JP2013542958A - アンサマイトシン誘導体を含む細胞傷害性剤 - Google Patents

アンサマイトシン誘導体を含む細胞傷害性剤 Download PDF

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Abstract

連結基を担持する新規アンサマイトシン誘導体を開示する。また、これら新規アンサマイトシン誘導体の合成方法および細胞結合剤との連結方法をも開示する。アンサマイトシン誘導体−細胞結合剤コンジュゲートは、標的細胞に特異的に送達され、細胞傷害性を有するゆえに、治療剤として有益である。これらコンジュゲートは、先行文献に記載の薬剤と比較して、哺乳動物腫瘍モデルにおいて、飛躍的に改善された治療効果を示す。

Description

（関連出願の相互参照）
本願は、２０１０年１１月３日に出願された米国特許仮出願第６１／４０９，８３１号に対する優先権を主張するものであり、その全体が参照により本明細書に援用される。
本発明は、アサトマイシン誘導体および細胞結合剤を含む細胞傷害性コンジュゲートの調製方法に関連する。これらコンジュゲートは、特定の細胞集団を標的として送達されるため、治療的に利用される。本発明はまた、細胞傷害性コンジュゲートの調製に使用され得る連結部分を有するアサトマイシン誘導体の調製方法に関する。本発明はさらに、新規のアサトマイシン誘導体に関する。
細胞傷害性剤の抗体コンジュゲートは、標的特異的治療剤として開発されている。これまでも様々な腫瘍細胞表面抗原に対する抗体が、異なる細胞傷害性剤とコンジュゲートされてきた（Chari 1998, Adv. Drug Delivery Revs., 31, p 89-104; Chari, 2008, Acc. Chem. Res., 41, p 98-107; Ducry & Stump, 2010, Bioconjugate Chem., 21, p 5-13; Senter, 2009, Curr Opinions in Chem.Biol., 13, p 235-244; Ojima. et al., 2002, J Med. Chem. 45, 5620-5623; Hamann, P.R. et al., 2002, Bioconjug Chem. 13, 47-58; Bross, P. F.. et al., 2001 Clin Cancer Res. 7, 1490-6; DiJoseph, J. F.et al., 2004, Blood, 103:1807-1814; Doronina, S. O., et al., 2003, Nat Biotechnol. 21, 778-784; Doronina, S. O., et al., 2006, Bioconjug Chem. 17, 114-24を参照）。
抗体−薬剤コンジュゲートに使用される細胞傷害性化合物は、微小管（マイタンシノイド、アウリスタチン、タキサン：米国特許第５，２０８，０２０号；第５，４１６，０６４号；第６，３３３，４１０号；第６，４４１，１６３号；第６，３４０，７０１号；第６，３７２，７３８号；第６，４３６，９３１号；第６，５９６，７５７号；第７，２７６，４９７号；第７，３０１，０１９号；第７，３０３，７４９号；第７，３６８，５６５号；第７，４７３，７９６号；第７，５８５，８５７号；第７，５９８，２９０号；第７，４９５，１１４号；第７，６０１，３５４号、米国特許出願第２０１０００９２４９５号、第２０１００１２９３１４、第２００９０２７４７１３号、第２００９００７６２６３号、第２００８０１７１８６５号）およびＤＮＡ（カリケアマイシン、ドキソルビシン、ＣＣ−１０６５類似体：米国特許第５，４７５，０９２号；第５，５８５，４９９号；第５，８４６，５４５号；第６，５３４，６６０号；第６，７５６，３９７号；第６，６３０，５７９号；第７，３８８，０２６号；第７，６５５，６６０号；第７，６５５，６６１号）などの様々な主要細胞標的を阻害する。これらのコンジュゲートでは、細胞傷害性部分および抗体が、ジスルフィド結合、酸不安定性結合、ペプチダーゼ不安定性結合、もしくはエステラーゼ不安定性結合などの開裂性リンカー、またはチオエーテル結合もしくはアミド結合などの非開裂性リンカーのいずれかを介して連結される。これら細胞傷害性剤の中には、抗体コンジュゲートを形成するものとして、現在、癌治療の臨床において積極的に研究が行われている（Richart, A. D., および Tolcher, A. W., 2007, Nature Clinical Practice, 4, 245-255; Krop et al., 2010, J. Clin. Oncol., 28, p 2698-2704）。
幅広いリンカー技術がかかる免疫結合体の調製に用いられており、開裂性リンカーおよび非開裂性リンカー双方ともこれまで研究が行われてきた。しかしながら、多くの場合、薬剤の細胞傷害性効能が最大限と成るのは、薬剤分子が標的部分において、非修飾形態のコンジュゲートから放出される場合のみであることが観察されている。
抗体−薬剤コンジュゲートの調製に利用されてきた開裂性リンカーの一つに、受容体がエンドサイトーシスおよびリソソームを媒介する間に遭遇するエンドソームなど、異なる細胞内区画の酸性環境を利用した、ｃｉｓ−アコニット酸ベースの酸不安定性リンカーがある。ＳｈｅｎとＲｙｓｅｒは、高分子担体を有するダウノルビシンのコンジュゲート調製方法を紹介した。（Biochem. Biophys. Res. Commun. 102:1048-1054 (1981)）。ＹａｎｇとＲｅｉｓｆｅｌｄは、抗メラノーマ抗体にダウノルビシンをコンジュゲートするのに同じ技術を使用した（J. Natl. Canc. Inst. 80:1154-1159 (1988)）。Ｄｉｌｌｍａｎらは、抗Ｔ細胞抗体を有するダウノルビシンのコンジュゲートを調製するのに類似の方法で酸不安定性リンカーを使用した。（Cancer Res. 48:6097-6102 (1988)）。
Ｔｒｏｕｅｔらが模索した代替アプローチは、ペプチドスペーサーアームを介してダウノルビシンを抗体に連結することを含んでいた（Proc. Natl. Acad. Sci. 79:626-629 (1982)）。これは、遊離型薬剤がリソソームペプチダーゼの活性によりかかるコンジュゲートから放出され得るという前提の下で行われた。
マイタンシノイドは非常に強い細胞傷害性を有する。マイタンシンは、Ｋｕｐｃｈａｎらが初めてアフリカの低木メイテナス・セラタから単離し、メトトレキサート、ダウノルビシン、およびビンクリスチンなどの、従来の癌化学療法剤よりも１００倍〜１０００倍もの細胞障害性を示した（米国特許第３，８９６，１１１号）。その後、一部の微生物もマイタンシノールおよびマイタンシノールのＣ−３エステルなど、マイタンシノイド類を産生することが発見された（米国特許第４，１５１，０４２号）。マイタンシノールの合成Ｃ−３エステルとマイタンシノールの類似体もまた報告されている（Kupchan et al. J. Med. Chem. 21:31-37 (1978); Higashide et al. Nature 270:721-722 (1977); Kawai et al. Chem. Pharm. Bull. 32:3441-3451 (1984)）。Ｃ−３エステル調製の原料であるマイタンシノール類似体の例として、芳香族環（例えば、ジクロロ）またはＣ−９、Ｃ−１４（例えば、ヒドロキシル化されたメチル基）、Ｃ−１５、Ｃ−１８、Ｃ−２０およびＣ−４，５が修飾されているマイタンシノールが含まれる。
マイタンシノールの自然発生および合成のＣ−３エステルは、２つのグループに分類できる：
（ａ）簡単なカルボン酸を有するＣ−３エステル（米国特許第４，２４８，８７０号；第４，２６５，８１４号；第４，３０８，２６８号；第４，３０８，２６９号；第４，３０９，４２８号；第４，３１７，８２１号；第４，３２２，３４８号；および第４，３３１，５９８号、ならびにChem. Pharm. Bull. 1984, 12:3441)、ならびに
（ｂ）Ｎ−メチル−Ｌ−アラニンの誘導体を有するＣ−３エステル（米国特許第４，１３７，２３０号；第４，２６０，６０８号；第５，２０８，０２０号;およびChem. Pharm. Bull. 1984, 12:3441）。
アシル化されたＮ−メチルアラニンエステルを担持するグループ（ｂ）のエステルは、グループ（ａ）のアンサマイトシンエステルよりもはるかに強い細胞傷害性を有することが分かった。例えば、Ｋｕｐｃｈａｎら（J.Med. Chem., 21; 31 (1978)）は、プロピオニルエステル、ブロモアセチルエステル、クロトニルエステルおよびトリフルオロアセチルエステルなどのアンサマイトシン類似体（マイタンシノールの簡単なＣ３エステル）の癌細胞に対する効能（ＩＣ５０＝０．０００２１〜０．０１μｇ／ｍＬ）は、Ｃ３にアシル化されたＮ−メチル−Ｌ−アラニンエステルを担持するマイタンシンなどのエステルの効能（ＩＣ５０＝０．０００００６１μｇ／ｍＬ）よりも、３４〜１６４０倍も低いと報告した。本研究で試験された６つの簡単なアンサマイトシンエステルのうち、化合物マイタンシンを含有するＮ−メチルアラニンに匹敵する効能を有していたのは二つのみであった。対照的に、マイタンシノールのＮ−アシル−Ｎ−メチル−Ｌ−アラニル・エステルは、アシル基の性質にも関わらず、高い効能を示した。その他の修飾アンサマイトシンは、Ｋａｗａｉらにより報告されている（Chem. Pharm. Bull., 32; 3441, 1984）。これらの化合物の大部分は、１〜４μｇ／ｍＬで抗微生物活性を有すると報告された。ｉｎ ｖｉｔｒｏ癌細胞に対する細胞致死活性は報告されなかった。
マイタンシンは、マイタンシノールのＮ−アセチル−Ｎ−メチル−Ｌ−アラニル・エステルである。有糸分裂阻害因子として高い効能を有する。ｉｎ ｖｉｖｏＬ１２１０細胞をマイタンシンで治療すると、６７％の細胞が有糸分裂で蓄積すると報告されている。未処理の対照細胞の分裂指数は、３．２〜５．８％の範囲であったと報告された（Sieber et al. 43 Comparative 白血病 Research 1975, Bibl. Haemat. 495-500 (1976)）。ウニの卵およびハマグリの卵での実験によると、マイタンシンは、微小管のタンパク質、チューブリンの重合を阻害することを介して微小管の形成を妨げることにより、有糸分裂を抑制することが示唆された。（Remillard et al. Science 189:1002-1005 (1975)）。
Ｉｎ ｖｉｔｒｏで、Ｐ３８８、Ｌ１２１０およびＬＹ５１７８ネズミ白血病細胞懸濁液は、１０−３〜１０−１μｇ／μｌの用量のマイタンシンにより阻害されることが発見され、中でもＰ３８８株が最も感受性が高かった。マイタンシンはまた、ヒトの鼻咽頭癌細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ成長の活性阻害剤であることが示され、ヒトの急性リンパ芽球性白血病株CEMは、わずか１０−７ｍｇ／ｍｌの低い濃度で阻害すると報告された（Wolpert-DeFillippes et al. Biochem. Pharmacol. 24:1735-1738 (1975)）。
Ｉｎ ｖｉｖｏでもマイタンシンは活性であることが示されている。Ｐ３８８リンパ性白血病系での腫瘍増殖は、５０〜１００倍の用量範囲で阻害されることが示されたが、これは高い治療指数であることを示唆している。同様に、Ｌ１２１０マウス白血病系、ヒトルイス肺癌系およびヒトＢ−１６黒色癌系でも、有意な阻害活性を示す可能性がある（Kupchan, Fed. Proc. 33:2288-2295 (1974)）。
細胞結合剤と連結するのに好適なＮ−メチルアラニル部分に様々なアシル側鎖を担持するマイタンシン類似体が、その高い効能に基づき記載されている（例えば、米国特許第５，２０８，０２０号；第５，４１６，０６４号；第７，４７３，７９６号；第７，３６８，５６５号；第７．３０１，０１９号；第７，２７６，４９７号；第６，７１６，８２１号；第６，４４１，１６３号；米国特許出願第２０１００１２９３１４号；第２０１０００９２４９５号；第２００９０２７４７１３号；第２００９００７６２６３号；第２００８０１７１８６５号；第２００８０１７１８５６号；第２００７０２７０５８５号；第２００７０２６９４４７号；第２００７０２６４２６６号；および第２００６０１６７２４５号；Chari et al., Cancer Res., 52: 127-131 (1992); Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 93: 8618-8623 (1996); および Widdison et al., J. Med. Chem., 49; 4392, 2006を参照）。これらのコンジュゲートでは、細胞結合剤は、ＤＭ１［Ｎ２’−ジアセチル−Ｎ−２’（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−マイタンシン、ＣＡＳ番号：１３９５０４−５０−０、図１］またはＤＭ４［Ｎ２’−ジアセチル−Ｎ−２’（４−メルカプト−４−メチル−１−オキソペンチル）−マイタンシン、ＣＡＳ番号：７９６０７３−６９−３］などのマイタンシノイド類に、ジスルフィド結合介して連結する。
上記の特許において、細胞結合剤に連結させるために使用されるマイタンシノイド剤は、アセチル化されたＮ−メチルアラニンまたはＮ−メチルシステイン含有エステル側鎖を担持する（図１）。Ｎ−メチルアラニンまたはＮ−メチルシステイン含有側鎖は、高い効能を得るためにはＬ−形状でなければならず、Ｄ−異性体だと最大１００倍も効能が低くなる（Widdison et al., J. Med. Chem., 49; 4392, 2006を参照されたし）。
本発明は、先行文献による報告とは対照的に、異なる簡単Ｃ３エステル（プロピオニル、イソブチル、イソペンタノイル、ペンタノイル）を担持するアンサマイトシンの効能は高く、さらにエステルマイタンシン含有Ｎ−メチルアラニンよりも高い効能を示したという予想外の発見に基づいている（図２および図３）。例えば、Ｃ３プロピオニルエステルを担持するアンサマイトシンは、ＫＢ細胞に対し、マイタンシンよりも約３４．４倍も効能が低いと報告されていた（Kupchan et al. J. Med. Chem. 21:31-37, 1978）。しかし、本明細書において、Ｃ３プロピオニルエステルを担持する同じアンサマイトシンがＫＢ細胞株に対し、マイタンシンよりも１．３倍も高い効能を示すことが分かった。マイタンシンと比較して、アンサマイトシンが高い効能を示すという類似の結果も、別の細胞株ＳＫ−Ｂｒ−３を用いて観察されている（図３）。よって、アンサマイトシンは、細胞結合剤を用いて標的送達するのに十分な効能を有する。
従って、本発明は、細胞結合剤に連結するのに使用され得る官能基を担持する新規のアサトマイシン誘導体を記載する。
第１の実施形態では、本発明は、以下の式（Ｉ）
ＭａｙＯ−Ａ− （Ｉ）
により表される誘導体化されたマイタンシノールもしくはマイタンシノール類似体の残基に化学的に連結する細胞結合剤を含む細胞結合剤コンジュゲート、または薬学的に許容可能なその塩もしくは溶媒和物であって；
式中、ＭａｙＯが、ＭａｙＯＨにより表されるマイタンシノールもしくはマイタンシノール類似体の残基であり；Ａは、Ｃ＝Ｏ、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’、およびＣ（＝Ｏ）Ｏから選択される任意の基であり、Ｒ’は、Ｈ、置換もしくは非置換直鎖状、分岐状、もしくは環状アルキル、アルケニル、もしくはアルキニル、および置換もしくは非置換アリールから選択され；
但し、前記コンジュゲートは、以下の式
Figure 2013542958
 により表されるＮ−メチルアラニンもしくはＮ−メチルシステイン部分を含まず；
直接ＭａｙＯ−に接続している、
に関する。
第２の実施形態では、本発明は、以下の式（ＩＩ）
ＭａｙＯ−Ａ−Ｙ− （ＩＩ）
により表される誘導体化されたマイタンシノールもしくはマイタンシノール類似体の残基を含む細胞結合剤コンジュゲート、または薬学的に許容可能なその塩もしくは溶媒和物であって；
式中、ＭａｙＯおよびＡは、式（Ｉ）に記載の通りであり、Ｙは、置換もしくは非置換直鎖状、分岐状、もしくは環状アルキル、アルケニルまたはアルキニル、置換もしくは非置換アリール、置換もしくは非置換複素環式基、置換もしくは非置換アリールアルキル、置換もしくは非置換ヘテロシクリルアルキル基、アジリジン基、およびエポキシ基から選択される任意の基であり、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリールアルキル基、ヘテロシクリルアルキル基はそれぞれ、ポリエチレングリコールユニット（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ（式中、ｎは１〜２００の整数である）、アジリジン基、エポキシ基、アミノ基、アミド基、エステル基、アリール基、複素環式基、アミノ酸およびペプチドから選択される一つまたは複数の基により任意選択的に遮断される；
に関する。
第３の実施形態では、本発明は、式（ＩＩＩ）
（ＭａｙＯ−Ａ−Ｙ−Ｌ’）ｍ−ＣＢ （ＩＩＩ）
により表される細胞結合剤コンジュゲート、または薬学的に許容可能なその塩もしくは溶媒和物であって；
式中、ＭａｙＯ、ＡおよびＹは、第１および第２の実施形態に記載の通りであり、Ｌ’はリンカー、ｍは１〜２０の整数であり、ＣＢは細胞結合剤を表している；
に関する。
第４の実施形態では、本発明は、式（ＩＶ）
ＭａｙＯ−Ａ−Ｙ−Ｌ’−ＣＢ （ＩＶ）
により表される細胞結合剤コンジュゲート、または薬学的に許容可能なその塩もしくは溶媒和物であって；
式中、ＭａｙＯ、Ａ、Ｌ’およびＣＢは、第１、第２および第３の実施形態で記載の通りであり、Ｙは任意の基であり、置換もしくは非置換直鎖状、分岐状、もしくは環状アルキル、アルケニルまたはアルキニル、置換もしくは非置換アリール、置換もしくは非置換複素環式基から選択され、各基は任意のポリエチレングリコールユニット（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ（式中、ｎは１〜２００の整数）およびペプチドを担持する；
に関する。
第５の実施形態では、本発明は、式（Ｖ）
（ＭａｙＯ−Ａ−Ｙ−Ｍ’−ＢＦＣＧ）ｍ−ＣＢ （Ｖ）
に表される細胞結合剤コンジュゲート、または、薬学的に許容可能なその塩もしくは溶媒和物であって；
式中、ＭａｙＯ、Ａ、Ｙ、ｍおよびＣＢは、第１、第２、第３および第４実施形態で記載の通りであり、ＢＦＣＧは非存在か、または二つの連結基を含む二官能性架橋試薬の残基であり、前記連結基の一つは、Ｍ’と反応し、他の連結基は前記細胞結合剤と反応したものであり；Ｍ’は、反応したＢＦＣＧの連結基の一つと共に、チオエーテル、ジスルフィド、チオエステル、アミド、イミン、−Ｏイミンまたはヒドラゾン部分を形成する連結基の残基であり；ならびに、ＢＦＣＧは、チオエーテル、ジスルフィド、チオエステル、アミド、イミン、−Ｏイミンまたはヒドラゾン部分を介してＣＢと連結している；
に関する。
第６の実施形態では、本発明は、細胞結合剤または二官能性架橋試薬と化学結合を形成し得る、誘導体化されたマイタンシノールまたはマイタンシノール類似体の残基および連結基を含む化合物であって、誘導体化されたマイタンシノールもしくはマイタンシノール類似体の残基は、式（ＶＩ）
ＭａｙＯ−Ａ （ＶＩ）
により表される化合物、または薬学的に許容可能なその塩もしくは溶媒和物であって；
式中、ＭａｙＯは、ＭａｙＯＨにより表されるマイタンシノールまたはマイタンシノール類似体の残基であり；Ａは、Ｃ＝Ｏ、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’、およびＣ（＝Ｏ）Ｏから選択される任意の基であり；ならびに、Ｒ’は、Ｈ、置換もしくは非置換直鎖状、分岐状、もしくは環状アルキル、アルケニルまたはアルキニル、および置換もしくは非置換アリールから選択され；但し、前記化合物には、以下の式
Figure 2013542958
 により表されるＮ−メチルアラニンもしくはＮ−メチルシステイン部分が含まれず；
直接ＭａｙＯ−に接続している；
に関する。
第７の実施形態では、本発明は、以下の式（ＶＩＩ）
ＭａｙＯ−Ａ−Ｙ− （ＶＩＩ）
により表される誘導体化されたマイタンシノールもしくはマイタンシノール類似体の残基を含む化合物であって；
式中、ＭａｙＯおよびＡは、第６の実施形態に記載の通りであり；ならびに、Ｙは、置換もしくは非置換直鎖状、分岐状、もしくは環状アルキル、アルケニルもしくはアルキニル、置換もしくは非置換アリール、置換もしくは非置換複素環式基、置換もしくは非置換アリールアルキル、置換もしくは非置換ヘテロシクリルアルキル基、アジリジン基およびエポキシ基から選択される任意の基であり、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリールアルキル基およびヘテロシクリルアルキル基はそれぞれ、ポリエチレングリコールユニット（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ（ｎは１〜２００の整数）、アジリジン基、エポキシ基、アミノ基、アミド基、エステル基、アリール基、複素環式基、アミノ酸、およびペプチドから選択される一つまたは複数の基により任意選択的に遮断される；
に関する。
第８の実施形態では、本発明は、式（ＶＩＩＩ）
ＭａｙＯ−Ａ−Ｙ−Ｌ （ＶＩＩＩ）
の化合物、または薬学的に許容可能なその塩もしくは溶媒和物であって；
式中、ＭａｙＯ、ＡおよびＹは、第６および第７の実施形態に記載の通りであり；ならびに、Ｌは、細胞結合剤もしくは二官能性架橋試薬と化学結合を形成し得る連結基である；
に関する。
第９の実施形態では、本発明は、式（ＩＸ）
ＭａｙＯ−Ａ−Ｙ−Ｌ （ＩＸ）
により表される化合物であって；
式中、ＭａｙＯ、ＡおよびＬは、第６、第７および第８の実施形態に記載の通りであり；ならびに、Ｙは、置換もしくは非置換直鎖状、分岐状、もしくは環状アルキル、アルケニルもしくはアルキニル、置換もしくは非置換アリール、置換もしくは非置換複素環式基から選択される任意の基であり、それぞれはポリエチレングリコールユニット（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ（ｎは１〜２００の整数）およびペプチドを担持し；Ｌは、ジスルフィド結合、チオエーテル結合、ペプチド結合、アミド結合、エステル結合もしくはヒドラゾン結合を介して細胞結合剤と化学結合を形成し得る官能基、または前記化合物の薬学的に許容可能な塩もしくは溶媒和物であり；但し、ＡがＣ＝Ｏの場合、ＹはＡと共に、Ｎ−メチルアラニンもしくはＮ−メチルシステイン部分ではない；
に関する。
第１０の実施形態で、本発明は、式（Ｘ）
ＭａｙＯ−Ａ− （Ｘ）
により表される誘導体化されたマイタンシノールもしくはマイタンシノール類似体の残基に連結する二官能性架橋試薬を含む化合物、または、薬学的に許容可能なその塩もしくは溶媒和物であって；
式中、ＭａｙＯは、ＭａｙＯＨにより表されるマイタンシノールもしくはマイタンシノール類似体の残基であり；Ａは、Ｃ＝Ｏ、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’、およびＣ（＝Ｏ）Ｏから選択される任意の基であり；Ｒ’は、Ｈ、置換もしくは非置換直鎖状、分岐状、もしくは環状アルキル、アルケニルもしくはアルキニル、置換もしくは非置換アリールから選択され；但し、前記化合物は、以下の式
Figure 2013542958
 により表されるＮ−メチルアラニンもしくはＮ−メチルシステイン部分を含まず；
直接ＭａｙＯ−に接続している；
に関する。
第１１の実施形態では、本発明は、式（ＸＩ）
ＭａｙＯ−Ａ−Ｙ− （ＸＩ）
により表される誘導体化されたマイタンシノールもしくはマイタンシノール類似体の残基に連結する二官能性架橋試薬を含む化合物であって；
式中、ＭａｙＯおよびＡは、第十の実施形態で記載の通りであり；ならびに、Ｙは、置換もしくは非置換直鎖状、分岐状、もしくは環状アルキル、アルケニルもしくはアルキニル、置換もしくは非置換アリール、置換もしくは非置換複素環式基、置換もしくは非置換アリールアルキル、置換もしくは非置換ヘテロシクリルアルキル基、アジリジン基、およびエポキシ基から選択される任意の基であり；アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキルおよびヘテロシクリルアルキル基は、ポリエチレングリコールユニット（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ（ｎは１〜２００の整数）、アジリジン基、エポキシ基、アミノ基、アミド基、エステル基、アリール基、複素環式基、アミノ酸およびペプチドから選択される一つまたは複数の基により任意選択的に遮断される；
に関する。
第１２の実施形態では、本発明は、式（ＸＩＩ）
ＭａｙＯ−Ａ−Ｙ−Ｍ’−ＢＦＣＧ’−Ｚ’ （ＸＩＩ）；
により表される、誘導体化されたマイタンシノールもしくはマイタンシノール類似体の残基に連結する二官能性架橋試薬を含む化合物、または薬学的に許容可能なその塩もしくは溶媒和物であって；
式中、ＭａｙＯ、ＡおよびＹは、第１０および第１１の実施形態に記載の通りであり；ＢＦＣＧ’−Ｚ’は、二つの連結基を含む二官能性架橋試薬の残基であり、前記連結基の一つはＺ’により表され、他の連結基は、Ｍ’と反応したものであり；Ｚ’は、チオエーテル、ジスルフィド、チオエステル、アミド、チオエステル、イミン、−Ｏ−イミンもしくはヒドラゾン部分を介して細胞結合剤に連結し得る連結基であり；Ｍ’はＢＦＣＧ’の反応した基の一つと共に、チオエーテル、ジスルフィド、チオエステル、アミド、イミン、−Ｏ−イミンもしくはヒドラゾン部分を形成する連結基の残基である；
に関する。
第１３の実施形態では、本発明は、式Ｉ〜Ｖのコンジュゲートおよび任意選択的に化学療法剤を、哺乳動物に治療的有効量投与することを含む、哺乳動物における異常な細胞増殖の抑制方法、または増殖性疾患、自己免疫疾患、破壊的骨障害、感染症、ウイルス性疾患、線維性疾患、神経変性疾患、膵炎または腎臓疾患の治療方法に関する。
第１４の実施形態では、本発明は、式Ｉ〜Ｖの細胞結合剤コンジュゲートおよび薬学的に許容可能なその担体、添加剤もしくは希釈剤の医薬組成物に関する。
マイタンシノールおよび先に記載されたマイタンシノイドの構造を示す図である。Ｙ’、ｌ、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓ、ｔおよびｕは、それぞれ独立して、０または１〜５の整数である。但し、ｌ、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓ、ｔおよびｕの少なくとも２つは、任意の時点で０ではなく；ならびにＺはＨ、ＳＲまたは−ＣＯＲであり、Ｒは、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキルまたはアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分岐状もしくは環状アルキルもしくはアルケニル、非置換もしくは置換アリール基、または置換もしくは非置換複素環式基である。連結可能なマイタンシノイドでは、ＺおよびＺ１は、Ｙ’に対するＺと同じ定義を有する。 アンサマイトシンおよびマイタンシンの構造を示す図である。 Ａ）ＫＢ細胞およびＢ）ＳＫ−Ｂｒ−３細胞に対し異なるエステル基を有するアンサマイトシンと比較した場合のマイタンシンのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性を示す図である。 側鎖の合成を示す図である。 同上。 同上。 ジスルフィドおよびチオール含有アンサマイトシン誘導体の合成を示す図である。 芳香族または複素環式側鎖を担持するチオール含有アンサマイトシン誘導体の合成を示す図である。 ジスルフィドおよびチオール含有ペグ化アンサマイトシン誘導体の合成を示す図である。 同上。 ペプチダーゼ不安定性リンカーを担持するアンサマイトシン誘導体の合成を示す図である。 カルボニル基を担持するアンサマイトシン誘導体の合成を示す図である。 アミノ基を担持するアンサマイトシン誘導体の合成を示す図である。 同上。 Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル基を担持するアンサマイトシン誘導体の合成を示す図である。 エーテル基、カルバマート基または炭酸塩基を担持するアンサマイトシン誘導体の合成を示す図である。 同上。 チオール含有アンサマイトシンの合成を示す図である。 同上。 同上。 本発明の化合物で調製されるジスルフィド連結コンジュゲートのコンジュゲーション手順を示す図である。 本発明の化合物で調製されるチオスクシンイミジル連結コンジュゲートのコンジュゲーション手順を示す図である。 本発明の化合物で調製されるチオアセタミジル連結コンジュゲートのコンジュゲーション手順を示す図である。 本発明の化合物で調製されるペプチダーゼ不安定性コンジュゲートのコンジュゲーション手順を示す図である。 本発明の化合物で調製されるペプチダーゼ不安定性チオスクシンイミジル連結コンジュゲートのコンジュゲーション手順を示す図である。 本発明の化合物で調製されるペプチダーゼ不安定性チオアセタミジル連結コンジュゲートのコンジュゲーション手順を示す図である。 本発明の化合物で調製されるアミド連結コンジュゲートのコンジュゲーション手順を示す図である。 本発明の化合物で調製されるヒドラゾン連結コンジュゲートのコンジュゲーション手順を示す図である。 本発明の化合物で調製されるヒドラゾン連結コンジュゲートのコンジュゲーション手順を示す図である。 本発明の化合物で調製されるヒドラゾン連結コンジュゲートのコンジュゲーション手順を示す図である。 本発明の化合物で調製されるアミド連結コンジュゲートのコンジュゲーション手順を示す図である。 本発明の化合物で調製されるジスルフィド連結コンジュゲートのコンジュゲーション手順を示す図である。 本発明の化合物で調製されるチオエーテル連結コンジュゲートのコンジュゲーション手順を示す図である。 同上。 同上。 本発明の化合物で調製されるアミド連結コンジュゲートのコンジュゲーション手順を示す図である。 ＫＢ細胞株に対する調製されたアンサマイトシン誘導体のｉｎ ｖｉｔｒｏ活性を示す図である（９６時間曝露） ＣＯＬＯ２０５細胞株に対する調製されたアンサマイトシン誘導体のｉｎ ｖｉｔｒｏ活性を示す図である（９６時間曝露） ＣＯＬＯ２０５−ＭＤＲ細胞株に対する調製されたアンサマイトシン誘導体のｉｎ ｖｉｔｒｏ活性を示す図である（９６時間曝露） ＣＯＬＯ２０５細胞に対する連結可能なアンサマイトシン誘導体およびチオール含有マイタンシノイド、ＤＭ１で調製されたコンジュゲートのｉｎ ｖｉｔｒｏ活性を示す図である。
本発明は、細胞結合剤に連結することを可能にする官能基を担持する新規のアンサマイトシン誘導体を開示する。さらに、本発明は、これら新規アンサマイトシン誘導体を細胞結合剤とコンジュゲートする調製法を開示する。
本発明の別の態様は、有効量の任意の上記アンサマイトシン誘導体−細胞結合剤コンジュゲート、薬学的に許容可能なその塩または溶媒和物、および薬学的に許容可能な担体、希釈剤または付形剤を含む医薬組成物である。
アンサマイトシン誘導体を含む上記の医薬組成物にはさらに抗体が含まれてもよい。
本発明のさらに別の態様は、標的細胞または標的細胞を含有する組織を、有効量の任意の上記アンサマイトシン誘導体−細胞結合剤、その塩または溶媒和物と接触させることを含む、選択細胞集団における細胞死誘発の方法である。
細胞傷害性の効能を低下させることなく、既存の薬剤を修飾することは極めて困難であることは、当技術分野で明らかにされている。本開示の発明は、官能基を担持する新規のアンサマイトシン誘導体を合成する方法を教授することにより、この問題を克服する。本開示の新規アンサマイトシン誘導体は、先行文献で記載されたアンサマイトシンの細胞傷害性効能を保持し、さらにそれを高めることさえある。
アンサマイトシン誘導体−細胞結合剤コンジュゲートにより、アンサマイトシン誘導体の細胞傷害性活動が十二分に、不要な細胞のみを標的として適用され、よって、非標的の健康な細胞を傷害することによる副作用を回避することができる。従って、本発明は、殺傷または溶解するべき疾患細胞または異常細胞、例えば、腫瘍細胞（特に、固形腫瘍細胞）、ウイルス感染細胞、微生物感染細胞、寄生虫感染細胞、自己免疫細胞（自己抗体を産生する細胞）活性化細胞（移植片拒絶もしくは移植片対宿主病に関与するもの）、またはその他任意の種類の疾患細胞もしくは異常細胞などを、副作用を最小限に留めつつ除去するため、有用な薬剤および同薬剤の新規製造方法を提供する。
本発明で使用され得るアンサマイトシン前駆体は、細胞結合剤に連結できるアンサマイトシン誘導体を産生するが、当技術分野では周知であり、既知の方法に従って天然のソースから単離することができ、または既知の方法に従って合成により調製することもできる（米国特許第６，７９０，９５４号；第７，１９２，７５０号；第７，４３２，０８８号を参照）。
好適なアンサマイトシン前駆体の例として、マイタンシノールおよびマイタンシノール類似体が挙げられる。好適なマイタンシノール類似体の例として、修飾された芳香族環を有するものおよび他の位置が修飾されたものが挙げられる。
修飾された芳香族環を有するマイタンシノールの好適な類似体の具体的な例として、
（１）Ｃ−１９−ジクロロ（米国特許第４，２５６，７４６号）（アンサマイトシンＰ２のＬＡＨ還元により調製）
（２）Ｃ−２０−ヒドロキシ（または、Ｃ−２０−デメチル）＋／−Ｃ−１９−ジクロロ（米国特許第４，３６１，６５０号および第４，３０７，０１６号）（ストレプトマイシンもしくは放線菌を用いて脱メチル化、またはＬＡＨを用いて脱塩素により調製）；ならびに
（３）Ｃ−２０−デメトキシ、Ｃ−２０−アシルオキシ（−ＯＣＯＲ）、＋／−Ｃ−１９−ジクロロ（米国特許第４，２９４，７５７号）（塩化アシルを用いてアシル化により調製）；
が挙げられる。
他の位置が修飾されたマイタンシノールの好適な類似体の具体的な例として、
（１）C９−ＳＨ（米国特許第４，４２４，２１９号）（マイタンシノールをＨ２ＳまたはＰ２Ｓ５と反応させることにより調製）
（２）Ｃ１４−アルコキシメチル（デメトキシ／ＣＨ２ＯＲ）（米国特許第４，３３１，５９８号）；
（３）Ｃ１４−ヒドロキシメチルまたはアシルオキシメチル（ＣＨ２ＯＨまたはＣＨ２ＯＡｃ）（米国特許第４，４５０，２５４号）（ノルカジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）から調製）；
（４）Ｃ１５−ヒドロキシ／アシルオキシ（米国特許第４，３６４，８６６号）（ストレプトマイシンによりマイタンシノールを変換することにより調製）；
（５）Ｃ１５−メトキシ（米国特許第４，３１３，９４６号および第４，３１５，９２９号）（Ｔｒｅｗｉａ ｎｕｄｉｆｌｏｒａから単離）；
（６）Ｃ１８−Ｎ−デメチル（米国特許第４，３６２，６６３号および第４，３２２，３４８号）（ストレプトマイシンによるマイタンシノールのデメチル化により調製）；ならびに
（７）４，５−デオキシ（米国特許第４，３７１，５３３号）（三塩化チタン／マイタンシノールのＬＡＨ還元により調製）；
が挙げられる。
マイタンシノール上には、連結部分に化学的に連結し得る位置がたくさんある。例えば、ヒドロキシル基を有するＣ−３位置、ヒドロキシメチルで修飾されたＣ−１４位置、ヒドロキシで修飾されたＣ−１５位置、およびヒドロキシ基を有するＣ−２０位置はすべて有益である。しかし、好ましいのはＣ−３およびＣ２０であり、マイタンシノールのＣ−３位置は特に好ましい。
連結部分を有するマイタンシノールのエステル合成に関しては、Ｃ−３位置におけるいくつかの例示的連結部分について以下に記載しており、当業者であれば、上記の通り、他の化学結合を有する連結部分もまた、上記の他のアンサマイトシンおよび他の連結位置と同様、本発明で使用することができると理解するであろう。
本明細書に記載の構造式（例えば、第一〜第十二の実施形態の式Ｉ〜ＸＩＩ）における変数の代替値は、以下に提供されている。
第１番目（１）の代替実施形態では、構造式ＩＩ〜Ｖ、ＶＩＩ〜ＩＸ、ＸＩおよびＸＩＩのＹは、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、ハロＣ１〜６アルキル、二つの隣接する炭素原子上のハロゲンおよびヒドロキシ基を有するＣ１〜６アルキル、
Figure 2013542958
 −Ｃ２〜６アルケニル−Ａｒ−、−Ａｒ−Ｃ２〜６アルケニル−、−Ｃ２〜６アルキニルＡｒ−、−Ａｒ−Ｃ２〜６アルキニル、Ｃ１〜６アルキルの二つの隣接する炭素原子上にハロゲンおよびヒドロキシル基を有する−Ｃ１〜６アルキル−Ａｒ−、および二つの隣接する炭素原子上にハロゲンおよびヒドロキシル基を有する−Ａｒ−Ｃ１〜６アルキルから選択される任意の基であり、式中、Ａｒは任意に置換されたアリールまたは任意に置換されたヘテロシクリルであり、Ｙにより表されるアルケニル基、アルキニル基、アルキル基は任意に置換される。
第２番目（２）の代替実施形態では、第１代替実施形態のＡｒは、Ｃ１〜４アルキル、Ｃ１〜４アルコキシ、ヒドロキシＣ１〜４アルキル、ハロＣ１〜４アルキル、−ＯＨ、−ＯＣ（＝Ｏ）−Ｃ１〜４アルキル、−ＯＣ（＝Ｏ）−Ｃ１〜４アルキル−ＮＲａＲｂ、−Ｃ１〜４アルキル−ＣＯＯＨ、−ＮＲａＲｂ、−Ｃ１〜４アルキルＮＲａＲｂ、−ＮＯ２およびハロゲンで任意に置換されるフェニル基であり、式中、ＲａおよびＲｂは、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１〜４アルキルまたはアミノ保護基であり、またはＲａおよびＲｂは、窒素原子と共に、一つまたは複数のヘテロ原子を有する複素環式環を形成する。
第３番目（３）の代替実施形態では、構造式ＩＩ〜Ｖ、ＶＩＩ〜ＩＸ、ＸＩおよびＸＩＩの−Ａ−Ｙ−は、以下の式の一つにより表され；
Figure 2013542958
 式中、ｎおよびｎ’は、それぞれ独立して、０、１、２または３であり、ｎ”は１、２または３であり、および各出現のＲｃは、Ｈ、Ｃ１〜４アルキル、Ｃ１〜４アルコキシ、ヒドロキシＣ１〜４アルキル、ハロＣ１〜４アルキル、−ＯＨ、−ＯＣ（＝Ｏ）−Ｃ１〜４アルキル、−ＯＣ（＝Ｏ）−Ｃ１〜４アルキル−ＮＲａＲｂ、−Ｃ１〜４アルキル−ＣＯＯＨ、−ＮＯ２およびハロゲンであり、式中、ＲａおよびＲｂは、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１〜４アルキル、アミノＣ１〜４アルキルもしくはアミノ保護基であり、ＲａおよびＲｂは、窒素原子と共に、一つまたは複数のヘテロ原子を有する複素環式環を形成する。
第４番目（４）の代替実施形態では、第２および第３の代替実施形態のＲａおよびＲｂは、窒素原子と共に、任意に置換されたピペラジニル、任意に置換された保護ピペラジニル、または任意に置換された４−ピペリジノピペリジニル（例えば、
Figure 2013542958
 を形成する。
第５番目（５）の代替実施形態では、ｎ”は１または２であり、Ｒｃは、Ｈ、メチル、エチル、ハロゲン、−ＣＦ３、−ＮＯ２、−ＯＭｅ、−ＣＯ２Ｍｅ、−ＯＨ、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２ＯＣ（Ｏ）ＣＨ２ＮＨ２、−ＣＨ２ＯＣ（Ｏ）（Ｃ（ＣＨ３）２）ＣＨ２ＮＨ２、−ＣＨ２ＮＨ２、−ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）２、−ＣＨ２ＣＯＯＨ、および代替実施形態２〜４の−ＣＨ２−ピペラジニルである。
第６番目（６）の代替実施形態では、構造式ＩＩ〜Ｖ、ＶＩＩ〜ＩＸ、ＸＩおよびＸＩＩのＹは、式（ＩＡ）
−［Ａｒ’］ｊ−（Ｃ１〜１０アルキル）− （ＩＡ）；
により表され；
式中、Ａｒ’は、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロシクリル、任意に置換されたＣ１〜４アルキルアリール、または任意に置換されたＣ１〜４アルキルヘテロシクリルであり；ｊは０または１である。
第７番目（７）の代替実施形態では、構造式ＩＩ〜Ｖ、ＶＩＩ〜ＩＸ、ＸＩおよびＸＩＩのＹは、式（ＩＩＡ）
［Ａｒ”］０−１−（ＣＲ１Ｒ２）ｘ−Ｂ−Ｗ−Ｄ−（ＣＲ１Ｒ２）ｗ− （ＩＩＡ）；
により表され；
式中、Ａｒ”は、アルキル、アルコキシル、ハロ、ハロアルキル、アルコキシ−ハロアルキル、ニトリルおよびニトロから選択される１〜４個の基で任意に置換されるフェニル、−ＣＨ２−フェニル、ヘテロシクリル、または−ＣＨ２−ヘテロシクリルであり；Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、水素またはＣ１〜４アルキルであり；ＢはＮＲ”、Ｏまたは非存在であり；Ｗは２〜８個のアミノ酸を含むペプチド、（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎまたは非存在であり；ＤはＣＯ、ＮＲ”または非存在であり；Ｒ”はＨ、置換もしくは非置換直鎖状、分岐状、もしくは環状アルキル、アルケニルもしくはアルキニル、および置換もしくは非置換アリールであり；ｘは１〜１０の整数であり；ｗは０または１〜１０の整数であり；ならびに、ｎは１〜２００の整数である。
第８番目（８）の代替実施形態では、構造式ＩＩＡのＲ”はＨまたはＣ１〜４アルキルである。
第９番目（９）の代替実施形態では、構造式ＩＩ〜Ｖ、ＶＩＩ〜ＩＸ、ＸＩおよびＸＩＩならびに代替実施形態１〜８のＹは、（ＣＲ１Ｒ２）ｘ−であり、ｘは１〜６の整数である。
第１０番目（１０）の代替実施形態では、構造式ＩＩ〜ＸＩＩおよび代替実施形態１〜９のＲ１およびＲ２は、それぞれ独立して、水素またはメチルである。
第１１番目（１１）の代替実施形態では、構造式ＩＩ〜Ｖ、ＶＩＩ〜ＩＸ、ＸＩおよびＸＩＩのＹは、以下の式の一つにより表される。
Figure 2013542958
第１２番目（１２）の代替実施形態では、式Ｉ〜ＸＩＩおよび代替実施形態１〜１１のＲ’は、ＨまたはＣ１〜４アルキルである。
第１３番目（１３）の代替実施形態では、式Ｉ〜ＸＩＩおよび代替実施形態１〜１２のＭａｙＯは、式
Figure 2013542958
 により表され；
式中、Ｘ’４＝Ｘ’５であり、またはＯＸ’５およびＸ’、Ｘ’１、Ｘ’２、Ｘ’３、およびＸ’５は同じかまたは異なり、Ｒ、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ２またはＣ（＝Ｏ）ＯＲから選択され、式中、Ｒはそれぞれ独立して、Ｈ、置換もしくは非置換直鎖状、分岐状、もしくは環状アルキル、アルケニルもしくはアルキニル、および置換もしくは非置換アリールから選択され；ＱはＯまたはＳから選択され；但し、Ｘ’、Ｘ’１、Ｘ’２、Ｘ’３、Ｘ’５のうち少なくとも一つはＭａｙＯとＡまたはＡＹとの間の共有結合を表している。
第１４番目（１４）の代替実施形態では、第１３の代替実施形態のＲは、独立して、ＨまたはＣ１〜４アルキルである。
第１５番目（１５）の代替実施形態では、式ＩからＸＩＩおよび代替実施形態１〜１４のＭａｙＯは、式
Figure 2013542958
 により表される。
第１６番目（１６）の代替実施形態では、式ＶのＢＦＣＧは、Ｍ’に接続されたＭ”部分およびＣＢに接続されたＺ部分を含み、式中、Ｍ”およびＺは、それぞれ独立して、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲｅ−、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝ＮＨ）−、−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＲｅ−、−Ｓ−、−ＮＲｅ−、−ＮＨ−ＮＲｅ−、
Figure 2013542958
 −Ｃ（＝ＮＲｅ）−、＝ＮＮＲｅ、−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−、および−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲｅから成る群から選択され、式中、Ｒｅは、Ｈ、アルキル、アルケニルまたはアルキルニルであり、残りの変数に関しては、代替実施形態１〜１５に記載の通りである。
第１７番目（１７）の代替実施形態では、第１６の代替実施形態のＭ”およびＺは、それぞれ独立して、−Ｃ（＝Ｏ）−、
Figure 2013542958
 −Ｓ−、−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）、−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−および−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−から成る群から選択され、変数の残りは代替実施形態１〜１５に記載の通りである。
第１８番目（１８）代替実施形態では、第１６の代替実施形態のＭ’−Ｍ”は、
Figure 2013542958
 から選択される構造式により表され、残りの変数は代替実施形態１〜１７に記載の通りである。
第１９番目（１９）の代替実施形態では、式Ｖの−ＢＦＣＧは、式（ＩＩＩＡ）
−Ｍ”−（ＣＲ３Ｒ４）ｙ−［Ｃｙ］０または１−Ｃ（Ｏ）− （ＩＩＩＡ）；
により表され、または薬学的に許容可能なその塩もしくは溶媒和物であり；
式中、Ｍ”は
Figure 2013542958
 であり、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して、水素、メチルまたは−ＳＯ３ −Ｍ＋であり、Ｍ＋は、Ｈ＋または薬学的に許容可能な陽イオンであり；Ｃｙは、シクロアルキル、またはアルキル、アルコキシル、ハロ、ハロアルキル、アルコキシハロアルキル、ニトリルおよびニトロから選択される１〜４個の基で任意に置換されるフェニルであり、ｙは０または１〜１０の整数であり、残りの変数は代替実施形態１〜１８に記載の通りである。
第２０番目（２０）の代替実施形態では、式ＶのＢＦＣＧは、
Figure 2013542958
 であり；および、
Ｍ’は−Ｓ−であり、残りの変数は代替実施形態１〜１９に記載の通りであり、残りの変数は代替実施形態１〜１９に記載の通りである。
第２１番目（２１）の代替実施形態では、式ＶのＢＦＣＧは、
Figure 2013542958
 であり；および
残りの変数は代替実施形態１〜２０に記載の通りである。
第２２番目（２２）の代替実施形態では、式Ｖの−ＢＦＣＧ−は、式（ＩＶＡ）
Ｓ−（ＣＲ３Ｒ４）ｙ’−Ｃ（Ｏ） （ＩＶＡ）；
により表され；
式中、Ｒ３Ｒ４は、それぞれ独立して、水素、メチルまたは−ＳＯ３ −Ｍ＋であり、Ｍ＋はＨ＋または薬学的に許容可能な陽イオン、ｙ’は１〜１０の整数、残りの変数は代替実施形態１〜１８に記載の通りである。
第２３番目（２３）の代替実施形態では、本発明は、ＢＦＣＧが自己犠牲部分を含み、残りの変数は代替実施形態１〜２２に記載の通りである、細胞結合剤コンジュゲートに関連する。
第２４番目（２４）の代替実施形態では、式ＶのＢＦＣＧは以下の式により表され；
Figure 2013542958
 式中、ＡＡは、アミノ酸または２〜８個のアミノ酸を含むペプチドであり、Ｒ１００はＨまたはアルキルであり、残りの変数は代替実施形態１〜１８に記載の通りである。代替的に、式ＶのＢＦＣＧは以下の式により表され；
Figure 2013542958
 式中、ＡＡは、アミノ酸または２〜８個のアミノ酸を含むペプチドであり、アミノ酸側鎖の一つは、本明細書に記載の、細胞結合剤と共有結合する連結部分Ｚ（例えば、−ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）−）を有し、Ｒ１００はＨまたはアルキルである。別の代替では、式ＶのＢＦＣＧは、−ＡＡ−（Ｃ＝Ｏ）０〜１−Ｃ０〜６アルキル−Ｚ−であり、式中、ＡＡはアミノ酸または２〜８個のアミノ酸を含むペプチドであり、Ｚは連結基であり；または
式ＶのＢＦＣＧは、
Figure 2013542958
 であり、式中、ＡＡはアミノ酸または２〜８個のアミノ酸を含むペプチドであり、アミノ酸側鎖の一つは、本明細書に記載の、細胞結合剤と共有結合する連結部分Ｚ（例えば、−ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）−）を有する。
第２５番目（２５）の代替実施形態では、代替実施形態２４のＡＡは、Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｖａｌ−Ｌｙｓ、Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、Ａｌａ−Ｌｙｓ、Ｐｈｅ−Ｃｉｔ、Ｌｅｕ−Ｃｉｔ、Ｌｌｅ−Ｃｉｔ、Ｔｒｐ、Ｃｉｔ、Ｐｈｅ−Ａｌａ、Ｐｈｅ−Ｎ９−トシル−Ａｒｇ、Ｐｈｅ−Ｎ９−ニトロ−Ａｒｇ、Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ、Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ、Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ、Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（配列番号１）、β−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（配列番号２）およびＧｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ（配列番号３）、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号４）、Ｖａｌ−Ａｒｇ、Ａｒｇ−Ｖａｌ、Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ｖａｌ−Ｄ−Ｃｉｔ、Ｖａｌ−Ｄ−Ｌｙｓ、Ｖａｌ−Ｄ−Ａｒｇ、Ｄ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｄ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ｖａｌ−Ａｒｇ、Ｄ−Ｖａｌ−Ｄ−Ｃｉｔ、Ｄ−Ｖａｌ−Ｄ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ｖａｌ−Ｄ−Ａｒｇ、およびＤ−Ａｒｇ−Ｄ−Ａｒｇから成る群から選択され、残りの変数は代替実施形態１〜１８に記載の通りである。
第２６番目（２６）の代替実施形態では、代替実施形態２４〜２５のＡＡは、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｐｈｅ−ＬｙｓまたはＶａｌ−Ｌｙｓであり、残りの変数は代替実施形態１〜１８に記載の通りである。
第２７番目（２７）の代替実施形態では、式ＶのＢＦＣＧは、
Figure 2013542958
 から選択され；
式中、ＡＡはＶａｌ−Ｃｉｔ、Ｐｈｅ−ＬｙｓまたはＶａｌ−Ｌｙｓであり、ｑは１〜５の整数、ｎは１〜２０の整数であり；ＭはＨ＋または薬学的に許容可能な陽イオンであり、残りの変数は代替実施形態１〜１８に記載の通りである。
第２８番目（２８）の代替実施形態では、式ＩＩＩ〜Ｖの細胞結合剤は、腫瘍細胞、ウイルス感染細胞、微生物感染細胞、寄生虫感染細胞、自己免疫細胞、活性化細胞、骨髄細胞は、活性化T細胞、B細胞、またはメラノサイト；ＣＤ４、ＣＤ６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５６、ＥｐＣＡＭ、ＣａｎＡｇ、ＣＡＬＬＡ、ＳＴＥＡＰ、ＴＥＮＢ２、ＭＵＣ１６、ＩＲＴＡ１、ＩＲＴＡ２、ＩＲＴＡ３、ＩＲＴＡ４、ＩＲＴＡ５、ｃ−ＭＥＴ、５Ｔ４、またはＨｅｒ−２抗原／Ｈｅｒ−３抗原を発現する細胞；またはインスリン成長因子受容体、上皮成長因子受容体、および葉酸受容体を発現する細胞から選択される標的細胞と結合し、残りの変数は、代替実施形態１〜２７に記載の通りである。
第２９番目（２９）の代替実施形態では、式ＩＩＩ〜Ｖの細胞結合剤は、抗体、単鎖抗体、標的細胞と特異的に結合する抗体断片、モノクロナール抗体、単鎖モノクロナール抗体、または標的細胞と特異的に結合するモノクロナール抗体断片、キメラ抗体、標的細胞と特異的に結合するキメラ抗体、ドメイン抗体、標的細胞と特異的に結合するドメイン抗体、二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）、ナノ抗体、ｐｒｏｂｏｄｙ、Ｄａｒｐｉｎ、リンホカイン、ホルモン、ビタミン、増殖因子、コロニー刺激因子、または栄養素輸送分子であり、残りの変数は、代替実施形態１〜２７に記載の通りである。
第３０番目（３０）の代替実施形態では、代替実施形態２９の抗体は、表面再構成（ｒｅｓｕｒｆａｃｅｄ）抗体、表面再構成単鎖抗体、または表面再構成抗体断片であり、残りの変数は、代替実施形態１〜２７に記載の通りである。
第３１番目（３１）の代替実施形態では、代替実施形態２９の抗体は、モノクロナール抗体、単鎖モノクロナール抗体、またはそのモノクロナール抗体断片であり、残りの変数は、代替実施形態１〜２７に記載の通りである。
第３２番目（３２）の代替実施形態では、代替実施形態２９の抗体は、ヒト化抗体、ヒト化単鎖抗体、またはヒト化抗体断片であり、残りの変数は、代替実施形態１〜２７に記載の通りである。
第３３番目（３３）の代替実施形態では、式Ｉ〜Ｖおよび例示的実施形態１〜３２の細胞結合剤コンジュゲートは、薬学的に許容可能な担体を有する医薬組成物として処方される。
第３４番目（３４）の代替実施形態では、式ＶＩ〜ＩＸの化合物は、構造式２〜５
Figure 2013542958
 により表され；
式中、Ｒ’は、Ｈ、置換もしくは非置換直鎖状、分岐状、もしくは環状アルキル、アルケニルまたはアルキニル、および置換もしくは非置換アリールから選択され；Ｙは、置換もしくは非置換直鎖状、分岐状、もしくは環状アルキル、アルケニルまたはアルキニル、置換もしくは非置換アリール、置換もしくは非置換複素環式基から選択される任意の基であり、それぞれは任意のポリエチレングリコールユニット（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ（ｎは１〜２００の整数）およびペプチドを担持し；Ｌは、ジスルフィド結合、チオエーテル結合、ペプチド結合、アミド結合、エステル結合もしくはヒドラゾン結合を介して細胞結合剤との連結を形成する官能基、または薬学的に許容可能なアンサマイトシン誘導体の塩もしくは溶媒和物であり、残りの変数は、代替実施形態１〜１５に記載の通りである。
第３５番目（３５）の代替実施形態では、式ＶＩＩＩ〜ＩＸおよび代替実施形態３４のＬは、マレイミド、ハロアセタミド、−ＳＨ、−ＳＳＲｄ、−ＣＨ２ＳＨ、−ＣＨ（Ｍｅ）ＳＨ、−Ｃ（Ｍｅ）２ＳＨ、−ＮＨＲｆ、−ＣＨ２ＮＨＲｆ、−ＮＲｆＮＨ２、−ＣＯＯＨ、および−ＣＯＥから選択される構造式により表され、式中、ＣＯＥは反応性エステルを表し、Ｒｄは、任意に置換されたフェニルまたは任意に置換されたピリジルであり、ＲｆはＨまたはアルキルであり、残りの変数は代替実施形態１〜１５で定められた通りである。
第３６番目（３６）の代替実施形態では、代替実施形態３５の−ＣＯＥにより表される反応性エステルは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド・エステル、Ｎ−ヒドロキシ・スルホスクシンイミド・エステル、ニトロフェニル（例えば、２または４−ニトロフェニル）エステル、ジニトロフェニル（例えば、２，４−ジニトロフェニル）エステル、スルホ−テトラフルオロフェニル（例えば、４−スルホ−２，３，５，６−テトラフルオロフェニル）エステル、およびペンタフルオロフェニル・エステルから選択され、Ｒｄは、フェニル、ニトロフェニル（例えば、２または４−ニトロフェニル）、ジニトロフェニル（例えば、２または４−ニトロフェニル）、カルボキシニトロフェニル（例えば、３−カルボキシ−４−ニトロフェニル）、ピリジルまたはニトロピリジル（例えば、４−ニトロピリジル）から選択され、残りの変数は、代替実施形態１〜１５で定められた通りである。
第３７番目（３７）の代替実施形態では、式ＶＩ〜ＩＸおよび例示的実施形態３４〜３６の化合物は、化合物６〜２６の任意の一つ、
Figure 2013542958
Figure 2013542958
Figure 2013542958
Figure 2013542958
 または薬学的に許容可能なその塩もしくは溶媒和物により表され；
式中、ｘは１〜６の整数であり；ＲｆはＨまたはアルキルである。
第３８番目（３８）の代替実施形態では、式ＸＩＩのＢＦＣＧ’には、Ｍ’に接続する連結基Ｍ”が含まれ、Ｍ”は、Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲｅ−、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ、−Ｏ Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝ＮＨ）−、−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＲｅ−、−Ｓ−、−ＮＲｅ−、−ＮＨ−ＮＲｅ−、
Figure 2013542958
 −Ｃ（＝ＮＲｅ）−、−＝ＮＮＲｅ−、−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−、および−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲｅ−から成る群から選択され、
式中、Ｒｅは、Ｈ、アルキル、アルケニルまたはアルキルニルであり、残りの変数は、代替実施形態１〜１５で定められた通りである。
第３９番目（３９）の代替実施形態では、代替実施形態３８のＭ”は、Ｃ（＝Ｏ）−、
Figure 2013542958
 −Ｓ−、−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）、−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨおよび−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−から成る群から選択され、残りの変数は、代替実施形態１〜１５で定められた通りである。
第４０番目（４０）の代替実施形態では、代替実施形態３８のＭ’−Ｍ”は、
Figure 2013542958
 から選択される構造式により表され、残りの変数は、代替実施形態１〜１５で定められた通りである。
第４１番目（４１）の代替実施形態では、式ＸＩＩのＢＦＣＧ’は、式（ＩＩＩＣ）
−Ｍ”−（ＣＲ３Ｒ４）ｙ−［Ｃｙ］０または１− （ＩＩＩＣ）；
により表され、または、薬学的に許容可能なその塩もしくは溶媒和物であり；
式中Ｍ”は
Figure 2013542958
 であり；
Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して、水素、メチルまたは−ＳＯ３ −Ｍ＋であり、Ｍ＋は、Ｈ＋または薬学的に許容可能な陽イオンであり、Ｃｙは、シクロアルキル、またはアルキル、アルコキシル、ハロ、ハロアルキル、アルコキシハロアルキル、ニトリル、およびニトリルから選択される１〜４個の基で任意に置換されたフェニルであり；ｙは０または１〜１０の整数であり、残りの変数は、代替実施形態１〜１５で定められた通りである。
第４２番目（４２）の代替実施形態では、式ＸＩＩおよび代替実施形態３８〜４１のＢＦＣＧ’は、
Figure 2013542958
 であり；および
Ｍ’は−Ｓ−であり、残りの変数は、代替実施形態１〜１５で定められた通りである。
第４３番目（４３）の代替実施形態では、式ＸＩＩＩおよび代替実施形態３８〜４２のＢＦＣＧ’は、
Figure 2013542958
 であり、残りの変数は、代替実施形態１〜１５に定められた通りである。
第４４番目（４４）の代替実施形態では、式ＸＩＩの−ＢＦＣＧ’は、式（ＩＶＣ）
Ｓ”−（ＣＲ３Ｒ４）ｙ （ＩＶＣ）；
により表され；
式中、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して、水素、メチル、−ＳＯ３ −Ｍ＋であり、Ｍ＋はＨ＋または薬学的に許容可能な陽イオンであり、ｙ’は１〜１０の整数であり、残りの変数は、代替実施形態１〜１５で定められた通りである。
第４５番目（４５）の代替実施形態では、式ＸＩＩのＢＦＣＧ’には自己犠牲部分が含まれ、残りの変数は、代替実施形態１〜１５で定められた通りである。
第４６番目（４６）の代替実施形態では、式ＸＩＩのＢＦＣＧ’は、以下の式により表され：
Figure 2013542958
 式中、ＡＡはアミノ酸または２〜８個のアミノ酸を含むペプチドであり、Ｒ１００はＨまたはアルキルであり、残りの変数は、代替実施形態１〜１５で定められた通りである。代替的に、式ＸＩＩのＢＦＣＧ’−Ｚ’は、以下の式により表され：
Figure 2013542958
 式中、ＡＡはアミノ酸または２〜８個のアミノ酸を含むペプチドであり、アミノ酸側鎖の一つは、細胞結合剤と共有結合することができる上記の連結基Ｚ’（例えば、−ＮＨ２、−ＣＯＯＨまたは−ＣＯＥ）を有し、Ｒ１００はＨまたはアルキルである。別の代替では、式ＶのＢＦＣＧ’は−ＡＡ−（Ｃ＝Ｏ）０〜１−Ｃ０〜６アルキル−であり、ＡＡは、アミノ酸または２〜８個のアミノ酸を有するペプチドであり；式ＶのＢＦＣＧ’−Ｚ’は、
Figure 2013542958
 であり、式中、ＡＡはアミノ酸または２〜８個のアミノ酸を有するペプチドであり、アミノ酸側鎖の一つは、細胞結合剤と共有結合することができる上記の連結基Ｚ’（例えば、−ＮＨ２、または−ＣＯＥ）を有する。
第４７番目（４７）の代替実施形態では、代替実施形態４６のＡＡは、Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｖａｌ−Ｌｙｓ、Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、Ａｌａ−Ｌｙｓ、Ｐｈｅ−Ｃｉｔ、Ｌｅｕ−Ｃｉｔ、Ｌｌｅ−Ｃｉｔ、Ｔｒｐ、Ｃｉｔ、Ｐｈｅ−Ａｌａ、Ｐｈｅ−Ｎ９−トシル−Ａｒｇ、Ｐｈｅ−Ｎ９−ニトロ−Ａｒｇ、Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ、Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ、Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ、Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（配列番号１）、β−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（配列番号２）およびＧｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ（配列番号３）、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号４）、Ｖａｌ−Ａｒｇ、Ａｒｇ−Ｖａｌ、Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ｖａｌ−Ｄ−Ｃｉｔ、Ｖａｌ−Ｄ−Ｌｙｓ、Ｖａｌ−Ｄ−Ａｒｇ、Ｄ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｄ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ｖａｌ−Ａｒｇ、Ｄ−Ｖａｌ−Ｄ−Ｃｉｔ、Ｄ−Ｖａｌ−Ｄ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ｖａｌ−Ｄ−Ａｒｇ、およびＤ−Ａｒｇ−Ｄ−Ａｒｇから成る群から選択され、残りの変数は、代替実施形態１〜１５で定められた通りである。
第４８番目（４８）の代替実施形態では、代替実施形態４６〜４７のＡＡは、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｐｈｅ−ＬｙｓまたはＶａｌ−Ｌｙｓであり、残りの変数は、代替実施形態１〜１５で定められた通りである。
第４９番目（４９）の代替実施形態では、式ＸＩＩのＢＦＣＧ’は、
Figure 2013542958
 から選択され；
式中、ＡＡは、Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｐｈｅ−ＬｙｓまたはＶａｌ−Ｌｙｓであり、ｑは１〜５の整数、ｎは１〜２０の整数であり；ＭはＨ＋または薬学的に許容可能な陽イオンであり、残りの変数は、代替実施形態１〜１５に定められた通りである。
第５０番目（５０）の代替実施形態では、式ＸＩＩのＺ’は、マレイミド、ハロアセタミド−ＳＨ、−ＳＳＲｄ、−ＣＨ２ＳＨ、−ＣＨ（Ｍｅ）ＳＨ、−Ｃ（Ｍｅ）２ＳＨ、−ＮＨＲｃ、−ＣＨ２ＮＨＲｃ、−ＮＲｃＮＨ２、−ＣＯＯＨ、および−ＣＯＥから成る群から選択され、ＣＯＥは反応性エステルを表し、Ｒｄは、任意に置換されたフェニルまたは任意に置換されたピリジルであり、ＲｆはＨまたはアルキルであり、残りの変数は、代替実施形態１〜４９で定められた通りである。
第５１番目（５１）の代替実施形態では、代替実施形態５０のＣＯＥは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド・エステル、Ｎ−ヒドロキシ・スルホスクシンイミド・エステル、ニトロフェニル（例えば、２または４−ニトロフェニル）エステル、ジニトロフェニル（例えば、２，４−ジニトロフェニル）エステル、スルホ−テトラフルオロフェニル（例えば、４−スルホ−２，３，５，６−テトラフルオロフェニル）エステル、およびペンタフルオロフェニル・エステルから選択され、Ｒｄは、フェニル、ニトロフェニル（例えば、２または４−ニトロフェニル）、ジニトロフェニル（例えば、２または４−ニトロフェニル）、カルボキシニトロフェニル（例えば、３−カルボキシ−４−ニトロフェニル）、ピリジルまたはニトロピリジル（例えば、４−ニトロピリジル)から選択され、残りの変数は、代替実施形態１〜４９で定められた通りである。
第５２番目（５２）の代替実施形態では、第１３代替実施形態の化学療法薬は、経時的または連続的に前記哺乳動物に投与される。
第５３番目（５３）の代替実施形態では、第１３代替実施形態および代替実施形態５２は、癌、関節リウマチ、多発性硬化症、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、移植片拒絶反応、狼瘡、筋炎、感染症、および免疫不全から選択される病態を治療するためのものである。
第５４番目（５４）の代替実施形態では、第１３代替実施形態および代替実施形態５２の方法は、癌治療のためである。
第５５番目（５５）の代替実施形態では、第１３代替実施形態ならびに代替実施形態５２および５４は、癌治療のためであって、癌は、乳癌、結腸癌、脳腫瘍、前立腺癌、腎臓癌、膵臓癌、卵巣癌、頭頸部癌、黒色腫、結腸直腸癌、胃癌、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、精巣癌、メルケル細胞癌、神経膠芽腫、神経芽細胞腫、およびリンパ器官の癌から選択される。
別の実施形態では、式ＶのＭａｙＯ−Ａ−Ｙ−Ｍ’−ＢＦＣＧは、以下の式で表され；
Figure 2013542958
 式中、ＲｆはＨまたはアルキルであり；Ｑは−Ｏ−または−ＮＲ１００であり；Ｒ１００はＨまたはアルキルであり；Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、アミノ酸側鎖である。
本明細書で使用する「二官能性架橋試薬」という用語は、二つの反応性基を所有している試薬を指しており：そのうちの一つは、細胞結合剤と反応することができ、もう一つは、細胞傷害性剤と反応して、細胞結合剤と細胞傷害性剤とを連結することができ（例えば、式（ＶＩ）−（ＩＸ）の化合物）、よってコンジュゲートを形成する。
任意の好適な二官能性架橋試薬は、連結試薬が細胞傷害性などの治療効果の保持性を提供し、過度の傷害性を示すことなく、細胞傷害性および細胞結合性それぞれの目標特性を提供する限りにおいて、本発明との関連で使用され得る。連結分子は、（上記の）化学結合を介して、細胞傷害性剤を細胞結合剤と連結させ、細胞傷害性剤および細胞結合剤を互いに化学的にカップリング（例えば、共有結合）させることが好ましい。本発明の薬剤連結化合物を作成するために使用され得る二官能性架橋試薬にはまた、その全体が参照により本明細書に援用される、Thermo Scientific Pierce Crosslinking Technical Hおよびbookに記載のものも含まれる。
一つの実施形態では、二官能性架橋試薬には、非開裂性リンカーが含まれる。非開裂性リンカーは、細胞傷害性剤（例えば、式（ＶＩ）〜（ＩＸ）の化合物）を細胞結合剤に、安定的かつ共有結合的に連結することができる任意の化学的部分である。よって、細胞傷害性剤または細胞結合剤が活性状態のままである条件下では、非開裂性リンカーは、酸誘導開裂、光誘導開裂、ペプチダーゼ誘導開裂、エステラーゼ誘導開裂、およびジスルフィド結合開裂に対し、実質上抵抗性を示す。
細胞傷害性剤と細胞結合剤との間に非開裂性リンカーを形成する好適な架橋試薬は、当技術分野で周知である。一つの実施形態では、細胞傷害性剤は、チオエーテル結合を介して、細胞結合剤と連結する。非開裂性リンカーの例として、細胞傷害性剤と反応するためのマレイミドまたはハロアセタミド部分を有するリンカーが含まれる。かかる二官能性架橋試薬は、当技術分野で周知であり（米国特許出願第２０１０／０１２９３１４号、第２００９／０２７４７１３号、第２００８／００５０３１０号、第２００５／０１６９９３３号、第２００９／０２７４７１３号、第２０１０／０１２９３１４号、およびPierce Biotechnology社（P.O. Box 117, Rocklおよび, IL 61105, USA）から市販されている製品）、Ｎ−スクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）、Ｎ−スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシ−（６−カプロン酸アミド）（ＳＭＣＣ（ＬＣ−ＳＭＣＣ）の「長鎖」類似体）、κ−マレイミドウンデカン酸Ｎ−スクシンイミジル・エステル（ＫＭＵＡ）、γ−マレイミド酪酸Ｎ−スクシンイミジル・エステル（ＧＭＢＳ）、ε−マレイミドカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド・エステル（ＥＭＣＳ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド・エステル（ＭＢＳ）、Ｎ−（α−マレイミドアセトキシ）−スクシンイミド・エステル（ＡＭＡＳ）、スクシンイミジル−６−（β−マレイミドプロパンアミド）ヘキサノエート（ＳＭＰＨ）、Ｎ−スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）−ブチレート（ＳＭＰＢ）、およびＮ−（ｐ−マレイミドフェニル）イソシアネート（ＰＭＰＩ）が含まれるが、これらに限定されない。ハロアセチルベースの部分を含む架橋試薬には、Ｎ−スクシンイミジル−４−（ヨードアセチル）−アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）、Ｎ−スクシンイミジル・ヨード酢酸（ＳＩＡ）、Ｎ−スクシンイミジル・ブロモ酢酸（ＳＢＡ）、およびＮ−スクシンイミジル３−（ブロモアセトアミド）プロピオネート（ＳＢＡＰ）、ビス−マレイミドポリエチレングリコール（ＢＭＰＥＯ）、ＢＭ（ＰＥＯ）２、ＢＭ（ＰＥＯ）３、Ｎ−（β−マレイミドプロピロキシ）スクシンイミド・エステル（ＢＭＰＳ）、５−マレイミド吉草酸ＮＨＳ、ＨＢＶＳ、４−（４−Ｎ−マレイミドフェニル）−酪酸ヒドラジド・ＨＣｌ（ＭＰＢＨ）、スクシンイミジル−（４−ビニルスルホニル）ベンゾエート（ＳＶＳＢ）、ジチオビス−マレイミドエタン（ＤＴＭＥ）、１，４−ビス−マレイミドブタン（ＢＭＢ）、１，４−ビスマレイミディ（ビスマレイミジル）−２，３−ジヒドロキシブタン（ＢＭＤＢ）、ビス−マレイミドヘキサン（ＢＭＨ）、ビス−マレイミドエタン（ＢＭＯＥ）、スルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミド−メチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）、スルホスクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（スルホ−ＳＩＡＢ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド・エステル（スルホ−ＭＢＳ）、Ｎ−（γ−マレイミドブチルオキシ）スルホスクシンイミド・エステル（スルホ−ＧＭＢＳ）、Ｎ−（ε−マレイミドカプロイルオキシ）スルホスクシンイミド・エステル（スルホ−ＥＭＣＳ）、Ｎ−（κ−マレイミドウンデカノイルオキシ）スルホスクシンイミド・エステル（スルホ−ＫＭＵＳ）、スルホスクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（スルホ−ＳＭＰＢ）、ＣＸ１−１、スルホ−ＭａｌおよびＰＥＧｎ−Ｍａｌが含まれる。二官能性架橋試薬はＳＭＣＣであることが好ましい。
Figure 2013542958
一つの実施形態では、連結試薬は開裂性リンカーである。好適な開裂性リンカーの例として、ジスルフィドリンカー、酸不安定性リンカー、感光性リンカー、ペプチダーゼ不安定性リンカー、およびエステラーゼ不安定性リンカーが含まれる。リンカーを含有するジスルフィドは、ジスルフィド交換を介して開裂可能なリンカーであり、生理学的条件下で発生し得る。酸不安定性リンカーは、酸性ｐＨで開裂可能なリンカーである。例えば、エンドソームやリソソームなど、特定の細胞内区画は、酸性ｐＨ（ｐＨ４〜５）を有し、酸不安定性リンカーを開裂するのに好適な状況を提供する。感光性リンカーは、体表面および光にアクセス可能な体腔において有益である。さらに、赤外線は組織に浸透する。ペプチダーゼ不安定性リンカーは、細胞内または細胞外の特定のペプチドを開裂するのに使用することができる（Trouet et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79: 626-629 (1982), および Umemoto et al., Int. J. Cancer, 43: 677-684 (1989)）。一つの実施形態では、開裂可能なリンカーは、例えば、細胞傷害性剤の活動に影響が及ばない細胞内の条件下など、穏やかな条件下で開裂される。
別の実施形態では、細胞傷害性剤は、ジスルフィド結合を介して細胞結合剤と連結する。連結分子には、細胞結合剤と反応し得る化学反応性基が含まれる。細胞結合剤と反応する好ましい化学反応性基は、Ｎ−スクシンイミジル・エステルおよびＮ−スルホスクシンイミジル・エステルである。さらに、リンカー分子には、細胞傷害性剤と反応してジスルフィド結合を形成し得る反応性化学基、好ましくはジチオピリジル基が含まれる。ジスルフィド結合を介して細胞結合剤を細胞傷害性剤と連結することができる二官能性架橋試薬は、当技術分野で既知であり、例えば、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）（例えば、Carlsson et al., Biochem. J., 173: 723-737 (1978)を参照）、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ブタノエート（ＳＰＤＢ）（例えば、米国特許第４，５６３，３０４号を参照）、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ペタノエート（ＳＰＰ）（例えば、CAS Registry number 341498-08-6を参照)、およびＮ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）２−スルホ・ブタノエート（スルホ−ＳＰＤＢ）（例えば、米国特許出願第２００９／０２７４７１３号を参照）がある。ジスルフィド基を導入するのに使用され得るその他の二官能性架橋試薬は、当技術分野で既知であり、その全体が参照により本明細書に援用される米国特許第６，９１３，７４８号、第６，７１６，８２１号および米国特許出願公開第２００９／０２７４７１３号および第２０１０／０１２９３１４号に記載されている。
Figure 2013542958
非開裂性リンカーを形成する、硫黄原子を含まないその他の架橋試薬もまた、本発明の方法で使用され得る。かかるリンカーは、ジカルボン酸ベースの部分から派生され得る。好適なジカルボン酸ベースの部分には、一般式（ＩＸ）
ＨＯＯＣ−Ｘｌ−Ｙｎ−Ｚｍ−ＣＯＯＨ （ＩＸ）
のα，ω−ジカルボン酸が含まれるが、これに限定されず、
式中、Ｘは、２〜２０個の炭素原子を有する直鎖状もしくは分岐状アルキル基、アルケニル基、またはアルキニル基であり、Ｙは、３〜１０個の炭素原子を担持するシクロアルキル基またはシクロアルケニル基であり、Ｚは、６〜１０個の炭素原子を担持する置換もしくは非置換芳香族基、または置換もしくは非置換複素環式基であり、ヘテロ原子はＮ、Ｏ，またはＳから選択され、ｌ、ｍ、およびｎは０または１であり、但し、ｌ、ｍ、ｎがすべて同時に０（ゼロ）になることはない。
本明細書の非開裂性リンカーの多くは、米国特許出願公開第２００５／０１６９９３３（Ａ１）号明細書に詳細が記載されている。
一つの実施形態では、式ＶＩＩのＢＦＣＧ’−Ｚ’は、以下の構造式により表され：
Figure 2013542958
Figure 2013542958
 式中、ｑは１〜５の整数であり；ｎは２〜６の整数であり；ＤはＨまたはＳＯ３Ｍであり；ＭはＨまたはＮａ＋またはＫ＋などの陽イオンである。ＢＦＣＧ’−Ｚ’は、式（ａ１）、（ａ４）、（ａ８）、（ａ９）および（ａ１０）により表されることがさらに好ましい。
「連結基」は、二官能性架橋試薬と反応し得る化合物、誘導体化されたマイタンシノールもしくはマイタンシノール類似体（例えば、式ＶＩ〜ＩＸの化合物）を含む化合物、または化学的結合を形成し得る細胞結合剤を含む化合物上の官能基である。
二つの部分、例えば、細胞結合剤または誘導体化されたマイタンシノールもしくはマイタンシノール類似体（例えば、式ＶＩ〜ＩＸの化合物）を含む化合物などの生物活性部分、または連結基などの反応性部分は、生物活性および／または反応性が実質上維持されるよう、化学結合もしくはその他の基により接続する時「連結」される。例えば、ＭａｙＯ−Ａ−および細胞結合剤は、構造式（ＩＩＩ）のＹ−Ｍ’−ＢＦＣＧにより連結される。前記二つの部分を接続する基は、本明細書では「リンカー」と称され、構造式（Ｖ）のＹ−Ｍ’−ＢＦＣＧのことである。
「残基」は、化合物の反応性官能基が第２の化合物と反応および結合した後に化合物内に残った原子のことである。同様に、反応後に残った第２の化合物の原子は、第２化合物の残基である。
「自己犠牲部分」という用語は、二つの化学的部分を、通常は安定している三分裂分子に共有結合的に連結することができる二官能性化学的部分を指している。自己犠牲的部分は、第１の部分への結合が開裂されれば、第２の部分から自発的に分離することができる。自己犠牲部分には、米国特許第７，７５０，１１６号および第７，７０５，０４５号ならびに米国特許出願第２０１０／００６２００８号に記載されているそのような部分が含まれるが、これに限定されない。一つの実施形態では、自己犠牲部分は、ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル（ＰＡＢＣ）である。代替的に、自己犠牲部分は、カルボニル基を含む構造ｐ−ＮＨ−Ｐｈ−ＣＨ＝Ｃ（ＣＨ２Ｏ）２を有する、ｐ−アミノ−ビス（ヒドロキシメチル）スチレン（ＢＨＭＳ）であり、構造はｐ−ＮＨ−Ｐｈ−ＣＨ＝Ｃ（ＣＨ２ＯCO）２である。
「遮断される（ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｅｄ）」と「担持する（ｂｅａｒｉｎｇ）」は、本明細書では同義に使用される。これらの用語は、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキルおよびヘテロシクリルアルキル基の一つまたは複数のメチレン基が、ポリエチレンユニット、アジリジン基、エポキシ基、アミノ基、アミド基、エステル基、アリール基およびヘテロシクリル基など、特異的な基により置換されるという意味である。
直鎖状または分岐状アルキルは、飽和直鎖または分岐鎖の一価炭化水素ラジカルであり、好ましくは１〜１０個の炭素原子を有している。好適な直鎖アルキルの例として、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、およびヘキシルが含まれる。好適な分岐アルキルの例として、イソプロピル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソペンチル、および１−エチル−プロピルが含まれる。直鎖および分岐アルキル基は、以下に記載の通り、一つまたは複数の置換基で置換されてもよい。
直鎖状または分岐状アルケニルは、直鎖または分岐鎖の一価炭化水素ラジカルであり、好ましくは、少なくとも一つの不飽和部位、すなわち、炭素−炭素、二重結合を持つ２〜１０個の炭素原子を有し、アルケニル基には、“ｃｉｓ”配置および“ｔｒａｎｓ”配置、または、“Ｅ”配置および“Ｚ”配置を有するラジカルが含まれる。好適な直鎖アルケニルの例として、エチレニルまたはビニル（−ＣＨ＝ＣＨ２）、アリル（−ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２）、プロペニル、ブテニル、ペンテニル、ヘキセニル、ペンタジエニルおよびヘキサジエニルが含まれる。好適な分岐アルケニルの例として、イソブチル、イソペンテニルおよびイソヘキセニルである。好ましいアルケニル基は、ビニル基、アリル基およびイソブテニル基である。直鎖および分岐アルケニル基は、以下に記載の通り、一つまたは複数の置換基で置換されてもよい。
直鎖状または分岐状アルケニルは、直鎖状または分岐状の一価炭化水素ラジカルであり、好ましくは、少なくとも一つの不飽和部位、すなわち、炭素−炭素、三重結合を持つ２〜１０個の炭素原子を有する。好適なアルキニルの例として、エチニル、プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル、１−ペンチニル、２−ペンチニル、３−ペンチニル、ヘキシニルなどが含まれる。直鎖および分岐アルキニル基は、以下に記載の通り、一つまたは複数の置換基で置換されてもよい。
環状アルキル、環状アルケニルおよび環状アルキニルは、一価非芳香族の飽和または一部不飽和の環であり、好ましくは、単環式環として３〜１２個の炭素原子を有し、または二環式環として７〜１２個の炭素原子を有する。環状アルキル、アルケニルおよびアルキニルの例として、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロへキセニル、シクロヘキサジエニル、シクロブチニル、シクロペンチニルおよびシクロヘキシニルが含まれる。好ましい環状アルキル、アルケニル、アルキニル基には、シクロプロピル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロペンテニル、シクロへキセニル、シクロヘキサジエニルおよびシクロヘキシニルおよびシクロオクチニルが含まれる。環状アルキル基、アルケニル基およびアルキニル基は、以下に記載の通り、一つまたは複数の置換基で置換されてもよい。
ＲおよびＲ’により表されるアルキル、アルケニルおよびアルキニルの好ましい置換基には、スルホン酸基、ホスホン酸、カルボキシル基、カルボキシルエステル、例えば、メチルまたはエチルエステルなど、および第一アミン、第二アミン、第三アミンまたは第四アミンから選択される一つまたは複数が含まれる。好ましいのは、メチル基、エチル基、プロピル基およびイソプロピル基である。ＹおよびＹ’で表されるアルキル、アルケニルおよびアルキニルのための好ましい置換基には、ハロゲン、メトキシ基、エトキシ基もしくはフェノキシ基などのアルコキシ基またはアリールオキシ基、Ｓ−メチル、Ｓ−エチルおよびＳ−フェニルなどの硫化物、Ｓ−アセチルなどのチオエステル、メチルスルホキシドまたはフェニルスルホキシドなどのスルホキシド、メチルスルホンまたはフェニルスルホンなどのスルホン、スルホンアミド、アルデヒド、アセチルまたはベンゾイルなどのケトン、エチレンオキシドなどのエポキシド、エピスルフィド、アセトアミドまたはベンゾアミドなどのアミド部分、第一アミノ基、第二アミノ基、第三アミノ基もしくは第四アミノ基またはアルキルアミノ基もしくはアリールアミノ基、例えば、メチルアミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノもしくはトリエチルアミノなど、ヒドラジノ、スルホン酸、カルボキシル基、メチルエステルまたはエチルエステルなどのカルボキシエステル、カルボキサミド、ウレイド基、リン酸基、ニトロ基、アジド基、シアノ基、およびシアネートから選択される一つまたは複数が含まれる。
アリール基または芳香族基は、一価の芳香族炭化水素ラジカルであり、好ましくは、６〜１８個の炭素原子を有する。アリール基または芳香族基には、飽和環、部分不飽和環、または芳香族炭素環式環または複素環式環と融合する芳香族環を含む二環式ラジカルが含まれる。置換アリールの例として、フェニル、ナフチルおよびアントラセニルが含まれる。
アリール基または芳香族基は、置換されてもよい。ＲおよびＲ’で表されるアリール基または芳香族基は、１〜４個の炭素原子を含有する少なくとも一つのアルキル基またはアルケニル基、メトキシもしくはエトキシなどのアルコキシ基、ハロゲン、ニトロ基、スルホン酸基、ホスホン酸、カルボキシル、メチルエステルもしくはエチルエステルなどのカルボキシエステル、第一アミン、第二アミン、第三アミンもしくは第四アミン、またはメトキシもしくはエトキシなどのアルコキシで置換されることが好ましい。ＹまたはＹ’で表されるアリール基または芳香族基は、少なくとも一つのハロゲン、メトキシ、エトキシもしくはフェノキシなどのアルコキシ基またはアリールオキシ基、Ｓ−メチル、Ｓ−エチルおよびＳ−フェニルなどの硫化物、Ｓ−アセチルなどのチオエステル、メチルスルホキシドまたはフェニルスルホキシドなどのスルホキシド、メチルスルホンまたはフェニルスルホンなどのスルホン、スルホンアミド、アルデヒド、アセチルまたはベンゾイルなどのケトン、エチレンオキシドなどのエポキシド、エピスルフィド、アセトアミドまたはベンゾアミドなどのアミド部分、メチルアミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノもしくはトリエチルアミノなど、第一アミノ基、第二アミノ基、第三アミノ基もしくは第四アミノ基またはアルキルアミノ基もしくはアリールアミノ基、ヒドラジノ、スルホン酸、カルボキシル基、メチルエステルまたはエチルエステルなどのカルボキシエステル、カルボキサミド、ウレイド基、リン酸基、ニトロ基、アジド基、シアノ基、またはシアネートで置換されることが好ましい。置換アリール基または芳香族基の好ましい例として、ニトロフェニル、ジニトロフェニル、クロロフェニル、およびメトキシフェニル、トルイル、およびアニリンが含まれる。
複素環式基またはヘテロシクリルは、飽和、一部不飽和または芳香族の炭素環式ラジカルで、好ましくは３〜１８個の環原子を有し、少なくとも一つの環原子は、窒素、酸素、リンおよび硫黄から選択されるヘテロ原子であり、一つまたは複数の環原子は、以下に記載の一つまたは複数の置換基と、独立して、任意に置換されるものを指している。複素環式基は、単環基でもよく、好ましくは３〜７員環（２〜６個の炭素原子およびＮ、Ｏ、ＰおよびＳから選択される１〜４個のヘテロ原子）であるか、または二環基であり、好ましくは７〜１０員環（４〜９個の炭素原子およびＮ、Ｏ、ＰおよびＳから選択される１〜６個のヘテロ原子）である。複素環式環に関しては、Paquette, Leo A.; "Principles of Modern Heterocyclic Chemistry" (W. A. Benjamin, New York, 1968)（特に、第１章、３章、４章、６章、７章および９章）；"The Chemistry of Heterocyclic Compounds, A series of Monographs" (John Wiley & Sons, New York, 1950 to present)（特に、Ｖｏｌ．１３、１４、１６、１９および２８；ならびに J. Am. Chem. Soc. (1960) 82:5566に記載されている。最も好ましくは、複素環式環は、Ｎ、ＯまたはＳから選択される一つまたは複数のヘテロ原子を含有する、３〜１０員環系を有する環状化合物である。複素環式基の例として、ピロリジニル、テトラヒドロフラニル、ジヒドロフラニル、テトラヒドロチエニル、テトラヒドロピラニル、ジヒドロピラニル、ピペリジノ、モルホリノ、ピペラジニル、オキセタニル、チエタニル、ピロリニル、インドリニル、２Ｈ−ピラニル、４Ｈ−ピラニル、ジオキサニル、ピラゾリニル、ジチアニル、ピペリジノピペリジニル、複素環芳香族基、例えば、ピペリジニル、イミダゾリル、ピリミジニル、ピラゾリル、トリアゾリル、ピラジニル、テトラゾリル、フリル、チエニル、イソオキサゾリル、チアゾリル、オキサゾリル、イソチアゾリル、ピロリル、キノリニル、イソキノリニル、インドリル、ベンゾイミダゾリルおよびベンゾフラニルが含まれる。一つの実施形態では、ヘテロシクリル基は、任意に置換されたピペラジニル基または任意に置換されたピペリジノピペリジニル（例えば、４−ピペリジノピペリジニル）基である。
複素環式基は、１〜４個の炭素原子を含有するアルキルもしくはアルケニル、または、メトキシもしくはエトキシなどのアルコキシから選択される一つまたは複数の置換基で、あるいはハロゲン、Ｓ−メチル、Ｓ−エチルおよびＳ−フェニルなどの硫化物、Ｓ−アセチルなどのチオエステル、メチルスルホキシドまたはフェニルスルホキシドなどのスルホキシド、メチルスルホンまたはフェニルスルホンなどのスルホン、スルホンアミド、アルデヒド、アセチルまたはベンゾイルなどのケトン、エチレンオキシドなどのエポキシド、エピスルフィド、アセトアミドまたはベンゾアミドなどのアミド部分、第一アミノ基、第二アミノ基、第三アミノ基もしくは第四アミノ基またはアルキルアミノ基もしくはアリールアミノ基、例えば、メチルアミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノもしくはトリエチルアミノなど、ヒドラジノ、スルホン酸、カルボキシル基、メチルエステルまたはエチルエステルなどのカルボキシエステル、カルボキサミド、ウレイド基、リン酸基、ニトロ基、アジド基、シアノ基、またはシアネートで任意に置換されてもよい。
本発明に有益なペプチド類は、短いアミノ酸ユニットであり、好ましくは、Ｎ−アルキルアミノ酸、例えば、Ｎ−メチルアミノ酸を含む天然または非天然のアミノ酸で構成される２〜１０個のアミノ酸ユニットであり、またＬ−異性体、Ｄ−異性体またはそのラセミアミノ酸である。好適なペプチド類の例として、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチドおよびペンタペプチドが含まれる。好ましいペプチド類には、バリン−シトルリン、ａｌａ−ｐｈｅ、ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ、ａｌａ−ｌｅｕ−ａｌａ−ｌｅｕ、ａｌａ−ｌｅｕ−ａｌａ−ｌｅｕ−β−ａｌａが含まれる。
好適なハロゲン類には、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩが含まれる。
薬学的に許容可能な塩は、本発明の化合物の、薬学的に許容可能なな有機または無機塩である。例示的塩には、硫酸塩、乳酸塩、サリチル酸塩、酸性クエン酸塩、酒石酸塩、アスコルビン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ゲンチシネート（ｇｅｎｔｉｓｉｎａｔｅ）、フマル酸塩、グルコン酸塩、グルクロン酸、ギ酸、ベンゾエート、グルタミン酸、メタンスルホネート「メシル酸」、エタンスルホネート、ベンゼンスルホネート、ｐ−トルエンスルホン酸塩、塩、アルカリ金属（例えば、ナトリウムおよびカリウム）塩、アルカリ土類金属（例えば、マグネシウム）塩、およびアンモニウム塩が含まれるが、これらに限定されない。薬学的に許容可能なな塩として、酢酸イオン、コハク酸イオンまたは他の対イオンなど、別の分子を含有してもよい。対イオンは、親化合物上で電荷を安定させる、任意の有機または無機部分であってもよい。さらに、薬学的に許容可能なな塩は、その構造に複数の荷電原子を有してもよい。複数の荷電原子が薬学的に許容可能なな塩の一部である場合には、複数の対イオンを有することができる。よって、薬学的に許容可能な塩は、一つもしくは複数の荷電原子および／または一つもしくは複数の対イオンを有することができる。
本発明の化合物が塩基である場合、薬学的に許容される所望の塩は、当技術分野で利用可能な任意の適切な方法、例えば、遊離塩基の無機酸（塩酸、臭化水素 酸、硫酸、硝酸、メタンスルホン酸、リン酸など）による処理、あるいは有機酸（酢酸、マレイン酸、コハク酸、マンデル酸、フマル酸、マロン酸、ピルビン酸、シュウ酸、グリコール酸、サリチル酸など）、ピラノシジル酸（グルクロン酸またはガラクツロン酸など）、αヒドロキシ酸（クエン酸または酒石酸など）、アミノ酸（アスパラギン酸またはグルタミン酸など）、芳香族酸（安息香酸またはケイ皮酸など）、スルホン酸（ｐ−トルエンスルホン酸またはエタンスルホン酸など）、あるいは同様のものなど）による処理によって調製してもよい。
本発明の化合物が酸である場合、薬学的に許容される所望の塩は、任意の適切な方法、例えば、遊離酸の無機または有機塩基（アミン（第一級、第二級もしくは第三級）、アルカリ金属水酸化 物もしくはアルカリ土類金属水酸化物、
または同様のものなど）による処理によって調製してもよい。適切な塩の実例として、アミノ酸由来の有機塩（グリシンおよびアルギニンなど）、アンモニア、第一級、第二級、および第三級アミン、ならびに環状アミン（ピペリジン、モルホリンおよびピペラジンなど）、ならびにナトリウム、カルシウム、カリウム、マグネシウム、マンガン、鉄、銅、亜鉛、アルミニウムおよびリチウム由来の無機塩が挙げられるが、これらに限定されない。
溶媒和物とは、水、イソプロパノール、アセトン、エタノール、メタノール、ヘキサン、ヘプタン、ジメチルアセトアミド、酢酸エチル、酢酸、エタノールアミン、ジクロロエタン、２−プロパノールなど、非共有結合性の分子間力によって結合された、化学量論的または非化学量論的な量の溶媒をさらに含む化合物である。本化合物の溶媒和物または水和物は、メタノール、エタノール、ｌ−プロパノール、２−プロパノールなどのヒドロキシ溶媒または水を前記化合物に、少なくとも１モル当量加えることで容易に調製できる。
（アンサマイトシン誘導体の合成）
本発明は、Ｃ３ヒドロキシル、Ｃ１-４ヒドロキシメチル、Ｃ-１５ヒドロキシ、またはＣ-２０デスメチルが、官能基を担持するエステル、カルバマート、炭酸塩またはエーテルに変換し、細胞結合剤と反応してコンジュゲートを生じさせるアンサマイトシン誘導体を産生する方法を提供する。好適な官能基は、ジスルフィド、チオール、アルコール、カルボキシル、カルボニル、アミン、ヒドラジド、マレイミド、アジド、ハロゲン、メタンスルホン酸などのスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸およびパラトルエンスルホン酸、ビニルピリジン、ビニルスルホン、ビニルスルホンアミド、スルホン酸、スルホニルクロリド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、ニトロまたはジニトロフェニルなどの反応性カルボキシエステル、ペンタフルオロフェニル、スルホテトラフルオロフェニル、フタルイミジルである。これらの官能基は、ジスルフィド結合、チオエーテル結合、ペプチド結合、アミド結合、エステル結合またはヒドラゾン結合を介して細胞結合剤と連結を形成する。
アンサマイトシンエステル誘導体は、マイタンシノールを、細胞結合剤に連結するのに好適な官能基をも担持するカルボン酸化合物でエステル化することにより調製する。かかる側鎖の合成を図４に示す。エステル化反応は、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、４，４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）またはＺｎＣｌ２などの触媒の存在下でのジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）または１−［（３−ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）など、当技術分野で既知のカップリング剤を利用する。異なる連結基を担持するアンサマイトシンエステルの合成を図５〜１３に示す。
鎖の長さが様々であるエステルを担持するチオール−含有アンサマイトシン誘導体６（図５）、５５（図１３a）および５８（図１３ｂ）が、以下のように合成された。異なるカルボン鎖長および分岐を有するメルカプト−カルボン酸を調製し、対応するメチルジスルフィドに変換した。これらのカルボン酸によるマイタンシノールのエステル化は、ＤＣＣ／ＤＭＡＰの存在下でスムーズに行われ、メチルジチオ・アンサマイトシンを提供した。ジスルフィドをジチオトレイトール（ＤＴＴ）で還元すると、チオール含有アンサマイトシン６、５５および５８が提供された。
細胞結合剤と連結させるためにＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルまたはＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルを担持するアンサマイトシン誘導体１３ａ，ｂを、図１１に示すとおりに調製した。ヘキサン−１，６−ジオイック酸は、ＴＥＯＣを有する二つのカルボキシル基の一つで部分的に保護された。マイタンシノールのエステル化により、保護されたカルボキシル基を担持するアンサマイトシンエステル誘導体が提供された。フッ化テトラブチルアンモニウムでＴＥＯＣ基を脱保護化すると、カルボキシアンサマイトシン誘導体１４ｂが提供された。Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドまたはＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミドで濃縮すると、細胞結合剤と連結させるための反応性エステルを担持するアサトマイシン誘導体１３ａ，ｂが提供された。
アンサマイトシンカルバマート誘導体は、マイタンシノールを４−ニトロフェニルクロロ炭酸塩などのクロロ炭酸塩と反応させ、その後、ジスルフィド部分など、細胞結合剤と反応する官能基をも担持するアミノ化合物と反応させることにより調製される。代替方法を図１２bに示す。
アンサマイトシン炭酸塩誘導体は、マイタンシノールをボスゲンと反応させ、その後、ジスルフィド部分など、細胞結合剤と反応する官能基をも担持するヒドロキシ化合物と反応させることにより調製される。代替方法を図１２ｂに示す。
アンサマイトシンエーテル誘導体を、図１２ａに示す通りに調製する。マイタンシノールを、水素化ナトリウム、ｎ−ブチルリチウム、亜鉛トリフレート／ジイソプロピルエチルアミン、またはリチウムヘキサメチルジシラジドなどの塩基（好適な塩基に関しては、明示的に参照により本明細書に援用される米国特許第７，５９８，３７５号および第７，３０１，０１９号を参照）で処理し、その後、細胞結合剤との反応のための官能基をも担持する、ハロゲンまたはスルホン酸塩（例えば、メタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、またはパラトルエンスルホン酸塩）含有化合物と反応させる。
エステル、カルバマート、炭酸塩を調製する別の一般的方法は、当技術分野で既知である（例えば、明示的に参照により本明細書に援用される、March’s Advanced Organic Chemistry, Jerry March & Michael B. Smith, Wiley 2007を参照）。
（アンサマイトシン誘導体のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性）
本発明のアンサマイトシン誘導体のＩｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性は、先行開示された方法（米国特許第７，２７６，４９７号、およびWiddison et al., J. Med. Chem., 49; 4392, 2006、両者とも明示的に参照により本明細書に援用される）により測定できる。例えば、ヒト乳癌細胞株ＳＫ−Ｂｒ−３またはヒト類表皮癌細胞株ＫＢなどの細胞株を使用して、これら新規アンサマイトシン誘導体の細胞傷害性の評価をする。評価対象の細胞を７２時間、前記化合物に曝露し、生き残った細胞断片を既知の方法によるダイレクトアッセイで測定した。アッセイの結果からＩＣ５０値を計算する。
（細胞結合剤）
本発明のそのアンサマイトシン誘導体またはそのコンジュゲートの治療剤としての効果は、適切な細胞結合剤を慎重に選択することに依る。細胞結合剤は、現在知られている任意の種類でもよく、または既知のものでペプチドおよび非ペプチドを含むものでもよい。一般に、これらは抗体（特に、モノクロナール抗体）、リンホカイン、ホルモン、成長因子、ビタミン、栄養素輸送分子（トランスフェリンなど）、または任意の他の細胞結合分子もしくは物質であり得る。
使用され得る細胞結合剤のより具体的な例として、
ポリクロナール抗体；
モノクロナール抗体；
Ｆａｂ、Ｆａｂ’、およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｖ（Parham, J. Immunol. 131:2895-2902 (1983); Spring et al. J. Immunol. 113:470-478 (1974); Nisonoff et al. Arch. Biochem. Biophys. 89:230-244 (1960)）；ミニ抗体（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）、三重特異性抗体（ｔｒｉｂｏｄｙ）、四重特異性抗体（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）、プロ抗体（ｐｒｏｂｏｄｙ）、ドメイン抗体（ｄｏｍａｉｎ ｂｏｄｙ）、ユニ抗体（ｕｎｉｂｏｄｙ）、ミニ抗体（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）（Kim et al., Mol, Cancer Ther., 7 : 2486-2497 (2008), Carter, Nature Revs., 6 : 343-357 (2006), R. Kontermann & S. Dubel, 2001 Antibody Engineering, Springer-Verlag, Heidelberg-New Yorkを参照）などの抗体断片；
二重特異性抗体（Morrison, SL Nature biotechnology 25 (11): 1233-4 (2007));
アンキリン反復タンパク質（DARPins; Zahnd et al., J. Biol. Chem., 281, 46, 35167-35175, (2006); Binz, H.K., Amstutz, P. & Pluckthun, A. (2005) Nature Biotechnology, 23, 1257-1268)、または、例えば米国特許出願公開第２００７／０２３８６６７号、米国特許第７，１０１，６７５号および国際公開第2007/147213号および第2007/062466号に記載のアンキリン様反復タンパク質または合成ペプチド；
インターフェロン（例えば、α、β、γ）
ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６などのリンホカイン；
インスリン、ＴＲＨ（甲状腺刺激ホルモン放出ホルモンが）、ＭＳＨ（メラニン細胞刺激ホルモン）、ステロイドホルモン（アンドロゲンおよびエストロゲンなど）などのホルモン；
ＥＧＦ、ＴＧＦ−α、ＦＧＦ、ＶＥＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦなどの成長因子およびコロニー刺激因子（Burgess, Immunology Today 5:155-158 (1984)）；
トランスフェリン（O'Keefe et al. J. Biol. Chem. 260:932-937 (1985)）；ならびに
葉酸塩などのビタミン；
が含まれる。
モノクロナール抗体技術により、特異性モノクロナール抗体の形態で極端に特異的な細胞結合剤の製造が可能となる。特に、マウス、ラット、ハムスターまたはその他の哺乳動物を、インタクトな標的細胞など、対象の抗原、すなわち、全ウイルス、弱毒化ウイルス全体、およびウイルスコートタンパク質などのウイルスタンパク質から単離された抗原で免役することにより産生されるモノクロナール抗体の作製技術は、当技術分野で周知である。感作ヒト細胞も使用できる。モノクロナール抗体の別の作製方法は、ｓｃＦｖ（単鎖変数領域）のファージライブラリー、具体的にヒトｓｃＦｖの利用である（例えば、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら、米国特許第５，８８５，７９３号および第５，９６９，１０８号；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、国際公開第９２／０１０４７号；Ｌｉｍｉｎｇら、国際公開第９９／０６５８７号を参照）。さらに、米国特許第５，６３９，６４１号に開示されている表面再構成抗体も、キメラ抗体およびヒト化抗体と同様、使用してもよい。適切な細胞結合剤の選択は、標的とする特定の細胞集団により異なるが、もし適切なものがあれば、一般的なヒトモノクロナール抗体が好ましい。
例えば、モノクロナール抗体ＭＹ９は、ＣＤ３３抗体に特異的に結合するネズミＩｇＧ１抗体であり（J.D. Griffin et al 8 Leukemia Res., 521 (1984)）、もし標的細胞が、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の疾患と同様にＣＤ３３を発現するなら、使用することができる。同様に、モノクロナール抗体の抗−Ｂ４は、Ｂ細胞のＣＤ１９抗体に結合するネズミＩｇＧ１であり（Nadler et al, 131 J. Immunol. 244-250 (1983)）、標的細胞が、非ホジキンリンパ腫または慢性リンパ芽球性白血病などのように、本抗原を発現するＢ細胞または疾患細胞であれば、使用することができる。Ｈｕ−Ｂ４は、ネズミ抗Ｂ−４抗体から派生した表面再構成抗体である（Roguska et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci., 91, pg 969-973）。ＨｕＮ９０１は、肺小細胞癌、多発性骨髄腫、卵巣癌、および神経内分泌癌を含む他の固形腫瘍に発現するＣＤ５６抗原に結合するヒト化抗体である（Roguska et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci., 91, pg 969-973）。Ｂ３８．１は、ＥｐＣＡＭを標的とするキメラ抗体である。いくつかの固形腫瘍に発現するＥＧＦ受容体を標的とするパニツムマブなどの完全ヒト抗体を使用してもよい（Van Cutsem et al., J Clin Oncol. 2007;25(13):1658-1664）。トラスツズマブおよびペルツズマブなどの抗−ｅｒｂＢ抗体もまた使用できる（Nahta et al., 2004, Cancer Research 64:2343-2346）。
細胞結合剤が抗体である場合、ポリペプチドである抗原と結合し、膜貫通分子（例えば、受容体）か、または成長因子などのリガンドであってもよい。例示的抗原には、レニンなどの分子；ヒト成長ホルモンおよびウシ成長ホルモンなどの成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク質；α−１−アンチトリプシン；インスリンA鎖；インスリンＢ鎖；プロインスリン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴン；要因vmc、第ＩＸ因子、組織因子（ＴＦ）、およびフォンウィルブランド因子などの凝固因子；プロテインＣなどの抗凝固因子；心房性ナトリウム利尿因子；肺界面活性剤；ウロキナーゼまたはヒト尿または組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）などのプラスミノーゲン活性化因子；ボンベシン；トロンビン；造血成長因子；腫瘍壊死因子−αおよび−β；エンケファリナーゼ；ＲＡＮＴＥＳ（正常T細胞発現と分泌の活性化制御）；ヒトマクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ−１−α）；ヒト血清アルブミンなどの血清アルブミン；ミューラー阻害物質；リラキシンＡ鎖；リラキシンＢ鎖；プロレラキシン；マウス性腺刺激ホルモン関連ペプチド；β−ラクタマーゼなどの微生物タンパク質；ＤＮアーゼ；ＩｇＥ；ＣＴＬＡ−４などの細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原（ＣＴＬＡ）；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子（VEGF）；ホルモンまたは成長因子に対する受容体；タンパク質AまたはＤ；リウマチ因子；骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３、−４、−５または−６（ＮＴ−３、ＮＴ４、ＮＴ−５、またはＮＴ−６）などの神経栄養因子；または、ＮＧＦ−βなどの神経成長因子；血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）；ａＦＧＦおよびｂＦＧＦなどの線維芽細胞増殖因子；線維芽細胞増殖因子受容体２（ＦＧＦＲ２）、上皮成長因子（ＥＧＦ）；ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４、またはＴＧＦ−β５を含む、ＴＧＦ−αおよびＴＧＦベータなどのトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）；インスリン様成長因子−IおよびＩＩ（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）； ｄｅｓ（１−３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様成長因子結合タンパク質、ＥｐＣＡＭ、ＧＤ３、ＦＬＴ３、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＳＴＥＡＰ、ＣＥＡ、ＴＥＮＢ２、ＥｐｈＡ受容体、ＥｐｈＢ受容体、葉酸受容体、ＦＯＬＲ１、メンセリン、クリプト（ｃｒｉｐｔｏ）、αｖβ６、インテグリン、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ、トランスフェリン受容体、ＩＲＴＡ１、ＩＲＴＡ２、ＩＲＴＡ３、ＩＲＴＡ４、ＩＲＴＡ５； ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ８、ＣＤ１１、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２６、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３６、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ５９、ＣＤ７０、ＣＤ７９、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ１０３、ＣＤ１０５、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１３８、ＣＤ１５２などのＣＤタンパク質、または、その全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２００８／０１７１０４０号もしくは米国特許出願公開第２００８０３０５０４４号に開示されている、一つもしくは複数の腫瘍関連抗原もしくは細胞表面受容体に結合する抗体；エリスロポエチン; 骨誘導因子；イムノトキシン；骨形成タンパク質（ＢＭＰ）；インターフェロン−α、−β、および−γなどのインターフェロン；例えば、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦなどのコロニー刺激因子（ＣＳＦｓ）；ＩＬ−１〜ＩＬ−１０などのインターロイキン（ＩＬs）；スーパーオキシドジスムターゼ；Ｔ細胞受容体；表面膜タンパク質；崩壊促進因子；例えば、ＨＩＶエンベロープの一部などのウイルス抗原；輸送タンパク質；ホーミング受容体；アドレシン；調節タンパク質；ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂを、ＣＤ１１ｃは、ＣＤ１８、ＩＣＡＭ、ＶＬＡ−４およびＶＣＡＭなどのインテグリン；ＨＥＲ２、ＨＥＲ３またはＨＥＲ４受容体などの腫瘍関連抗原；エンドグリン、c−Ｍｅｔ、ｃ−ｋｉｔ、１ＧＦ１Ｒ、ＰＳＧＲ、ＮＧＥＰ、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＬＧＲ５、Ｂ７Ｈ４、ＴＡＧ７２（腫瘍関連糖タンパク質７２）、5T4 (Bogharert et al., International J. of Oncology 32: 221-234, 2008)、および上記に挙げた任意のポリペプチド類の断片が含まれる。
さらに、骨髄細胞に結合するＧＭ−ＣＳＦを、急性骨髄性白血病由来の疾患細胞に対する細胞結合剤として使用することもできる。活性化Ｔ細胞に結合するＩＬ−２は、移植片拒絶の予防のため、移植片対宿主病の治療および予防のため、ならびに急性Ｔ細胞白血病の治療のために使用することができる。メラノサイトに結合するＭＳＨは、メラノーマの治療のために使用することができる。葉酸は、卵巣癌および他の腫瘍上に発現する葉酸受容体の標的化に使用することができる。上皮成長因子は、肺および頭頸部扁平上皮癌などを標的とするために使用することができる。ソマトスタチンは、神経芽細胞腫、その他の腫瘍型を標的とするために使用することができる。
乳癌および精巣癌は、それぞれエストロゲン（もしくはエストロゲン類似体）またはアンドロゲン（もしくはアンドロゲン類似体）を細胞結合剤として、うまく標的化することができる。
別の実施形態では、細胞結合剤は、ｈｕＮ９０１、ｈｕＭｙ９−６、ｈｕＢ４、ｈｕＣ２４２、トラスツズマブ、ビバツズマブ、シブロツズマブ、リツキシマブ、ＣＮＴＯ９５、ｈｕＤＳ６、国際公開第２０１０／１２４７９７号に記載の抗メソテリン抗体（ＭＦ−Ｔなど）、米国特許出願公開第２０１０／００９３９８０号に記載の抗−クリプト抗体（ｈｕＢ３Ｆ６など）、米国特許出願公開第２００７／０１８３９７１号に記載の抗ＣＤ１３８抗体（ｈｕＢ−Ｂ４など）、米国特許第７，７３６，６４４号および第７，６２８，９８６号ならびに米国特許出願公開第２０１０／０１１１９７９号、第２００９／０２４００３８号、２００９／０１７５８８７号、第２００９／０１５６７９０号および第２００９／０１５５２８２号に記載の抗−ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体、国際出願ＰＣＴ／ＩＢ２０１０／０５４４１７号および国際出願ＰＣＴ／ＩＢ２０１０／０５４４２２号に記載のヒト化ＥｐｈＡ２抗体（２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４など）；国際公開第２００８／０４７２４２号に記載の抗ＣＤ３８抗体（ｈｕ３８ＳＢ１９など）、米国特許仮出願公開第６１／３０７，７９７号、第６１／３４６，５９５号および第６１／４１３，１７２号ならびに米国特許出願公開第１３／０３３，７２３号に記載の抗葉酸受容体抗体である。これら全出願の明細書にある教示は、その全体が参照により本明細書に援用される。
（細胞結合剤コンジュゲートの産生）
本発明はまた、ジスルフィドリンカー、チオエーテルリンカー、アミド結合リンカー、ペプチダーゼ不安定性リンカー、酸不安定性リンカー、エステラーゼ不安定性リンカーを含むが、これらに限定されない、様々なリンカーを介して、一つまたは複数の細胞傷害性アンサマイトシン誘導体に連結する細胞結合剤を含む、アンサマイトシン誘導体−細胞結合剤コンジュゲートを提供する。
リンカーは、多くの方法で細胞傷害性剤を標的に送達するため、腫瘍細胞／不要な増殖細胞の部位で開裂され得る。リンカーは、例えば、低ｐＨ（ヒドラゾン）、還元環境（ジスルフィド）、タンパク質分解（アミド／ペプチドリンク）により、または酵素反応（エステルase／グリコシダーゼ）を介して開裂され得る。
本発明の代表的な細胞傷害性コンジュゲートは、抗体／アンサマイトシン誘導体、抗体断片−アンサマイトシン誘導体、成長因子（ＥＧＦ）／アンサマイトシン誘導体、メラノサイト刺激性ホルモン（ＭＳＨ）／アンサマイトシン誘導体、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）／アンサマイトシン誘導体、成長ホルモン分泌抑制ホルモン／アンサマイトシン誘導体、葉酸／アンサマイトシン誘導体、エストロゲン／アンサマイトシン誘導体、エストロゲン類似体／アンサマイトシン誘導体、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）阻害剤／アンサマイトシン誘導体、マトリプターゼ阻害剤／アンサマイトシン誘導体、設計されたアンキリン反復タンパク質（ＤＡＲＰｉｎｓ）／アンサマイトシン誘導体、アンドロゲン／アンサマイトシン誘導体、およびアンドロゲン類似体／アンサマイトシン誘導体である。
本発明のコンジュゲートは、当技術分野で既知の任意の方法に従って調製され得る。例えば、国際公開第２００９／１３４９７７号、米国特許第７，８１１，５７２号、第６，４４１，１６３号、米国特許出願第２００６／０１８２７５０号、およびWiddison, W. C. et. al. Semisynthetic maytansine analogues for the targeted treatment of cancer. J Med Chem 2006, 49 (14), 4392-4408を参照されたし。一つの実施形態では、本発明のコンジュゲートは、ａ）細胞結合剤を二官能性架橋試薬と反応させて、それと共有結合するリンカーを有する修飾細胞結合剤を形成させ；ｂ）前記の修飾された細胞結合剤を任意選択的に精製し；ｃ）細胞傷害性剤（すなわち、式ＶＩ〜ＩＸの化合物など、本明細書に記載のアンサマイトシン誘導体）を前記の修飾された細胞結合剤とコンジュゲートして、細胞結合剤−細胞傷害性剤コンジュゲートを形成し；およびｄ）前記の細胞結合剤−細胞傷害性剤コンジュゲートを精製することにより調製され得る。
別の実施形態では、本発明のコンジュゲートは、細胞結合剤を、細胞結合剤と共有結合を形成し、細胞結合剤−細胞傷害性剤コンジュゲートを形成することができるリンカー基を有する薬剤連結化合物（例えば、式Ｘ〜ＸＩＩの化合物）と反応させることにより調製され得る。その後、コンジュゲートを精製することができる。薬剤連結化合物をｉｎ ｓｉｔｕで生成し、精製せずに抗体との反応に使用することができる。
チオール部分を持つアンサマイトシン誘導体は、まず細胞結合剤を市販のＳＭＣＣなどの二官能性リンカーと反応させた後に、抗体のＦａｂユニットなどの細胞結合剤とカップリングすることができる。例えば、Ｆａｂ断片の複数のリシン残基をＳＭＣＣと反応させてマレイミド基を担持する修飾Ｆａｂを生じさせ、その後、チオール含有アンサマイトシンを修飾Ｆａｂと反応させてコンジュゲートを生じさせることができる。
マレイミド基を担持するアンサマイトシン誘導体は、一つまたは複数のチオール部分を含有する細胞結合剤と反応させることができる。例えば、抗体をジチオトレイトールと反応させて、複数の抗体内部ジスルフィド結合を還元させることができる。ジチオトレイトールを、サイズ排除クロマトグラフィにより除去し、その後、マレイミド担持アンサマイトシン誘導体を遊離チオール基とカップリングし、コンジュゲートを生じさせることができる。
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルなどの活性化エステルを担持するアンサマイトシン誘導体は、一つまたは複数のアミン部分を担持する細胞結合剤と反応し得る。例えば、一つまたは複数のリシン残基を含有する二重特異性抗体は、ペンタフルオロフェニルエステルを担持するアンサマイトシン誘導体と反応してコンジュゲートを生じさせることができる。
上記の方法で調整された細胞結合剤コンジュゲートは、本明細書に記載の任意の方法で精製され得る。
ジスルフィド含有細胞傷害性コンジュゲートは、チオール含有アンサマイトシン誘導体を、適切に修飾された細胞結合剤と反応させることにより作成される（図１４、２５を参照）。これらのコンジュゲートを、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、セラミックヒドロキシアパタイト（ＣＨＴ）クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＣＨＴ）、タンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）、またはＨＰＬＣを用いて精製し、非連結性細胞傷害性剤を除去する。
水性緩衝液の抗体溶液は、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）またはＮ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）ブタノエート（ＳＰＤＢ）などのモル過剰の抗体修飾剤で培養し、ジチオピリジル基を導入する。その後、修飾抗体を、化合物１７、１８、１９または４６などのチオール含有細胞傷害性剤と反応させて、ジスルフィド連結抗体−アンサマイトシン誘導体コンジュゲートを産生させる。次に、傷害性細胞結合コンジュゲートを、上記の任意の方法を使用して精製する。ジスルフィド基を導入するのに使用されるその他の架橋剤は、当技術分野で既知であり、米国特許第６，９１３，７４８号、第６，７１６，８２１号および米国特許出願公開第２００９／０２７４７１３号および第２０１０／０１２９３１４号に開示されている。
代替的に、２−イミノチオラン、Ｌ−ホモシステインチオラクトン（もしくは誘導体）、またはＮ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ）など、モル過剰の抗体修飾剤で抗体を培養し、スルフヒドリル基を導入する。その後、修飾された抗体を、適切なジスルフィド含有アンサマイトシン誘導体と反応させて、ジスルフィド連結抗体−細胞傷害性剤コンジュゲートを産生する。次に、抗体−細胞傷害性剤コンジュゲートを、ゲル濾過または上記のその他の方法により精製する。
抗体分子毎の細胞傷害性分子結合の数は、２８０ｎｍおよび２５２ｎｍで吸光度を測定することにより、分光測定で決定する。平均して、抗体分子毎に１〜１０個の細胞傷害性分子が本方法により連結される。連結された細胞傷害性分子の平均数は、好ましい平均値は、抗体分子毎に２〜５個であり、最も好ましいのは３〜４．５である。
代替的に、コンジュゲートは、アンサマイトシン誘導体が非開裂性リンカーを介して細胞結合剤と連結することにより調製され得る（図１５、１６、２６を参照）。水性緩衝液の抗体溶液を、Ｎ−スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）など、モル過剰の抗体修飾剤で培養し培養してマレイミド基を導入するか、またはＮ−スクシンイミジル−４−（ヨードアセチル）−アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）で培養してヨードアセチル基を導入する。その後、修飾抗体をチオール含有アンサマイトシン誘導体と反応させて、チオール連結抗体−細胞傷害性剤コンジュゲートを産生させる。次に、抗体−細胞傷害性コンジュゲートをゲル濾過もしくは上記のその他の方法により、または当業者に既知の方法により精製する。マレイミド基またはハロアセチル基を細胞結合剤に導入するその他の架橋剤は、当技術分野に周知であり（米国特許出願第２００８／００５０３１０号、第２００５／０１６９９３３号を参照、Pierce Biotechnology Inc. P.O. Box 117, Rocklおよび, IL 61105, USAから市販）、ＢＭＰＥＯ、ＢＭＰＳ、ＧＭＢＳ、ＥＭＣＳ、５−マレイミド吉草酸ＮＨＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＫＭＵＡ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、ＳＶＳＢ、ＤＴＭＥ、ＢＭＢ、ＢＭＤＢ、ＢＭＨ、ＢＭＯＥ、ＢＭ（ＰＥＯ）３、ＢＭ（ＰＥＯ）３、スルホ−ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＫＭＵＳ、およびスルホ−ＳＭＰＢを含むが、これらに限定されない。
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル（ＮＨＳ）エステルなど、アミン反応性基を担持するアンサマイトシン誘導体を細胞結合剤と反応させて、ダイレクトアミド連結コンジュゲートを産生させる（図２０、２４、２７を参照）。抗体−細胞傷害性剤コンジュゲートを、ゲル濾過または上記のその他の方法により精製する。
ペプチド開裂性リンカーを含む細胞結合剤−アンサマイトシン誘導体コンジュゲートは、対応するペプチド含有アンサマイトシン誘導体から調製する（図１７、１８、１９を参照）。
Ｎ末端−ヒドロキシスクシンイミドエステルを担持するペプチド含有アンサマイトシン誘導体を、細胞結合剤と直接反応させて、ペプチド開裂性コンジュゲートを提供させる。前記コンジュゲートをゲル濾過、分離または当技術分野既知のその他の方法により精製する。例示的ペプチドには、バリン−シトルリン（ｖａｌ−ｃｉｔ）、アラニン−フェニルアラニンなどのジペプチド；ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ、ｇｌｙ−ｖａｌ−ｃｉｔ、ａｌａ−ｖａｌ−ｃｉｔなどのトリペプチド；ｌｅｕ−ｌｅｕ−ｌｅｕ−ｌｅｕ、ａｌａ−ｌｙｓ−ａｌａ−ｌｙｓ、ａｌａ−ｌｅｕ−ａｌａ−ｌｅｕなどのテトラペプチド；ペンタペプチドまたはヘキサペプチドが含まれる。使用され得るその他のペプチドは、当技術分野で開示されている（米国特許出願公開第２００８／００５０３１０号、第２００９／００４７２９６号、第２００８／０２８０９３７号、第２００９／０２０３８８９号を参照）。
酸不安定性リンカーを含むアンサマイトシン誘導体の細胞結合剤コンジュゲートは、図２１、２２に示される通りに調製される。ヒドラゾンなど、酸不安定性リンカーを有するコンジュゲートは、アルキル、アリールケトンを含有するアンサマイトシン誘導体をヒドラジド修飾細胞結合剤で濃縮して調製される。代替的に、当技術分野に記載のように（米国特許第５，７７３，００１号、第５，７６７，２８５号、第５，８７７，２９６号を参照）、細胞結合剤を修飾してカルボニル部分を導入し、その後、ヒドラゾン部分を担持するアンサマイトシン誘導体と反応させる。
本発明のアンサマイトシン誘導体と細胞結合剤とのコンジュゲートは、Ｉｎ ｖｉｔｒｏで様々な不必要細胞株の増殖を抑制する能力があるとして評価される。例えば、これらコンジュゲートの細胞傷害性評価に、ヒト結腸癌細胞株ＣＯＬＯ２０５、ヒトメラノーマ細胞株Ａ−３７５およびヒト骨髄白血病細胞株ＨＬ６０などの細胞株を使用することができる。評価対象の細胞を、２４時間、７２時間またはそれよりも長い期間、前記化合物に曝露し、既知の方法により、生き残った細胞断片をダイレクトアッセイで測定することができる。その後、前記アッセイの結果からＩＣ５０値を計算することができる。
アンサマイトシン誘導体と細胞結合剤とのコンジュゲートのｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍効能は、先行開示された方法により評価する（参照により本明細書に援用される米国特許第７，４７３，７９６号）。
（化合物および使用方法）
本発明は、本発明の任意のアンサマイトシン誘導体−細胞結合剤コンジュゲートを有効量含む医薬組成物、薬学的に許容可能なその塩もしくは溶媒和物、および薬学的に許容可能な担体、希釈剤または付形剤を提供する。
本発明はまた、上記の任意のコンジュゲートを有効量、必要とする対象に投与することを含む治療方法を提供する。
同様に、本発明は、標的細胞または標的細胞を含有する組織を、本発明の任意のアンサマイトシン誘導体−細胞結合剤コンジュゲートを含む有効量の細胞傷害性剤、その塩または溶媒和物と接触させることを含む、選択された細胞集団における細胞死を導入する方法を提供する。標的細胞は、細胞結合剤の結合先の細胞のことである。
所望であれば、その他の抗腫瘍剤など、その他の活性剤をコンジュゲートと共に投与してもよい。
薬学的に許容可能かつ好適な担体、希釈剤、および付形剤は周知であり、臨床状況が許す範囲で当業者により決定され得る。
好適な担体、希釈剤および／または付形剤には、（１）約１ｍｇ／ｍｌ〜２５ｍｇ／ｍｌのヒト血清アルブミンを含有するまたは含有しないダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ約７．４、（２）０．９％生理食塩水（０．９％ｗ／ｖ ＮａＣｌ）、および（３）５％（Ｗ／Ｖ）ブドウ糖が含まれ、トリプタミンなどの抗酸化物質、Ｔｗｅｅｎ２０などの安定剤を含んでもよい。
選択された細胞集団において細胞死を導入する方法は、ｉｎｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、またはｅｘ ｖｉｖｏで行うことができる。
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの利用例として、疾患細胞または悪性細胞を殺傷するために、自家骨髄を同じ患者に移植する前に自家骨髄を処置すること；コンピテントなＴ細胞を殺傷し、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を防ぐために自家骨髄移植前に骨髄を処置すること；標的抗原を発現しない所望のバリアントを除く全ての細胞を殺傷し、所望でない抗原を発現するバリアントを殺傷するために細胞培養を処置することが含まれる。
ｉｎ ｖｉｔｒｏで非臨床利用する場合の条件は、当業者により容易に決定される。
ｅｘ ｖｉｖｏで臨床利用する例として、腫瘍治療または自己免疫疾患の治療において、自家骨髄移植前に骨髄から腫瘍細胞もしくはリンパ球様細胞を除去すること、または、ＧＶＨＤを防ぐために、移植前に自家もしくは同種の骨髄もしくは組織からＴ細胞およびその他のリンパ球様細胞を除去することが挙げられる。治療は以下のように行われる。骨髄を、患者またはその他の個体から収穫し、次に、本発明の細胞傷害性剤を加えた、血清含有媒体中で、約１０μＭ〜１ｐＭの濃度で、約３０分〜約４８時間、３７℃で培養する。濃度と培養時間の正確な条件、すなわち、用量は、当業者により容易に決定される。培養後、骨髄細胞を血清含有媒体で洗浄し、既知の方法により患者の静脈内に戻す。患者が、骨髄収穫と処理された細胞の再注入との間に、破壊的化学療法（ａｂｌａｔｉｖｅ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ）または全身照射のコースなど、その他の治療を受けている場合、処置した骨髄細胞を、標準的な医学装置を用いて液体窒素中に凍結保存する。
臨床的なｉｎ ｖｉｖｏ利用では、本発明の細胞傷害性剤は、無菌性およびエンドトキシンレベルについて検査された溶液または凍結乾燥粉末として提供される。コンジュゲート投与の好適なプロトコルの例は以下の通りである。コンジュゲートは、毎週、静脈内ボーラス投与し、それを４週間続ける。ボーララス投与量は、５０〜１０００ｍｌの通常の生理食塩水で、それに５〜１０ｍｌのヒト血清アルブミンを添加し得る。１回当たりのボーラス投与量は、静脈内へ１０μｇ〜２０００ｍｇ（１日当たり１００ｎｇから２０ｍｇ/ｋｇ）とする。４週間の治療後、患者は週単位で治療を継続して受けることができる。投与経路、付形剤、希釈剤、投与量、時間などに関する具体的な臨床プロトコル、は、臨床的状況が許す範囲で当業者により決定され得る。
選択された細胞集団への細胞死導入のｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏの方法に従って治療可能な病態の例として、例えば、肺癌、乳癌、結腸癌、前立腺癌、腎臓癌、膵臓癌、卵巣癌、およびリンパ器官の癌などを含む任意の種類の悪性腫瘍；全身紅はん性、関節リウマチ、および多発性硬化症などの自己免疫疾患；腎移植拒絶、肝移植拒絶、肺移植拒絶、心臓移植拒絶、および骨髄移植拒絶などの移植片拒絶、移植片対宿主病；ＣＭＶ感染、ＨＩＶ感染、ＡＩＤＳなどのウイルス感染；ならびに、ランブル鞭毛虫症、アメーバ症、住血吸虫症などの寄生虫感染症、ならびに当業者が決定するその他のものが含まれる。
本明細書に記載の全刊行物、特許文献および非特許文献は、その全体が参照により明示的に本明細書に援用される。
本発明を、非制限的実施例を参照としてここに例示する。特段の指定がない限り、全てのパーセント、割合、部分などは重量ベースとする。
試薬はすべて、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社（ニュージャージー）またはその他の商業的ソースから購入した。マイタンシノール（１１）は、先に記載の通りに調製した（米国特許第６，３３３，４１０号）。核磁気共嗚（１Ｈ NＭＲ）スペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ４００ＭＨｚ装置で獲得し、マススペクトルは、エレクトロスプレイイオン化を用いて、Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ Ｅｓｑｕｉｒｅ３０００装置で獲得した。ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性アッセイは、先行文献に記載の通りに行う（米国特許第７，２７６，４９７号およびW. C. Widdison et al., J. Med. Chem., 2006, 49, 4392-4408を参照）。
ＫＢ（ＡＴＣＣ ＣＣｌ−１７）細胞株は、ヒト上皮由来である。ＳＫ−ＢＲ−３（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−３０）細胞株は、ヒト乳腺癌から確立したものである。ヒト結腸腫瘍細胞株ＣＯＬＯ２０５（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２２２）およびＨＴ−２９（ＡＴＣＣ ＨＴＢ３８）、ヒトメラノーマ細胞株Ａ−３７５（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６１９）、ヒトバーキットリンパ腫細胞株Ｒａｍｏｓ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５９６）およびヒト骨髄白血病細胞株ＨＬ−６０（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２４０）はすべてＡＴＣＣ（メリーランド）から得た。細胞株は、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ、Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ社、メリーランド州ウォーカーズビル）の中で、１０％ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ社、ユタ州ローガン）および５０μｇ／ｍＬの硫酸ゲンタマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、メリーランド州ロックビル）を供給したＬ−グルタミンで生育した。細胞は、６％ＣＯ２を含有する加湿雰囲気の中で、３６〜３７．５℃で維持された。
実施例１：ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性
細胞傷害性の研究は、クローン原性アッセイを用いて行った。試験細胞株（ＫＢおよびＳＫ−Ｂｒ−３）を、ウェル毎に１０００個の細胞を定数として、６ウェル培養皿に配置した。様々なアンサマイトシンまたはマイタンシンの様々な濃度（０〜３ｎＭ）で、７２時間細胞を培養した。その後、媒体をプレートから吸引し、新鮮な媒体と取り替えた。プレーティング後、培養物は合計７〜１０間で成長し、コロニーを形成した。その後、培養物を固定して、１０％ホルマリン／ＰＢＳ中０．２％クリスタルバイオレットで染色し、コロニーを数えた。コロニー数を数えて得られた数字をプレーティングされた細胞数で割り、非処理細胞（媒体のみ）のプレーティング効率を決定した。薬剤に曝露した細胞の生存率は、薬剤に曝露したウェル中のコロニー数を対照ウェル中のコロニー数で割ることにより決定した。
様々なアンサマイトシンのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性測定をマイタンシンと比較した結果を図３に示した。結果によると、試験された３つのアンサマイトシンエステルはすべて、試験された両方の細胞株（ＫＢおよびＳＫ−Ｂｒ−３）に対し、マイタンシンよりも効能があった。例えば、Ｃ３ペタノイルを担持するアンサマイトシンＰ４’、およびイソブタノイルエステルを担持するアンサマイトシンＰ３は共に、ＳＫ−Ｂｒ−３細胞に対し、Ｃ３Ｎ−アセチル−Ｎ−メチルアラニルエステル、マイタンシン（ＩＣ５０＝３．４×１０−１１Ｍ）よりも１７倍の効能がある（ＩＣ５０＝２×１０−１２Ｍ）。同様に、アンサマイトシンＰ３エステル，Ｐ４エステルおよびＰ４’エステルは、ＫＢ細胞に対し、マイタンシンよりも３．７倍〜６倍の効能がある。
実施例２：誘導体化されたカルボン酸の調製
化合物２８：先行文献で記載の通り（Widdison, W.C., et al., J Med Chem, 2006. 4, 4392-408）、３−メルカプトプロパン酸をエタノール中のＳ−メチルメタンチオスルホン酸塩と反応させて２８を生じさせた。
化合物３０：化合物３０は、Ｓ−メチルメタンチオスルホン酸塩を４−メルカプト−１−ブタノールと反応させることにより作成する。
化合物３２：化合物３２は、Ｓ−メチルメタンチオスルホン酸塩を１−アミノ−ブタン−４−チオールと反応させることにより作成する（Reineke, T. M. et. al. Bioconjugate Chem., 2003 14, 247-254）。
化合物３４：フラン担持カルボン酸３４は、以下のように調製する。メチル５−ヒドロキシメチル−２−フロ酸（３３）（Moore, J. A et. al., Journal of Polymer Science, Polymer Chemistry Edition (1984), 22(3), 863-4）をメタンスルホニルクロリドと反応させ、続いて、チオ尿素と反応させ、加水分解をして３３を生じさせる。その後、３３をメタンチオスルホン酸塩と反応させる。
化合物３７：化合物３７は、２，２’−ジチジピリジンを４−（メルカプトメチル）安息香酸３６と反応させることにより調製する。
化合物３９：化合物３９は、２，２’−ジチジピリジンをチオＰＦＧ４カルボン酸３８と反応させることにより調製する。
化合物４２：ペプチド担持カルボン酸４２を以下のように調製する。ジペプチドＦＭｏｃ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＯＨ４０(Dubowchik G.M. et. al. Bioconjugate Chem. 2002, 13, 855-869）を、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ′−エチルカルボジイミド・ヒドロクロリド（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）を使って、βアラニンのｔ−ブチルエステルとカップリングし、続いて、ピペリジンでＦＭｏｃ脱保護化し４１を生じさせる。その後、化合物４１をＮ−スクシンイミジル３−［２−ピリジルジチオ］−プロピオネート（ＳＰＤＰ）と反応させ、続いて、トリフルオロ酢酸でｔ−ブチルエステル脱保護化する。
実施例３：４−ニトロ−フェノール炭酸塩または４−ニトロ−フェノールカルバマートの調製
４−ニトロフェニルクロロ炭酸塩を化合物３０と反応させて、ジスルフィド担持炭酸塩４３を生じさせる。
４−ニトロフェニルクロロ炭酸塩を化合物３２と反応させて、ジスルフィド担持カルバマート４４を生じさせる。
（アンサマイトシン誘導体の調製）
実施例４：
チオール担持アンサマイトシン誘導体６は、４，４−ジメチルピリジン（ＤＭＡＰ）を触媒として、マイタンシノールを２８とジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）カップリングし、続いて、ジチオトレイトールを用いてジスルフィド還元をする。
実施例５：
チオール担持アンサマイトシン誘導体１９は、４，４−ジメチルピリジン（ＤＭＡＰ）を触媒として、マイタンシノールを３７とジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）カップリングし、続いて、ジチオトレイトールを用いてジスルフィド還元をする。
実施例６：
チオール担持アンサマイトシン誘導体２３は、４，４−ジメチルピリジン（ＤＭＡＰ）を触媒として、マイタンシノールを３４とジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）カップリングし、続いて、ジチオトレイトールを用いてジスルフィド還元をする。
実施例７：
チオール担持アンサマイトシン誘導体１８は、４，４−ジメチルピリジン（ＤＭＡＰ）を触媒として、マイタンシノールを３９とジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）カップリングし、続いて、ジチオトレイトールを用いてジスルフィド還元をする。
実施例８：
チオール担持アンサマイトシン誘導体１７は、４，４−ジメチルピリジン（ＤＭＡＰ）を触媒として、マイタンシノールを４２とジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）カップリングし、続いて、ジチオトレイトールを用いてジスルフィド還元をする。
実施例９：
チオール担持アンサマイトシン誘導体２０は、ＤＭＡＰを触媒として、マイタンシノールを４４とカップリングし、続いて、ジチオトレイトールを用いてジスルフィド還元をする。
実施例１０：
チオール担持アンサマイトシン誘導体２１は、ＤＭＡＰを触媒として、マイタンシノールを４３とカップリングし、続いて、ジチオトレイトールを用いてジスルフィド還元をする。
実施例１１：
アンサマイトシン誘導体９は、ＤＭＡＰを触媒として、マイタンシノールを３オキソプロピオン酸４８とＤＣＣカップリングする（Yamada, E. M. et. Al. J. Biol. Chem. 1959 234, 941-945）。
実施例１２：
アンサマイトシン誘導体８は、ＤＭＡＰを触媒として、マイタンシノールを３−オキソブタン酸４９とＤＣＣカップリングする。
実施例１３：
アンサマイトシン誘導体１５は、ＤＭＡＰを触媒として、マイタンシノールを５０とＤＣＣカップリングし、続いて、モルホリンでＦＭｏｃ脱保護化する。
実施例１４：
アンサマイトシン誘導体１６は、ＤＭＡＰを触媒として、マイタンシノールを５１Ｆｍｏｃ−β−アラニンとＤＣＣカップリングし、続いて、モルホリンでＦＭｏｃ脱保護化する。
実施例１５：
アンサマイトシン誘導体１３ａ、ｂを以下のように調製した（図１１を参照）。
マイタンシノールのヘキサンジオイック酸−１−［２−トリメチルシリル）エチル］エステルエステル（１４ａ）
ＣＨ２Ｃｌ２（２ｍＬ）中にヘキサンジオイック酸−１［２−トリメチルシリル）エチル］エステル（５２３．０ｍｇ、２．１２ｍｍｏｌ）を溶かした溶液に、ジシクロヘキシルカルボジイミド（４３８ｍｇ、２．１２４ｍｍｏｌ）、４−ジメチルアミノピリジン（８６．０ｍｇ、０．７０８ｍｍｏｌ）およびマイタンシノール（２００．００ｍｇ、０．３５４ｍｍｏｌ）を雰囲気温度で加えた。２時間後、反応物を濾過し、真空で濃縮した。産物をＣ１８ＨＰＬＣにより水性の０．１％ギ酸中のアセトニトリルの直線勾配で溶出して単離した。留分を含有する産物を混ぜ合わせて真空で濃縮し、３２．０ｍｇ（収率１１％）の所望の産物を生じさせた。ＭＳ計算値（Ｍ＋Ｎａ）＋、８１５．３；実測値、８１５．２。
マイタンシノールのヘキサンジオイック酸エステル（１４ｂ）
ＴＨＦ（３７８μＬ）中にマイタンシノールのヘキサンジオイック酸−１［２−トリメチルシリル）エチル］エステルエステル（３０ｍｇ、０．０３８ｍｍｏｌ）を溶かした溶液を入れた氷冷／水冷フラスコに、テトラヒドロフラン（４５．４μＬ、０．０４５ｍｍｏｌ）中に１Ｍのテトラブチルアンモニウムフッ化物溶液を加えた。冷却槽を除去し、６時間後に、飽和塩化アンモニウムで反応を消し、ＥｔＯＡＣで抽出してブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥して、真空で濃縮した。産物をＣ１８ＨＰＬＣにより水性の０．１％ギ酸中のアセトニトリルの直線勾配で溶出して単離した。留分を含有する産物を混ぜ合わせて真空で濃縮し、５．４ｍｇ（収率２１％）の所望の産物を生じさせた。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ０．８２（ｓ、３Ｈ）、１．３５〜１．１７（ｍ、４Ｈ）、１．５４〜１．３９（ｍ、２Ｈ）、１．６１（ｄ、Ｊ＝１３．７Ｈｚ、１Ｈ）、１．６８（ｓ、３Ｈ）、１．８２〜１．７０（ｍ、２Ｈ）、２．２０（ｄ、Ｊ＝１１．９Ｈｚ、２Ｈ）、２．３６（ｄ、Ｊ＝１１．１Ｈｚ、３Ｈ）、２．６１〜２．５０（ｍ、２Ｈ）、２．７７〜２．６３（ｍ、２Ｈ）、２．９１（ｄ、Ｊ＝９．７Ｈｚ、１Ｈ）、３．１６（ｓ、１Ｈ）、３．１９（ｓ、３Ｈ）、３．３７（ｓ、３Ｈ）、３．５１（ｄｄ、Ｊ＝１７．７、１１．０Ｈｚ、１Ｈ）、３．７２（ｄｄ、Ｊ＝１４．１、７．０Ｈｚ、１Ｈ）、３．９９（ｓ、３Ｈ）、４．２９〜４．２１（ｍ、１Ｈ）、４．８８（ｄ、Ｊ＝９．１Ｈｚ、１Ｈ）、５．５３（ｄｄ、Ｊ＝１５．５、８．８Ｈｚ、１Ｈ）、６．１６（ｄ、Ｊ＝１０．６Ｈｚ、１Ｈ）、６．４２（ｄｄ、Ｊ＝１５．３、１０．９Ｈｚ、１Ｈ）、６．６３（ｓ、１Ｈ）、６．７９（ｓ、１Ｈ）、６．８４（ｓ、１Ｈ）。ＭＳ計算値（Ｍ＋Ｎａ）＋、７１５．３；実測値、７１５．３。
マイタンシノールのヘキサンジオイック酸エステルのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（１３）
ＣＨ２Ｃｌ２（１ｍＬ）中にマイタンシノールのヘキサンジオイック酸エステル（５ｍｇ、７．２１μｍｏｌ）を溶かした溶液に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（４．１５ｍｇ、０．０３６ｍｍｏｌ）およびＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（６．９１ｍｇ、０．０３６ｍｍｏｌ）を雰囲気温度で加えた。２４時間後、真空下で溶媒を除去し、残基をＣ１８ＨＰＬＣにより水性の０．１％ギ酸中のアセトニトリルの直線勾配で溶出して精製した。留分を含有する産物をすぐに冷凍し、凍結乾燥して０．９１ｍｇ（収率１６％）の所望の産物を生じさせた。ＭＳ計算値（Ｍ＋Ｎａ）＋、８１２．３；実測値、８１２．３。
実施例１６：チオール含有アンサマイトシン６を以下のように調製した（図５を参照）。
マイタンシノールの３−（メチルジチオ）プロパン酸エステル（４５）
ＣＨ２Ｃｌ２（２ｍＬ）中に３−（メチルジチオ）プロパン酸（３２３．０ｍｇ、２．１２ｍｍｏｌ）を溶かした溶液に、ジシクロヘキシルカルボジイミド（４３８ｍｇ、２．１２４ｍｍｏｌ）、４−ジメチルアミノピリジン（８９．３ｍｇ、０．７３１ｍｍｏｌ）およびマイタンシノール（１９７．０ｍｇ、０．３４８ｍｍｏｌ）を雰囲気温度で加えた。２時間後、反応物を濾過し、真空で濃縮した。産物をＣ１８ＨＰＬＣにより水性の０．１％ギ酸中のアセトニトリルの直線勾配で溶出して精製した。留分を含有する産物を混ぜ合わせて真空で濃縮し、９３．６ｍｇ（収率３８％）の所望の産物を生じさせた。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ０．８５（ｓ、３Ｈ）、１．２４（ｄ、Ｊ＝１３．７Ｈｚ、１Ｈ）、１．２８（ｄ、Ｊ＝６．４Ｈｚ、３Ｈ）、１．５３〜１．４１（ｍ、１Ｈ）、１．６３（ｄ、Ｊ＝１３．６Ｈｚ、２Ｈ）、１．６８（ｓ、３Ｈ）、２．１９（ｄｄ、Ｊ＝１３．９、２．６Ｈｚ、１Ｈ）、２．４３〜２．４０（ｍ、１Ｈ）、２．４４（ｍ、２Ｈ）、２．５２（ｄｄ、Ｊ＝１３．９、１２．０Ｈｚ、１Ｈ）、２．８７〜２．７７（ｍ、２Ｈ）、２．８９（ｄｄ、Ｊ＝８．５、４．９Ｈｚ、１Ｈ）、３．０２〜２．９４（ｍ、３Ｈ）、３．１８（ｓ、３Ｈ）、３．３６（ｓ、３Ｈ）、３．５２（ｄ、Ｊ＝８．９Ｈｚ、１Ｈ）、３．５６（ｄ、Ｊ＝１２．９Ｈｚ、１Ｈ）、３．９９（ｓ、３Ｈ）、４．２４（ｔ、Ｊ＝１１．３Ｈｚ、１Ｈ）、４．９６（ｄｄ、Ｊ＝１１．９、２．７Ｈｚ、１Ｈ）、５．６１（ｄｄ、Ｊ＝１５．４、８．９Ｈｚ、１Ｈ）、６．２７（ｄ、Ｊ＝１１．０Ｈｚ、１Ｈ）、６．３４（ｓ、１Ｈ）、６．４５（ｄｄ、Ｊ＝１５．４、１１．１Ｈｚ、１Ｈ）、６．８０（ｄ、Ｊ＝１．７Ｈｚ、１Ｈ）、６．８４（ｄ、Ｊ＝１．７Ｈｚ、１Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ１２．０８、１４．５１、１５．７６、２２．１６、２２．７２、２４．７０、３１．２５、３３．４１、３４．２４、３５．６８、３８．３４、４７．１５、５６．５８、５６．７２、６０．３４、６６．１８、７４．４７、８１．０９、８８．０８、１１３．０２、１１９．４４、１２２．２８、１２４．４９、１２８．０９、１３２．４７、１４０．０９、１４１．５８、１４２．５１、１４９．１０、１５２．３２、１６８．５２、１７０．５１。ＭＳ計算値（Ｍ＋Ｎａ）＋、７２１．２；実測値、７２１．２。
マイタンシノールの３−チオプロパン酸エステル（６）
１，２−ジメトキシエタン（３ｍＬ）中にマイタンシノールの３−（メチルジチオ）プロパン酸エステル（４５ｍｇ、０．０６４ｍｍｏｌ）を溶かした溶液に、１００ｍＭのリン酸カリウム、２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．５緩衝液（３．００ＭＬ）中にＤ，Ｌ−ジチオトレイトール（４９．６ｍｇ、０．３２２ｍｍｏｌ）を溶かした溶液を雰囲気温度で加えた。１時間後、反応容積を真空下で、オリジナルの容積の約２分の１に減らし、産物をＣ１８ＨＰＬＣにより水性の０．１％ギ酸中のアセトニトリルの直線勾配で溶出して単離した。留分を含有する産物をすぐに冷凍し、凍結乾燥して４．０ｍｇ（収率９．5％）の所望の産物６を生じさせた。ＭＳ計算値（Ｍ＋Ｎａ）＋、６７５．２；実測値、６７５．２。
実施例１６：チオール含有アンサマイトシン５５を以下のように調製した（図１３ａ）
６−（メチルジチオ）ヘキサン酸（５３）
脱イオン化水（２ｍＬ）中に６−メルカプトヘキサン酸（５００．０ｍｇ、３．３７ｍｍｏｌ）を溶かした溶液を含む、氷冷／水冷フラスコに、エタノール（１ｍＬ）にＳ−メチルメタンチオスルホン酸塩（４６８ｍｇ、３．７１ｍｍｏｌ）を溶かした溶液を加えた。１６時間後、反応物を飽和塩化ナトリウム（４００ｍＬ）で希釈し、エチルエーテル（３×１５０ｍＬ）で抽出した。混合した抽出物を飽和ＮａＣｌ（１００ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥して、真空で濃縮した。産物を、シリカクロマトグラフィーにより、酢酸エチル／ヘキサン／酢酸（４０：５８：２）で溶出して精製した。留分を含有する産物を混ぜ合わせて真空で濃縮し、４８２ｍｇ（収率７３％）の所望の産物を生じさせた。ＭＳ計算値（Ｍ＋Ｎａ）＋、２１７．３；実測値、２１７．３。
マイタンシノールの６−（メチルジチオ）ヘキサン酸エステル（５４）
ＣＨ２Ｃｌ２（２ｍＬ）中に６−（メチルジチオ）ヘキサン酸（４１３．０ｍｇ、２．１２ｍｍｏｌ）を溶かした溶液に、ジシクロヘキシルカルボジイミド（４３８ｍｇ、２．１２４ｍｍｏｌ）４−ジメチルアミノピリジン（８６．０ｍｇ、０．７０８ｍｍｏｌ）およびマイタンシノール（２００．００ｍｇ、０．３５４ｍｍｏｌ）を雰囲気温度で加えた。２時間後、反応物を濾過し、真空で濃縮した。産物をＣ１８ＨＰＬＣにより水性の０．１％ギ酸中のアセトニトリルの直線勾配で溶出して単離した。留分を含有する産物を混ぜ合わせて真空で濃縮し、３６．７ｍｇ（収率１４％）の所望の産物を生じさせた。ＭＳ計算値（Ｍ＋Ｎａ）＋、７６３．３；実測値、７６３．３。
マイタンシノールの６−メルカプトヘキサン酸エステル（５５）
１，２−ジメトキシエタン（３ｍＬ）中にマイタンシノールの６−（メチルジチオ）ヘキサン酸エステル（３０．０ｍｇ、０．０４０ｍｍｏｌ）を溶かした溶液に、１００ｍＭのリン酸カリウム、２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．５緩衝液（３．００ｍＬ）中にＤ，Ｌ−ジチオトレイトール（３１．２ｍｇ、０．２０２ｍｍｏｌ）を溶かした溶液を雰囲気温度で加えた。４時間後、反応容積を真空で約３分の２の容積に濃縮し、産物をセミ分取Ｃ１８ＨＰＬＣにより水性の０．１％ギ酸中のアセトニトリルの直線勾配で溶出して単離した。留分を含有する産物をすぐに冷凍し、凍結乾燥して１２．５５ｍｇ（収率４４％）の所望の産物５５を生じさせた。ＭＳ計算値（Ｍ＋Ｎａ）＋、７１７．３；実測値、７１７．３。
実施例１７：チオール含有アンサマイトシン５８を以下のように調製した（図１３ｂを参照）
２−（メチルジチオ）プロパン酸（５６）
水（５０．０ｍＬ）に２−メルカプトプロパン酸（２．０ｍＬ、２２．５５ｍｍｏｌ）を溶かした溶液に、炭酸ナトリウム（４．７７ｇ、４５．００ｍｍｏｌ）を、過剰に泡立つのを回避しつつ、小分けにして加えた。その後、エタノール（５０．０ｍＬ）中にＳ−メチルメタンチオスルホン酸塩（２．７７ｍＬ、２９．３ｍｍｏｌ）を溶かした溶液を雰囲気温度でゆっくり加えた。２時間後、真空で、反応物の容積を元の容積の約２分の１に減らし、その後、１ＭのＨＣｌを用いてｐＨ〜２に酸化し、酢酸エチル（２×２５０ｍＬ）で抽出した。有機抽出物を混ぜ合わせ、ブラインで洗浄し、真空で濃縮して原油を生じさせ、シリカクロマトグラフィーにより、ヘキサン：酢酸エチル：酢酸（５０：４９：１）の混合物で溶出して精製した。留分を含有する産物を混ぜ合わせて真空で濃縮し、２．３ｇ（収率６７％）の所望の産物を生じさせた。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ１．５２０（３Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．２Ｈｚ）、２．４４６（３Ｈ、ｓ）および３．５５９（１Ｈ、ｍ）ｐｐｍ。
マイタンシノールの２−（メチルジチオ）プロパン酸エステル（５７）
ＣＨ２Ｃｌ２（２ｍＬ）中に２−（メチルジチオ）プロパン酸（３０３．３ｍｇ、１．９９２ｍｍｏｌ）を溶かした溶液に、ジシクロヘキシルカルボジイミド（４３８ｍｇ、２．１２４ｍｍｏｌ）４−ジメチルアミノピリジン（８６ｍｇ、０．７０８ｍｍｏｌ）およびマイタンシノール（２００．０ｍｇ、０．３５４ｍｍｏｌ）を加えた。１時間後に酢酸エチル（２０ｍＬ）を加え、混合物を濾過し、飽和炭酸水素ナトリウム (10 mL)およびブライン（５ｍＬ）で連続して洗浄し、その後、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、真空で濃縮した。産物をＣ１８ＨＰＬＣにより水性の０．１％ギ酸中のアセトニトリルの直線勾配で溶出して単離した。留分を含有する産物を混ぜ合わせて真空で濃縮し、８．５３ｍｇ（収率３．３％）の所望の産物を生じさせた。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、ｒｅｆ．７．２６ｐｐｍ）δ０．８２１（３Ｈ、ｓ）、１．２８８（３Ｈ、ｄ、Ｊ＝６．４Ｈｚ）、１．４５５（１Ｈ、ｍ）、１．６５０（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝４Ｈｚ）、１．６７９（３Ｈ、ｄ、Ｊ＝３．２Ｈｚ）、１．６９３（３Ｈ、ｓ）、１．７８２（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．２Ｈｚ）、２．２４５（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝１１．６、Ｊ＝２．４Ｈｚ）、２．４９４（３Ｈ、ｓ）、２．５７３（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝１１．６、Ｊ＝２Ｈｚ）、２．８７７（１Ｈ、ｍ）、３．１８６（３Ｈ、ｓ）、３．３５９（３Ｈ、ｓ）、３．５１１（３Ｈ、ｍ）、３．６４５（１Ｈ、ｍ）、３．９８７（３Ｈ、ｓ）、４．２６５（１Ｈ、ｍ）、４．９１４（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝９．２、Ｊ＝３．２Ｈｚ）、５．５３９（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝１１．６、Ｊ＝６．４Ｈｚ）、６．１５８（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１１．２）、６．３０８（１Ｈ、ｓ）、６．４２２（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝１０．８、Ｊ＝４．４Ｈｚ）、６．８３４（１Ｈ、ｓ）および６．９０５（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１．６Ｈｚ）。ＭＳ計算値（Ｍ＋Ｎａ）＋、７２１．２；実測値、７２１．２。ＭＳ計算値（Ｍ＋Ｃｌ）−、７３３．２；実測値、７３５．１。
マイタンシノールの２−（チオ）プロパン酸エステル（５８）
１，２−ジメトキシエタン（１ｍＬ）中にマイタンシノールの２−（メチルジチオ）プロパン酸 エステル（８ｍｇ、０．０１１ｍｍｏｌ）を溶かした溶液に、１００ｍＭのリン酸カリウム、２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．５緩衝液（１．０００ｍＬ）中にＤ，Ｌ−ジチオトレイトール（５．２９ｍｇ、０．０３４ｍｍｏｌ）を溶かした溶液を雰囲気温度で加えた。９０分後に、反応物の容積を真空で減らして乾燥し、Ｃ１８ＨＰＬＣにより水性の０．１％ギ酸中のアセトニトリルの直線勾配で溶出して精製した。留分を含有する産物をすぐに冷凍し、凍結乾燥して１．６ｍｇ（収率１８％）の所望の産物を生じさせた。ＭＳ計算値（Ｍ＋Ｎａ）＋、６７５．２；実測値、６７６．２。ＭＳ計算値（Ｍ−Ｈ）−、６５１．１；実測値、６５１．２。
実施例１８：
アンサマイトシン誘導体１３ａは、３７をＮ−ヒドロキシスクシンイミドにＤＣＣカップリングすることにより調製される。
実施例１９
アンサマイトシン１３ｂは、３７をスルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドとＤＣＣカップリングすることにより調製する。
実施例２０
アンサマイトシン誘導体２２を以下のように調製する。３０のヒドロキシル部分をメタンスルホニルクロリドと反応させて、メシレート５２を生じさせる。マイタンシノールのテトラヒドロフラン溶液を、換算温度で、ブチルリチウムで脱プロトン化し、５２の溶液にカニューレ挿入してエーテル結合を形成させ、その後、ジスルフィド部分をＤＴＴで開裂する。
実施例２１：ジスルフィドリンカーによる抗体とスルフィドリル担持アンサマイトシン誘導体とのコンジュゲーション
抗体を、本明細書に記載の先行文献（W. C. Widdison et al., J. Med. Chem., 2006, 49, 4392-4408）に記載の方法により、本発明のスルフィドリル担持アンサマイトシン誘導体の複数の分子とコンジュゲートする。ヒト化抗体をまず、アミン反応性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基（ＮＨＳ基）とチオール反応性２−ピリジルジチオ基（−ＳＳＰｙ基）の両方を含有するヘテロ二官能性リンカー（ＳＰＤＢ、ＳＰＰ、ＳＰＤＰ）で修飾し、１個の抗体分子に複数のリンカー分子（例えば、１〜１０個）を取り込む。この後、反応性チオール基を担持するアンサマイトシン誘導体を、リンカー修飾抗体に加え、ジスルフィド結合によりアンサマイトシン誘導体を抗体にコンジュゲートする。
具体的な実施例では、ヒト化抗体を、濃度５〜１０ｍｇ／ｍｌで、ｐＨ６．５〜８の水性緩衝液中、０．２５〜３時間、雰囲気温度で、ＳＰＤＢ、ＳＰＰ、およびＳＰＤＰなどのヘテロ二官能性リンカーを３〜１５倍モル過剰用いて修飾し、ゲル濾過（例えば、セファデックスＧ２５クロマトグラフィーを用いて）により精製し、抗体分子当たり平均３〜１５個のリンカー基で修飾された抗体を得る。リンカー基は、過剰な１，４−ジチオトレイトール（ＤＴＴ）試薬をリンカー修飾抗体サンプルの小さなアリコートに添加すると同時に、２−チオピリドンの放出を、３４３ｎｍ（ε３４３ｎｍ＝８０８０Ｍ−１ｃｍ−１）におけるその吸光度に基づいて測定することにより評価する。抗体上の連結された反応性基の数を測定後、リンカー修飾抗体を、過剰のチオール含有アンサマイトシン誘導体（典型的には、反応性連結基当たり、１．０〜２．５倍モル過剰のチオール担持アンサマイトシン誘導体）と、抗体濃度約２．５ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ６．５〜８で、反応時間を２〜２４時間としてコンジュゲートする。抗体−アンサマイトシン誘導体コンジュゲートを、ゲル濾過または分解により精製し、不反応のアンサマイトシン誘導体を除去する。精製されたコンジュゲートにおける抗体分子１個当たりの連結アンサマイトシン誘導体の数は、２５２ｎｍおよび２８０ｎｍにおける吸光度測定、およびア２５２ｎｍおよび２８０ｎｍにおけるアンサマイトシン誘導体と抗体の減衰係数を用いて決定される（図１３、ｍ＝１〜１０）。
実施例２２：非開裂性チオエーテルリンカーにより、抗体分子１個につき複数のスルフィドリル担持アンサマイトシン誘導体分子を連結させる、抗体とのコンジュゲーション
チオエーテル連結抗体−アンサマイトシン誘導体コンジュゲートは、二段階過程で調製され得る。ヒト化抗体は、アミン−反応性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基（ＮＨＳ基）を担持するヘテロ二官能性架橋剤、およびチオール反応性マレイミド、ビニルピリジン、ビニルスルホン、ビニルスルホンアミドまたはハロアセチルベースの基で修飾して、抗体分子に複数のリンカー分子を取り込む。マレイミドベースの部分を含む架橋試薬には、Ｎ−スクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）、ＳＭＣＣ（ＬＣ−ＳＭＣＣ）の「長鎖」類似体であるＮ−スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシ−（６−カプロン酸アミド）、κ−マレイミドウンデカン酸Ｎ−スクシンイミジルエステル（ＫＭＵＡ）、γ−マレイミド酪酸Ｎ−スクシンイミジルエステル（ＧＭＢＳ）、ε−マレイミドカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＥＭＣＳ）ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、Ｎ−（α−マレイミドアセトキシ）−スクシンイミドエステル（ＡＭＡＳ）、スクシンイミジル−６−（β−マレイミドプロパンアミド）ヘキサノエート（ＳＭＰＨ）、Ｎ−スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）−ブチレート（ＳＭＰＢ）、およびＮ−（ｐ−マレイミドフェニル）イソシアネート（ＰＭＰＩ）が含まれる。ビニルピリジンを含有する、チオール反応性化合物に関しては、記載がある（Friedman M. et. Al. Int. J. Peptide Protein Res. 1974, 6, 183-185; Mak A. et. Al. Anal. Biochem. 1978, 84, 432-440）。ビニルスルホン部分を含有する反応性化合物も記載がある（Masri M. S. J. Protein Chem.. 1988, 7, 49-54; Morpurgo, M. et. Al. Bioconjugate Chem. 1996, 7, 363-368）。ハロアセチルベースの部分を含む架橋試薬には、Ｎ−スクシンイミジル−４−（ヨードアセチル）−アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）、Ｎ−スクシンイミジルヨード酢酸（ＳＩＡ）、Ｎ−スクシンイミジルブロモ酢酸（ＳＢＡ）、およびＮ−スクシンイミジル３−（ブロモアセトアミド）プロピオネート（ＳＢＡＰ）が含まれる。
抗体を、ｐＨ６．５〜８の水性緩衝液中５〜１０ｍｇ／ｍＬの過剰ヘテロ二官能性架橋剤で、０．２５〜３時間、雰囲気温度で修飾し、続いて、Ｇ２５クロマトグラフィで精製する。修飾抗体上の連結マレイミド基またはハロアセチル基の数は、リンカー−修飾抗体の小さなアリコートを用い、またマレイミドまたはハロアセチル濃度に対し既知の過剰チオール（２−メルカプトエタノールなど）を加えることで決定される。チオールを、修飾抗体上に導入されたマレイミド基またはハロアセチル基と反応させ、過剰チオールをＤＴＮＢ試薬（４１２ｎｍ＝１４１５０Ｍ−１ｃｍ−１におけるＴＮＢチオール酸の減衰係数；Riddles, P. W. et al., Methods Enzymol., 1983, 91, 49-60; Singh, R., Bioconjugate Chem., 1994, 5, 348-351）を用いてＥｌｌｍａｎアッセイにより測定する。抗体上の連結された反応性基の数を測定した後、リンカー修飾抗体を過剰チオール担持アンサマイトシン誘導体（反応性リンカー基当たり１．０〜２．５倍モル過剰チオール担持アンサマイトシン誘導体）と、抗体濃度約２．５ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ６．５〜８、反応時間を２〜２４時間としてコンジュゲートする。非開裂性抗体−アンサマイトシン誘導体コンジュゲートを、ゲル濾過または分解により精製し、不反応の任意のアンサマイトシン誘導体を除去する。精製されたコンジュゲートにおいて、抗体分子１個当たりに連結した非開裂性アンサマイトシン誘導体分子の数は、２５２ｎｍおよび２８０ｎｍにおける吸光度測定、ならびに２５２ｎｍおよび２８０ｎｍにおけるアンサマイトシン誘導体および抗体の減衰係数を用いて決定する（図１４，１５、ｍ＝１〜１０）。
実施例２３：抗体分子１個につき複数のアミン反応性アンサマイトシン誘導体分子を連結させる、抗体とのコンジュゲーション
抗体−アンサマイトシン誘導体コンジュゲートは、ヒト化抗体上のリシン残基を、本発明のアミン反応性アンサマイトシン誘導体で修飾することにより、単一段階過程で調製され得る。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基（ＮＨＳ基）などのアミン反応性基を担持するアンサマイトシン誘導体は、本明細書に記載の通りに調製する。最初、複数の過剰アミン反応性アンサマイトシン誘導体で抗体の滴定を行い、アンサマイトシン誘導体と抗体の望ましい割合を決定する。典型的には、ヒト化抗体の６〜１０倍モル過剰の範囲である。
単一段階過程で、ヒト化抗体を、アミン反応性ＮＨＳ基を担持する過剰アンサマイトシン誘導体と、水性緩衝液中５〜１０ｍｇ／ｍＬの濃度で、ｐＨ６．０〜８．０、雰囲気温度で１〜２４時間反応させる。抗体−アンサマイトシン誘導体コンジュゲートをゲルクロマトグラフィーで精製し、その後分解する。最終的なコンジュゲートにおいて、抗体分子１個当たりのアンサマイトシン誘導体分子の連結数は、２５２および２８０ｎｍにおけるコンジュゲートの吸光度を測定し、これら二つの波長におけるアンサマイトシン誘導体と抗体の減衰係数を用いて決定する（図１９、ｍ＝１〜１０）。
実施例２４：
酸不安定性リンカーと用いて、抗体分子１個につき複数のアンサマイトシン誘導体分子を連結させる、抗体とのコンジュゲート
抗体を、本発明のカルボニル担持アンサマイトシン誘導体の複数の分子とコンジュゲートする二段階過程において、まずヒト化抗体を、アミン反応性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基（ＮＨＳ基）とカルボニル反応性ヒドラジン基の両方を含有する市販の過剰ヘテロ二官能性リンカーで修飾し、複数のリンカー分子を抗体分子に取り込む。かかる市販の架橋剤の例として、スクシンイミジル６−ヒドラジノニコチンアミド・アセトン・ヒドラゾン（ＳＡＮＨ）、スクシンイミジル４−ヒドラジドテレフタレート塩酸塩（ＳＨＴＨ）およびスクシンイミジル・ヒドラジニウム・ニコチネート塩酸塩（ＳＨＮＨ）が含まれる。その後、修飾抗体を過剰ケトンまたはアルデヒド担持アンサマイトシン誘導体と反応させて、酸不安定性連結を介してアンサマイトシン誘導体を抗体とコンジュゲートさせる。
酸不安定性連結を担持するコンジュゲートも、本発明のヒドラジン担持アンサマイトシン誘導体を用いて調製する。上記の二段階過程と同様に、ヒト化抗体を、アミン反応性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基とヒドラジン反応性カルボニル基を担持する市販のヘテロ二官能性架橋剤で修飾する。かかる架橋剤の例として、スクシンイミジル−ｐ−ホルミルベンゾエート（ＳＦＢ）およびスクシンイミジル−ｐ−ホルミルフェにキシアセテート（ＳＦＰＡ）が含まれる。その後、リンカー修飾抗体を、過剰ヒドラジド担持アンサマイトシン誘導体と反応させて、酸不安定性連結を介して連結した抗体−アンサマイトシン誘導体コンジュゲートを生じさせる（図２０〜２２、ｍ＝１〜１０）。
実施例２５：アミン反応性アンサマイトシン誘導体１３ａを以下のように調製した（図１１を参照）
マイタンシノールのヘキサンジオイック酸−１−［トリメチルシリル）エチル］エステル（１４ａ）
反応フラスコに、６−オキソ−６−（２−（トリメチルシリル）エトキシ）ヘキサン酸（５２３ｍｇ、２．１２４ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（４３８ｍｇ、２．１２４ｍｍｏｌ）および塩化メチレン（２．５ｍＬ）を入れた。４−ジメチルアミノピリジン（８６ｍｇ、０．７０８ｍｍｏｌ）を加えて溶液を攪拌し、続いて、マイタンシノール（２００ｍｇ、０．３５４ｍｍｏｌ）を加えた。反応物を室温で４時間攪拌した。４時間攪拌した後、粗反応混合物を遠心分離し、真空で濃縮した。得られた原油をセミ分取Ｃ１８ＨＰＬＣで精製して、３２ｍｇの１４ａを収率１１．４％で生じさせた。ＨＲＭＳ（Ｍ＋Ｎａ）＋実測値：８１５．３２９９、計算値：８１５．３３１２ １Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ６．８４（ｓ、１Ｈ）、６．７７（ｓ、１Ｈ）、６．４３（ｄｄ、Ｊ＝１５．３、１１．０Ｈｚ、１Ｈ）、６．３２（ｓ、１Ｈ）、６．１７（ｄ、Ｊ＝１０．９Ｈｚ、１Ｈ）、５．５２（ｄｄ、Ｊ＝１５．４、８．９Ｈｚ、１Ｈ）、４．８９（ｄｄ、Ｊ＝１１．９、２．８Ｈｚ、１Ｈ）、４．２４（ｔ、Ｊ＝１０．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．１５（ｍ、２Ｈ）、３．９９（ｓ、３Ｈ）、３．５２（ｍ、２Ｈ）、３．３７（ｓ、３Ｈ）、３．２２（ｓ、２Ｈ）、３．１７（ｍ、１Ｈ）、３．１６（ｓ、３Ｈ）、２．８７（ｄ、Ｊ＝９．７Ｈｚ、１Ｈ）、２．４９（ｍ、２Ｈ）、２．３４（ｍ、２Ｈ）、２．１８（ｄｄ、Ｊ＝１３．９、２．７Ｈｚ、１Ｈ）、２．００（ｓ、３Ｈ）、１．６８（ｓ、３Ｈ）、１．６３（ｄ、Ｊ＝１３．６Ｈｚ、１Ｈ）、１．４６（ｍ、１Ｈ）、１．２７（ｄ、Ｊ＝６．３Ｈｚ、３Ｈ）、１．２２（ｍ、１Ｈ）、０．９７（ｍ、２Ｈ）、０．８３（ｓ、３Ｈ）、０．０３（ｓ、９Ｈ）。
マイタンシノールのヘキサンジオイック酸エステル of マイタンシノール （１４ｂ）
トリメチルシリル保護化アンサマイトシン誘導体１４ａ（３０ｍｇ、０．０３８ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（０．３８ｍＬ）に溶解し、０℃まで冷却した。いったん冷却すると、反応物をテトラヒドロフラン（０．０４５ｍＬ、０．０４５ｍｍｏｌ）中の１Ｍのテトラブチルアンモニウムフッ化物で処理した。冷却槽を除去し、反応物を室温に温め、６時間攪拌した。その後、飽和塩化アンモニウムで反応を消し、酢酸エチルに抽出して、ブラインで洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥して、真空で濃縮した。粗産物をセミ分取 C18 HPLCで精製し、５．４ｍｇの所望のカルボン酸アンサマイトシン誘導体１４ｂを２０．６％収率で生じさせた。ＨＲＭＳ（Ｍ＋Ｎａ）＋実測値：７１５．２５９３、計算値：７１５．２６０４ １Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ６．８４（ｓ、１Ｈ）、６．７９（ｓ、１Ｈ）、６．６３（ｓ、１Ｈ）、６．４２（ｄｄ、Ｊ＝１５．３、１０．９Ｈｚ、１Ｈ）、６．１６（ｄ、Ｊ＝１０．６Ｈｚ、１Ｈ）、５．５３（ｄｄ、Ｊ＝１５．５、８．８Ｈｚ、１Ｈ）、４．８８（ｄ、Ｊ＝９．１Ｈｚ、１Ｈ）、４．２６（ｔ、Ｊ＝１０．９Ｈｚ、１Ｈ）、３．９９（ｓ、３Ｈ）、３．７２（ｍ、２Ｈ）、３．５１（ｍ、１Ｈ）、３．３７（ｓ、３Ｈ）、３．１９（ｓ、３Ｈ）、２．９１（ｄ、Ｊ＝９．７Ｈｚ、１Ｈ）、２．７１（ｍ、１Ｈ）、２．５３（ｍ、１Ｈ）、２．４１（ｍ、３Ｈ）、２．２０（ｄ、１Ｈ）、２．０１（ｓ、３Ｈ）、１．７３（ｍ、２Ｈ）、１．６８（ｓ、３Ｈ）、１．６１（ｄ、Ｊ＝１３．７Ｈｚ、１Ｈ）、１．４６（ｍ、１Ｈ）、１．２６（ｍ、３Ｈ）、０．８２（ｓ、３Ｈ）。
マイタンシノールのヘキサンジオイック酸エステルのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（１３a)
反応フラスコに１４ｂ（５ｍｇ、０．００７ｍｍｏｌ）および塩化メチレン（１ｍＬ）を入れた。連続して、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（４．１５ｍｇ、０．０３６ｍｍｏｌ）および１−エチル−３−（３−ｄｉメチルアミノプロピル）カルボジイミド（６．９１ｍｇ、０．０３６ｍｍｏｌ）を攪拌する混合物に加えた。一晩、室温で反応を行った。完了後、反応容積を真空で減らし、産物をセミ分取Ｃ１８ＨＰＬＣで精製した。留分を含有する産物を回収し、冷凍し、凍結乾燥して、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル基を担持する、０．９１ｍｇの所望のアンサマイトシン誘導体１３ａを、収率１５．９％で生じさせた。ＨＲＭＳ（Ｍ＋Ｎａ）＋実測値：８１２．２７６３、計算値：８１２．２７６８。
実施例２６：チオール含有アンサマイトシン誘導体６を以下のように調製した（図５を参照）
マイタンシノールの３−（メチルジチオ）プロパン酸エステル（４５）
反応フラスコに、３−メルカプトプロパン酸（２８、３１８ｍｇ、２．０８８ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（４３１ｍｇ、２．０８８ｍｍｏｌ）および塩化メチレン（２．０ｍＬ）を入れた。４−ジメチルアミノピリジン（８５ｍｇ、０．６９６ｍｍｏｌ）およびマイタンシノール（１９７ｍｇ、０．３４８ｍｍｏｌ）を連続して加えながら、溶液を攪拌した。反応物を２時間室温で攪拌した。２時間後、反応物を濾過して沈殿物を除去し、真空で濃縮した。産物をセミ分取Ｃ１８ＨＰＬＣで単離した。留分を含有する産物を混ぜ合わせ、濃縮して乾燥させ、９３ｍｇ（収率３８．４％）の化合物４５を生じさせた。ＨＲＭＳ（Ｍ＋Ｎａ）＋実測値：７６３．２４４８、計算値：７６３．２４６０．１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ６．８４（ｓ、１Ｈ）、６．８２（ｓ、１Ｈ）、６．４５（ｄｄ、Ｊ＝１５．４、１１．１Ｈｚ、１Ｈ）、６．３２（ｓ、１Ｈ）、６．１９（ｄ、Ｊ＝１１．０Ｈｚ、１Ｈ）、５．５４（ｄｄ、Ｊ＝１５．４、８．８Ｈｚ、１Ｈ）、４．９８（ｄｄ、Ｊ＝１１．９、２．６Ｈｚ、１Ｈ）、４．２３（ｔ、Ｊ＝１１．２Ｈｚ、１Ｈ）、３．９９（ｓ、３Ｈ）、３．５２（ｔ、Ｊ＝１２．１Ｈｚ、２Ｈ）、３．３７（ｓ、３Ｈ）、３．２０（ｍ、２Ｈ）、３．１６（ｓ、３Ｈ）、２．８９（ｍ、２Ｈ）、２．８３（ｄ、Ｊ＝９．７Ｈｚ、１Ｈ）、２．７０（ｍ、２Ｈ）、２．５２（ｍ、１Ｈ）、２．２０（ｄｄ、Ｊ＝１３．９、２．４Ｈｚ、１Ｈ）、１．７２（ｍ、１Ｈ）、１．６８（ｓ、３Ｈ）、１．６２（ｄ、Ｊ＝１３．５Ｈｚ、２Ｈ）、１．４８（ｍ、１Ｈ）、１．２８（ｄ、Ｊ＝６．３Ｈｚ、３Ｈ）、１．２３（ｄ、Ｊ＝１３．５Ｈｚ、１Ｈ）、０．８４（ｓ、３Ｈ）．
１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ１７０．６５、１６８．６６、１５２．４６、１４９．４７、１４２．６５、１４０．２０、１２８．２４、１２４．６３、１２２．４２、１１９．５８、１１３．１６、８８．２２、８１．２４、７４．４６、６６．３２、６０．４８、５６．８６、５６．７３、４７．２９、３８．４８、３５．８３、３４．３８、３３．５５、３２．９３、３１．３９、２４．８６、２２．８７、２２．３１、１５．９０、１４．７６、１４．６５、１２．２２。
マイタンシノールの３−チオプロパン酸エステル（６）
１０ｍＬの攪拌棒付き丸底フラスコで、１，２−ジメトキシエタン（３ｍＬ）に４５（４５ｍｇ、０．０６４ｍｍｏｌ）を溶かし、溶液を調製した。その後、リン酸塩緩衝液ｐＨ７．５（３ｍＬ、１００ｍＭのリン酸カリウム、２ｍＭのＥＤＴＡ）中のＤ，Ｌ−ジチオトレイトール（４９．６ｍｇ、０．３２２ｍｍｏｌ）を加えた。反応フラスコには隔壁を設け、アルゴン雰囲気下で反応完了まで攪拌しながら、室温で反応を進めた。反応容積を真空で減少させ、産物をセミ分取Ｃ１８精製で単離した。留分を含有する産物を化合物溶出後に冷凍し、凍結乾燥して４ｍｇ（収率９．５％）の化合物６を白色固体として生じさせた。
ＨＲＭＳ（Ｍ＋Ｎａ）＋実測値：６７５．２０９２、計算値：６７５．２１１４ １Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ６．８４（ｓ、１Ｈ）、６．７７（ｓ、１Ｈ）、６．４３（ｄｄ、Ｊ＝１５．３、１１．０Ｈｚ、１Ｈ）、６．３２（ｓ、１Ｈ）、６．１７（ｄ、Ｊ＝１０．９Ｈｚ、１Ｈ）、５．５２（ｄｄ、Ｊ＝１５．４、８．９Ｈｚ、１Ｈ）、４．８９（ｄｄ、Ｊ＝１１．９、２．８Ｈｚ、１Ｈ）、４．２４（ｔ、Ｊ＝１０．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．１５（ｍ、２Ｈ）、３．９９（ｓ、３Ｈ）、３．５２（ｄｄ、Ｊ＝１６．５、１１．０Ｈｚ、１Ｈ）、３．３７（ｓ、３Ｈ）、３．２０（ｍ、２Ｈ）、３．１６（ｓ、３Ｈ）、２．８７（ｄ、Ｊ＝９．７Ｈｚ、１Ｈ）、２．５１（ｍ、１Ｈ）、２．３４（ｍ、２Ｈ）、２．１８（ｄｄ、Ｊ＝１３．９、２．７Ｈｚ、１Ｈ）、１．６８（ｓ、３Ｈ）、１．６３（ｄ、Ｊ＝１３．６Ｈｚ、１Ｈ）、１．４６（ｍ、１Ｈ）、１．２７（ｄ、Ｊ＝６．３Ｈｚ、２Ｈ）、１．２２（ｍ、１Ｈ）、０．９７（ｍ、１Ｈ）、０．８３（ｓ、３Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ１７０．３５、１６８．７１、１５６．１８、１５２．３２、１４２．６６、１４０．３７、１４０．１４、１３２．５５、１２８．１４、１２４．４８、１２２．３３、１１９．６１、１１３．１５、８８．２６、８１．２１、７７．３０、７４．４２、６６．１６、６０．４９、５６．８８、５６．７２、４７．３１、３８．６７、３８．４８、３５．８５、３５．８１、３２．９５、１９．８４、１５．９３、１４．６５、１２．２７。
チオール含有アンサマイトシン５８を以下のように調製した（図１３Ｂを参照）
２−（メチルジチオ）プロパン酸（５６）
攪拌棒付き丸底フラスコに、２−メルカプトプロパン酸（１．９９ｍＬ、２．３９ｇ、２２．５５ｍｍｏｌ）および水（５０．０ｍＬ）を入れた。炭酸ナトリウム（４．７７ｇ、４５．００ｍｍｏｌ）を反応フラスコにゆっくりと加えながら、反応物を攪拌した。それとは別に、エタノール（５０．０ｍＬ）にメチルメタンチオールスルホン酸塩（２．７７ｍＬ、２９．３ｍｍｏｌ）を溶かして溶液を調製し、ゆっくりと攪拌反応溶液に加えた。室温で２時間、アルゴン雰囲気下で反応を行った。反応終了後、反応容積を真空で元の容積の２分の１に減少させた。残りの水性溶液を、１ＭのＨＣｌを用いてｐＨ２に酸化し、酢酸エチル（２×２５０ｍＬ）で抽出した。有機抽出物を混合し、ブラインで洗浄し、真空で濃縮して、原油を生じさせた。産物を、シリカクロマトグラフィーにより、ヘキサン：酢酸エチル：酢酸（５０：４９：１）の混合物で溶出して精製した。留分を含有する産物を混ぜ合わせて真空で濃縮し、２．３ｇの精製された無色の５６を、収率６７％で生じさせた。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ１．５２０（３Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．２Ｈｚ）、２．４４６（３Ｈ、ｓ）、３．５５９（１Ｈ、ｍ）。
マイタンシノールの２−（メチルジチオ）プロパン酸エステル（５７）
丸底フラスコに、２−（メチルジチオ）プロパン酸（５６、３０３．３ｍｇ、１．９９２ｍｍｏｌ）、塩化メチレン（２ｍＬ）を入れ、攪拌棒を挿入した。溶液を攪拌しながら、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（４３８ｍｇ、２．１２４ｍｍｏｌ）を加え、その後、４−ジメチルアミノピリジン（８６ｍｇ、０．７０８ｍｍｏｌ）およびマイタンシノール（２００．０ｍｇ、０．３５４ｍｍｏｌ）を連続して加えた。フラスコには隔壁を設け、室温で攪拌しながら反応を進めた。１時間後、反応物を酢酸エチル（２０ｍＬ）で希釈し、濾過し、飽和炭酸水素ナトリウム溶液（１０ｍＬ）とブライン（５ｍＬ）で連続して洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空で濃縮した。産物をセミ分取Ｃ１８ＨＰＬＣにより水性の０．１％ギ酸中のアセトニトリルの直線勾配で溶出して単離した。留分を含有する産物を回収し、混合し、真空で濃縮して、８．５３ｍｇの化合物５７を３．３％収率で生じさせた。ＨＲＭＳ（Ｍ＋Ｎａ）＋実測値：７２１．１９９８、計算値：７２１．１９９１ １Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ６．９１（ｄ、Ｊ＝１．４Ｈｚ、１Ｈ）、６．８３（ｓ、１Ｈ）、６．４２（ｄｄ、Ｊ＝１５．４、１１．０Ｈｚ、１Ｈ）、６．３１（ｓ、１Ｈ）、６．１６（ｄ、Ｊ＝１０．９Ｈｚ、１Ｈ）、５．５４（ｄｄ、Ｊ＝１５．５、９．０Ｈｚ、１Ｈ）、４．９１（ｄｄ、Ｊ＝１２．０、３．０Ｈｚ、１Ｈ）、４．２６（ｔ、Ｊ＝１１．０Ｈｚ、１Ｈ）、３．９９（ｓ、３Ｈ）、３．６５（ｄｄ、Ｊ＝１４．５、７．２Ｈｚ、１Ｈ）、３．５１（ｄｄ、Ｊ＝１０．６、７．９Ｈｚ、１Ｈ）、３．３６（ｄ、Ｊ＝３．６Ｈｚ、３Ｈ）、３．１９（ｓ、３Ｈ）、２．８６（ｍ、１Ｈ）、２．５７（ｄｄ、Ｊ＝１４．１、１２．０Ｈｚ、１Ｈ）、２．４９（ｓ、３Ｈ）、２．２４（ｍ、１Ｈ）、１．８９（ｍ、１Ｈ）、１．７８（ｄ、Ｊ＝７．１Ｈｚ、１Ｈ）、１．６９（ｓ、３Ｈ）、１．６８（ｄ、Ｊ＝３．１Ｈｚ、３Ｈ）、１．６５（ｄ、Ｊ＝４．１Ｈｚ、１Ｈ）、１．４７（ｍ、１Ｈ）、１．２９（ｄ、Ｊ＝６．２Ｈｚ、３Ｈ）、１．２５（ｓ、１Ｈ）、０．８２（ｓ、３Ｈ）。
マイタンシノールの２−（チオ）プロパン酸エステル（５８）
丸底フラスコに５７（８ｍｇ、０．０１１ｍｍｏｌ）、１，２−ジメトキエタン（１ｍＬ）を入れ、攪拌棒を挿入した。それとは別に、リン酸塩緩衝液ｐＨ７．５（３ｍＬ、１００ｍＭのリン酸カリウム、２ｍＭのＥＤＴＡ）にＤ，Ｌ−ジチオトレイトール（５．２９ｍｇ、０．０３４ｍｍｏｌ）を溶かして溶液を調製し、反応フラスコに加えた。アルゴン雰囲気下で、反応終了まで室温で攪拌しながら反応を進めた。反応完了（９０分）に伴い、反応混合物を蒸発させ、真空で乾燥し、セミ分取Ｃ１８ＨＰＬＣで精製した。産物を回収し、冷凍し、凍結乾燥させて、１．６ｍｇの化合物５８を、９７．１％精度、１８．２％収率で単離し、生じさせた。ＭＳ計算値（Ｍ＋Ｎａ）＋ ６７５．２；実測値 ６７６．２、ＭＳ計算値（Ｍ−Ｈ）− ６５１．１；実測値 ６５１．２。
実施例２８：チオール含有アンサマイトシン５５を以下のように調製した（図１３Ａ参照）
６−（メチルジスルファニル）ヘキサン酸（５３）
反応フラスコを氷浴で冷却し、６−メルカプトヘキサン酸（５００ｍｇ、３．３７ｍｍｏｌ）と水（２ｍＬ）を入れた。エタノール（１ｍＬ）に溶かしたメチルメタンチオールスルホン酸塩（４６８ｍｇ、３．７１ｍｍｏｌ）を加え、溶液を攪拌した。反応物を室温で一晩中、アルゴン雰囲気下で攪拌した。その後、反応混合物を飽和塩化ナトリウム（４００ｍＬ）で希釈し、エーテル（３×１５０ｍＬ）で抽出した。混合抽出物を塩化ナトリウム溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、真空で濃縮した。産物をシリカフラッシュクロマトグラフィーを介して、ヘキサン：酢酸エチル：酢酸（１：０．９：０．１）の混合物で溶出して単離し、４８２ｍｇ（収率７３．５％）の化合物５３を生じさせた。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、ｒｅｆ．７．２６ｐｐｍ）δ１．４７３（２Ｈ、ｍ）、１．７０２（４Ｈ、ｍ）、２．３５９（２Ｈ、ｔ）、２．４０５（３Ｈ、ｓ）、２．７０８（２Ｈ、t)。
マイタンシノールの６−（メチルジチオ）ヘキサン酸エステル（５４）
反応フラスコに６−（メチルジスルファニル）ヘキサン酸（５３、４１３ｍｇ、２．１２４ｍｍｏｌ）と塩化メチレン（２．０ｍＬ）を入れた。攪拌した溶液を、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（４３８ｍｇ、２．１２４ｍｍｏｌ）、４−ジメチルアミノピリジン（８６ｍｇ、０．７０８ｍｍｏｌ）およびマイタンシノール（２００ｍｇ、０．３５４ｍｍｏｌ）で連続処理した。室温で一晩中攪拌しながら反応を進めた。反応混合物を濾過し、真空で濃縮し、セミ分取Ｃ１８ＨＰＬＣで精製して３６．７ｍｇの５４を収率１３．９％で生じさせた。ＨＲＭＳ（Ｍ＋Ｎａ）＋実測値：７６３．２４４８、計算値：７６３．２４６０ １Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ６．８３（ｓ、１Ｈ）、６．７７（ｓ、１Ｈ）、６．４４（ｍ、１Ｈ）、６．３９（ｓ、１Ｈ）、６．１５（ｄ、Ｊ＝１１．２Ｈｚ、１Ｈ）、５．４９（ｍ、１Ｈ）、４．８９（ｄｄ、Ｊ＝１１．８、２．６Ｈｚ、１Ｈ）、４．２４（ｔ、Ｊ＝１０．５Ｈｚ、１Ｈ）、３．９８（ｓ、３Ｈ）、３．５１（ｍ、１Ｈ）、３．３６（ｓ、３Ｈ）、３．２０（ｄ、１Ｈ）、３．１７（ｓ、３Ｈ）、２．８７（ｍ、１Ｈ）、２．６９（ｍ、２Ｈ）、２．５０（ｍ、２Ｈ）、２．４２（ｓ、３Ｈ）、２．３９（ｓ、１Ｈ）、２．３９（ｓ、１Ｈ）、２．３４（ｍ、１Ｈ）、２．１７（ｄ、１Ｈ）、２．００（ｓ、３Ｈ）、１．７２（ｍ、６Ｈ）、１．４５（ｍ、２Ｈ）、１．２７（ｄ、Ｊ＝６．３Ｈｚ、３Ｈ）、０．８２（ｓ、３Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ１７２．０４、１６８．９７、１５９．４９、１５６．２１、１５２．５１、１５１．６５、１４２．７０、１４０．１７、１３２．５０、１２８．１９、１２４．６０、１２２．２３、１１３．１３、８８．３２、８１．１４、７４．４７、６６．４４、６０．４９、５６．７２、４７．３５、４４．０３、３８．６０、３８．０３、３５．７６、３４．０５、３２．９１、２８．９３、２７．９０、２５．３７、２４．３６、２３．３０、２２．３０、１５．９２、１４．６７、１２．２３。
マイタンシノール６−メルカプトヘキサン酸エステル（５５）
ジスルフィド担持アンサマイトシン誘導体５４（３０．０ｍｇ、０．０４０ｍｍｏｌ）を、攪拌棒を備えた１０ｍＬの丸底フラスコの中で、１，２−ジメトキシエタン（３ｍＬ）に溶解した。リン酸塩緩衝液ｐＨ７．５（３ｍＬ、１００ｍＭリン酸カリウム、２ｍＭのＥＤＴＡ）中のＤ，Ｌ−ジチオトレイトール（３１．２ｍｇ、０．２０２ｍｍｏｌ）を加えた。反応フラスコに隔壁を設け、アルゴン雰囲気下で３．５時間攪拌しながら、室温で反応を行った。産物をセミ分取Ｃ１８ＨＰＬＣ精製で単離した。産物を溶出後に冷凍し、凍結乾燥し、１２．５ｍｇ（収率４４．６％）の５５を生じさせた。ＨＲＭＳ（Ｍ＋Ｎａ）＋ 実測値：７１７．２５６３、計算値：７１７．２５８３ １Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚＣＤＣｌ３）δ６．８４（ｄ、Ｊ＝１．５Ｈｚ、１Ｈ）６．７７（ｄ、Ｊ＝１．５Ｈｚ１Ｈ）６．４４（ｄｄ、Ｊ＝１５．４１１．０Ｈｚ１Ｈ）６．３４（ｓ１Ｈ）６．１６（ｄ、Ｊ＝１１．２Ｈｚ１Ｈ）５．４９（ｄｄ、Ｊ＝１５．４８．９Ｈｚ１Ｈ）４．８９（ｄｄ、Ｊ＝１１．９２．８Ｈｚ１Ｈ）４．２５（ｔ、Ｊ＝１０．５Ｈｚ１Ｈ）３．９９（ｓ、３Ｈ）３．７２（ｑ、Ｊ＝７．０Ｈｚ１Ｈ）３．５１（ｍ、１Ｈ）３．３７（ｓ、３Ｈ）３．２１（ｄ、Ｊ＝１２．８Ｈｚ１Ｈ）３．１７（ｓ、３Ｈ）２．８８（ｍ、１Ｈ）２．５２（ｍ、６Ｈ）２．３５（ｍ、１Ｈ）２．１９（ｄｄ、Ｊ＝１３．７２．７Ｈｚ１Ｈ）１．６６（ｄ、Ｊ＝７．３Ｈｚ３Ｈ）１．６１（ｍ、２Ｈ）１．４６（ｍ、４Ｈ）１．３６（ｍ、１Ｈ）１．２６（ｍ、３Ｈ）０．８３（ｓ３、Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚＣＤＣｌ３）δ１７２．０４１６８．８２１５６．２２１５２．４１１４２．７２１４０．１９１３２．５１１２８．１７１２４．５８１２２．２２１１９．６７１１３．１２８８．３４８１．１４７４．４５６６．４７６０．４６５６．７３４７．３７４４．０３３８．６１３５．７５３４．０７３３．６６３２．９１２９．８５２９．４３２８．７０２８．３２２７．８１２４．４１１５．９２１４．６７１２．２３。
実施例２９：チオール含有アンサマイトシン誘導体１９を以下のように調製した（図６Ｂ）
４−（（メチルジスルファニル）メチル）安息香酸（３７ｂ）
４−（メルカプトメチル）安息香酸（３６、５００ｍｇ、２．９７ｍｍｏｌ）を水（１０ｍＬ）に溶かし、冷浴で冷却した。エタノール（５．００ｍＬ）に溶かしたメチルメタンチオールスルホン酸塩（４１３ｍｇ、３．２７ｍｍｏｌ）を加えながら、冷却した溶液を攪拌した。加えた後に、冷却槽を取り除き、反応物を一晩中室温で攪拌した。一晩中反応を行った後、反応物を飽和塩化ナトリウムで希釈し、エーテルで抽出した。混合抽出物を塩化ナトリウムで洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥して、真空で濃縮した。産物をシリカフラッシュクロマトグラフィーを用いて、１％酢酸を含有するヘキサン中の４０〜６０％の酢酸エチル勾配で２０分間溶出して単離し、４８２ｍｇの所望の産物４−（（メチルジスルファニル）メチル）安息香酸（３７ｂ）を７３．５％の収率で生じさせた。
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ２．１２１（３Ｈ、ｓ）、３．９３８（２Ｈ、ｓ）、７．４５７（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．４Ｈｚ）、８．０６８（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝８Ｈｚ）。
マイタンシノールの４−（（メチルジスルファニル）メチル）安息香酸エステル（５９）
塩化メチレン（２．０ｍＬ）に４−（（メチルジスルファニル）メチル）安息香酸（３７ｂ、２２８ｍｇ、１．０６２ｍｍｏｌ）を溶かした溶液を、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（２１９ｍｇ、１．０６２ｍｍｏｌ）、４−ジメチルアミノピリジン（４３．２ｍｇ、０．３５４ｍｍｏｌ）およびマイタンシノール（１００ｍｇ、０．１７７ｍｍｏｌ）で連続処理した。７２時間攪拌しながら反応を行い、その後、反応混合物を濾過し、真空で濃縮し、セミ分取Ｃ１８ＨＰＬＣで精製し、３．４ｍｇの化合物５９（収率２．５％）を生じさせた。ＨＲＭＳ（Ｍ＋Ｎａ）＋実測値：７８３．２１５５、計算値：７８３．２１４７ １Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ８．０３（ｄ、Ｊ＝８．２Ｈｚ、２Ｈ）、７．４９（ｄ、Ｊ＝８．２Ｈｚ、２Ｈ）、７．０５（ｄ、Ｊ＝１．５Ｈｚ、１Ｈ）、６．８５（ｄ、Ｊ＝１．５Ｈｚ、１Ｈ）、６．２８（ｄｄ、Ｊ＝１５．４、１０．９Ｈｚ、１Ｈ）、６．１２（ｓ、１Ｈ）、５．８８（ｄ、Ｊ＝１０．８Ｈｚ、１Ｈ）、５．０２（ｄｄ、Ｊ＝１２．０、３．３Ｈｚ、１Ｈ）、４．７８（ｄｄ、Ｊ＝１５．４、９．１Ｈｚ、１Ｈ）、４．２７（ｔ、Ｊ＝１０．４Ｈｚ、１Ｈ）、４．００（ｓ、３Ｈ）、３．９７（ｓ、２Ｈ）、３．４８（ｄ、Ｊ＝１２．９Ｈｚ、１Ｈ）、３．３４（ｄ、Ｊ＝９．１Ｈｚ、１Ｈ）、３．２３（ｓ、３Ｈ）、３．１９（ｓ、３Ｈ）、３．１４（ｄ、Ｊ＝９．６Ｈｚ、１Ｈ）、２．７５（ｔ、Ｊ＝１３．２Ｈｚ、１Ｈ）、２．３３（ｄｄ、Ｊ＝１４．３、３．２Ｈｚ、１Ｈ）、２．２３（ｓ、３Ｈ）、１．６６（ｓ、３Ｈ）、１．５９（ｄ、Ｊ＝１３．３Ｈｚ、１Ｈ）、１．５３〜１．３６（ｍ、１Ｈ）、１．３１（ｄ、Ｊ＝６．３Ｈｚ、３Ｈ）、１．１４（ｔ、Ｊ＝１２．９Ｈｚ、２Ｈ）、０．８４（ｓ、３Ｈ）。
マイタンシノールの４−メルカプトメチル安息香酸エステル（１９）
１０ｍＬの丸底フラスコに５９（３ｍｇ、０．００４ｍｍｏｌ）、１，２−ジメトキシエタン（３ｍＬ）を入れ、攪拌棒を挿入した。それとは別に、リン酸塩緩衝液ｐＨ７．５（３ｍＬ、１００ｍＭのリン酸カリウム、２ｍＭのＥＤＴＡ）に溶かしたＤ，Ｌ−ジチオトレイトール（３．０４ｍｇ、０．０２０ｍｍｏｌ）の溶液を調製し、反応フラスコに加えた。反応フラスコに隔壁を設け、アルゴン雰囲気下で３．５時間攪拌しながら、室温で反応を行った。その後、反応容積を真空で濃縮し、産物をセミ分取Ｃ１８精製で単離した。留分を含有する産物を溶出後に冷凍し、凍結乾燥して１．４ｍｇ（収率３５．５％）の化合物１９を白色固体として生じさせた。ＨＲＭＳ（Ｍ＋Ｎａ）＋実測値：７３７．２２６９、計算値：７３７．２２７０。
実施例３０：ペグ化された、チオール反応性アンサマイトシン６０を以下のように調製した（図７Ｂを参照）
マイタンシノールのＰＥＧ４−ＳＰＤＰエステル（６０）
１０ｍＬの丸底フラスコに、ＳＰＤＰ−ｄＰＥＧ４−酸（Ｑｕａｎｔａ Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ社、カタログ番号１０３７３、１００ｍｇ、０．２１６ｍｍｏｌ）および塩化メチレン（２ｍＬ）を入れた。フラスコに攪拌棒を挿入し、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（１３４ｍｇ、０．６４８ｍｍｏｌ）を加えながら、溶液を攪拌した。その後、マイタンシノール（６１．０ｍｇ、０．１０８ｍｍｏｌ）および４−ジメチルアミノピリジン（２６．４ｍｇ、０．２１６ｍｍｏｌ）を連続して加えた。フラスコに隔壁を設け、室温で攪拌しながら反応を行った。２．５時間後、粗反応混合物を濾過し、真空で濃縮し、セミ分取Ｃ１８HPLCで精製した。留分を含有する産物を混ぜ合わせて真空で濃縮し、３０ｍｇの化合物６０を収率２７％で生じさせた。
ＭＳ計算値（Ｍ＋Ｎａ）＋ １０３１．３；実測値 １０３１．３；ＭＳ計算値（Ｍ＋Ｃｌ）− １０４３．３；実測値 １０４３．２ １Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ８．４３（ｄ、Ｊ＝４．１Ｈｚ，１Ｈ）、７．６７（ｍ、２Ｈ）、７．０８（ｍ、１Ｈ）、６．８２（ｓ、１Ｈ）、６．７６（ｄ、Ｊ＝１．３Ｈｚ、１Ｈ）、６．６５（ｓ、１Ｈ）、６．４２（ｄｄ、Ｊ＝１５．４、１１．０Ｈｚ、１Ｈ）、６．２０（ｄ、Ｊ＝１１．０Ｈｚ、１Ｈ）、５．６１（ｄｄ、Ｊ＝１５．５、８．９Ｈｚ、１Ｈ）、４．９３（ｄｄ、Ｊ＝１１．８、２．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．５５（ｓ、１Ｈ）、４．２４（ｔ、Ｊ＝１１．２Ｈｚ、１Ｈ）、３．９７（ｓ、３Ｈ）、３．８７（ｍ、１Ｈ）、３．６３（ｍ、８Ｈ）、３．５０（ｍ、３Ｈ）、３．３２（ｓ、３Ｈ）、３．１５（ｓ、３Ｈ）、３．０７（ｍ、２Ｈ）、２．８１（ｄ、Ｊ＝９．５Ｈｚ、２Ｈ）、２．７０（ｍ、１Ｈ）、２．６２（ｍ、２Ｈ）、２．４８（ｍ、１Ｈ）、２．１６（ｄｄ、Ｊ＝１３．９、２．４Ｈｚ、１Ｈ）、１．９１（ｍ、１Ｈ）、１．６９（ｍ、２Ｈ）、１．６５（ｓ、３Ｈ）、１．５９（ｍ、２Ｈ）、１．４７（ｍ、１Ｈ）、１．３２（ｍ、２Ｈ）、１．２６（ｄ、Ｊ＝６．４Ｈｚ、３Ｈ）、１．１０（ｍ、４Ｈ）、０．８４（ｓ、３Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ１７１．０３、１７０．０１、１６８．７６、１６０．０３、１５６．９４、１５６．０９、１５２．８８、１４９．７１、１４２．５９、１４０．３３、１３９．７２、１３７．２８、１３２．２１、１２８．８７、１２４．７４、１２２．２７、１２０．９１、１１９．９１、１１９．４６、１１３．１５、８８．７９、８０．８７、７４．４４、７０．９２、７０．５７、７０．４７、７０．３４、７０．１３、６９．９１、６６．３８、６６．１７、６０．６０、５６．８０、５６．６９、４９．２４、４７．２０、３９．４１、３８．３９、３５．７２、３５．５５、３４．６２、３４．０８、２５．７６、２５．０８、１５．８２、１４．６８、１２．１９。
実施例３１：アンサマイトシン誘導体６４ａおよび６４ｂを以下のように調製した（図１３Ｃ参照）
３，７−ジメチルオキセパン−２−オン（６１）
２５０ｍＬの丸底フラスコに、２，６−ジメチルシクロヘキサノン（２．１６２ｍＬ、２．０ｇ、１５．８５ｍｍｏｌ）および１２６ｍＬのメタノールｌ／水（１：１）混合物を入れた。モノペルオキシフタル酸マグネシウム六水和物（ＭＭＰＰ、１５．６８ｇ、３１．７ｍｍｏｌ）および炭酸水素ナトリウム（２．６６ｇ、３１．７ｍｍｏｌ）を加えながら、溶液を攪拌した。一晩中、室温で攪拌しながら反応を行った。翌日、粗産物を酢酸エチルで抽出し、飽和炭酸水素ナトリウムとブラインで連続して洗浄し、真空で濃縮する前に無水硫酸ナトリウムで乾燥して、１．０７ｇ（収率４７．５％）の３，７−ジメチルオキセパン−２−オン（６１）を透明無色油として生じさせた。
６−メルカプト−２−メチルヘプタン酸（６２）
１０ｍＬの攪拌棒付き丸底フラスコに３，７−ジメチルオキセパン−２−オン（６１、０．７２９ｇ、５．１３ｍｍｏｌ）、よう化水素酸（２．０２９ｍｌ、１５．３８ｍｍｏｌ）およびチオ尿素（２．７３ｇ、３５．９１ｍｍｏｌ）を入れた。フラスコに水冷の水コンデンサを備え、窒素雰囲気下に配置し、加熱環流した。一晩中、環流しながら反応を行った。その後、水（５ｍＬ）に溶かした水酸化ナトリウム（３．６９ｇ、９２ｍｍｏｌ）溶液を反応フラスコに加えた。一晩中反応を環流した。反応混合物を熱から取り出し、室温に冷却して、フラスコの内容物を別の漏斗へ移した。水層を酢酸エチルで抽出し、抽出物を取り分けた。水槽をＨＣｌでｐＨ２に酸化し、酢酸エチル（２×１００ｍＬ）および塩化メチレン（１×１００ｍＬ）で抽出した。有機抽出物を混合し、３０ｍＬのブラインで洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、真空で濃縮して８２３ｍｇの粗６−メルカプト−２−メチルヘプタン酸（６２、収率９２％）を淡褐色の油として生じさせた。
２−メチル−６−（メチルジスルファニル）ヘプタン酸（６３）
１００ｍＬの丸底フラスコに、粗６−メルカプト−２−メチルヘプタン酸（６２、８３２．３ｍｇ、４．７２ｍｍｏｌ）および水（３０ｍＬ）を入れた。炭酸ナトリウム（１．００１ｇ、９．４４ｍｍｏｌ）を攪拌溶液に加えた。それとは別に、エタノール（３０ｍＬ）にメチルメタンチオールスルホン酸塩（０．６６８ｍＬ、７．０８ｍｍｏｌ）を溶かして溶液を調製し、攪拌反応混合物にゆっくりと加えた。添加終了後、反応フラスコに隔壁を設け、アルゴン雰囲気下に配置した。反応混合物を室温で３時間攪拌した。
３時間後、反応容積を真空で半分に減少させた。残りの水槽を別の漏斗に移し、酢酸エチル（２×４０ｍＬ）で２回抽出した。水槽を濃縮ＨＣｌでｐＨ２に酸化し、有機抽出物を取り分けた。酸化後、水槽を酢酸エチル（３×７０ｍＬ）で抽出した。有機抽出物を混ぜ合わせ、産物を抽出して飽和炭酸水素ナトリウム（３×１００ｍＬ）に戻した。水性抽出物を混ぜ合わせ、濃縮ＨＣｌでｐＨ２に酸化した。酸化水層を別の漏斗に移し、産物を酢酸エチル（３×１００ｍＬ）で抽出した。有機抽出物を混合し、５０ｍＬブラインで洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、真空で濃縮して黄色の原油を生じさせた。産物をシリカゲルクロマトグラフィーにより、ヘキサン：酢酸エチル：酢酸（６６：３３：１）の混合物で溶出して精製した。留分を含有する産物を混ぜ合わせて真空で濃縮し、２９２ｍｇの化合物６３を収率２８％で生じさせた。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ１．１８９（３Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．２Ｈｚ）、１．３１７（３Ｈ、ｄ、Ｊ＝６．４Ｈｚ）、１．４４２〜１．７０６（６Ｈ、ｍ）、２．３９２（３Ｈ、ｓ）、２．４７５（１Ｈ、ｍ）、２．８４０（１Ｈ、ｍ）。
マイタンシノールの２−メチル−６−（メチルジスルファニル）ヘプタン酸エステル（６４ａおよび６４ｂ）
１０ｍＬの丸底フラスコにマイタンシノール（２９．６ｍｇ、０．０５２ｍｍｏｌ）、塩化メチレン（３ｍＬ）を入れ、攪拌棒を挿入した。２−メチル−６−（メチルジスルファニル）ヘプタン酸（６３、６９．９ｍｇ、０．３１４ｍｍｏｌ）を加えながら溶液を攪拌し、続いて、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（６４．８ｍｇ、０．３１４ｍｍｏｌ）および４−ジメチルアミノピリジン（１２．８ｍｇ、０．１０５ｍｍｏｌ）を連続して加えた。反応フラスコに隔壁を設け、室温で４時間反応を行った。粗反応混合物を別の漏斗に移し、酢酸エチルで希釈した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウムで２回、ブラインで１回洗浄し、真空で濃縮して黄色の原油を生じさせた。産物をセミ分取Ｃ１８ＨＰＬＣで精製した。産物のラセミ体に対応する２つのピークを別々に回収して、真空で濃縮し、全部で合わせて４．７ｍｇの所望の化合物を生じさせた（６４ａ：２．１ｍｇおよび６４ｂ：２．６ｍｇ）。ＭＳ（Ｍ＋Ｎａ）＋実測値６４ａ：７９１．０、計測値：７９１．３；（Ｍ＋Ｃｌ）− 実測値６４ａ：８０２．９、計測値：８０３．２。ＭＳ（Ｍ＋Ｎａ）＋ 実測値６４ｂ：７９１．１、計測値：７９１．３；（Ｍ＋Ｃｌ）− 実測値６４ｂ：８０２．９、計測値：８０３．２。
実施例３２：アンサマイトシン誘導体６６を以下のように調製した（図１０Ｂ）
マイタンシノールのジメチルアミノ酪酸エステル（６６）
反応フラスコに４−（ジメチルアミノ）−酪酸ＨＣｌ（９３．５ｍｇ、０．５５８ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１５．４５μＬ、０．０８８ｍｍｏｌ）および塩化メチレン（０．２ｍＬ）を入れた。その後、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（１１０ｍｇ、０．５３１ｍｍｏｌ）、４−ジメチルアミノピリジン（２１．６２ｍｇ、０．１７７ｍｍｏｌ）およびマイタンシノール（５０ｍｇ、０．０８８ｍｍｏｌ）を連続して加えた。反応フラスコに隔壁を設け、７２時間攪拌しながら室温で反応を行った。粗反応混合物を濾過し、真空で濃縮しセミ分取Ｃ１８ＨＰＬＣで精製した。留分を含有する産物を回収して混ぜ合わせ、真空で濃縮し、８．２ｍｇ（収率１３．７％）の化合物６６を生じさせた。ＭＳ計算値（Ｍ＋Ｈ）＋；６７８．３；実測値６７８．２。
実施例２３：アンサマイトシン誘導体のｉｎ ｖｉｔｒｏ活性
図２８〜３０は、本発明の様々なアンサマイトシン誘導体の、ＫＢ、ＣＯＬＯ２０５およびＣＯＬＯ２０５−ＭＤＲ細胞株に対する細胞傷害性活性を示している。ジスルフィド担持アンサマイトシン誘導体４５、５４、５７、５９、６４ａおよび６４ｂは、ＩＣ５０値が０．２７ｎＭ〜４ｎＭの範囲で、ＫＢ細胞株に対し効能があった（図２８ａ〜ｄ）。ヒト結腸腫瘍細胞株ＣＯＬＯ２０５に対し試験をすると、ジスルフィド担持アンサマイトシン誘導体５４および５９は、ＩＣ５０値がそれぞれ０．３１ｎＭと０．５３ｎＭで、同様の効能を示した。
化合物１３ａの合成前駆体、アミン反応性の連結可能なアンサマイトシン誘導体を、ＫＢ、ＣＯＬＯ２０５およびＣＯＬＯ２０５−ＭＤＲ細胞株に対し評価した。３つの細胞株に対するＴＭＳ保護化前駆体１４ａの活性は、ＣＯＬＯ２０５細胞に対する０．４０ｎＭから、ＣＯＬＯ２０５ＭＤＲ細胞株に対する０．４８ｎＭの範囲であった。ＴＭＳ保護基を除去した後、端末カルボン酸１４ｂを担持するアンサマイトシン誘導体を単離し、ＫＢ細胞株に対しｉｎ ｖｉｔｒｏで評価した。１４ｂに関しては、ＫＢ細胞株に対するＴＭＳ保護前駆体と比較して、１５倍の活性低下が認められた。効能低下の一番の原因は、荷電アンサマイトシンカルボキシレートの細胞浸透生が低いことが挙げられる。しかし、細胞内送達は、効能を高めるためにモノクロナール抗体などの細胞結合剤をコンジュゲートすることにより達成し得る。
ジメチルアミノ酪酸アンサマイトシン誘導体６６は、３つの細胞株に対し試験された化合物の中で一番効能が低かった。この化合物の非ＭＤＲ細胞株に対するＩＣ５０測定値は、１１〜１２ｎＭであり、ＣＯＬＯ２０５ＭＤＲ細胞株に対しては２０ｎＭ超であった（図３０）。
実施例３４：ジスルフィドリンカーによる抗体とスルフィドリル担持アンサマイトシン誘導体とのコンジュゲーション
スルフィドリル担持アンサマイトシン誘導体５５の溶液（８．４ｍＭのストック、ｗ／ｖ）をＤＭＡで調製した。ストック溶液をエタノールで希釈し、エタノールおよびＤＭＡの試薬ブランクに対し、２８０ｎｍでの吸光度を測定した。ストック５５の濃度を２８０ｎｍにおける５，４５６Ｍ−１の減衰係数を用いて計算した。それは、同波長におけるマイタンシノイドの減衰係数として実験により決定される。
ＤＭＡ（５％、ｖ／ｖ）を含有する、ｐＨ７．５、２０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム緩衝液中の抗ＥｐＣａｍ抗体（５ｍｇ／ｍＬ）を、８倍モル過剰ＳＰＰ（ＤＭＡ中に１０ｍＭ）と３時間、室温で反応させた。その後、修飾抗体をｐＨ６．５、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、５０ｍＭの塩化ナトリウム、２ｍＭのＥＤＴＡ緩衝液で２．５ｍｇ／ｍＬに希釈し、修飾反応で使用されるモル過剰ＳＰＰ当たり、２倍モル過剰の５５で処理された。コンジュゲーション反応は、ｐＨ６．５緩衝液中で、ＤＭＡ（７．５％、ｖ／ｖ）と、室温で２０時間行った。その後、このコンジュゲートを、１０ｍＭのヒスタジン、２５０ｍＭのグリシン、１％のショ糖、ｐＨ５．５から成る緩衝液で均衡させたＮＡＰ−２５（セファデックスＧ２５）カラム上で精製し、分解し、濾過した。分解後、コンジュゲートでは、抗体分子１個当たり３．８個のアンサマイトシン分子が連結した。最終的コンジュゲートにおける抗体分子１個当たりのアンサマイトシン分子の数は、２５２ｎｍおよび２８０ｎｍにおけるコンジュゲートの吸光度測定、ならびにこれら二つの波長におけるマイタンシノイドと抗体の既知の減衰係数を用いて決定された。ＳＥＣ ＨＰＬＣをコンジュゲート上で行い、コンジュゲーション後には８６％が単量体であることが示された。
実施例３４：抗体とアミン反応性アンサマイトシン誘導体のコンジュゲーション
アミン反応性アンサマイトシン誘導体１３ａの５ｍＭのストック（ｗ／ｖ）をＤＭＡで調製した。ストック溶液をエタノールで希釈し、エタノールとＤＭＡの試薬ブランクに対する２８０ｎｍでの吸光度を測定した。ストック１３ａの濃度を、２８０ｎｍにおける５，４５６Ｍ−１の減衰係数を用いて計算した。それは、同波長におけるマイタンシノイドの減衰係数として実験により決定される。
抗−ＥｐＣａｍ抗体を、ＤＭＡ（１０％、ｖ／ｖ）を含む、ｐＨ７．５の２０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム緩衝液中の１２倍モル過剰１３ａ（２．５ｍｇ／ｍＬ）と、室温で４．５時間コンジュゲートした。その後、このコンジュゲートを、１０ｍＭのヒスタジン、２５０ｍＭのグリシン、１％のショ糖、ｐＨ５．５から成る緩衝液で均衡させたＮＡＰ−１０（セファデックスＧ２５）カラム上で精製し、分解し、濾過した。分解後、
コンジュゲートでは、抗体分子１個当たり３．３個のアンサマイトシン分子が連結し、コンジュゲートには検出可能な遊離薬剤は存在しなかった。最終的コンジュゲートにおける抗体分子１個当たりのアンサマイトシン分子の数は、２５２ｎｍおよび２８０ｎｍにおけるコンジュゲートの吸光度測定、ならびにこれら二つの波長におけるマイタンシノイドと抗体の既知の減衰係数を用いて決定された（図２０）。ＳＥＣ ＨＰＬＣをコンジュゲート上で行い、コンジュゲーション後には９１％が単量体であることが示された。
実施例３５：アンサマイトシン誘導体およびマイタンシノイドで調製されたコンジュゲートのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性
連結可能なアンサマイトシン誘導体５５および１３ａで調製したＥｐＣａｍ抗原を標的とするコンジュゲートを、細胞株ＣＯＬＯ２０５を発現するＥｐＣａｍに対する効能をｉｎ ｖｉｔｒｏで評価した。ジスルフィド連結ｍＡｂ−ＳＰＰ−５５コンジュゲートは効能がありかつ特異的で、活性の測定値は０．２３ｎＭであった（図３１）。非開裂性アンサマイトシンコンジュゲート、ｍＡｂ−１３ａ、は、ジスルフィドコンジュゲートより僅かに活性であり、ＩＣ５０値は０．１４ｎＭであった（図３１）。抗−ＥｐＣａｍ ｍＡｂ−アンサマイトシンコンジュゲートで培養する前に、過剰の非コンジュゲート抗−ＥｐＣａｍ抗体で事前処理されたＣＯＬＯ２０５に対しコンジュゲートを試験すると、活性が失われたことから、試験対象のコンジュゲートは共に標的細胞株に対して特異的であることが示された（図３１）。

Claims (97)

  1. 以下の式、
    ＭａｙＯ−Ａ−
    により表される誘導体化されたマイタンシノールもしくはマイタンシノール類似体の残基に化学的に結合する細胞結合剤を含む細胞結合剤コンジュゲート、または薬学的に許容可能なその塩もしくは溶媒和物であって；
    式中、ＭａｙＯは、ＭａｙＯＨにより表されるマイタンシノールもしくはマイタンシノール類似体の残基であり；
    Ａは、Ｃ＝Ｏ、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’、およびＣ（＝Ｏ）Ｏから選択される任意の基であり；
    Ｒ’はＨ、置換もしくは非置換直鎖状、分岐状、もしくは環状アルキル、アルケニル、もしくはアルキニル、および置換または非置換アリールから選択され、
    但し、前記コンジュゲートは、以下の式
    Figure 2013542958
     により表されるＮ−メチルアラニンもしくはＮ−メチルシステイン部分を含まず；
    直接ＭａｙＯに接続している；
    細胞結合剤コンジュゲート。
  2. 前記誘導体化されたマイタンシノールもしくはマイタンシノール類似体の残基が以下の式
    ＭａｙＯ−Ａ−Ｙ−
    により表され；
    式中、Ｙは、置換もしくは非置換直鎖状、分岐状、もしくは環状アルキル、アルケニルまたはアルキニル、置換もしくは非置換アリール、置換もしくは非置換複素環式基、置換もしくは非置換アリールアルキル、置換もしくは非置換
    ヘテロシクリルアルキル基、アジリジン基およびエポキシ基から選択される任意の基であり、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリールアルキル基、およびヘテロシクリルアルキル基はそれぞれ、ポリエチレングリコールユニット（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ（式中、ｎは１〜２００の整数である）、アジリジン基、エポキシ基、アミノ基、アミド基、エステル基、アリール基、複素環式基から選択される一つまたは複数の基、アミノ酸およびペプチドにより任意選択的に遮断される、
    請求項１に記載の細胞結合剤コンジュゲート。
  3. Ｙが、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、ハロＣ１〜６アルキル、二つの隣接する炭素原子上にハロゲン基およびヒドロキシル基を有するＣ１〜６アルキル
    Figure 2013542958
     −Ｃ２〜６アルケニル−Ａｒ、−Ａｒ−Ｃ２〜６アルケニル−、−Ｃ２〜６アルキニル−Ａｒ−、−Ａｒ−Ｃ２〜６アルキニル−、Ｃ１〜６アルキルの二つの隣接する炭素原子上にハロゲン基およびヒドロキシル基を有する−Ｃ１〜６アルキル−Ａｒ−、および二つの隣接する炭素原子上にハロゲン基およびヒドロキシル基を有する−Ａｒ−Ｃ１〜６アルキルから選択される任意の基であって、Ａｒは任意に置換されたアリールまたは任意に置換されたヘテロシクリルであり、およびＹにより表される基中のアルケニル基、アルキニル基、アルキル基が任意に置換されている、
    請求項２に記載の細胞結合剤コンジュゲート。
  4. ＡｒがＣ１〜４アルキル、Ｃ１〜４アルコキシ、ヒドロキシＣ１〜４アルキル、ハロＣ１〜４アルキル、−ＯＨ、−ＯＣ（＝Ｏ）−Ｃ１〜４アルキル、−ＯＣ（＝Ｏ）−Ｃ１〜４アルキル−ＮＲａＲｂ、−Ｃ１〜４アルキル−ＣＯＯＨ、−ＮＲａＲｂ、−Ｃ１〜４アルキルＮＲａＲｂ、−ＮＯ２−およびハロゲンと任意に置換されたフェニル基であり、式中、ＲａおよびＲｂは、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１〜４アルキルもしくはアミノ保護基であるか、またはＲａおよびＲｂは、窒素原子と共に、一つまたは複数のヘテロ原子を有する複素環式環を形成する、
    請求項３に記載の細胞結合剤コンジュゲート。
  5. −Ａ−Ｙが以下の式
    Figure 2013542958
     のうちの一つにより表され、
    ｎおよびｎ’は、それぞれ独立して、０、１、２または３であり；ｎ”は１、２または３、および各出現のＲｃは、Ｈ、ハロゲン、−ＮＯ２、Ｃ１〜４アルキル、Ｃ１〜４アルコキシ、ヒドロキシＣ１〜４アルキル、ハロＣ１〜４アルキル、−ＯＨ、−ＯＣ（＝Ｏ）−Ｃ１〜４アルキル、−ＯＣ（＝Ｏ）−Ｃ１〜４アルキル−ＮＲａＲｂ、Ｃ１〜４アルキル−ＣＯＯＨであり、式中、ＲａおよびＲｂは、それぞれ独立して、
    Ｈ、Ｃ１〜４アルキル、アミノＣ１〜４アルキルもしくはアミノ保護基であるか、またはＲａおよびＲｂは、窒素原子と共に、一つまたは複数のヘテロ原子を有する複素環式環を形成する、
    請求項２に記載の細胞結合剤コンジュゲート。
  6. ＲａおよびＲｂは、窒素原子と共に、任意に置換されたピペラジニルまたは任意に置換された保護化ピペラジニル、または任意に置換された４−ピペリジノピペリジニルを形成する、請求項５に記載の細胞結合剤コンジュゲート。
  7. ｎ”は１または２、ＲｃはＨ、メチル、エチル、ハロゲン、−ＣＦ３、−ＮＯ２、−ＯＭｅ、−ＣＯ２Ｍｅ、−ＯＨ、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２ＯＣ（Ｏ）ＣＨ２ＮＨ２、−ＣＨ２ＯＣ（Ｏ）（Ｃ（ＣＨ３）２）ＣＨ２ＮＨ２、−ＣＨ２ＮＨ２、−ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）２、−ＣＨ２ＣＯＯＨおよび−ＣＨ２−ピペラジニルである、請求項５に記載の細胞結合剤コンジュゲート。
  8. Ｙが以下の式
    −［Ａｒ’］ｊ−（Ｃ１〜１０アルキル）−；
    により表され、
    式中、
    Ａｒ’は任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロシクリル、任意に置換されたＣ１〜４アルキルアリールまたは任意に置換された Ｃ１〜４アルキルヘテロシクリルであり；および
    ｊは０または１である、
    請求項２に記載の細胞結合剤コンジュゲート。
  9. Ｙが以下の式
    ［Ａｒ”］０〜１−（ＣＲ１Ｒ２）ｘ−Ｂ−Ｗ−Ｄ−（ＣＲ１Ｒ２）ｗ¬；
    により表され、
    式中、
    Ａｒ”は、アルキル、アルコキシル、ハロ、ハロアルキル、アルコキシ−ハロアルキル, ニトリルおよびニトロから選択される１〜４個の基で任意に置換されたフェニル、−ＣＨ２−フェニル、ヘテロシクリル、または−ＣＨ２−ヘテロシクリルであり；
    Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、水素またはＣ１〜４アルキルであり；
    Ｂは、ＮＲ”、Ｏまたは非存在であり；
    Ｗは、アミノ酸もしくは２〜８個のアミノ酸を含むペプチド、（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ、または非存在であり；
    Ｄは、ＣＯ、ＮＲ”または非存在であり；
    Ｒ”は、Ｈ、置換もしくは非置換直鎖状、分岐状、もしくは環状アルキル、アルケニルまたはアルキニル、および置換もしくは非置換アリールから選択され；
    ｘは１〜１０の整数であり；
    ｗは０、または１〜１０の整数であり；ならびに
    ｎは１〜２００の整数である、
    請求項２に記載の細胞結合剤コンジュゲート。
  10. Ｒ”がＨまたはＣ１〜４アルキルである、請求項９に記載の細胞結合剤コンジュゲート。
  11. Ｙが−（ＣＲ１Ｒ２）ｘであり、ｘが１〜６の整数である、請求項２に記載の細胞結合剤コンジュゲート。
  12. Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、水素またはメチルである、請求項１１に記載の細胞結合剤コンジュゲート。
  13. Ｙが以下の式
    Figure 2013542958
     の一つにより表される、請求項２に記載の細胞結合剤コンジュゲート。
  14. 前記コンジュゲートが、式
    （ＭａｙＯ−Ａ−Ｙ−Ｌ’）ｍ−ＣＢ；
    により表され、または薬学的に許容可能なその塩もしくは溶媒和物であり；
    式中、
    Ｌ’はリンカーであり；
    ｍは１〜２０の整数であり；および
    ＣＢは細胞結合剤を表している；
    請求項２〜１３のいずれか一項に記載の細胞結合剤コンジュゲート。
  15. 式
    ＭａｙＯ−Ａ−Ｙ−Ｌ’−ＣＢ
    により表される細胞結合剤コンジュゲート、または薬学的に許容可能なその塩もしくは溶媒和物であって；
    式中、
    ＣＢは細胞結合剤を表し；
    ＭａｙＯは、ＭａｙＯＨで表されるマイタンシノールの残基であり；
    Ａは、Ｃ＝Ｏ、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’およびＣ（＝Ｏ）Ｏから選択される任意の基であり；Ｒ’はH、置換もしくは非置換直鎖状、分岐状、もしくは環状アルキル、アルケニルまたはアルキニル、および置換もしくは非置換アリールから選択され；
    Ｙは、置換もしくは非置換直鎖状、分岐状、もしくは環状アルキル、アルケニルまたはアルキニル、置換もしくは非置換アリール、または置換もしくは非置換複素環式基から選択される任意の基であり、各基は、任意のポリエチレングリコールユニット（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ（ｎは１〜２００の整数）、およびペプチドを担持し；
    Ｌ’はリンカーであり；
    但し、ＡはＣ＝Ｏ、ＹはＡと共に、Ｎ−メチルアラニンまたはＮ−メチルシステイン部分ではない；
    細胞結合剤コンジュゲート。
  16. Ｒ’はＨまたはＣ１〜４アルキルである、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の細胞結合剤コンジュゲート。
  17. ＭａｙＯが、式
    Figure 2013542958
     により表され、
    式中、Ｘ’４＝Ｘ’５またはＯＸ’５であり；および
    Ｘ’、Ｘ’１、Ｘ’２、Ｘ’３、およびＸ’５は同じまたは異なり、Ｒ、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ２またはＣ（＝Ｏ）ＯＲから選択され、式中、Ｒはそれぞれ独立して、Ｈ、置換もしくは非置換直鎖状、分岐状、もしくは環状アルキル、アルケニルまたはアルキニル、および置換もしくは非置換アリールから選択され；
    Ｑは、ＯまたはＳから選択され；但し、Ｘ’、Ｘ’１、Ｘ’２、Ｘ’３、Ｘ’５のうち少なくとも一つがＭａｙＯとＡまたはＡＹとの間の共有結合を示している；
    請求項１〜１６のいずれか一項に記載の細胞結合剤コンジュゲート。
  18. Ｒがそれぞれ独立してＨまたはＣ１〜４アルキルである、請求項１７に記載の細胞結合剤コンジュゲート。
  19. ＭａｙＯが式
    Figure 2013542958
     により表される、請求項１７または１８に記載の細胞結合剤コンジュゲート。
  20. 前記コンジュゲートが、式
    （ＭａｙＯ−Ａ−Ｙ−Ｍ’−ＢＦＣＧ）ｍ−ＣＢ
    により表され、または薬学的に許容可能なその塩もしくは溶媒和化合物であり；
    式中、
    ＢＦＣＧは非存在であるか、または二つの連結基を含む二官能性架橋試薬の残基であり、連結基のうち一つはＭ’と反応したものであり、もう一つの連結基は細胞結合剤と反応したものであり；
    Ｍ’は、ＢＦＣＧの反応した連結基の一つと共にチオエーテル、ジスルフィド、チオエステル、アミド、イミン、−Ｏイミンまたはヒドラゾン部分を形成する連結基の残基であり；ならびに
    ＢＦＣＧは、チオエーテル、ジスルフィド、チオエステル、アミド、イミン、-O-イミンまたはヒドラゾン部分を介してＣＢと連結する；
    請求項２〜１９のいずれか一項に記載の細胞結合剤コンジュゲート。
  21. ＢＦＣＧが、Ｍ’に接続されたＭ”部分およびＣＢに接続されたＺ部分を含み、式中、Ｍ”およびＺは、それぞれ独立して、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲｅ−、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝ＮＨ）−、−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＲｅ−、−Ｓ−、−ＮＲｅ−、−ＮＨ−ＮＲｅ−、
    Figure 2013542958
     −Ｃ（＝ＮＲｅ）−、＝ＮＮＲｅ−、−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−、および−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲｅから成る群から選択され、Ｒｅは、Ｈ、アルキル、アルケニルまたはアルキニルである、
    請求項２０に記載の細胞結合剤コンジュゲート。
  22. Ｍ”およびＺが、それぞれ独立して、−Ｃ（＝Ｏ）−、
    Figure 2013542958
     −Ｓ−、−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−、−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−および−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−から成る群から選択される、
    請求項２１に記載の細胞結合剤コンジュゲート。
  23. Ｍ’−Ｍ”が、
    Figure 2013542958
     から選択される構造式により表される、請求項２１または２２に記載の細胞結合剤コンジュゲート。
  24. −ＢＦＣＧ−が、式
    −Ｍ”−（ＣＲ３Ｒ４）ｙ−［Ｃｙ］０または１−Ｃ（Ｏ）−
    により表され、または薬学的に許容可能なその塩もしくは溶媒和化合物であり；
    式中、
    Ｍ”は
    Figure 2013542958
     であり；
    Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して、水素, メチルまたは−ＳＯ３ −Ｍ＋であり、Ｍ＋は、Ｈ＋もしくは薬学的に許容可能な陽イオンであり；
    Ｃｙは、アルキル、アルコキシル、ハロ、ハロアルキル、アルコキシハロアルキル、ニトリルおよびニトロから選択される１〜４個の基で任意に置換されたシクロアルキルまたはフェニルであり；ならびに
    ｙは０、または１〜１０の整数である、
    請求項２０に記載の細胞結合剤コンジュゲート。
  25. ＢＦＣＧが
    Figure 2013542958
     であり；および
    Ｍ’が−Ｓ−である、
    請求項２４に記載の細胞結合剤コンジュゲート。
  26. ＢＦＣＧが
    Figure 2013542958
     である、
    請求項２５に記載の細胞結合剤コンジュゲート。
  27. −ＢＦＣＧ−が、式
    −Ｓ−（ＣＲ３Ｒ４）ｙ’−Ｃ（Ｏ）
    により表され；
    式中、
    Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して、水素, メチルまたは−ＳＯ３ −Ｍ＋であり、Ｍ＋は、Ｈ＋もしくは薬学的に許容可能な陽イオンであり；
    ｙ’は１〜１０の整数である、
    請求項２０に記載の細胞結合剤コンジュゲート。
  28. ＢＦＣＧが自己犠牲部分を含む、請求項２０に記載の細胞結合剤コンジュゲート。
  29. ＢＦＣＧが、以下の式
    Figure 2013542958
     により表され；
    式中、ＡＡは、アミノ酸または２〜８個のアミノ酸を含むペプチドであり、Ｒ１００はＨまたはアルキルである、
    請求項２１に記載の細胞結合剤コンジュゲート。
  30. ＡＡは、Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｖａｌ−Ｌｙｓ、Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、Ａｌａ−Ｌｙｓ、Ｐｈｅ−Ｃｉｔ、Ｌｅｕ−Ｃｉｔ、Ｌｌｅ−Ｃｉｔ、Ｔｒｐ、Ｃｉｔ、Ｐｈｅ−Ａｌａ、Ｐｈｅ−Ｎ９−トシル−Ａｒｇ、Ｐｈｅ−Ｎ９−ニトロ−Ａｒｇ、Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ、Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ、Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ、Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（配列番号１）、β−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（配列番号２）およびＧｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ（配列番号３）、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号４）、Ｖａｌ−Ａｒｇ、Ａｒｇ−Ｖａｌ、Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ｖａｌ−Ｄ−Ｃｉｔ、Ｖａｌ−Ｄ−Ｌｙｓ、Ｖａｌ−Ｄ−Ａｒｇ、Ｄ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｄ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ｖａｌ−Ａｒｇ、Ｄ−Ｖａｌ−Ｄ−Ｃｉｔ、Ｄ−Ｖａｌ−Ｄ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ｖａｌ−Ｄ−Ａｒｇ、およびＤ−Ａｒｇ−Ｄ−Ａｒｇから選択される、請求項２９に記載の細胞結合剤コンジュゲート。
  31. ＡＡがＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｐｈｅ−ＬｙｓまたはＶａｌ−Ｌｙｓである、請求項３０に記載の細胞結合剤コンジュゲート。
  32. 前記ＢＦＣＧが、
    Figure 2013542958
     から選択され、
    式中、
    ＡＡは、Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｐｈｅ−ＬｙｓまたはＶａｌ−Ｌｙｓであり；
    ｑは１〜５の整数であり；
    ｎは１〜２０の整数であり；ならびに
    Ｍは、Ｈ＋または薬学的に許容可能な陽イオンである、
    請求項２０に記載の細胞結合剤コンジュゲート。
  33. 細胞結合剤が、腫瘍細胞、ウイルス感染細胞、微生物感染細胞、寄生虫感染細胞、自己免疫細胞、活性化細胞、骨髄細胞、活性化されたＴ細胞、Ｂ細胞もしくはメラノサイト；ＣＤ４、ＣＤ６、ＣＤ１９， ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５６、ＥｐＣＡＭ、ＣａｎＡｇ、ＣＡＬＬＡ、ＳＴＥＡＰ、ＴＥＮＢ２、ＭＵＣ１６、ＩＲＴＡ１、ＩＲＴＡ２、ＩＲＴＡ３、ＩＲＴＡ４、ＩＲＴＡ５、ｃ−ＭＥＴ、５Ｔ４、もしくはＨｅｒ−２抗原；Ｈｅｒ−３抗原を発現する細胞；またはインスリン成長因子受容体、表皮成長因子受容体、および葉酸受容体を発現する細胞から選択される標的細胞に結合する、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の細胞結合剤コンジュゲート。
  34. 前記細胞結合剤が、標的細胞に特異的に結合する抗体、単鎖抗体、抗体断片；標的細胞に特異的に結合するモノクロナール抗体、単鎖モノクロナール抗体、またはモノクロナール抗体断片；標的細胞に特異的に結合するキメラ抗体、キメラ抗体断片；標的細胞に特異的に結合するドメイン抗体、ドメイン抗体断片；
    二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）、ナノ抗体、プロ抗体（ｐｒｏｂｏｄｙ）、Ｄａｒｐｉｎ、リンホカイン、ホルモン、ビタミン、増殖因子、コロニー刺激因子、または栄養素輸送分子である、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の細胞結合剤コンジュゲート。
  35. 前記抗体が、表面再構成（ｒｅｓｕｒｆａｃｅｄ）抗体、表面再構成単鎖抗体、または表面再構成抗体断片である、請求項３４に記載の細胞結合剤コンジュゲート。
  36. 前記抗体が、モノクロナール抗体、単鎖モノクロナール抗体、またはそのモノクロナール抗体断片である、請求項３４に記載の細胞結合剤コンジュゲート。
  37. 前記抗体が、ヒト化抗体、ヒト化単鎖抗体、またはヒト化抗体断片である、請求項３４に記載の細胞結合剤コンジュゲート。
  38. 請求項１〜３７のいずれか一項に記載のコンジュゲートおよび薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物。
  39. 式
    ＭａｙＯ−Ａ−
    により表される誘導体化されたマイタンシノールまたはマイタンシノール類似体の残基、および、細胞結合剤または二官能性架橋試薬と化学的結合を形成し得る連結基を含む化合物、または薬学的に許容可能なその塩もしくは溶媒和物であって；
    式中、
    ＭａｙＯは、ＭａｙＯＨにより表されるマイタンシノールもしくはマイタンシノール類似体の残基であり；
    Ａは、Ｃ＝Ｏ、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’、およびＣ（＝Ｏ）Ｏから選択される任意の基であり；および
    Ｒ’は、Ｈ、置換もしくは非置換直鎖状、分岐状、もしくは環状アルキル、アルケニルまたはアルキニル、および置換もしくは非置換アリールから選択され；
    但し、前記化合物は、以下の式
    Figure 2013542958
     により表されるＮ−メチルアラニンまたはＮ−メチルシステイン部分を含まず；
    直接ＭａｙＯ−に接続する、
    化合物。
  40. 前記誘導体化されたマイタンシノールもしくはマイタンシノール類似体が、以下の式
    ＭａｙＯ−Ａ−Ｙ；
    により表され、
    式中、Ｙは置換もしくは非置換直鎖状、分岐状、もしくは環状アルキル、アルケニルまたはアルキニル、置換もしくは非置換アリール、置換もしくは非置換複素環式基、置換もしくは非置換アリールアルキル、置換もしくは非置換ヘテロシクリルアルキル基、アジリジン基、およびエポキシ基から選択される任意の基であり、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリールアルキル基およびヘテロシクリルアルキル基はそれぞれ、ポリエチレングリコールユニット（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ（ｎは１〜２００の整数）、アジリジン基、エポキシ基、アミノ基、アミド基、エステル基、アリール基および複素環式基から選択される一つまたは複数の基、アミノ酸およびペプチドにより任意選択的に遮断される、
    請求項３９に記載の化合物。
  41. Ｙは、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、ハロＣ１〜６アルキル、二つの隣接する炭素原子上にハロゲン基およびヒドロキシル基を有するＣ１〜６アルキル、
    Figure 2013542958
     −Ｃ２〜６アルケニル−Ａｒ−、−Ａｒ−Ｃ２〜６アルケニル、−Ｃ２〜６アルキニル−Ａｒ−、−Ａｒ−Ｃ２〜６アルキニル−、−Ｃ１〜６のアルキル二つの隣接する炭素原子上にハロゲン基およびヒドロキシル基を有する−Ｃ１〜６アルキル−Ａｒ−、二つの隣接する炭素原子上にハロゲン基およびヒドロキシル基を有する−Ａｒ−Ｃ１〜６アルキルから選択される任意の基であり、Ａｒは、任意に置換されたアリールまたは任意に置換されたヘテロシクリルであり、およびＹにより表されるアルケニル基、アルキニル基およびアルキル基が任意に置換された、
    請求項４０に記載の化合物。
  42. Ａｒが、Ｃ１〜４アルキル、Ｃ１〜４アルコキシ、ヒドロキシＣ１〜４アルキル、ハロＣ１〜４アルキル、−ＯＨ、−ＯＣ（＝Ｏ）−Ｃ１〜４アルキル、−ＯＣ（＝Ｏ）−Ｃ１〜４アルキル−ＮＲａＲｂ、−Ｃ１〜４アルキル−ＣＯＯＨ、−ＮＲａＲｂ、−Ｃ１〜４アルキルＮＲａＲｂ、−ＮＯ２およびハロゲンと任意に置換されたフェニル基であり、ＲａおよびＲｂがそれぞれ独立してＨ、Ｃ１〜４アルキルもしくはアミノ保護基であるか、または、ＲａおよびＲｂが窒素原子と共に一つまたは複数のヘテロ原子を有する複素環式環を形成する、請求項４１に記載の化合物。
  43. −Ａ−Ｙ−が、以下の式
    Figure 2013542958
     の一つで表され、
    式中、ｎおよびｎ’は、それぞれ独立して、０、１、２もしくは３であり；ｎ”は１、２もしくは３であり、および各出現のＲｃはＨ、−ＮＯ２、ハロゲン、Ｃ１〜４アルキル、Ｃ１〜４アルコキシ、ヒドロキシＣ１〜４アルキル、ハロＣ１〜４アルキル、−ＯＨ、−ＯＣ（＝Ｏ）−Ｃ１〜４アルキル、−ＯＣ（＝Ｏ）−Ｃ１〜４アルキル−ＮＲａＲｂ、 Ｃ１〜４アルキル−ＣＯＯＨであり、ＲａおよびＲｂは、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１〜４アルキル、アミノＣ１〜４アルキルもしくはアミノ保護基であるか、またはＲａおよびＲｂは、窒素原子と共に、一つまたは複数のヘテロ原子を有する複素環式環を形成する、請求項４０に記載の化合物。
  44. ＲａおよびＲｂは、窒素原子と共に、任意に置換されたピペラジニル、任意に置換された保護化ピペラジニルまたは任意に置換された４−ピペリジノピペリジニルを形成する、請求項４３に記載の化合物。
  45. ｎ”が１または２であり、ＲｃがＨ、メチル、エチル、ハロゲン、−ＣＦ３、−ＮＯ２、−ＯＭｅ、−ＣＯ２Ｍｅ、−ＯＨ、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２ＯＣ（Ｏ）ＣＨ２ＮＨ２、−ＣＨ２ＯＣ（Ｏ）（Ｃ（ＣＨ３）２）ＣＨ２ＮＨ２、−ＣＨ２ＮＨ２、−ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）２、−ＣＨ２ＣＯＯＨ、および−ＣＨ２−ピペラジニルである、請求項４３に記載の化合物。
  46. Ｙが、式
    −［Ａｒ’］ｊ−（Ｃ１〜１０アルキル）−
    により表され、または薬学的に許容可能なその塩もしくは溶媒和物であって、
    式中、
    Ａｒ’が、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロシクリル、任意に置換されたＣ１〜４アルキルアリール、または任意に置換されたＣ１〜４アルキルヘテロシクリルであり；および
    ｊが０または１である、
    請求項４０に記載の化合物。
  47. Ｙが、式
    ［Ａｒ”］０〜１−（ＣＲ１Ｒ２）ｘ−Ｂ−Ｗ−Ｄ−（ＣＲ１Ｒ２）ｗ¬
    により表され、
    式中、
    Ａｒ”は、アルキル、アルコキシル、ハロ，ハロアルキル、アルコキシ−ハロアルキル、ニトリルおよびニトロから選択される１〜４個の基で任意に置換されたフェニル、−ＣＨ２−フェニル、ヘテロシクリル、または−ＣＨ２−ヘテロシクリルであり；
    Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して水素またはＣ１〜４アルキルであり；
    ＢはＮＲ”、Ｏまたは非存在であり；
    Ｗは、アミノ酸または２〜８個のアミノ酸を含むペプチド、（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ、または非存在であり；
    ＤはＣＯ、ＮＲ”または非存在であり；
    Ｒ”は、Ｈ、置換もしくは非置換直鎖状、分岐状、もしくは環状アルキル、アルケニルまたはアルキニル、および置換もしくは非置換アリールから選択され；
    ｘは１〜１０の整数であり；
    ｗは０、または１〜１０の整数であり；および
    ｎは１〜２００の整数である、
    請求項４６に記載の化合物。
  48. Ｒ”がＨまたはＣ１〜４アルキルである、請求項４７に記載の化合物。
  49. Ｙが−（ＣＲ１Ｒ２）ｘ−であり、ｘが１〜６の整数である、請求項４７に記載の化合物。
  50. Ｒ１およびＲ２が、それぞれ独立して、水素またはメチルである、請求項４９に記載の化合物。
  51. Ｙが、以下の式、
    Figure 2013542958
     の一つにより表される、請求項４６に記載の化合物。
  52. 前記化合物が、式
    ＭａｙＯ−Ａ−Ｙ−Ｌ
    により表され、または薬学的に許容可能なその塩もしくは溶媒和物であり；
    式中、
    Ｌは、細胞結合剤または二官能性架橋試薬に化学的結合を形成し得る連結基である、
    請求項４０〜５１のいずれか一項に記載の化合物。
  53. 以下の式、
    ＭａｙＯ−Ａ−Ｙ−Ｌ
    により表され；
    式中、
    ＭａｙＯは、ＭａｙＯＨにより表されるマイタンシノールの残基であり；
    Ａは、Ｃ＝Ｏ、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’およびＣ（＝Ｏ）Ｏから選択される任意の基であり；Ｒ’は、Ｈ、置換もしくは非置換直鎖状、分岐状、もしくは環状アルキル、アルケニルまたはアルキニル、および置換もしくは非置換アリールから選択され；
    Ｙは、置換もしくは非置換直鎖状、分岐状、もしくは環状アルキル、アルケニルまたはアルキニル、置換もしくは非置換アリール、置換もしくは非置換複素環式基から選択される任意の基であり、それぞれは任意のポリエチレングリコールユニット（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ（ｎは１〜２００の整数）、およびペプチドを担持し；ならびに
    Ｌは、ジスルフィド結合、チオエーテル結合、ペプチド結合、アミド結合、エステル結合またはヒドラゾン結合を介して、細胞結合剤と化学結合を形成し得る官能基、または薬学的に許容可能な本化合物の塩もしくは溶媒和物であり；
    但し、ＡはＣ＝Ｏであり、ＹはＡと共にＮ−メチルアラニンまたはＮ−メメチルシステイン部分ではない、
    請求項３９に記載の化合物。
  54. Ｒ’がＨまたはＣ１〜４アルキルである、請求項４０〜５３のいずれか一項に記載の化合物。
  55. ＭａｙＯが、式
    Figure 2013542958
     により表され、
    式中
    Ｘ’４＝Ｘ’５またはＯＸ’５であり；および
    Ｘ’、Ｘ’１、Ｘ’２、Ｘ’３、およびＸ’５は同じまたは異なり、Ｒ、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ２またはＣ（＝Ｏ）ＯＲから選択され、式中、Ｒはそれぞれ独立して、Ｈ、置換もしくは非置換直鎖状、分岐状、もしくは環状アルキル、アルケニルまたはアルキニル、および置換もしくは非置換アリールから選択され；
    ＱはＯまたはＳから選択され；但し、Ｘ’、Ｘ’１、Ｘ’２、Ｘ’３、およびＸ’５の少なくとも一つが、ＭａｙＯとＡまたはＡＹとの間の共有結合を表している、
    請求項４０〜５４のいずれか一項に記載の化合物。
  56. Ｒがそれぞれ独立してＨまたはＣ１〜４アルキルである、請求項５４に記載の化合物。
  57. ＭａｙＯが、式
    Figure 2013542958
     により表される、請求項５５または５６に記載の化合物。
  58. Ｌが、マレイミド、ハロアセタミド、−ＳＨ、−ＳＳＲｄ、−ＣＨ２ＳＨ、−ＣＨ（Ｍｅ）ＳＨ、−Ｃ（Ｍｅ）２ＳＨ、−ＮＨＲｆ、−ＣＨ２ＮＨＲｆ、−ＮＲｆＮＨ２、−ＣＯＯＨ、および−ＣＯＥから選択される構造式により表され、式中、ＣＯＥは反応性エステルを表し、Ｒｄは任意に置換されたフェニルまたは任意に置換されたピリジルであり、ＲｆはＨまたはアルキルである、
    請求項５２〜５７のいずれか一項に記載の化合物。
  59. −ＣＯＥにより表される前記反応性エステルが、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド・エステル、Ｎ−ヒドロキシ・スルホスクシンイミド・エステル、ニトロフェニル（例えば、２または４−ニトロフェニル）エステル、ジニトロフェニル（例えば、２，４−ジニトロフェニル）エステル、スルホ−テトラフルオロフェニル（例えば、４−スルホ−２，３，５，６−テトラフルオロフェニル）エステル、およびペンタフルオロフェニル・エステルから選択され、およびＲｄは、フェニル、ニトロフェニル（例えば、２または４−ニトロフェニル）、ジニトロフェニル（例えば、２または４−ニトロフェニル）、カルボキシニトロフェニル（例えば、３−カルボキシ−４−ニトロフェニル）、ピリジルまたはニトロピリジル（例えば、４−ニトロピリジル）から選択される、
    請求項５８に記載の化合物。
  60. 前記化合物が、化合物６〜２６のいずれか一つにより表され、
    Figure 2013542958
    Figure 2013542958
    Figure 2013542958
     または薬学的に許容可能なその塩もしくは溶媒和物である、
    請求項３９に記載の化合物。
  61. 式
    ＭａｙＯ−Ａ−
    により表される誘導体化されたマイタンシノールもしくはマイタンシノール類似体の残基に連結する二官能性架橋試薬を含む化合物、または、薬学的に許容可能なその塩もしくは溶媒和物であって；
    式中、
    ＭａｙＯは、ＭａｙＯＨにより表されるマイタンシノールもしくはマイタンシノール類似体の残基であり；
    Ａは、Ｃ＝Ｏ、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’、およびＣ（＝Ｏ）Ｏから選択される任意の基であり；
    Ｒ’は、Ｈ、置換もしくは非置換直鎖状、分岐状、もしくは環状アルキル、アルケニルまたはアルキニル、および置換もしくは非置換アリールから選択され；
    但し、前記化合物には、以下の式
    Figure 2013542958
     により表されるＮ−メチルアラニンもしくはＮ−メチルシステイン部分が含まれず；
    直接ＭａｙＯ−に接続される、
    化合物。
  62. 誘導体化されたマイタンシノールもしくはマイタンシノール類似体の残基が、以下の式、
    ＭａｙＯ−Ａ−Ｙ−
    により表され；
    式中、Ｙは、置換もしくは非置換直鎖状、分岐状、もしくは環状アルキル、アルケニルまたはアルキニル、置換もしくは非置換アリール、置換もしくは非置換複素環式基、置換もしくは非置換アリールアルキル、置換もしくは非置換ヘテロシクリルアルキル基、アジリジン基、およびエポキシ基から選択される任意の基であり、アルキル, アルケニル, アルキニル, アリールアルキルおよびヘテロシクリルアルキル基のそれぞれは、ポリエチレングリコールユニット（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ（ｎは１〜２００の整数）、アジリジン基、エポキシ基、アミノ基、アミド基、エステル基、アリール基および複素環式基から選択される一つまたは複数の基、アミノ酸、およびペプチドにより任意選択的に遮断される、
    請求項６１に記載の化合物。
  63. Ｙが、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、ハロＣ１〜６アルキル、二つの隣接する炭素原子上にハロゲン基およびヒドロキシル基を有するＣ１〜６アルキル
    Figure 2013542958
     −Ｃ２〜６アルケニル−Ａｒ−、−Ａｒ−Ｃ２〜６アルケニル−、−Ｃ２〜６アルキニル−Ａｒ−、−Ａｒ−Ｃ２〜６アルキニル、Ｃ１〜６アルキルの二つの隣接する炭素原子上にハロゲン基およびヒドロキシル基を有する−Ｃ１〜６アルキル−Ａｒ−、および二つの隣接する炭素原子上にハロゲン基およびヒドロキシル基を有する−Ａｒ−Ｃ１〜６アルキルから選択される任意の基であり、Ａｒが任意に置換されたアリールもしくは任意に置換されたヘテロシクリルであり、Ｙにより表される基のアルケニル、アルキニル、アルキルが任意に置換されている、
    請求項６１に記載の化合物。
  64. Ａｒが、Ｃ１〜４アルキル、Ｃ１〜４アルコキシ、ヒドロキシＣ１〜４アルキル、ハロＣ１〜４アルキル、−ＯＨ、−ＯＣ（＝Ｏ）−Ｃ１〜４アルキル、−ＯＣ（＝Ｏ）−Ｃ１〜４アルキル−ＮＲａＲｂ、−Ｃ１〜４アルキル−ＣＯＯＨ、−ＮＲａＲｂ、−Ｃ１〜４アルキルＮＲａＲｂ、−ＮＯ２およびハロゲンで任意に置換されたフェニル基であり、ＲａおよびＲｂは、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１〜４アルキルまたはアミノ保護基であるか、または、ＲａおよびＲｂは、窒素原子と共に、一つまたは複数のヘテロ原子を有する複素環式環を形成する、
    請求項６３に記載の化合物。
  65. −Ａ−Ｙ−が、以下の式の一つにより表され、
    Figure 2013542958
     式中、ｎおよびｎ’は、それぞれ独立して、０、１、２または３；ｎ”は、１、２または３であり、各出現のＲｃはＨ、−ＮＯ２、ハロゲン、Ｃ１〜４アルキル、Ｃ１〜４アルコキシ、ヒドロキシＣ１〜４アルキル、ハロＣ１〜４アルキル、−ＯＨ、−ＯＣ（＝Ｏ）−Ｃ１〜４アルキル、−ＯＣ（＝Ｏ）−Ｃ１〜４アルキル−ＮＲａＲｂ、−Ｃ１〜４アルキル−ＣＯＯＨであり、ＲａおよびＲｂは、それぞれ独立して、Ｈ、
    Ｃ１〜４アルキル、アミノＣ１〜４アルキルもしくはアミノ保護基であるか、またはＲａおよびＲｂは、窒素原子と共に、一つまたは複数のヘテロ原子を有する複素環式環を形成する、
    請求項６２に記載の化合物。
  66. ＲａおよびＲｂが、窒素原子と共に、任意に置換されたピペラジニル、任意に置換された保護化ピペラジニルまたは任意に置換された４−ピペリジノピペリジニルを形成する、請求項６５に記載の化合物。
  67. ｎ”が１または２であり、ＲｃがＨ、メチル、エチル、−ＮＯ２、−ＣＦ３、ハロゲン、−ＯＭｅ、−ＣＯ２Ｍｅ、−ＯＨ、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２ＯＣ（Ｏ）ＣＨ２ＮＨ２、−ＣＨ２ＯＣ（Ｏ）（Ｃ（ＣＨ３）２）ＣＨ２ＮＨ２、−ＣＨ２ＮＨ２、−ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）２、−ＣＨ２ＣＯＯＨ、および−ＣＨ２−ピペリジニルである、請求項６５に記載の化合物。
  68. Ｙが、
    −［Ａｒ’］ｊ−（Ｃ１〜１０アルキル）−
    により表され、
    式中、
    Ａｒ’は任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロシクリル、任意に置換されたＣ１〜４アルキルアリール、または任意に置換されたＣ１〜４アルキルヘテロシクリル；および
    ｊは０または１である、
    請求項６２に記載の化合物。
  69. Ｙが、式
    −［Ａｒ”］０〜１−（ＣＲ１Ｒ２）ｘ−Ｂ−Ｗ−Ｄ−（ＣＲ１Ｒ２）ｗ¬
    により表され、または薬学的に許容可能なその塩もしくは溶媒和物であり；
    式中、
    Ａｒ”は、アルキル、アルコキシル、ハロ、ハロアルキル、アルコキシ−ハロアルキル、ニトリルおよびニトロから選択される１〜４個の基で任意に置換されるＣＨ２−フェニル、フェニル、ＣＨ２−ヘテロシクリルまたはヘテロシクリルであり；
    Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、水素またはＣ１〜４アルキルであり；
    ＢはＮＲ”、Ｏまたは非存在であり；
    Ｗは、アミノ酸、２〜１０個のアミノ酸を含むペプチド、（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ、または非存在であり；
    Ｄは、ＣＯ、ＮＲ”または非存在であり；
    Ｒ”は、Ｈ、置換もしくは非置換直鎖状、分岐状、もしくは環状アルキル、アルケニルまたはアルキニル、および置換もしくは非置換アリールから選択され；
    ｘは１〜１０の整数であり；
    ｗは０、または１〜１０の整数であり；ならびに
    ｎは１〜２００の整数である、
    請求項６８に記載の化合物。
  70. Ｒ”はＨまたはＣ１〜４アルキルである、請求項６９に記載の化合物。
  71. Ｙが−（ＣＲ１Ｒ２）ｘ−であり、ｘが１〜６の整数である、請求項６９に記載の化合物。
  72. Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、水素またはメチルである、請求項７１に記載の化合物。
  73. Ｙが、以下の式の一つにより表される、
    Figure 2013542958
     請求項６９に記載の化合物。
  74. 前記化合物が、式
    ＭａｙＯ−Ａ−Ｙ−Ｍ’−ＢＦＣＧ’−Ｚ’
    により表され、または薬学的に許容可能なその塩もしくは溶媒和物であり；
    式中、
    ＢＦＣＧ’−Ｚ’が二つの連結基を含む二官能性架橋試薬の残基であり、前記連結基の一つがＺ’で表され、もう一つがＭ’と反応したものであり；
    Ｚ’は、チオエーテル、ジスルフィド、チオエステル、アミド、チオエステル、イミン、−Ｏ−イミンまたはヒドラゾン部分を介して、細胞結合剤と連結し得る連結基であり；
    Ｍ’は、ＢＦＣＧ’の反応した基の一つと共に、チオエーテル、ジスルフィド、チオエステル、アミド、イミン、Ｏ−イミン、ヒドラゾン部分を形成する連結基の残基である；
    請求項５８〜６９のいずれか一項に記載の化合物。
  75. Ｙが、置換もしくは非置換直鎖状、分岐状、もしくは環状アルキル、アルケニルまたはアルキニルから選択される任意の基であり、各基は、ポリエチレングリコールユニット（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ（ｎは１〜２００の整数）およびペプチドにより任意選択的に遮断される、
    請求項７４に記載の化合物。
  76. ＭａｙＯが、式
    Figure 2013542958
     により表され、
    式中、
    Ｘ’４＝Ｘ’５またはＯＸ’５；および
    Ｘ’、Ｘ’１、Ｘ’２、Ｘ’３、およびＸ’５は、同じまたは異なり、Ｒ、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ２またはＣ（＝Ｏ）ＯＲから選択され、Ｒは、それぞれ独立してＨ、置換もしくは非置換直鎖状、分岐状、もしくは環状アルキル、アルケニルまたはアルキニル、および置換もしくは非置換アリールから選択され；ならびに
    Ｑは、ＯまたはＳから選択され；但し、Ｘ’、Ｘ’１、Ｘ’２、Ｘ’３、およびＸ’５のうち少なくとも１つがＭａｙＯとＡまたはＡＹとの間の共有結合を表している、
    請求項６１〜７５のいずれか一項に記載の化合物。
  77. Ｒが、それぞれ独立して、ＨまたはＣ１〜４アルキルである、請求項７６に記載の化合物。
  78. ＭａｙＯが、式
    Figure 2013542958
     により表される、請求項７６または７７に記載の化合物。
  79. ＢＦＣＧ’が、Ｍ’に接続されている連結基Ｍ”を含み、Ｍ”は、独立して、Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲｅ−、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝ＮＨ）−、−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＲｅ−、−Ｓ−、−ＮＲｅ−、−ＮＨ−ＮＲｅ−、
    Figure 2013542958
     −Ｃ（＝ＮＲｅ）−、＝ＮＮＲｅ−、−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−、および−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲｅ−から成る群から選択され、Ｒｅは、Ｈ、アルキル、アルケニルまたはアルキニルである、
    請求項７４〜７８のいずれか一項に記載の化合物。
  80. Ｍ”がＣ（＝Ｏ）−、
    Figure 2013542958
     −Ｓ−、−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−、−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−および−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−から成る群から選択される、請求項７９に記載の化合物。
  81. Ｍ’−Ｍ”が、
    Figure 2013542958
     から選択される構造式により表される、請求項７９に記載の化合物。
  82. ＢＦＣＧ’が、式
    −Ｍ”−（ＣＲ３Ｒ４）ｙ−［Ｃｙ］０または１−
    により表され、または薬学的に許容可能なその塩もしくは溶媒和物であり：
    式中、Ｍ”は
    Figure 2013542958
     Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して、水素、メチルまたは−ＳＯ３ −Ｍ＋であり、
    M+は、H+または薬学的に許容可能な陽イオンであり；
    Ｃｙは、アルキル、アルコキシル、ハロ、ハロアルキル、アルコキシ ハロアルキル, ニトリルおよびニトロから選択される１〜４個の基で任意に置換されたシクロアルキルまたはフェニルであり；
    ｙは０、または１〜１０の整数である、
    請求項７４〜８１のいずれか一項に記載の化合物。
  83. ＢＦＣＧ’が
    Figure 2013542958
     であり；
    Ｍ’が−Ｓ−である、
    請求項８２に記載の化合物。
  84. ＢＦＣＧ’が
    Figure 2013542958
     である、請求項８３に記載の化合物。
  85. −ＢＦＣＧ’−が、式
    −Ｓ”−（ＣＲ３Ｒ４）ｙ
    により表され；
    式中、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して、水素、メチルまたは−ＳＯ３ −Ｍ＋であり、Ｍ＋は、Ｈ＋または薬学的に許容可能な陽イオンであり；
    ｙ’は、１〜１０の整数である、
    請求項７４〜８１のいずれか一項に記載の化合物。
  86. ＢＦＣＧ’が自己犠牲部分を含む、請求項８３に記載の化合物。
  87. ＢＦＣＧ’が、以下の式、
    Figure 2013542958
     により表され、
    式中、ＡＡは、アミノ酸または２〜８個のアミノ酸を含むペプチドであり、Ｒ１００はＨまたはアルキルである、
    請求項８６に記載の化合物。
  88. ＡＡが、Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｖａｌ−Ｌｙｓ、Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、Ａｌａ−Ｌｙｓ、Ｐｈｅ−Ｃｉｔ、Ｌｅｕ−Ｃｉｔ、Ｌｌｅ−Ｃｉｔ、Ｔｒｐ、Ｃｉｔ、Ｐｈｅ−Ａｌａ、Ｐｈｅ−Ｎ９−トシル−Ａｒｇ、Ｐｈｅ−Ｎ９−ニトロ−Ａｒｇ、Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ、Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ、Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ、Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（配列番号１）、β−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（配列番号２）およびＧｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ（配列番号３）、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号４）、Ｖａｌ−Ａｒｇ、Ａｒｇ−Ｖａｌ、Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ｖａｌ−Ｄ−Ｃｉｔ、Ｖａｌ−Ｄ−Ｌｙｓ、Ｖａｌ−Ｄ−Ａｒｇ、Ｄ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｄ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ｖａｌ−Ａｒｇ、Ｄ−Ｖａｌ−Ｄ−Ｃｉｔ、Ｄ−Ｖａｌ−Ｄ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ｖａｌ−Ｄ−Ａｒｇ、およびＤ−Ａｒｇ−Ｄ−Ａｒｇから成る群から選択される、請求項８７に記載の化合物。
  89. ＡＡがＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｐｈｅ−ＬｙｓまたはＶａｌ−Ｌｙｓである、請求項８８に記載の化合物。
  90. ＢＦＣＧ’が、
    Figure 2013542958
     から選択され、
    式中、
    ＡＡは、Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｐｈｅ−ＬｙｓまたはＶａｌ−Ｌｙｓであり；
    ｑは１〜５の整数であり；
    ｎは１〜２０の整数であり；および
    Ｍは、Ｈ＋または薬学的に許容可能な陽イオンである、
    請求項７４〜８１のいずれか一項に記載の化合物。
  91. Ｚ’が、マレイミド、ハロアセタミド、−ＳＨ、−ＳＳＲｄ、−ＣＨ２ＳＨ、−ＣＨ（Ｍｅ）ＳＨ、−Ｃ（Ｍｅ）２ＳＨ、−ＮＨＲｃ、−ＣＨ２ＮＨＲｃ、−ＮＲｃＮＨ２、−ＣＯＯＨ、および−ＣＯＥから選択され、ＣＯＥは反応性エステルを表し、Ｒｄは、任意に置換されたフェニルまたは任意に置換されたピリジルであり、ＲｆはＨまたはアルキルである、
    請求項７４〜９０のいずれか一項に記載の化合物。
  92. ＣＯＥが、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド・エステル、Ｎ−ヒドロキシ・スルホスクシンイミド・エステル、ニトロフェニル（例えば、２または４−ニトロフェニル）エステル、ジニトロフェニル（例えば、２，４−ジニトロフェニル）エステル、スルホ−テトラフルオロフェニル（例えば、４−スルホ−２，３，５，６−テトラフルオロフェニル）エステル、およびペンタフルオロフェニル・エステルから選択され、Ｒｄは、フェニル、ニトロフェニル（例えば、２または４−ニトロフェニル）、ジニトロフェニル（例えば、２または４−ニトロフェニル）、カルボキシニトロフェニル（例えば、３−カルボキシ−４−ニトロフェニル）、ピリジルまたはニトロピリジル（例えば、４−ニトロピリジル）から選択される、請求項９１に記載の化合物。
  93. 異常な細胞増殖を抑制し、または哺乳動物における増殖性疾患、自己免疫疾患、破壊的骨障害、感染症、ウイルス性疾患、線維性疾患、神経変性疾患、膵炎または腎疾患を治療する方法であって、前記哺乳動物に、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の、治療有効量のコンジュゲート、および任意選択的に化学療法剤を投与することを含む、
    方法。
  94. 前記第二の化学療法剤を、前記哺乳動物に経時的または連続的に投与する、請求項９３に記載の方法。
  95. 前記方法が、癌、関節リウマチ、多発性硬化症、移植片対宿主病（GVHD）、移植片拒絶反応、狼瘡、筋炎、感染症、および免疫不全から選択される病態を治療するためのものである、請求項９３に記載の方法。
  96. 前記方法が癌を治療するためのものである、請求項９３に記載の方法。
  97. 前記癌が、乳癌、結腸癌、脳腫瘍、前立腺癌、腎臓癌、膵臓癌、卵巣癌、頭頸部癌、黒色腫、結腸直腸癌、胃癌、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、精巣癌、メルケル細胞癌、神経膠芽腫、神経芽細胞腫、およびリンパ器官の癌から選択される、請求項９６に記載の方法。
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