мэйтансиноидном соединении или дисульфидная группа в связанном через дисульфидную связь конъюгате связывающегося с клетками агента с таким мэйтансиноидом является незатрудненной», поскольку отсутствуют объемистые заместители при α-углеродном атоме, смежном с сульфгидрильной или дисульфидной группой, которые вызывают стерические затруднения. В формуле 2Ь, т означает 0, 1, 2 или 3. Следовательно, мэйтансиноиды формулы 2Ь также имеют атом серы, присоединенный к незамещенной метиленовой группе, за исключением случаев, когда т=0, и К2=СН3 или СН2СН3. Если т=0, тогда в мэйтансиноиде имеется один заместитель при атоме углерода, несущем тиоловую функциональную группу или дисульфидную функциональную группу после конъюгирования со связывающимся с клетками агентом с помощью дисульфидной связи. Однако было обнаружено, что, поскольку в этом случае атом серы находится в β-положении относительно карбонильной группы, эти мэйтансиноиды и конъюгаты таких мэйтансиноидов со связывающимися с клетками агентами через дисульфидную связь являются нестабильными из-за их склонности к процессу βэлиминирования.
Раскрытие изобретения
Настоящее изобретение основано на неожиданном открытии, что присоединение мэйтансиноидов, несущих стерически затрудненную тиоловую группу (имеющую один или два заместителя при α-атоме углерода, несущем тиоловую функциональную группу), к связывающимся с клетками агентам дает конъюгаты, которые обладают чрезвычайно улучшенной противоопухолевой активностью ίη νίνο, по сравнению с конъюгатами, полученными с ранее описанными мэйтансиноидами, в которых отсутствует заместитель при α-атоме углерода, несущем дисульфидную связь. Другим неожиданным открытием является то, что достигается улучшенная биологическая активность, когда стерическое затруднение является оптимальным на мэйтансиноидной стороне дисульфидной связи в конъюгатах. Кроме того, ацильная группа в боковой цепи ацилированной аминокислоты мэйтансиноида, несущей сульфгидрильную группу, должна обладать линейной цепочкой длиной по меньшей мере три атома углерода между карбонильной группой амида и атомом серы.
Эти наблюдения показали, что связанные дисульфидной связью конъюгаты связывающегося с клетками агента и мэйтансиноида могут иметь такую конфигурацию, что замещения при двух α-атомах углерода, несущих дисульфидную связь, могут привести к различным степеням стерического затруднения на каждой стороне дисульфидной связи.
Соответственно, в настоящем изобретении описан синтез новых, стерически затрудненных тиол- и дисульфидсодержащих мэйтансиноидов, в которых имеется один или два алкильных заместителя при αуглеродном атоме, несущем атом серы. Кроме того, ацильная группа в боковой цепи ацилированной аминокислоты обладает линейной цепочкой длиной по меньшей мере три атома углерода между карбонильной группой амида и атомом серы.
Кроме того, описано получение и биологическая оценка конъюгатов этих новых мэйтансиноидов со связывающимися с клетками агентами.
В одном воплощении изобретения описаны новые тиол- и дисульфидсодержащие мэйтансиноиды, имеющие моно- или диалкильное замещение при атоме углерода, несущем атом серы.
Во втором воплощении настоящего изобретения описаны способы синтеза этих новых мэйтансиноидов.
В третьем воплощении описаны способы присоединения этих новых мэйтансиноидов к связывающимся с клетками агентам. Эти конъюгаты используются в качестве терапевтических агентов, которые доставляются специфично к клеткам-мишеням и являются цитотоксическими. Эти конъюгаты обладают чрезвычайно улучшенной терапевтической эффективностью в моделях опухолей животных по сравнению с ранее описанными агентами.
- 3 010909
Более конкретно, настоящее изобретение обеспечивает
Мэйтансиноид, имеющий в положении С-3, С-14-гидроксиметил, С-15-гидрокси или С-20десметил, боковую цепочку ацилированной аминокислоты с ацильной группой, несущей затрудненную сульфгидрильную группу, в которой атом углерода ацильной группы, несущей тиоловую функциональную группу, имеет один или два заместителя, причем указанные заместители представляют собой СН3, С2Н5, линейный или разветвленный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал, и кроме того, один из заместителей может представлять собой Н, и в которой ацильная группа имеет длину линейной цепи по меньшей мере три атома углерода между карбонильной функциональной группой и атомом серы;
Соединение, представленное формулой 4'
в которой Υ' представляет собой группу (С1и\)-(С1СС1Е)Х С Л.(С1ии...1).(СН СН-2НС С).В.(СН;1С)..СН-Н28/. в которой каждый заместитель В! и В2 независимо представляет собой СН3, С2Н5, линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал, и кроме того, В2 может представлять собой Н;
А, В, Ό означают циклоалкил или циклоалкенил, имеющий 3-10 атомов углерода, простой или замещенный арил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал;
каждый заместитель В3, В4, В5, В6, В7, В8, В9, Вп и В12 независимо представляет собой Н, СН3, С2Н5, линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал;
каждый символ 1, т, п, о, р, с.|. г, 5 и I независимо означает 0 или целое число от 1 до 5, при условии что по меньшей мере два из 1, т, п, о, р, ц, г, 5 и I не равны нулю одновременно;
Ζ означает Н, 8В или -СОВ, в котором В представляет собой линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, или простой или замещенный арил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал.
Соединение, представленное формулой 4', в которой В1 означает метил, В2 представляет собой Н и Ζ означает Н.
Соединение, представленное формулой 4', в которой В1 и В2 представляют собой метил и Ζ означает Н.
Соединение, представленное формулой 4', в которой В1 означает метил, В2 представляет собой Н и Ζ означает -8СН3.
Соединение, представленное формулой 4', в которой В1 и В2 представляют собой метил и Ζ означает -8СН3.
Соединение, представленное формулой (Ι-Ь), (Ι-О) или (Ι-Ό, Ь)
где Υ представляет собой (СВ7В8)1(СВ5В6)т(СВ3В4)ηСВ1В28Ζ, в которой
- 4 010909 каждый Κι и Κ2 независимо представляет собой СН3, С2Н5, линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил, или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил, или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал, и кроме того, Κ2 может представлять собой Н;
каждый Κ3, Κ4, Κ5, Κ6, Κ7 и Κ независимо представляет собой Н, СН3, С2Н5, линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал;
каждый 1, т и η независимо означает целое число от 1 до 5, и кроме того, η может означать 0;
Ζ представляет собой Н, 8Κ или -СОК, где Κ представляет собой линейный или разветвленный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, или простой или замещенный арил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал; и
Мау означает мэйтансиноид, который имеет боковую цепочку при С-3, С-14 гидроксиметил, С-15 гидрокси или С-20-десметил;
Описанное выше соединение, в котором Κι представляет собой метил, Κ2 означает Н, каждый из Κ5, Κ6, Κ7 и Κ8 означает Н, каждый 1 и т равен 1, η означает 0 и Ζ представляет собой Н;
Описанное выше соединение, в котором Κι и Κ2 представляют собой метил, каждый Κ5, Κ6, Κ7, Κ8 означает Н, 1 и т равны 1, η означает 0 и Ζ означает Н;
Описанное выше соединение, в котором Κι представляет собой метил, К2 означает Н, каждый К5, К6, К7 и К8 означает Н, каждый 1 и т равен 1, η равно 0 и Ζ означает -8СН3;
Описанное выше соединение, в котором Κι и К2 представляют собой метил, каждый К5, К6, К7, К8 означает Н, 1 и т равны 1, η равно 0 и Ζ означает -8СН3;
Соединение, представленное формулой 4
в которой Υ представляет собой (Ό^Κ^^^Κ^^Κ^^Κ^δΖ, где каждый Κ1 и Κ2 независимо представляет собой СН3, С2Н5, линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал, и кроме того, Κ2 может представлять собой Н;
каждый Κ3, Κ4, Κ5, Κ6, Κ7 и Κ8 независимо представляет собой Н, СН3, С2Н5, линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал;
каждый 1, т и η независимо означает целое число от 1 до 5, и кроме того, η может быть равно 0; и
Ζ означает Н, 8Κ или -СОК где Κ представляет собой линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, или простой или замещенный арил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал;
Соединение формулы 4, в которой Κ1 означает метил, Κ2 означает Н, каждый Κ5, Κ6, Κ7 и Κ8 представляет собой Н; каждый 1 и т равен 1; η равно 0; Ζ означает Н;
Соединение формулы 4, в которой Κ1 и Κ2 означают метил; каждый Κ5, Κ6, Κ7, Κ8 представляет собой Н, 1 и т равны 1; η равно 0; Ζ означает Н;
Соединение формулы 4, в которой Κ1 означает метил, Κ2 означает Н, каждый Κ5, Κ6, Κ7 и Κ8 представляет собой Н, каждый 1 и т равен 1, η равно 0 и Ζ представляет собой -§СН3;
Соединение формулы 4, в которой Κ1 и Κ2 означают метил, каждый Κ5, Κ6, Κ7, Κ8 представляет собой Н, 1 и т равны 1, η равно 0 и Ζ означает -§СН3;
Конъюгат мэйтансиноида со связывающимся с клетками агентом, содержащий по меньшей мере
- 5 010909 один мэйтансиноид, связанный со связывающимся с клетками агентом, в котором мэйтансиноид представляет собой любое из вышеописанных соединений;
Любой из вышеупомянутых конъюгатов мэйтансиноида со связывающимся с клетками агентом, в котором связывающийся с клетками агент содержит по меньшей мере один связывающий сайт антитела, предпочтительно ΜΥ9, гуманизированного или с перелицованной поверхностью ΜΥ-9, гуманизированного или с перелицованной поверхностью анти-В4, или гуманизированного или с перелицованной поверхностью С242.
Фармацевтическая композиция, содержащая эффективное количество любого из вышеупомянутых конъюгатов мэйтансиноида со связывающимся с клетками агентом, их фармацевтически приемлемых солей или сольватов, и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или наполнитель;
Способ этерификации мэйтансиноида в положениях С-3, С-14-гидроксиметил, С-15-гидрокси или С-20-десметил, аминокислотой с ацилированной боковой цепочкой, где ацильная группа имеет защищенную сульфгидрильную функциональную группу, в которой атом углерода ацильной группы, несущий защищенную тиоловую функциональную группу, имеет один или два заместителя, причем указанные заместители представляют собой СН3, С2Н5, линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал, и кроме того, один из заместителей может представлять собой Н, и в которой ацильная группа имеет линейную цепочку протяженностью по меньшей мере три атома углерода между карбонильной функциональной группой и атомом серы, причем указанный способ включает взаимодействие мэйтансиноида в положении С-3, С-14-гидроксиметил, С-15-гидрокси или С-20-десметил, с ацилированной аминокислотой, где ацильная группа имеет защищенную сульфгидрильную группу.
Способ этерификации мэйтансиноида с целью получения сложного эфира мэйтансиноида, представленного формулой (ΙΥ-Ь), (ΙΥ-Ό) или (ΙΥ-Ό, Ь)
в которой Υ2 представляет собой (СВ7В8)1(СВ5В6)т(СВ3В4)пСВ1В2§22, где каждый В! и Β2 независимо представляет собой СН3, С2Н5, линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал, и кроме того, Β2 может представлять собой Н;
каждый Β3, В4. Β5, Β6, Β7 и Β8 независимо представляет собой Н, СН3, С2Н5, линейный циклический алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал;
каждый 1, т и п независимо представляет собой целое число от 1 до 5, и кроме того, п может быть равно 0;
Ζ2 представляет собой группу 8В или СОВ, в которой В означает линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, или простой или замещенный арил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал; и
Мау представляет собой мэйтансиноид;
причем указанный способ включает в себя взаимодействие указанного мэйтансиноида в положении С-3, С-14-гидроксиметил, С-15-гидрокси или С-20-десметил с соединением формулы (ΙΙΙ-Ь), (ΙΙΙ-Ό) или (ΙΙΙ-Ό, Ь)
в которой Υ2 представляет собой (ΌΒ7Β8)1(ΌΒ5Β6^(ΌΒ3Β4)^Β1Β28Ζ2, где каждый В1 и В2 независимо означает СН3, С2Н5, линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный ра
- 6 010909 дикал, и кроме того, Я2 может означать Н;
каждый Я3, Я4, Я5, Я6, Я7 и Я8 независимо представляет собой Н, СН3, С2Н5, линейный или разветвленный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал;
каждый 1, т и η независимо представляет собой целое число от 1 до 5, и кроме того, η может означать 0; и
Ζ2 представляет собой группу 8Я или СОЯ, в которой Я означает линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, или простой или замещенный арил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал;
Вышеупомянутый способ, в котором Я1 представляет собой метил, Я2 означает Н, каждый Я5, Я6, Я7 и Я8 представляет собой Н; каждый 1 и т равен 1; η означает 0;
Вышеупомянутый способ, в котором соединение формулы (III) представлено формулой (Ш-Ь);
Вышеупомянутый способ, в котором соединение формулы (Ш-Ь) представляет собой соединение 15а (8,8), 15Ь (8,Я) или смесь 15а (8,8) и 15Ь (8,Я);
Вышеупомянутый способ, в котором соединение формулы (Ш-Ό) представляет собой соединение 15 (Я,8), 15 (Я,Я) или смесь 15 (Я,8) и 15 (Я,Я);
Вышеупомянутый способ, в котором соединение формулы (ΙΙΙ-Ό, Ь) представляет собой рацемический Ν-метилаланин, ацилированный карбоксильной группой, несущий защищенную тиоловую функциональную группу, в которой углеродный центр, несущий атом серы, является или рацемическим, или имеет Я- или 8-хиральность, для того, чтобы образовались соединения структуры 15;
Вышеупомянутый способ, в котором смесь 15а (8,8) и 15Ь (8,Я) получают с помощью способа, который включает в себя:
(1) взаимодействие 4-меркаптопентановой кислоты (12) с метиловым эфиром метантиолсульфокислоты, чтобы образовалось соединение 13;
(2) превращение соединения 13 в его Ν-гидроксисукцинимидный эфир 14;
(3) взаимодействие соединения 14 с Ν-метил-Ь-аланином с образованием указанной смеси соединений 15а (8,8) и 15Ь (8,Я);
Вышеупомянутый способ, в котором соединение 15а (8,8) получают способом, который включает в себя:
(1) превращение (Я)-1,3-бутандиола в (8)-4-(метилдитио)пентановую кислоту 19;
(2) превращение соединения 19 в его Ν-гидроксисукцинимидный эфир (20);
(3) взаимодействие соединения 20 с Ν-метил-Ь-аланином с образованием указанного соединения 15а (8,8).
Вышеупомянутый способ, в котором соединение 15Ь (8,Я) получают способом, который включает в себя:
(1) превращение (8)-1,3-бутандиола в (Я)-4-(метилдитио)пентановую кислоту 24;
(2) превращение соединения 24 в его Ν-гидроксисукцинимидный эфир (25);
(3) взаимодействие соединения 25 с Ν-метил-Ь-аланином с образованием указанного соединения 15Ь (8,Я).
Описанный выше способ, в котором смесь соединений 15 (Я,8) и 15 (Я,Я) получают с помощью способа, включающего в себя:
(1) взаимодействие 4-меркаптопентановой кислоты (12) с метиловым эфиром метантиолсульфокислоты с образованием соединения 13;
(2) превращение соединения 13 в его Ν-гидроксисукцинимидный эфир 14, (3) взаимодействие соединения 14 с Ν-метил-Э-аланином с образованием указанной смеси соединений 15 (Я,8) и 15 (Я,Я).
Вышеупомянутый способ, в котором рацемический Ν-метилаланин, ацилированный карбоксильной группой, несущей защищенную тиоловую функциональную группу, в которой углеродный центр, несущий атом серы, является или рацемическим, или имеет Я- или 8-хиральность, давая соединения структуры 15, получают с помощью способа, включающего в себя:
(1) взаимодействие 4-меркаптопентановой кислоты (12) с метиловым эфиром метантиолсульфокислоты, чтобы получить соединение 13;
(2) превращение соединения 13 в его Ν-гидроксисукцинимидный эфир 14;
(3) взаимодействие соединения 14 с рацемическим Ν-метилаланином с образованием рацемического Ν-метилаланина, ацилированного карбоксильной группой, несущей защищенную тиоловую функциональную группу, в которой углеродный центр, несущий атом серы, является или рацемическим, или имеет Я- или 8-хиральность, с образованием соединений структуры 15,
Вышеупомянутый способ, в котором Я1 и Я2 представляют собой метил; каждый Я5, Я6, Я7 и Я8 означает Н; каждый 1 и т равен 1; η означает 0;
Вышеупомянутый способ, в котором соединение формулы (Ш-Ь) представляет собой соединение
- 7 010909
10(8), содержащее Ν-метил-Ь-аланин;
Вышеупомянутый способ, в котором соединение формулы (Ш-Ό) представляет собой соединение 10(К), содержащее Ν-метил-Э-аланин;
Вышеупомянутый способ, в котором соединение формулы (ΙΙΙ-Ό, Ь) представляет собой соединение 10(8,К), содержащее рацемический Ν-метилаланин;
Вышеупомянутый способ, в котором соединение 10, содержащее Ν-метил-Ь-аланин, Ν-метил-Эаланин или рацемический Ν-метилаланин, получено способом, который включает в себя:
(1) взаимодействие изобутиленсульфида (5) с анионом ацетонитрила, с образованием соединения 6;
(2) гидролиз соединения 6 с образованием 4-меркапто-4-метилпентановой кислоты (7);
(3) превращение соединения 7 в дисульфид 8 путем взаимодействия с метиловым эфиром метантиолсульфокислоты;
(4) превращение соединения 8 в его Ν-гидроксисукцинимидный эфир 9;
(5) взаимодействие соединения 9 с Ν-метил-Ь-аланином, Ν-метил-Э-аланином или рацемическим Ν-метилаланином с образованием указанного соединения 10, содержащего Ν-метил-Ь-аланин, Ν-метилΌ-аланин или рацемический Ν-метилаланин;
Способ получения мэйтансиноида с помощью любого из вышеупомянутых способов, с разделением диастереоизомеров, если они присутствуют, и очисткой мэйтансиноида с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на силикагеле с циано-связями;
Способ получения конъюгата мэйтансиноида со связывающимся с клетками агентом, который включает в себя получение очищенного мэйтансиноида любым из вышеупомянутых способов и взаимодействие очищенного мэйтансиноида со связывающимся с клетками агентом, содержащим реакционноспособную дитиогруппу или сульфгидрильную группу.
Вышеупомянутый способ получения конъюгата мэйтансиноида со связывающимся с клетками агентом, в котором реакционноспособная дитиогруппа представляет собой дитиопиридильную группу или замещенную дитиопиридильную группу;
Способ получения конъюгата мэйтансиноида со связывающимся с клетками агентом, который включает в себя получение очищенного мэйтансиноида любым из упомянутых выше способов, и взаимодействие очищенного мэйтансиноида со связывающимся с клетками агентом, содержащим малеимидную или галоидацетильную группу;
Способ этерификации мэйтансинола с образованием мэйтансиноида формулы 42'
42* в которой Υ2' представляет собой группу (СК-МнСК.СК- Р(СС) Л.(С1С1С)...1)(СН СН-2НС С)..В.(С1ЫО.С1ЫС8/2. в которой каждый К.1 и К2 независимо представляет собой СН3, С2Н5, линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал, и кроме того, К2 может означать Н;
каждый А, В и Ό независимо представляет собой циклоалкил или циклоалкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, простой или замещенный арил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал;
каждый К3, К4, К5, К6, К7, К8, К9, К11 и К12 независимо представляет собой Н, СН3, С2Н5, линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал;
каждый 1, т, п, о, р, ср г, 5 и 1 независимо означает 0 или целое число от 1 до 5 при условии, что по меньшей мере два из 1, т, п, о, р, д, г, 5 и 1 не равны нулю одновременно; и
- 8 010909
Ζ2 представляет собой группу 8Я или -СОЯ, в которой Я означает линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, или простой или замещенный арил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал, причем указанный способ включает в себя взаимодействие мэйтансинола структуры 11 в положении С-3
с соединением формулы (Ш'-Ь), (ΠΓ-Ό) или (Ш'-Э, Ь)
(Ш’)
в которой Υ2' представляет собой группу (СЯ7Я8)1(СЯ9=СЯ1ο)ρ(СΞС)^Αг(СЯ5Я6)т^и(СЯ11=СЯ12)г(СΞС)8Β1(СЯзЯ4)ηСЯ1Я28Ζ2, в которой каждый Я! и Я2 независимо представляет собой СН3, С2Н5, линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал, и кроме того, Я2 может означать Н;
каждый А, В и Ό независимо представляет собой циклоалкил или циклоалкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, простой или замещенный арил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал;
каждый Я3, Я4, Я5, Я6, Я7, Я8, Я9, Яп и Я12 независимо представляет собой Н, СН3, С2Н5, линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал;
каждый 1, т, η, ο, р, с.|. г, 5 и ΐ независимо означает 0 или целое число от 1 до 5 при условии, что по меньшей мере два из 1, т, η, ο, р, ς, г, 5 и ί не равны нулю одновременно; и
Ζ2 является группой 8Я или -СОЯ, в которой Я представляет собой линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, или простой или замещенный арил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал.
Способ этерификации мэйтансинола с получением мэйтансиноида формулы 42', в котором соединение формулы (I) представлено формулой (1-Ь).
Способ этерификации мэйтансинола с получением мэйтансиноида формулы 42', в которой Я1 представляет собой метил и Я2 является Н.
Способ этерификации мэйтансинола с получением мэйтансиноида формулы 42
- 9 010909
в которой Υ2 представляет собой группу (СВ7В8)1(СВ5В6)т(СВ3В4)ηСВ1В28Ζ2, в которой каждый В1 и В2 независимо представляет собой СН3, С2Н5, линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал, и кроме того, В2 может означать Н;
каждый В3, В4, В5, В6, В7 и В8 независимо представляет собой Н, СН3, С2Н5, линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал;
каждый 1, т и п независимо означает целое число от 1 до 5, и кроме того, п может означать 0;
Ζ2 представляет собой группу 8В или СОВ, в которой В означает линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, или простой или замещенный арил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал, причем указанный способ включает в себя взаимодействие мэйтансинола структуры 11
в С-3 положении с соединением формулы (ΙΙΙ-Ь), (ΙΙΙ-Ό) или (ΙΙΙ-Ό, Ь) 1 θ
Ή
ь о ρ,ε (Ш) в которой Υ2 представляет собой группу (СВ7В8)1(СВ5В6)т(СВ3В4)ηСВ1В28Ζ2, в которой каждый В1 и В2 независимо представляет собой СН3, С2Н5, линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал, и кроме того, В2 может означать Н;
каждый В3, В4, В5, В6, В7 и В8 независимо представляет собой Н, СН3, С2Н5, линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал;
каждый 1, т и п независимо представляет собой целое число от 1 до 5, и кроме того, п может означать 0;
- 10 010909
Ζ2 представляет собой группу 8Β или СОΒ, в которой Β означает линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, или простой или замещенный арил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал;
Вышеупомянутый способ этерификации мэйтансинола с получением мэйтансиноида формулы 4а, в котором соединение формулы (ΙΙΙ) представлено формулой (ΙΙΙ-Ь);
Вышеупомянутый способ этерификации мэйтансинола с получением мэйтансиноидов формулы 4а, в котором указанным соединением формулы (ΙΙΙ-Ь) является соединение 15а (8,8), 15Ь (8,Β) или смесь 15а (8,8) и 15Ь (8,Β);
Вышеупомянутый способ этерификации мэйтансинола с получением мэйтансиноидов формулы 4а, в котором указанным соединением формулы (ΙΙΙ-Ό) является соединение 15 (Β,8), 15 (Β,Β) или смесь 15 (Β,8) и 15 (Β,Β);
Вышеупомянутый способ этерификации мэйтансинола с получением мэйтансиноидов формулы 4а, в котором указанным соединением формулы (ΙΙΙ-Ό, Ь) является рацемический Ν-метилаланин, ацилированный карбоксильной группой, несущей защищенную тиоловую функциональную группу, в которой углеродный центр, несущий атом серы, является или рацемическим, или имеет Β- или 8-хиральность, с образованием соединений структуры 15;
Вышеупомянутый способ этерификации мэйтансинола с получением мэйтансиноидов формулы 4а, в котором смесь 15а (8,8) и 15Ь (8,Β) получают способом, который включает в себя:
(1) взаимодействие 4-меркаптопентановой кислоты 12 с метиловым эфиром метантиолсульфокислоты с образованием соединения 13;
(2) превращение соединения 13 в его Ν-гидроксисукцинимидный эфир 14;
(3) взаимодействие соединения 14 с Ν-метил-Ь-аланином с образованием указанной смеси соединений 15а (8,8) и 15Ь (8,Β);
Вышеупомянутый способ этерификации мэйтансинола, в котором указанное соединение 15а (8,8) получают способом, который включает в себя:
(1) превращение (Β)-1,3-бутандиола в (8)-4-(метилдитио)пентановую кислоту 19;
(2) превращение соединения 19 в его Ν-гидроксисукцинимидный эфир 20;
(3) взаимодействие соединения 20 с Ν-метил-Ь-аланином с получением соединения 15а (8,8).
Вышеупомянутый способ этерификации мэйтансинола, в котором указанное соединение 15Ь (8,Β) получают способом, который включает в себя:
(1) превращение (8)-1,3-бутандиола в (Β)-4-(метилдитио)пентановую кислоту 24;
(2) превращение соединения 24 в его Ν-гидроксисукцинимидный эфир 25; и (3) взаимодействие соединения 25 с Ν-метил-Ь-аланином с получением соединения 15Ь (8,Β);
Вышеупомянутый способ этерификации мэйтансинола с образованием мэйтансиноидов формулы 4а, в котором смесь соединений 15 (Β,8) и 15 (Β,Β) может быть получена способом, который включает в себя:
(1) взаимодействие 4-меркаптопентановой кислоты 12 с метиловым эфиром метантиолсульфокислоты с образованием соединения 13;
(2) превращение соединения 13 в его Ν-гидроксисукцинимидный эфир 14;
(3) взаимодействие соединения 14 с Ν-метил-Э-аланином с получением указанной смеси соединений 15 (Β,8) и 15 (Β,Β).
Вышеупомянутый способ этерификации мэйтансинола с образованием мэйтансиноидов формулы 4а, в котором рацемический Ν-метилаланин, ацилированный карбоксильной группой, несущей защищенную тиоловую функциональную группу, в которой углеродный центр, несущий атом серы, является или рацемическим, или имеет Β- или 8-хиральность, чтобы получить соединения структуры 15, получают способом, который включает в себя:
(1) взаимодействие 4-меркаптопентановой кислоты 12 с метиловым эфиром метантиолсульфокислоты, чтобы получить соединение 13;
(2) превращение соединения 13 в его Ν-гидроксисукцинимидный эфир 14;
(3) взаимодействие соединения 14 с рацемическим Ν-метилаланином, чтобы получить рацемический Ν-метилаланин, ацилированный карбоксильной группой, несущей защищенную тиоловую функциональную группу, в которой углеродный центр, несущий атом серы, является или рацемическим, или имеет Β- или 8-хиральность, с образованием соединений структуры 15,
Вышеупомянутый способ этерификации мэйтансинола с получением мэйтансиноидов формулы 4Ь, в которой Β1 и Β2 представляют собой метил, каждый Β5, Β6, Β7, Β8 означает Н; 1 и т равны 1, п равно 0;
Вышеупомянутый способ этерификации мэйтансинола с получением мэйтансиноидов формулы 4Ь, в котором указанное соединение формулы (ΙΙΙ-Ь) представляет собой соединение 10, содержащее Νметил-Ь-аланин;
Вышеупомянутый способ этерификации мэйтансинола с получением мэйтансиноидов формулы 4Ь, в котором указанное соединение формулы (ΙΙΙ-Ό) представляет собой соединение 10, содержащее Νметил-Э-аланин;
- 11 010909
Вышеупомянутый способ этерификации мэйтансинола с получением мэйтансиноидов формулы 4Ь, в котором указанное соединение формулы (ΙΙΙ-Ь, Ь) представляет собой соединение 10, содержащее рацемический Ν-метилаланин;
Вышеупомянутый способ этерификации мэйтансинола с получением мэйтансиноидов формулы 4Ь, в котором соединение 10, содержащее Ν-метил-Ь-аланин, Ν-метил-Ь-аланин или рацемический Νметилаланин, получают способом, который включает в себя:
(1) взаимодействие изобутиленсульфида 5 с анионом ацетонитрила с образованием соединения 6;
(2) гидролиз соединения 6 с образованием 4-меркапто-4-метилпентановой кислоты 7;
(3) превращение соединения 7 в дисульфид 8 путем взаимодействия с метиловым эфиром метантиолсульфокислоты;
(4) превращение соединения 8 в его Ν-гидроксисукцинимидный эфир 9;
(5) взаимодействие соединения 9 с Ν-метил-Ь-аланином, Ν-метил-Ь-аланином или рацемическим Ν-метилаланином с образованием соединения 10, содержащего Ν-метил-Ь-аланин, Ν-метил-Ь-аланин или рацемический Ν-метилаланин;
Вышеупомянутый способ этерификации мэйтансинола соединением 10 с последующим разделением диастереоизомеров, если они присутствуют, и очисткой мэйтансиноида методом ВЭЖХ на силикагеле с циано-связями, который дополнительно включает восстановление дисульфидной связи с получением мэйтансиноидов формулы 4Ь;
Способ получения конъюгата мэйтансиноида со связывающимся с клетками агентом, который включает в себя получение очищенного мэйтансиноида любым из вышеупомянутых способов этерификации мэйтансинола с получением мэйтансиноидов формулы 4Ь, и взаимодействие мэйтансиноида со связывающимся с клетками агентом, который включает в себя сульфгидрильную группу или реакционноспособную дитиогруппу, предпочтительно дитиопиридильную группу или замещенную дитиопиридильную группу;
Способ получения конъюгата мэйтансиноида со связывающимся с клетками агентом, который включает в себя получение очищенного мэйтансиноида любым из вышеупомянутых способов этерификации мэйтансинола, чтобы получить мэйтансиноиды формулы 4Ь, и взаимодействие мэйтансиноида со связывающимся с клетками агентом, содержащим малеимидную или галоидацетильную группу.
Способы терапии с использованием вышеупомянутых конъюгатов.
Соединения формулы (III)
в которой Υ2 представляет собой группу (СК7К8)1(СК5К6)т(СК3К4)пСК1И2§22, в которой каждый Κι и К2 независимо представляет собой СН3, С2Н5, линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал, и кроме того, К2 может означать Н;
каждый К3, К4, Κ5, Κ6, Κ7 и Κ8 независимо представляет собой Н, СН3, С2Н5, линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал;
каждый 1, т и п независимо означает целое число от 1 до 5, и кроме того, п может быть равно 0; и
Ζ2 представляет собой группу 8Κ или -СОК, в которой К означает линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, или простой или замещенный арил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал.
Соединения 10(8), 10(К) или рацемическое соединение 10;
Способ получения соединения 10, содержащего Ν-метил-Ь-аланин, Ν-метил-Ь-аланин или рацемический Ν-метилаланин, который включает в себя:
(1) взаимодействие изобутиленсульфида 5 с анионом ацетонитрила, с образованием соединения 6;
(2) гидролиз соединения 6 с образованием 4-меркапто-4-метилпентановой кислоты 7;
(3) превращение соединения 7 в дисульфид 8 путем взаимодействия с метиловым эфиром метантиолсульфокислоты;
(4) превращение соединения 8 в его Ν-гидроксисукцинимидный эфир 9;
(5) взаимодействие соединения 9 с Ν-метил-Ь-аланином, Ν-метил-Ь-аланином или рацемическим Ν-метилаланином, чтобы получить указанное соединение 10, содержащее Ν-метил-Ь-аланин, Ν-метил-Ь- 12 010909 аланин или рацемический Ν-метилаланин.
Смесь соединений 15а (8,8) и 15Ь (δ,Κ);
Способ получения смеси соединений 15а (8,8) и 15Ь (δ,Κ), включающий в себя:
(1) взаимодействие 4-меркаптопентановой кислоты 12 с метиловым эфиром метантиолсульфокислоты с образованием соединения 13;
(2) превращение соединения 13 в его Ν-гидроксисукцинимидный эфир 14;
(3) взаимодействие соединения 14 с Ν-метил-Ь-аланином с получением указанной смеси соединений 15а (8,8) и 15Ь (δ,Κ);
Смесь соединений 15 (Κ,8) и 15 (Κ,Κ).
Способ получения смеси соединений 15 (Κ,8) и 15 (Κ,Κ), который включает в себя:
(1) взаимодействие 4-меркаптопентановой кислоты 12 с метиловым эфиром метантиолсульфокислоты с образованием соединения 13;
(2) превращение соединения 13 в его Ν-гидроксисукцинимидный эфир 14;
(3) взаимодействие соединения 14 с Ν-метил-Э-аланином, чтобы получить указанную смесь соединений 15 (Κ,8) и 15 (Κ,Κ).
Рацемический Ν-метилаланин, ацилированный карбоксильной группой, имеющей защищенную тиоловую функциональную группу, в которой углеродный центр, несущий атом серы, является или рацемическим, или имеет Κ- или 8-хиральность, чтобы получить соединения структуры 15;
Способ получения рацемического Ν-метилаланина, ацилированного карбоксильной группой, имеющей защищенную тиоловую функциональную группу, в которой углеродный центр, несущий атом серы, является или рацемическим, или имеет Κ- или 8-хиральность, чтобы получить соединения структуры 15, который включает в себя:
(1) взаимодействие 4-меркаптопентановой кислоты 12 с метиловым эфиром метантиолсульфокислоты с образованием соединения 13;
(2) превращение соединения 13 в его Ν-гидроксисукцинимидный эфир 14;
(3) взаимодействие соединения 14 с рацемическим Ν-метилаланином с образованием рацемического Ν-метилаланина, ацилированного карбоксильной группой, несущей защищенную тиоловую функциональную группу, в которой углеродный центр, несущий атом серы, является или рацемическим, или имеет Κ- или 8-хиральность, для того, чтобы получить соединение структуры 15;
Соединение 15а (8,8);
Соединение 15Ь (8,Κ);
Способ получения соединения 15а (8,8), который включает в себя:
(1) превращение (В)-1,3-бутандиола в (8)-4-(метилдитио)пентановую кислоту 19;
(2) превращение соединения 19 в его Ν-гидроксисукцинимидный эфир 20;
(3) взаимодействие соединения 20 с Ν-метил-Ь-аланином с получением указанного соединения 15а (8,8);
Способ получения соединения 15Ь (8,Κ), который включает в себя:
(1) превращение (8)-1,3-бутандиола в (Κ)-4-(метилдитио)пентановую кислоту 24;
(2) превращение соединения 24 в его Ν-гидроксисукцинимидный эфир 25;
(3) взаимодействие соединения 25 с Ν-метил-Ь-аланином с получением указанного соединения 15Ь (8,Κ).
Фармацевтическая композиция, содержащая эффективное количество любого из вышеупомянутых мэйтансиноидных соединений, их фармацевтически приемлемые соли или сольваты, и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или наполнитель;
Вышеупомянутая фармацевтическая композиция, содержащая мэйтансиноидное соединение и дополнительно содержащая антитело.
Способ индукции гибели смерти клеток в выбранных популяциях клеток, который включает в себя контактирование клеток-мишеней или тканей, содержащих клетки-мишени, с эффективным количеством любого из вышеупомянутых конъюгатов мэйтансиноида со связывающимися с клетками агентами, их солей или сольватов.
Краткое описание фигур
На фиг. 1 продемонстрированы структуры ранее описанных мэйтансиноидов.
На фиг. 2 продемонстрированы структуры некоторых мэйтансиноидов настоящего изобретения.
На фиг. 3а-б показаны схемы синтеза репрезентативных мэйтансиноидов настоящего изобретения.
На фиг. 4а,Ь представлена эффективность ίη νίίτο новых мэйтансиноидов настоящего изобретения.
На фиг. 4е.б графически сопоставлена ίη νίίτο эффективность новых мэйтансиноидов настоящего изобретения с описанными ранее мэйтансиноидами.
На фиг. 5а-б показаны схемы получения конъюгатов связывающихся с клетками агентов с мэйтансиноидами настоящего изобретения.
На фиг. 6 графически продемонстрирована эффективность ίη νίίτο конъюгатов связывающихся с клетками агентов-мэйтансиноидов настоящего изобретения.
На фиг. 7 графически сопоставлена противоопухолевая эффективность ίη νίνο 1шС242
- 13 010909 мэйтансиноидов настоящего изобретения с конъюгатами 1иС42 с ранее описанными мэйтансиноидами против ксенотрансплантатов опухоли ободочной кишки человека НТ-29.
На фиг. 8 графически сопоставлена противоопухолевая эффективность ш νίνο 1шС242мэйтансиноидов настоящего изобретения с конъюгатами 1шС242 с ранее описанными мэйтансиноидами против ксенотрансплантатов опухоли ободочной кишки человека СОЬО 205.
На фиг. 9 графически сопоставлена противоопухолевая эффективность ш νίνο ΜΥ9-6мэйтансиноидов настоящего изобретения с конъюгатами ΜΥ9-6 с ранее описанными мэйтансиноидами против ксенотрансплантатов промиелоцитарного миелоидного лейкоза НЬ60.
На фиг. 10 показан результат оценки цитотоксичности ш νίίτο конъюгата йиМу9-6-ОМ4 на клеткахмишенях НЬ-60 и на клетках ПатаШа, не являющихся мишенями.
На фиг. 11 показана оценка эффективности конъюгата 1шМу9-6-ΩΜ4 ш νίνο против ксенотрансплантированных опухолей человека НЬ-60 на мышах 8СГО и ее сопоставление с эффективностью конъюгата 1иМу9-6 с ранее описанным мэйтансиноидом (1иМу9-6-ОМ1).
На фиг. 12 показан результат оценки цитотоксичности конъюгата 1шВ4-ЬМ4 ш νίίτο на клеткахмишенях Ваток и на клетках ί,'οίο 205, не являющихся мишенями.
На фиг. 13а показана оценка эффективности конъюгата 1шВ4-ЬМ4 ш νίνο против ксенотрансплантированных опухолей человека Ватο8 на мышах 8СГО, и на фиг. 13Ь показаны изменения массы тела животных в течение периода испытаний.
Осуществление изобретения
В этом изобретении раскрыты новые, стерически затрудненные тиол- и дисульфидсодержащие мэйтансиноиды, в которых α-атом углерода, несущий атом серы, имеет один или два алкильных заместителя. Кроме того, в изобретении раскрыт способ синтеза этих новых мэйтансиноидов. Дополнительно описаны новые соединения, которые применяются в качестве промежуточных соединений в синтезе новых мэйтансиноидов. Кроме того, в этом изобретении описано получение конъюгатов этих новых мэйтансиноидов со связывающимися с клетками агентами.
Из уровня техники выявлено, что в высшей степени трудно модифицировать существующие лекарственные препараты без снижения их цитотоксического потенциала. В описанном изобретении эта проблема решена путем раскрытия способа синтеза новых мэйтансиноидных молекул, содержащих стерически затрудненную тиоловую или дисульфидную функциональную группу. Раскрытые новые мэйтансиноиды сохраняют, а в некоторых случаях даже усиливают, цитотоксическую эффективность ранее описанных мэйтансиноидов.
Конъюгаты мэйтансиноида со связывающимися с клетками агентами в полной мере обеспечивают, чтобы цитотоксическое действие мэйтансиноидов было использовано направленным образом только против нежелательных клеток, тем самым устраняя побочные эффекты, вызванные повреждением здоровых клеток, не являющихся мишенями. Таким образом, изобретение предоставляет полезные агенты и новые способы их получения для элиминирования пораженных болезнью или аномальных клеток, которые следует уничтожить или лизировать, таких как опухолевые клетки (в частности, клетки солидной опухоли), клетки, инфицированные вирусом, клетки, инфицированные микроорганизмами, клетки, инфицированные паразитами, аутоиммунные клетки (клетки, которые продуцируют аутоантитела), активированные клетки (которые вовлечены в отторжение трансплантата или в реакцию «трансплантат против хозяина»), или любые другие типы пораженных болезнью или аномальных клеток, при этом побочные эффекты проявляются в минимальной степени.
Таким образом, в этом изобретении раскрыт способ получения улучшенных цитотоксических конъюгатов, содержащих новые мэйтансиноиды и связывающиеся с клетками агенты с чрезвычайно улучшенной биологической активностью по сравнению с ранее описанными мэйтансиноидами и связывающимися с клетками агентами. В изобретении, кроме того, раскрыт способ синтеза мэйтансиноидных производных, в которых имеется стерически затрудненная тиоловая или дисульфидная функциональная группа, которая обеспечивает химическое присоединение к связывающемуся с клетками агенту, и в то же время проявляющих высокую цитотоксичность или в связанном виде, или в освобожденном виде, или в обоих состояниях. Цитотоксический конъюгат согласно настоящему изобретению содержит один или несколько мэйтансиноидов, связанных со связывающимся с клетками агентом. Для того чтобы связать мэйтансиноид со связывающимся с клетками агентом, сначала этот мэйтансиноид необходимо модифицировать.
Мэйтансиноиды, которые могут быть использованы в настоящем изобретении с целью получения мэйтансиноидов, которые способны быть присоединенными к связывающемуся с клетками агенту, хорошо известны из уровня техники и они могут быть выделены из природных источников согласно известным способам или приготовлены синтетически в соответствии с известными способами.
Примеры подходящих мэйтансиноидов включают мэйтансинол и аналоги мэйтансинола. Примеры подходящих аналогов мэйтансинола включают те, в которых имеется модифицированное ароматическое кольцо, и те, в которых имеются модификации в других положениях.
Конкретные примеры подходящих аналогов мэйтансинола, имеющих модифицированное ароматическое кольцо, включают:
- 14 010909 (1) С-19-дехлоро (и.8. Ра!. № 4256746) (получен путем ЬАН восстановления ансамитоцина Р2);
(2) С-20-гидрокси (или С-20-деметил) +/-С-19-дехлоро (и.8. Ра!. № 4361650 и 4307016) (получен путем деметилирования с использованием 81гер1отусе5 или Асйпотусек или путем дехлорирования с использованием ЬАН);
(3) С-20-деметокси, С-20-ацилокси (-ОСОК), +/-дехлоро (И.8. Ра!. № 4294757) (получен путем ацилирования с использованием ацилхлоридов).
Конкретные примеры подходящих аналогов мэйтансинола, имеющих модификации в других положениях, включают:
(1) С-9-8Н (и.8. Ра!. № 4424219) (получен путем взаимодействия мэйтансинола с Н28 или Р285);
(2) С-14-алкоксиметил (деметокси/СН2ОК) (и.8. Ра!. № 4331598);
(3) С-14-гидроксиметил или ацилоксиметил (СН2ОН или СН2ОАс) (И.8. Ра!. № 4450254) (получен из №сагб1а);
(4) С-15-гидрокси/ацилокси (и.8. Ра!. № 4364866) (получен путем превращения мэйтансинола под действием 8!гер!отусек);
(5) С-15-метокси (И.8. Ра!. № 4313946 и 4315929) (выделен из Тге\\Ь1 пибШога);
(6) С-18-Ы-деметил (И.8. Ра!. № 4362663 и 4322348) (получен путем деметилирования мэйтансинола под действием 8!гер!отусек);
(7) 4,5-деокси (И.8. Ра!. № 4371533) (получен путем восстановления мэйтансинола трихлоридом титана/ литий-алюминийгидридом (ЬАН)).
Для обеспечения связывания мэйтансиноида со связывающимся с клетками агентом этот мэйтансиноид включает в себя связывающую функциональную группу. Эта связывающая группа содержит химическую связь, которая обеспечивает высвобождение полностью активных мэйтансиноидов в конкретном месте. Подходящие химические связи хорошо известны из уровня техники и включают дисульфидные связи, кислотно-лабильные связи, фотолабильные связи, связи, лабильные к пептидазе, и связи, лабильные к эстеразе. Предпочтительными являются дисульфидные связи.
В описании патента США № 5208020, включенного в это изобретение путем отсылки, раскрыто получение мэйтансиноидов, несущих такие связи.
Согласно настоящему изобретению связывающая функциональная группа содержит стерически затрудненную тиоловую или дисульфидную группу.
Особенно предпочтительными мэйтансиноидами, включающими в себя связывающую группу, которая содержит реакционноспособную химическую группу, являются С-3 сложные эфиры мэйтансинола и его аналогов, причем связывающая группа содержит стерически затрудненную тиоловую или дисульфидную связь.
Многие положения в мэйтансиноидах могут служить в качестве места для химического присоединения связывающей группы. Например, можно ожидать, что С-3 положение, содержащее гидроксильную группу, С-14 положение, модифицированное гидроксиметилом, С-15 положение, модифицированное гидроксигруппой, и С-20 положение, содержащее гидроксигруппу, все будут эффективными. Однако С-3 положение является предпочтительным и особенно предпочтительным является С-3 положение мэйтансинола.
Кроме того, хотя синтез сложных эфиров мэйтансинола, имеющих связывающую группу, описан ниже на примере дисульфидной связи, содержащей связывающие группы в С-3 положении, специалист в этой области техники может понять, что связывающие группы с другими химическими связями, которые описаны выше, также могут быть использованы в настоящем изобретении, как и другие мэйтансиноиды и другие связывающие положения, которые описаны выше.
Структуры различных мэйтансиноидов настоящего изобретения представлены на фиг. 2. Синтез мэйтансиноидов, имеющих стерически затрудненную тиоловую или дисульфидную функциональную группу, может быть описан со ссылкой на фиг. 3. Во многих приведенных ниже иллюстративных способах используются тиолсодержащие мэйтансиноиды:
^-деацетил-Ы2-(4-меркапто-1-оксопентил)мэйтансин (обозначается ΌΜ3) и
Ν2 -деацетил-Ν2 -(4-метил-4-меркапто-1 -оксопентил)мэйтансин (обозначается-ОМ4).
ΌΜ3 (4а) и ЭМ4 (4й) представлены следующими структурными формулами:
- 15 010909
Цитотоксичность ίη νίίτο новых стерически затрудненных тиол- и дисульфидсодержащих мэйтансиноидов изобретения может быть оценена по их способности подавлять пролиферацию различных нежелательных клеточных линий ίη νίίτο (фиг. 4). Например, клеточные линии, такие как линия карциномы молочной железы человека 8К-Вт-3, или клеточная линия плоскоклеточного рака человека КВ, могут быть использованы для оценки цитотоксичности этих новых мэйтансиноидов. Клетки, подлежащие оценке, могут быть обработаны соединениями в течение 72 ч, и измеряют долю выживших клеток в прямом анализе известными способами. Затем, из результатов анализа могут быть рассчитаны величины ингибирующих концентраций (1С50).
Получение мэйтансиноидов, имеющих стерически затрудненную тиоловую или дисульфидную функциональную группу
Новыми мэйтансиноидами изобретения являются соединения, имеющие в положении С-3, С-14гидроксиметил, С-15-гидрокси или С-20-десметил боковую цепочку ацилированной аминокислоты с ацильной группой, содержащей затрудненную сульфгидрильную группу, в которой атом углерода ацильной группы, несущий тиоловую функциональную группу, имеет один или два заместителя, причем указанные заместители представляют собой СН3, С2Н5, линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал, и кроме того, один из заместителей может означать Н, и в которой ацильная группа имеет линейную цепочку длиной по меньшей мере в три атома углерода между карбонильной функциональной группой и атомом серы.
Предпочтительно мэйтансиноидные соединения представлены формулой 4'
в которой Υ' представляет собой группу (СЯ7Я8)1(СЯ9=СЯ1ο)ρ(СΞС)^Аг(СЯ5Я6)т^и(СЯ11=СЯ12)г(СΞС)8В1(СЯзЯ4)ηСЯ1Я28Ζ, в которой каждый Я1 и Я2 независимо представляет собой СН3, С2Н5, линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенныйй фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал, и кроме того, Я2 может означать Н;
А, В, Ό представляют собой циклоалкил или циклоалкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, простой или замещенный арил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал;
каждый Я3, Я4, Я5, Я6, Я7, Я8, Я9, Яп и Я12 независимо представляет собой Н, СН3, С2Н5, линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или
- 16 010909 алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал;
каждый 1, т, п, о, р, с.|. г, 8 и 1 независимо означает 0 или целое число от 1 до 5 при условии, что по меньшей мере два из 1, т, п, о, р, ц, г, 8 и 1 не равны нулю одновременно;
Ζ представляет собой Η, 8Я или -СОЯ, в которых Я представляет собой линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, или простой или замещенный арил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал.
В предпочтительных вариантах воплощения соединения, представленного формулой 4', Я1 означает метил, Я2 представляет собой Η и Ζ означает Η; Я1 и Я2 представляют собой метил и Ζ означает Η; Я1 означает метил, Я2 означает Η и Ζ представляет собой группу -8СИ3; или Я1 и Я2 означают метил и Ζ представляет собой -8ίΉ3.
Более предпочтительно мэйтансиноиды представляют собой соединения, представленные формулами (Ι-Ь), (Ι-О) или (Ι-Ό, Ь)
в которых Υ представляет собой группу (СЯ7Я8)1(СЯ5Я6)т(СЯ3Я4)пСЯ1Я2^, в которой каждый Я1 и Я2 независимо представляет собой СИ3, СЕШ линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал, и кроме того, Я2 может означать Η;
каждый Я3, Я4, Я5, Я6, Я7 и Я8 независимо представляет собой Η, СИ3, С2И5, линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал;
каждый 1, т и п независимо означает целое число от 1 до 5, и кроме того, п может означать 0;
Ζ представляет собой Η, 8Я или -СОЯ, в которых Я означает линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, или простой или замещенный арил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал; и
Мау представляет собой мэйтансиноид, в котором имеется боковая цепочка в положении С-3, С-14гидроксиметил, С-15-гидрокси или С-20-десметил.
Более предпочтительным является С-3 сложный эфир, который представляет собой соединение представленное формулой 4
в которой заместители определены выше.
Особенно предпочтительными являются любые из вышеупомянутых соединений, в которых Я1 означает метил, Я2 означает Η, каждый Я5, Я6, Я7 и Я8 представляет собой Η, каждый 1 и т равен 1, п равно 0 и Ζ представляет собой Η; соединения, в которых Я1 и Я2 означают метил, каждый Я5, Я6, Я7, Я8 представляет собой Η, 1 и т равны 1, п равно 0 и Ζ означает Η; соединения, в которых Я1 означает метил, Я2 означает Η, каждый Я5, Я6, Я7 и Я8 представляет собой Η, каждый 1 и т равен 1, п равно 0 и Ζ означает
- 17 010909
-8СН3; и соединения, в которых Κι и К2 означают метил, каждый Κ5, К,6. Κ7, К8 представляет собой Η, 1 и т равны 1, η равно 0 и Ζ означает -8СН3. Кроме того, предпочтительным является Ь-аланиловый стереоизомер, поскольку он является наиболее полезньм для конъюгатов изобретения.
Предпочтительные воплощения соединений формулы 4 включают ΌΜ3 и ΌΜ4, т.е. мэйтансиноид формулы 4, в которой Ζ означает Η, Κ1 означает метил, К2 означает Н, каждый Κ5, Κ^, Κ7 и Κ8 представляет собой Н, 1 и т равны 1 и η равно 0 (ΌΜ3, соединение 4а); мэйтансиноид формулы 4, в которой Ζ означает Н, оба Κ1 и К2 представляют собой метил, каждый Κ5, Κ6, Κ7 и Κ8 представляет собой Н, 1 и т равны 1 и η равно 0 (ΌΜ4, соединение 4Ь); мэйтансиноид формулы 4, в которой Κ1 означает метил, К2 означает Н, каждый Κ5, Κ6, Κ7 и Κ8 представляет собой Н, каждый 1 и т равен 1, η равно 0 и Ζ означает -8СН3; и мэйтансиноид формулы 4, в которой Κ1 и К2 означают метил, каждый Κ5, Κ6, Κ7, Κ8 представляет собой Н, 1 и т равны 1, η равно 0 и Ζ означает группу -8СН3.
Примеры линейных алкилов или алкенилов, имеющих от 1 до 10 атомов углерода, включают (но не ограничиваются указанными) метил, этил, пропил, бутил, пентил, гексил, пропенил, бутенил и гексенил.
Примеры разветвленных алкилов или алкенилов, имеющих от 3 до 10 атомов углерода, включают (но не ограничиваются указанными) изопропил, изобутил, втор-бутил, трет-бутил, изопентил, 1этилпропил, изобутенил и изопентенил.
Примеры циклических алкилов или алкенилов, имеющих от 3 до 10 атомов углерода, включают (но не ограничиваются указанными) циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил, циклопентенил, и циклогексенил.
Простые арилы включают арилы, имеющие от 6 до 10 атомов углерода, и замещенные арилы включают арилы, имеющие от 6 до 10 атомов углерода, несущие по меньшей мере один алкильный заместитель, содержащий от 1 до 4 атомов углерода, или алкоксизаместитель, такой как метокси, этокси, или галоидный заместитель, или нитрозаместитель.
Примеры простого арила, который содержит от 6 до 10 атомов углерода, включают фенил и нафтил.
Примеры замещенного арила включают нитрофенил, динитрофенил.
Гетероциклические ароматические радикалы включают группы, в которых имеется 3-10-членное кольцо, содержащее один или два гетероатома, выбранных из Ν, О или 8.
Гетероциклоалкильные радикалы включают циклические соединения, которые включают в себя 3-
10-членные кольцевые системы, содержащие один или два гетероатома, выбранных из Ν, О или 8.
Примеры гетероциклических ароматических радикалов включают пиридил, нитро-пиридил, пирролил, оксазолил, тиенил, тиазолил и фурил.
Примеры гетероалкильных радикалов включают дигидрофурил, тетрагидрофурил, тетрагидропирролил, пиперидинил, пиперазинил и морфолино.
Новые мэйтансиноиды, имеющие стерически затрудненную тиоловую или дисульфидную функциональную группу, могут быть получены с помощью следующих вновь разработанных способов.
Синтез мэйтансиноидов
На фиг. 3а показаны стадии синтеза мэйтансиноида ΌΜ4 (4Ь). Изобутиленсульфид (5) реагирует с анионом ацетонитрила, образуя меркапто-соединение 6. Гидролиз 6 под действием основания дает 4меркапто-4-метилпентановую кислоту (7). Превращение 7 в дисульфид 8 достигается путем взаимодействия с метиловым эфиром метантиолсульфокислоты (Μο8802Μο). Превращение 8 в Νгидроксисукцинимидный эфир 9, с последующим взаимодействием с Ν-метил-Ь-аланином, обеспечивает карбоновую кислоту 10, которую очищают хроматографией на колонке с силикагелем. При взаимодействии 10 с мэйтансинолом (11) в присутствии Ν,Ν'-дициклогексилкарбодиимида (ОСС) и хлористого цинка получают смесь №ацил-Л-метил-Ь-аланилового мэйтансиноида Ε-ΌΜ48Μο (4е) и №ацил-Н-метил-Оаланилмэйтансиноида ^-^Μ48Μе (4ί). Эту смесь диастереоизомеров разделяют с помощью ВЭЖХ, используя колонку с циано-связями. Целевой изомер, содержащий Ь-аминокислоту 4е, собирают и восстанавливают дитиотреитолом, чтобы получить тиолсодержащий Ь-аминоацилмэйтансиноид ΌΜ4 (4Ь), который снова очищают методом ВЭЖХ, используя колонку с циано-связями.
На фиг. 3Ь показаны стадии синтеза мэйтансиноида ΌΜ3 (4а). Превращают 4-меркаптопентановую кислоту (12) в метилдисульфид путем взаимодействия с метиловым эфиром метантиолсульфокислоты, чтобы получить 13. Превращение 13 в Ν-гидроксисукцинимидный эфир 14, с последующим взаимодействием с Ν-метил-Ь-аланином, обеспечивает карбоновую кислоту 15, которую очищают хроматографией на колонке с силикагелем. При взаимодействии 15 с мэйтансинолом (Κ) в присутствии Ν,Ν'дициклогексилкарбодиимида (ЭСС) и хлористого цинка получают смесь Н-ацил-Н-метил-Еаланилмэйтансиноида ^-^Μ388Μе, (4с) и N-ацил-N-метил-^-аланилмэйтансиноида ^-^Μ388Μе (46). Эту смесь диастереоизомеров разделяют методом ВЭЖХ, используя колонку с циано-связями. Целевой изомер, содержащий Ь-аминокислоту, собирают и восстанавливают дитиотреитолом, получая мэйтансиноид ΌΜ3 (4а), содержащий меркапто-Ь-аминокислоту, который снова очищают методом ВЭЖХ, используя колонку с циано-связями.
На фиг. 3с и 36 показан синтез ΌΜ3, имеющего или (8)-4-метилдитио-1-оксопентильную функциональную группу, или (К)-4-метилдитио-1-оксопентильную группу. Превращение (К)-1,3-бутандиола (16) в соответствующий дитозилат 17, с последующим взаимодействием с цианидом натрия и этилксантатом
- 18 010909 калия, дает нитрил 18 (фиг. 3с). Щелочной гидролиз, с последующим дисульфидным обменом, дает (8)-
4-метилдитиопентановую кислоту 19. Превращение 19 в сукцинимидильный эфир 20, с последующим взаимодействием с Ν-метил-Ь-аланином дает №метил-Н-[4-(8)метилдитио-Гоксопентил]-8-аланин (15а). При взаимодействии с мэйтансинолом, как описано выше для соединения 15, образуются два диастереоизомера Ь-ЭМ38Ме 4д и 411. Аналогично, (8)-1,3-бутандиол (21) превращают в (Я)-4метилдитиопентановую кислоту 24 и затем в соединение 15Ь. При взаимодействии с мэйтансинолом, как описано выше, получают два диастереоизомера ЙМ38Ме, 4к и 41.
Таким образом, настоящее изобретение предоставляет способ этерификации мэйтансиноида в положении С-3, С-14-гидроксиметил, С-15-гидрокси или С-20-десметил аминокислотой с ацилированной боковой цепочкой, в которой ацильная группа имеет защищенную сульфгидрильную группу, в которой атом углерода ацильной группы, несущий защищенную тиоловую функциональную группу, имеет один или два заместителя, причем указанные заместители представляют собой СН3, С2Н5, линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал, и кроме того, один из заместителей может означать Н, и в которой ацильная группа имеет линейную цепочку длиной по меньшей мере в три атома углерода между карбонильной функциональной группой и атомом серы, причем указанный способ включает в себя взаимодействие мэйтансиноида в положении С-3, С-14-гидроксиметил, С-15-гидрокси или С-20-десметил с ацилированной аминокислотой, в которой ацильная группа несет защищенную сульфгидрильную группу.
В предпочтительном воплощении настоящее изобретение представляет способ этерификации мэйтансинола с образованием мэйтансиноида формулы 42'
4/ в которой Υ2' представляет собой группу (СЯ ΙΤΗί'Η.ίΊΤ).(С С) А.(С1СК.)...1Ь(СЯ СЯ ).(С С)..В.(СЯ;1С)..в которой каждый Я1 и Я2 независимо представляет собой СН3, С2Н5, линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал, и кроме того, Я2 может означать Н;
каждый А, В и Ό независимо представляет собой циклоалкил или циклоалкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, простой или замещенный арил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал;
каждый Я3, Щ, Я5, Я6, Я7, Я8, Я9, Яп и Я12 независимо представляет собой Н, СН3, С2Н5, линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал;
каждый 1, т, η, о, р, с.|. г, 5 и ί независимо означает 0 или целое число от 1 до 5 при условии, что по меньшей мере два из 1, т, η, о, р, ц, г, 5 и ί не равны нулю одновременно; и
Ζ2 представляет собой 8Я или -СОЯ, в которых Я означает линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3-10 атомов углерода, или простой или замещенный арил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал, причем указанный способ включает в себя взаимодействие мэйтансинола структуры 11 в положении С-3
- 19 010909
с соединением формулы (ΙΙΙ'-Ь), (ΙΙΙ'-Ό) или (ΙΙΙ'-Ό, Ь)
в которых Υ2' представляет собой группу (СК7К8)1(СК9=СК10)р(С^С)чАг(СК5Кб)тПи(СК11=СК12)г(С^С)8В1(СКзК4)пСК1К2822, в которой каждый К1 и К2 независимо представляет собой СН3, С2Н5, линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал, и кроме того, К2 может означать Н;
каждый А, В и Ό независимо представляет собой циклоалкил или циклоалкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, простой или замещенный арил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал;
каждый К3, К4, К5, К6, К7, К8, К9, К11 и К12 независимо представляет собой Н, СН3, С2Н5, линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал;
каждый 1, т, п, о, р, д, г, 5 и 1 независимо означает 0 или целое число от 1 до 5 при условии, что по меньшей мере два из 1, т, п, о, р, д, г, 5 и 1 не равны нулю одновременно; и
Ζ2 представляет собой 8К или -СОК, в которых К означает линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, или простой или замещенный арил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал.
Предпочтительно соединение формулы (I) представлено формулой (Ι-Ь) и, также предпочтительно, К1 означает метил и К2 означает Н.
В более предпочтительном воплощении настоящее изобретение обеспечивает способ этерификации мэйтансинола с получением мэйтансиноида формулы 42
в которой Υ2 представляет собой группу (СК7К8)1(СК5К6)т(СКзК4)ηСК1К28Ζ2, в которой каждый К1 и К2 независимо представляет собой СН3, С2Н5, линейный или разветвленный или алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10
- 20 010909 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал, и кроме того, Н2 может означать Н;
каждый Н3, Н4, Н5, Н6, Н7 и Н8 независимо означает Н, СН3, С2Н5, линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал;
каждый 1, т и п независимо означает целое число от 1 до 5, и кроме того, п может означать 0;
Ζ2 означает 8Н или -СОН, в которых Н представляет собой линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, или простой или замещенный арил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал, причем указанный способ включает в себя взаимодействие мэйтансинола структуры 11 в положении С-3
с соединением, представленным формулами (Ίΐΐ-Ь), (Ίΐΐ-Ό) или (Ίΐΐ-Ό, Ь)
в которых Υ2 представляет собой группу (СН7Н8)1(СН5Н6)т(СН3Н4)пСН1Н2^2, в которой каждый Н1 и Н2 независимо представляет собой СН3, С2Н5, линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал, и кроме того, Н2 может означать Н;
каждый Н3, Н4, Н5, Н5, Н7 и Н8 независимо представляет собой Н, СН3, С2Н5, линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал;
каждый 1, т и п независимо означает целое число от 1 до 5, и кроме того, п может означать 0; и
Ζ2 означает 8Н или -СОН, в которых Н представляет собой линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, или простой или замещенный арил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал.
Диастереоизомеры могут быть разделены методом ВЭЖХ на силикагеле с циано-связями.
В более предпочтительном воплощении настоящее изобретение предоставляет способ этерификации мэйтансиноида с целью получения сложного эфира мэйтансиноида, представленного формулами (ΊΥ-Ь), (ΊΥ-ϋ) или (ΊΥ-Ό, Ь)
в которых Υ2 представляет собой группу (СН7Н8)1(СН5Н6)т(СН3Н4)пСН1Н2^2, в которой каждый Н1 и Н2 независимо представляет собой СН3, С2Н5, линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10
- 21 010909 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал, и кроме того, Я2 может означать Н;
каждый Я3, Я4, Я5, Я6, Я7 и Я8 независимо представляет собой Н, СН3, С2Н5, линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал;
каждый 1, т и η независимо означает целое число от 1 до 5, и кроме того, η может означать 0;
Ζ2 означает 8Я или -СОЯ, в которых Я представляет собой линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, или простой или замещенный арил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал; и
Мау представляет собой мэйтансиноид;
причем указанный способ включает в себя взаимодействие указанного мэйтансиноида в положении С-3, С-14-гидроксиметил, С-15-гидрокси или С-20-десметил с соединением формулы (Ш-Ь), (ΙΙΙ-Ό) или (IIIО, Ь)
в которых Υ2 представляет собой группу (СЯ^ЦСЯ^ЭЦСЯ^ЦСЯ^^^ в которой каждый Я1 и Я2 независимо представляет собой СН3, С2Н5, линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал, и кроме того, Я2 может означать Н;
каждый Я3, Я4, Я5, Я6, Я7 и Я8 независимо представляет собой Н, СН3, С2Н5, линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал;
каждый 1, т и η независимо означает целое число от 1 до 5, и кроме того, η может означать 0; и
Ζ2 означает 8Я или -СОЯ, в которых Я представляет собой линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, или простой или замещенный арил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал.
В еще более предпочтительном варианте воплощения настоящее изобретение предоставляет способ этерификации мэйтансинола с получением мэйтансиноида формулы 42
в которой Υ2 представляет собой группу (СЯ^ЦСЯ^ЦЦСЯ^ЦСЯ^^, в которой каждый Я1 и Я2 представляет собой независимо СН3, С2Н5, линейный алкил или алкенил имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил имеющий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал, и кроме того, Я2 может означать Н;
каждый Я3, Я4, Я5, Я6, Я7 и Я8 независимо представляет собой Н, СН3, С2Н5, линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил,
- 22 010909 имеющий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал;
каждый 1, т и η независимо означает целое число от 1 до 5, и кроме того, η может означать 0;
Ζ2 означает 8Κ или -СОК в которых Κ представляет собой линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, или простой или замещенный арил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал, причем указанный способ включает в себя взаимодействие мэйтансинола в положении С-3 с соединением формулы (ΙΙΙ-Ь), (ΙΙΙ-Ό) или (ΙΙΙ-Ό, Ь)
в которых Υ2 представляет собой группу (СΚ7Κ8)1(СΚ5Κ6)т(СΚзΚ4)ηСΚ1Κ28Ζ2, в которой каждый Κ1 и Κ2 независимо представляет собой СН3, С2Н5, линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал, и кроме того, Κ2 может означать Н;
каждый Κ3, Κ4, Κ5, Κ6, Κ7 и Κ8 независимо представляет собой Н, СН3, С2Н5, линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал;
каждый 1, т и η независимо означает целое число от 1 до 5, и кроме того, η может означать 0;
Ζ2 означает 8Κ или -СОК в которых Κ представляет собой линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, или простой или замещенный арил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал.
Предпочтительно соединение, представленное формулой (I), является Ь-стереоизомером.
В указанных выше способах предпочтительно, чтобы Κι означал метил, Κ2 означал Н, каждый Κ5, Κ6, Κ7 и Κ8 представлял собой Н, каждый 1 и т был равен 1 и η означал 0; или чтобы Κ1 и Κ2 означали метил, каждый Κ5, Κ6, Κ7 и Κ8 означал Н, 1 и т были равны 1 и η означал 0.
При получении ΌΜ3 соединение формулы (ΙΙΙ-Ь) представляет собой 15а (8,8), 15Ь (8,Κ) или смесь 15а (8,8) и 15Ь (8,Κ); соединение формулы (ΙΙΙ-Ό) представляет собой Ν-метил-Э-аланин, ацилированный рацемической ацильной группой или ацильной группой, имеющей или Κ-, или 8-хиральность, чтобы образовались соединения 15; и соединение формулы (ΙΙΙ-Ό, Ь) представляет собой рацемический Νметилаланин, ацилированный карбоксильной группой, имеющей защищенную тиоловую функциональную группу, в которой углеродный центр, несущий атом серы, является или рацемическим, или имеет Κили 8-хиральность, чтобы образовались соединения структуры 15,
Смесь 15а (8,8) и 15Ь (8,Κ) может быть получена способом, который включает в себя:
(1) взаимодействие 4-меркаптопентановой кислоты 12 с метиловым эфиром метантиолсульфокислоты, с образованием соединения 13;
(2) превращение соединения 13 в соответствующий Ν-гидроксисукцинимидный эфир 14;
(3) взаимодействие соединения 14 с Ν-метил-Ь-аланином, чтобы получить указанную смесь соединений 15а (8,8) и 15Ь (8,Κ).
Аналогично, смесь соединений 15 (Κ,8) и 15 (Κ,Κ) может быть получена способом, который включает в себя:
(1) взаимодействие 4-меркаптопентановой кислот 12 с метиловым эфиром метантиолсульфокислоты, с образованием соединения 13;
(2) превращение соединения 13 в соответствующий Ν-гидроксисукцинимидный эфир 14;
(3) взаимодействие соединения 14 с Ν-метил-Ь-аланином с образованием указанной смеси соединений 15 (Κ,8) и 15 (Κ,Κ).
Рацемический Ν-метилаланин, ацилированный карбоксильной группой, имеющей защищенную тиоловую функциональную группу, в которой углеродный центр, несущий атом серы, является или рацемическим, или имеет Κ- или 8-хиральность, чтобы получить соединения структуры 15, может быть получен способом, который включает в себя:
(1) взаимодействие 4-меркаптопентановой кислоты 12 с метиловым эфиром метантиолсульфокислоты, с образованием соединения 13;
(2) превращение соединения 13 в соответствующий Ν-гидроксисукцинимидный эфир 14;
(3) взаимодействие соединения 14 с рацемическим Ν-метилаланином с образованием указанного
- 23 010909 рацемического Ν-метилаланина, ацилированного карбоксильной группой, имеющей защищенную тиоловую функциональную группу, в которой углеродный центр, несущий атом серы, является или рацемическим, или имеет К- или 8-хиральность, чтобы получить соединения структуры 15;
Соединение 15а (8,8) может быть получено в процессе, который включает в себя:
(1) превращение (К)-1,3-бутандиола в (8)-4-(метилдитио)пентановую кислоту 19;
(2) превращение соединения 19 в соответствующий Ν-гидроксисукцинимидный эфир 20;
(3) взаимодействие соединения 20 с Ν-метил-Ь-аланином с образованием указанного соединения 15а (8,8).
Соединение 15Ь (8,К) может быть получено способом, который включает в себя:
(1) превращение (8)-1,3-бутандиола в (К)-4-(метилдитио)пентановую кислоту 24;
(2) превращение соединения 24 в соответствующий Ν-гидроксисукцинимидный эфир 25;
(3) взаимодействие соединения 25 с Ν-метил-Ь-аланином с образованием указанного соединения 15Ь (8,К).
При получении ΌΜ4, соединение формулы (ΙΙΙ-Ь) представляет собой соединение 10, содержащее Ν-метил-Ь-аланин; соединение формулы (ΙΙΙ-Ь) представляет собой соединение 10, содержащее Νметил-Ь-аланин, и соединение формулы (ΙΙΙ-Ь, Ь) представляет собой соединение 10, содержащее рацемический Ν-метилаланин.
Соединение 10, содержащее Ν-метил-Ь-аланин, Ν-метил-Ь-аланин или рацемический Νметилаланин, получают способом, который включает в себя:
(1) взаимодействие изобутиленсульфида 5 с анионом ацетонитрила, с образованием соединения 6;
(2) гидролиз соединения 6 с образованием 4-меркапто-4-метилпентановой кислоты 7;
(3) превращение соединения 7 в дисульфид 8 путем взаимодействия с метиловым эфиром метантиолсульфокислоты;
(4) превращение соединения 8 в соответствующий Ν-гидроксисукцинимидный эфир 9;
(5) взаимодействие соединения 9 с Ν-метил-Ь-аланином, Ν-метил-Ь-аланином или рацемическим Ν-метилаланином, чтобы получить соединение 10, содержащее Ν-метил-Ь-аланин, Ν-метил-Ь-аланин или рацемический Ν-метилаланин.
Согласно настоящему изобретению соединения формулы (ΙΙΙ) также являются новыми
в которых Υ2 представляет собой группу в которой каждый К! и К2 независимо представляет собой СН3, С2Н5, линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал, и кроме того, К2 может означать Н;
каждый К3, К4, К5, К6, К7 и К8 независимо представляет собой Н, СН3, С2Н5, линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал;
каждый 1, т и п независимо означает целое число от 1 до 5, и кроме того, п может означать 0; и
Ζ2 означает 8К или -СОК, в которых К представляет собой линейный алкил, разветвленный алкил или циклический алкил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, или простой или замещенный арил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал.
Соединения формулы (ΙΙΙ) могут быть легко получены соединения специалистом в этой области техники с помощью способов, аналогичных описанным выше для получения соединений 10 и 15,
Цитотоксичность мэйтансиноидов ш νίίτο
Цитотоксичность ш νίίτο мэйтансиноидов настоящего изобретения продемонстрирована на фиг. 4. Новые мэйтансиноиды (4с, 4е), несущие затрудненную дисульфидную связь, высокоэффективны в отношении испытанных клеточных линий. Так, 4с уничтожает клетки А-375 и клетки 8К-Вг-3 при значениях ΙΟ50, равных 1,5х10-11 М и 7,0х10-12 М соответственно. Аналогично, мэйтансиноид 4е также высокоэффективен со значением ΙΟ50, равным 3,2х10-11 М и 9,0х10-12 М в отношении клеток А-375 и 8К-Вг-3 соответственно. Сопоставление эффективности ш νίίτο затрудненного тиолсодержащего мэйтансиноида 4а настоящего изобретения с эффективностью ранее описанного мэйтансиноида 1 (фиг. 4с, б) показывает, что новые мэйтансиноиды обладают в 20-50 раз большей эффективностью, чем описанные ранее.
- 24 010909
Получение связывающихся с клетками агентов
Эффективность соединений изобретения в качестве терапевтических агентов зависит от надлежащего выбора подходящего связывающегося с клетками агента. Связывающиеся с клетками агенты могут быть любого известного в настоящее время типа или соединениями, которые станут известными, и включают пептиды и непептиды. Обычно они могут представлять собой антитела (особенно моноклональные антитела), лимфокины, гормоны, факторы роста, витамины, молекулы, транспортирующие питательные вещества (такие, как трансферрин), или любые другие связывающиеся с клетками молекулы или соединения.
Более конкретные примеры связывающихся с клетками агентов, которые могут быть использованы, включают поликлональные антитела;
моноклональные антитела;
фрагменты антител, такие как РаЬ, РаЬ', и Р(аЬ')2, Ρν (РаЛат, 1. Iттиηο1. 131:2895-2902 (1983); 8ргтд и др., 1. ^типоР 113:470-478 (1974); МкопоГГ и др., Агс11. ВюсНет. Вюрйук. 89:230-244 (1960));
интерфероны (например, альфа-, бета-, гамма-);
лимфокины, такие как ΙΕ-2, ΙΕ-3, ΙΕ-4, ΙΕ-6;
гормоны, такие как инсулин, ΤΒΠ (гормон, высвобождающий тиреотропин), М8Н (меланоцитстимулирующий гормон), стероидные гормоны, такие как андрогены и эстрогены;
факторы роста и колониестимулирующие факторы, такие как эпидермальный фактор роста (БОР), трансформирующий фактор роста-альфа (ΤΟΡ-альфа), фактор роста фибробластов (РОР), фактор роста сосудистого эндотелия (УБОР), гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (О-С8Р), макрофагальный колониестимулирующий фактор (М-С8Р), гранулоцитарный - макрофагальный колониестимулирующий фактор (ОМ-С8Р) (Вигдекк, [ттипо1оду Тойау 5:155-158 (1984)); трансферрин (О'КееГе и др., 1. Вю1. Скет. 260:932-937 (1985)); и витамины, такие как фолат.
Методики на основе моноклональных антител обеспечивают получение в высшей степени специфических связывающихся с клетками агентов в виде специфических моноклональных антител. Из уровня техники особенно хорошо известны методики создания моноклональных антител, полученных путем иммунизации мышей, крыс, хомяков или любых других млекопитающих представляющим интерес антигеном, таким как неповрежденные клетки-мишени, антигены, выделенные из клетки-мишени, цельный вирус, ослабленный цельный вирус, и вирусные белки, такие как белки оболочки вируса. Кроме того, могут быть использованы сенсибилизированные человеческие клетки. Другой способ создания моноклональных антител заключается в применении фаговых библиотек ксР\г (одноцепочечная вариабельная область), конкретно человеческих ксРт (см., например, ОпРГййк и др., патенты США № 5885793 и 5969108; МсСаГГейу и др., \УО 92/01047; Ыттд и др., \УО 99/06587). Кроме того, также могут быть использованы антитела с замененной поверхностью, раскрытые в патенте США № 5639641, как и гуманизированные антитела.
Подбор подходящего связывающегося с клетками агента представляет собой предмет выбора, и зависит от конкретной популяции клеток, которая будет выбрана в качестве мишени, однако обычно предпочтительными являются человеческие моноклональные антитела, если подходящие являются доступными.
Например, моноклональное антитело ΜΥ9 представляет собой мышиное антитело ^Οι, которое специфически связывается с антигеном СЭ33 [ЕЭ. СпГПп и др. Беикет1а Рек., 8, 521 (1984)}, и может быть использовано, если клетки-мишени экспрессируют СЭ33, как при заболевании острым миелогенным лейкозом (АМБ). Аналогично, моноклональное антитело антиВ4 представляет собой мышиное антитело ^Οι, которое связывается с антигеном СЭ19 на В клетках [№1й1ег и др., 1. ^типок 131, 244-250 (1983)}, и может быть использовано, если клетки-мишени представляют собой В-клетки или пораженные болезнью клетки, которые экспрессируют этот антиген, как в случае неходжкинской лимфомы или хронического лимфобластного лейкоза. Аналогично, моноклональное антитело С242, которое связывается с антигеном СапАд, (патент США № 5552293), может быть использовано для лечения опухолей, экспрессирующих СапАд, таких как колоректальный, панкреатический рак и рак желудка.
Кроме того, ОМ-С8Р, который связывается с миелоидными клетками, может быть использован в качестве связывающегося с клетками агента для пораженных болезнью клеток при остром миелогенном лейкозе. Лимфокин ΙΕ-2, который связывается с активированными Т-клетками, может быть использован для предупреждения отторжения пересаженного трансплантата, для терапии и предупреждения реакции трансплантата против хозяина, и для лечения острого Т-клеточного лейкоза. М8Н, который связывается с меланоцитами, может быть использован для лечения меланомы. Фолиевая кислота может быть использована для нацеливания на фолатный рецептор, экспрессируемый на опухолях яичников и других опухолях. Эпидермальный фактор роста может быть использован для нацеливания на сквамозные опухоли, такие как рак легких, головы и шеи. Соматостатин может быть использован для нацеливания на нейробластомы и другие типы опухолей.
Раки молочной железы и яичек могут быть успешно сделаны мишенями при помощи эстрогена (или аналогов эстрогена) или андрогена (или аналогов андрогена), соответственно, в качестве связывающихся
- 25 010909 с клетками агентов.
Получение цитотоксических конъюгатов
Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает конъюгат мэйтансиноида со связывающимся с клетками агентом, содержащий по меньшей мере один мэйтансиноид, связанный со связывающимся с клетками агентом, в котором связывающийся с клетками агент присоединен к мэйтансиноиду с использованием тиоловой или дисульфидной функциональной группы, которая находится в ацильной группе аминокислоты с ацилированной боковой цепочкой, созданной в положении С-3, С-14-гидроксиметил, С15-гидрокси или С-20-десметил мэйтансиноида, и в которой ацильная группа аминокислоты с ацилированной боковой цепочкой имеет соответствующую тиоловую или дисульфидную группу, расположенную при атоме углерода, который имеет один или два заместителя, причем указанные заместители представляют собой 0Η3, ΟΗ5, линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал, и кроме того, один из заместителей может означать Η, и в которой ацильная группа имеет линейную цепочку длиной по меньшей мере в три атома углерода между карбонильной групп и атомом серы.
Предпочтительный конъюгат связывающегося с клетками агента содержит по меньшей мере один мэйтансиноид, связанный со связывающимся с клетками агентом, в котором мэйтансиноид представлен формулой 41'
в которой Υι' представляет собой группу (СЯ·ЮНСЯ.СЯ !(СС)А.(СЯ.,Я.)...1)(СЯ СК;).(СС‘)..В.(С‘Я;1С)..С‘Я ΗΑ-, в которой каждый Я1 и Я2 независимо представляет собой 0Η3, С2Л5, линейный алкил или алкенил, содержащий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, содержащий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал, и кроме того, Я2 может представлять собой Η;
каждый А, В и Ό независимо представляет собой циклоалкил или циклоалкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, простой или замещенный арил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал;
каждый Я3, К4, Я5, Я6, Я7, Я8, Я9, Яп и Я12 независимо представляет собой Η, 0Η3, С2Л5, линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал; и каждый 1, т, п, о, р, ц, г, 8 и 1 независимо означает 0 или целое число от 1 до 5 при условии, что по меньшей мере два из 1, т, п, о, р, ц, г, 8 и 1 не равны нулю одновременно.
Предпочтительно Я1 означает метил и Я2 означает Η, или Я1 и Я2 представляют собой метил.
Еще более предпочтительный конъюгат связывающегося с клетками агента содержит по меньшей мере один мэйтансиноид, присоединенный к связывающемуся с клетками агенту, в котором мэйтансиноид представлен формулой (ΙΙ-Ь), (ΙΙ-Ό) или (ΙΙ-Ό, Ь)
в которой Υι представляет собой группу (СЯ7Я8)1(СЯ5Я6)т(СЯ3Я4)пСЯ1Я28-, в которой
- 26 010909 каждый В1 и В2 независимо представляет собой СН3, С2Н5, линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил, гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал, и кроме того, В2 может означать Н;
каждый В3, В4, В5, В6, В7 и В8 независимо представляет собой Н, СН3, С2Н5, линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал;
каждый 1, т и п независимо означает целое число от 1 до 5, и кроме того, п может означать 0; и
Мау представляет собой мэйтансинол, который несет боковую цепочку в положении С-3, С-14гидроксиметил, С-15-гидрокси или С-20-десметил.
Еще более предпочтительным является конъюгат мэйтансиноида со связывающимся с клетками агентом, в котором мэйтансиноид представлен формулой 4!
в которой заместители такие же, как определено выше для формулы (ΙΙ).
Особенно предпочтительными являются любые из вышеупомянутых соединений, в которых В1 означает метил, В2 означает Н, каждый В5, В6, В7 и В8 представляет собой Н, каждый 1 и т равен 1 и п равно 0; и те, в которых В1 и В2 означают метил, каждый В5, В6, В7, В8 представляет собой Н, 1 и т равны 1 и п равно 0.
Кроме того, предпочтительным является Ь-аминоацильный стереоизомер.
Репрезентативные цитотоксические конъюгаты изобретения представляют собой антитело/мэйтансиноид, фрагмент антитела/мэйтансиноид, эпидермальный фактор роста (Е6Е)/мэйтансиноид, меланоцитстимулирующий гормон (М8Н)/мэйтансиноид, тиреоидстимулирующий гормон (Т8Н)/мэйтансиноид, соматостатин/мэйтансиноид, фолат/мэйтансиноид, эстроген/мэйтансиноид, аналог эстрогена/мэйтансиноид, андроген/мэйтансиноид, и аналог андрогена/мэйтансиноид.
Тиолсодержащий мэйтансиноид вводят в реакцию с соответственно модифицированным связывающимся с клетками агентом, чтобы получить цитотоксические конъюгаты. Эти конъюгаты могут быть очищены с помощью гель-фильтрации, ионообменной хроматографии или методом ВЭЖХ.
Схемы получения конъюгатов из мэйтансиноидов, содержащих сульфгидрильные группы, приведены на фиг. 5. Более конкретно (фиг. 5а, Ь), раствор антитела в водном буфере может быть инкубирован с молярным избытком модифицирующего антитело агента, такого как Ы-сукцинимидил-3-(2пиридилдитио)пропионат (8ΡΌΡ, 3а) для того, чтобы ввести дитиопиридильные группы (фиг. 5а), или с Х-сукцинимидил-4-(2-пиридилдитио)бутаноатом (8ΡΌΒ, 3Ь) для того, чтобы ввести дитиопиридильные группы (фиг. 5Ь). Затем модифицированное антитело взаимодействует с тиолсодержащими мэйтансиноидами (такими как 4а или 4Ь) для того, чтобы получить связанный дисульфидом конъюгат антителомэйтансиноид. Затем этот конъюгат мэйтансиноида с антителом может быть очищен методом гельфильтрации.
Альтернативно, антитело может быть инкубировано с молярным избытком амодифицирующего антитело агента, такого как 2-иминотиолан, чтобы ввести сульфгидрильные группы. Затем модифицированное антитело взаимодействует с подходящими дисульфидсодержащими мэйтансиноидами, чтобы получить связанный дисульфидной связью конъюгат антитело-мэйтансиноид. Затем этот конъюгат мэйтансиноида с антителом может быть очищен путем гель-фильтрации.
Число молекул мэйтансиноида (обозначено как \ν на фиг. 5а-б), связанных с одной молекулой антитела, можно определить спектрофотометрически, измеряя отношение поглощения при 252 и 280 нм. Этим способом можно связать в среднем 1-10 молекул мэйтансиноида с молекулой антитела. Предпочтительно среднее число молекул мэйтансиноида, связанных с одной молекулой антитела, составляет 2-5 и наиболее предпочтительно равно 3-4,5.
Альтернативно, раствор антитела в водном буфере может быть инкубирован с молярным избытком
- 27 010909 модифицирующего антитело агента, такого как М-сукцинимидил-4-(М-малеимидометил)циклогексан-1карбоксилат (8МСС, 26) для того, чтобы ввести малеимидные группы (фиг. 5с), или с Ν-сукцинимидил-
4-(иодацетил)аминобензоатом (81АБ, 27), чтобы ввести иодацетильные группы (фиг. 56). Затем модифицированное антитело вводят в реакцию с тиолсодержащими мэйтансиноидами (такими, как 4а или 4Ь), чтобы получить связанный тиоэфирной связью конъюгат антитела с мэйтансиноидом. Затем конъюгат мэйтансиноида с антителом может быть очищен методом гель-фильтрации.
Число молекул мэйтансиноида, связанных с одной молекулой антитела, может быть определено с помощью спектрофотометрического анализа, как описано выше.
Таким образом, настоящее изобретение предоставляет способ получения конъюгата мэйтансиноида со связывающимся с клетками агентом, который включает в себя приготовление очищенного мэйтансиноида одним из способов, описанных выше, и взаимодействие очищенного мэйтансиноида со связывающимся с клетками агентом.
Предпочтительно реакционноспособная дитиогруппа представляет собой дитиопиридильную группу или замещенную дитиопиридильную группу. Особенно предпочтительно реакционноспособная дитиогруппа содержит нитропиридилдитио- или динитропиридилдитиогруппу.
В другом способе очищенный мэйтансиноид вводят в реакцию со связывающимся с клетками агентом, содержащим малеимидную группу или галоидацетильную группу.
Конъюгаты связывающихся с клетками агентов с мэйтансиноидными лекарственными препаратами изобретения могут быть оценены по их способности подавлять пролиферацию различных нежелательных клеточных линий ίη νίΐτο (фиг. 6). Например, клеточные линии, такие как линия человеческой карциномы ободочной кишки СОЬО 205, клеточная линия человеческой меланомы А-375, клеточная линия человеческого миелоидного лейкоза НЬ60, могут быть использованы для оценки цитотоксичности этих конъюгатов. Подлежащие оценке клетки могут контактировать с соединениями в течение 24 ч, и измеряют долю выживших клеток в прямом анализе известными способами. Затем из результатов анализа могут быть рассчитаны величины ингибирующих концентраций (1С50).
Эффективность ίη νίΐτο и специфичность по отношению к мишени конъюгатов антител с мэйтансиноидами настоящего изобретения продемонстрирована на фиг. 6, 10 и 12. Так, на фиг. 6 показано, что 1шС242-ЭМ3. а также йиС242-ОМ4 обладают высокой эффективностью при уничтожении антигенположительных клеток СОЬО 205, при значениях 1С50 1,3х10-11 М и 1,1х10-11 М соответственно. Напротив, антиген-отрицательные клетки А-375 приблизительно в 500 раз менее чувствительны, демонстрируя, что мэйтансиноидные конъюгаты настоящего изобретения обладают высокой эффективностью и специфичностью. Аналогично, фиг. 10 и 12 демонстрируют высокую эффективность и специфичность по отношению к мишени конъюгатов мэйтансиноидов настоящего изобретения с антителами ΜΥ9-6 и антиВ4 соответственно.
Противоопухолевую эффективность ίη νίνο конъюгатов антител с затрудненными тиолсодержащими мэйтансиноидами настоящего изобретения сравнивали с эффективностью ранее описанных мэйтансиноидных конъюгатов на нескольких различных моделях человеческих опухолей на мышах. В первой модели (фиг. 7) мышей 8СГО, несущих устойчивые подкожные ксенотрансплантаты опухоли человеческой ободочной кишки НТ-29, обрабатывали или конъюгатом антитела (йиС242-ОМ1) с ранее описанным мэйтансиноидом ΌΜ1, или двумя новыми мэйтансиноидными конъюгатами (йиС242-ОМ3, 1шС242ΌΜ4). Обработка конъюгатом йиС242-ОМ1 приводит к задержке роста опухоли на 18 суток. Напротив, новые агенты обладают значительно большей эффективностью: время задержки роста опухоли составляет 28 суток для 111.1С242-ОМ3 и 36 суток для йиС242-ОМ4.
Во второй модели (фиг. 8) мышей, несущих устойчивые подкожные ксенотрансплантаты опухоли человеческой ободочной кишки СОЬО 205, обрабатывали или конъюгатом антитела (1шС242-ЭМ1) с ранее описанным мэйтансиноидом ЭМ1, или двумя новыми мэйтансиноидными конъюгатами (1шС242ЭМ3, йиС242-ОМ4). Обработка конъюгатом йиС242-ОМ1 не приводит к регрессии опухоли и дает задержку роста опухоли на 20 суток. Напротив, новые агенты обладают значительно большей эффективностью. Полная регрессия опухоли в течение 45 суток наблюдается в группе, обработанной 1шС242-ЭМ3. Конъюгат 1шС242-ЭМ4 является даже более эффективным, и приводит к излечению всех обработанных мышей.
В третьей модели (фиг. 9) мышей, несущих устойчивые подкожные ксенотрансплантаты человеческого миелоидного лейкоза НЬ60, обрабатывали или конъюгатом антитела (М^-9-6-ОМ1) с ранее описанным мэйтансиноидом ЭМ1, или двумя новыми мэйтансиноидными конъюгатами (М^9-6-ОМ3, М^9-
6-ЭМ4). Обработка конъюгатом М^9-6-ОМ1 не приводит к регрессии опухоли, и дает задержку роста опухоли на 5 суток. Напротив, новые агенты обладают значительно большей эффективностью, приводят к регрессии опухоли. Конъюгат М^9-6-ЭМ3, а также М^-9-6-ЭМ4 обеспечивают время задержки роста опухоли больше чем на 20 суток.
В четвертой модели (фиг. 11) конъюгат мэйтансиноида настоящего изобретения (йиМ^9-6-ОМ4) непосредственно сравнивали с конъюгатом ранее описанного мэйтансиноида (йиМ^9-6-ОМ1) в подкожной модели ксенотрансплантата, полученной с клетками НЬ-60. При эквивалентной дозе обработка конъюгатом настоящего изобретения М^9-6-ОМ4 приводит к полной регрессии опухоли в течение 85
- 28 010909 суток. Напротив, конъюгат ранее описанного мэйтансиноида обладает гораздо меньшей активностью, и дает задержку роста опухоли приблизительно только на 48 суток.
В пятой модели (фиг. 13а) конъюгат мэйтансиноида настоящего изобретения с антителом йиВ4 демонстрирует высокую противоопухолевую активность, которая зависит от дозы, на модели подкожной опухоли Каток. Полная регрессия опухоли и излечение наблюдаются при дозах, которые не являются токсичными (фиг. 13а,й).
Результаты приведенных выше пяти экспериментов по эффективности демонстрируют, что стерически затрудненные тиолсодержащие мэйтансиноиды настоящего изобретения дают конъюгаты со связывающимися с клетками агентами, обладающие чрезвычайно улучшенной противоопухолевой активностью по сравнению с ранее описанными конъюгатами мэйтансиноидов со связывающимися с клетками агентами.
Композиции и способы их применения
Настоящее изобретение предоставляет фармацевтические композиции, содержащие эффективное количество любого конъюгата мэйтансиноида со связывающимися с клетками агентами настоящего изобретения, его фармацевтически приемлемой соли или сольвата, и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или наполнитель.
Настоящее изобретение также предоставляет способы лечения, которые включают в себя введение субъекту, нуждающемуся в лечении, эффективного количества любого из описанных выше конъюгатов.
Аналогично, настоящее изобретение предоставляет способ индукции гибели клеток в выбранных популяциях клеток, который включает в себя контактирование клеток-мишеней или тканей-мишеней, содержащих клетки-мишени, с эффективным количеством цитотоксического агента, содержащего любой конъюгат мэйтансиноида со связывающимся с клетками агентом настоящего изобретения, его фармацевтически приемлемой соли или сольвата. Клетки-мишени представляют собой клетки, с которыми может связываться связывающийся с клетками агент.
По желанию, наряду с конъюгатом могут быть введены другие активные агенты, такие как другие противоопухолевые агенты.
Подходящие фармацевтически приемлемые носители, разбавители и наполнители хорошо известны и могут быть определены специалистами в этой области техники, как предписывается клинической ситуацией.
Примеры подходящих носителей, разбавителей и/или наполнителей включают:
(1) физиологический раствор ЭЫйессо'к с фосфатным буфером, рН около 7,4, содержащий (или не содержащий) приблизительно от 1 мг/мл до 25 мг/мл человеческого сывороточного альбумина, (2) 0,9%-й физиологический раствор (0,9% вес./об. №1С1).
(3) 5% (вес./об.) декстрозу; и кроме того, может содержать антиоксидант, такой как триптамин, и стабилизирующий агент, такой как Тетееп 20.
Способ индукции гибели клеток в выбранных популяциях клеток может быть осуществлен ш уйго, ш νί\Ό или ех νί\Ό.
Примеры использования ш νίΙΐΌ включают обработки аутологического костного мозга до его трансплантации тому же самому пациенту, для того чтобы уничтожить пораженные болезнью или злокачественные клетки; обработки костного мозга до его трансплантации, для того чтобы уничтожить компетентные Т-клетки и предупредить реакцию трансплантата против хозяина (ОУНИ); обработки клеточных культур для того, чтобы уничтожить все клетки, за исключением желаемых вариантов, которые не экспрессируют целевой антиген; или чтобы уничтожить варианты, которые экспрессируют нежелательный антиген.
Условия неклинического применения ш νίΙΐΌ могут быть легко определены специалистом в этой области техники.
Примерами клинического применения ех νί\Ό могут быть удаление опухолевых клеток или лимфоидных клеток из костного мозга до аутологической трансплантации при лечении рака или при лечении аутоиммунного заболевания, или для удаления Т-клеток и других лимфоидных клеток из аутологического или аллогенного костного мозга или ткани до трансплантации для того, чтобы предупредить ОУНИ. Обработка может быть проведена следующим образом. Костный мозг заимствуют у пациента или у других индивидов и затем инкубируют в среде, содержащей сыворотку, в которую добавляют цитотоксический агент изобретения, в диапазоне концентраций приблизительно от 10 мкМ до 1 пМ, приблизительно в течение от 30 мин до 48 ч, приблизительно при 37°С. Точные условия концентрации и времени инкубации, т. е. доза, легко определяются специалистом в этой области техники. После инкубации клетки костного мозга промывают средой, содержащей сыворотку, и возвращают пациенту внутривенно, в соответствии с известными способами. В тех случаях, когда пациент получает другие типы лечения, такие как курс аблационной химиотерапии или облучение всего организма, между временем заимствования и повторной инфузии обработанных клеток, эти обработанные клетки костного мозга хранят замороженными в жидком азоте, используя стандартное медицинское оборудование.
Для клинического применения ш νί\Ό цитотоксический агент изобретения может вводиться в виде раствора или лиофилизированного порошка, который тестируют на стерильность и на уровень эндоток
- 29 010909 сина. Примеры подходящих протоколов введения конъюгата следуют ниже. Конъюгаты вводятся еженедельно в течение 4 недель в виде внутривенного болюса каждую неделю. Дозы болюсов задаются в 501000 мл нормального физиологического раствора, в который может быть добавлено от 5 до 10 мл человеческого сывороточного альбумина. Внутривенные дозировки могут составлять от 10 мкг до 2000 мг на введение (диапазон от 100 нг до 20 мг/кг в сутки). Спустя четыре недели после обработки, лечение пациента может продолжаться на еженедельной основе. Конкретные клинические протоколы, с учетом способа введения, наполнителей, разбавителей, дозировок, кратности и др., могут быть определены специалистом в этой области техники, как предписывается клинической ситуацией.
Примеры медицинских состояний, которые могут подвергаться лечению в соответствии со способами ίη νίνο или ех νίνο индукции гибели клеток в выбранных популяциях клеток, включают злокачественность любого типа, в том числе, например, рак легких, молочной железы, ободочной кишки, предстательной железы, почек, поджелудочной железы, яичников и лимфатических органов; аутоиммунные заболевания, такие как системная волчанка, ревматоидный артрит, и рассеянный склероз; отторжение трансплантата, такое как отторжение почечного трансплантата, отторжение печеночного трансплантата, отторжение легочного трансплантата, отторжение сердечного трансплантата, и отторжение трансплантата костного мозга; реакция трансплантата против хозяина; вирусные инфекции, такие как цитамегавирусная (СМУ) инфекция, ВИЧ инфекция, СПИД, и др.; и паразитные инфекции, такие как жиардиаз, амебная дизентерия, бильгарциоз, и другие, как может быть определено средним специалистом в этой области техники.
Примеры
Теперь изобретение будет проиллюстрировано со ссылкой на не ограничивающие примеры. Если не указано другое, все проценты, соотношения, части, и др. даны по массе. Ниже описаны примеры для соединений, в которых Я1 представляет собой Н или СН3, Я2 означает СН3, каждый Я5, Я6, Я7, Я8 представляет собой Н, каждый 1 и т равен 1 и η равно нулю. Аналогичный синтез может быть осуществлен для других соединений изобретения, в которых каждый Я1 и Я2 независимо представляют собой Н, СН3, С2Н5, или более высокомолекулярный алкил, алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, или фенил, замещенный фенил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал; и где каждый 1, т и η означает целое число от 1 до 5, и кроме того, η также может означать 0.
Все реагенты были закуплены на фирме А1бпс11 С11ет1са1 Οο., Иете 1ег§еу, или из других коммерческих источников. Мэйтансинол (11) приготовлен, как описано ранее (патент США № 6333410). Спектры ядерного магнитного резонанса ( Н-ЯМР) регистрировали на приборе Вгакег 400 МГц и масс-спектры регистрировали на приборе Вгикег ИаИвшс^ Е5С.|шге 3000 с использованием электрораспылительной ионизации.
Пример 1. Синтез мэйтансиноида 4Ь.
4-Меркапто-4-метилпентановая кислота (7). Колбу емкостью 500 мл снабжают магнитной мешалкой и капельной воронкой на 150 мл. Эту систему помещают в атмосферу аргона. Через полую иглу добавляют 150 мл безводного тетрагидрофурана (ТГФ) и 75 мл 2,5 молярного раствора н-бутиллития (ВиЬ1) в гексане (18,7 ммоль), и раствор охлаждают при -78°С в бане сухой лед/ацетон. Ацетонитрил (7,3 г, 9,4 мл, 18 ммоль) по каплям добавляют из шприца приблизительно в течение 5 мин. Реакционную смесь перемешивают в течение 30 мин, в течение которых образуется белый осадок литий-ацетонитрила. Изобутиленсульфид (15 г, 17 ммоль) растворяют в 100 мл безводного ТГФ и добавляют по каплям в течение приблизительно 30 мин из капельной воронки. Удаляют охлаждающую баню, и оставляют перемешиваться реакционную смесь в течение 3 ч. Колбу охлаждают в бане с ледяной водой, в то время как по каплям добавляют 38 мл 0,5 молярного раствора НС1. Слой в ТГФ сохраняют, и водный слой промывают два раза этилацетатом (75 мл). Слои в ТГФ и этилацетате объединяют, сушат приблизительно над 20 г безводного сульфата натрия и переносят в колбу емкостью 250 мл. Растворитель удаляют с помощью роторного испарителя в вакууме, получая неочищенное соединение 6. Добавляют этанол (30 мл) и магнитную мешалку. Содержимое перемешивают, в то время как медленно добавляют раствор 8,0 г №ОН в 30 мл деионизированной воды. Колбу снабжают обратным холодильником и помещают в атмосферу аргона. Реакционную смесь кипятят с обратным холодильником в течение ночи, затем охлаждают до комнатной температуры. Добавляют деионизированную воду (60 мл), и смесь экстрагируют два раза (порциями по 25 мл) смесью этилацетата и гексана (2:1). Водный слой подкисляют концентрированной НС1 до рН 2, затем экстрагируют три раза этилацетатом (порциями по 75 мл). Органические слои сушат над безводным Иа28О4, и растворитель удаляют с помощью роторного испарителя в вакууме, получая 10 г продукта 7 (выход 39%). Этот продукт используют без дополнительной очистки.
’Н ЯМР (СИС13): δ 1,38 (6Н, с), 1,87-1,93 (2Н, м), 2,08 (1Н, с), 2,51-2,57 (2Н, м).
4-Метил-4-(метилдитио)пентановая кислота (8). Раствор меркаптопентановой кислоты 7 (6,0 мл, 40 ммоль) растворяют в 50 мл деионизированной воды в колбе емкостью 250 мл. Этот раствор перемешивают магнитной мешалкой, в то время как добавляют к кислоте карбонат натрия (6,4 г, 60 ммоль) со скоростью, которая не будет приводить к избыточному вспениванию. Колбу снабжают капельной воронкой на 100 мл, в которую заливают раствор метилового эфира метантиолсульфокислоты (7,5 г, 60 ммоль), растворенного в 30 мл перегнанного в стекле 100%-го этанола. Колбу охлаждают в бане с ле
- 30 010909 дяной водой и систему выдерживают в атмосфере аргона. Раствор метилового эфира метантиолсульфокислоты добавляют по каплям в колбу по-возможности быстро, но не вызывая избыточного вспенивания. Охлаждающую баню удаляют, и реакционной смеси дают перемешаться еще в течение 3 часов. Растворитель удаляют с помощью роторного испарителя в вакууме, до объема остатка приблизительно 20 мл. После этого добавляют 10 мл насыщенного раствора бикарбоната натрия и 30 мл деионизированной воды. Смесь промывают три раза этилацетатом (порциями по 25 мл) в делительной воронке. Кислотность водного слоя доводят приблизительно до рН 2 с помощью 5 М соляной кислоты, и экстрагируют два раза этилацетатом (порциями по 120 мл). Органические слои объединяют и промывают 20 мл раствора, состоящего из насыщенного раствора ΝαΟΊ и 1М соляной кислоты в соотношении 4:1. Затем органический слой сушат над 14 г безводного сульфата натрия, и растворитель удаляют с помощью роторного испарителя в вакууме, получая 5,4 г продукта 8 (выход 70%). Этот продукт может быть использован на следующей стадии без дополнительной очистки.
Ή-ЯМР (ΟΌΟ13): δ 1,54 (6Н, с), 2,15-2,21 (2Н, м), 2,64 (3Н, с), 2,69-2,72 (2Н, м).
Масс-спектр (МС) (М+Να') вычислено: 217,0, найдено: 217,1.
Ν-Гидроксисукцинимидный эфир 4-метил-4-(метилдитио)пентановой кислоты (9). Метилдитиопентановую кислоту 8 (3,0 г, 15 ммоль) растворяют в 20 мл метиленхлорида и перемешивают магнитной мешалкой. Добавляют Ν-гидроксисукцинимид (2,65 г, 23 ммоль) и затем гидрохлорид 1-[3(диметиламино)пропил]-3-этилкарбодиимида (ΕΌΟ, 4,4 г, 23 ммоль). Смесь перемешивают в атмосфере аргона в течение 2 ч. Реакционную смесь выливают в делительную воронку емкостью 125 мл, добавляют 40 мл этилацетата, и раствор промывают два раза калий-фосфатным буфером (порциями по 20 мл), 50 мМ, рН 6,0, и один раз 12 мл насыщенного раствора хлорида натрия. Органический слой сушат над 14 г безводного Να28Ο4, и растворитель удаляют с помощью роторного испарителя в вакууме, чтобы получить 4,0 г продукта 9 (выход 90%), который используют без дополнительной очистки.
Ή-ЯМР (ΟΌΟ13): δ 1,30 (6Н, с), 2,00-2,05 (2Н, м), 2,39 (3Н, с), 2,68-2,72 (2Н, м), 2,73-2,83 (4Н, м).
МС (М+Να') вычислено: 314,0, найдено: 314,1.
№Метил-Н-(4-метил-4-метилдитио-1-оксопентил)-Е-аланин (10). Ν-Метил-Е-аланин (2,85 г, 18,0 ммоль) растворяют в 50 мл раствора диметоксиэтана и деионизированной воды (1:1) в колбе (на 125 мл), снабженной магнитной мешалкой. Добавляют триэтиламин (6,9 г, 36 ммоль), и раствор энергично перемешивают, в то время как добавляют по каплям соединение 9 (5,44 г, 18 ммоль), растворенное в 40 мл той же самой смеси растворителей приблизительно в течение 5 мин. Спустя 2 ч реакционную смесь концентрируют приблизительно до объема 40 мл с помощью роторного испарителя под вакуумом, затем добавляют 10 мл деионизированной воды и 1 М соляную кислоту, чтобы получить значение рН, приблизительно равное 2. Смесь выливают в делительную воронку и экстрагируют два раза этилацетатом (порциями по 50 мл). Органические слои объединяют и затем промывают насыщенным раствором хлорида натрия (7 мл). Органический слой сушат над 8,0 г безводного Να28Ο4, и растворитель удаляют с помощью роторного испарителя в вакууме. Остаток растворяют в минимальном объеме этилацетата и очищают хроматографией на силикагеле (40 микрон (мкм), марки «для флэш-хроматографии», слой силикагеля: 24x3,0 см, подвижная фаза - смесь гексан:этилацетат:уксусная кислота 50:48:2). Фракции, содержащие желаемый продукт, объединяют, и растворитель удаляют в вакууме. Остаточную уксусную кислоту удаляют путем растворения остатка в минимальном объеме этилацетата и осаждения продукта, путем быстрого добавления гексана по каплям при перемешивании. Добавляют гексан, до отсутствия продукта в надосадочной жидкости, анализируемой методом тонкослойной хроматографии (ТСХ). Осадок сушат в вакууме в течение 4 ч, чтобы получить 2,2 г продукта 10 (выход 51%).
Ή-ЯМР (ΟΌΟ13): δ 1,32 (6Н, с), 1,42 (3Н, д, 1=7 Гц), 1,90-97 (2Н, м), 2,40 (3Н, с), 2,42-2,49 (2Н, м), 2,9 (3Н, с), 5,15 (1Н, кв, 1=7 Гц).
МС (М+Να') вычислено: 302,1, найдено: 302,0.
^-Деацетил-И2-(4-метил-4-метилдитио-1-оксопентил)мэйтансин (Ь-ОМ4-8Ме, 4е). Раствор мэйтансинола (11, 25 мг, 0,44 ммоль) и М-метил-Н-(4-метил-4-метилдитио-1-оксопентил)-Е-аланина (10, 42,0 мг, 0,177 ммоль) в 3 мл дихлорметана перемешивают магнитной мешалкой в атмосфере аргона, в то время как добавляют раствор дициклогексилкарбодиимида (ЭСС, 57,1 мг, 0,277 ммоль) в 0,67 мл дихлорметана. Спустя 1 мин добавляют 1 М раствор ΖηС12 в диэтиловом эфире (0,03 мл, 0,03 ммоль). Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 2 ч, затем добавляют 5 мл этилацетата, и смесь фильтруют под вакуумом через слой грубой фильтровальной бумаги. Фильтрат промывают 2 мл бикарбоната натрия и затем 1 мл насыщенного раствора хлорида натрия. Органический слой сушат над 2 г безводного сульфата натрия. Растворитель удаляют в вакууме, и остаток очищают хроматографией на силикагеле, используя смесь дихлорметана и метанола, чтобы удалить непрореагировавший мэйтансинол. Объединяют фракции, содержащие желаемый продукт, и растворитель удаляют в вакууме, чтобы получить смесь диастереоизомеров 4е и 4£. Остаток растворяют в минимальном объеме этилацетата, и очищают на колонке (50 смх250 см, 10 мкм О|ахет™ СЫ), используя в качестве подвижной фазы смесь гексана, 2-пропанола и этилацетата в соотношении 68:8:24. Скорость потока составляет 118 мл/мин. В этих условиях желаемый продукт 4е элюируется при времени удерживания 11 мин, и нежелательный
- 31 010909 диастереоизомер 4ί имеет время удерживания, равное 19 мин. Фракции, содержащие желаемый продукт, объединяют, и растворитель удаляют в вакууме, чтобы получить 12,0 мг продукта 4е (выход 36%).
Ή-ЯМР (СБС13): δ 0,80 (3Н, с), 1,28-1,36 (13Н, м), 1,42-1,46 (2Н, м), 1,53-1,63 (2Н, м), 1,64 (3Н, с), 1,75-1,85 (1Н, м), 1,90-2,10 (1Н, м), 2,18 (1Н, дд, 1=3 Гц и 14 Гц), 2,31 (3Н, с), 2,40-2,49 (1Н, м), 2,50-2,65 (1Н, м), 2,85 (3Н, с), 3,04 (1Н, д, 1=9 Гц), 3,11 (1Н, д, 1=11 Гц), 3,23 (3Н, с), 3,35 (3Н, с), 3,49 (1Н, д, 1=9 Гц), 3,63 (1Н, д, 1=12 Гц), 3,98 (3Н, с), 4,27 (1Н, т, 1=10 Гц), 4,79 (1Н, дд, 1=3 Гц и 12 Гц), 5,41 (1Н, кв, 1=7 Гц), 5,66 (1Н, дд, 1=9 Гц и 15 Гц), 6,21 (1Н, с), 6,42 (1Н, дд, 1=11 Гц и 15 Гц), 6,65 (1Н, д, 1=1,5 Гц), 6,73 (1Н, д, 1=11 Гц), 6,81 (1Н, д, 1=1,5 Гц).
МС высокого разрешения (М+Н+) вычислено: 826,3174, найдено: 826,3150.
^-деацетил-^-(4-меркапто-4-метил-1-оксопентил)мэйтансин (Ь-ОМ4, 4Ь). Дисульфид 4е, полученный выше (12 мг, 0,015 ммоль), растворяют в 1,0 мл смеси 1:1 этилацетат:метанол. Затем добавляют раствор дитиотреитола (18 мг, 0,117 ммоль) в 0,50 мл 50 мМ фосфатного буфера, рН 7,5. Раствор перемешивают магнитной мешалкой в атмосфере аргона в течение 3 ч, затем добавляют 1 мл 200 мМ фосфатного буфера, рН 6,0, и смесь экстрагируют три раза этилацетатом (порциями по 2 мл). Органические слои объединяют и промывают 1 мл насыщенного раствора хлорида натрия, затем сушат над 1 г безводного сульфата натрия. Растворитель удаляют в вакууме, и остаток растворяют в минимальном объеме этилацетата и очищают на колонке (50 смх250 см, 10 мкм ^^аζет™ ΟΝ), используя в качестве подвижной фазы смесь гексана, 2-пропанола и этилацетата в соотношении 70:8:22. Скорость потока составляет 22 мл/мин. Желаемый продукт 4Ь элюируется при времени удерживания 10 мин. Фракции, содержащие чистый продукт 4Ь, объединяют, и растворитель удаляют в вакууме, чтобы получить 11 мг продукта 4Ь (выход 97%).
Ή-ЯМР (СБС13): δ 0,80 (3Н, с), 1,19-1,23(1Н, м), 1,28-1,36 (12Н, м), 1,42-1,46(2Н, м), 1,53-1,63 (2Н, м), 1,64 (3Н, с), 1,75-1,85 (1Н, м), 1,90-2,10 (1Н, м), 2,18 (1Н, дд, 1=3 Гц и 14 Гц), 2,40-2,49 (1Н, м), 2,502,65 (2Н, м), 2,88 (3Н, с), 3,04 (1Н, д, 1=9 Гц), 3,11 (1Н, д, 1=11 Гц), 3,23 (3Н, с), 3,35 (3Н, с), 3,49 (1Н, д, 1=9 Гц), 3,63 (1Н, д, 1=12 Гц), 3,98 (3Н, с), 4,27 (1Н, т, 1=10 Гц), 4,79 (1Н, дд, 1=3 Гц и 12 Гц), 5,41 (1Н, кв, 1=7 Гц), 5,66 (1Н, дд, 1=9 Гц и 15 Гц), 6,21 (1Н, с), 6,42 (1Н, дд, 1=11 Гц и 15 Гц), 6,65 (1Н, д, 1=1,5 Гц), 6,73 (1Н, д, 1=11 Гц), 6,81 (1Н, д, 1=1,5 Гц).
МС высокого разрешения (М+Νη') вычислено: 802,3101, найдено: 802,3116.
Пример 2. Синтез мэйтансиноида 4а.
4-Метилдитиопентановая кислота (13). Раствор 4-меркаптопентановой кислоты (12, 16,6 г, 124 ммоль) растворяют в 350 мл деионизированной воды в колбе объемом 500 мл. Раствор перемешивают магнитной мешалкой при добавлении карбоната натрия (19,7 г, 186 ммоль) к кислоте со скоростью, которая не вызывает избыточного вспенивания. Колбу снабжают капельной воронкой на 250 мл, в которую заливают раствор метилового эфира метантиолсульфокислоты (23,4 г, 186 ммоль), растворенного в 220 мл перегнанного в стекле 100%-го этанола. Колбу охлаждают в бане с ледяной водой, и систему выдерживают в атмосфере аргона. Раствор метилового эфира метантиолсульфокислоты добавляют по каплям в колбу по возможности быстро, но не вызывая избыточного вспенивания. Охлаждающую баню удаляют, и реакционной смеси дают перемешиваться еще в течение 2 ч. Растворитель удаляют с помощью роторного испарителя в вакууме, до объема остатка приблизительно 250 мл. После этого добавляют 30 мл насыщенного раствора бикарбоната натрия и 50 мл деионизированной воды. Смесь промывают три раза этилацетатом (порциями по 200 мл) в делительной воронке. Водный слой доводят до значения рН около 2, добавляя 5 М НС1, и экстрагируют два раза этилацетатом (порциями по 400 мл). Органические слои объединяют, затем промывают 60 мл смеси 4:1 насыщенного раствора №1С1 и 1М НС1, затем сушат над 50 г безводного сульфата натрия, и окончательно растворитель удаляют с помощью роторного испарителя в вакууме, чтобы получить 10,2 г продукта 13 (выход 45%). Этот продукт используют в следующей реакции без дополнительной очистки.
Ή-ЯМР δ: 1,36 (3Н, д, 1=7 Гц), 1,84-1,95 (Н, м), 1,85-2,56 (1Н, м), 2,42 (3Н, с), 2,53 (2Н, т, 1=7 Гц), 2,85-2,95 (1Н, м).
МС (М+Ыа+) вычислено: 203,3, найдено: 203,2.
Ν-Гидроксисукцинимидный эфир 4-метилдитиопентановой кислоты (14). 4-Метилдитиопентановую кислоту (13, 0,75 г, 4,16 ммоль) растворяют в 7,0 мл метиленхлорида и перемешивают магнитной мешалкой, в то время как добавляют Ν-гидроксисукцинимид (0,526 г, 4,57 ммоль) и затем гидрохлорид 1-[3-(диметиламино)пропил]-3-этилкарбодиимида (0,877 г, 4,57 ммоль). Смесь перемешивают в атмосфере аргона в течение 2,5 ч, затем выливают в делительную воронку (емк. 60 мл), содержащую 20 мл этилацетата. Образовавшийся раствор промывают два раза калий-фосфатным буфером (порциями по 15 мл, 50 мМ), рН 6,0, и один раз 5 мл насыщенного раствора хлорида натрия. Органический слой сушат над 8 г безводного №28О4, и растворитель удаляют с помощью роторного испарителя в вакууме, чтобы получить 1,15 г продукта 14 (выход 87%), который используют в следующей реакции без дополнительной очистки.
Ή-ЯМР δ: 1,48 (3Н, д, 1=7 Гц), 2,06 (1Н, м), 2,17(1Н, м), 2,55(3Н, с), 2,93(2Н, т, 1=7 Гц), 2,98(4Н, с), 3,15 (1Н, м).
- 32 010909
МС (М+Νη') вычислено: 304,1, найдено: 304,0.
№метил-И-(4-метилдитио-1-оксопентил)-Ь-аланин (15). Ν-Метил-Ь-аланин (0,64 г, 6,2 ммоль) растворяют в 8 мл смеси 1:1 диметоксиэтана и деионизированной воды в колбе (емк. 125 мл), снабженной магнитной мешалкой. Добавляют триэтиламин (0,841 г, 8,3 ммоль), и содержимое колбы энергично перемешивают, в то время как добавляют по каплям раствор 14 (1,0 г, 3,6 ммоль) в 8 мл той же самой смеси растворителей приблизительно в течение 5 мин. Спустя 2 ч реакционную смесь концентрируют приблизительно до объема 3 мл с помощью роторного испарителя в вакууме, затем добавляют 15 мл деионизированной воды и 1М НС1, чтобы получить значение рН около 2. Смесь выливают в делительную воронку (емк. 60 мл) и экстрагируют два раза этилацетатом (порциями по 15 мл). Органические слои объединяют, промывают 3 мл насыщенного раствора хлорида натрия, затем сушат над 8,0 г безводного №28О4, и окончательно растворитель удаляют с помощью роторного испарителя в вакууме. Остаток растворяют в минимальном объеме этилацетата и очищают хроматографией на силикагеле (марки «для флэшхроматографии», 40 мкм, слой силикагеля 24x3,0 см, подвижная фаза - гексан:этилацетат:уксусная кислота 50:48:2). Фракции, содержащие желаемый продукт 15, объединяют, и растворитель удаляют в вакууме. Остаточную уксусную кислоту удаляют путем растворения остатка в минимальном объеме этилацетата и осаждения продукта путем добавления гексана по каплям при перемешивании. Гексан добавляют до отсутствия продукта в надосадочной жидкости при анализе методом тонкослойной хроматографии. Осадок сушат в вакууме, чтобы получить 0,60 г продукта 15 (выход 62%).
Ή-ЯМР δ: 1,35 (3Н, д, 1=7 Гц), 1,41 (3Н, д, 1=7 Гц), 1,94-2,03 (2Н, м), 2,43(3Н, с), 2,50-2,55 (2Н, м), 2,83-2,93 (1Н, м), 2,98 (3Н, с), 5,14 (1Н, кв, 1=7 Гц).
МС (М+Νη') вычислено: 288,1, найдено: 288,1.
М2-Деацетил-Н2-(4-метилдитио-1-оксопентил)мэйтансин (Ь-ЭМ3-8Ме, 4с). Раствор мэйтансинола (25 мг, 0,44 ммоль) и соединения 15 (42,0, 0,177 ммоль) в 3 мл дихлорметана перемешивают магнитной мешалкой в атмосфере аргона, в то время как добавляют раствор дициклогексилкарбодиимида (ЙСС, 57,1 мг, 0,277 ммоль) в 0,67 мл дихлорметана. Спустя 1 мин добавляют раствор 1М ΖηΟ2 в диэтиловом эфире (0,03 мл, 0,03 мМ).
Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 2 ч, затем добавляют 5 мл этилацетата, и смесь фильтруют под вакуумом через слой грубой фильтровальной бумаги. Фильтрат промывают 2 мл насыщенного бикарбоната натрия и затем 1 мл насыщенного раствора хлорида натрия. Органический слой сушат над 2 г безводного сульфата натрия, и затем растворитель удаляют в вакууме. Остаток очищают хроматографией на силикагеле, используя смесь дихлорметана и метанола, чтобы удалить непрореагировавший мэйтансинол. Фракции, содержащие желаемый продукт, объединяют, и растворитель удаляют в вакууме, чтобы получить смесь диастереоизомеров 4с и 4й. Остаток растворяют в минимальном объеме этилацетата и очищают на колонке (50 смх250 см, 10 мкм Й1ахет'™ ΟΝ), используя в качестве подвижной фазы смесь гексана, 2-пропанола и этилацетата в соотношении 68:8:24. Скорость потока составляет 118 мл/мин. Желаемый продукт 4с элюируется при времени удерживания 11 мин, и нежелательный диастереоизомер 4й имеет время удерживания, равное 19 мин. Фракции, содержащие желаемый продукт, объединяют, и растворитель выпаривают в вакууме, чтобы получить 12,0 мг продукта 4е (выход 36%).
Ή-ЯМР (СйС13): δ 0,80 (3Н, с), 1,19-1,23(1Н, м), 1,28-1,36 (9Н, м), 1,42-1,46(1Н, м), 1,53-1,63 (2Н, м), 1,64 (3Н, с), 1,80-1,89 (1Н, м), 1,90-2,09 (1Н, м), 2,18 (1Н, дд, 1=3 Гц и 14 Гц), 2,32 (3Н, с), 2,33-2,42 (1Н, м), 2,49-2,62 (2Н, м), 2,88 (3Н, с), 3,04 (1Н, д, 1=9 Гц), 3,11 (1Н, д, 1=11 Гц), 3,23 (3Н, с), 3,35 (3Н, с),
3,49 (1Н, д, 1=9 Гц), 3,63 (1Н, д, 1=12 Гц), 3,98 (3Н, с), 4,27 (1Н, т, 1=10 Гц), 4,79 (1Н, дд, 1=3 Гц и 12 Гц),
5,41 (1Н, кв, 1=7 Гц), 5,66 (1Н, дд, 1=9 Гц и 15 Гц), 6,21 (1Н, с), 6,42 (1Н, дд, 1=11 Гц и 15 Гц), 6,65 (1Н, д, 1=1,5 Гц), 6,73 (1Н, д, 1=11 Гц), 6,81 (1Н, д, 1=1,5 Гц).
МС (М+Νη') вычислено: 834,3, найдено: 834,3.
М2'-Деацетил-Н2'-(4-меркапто-1-оксопентил)мэйтансин (Ь-ЭМ3, 4а). Ь-ЭМ3-8Ме (4с, 12 мг,
0,015 ммоль) растворяют в 1,0 мл смеси 1:1 этилацетата и метанола. Затем добавляют раствор дитиотреитола (18 мг, 0,117 ммоль) в 0,50 мл 50 мМ фосфатного буфера, рН 7,5. Реакционный раствор перемешивают магнитной мешалкой в атмосфере аргона в течение 3 ч, затем добавляют 1 мл 200 мМ фосфатного буфера, рН 6,0, и смесь экстрагируют три раза этилацетатом (порциями по 2 мл). Органические слои объединяют и промывают 1 мл насыщенного раствора хлорида натрия, затем сушат над 1 г безводного сульфата натрия. Растворитель удаляют в вакууме, и остаток растворяют в минимальном объеме этилацетата и очищают на колонке (50 смх250 см, 10 мкм Й1ахет™ СЫ), используя в качестве подвижной фазы смесь гексана, 2-пропанола и этилацетата в соотношении 70:8:22. Скорость потока составляет 22 мл/мин. Желаемый продукт элюируется при времени удерживания 10 мин. Фракции, содержащие чистый продукт, объединяют, и растворитель удаляют в вакууме, чтобы получить 11 мг продукта 4а (выход 97%).
Ή-ЯМР (СйС13): δ 0,80 (3Н, с), 1,19-1,23(1Н, м), 1,28-1,36 (9Н, м), 1,42-1,46 (1Н, м), 1,53-1,63 (2Н, м), 1,64 (3Н, с), 1,80-1,89 (1Н, м), 1,90-2,09 (1Н, м), 2,18 (1Н, дд, 1=3 Гц и 14 Гц), 2,33-2,42 (1Н, м), 2,492,62 (2Н, м), 2,88 (3Н, с), 3,04 (1Н, д, 1=9 Гц), 3,11 (1Н, д, 1=11 Гц), 3,23 (3Н, с), 3,35 (3Н, с), 3,49 (1Н, д,
- 33 010909
1=9 Гц), 3,63 (1Н, д, 1=12 Гц), 3,98 (3Н, с), 4,27 (1Н, т, 1=10 Гц), 4,79 (1Н, дд, 1=3 Гц и 12 Гц), 5,41 (1Н, кв, 1=7 Гц), 5,66 (1Н, дд, 1=9 Гц и 15 Гц), 6,21 (1Н, с), 6,42 (1Н, дд, 1=11 Гц и 15 Гц), 6,65 (1Н, д, 1=1,5 Гц), 6,73 (1Н, д, 1=11 Гц), 6,81 (1Н, д, 1=1,5 Гц).
МС: (М+Ыа+) вычислено: 788,3, найдено: 788,3.
Пример 3. Синтез мэйтансиноида 4д,1 (фиг. 3с).
В-1,3-Ди-О-п-толуолсульфонилбутан (17). Раствор В-(-)-1,3-бутандиола (16, 2,00 г, 22,22 ммоль) в смеси сухого пиридина (40 мл) и сухого толуола (60 мл) обрабатывают п-толуолсульфонилхлоридом (12,70 г, 66,84 ммоль) в атмосфере аргона при 0°С. После перемешивания при 0°С в течение 5 мин с последующим перемешиванием при комнатной температуре в течение 2 ч смесь выпаривают в вакууме, снова растворяют в этилацетате и промывают 0,1 М водным №НСО3, и затем насыщенным раствором №С1. Органический слой сушат над Мд8О4, фильтруют, и растворитель выпаривают. После хроматографической очистки на силикагеле, элюируя смесью 1:2 (по объему) этилацетат/гексан, получают 6,51 г (74%) указанного в заголовке продукта 17, В(=0,40 (1:1 этилацетат/гексан).
Ή-ЯМР (СБС13): 7,76 (дд, 4Н, 1=1,0, 8,0 Гц), 7,35 (дт, 4Н, 1=0,4, 8,0 +8,0 Гц), 4,70 (м, 1Н), 4,03 (м, 1Н), 3,94 (м, 1Н), 2,46 (с, 6Н), 1,92 (м, 2Н), 1,26 (д, 3Н, 1=6,3 Гц);
13С-ЯМР 145,17, 133,00, 130,11, 128,12, 127,91, 76,28, 66,21, 36,08, 21,86, 21,06.
МС: 420,99 (М+Ыа)+, 421,93 (М+1+Ыа)+.
8-4-О-Этилксантикпентанонитрил (18). Раствор В-1,3-ди-О-п-толуолсульфонил-бутана (17, 4,80 г, 12,06 ммоль) в 50 мл сухого диметилсульфоксида (ДМСО) обрабатывают №ιί.’Ν (0,65 г). После перемешивания при комнатной температуре под аргоном в течение 18 ч реакционную смесь разбавляют этилацетатом, промывают последовательно холодным 1,0 М раствором NаН2ΡО4 при рН 7,5, водой и 1,0 М раствором NаН2ΡО4 при рН 4,0. Органический слой отделяют и сушат над Мд8О4, фильтруют, и затем выпаривают, чтобы получить 2,63 г неочищенного В-3-О-п-толуолсульфонилпентанонитрила. МС 275,80 (М+№1)\ 276,75 (М+1+Νη)'. Этот продукт используют непосредственно без дополнительной очистки.
К раствору неочищенного В-3-О-п-толуолсульфонилпентанонитрила (2,63 г) в этаноле (15 мл) добавляют О-этилксантат калия (4,55 г) в этаноле (50 мл). После перемешивания в течение ночи в атмосфере аргона смесь концентрируют, разбавляют этилацетатом и фильтруют через короткую силикагелевую колонку. Элюат концентрируют и очищают хроматографией на силикагеле, элюируя смесью 1:4 (по объему) этилацетат/гексан, чтобы получить 1,54 г (63%, 2 стадии) указанного в заголовке продукта 18, В{=0,40 (1:4 этилацетат/гексан).
Ή-ЯМР (СОС13): 4,67 (дд, 2Н, 1=7,1, 14,2 Гц), 3,86 (ддд, 1Н, 1=7,0, 14,0, 21,9 Гц), 2,50 (т, 2Н, 1=7,3+7,6 Гц), 2,06 (м, 2Н), 1,44 (м, 6Н);
13С-ЯМР 213,04, 119,16, 70,28, 44,57, 32,10, 20,20, 15,21, 13,93.
МС: 226,51 (М+Ыа)+, 242,51 (М+К)+.
8-(+)-4-Метилдитиопентановая кислота (19). К раствору 8-4-О-этилксантикпентанонитрила 18, (1,95 г, 9,61 ммоль) в смеси этанола (10 мл) и воды (150 мл) добавляют 5,0 г ЫаОН. Реакционную смесь кипятят с обратным холодильником в течение ночи в атмосфере аргона. Смесь охлаждают до комнатной температуры, разбавляют водой (150 мл) и экстрагируют смесью 1:1 этилацетат/гексан (2 раза по 100 мл). Водный слой подкисляют Н3РО4 до рН 2,5~3,0 и экстрагируют этилацетатом (6 раз по 75 мл). Органические слои объединяют, сушат над Мд8О4, фильтруют и выпаривают досуха, чтобы получить неочищенную 8-4-меркаптопентановую кислоту. Этот неочищенный продукт используют непосредственно на следующей стадии без дополнительной очистки.
К раствору неочищенной 8-4-меркаптопентановой кислоты (1,2 г) в смеси этанола (50 мл) и 0,5 М раствора МаН2РО4, рН 7,0 (75 мл) добавляют по каплям метиловый эфир метантиолсульфокислоты (1,47 г, 11,65 ммоль) в сухом ТГФ (5 мл) в течение 45 мин при 0°С. После перемешивания в атмосфере аргона при 0°С в течение 30 мин, с последующим перемешиванием при комнатной температуре в течение 2 ч смесь концентрируют и экстрагируют дихлорметаном (2x50 мл). Водный слой подкисляют Н3РО4 до значения рН 2,5~3,0 и экстрагируют этилацетатом (4 раза по 100 мл). Органические слои объединяют, сушат над Мд8О4, фильтруют и выпаривают. Остаток очищают хроматографией на силикагеле, элюируя смесью (1:100:400) уксусная кислота/этилацетат/гексан, чтобы получить 1,43 г (83%) указанного в заголовке продукта 19. В(=0,32 (1:100:400 уксусная кислота/этилацетат/гексан).
Ή-ЯМР (СБС13): 2,91 (ддд, 1Н, 1=6,8, 13,7, 20,5 Гц), 2,53 (т, 2Н, 1=7,7+7,4 Гц), 2,42 (с, 3Н), 1,94 (м, 2Н), 1,36 (д, 3Н, 1=6,8 Гц);
13С-ЯМР 179,18, 45,35, 31,58, 30,73, 24,70, 21,05.
МС: 202,92 (М+Ыа)+, 203,91 (М+1+Ыа)+; [α] = 41,35 (с=2, СН3ОН).
М-Метил-М-[4-(8)метилдитио-1-оксопентил]-8-аланин (15а). 8-(+)-4-(метилдитио)пентановую кислоту (19) превращают в Ν-гидроксисукцинимидный эфир 20, по способу, который описан выше для соединения 14. После взаимодействия с Ν-метил-Ь-аланином по описанной выше методике для соединения 15 получают продукт 15а (выход 62%).
Н’-ЯМР δ: 1,36 (3Н, д, 1=7 Гц), 1,42 (3Н, д, 1=7 Гц), 1,93-1,98 (2Н, м), 2,40 (3Н, с), 2,50-2,53 (2Н, м), 2,90-2,95 (1Н, м), 2,99 (3Н, с), 5,14 (1Н, кв, 1=7 Гц).
- 34 010909
МС: (М+№) вычислено: 288,1, найдено: 288,1.
^'-Деацетил-И2'-(4-(8)метилдитио-1-оксопентил)мэйтансин (ЬМ3-8Ме, 4д,1). Мэйтансинол (Κ) конъюгируют с 15а, используя ЭСС и хлористый цинк в дихлорметане, как описано выше для синтеза 4с. Получают смесь двух диастереоизомеров, несущих функциональные группы №метил-8-аланила (4д, 8, 8) и Ν-метил-Р-аланила (41, Κ, 8). Эти диастереоизомеры разделяют методом ВЭЖХ на Кготакйциановой колонке (4,6 ммх250 мм), используя изократическое элюирование (при скорости потока 1 мл/мин) смесью гексан:этилацетат:2-пропанол (68:24:8, по объему). В этих условиях изомер 4д (8,8) элюируется за 24,5 мин. Масс-спектр: т/ζ 834,2 (М+Νη)'. Другой изомер 41 (Κ, 8) хорошо разделяется и элюируется за 34,6 мин. МС: т/ζ 834,2 (М+Νη)'.
Пример 4. Синтез мэйтансиноида 4к,1 (фиг. 36).
8-1,3-Ди-О-п-толуолсульфонилбутан (22). Раствор 8-(-)-1,3-бутандиола (21, 2,00 г, 22,22 ммоль) в смеси сухого пиридина (40 мл) и сухого толуола (60 мл) обрабатывают п-толуолсульфонилхлоридом (12,70 г, 66,84 ммоль) в атмосфере аргона при 0°С. После перемешивания при 0°С в течение 5 мин с последующим перемешиванием при комнатной температуре в течение 2 ч смесь выпаривают в вакууме. Остаток снова растворяют в этилацетате, промывают 0,1 М водным раствором №1НСО3 и насыщенным раствором №1С1. Органический слой разделяют, сушат над Мд8О4, фильтруют и выпаривают. Остаток очищают хроматографией на силикагеле, элюируя смесью 1:2 этилацетат/гексан, чтобы получить 6,25 г (71%) указанного в заголовке продукта 22; Κ(=0,40 (1:1 этилацетат/гексан).
Ή-ЯМР (СЬС13): 7,76 (дд, 4Н, 1=1,0, 8,0 Гц), 7,35 (дт, 4Н, 1=0,4, 8,0+8,0 Гц), 4,70 (м, 1Н), 4,03 (м, 1Н), 3,94 (м, 1Н), 2,46 (с, 6Н), 1,92 (м, 2Н), 1,26 (д, 3Н, 1=6,3 Гц);
13С-ЯМР 145,17, 133,00, 130,11, 128,12, 127,91, 76,28, 66,21, 36,08, 21,86, 21,06.
МС: 420,99 (М+Ыа)+.
Κ-4-О-Этилксантикпентанонитрил (23). Раствор 8-1,3-ди-О-п-толуолсульфонил-бутана (22, 6,25 г, 15,70 ммоль) в сухом ДМСО (50 мл) обрабатывают Νηί’Ν (0,85 г). Реакционную смесь перемешивают под аргоном в течение 18 ч при комнатной температуре. Затем реакционную смесь разбавляют этилацетатом, промывают последовательно холодным 1,0 М раствором ЫаН2РО4 при рН 7,5, водой и 1,0 М раствором №1Н;РО4 при рН 4,0. Органический слой сушат над Мд8О4, фильтруют и выпаривают, чтобы получить 3,62 г неочищенного 8-3-О-п-толуолсульфонилпентанонитрила. Этот продукт используют непосредственно, без дополнительной очистки.
К раствору неочищенного 8-3-О-п-толуолсульфонилпентанонитрила (3,62 г) в этаноле (50 мл) добавляют О-этилксантат калия (5,72 г) в этаноле (100 мл). После перемешивания в атмосфере аргона в течение ночи смесь концентрируют, разбавляют этилацетатом и фильтруют через короткую колонку с силикагелем. Элюат концентрируют, и остаток очищают хроматографией на силикагеле, элюируя смесью 1:4 этилацетат/гексан, чтобы получить 2,0 г (62%, 2 стадии) указанного в заголовке продукта 23, Κ{=0,40 (1:4 этилацетат/гексан).
Ή-ЯМР (СЬС13): 4,67 (дд, 2Н, 1=7,1, 14,2 Гц), 3,86 (ддд, 1Н, 1=7,0, 14,0, 21,9 Гц), 2,50 (т, 2Н 1=7,3+7,6 Гц), 2,06 (м, 2Н), 1,44 (м, 6Н);
13С-ЯМР 213,04, 119,16, 70,28, 44,57, 32,10, 20,20, 15,21, 13,93.
МС: 226,51 (М+Ыа)+, 242,51 (М+К)+.
Κ-(-)-4-Метилдитиопентановая кислота (24). Раствор Κ-4-О-этилксантик-пентанонитрила (23, 2,0 г, 9.85 ммоль) в смеси этанола (10 мл) и 200 мл воды обрабатывают ЫаОН (6,0 г). Реакционную смесь кипятят с обратным холодильником в течение ночи в атмосфере аргона. Смесь разбавляют водой (150 мл) и экстрагируют смесью 1:1 этилацетат/гексан (2x100 мл). Водный слой подкисляют Н3РО4 до рН 2,5~3,0 и экстрагируют этилацетатом (6x75 мл). Органические слои объединяют, сушат над Мд8О4, фильтруют и выпаривают досуха, получая неочищенную Κ-4-меркаптопентановую кислоту. Этот неочищенный продукт используют непосредственно на следующей стадии, без дополнительной очистки.
К раствору 1,60 г неочищенной Κ-4-меркаптопентановой кислоты в смеси этанола (50 мл) и 0,5 М раствора МаН2РО4, при рН 7,0 (75 мл) добавляют по каплям метиловый эфир метантиолсульфокислоты (1,96 г, 15,53 ммоль) в сухом ТГФ (7 мл) в течение 45 мин при 0°С. Реакционную смесь перемешивают в атмосфере аргона при 0°С в течение 30 мин и затем при комнатной температуре в течение 2 ч. Эту смесь концентрируют и экстрагируют дихлорметаном (2x50 мл). Водный слой подкисляют Н3РО4 до рН 2,5-3,0 и экстрагируют этилацетатом (4x100 мл). Органические слои объединяют, сушат над Мд8О4, фильтруют и выпаривают. Остаток очищают хроматографией на силикагеле, элюируя смесью 1:100:400 уксусная кислота/этилацетат/гексан, чтобы получить 1,65 г (93%) указанного в заголовке продукта 24, Κ(=0,32 (1:100:400 уксусная кислота/этилацетат/гексан);
Ή-ЯМР (СЬС13): 2,91 (ддд, 1Н, 1=6,8, 13,7, 20,4 Гц), 2,53 (т, 2Н, 1=7,7+7,4 Гц), 2,42 (с, 3Н), 1,96 (м, 2Н), 1,36 (д, 3Н, 1=6,8 Гц);
13С ЯМР 179,46, 45,67, 31,91, 31,07, 25,02, 21,36.
МС: 202,9 (М+Ыа+), 203,9 (М+1+Ыа+); [α]=-39,16 (с=2, СН3ОН).
N-Метил-N-[4-(Κ)метилдитио-1-оксопентил]-8-аланин (15Ь). Κ-(+)-4-Метилдитио-пентановую кислоту (24) превращают в Ν-гидроксисукцинимидный эфир 25 по способу, который описан выше для со
- 35 010909 единения 14. Взаимодействие с Ν-метил-Ь-аланином по методике, описанной выше для соединения 15, дает продукт 15Ь. МС: т/ζ (М+Να): вычислено: 288,1, найдено: 288,1 ^'-Деацетил-^'-(4-(Я)-метилдитио-1-оксопентил)мэйтансин (ЭМ3-8Ме, 4к,1). Мэйтансинол (11) конъюгируют с соединением 15Ь, используя ОСС и хлористый цинк в дихлорметане, как описано выше для синтеза продукта 4с. Получают смесь двух диастереоизомеров, несущих функциональные группы Νметил-8-аланила (4к, 8,Я) и Ν-метил-Я-аланила (41, Я,Я). Эти диастереоизомеры разделяют методом ВЭЖХ на Кгота811-циановой колонке (4,6 ммх250 мм), используя изократическое элюирование при скорости потока 1 мл/мин смесью гексан:этилацетат:2-пропанол (68:24:8, по объему). В этих условиях изомер 4к (8,Я) элюируется за 23,9 мин. Масс-спектр: т/ζ 834,2 (М+Να)'. Пик другого изомера 41 (Я,Я) хорошо разделяется и элюируется за 33,7 мин. МС: т/ζ 834,2 (М+Να)'.
Пример 5а. Цитотоксичность ίπ νίΙΐΌ мэйтансиноидов и конъюгатов мэйтансиноидов с антителами.
Клеточная линия КВ (АТСС СС1-17) имеет происхождение из человеческого эпителия. Клеточная линия 8К-ВЯ-3 (АТСС ΗΤΒ-30) отобрана из аденокарциномы молочной железы человека. Клеточные линии опухоли человеческой ободочной кишки СОЬО 205 (АТСС ССЬ-222) и ΗΤ-29 (АТСС ΗΤΒ 38), клеточная линия человеческой меланомы А-375 (АТСС СРЬ 1619), клеточная линия человеческой лимфомы Беркетта Яато8 (АТСС СЯЙ-1596) и клеточная линия человеческого миелоидного лейкоза ΗΤ-60 (АТСС ССЬ-240) получены из коллекции АТСС, в штате Магу1апй. Клеточные линии выращивают в среде Игла, модифицированной Дульбекко (ЭМЕМ, фирма Вю^Ыйакег, г. ^а1кег8УЙ1е, шт. Магу1апй) с Ьглутамином и добавкой 10% фетальной сыворотки коровы (фирма Ыус1опе, Ьодап, шт. И1ай) и 50 мкг/мл гентамицинсульфата (фирма Ьйе Тесйпо1од1е8, ЯоскуШе, МЭ). Клетки поддерживают при температуре 36-37,5°С в увлажненной атмосфере, содержащей 6% СО2.
Исследование цитотоксичности проведено с использованием клоногенного анализа. Испытуемые клеточные линии высевают на культуральные чашки с 6-лунками, при постоянном числе 1000 клеток в лунке. Клетки инкубируют при варьируемой концентрации (от 0 до 3 нМ) различных мэйтансиноидов (свободных или конъюгированных с антителами) в течение 72 ч. Затем среду отсасывают из чашек и заменяют ее свежей средой. Культурам дают вырасти и образовать колонии в течение срока 7-10 суток после высева на чашки. Затем культуры фиксируют и окрашивают раствором 0,2% кристаллического фиолетового в 10% формалин/ЗФР и подсчитывают число колоний. Эффективность высева необработанных клеток (только среда) определяют путем деления подсчитанного числа колоний на число высеянных клеток. Долю выживших клеток, обработанных лекарственными препаратами, определяют путем деления числа колоний в лунках, обработанных лекарственным препаратом, на число колоний в контрольных лунках.
Результаты измерений цитотоксичности 1п уйго новых мэйтансиноидов настоящего изобретения представлены на фиг. 4. Новые мэйтансиноиды 4 с,е, имеющие затрудненные дисульфидные связи, обладают высокой цитотоксичностью в отношении обоих тестируемых клеточных линий, 8К-ВЯ-3 и А-375, причем значения Κ.'50 находятся в диапазоне от 7-10-12 М до 2,5-10-11 М. Таким образом, введение алкильных заместителей при атоме углерода, несущем дисульфидную функциональную группу, сохраняет высокую цитотоксическую эффективность. Стерически затрудненный тиолсодержащий мэйтансиноид 4а настоящего изобретения обладает в 30-50 раз большей эффективностью, чем описанный ранее соответствующий незатрудненный мэйтансиноид 1. Таким образом, введение алкильных заместителей при атоме углерода, несущем тиоловую функциональную группу, сильно увеличивает эффективность.
Результаты тестирования ш ν 11го конъюгатов антител с мэйтансиноидами настоящего изобретения приведены на фиг. 4с и 4ά. Присоединение двух новых мэйтансиноидов, 4а или 4Ь к антителу йиС242, направленному против человеческой опухоли ободочной кишки, приводит к антиген-специфическому уничтожению клеток-мишеней. Таким образом, конъюгаты обладают высокой эффективностью против антиген-положительных клеток СОЬО 205, причем значения Κ.'50 находятся в диапазоне от 1,1 до 1,3-10-11 М. Напротив, эти конъюгаты являются в 100-200 раз менее цитотоксичными в отношении антиген-отрицательных клеток А-375, демонстрируя, что новые мэйтансиноиды настоящего изобретения образуют конъюгаты, которые имеют стерически затрудненные дисульфидные связи, и проявляют высокую специфическую цитотоксичность в отношении мишени.
Пример 5Ь. Получение цитотоксических конъюгатов антител йиС242с использованием мэйтансиноидов 4а или 4Ь (способ А, фиг. 5 а, Ь).
Раствор антитела йиС242 (8 мг/мл) в водном буфере (50 мМ фосфат калия, 50 мМ хлорид натрия, 2 мМ динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты), ρΗ 6,5, инкубируют в течение 2 ч с молярным избытком (7-10-кратный) сукцинимидного эфира 3-(2-пиридилдитио)пропионовой кислоты (8ΡΌΡ, 3а) или Ν-сукцинимидного эфира 4-(2-пиридилдитио)бутановой кислоты (8ΡΌΒ, 3Ь). Реакционную смесь очищают путем пропускания через гель-фильтрационную колонку 8ерйайех С25. Концентрацию антител определяют спектрофотометрически, используя известный коэффициент поглощения для антител е280нм=217560 М-1-см-1.
Модифицированное антитело разбавляют до концентрации 2,5 мг/мл в водном буфере (50 мМ фосфат калия, 50 мМ хлорид натрия, 2 мМ динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты), ρΗ 6,5,
- 36 010909 и затем обрабатывают молярным избытком (от 1,5 до 2,5) или ΌΜ3, или ΌΜ4 в диметилацетамиде (ДМА) (конечная концентрация ДМА составляет 3% по объему). Реакционную смесь инкубируют в течение 18 ч при комнатной температуре. Эту реакционную смесь очищают путем пропускания через гельфильтрационную колонку 8ер1а6ех С25. Концентрацию конъюгата определяют спектрофотометрически, используя известные коэффициенты поглощения для антител О280нм=217560 М-1-см-1 и е252нм=80062 М-1-см-1; для ΌΜ3 или ΌΜ4, е280нм=5700 М-1-см-1 и е252нм=26790 М-1-см-1. Получающийся конъюгат является мономерным и содержит в среднем 3,2-3,5 молекул ΌΜ3 или ΌΜ4, связанных с молекулой антитела.
Пример 5с. Получение цитотоксических конъюгатов антител 1шС242 с использованием мэйтансиноидов 4а или 4Ь (способ В, фиг. 5с).
Раствор антитела 1иС242 (8 мг/мл) в водном буфере (50 мМ фосфат калия, 50 мМ хлорид натрия, 2 мМ динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты), рН 6,5, инкубируют в течение 2 ч с молярным избытком (7-10-кратный) сукцинимидного эфира 4-(N-малеимидометил)циклогексан-1карбоновой кислоты, 8ΜСС, 26). Реакционную смесь очищают путем пропускания через гельфильтрационную колонку 8ерНа6ех С25. Концентрацию антител определяют спектрофотометрически, используя известный коэффициент поглощения для антител е280нм=217560 М-1-см-1.
Модифицированное антитело разбавляют до концентрации 2,5 мг/мл в водном буфере (50 мМ фосфат калия, 50 мМ хлорид натрия, 2 мМ динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты), рН 6,5, и затем обрабатывают молярным избытком (от 1,5 до 2,5) или ΌΜ3, или ΌΜ4 в диметилацетамиде (ДМА) (конечная концентрация ДМА составляет 3% по объему). Реакционную смесь инкубируют в течение 18 ч при комнатной температуре. Эту реакционную смесь очищают путем пропускания через гельфильтрационную колонку 8ер1а6ех С25. Концентрацию конъюгата определяют спектрофотометрически, используя известные коэффициенты поглощения для антител 8280нм=217560 М-1-см-1 и 8252нм=80062 М-1-см-1; для ΌΜ3 или ΌΜ4, е280нм=5700 М-1-см-1 и е252нм=26790 М-1-см-1. Получающийся конъюгат является мономерным и содержит в среднем 3,2-3,5 молекул ΌΜ3 или ΌΜ4, связанных с молекулой антитела.
Пример 56. Получение цитотоксических конъюгатов антител 1шС242 с использованием мэйтансиноидов 4а или 4Ь (способ С, фиг. 56).
Раствор антитела 1иС242 (8 мг/мл) в водном буфере (50 мМ фосфат калия, 50 мМ хлорид натрия, 2 мМ динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты), рН 6,5, инкубируют в течение 2 ч с молярным избытком (7-10-кратный) Ν-сукцинимидного эфира (4-иодацетил)аминобензойной кислоты, 8ΙΑΒ, 27. Реакционную смесь очищают путем пропускания через гель-фильтрационную колонку 8ер1а6ех С25. Концентрацию конъюгата определяют спектрофотометрически, используя известные коэффициенты поглощения для антител е280нм=217560 М-1-см-1.
Пример 6. Эффективность ίη νίνο конъюгатов 1иС242-мэйтансиноид против ксенотрансплантатов НТ-29.
Самкам пятинедельных мышей 8СГО (20 животных) подкожно инокулируют в правый бок клетки карциномы ободочной кишки человека НТ-29 (1,5-10 клеток каждой мыши) в 0,1 мл среды, не содержащей сыворотки. Опухоли росли в течение 11 суток до среднего размера 100 мм3. Затем животных случайным образом статистически разделяют на четыре группы (по 5 животных в группе). Первая группа получает конъюгат 1π.ιί.'242-ΌΜ1 (доза ΌΜ1 равна 75 мкг/кг, ежедневно в течение 5 дней), вводимый внутривенно. Вторая группа получает конъюгат 1ιι.ιί'242-ΌΜ3 (доза ΌΜ3 равна 75 мкг/кг, ежедневно в течение 5 дней), вводимый внутривенно. Третья группа получает конъюгат 1ιι.ιί'242-ΌΜ4 (доза ΌΜ4 равна 75 мкг/кг, ежедневно в течение 5 дней), в то время как четвертая группа животных служит в качестве контроля и получает ЗФР при использовании той же самой схемы лечения, как в группах 1-3.
Размер опухоли измеряют два раза в неделю, и объем опухоли рассчитывают по формуле объем опухоли=1/2 (длинахширинахвысота)
Кроме того, два раза в неделю измеряют массу животных. Результаты приведены на фиг. 7. В контрольной группе мышей опухоли растут до размера приблизительно 1000 мм за 35 суток. Обработка конъюгатом 1ιι.ιί'242-ΌΜ1 приводит к задержке роста опухоли на 18 суток, в то время как конъюгаты, полученные с мэйтансиноидами 4а и 4Ь настоящего изобретения, обладают значительно большей эффективностью, и время задержки роста опухоли увеличивается до 28 суток и 36 суток соответственно.
Пример 7. Эффективность ίη νίνο конъюгатов 1иС242-мэйтансиноид против ксенотрансплантатов СОЬО 205.
Самкам пятинедельных мышей 8СГО (20 животных) подкожнно инокулируют в правый бок клетки карциномы человеческой ободочной кишки человека СОЬО 205 (1,5-106 клеток каждой мыши) в 0,1 мл среды, не содержащей сыворотки. Опухоли росли в течение 11 суток до среднего размера 100 мм3. Затем животных случайным образом разделяют на четыре группы (по 5 животных в группе). Первая группа получает конъюгат 1ιι.ιί'242-ΌΜ1 (доза ΌΜ1 равна 75 мкг/кг, ежедневно в течение 5 дней), вводимый внутривенно. Вторая группа получает конъюгат 1ιι.ιί'242-ΌΜ3 (доза ΌΜ3 равна 75 мкг/кг, ежедневно в течение 5 дней), вводимый внутривенно. Третья группа получает конъюгат 1ιι.ιί'242-ΌΜ4 (доза ΌΜ4 рав
- 37 010909 на 75 мкг/кг, ежедневно в течение 5 дней), в то время как четвертая группа животных служит в качестве контроля и получает ЗФР при использовании той же самой схемы лечения, как в группах 1-3.
Размер опухоли измеряют два раза в неделю, и объем опухоли рассчитывают по формуле объем опухоли=1/2 (длинах ширинах высота).
Кроме того, два раза в неделю измеряют массу животных. Результаты приведены на фиг. 8. В контрольной группе мышей опухоли растут до размера приблизительно 900 мм за 24 суток. Обработка конъюгатом 1шС242-ЬМ1 приводит к задержке роста опухоли на 20 суток, в то время как конъюгат, полученный с мэйтансиноидом 4а настоящего изобретения, обладает значительно большей эффективностью, и вызывает полную регрессию опухоли на протяжении 45 суток. Обработка конъюгатом, полученным с мэйтансиноидом 4Ь настоящего изобретения, обладает еще большей эффективностью, и приводит к излечению всех обработанных животных.
Пример 8. Эффективность ш νίνο конъюгатов М^9-6-мэйтансиноид против ксенотрансплантатов НЬ-60.
Самкам пятинедельных мышей 8СГО (20 животных) подкожнно инокулируют в правый бок клетки миелоидного лейкоза человека НЬ-60 (1,5х10 клеток каждой мыши) в 0,1 мл среды, не содержащей сыворотки. Опухоли росли в течение 12 суток до среднего размера 100 мм3. Затем животных случайным образом разделяют на четыре группы (по 5 животных в группе). Первая группа получает конъюгат ΜΥ96-ΌΜ1 (доза ΌΜ1 равна 200 мкг/кг, ежедневно в течение 5 дней), вводимый внутривенно. Вторая группа получает конъюгат ΜΥ9-6-ΌΜ3 (доза ΌΜ3 равна 200 мкг/кг, ежедневно в течение 5 дней), вводимый внутривенно. Третья группа получает конъюгат ΜΥ9-6-ΌΜ4 (доза ΌΜ4 равна 200 мкг/кг, ежедневно в течение 5 дней), в то время как четвертая группа животных служит в качестве контроля и получает ЗФР при использовании той же самой схемы обработки, как в группах 1-3.
Размер опухоли измеряют два раза в неделю, и объем опухоли рассчитывают по формуле объем опухоли=1/2 (длинах ширинах высота).
Кроме того, два раза в неделю измеряют массу животных. Результаты приведены на фиг. 9. В контрольной группе мышей опухоли быстро растут до размера приблизительно 1600 мм за 21 сутки. Обработка конъюгатом ΜΥ9-6-ΌΜ1 приводит к задержке роста опухоли приблизительно на 5 суток, в то время как конъюгаты, полученные с мэйтансиноидами 4а и 4Ь настоящего изобретения, обладают значительно большей эффективностью, продлевая задержку роста опухоли более чем на 20 суток.
Пример 9. Получение цитотоксического конъюгата антитела 1ιιιΜν9-6 с использованием мэйтансиноида ΌΜ4 (4Ь).
Раствор антитела 1ιιιΜν9-6 с концентрацией 8 мг/мл инкубируют в течение 2 ч с 6,5-кратным молярным избытком сульфосукцинимидного эфира 4-(5'-нитро-2'-пиридилдитио)бутановой кислоты (88ΝΡΒ) в калий-фосфатном буфере (50 мМ, содержит 2 мМ этилендиаминтетрауксусную кислоту, буфер А), рН 6,5, с 5% этанола. Модифицированное антитело очищают путем пропускания через гельфильтрационную колонку 8ерЬабех 025, уравновешенную буфером А, и концентрацию очищенных антител определяют спектрофотометрически, используя коэффициент поглощения для антител при 280 нм. Модифицированное антитело разбавляют буфером А до концентрации 4,9 мг/мл и инкубируют в течение 18 ч при комнатной температуре с молярным избытком (1,7-кратный) ΌΜ4, который добавляют в реакционную смесь в качестве маточного раствора в диметилацетамиде (конечная концентрация диметилацетамида равна 3% по объему). Конъюгат антитело-лекарственный препарат очищают путем пропускания через колонку 8ерЬабех 025, уравновешенную фосфатным буфером, при рН 6,5. Концентрацию конъюгата определяют спектрофотометрически, используя известные коэффициенты поглощения для антител и ΌΜ4 (для антитела, е280нм=206460 М-1-см-1, е252нм=72261 М-1-см-1; для ΌΜ4, е252нм=5700 М-1-см-1, 8252нм=26790 М-1-см-1). Получающийся конъюгат антитело-лекарственный препарат содержит в среднем 3,6 молекул ΌΜ4 на молекулу антитела. Биохимическим анализом продемонстрировано, что после конъюгирования антитело остается мономерным более чем на 94%, и имеет сродство связывания, сопоставимое со сродством для немодифицированного антитела, как определено методом проточной цитометрии. Количество лекарственного препарата, который ассоциирован с антителом и не связан ковалентно (свободный лекарственный препарат), определяют с помощью анализа ВЭЖХ, причем найдено, что это количество составляет менее 1% от всего связанного лекарственного препарата.
Пример 10. Селективность и эффективность ш νίίτο конъюгата 1ιιιΜν9-6-ΟΜ4.
Цитотоксичность 1ιιιΜν9-6-ΟΜ4 в отношении экспрессирующих СЬ33 клеток (НЬ-60) и СЬ33отрицательных клеток №та1\\га тестируют, используя клоногенный анализ, в котором активность уничтожения клеток определяется путем подсчета числа колоний, которые могут расти после обработки. Конъюгат 1πιΜν9-6-ΩΜ4 обладает высокой эффективностью в отношении уничтожения СЬ33положительных клеток человеческой опухоли НЬ-60 ш νίίτο (фиг. 10). Не отмечена значительная токсичность в отношении СЬ33-отрицательных человеческих клеток МцпаБта. что указывает на то, что СЬ33зависимая цитотоксичность вызвана специфическим таргетингом конъюгата за счет анти-СЬ33 антитела 1πΜγ9-6.
- 38 010909
Пример 11. Эффективность ш νί\Ό конъюгатов йиМу9-6-ЭМ4 против ксенотрансплантатов человеческой опухоли НЬ60 на мышах 8СГО.
Эффективность конъюгата йиМу9-6-ЭМ4 ш νί\Ό определяют на мышах 8СГО, несущих ксенотрансплантаты человеческой опухоли НЬ-60. Клетки НЬ-60 вводят подкожно и опухолям дают вырасти до среднего размера 100 мм3. Конъюгат йиМу9-6-ЭМ4 вводят внутривенно 1 раз в день в течение 5 суток в дозе, указанной на фиг. 11. Дозировка выражается количеством (в мкг) ИМ4 в конъюгате, что соответствует дозе антитела приблизительно 67 мкг антитела на 1 мкг ИМ4. Объем опухоли измеряют в качестве показателя эффективности лечения, и регистрируют массу тела мыши, для того чтобы обнаружить токсичность, вызванную обработкой. Конъюгат йиМу9-6-ЭМ4 стимулирует продолжительную задержку роста опухоли ксенотрансплантатов человеческих клеток НЬ-60 при дозах, которые вызывают небольшую токсичность (фиг. 11). Кроме того, эффективность конъюгата йиМу9-6-ЭМ4 сравнивали с эффективностью йиМу9-6-ЭМ1. Неожиданно было обнаружено, что йиМу9-6-ЭМ4 более эффективен, чем йиМу9-6-ЭМ1. Конъюгат йиМу9-6-ЭМ4 сохраняет состояние полной ремиссии (СК) животных в течение почти 60 суток, в то время как животные, обработанные йиМу9-6-ЭМ1, снова заболевают приблизительно после 20 суток в состоянии полной ремиссии.
Пример 12. Получение цитотоксического конъюгата антитела йиВ4 с использованием мэйтансиноида ИМ4 (4й).
Раствор антитела йиВ4 в концентрации 20 мг/мл инкубируют в течение 1,5 ч с 8-кратным молярным избытком сульфосукцинимидного эфира 4-(5'-нитро-2'-пиридилдитио)бутановой кислоты (88№В) в 50 мМ растворе калий-фосфатного буфера, рН 6,5, содержащего 2 мМ этилендаминтетрауксусную кислоту (буфер А) с 5% диметилацетамида. Модифицированное антитело очищают путем пропускания через гель-фильтрационную колонку 8ерйабех О25, уравновешенную буфером А, и концентрацию очищенных антител определяют спектрофотометрически, используя коэффициент поглощения для антител при 280 нм (199560 М-1-см-1). Модифицированное антитело разбавляют буфером А до концентрации 8 мг/мл и инкубируют в течение 3 ч при комнатной температуре с 1,7-кратным молярным избытком ИМ4, который добавляют в реакционную смесь в качестве маточного раствора в диметилацетамиде (конечная концентрация диметилацетамида равна 3% по объему). Конъюгат антитела с лекарственным препаратом очищают путем пропускания через колонку 8ерйабех О25 и колонку 8ерйабех 8300, которые обе уравновешены фосфатным буфером при рН 6,5. Концентрацию конъюгата определяют спектрофотометрически, используя известные коэффициенты поглощения для антитела (е280нм=199560 М-1-см-1; е252нм=67850 М-1-см-1) и ИМ4 (е280нм=5700 М-1-см-1, е252нм=26790 М-1-см-1). Получающийся конъюгат антитела с лекарственным препаратом содержит в среднем 4,0 молекулы ИМ4 на одну молекулу антитела. Биохимическим анализом продемонстрировано, что после конъюгирования антитело остается мономерным более чем на 98%, и имеет сродство связывания, сопоставимое со сродством для немодифицированного антитела, как определено методом проточной цитометрии. Количество лекарственного препарата, который ассоциирован с антителом и не связан ковалентно (свободный лекарственный препарат), определяют с помощью анализа ВЭЖХ, причем найдено, что это количество составляет приблизительно 2% от всего связанного лекарственного препарата.
Пример 13. Селективность и эффективность ш У11го конъюгата йиВ4-ЭМ4.
Цитотоксичность йиВ4-ЭМ4 в отношении экспрессирующих СИ 19 клеток (Каток) и СИ 19отрицательной клеточной линии (Со1о 205) тестируют, используя анализ на основе МТТ, в котором активность уничтожения клеток определяется путем подсчета числа жизнеспособных клеток, которые остаются после обработки конъюгатом. Число жизнеспособных клеток определяется количественным спектрофотометрическим анализом после инкубации п клеток с витальным красителем МТТ. Конъюгат НиВ4-ЭМ4 проявляет мощную активность уничтожения клеток в отношении СИ19-положительных клеток человеческой опухоли Каток ш νίΙΐΌ (фиг. 12). Не отмечена значительная токсичность в отношении СВ19-отрицательных клеток, что указывает на то, что СИ 19-зависимая цитотоксичность вызвана специфическим таргетингом за счет анти-СЬ19 антитела йиВ4.
Пример 14. Эффективность ш νί\Ό конъюгата йиВ4-ЭМ4 против ксенотрансплантатов человеческой опухоли Каток на мышах 8СГО.
Эффективность конъюгата йиВ4-ЭМ4 ш νί\Ό определяют, используя мышей 8СГО, несущих устойчивые ксенотрансплантаты человеческой опухоли Каток. Клетки Каток вводят подкожно, и опухолям дают вырасти до среднего размера 100 мм3. Конъюгат йиВ4-ЭМ4 вводят внутривенно в виде одной инъекции в дозах, указанных на фиг. 13а. Дозировка выражается количеством (в мкг) ИМ4 в конъюгате, что соответствует дозе антитела приблизительно 44 мкг антитела на 1 мкг ИМ4. Объем опухоли измеряют в качестве показателя эффективности лечения, и регистрируют массу тела мыши, для того чтобы обнаружить токсичность, вызванную обработкой. При дозах выше 50 мкг/кг конъюгат йиВ4-ЭМ4 вызывает полную регрессию опухоли у всех животных. В группе, обработанной 100 мкг/кг, у животных отсутствуют признаки болезни почти в течение 35 суток и больше чем 55 суток в двух группах с наибольшей дозой. Эта обработка вызывает небольшую (если она вообще имеется) токсичность (фиг. 13й), судя по изменениям массы тела обработанных животных.

Claims (22)

1. Мэйтансиноид, имеющий в положении С-3, С-14-гидроксиметил, С-15-гидрокси или С-20десметил боковую цепочку ацилированной аминокислоты с ацильной группой, несущей затрудненную сульфгидрильную группу, в которой атом углерода ацильной группы, несущей тиоловую функциональную группу, имеет один или два заместителя, причем указанные заместители представляют собой линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, фенил, замещенный по меньшей мере одним алкилом, содержащим 1-4 атома углерода, или алкокси, галогеном или нитро, или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал, где указанный гетероциклический ароматический радикал или указанный гетероциклоалкильный радикал представляет собой 3-10-членное кольцо, содержащее один или два гетероатома, выбранных из Ν, О или 8, и, кроме того, один из одного или двух заместителей на защищенной сульфгидрильной группе может представлять собой Н, и в которой ацильная группа имеет длину линейной цепи по меньшей мере три атома углерода между карбонильной функциональной группой и атомом серы.
2. Соединение, представленное формулой 4' в которой Υ' представляет собой группу (СΒ7Β8)1(СΒ9=СΒ1ο)р(СΞС)^Аг(СΒ5Β6)т^и(СΒ11=СΒ12)г(СΞС)кВ1(СΒзΒ4)ηСΒ1Β28Ζ, в которой каждый заместитель Βι и Β2 независимо представляет собой линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, фенил, замещенный по меньшей мере одним алкилом, содержащим 1-4 атома углерода, алкокси, галогеном или нитро, гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал, и кроме того, Β2 может представлять собой Н;
А, В, Ό представляют собой циклоалкил или циклоалкенил, имеющий 3-10 атомов углерода, простой или замещенный арил или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал;
каждый заместитель Β3, Β4, Β5, Β6, Β7, Β8, Β9, Βπ и Β12 независимо представляет собой Н, линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, фенил, замещенный по меньшей мере одним алкилом, содержащим 1-4 атома углерода, алкокси, галогеном или нитро, или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал;
каждый 1, т, п, о, р, ς, г, к и ΐ независимо означает 0 или целое число от 1 до 5 при условии, что по меньшей мере два из 1, т, п, о, р, ς, г, к и ΐ не равны нулю одновременно;
Ζ означает Н, 8Β или -СОΒ, где Β представляет собой линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, арил, содержащий 6-10 атомов углерода, или арил, содержащий 6-10 атомов углерода и замещенный по меньшей мере одним алкилом, содержащим 1-4 атома углерода, алкокси, галогеном или нитро, или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал, где указанный гетероциклический ароматический радикал или указанный гетероциклоалкильный радикал представляет собой 3-10-членное кольцо, содержащее один или два гетероатома, выбранных из Ν, О или 8.
3. Соединение по п.2, в котором Β1 означает метил, Β2 представляет собой Н и Ζ означает Н.
4. Соединение по п.2, в котором Βι и Β2 представляют собой метил и Ζ означает Н.
5. Соединение по п.2, в котором Βι означает метил, Β2 представляет собой Н и Ζ означает -8СН3.
6. Соединение по п.2, в котором Βι и Β2 представляют собой метил и Ζ означает -8СН3.
7. Соединение, представленное формулой (Ι-Ь), (Ι-Ό) или (Ι-Ό,Ε)
- 40 010909 ь τ> п,ъ
О) где Υ представляет собой группу (СЯ7Я8)1(СЯ5Я6)1П(СЯзЯ4)пСЯ1Я2^, в которой каждый Я1 и Я2 независимо представляет собой линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, фенил, замещенный по меньшей мере одним алкилом, содержащим 1-4 атома углерода, алкокси, галогеном или нитро, или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал, и, кроме того, Я2 может представлять собой Н;
каждый Я3, Я4, Я5, Я6, Я7 и Я8 независимо представляет собой Н, линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, фенил, замещенный по меньшей мере одним алкилом, содержащим 1-4 атома углерода, алкокси, галогеном или нитро, или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал;
каждый 1, т и η независимо означает целое число от 1 до 5, и, кроме того, η может означать 0;
Ζ представляет собой Н, 8Я или -СОЯ, где Я представляет собой линейный алкил, разветвленный алкил или циклический алкил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, арил, содержащий 6-10 атомов углерода, или арил, содержащий 6-10 атомов углерода и замещенный по меньшей мере одним алкилом, содержащим 1-4 атома углерода, алкокси, галогеном или нитро, гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал; и
Мау означает мэйтансиноид, который имеет боковую цепочку при С-3, С-14-гидроксиметил, С-15гидрокси или С-20-десметил;
где указанный гетероциклический ароматический радикал или указанный гетероциклоалкильный радикал представляет собой 3-10-членное кольцо, содержащее один или два гетероатома, выбранных из Ν, О или 8.
8. Соединение по п.7, в котором Я1 представляет собой метил, Я2 означает Н, каждый из Я5, Я6, Я7 и Я8 означает Н, каждый 1 и т равен 1, η означает 0 и Ζ представляет собой Н.
9. Соединение по п.7, в котором Я1 и Я2 означают метил, каждый Я5, Я6, Я7 и Я8 означает Н, 1 и т равны 1, η равно 0 и Ζ означает Н.
10. Соединение по п.7, в котором Я1 представляет собой метил, Я2 означает Н, каждый из Я5, Я6, Я7 и Я8 означает Н, каждый 1 и т равен 1, η означает 0 и Ζ представляет собой -8СН3.
11. Соединение по п.7, в котором Я1 и Я2 означают метил, каждый Я5, Я6, Я7 и Я8 означает Н, 1 и т равны 1, η равно 0 и Ζ означает -8СН3.
12. Соединение по любому из пп.7-11, которое представлено формулой (БЬ).
13. Соединение, представленное формулой 4 в которой Υ представляет собой (СЯ7Я8)1(СЯ5Я6)т(СЯ3Я4)ηСЯ1Я28Ζ, где каждый Я1 и Я2 независимо представляет собой линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, фенил, замещенный по меньшей мере одним алкилом, содержащим 1-4 атома углерода, алкокси, галогеном или нитро, гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал, и,
- 41 010909 кроме того, К2 может представлять собой Н;
каждый Я3, Я4, Я5, Я6, Я7 и К8 независимо представляет собой Н, линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, фенил, замещенный по меньшей мере одним алкилом, содержащим 1-4 атома углерода, алкокси, галогеном или нитро, гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал;
каждый 1, т и η независимо означает целое число от 1 до 5, и, кроме того, η может быть равно 0; и
Ζ означает Н, 8Я или -СОЯ, где К. представляет собой линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, или простой арил или арил, замещенный по меньшей мере одним алкилом, содержащим 1-4 атома углерода, алкокси, галогеном или нитро, гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал, где указанный гетероциклический ароматический радикал или указанный гетероциклоалкильный радикал представляет собой 3-10-членное кольцо, содержащее один или два гетероатома, выбранных из Ν, О или 8.
14. Соединение по п.13, в котором Κι означает метил, означает Н, каждый Я5, К6, Я7 и Я8 пред- ставляет собой Н, каждый 1 и т равен 1, η равно 0 и Ζ означает Н.
15. Соединение по п.13, в котором Κι и означают метил, каждый Я5, К6, Я7, К8 представляет собой Н, 1 и т равны 1, η равно 0 и Ζ означает Н.
16. Соединение по п.13, в котором Κι означает метил, означает Н, каждый Я5, К6, Я7 и К8 пред- ставляет собой Н, каждый 1 и т равен 1, η равно 0 и Ζ представляет собой -8СН3.
17. Соединение по п.13, в котором Κι и означают метил, каждый Я5, К6, Я7, К8 представляет собой Н, 1 и т равны 1, η равно 0 и Ζ означает -8СН3.
18. Конъюгат майтансиноида со связывающимся с клетками агентом, содержащий по меньшей мере один майтансиноид, связанный со связывающимся с клетками агентом, в котором связывающийся с клетками агент присоединен к мэйтансиноиду с использованием тиоловой или дисульфидной функциональной группы, которая присутствует в ацильной группе боковой цепочки ацилированной аминокислоты, находящейся в положении С-3, С-14-гидроксиметил, С-15-гидрокси или С-20-десметил мэйтансиноида, и в которой ацильная группа боковой цепочки ацилированной аминокислоты имеет соответствующую тиоловую или дисульфидную группу, расположенную при атоме углерода, который имеет один или два заместителя, причем указанные заместители представляют собой линейный алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, фенил, замещенный по меньшей мере одним алкилом, содержащим 1-4 атома углерода, алкокси, галогеном или нитро, или гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал, где указанный гетероциклический ароматический радикал или указанный гетероциклоалкильный радикал представляет собой 3-10-членное кольцо, содержащее один или два гетероатома, выбранных из Ν, О или 8, и, кроме того, один из одного или двух заместителей на защищенной сульфгидрильной группе может означать Н, и в которой ацильная группа имеет длину линейной цепочки по меньшей мере три атома углерода между карбонильной функциональной группой и атомом серы.
19. Конъюгат майтансиноида со связывающимся с клетками агентом по п.18, в котором связывающийся с клетками агент содержит по меньшей мере один связывающий центр антитела.
20. Конъюгат майтансиноида со связывающимся с клетками агентом по п.19, в котором антитело представляет собой ΜΥ9, анти-В4 или С242.
21. Конъюгат майтансиноида со связывающимся с клетками агентом по п.19, в котором антитело представляет собой ΜΥ9, гуманизированное или с перелицованной поверхностью, анти-В4, гуманизированное или с перелицованной поверхностью, или С242, гуманизированное или с перелицованной поверхностью.
22. Конъюгат майтансиноида со связывающимся с клетками агентом по п.19, в котором майтансиноид представлен формулой 41'
EA200501836A 2003-05-20 2004-05-20 Усовершенствованные цитотоксические агенты, содержащие новые мэйтансиноиды EA010909B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US47173903P 2003-05-20 2003-05-20
PCT/US2004/013314 WO2004103272A2 (en) 2003-05-20 2004-05-20 Improved cytotoxic agents comprising new maytansinoids

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200501836A1 EA200501836A1 (ru) 2006-08-25
EA010909B1 true EA010909B1 (ru) 2008-12-30

Family

ID=33476883

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200501836A EA010909B1 (ru) 2003-05-20 2004-05-20 Усовершенствованные цитотоксические агенты, содержащие новые мэйтансиноиды

Country Status (28)

Country Link
EP (4) EP3851126A1 (ru)
JP (2) JP5208420B2 (ru)
KR (1) KR101145506B1 (ru)
CN (2) CN1956722A (ru)
AU (1) AU2004240541B2 (ru)
BR (2) BRPI0419348B8 (ru)
CA (1) CA2525130C (ru)
CL (1) CL2012000651A1 (ru)
CO (1) CO5660276A2 (ru)
CR (1) CR20170291A (ru)
CY (2) CY1117161T1 (ru)
DK (2) DK3524611T3 (ru)
EA (1) EA010909B1 (ru)
EC (1) ECSP056149A (ru)
ES (2) ES2863498T3 (ru)
HK (1) HK1116777A1 (ru)
HR (2) HRP20160046T1 (ru)
HU (2) HUE028314T2 (ru)
IL (6) IL171170A (ru)
LT (1) LT3524611T (ru)
MX (3) MX370281B (ru)
NO (1) NO339597B1 (ru)
NZ (1) NZ542695A (ru)
PL (2) PL1651162T3 (ru)
PT (2) PT3524611T (ru)
SI (2) SI3524611T1 (ru)
WO (1) WO2004103272A2 (ru)
ZA (1) ZA200507845B (ru)

Families Citing this family (97)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
LT3524611T (lt) * 2003-05-20 2021-04-12 Immunogen, Inc. Patobulinti citotoksiniai agentai, apimantys naujus maitansinoidus
EP1819359B1 (en) 2004-12-09 2015-03-18 Janssen Biotech, Inc. Anti-integrin immunoconjugates, methods of their production and their use
AU2006213662B2 (en) * 2005-02-11 2010-08-05 Immunogen, Inc. Process for preparing stable drug conjugates
WO2006110581A2 (en) 2005-04-07 2006-10-19 Novartis Vaccines And Diagnostics Inc. Cancer-related genes
EP1865981A2 (en) 2005-04-07 2007-12-19 Chiron Corporation Cacna1e in cancer diagnosis, detection and treatment
CN102603770A (zh) 2005-04-15 2012-07-25 免疫基因公司 消除肿瘤中的异质或混合细胞群体
BRPI0615049B1 (pt) 2005-08-24 2023-04-25 Immunogen, Inc Processo para a preparação de um conjugado de anticorpo- maitansinóide
US9486408B2 (en) 2005-12-01 2016-11-08 University Of Massachusetts Lowell Botulinum nanoemulsions
EP1813614B1 (en) 2006-01-25 2011-10-05 Sanofi Cytotoxic agents comprising new tomaymycin derivatives
EP2389946A1 (en) 2006-03-23 2011-11-30 Novartis AG Anti-tumor cell antigen antibody therapeutics
EP2407483A1 (en) 2006-04-13 2012-01-18 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Methods of treating, diagnosing or detecting cancers
JP2010521180A (ja) 2007-03-14 2010-06-24 ノバルティス アーゲー 癌を処置、診断または検出するためのａｐｃｄｄ１阻害剤
BRPI0911442A2 (pt) 2008-04-30 2019-03-12 Immunogen, Inc. conjugados potentes e ligantes hidrofílicos
DK2437790T3 (da) * 2009-06-03 2019-05-20 Immunogen Inc Konjugeringsfremgangsmåder
FR2947269B1 (fr) 2009-06-29 2013-01-18 Sanofi Aventis Nouveaux composes anticancereux
FR2949469A1 (fr) 2009-08-25 2011-03-04 Sanofi Aventis Derives anticancereux, leur preparation et leur application en therapeutique
WO2011028952A1 (en) 2009-09-02 2011-03-10 Xencor, Inc. Compositions and methods for simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of antigens
UY32913A (es) 2009-10-02 2011-04-29 Sanofi Aventis Nuevos maitansinoides y el uso de dichos maitansinoides para preparar conjugados con un anticuero
EP2486023A4 (en) * 2009-10-06 2014-05-07 Immunogen Inc EFFICIENT CONJUGATES AND HYDROPHILIC BINDER
HUE026447T2 (en) 2009-10-16 2016-05-30 Novartis Ag Pharmacodynamic tumor response biomarkers
FR2963007B1 (fr) 2010-07-26 2013-04-05 Sanofi Aventis Derives anticancereux, leur preparation et leur application therapeutique
AU2011283694B2 (en) 2010-07-29 2017-04-13 Xencor, Inc. Antibodies with modified isoelectric points
EP3828205A1 (en) 2010-10-01 2021-06-02 Oxford BioTherapeutics Ltd Anti-ror1 antibodies
AU2011323316B2 (en) * 2010-11-03 2016-02-25 Immunogen, Inc. Cytotoxic agents comprising new ansamitocin derivatives
JOP20210044A1 (ar) 2010-12-30 2017-06-16 Takeda Pharmaceuticals Co الأجسام المضادة لـ cd38
RU2451010C1 (ru) * 2011-01-11 2012-05-20 Закрытое Акционерное Общество "Ива Фарм" Палладиево-медные катализаторы гомогенного селективного окисления тиольных групп, комбинация и композиция на их основе и способ терапевтического воздействия
US8795673B2 (en) 2011-03-29 2014-08-05 Immunogen, Inc. Preparation of maytansinoid antibody conjugates by a one-step process
EP2524929A1 (en) * 2011-05-17 2012-11-21 Sanofi Use of anti-CD19 maytansinoid immunoconjugate antibody for the treatment of CD19+ B-cell malignancies syptoms
EP2550975A1 (en) * 2011-07-29 2013-01-30 Sanofi Combination therapy for the treatment of CD19+ B-cell malignancies symptoms comprising an anti-CD19 maytansinoid immunoconjugate and rituximab
DK2766392T3 (da) 2011-10-10 2019-10-07 Xencor Inc Fremgangsmåde til oprensning af antistoffer
US10851178B2 (en) 2011-10-10 2020-12-01 Xencor, Inc. Heterodimeric human IgG1 polypeptides with isoelectric point modifications
PL3486248T3 (pl) 2012-09-26 2021-10-25 Immunogen, Inc. Ulepszone sposoby acylacji majtansynolu
CN105209592A (zh) 2012-10-04 2015-12-30 伊缪诺金公司 使用pvdf膜纯化细胞结合剂细胞毒性剂缀合物
US10968276B2 (en) 2013-03-12 2021-04-06 Xencor, Inc. Optimized anti-CD3 variable regions
US9605084B2 (en) 2013-03-15 2017-03-28 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US9701759B2 (en) 2013-01-14 2017-07-11 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US11053316B2 (en) 2013-01-14 2021-07-06 Xencor, Inc. Optimized antibody variable regions
EP2943511B1 (en) 2013-01-14 2019-08-07 Xencor, Inc. Novel heterodimeric proteins
US10487155B2 (en) 2013-01-14 2019-11-26 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US10131710B2 (en) 2013-01-14 2018-11-20 Xencor, Inc. Optimized antibody variable regions
EP2945969A1 (en) 2013-01-15 2015-11-25 Xencor, Inc. Rapid clearance of antigen complexes using novel antibodies
CN103933575B (zh) 2013-01-23 2017-09-29 上海新理念生物医药科技有限公司 一种三齿型连接子及其应用
US10519242B2 (en) 2013-03-15 2019-12-31 Xencor, Inc. Targeting regulatory T cells with heterodimeric proteins
AU2014232501C1 (en) 2013-03-15 2021-04-22 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
WO2014145907A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Xencor, Inc. Targeting t cells with heterodimeric proteins
US10106624B2 (en) 2013-03-15 2018-10-23 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US10858417B2 (en) 2013-03-15 2020-12-08 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US10208125B2 (en) 2013-07-15 2019-02-19 University of Pittsburgh—of the Commonwealth System of Higher Education Anti-mucin 1 binding agents and uses thereof
SG10202008629XA (en) 2014-03-28 2020-10-29 Xencor Inc Bispecific antibodies that bind to cd38 and cd3
CN104974252B (zh) * 2014-04-01 2020-04-24 三生国健药业（上海）股份有限公司 一种抑制肿瘤生长的抗体-小分子药物偶联物及其制备方法和用途
JP6602834B2 (ja) 2014-06-30 2019-11-06 ターベダ セラピューティクス インコーポレイテッド 標的化コンジュゲートならびにその粒子及び製剤
AU2015292326A1 (en) 2014-07-24 2017-02-23 Xencor, Inc. Rapid clearance of antigen complexes using novel antibodies
MA42561A (fr) 2014-09-02 2018-04-25 Immunogen Inc Procédés de formulation de compositions de conjugués anticorps-médicament
EA034138B1 (ru) 2014-09-03 2020-01-09 Иммуноджен, Инк. Цитотоксические бензодиазепиновые производные
TW201613930A (en) 2014-09-03 2016-04-16 Immunogen Inc Cytotoxic benzodiazepine derivatives
US10259887B2 (en) 2014-11-26 2019-04-16 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and tumor antigens
IL252480B2 (en) 2014-11-26 2023-12-01 Xencor Inc Heterodimeric antibodies that bind CD3 and tumor antigens
JP2017536830A (ja) 2014-11-26 2017-12-14 ゼンコー・インコーポレイテッドＸｅｎｃｏｒ、 Ｉｎｃ． Ｃｄ３及びｃｄ３８に結合するヘテロ二量体抗体
EP3237449A2 (en) 2014-12-22 2017-11-01 Xencor, Inc. Trispecific antibodies
US10227411B2 (en) 2015-03-05 2019-03-12 Xencor, Inc. Modulation of T cells with bispecific antibodies and FC fusions
CN106279352B (zh) 2015-05-29 2020-05-22 上海新理念生物医药科技有限公司 海兔毒素10的衍生物及其应用
JP6802840B2 (ja) 2015-06-09 2020-12-23 エックスディーシーエクスプローラー （シャンハイ） カンパニー リミテッド 抗体薬物複合体、中間体、その製造方法、薬学的組成物及び応用
WO2017075495A1 (en) 2015-10-28 2017-05-04 Tarveda Therapeutics, Inc. Sstr-targeted conjugates and particles and formulations thereof
CN106729743B (zh) 2015-11-23 2021-09-21 四川科伦博泰生物医药股份有限公司 抗ErbB2抗体-药物偶联物及其组合物、制备方法和应用
US11623957B2 (en) 2015-12-07 2023-04-11 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and PSMA
IL263542B1 (en) 2016-06-14 2024-06-01 Xencor Inc Bispecific antibodies inhibit immunological checkpoint
WO2018005706A1 (en) 2016-06-28 2018-01-04 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind somatostatin receptor 2
US10793632B2 (en) 2016-08-30 2020-10-06 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
GB201615725D0 (en) 2016-09-15 2016-11-02 Polytherics Ltd Novel cytotoxic agents and conjugates thereof
AU2017342559B2 (en) 2016-10-14 2022-03-24 Xencor, Inc. Bispecific heterodimeric fusion proteins containing IL-15/IL-15Ralpha Fc-fusion proteins and PD-1 antibody fragments
JP2019535829A (ja) 2016-11-21 2019-12-12 エイリオン セラピューティクス， インコーポレイテッド 大型薬剤の経皮送達
WO2018160539A1 (en) 2017-02-28 2018-09-07 Immunogen, Inc. Maytansinoid derivatives with self-immolative peptide linkers and conjugates thereof
GB201703876D0 (en) 2017-03-10 2017-04-26 Berlin-Chemie Ag Pharmaceutical combinations
US20180346488A1 (en) 2017-04-20 2018-12-06 Immunogen, Inc. Cytotoxic benzodiazepine derivatives and conjugates thereof
WO2019006472A1 (en) 2017-06-30 2019-01-03 Xencor, Inc. TARGETED HETETRODIMERIC FUSION PROTEINS CONTAINING IL-15 / IL-15RA AND ANTIGEN-BINDING DOMAINS
US10981992B2 (en) 2017-11-08 2021-04-20 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
CA3082383A1 (en) 2017-11-08 2019-05-16 Xencor, Inc. Bispecific and monospecific antibodies using novel anti-pd-1 sequences
WO2019105835A1 (en) 2017-11-29 2019-06-06 Bayer Consumer Care Ag Combinations of copanlisib and anetumab ravtansine
US11319355B2 (en) 2017-12-19 2022-05-03 Xencor, Inc. Engineered IL-2 Fc fusion proteins
EP3732178A1 (en) 2017-12-28 2020-11-04 ImmunoGen, Inc. Benzodiazepine derivatives
US10982006B2 (en) 2018-04-04 2021-04-20 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind fibroblast activation protein
JP2021521784A (ja) 2018-04-18 2021-08-30 ゼンコア インコーポレイテッド ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲａＦｃ融合タンパク質とＰＤ−１抗原結合ドメインを含むＰＤ−１標的化ヘテロダイマー融合タンパク質およびそれらの使用
US11505595B2 (en) 2018-04-18 2022-11-22 Xencor, Inc. TIM-3 targeted heterodimeric fusion proteins containing IL-15/IL-15RA Fc-fusion proteins and TIM-3 antigen binding domains
GB201809746D0 (en) 2018-06-14 2018-08-01 Berlin Chemie Ag Pharmaceutical combinations
SG11202013138RA (en) 2018-07-02 2021-01-28 Amgen Inc Anti-steap1 antigen-binding protein
US11857638B2 (en) 2018-07-27 2024-01-02 Promega Corporation Quinone-containing conjugates
WO2020072821A2 (en) 2018-10-03 2020-04-09 Xencor, Inc. Il-12 heterodimeric fc-fusion proteins
SG11202109406TA (en) 2019-03-01 2021-09-29 Xencor Inc Heterodimeric antibodies that bind enpp3 and cd3
HUE061695T2 (hu) * 2019-04-18 2023-08-28 Indena Spa Diaszteroszelektív eljárás tiol-vagy diszulfid-tartalmú maytansinoid-észterek elõállítására és köztitermékeik
WO2020234114A1 (en) 2019-05-21 2020-11-26 Bayer Aktiengesellschaft A novel stable high concentration formulation for anetumab ravtansine
KR20220052918A (ko) 2019-07-10 2022-04-28 싸이브렉사 2, 인크. 치료제로서의 사이토톡신의 펩티드 접합체
JP2022541747A (ja) 2019-07-10 2022-09-27 サイブレクサ ３，インコーポレイテッド 治療薬としての微小管標的化剤のペプチドコンジュゲート
WO2021231976A1 (en) 2020-05-14 2021-11-18 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind prostate specific membrane antigen (psma) and cd3
IL300666A (en) 2020-08-19 2023-04-01 Xencor Inc ANTI–CD28 COMPOSITIONS
CN117157319A (zh) 2021-03-09 2023-12-01 Xencor股份有限公司 结合cd3和cldn6的异二聚抗体
JP2024509274A (ja) 2021-03-10 2024-02-29 ゼンコア インコーポレイテッド Ｃｄ３及びｇｐｃ３に結合するヘテロ二量体抗体
WO2023089314A1 (en) 2021-11-18 2023-05-25 Oxford Biotherapeutics Limited Pharmaceutical combinations

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6441163B1 (en) * 2001-05-31 2002-08-27 Immunogen, Inc. Methods for preparation of cytotoxic conjugates of maytansinoids and cell binding agents

Family Cites Families (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3896111A (en) 1973-02-20 1975-07-22 Research Corp Ansa macrolides
US4151042A (en) 1977-03-31 1979-04-24 Takeda Chemical Industries, Ltd. Method for producing maytansinol and its derivatives
US4137230A (en) 1977-11-14 1979-01-30 Takeda Chemical Industries, Ltd. Method for the production of maytansinoids
US4265814A (en) 1978-03-24 1981-05-05 Takeda Chemical Industries Matansinol 3-n-hexadecanoate
US4307016A (en) 1978-03-24 1981-12-22 Takeda Chemical Industries, Ltd. Demethyl maytansinoids
JPS5562090A (en) 1978-10-27 1980-05-10 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
JPS5566585A (en) 1978-11-14 1980-05-20 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
US4256746A (en) 1978-11-14 1981-03-17 Takeda Chemical Industries Dechloromaytansinoids, their pharmaceutical compositions and method of use
JPS55164687A (en) 1979-06-11 1980-12-22 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
JPS55102583A (en) 1979-01-31 1980-08-05 Takeda Chem Ind Ltd 20-acyloxy-20-demethylmaytansinoid compound
JPS55162791A (en) 1979-06-05 1980-12-18 Takeda Chem Ind Ltd Antibiotic c-15003pnd and its preparation
JPS55164685A (en) 1979-06-08 1980-12-22 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
JPS55164686A (en) 1979-06-11 1980-12-22 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
US4309428A (en) 1979-07-30 1982-01-05 Takeda Chemical Industries, Ltd. Maytansinoids
JPS5645483A (en) 1979-09-19 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd C-15003phm and its preparation
EP0028683A1 (en) 1979-09-21 1981-05-20 Takeda Chemical Industries, Ltd. Antibiotic C-15003 PHO and production thereof
JPS5645485A (en) 1979-09-21 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd Production of c-15003pnd
WO1982001188A1 (en) 1980-10-08 1982-04-15 Takeda Chemical Industries Ltd 4,5-deoxymaytansinoide compounds and process for preparing same
US4450254A (en) 1980-11-03 1984-05-22 Standard Oil Company Impact improvement of high nitrile resins
US4313946A (en) 1981-01-27 1982-02-02 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Chemotherapeutically active maytansinoids from Trewia nudiflora
US4315929A (en) 1981-01-27 1982-02-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Method of controlling the European corn borer with trewiasine
JPS57192389A (en) 1981-05-20 1982-11-26 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
CA2026147C (en) * 1989-10-25 2006-02-07 Ravi J. Chari Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
SE9102074D0 (sv) 1991-07-03 1991-07-03 Kabi Pharmacia Ab Tomour antigen specific antibody
ATE275198T1 (de) 1991-12-02 2004-09-15 Medical Res Council Herstellung von antikörpern auf phagenoberflächen ausgehend von antikörpersegmentbibliotheken.
US5639641A (en) 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
WO1999006587A2 (en) 1997-08-01 1999-02-11 Morphosys Ag Novel method and phage for the identification of nucleic acid sequences encoding members of a multimeric (poly)peptide complex
EP2289549A3 (en) * 1999-10-01 2011-06-15 Immunogen, Inc. Immunoconjugates for treating cancer
US6333410B1 (en) 2000-08-18 2001-12-25 Immunogen, Inc. Process for the preparation and purification of thiol-containing maytansinoids
EP1258255A1 (en) * 2001-05-18 2002-11-20 Boehringer Ingelheim International GmbH Conjugates of an antibody to CD44 and a maytansinoid
JP5224632B2 (ja) * 2001-09-05 2013-07-03 ジェネンテック， インコーポレイテッド 細胞増殖異常に伴う疾患に関連するポリペプチド抗原の同定方法及びそのような疾患の治療に有効な組成物
EA009285B1 (ru) * 2003-05-14 2007-12-28 Иммуноджен, Инк. Композиция конъюгированного лекарственного средства
LT3524611T (lt) * 2003-05-20 2021-04-12 Immunogen, Inc. Patobulinti citotoksiniai agentai, apimantys naujus maitansinoidus
JP2007503202A (ja) * 2003-07-21 2007-02-22 イミュノジェン・インコーポレーテッド Ｃａ６抗原特異的な細胞毒性コンジュゲートおよびその使用方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6441163B1 (en) * 2001-05-31 2002-08-27 Immunogen, Inc. Methods for preparation of cytotoxic conjugates of maytansinoids and cell binding agents

Also Published As

Publication number Publication date
NO339597B1 (no) 2017-01-09
ES2559670T3 (es) 2016-02-15
CN101186613B (zh) 2014-09-17
JP5563673B2 (ja) 2014-07-30
EP1651162A4 (en) 2010-06-30
NO20056039L (no) 2006-02-20
BRPI0410748A (pt) 2006-06-27
EP3524611B1 (en) 2020-12-30
PT1651162E (pt) 2016-02-22
BRPI0419348B8 (pt) 2021-05-25
ZA200507845B (en) 2007-03-28
IL223297A (en) 2014-04-30
LT3524611T (lt) 2021-04-12
NZ542695A (en) 2009-04-30
HRP20160046T1 (hr) 2016-02-12
CA2525130A1 (en) 2004-12-02
JP2007514646A (ja) 2007-06-07
EP3031810B1 (en) 2019-03-06
AU2004240541B2 (en) 2009-08-20
BRPI0410748B8 (pt) 2021-05-25
JP2013082733A (ja) 2013-05-09
CN101186613A (zh) 2008-05-28
EP3031810A1 (en) 2016-06-15
IL231810A (en) 2016-02-29
MXPA05011811A (es) 2006-02-17
EP1651162B1 (en) 2015-10-21
BRPI0419348B1 (pt) 2018-10-16
PL1651162T3 (pl) 2016-04-29
HUE054074T2 (hu) 2021-08-30
IL223297A0 (en) 2012-12-31
CN1956722A (zh) 2007-05-02
IL241211B (en) 2019-09-26
KR20060003120A (ko) 2006-01-09
ECSP056149A (es) 2006-10-17
CY1124278T1 (el) 2021-10-29
PL3524611T3 (pl) 2021-06-14
CA2525130C (en) 2014-04-15
BRPI0410748B1 (pt) 2019-02-19
MX370281B (es) 2019-12-09
IL238894A (en) 2017-06-29
AU2004240541A1 (en) 2004-12-02
HK1116777A1 (en) 2009-01-02
CO5660276A2 (es) 2006-07-31
EP3851126A1 (en) 2021-07-21
IL241211A0 (en) 2015-11-30
KR101145506B1 (ko) 2012-05-15
IL171170A (en) 2015-09-24
HRP20210464T1 (hr) 2021-05-14
IL238894A0 (en) 2015-06-30
WO2004103272A2 (en) 2004-12-02
MX340862B (es) 2016-07-28
EA200501836A1 (ru) 2006-08-25
EP1651162A2 (en) 2006-05-03
WO2004103272A3 (en) 2006-11-23
IL213876A0 (en) 2011-07-31
JP5208420B2 (ja) 2013-06-12
SI3524611T1 (sl) 2021-05-31
PT3524611T (pt) 2021-04-01
IL231810A0 (en) 2014-05-28
EP3524611A1 (en) 2019-08-14
HUE028314T2 (en) 2016-12-28
IL213876A (en) 2013-12-31
ES2863498T3 (es) 2021-10-11
DK3524611T3 (da) 2021-04-06
DK1651162T3 (en) 2016-02-01
CR20170291A (es) 2017-07-27
SI1651162T1 (sl) 2016-02-29
CL2012000651A1 (es) 2012-10-19
CY1117161T1 (el) 2017-04-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA010909B1 (ru) Усовершенствованные цитотоксические агенты, содержащие новые мэйтансиноиды
US20180043013A1 (en) Cytotoxic agents comprising new maytansinoids (dm4)
US5416064A (en) Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5585499A (en) Cyclopropylbenzindole-containing cytotoxic drugs
EP0425235B1 (en) Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
EA017345B1 (ru) Производные лептомицина
PT1242401E (pt) Agentes citotóxicos compreendendo taxanos e o seu uso terapêutico
PT2348024E (pt) Preparação de ácido biliar sintético
JP2013542958A (ja) アンサマイトシン誘導体を含む細胞傷害性剤