KR20060003120A - 새로운 메이탠시노이드를 포함하는 개선된 세포독성체 - Google Patents

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Abstract

황원자를 갖는 α-탄소 원자에 단일 또는 두개의 알킬 치환기를 갖는 메이탠시노이드를 포함하는 새로운 티올과 이황화물이 발견되었다. 또한, 상기 새로운 메이탠시노이드의 합성방법과 상기 새로운 메이탠시노이드를 세포-결합 물질에 연결하는 방법이 발견되었다.
상기 메이탠시노이드-세포-결합 물질은 치료 약제 물질로서 유용하고, 그것은 목적세포에 특정적으로 운반되고 독성이 있다. 상기 결합은 종래의 물질에 비해 동물 악성 종양 모델에 있어서, 월등히 개선된 치료효과를 보여 준다.
메이탠시노이드, 메이탠시노이드-세포-결합 물질

Description

새로운 메이탠시노이드를 포함하는 개선된 세포독성체{IMPROVED CYTOTOXIC AGENTS COMPRISING NEW MAYTANSINOIDS}
이 출원은 2003. 5. 20에 출원된 임시출원번호 60/471,739의 이점을 주장하고 있으며, 여기 참고 문헌에 의하여 개시된 것을 알 수 있다.
본 발명은 메이탠시노이드와 세포 결합 물질을 포함하는 개선된 세포독성 결합에 대한 준비를 위한 방법과 관련이 있다. 이러한 결합은 그것들이 표적 방식에 특정세포집단에 전달됨에 따른 치료목적의 사용이 있다. 본 발명은 또한 티올 연결부위를 포함하는 메이탠시노이드를 준비하는 방법과 관련이 있고, 그것은 세포독성 결합 준비에 사용될 수 있다. 본 발명은 또한 신규 메이탠시노이드와, 신규 메이탠시노이드를 합성하는데 있어서의 신규 매개물과 관계가 있다.
단일클론 항체 약제 결합과 함께 종양세포의 특정 표적을 시도하는 많은 보고가 있어 왔다.(Sela et al. in Immunoconjugates 189-216(C. Vogel, ed. 1987); Ghose et al, in Targeted Drugs 1-22(E. Goldberg, ed. 1983); Diener et al, in Antibody Mediated Delivery Systems 1-23(J.Rodwell, ed.1988); Pietersz et al, in Antibody Mediated Delivery Systems 25-53(J.Rodwell,ed. 1988); Bumol et al, in Antibody Mediated Delivery Systems 55-79( J. Rodwell, ed. 1988). Methotrexate, daunorubicin, doxorubicin, vincristine, vinblastine, melphalan, mitomycin C 및 chlorambucil 과 같은 세포독성 약제는 뮤린 단일클론 항체의 다양성에 결합한다. 몇몇의 경우에, 약제분자는 세럼 알부민과 같은 중간 캐리어를 통해서 항체 분자와 링크된다.(Garnett et al. Cancer Res. 46:2407-2412(1986); Ohkawa et al. Cnacer Immumol. Immunother. 23:81-86(1986): Endo et al. Cancer Res. 47:1076-1080(1980)), dextran(Hurwitz et al. Appl. Biochem. 2:25-35(1980); manabi et al. Biochem. Pharmacol. 34:289-291(1985); Dillman et al. Cnacer Res. 46:4886-4891(1986); Shoval et al, Proc. Natl, Acad. Sci. 85:8276-8280(1988)), or polyglumatic acid(Tsukada et al.J.Natl.Canc. Inst. 73:721-729(1984);Kato et al,J.Med. Chem. 27:1602-1607(1984); Tsukada et al.Br.J.Cancer 52:111-116(1985)).
폭넓은 링커 배열기술이 면역결합 같은 준비에 적용되어왔고, 절개가능한 것과 절개 불가능한 링커 모두 연구되어 왔다. 만약 약제분자가 표적장소의 변경되지 않는 결합으로부터 풀어질 수 있다면 대부분의 경우에 있어서 약제의 세포독성 가능성은 관찰될 수 있다.
그러나 항체 약제 결합의 준비에 대하여 적용되는 절개가능한 링커의 하나는 cis-aconitic 산에 기초하는 산화 가능한 링커인데, 이것은 수용기가 엔도시토시스와 리소좀의 중간의 수용기 동안에 만나게 되는 엔도좀과 같은 다른 세포 내간 구 역의 산화환경에서 유리하다. Shen 과 Ryser는 고분자 캐리어와 함께 다우노루비신 결합의 준비하는 방법에 소개하고 있다.(Biochem. Biophys. Res. Commun. 102:1048-1054(1981). Yang 과 Reisfeld는 항 melanoma 항체에 다우노루비신을 결합하는 동일한 기술에 사용된다.(J.Natl. Canc. Inst. 80:1154-1159(1988)).
최근에, Dillman et al. 또한 항-T세포 항체와 함께 다우노루비신의 결합을 준비하는 유사한 방식에 있어 산화 가능한 링커를 사용하였다.(Cancer Res. 48:6097-6102(1988)).
Trouet et al.에 의해 실험된 선택적 접근에서, 다우노루비신을 펩타이트 스페이서 암을 경유한 항체에 결합하는 것을 포함한다.(Proc. Natl. Acad. Sci. 79:626-629(1982)). 이것은 free drug가 lysosomal 펩티다아제의 액션에 의한 결합과 같은 것으로부터 풀어지는 것이 가능하게 한다는 전제하에서 행해진다.
그러나 시험관 내의 독성 테스트에서, 항-약제가 free 비결합 약제처럼 세포독성능력과 같은 결합을 수행할 수 없음이 밝혀졌다. 이것은 어떤 약제분자가 항체로부터 풀릴 때 매우 비효율적인 것임을 암시한다. 면역독소의 영역에서, 결합은 단일클론항체와 촉매로 활성화된 단백질 독소 사이에서 이황화물을 거쳐서 형성되고 다른 링커를 포함하는 결합보다 세포독성이 더 강함을 나타낸다. Lambert et al.J. Biol. Chem. 260:12035-12041(1985); Lambert et al. in Immunotoxins 175-209(A. Frankel, ed. 1988); Ghetie et al. Cnacer Res. 48:2610-2617(1988).을 보면 알 수 있다. 이것은 항체분자와 독소 사이의 이황화 결합의 효과적인 틈을 기여하는 굴루타디온의 세포내 집중에 기인한다. 그럼에도, 약제와 고분자 사이의 결합 의 준비에 대한 이황화물 브리지의 사용의 보고된 예는 몇 가지에 불과하다. Shen et al.은 이황화결합을 거쳐 폴리-D-라이신(Lysine)의 결합이 뒤따르는 메토트렉스트가 메르캅도에필라마이드 유도체로 변화하는 것을 기술한다.(J. Biol. Chem. 260:10905-10908(1985)). 게다가, 몇몇 보고서는 항체와 함께 3황화물을 포함하는 독성 약제 칼리치아미신의 결합의 준비를 기술한다.(Hinman et al, 53 Cancer Res. 3336-3342(1993), Hamann et al., Bioconjugate Chem., 1340-46(2002), Hamann et al., Bioconjugate Chem., 13, 47-58(2002)).
항체-약제 결합과 결합된 이황화물의 부족에 대한 한가지 이유는 이황화물 브리지를 경유하여 항체에 결합되는데 이미 사용되는 부분(moiety)을 포함하는 황 원자의 세포독성 약제의 비유용성에서 기인한다. 더욱이, 존재하는 약제의 화학적 변화는 세포독성 능력의 감소 없이는 어렵다.
메이탠시노이드는 매우 세포독성이 강한 약제이다. 메이탠시노이드는 처음에 동아프리카의 Maytenus serrata라는 관목에서 Kupchan et al.에 의해 분리되었고, methotrexate, daunorubicin과 vincristine(U.S. Pat. No. 3,896,111)과 같은 관습적인 암 화학요법 물질보다도 100배에서 1000배 정도 독성이 강한 것을 보여주고 있다. 이에 따라, 몇몇 미생물이 또한 메이탠시놀과 메이탠시놀의 C-3 에스테르 와 같은 메이탠시노이드를 생산하는 것이 발견되었다.(US. Pat. No. 4,151,042). 메이탠시놀의 합성 C-3 에스테르와 메이탠시놀의 유사물질이 또한 보고되었다.(Kupchan et al.J.Med.Chem.21:31-37(1978);Higashide et al. Nature 270:721-722(1977); Kawai et al. Chem. Pharm. Bull. 32:3441-3451(1984)). C-3 에스테르로부터 메이 탠시놀의 유사물의 예는 방향족화합물 환(예. 디클로로) 또는 C-9, C-14(예. hydroxylated methyl group), C-15, C-18, C-20 and C-4, 5의 변형에 메이탠시놀을 포함하고 있다.
메이탠시놀(Maytansinol)의 천연 그리고 합성 C-3 에스테르는 두 족으로 나눌 수 있다.
(a) 단순한 카르복실산과 함께 C-3 에스테르(US. Pat. Nos. 4,248,870; 4,265,814; 4,308,269; 4,309,428; 4,317,821; 4,322,348; 4,331,598) 와
(b) N-메틸-L-알라닌의 부산물을 가진 C-3 에스테르(US. Pat. Nos. 4,137,230; 4,260,608; 5,208; Chem, Pharm. Bull. 12:3441(1984)).
족 (b)의 에스테르는 족 (a)의 에스테르보다 더 세포독성이 강함을 알 수 있다.
메이탠신(Maytansin)은 유사분열 억제제이다. 메이탠신과 함께 생체 안에서 L1210 세포의 치료는 세포 유사분열의 축적의 67%의 결과가 나타난 것으로 보고되었다. 치료되지 않은 컨트롤 세포는 3.2%부터 5.8%의 범위 내에서 유사분열지수를 나타내는 것으로 보고되었다.(Sieber et al. 43 Comparative Leukemia Research 1975, Bibl. Haemat. 495-500(1976)). 성게알과 조개알을 가지고 한 실험에서 메이탠신은 미소관 단백질, 튜불린의 중합의 억제를 통하여 미소관의 형성을 방해하는 유사분열을 억제한다.(Remillard et al. Science 189: 1002- 1005(1975)).
실험실 밖에서, P388, L1210 그리고 LY5178 뮤린 백혈병 세포 현탁은 P388 라인과 함께 메이탠신의 10- 3 에서 10-1 ㎍/㎕ 일 때 가장 민감하다. 메이탠신은 또한 실험실 밖에서 인간 nasopharyngeal 암세포의 성장을 억제하는데 활성화된 것을 보여주고, 인간 급성 림포블라스틱 백혈병 라인 CEM은 10-7 ㎎/㎖ 만큼 낮은 집중도에서 억제되는 것으로 보고되었다.(Wolpert-DeFillippes et al. Biochem. Pharmacol. 24:1735-1738(1975)).
생체 내에서 메이탠신은 또한 활동적인 것으로 보여주고 있다. P388 림포시틱 백혈병 시스템의 종양 성장에 50 내지 100배의 복용량 범위에서 억제되는 것을 보여주고 있는데, 이는 높은 치료지수를 나타낸다; 또한 강력한 억제 활성화는 L1210 쥐 백혈병 시스템과 함께 보여주고 있다.(Kupchan, Ped. Proc. 33:2288-2295(1974)). 메이탠시노이드는 미국 특허 5,208,020 및 5,416,064 그리고 Chari et al., Cancer Res., 52: 127-131(1992) 와 Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 93:8618-8623(1996)에 묘사된 세포 결합 물질의 결합과 함께 사용된다. 이러한 결합에서, 세포-결합 물질은 이황화 결합에서 메이탠시노이드 DM1을 결합된다.[N2'-deacetyl-N2'(3-mercaptao-1-oxopropyl)-maytansine,1, CAS Number: 139504-50-0, 도 1]
상기 특허에서는, acylated N-methyl-L-alanine side Chain 을 포함하는 메이탠시노이드 약제는 화학식 2a, 2b이다.
Figure 112005066719031-PCT00001
화학식 2a에서, I는 1부터 10까지의 정수를 나타낸다. 따라서 화학식 2a 의 메이탠시노이드는 치환불가능한 메틸렌 족(-CH2-S-)에 결합되는 황 원자를 가지고 있다. 메이탠시노이드 복합물 또는 이황화물 족과 같은 설프히드릴 족은 그러한 메이탠시노이드가 "non-hindered"되는 것과 같이 이황화물-결합된 세포-결합물질-메이탠노시드 결합인데, 이는 설프히드릴 또는 이황화물 족의 α-카본상의 큰 치환기이 없기 때문이며, 그것은 입체적인 방해를 초래한다. 화학식 2b에서 m 은 0,1,2 또는 3을 나타낸다. 그러므로, 화학식 2b의 메이탠시노이드 또한 치환될 수 없는 메틸렌 족과 결합되는 황 원자를 가지며, m = 0 그리고 R2 = Ch3 또는 Ch2CH3인 경우를 제외한다. 만약에 m = 0이면, 그러면 메이탠시노이드는 이황화물 결합을 통 하여 세포 결합물질의 결합 후에 티올기 또는 이황화물기를 가지는 하나의 탄소 치환기를가진다. 그러나, 이 경우에는 황 원자가 카르보닐 족과 관련하여 β포지션을 가지고, 이러한 메이탠시노이드와 이황화물 결합을 경유한 세포-결합 물질과 함께 그런 메이탠시노이드의 결합은 β-엘리미네이션을 겪는 경향 때문에 불안정한 것으로 발견된다.
본 발명은 1개 혹은 2개의 알킬 치환된들을 운반하는 유황 원자를 가진 α-탄소 원자안에 있는 입체 장해형 티올 그리고 메이탠시노이드를 포함하는 이황화물을 새롭게 발표한다. 본 발명은 이러한 새로운 메이탠시노이드의 합성과정을 보여준다. 새로운 메이탠시노이드의 합성에서의 매개물으로서 유용한 신규 혼합물들이 점점 더 발표됨에 따라 본 발명은 세포결합물질을 가진 이러한 새로운 메이탠시노이들의 결합 표본을 보여준다.
종래의 기술은 그들의 독성을 감소시키지 않고 현존하는 약을 보완하기엔 거의 불가능했다. 본 발명은 입체 장해형 티올 또는 이황화물 일부분에 상당하는 새로운 메이탠시노이드 분자를 합성하는 방법을 가르치는 것으로 이 문제를 해결한다. 새로운 메이탠시노이드는 늘어나는 몇몇 사례들에서 이미 설명된 메이탠시노이드의 독성효능을 보존하고 있다.
메이탠시노이드의 세포결합물질은 목표가 아닌 건강한 세포들에게 손상을 입히는 부작용을 없애기 위한 것으로, 단 불필요한 세포들에 대항하는 목표방식에 적용되는 메이탠시노이드의 세포 독성 작용의 완전한 측정이 가능하다.
이처럼, 활성화된 세포(이식 거부 또는 접목) 또는 병들거나 이상한 다른 형태의 세포는 최소한의 부작용을 나타내는 반면, 발명은 유용한 작용매와 동일한 것을 만드는 새로운 방법을 제공하며 죽게 되는 병에 걸리거나 이상한 세포들의 제거를 위한 종양세포(특히 충실성종양 세포들)처럼 바이러스 전염된 세포, 미생물에 전염된 세포, 기생충에 전염된 세포, 자가면역세포(자기항체들을 생산하는 세포)를 오염시킨다.
이렇게, 본 발명은 이전에 나와있던 메이탠시노이드와 세포결합물질과 비교하여 굉장히 개선된 생물학적 활성으로 새로운 메이탠시노이드 세포결합물질을 포함하는 개선된 독성 생산방법을 보여준다. 구속 형식에 또는 배포된 서식에 또는 양쪽 보고서에서 높은 세포 독성을 나타내는 동안에 발명은 더욱 더 입체 장해형 티올 또는 세포결합물질의 화학적인 연관을 수용한 이황화물 일부분을 소유한 메이탠시노이드 파생물의 혼합방법을 보여준다. 현재 발명에 의해 결합제는 관련된 하나 이상의 메이탠시노이드를 포함한다.
메이탠시노이드를 세포결합물질에 결합하기 위하여, 메이탠시노이드는 먼저 보완되어야 한다. 본 발명에서 세포결합물질에 결합되는 능력이 있는 메이탠시노이드를 생산하기 위하여 사용될 수 있는 메이탠시노이드는 기술적으로 잘 알려져있고, 천연자원으로부터 추출할 수 있거나 알려진 방법에 따라 종합적으로 준비된다.
적당한 메이탠시놀 유사물들의 적절한 예는 다른 위치에서 변경된 방향환 차이를 가지고 있는 메이탠시노이드들을 포함한다.:
(1) C-19-데클로로 (미국특허 제4,256,746호) (안사미토신 P2의 LAH 절감으로 준비된);
(2) C-20-하이드록시 (또는 C-20-데미씰틸 + /-C-19-데클로로 (미국특허 제 4,361,650호와 제4,307,016호) (스트렙토마이시스 또는 방사선균을 사용하는 데미틸레이션이나 LAH를 사용하는 염소제거에 의해 준비된 ) 그리고;
(3) C-20-데미톡시, C-20-엑실록시(-OCOR), +/-데클로로 (미국특허 제 4,294,757호) (엑실 염화물을 사용하는 엑실레이션에 의해 준비된)
다른 위치에서의 변형을 가진 메이탠시놀의 유사화합물을 포함하는 특수한 예:
(1) C-9-SH (미국특허 제4,424,219) (H2S 또는 P2S5를 가진 메이탠시놀의 반응성에 의해 준비된)
(2) C-14-알콜씨멕실 (데미톡시/CH2OR) (미국특허 제4,331,598호);
(3) C-14-하이드록시메틸 또는 액시록시메틸 (CH2OH 또는 CH2OAC) (미국특허 제 4,450,254호) (노카르디아로부터 준비된)
(4) C-15-하이드록시/엑실록시 (미국특허 제4,364,866호) (스트렙토마이시스에 의한 메이탠시놀의 변환에 의해 준비된)
(5) C-15-메톡시 (미국특허 제4,313,946호와 제4,315,929호) (트레비아 누디플로라로부터 분리된)
(6) C-18-N-데미틸 (미국특허 제4,362,663호와 제4,322,348호)(스트렙토마이시스에 의한 메이탠시놀의 데미틸레이션에 의해 준비된); 그리고
(7) 4,5-데옥시 (미국특허 제4,371,533호) (메이탠시놀의 LAH의 감소/티타늄 3염화물에 의해 준비된)
메이탠시노이드를 세포-결합제로 결합하기 위해, 메이탠시노이드는 연결부분을 이룬다. 연결부분은 특정위치에서 완전히 활동적인 메이탠시노이드들의 배출을 따르는 화학상의 결합을 내포한다. 알맞은 화학상의 결합은 기술분야에서 잘 알려져 있으며 이황화물결합, 불안정한 산성의 결합, 불안정한 빛의 결합, 불안정한 펩티다아제의 결합과 불안정한 에스테라제의 결합을 포함한다. 이황화물결합이 선구물질이 된다.
여기에 첨부된 참고문헌, 미국특허 제5,208,020호의 명세서는 그러한 결합들을 지니고 있는 메이탠시노이드들의 생산을 보여준다.
최근 발명들에 따르면 고리부분은 원자의 공간적 배치를 방해하는 티올 또는 이황화물결합를 포함한다.
특히, 반응이 있는 화학족을 포함한 연결부분이 함유된 우선된 메이탠시노이드들은 메이탠시놀의 C-3이며 그것의 연속 원자의 공간적 배치를 방해하는 티올 또는 이황화물결합를 함유하는 연결부분에서 연속이다.
메이탠시노이드 상의 많은 위치들은 연결부분을 화학적으로 연결하는 위치로써 공급될 수 있다. 예를 들면, 하이드록실 족이 있는 C-3위치, 하이드록시메틸로 변경된 C-14위치, 하이드록시로 변경된 C-15위치와 하이드록시족이 있는 C-20위치들은 모두 유용할 것으로 기대되어진다. 그러나 이 중 C-3위치는 우선되어지며, 메이탠시놀의 C-3위치는 특히 더 우선되어진다.
또한, 연결부분을 가진 메이탠시놀의 에스테르 합성은 C-3위치에서 연결부분을 함유한 이황화물결합의 관점에서 하기에 묘사되었지만, 상기 묘사된 것처럼 다른 화학적 결합을 가진 연결부분은 다른 메이탠시노이드와는 다른 연결부분으로 최근의 발명에서 사용되어진다.
본 발명에서의 다양한 메이탠시노이드들의 구조는 도2로 대표된다. 원자의 공간적 배치를 방해하는 티올 또는 이황화물결합을 가진 메이탠시노이드들의 합성은 참고로 도3에 나타내어질 수 있다. 실례로 메이탠시노이드 N 2'-디아세틸-N- 2'(4-메르캡토-1-옥소펜틸)-메이탄신(DM3라 불리우는) 과 N 2'디아세틸-N- 2'(4-메틸-4-메르셉토-1-옥소펜틸)메이탠신(DM4라불리우는)가 있으며, DM3(4a)와 DM4(4b)는 다음과 같은 구조적 화학식에 의해 대표된다.
Figure 112005066719031-PCT00002
4a 4b
새로운 원자의 공간적 배치를 방해하는 티올과 발명의 메이탠시노이드를 함유하는 이황화물의 시험관 안의 씨토톡시시티는 시험관안의 불필요한 다양한 세포라인의 증식을 나타내지 않기 위한 그들의 능력으로 평가되어진다. 예를 들면, 생체 내 유방암 라인 SK-Br-3 또는 생체 내 피부암 라인 KB와 같은 세포라인은 이러한 새로운 메이탠시노이드의 씨토톡시시티의 부과로 이용될 수 있다. 평가된 세포들은 72시간 동안 알려진 방법들로 직접적인 분석에 의해 측정된 살아남은 파편과 화합물로 드러나게 된다. IC50의 가치는 분석 결과로부터 그 때 산정되어 질 수 있다.
원자의 입체적 배치가 방해된 티올 또는 이황화 부분을 가진 메이탠시노이드의 생산
여기서 상기 티올기를 갖는 아실 족의 탄소원자는 족의 탄소원자 중에 방해받는 설프하이드릴 족과 관련된 족이 있는 아실레이트된 아미노산고리를 가진 본 발명의 새로운 메이탠시노이드들은 C-3과 C-14에서 방해받은 설프하이드릴 족을 가지는 아실족을 갖는아실하이드록시메틸, C-15 하이드록시 또는 C-20 데스메틸에서 CH3, C2H5 이 되는 원자테이트 된 아미노산 측쇄을 갖는다. 여기서 티올기를 갖는 상기 아실 족의 탄소원자는 1개 또는 2개의 치환된를 가지며, 상기 치환된들은 CH3, C2H5 , 1 내지 10개의 탄소원자를 갖는 알킬 또는 알케닐, 3내지 10개의 탄소 원자를 가진 가지형 또는 고리형 알킬 또는 알케닐, 페닐, 치환된된 페닐 또는 헤테로사이클로 방향족화합물 또는 기본적인 헤테로사이클로알킬 그리고 상기 치환된 중의 하나는 H가 될 수도 있다. 그리고 여기서 상기 아실 족은 상기 카르보닐기와 상기 황원자 사이에서 적어도 3개의 탄소원자의 선형체인길이를 갖는다.
바람직하게는, 상기 메이탠시노이드 화합물은 화학식 4'로 대표된다:
Figure 112005066719031-PCT00003
4'
여기서:
Y'은
(CR7CR8)1(CR9=CR10)p(C≡C)qAr(CR5CR6)mDu(CR11=CR12)(C≡C)sBt(CR3CR4)nCR1R2SZ를 나타내고,
여기서:
R1과 R2는 각각 독립적으로 CH3, C2H5, 1내지 10의 탄소원자를 가진 선형의 알케닐킬 또는 알킬, 3부터 10까지의 탄소원자를 가진 가지형, 사이클로 알킬 혹은 알케닐, 페닐, 치환된 페닐 또는 헤테로사이클로 방향족화합물 또는 기본적인 헤테로사이클로알킬이며, 이외에도 R2는 H 일 수 있다; A, B, D 는 분해할 수 없거나 치환된 아릴 또는 헤테로사이클로 방향족화합물이거나 헤테로사이클로알킬 라디칼이다.;
R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R11, 그리고 R12는 각각 독립적으로 H, CH3, C2H5, 1부터 10까지의 탄소원자를 가진 알케닐 또는 선형 알킬, 3부터 10까지의 탄소원자를 가진 가지형, 사이클로 알킬 혹은 알케닐, 페닐, 치환된 페닐 또는 헤테로사이클로 방향족화합물 또는 헤테로사이클로알킬 라디칼이다;
l, m, n, o, p, q, r, s, 그리고 t는 각각 독립적으로 0이거나 1내지 5 사이의 정수이고, l, m, n, o, p, q, r, s, t 중 적어도 동시에 0이 아니다;
Z는 H, SR 혹은 -COR, 이중에 R은 선형 알킬 또는 1부터 10까지의 탄소원자를 갖는 알케닐, 3 내지 10의 탄소원자를 갖는 가지형, 사이클로 알킬 혹은 알케닐이거나, 분해할 수 없거나 치환된 아릴 또는 헤테로사이클로 방향족화합물 또는 기본적인 헤테로사이클로알킬이다.
화학식 4‘에 의해 표현된 화합물의 바람직한 실시예에서 R1은 H, R2는 메틸 그리고 Z는 H; R1과 R2는 메틸이며 Z는 H; R1은 H, R2는 메틸, 그리고 Z는 -SCH3; 혹은 R1과 R2는 메틸, 그리고 Z는 -SCH3.
더욱 바람직하게는, 메이탠시노이드는 화학식 (I-L), (I-D) 혹은 (I-D,L) 에 의해 대표되어지는 화합물이다.
Figure 112005066719031-PCT00004
L D D, L
(I)
상기식에서:
Y는 (CR7CR8)1(CR5CR6)m(CR3CR4)nCR1R2SZ를 대표한다. 여기서;
R1과 R2는 각각 독립적으로 CH3, C2H5, 1내지 10의 탄소원자를 가진 선형의 알킬 또는 알케닐, 3내지 10의 탄소원자를 가진 가지형이거나 사이클로 알킬 혹은 알케닐, 페닐, 치환된페닐 또는 헤테로사이클로 방향족화합물 또는 기본적인 헤테로사이클로알킬이며 나머지 하나 R2는 H 일 수 있다;
R3, R4, R5, R6, R7, 그리고 R8, 은 각각 독립적으로 H, CH3, C2H5, 1내지 10의 탄소원자를 가진 알케닐 또는 선형 알킬, 3내지 10의 탄소원자를 가진 가지형이거나 사이클로 알킬 혹은 알케닐, 페닐, 치환된 페닐 또는 헤테로사이클로 방향족화합물 또는 헤테로사이클로알킬 라디칼이다;
l, m 그리고 n은 각각 1부터 5사이의 정수이고, 이외에도 n은 0이 될 수 있다.;
Z는 H, SR 혹은 -COR, 이중에 R은 직선형 알킬 또는 1내지 10의 탄소원자를 갖는 알케닐, 3내지 10의 탄소원자를 갖는 가지형이거나 사이클로 알킬 혹은 알케닐이거나, 분해할 수 없거나 치환된 아릴 또는 헤테로사이클로 방향족화합물 또는 기본적인 헤테로사이클로알킬이다.; 그리고 May는
C-3, C-14 하이드록시메틸, C-15 하이드록시 혹은 C-20 데스메틸에서 측면고리를 가지는 메이탠시노이드를 대표한다.
화학식 4로 대표되는 화합물인 C-3 에스테르는 더욱 바람직하다.
Figure 112005066719031-PCT00005
4
여기서 치환된들은 상기 정의된 것들이다.
상기 화합물들 중 특별히 바람직한 것은 R1은 H, R2는 메틸, R5, R6, R7 그리고 R8은 각각 H, 1과 m은 각각 1, n은 0, 그리고 Z는 H; 그러한 화합물 중 R1, R2는 메틸, R5, R6, R7 그리고 R8 은 각각 H, 1과 m은 1, n은 0, 그리고 Z는 H; 그러한 화합물 중 R1은 H, R2는 메틸, R5, R6, R7 그리고 R8 은 각각 H, 1과 m은 각각 1, n은 0, 그리고 Z는 -SCH3이다. 또한, L-알라닐 스테레오 이성체는 본 발명 상기 결합 물질로서 가장 바람직하다.
화학식4의 바람직한 실시예는 DM3과 DM4를 포함한다. 다시 말해 (4a를 합성하는 DM3) Z는 H, R1은 H, R2는 메틸, R5, R6, R7과 R8 은 각각 H, 그리고 1 과 m은 1, 그리고 n은 0이 있는 화학식4의 메이탠시노이드; (4b를 합성하는 DM4) Z는 H, R1은 R2 그리고 메틸, R5, R6, R7과 R8 은 각각H, I와 m은 1, 그리고 n은 0; 화학식4의 메이탠시노이드 중에 R1은 H, R2는 메틸, R5, R6, R7과 R8 은 각각 H, I 와 m은 각각 1, n은 0, 그리고 Z는 -SCH3; 그리고 화학식4의 메이탠시노이드 중에 R1과 R2는 메틸, R5, R6, R7과 R8 은 각각 H, I와 m은 1, n은 0, 그리고 Z는 -SCH3이다.
1내지 10의 탄소원자를 가진 선형의 알킬 또는 알케닐의 실례는 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, 헥실, 프로페닐, 부테닐과 헥세닐을 포함한다. 그러나 이에 한정되지는 않는다.
3내지 10의 탄소원자를 가진 가지형 알킬 또는 알케닐의 실례는 이소프로필, 이소부틸, 순간부틸, 테르트부틸, 이소펜틸, 1-에틸-프로필, 이소부테닐과 이소펜테닐을 포함한다. 그러나, 이에 한정되지는 않는다.
3내지 10의 탄소원자를 가진 사이클로 알켈 또는 알케닐의 실례는 사이클로푸로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 사이클로펜데닐 사이클로헥세닐을 포함한다. 그러나 이에 한정되지는 않는다.
단일 아릴은 6내지 10까지의 탄소원자를 포함하며 치환된 아릴은 1내지 4의 탄소원자를 보유한 최소한 하나의 알킬치환된 혹은 메톡시나 에톡시와 같이 치환된 알콕시나 치환된 할로겐 또는 치환된 질소를 가지는 6부터 10까지의 탄소원자를 가지는 아릴을 포함한다.
6내지 10의 탄소원자를 함유한 단일 아릴의 실례는 페닐과 나프틸을 포함한다.
치환된 아릴의 실례는 질소페닐과 디니트로페닐을 포함한다.
헤테로사이클로 방향족화합물 라디칼은 N, O 혹은 S로부터 선택된 하나 또는 둘의 헤테로 원자를 보유한 3내지 10의-수를 가진 고리가 있는 족을 포함한다.
헤테르사이클로아킬 라디칼은 N, O 또는 S로부터 선택된 하나 혹은 둘의 헤테로 원자를 보유한 3내지 10의-수를 가진 고리시스템을 형성하는 사이클로 화합물을 포함한다.
헤테로사이클로 방향족화합물 라디칼의 실례는 파이리딜, 질소파이리딜, 파이롤릴, 옥사졸릴, 티에닐, 티아졸릴과 퓨릴을 포함한다.
헤테로알킬의 실례는 디하이드로퓨릴, 테트라하이드로퓨릴, 테트라하이드로파이롤릴, 피페리디닐, 피페라진닐과 몰포리노를 포함한다.
입체적으로 원자의 공간적 배치를 방해하는 티올 혹은 이황화물의 부분을 가지는 새로운 메이탠시노이드는 후에 새롭게 드러난 방법들에 의해 준비되어 질 수 있다.
메이탠시노이드의 합성
도3a은 메이탠시노이드DM4(4b)의 합성단계를 보여준다. 이소부틸렌 황화물은 메르캡토 화합물6을 공급하기 위해 아세토니트릴의 음이온으로 반응된다. 염기를 가진 6의 가수분해는 4-메르캡토-4-메틸펜타노익산를 제공했다(7). 7에서 이황화물 8로의 변환은 메틸 메탄에티올설포네이트(MeSSO2Me) 로 반응됨에 의해 달성되었다. 8에서 N-하이드록시석시니마이드 에스테르 9로의 변환은 실리카겔을 뛰어넘는 색층분석 원주에 의해 순화된 카르복실릭산 10을 제공했던 N-메틸-L알라닌으로 반응함으로써 뒤따랐다. N,N'-디사이클로힉셀카르보디미드(DCC)와 아연클로라이드의 존재에서 메이탠시놀을 가진 10의 반응은 N-아실-N-메틸-L-알라닐 메이탠시노이드 L-DM4SMe,(4a) 그리고 N-아실-N-메틸-D-알라닐 메이탠시노이드 D-DM4SMe(4f)의 혼합물을 제공한다. 디아스테르오머 혼합물은 사이애노가 결합된 원주를 사용하는 HLPC에 의해 분리되었다. 올바른 이성질체 4e를 보유한 L-아미노산은 사이애노가 결합된 원주를 사용하는 HPLC에 의해 다시 정련되어지는 L-아미노아실 메이탠시노이드 DM4(4b)를 함유한 티올을 공급하기위해 dithiothreto를 보유하여 수집되었으며 감소되었다. 도3b는 메이탠시노이드DM3(4a)의 합성단계를 보여준다. 4메르캡토펜타노익산(12)는 13을 주기위해 메틸 메탄에티올설포네이트와 의 반응에 의해 메틸디설파이드로 전환되었다. N-메틸-L-알라닌의 반응성으로 이어지는 13에서 N-하이드록시석시니마이드 에스테르 14로의 전환은 실리카 겔을 능가하는 색층분석 원주에 의해 정련되어진 카르복실릭산 15를 제공했다.
아연클로라이드와 N,N'-디클로헥실카르보디마이드(DCC)의 실재 안에서 메이탠시놀을 가진 15의 반응은 N-아실-N-메틸-L-알라닐 메이탠시노이드 L-DM3SSMe,(4a)와 N-아실-N-메틸-D-알라닐 메이탠시노이드D-DM3SSMe(4d)의 조합을 제공했다. 디아스테르오머 혼합물은 사이애노가 결합된 원주를 사용하는 HPLC에 의해 분리되었다. 이성질체를 보유한 바람직한 L-아미노산은 사이애노가 결합된 원주를 사용하는 HPLC에 의해 다시 한 번 정련되며 DM3(4a) 메이탠시노이드를 함유한 메르캡토-L-아미노산을 주기 위해 디티오트레이톨로 수집되었고 줄어들었다.
도3c와 d는 (R)-4-메틸디티오-1-옥소-펜틸부분 혹은 (S)-4-메틸디티오-1-옥소펜틸부분을 견뎌내는 DM3의 합성을 보여준다. 변환하거나 (R)-1, 3-부탄에디올(16)이 그것의 ditosylate 17로의 변환은 니트릴18을 공급한 potassium 칼륨 에틸 크산틴산염과 화학나트륨 시안화물로 반응되는 일련의 반응에 의해 계속된다. 전환된 디설파이드에 의해 따라오는 염기 하이드로리시스는 (S)-4-메티디티오-펜타노익산19를 제공했다. 19가 석시미딜 에스테르 20으로의 변환은, N-메틸-N-[4-(S)메틸디티오-1-옥소-펜틸]-S-알라닌이 주어진 N-메틸-L-알라닌으로의 변환으로 이어졌다. (15a) 화합물 15에 묘사된 것처럼 메이탠시놀의 반응은 L-DM3SMe 4g와 4h의 두 디에스테르오머 , (S)-1, 3-부타네디올(21)은 (R)-4-메티디티오-펜타노익산24 그리고 나서 15b로 화학변화시켰다.
상기 설명된 것처럼, 메이탠시놀의과의 반응은 두 개의 DM3SMe diastereomers, 4K 그리고 4l를 주었다.
이처럼 본 발명은 보호되는 설프히드릴 족을 가지는 아실 족에서 아실테이트된 아미노산 측쇄을 가지는 C-3, C-14 하이드록시메틸, C-15 하이드록시 또는 C-20 디스메틸에서 메이탠시노이드의 에스테르화 방법을 제공한다.
여기서, 상기 보호되는 티올기를 갖는 아실 족의 탄소원자는 1개 또는 2개의 치환된를 가지고, 상기 치환된들은 CH₃, C2H5 , 1내지 10의 탄소원자를 갖는 선형 알킬 또는 알케닐, 3내지 10의 탄소원자를 갖는 가지화된 또는 사이클로 알킬 또는 알케닐, 페닐, 치환된 페닐 또는 헤테로사이클로 방향족화합물 또는 헤테로사이클로알킬 라디칼, 그리고 이외에도 상기 치환된들의 하나는 H가 될 수 있다.
그리고, 상기 알킬 족은 상기 카르보닐기와 상기 황원자 사이에 적어도 3개의 탄소원자 선형 체인 길이를 갖는다.
C-3, C-14 하이드록시메틸, C-15 하이드록시 또는 C-20 디스메틸에서 메이탠시노이드와 아실 족이 보호되는 설프히드릴 족을 갖는 아실테이티드 아미노산과의 반응하는 상기 방법.
바람직한 실시예에서, 본 발명은 화학식 42' 의 메이탠시노이드를 제공하기 위한 메이탠시놀의 에스테르화의 방법을 제공한다.
Figure 112005066719031-PCT00006
42
여기서:
Y2' 는
(CR7CR8)l(CR9=CR10)p(C=C)qAr(CR5CR6)mDu(CR11=CR12)r(C=C)sBt(CR3CR4)nCR1R2SZ2을 나타낸다.
또한 여기서,
R1과 R2는 각각 독립적으로 CH3, C2H5, 선형 또는 가지형 1내지 10의 탄소원자를 가지는 알킬 혹은 알케닐, 3내지 10의 탄소원자를 가지는 사이클로 알킬 혹은 알케닐, 페닐, 치환된 페닐, 혹은 헤테로사이클로 방향족화합물 혹은 헤테로사이클로알킬 라디칼, 이외에도 R2는 H가 될 수 있다.;
A, B와 D는 각각 독립적으로 3내지 10의 탄소원자를 가지는 사이클로 알킬이거나 사이클로알케닐이거나, 단순 또는 치환된 아릴, 혹은 헤테로사이클로 방향족화합물 또는 헤테로 싸이클로알킬 방향족화합물이다.;
R3 ,R4 ,R5 ,R6 ,R7 ,R8 ,R9 ,R11과 R12는 각각 H, CH3, C2H5 , 1내지 10의 탄소원자를 가진 알케닐 혹은 선형 알킬, 3내지 10의 탄소원자를 가지는 가지화 된 또는 싸이클릭 알킬 또는 알케닐, 또는 페닐, 치횐된 페닐, 또는 헤테로싸이클릭 방향족화합물 또는 헤테로사이클로알킬 라디칼이다.
l, m, n, o, p, q, r, s와 t는 각각 독립적인 0이거나 1부터 5까지의 정수이며 l, m, n, o, p, q, r, s와 t에서 적어도 둘은 어느 때에도 0이 아니다.
Z2는 SR 또는 -COR인데, 여기서 R은 1내지 10의 탄소원자를 가지는 선형 알킬 또는 알케닐이거나 또는 단순 또는 치환된 아릴 또는 헤테로사이클로 방향족화합물 또는 헤테로 사이클로 알킬 라디칼이며, 상기 방법은 C-3에서 구조 11의 메이탠시놀과 화학식 (III'-L), (III-D), 또는 (III'-D,L)의 화합물과 반응을 포함한다.
Figure 112005066719031-PCT00007
11
Figure 112005066719031-PCT00008
L D D, L
(III')
여기에서:
Y2'는
(CR7CR8)l(CR9=CR10)p(C=C)qAr(CR5CR6)mDu(CR11=CR12)r(C=C)sBt(CR3CR4)nCR1R2SZ2를 나타낸다:
R1과 R2는 각각 독립적으로 CH3, C2H5, 1내지 10의 탄소원자를 가지는 선형 알킬 혹은 알케닐, 3내지 10의 탄소원자를 갖는 가지형이거나 사이클로 알킬 혹은 알케닐, 치환된 페닐이나 헤테로 사이클로 방향족화합물이거나, 헤테로 사이클로 알킬 라디칼이며, 이외에도 R2는 H가 될 수 있다;
A, B와 D는 각각 독립적으로 사이클로 알킬 또는 3내지 10의 탄소원자를 갖는 사이클로 알케닐, 단순 또는 치환된 아릴, 또는 헤테로사이클로 방향족화합물 또는 헤테로 사이클로 알킬 라디칼이다;
R3 ,R4 ,R5 ,R6 ,R7 ,R8 ,R9 ,R11과 R12는 각각 독립적으로 H, CH3, C2H5, 1내지 10의 탄소원자를 가지는 선형 알킬이나 알케닐, 3내지 10의 탄소원자를 가진 가지화된 또는 사이클로 알킬 또는 알케닐, 페닐, 치환된 페닐이나 헤테로 사이클로 방향족화합물 또는 헤테로사이클로 알킬 라디칼이다;
l, m, n, o, p, q, r, s와 t는 각각 독립적으로 0또는 1~5의 정수이고, l, m, n, o, p, q, r, s와 t중 적어도 둘은 어느 때에도 0이 아니다; 그리고,
Z2는 SR 이나 -COR이다. 여기서 R은 1내지 10의 탄소원자를 가진 선형 알킬이거나 알케닐, 3내지 10의 탄소원자를 가진 가지형 또는 사이클로 알킬 혹은 알케닐 또는 단순나 치환된 아릴이거나 헤테로 사이클로 방향족화합물 혹은 헤테로사이클로알킬 라디칼이다.
바람직하게는 화학식(I)의 화합물은 화학식(I-L)에 의해 표현되며 또한, R1은 H이며, R2는 메틸이다.
더 바람직한 실시예에서 본 발명은 화학식 42의 메이탠시노이드를 공급하기위한 메이탠시놀의 에스테르화의 방법을 제공한다;
Figure 112005066719031-PCT00009
42
여기서:
Y2는 (CR7CR8)l(CR5CR6)m(CR3CR4)nCR1R2SZ2를 나타내고, 또한 여기서;
R1과 R2는 각각 독립적으로 CH3, C2H5, 1내지 10의 탄소원자를 가지는 선형 알킬 혹은 알케닐, 3내지 10의 탄소원자를 갖는 가지형이거나 사이클로 알킬 혹은 알케닐, 치환된 페닐이나 헤테로 사이클로 방향족화합물이거나, 헤테로 사이클로 알킬 라디칼이며, 이외에도 R2는 H가 될 수 있다;
R3 ,R4 ,R5 ,R6 ,R7 ,R8 ,R9 ,R11과 R12는 각각 독립적으로 H, CH3, C2H5, 1내지 10의 탄소원자를 가지는 선형 알킬이나 알케닐, 3내지 10의 탄소원자를 가진 가지화된 또는 사이클로 알킬 또는 알케닐, 페닐, 치환된 페닐이나 헤테로 사이클로 방향족화합물 또는 헤테로사이클로 알킬 라디칼이다;
l,m과 n은 각각 독립적으로 1~5의 하나의 정수이며, 이외에도 n은 0이 될 수 있다;
Z2는 SR또는 -COR이며, 여기서 상기R은 1내지 10의 탄소원자를 갖는 선형 알킬이나 알케닐, 3내지 10의 탄소원자를 갖는 가지화된 또는 사이클로 알케닐, 또는 단순 또는 치환된 아릴이거나 헤테로 사이클로 방향족화합물이거나 헤테로 사이크로 알킬라디칼이다. 상기 방법은 C-3에서 구조11의 메이탠시놀과 화학식(III-L), (III-D) 혹은 (III-D,L)에 의해 표현되는 화합물과의 반응을 포함한다.:
Figure 112005066719031-PCT00010
11
Figure 112005066719031-PCT00011
L D D, L
(III)
여기서:
Y2는 또한 (CR7CR8)l(CR5CR6)m(CR3CR4)nCR1R2SZ2를 나타내며, 또한 여기서;
R1과 R2는 각각 독립적으로 CH3, C2H5, 1내지 10의 탄소원자를 가지는 선형 알킬 혹은 알케닐, 3내지 10의 탄소원자를 갖는 가지형이거나 사이클로 알킬 혹은 알케닐, 치환된 페닐이나 헤테로 사이클로 방향족화합물이거나, 헤테로 사이클로 알킬 라디칼이며, 이외에도 R2는 H가 될 수 있다
R3 ,R4 ,R5 ,R6 ,R7 ,과 R8은 각각 독립적으로 H, CH3, C2H5, 1내지 10의 탄소원자를 갖는 선형의 알킬 혹은 알케닐, 3내지 10의 탄소원자를 가진 가지형 또는 사이클로 알킬이나 알케닐, 페닐, 치환된 페닐이나 헤테로 사이클로 방향족화합물이거나 헤테로 사이클로 알킬 라디칼이다:
l, m, n들은 각각 독립적으로 1~10의 정수이며, 이외에도 n은 0이 될 수 있다; 그리고
Z2는 SR또는 -COR이며, 여기서 상기R은 1내지 10의 탄소원자를 갖는 선형 알킬이나 알케닐, 3내지 10의 탄소원자를 갖는 가지화된 또는 사이클로 알케닐, 또는 단순 또는 치환된 아릴이거나 헤테로 사이클로 방향족화합물이거나 헤테로 사이클로 알킬라디칼이다.
상기 diasteromers는 사이애노가 결합된 실리카 위의 HLPC에 의해 분리될 수 있다.
더 바람직한 실시예에서는, 본 발명은 화학식(IV-L), (IV-D), 혹은 (IV-D,L)에 의해 표현되는 메이탠시노이드 에스테르를 생산하기 위한 메이탠시노이드의 에스테르화 방법을 제공한다.
Figure 112005066719031-PCT00012
L D D, L
(IV)
여기서:
Y2는 (CR7CR8)l(CR5CR6)m(CR3CR4)nCR1R2SZ2를 나타내며, 또한 여기서
R1과 R2는 각각 독립적으로 CH3, C2H5, 1에서 10의 탄소원자를 갖는 선형 아릴 또는 알케닐, 3에서 10의 탄소원자를 가지형 또는 사이클로 알킬 또는 알케닐, 페닐, 치환된 페닐, 또는 헤테로싸이클릭 방향족화합물 또는 헤테로싸이클로알킬 라디칼이며, 또한 R2는 H가 될 수 있다.
R3, R4, R5, R6, R7 과 R8는 독립적으로 H, CH3, C2H5, 1에서 10의 탄소원자를 갖는 선형 알킬 또는 알케닐, 3에서 10의 탄소원자를 갖는 가지형 또는 사이클로 알킬 또는 알케닐, 페닐, 치환된 페닐 또는 헤테로싸이클릭 방향족화합물 또는 헤테로싸이클로알킬 라디칼이다;
l, m과 n은 각각 독립적으로 1에서 5사이의 하나의 정수이며, 또한 n은 0이 될 수 있다;
Z2는 SR 또는 COR이며, 여기서 R이 1에서 10의 탄소원자를 갖는 선형 알킬 또는 알케닐, 3에서 10의 탄소원자를 갖는 가지형 또는 사이클로 알킬 또는 알케닐, 또는 단순 또는 치환 아릴기 또는 헤테로싸이클릭 방향족화합물 또는 헤테로싸이클로알킬 라디칼이다.; 그리고;
May는 메이탠시노이드이고; may가 C-3, C-14 히드록시메틸, C-15 히드록시, 또는 C-20 데스메틸에서 상기 may와 화학식(Ⅲ-L), (Ⅲ-D), 또는 (Ⅲ-D,L)과의 반응을 포함하는 상기 방법;
Figure 112005066719031-PCT00013
(Ⅲ)
여기서, Y2는 (CR7CR8)l(CR5CR6)m(CR3CR4)nCR1R2SZ2를 나타내고, 또한 여기서,
R1과 R2는 각각 독립적으로 CH3, C2H5, 1에서 10의 탄소원자를 갖는 선형 알킬 또는 알케닐, 3에서 10의 탄소원자를 갖는 가지형 또는 사이클로 알킬 또는 알케닐, 페닐, 치환된 페닐 또는 헤테로싸이클릭 방향족화합물 또는 헤테로싸이클로알킬 라디칼이며, 또한 R2는 H가 될 수 있다
R3 , R4, R5, R6, R7 과 R8는 독립적으로 H, CH3, C2H5, 1에서 10의 탄소원자를 갖는 선형 알킬 또는 알케닐, 3에서 10의 탄소원자를 갖는 가지형 또는 사이클로 알킬 또는 알케닐, 페닐, 치환된 페닐 또는 헤테로싸이클릭 방향족화합물 또는 헤테로싸이클로알킬 라디칼이다;
l, m과 n은 각각 독립적으로 1에서 5사이의 하나의 정수이며, 또한 n은 0이 될 수 있으며;
Z2는 SR 또는 -COR이며, 여기서 상기R이 1에서 10의 탄소원자를 갖는 선형 알킬 또는 알케닐, 3에서 10의 탄소원자를 갖는 가지형 또는 사이클로 알킬 또는 알케닐, 또는 단순(單體) 또는 치환 아릴기 또는 헤테로싸이클릭 방향족화합물 또는 헤테로싸이클로알킬 라디칼이다.
본 발명의 더욱 실시예는 화학식 42의 메이탠시노이드를 주기 위한 메이텐시놀의 에스테르화 방법을 제공하는 것이다.
Figure 112005066719031-PCT00014
42
여기서 Y2는 CR7CR8)l(CR5CR6)m(CR3CR4)nCR1R2SZ2를 나타내며, 또한 여기서,
R1과 R2는 각각 독립적으로 CH3, C2H5, 1에서 10의 탄소원자를 갖는 선형 알킬 또는 알케닐, 3에서 10의 탄소원자를 갖는 가지형 또는 사이클로 알킬 또는 알케닐, 페닐, 치환 페닐 또는 헤테로싸이클릭 방향족화합물 또는 헤테로싸이클로알킬 라디칼이며, 또한 R2는 H가 될 수 있다.
R3 , R4, R5, R6, R7 과 R8는 독립적으로 H, CH3, C2H5, 1에서 10까지의 탄소원자를 갖는 선형 알킬 또는 알케닐, 3에서 10의 탄소원자를 갖는 가지형 또는 사이클로 알킬 또는 알케닐, 페닐, 치환 페닐 또는 헤테로싸이클릭 방향족화합물 또는 헤테로싸이클로알킬 라디칼이다;
l, m과 n은 각각 독립적으로 1에서 5사이의 하나의 정수이며, 또한 n은 0이 될 수 있으며;
Z2는 SR 또는 -COR이며, 여기서 상기R이 1에서 10의 탄소원자를 갖는 선형 알킬 또는 알케닐, 3에서 10의 탄소원자를 갖는 가지형 또는 사이클로 알킬 또는 알케닐, 또는 단순 또는 치환된 아릴기 또는 헤테로싸이클릭 방향족화합물 또는 헤테로싸이클로알킬 라디칼이다.
상기 방법은 화학식(Ⅲ-L), (Ⅲ-D), 또는 (Ⅲ-D,L)에 의해 표현되는 화합물C-3의 반응을 포함한다.
Figure 112005066719031-PCT00015
(III)
여기서 Y2는 (CR7CR8)l(CR5CR6)m(CR3CR4)nCR1R2SZ2를 나타낸다. 또한 여기서;
R1과 R2는 각각 독립적으로 CH3, C2H5, 1에서 10의 탄소원자를 갖는 선형 알킬 또는 알케닐, 3에서 10의 탄소원자를 갖는 가지형 또는 사이클로 알킬 또는 알케닐, 페닐, 치환된 페닐 또는 헤테로싸이클릭 방향족화합물 또는 헤테로싸이클로알킬 라디칼이며, 또한 R2는 H가 될 수 있다.
R3 , R4, R5, R6, R7 과 R8는 독립적으로 H, CH3, C2H5, 1에서 10까지의 탄소원자를 갖는 선형 알킬 또는 알케닐, 3에서 10의 탄소원자를 갖는 가지형 또는 사이클로 알킬 또는 알케닐, 페닐, 치환된 페닐 또는 헤테로싸이클릭 방향족화합물 또는 헤테로싸이클로알킬 라디칼이다;
l, m과 n은 독립적으로 1에서 5 사이의 하나의 정수이며, 또한 n은 0이 될 수 있으며;
Z2는 SR 또는 -COR이며, 여기서 상기R이 1에서 10의 탄소원자를 갖는 선형 알킬 또는 알케닐, 3에서 10의 탄소원자를 갖는 가지형 또는 사이클로 알킬 또는 알케닐, 또는 단순 또는 치환 아릴기 또는 헤테로싸이클릭 방향족화합물 또는 헤테로싸이클로알킬 라디칼이다.
바람직하게는, 화학식(I)에 의해 표현되는 화합물은 L 스테로이소머(steroisomer)이다.
상기 방법을 위해, R1은 H, R2는 메틸, R5, R6, R7과 R8은 각각 H이며, l과 m은 각각 1, n은 0인 것이 바람직하다; 또는 R1과 R2는 메틸, R5, R6, R7과 R8은 각각 H, l과 m은 1, 그리고 n은 0인 것이 선호된다.
DM3를 만들 때, (Ⅲ-L)화학식의 화합물은 15a(S,S), 15b(S,R)이거나 15a(S,S)와 15b(S,R)의 혼합물이다; (Ⅲ-D)화학식의 화합물은 R 또는 S 키랄성을 가진 아실족 또는 racemic 아실족에 의해 N-메틸-D-알라닌이 화합물 15를 부여하기 위하여 아킬레이트된다; (Ⅲ-D,L)화학식의 화합물은 황 원소를 함유하는 탄소중심은 15 구조의 화합물을 부여하기 위해 racemic 또는 R 또는 S 키랄성인 보호받은 티올 기능성을 함유하는 카르복시기족으로 인해 아킬레이트된다.
15a(S,S)와 15b(S,R)의 혼합물은 다음을 포함하는 과정에 의해 제조된다.;
(1) 화합물 13을 만들기 위해, 메틸 메탄티올썰포네이트(methyl methanethiolsulfonate)를 4-머캡토펜타모익 산(mercaptopentamoic acid)(12)을 반응시키는 과정;
(2) 화합물 13을 그것의 N-하이드록시썩시니마이드 에스테르(hydroxysuccinimide ester) 14로 변환하는 과정;
(3) 화합물 15a(S,S)와 15b(S,R)을 만들기 위해 화합물 14와 N-메틸(methyl)-L-알라닌(alanine)을 반응시키는 과정;
유사하게, 화합물 15a(S,S)와 15b(S,R)의 혼합물은 다음을 포함하는 과정에 의해 제조된다.
(1) 화합물 13을 만들기 위해, 메틸메탄티올썰포네이트(methyl methanethiolsulfonate)를 4-머캡토펜타모익 산(mercaptopentamoic acid)(12)과 반응시키는 과정;
(2) 화합물 13을 그것의 N-하이드록시썩시니마이드 에스테르(hydroxysuccinimide ester) 14로 변환하는 과정;
(3) 화합물 15a(R,S)와 15b(R,R)의 혼합물을 만들기 위해, 화합물 14와 N-메틸(methyl)-D-알라닌(alanine)을 반응시키는 과정;
보호되는 티올기를 갖는 카르복시키족에 의해 아실테이트된 라세믹 N-메틸알라닌- 여기서 구조 15의 화합물을 주기 위해, 상기 황원자를 갖는 단소중심은 라세믹 또는 R 또는 S 키랄성 중 어느 하나인 것- 은 다음 과정에 의해 제조된다.
(1) 화합물 13을 만들기 위해, 메틸메탄티올썰포네이트(methyl methanethiolsulfonate)와 4-머캡토펜타모익 산(mercaptopentamoic acid)(12)을 반응하는 과정
(2) 화합물 13을 그것의 N-하이드록시썩시니마이드 에스테르(hydroxysuccinimide ester) 14로 변환하는 과정
(3) 보호되는 티올기를 갖는 가르복실족에 의해 아실테이트되는 상기 라세믹 N-메틸알라닌을 만들기 위해, 화합물 14와 라세믹 N-메틸알라닌을 반응시키는 과정, 여기서 구조 15의 화합물을 주기 위해, 황원자를 갖는 탄소중심은 라세믹 또는 R 또는 S 키랄성 중 어느 하나이다.
화합물 15a(S,S)는 다음 과정에 의해 제조된다.;
(1) (R)-1,3-부탄디올(butanediol)을 (S)-4-(메티디티오((methydithio))펜타노익 산(pentanoic acid) 19로 변환하는 과정
(2) 화합물 19를 그것의 N-하이드록시썩시니마이드 에스테르(hydroxysuccinimide ester)(20)로 변화하는 과정
(3) 상기 혼합물 15a(S,S)를 만들기 위해, 화합물 20과 N-메틸(methyl)-L-알라닌(alanine)을 반응시키는 과정
화합물 15b(S,R)는 다음 과정에 의해 제조된다.;
(1) (S)-1,3-부탄디올(butanediol)을 (R)-4-(메티디티오((methydithio))펜타노익 산(pentanoic acid) 24로 변환하는 과정
(2) 화합물 24를 그것의 N-하이드록시썩시니마이드 에스테르(hydroxysuccinimide ester)(25)로 변화하는 과정
(3) 상기 혼합물 15b(S,R)을 만들기 위해, 상기 화합물 25와 N-메틸(methyl)-L-알라닌(alanine)을 반응시키는 과정
DM4를 만들 때, (Ⅲ-L)화학식의 화합물은 N-메틸(methyl)-L-알라닌(alanine)을 포함하는 화합물 10이다; 상기 (Ⅲ-D)화학식의 화합물은 N-메틸(methyl)-D-알라닌(alanine)을 포함하는 화합물 10이며, 상기 (Ⅲ-D,L)화학식의 화합물은 racemic N-메틸알라닌(methylalanine)을 포함하는 화합물10이다.
N-메틸(methyl)-L-알라닌(alanine), N-메틸(methyl)-D-알라닌(alanine), 또는 라세믹 N-메틸알라닌(methylalanine)을 포함하는 화합물 10은 다음 과정에 의해 제조된다.;
(1) 화합물 6을 만들기 위해, 이소부틸렌(isobuthylene) 황화물을 아세토니트릴(acetonitrile)의 음이온과 반응시키는 과정
(2) 4-머켑토(mercapto)-4-메틸페타노익 산(methylpentanoic acid)(7)을 만들기 위해 화합물 6을 가수분해하는 과정
(3) 메틸메탄티올설포네이트(methylmethanethiolsulfonate)와 반응에 의하여 화합물 7을 이황화물 8로 변환하는 과정
(4) 화합물 8을 N-하이드록시썩시니마이드 에스테르(hydroxysuccinimide ester) 9로 변환하는 과정; 그리고
(5) N-메틸(methyl)-L-알라닌(alanine), N-메틸(methyl)-D-알라닌(alanine), 또는 racemic N-메틸알라닌(methylalanine)을 포함하는 화합물 10을 만들기 위해, 화합물 9와 N-메틸(methyl)-L-알라닌(alanine), N-메틸(methyl)-D-알라닌(alanine), 또는 라세믹 N-메틸알라닌(methylalanine)을 반응시키는 과정
본 발명에 의하면, 화학식Ⅲ의 화합물 역시 신규이다:
Figure 112005066719031-PCT00016
(Ⅲ)
여기서; Y2는 (CR7CR8)l(CR5CR6)m(CR3CR4)nCR1R2SZ2를 나타내며, 또한 여기서;
R1과 R2는 각각 독립적으로 CH3, C2H5, 1에서 10의 탄소원자를 갖는 선형 아릴 또는 알케닐, 3에서 10의 탄소원자를 가지형 또는 사이클로 알킬 또는 알케닐, 페닐, 치환된 페닐, 또는 헤테로싸이클릭 방향족화합물 또는 헤테로싸이클로알킬 라디칼이며, 또한 R2는 H가 될 수 있다.
R3, R4, R5, R6, R7 과 R8는 각각 독립적으로 H, CH3, C2H5, 1에서 10의 탄소원자를 갖는 선형 알킬 또는 알케닐, 3에서 10의 탄소원자를 갖는 가지형 또는 사이클로 알킬 또는 알케닐, 페닐, 치환된 페닐 또는 헤테로싸이클릭 방향족화합물 또는 헤테로싸이클로알킬 라디칼이다;
l, m과 n은 각각 독립적으로 1에서 5의 하나의 정수이며, 또한 n은 0이 될 수 있다;
Z2는 SR 또는 -COR이며, 여기서 상기 R이 선형 알킬, 1에서 10의 탄소원자를 갖는 가지형 또는 사이클로 알킬, 또는 단순(單體) 또는 치환된 아릴 또는 헤테로싸이클릭 방향족화합물 또는 헤테로싸이클로알킬 라디칼이다.
화학식Ⅲ의 화합물은 여기서 기술된 화합물 10과 15을 생성하는 유사한 방법에 의한 일반적인 기술로 즉시 생성될 수 있다.
시험관 안의 메이탠시노이드의 세포독성
본 발명의 시험관 안의 메이탠시노이드의 세포독성은 도 4에서 보이는 바와 같다. 방해받은 이황화물 결합를 함유한 신규의 메이탠시노이드(4c, 4e)는 시험을 거친 세포계에서는 매우 강력하다. 이와 같이 4c는 1.5 x 10-11 M와 7.0 x 10-12 M의 IC50 값을 갖는 A-375세포와 SK-Br-3 세포를 각각 죽인다. 유사하게, 메이탠시노이드 4e 역시 3.2 x 10-11 M 와 9.0 x 10-12 M IC50 값을 갖는 A-375세포와 SK-Br-3 세포에 각각 강력 중요하다. 본 발명의 메이탠시노이드 4a를 포함하는 방해받은(hindered) 티올의 실험관에서의 효능과 종래의 메이탠시노이드 1의 시험관에서의 효능을 비교해보면, 신규의 메이탠시노이드가 종래의 것보다 20~50배로 강력하다는 것을 보여준다.(도 4c, d)
세포-결합물질의 준비
치료물질로서의 본 발명의 화합물의 유효성은 적절한 세포-결합물질의 조심스러운 선택에 달려있다. 세포-결합물질은 현재에 어떤 형태의 것으로 알려져 있거나, 알려지게 될 것이며 펩타이드(peptide)와 논-펩타이드(non-petide)를 포함하는 것이다. 일반적으로, 이것들은 항체(특히 단일 클론의 항체), 림포카인(lympokines), 호르몬(hormones), 성장요소, 비타민, 영양분-수송 분자(트렌스페린과 같은), 또는 다른 세포-결합 분자 또는 물질이 될 수 있다.
사용 가능한 세포-결합물질의 더욱 구체적인 예로는 다음의 것들을 포함한다:
-다클론성 항체;
-단일 클론의 항체;
-Fab, Fab'와 F(ab‘)₂, Fv와 같은 항체들의 조각(Parham, J. Immunol. 131:2895-2902(1983); Spring et al. J. Immunol 113:470-478(1974);Nisonoff et al. Arch. Biochem. Biophys. 89:230-244(1960));
-인터페론(예를 들어.알파., .베타., .감마.);
-IL-2, IL-3, IL-4, IL-6과 같은 림포카인;
-인슐린, TRH(갑상선 자극 호르몬 방출 호르몬), MSH(멜라닌 세포 자극 호르몬), 스테로이드 호르몬, 안드로겐과 에스트로겐과 같은 호르몬
-성장요소와 EGF, TGF-알파, FGF, VEGF, G-CSF, M-CSFd와 GM-CSF(Burgess, Immunology Today 5:155-158(1984))와 같은 골수계 성장 인자;
-트렌스페린(O'Keefe et al. J. Biol. Chem. 260:932-937(1985));와
-엽산과 같은 비타민
단일클론항체 기법은 극도로 특유한 세포-결합물질의 생산을 단일클론항체의 형태로 가능하게 한다. 특히 이 분야에서 잘 알려진 단일클론항체의 생성 기법은 면역성을 기른 생쥐, 쥐, 햄스터 또는 intact target cell과 같은 강력한 항원, target cell로부터 분리된 항원, whole 바이러스, 독소가 약화된 whole 바이러스와 바이러스성 코팅 단백질(viral coat proteins)과 같은 바이러스성 단백질을 갖는 포유류에 의해 생산된다. 항원에 민감해진 인간의 세포 역시 사용될 수 있다. 단일클론항체를 생성하는 또 다른 방법은 특히, 인간의 scFv(Griffiths et al., U.S. Patent Nos. 5,885,793와 5,969,108; McCafferty et al., WO 92/01047;Liming et al., WO 99/06587)와 같은 scFv(단일연쇄가변영역:single chain variable region)의 phage libraries(파즈 자료관)의 사용하는 것이다. 또한, U.S. Patent No. 5,639,641에 기술된 보수된(resurfaced)항체는, 인체에 적응된(humanized) 항체들처럼 역시 사용될 수 있다.
적절한 세포-결합물질의 선택은 목표로 삼은 특정 세포집단(particular cell population)에 좌우되는 선택 사안이지만, 일반적으로 만일 적절한 것으로 하나가 가능하다면, 인간의 단일클론항체들이 바람직하다.
예를 들어, 단일클론항체 MY9는 특히 CD33항원{J.D.Griffin et al 8 Leukemia Res., 521(1984)}과 결합하는 쥣과(murine)의 IgG₁이며, 목표세포가 급성 골수성 백혈병(AML)에서와 같이 CD33를 나타낸다면 사용될 수 있다. 유사하게, 단일클론항체 anti-B4는 B세포{Nadler er al. 131 J. Immunol. 244-250(1983)} 상의 CD 19에 결합하는 쥣과의 IgG₁이며, 목표세포가 비-호킨슨림프종 또는 만성림프성백혈병과 같은 항원을 표현하는 B 세포 또는 죽은 세포라면 사용될 수 있다. 유사하게, 단일클론항체, C242로 결합하는 CanAg 항원(U.S. patent No. 5,552,293)은 직장암, 췌장암과 위암과 같은 종양을 표현하는 CanAg를 다루는데 사용될 수 있다.
게다가, 골수 세포와 결합하는 GM-CSF는 급성골수성백혈병으로부터 죽은 세포로 세포-결합물질로서 사용될 수 있다. 활성화된 T-세포를 결합하는 IL-2는 이식거부이식편(transplant graft rejection)의 방지, 이식편대숙주병(graft-versus-host disease)의 치료와 방지, 그리고 급성T-세포백혈병(acute T-cell leukemia)의 치료를 위해 사용될 수 있다. 멜라노시테(melanocytes)와 결합하는 MSH는 흑색종(melanoma)의 치료에 사용될 수 있다. 엽산(folic acid)은 난소와 다른 종양 상에 나타날 수 있는 엽산수용체(folate receptor)를 표적으로 하여 사용될 수 있다. 상피의 성장요소는 폐와 머리, 목과 같은 비늘모양 암(squamous cancers)를 표적으로 사용될 수 있다. 소마토스타틴(somatostatin)은 뉴로블라스토머스(neuroblastomas)와 다른 종양의 형태를 표적으로 사용될 수 있다.
유방암과 정소(精巢)암은 다른 세포-결합물질에스트로겐 (또는 에스트로겐 아날로그)또는 안드로겐 각각이 세포-결합물질로서 성공적으로 표적이 될 수 있다.
세포독성결합의 제조
또한 본 발명은 세포-결합물질에 링크되는 적어도 하나의 메이탠시노이드를 포함하는 메이탠시노이드-세포-결합물질결합을 제공한다. 여기서, 상기 세포결합물질은 메이텐시노이드의 C-3, C-14 히드록시메틸, C-15히드록시, C-0 데스메틸에서 발견되는 아실테이트된 아미노산 측쇄의 아실족에 있는 티올기 또는 이황화물기를 사용하는 메이탠시노이드와 링크된다. 또한 상기 아실테이트된 아미노산 측쇄의 아실족은 하나 또는 2개의 치환기를 갖는 탄소원자에 위치된 티올기 또는 선형 알킬 또는 알케닐, 3~10의 탄소원자를 가지는 가지형 또는 사이클릭 알킬 또는 알케닐, 페닐, 치환된 페닐 또는 헤테로사이클릭 방향족화합물 또는 헤테로 사이클로알킬 라디칼이며, 이외에도 상기 치환기는 H가 될 수도 있다. 상기 아실족은 카르보닐기와 황원자 사이에 적어도 3개의 탄소원자의 선형 체인 길이를 갖는다.
바람직한 세포-결합물질결합은 세포-결합물질에 링크된 적어도 하나의 메이탠시노이드를 포함한다.: 상기 메이탠시노이드는 화학식 41 '에 의해 표현된다.
Figure 112005066719031-PCT00017
4₁'
여기서 Y1'은
(CR7CR8)l(CR9=CR10)p(C=C)qAr(CR5CR6)mDu(CR11=CR12)r(C=C)sBt(CR3CR4)nCR1R2S-를 나타내고, 또한 여기서,
A, B와 D는 각각 독립적으로 3에서 10의 탄소원자를 갖는 싸이클로알킬 또는 싸이클로알케닐, 단순 또는 치환된 아릴, 또는 헤테로싸이클릭 방향족화합물 또는 헤테로싸이클로알킬 라디칼이다;
R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R11 그리고 R12는 각각 독립적으로 H, CH3, C2H5이며, 1에서 10의 탄소원자를 갖는 선형 알킬 또는 알케닐, 3에서 10의 탄소원자를 갖는 가지형 또는 사이클로 알킬 또는 알케닐, 페닐, 치환된 페닐 또는 헤테로싸이클릭 방향족화합물 또는 헤테로싸이클로알킬 라디칼이다; 그리고
l, m, n, o, p, q, r, s와 t중 적어도 두 개가 어떤 한 경우에 0이 아니지 않을 경우, l, m, n, o, p, q, r, s와 t는 각각 독립적으로 0 또는 1부터 5사이의 하나의 정수이다.
바람직하게는, R1는 H이며 R2는 메틸이다. 또는 R1과 R2가 메틸이다.
더욱 바람직한 세포-결합물질결합은 세포-결합물질에 링크된 적어도 하나의 메이탠시노이드를 포함한다.: 상기 메이탠시노이드는 화학식(Ⅱ-L), (Ⅱ-D) 또는 (Ⅱ-D,L)에 의해 표현된다.
Figure 112005066719031-PCT00018
L D D,L
(Ⅱ)
여기서 Y₁은 (CR7CR8)l(CR5CR6)m(CR3CR4)nCR1R2S-를 나타낸다. 또한 여기서;
R1과 R2는 각각 독립적으로 CH3, C2H5, 1에서 10의 탄소원자를 갖는 선형 알킬 또는 알케닐, 3에서 10의 탄소원자를 갖는 가지형 또는 사이클로 알킬 또는 알케닐, 페닐, 치환된 페닐, 헤테로싸이클릭 방향족화합물 또는 헤테로싸이클로알킬 라디칼, 이외에도 R2는 H가 될 수 있다.
R3 , R4, R5, R6, R7 과 R8 은 각각 독립적으로 H, CH3, C2H5, 1에서 10의 탄소원자를 갖는 선형 알킬 또는 알케닐, 3에서 10의 탄소원자를 갖는 가지형 또는 사이클로 알킬 또는 알케닐, 페닐, 치환된 페닐 또는 헤테로싸이클릭 방향족화합물 또는 헤테로싸이클로알킬 라디칼이다;
l, m과 n은 각각 독립적으로 1에서 5 사이의 하나의 정수이며, 또한 n은 0이 될 수 있다;
그리고 May는 C-3, C-14 히드록시메틸, C-15 히드록시 또는 C-20 데스메틸에서 측쇄를 갖는 메이탠시노이드를 뜻한다.
메이탠시노이드-세포-결합물질결합은 더욱 바람직하다. 여기서 메이탠시노이드는 4₁을 뜻한다.
Figure 112005066719031-PCT00019
4₁
상기 치환기들은 상기 화학식(Ⅱ)에서 정의된 것들이다.
R1이 H, R2가 메틸, R5, R6, R7 과 R8이 각각 H, l과 m이 각각 1, 그리고 n이 0일 때, 그리고 R1과 R2가 메틸, R5, R6, R7, R8 이 각각 H, l과 m이 1, 그리고 n이 0일 때, 위에서 기술된 화합물이 특별히 바람직하다.
또한, L-아미노아실 입체이성체(L- aminoacyl stereoisomer)가 바람직하다.
본 발명의 대표적인 세포독성결합은 항체/메이탠시노이드, 항체조각/메이탠시노이드, 상피성장요소(EGF)/메이탠시노이드, 멜라닌 세포 자극 호르몬(MSH)/메이탠시노이드, 갑상선자극호르몬(TSH)/메이탠시노이드, 소마토스타틴/메이탠시노이드, 엽산/메이탠시노이드, 에스트로겐/메이탠시노이드, 에스트로겐 아날로그/메이탠시노이드, 안드로겐/메이탠시노이드, 그리고 안드로겐 아날로그/메이탠시노이드이다.
티올-을 포함하는 메이탠시노이드는 세포독성결합을 생산하기 위하여 적절하게 개조된 세포-결합물질과 반응한다. 이 결합은 겔-여과법(gel-filtration), 이온교환크로마토그래피(ion exchange chromatography), 또는 HPLC에 의해 정화될 수 있다.
설프히드릴족(설프히드릴 group)을 포함하는 메이탠시노이드로부터 결합을 준비하는 계획은 도 5에서 보이는 바와 같다. 더욱 구체적으로는(도 5a, b), 수성 완충제(aqueous buffer) 내의 항체의 용액(solution)은 디티오피리딜기(도 5a)를 삽입하기 위해 N-썩시니미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피온에스테르(SPDP, 3a) 또는 디티오피리딜기(도 5b)에 삽입하기 위한 N-썩시니미딜-4-(2-피리딜디티오)부테노에이트(SPDB, 3b)와 같은 물질을 변경하는 항체의 질량의 초과로 성장될 수 있다. 그런 다음 변경된 항체는 이황화물-결합된 항체-메이탠시노이드 결합을 삽입하기 위해 (도 4a 또는 4b에서와 같이) 티올-을 포함하는 메이탠시노이드와 반응한다. 메이탠시노이드-항체결합은 그런 다음 겔-여과법에 의해 정화될 수 있다.
대안으로, 항체는 설프히드릴족을 삽입하기 위해 2-이미노티올린과 같은 물질을 변화시키는 항체의 그램분자의 초과로 성장될 수 있다. 그 후 변화된 항체는 이황화물-링크된 항체-메이탠시노이드 결합을 생산하기 위하여 적절한 이황화물-을 갖는 메이탠시노이드와 반응한다. 그 후 메이탠시노이드-항체 결합은 겔-여과법에 의해 정화될 수 있다.
252nm와 280nm에서 흡광률(ratio of absorbance)을 분광 광도계(spectrophotometrically)의 측정에 의해 측정함으로써, 항체 분자마다 묶인(bound) 메이탠시노이드 분자의 수는 결정될 수 있다.(도 5a에서 5d에 표시됨) 1에서 10의 메이탠시노이드/항체 분자의 평균수는 이 방법에 의해 링크될 수 있다. 항체분자 당 링크된 메이탠시노이드 분자의 바람직한 평균 수는 2~5이며, 더욱 바람직한 바로는 3~4, 5이다.
대안으로, 수성 완충제 내의 항체의 용액은 말레미도기(도 5c)을 삽입하기 위해 N-썩시니미딜-4-(N-말레미도메틸)-싸이클로헥산-1-카르복시산염(SMCC, 26)또는, 이디오아세틸기(도 5d)를 삽입하기 위한 N-썩시니미딜-4-(이디오아세틸)-아미도벤조에이트(SIAB, 27)와 같은 물질을 변화시키는 항체의 그램분자의 초과에 의해 성장될 수 있다. 그 후 변화된 항체는 티올에스테르-와 링크된 항체-메이탠시노이드 결합을 삽입하기 위한 (도 4a 또는 4b와 같은) 티올-을 포함하는 메이탠시노이드와 반응한다. 메이탠시노이드-항체결합은 겔-여과기에 의해 정화될 수 있다.
항체분자마다 묶인 메이탠시노이드 분자의 수는 위에서 기술된 바와 같이 분광 광도계의 분석으로 측정될 수 있다.
상기와 같이, 본 발명은 위에서 기술된 방법들 중 하나에 의해 정화된 메이탠시노이드의 제조 과정과, 상기 정화된 메이탠시노이드와 반응성있는 디티오기 또는 설프히드릴기를 갖는 세포-결합물질과 반응 과정을 제공한다. 바람직하게는, 반응성 있는 디티오기는 디티오피라딜기 또는 치환 디티오피리딜기이다. 특히 바람직하게는, 반응성 있는 디티오기는 니트로피리딜디티오기 또는 디니트로피리딜디티오기를 포함한다.
다른 방법으로는, 정화된 메이탠시노이드는 말레미도기 또는 할로아세틸기를 포함하는 세포-결합물질과 반응한다.
본 발명에서 메이탠시노이드 약품을 갖은 세포-결합물질의 결합은 실험관에서(도 6)다양한 원하지 않는 세포계의 증식을 억제하는 능력이 측정될 수 있다. 예를 들어, human colon carcinoma line COLO 205, human melanoma cell line A-375, human myeloid leukemia cell line HL60과 같은 세포계는 이들의 결합의 세포독성의 평가(assessment)를 위해 사용될 수 있다. 평가될 세포들은 24시간동안 화합물에 노출될 수 있으며, 생존한 일부 세포들은 알려진 방법에 의한 직접적인 평가로 측정될 수 있다. IC50 값은 상기 평가의 결과에 의해 산출될 수 있다.
본 발명의 항체-메이탠시노이드 결합의 실험관에서 효력과 목표의 특이성은 도 6, 10과 12에서 보이는 바와 같다. 이와 같이 도 6은 양 huC242-DM3과 huC242-DM4가 IC가 각각 1.3 x 10-11 M 과 1.1 x 10-　11 M 의 수치로 양성항체 COLO 205 세포를 죽이는데 탁월함을 보이고 있다. 이와는 대조적으로, 음성항원 A-375 세포들은 본 발명의 메이탠시노이드 결합의 효능보다는 약 500정도로 덜 민감하다. 유사하게, 도 10과 도 12는 각각 MY9-6항체와 안티-B4로 본 발명의 메이탠시노이드의 결합의 탁월함과 목표의 특효를 논증하고 있다.
본 발명의 방해받는 티올-을 포함하는 메이탠시노이드를 갖는 항체의 결합의 생체 내에서의 반-종양(anti-tumor)효능은 쥐에서의 여러 가지 인간 종양 모델들의 이전에 기술된 메이탠시노이드 결합과 비교되었다. 첫 번째 모델(도 7)에서, 정착된 피하 인간 콜론 종양 HT-29 이종이식을 가진 SCID 쥐는 이전에 기술된 메이탠시노이드 DM1의 항체결합(huC242-DM1) 또는 두 개의 메이탠시노이드 결합(huC242-DM3, huC242-DM4)로 치료되었다. huC242-DM1의 치료는 18일의 종양성장을 지연하는 결과를 낳았다.
이와 대조적으로, 새로운 물질은 huC242-DM3는 28일의 종양성장의 지연과 huC242-DM4는 36일의 종양성장의 지연하는 두드러지게 더욱 효능이 있었다.
두 번째 모델(도 8)에서, 정착된 피하인간콜론종양 COLO 205 이종이식을 갖는 쥐는 이전에 기술된 메이탠시노이드 DM1의 항체결합(huC242-DM1) 또는, 두 개의 새로운 메이탠시노이드 결합(huC242-DM3, huC242-DM4)로 치료되었다. huC242-DM1의 치료는 종양이 퇴화하지 않았으며 20일의 종양의 성장지연을 초래하였다. 대조적으로, 새로운 물질은 두드러지게 더욱 효능이 있었다. huC242-DM3로 치료된 족에서 45일 간 완전한 종양의 퇴화가 지속되는 결과를 얻었다. huC242-DM4은 더욱 효능이 있어 모든 치료받은 쥐들이 치료되는 결과를 얻었다.
세 번째 모델(도 9)에서, 정착된 피하인간골수성백혈병 HL60 이종이식을 갖는 쥐는 이전에 기술된 메이탠시노이드 DM1의 항체결합(MY-9-6-DM1) 또는, 두 개의 새로운 메이탠시노이드 결합(MY9-6-DM3, MY9-6-DM4)로 치료되었다. MY-9-6-DM1의 치료는 종양이 퇴화하지 않았으며 5일의 종양의 성장지연을 초래하였다. 대조적으로, 새로운 물질은 두드러지게 더욱 효능이 있었다. 종양의 퇴화를 초래하였다. 양 MY9-6-DM3과 MY9-6-DM4는 20일보다 훨씬 많은 종양의 성장지연을 초래하였다.
네 번째 모델(도 11)에서, 본 발명의 메이탠시노이드(huMY9-6-DM4)는 HL-60세포로 정착된, 피하이종이식모델(aubcutaneous xenograft model) 내의 이전에 기술된 메이탠시노이드(huMY9-6-DM1)의 결합과 직접 비교되었다. 동등한 분량으로, 본 발명의 결합의 치료, MY9-6-DM4는 85일의 완전한 종양퇴화를 초래하였다. 대조적으로, 이전에 기술된 메이탠시노이드의 결합은 약 48일의 종양성장의 지연하여 덜 활동적이다.
위의 5개의 효능 시험들로부터의 결과는 본 발명의 입체적으로 방해받은 티올-을 포함하는 메이탠시노이드가 이전에 기술된 메이탠시노이드-세포-결합물질결합과 비교하여 막대하게 향상된 반-종양 활동을 하는 세포-결합물질결합을 부여함을 논증하고 있다.
구성물과 사용법
본 발명은 본 발명의 메이탠시노이드-세포-결합물질의 어떤 효과적인 양을 포함하는 제약 구성물과, 약제학적으로 수용할 수 있는 염 또는 염의 용매와 약제학적으로 수용할 수 있는 운반체, 희석액, 첨가물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 결합물질의 효과적인 양의 취급에 필요한 물질의 관리를 포함하는 취급방법을 제공한다.
유사하게, 본 발명은 목표세포 또는 목표세포를 포함하는 조직과 염이나 염의 용매와 같은 본 발명의 어떤 메이탠시노이드-세포-결합물질을 포함하는 세포독성물질의 효과적인 양을 접촉시키는 과정을 포함하여 이루어지는 선택된 세포집단 내의 세포를 죽이기 위한 방법을 제공한다. 상기 목표세포는 세포-결합물질과 결합할 수 있는 세포들이다.
요구될 경우, 다른 반-종양 물질(anti-tumor agents)들과 같은, 다른 활성물질들이 상기 결합물질과 함께 공급될 수 있다.
적절하게 약제학적으로 받아들일 수 있는 운반물질, 희석액, 그리고 첨가제들이 잘 알려져 있으며, 임상적 입장에서 보장되는 형태의 일반적인 기술에 의해 결정될 수 있다.
적절한 운반물질, 희석액 및/또는 첨가제들의 예는 다음과 같다:
(1) 약 pH7.4의, 약 1 mg/ml 에서 25mg/ml의 인간 혈청 알부민을 포함하거나 포함하지 않는 Dulbecco의 인산염으로 완충물이 된 염분, (2) 0.9% 염분 (0.9% w/v NaCl)과 (3) 5% (w/v) 포도당; 그리고 트립타민과 트윈(Tween) 20과 같은 안정적인 물질의 산화방지제를 역시 포함할 수도 있다.
선택된 세포집단 내의 세포를 죽이기 위한 방법은 시험과 내에서, 생체 안에서 또는 생체 밖에서 실시될 수 있다.
시험관 내의 사용의 예들은 병들거나 악성 세포들을 죽이기 위해 같은 환자에게 이식하기에 앞서 다음과 같은 자가조직의 골수 취급을 포함한다: 항체반응을 일으키는 T 세포를 죽이고 이식편대숙주병(GVHD)를 방지하기 위하여 이식에 앞선 골수의 취급단계; 목표 항원을 표현하지 않는 원하는 변이체(variants)를 제외한 모든 세포를 죽이기 위해 세포배양 취급; 또는 원하지 않는 항원을 표현하는 변이체을 죽이기 위한 세포배양 취급단계.
비임상적 시험관 상의 사용의 조건은 이와 같은 형태의 일반적인 기술 중 하나에 의해 손쉽게 결정된다.
임상적 생체 밖의 사용의 예는, 암 치료 또는 자기면역질환의 치료에서 자가조직의 이식에 앞서 종양세포 또는 골수로부터의 임파세포를 제거하거나, GVHD를 방지하기 위한 이식에 앞서 자가조직 또는 이인자형 골수 또는 조직으로 부터의 T세포와 다른 임파세포들을 제거하는 것이다. 치료는 다음과 같이 수행될 수 있다. 골수는 환자 또는 다른 개인으로부터 채취되고, 그런 다음 본 발명의 세포독성물질이 첨가된 혈청을 포함하는 매개체에서 약 10 mM 에서 1 pM의 농축범위에서, 37oC에서 약 30분에서 약 48시간 동안 배양된다. 배양의 농축과 시간의 정확한 조건은, 즉, 이와 같은 형태의 일반적인 기술 중 하나에 의해 손쉽게 결정된다. 배양 이후 골수세포들은 혈청을 포함하는 매개체로 씻겨지고 알려진 방법들에 따라 환자의 정맥 내로 돌아간다. 탈화학요법, 또는 골수를 채취하는 시간 사이에 모든 몸의 방사선치료와 치료된 세포들의 재주입과 같은 환자가 다른 치료를 받는 환경에서, 치료된 골수 세포들은 표준의료장비를 사용하는 약화 질소 내에 냉동보관된다.
임상의 생체 내의 사용을 위해, 본 발명의 세포독성물질은 불임과 내독소 단계를 위해 실험된 용액 또는 동결건조가루로 공급될 것이다. 결합관리의 적절한 프로토콜의 예는 다음과 같다. 결합은 매주, 4주 동안, 주사용 환약으로 매주 주어진다. 환약은 5~10ml의 인간 혈청 알부민이 추가될 수 있는 50~1000ml의 일반 염류가 주어진다. 투약은 관리에 의해 10 mg ~ 2000 mg (매일 100 ng ~ 20 mg/kg) 정맥 주사한다. 4주간의 치료 후에, 환자는 주간으로 치료받기를 계속할 수 있다. 관리의 루트와 관련한 특별임상 프로토콜은, 첨가제, 희석액, 투약, 횟수 등은 임상적 위치증명으로 이와 같은 형태의 일반적인 기술 중 하나에 의해 결정될 수 있다.
예를 들어 폐암, 유방암, 직장암, 전립선암, 신장암, 췌장암, 난소암 그리고 림프성 조직암; 전신성 낭창, 류마티스 관절염과 다발성 경화증과 같은 자기면역질환; 신장이식거부, 간장이식거부, 폐이식거부, 강심제 이식거부와 골수이식거부와 같은 이식거부반응; 이식편대숙주반응; CMV감염, HIV 감염, 에이즈 등과 같은 바이러스 감염; 그리고 람블편모충, 아메바층, 주혈흡충병과 같은 기생충 감염 또는 이와 같은 형태의 일반적인 기술에 의해 결정된 다른 것들을 포함하는 어떤 종류의 악성 종양을 포함하는 선택된 세포집단의 세포의 죽음을 유도하는 생체 내 또는 생체 밖의 방법에 의해 치료될 수 있는 의학적 조건의 예들은 치료될 수 있다.
(요약)
본 발명은 메이탠시노이드의 결합의 예상치 못한 발견에 기초하고, 입체적으로 방해되는 티올 족을 포함하고(티올 기를 포함하는 α-탄소의 치환물을 하나 또는 둘을 가지며), 이황화결합을 포함하는 α-탄소 원자의 치환물을 가지는 기존에 설명된 메이탠시노이드의 준비된 접합과 비교할 때 생체내에서 훨씬 개선된 항-종양 활동을 가지는 세포-결합 물질을 접합한다. 또 다른 예상치못한 발견은 개선될 생물학적 활성도인데. 이는 접합시에 입체적 방해는 이황화 결합의 메이탠시노이드면에 최적이다. 게다가, sulfhydryl 족을 포함하는 메이탠시노이드의 아실(acyl)레이트 아미노산 사이드 체인을 가지는 아실 족은 아미드의 카르보닐기와 황 원자 상이의 적어도 3개의 탄소 원자의 선형 체인 길이를 가져야 한다.
이러한 발견은 이황화물-결합된 세포-결합 물질-메이탠시노이드 접합이 이황화 결합을 포함하는 두 개의 α-탄소 원자의 그러한 치환물을 구성할 수 있고, 이황화 결합의 어느 한쪽 면에 입체적 방해를 다양화하는 정도를 만들어 낼 수 있다.
이에 따라서, 본 발명은 새로운, 입체적으로 억제된 티올과 이황화물-포함하는 메이탠시노이드의 합성을 설명하고 있고, 그것은 황 원자를 포함하는 α-탄소상의 하나 또는 두 개의 알킬 치환물을 포함한다. 게다가, 아크릴레이티드 아미노산 사이드 체인의 아크릴족은 아미드의 카르보닐 족과 황 원자의 사이에 적어도 세 개의 탄소 원자의 선형 체인 길이를 가진다.
이러한 새로운 메이탠시노이드의 세포-결합 물질 접합(disulfide-linked cell-binding agent-matansinoid conjugate)의 생물학적 평가 및 준비도 또한 기술되어 있다.
본 발명의 실시예 중 하나는, 황 원자를 포함하는 탄소 원자상의 단일 또는 이중-알킬 치환물을 포함하는 새로운 티올(thiol)과 이황화물-포함하는 메이탠시노이드가 기술되어 있다.
본 발명의 두 번째 실시예에서는, 본 발명은 이러한 새로운 메이탠시노이드의 합성 방법을 개시하고 있다.
세 번째 실시예에서는, 세포 결합 물질의 이러한 새로운 메이탠시노이드의 결합 방법을 기술하고 있다. 이러한 접합은 치료물질에 유용한데, 그것은 표적세포에 구체적으로 타격을 가하고, 또한 세포독성이다. 이러한 접합은 이전의 기술된 물질에 비하여 동물 종양 치료에서 개선된 치료 효능을 보여주고 있다.
보다 구체적으로, 본 발명은 다음과 같은 것을 제공한다:
C-3, C-14 하이드록시메틸, C-15 하이드록시, 또는 C-20 desmethyl, 억제된 sulfhydryl 족을 포함하는 아실(acyl) 족과 함께 아킬레이티드 아미노산 사이드 체인과, 거기에 티올기가 하나 또는 두 개의 치환물을 포함하는 아실(acyl) 족의 탄소원자와, 상기 치환물은 CH3, C2H5, 1부터 10까지 탄소 원자를 가지는 선형 또는 가지의 알케닐, 3 내지 10까지 탄소 원자를 가지는 알킬 또는 알케닐, 페닐, 치환 페닐, 이종고리식 방향족화합물 또는 이종사이클로알킬기와 치환물의 하나는 H가 될 수 있고, 거기에 아크릴기는 카르보닐기와 황 원자 사이의 탄소 원자를 적어도 세 개의 선형 체인길이를 가진다.
화합물은 포뮬러 4'에 의해 나타낸다.
Figure 112005066719031-PCT00020
4'
여기에서;
Y'는(CR7CR8)1(CR9=CR10)pC≡CqAr(CR5CR6)mDu(CR11=CR12)r(C≡C)sBt(CR3CR4)nCR1R2SZ,
여기에서:
R1 과 R2는 모두 독립적으로 CH3, C2H5, 1부터 10까지의 탄소 원자를 가지는 선형 알킬 또는 알케닐, 3부터 10까지의 탄소 원자를 가지는 가지형 또는 환형 알케닐, 페닐, 치환페닐, 또는 헤테로사이클릭 방향족화합물 또는 헤테로사이클로알킬기 그리고 R2는 H가 될 수 있다.
A,B,D는 3-10 탄소 원자를 갖는 사이클로알킬 또는 사이클로아케닐이고, 단일 또는 치환되는 아실(acyl) 또는 헤테로사이클릭 방향족화합물 또는 헤테로사이클로알킬기 이고;
R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R11과 R12는 모두 독립적으로 H, CH3, C2H5, 1부터 10까지 탄소원자를 가지고 있는 선형 알킬 또는 알케닐이고, 3에서 10의 탄소원자를 가지는 가지형 또는 사이클릭 알킬 또는 알케닐, 페닐, 치환된 페닐 또는 헤테로사이클릭 방향족화합물 또는 헤테로사이클로알킬기이고;
l, m, n, o, p, q, r, s와 t는 각각 독립적으로 0 또는 1부터 5까지의 정수이고, 적어도 l, m, n, o, p, q, r, s, 와 t 중의 두 개가 한 번에 제로가 되지 않는다.
Z는 H, SR 또는 -COR이고, 여기에 R은 1부터 10까지 탄소 원자를 가지는 선형 알킬 또는 알케닐이거나, 단순 또는 치환되는 아릴 또는 헤테로사이클릭 방향족화합물 또는 헤테로사이클로알킬기이다.
포뮬러 4'에 의해 나타나는 화합물에서, R1 은 H이고, R2는 메틸이고, Z는 H이다.
포뮬러4'에 의해 나타나는 화합물에서, R1과 R2는 메틸이고, Z는 H이다.
포뮬러4'에 의해 나타나는 화합물에서, R1은 H이고, R2는 메틸이고, Z는 -SCH3이다.
포뮬러4'에 의해 나타나는 화합물에서, R1과 R는 메틸이고, Z는 -SCH3이다.
포뮬러(I-L), (I-D), 또는 (I-D,L)에 의한 화합물:
Figure 112005066719031-PCT00021
L D D, L
(I)
여기에서:
Y는 (CR7CR8)l(CR5CR6)m(CR3CR4)nCR1R2SZ 이고, 여기서:
R1 과 R2는 각각 독립적으로 CH3, C2H5이고, 1부터 10까지 탄소 원자를 가지는 선형 알킬 또는 알케닐, 3부터 10까지 탄소원자를 가지는 가지형 도는 원형 알킬 또는 알케닐, 또는 헤테로사이클릭 방향족화합물 또는 헤테로사이클로알킬기, 그리고 R2는 H가 될 수 있다.
R3, R4, R5, R6, R7 그리고 R8은 각각 독립적으로 H, CH3, C2H5, 1부터 10까지를 갖는 알킬 또는 알케닐, 3부터 10까지를 갖는 가지형 또는 원형 알킬 또는 알케닐,페닐, 치환되는 페닐, 또는 헤터로사이클릭 방향족화합물 또는 헤테로사이클로알킬기이고;
l, m, n은 각각 독립적으로 1부터 5까지의 정수이고, n은 0이 될 수 있고;
Z는 H, SR 또는 -COR 이고 R은 1부터 10까지의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 가지형 알킬 또는 알케닐, 3부터 10까지의 탄소 원자를 갖는 사이클릭알킬 또는 알케닐, 또는 심플 또는 치환되는 아릴 또는 헤테로사이클릭 방향족화합물 또는 헤테로사이클로알킬기이고;
May는 C-3, C-14 하이드록시메틸, C15 하이드록시 또는 C-20 desmethyl의 측쇄을 갖는 메이탠시노이드를 나타낸다;
상기 설명된 화합물에서, R1은 H이고, R2는 메틸이고, R5, R6, R7, 그리고 R8은 각각 H이고, m은 각각 1이고, n은 0이고, Z는 H이고;
상기 설명된 화합물에서, R1과 R2는 메틸이고, R5, R6, R7, R8은 각각 H이고, m은 1이고, n은 0이고 Z는 H이고;
상기 설명된 화합물에서, R1 은 H이고, R2는 메틸이고, R5, R6, R7, R8은 각각 H이고, l과 m은 각각 1이고, n은 0이고 Z는 -SCH3이고;
상기 설명된 화합물에서, R1과 R2는 메틸, R5, R6, R7, R8은 각각 H이고 l과 m은 각각 1이고, n은 0이고, Z는 -SCH3이고;
포뮬러 4에 의해 표현되는 화합물;
Figure 112005066719031-PCT00022
4
여기에서: Y는 (CR7CR8)l(CR5CR6)m(CR3CR4)nCR1CR2SZ 이고 여기서:
R1과 R2은 각각 독립적으로 CH3, C2H5, 1부터 10까지의 탄소 원자를 갖는 선형 알킬 또는 알케닐, 가지형 또는 사이클릭 알킬 또는 알케닐, 페닐, 치환되는 페닐 또는 헤테로사이클릭 방향족화합물 또는 헤테로사이클로알킬기, 그리고 R2는 H가 될 수 있고;
R3, R4, R5, R6, R7 그리고 R8은 각각 독립적으로 H, CH3, C2H5, 1부터 10까지 탄소원자를 갖는 선형 알킬 또는 알케닐, 3에서 10까지 탄소 원자를 가지는 선형 또는 사이클릴 알킬 또는 알케닐, 페닐, 치환되는 페닐, 또는 헤테로사이클릭 방향족화합물 또는 헤테로사이클로알킬기에서;
l, m, n은 각각 독립적으로 1부터 5까지의 정수를 가지고, n은 0이 될 수 있고,
Z는 H, SR 또는 -COR이고 여기서 R은 1부터 10까지 탄소 원자를 갖는 선형 알킬 또는 알케닐 3부터 10까지의 탄소 원자를 가지는 가지형 또는 사이클릭 알킬 알케닐, 또는 심플 도는 치환되는 아릴 또는 헤테로사이클릭 방향족화합물 또는 헤테로 사이클로알킬기이고;
포뮬러 4의 화합물에서, R1은 H이고, R2는 메틸이고, R5, R6, R7 그리고 R8은 각각 H이다; l과 m은 각각 1이고; n은 0이고: Z는 H이고;
포뮬러 4의 화합물에서, R1과 R2는 메틸이고, R5, R6, R7, R8은 각각 H이고, l과 m은 1이고; n은 0이고; Z는 H이다;
포뮬러 4의 화합물에서, R1은 H이고, R2는 메틸이고, R5, R6, R7, R8은 각각 H이고, l과 m은 각각 1이고, n은 0이고 Z는 -SCH3이고;
포뮬러 4의 화합물에서, R1과 R2는 메틸이고, R5, R6, R7, R8은 각각 H이고, l과 m은 각각 1이고, n은 0이고 Z는 -SCH3이고;
세포-결합 물질을 결합하는 적어도 하나의 메이탠시노이드를 구성하는 적어도 하나의 메이탠시노이드를 포함하는 세포-결합-메이탠시노이드(maytansinoid-cell-binding agent conjugate ) 물질 접합은 세포결합물질과 연결되고, 상기 메이탠시노이드는 상기 기술된 화합물의 하나이고;
상기-기술된 메이텐시노이드-세포-결합 물질은 상기 세포-결합물질은 적어도 하나의 항체 결합 장소를 포함하는데 바람직하게는 humanized 또는 resurfaced MY96, humanized or resurfaced 항-B4, 또는 humanized 또는 resurfaced C242이고;
효과적인 양의 상기의 치료적으로 승인될 수 있는 염 또는 용매를 포함하는 치료 화합물은 치료적으로 승인될 수 있는 캐리어, 희석제, 첨가제를 접합한 것이고,;
C-3, C-14 하이드록시메틸, C-15 하이드록시, 또는 C-20 desmethyl에서 아실(acyl) 과 아크릴 족이 sulfhydryl 기를 보호하는아실레이티드 아미노산 사이드 체인과 함께 메이탠시노이드의 에스테르화 하는 방법에 있어서, 보호되는 티올기를 가지는 상기 아실아크릴 족의 탄소 원자가 하나 또는 두 개의 치환기를 가지며, 상기 치환기는 CH3, C2H5, 1부터 10까지의 탄소 원자를 가지는 선형 알킬 또는 알케닐, 3부터 10까지의 탄소 원자를 가지는 가지형 또는 사이클릭 알킬 또는 알케닐, 페닐, 치환된 페닐, 헤테로사이클릭 방향족화합물 또는 헤테로사이클로알킬기, 이에 더하여 치환기 중 하나는 H 가 될 수 있고, 여기에서 상기 아실 족은 카르보닐기와 황 원자사이의 적어도 세 탄소 원자의 선형 체인 길이를 가지고, 상기 방법은 C-3, C-14 하이드록시메틸, C15 하이드록시, 또는 C20 desmethyl에서보호되는 sulfhydryl 족을 가지는 아실 족의 아실레이티드 아마노산과 메이탠시노이드가 반응하는 것을 포함하고;
포뮬러(IV-L),(IV-D), 또는 (IV-D,L)에 의해 나타나는 메이탠시노이드 에스테르를 생산하기 위한 메이탠시노이드의 에스테르화 방법:
Figure 112005066719031-PCT00023
L D D, L
(IV)
여기에서 Y2는 (CR7CR8)l(CR5CR6)m(CR3CR4)nCR1R2SZ이고:
R1과 R2는 각각 독립적으로 CH3, C2H5, 1부터 10까지의 탄소 원자를 가지는 선형 알킬 또는 알케닐, 3부터 10까지의 탄소 원자를 가지는 가지형 또는 사이클린 알킬 또는 알케닐, 페닐, 치환 페닐 또는 헤터로사이클릭 방향족화합물 또는 헤테로사이클로알킬기, 그리고 R2는 H가 될 수 있고;
R3, R4, R5, R6, R7, R8,은 각각 독립적으로 H, CH3, C2H5, 1부터 10까지의 탄소 원자를 가지는 선형 알킬 또는 알케닐, 3부터 10까지의 탄소 원자를 가지는 가지형 또는 사이클린 알킬 또는 알케닐, 페닐, 치환 페닐 또는 헤테로사이클릭 방향족화합물 또는 헤테로사이클로알킬기이고,
l, m 그리고 n은 각각 독립적으로 1부터 5까지의 정수이고, n은 0이 될 수 있고;
Z2는 SR 또는 -COR이고, R은 1부터 10까지 탄소 원자를 가지는 알킬 또는 알케닐, 3부터 10까지 탄소 원자를 가지는 가지형 또는 사이클릭 알킬 또는 알케닐, 또는 심플 또는 치환 알킬 또는 헤테로사이클릭 방향족화합물 또는 헤테로사이클로알킬기이고;
May는 메이탠시노이드이고; C-3, C-14 하이드록시메틸, C-15 하이드록시, 또는 C-20 desmethyl에서 포뮬러(Ⅲ-L), (Ⅲ-D), 또는(Ⅲ-D,L)에 의한 화합물이 반응하는 것을 포함하는 상기 방법에서:
Figure 112005066719031-PCT00024
(Ⅲ)
여기에서:
Y2는 (CR7CR8)l(CR5CR6)m(CR3CR4)nCR1R2SZ2, 여기에서:
R1과 R2는 각각 독립적으로 CH3, C2H5, 1부터 10까지의 탄소 원자를 가지는 선형 알킬 또는 알케닐, 3부터 10까지의 탄소 원자를 가지는 가지형 또는 사이클린 알킬 또는 알케닐, 페닐, 치환 페닐 또는 헤터로사이클릭 방향족화합물 또는 헤테로사이클로알킬기, 그리고 R2는 H가 될 수 있고;
R3, R4, R5, R6, R8은 각각 독립적으로 H, CH3, C2H5, 1부터 10까지의 탄소 원자를 가지는 선형 알킬 또는 알케닐, 3부터 10까지의 탄소 원자를 가지는 가지형 또는 사이클린 알킬 또는 알케닐, 페닐, 치환 페닐 또는 헤테로사이클릭 방향족화합물 또는 헤테로사이클로알킬기이고,
l, m 그리고 n은 각각 독립적으로 1부터 5까지의 정수이고, n은 0이 될 수 있고;
Z2는 SR 또는 -COR이고, R은 1부터 10까지 탄소 원자를 가지는 알킬 또는 알케닐, 3부터 10까지 탄소 원자를 가지는 가지형 또는 사이클릭 알킬 또는 알케닐, 또는 심플 또는 치환 알킬 또는 헤테로사이클릭 방향족화합물 또는 헤테로사이클로알킬기이고;
상기-기술된 방법에서, R1은 H이고, R2는 메틸이고, R5, R6, R7과 R8은 각각 H이고; l과 m은 각각 1이고; n은 0이고;
상기-기술된 방법에서, 포뮬러(Ⅲ)의 화합물은 포뮬러(Ⅲ-L)에 의해 나타나고;
상기-기술된 방법에서, 포뮬러(Ⅲ-L)의 화합물은 15a(S,S), 15b(S,R) 또는 15a(S,S) 그리고 15b(S,R)의 혼합물의 화합물이며;
상기-기술된 방법에서, 포뮬러(Ⅲ-D)의 화합물이 15a(R,S), 15b(S,R) 또는 15a(S,S) 그리고 15b(R,R)의 혼합물의 화합물이며;
상기-기술된 방법에서, 포뮬러(Ⅲ-D,L)의 화합물은 보호된 티올기능기를 가지는 카르보닐 족과 함께 라세믹 N-메틸렌알라니 아크릴레이티드이고, 황 원자를 포함하는 탄소 중앙에 15의 구조의 화합물을 주는 라세믹이나 R 또는 S chirality 중 하나이고;
상기-기술된 방법에서, 15a(S,S) 와 15b(S,R)의 혼합은 다음의 과정에 의해 제조된다.
(1) 화합물 13을 주기 위한 메틸 메탄티올설포네이드화 함께 4-메르캅도펜타노익(12)과 반응하고;
(2) 화합물 13을 그것의 N-하이드록시석시니마이드 에스테르 14로 변환시키고;
(3) N-메틸-L-알라닌의 화합물 14를 상기 화합물 15a(S,S)와 15b(S,R)의 반응하는 것;
상기-기술된 방법에서, 화합물 15a(S,S)는 다음의 방법에 의해 제조된다.;
(1) (R)-1,3-부타네디올을 (S)-4-(메틸디티오)펜타노익 산19로 변환시키고;
(2) 화합물 19를 그것의 N-하이드록시석시니마이드 에스테르(20)로 변환시키고;그리고
(3) N-메틸-L-알라닌과 함께 화합물 20을 상기 화합물 15a(S,S)에 반응시키는 것으로 만들어진다.
상기-기술된 방법에서, 화합물 15b(S,R)는 다음의 방법에 의해 제조된다.;
(1) (S)-1,3-부타네디올을 (R)-4-(메틸디티오)펜타노익 산24로 변환시키고;
(2) 화합물 24를 그것의 N-하이드록시석시니마이드 에스테르(25)로 변환시키고;그리고
(3) N-메틸-L-알라닌과 함께 화합물 25을 상기 화합물 15b(S,R)에 반응시키는 것으로 만들어진다.
상기 설명된 방법에서 화합물 15(R,S)와 15(R,R)의 혼합물은 이 다음의 과정에 의해 제조된다:
(1) 메틸 메탄티올설포네이드와 4-메르캅토펜타노익산(12)를 화합물 13과 반응하고;
(2) 화합물 13을 그것의 N-하이드록시석시니마이드 에스테르 14로 변환시키고,
(3) N-메틸-D 알라닌을 가지는 화합물 14를 화합물 15(R,S)와 15(R,R)의 상기혼합물에 반응시켜서 만들어진다.
상기-기술된 방법에서, 보호되는 티올기능기를 가지고 있는 카르복실(carboxyl)족을 갖는 라세믹 N-메틸알라인 아셀레이티드에서, 황 원자를 포함하는 탄소 중앙은 다음의 과정을 포함하는 방법에 의해 라세믹 또는 15의 화합물구조를 주는 R 또는 S chirality 중 어느 하나가 제조되는 방법;
(1) 메틸 메탄티올설포네이드와 4-메르캅토펜타노익산(12)를 화합물 13과 반응하고;
(2) 화합물 13을 그것의 N-하이드록시 석시니마이드 에스테르 14에 변환시키고,
(3) 라세믹 N-메틸알라닌과 화합물 14를 보호되는 티올기능기를 포함하는 카르복시릭 족과 라세믹 N-메틸알라닌 아크릴레이티드와 반응하고, 여기에서 황 원자를 포함하는 탄소 중앙은 라세믹 또는 구조15의 화합물을 주는 상기 R, S chirality 중 어느 하나이다..
상기-기술된 방법에서, R1과 R2는 메틸이고; R5, R6, R7과 8은 각각 H이고; l과 m은 각각 1이고; n은 0이다.
상기-기술된 방법에서, 포뮬러(Ⅲ-L)의 화합물은 N-메틸-L-알라닌을 포함하는 화합물10(S)이고;
상기-기술된 방법에서, 포뮬러(Ⅲ-D)의 화합물은 N-메틸-D-알라닌을 포함하는 화합물 10(R)이고;
상기-기술된 방법에서, 포뮬러((Ⅲ-D,L)의 화합물은 라세믹 N-메틸알라닌을 포함하는 화합물10(S,R)이고
상기-기술된 방법에서, N-메틸-L-알라닌, N-메틸-D-알라닌 또는 라세믹 N-메틸알라닌을 포함하는 화합물 10은 다음의 과정에 의해 제조된다:
(1) 아세토니트릴의 음이온과 이소부틸렌 황화물(5)과 주어진 화합물 5를 반응시키고;
(2) 화합물 6을 4-메르캅토-메릴펜타노익산(7)에 주어 가수분해하고;
(3) 화합물 7을 메틸 메탄티올설포네이트화 반응하여 이황화물 8로 변환시키고;
(4) 화합물 8을 그것의 N-하이드록시석시니마이드 에스테르 9로 변환시키고;
(5) 화합물 9와 N-메틸-L-알라닌, N-메틸-D-알라니, 또는 라세믹 N-메틸알라니을 반응하여 N-메틸-L-알라니, N-메틸-D-알라닌 또는 라세믹 N-메틸알라닌을 포함하는 화합물 10이 생성되는 방법;
상기-기술된 방법 중 어느 한 방법에 의해 메이탠시노이드를 만드는 방법에서, diasteromers를 분리하고, 만일 주어진다면, 그리고 시아노-결합된 실리카 상의 HPLC의 메이탠시노이드를 정제시키는 방법:
상기-기술된 방법의 어느 한 방법에 의해 정제된 메이탠시노이드를 만드는 것을 포함하는 메이탠시노이드-세포-결합-물질 접합을 만드는 방법에서, 반응 디티오(dithio) 족 또는 sulfhydryl 족을 포함하는 세포결합 물질을 갖는 정제된 메이탠시노이드와 반응하는 방법.
메이탠시노이드-세포-결합 물질 접합을 만드는 상기-기술된 방법에 있어서, 반응 디티오 족이 dithiopyridyl 족 또는 치환된 dithiopyridyl 족인 방법;
상기-기술된 방법 중 어느 방법에 의해 정제된 메이탠시노이드를 만드는 것을 포함하는 메이탠시노이드-세포-결합 물질 접을 만드는 방법에서, maleimido 족 또는 haloacetyl 족을 포함하는 정제된 메이탠시노이드와 반응하는 방법;
포뮬러 4 2 '의 메이탠시노이드에 주어진 메이탠시놀의 에스테르와 하는 방법에서;
Figure 112005066719031-PCT00025
4 2 '
여기에서;
Y2'는(CR7CR8)1(CR9=CR10)pC≡CqAr(CR5CR6)mDu(CR11=CR12)r(C≡C)sBt(CR3CR4)nCR1R2SZ2
여기에서:
R1 과 R2는 모두 독립적으로 CH3, C2H5, 1부터 10까지의 탄소 원자를 가지는 선형 알킬 또는 알케닐, 3부터 10까지의 탄소 원자를 가지는 가지형 또는 환형 알케닐, 페닐, 치환페닐, 또는 헤테로사이클릭 방향족화합물 또는 헤테로사이클로알킬기 그리고 R2는 H가 될 수 있다.
A,B,D는 3-10 탄소 원자를 갖는 사이클로알킬 또는 사이클로아케닐이고, 심플 도는 치환되는 아크릴 또는 헤테로사이클릭 방향족화합물 또는 헤테로사이클로알킬기 이고;
R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R11과 R12는 각각 독립적으로 H, CH3, C2H5, 1부터 10까지 탄소원자를 가지고 있는 선형 알킬 또는 알케닐이고, 3에서 10의 탄소원자를 가지는 가지형 또는 사이클릭 알킬 또는 알케닐, 페닐, 치환된 페닐 또는 헤테로사이클릭 방향족화합물 또는 헤테로사이클로알킬기이고;
l, m, n, o, p, q, r, s와 t는 각각 1부터 5까지의 정수이고, 적어도 l, m, n, o, p, q, r, s, 와 t 중의 두 개가 한 번에 제로가 되지 않는다.
Z2는 SR 또는 -COR이고, 여기에 R은 1부터 10까지 탄소 원자를 가지는 선형 알킬 또는 알케닐이거나, 단순 또는 치환되는 아릴 또는 헤테로사이클릭 방향족화합물 또는 헤테로사이클로알킬기이고, 상기 방법은 C-3에서 구조 11의 메이탠시놀의 반응을 포함하고;
Figure 112005066719031-PCT00026
11
포뮬러 포뮬러(Ⅲ'-L), (Ⅲ'-D), 또는(Ⅲ'-D,L)에 화합물에서
Figure 112005066719031-PCT00027
(Ⅲ')
여기에서:
Y2'는 (CR7CR8)1(CR9=CR10)p(C≡C)qAr(CR5CR6)mDu(CR11=CR12)r(C≡C)sBt(CR3CR4)nCR1R2SZ2
여기에서:
R1과 R2는 각각 독립적으로 CH3, C2H5, 1부터 10까지의 탄소 원자를 가지는 선형 알킬 또는 알케닐, 3부터 10까지의 탄소 원자를 가지는 가지형 또는 사이클린 알킬 또는 알케닐, 페닐, 치환 페닐 또는 헤터로사이클릭 방향족화합물 또는 헤테로사이클로알킬기, 그리고 R2는 H가 될 수 있고;
A, B, 그리고 D 각각, 독립적으로 3에서 10까지 탄소 원자를 가지는 사이클로알킬 또는 싸이클로알케닐, 단일 또는 치환되는 아릴, 헤테로사이클릭 방향족화합물 또는 헤테로사이클로알킬 방향기이고;
R3, R4, R5, R6, R7, R8은 각각 독립적으로 H, CH3, C2H5, 1부터 10까지의 탄소 원자를 가지는 선형 알킬 또는 알케닐, 3부터 10까지의 탄소 원자를 가지는 가지형 또는 사이클린 알킬 또는 알케닐, 페닐, 치환 페닐 또는 헤테로사이클릭 방향족화합물 또는 헤테로사이클로알킬기이고,
l, m,n,o,p,q,r,s, 와 t 는 각각 독립적으로 1부터 5까지의 정수이고, l, m, n, o, p, q, r, s, 와 t 중 적어도 두 개는 한번에 0이 될 수 없고,
Z2는 SR 또는 -COR이고, R은 1부터 10까지 탄소 원자를 가지는 알킬 또는 알케닐, 3부터 10까지 탄소 원자를 가지는 가지형 또는 사이클릭 알 킬 또는 알케닐, 또는 심플 또는 치환 알킬 또는 헤테로사이클릭 방향족화합물 또는 헤테로사이클로알킬기이고;
포뮬러 4 2 '에 의한 메이탠시노이드에서 메이탠시놀의 에스테르화의 방법에서, 포뮬러(I)의 화합물이 포뮬러(I-L)에 의해 나타나는 방법.
포뮬러 4 2 '에 의한 메이탠시노이드에서 메이탠시놀의 에스테르화의 방법에서, R1이 H이고 R2가 메틸인 방법.
포뮬러 4 2 에 의한 메이탠시노이를 주는 메이탠시놀의 에스테르화의 방법에서,
Figure 112005066719031-PCT00028
4 2
여기에서:
Y2는 (CR7CR8)l(CR5CR6)m(CR3CR4)nCR1CR2SZ2 이고, 여기서:
R1과 R2은 각각 독립적으로 CH3, C2H5, 1부턴 10까지의 탄소 원자를 갖는 선형 알킬 또는 알케닐, 가지형 또는 사이클릭 알킬 또는 알케닐, 페닐, 치환되는 페닐 또는 헤테로사이클릭 방향족화합물 또는 헤테로사이클로알킬기, 그리고 R2는 H가 될 수 있고;
R3, R4, R5, R6, R7, 그리고 R8은 각각 독립적으로 H, CH3, C2H5, 1부터 10까지 탄소원자를 갖는 선형 알킬 또는 아케닐, 3에서 10까지 탄소 원자를 가지는 선형 또는 사이클릴 알킬 또는 알케닐, 페닐, 치환되는 페닐, 또는 헤테로사이클릭 방향족화합물 또는 헤테로사이클로알킬기에서;
l, m, n은 각각 독립적으로 1부터 5까지의 정수를 가지고, n은 0이 될 수 있고,
Z2는 H, SR 또는 COR이고 여기서 R은 1부터 10까지 탄소 원자를 갖는 선형 알킬 또는 아케닐, 3부터 10까지의 탄소 원자를 가지는 가지형 또는 사이클릭 알킬 알케닐, 또는 심플 또는 치환되는 아릴 또는 헤테로사이클릭 방향족화합물 또는 헤테로 사이클로알킬기이고; 상기 방법은 구조 11의 메이탠시놀의 반응을 포함하는 방법;
Figure 112005066719031-PCT00029
11
포뮬러(Ⅲ-L),(Ⅲ-D), 또는 (Ⅲ-D,L)의 화합물을 갖는 C-3 위치에서
Figure 112005066719031-PCT00030
L D D, L
(Ⅲ)
여기에서:
Y2는 (CR7CR8)l(CR5CR6)m(CR3CR4)nCR1R2SZ, 여기에서:
R1과 R2는 각각 독립적으로 CH3, C2H5, 1부터 10까지의 탄소 원자를 가지는 선형 알킬 또는 알케닐, 3부터 10까지의 탄소 원자를 가지는 가지형 또는 사이클린 알킬 또는 알케닐, 페닐, 치환 페닐 또는 헤터로사이클릭 방향족화합물 또는 헤테로사이클로알킬기, 그리고 R2는 H가 될 수 있고;
R3, R4, R5, R6, R7, R8은 각각 독립적으로 H, CH3, C2H5, 1부터 10까지의 탄소 원자를 가지는 선형 알킬 또는 알케닐, 3부터 10까지의 탄소 원자를 가지는 가지형 또는 사이클린 알킬 또는 알케닐, 페닐, 치환 페닐 또는 헤테로사이클릭 방향족화합물 또는 헤테로사이클로알킬기이고,
l, m 그리고 n은 각각 독립적으로 1부터 5까지의 정수이고, n은 0이 될 수 있고;
Z2는 SR 또는 COR이고, R은 1부터 10까지 탄소 원자를 가지는 알킬 또는 알케닐, 3부터 10까지 탄소 원자를 가지는 가지형 또는 사이클릭 알킬 또는 알케닐, 또는 단순 또는 치환 알킬 또는 헤테로사이클릭 방향족화합물 또는 헤테로사이클로알킬기이고;
포뮬러 4a 의 메이탠시노이드를 주기 위한 메이탠시놀의 상기 설명된 에스테르화 방법에 있어서, 포뮬러(Ⅲ)의 화합물은 포뮬러(Ⅲ-L)에 의해 나타난다;
포뮬러 4a 의 메이탠시노이드를 주기 위한 메이탠시놀의 상기 설명된 에스테르화 방법에 있어서, 상기의 포뮬러(Ⅲ-L)의 화합물은 화합물 15a (S,S), 15b (S,R) 또는 15a (S,S)와 15b (S,R)의 혼합물이고;
포뮬러 4a 의 메이탠시노이드를 주기 위한 메이탠시놀의 상기 설명된 에스테르화 방법에 있어서, 포뮬러(Ⅲ-D)는 화합물 15(R,S), 15(R,R) 또는 15(R,S)와 15(R,R)의 혼합물이고;
포뮬러 4a 의 메이탠시노이드를 주기 위한 메이탠시놀의 상기 설명된 에스테르화 방법에 있어서, 포뮬러(Ⅲ-D,L)의 상기 화합물이 보호되는 티올기능기를 가진 카르복시릭 족의 라세믹 N-메틸알라니 아크릴레이티드이고; 15의 구조의 화합물을 주기 위하여 탄소 중앙에 라세믹 또는 R 또는 S chirality 를 포함하는 황 원자를 가지고;
포뮬러 4a 의 메이탠시노이드를 주기 위한 메이탠시놀의 상기 설명된 에스테르화 방법에 있어서, 15a(S,S)와 15b(S,R)의 혼합물이 다음의 과정으로 만들어지는것:
(1) 메틸 메탄티올설포네이트와 4-메르캅토펜타노익 산(12) 반응하여 화합물 13을 주고;
(2) 화합물 13을 그것의 N-하이드록시석시니마이드 에스테르 14로 변환시키고;
(3) N-메틸-L알라닌과 화합물 14를 반응하여 상기 화합물 15a(S,S) 와 15b(S,R)을 혼합하는 방법;
상기-기술된 방법에서, 상기 화합물 15a(S,S)는 다음을 포함하는 과정에 의해 제조된다.;
(1) (R)-1,3-부타네디올을 (S)-4-(메틸디티오)펜타노익 산19로 변환시키고;
(2) 화합물 19를 그것의 N-하이드록시석시니마이드 에스테르(20)로 변환시키고;그리고
(3) N-메틸-L-알라닌과 함께 화합물 20을 상기 화합물 15a(S,S)에 반응시키는 것으로 만들어지는 방법.
상기-기술된 방법에서, 상기 화합물 15(S,R)는 다음을 포함하는 과정에 의해 제조된다;
(1) (S)-1,3-부타네디올을 (R)-4-(메틸디티오)펜타노익 산24로 변환시키고;
(2) 화합물 24를 그것의 N-하이드록시석시니마이드 에스테르(25)로 변환시키고;그리고
(3) N-메틸-L-알라닌과 함께 화합물 25을 상기 화합물 15a(S,R)에 반응시키는 것으로 만들어진다.
상기 설명된 방법에서 화합물 15(R,S)와 15(R,R) 이 다음의 과정으로 구성된 것:
(1) 메틸 메탄티올설포네이드와 4-메르캅토펜타노익산(12)를 화합물 13과 반응하고;
(2) 화합물 13을 그것의 N-하이드록시 석시니마이드 에스테르 14에 변환시키고,
(3) N-메틸-D 알라닌과 화합물 14를 화합물 15(R,S)와 15(R,R)의 상기혼합물에 반응시켜서 만들어진다.
포뮬러 4a 에 의한 메이탠시노이드를 주기 위한 메이탠시놀의 에르테르화하는 상기-기술된 방법에서, 라세믹 N-메틸알라닌은 카르복시릭(carboxylic)족과 에길레이트화되고, 황원자를 포함하는 탄소 중앙은 라세믹 또는 구조15의 화합물을 주는 R, S chirality 중 어느 하나는 다음을 포함하는 과정에 의해 제조된다.;
(1) 메틸 메탄티올설포네이드와 4-메르캅토펜타노익산(12)를 화합물 13과 반응하고;
(2) 화합물 13을 그것의 N-하이드록시 석시니마이드 에스테르 14에 변환시키고,
(3) 라세믹 N-메틸알라닌과 화합물 14를 보호되는 티올기능기를 포함하는 카르복시릭 족과 라세믹 N-메틸알라닌 아크릴레이티드와 반응하고, 여기에서 황 원자를 포함하는 탄소 중앙은 라세믹 또는 구조15의 화합물을 주는 R, S chirality 중 어느 하나이다.
포뮬러 4b의 메이탠시노이드를 주기 위해 메이탠시놀의 에스테르화하는 상기-기술된 방법에서, R1과 R2는 메틸이고; R5, R6, R7과 R8은 각각 H이고; l과 m은 각각 1이고; n은 0이다.
포뮬러 4b의 메이탠시노이드를 주기 위해 메이탠시놀의 에스테르화하는 상기-기술된 방법에서, 포뮬러(Ⅲ-L)의 화합물은 N-메틸-L-알라닌을 포함하는 화합물10이고;
포뮬러 4b의 메이탠시노이드를 주기 위해 메이탠시놀의 에스테르화하는 상기-기술된 방법에서, 포뮬러(Ⅲ-D)의 화합물은 N-메틸-D-알라닌을 포함하는 화합물 10이고;
포뮬러 4b의 메이탠시노이드를 주기 위해 메이탠시놀의 에스테르화하는 상기-기술된 방법에서, 포뮬러((Ⅲ-D,L)의 화합물은 라세믹 N-메틸알라닌을 포함하는 화합물 10이고
포뮬러 4b의 메이탠시노이드를 주기 위해 메이탠시놀의 에스테르화하는 상기-기술된 방법에서, N-메틸-L-알라닌, N-메틸-D-알라닌 또는 라세믹 N-메틸알라닌을 포함하는 화합물 10은 다음을 포함하는 과정에 의해 제조된다.:
(1) 아세토니트릴의 음이온과 이소부틸렌 황화물(5)과 주어진 화합물 6를 반응시키고;
(2) 화합물 6을 4-메르캅토-메릴펜타노익산(7)에 주어 가수분해하고;
(3) 화합물 7을 메틸 메탄티올설포네이트화 반응하여 이황화물 8로 변환시키고;
(4) 화합물 8을 그것의 N-하이드록시석시니마이드 에스테르 9로 변환시키고;
(5) 화합물 9와 N-메틸-L-알라닌, N-메틸-D-알라니, 또는 라세믹 N-메틸알라니을 반응하여 N-메틸-L-알라니, N-메틸-D-알라닌 또는 라세믹 N-메틸알라닌을 포함하는 화합물 10이 생성되는 방법;
분리된 diastreomer에 의해 뒤따르는 상기 화합물 10을 갖는 메이탠시놀의 에스테르화하는 상기-기술된 방법과 사아노-결합된 실리카 상의 HPLC에 의해 메이탠시노이드를 정제하는 것과, 더 나아가 이황화 결합의 감소를 포함하는 것과 포뮬러 4b의 메이탠시노이드를 주기 위해;
포뮬러 4b에 의한 메이탠시노이드를 주기 위한 메이탠시놀의 에스테르화하는 상기-기술된 어느 하나의 방법에 의해 정제된 메이탠시노이드를 만드는 것을 포함하는 메이탠시노이드-세포-결합 물질 접합을 만드는 방법에서, 메이탠시놀과 sulfhydryl 족 또는 반응하는 디티오 족을 포함하는 세포-결합물질이 반응하는 것, 바람직하게는 디티오피리딜족 또는 치환 디티오피리딜 족인 것;
포뮬러 4b에 희안 메이탠시노이드를 주기 위한 메이탠시놀의 에스테르화하는 상기-기술된 어느 하나의 방법에서 정제된 메이탠시노이드를 포함하는 메이탠시노이드-세포-결합 물질 접합을 만드는 방법에서, 말레이미도 또는 할로아세틸 족을 구성하는 세포-결합 물질과 메이탠시노이드와 반응하는 것;
상기-기술된 접합을 이용하여 치료를 하는 방법.
포뮬러(Ⅲ)의 화합물:
Figure 112005066719031-PCT00031
L D D, L
(Ⅲ)
여기에서:
Y2는 (CR7CR8)l(CR5CR6)m(CR3CR4)nCR1R2SZ, 여기에서:
R1과 R2는 각각 독립적으로 CH3, C2H5, 1부터 10까지의 탄소 원자를 가지는 선형 알킬 또는 알케닐, 3부터 10까지의 탄소 원자를 가지는 가지형 또는 사이클린 알킬 또는 알케닐, 페닐, 치환 페닐 또는 헤테로사이클릭 방향족화합물 또는 헤테로사이클로알킬기, 그리고 R2는 H가 될 수 있고;
R3, R4, R5, R6, R7, R8은 각각 독립적으로 H, CH3, C2H5, 1부터 10까지의 탄소 원자를 가지는 선형 알킬 또는 알케닐, 3부터 10까지의 탄소 원자를 가지는 가지형 또는 사이클린 알킬 또는 알케닐, 페닐, 치환 페닐 또는 헤테로사이클릭 방향족화합물 또는 헤테로사이클로알킬기이고,
l, m 그리고 n은 각각 독립적으로 1부터 5까지의 정수이고, n은 0이 될 수 있고;
Z2는 SR 또는 -COR이고, R은 1부터 10까지 탄소 원자를 가지는 알킬 또는 알케닐, 3부터 10까지 탄소 원자를 가지는 가지형 또는 사이클릭 알킬 또는 알케닐, 또는 심플 또는 치환 알킬 또는 헤테로사이클릭 방향족화합물 또는 헤테로사이클로알킬기이고;
화합물 10(S), 10(R) 또는 라세믹 10;
N-메틸-L-알라닌, N-메틸-D-알라닌 또는 라세믹 N-메틸알라닌을 포함하는 화합물 10을 제조하는 방법은 다음의 과정으로 이루어진다.:
(1) 아세토니트릴의 음이온과 이소부틸렌 황화물(5)과 주어진 화합물 5를 반응시키고;
(2) 화합물 6을 4-메르캅토-메릴펜타노익산(7)에 주어 가수분해하고;
(3) 화합물 7을 메틸 메탄티올설포네이트화 반응하여 이황화물 8로 변환시키고;
(4) 화합물 8을 그것의 N-하이드록시석시니마이드 에스테르 9로 변환시키고;
(5) 화합물 9와 N-메틸-L-알라닌, N-메틸-D-알라니, 또는 라세믹 N-메틸알라니을 반응하여 N-메틸-L-알라니, N-메틸-D-알라닌 또는 라세믹 N-메틸알라닌을 포함하는 화합물 10이 생성되는 방법;
화합물 15a(S,S) 와 15b(S,R)의 혼합물;
15a(S,S) 와 15b(S,R)의 혼합물을 제조하는 방법은 다음의 과정으로 이루어진다.
(1) 화합물 13을 주기 위한 메틸메탄티올설포네이드와 함께 4-메르캅도펜타노익(12)과 반응하고;
(2) 화합물 13을 그것의 N-하이드록시석시니마이드 에스테르 (14)로 변환시키고;
(3) N-메틸-L-알라닌의 화합물 14를 상기 화합물 15a(S,S)와 15b(S,R)의 반응하는 것;
화합물 15(R,S) 와 15(R,R)의 혼합물;
화합물 15(R,S)와 15(R,R)의 화합물을 제조하는 방법은 다음의 과정으로 이루어진다.:
(1) 메틸 메탄티올설포네이드와 4-메르캅토펜타노익산(12)를 화합물 13과 반응하고;
(2) 화합물 13을 그것의 N-하이드록시석시니마이드 에스테르 14에 변환시키고,
(3) N-메틸-D 알라닌과 화합물 14를 화합물 15(R,S)와 15(R,R)의 상기혼합물에 반응시켜서 만들어진다.
보호된 티올기능기를 포함하는 카리복시릭 족에 의해 아실화(acylated)된 라세믹 N-메틸 N-메틸알라닌은 라세믹 또는 구조15의 화합물을 주는 R, S chirality 중 어느 하나인 것:
보호된 티올기능기를 포함하는 카리복시릭 족과 라세믹 N-메틸 N-메틸알라니 아크릴레이티드를 만드는 방법에서, 황 원자를 포함하는 탄소 중앙이 15 구조의 화합물을 주기 위한 라세믹, 또는 R 또는 S chirality 에서 다음의 구성으로 된 물질.
(1) 화합물 13을 주기 위해 메틸메탄티올설포네이트와 4-메르캅토펜타노익 산(12)과 반응하고;
(2) 화합물 13을 그것의 N-하이드록시석시니마이드 에스테르 14로 변환시키고;
(3) 보호되는 티올 기능기를 포함하는 카르복시릭 족에 의해 아실화된 라세믹 N-메틸알라닌을 주기 위해 화합물 14와 라세믹 N-메틸알라닌은 반응하고, 여기서 상기 라세믹 또는 구조15의 화합물을 주는 R, S chirality 중 어느 하나인 것.
화합물 15a(S,S);
화합물 15b(S,R);
화합물 15a(S,S)를 만드는 방법은 다음의 과정으로 이루어진다.;
(1) (R)-1,3-부타네디올을 (S)-4-(메틸디티오)펜타노익 산19로 변환시키고;
(2) 화합물 19를 그것의 N-하이드록시석시니마이드 에스테르(20)로 변환시키고;그리고
(3) 보호된 티올기를 갖는 카르복실족에 의해 아실화된 라세믹 N-메틸 알라닌을 만들기 위해, 화합물 14와 라세믹 N-메틸알라닌를 반응시키고, 구조15의 화합물을 제공하기 위해, 황원자를 갖는 탄소중심은 라세믹 또는 R 또는 S 키탈성 중의 어느 하나이다.
화합물15b(S,R)를 만드는 방법은 다음의 과정으로 이루어진다.;
(1) (S)-1,3-부타네디올을 (R)-4-(메틸디티오)펜타노익 산24로 변환시키고;
(2) 화합물 24를 그것의 N-하이드록시석시니마이드 에스테르(25)로 변환시키고;그리고
(3) N-메틸-L-알라닌과 함께 화합물 25를 상기 화합물 15b(S,R)를 주기 위해 상기 화합물 25와 N-메틸-L-말라닌과 반응시킨다.
상기-기술된 메이탠시노이드 화합물 중 어느 하나의 효과적인 양을 포함하는 치료용 합성물에 있어서, 치료적으로 가능한 salt 또는 용매로서, 치료적으로 가능한 캐리어, 희석제, 첨가제이고;
상기-기술된 치료적인 메이탠시노이드 합성물에서 메이탠시노이드는 더 나아가 항체를 구성하는 물질.
상기-기술된 메이탠시노이드-세포-결합-물질, 솔트, 용매물질 중 어느 하나의 효과적인 양에 의해 표적세포를 포함하는 표적세포 또는 조직과 접촉하여 선택된 세포를 사멸하게 하는 방법.
도1은 종래의 기술된 메이탠시노이드에 대한 구조를 도시한 도,
도2는 본 발명의 메이탠시노이드의 몇몇 구조를 도시한 도,
도3a 내지 도3d는 본 발명의 메이탠시노이드를 대표하는 합성에 대한 도표를 도시한 도,
도4a,b는 본 발명의 새로운 메이탠시노이드의 시험관 내의 효능을 보여주는 그래프,
도4c,d는 종래의 메이탠시노이드와 본 발명의 새로운 메이탠시노이드의 실험실 내의 효능을 비교한 그래프,
도5a내지 도5d는 본 발명의 메이탠시노이드와 세포-결합물질의 결합에 대한 준비에 대한 계획을 도시한 도,
도6은 본 발명의 세포-결합 물질-메이탠시노이드 결합의 실험실 내에서의 효능을 도시한 그래프,
도7은 HT-29 휴먼 클론 종양 xenocraft에 대응하는, 본 발명의 생체내에서의 항-종양 huC242-메이탠시노이드의 효능과 종래의 huC42 결합과 비교한 그래프,
도.8 은 COLO 205 휴먼 클론 종양 xenocraft에 대응하는, 본 발명의 생체내에서의 항-종양 huC242-메이탠시노이드의 효능과 종래의 기술된 huC42 결합과 비교한 그래프,
도.9 는 HL60 promyelocytic myeloid leukemia xenocraft에 대응하는, 본 발명의 생체내에서의 MY9-6-메이탠시노이드의 항-종양의 효능과 종래의 메이탠시오이드의 MY9-6 결합과 비교한 그래프,
도.10 은 표적 HL-60 세포와 비-표적 Namalwa 세포와 huMy9-6-DM$의 실험실 내에서의 세포 독성 실험에 대한 결과를 도시한 도,
도.11 은 쥐의 human HL-60 xenocraft 종양에 대한 huMy9-6-DM4 결합에 대한 생체내 측정과 그것을 종래의 메이탠시노이드(huMy9-6-DM1)의 Humy9-6 결합과 비교한 것을 도시한 도,
도.12 는 실험실 내에서 표적 라모스 세포와 비-표적 콜로 205 세포와 huB4-DM4결합의 세포독성 평가의 결과를 도시한 도,
도.13a 는 쥐의 human Ramos xenograft 종양에 대한 huB4-DM4의 결합에 대한 평가의 효능을 보여주고, 도 13b는 테스트 기간에 동물의 몸무게에 대한 변화를 도시한 도.
본 발명은 이제 제한적이지 않은 예들과 관련하여 설명될 것이다. 다른 언급 이 없다면, 모든 백분율, 비율, 부분 등은 무게에 의한다. 아래에 기술된 예들은 R1 은 H 또는 CH3, R2 는 CH3, R5, R6, R7, R8 는 각각 H, l 과 m은 각각 1, n은 0일 때의 혼합물이다. 본 발명의 다른 실시예를 위한 상기와 유사한 합성은 다음과 같이 수행될 수 있다: R1 과 R2 는 각각 독립적으로 H, CH3, C2H5, 또는 더 높은(higher) 1에서 10의 탄소원자를 갖는 알킬과 알케닐, 또는 페닐, 치환된 페닐 또는 헤테로싸이클릭 방향족화합물 또는 헤테로싸이클로알킬 라디칼이며; 여기서, l, m 과n 이 각각 1에서 5 사이의 정수이며, 또한 n이 0이 될 수 있다.
모든 시약은 뉴저지 소재의 앨드리히 케미컬 컴퍼니(Aldrich Chemical Co.)에서 구매되었거나, 다른 상업자원(commercial sources)에 의해 구매되었다. 메니텐시놀(11)은 이전에 기술된 것처럼(US Patent 6,333,410) 준비되었다. 원자력반향스펙트럼(Nuclear Magnetic Resonance (1H NMR) spectra)는 Bruker 400 MHz기계에서 얻어졌으며 메스 스펙트럼은 전자분무 이온화를 사용하는 Bruker Daltonics Esquire 3000 기계에 의해 얻어졌다.
예1
메이텐시노이드 4b의 합성
4-머캡토-4-메탈펜타노익 산(4-Mercapto-4-methylpentanoic acid) (7): 500mL의 플라스크를 젓는 막대기와 150mL의 추가 깔때기를 준비한다. 시스템은 아르곤 기체 하에 위치한다. 150 mL의 무수의 테트라하이드로퓨레인(THF)과 (anhydrous tetrahydrofurane (THF)) 75mL의 헥산의 2.5 M n-BuLi(18.7mmol)이 카눌라(canula)를 통해 추가되었고, 용액은 -78 oC의 드라이아이스/아세톤 용액조에서 냉각된다. 아세토니트릴(7.3g, 9.4mL, 18mmol)이 주사기를 통해 약 5분 이상 방울 형태로 추가된다. 백색 리튬-아세토니트릴 침전물이 형성되는 동안 반응물을 30분간 젓는다. 이소부틸렌 황화물(Isobutylene sulfide) (15g, 17mmol)은 100mL의 무수의 THF에 용해되고 추가 깔때기를 통해 약 30분 이상 방울 형태로 추가된다. 냉각용액조를 제거하고 반응물을 3시간 동안 젓는다. 플라스크는 38mL의 0.5M HCL이 방울 형태로 추가된 얼음/물 용액조 내에서 냉각된다. THF 층은 유지되고 수성층은 75mL의 에틸 아세테이트로 두 번 세척한다. THF와 에틸 아세테이트 층은 혼합되고, 약 20g의 무수의 나트륨 황산염으로 건조되고, 250mL의 플라스크로 옮겨진다. 용매는 천연 6을 부여하기 위해 진공 상태에서 회전증발에 의해 제거된다. 에탄올 (30mL)과 젓는 막대기를 추가한다. 내용물은 30mL의 이온이 제거된 물 내에서 8.0g NaOH 용액을 저어서 천천히 추가한다. 플라스크를 역류콘덴서(reflux condenser)와 준비하고 아르곤 기체 하에 위치한다. 반응물은 밤새 역류하며, 그런 다음 실내 온도로 냉각된다. 이온이 제거된 물(60mL)을 첨가하고 혼합물은 에틸 아세테이트와 헥산의 2:1 혼합의 25mL의 분할로 두 번 추출된다. 수성층은 HCL이 농축된 pH2로 산화된 다음 에틸 아세테이트 75mL 분할로 3번 추출된다. 조직층은 무수의 Na2SO4 로 건조되고 용매는 10g의 생산품 7(39% 수율)을 부여하기 위해 진공상태에서 회전 증발에 의해 제거된다. 물질은 추가의 정화작용 없이 사용된다. 1H NMR (CDCl3): d1.38 (6H, s), 1.87-1.93 (2H, m), 2.08 (1H, s), 2.51-2.57 (2H, m).
4-메틸-4-(메틸디티오)펜타노익(4-Methyl-4-(methyldithio)pentanoic acid 산(8): 머캡토펜타노익 산 7(6.0mL, 40mmol) 용액은 250mL 플라스크 내의 50mL의 이온이 제거된 물에 용해된다. 용액은 초과로 거품을 야기하지 않는 비율의 산에 탄산나트륨(6.4g, 60mmol)으로 자기(磁氣)적으로 저어져 추가되었다. 플라스크를 유리-증류된 100% 에탄올 30mL 내에 용해된 메틸 메탄티올썰포네이트(7.5g, 60mmol) 용액이 채워진 100mL의 추가 깔때기와 준비한다. 플라스크는 얼음/물 용액조내에서 냉각되며 시스템은 아르곤 기체 내에서 유지된다. 메틸 메탄티올썰포네이트 용액은 초과의 거품을 야기함이 없이 가능한 한 빨리 방울형태로 플라스크에 추가시킨다. 냉각 용액조는 제거되고 반응물의 혼합은 추가로 3시간 동안 젓는다. 용매는 진공상태에서 약 20mL가 남을 때까지 회전증발에 의해 제거시킨다. 그 다음 포화중탄산나트륨 10mL과 이온이 제거된 물 30mL이 추가된다. 혼합물은 분별깔때기에서 25mL 분할의 에틸 아세테이트로 세 번 세척된다. 수성층은 5M HCL의 약 pH2로 조절되고 120mL 분할의 에틸 아세테이트로 두 번 추출된다. 조직층은 결합되고 포화 NaCl과 4:1 비율의 1M HCL로 구성된 용액 20mL로 세척된다. 조직층은 그런 다음 14g의 무수의 황산나트륨으로 건조되고 용매는 5.4 g의 생산품 8(70% 수율)을 부여하기 위해 진공상태에서 회전증발에 의해 제거된다. 물질은 추가의 정화작용 없이 다음 단계로 진행될 수 있다. 1H NMR (CDCl3): d1.54 (6H, s), 2.15-2.21 (2H, m), 2.64 (3H, s), 2.69-2.72 (2H, m). MS (M + Na+) calc.: 217.0, found: 217.1
N-하이드로석씨니미딜(Hydroxysuccinimidyl) 4-메틸-4-(메틸디티오)펜타노에이트((methyldithio)pentanoate)(9):
메틸디티오펜타노익 산 8(3.0g 15mmol)은 20mL의 메틸렌 염화물에 용해되고 N-하이드로석씨니마이드(2.65g, 23mmol)으로 자기적으로 저어져 1-[3-(디메틸아미노)프로필]-3-에틸카보디마이드 하이드로클로라이드(EDC, 4.4 g, 23 mmol)과 같이 추가된다. 혼합물은 아르곤 기체 하에서 2시간 동안 젓는다. 반응물 혼합을 125mL의 분별깔때기에 붓고, 40mL의 에틸 아세테이트를 추가하고 용액을 50mM의 pH 6.0d의 칼륨인산염완충제를 20mL 분할로 두 번, 포화염화나트륨 12mL로 한번 세척한다. 조직층은 14 g의 무수의 Na2SO4로 건조되고 용매는 추가의 정화작용 없이 사용되는 4.0 g의 생산품 9(90% 수율)을 부여하기 위해 진공상태에서 회전증발에 의해 제거된다. 1H NMR (CDCl3): d1.30 (6H, s), 2.00-2.05 (2H, m), 2.39 (3H, s), 2.68-2.72 (2H, m), 2.73-2.83 (4H, m). MS (M + Na+) calc.: 314.0, found: 314.1
N-메틸-N-(4-메틸-4-메틸디티오-1-옥소펜틸)-L-알라닌(10):
N-메틸-L-알라닌(2.85g, 18.0mmol)은 자기(磁氣) 젓는 막대기가 구비된 125mL 플라스크 내에 디메톡시에탄과 이온이 제거된 물의 비율이 1:1인 용액 50mL에 용해된다. 트리에틸아민(6.9g, 36mmol)이 추가되고 용액은 격렬하게 저어져 9(5.44g 18mmol)로 40mL의 같은 용매의 혼합에 용해되고 약 5분 넘게 방울 형태로 추가된다. 2시간 후 반응물 혼합은 진공상태에서 회전증발에 의해 약 40mL로 농축되고, 그런 다음 약 2pH를 부여하기 위해 10mL의 이온이 제거된 물과 1M HCL이 추가된다. 혼합물을 분별깔때기에 붓고 50mL 분할의 에틸아세테이트로 2번 추출된다. 조직층이 결합하고 그런 다음 7mL의 포화염화나트륨 용액에 의해 세척된다. 조직층은 8.0g 이상의 무수의 Na2SO4 로 건조되고, 용매는 진공상태에서 회전증발에 의해 제거된다. 잔류물은 최소한의 부피의 에틸 아세테이트에 흡수되고 이산화규소 상의 색층분석(chromatography)에 의해 정화된다. (Silica: 40 micron flash grade, silica bed: 24 x 3.0 cm, mobile phase: hexanes: ethyl acetate: acetic acid 50:48:2). 원하는 제품을 포함하는 조각들은 결합하고 용매는 진공상태에서 제거된다. 잔여 아세트산은 최소한의 부피의 에틸 아세테이트 내의 잔여물을 용해와 빠르지만 방울 형태의 추가의 핵산의 젓기에 의해 제거된다. 핵산은 제품이 더이상 TLC 분석에 의해 상청액(supernatant) 내에서 검출되지 않을 때까지 추가된다. 침전은 2.2g의 제품 10(5% 수율)4시간 동안 진공건조된다. 1H NMR (CDCl3): d1.32 (6H, s), 1.42 (3H, d, J = 7 Hz), 1.90-97 (2H, m), 2.40 (3H, s), 2.42-2.49 (2H, m), 2.9 (3H, s), 5.15 (1H, q, J= 7 Hz). MS (M + Na+) calc.: 302.1, found: 302.0.
N 2'-디아세틸-N2'(4-메틸-4-메틸디티오-1-옥소펜틸)메이텐신(L-DM4-SMe, 4e). 3mL의 디클로메탄 내의 메이텐시놀 용액(11, 25mg, 0.44mmol)과 N-메틸-N-(4-메틸-4-메틸디티오-1-옥소펜틸)-L-알라닌(10, 42.0mg, 0.177mmol)은 아르곤 기체 하에서 자기적으로 저어져 0.67mL의 디클로메탄 내의 디클로헥실카보디마이드(DCC, 57.1mg, 0.277mmol) 용액으로 추가된다. 1분 후에 디에틸 에스테르(0.03mL, 0.03mmol)내의 1M ZnCl2 용액을 추가한다. 혼합물을 2시간 동안 실내 온도에서 저어준 다음 5mL의 에틸 아세테이트를 추가하고 혼합물은 여과지를 통해 진공 여과된다. 여과액은 1mL의 포화 염화나트륨 용액에 의해 2mL의 포화탄산수소나트륨용액으로 세척된다. 조직층은 2g의 무수의 황산나트륨으로 건조된다. 그리고 용매는 진공상태에서 제거되고 잔류물은 반응되지 않은 메이텐시놀을 제거하기 위한 디클로메탄과 메탄올의 혼합물을 사용하는 이산화규소 색층분석에 의해 정화된다. 원하는 생산품을 포함하는 조각은 결합하고 용매는 다이에스터로머 4e와 4f의 혼합물을 부여하기 위해 진공상태에서 제거된다. 잔류물은 최소한의 부피의 에틸 아세테이트 내로 흡수되고, 핵산의 혼합물과 68:8:24의 비율로 2-프로판올과 에틸 아세테이트를 이동면으로 사용하는, 50cm x 250cm, 10 micron DiazemTM CN column으로 정화된다. 유속은 118 mL/min이다. 이와 같은 조건에서 11분의 정체시간으로 용출하며 원 하는 생산품 4e와 원하지 않는 다이에스터로머 4f는 19분의 정체시간을 가졌다. 원하는 생산품을 포함하는 조각은 결합하며 용매는 12.0mg의 생산품 4e(36% 수율)를 부여하기 위해 진공상태에서 제거된다. 1H NMR (CDCl3): d0.80 (3H, s), 1.28-1.36 (13H, m), 1.42-1.46(2H, m), 1.53-1.63 (2H, m), 1.64 (3H, s), 1.75-1.85 (1H, m), 1.90-2.10 (1H, m), 2.18 (1H, dd, J=3 Hz and 14 Hz), 2.31 (3H,s), 2.40-2.49 (1H, m), 2.50-2.65 (1H, m), 2.85 (3H, s), 3.04 (1H, d, J=9 Hz), 3.11 (1H,d,J=11 Hz), 3.23 (3H,s), 3.35 (3H,s), 3.49 (1H, d, J=9 Hz), 3.63 (1H, d, J=12 Hz), 3.98 (3H, s), 4.27 (1H, t, J=10 Hz), 4.79 (1H, dd, J=3 Hz and 12 Hz), 5.41 (1H, q, J=7 Hz), 5.66 (1H, dd J=9 Hz and 15 Hz), 6.21 (1H, s), 6.42 (1H, dd, J=11 Hz and 15 Hz), 6.65 ( 1H, d, J=1.5 Hz), 6.73 (1H, d, J=11 Hz), 6.81 (1H, d, J=1.5 Hz). 고해상도 MS (M + H+) calc.: 826.3174, found: 826.3150.
N2'-디아세틸-N2'-(4-메르켑토-4-메틸-1-옥소펜틸)메이탠신(L-DH4,4b) 위(12 mg, 0.015 mmol)로부터의 이황화물 4e는 아세트산에틸 : 메탄올의 1:1의 비율로1.0mL의 용액에 용해된다. 50 mM 인산 완충액(pH 7.5)의 0.50 mL에 디티오트리에틸(dithiothreitol)(18 mg, 0.117 mmol)의 용액은 그 다음에 더해진다. 용액은 3시간 동안 아르콘 대기에서 자기적으로 뒤섞인 용액에 200 mM 인산 완충액(pH 6.0)의 1 mL가 더해지고 혼합물은 아세트산에틸의 2mL 부분들로 3번 추출되었다. 유기층들은 포화된 염화나트륨 용액의 1mL와 결합되고 씻기며, 그 다음엔 무수황산나트륨의 1g 이상 건조된다. 용매는 진공에서 제거되고 잔여물은 최소한의 아세트산에틸로 추출되고 70:8:22의 비율에서 250 cm x 50 cm의 이동상으로서 헥산의 혼합물을 사용하는 10 마이크론 DiazemTM CN 기둥, 2-프로판올 그리고 아세트산에틸에 의해 정화된다. 흐름 속도는 분당 22 mL이다. 원하는 제품 4b는 10분의 유지 시간을 가진 채로 용리(-elute)된다. 순수한 4b를 포함한 증류의 분류들(fraction)은 화합되고, 상기 용매는 11mg의 4b(97% 생산량)을 주는 진공 하에서 제거된다. 1H NMR (CDCl3): d0.80 (3H, s), 1.19-1.23(1H,m), 1.28-1.36 (12H, m), 1.42-1.46(2H, m), 1.53-1.63 (2H, m), 1.64 (3H, s), 1.75-1.85 (1H, m), 1.90-2.10 (1H, m), 2.18 (1H, dd, J=3 Hz and 14 Hz), 2.40-2.49 (1H, m), 2.50-2.65 (2H, m), 2.88 (3H, s), 3.04 (1H, d, J=9 Hz), 3.11 (1H,d,J=11 Hz), 3.23 (3H,s), 3.35 (3H,s), 3.49 (1H, d, J=9 Hz), 3.63 (1H, d, J=12 Hz), 3.98 (3H, s), 4.27 (1H, t, J=10 Hz), 4.79 (1H, dd, J=3 Hz and 12 Hz), 5.41 (1H, q, J=7 Hz), 5.66 (1H, dd J=9 Hz and 15 Hz), 6.21 (1H, s), 6.42 (1H, dd, J=11 Hz and 15 Hz), 6.65 ( 1H, d, J=1.5 Hz), 6.73 (1H, d, J=11 Hz), 6.81 (1H, d, J=1.5 Hz). High resolution MS (M + Na+) calc.: 802.3101, found: 802.3116.
예2
메이탠시노이드 4a의 합성
4-메틸디티오-펜타노익산(13) : 4-메르켑토펜타노익산의 욕액은 500mL 플라 스크 안에 탈이온화된 물 350mL에 의해 용해된다. 탄산나트륨(19.7g, 186mmol)이 과도한 거품이 일어나지 않는 비율로 상기 산에 첨가됨에 따라 상기 용액은 자기적으로 뒤섞인다. 상기 풀라스크는 250mL 추가깔때기를 구비하고, 그것은 메틸메탄에티올설퍼네이트(methanethiolsulfonate)(23.4g, 186mmol)의 용액으로 채워진다. 상기플라스크는 얼음 / 중탕 용해조 내에서 차가워지며 이 시스템은 아르콘 대기에서 유지된다. 상기 메탄에티올설퍼네이트(methanethiolsulfonate) 용액은 플라스크에 과도한 거품이 이는 것을 막기 위해 가능한 한 빠르게 drop-wise를 더해주어야 한다. 상기 냉각조는 제거되고 상기 반응 혼합물은 추가로 2시간 동안 뒤섞인다. 용매는 진공에서의 회전 증발에 의해 제거되고 결국, 약 250mL가 남는다. 그 후, 포화된 중탄산나트륨 용액의 30 mL와 탈이온수 50 mL가 가해진다. 상기 혼합물은 분별 깔때기에서 200mLZ더해진 후에 혼합물은 분별 깔대기에 200mL의 아세트산에틸에 의해 3차례 씻겨진다. 수성의 층기가 5 M HCl으로 대략 pH2로 조절되며 400mL의 아세트산에틸이 두 번 추출되었다. 상기 유기층들은 결합되고, 그 후 포화된 NaCl 용액과 1M HCl가 4 : 1로 혼합된 60mL의 용액으로 씻겨진다. 그 후, 무수 황산나트륨의 50g으로 건조된다. 최종적으로 용매는 제품 13(45 % 생산량)의 10.2 g을 공급하기 위하여 진공에서 증발에 의하여 제거된다. 물질은 고급의 정화단계 없이 다음 반작용에서 사용되었다.. H1 NMR 1.36 (3H, d, J = 7 Hz), 1.84-1.95 (H, m), 1.85-2.56 (1H, m), 2.42 (3H, s), 2.53 (2H, t, J = 7 Hz), 2.85-2.95 (1H, m), MS (M + Na+) calc.: 203.3, found: 203.2.
N-히드록시석씨니미딜(Hydroxysuccinimidyl)4-메틸디티오(methyldithio)-펜타노에이트(pentanoate)(14) : N-히드록시석씨니미드(hydroxysuccinimide)(0.526 g, 4.57 mmol)가 하기될 1- [3-( dimethylamino)propyl] -3-ethylcarbodiimide 염산염(0.877 g, 4.57 mmol)이 더해지는 동안 4 메틸디티오펜타노익산(methyldithio pentanoic) 산(13, 0.75 g, 4.16 mmol)은 7.0mL의 염화메틸렌 용액 안에서 용해된다. 상기 혼합물은 2.5시간 동안 아르콘 대기에서 뒤섞이고 그 후, 20mL의 아세트산에틸을 포함하는 60mL 분별깔대기에 따라진다. 그 결과 생긴 용액은 50mM의 인산칼륨 완충기 중 15mL, pH 6.0으로 두 번 씻기며 그리고 포화된 염화나트륨의 5 mL에 의해 한 번 씻긴다. 유기층은 무수 Na2SO4의 8 g이상 건조되며 용매는 제품 14(87 % 생산량)의 1.15 g을 공급하기 위하여 진공에서의 증발에 의하여 제거된다. 이 과정은 더 높은 단계의 정화없이 이용된다. H1 NMR 1.48(3H, d, J = 7), 2.06(1H, m), 2.17(1H, m), 2.55(3H, s), 2.93(2H, t, J= 7), 2.98(4H, s), 3.15(1H, m). MS (M + Na+) calc.: 304.1, found: 304.0.
N-메틸-N-(4-메틸디티오-1-옥소펜틸)-L-알라님(15): N-메틸-L-알라닌(0.64g, 6.2mmol)은 자석진동막대가 갖추어진 125mL 플라스크 안에서 디메스옥시테인(dimethoxyethane)과 탈이온수의 1 : 1 혼합물 8 mL에 용해된다. 트리에틸라민(Triethylamine)(0.841 g, 8.3 mmol)가 더해지고 대략 5분이상 상기 용매 혼합물에 drop-wise가 가해짐에 따라 상기 플라스크를 격렬히 흔든다. 2시간 후에, 상기 혼합물은 진공에서 회전 증발에 의해 대략 3 mL로 농축되고 그리고 나서 약 pH2가 되 도록 탈이온수의 15 mL와 1 M HCl가 가해진다. 상기 혼합물은 60 mL 분별깔대기에 따라지고 15mL의 아세트산에틸에 의해 2번 추출된다. 유기층들은 결합되고, 포화된 염화나트륨 용액 3 mL에 의해 씻겨지고, 그 다음에 무수 Na2SO4의 8.0g 이상 건조되며 최종적으로, 용매는 진공에서 증발에 의하여 제거된다. 잔여물은 최소한 부피의 아세트산에틸에 의해 뽑아지고 실리카 크로마토그래피(silica: 40 micron flash grade, silica bed 24 x 3.0 cm, mobile phase hexanes: ethyl acetate: acetic acid 50:48:2).에 의해 정화된다. 원하는 제품 15를 포함하는 증류의 분류(fraction)는 결합되고 용매는 진공하에서 제거된다. 남은 아세트산은 아세트산에틸의 최소 부피의 아세트산에서 찌꺼기가 녹아지며 제거되고 급류지만 drop-wise가 추가된 섞인 헥산에 의해 거꾸로 떨어진다. 제품이 더 이상 TLC 분해에 의해 발견되지 않을 때까지 헥산은 더해진다. 침전물은 제품 15(62 % 생산량)의 0.60 g을 공급하기 위하여 진공에서 건조된다. H1 NMR 1.35(3H, d, J = 7), 1.41 (3H,d,J = 7), 1.94-2.03 (2H,m), 2.43(3H,s), 2.50-2.55 (2H,m), 2.83-2.93 (1H,m), 2.98 (3H,s), 5.14(1H, q, J= 7). MS (M + Na+) calc.: 288.1, found: 288.1.
N2'-디아세틸-N2'-(4-메틸디티오-1 옥소펜탈)메이탠신(L-DM3-SMe, 4c) : 3m의 디클로메탄 안에 있는 상기 제품 15 (42.0, 0.177 mmol)와 메이탠시놀(25 mg, 0.44 mmol)용액은, 0.67mL 디클로로메탄 안에 있는 디사이클헥실카보디이미드(dicyclohexylcarbodiimide)(DCC, 57.1 mg, 0.277 mmol)의 용액이 가해짐에 따라, 아르곤 대기 하에서 자기적으로 섞여지다. 1분 후, 디에틸 에테르(0.03 mL, 0.03 mmol) 안의 1 M ZnCl2 용액이 가해진다. 상기 혼합물을 실온에서 2시간 동안 저은 다음, 5mL의 에틸아세테이트를 첨가하고 상기 혼합물은 course filter paper(course 여과지)를 통해 진공 여과된다. 상기 여과액은 1mL의 포화 염화나트륨 용액을 뒤이어 2mL의 포화 탄산수소나트륨으로 세척된다. 유기층은 2g의 무수의 황산나트륨으로 건조된 다음, 용매는 진공상태에서 제거된다. 잔류물은 반응하지 않은 메이텐시놀을 제거하기 위해 디클로로메탄과 메탄올의 혼합물을 사용하는 이산화규소 크로마토그래피에 의해 정화된다. 원하는 제품을 포함하는 증류의 분류는 혼합되고 용매는 디에스테레오머 4c와 4d의 혼합물을 만들기 위해 진공상태에서 제거된다. 잔류물은 에틸 아세테이트의 최소한의 부피로 흡수되고, 이동성 면에서 68:8:24의 핵산 혼합물, 2-프로판올 과 에틸 아세테이트를 사용하는 50 cm x 250 cm, 10 micron DiazemTM CN column으로 정화된다. 유속은 118mL/분이다. 원하는 제품 4c는 11분의 유지시간을 가지며 용리(elute)되고, 상기 원하지 않는 디에스테레오머 4d는 19분의 유지시간을 가진다. 원하는 제품을 포함하는 증류의 분류는 결합되고, 12.0 mg의 생산품 4c (36% 수율)를 만들기 위하여 진공상태에서 상기 용매는 제거된다. 1H NMR (CDCl3): d0.80 (3H, s), 1.19-1.23(1H,m), 1.28-1.36 (9H, m), 1.42-1.46(1H, m), 1.53-1.63 (2H, m), 1.64 (3H, s), 1.80-1.89 (1H, m), 1.90-2.09 (1H, m), 2.18 (1H, dd, J=3 Hz and 14 Hz), 2.32 (3H, s), 2.33-2.42 (1H, m), 2.49-2.62 (2H, m), 2.88 (3H, s), 3.04 (1H, d, J=9 Hz), 3.11 (1H,d,J=11 Hz), 3.23 (3H,s), 3.35 (3H,s), 3.49 (1H, d, J=9 Hz), 3.63 (1H, d, J=12 Hz), 3.98 (3H, s), 4.27 (1H, t, J=10 Hz), 4.79 (1H, dd, J=3 Hz and 12 Hz), 5.41 (1H, q, J=7 Hz), 5.66 (1H, dd J=9 Hz and 15 Hz), 6.21 (1H, s), 6.42 (1H, dd, J=11 Hz and 15 Hz), 6.65 ( 1H, d, J=1.5 Hz), 6.73 (1H, d, J=11 Hz), 6.81 (1H, d, J=1.5 Hz). MS (M + Na+) calc.: 834.3, found: 834.3.
N 2 ´디아세틸-N2 ´(4-머캡토-1-옥소펜틸)메이탠신 (L-DM3, 4a): L-DM3-SMe (4c, 12mg, 0.015mmol)은 에틸 아세테이트와 메탄올의 1:1 혼합물 1.0mL에 용해된다. pH7.5의 50mM 인산염 버퍼( phosphate buffer) 0.50mL에 디티오트리톨 용액(18mg, 0.117mmol)이 그런 다음 첨가된다. 3시간 동안 아르곤 기체 하에서 반응용액을 자기적으로 저은 다음, 1mL의 200mM 인산염 버퍼 pH6.0이 첨가되고, 혼합물은 2mL 분량의 에틸 아세테이트로 3번 추출된다. 조직층은 결합되고 1mL의 포화 염화나트륨 용액으로 세척된 다음, 1g의 무수의 황산나트륨으로 건조된다. 용매는 진공상태에서 제거되고 잔류물은 최소의 에틸 아세테이트에 흡수되고 이동성 면에서 70:8:22의 핵산 혼합물, 2-프로판올 과 에틸 아세테이트를 사용하는 50 cm x 250 cm, 10 micron DiazemTM CN column으로 정화된다. 유속은 22mL/min이다. 원하는 제품 4c는 10분의 유지시간을 가지며 용리된다. 11mg의 생산품 4a (97% 수율)를 만들기 위하여 순수한 제품을 포함하는 증류의 분별은 결합되고 진공상태에서 용매는 제거된다. 1H NMR (CDCl3): d0.80 (3H, s), 1.19-1.23(1H,m), 1.28-1.36 (9H, m), 1.42-1.46(1H, m), 1.53-1.63 (2H, m), 1.64 (3H, s), 1.80-1.89 (1H, m), 1.90-2.09 (1H, m), 2.18 (1H, dd, J=3 Hz 와 14 Hz), 2.33-2.42 (1H, m), 2.49--2.62 (2H, m), 2.88 (3H, s), 3.04 (1H, d, J=9 Hz), 3.11 (1H,d,J=11 Hz), 3.23 (3H,s), 3.35 (3H,s), 3.49 (1H, d, J=9 Hz), 3.63 (1H, d, J=12 Hz), 3.98 (3H, s), 4.27 (1H, t, J=10 Hz), 4.79 (1H, dd, J=3 Hz and 12 Hz), 5.41 (1H, q, J=7 Hz), 5.66 (1H, dd J=9 Hz and 15 Hz), 6.21 (1H, s), 6.42 (1H, dd, J=11 Hz and 15 Hz), 6.65 ( 1H, d, J=1.5 Hz), 6.73 (1H, d, J=11 Hz), 6.81 (1H, d, J=1.5 Hz). MS: (M + Na+) calc.: 788.3, found: 788.3.
실시예3
메이텐시노이드 4g,h의 합성(도 3c)
R-1,3-Di-O-p-톨루엔술포닐-부탄(17): 건조 피리딘(40mL)과 건조 톨루엔(60mL) 혼합물 내의 R-(-)-1,3-부탄디올(16, 2.00g, 22.22mmol) 용액은 0℃의 아르곤 하에서 p-톨루엔술포닐 염화물(12.70g, 66.84mmol)로 처리된다. 0℃에서 5분간 저은 후, 뒤이어 실온에서 2시간 동안 젓고, 상기 혼합물은 진공상태에서 증발되며, 에틸 아세테이트에서 다시 용해되고, 수성 NaHCO3 0.1M로 세척하고, 포화 NaCl 에 의해 반복된다. 상기 유기층은 MgSO4로 건조되고, 여과되며, 용매는 증발된다. 1:2 (v/v) 에틸 아세테이트/핵산으로 용리되는, 실리카 겔 위의 크로마토그래피에 의한 정화는 상기 제품 17의 6.51g(74%)를 제공한다. Rf = 0.40 (1:1 EtOAc/핵산); 1H NMR (CDCl3) 7.76 (dd, 4H, J = 1.0, 8.0 Hz), 7.35 (dt, 4H, J = 0.4, 8.0 +8.0 Hz), 4.70 (m, 1H), 4.03 (m, 1H), 3.94 (m, 1H), 2.46 (s, 6H), 1.92 (m, 2H), 1.26 (d, 3H, J = 6.3 Hz); 13C NMR 145.17, 133.00, 130.11, 128.12, 127.91, 76.28, 66.21, 36.08, 21.86, 21.06; MS: 420.99 (M + Na)+, 421.93 (M+1+Na)+.
S-4-O-에틸잔틱-펜탄니트릴(18): 건조 DMSO(50mL) 내의 R-1,3-di-O-p-톨루엔술포닐-부탄 (17, 4.80g, 12.06mmol) 용액은 NaCN(0.65)로 처리된다. 아르곤 하에서 18시간 동안 실온에서 저은 다음, 반응 화합물은 에틸 아세테이트에 희석되고, pH 7.5의 차가운 NaH2PO4 1.0M과 물, pH 4.0의 1.0M의 NaH2PO4에 연속적으로 세척된다. 유기층은 분리되고 MgSO4으로 건조되며, 여과된 다음, 천연의 R-3-O-p-톨루엔술포닐-펜탄니트릴 2.63g을 제공하기 위하여 증발된다. MS 275.80 (M + Na)+, 276.75 (M +1 +Na)+. 제품은 추가의 정화작용 없이 직접 사용된다.
에탄올(15mL)의 천연의 R-3-O-p-톨루엔술포닐-펜탄니트릴 (2.63g) 용액에 에탄올(50mL)의 칼륨 O-에틸크산틴산염(4.55g)을 추가한다. 아르곤 하에서 밤새 저은 다음, 혼합물은 농축되고, 에틸 아세테이트에 희석되고, 짧은 실리카 기둥을 통 과하여 여과된다. 용리액은 타이틀 제품 18 1.54g(63%, 2단계)을 제공하기 위해, 1:4 (v/v) EtOAc/핵산을 녹여서 분리하는 실리카 겔 위의 크로마토그래피에 의해 농축되고 정화된다. Rf = 0.40 (1:4 EtAc/hexane). 1H NMR (CDCl3) 4.67 (dd, 2H, J = 7.1, 14.2 Hz), 3.86 (ddd, 1H, J = 7.0, 14.0, 21.9 Hz), 2.50 (t, 2H J = 7.3 + 7.6 Hz), 2.06 (m, 2H), 1.44 (m, 6H); 13C NMR 213.04, 119.16, 70.28, 44.57, 32.10, 20.20, 15.21, 13.93; MS: 226.51 (M + Na) +, 242.51 (M + K) +.
S-(+)-4-메틸디티오-펜타노익산(19): 에탄올(10mL)과 물(150mL)의 혼합물 안에 S-4-O-에틸크센틱(Ethylxanthic)-펜탄니트릴(pentanenitrile)(18, 1.95 g (9.61 mmol) 용액을 위해 5.0g의 NaOH가 가해진다. 상기 반응 혼합물은 아르곤 하에서 밤새 환류된다. 상기 혼합물은 실내온도에서 냉각되고 물(150 ml)과 함께 희석되며 1:1 EtOAc/hexane (2 x 100 ml)으로 추출된다. 수액층은 H3PO4 으로 pH 2.5 ~ 3.0가 될 때까지 산화되고, EtOAc (6 x 75 ml)에 의해 추출된다. 유기층은 결합되고, MgSO4에서 건조되고, 건조되면서 여과와 증발을 거쳐서 천연 S-4-메르캡토펜타노익(mercaptopentanoic) 산을 만든다. 이러한 천연 물질은 다른 여과과정 없이 바로 다음 단계를 위해 사용된다.
Ethanol(50mL)과 0.5M NaH2PO3, pH 7.0(75mL)의 혼합물 안의 천연 S-4- mercaptopentanoic산(1.2g) 용액을 위해, 0'C에서 45분 넘게 5드라이 THF(5mL)안의 dropwise 메틸메탄에틸설포네이트(methyl methanethiolsulfonate) (1.47 g, 11.65 mmol)이 가해진다. 0'C의 아르곤 상태에서 30분간 휘저은 후, 2시간 동안 실온에서 저어준 후, 상기 혼합물은 응집되고 디클로로메탄(2x 50 ml)에 의해 추출된다. 수액층은 결합되고, MgSO4 에서 건조되고, 여과되고 증발한다. 유기층은 pH 2.5 ~ 3.0의 H3PO4 과 함께 산화되고 EtOAc (4 x 100 ml)에 의해 추출된다. 잔여물은 실리카겔 위에서 크로마토그래피에 의해 정제되고, 타이틀 생산품 19 Rf = 0.32 (1:100:400 HOAc/EtAc/hexane)의 1.43 g (83%)를 주기 위해 (1:100:400 HOAc/EtOAc/hexane)와 같이 녹여 분리된다.; 1H NMR (CDCl3) 2.91 (ddd, 1H, J = 6.8, 13.7, 20.5 Hz), 2.53 (t, 2H, J = 7.7 + 7.4 Hz), 2.42 (s, 3H), 1.94 (m, 2H), 1.36 (d, 3H, J = 6.8 Hz); 13C NMR 179.18, 45.35, 31.58, 30.73, 24.70, 21.05; MS: 202.92 (M+Na)+, 203.91 (M+1+Na)+; [a] = 41.35 (c = 2, CH3OH).
N-메틸-N-[4-(S)-메틸디티오-1-옥소펜틸]-S-알라닌(15a): S-(+)-4-(메틸디티오(Methyldithio))-펜타노익산(pentanoic acid) (19) 은 상기의 화합물 14의 기술된 방법에 의하여 N-hydroxysuccinimdyl ester 20으로 변환된다. 15a(62 % yield)를 주기 위한 화합물 15를 위한 상기 설명된 절차에 의해 N-methyl-L-alanine 반 응이 일어난다. H1 NMR d1.36(3H, d, J = 7), 1.42 (3H,d,J = 7), 1.93-1.98 (2H,m), 2.40(3H,s), 2.50-2.53 (2H,m), 2.90-2.95 (1H,m), 2.99 (3H,s), 5.14 (1H, q, J= 7), MS: (M + Na) calc.: 288.1, found: 288.1
N2'디아세틸-N2'(4-(S)-메틸디티오-1-옥소펜틸)메이탠신(DM3-SMe, 4g,h): 메이탠시놀(Maytansinol) (11) 15a에 의해 두 배가 되고, 이 때 4c의 합성을 위하여 상기 설명된 디클로로메탄안의 DCC 와 zinc 클로라이드를 사용한다. N-methyl-S-alanyl moiety (4g, S,S)를 포함하는 2개의 diastereomers의 혼합물과 N-methyl-R-alanyl moiety (4h,R,S)가 획득된다. Diastereomers는 Kromasil cyano column (4.6 mm x 250 mm)상의 HPLC에 의해 분리되고, 1 mL/min의 플로우 arte에 의해 isocratic를 사용하여, hexane: ethyl acetate:2-propanol (68:24:8, v/v/v)의해 분리된다. 이러한 조건에서, the isomer 4g (S.S)는 24.5분 동안 녹인다. Mass spectrum: m/z 834.2 (M + Na)+. 다른 isomer 4h (R,S)의 정점은 34.6분에 잘 분리되어 진다. MS: m/z 834.2 (M + Na)+.
실시예 4
메이탠시노이드 4k,l의 합성 (도 3d)
S-1,3-Di-O-p-톨루엔설토닐(toluenesulfonyl)-부탄(butane) 22: 건조 피리딘 (40mL)와 드라이 톨루엔(60mL)의 혼합물이 든 S-(-)-1,3-butanediol (21,2.00 g (22.22 mmol) 용액은 0도씨의 아르곤에서 p-toluenesulfonyl chloride (12.70 g, 66.84 mmol)에 의해 처리된다. 5분간 0도 씨에서 저어준 후, 상온에서 2시간 동안 저어주고, 진공상태에서 증발된다. 잔여물은 ethyl acetate에 의해서 재용해되고, 0.1 M NaHCO3 과 적신 NaCl 수용액에 의해 세척된다. 유기층은 분리되고, MgSO4에서 건조되고, 여과되고 증발한다. 잔여물은 실리카겔의 크로마토그래피에 의해 정화되고, 타이틀 생산품 22 Rf = 0.40 (1:1 EtOAc/hexane)의 6.25 g (71%)를 주기 위해 1:2 에틸 아세테이트/핵산을 녹인다. ; 1H NMR (CDCl3) 7.76 (dd, 4H, J = 1.0, 8.0 Hz), 7.35 (dt, 4H, J = 0.4, 8.0 +8.0 Hz), 4.70 (m, 1H), 4.03 (m, 1H), 3.94 (m, 1H), 2.46 (s, 6H), 1.92 (m, 2H), 1.26 (d, 3H, J = 6.3 Hz); 13C NMR 145.17, 133.00, 130.11, 128.12, 127.91, 76.28, 66.21, 36.08, 21.86, 21.06; MS: 420.99 (M + Na)+.
R-4-O-Ethylxanthic-pentanenitrile (23): 60 dry DMSO (50mL)안에 S-1,3-di-O-p-toluenesulfonyl-butane (22, 6.25 g (15.70 mmol)의 용액을 NaCN (0.85 g)과 함께 처리한다. 반응 혼합물은 RT에서 18시간동안 아르곤상태에서 휘저어준다. 반응 혼합물은 ethyl acetate에 희석되고, 차가운 1.0 M의 NaH2PO4 pH 7.5의 물 과, 1.0 M 의 NaH2PO4 pH 4.0에 의해 순차적으로 세척된다. 유기층은, 3.62g 의 천연 S-3-O-p-toluenesulfonyl-pentanenitrile을 주기 위해 MgSO4상에서 건조되고, 여과되고 증발한다. 생산품은 추가적인 정제 없이 바로 사용된다.
에탄올(50mL)안에 천연 S-3-O-p-toluenesulfonyl-pentanenitrile(3.62g)용액에서 , 에탄올(100mL)안의 potassium O-ethylxanthate (5.72 g)가 더해진다. 밤새 아르곤 상태에서 저어주고, 그 혼합물은 응집되고, 에틸 아세테이트에 의해 희석되고, 실리카겔의 작은 기둥을 통하여 여과된다. 용리액은 농축되고 그리고 잔여물은 실리카겔의 크로마토그래피를 통해서 정화되고, 타이틀 생산품 23의 2.0g (62%, 2steps)을 만들기 위해 1:4 EtOAc/hexane을 녹여서 분리한다. Rf = 0.40 (1:4 EtAc/hexane). 1H NMR (CDCl3) 4.67 (dd, 2H, J = 7.1, 14.2 Hz), 3.86 (ddd, 1H, J = 7.0, 14.0, 21.9 Hz), 2.50 (t, 2H J = 7.3 + 7.6 Hz), 2.06 (m, 2H), 1.44 (m, 6H); 13C NMR 213.04, 119.16, 70.28, 44.57, 32.10, 20.20, 15.21, 13.93; MS: 226.51 (M + Na) +, 242.51 (M + K) +.
R-(-)-4-Methyldithio-pentanoic acid (24): ethanol(10mL)과 200ml의 물의 혼합물에 R-4-O-Ethylxanthic-pentanenitrile (23, 2.0g, 9.85mmol)의 용액이 NaOH(6.0g)에 처리된다. 반응 혼합물은 아르곤에서 환류된다. 혼합물은 물(150ml)에 의해서 희석되고 1:1 EtOAc/hexane (2x100ml)에서 추출된다. 수액층은 pH 2.5 ~ 3.0의 H3PO4에서 산화되고 EtAc (6x75ml)에서 추출된다. 유기층은 결합되고, MgSO4에서 건조되고, 건조되면서 여과와 증발을 거쳐서 천연 R-4-mercaptopentanoic 산을 만든다. 이러한 천연 물질은 다른 정제과정없이 바로 다음 단계에 사용된다.
Ethanol(50mL)과 0.5 M NaH2PO4, pH 7.0 (75 mL)에 1.60g 의 천연 R-4-mercaptopentanoic 산 용액에, 0도씨에서 45분 넘게 dry THF (7mL)에서 dropwise methyl methanethiolsulfonate (1.96 g, 15.53 mmol)를 부가한다. 0도씨의 아르곤상태에서 30분간 저어주고, 혼합물은 실온에서 2시간 동안 저어준다. 혼합물은 응집되고 dichloromethane(2x50ml)과 추출된다. 수액층은 TH3PO4와 함께 pH 2.5 ~ 3.0 에서 산화되고 EtOAc(4x100ml)와 함께 추출된다. 유기층은 결합되고, MgSO4에서 건조되고, 여과되고 증발한다. 잔여물은 실리카 겔 위에서 크로마토그래피에 의해서 정제되고, 타이틀 생산품 24 인 Rf = 0.32 (1:100:400 HOAc/EtOAc/hexane)의 1.65 g (93%)를 주기 위해 1:100:400 HOAc/EtOAc/hexane와 같이 녹여 분리한다.; 1H NMR (CDCl3) 2.91 (ddd, 1H, J = 6.8, 13.7, 20.4 Hz), 2.53 (t, 2H, J = 7.7 + 7.4 Hz), 2.42 (s, 3H), 1.96 (m, 2H), 1.36 (d, 3H, J = 6.8 Hz); 13C NMR 179.46, 45.67, 31.91, 31.07, 25.02, 21.36; MS: 202.9 (M+Na)+, 203.9 (M+1+Na)+; [a] = -39.16 (c = 2, CH3OH).
N-methyl-N-[4-(R)-methyldithio-1-oxopentyl]-S-alanine (15b): R-(+)-4-Methyldithio-pentanoic 산(24)은 사기의 화합물 14에 의해 기술된 방법에 의하여 N-hydroxysuccinimdyl ester 25로 변환된다. 15b를 주기 위한 화합물 15를 위한 상기 기술된 절차에 의해 N-methyl-L-alanine 반응이 일어난다. MS: m/z (M + Na): calc.: 288.1, found: 288.1
N 2'deacetyl-N2'-(4-(R)-methyldithio-1-oxopentyl)maytansine(DM3-SMe, 4k,l): 메이탠시놀(11)은 15b에 의해 두 배가 되고, 이 때 4c의 합성을 위하여 상기 기술된 디클로로메탄의 DCC와 zinc chloride를 사용한다. N-methyl-S-alanyl moiety (4k, S,R)를 포함하는 2개의 diastereomers의 혼합물과 N-methyl-R-alanyl moiety (4l,R,R)가 획득된다. Diastereomers는 Kromasil cyano column (4.6 mm x 250 mm)상의 HLPC에 의해 분리되고, 1mL/min의 플로우 arte에 의해 isocratic을 사용하여, hexane: ethyl acetate:2-propanol (68:24:8, v/v/v)의해 분리된다. 이러한 조건에서, the isomer 4g (S.R)는 23.9분 동안 녹인다. Mass spectrum: m/z 834.2 (M + Na)+. 다른 isomer 4l (R,R)의 정점은 33.7분에 잘 분리되어 녹는다 MS: m/z 834.2 (M + Na)+.
실시예 5a
실험실 밖에서 메이탠시노이드의 세포독성과 항체-메이탠시노이드 결합
KB(ATCC CCI17)세포 라인은 인간 상피(epithelial)의 기원이다. SK-BR-3(ATCC HTB-30)세포라인은 인간 가슴 선암으로부터 확립되었다. 인간 결장 종양 세포라인 COLO205(ATCC CCL-222)과 HT-29(ATCC HTB 38), 인간 meyloid leukemia 세포라인 HL-60(ATCC CCL-240)는 모두 ATCC, Maryland 로부터 획득된다. 세포라인은 L-glutamine 보충된 10%의 fetal bovine serum(Hyclone,Logan,Utah)와 50㎍/mL gentamycin sulfate(Life Technologies, Rockville, MD)와 같이 Dulbecco의 변경된 Eagle Medium에서 자란다.
세포독성에 관한 연구는 clonogenic assay을 이용하여 행해진다. 테스트 세포라인은 well당 불변하는 1000개의 수를 6-well 배양 접시에 놓는다. 세포는 72시간 동안 다양한 메이탠시노이드(자유로이 또는 항체에 결합하여)의 다양한 응집(0부터 3nM)에서 배양된다. 중간의 것이 그러면 플레이트에서 수거하여 새로운 신선한 것으로 치환된된다. 배양균은 플레이팅 후에 7-10일간 성장하고, 집단을 형성하도록 한다. 배양균은 10% formalin/PBS의 0.2% crystal violet에 고정되고 stained 되면 집단을 형성한다. 비-처리세포(중간 것만)의 플레이팅 효율은 세포플레이트의 개수에 의해서 집단의 수가 분리되느냐에 따라 결정된다. 약제에 노출된 살아남은 세포의 분류는 컨트롤 well에 집단의 수에 의한 약제에 의해 노출된 well의 집단 수에 의해 분리된 것에 결정된다.
실험실 밖에서의 본 발명의 새로운 메이탠시노이드의 세포독성의 측정은 도 4에 나타나 있다. 억제된 이황화 결합을 포함하는 새로운 메이탠시노이드 4c,e는 7 x 10-12 M 부터 2.5 x 10-11 M 까지의 IC50 밸류범위와 함께 세포라인 SK-BR-3 과 A-375 모두의 테스트에서 매우 세포독성이 매우 높다. 따라서, 이황화 moiety를 포함하는 탄소의 알킬 치환기의 결합은 높은 세포독성 능력을 보존하고 있다. 본 발명의 입체적이게 억제된 티올-메이탠시노이드 4a는 억제되지 않은 이전에 기술한 메이탠시노이드보다 30에서 50배 더 강력하다. 따라서 티올 moiety를 포함하는 탄소 원자의 알킬 치환기의 결합은 힘이 매우 증대되었다.
본 발명의 메이탠시노이드의 항체결합의 실험실 밖에서의 테스트는 도 4c와 4d에 나타나 있다. 두 개의 메이탠시노이드 4a 또는 4b의 결합은, 인간 콜론 종양에 직접적으로 대응하는 huC242 항체에서, 표적세포에 대한 항원-특정 킬링의 결과가 나타난다. 따라서, 결합은 1.1부터 1.3 x 10-11M 까지의 IC50 밸류의 항원-ㅇ양성 C0LO 205 세포에 매우 강력하다. 이와 반대로, 결합은 항원-음성 A-375 세포에 대하여 100내지 200배 세포독성이 덜하고, 본 발명의 새로운 메이탠시노이드는 입체적으로 억제된 이황화결합을 소유하는 결합을 생산하고, 높은 표적 구체적 세포 독성을 보여준다.
실시예 5b
메이탠시노이드 4a 또는 4b를 이용하여(방법 A, 도. 5 a,b) huC242 항체의 세포독성 결합의 준비
수액층 완충액(50 mM potassium phosphate, 50 mM sodium chloride, 2 mM ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt)에 pH6.5의 huC242 antibody(8mg/mL)의 용액에, 2시간동안 SPDP[succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionate,3a),또는 N-succinimidyl-4-(2-pyridyldithio)butanoate (SPDB,3b)의 7내지 10배 molar excess에서 배양된다. 반응 혼합물은 Sephadex G25 gel filtration column을 통과하면서 정제된다. 항체의 응집은 항체 e280nm = 217,560 M-1cm-1 에 상호 효과적인 사멸로 알려진 것을 이용한 분광광도계의 의해 결정된다.
변경된 항체는 수액 완충의 2.5 mg/mL (50 mM potassium phosphate, 50 mM sodium chloride, 2 mM ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt), pH 6.5에서 희석되고, 그리고 dimethylacetamide DM3나 DM4 중에서 1.5 에서 2.5 molar excess(final concentration of DMA was 3% v/v)으로 처리된다. 반응 혼합물은 18시간동안 실온에서 배양된다. 반응 혼합물은 Sephadex G25 gel filtration column 을 통과하면서 정제된다. 항체의 응집은 항체 e280nm = 217,560 M-1cm- and e252nm = 80,062 M-1cm-1; for DM3 or DM4, e280nm = 5,700 M-1cm-1 와 e252nM = 26,790 M-1cm-1 에 상호 효과적인 사멸로 알려진 것을 이용한 분광광도계의 의해 결정된다. 결과적인 결합은 단량체와, 평균적으로, 항체 분자당 링크된, 3.2-3.5 DM3 or DM4 분자가 포함된다.
실시예 5c
메이탠시노이드 4a 또는 4b(방법 B, 도. 5c)를 이용한 huC242 항체의 세포독성의 준비
수액층 완충액(50 mM potassium phosphate, 50 mM sodium chloride, 2 mM ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt)에 pH 6.5의 huC242 antibody(8mg/mL)의 용액에, 2시간 동안 SMCC[succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)-cyclohexane-1-carboxylate, 26)의 7내지 10배 molar excess에서 배양된다. 반응 혼합물은 Sephadex G25 gel filtration column을 통과하면서 정제된다. 항체의 응집은 항체 e280nm = 217,560 M-1cm-1 에 상호 효과적인 사멸로 알려진 것을 이용한 분광광도계의 의해 결정된다.
변경된 항체는 수액 완충의 2.5 mg/mL (50 mM potassium phosphate, 50 mM sodium chloride, 2 mM ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt), pH 6.5 에서 희석되고, 그리고 dimethylacetamide DM3나 DM4 중에서 1.5 에서 2.5 molar excess(final concentration of DMA was 3% v/v)으로 처리된다. 반응 혼합물은 18시간 동안 실온에서 배양된다. 반응 혼합물은 Sephadex G25 gel filtration column을 통과하면서 정제된다. 항체의 응집은 항체 e280nm = 217,560 M-1cm- and e252nm = 80,062 M-1cm-1; for DM3 or DM4, e280nm = 5,700 M-1cm-1 와 e252nM = 26,790 M-1cm-1 에 상호 효과적인 사멸로 알려진 것을 이용한 분광광도계의 의해 결정된다. 결과적인 결합은 단량체와, 평균적으로, 항체 분자당 링크된, 3.2-3.5 DM3 or DM4 분자가 포함된다.
실시예 5d
메이탠시노이드 4a 또는 4b를 사용한 huC242 항체의 세포독성 물질의 제조(방법 C, 도 5d)
pH 6.5 의 수용액 버퍼(50mM 포타슘 포스페이트, 50mM 염화나트륨, 2mM 에틸렌디아민테트라아세틱 산 디소디움 염)에서 huC242 항체(8 mg/ml) 용액은 7 내지 10배의 과도한 몰의 SIAB[N-석시니미딜(4-이오도아세틸)아미노벤조에이트] 와 함께 2시간동안 인큐베이트된다. 반응 혼합물은 세파덱스 G25 겔 여과 기둥을 통한 컬럼통로에 의해 정제된다. 항체의 농도는 항체 ε280nm=217,560 M-1cm-1에 대한 소멸 계수로서 알려져 있는 것을 분광광도적으로 사용하여 결정된다.
실시예 6
비보(vivo)에서 HT-29 제노그래프트에 대한 huC242-메이탠시노이드 물질의 효율성
HT-29 인간 결장 암 세포(1.5×106 세포수/쥐)를 가진 5주된 암컷 SCID 쥐(20마리)가 0.1mL 혈청 없는 환경에서 오른쪽 옆구리 살에 피하주사가 접종되었다. 종양은 11일 동안 성장했으며 평균 크기는 100㎣ 가 된다. 쥐는 랜덤하게 네 족으로 나누어진다(족당 5마리). 첫번째 그룹은 huC242-DM1 물질이 정맥내로 받아들여졌다(DM1 복용량 75㎍/kg, qd×5). 두번째 그룹은 huC242-DM3 물질이 정맥내로 받아들여졌다(DM3 복용량 75㎍/kg, qd×5). 세번째 그룹은 huC242-DM4 물질이 정맥내로 받아들여졌으며(DM4 복용량 75㎍/kg, qd×5), 반면에 네번째 그룹은 1-3 족에서 같은 치료 스케줄을 사용하여 PBS를 받아들였으며, 대조군으로서 사용된다.
종양의 크기는 주마다 2번씩 측정되었고 종양 부피는 식에 의해 계산되었다: 종양 부피=1/2(길이×넓이×높이). 쥐의 무게는 또한 주마다 2번씩 측정되었다. 그 결과는 도 7에 나타나 있다. 대조군 쥐의 종량은 거의 35일 동안 1000㎣ 크기로 자랐다. huC242-DM1 을 사용한 치료는 18일 동안 종양의 성장을 늦추는 결과를 가져왔으나, 반면에 본 발명에 의한 메이탠시노이드 4a 와 4b로 만들어지는 물질은 중요하게 더욱 효능이 있고 종양 성장을 더욱 늘려 28일과 36일로 각각 늦추는 결과를 가져왔다.
실시예 7
비보(vivo)에서 COLO 205 제노그래프트에 대한 huC242-메이탠시노이드 물질의 효율성
COLO 205 인간 결장 암 세포(1.5×106 세포수/쥐)를 가진 5주된 암컷 SCID 쥐(20마리)가 0.1mL 혈청 없는 환경에서 오른쪽 옆구리 살에 피하주사가 접종되었다. 종양은 11일 동안 성장했으며 평균 크기는 100㎣ 가 된다. 쥐는 랜덤하게 네 족으로 나누어진다(족당 5마리). 첫번째 그룹은 huC242-DM1 물질이 정맥내로 받아들여졌다(DM1 복용량 75㎍/kg, qd×5). 두번째 그룹은 huC242-DM3 물질이 정맥내로 받아들여졌다(DM3 복용량 75㎍/kg, qd×5). 세번째 그룹은 huC242-DM4 물질이 정맥내로 받아들여졌으며(DM4 복용량 75㎍/kg, qd×5), 반면에 네번째 그룹은 1-3 족에서 같은 치료 스케줄을 사용하여 PBS를 받아들였으며, 대조군으로서 사용된다.
종양의 크기는 주마다 2번씩 측정되었고 종양 부피는 식에 의해 계산되었다: 종양 부피=1/2(길이×넓이×높이). 쥐의 무게는 또한 주마다 2번씩 측정되었다. 그 결과는 도 8에 나타나 있다. 대조군 쥐의 종양은 거의 24일 동안 900㎣ 크기로 자랐다. huC242-DM1 을 사용한 치료는 20일 동안 종양의 성장을 늦추는 결과를 가져왔으나, 반면에 본 발명에 의한 메이탠시노이드 4a는 더욱 더 효능이 좋고 완벽한 종양 퇴화를 가져오며 45일을 지속시켰다. 본 발명에 의한 메이탠시노이드 4b로 만들어지는 물질은 중요하게 더욱 효능이 있고 치료된 쥐의 치료를 가져왔다.
실시예 8
비보(vivo)에서 HL-60 제노그래프트에 대한 MY9-6-메이탠시노이드 물질의 효율성
HL-60 인간 결장 암 세포(1.5×106 세포수/쥐)를 가진 5주된 암컷 SCID 쥐(20마리)가 0.1mL 혈청 없는 환경에서 오른쪽 옆구리 살에 피하주사가 접종되었다. 종양은 12일 동안 성장했으며 평균 크기는 100㎣ 가 된다. 쥐는 랜덤하게 네 족으로 나누어진다(족당 5마리). 첫번째 그룹은 MY9-6-DM1 물질이 정맥내로 받아들여졌다(DM1 복용량 200㎍/kg, qd×5). 두번째 그룹은 MY9-6-DM3 물질이 정맥내로 받아들여졌다(DM3 복용량 200㎍/kg, qd×5). 세번째 그룹은 MY9-6-DM4 물질이 정맥내로 받아들여졌으며(DM4 복용량 200㎍/kg, qd×5), 반면에 네번째 그룹은 1-3 족에서 같은 치료 스케줄을 사용하여 PBS를 받아들였으며, 대조군으로서 사용된다.
종양의 크기는 주마다 2번씩 측정되었고 종양 부피는 식에 의해 계산되었다: 종양 부피=1/2(길이×넓이×높이). 쥐의 무게는 또한 주마다 2번씩 측정되었다. 그 결과는 도 9에 나타나 있다. 대조군 쥐의 종양은 거의 21일 동안 1600㎣ 크기로 자랐다. MY9-6-DM1 을 사용한 치료는 5일 동안 종양의 성장을 늦추는 결과를 가져왔으나, 반면에 본 발명에 의한 메이탠시노이드 4a 와 4b로 만들어지는 물질은 중요하게 더욱 효능이 있고 종양 성장을 더욱 늘려 20일 이상으로 늦추는 결과를 가져왔다.
실시예 9
메이탠시노이드 DM4(4b)를 사용한 huMy9-6 항체의 세포독성 물질의 제조.
pH 6.5 의 50mM 포타슘 포스페이트 버퍼, 5% 에탄올을 가진 2mM 에틸렌디아민테트라아세틱 산(버퍼 A)을 포함하는 huMy9-6 항체 8 mg/mL 용액은 6.5 과도한 몰의 SSNPB[설포석시니미딜4-(5'-니트로-2'피리딜디씨오)부티레이트] 과 함께 2시간동안 인큐베이트된다. 수정된 항체는 버퍼 A와 280nm에서 분광광도적으로 사용하여 결정되는 항체를 위한 소멸 계수로서 정제된 항체 농도 사이에서 평형을 이루는 세파덱스 G25 겔 여과 기둥을 통과하는 통로에 의해 정제된다.
수정된 항체는 버퍼 A와 18시간동안 상온에서 1.7배 과도한 몰 디메틸아세트아미드(디메틸아세트아미드의 최종농도는 3% v/v)에서 저장 용액으로 반응 혼합물로 추가되는 DM4로 인큐베이트되고, 4.9mg/mL로 증류된다.
항체-약 물질은 pH6.5, PBS에서 평형을 이루는 세파덱스 G25를 통과하는 통로에 의해 정제된다. 상기 물질의 농도는 항체와 DM4의 소멸 계수로 알려져서 사용되면서 분광광도적으로 결정된다.(항체의 경우, ε280nm=206,460 M-1cm-1 , ε252nm=72,261 M-1cm-1 ;DM4의 경우, ε280nm=5,700 M-1cm-1 , ε252nm=26,790 M-1cm-1 )
결과로서 나오는 항체-약 물질은 항체 분자당 평균적으로 3.6 DM4 몰을 포함한다. 생화학적 분석은 항체가 따라오는 94% 모노메릭(monomeric) 물질 이상으로 남아있고 흐름 세포형태학에 의해 결정되는 변형되지 않은 항체에 비교되는 결합 친화도를 가진다. 항체와 결합되는 약의 양은 공유결합적으로(free drug) 결합되지 않고, HPLC 분석을 통해 결정되며 전체 결합된 약 1%미만으로 발견된다.
실시예 10
비트로에서 huMy9-6-DM4 물질의 선택성과 효율성
CD33에 대해 세포(HL-60)와 CD33-네거티브 나말와 세포를 표현하는 hyMy9-6-DM4 의 세포독성은 클론을 형성하는 분석표를 사용하여 테스트되었으며, 세포 소멸 능력은 따라오는 치료로 성장할 수 있는 콜로니의 수를 셈으로써 결정된다. hyMy9-6-DM4는 비트로(vitro)에 있는 CD33-포지티브 HL-60 인간 종양 세포에 대해 능력있는 세포 소멸 능력을 보여준다(도10). CD33-네거티브 인간 나말와 세포에 대한 강력한 독성은 없는 것이 관찰되었고, 이는 CD33-의존하는 세포독성이 항-CD33 항체, huMy9-6 물질에 의해 특정한 목적에 예정되어 있다는 것을 알려준다.
실시예 11
비보(vivo)에서 HL60 인간 종양 제로그래프트에 대한 SCID 쥐에 있어서 huMy9-6-DM4 물질의 효율성
비보(vivo)에서 huMy9-6-DM4의 효율성은 HL-60 종양 제노그래프트를 가지는 SCID 쥐에서 결정된다. HL-60 세포는 피하주사로 주입되고, 종양은 평균 100㎣ 의 크기 로 성장하는 것이 허락된다. HuMy9-6-DM4 물질은 도 11에서 나타난 복용량으로서 하루에 한번씩 5일 동안 운반된다. 복용량은 물질에서 ㎍ DM4로 표현되며, DM4의 ㎍ 당 대략 67㎍의 항체 복용량에 대응된다. 종양 부피는 치료 효율성의 지표로서 측정되고, 쥐 몸 무게는 치료때문에 독성을 나타내는 데 표시된다. hyMy9-6-DM4는 거의 독성을 일으키지 않는 복용량에서 인간 HL-60 세포 제토그래프트의 늘어난 종양 성장 늦춤을 유도한다(도11). huMy9-6-DM4의 효율성은 또한 huMy9-6-DM1에 비교된다. 의외로, huMy9-6-DM4는 huMy9-6-DM1보다 더욱 효과적이다는 것이 발견되었습니다. HuMy9-6-DM4는 거의 60년 동안 완벽한 완화(CR)를 쥐에서 유지하였으며, 반면에 huMy9-6-DM1로 치료된 쥐는 약 CR에서 20일 후에 재발되었다.
실시예 12
메이탠시노이드 DM4(4b)를 이용한 huB4 항체의 세포독성 물질 제조
pH 6.5 의 50mM 포타슘 포스페이트 버퍼, 5% 에탄올을 가진 2mM 에틸렌디아민테트라아세틱 산(버퍼 A)을 포함하는 huMy9-6 항체 20 mg/mL 용액은 8배 과도한 몰의 SSNPB[설포석시니미딜4-(5'-니트로-2'피리딜디씨오)부티레이트] 와 함께 1.5시간동안 인큐베이트된다. 수정된 항체는 버퍼 A와 280nm(199,560M-1cm-1 )에서 분광광도적으로 사용하여 결정되는 항체를 위한 소멸 계수로서 정제된 항체 농도 사이에서 평형을 이루는 세파덱스 G25 겔 여과 기둥을 통과하는 통로에 의해 정제된다.
수정된 항체는 버퍼 A와 3시간동안 대기온도에서 1.7배 과도한 몰 디메틸아 세트아미드(디메틸아세트아미드의 최종농도는 3% v/v)에서 저장 용액으로 반응 혼합물로 추가되는 DM4로 인큐베이트되고, 8mg/mL로 증류된다.
항체-약 물질은 pH6.5, PBS 버퍼에서 평형을 이루는 세파덱스 G25와 세파덱스 S300을 통과하는 통로에 의해 정제된다. 상기 물질의 농도는 항체의(ε280nm:199,560 M-1cm-1 , ε252nm=67,850 M-1cm-1 ) DM4의 (ε280nm=5,700 M-1cm-1 , ε252nm=26,790 M-1cm-1 ) 소멸 계수로 알려져 사용되면서 분광광도적으로 결정된다.
결과로서 나오는 항체-약 물질은 항체 분자당 평균적으로 4.0 DM4 몰을 포함한다. 생화학적 분석은 항체가 따라오는 98% 모노메릭(monomeric) 물질 이상으로 남아있고 흐름 세포형태학에 의해 결정되는 변형되지 않은 항체에 비교되는 결합 친화도를 가진다. 항체와 결합되는 약의 양은 공유결합적으로(free drug) 결합되지 않고, HPLC 분석을 통해 결정되며 전체 결합된 약 2%로 발견된다.
실시예 13
비트로(vitro)에서 huB4-DM4 물질의 효율성
CD19-네거티브 세포 라인(Colo 205)와 비교되는 CD10-표현하는 세포(Ramos)에 대한 huB4-DM4의 세포독성은 MTT-기초한 분석표를 사용하여 테스트되었으며, 세포 소멸 능력은 따라오는 치료로 성장할 수 있는 세포의 수를 셈으로써 결정된다. 성장할 수 있는 세포 수는 따라오는 필수적인 색조 MTT를 가진 세포 잠복기의 분광 광도적인 셈을 통해 측정되었다.
HuB4-DM4는 비트로(vitro)에 있는 CD19-포지티브 Ramos 인간 종양 세포에 대해 능력있는 세포 소멸 능력을 보여준다(도12). CD19-네거티브 세포에 대한 강력한 독성은 없는 것이 관찰되었고, 이는 CD19-의존하는 세포독성이 항-CD19 항체, huB4에 의해 특정한 목적에 예정되어 있다는 것을 알려준다.
실시예 14
비보(vivo)에서 SCID 쥐에 있어서 Ramos 인간 종양 제노그래프트에 대한 huB4-DM4 물질의 효율성
비보(vivo)에서 huB-DM4의 효율성은 Ramos 종양 제노그래프트를 가지는 SCID 쥐에서 결정된다. Ramos 세포는 피하주사로 주입되고, 종양은 평균 100㎣ 의 크기로 성장하는 것이 허락된다. HuB4-DM4 물질은 도 13a에서 나타난 복용량으로서 한번의 주사로 운반된다. 복용량은 물질에서 ㎍ DM4로 표현되며, DM4의 ㎍ 당 대략 44㎍의 항체 복용량에 대응된다. 종양 부피는 치료 효율성의 지표로서 측정되고, 쥐 몸 무게는 치료때문에 독성을 나타내는 데 표시된다. 50㎍/kg 이상의 복용량에서, HuB4-DM4는 모든 쥐에서 종양의 완벽한 퇴화를 야기한다. 셀 수 있는 질병 없이 쥐는 100 mg/kg 치료 족으로 약 35일 동안 남아 있으며, 55일 이상은 두개의 가장 높은 복용 족에서 남아 있는다. 이러한 치료는 어떠한 독성도 남기지 않으며(도13b) 치료된 쥐의 몸 무게에서 변화로 판단된다.

Claims (131)

  1. C-3, C-14 히드록시메틸, C-15 히드록시, 또는 C-20 데스메틸의 위치에서, 방해받는 설프히드릴족을 가진 아실족을 갖는 아실화된 아미노산 측쇄를 가지며, 여기서 티올기를 갖는 아실족의 탄소원자는 1 또는 2개의 치환기를 가지며, 상기 치환기는 CH3, C2H5 , 1 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 선형 알킬 또는 알케닐, 3 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 가지형 또는 사이클로 알킬 또는 알케닐, 페닐, 치환된 페닐, 또는 헤테로사이클로 방향족화합물 또는 헤테로싸이클로 라디칼이며, 이외에도 상기 치환기의 하나는 H가 될 수 있으며, 상기 아실 족은 카르보닐기와 황원자 사이에 적어도 3개의 탄소 원자의 선형 체인 길이를 갖는 것을 특징으로하는 메이탠시노이드.
  2. Figure 112005066719031-PCT00032
    4′
    여기서, Y′는
    (CR7CR8)1(CR9=CR10)p(C≡C)qAr(CR5CR6)mDu(CR11=CR12)r(C≡C)sBt(CR3CR4)uCR1R2SZ이고, 또한 상기 R1과 R2는 각각 독립적으로 CH3, C2H5 , 1 내지 10개의 탄소원자를 가지는 선형 알킬 또는 알케닐, 3 내지 10개의 탄소원자를 가지는 가지형 또는 싸이클로 알킬 또는 알케닐, 페닐, 치환된 페닐 또는 헤테로싸이클로 방향족화합물 또는 헤테로사이클로알킬 라디칼, 이외에도 R2는 H 일 수 있으며;
    A, B, D는 3 내지 10개의 탄소원자를 가지는 싸이클로알킬 또는 싸이클로알케닐, 단순 또는 치환된 아릴 또는 헤테로싸이클로 방향족화합물 또는 헤테로사이클로알킬 라디칼;
    R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R11 그리고 R12는 각각 독립적으로 H, CH3, C2H5, 1 내지 10개의 탄소원자를 가지는 선형 알킬 또는 알케닐, 3 내지 10개 탄소원자를 가지는 가지형 또는 싸이클로 알킬 또는 알케닐, 페닐, 치환된 페닐 또는 헤테로싸이클로 방향족화합물 또는 헤테로사이클로알킬 라디칼;
    l, m, n, o, p, q, r, s, 그리고 t는 각각 독립적으로 0 또는 1부터 5까지의 정수이고, l, m, n, o, p, q, r, s, t중 적어도 2개는 어느 때에도 0은 아니며,
    Z는 H, SR 또는 -COR이며, 상기 R은 1 내지 10개의 탄소원자를 가지는 선형 알킬 또는 알케닐, 3 내지 10개의 탄소원자를 가지는 가지형 또는 싸이클로 알킬 또는 알케닐, 단순한 또는 치환된 아릴 또는 헤테로싸이클로 방향족화합물 또는 헤테로사이클로알킬 라디칼인 화학식 4' 으로 표현되는 화합물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 R1은 H, R2는 메틸이고 Z는 H인 화합물.
  4. 제2항에 있어서, 상기 R1과 R2는 메틸이고 Z는 H인 화합물.
  5. 제2항에 있어서, 상기 R1은 H, R2는 메틸이고 Z는 -SCH₃인 화합물.
  6. 제2항에 있어서, 상기 -SCH₃인 화합물.R1, R2는 메틸이고 Z는 -SCH₃인 화합물.
  7. Figure 112005066719031-PCT00033
    L D L,D
    (I)
    상기 Y는 (CR7CR8)1(CR5CR6)m(CR3CR4)nCR1R2SZ이고, 또한 상기 R1과 R2는 각각 독립적으로 CH3, C2H5 , 1 내지 10개의 탄소원자를 가지는 선형 알킬 또는 알케닐, 3 내지 10개의 탄소원자를 가지는 가지형 또는 싸이클로 알킬 또는 알케닐, 페닐, 치 환된 페닐 또는 헤테로싸이클로 방향족화합물 또는 헤테로사이클로알킬 라디칼, 이외에도 R2는 H 일 수 있으며;
    R3, R4, R5, R6, R7 그리고 R8는 각각 독립적으로 H, CH3, C2H5, 1 내지 10개의 탄소원자를 가지는 선형 알킬 또는 알케닐, 3 내지 10개 탄소원자를 가지는 가지형 또는 싸이클로 알킬 또는 알케닐, 페닐, 치환된 페닐 또는 헤테로싸이클로 방향족화합물 또는 헤테로사이클로알킬 라디칼;
    May는 C-3, C-14 히드록실메틸, C-15 히드록시 또는 C-20 디스메틸의 위치에서 측쇄(side chain)를 가지는 메이탠시노이드인 화학식(I-L), (I-D), 또는 (I-D,L)으로 표현되는 화합물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 R1는 H, R2는 메틸, R5, R6, R7과 R8는 H, l과 m은 각각 1, n은 0, Z는 H인 화합물.
  9. 제7항에 있어서, 상기 R1과 R2는 메틸, R5, R6, R7과 R8는 각각 H, l과 m은 각각 1, n은 0, Z는 H인 화합물.
  10. 제7항에 있어서, 상기 R1은 H, R2는 메틸, R5, R6, R7과 R8는 각각 H, l과 m은 각각 1, n은 0, Z는 -SCH₃인 화합물.
  11. 제7항에 있어서, 상기 R1과 R2는 메틸, R5, R6, R7, R8는 각각 H, l과 m은 각각 1, n은 0, Z는 -SCH₃인 화합물.
  12. 제11항 또는 제12항에 있어서, 식 (I-L)로 표현되는 화합물.
  13. Figure 112005066719031-PCT00034
    4
    상기 Y는 (CR7CR8)1(CR5CR6)m(CR3CR4)nCR1R2SZ이고, 또한 상기 R1과 R2는 각각 독립적으로 CH3, C2H5 , 1 내지 10개의 탄소원자를 가지는 선형 알킬 또는 알케닐, 3 내지 10개의 탄소원자를 가지는 가지형 또는 싸이클로 알킬 또는 알케닐, 페닐, 치환된 페닐 또는 헤테로싸이클로 방향족화합물 또는 헤테로사이클로알킬 라디칼, 이외에도 R2는 H 일 수 있으며;
    R3, R4, R5, R6, R7 그리고 R8는 각각 독립적으로 H, CH3, C2H5, 1 내지 10개의 탄소원자를 가지는 선형 알킬 또는 알케닐, 3 내지 10개 탄소원자를 가지는 가지형 또는 싸이클로 알킬 또는 알케닐, 페닐, 치환된 페닐 또는 헤테로싸이클로 방향족화합물 또는 헤테로사이클로알킬 라디칼;
    l, m, n은 각각 독립적으로 1부터 5까지의 정수이며, 이외에도 n은 0일 수 있고;
    Z는 H, SR 또는 -COR이며, 상기 R은 1 내지 10개의 탄소원자를 가지는 선형 알킬 또는 알케닐, 3 내지 10개의 탄소원자를 가지는 가지형 또는 싸이클로 알킬 또는 알케닐, 단순한 또는 치환된 아릴 또는 헤테로싸이클로 방향족화합물 또는 헤테로사이클로알킬 라디칼인 화학식 4로 표현되는 화합물.
  14. 제13항에 있어서, R1은 H, R2는 메틸, R5, R6, R7과 R8는 각각 H, l과 m은 1, n은 0, Z는 H인 화합물.
  15. 제13항에 있어서, 상기 R1과 R2는 메틸, R5, R6, R7과 R8는 각각 H, l과 m은 1, n은 0, Z는 H인 화합물.
  16. 제13항에 있어서, 상기 R1은 H, R2는 메틸, R5, R6, R7과 R8는 각각 H, l과 m은 1, n은 0, Z는 -SCH₃인 화합물.
  17. 제13항에 있어서, 상기 R1과 R2는 메틸, R5, R6, R7과 R8는 각각 H, l과 m은 1, n은 0, Z는 -SCH₃인 화합물.
  18. 메이탠시노이드의 C-3, C-14 히드록시메틸, C-15 히드록시 또는 C-20 데스메틸에서 발견되는 아실화된 아미노산 측쇄의 아실 족에 존재하는 티올 또는 이황화물기를 사용하는 메이탠시노이드에 연결되며, 상기 아실화된 아미노산 측쇄의 아실족은 하나 또는 두 개의 치환기를 가지는 탄소원자에 위치된 티올 또는 이황화물기 를 가지며, 상기 치환기는 CH3, C2H5, 1 내지 10개의 탄소원자를 가지는 선형 알킬 또는 알케닐, 가지형 또는 3 내지 10개의 탄소원자를 가지는 싸이클로 알킬 또는 알케닐, 페닐, 치환된 페닐 또는 헤테로싸이클로 방향족화합물 또는 헤테로사이클로알킬 라디칼, 이와에도 상기 치환기은 H일 수 있으며, 상기 아실족은 카르보닐기와 황원자 사이에 적어도 세 개의 탄소원자의 선형 체인 길이를 가지는, 세포결합물질에 연결되는 최소한 하나의 메이탠시노이드를 포함하는 메이탠시노이드-세포-결합 물질.
  19. 제18항에 있어서, 상기 세포-결합 물질은 적어도 하나의 항체 결합 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 메이탠시노이드-세포-결합 물질.
  20. 제19항에 있어서, 상기 항체는 MY9, 항-B4 또는 C242인 메이탠시노이드-세포 -결합 물질.
  21. 제19항에 있어서, 상기 항체는 휴머나이즈드(humanized) 또는 표면이 재처리된 MY9, 항-B4, C242인 메이탠시노이드-세포-결합 물질.
  22. Figure 112005066719031-PCT00035
    41′
    여기서 Y₁′는
    (CR7CR8)1(CR9=CR10)p(C≡C)qAr(CR5CR6)mDu(CR11=CR12)r(C≡C)sBt(CR3CR4)uCR1R2S- 이고, 또한 A, B, D는 3 내지 10의 탄소원자를 가지는 싸이클로알킬 또는 싸이클로알케닐, 단순한 또는 치환된 아릴 또는 헤테로싸이클로 방향족화합물 또는 헤테로사이클로알킬 라디칼;
    R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R11 그리고 R12는 각각 독립적으로 H, CH3, C2H5, 1 내지 10개의 탄소원자를 가지는 선형 알킬 또는 알케닐, 가지형 또는 3 내지 10 탄 소원자를 가지는 가지형 또는 싸이클로 알킬 또는 알케닐, 페닐, 치환된 페닐 또는 헤테로싸이클로 방향족화합물 또는 헤테로사이클로알킬 라디칼;
    l, m, n, o, p, q, r, s, 그리고 t는 각각 독립적으로 0 또는 1부터 5까지의 정수이고, l, m, n, o, p, q, r, s, t중 적어도 2개는 어느 때에도 0은 아니며, 식 4₁′에 의해 표현되는 메이탠시노이드를 포함하는 메이탠시노이드-세포-결합 물질.
  23. 제22항에 있어서, 상기 R1은 H, R2는 메틸인 메이탠시노이드-세포-결합 물질.
  24. 제22항에 있어서, 상기 R1과 R2는 메틸인 메이탠시노이드-세포-결합 물질.
  25. 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포-결합 물질은 적어도 하나의 항체 결합 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 메이탠시노이드-세포-결합 물질.
  26. 제25항에 있어서, 상기 항체는 MY9, 항-B4, 또는 C242인 메이탠시노이드-세포-결합 물질.
  27. 제25항에 있어서, 상기 항체는 휴머나이즈드(humanized) 또는 표면이 재처리된 MY9, 항-B4, C242인 메이탠시노이드-세포-결합 물질.
  28. Figure 112005066719031-PCT00036
    L D D, L
    (Ⅱ)
    여기서 Y₁는 (CR7CR8)1(CR5CR6)m(CR3CR4)nCR1R2S-이고, 상기 R1과 R2는 각각 독립적으로 CH3, C2H5 , 1 내지 10개의 탄소원자를 가지는 선형 알킬 또는 알케닐, 3 내지 10개의 탄소원자를 가지는 가지형 또는 싸이클로 알킬 또는 알케닐, 페닐, 치환된 페닐 또는 헤테로싸이클로 방향족화합물 또는 헤테로사이클로알킬 라디칼, 이외에도 R2는 H 일 수 있으며;
    R3, R4, R5, R6, R7 그리고 R8는 각각 독립적으로 H, CH3, C2H5, 1 내지 10개의 탄소원자를 가지는 선형 알킬 또는 알케닐, 3 내지 10개 탄소원자를 가지는 가지형 또는 싸이클로 알킬 또는 알케닐, 페닐, 치환된 페닐 또는 헤테로싸이클로 방향족화합물 또는 헤테로사이클로알킬 라디칼;
    l, m, n은 각각 독립적으로 1부터 5의 정수이며, 이외에도 n은 0일 수 있고;
    May는 C-3, C-14 히드록실메틸, C-15 히드록시 또는 C-20 데스메틸의 위치에서 측쇄를 가지는 메이탠시노이드인, 세포-결합 물질에 연결되며, 상기 화학식(Ⅱ-L), (Ⅱ-D) 또는 (Ⅱ-D, L)로 표현되는 적어도 하나의 메이탠시노이드를 포함하는 메이텐시노이드-세포-결합 물질.
  29. 제28항에 있어서, 상기 R1는 H, R2는 메틸, R5, R6, R7, R8는 H, l과 m은 각각 1, n은 0인 화합물.
  30. 제28항에 있어서, 상기 R1과 R2는 메틸, R5, R6, R7, R8는 각각 H, l과 m은 각각 1, n은 0인 화합물.
  31. 제28항에 있어서, 식 (Ⅱ-L)로 표현되는 메이탠시노이드를 포함하는 메이탠시노이드-세포-결합 물질.
  32. 제29항에 있어서, 식 (Ⅱ-L)로 표현되는 메이탠시노이드를 포함하는 메이탠시노이드-세포-결합 물질.
  33. 제30항에 있어서, 식 (Ⅱ-L)로 표현되는 메이탠시노이드를 포함하는 메이탠시노이드-세포-결합 물질.
  34. 제28항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포-결합 물질은 적어도 하나의 항체 결합 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 메이탠시노이드-세포-결합 물질.
  35. 제34항의 메이탠시노이드-세포-결합 물질에 있어서, 상기 항체는 MY9, 항-B4 또는 C242인 메이탠시노이드-세포-결합 물질.
  36. 제34항의 메이탠시노이드-세포-결합 물질에 있어서, 상기 항체는 휴머나이즈드(humanized) 또는 표면이 재처리된 MY9, 항-B4, C242인 메이탠시노이드-세포-결합 물질.
  37. Figure 112005066719031-PCT00037
    41
    여기서 Y₁는 (CR7CR8)1(CR5CR6)m(CR3CR4)nCR1R2S-이고, 상기 R1과 R2는 각각 독 립적으로 CH3, C2H5 , 1 내지 10개의 탄소원자를 가지는 선형 알킬 또는 알케닐, 3 내지 10개의 탄소원자를 가지는 가지형 또는 싸이클로 알킬 또는 알케닐, 페닐, 치환된 페닐 또는 헤테로싸이클로 방향족화합물 또는 헤테로사이클로알킬 라디칼, 이외에도 R2는 H 일 수 있으며;
    R3, R4, R5, R6, R7 그리고 R8는 각각 독립적으로 H, CH3, C2H5, 1 내지 10개의 탄소원자를 가지는 선형 알킬 또는 알케닐, 3 내지 10개의 탄소원자를 가지는 가지형 또는 싸이클로 알킬 또는 알케닐, 페닐, 치환된 페닐 또는 헤테로싸이클로 방향족화합물 또는 헤테로사이클로알킬 라디칼;
    l, m, n은 각각 독립적으로 1부터 5까지의 정수이며, 추가로 n은 0이 될 수 있는, 상기 화학식 41 에 의해 표현되는 메이탠시노이드를 포함하는 메이탠시노이드-세포-결합 물질.
  38. 제37항에 있어서, 상기 R1는 H, R2는 메틸, R5, R6, R7, R8는 H, l과 m은 각각 1, n은 0인 메이탠시노이드-세포-결합 물질.
  39. 제37항에 있어서, 상기 R1과 R2는 메틸, R5, R6, R7, R8는 H, l과 m은 각각 1, n은 0인 메이탠시노이드-세포-결합 물질.
  40. 제37항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포-결합 물질은 적어도 하나의 항체 결합 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 메이탠시노이드-세포-결합 물질.
  41. 제40항의 메이탠시노이드-세포-결합 물질에 있어서, 상기 항체는 MY9, 항-B4 또는 C242인 메이탠시노이드-세포-결합 물질.
  42. 제40항의 메이탠시노이드-세포-결합 물질에 있어서, 상기 항체는 휴머나이즈드(humanized) 또는 표면이 재처리된 MY9, 항-B4, C242인 메이탠시노이드-세포-결합 물질.
  43. 제18항 내지 제24항, 제28항 내지 제33항, 제37항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서의 메이탠시노이드-세포-결합 물질의 적당량과 약제학적으로 수용할 수 있는 염 또는 용매, 그리고 캐리어, 희석제, 결합제를 포함하여 구성되는 약제.
  44. 제25항의 메이탠시노이드-세포-결합 물질의 적당량과 약제학적으로 수용할 수 있는 염 또는 용매, 그리고 캐리어, 희석제, 결합제를 포함하여 구성되는 약제.
  45. 제26항의 메이탠시노이드-세포-결합 물질의 적당량과 약제학적으로 수용할 수 있는 염 또는 용매, 그리고 캐리어, 희석제, 결합제를 포함하여 구성되는 약제.
  46. 제27항의 메이탠시노이드-세포-결합 물질의 적당량과 약제학적으로 수용할 수 있는 염 또는 용매, 그리고 캐리어, 희석제, 결합제를 포함하여 구성되는 약제.
  47. 제34항의 메이탠시노이드-세포-결합 물질의 적당량과 약제학적으로 수용할 수 있는 염 또는 용매, 그리고 캐리어, 희석제, 결합제를 포함하여 구성되는 약제.
  48. 제35항의 메이탠시노이드-세포-결합 물질의 적당량과 약제학적으로 수용할 수 있는 염 또는 용매, 그리고 캐리어, 희석제, 결합제를 포함하여 구성되는 약제.
  49. 제36항의 메이탠시노이드-세포-결합 물질의 적당량과 약제학적으로 수용할 수 있는 염 또는 용매, 그리고 캐리어, 희석제, 결합제를 포함하여 구성되는 약제.
  50. 제40항의 메이탠시노이드-세포-결합 물질의 적당량과 약제학적으로 수용할 수 있는 염 또는 용매, 그리고 캐리어, 희석제, 결합제를 포함하여 구성되는 약제.
  51. 제41항의 메이탠시노이드-세포-결합 물질의 적당량과 약제학적으로 수용할 수 있는 염 또는 용매, 그리고 캐리어, 희석제, 결합제를 포함하여 구성되는 약제.
  52. 제42항의 메이탠시노이드-세포-결합 물질의 적당량과 약제학적으로 수용할 수 있는 염 또는 용매, 그리고 캐리어, 희석제, 결합제를 포함하여 구성되는 약제.
  53. 아실족은 보호된 설프히드릴 족을 가지며, 상기 보호된 설프히드릴족을 가지는 아실족의 탄소원자는 하나 또는 두 개의 치환기를 가지며, 상기 치환기는 CH3, C2H5, 1 내지 10개의 탄소원자를 가지는 선형 알킬 또는 알케닐, 3 내지 10개의 탄소원자를 가지는 가지형 또는 싸이클로 알킬 또는 알케닐, 페닐, 치환된 페닐 또는 헤테로싸이클로 방향족화합물 또는 헤테로사이클로알킬 라디칼이며, 이외에도 상기 치환기의 하나는 H이며, 상기 아실족은 황원자와 카르보닐기 사이에 적어도 3개의 탄소원자의 선형 측면 길이를 가지며, C-3, C-14 히드록시메틸, C-15 히드록시, 또는 C-20 데스메틸의 위치에서 메이탠시노이드와 보호된 설프히드릴족을 갖는 아실족이 있는 아실화된 아미노산을 반응시키는 과정을 포함하여 이루어지는 메이탠시노이드를 에스테르화 하는 방법.
  54. Figure 112005066719031-PCT00038
    42
    여기서 Y₂′는
    (CR7CR8)1(CR9=CR10)p(C≡C)qAr(CR5CR6)mDu(CR11=CR12)r(C≡C)sBt(CR3CR4)uCR1R2SZ2 이고, 상기 R1과 R2는 각각 독립적으로 CH3, C2H5 , 1 내지 10개의 탄소원자를 가지는 선형 알킬 또는 알케닐, 3 내지 10개의 탄소원자를 가지는 가지형 또는 싸이클로 알킬 또는 알케닐, 페닐, 치환된 페닐 또는 헤테로싸이클로 방향족화합물 또는 헤테로사이클로알킬 라디칼, 이외에도 R2는 H 일 수 있으며;
    A, B, D는 각각 독립적으로 3 내지 10개의 탄소원자를 가지는 싸이클로알킬 또는 싸이클로알케닐이며, 단순 또는 치환된 아릴, 또는 헤테로싸이클로 방향족화합물 또는 헤테로사이클로알킬 라디칼이고;
    R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R11 그리고 R12는 각각 독립적으로 H, CH3, C2H5, 1 내지 10개의 탄소원자를 가지는 선형 알킬 또는 알케닐, 3 내지 10개 탄소원자를 가지는 가지형 또는 싸이클로 알킬 또는 알케닐, 페닐, 치환된 페닐 또는 헤테로싸이클로 방향족화합물 또는 헤테로사이클로알킬 라디칼;
    l, m, n, o, p, q, r, s, 그리고 t는 각각 독립적으로 0 또는 1부터 5까지의 정수이고, l, m, n, o, p, q, r, s, t중 적어도 2개는 어느 때에도 0은 아니며,
    Z₂는 SR 또는 -COR이며, 상기 R은 1 내지 10개의 탄소원자를 가지는 선형 알킬 또는 알케닐, 3 내지 10개의 탄소원자를 가지는 가지형 또는 싸이클로 알킬 또는 알케닐, 단순한 또는 치환된 아릴 또는 헤테로싸이클로 방향족화합물 또는 헤 테로사이클로알킬 라디칼이고, C-3에서 구조11의 메이탠시놀과 화학식(Ⅲ′-L), (Ⅲ′-D), 또는 (Ⅲ′-D,L)의 화합물과 반응시키는 것을 포함하여 이루어지는 메이탠시노이드를 에스테르화하는 방법으로서,
    Figure 112005066719031-PCT00039
    11
    Figure 112005066719031-PCT00040
    L D D,L
    (Ⅲ′)
    여기서 Y₂′은
    (CR7CR8)1(CR9=CR10)p(C≡C)qAr(CR5CR6)mDu(CR11=CR12)r(C≡C)sBt(CR3CR4)uCR1R2SZ2 이고, 상기 R1과 R2는 각각 독립적으로 CH3, C2H5, 1 내지 10의 탄소원자를 가지는 선형 알킬 또는 알케닐, 가지형 또는 3 내지 10개의 탄소원자를 가지는 싸이클로 알킬 또는 알케닐, 페닐, 치환된 페닐 또는 헤테로싸이클로 방향족화합물 또는 헤 테로사이클로알킬 라디칼, 이외에도 R2는 H일 수 있으며;
    A, B, D는 각각 독립적으로 3 내지 10개의 탄소원자를 가지는 싸이클로알킬 또는 싸이클로알케닐이며, 단순 또는 치환된 아릴, 또는 헤테로싸이클로 방향족화합물 또는 헤테로사이클로알킬 라디칼;
    R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R11 그리고 R12는 각각 독립적으로 H, CH3, C2H5, 1 내지 10개의 탄소원자를 가지는 선형 알킬 또는 알케닐, 가지형 또는 3 내지 10 탄소원자를 가지는 가지형 싸이클로 알킬 또는 알케닐, 페닐, 치환된 페닐 또는 헤테로싸이클로 방향족화합물 또는 헤테로사이클로알킬 라디칼;
    l, m, n, o, p, q, r, s, 그리고 t는 각각 독립적으로 0 또는 1부터 5까지의 정수이고, l, m, n, o, p, q, r, s, t중 적어도 2개는 어느 때에도 0은 아니며;
    Z₂는 SR 또는 -COR이고, 상기 R은 1 내지 10개의 탄소원자를 가지는 선형 알킬 또는 알케닐, 가지형 또는 3 내지 10개의 탄소원자를 가지는 가지형 또는 싸이클로 알킬 또는 알케닐, 또는 단순 또는 치환된 아릴 또는 헤테로싸이클로 방향족화합물 또는 헤테로사이클로알킬 라디칼인 메이탠시노이드를 에스테르화하는 방법.
  55. 제54항에 있어서, 화학식(I)의 화합물은 화학식(I-L)로 표현되는 메이탠시노이드를 에스테르화하는 방법.
  56. 제54항에 있어서, 상기 R1는 H, R2는 메틸인 메이탠시노이드를 에스테르화하는 방법.
  57. 화학식 (Ⅳ-L), (Ⅳ-D), (Ⅳ-D,L)에 의해 표현되는 메이탠시노이드 에스테르를 생산하는 메이탠시노이드를 에스테르화하는 방법.
    Figure 112005066719031-PCT00041
    L D D, L
    (IV)
    여기서, Y₂는 (CR7CR8)1(CR5CR6)m(CR3CR4)nCR1R2SZ2 이고, 상기 R1과 R2는 각각 독립적으로 CH3, C2H5 , 1 내지 10개의 탄소원자를 가지는 선형 알킬 또는 알케닐, 3 내지 10개의 탄소원자를 가지는 가지형 또는 싸이클로 알킬 또는 알케닐, 페닐, 치환된 페닐 또는 헤테로싸이클로 방향족화합물 또는 헤테로사이클로알킬 라디칼, 이외에도 R2는 H 일 수 있으며;
    R3, R4, R5, R6, R7 그리고 R8는 각각 독립적으로 H, CH3, C2H5, 1 내지 10개의 탄소원자를 가지는 선형 알킬 또는 알케닐, 3 내지 10개의 탄소원자를 가지는 가지형 또는 싸이클로 알킬 또는 알케닐, 페닐, 치환된 페닐 또는 헤테로싸이클로 방향족화합물 또는 헤테로사이클로알킬 라디칼;
    l, m, n은 각각 독립적으로 1부터 5까지의 정수이며, 이외에도 n은 0일 수 있으며;
    Z₂는 SR 또는 -COR이며, 상기 R은 1 내지 10개의 탄소원자를 가지는 선형 알킬 또는 알케닐, 3 내지 10개의 탄소원자를 가지는 가지형 또는 싸이클로 알킬 또는 알케닐, 단순 또는 치환된 아릴 또는 헤테로싸이클로 방향족화합물 또는 헤테로사이클로알킬 라디칼이고; 그리고 May는 메이탠시노이드이고, C-3, C-14 히드록실메틸, C-15 히드록시, 또는 C-20 데스메틸의 위치에서 상기 메이탠시노이드와, 화학식 (Ⅲ-L), (Ⅲ-D), (Ⅲ-D, L)의 화합물을 반응시켜서, 메이탠시노이드를 에스테르화 하는 방법으로서;
    Figure 112005066719031-PCT00042
    L D D,L
    (Ⅲ)
    여기서, Y₂는 (CR7CR8)1(CR5CR6)m(CR3CR4)nCR1R2SZ2 이고, 상기 R1과 R2는 각각 독립적으로 CH3, C2H5 , 1 내지 10개의 탄소원자를 가지는 선형 알킬 또는 알케닐, 3 내지 10개의 탄소원자를 가지는 가지형 또는 싸이클로 알킬 또는 알케닐, 페닐, 치환된 페닐 또는 헤테로싸이클로 방향족화합물 또는 헤테로사이클로알킬 라디칼, 이외에도 R2는 H 일 수 있으며;
    R3, R4, R5, R6, R7 그리고 R8는 각각 독립적으로 H, CH3, C2H5, 1 내지 10개의 탄소원자를 가지는 선형 알킬 또는 알케닐, 3 내지 10개의 탄소원자를 가지는 가지형 또는 싸이클로 알킬 또는 알케닐, 페닐, 치환된 페닐 또는 헤테로싸이클로 방향족화합물 또는 헤테로사이클로알킬 라디칼;
    l, m, n은 각각 독립적으로 1부터 5까지의 정수이며, 이외에도 n은 0일 수 있고;
    Z₂는 SR 또는 -COR이며, 상기 R은 1 내지 10개의 탄소원자를 가지는 선형 알킬 또는 알케닐, 3 내지 10개의 탄소원자를 가지는 가지형 또는 싸이클로 알킬 또는 알케닐, 단순 또는 치환된 아릴 또는 헤테로싸이클로 방향족화합물 또는 헤테로사이클로알킬 라디칼인 메이탠시노이드 에스테르를
    식 (Ⅳ-L), (Ⅳ-D), (Ⅳ-D,L)에 의해 표현되는 메이탠시노이드 에스테르를 생산하는 메이탠시노이드를 에스테르화하는 방법.
  58. 제57항에 있어서, 상기 R1는 H, R2는 메틸, R5, R6, R7과 R8는 H, l과 m은 각각 1, n은 0인 메이탠시노이드를 에스테르화하는 방법.
  59. 제58항에 있어서, 식 (I-L)에 의해 표현되는 상기 식(I)에 의한 메이탠시노 이드를 에스테르화하는 방법.
  60. 제58항에 있어서, 상기 식(Ⅲ-L)에 의한 화합물이 15a(R,S), 15b(S,R) 또는 15a(S,S)와 15b(S,R)의 혼합물인 메이탠시노이드를 에스테르화하는 방법.
  61. 제58항에 있어서, 상기 식(Ⅲ-D)에 의한 화합물이 15(R,S), 15(R,R) 또는 15a(S,S)와 15b(S,R)의 혼합물인 메이탠시노이드를 에스테르화하는 방법.
  62. 제58항에 있어서, 상기 식(Ⅲ-D,L)의 화합물이 황 원자를 가지는 탄소 중심은 라세믹 또는 R 또는 S 키랄성을 15 구조의 화합물에 제공하며 보호된 티올 기능기를 가지고 카르복실 족에 의해 아실화된 라세믹 N-메틸알라닌인 메이탠시노이드를 에스테르화하는 방법.
  63. 제60항에 있어서, 상기 15a(S,S)와 15b(S,R)의 혼합물은 다음 과정으로 제조되는 것을 특징으로 하는 메이탠시노이드를 에스테르화하는 방법:
    (1) 4-메캡토펜태노익 산(12)을 메틸 메탠씨올설퍼네이트와 함께 섞어 화합 물 13을 만들고;
    (2) 화합물 13을 N-히드로시석시니마이드 에스테르 14로 변화시키고;
    (3) 화합물 14를 N-메틸-L-알라닌과 반응시켜 15a(S,S)와 15b(S,R)의 혼합물을 만든다.
  64. 제60항에 있어서, 상기 15a(S,S) 화합물이 다음 과정으로 메이탠시노이드를 에스테르화하는 방법.
    (1) (R)-1,3-부테인디올을 (S)-4-(메티디씨오)펜타노익 산 19로 변환하고;
    (2) 화합물 19를 N-히드록시석시니나이드 에스테르 (20)으로 변환하며; 그리고
    (3) 화합물 20을 N-메틸-L-알라닌과 반응시켜 화합물 15a(S,S)를 만든다.
  65. 제60항에 있어서, 상기 화합물 15b(S,R)이 다음 과정으로 제조되는 것을 특징으로 하는 메이탠시노이드를 에스테르화하는 방법.
    (1) (S)-1,3-부테인디올을 (R)-4-(메티디씨오)펜타노익 산 24로 변환하고;
    (2) 화합물 25는 N-히드록시석시니마이드 에스테르(25)로 변환하고; 그리고
    (3) 화합물 25를 N-메틸-L-알라닌과 반응시켜 화합물 15b(S,R)을 만든다.
  66. 제61항에 있어서, 상기 15(R,S)와 15(R,R) 혼합물이 다음 과정으로 제조되는 것을 특징으로 하는 메이탠시노이드를 에스테르화하는 방법.
    (1) 4-메캡토펜태노익 산(12)을 메틸 메탠티올설포네이트와 반응시켜 화합물 13을 만들고;
    (2) 화합물 13을 N-히드록시석시니마이드 에스테르 14로 변환하며;
    (3) 화합물 14를 N-메틸-D-알라닌과 반응시켜 화합물 15(R,S)와 15(R,R)의 혼합물로 만든다.
  67. 제62항에 있어서, 구조15의 화합물을 만들기 위해 상기 라세믹 N-메틸알라닌은 건조된 티올기를 가지는 카르복실족에 의해 아실화되며, 황원자를 갖는 탄소중심은 라세믹 또는 R 또는 S 키랄성 중 어느 하나인 것으로 다음 과정으로 제조되는 것을 특징으로 하는 메이탠시노이드를 에스테르화하는 방법.
    (1) 4-메캡토펜타노익 산(12)을 메틸 메탄티올설포네이트와 반응시켜 화합물 13을 만들고;
    (2) 화합물 13을 N-히드록시석시니마이드 에스테르 14로 변환하며;
    (3) 보호된 티올기를 갖는 카르복실족에 의해 아실화된 라세믹 N-메틸 알라닌을 만들기 위해, 화합물 14와 라세믹 N-메틸알라닌를 반응시키고, 구조15의 화합물을 제공하기 위해, 황원자를 갖는 탄소중심은 라세믹 또는 R 또는 S 키탈성 중의 어느 하나이다.
  68. 제56항에 있어서, R1과 R2는 메틸, R3, R4, R5 그리고 R6는 H, l과 m은 각각 1, n은 0인 메이탠시노이드를 에스테르화하는 방법.
  69. 제68항에 있어서, 상기 식(Ⅲ-L)의 화합물이 N-메틸-L-알라닌을 포함하는 화합물 10인 메이탠시노이드를 에스테르화하는 방법.
  70. 제68항에 있어서, 상기 식(Ⅲ-D)의 화합물이 N-메틸-D-알라닌을 포함하는 화합물 10인 메이탠시노이드를 에스테르화하는 방법.
  71. 제68항에 있어서, 상기 식(Ⅲ-D,L)의 화합물이 라세믹 N-메틸알라닌을 포함하는 화합물 10인 메이탠시노이드를 에스테르화하는 방법.
  72. 제69항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, N-메틸-L-알라닌, N-메틸-D-알라닌, 또는 라세믹 N-메틸알라닌을 포함하는 상기 화합물 10은 다음 과정에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는 메이탠시노이드를 에스테르화하는 방법.
    (1) 이소부틸렌 설파이드(5)를 아세토니드릴의 음이온과 반응시켜 화합물 6을 만들고;
    (2) 화합물 6을 4-메캡토-4-메틸펜태노익 산(7)으로 가수분해하고;
    (3) 화합물 7을 디설파이드 8로 메틸메탄티올설포네이트와 반응시켜 변환하며;
    (4) 화합물 8을 N-히드록시석시니마이드 에스테르 9로 변환하고;
    (5) N-메틸-L-알라닌, N-메틸-D-알라닌, 또는 라세믹 N-메틸알라닌을 포함하는 화합물 10을 만들기 위해 화합물 9를 N-메틸-L-알라닌, N-메틸-D-알라닌, 또는 라세믹 N-메틸알라닌과 반응시킨다.
  73. 제57항 내지 60항 중 어느 한 항에 있어서, 다이어스테레오머(diasteromer)를 분리하는 과정과 시아노-결합된 실리카 상의 HLPC 에 의해 상기 메이탠시노이드를 정제하는 과정을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 메이탠시노이드를 에스테르화하는 방법.
  74. 제73항의 방법에 의해 정제된 메이탠시노이드를 제조하고, 상기 정제된 메이탠시노이드를 반응성 있는 디티오족 또는 설프드릴족을 포함하는 세포-결합 물질과 반응시키는 것을 특징으로 하는 메이탠시노이드를 에스테르화하는 방법.
  75. 제74항에 있어서, 상기 반응성 있는 디티오 족은 디티오피리딜 족 또는 치환된 디티오피리딜 족인 메이탠시노이드를 에스테르화하는 방법.
  76. 제72항의 방법에 의해 정제된 메이탠시노이드를 제조하고, 상기 정제된 메이탠시노이드를 말레이미도(maleimido)족 또는 할로아세틸족을 포함하는 세포-결합 물질과 반응시키는 것을 특징으로 하는 메이탠시노이드를 에스테르화하는 방법.
  77. 메이탠시놀을 식 4₂의 메이탠시노이드로 에스테르화하는 방법으로,
    Figure 112005066719031-PCT00043
    42
    여기서, Y₂는 (CR7CR8)1(CR5CR6)m(CR3CR4)nCR1R2SZ2 이고, 상기 R1과 R2는 각각 독립적으로 CH3, C2H5, 1 내지 10의 탄소원자를 가지는 선형 알킬 또는 알케닐, 가지달린 또는 3 내지 10 탄소원자를 가지는 싸이클릭 알킬 또는 알케닐이 있으며, 페닐, 치환된 페닐 또는 헤테로싸이클릭 어로매틱 또는 헤테로씨클로알킬 라디컬, 추가적으로 R2는 H일 수 있으며;
    R3, R4, R5, R6, R7과 R8는 각각 독립적으로 H, CH3, C2H5, 1 내지 10의 탄소원자를 가지는 선형 알킬 또는 알케닐, 가지달린 또는 3 내지 10 탄소원자를 가지는 싸이클릭 알킬 또는 알케닐이 있으며, 페닐, 치환된 페닐 또는 헤테로싸이클릭 어로매틱 또는 헤테로씨클로알킬 라디컬;
    l, m, n은 각각 독립적으로 1부터 5까지의 정수로 주어지며, 추가로 n은 0일 수 있고;
    Z₂는 SR 또는 -COR이고, 상기 R은 1 내지 10의 탄소원자를 가지는 선형 알킬 또는 알케닐, 가지달린 또는 3 내지 10 탄소원자를 가지는 싸이클릭 알킬 또는 알케닐, 또는 간단하거나 치환된 아릴 또는 헤테로싸이클릭 어로매틱 또는 헤테로씨클로알킬 라디컬이며; C-3에서 구조 11의 메이탠시놀과 화학식 (Ⅲ-L), (Ⅲ-D), 또는 (Ⅲ-D,L)의 화합물을 반응시켜서 메이탠시놀을 식 42의 메이탠시노이드로 에스테르화하는 방법으로서, :
    Figure 112005066719031-PCT00044
    11
    식 에 의해 표현되는
    Figure 112005066719031-PCT00045
    (Ⅲ)
    여기서, Y₂는 (CR7CR8)1(CR5CR6)m(CR3CR4)nCR1R2SZ2 이고, 상기 R1과 R2는 각각 독립적으로 CH3, C2H5, 1 내지 10의 탄소원자를 가지는 선형 알킬 또는 알케닐, 가지달린 또는 3 내지 10 탄소원자를 가지는 싸이클릭 알킬 또는 알케닐이 있으며, 페닐, 치환된 페닐 또는 헤테로싸이클릭 어로매틱 또는 헤테로씨클로알킬 라디컬, 추가적으로 R2는 H일 수 있으며;
    R3, R4, R5, R6, R7과 R8는 각각 독립적으로 H, CH3, C2H5, 1 내지 10의 탄소원 자를 가지는 선형 알킬 또는 알케닐, 가지달린 또는 3 내지 10 탄소원자를 가지는 싸이클릭 알킬 또는 알케닐이 있으며, 페닐, 치환된 페닐 또는 헤테로싸이클릭 어로매틱 또는 헤테로씨클로알킬 라디컬;
    l, m, n은 각각 독립적으로 1부터 5까지의 정수로 주어지며, 추가로 n은 0일 수 있고;
    Z₂는 SR 또는 -COR이고, 상기 R은 1 내지 10의 탄소원자를 가지는 선형 알킬 또는 알케닐, 가지달린 또는 3 내지 10 탄소원자를 가지는 싸이클릭 알킬 또는 알케닐, 또는 간단하거나 치환된 아릴 또는 헤테로싸이클릭 어로매틱 또는 헤테로씨클로알킬 라디컬인 메이탠시놀을 화학식 42의 메이탠시노이드로 에스테르화하는 방법.
  78. 제77항에 있어서, 화학식(I)의 화합물은 화학식(I-L)로 표현되는 것을 특징으로 하는 메이탠시놀을 화학식 42의 메이탠시노이드로 에스테르화하는 방법.
  79. 제77항에 있어서, R1는 H, R2는 메틸, R5, R6, R7과 R8는 H, l과 m은 각각 1, n은 0인 메이탠시놀을 화학식 42의 메이탠시노이드로 에스테르화하는 방법.
  80. 제77항에 있어서, 식(Ⅲ-L)은 15a(S,S), 15b(S,R) 또는 15a(S,S)와 15b(S,R)의 혼합물인 메이탠시놀을 화학식 42의 메이탠시노이드로 에스테르화하는 방법.
  81. 제77항에 있어서, 식(Ⅲ-D)은 15(R,S), 15(R,R) 또는 15(R,S)와 15(R,R)의 혼합물인 메이탠시놀을 화학식 42의 메이탠시노이드로 에스테르화하는 방법.
  82. 제77항에 있어서, 구조 15의 화합물을 만들기 위해 상기 화학식(Ⅲ-D,L)의 화합물은 보호된 티올기를 갖는 카르복실족에 의해 아실화된 N-메틸알라닌이고, 황 원자를 갖는 탄소중심은 라세믹 또는 R 또는 S 키랄성 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 메이탠시놀을 화학식 42의 메이탠시노이드로 에스테르화하는 방법.
  83. 제80항에 있어서, 상기 15a(S,S)와 15b(S,R)의 혼합물의 다음 과정에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는 메이탠시놀을 화학식 42의 메이탠시노이드로 에스테르화하는 방법.
    (1) 4-메캡토펜태노익 산(12)을 메틸 메탄티올설포네이트와 반응시켜 화합물 13을 만들고;
    (2) 화합물 13을 N-히드록시석시니마이드 에스테르 14로 변환하며;
    (3) 15a(S,S)와 15b(S,R)의 혼합물을 만들기 위해 화합물 14를 N-메틸-L-알라닌과 반응시킨다.
  84. 제80항에 있어서, 상기 화합물 15a(S,S)는 다음 과정에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는 메이탠시놀을 화학식 42의 메이탠시노이드로 에스테르화하는 방법.:
    (1) (R)-1,3-부테인디올을 (S)-4-(메티디씨오)펜태노익 산 19로 변환하고;
    (2) 화합물 19를 N-히드록시석시니마이드 에스테르(20)으로 변환하며;
    (3) 화합물 20을 N-메틸-L-알라닌과 반응시켜 화합물 15a(S,S)를 만든다.
  85. 제80항에 있어서, 상기 화합물 15b(S,R)는 다음 과정에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는 메이탠시놀을 화학식 42의 메이탠시노이드로 에스테르화하는 방법.:
    (1) (S)-1,3-부테인디올을 (R)-4-(메티디티오)펜타노익 산 24로 변환하고;
    (2) 화합물 24를 N-히드록시석시니마이드 에스테르(25)로 변환하며;
    (3) 화합물 15b(S, R)을 만들기 위해 화합물 25를 N-메틸-L-알라닌과 반응시킨다.
  86. 제81항에 있어서, 상기 화합물 15(R,S)와 15(R,R)은 다음 과정에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는 메이탠시놀을 화학식 42의 메이탠시노이드로 에스테르화하는 방법:
    (1) 4-메캡토펜타노익 산(12)을 메틸 메탄티올설포네이트와 반응시켜 화합물 13을 만들고;
    (2) 화합물 13을 N-히드록시석시니마이드 에스테르 14로 변환하며;
    (3) 15(R,S)와 15(R,R)의 혼합물을 만들기 위해 화합물 14를 N-메틸-D-알라닌과 반응시킨다.
  87. 제82항에 있어서, 구조 15의 화합물을 만들기 위해 상기 라세믹 사에틸알라닌은 건조된 티올기를 가지는 카르복실족에 의해 아실화되며, 황 원자를 갖는 탄소중심은 라세믹 또는 R 또는 S 키랄성 중 어느 하나인 것으로 다음 과정으로 제도되는 것을 특징을 하는 메이탠시놀을 화학식 42의 메이탠시노이드로 에스테르화하는 방법:
    (1) 4-메캡토펜태노익 산(12)을 메틸 메탄티올설포네이트와 반응시켜 화합물 13을 만들고;
    (2) 화합물 13을 N-히드록시석시니마이드 에스테르 14로 변환하며;
    (3) 보호된 티올기를 갖는 카르복실족에 의해 아실화된 라세믹 N-메틸알라닌을 만들기 위해, 화합물 14와 라세믹 N-메틸알라닌을 반응시키고, 구조 15의 화합물을 제공하기 위해, 황원자를 갖는 탄소중심은 라세믹 또는 R 또는 S 카랄성 중의 하나이다.
  88. 제77항에 있어서, 상기 R1과 R2는 메틸, R5, R6, R7과 R8는 H, l과 m은 각각 1, n은 0인 방법.
  89. 상기 제77항에 있어서, 상기 화학식 (Ⅲ-L)의 화합물은 N-메틸-L-알라닌을 포함하는 화합물 10인 것을 특징으로 하는 메이탠시놀을 화학식 42의 메이탠시노이드로 에스테르화하는 방법.
  90. 제77항에 있어서, 상기 화학식 (Ⅲ-D)의 화합물은 N-메틸-D-알라닌을 포함하는 화합물 10인 것을 특징으로 하는 메이탠시놀을 화학식 42의 메이탠시노이드로 에스테르화하는 방법.
  91. 제77항에 있어서, 상기 화학식 (Ⅲ-D,L)의 화합물은 라세믹 N-메틸-알라닌을 포함하는 화합물 10인 것을 특징으로 하는 메이탠시놀을 화학식 42의 메이탠시노이드로 에스테르화하는 방법.
  92. 제89항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물 10은 N-메틸-L-알라닌, N-메틸-D-알라닌, 라세믹 N-메틸알라닌이 다음 과정에 의해 만들어지는 방법.
    (1) 이소부틸렌 설파이드(5)를 아세토니드릴의 음이온과 반응시켜 화합물 6을 만들고;
    (2) 화합물 6을 4-메캡토-4-메틸펜태노익 산(7)으로 가수분해하고;
    (3) 화합물 7을 디설파이드 8로 메틸메탠씨올설포네이트와 반응시켜 변환하며;
    (4) 화합물 8을 N-히드록시석시니마이드 에스테르 9로 변환하고;
    (5) N-메틸-L-알라닌, N-메틸-D-알라닌, 또는 라세믹 N-메틸알라닌을 포함하는 화합물 10을 만들기 위해 화합물 9를 N-메틸-L-알라닌, N-메틸-D-알라닌, 또는 라세믹 N-메틸알라닌과 반응시킨다.
  93. 제77항, 제79항 또는 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 다이어스테레오머를 분리하는 과정과 시아노-결합된 실리카 상의 HLPC 에 의해 상기 메이탠시노이드를 정제하는 과정을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 N-메틸-L-알라닌, N-메틸-D-알라닌, 또는 라세믹 N-메틸알라닌을 포함하는 화합물 10을 만드는 방법.
  94. 제93항의 방법에 의한 정제된 메이탠시노이드를 제조하고, 정제된 메이탠시노이드를 세포-결합 물질과 반응시키고 디티오 족 또는 설프히드릴 족으로 구성되는 것을 포함하는 메이탠시노이드-세포-결합 물질의 제조방법.
  95. 제94항에 있어서, 상기 반응성 있는 디티오 족은 디티오피리딜 족 또는 치환된 디티오피리딜 족인 것을 특징으로 하는 메이탠시노이드-세포-결합 물질의 제조방법.
  96. 제93항의 방법에 의해 정제된 메이탠시노이드를 제조하는 과정과, 정제된 상기 메이탠시노이드를 말레이미도족 또는 할로아세틱 족을 포함하는 세포-결합 물질 과 반응시키는 과정을 포함하여 이루어진 메이탠시노이드-세포-결합 물질의 제조방법.
  97. 제18항 내지 24항, 제28항 내지 제33항, 제37항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서의 메이탠시노이드-세포-결합 물질, 또는 상기 물질의 약제학적으로 수용할 수 있는 염 또는 용매 화합물의 적절한 양을 치료가 필요한 환자에게 복용시키는 과정을 포함하는 치료방법.
  98. 제25항에 있어서의, 메이탠시노이드-세포-결합 물질, 또는 상기 물질의 약제학적으로 수용할 수 있는 염 또는 용매 화합물의 적절한 양을 치료가 필요한 환자에게 복용시키는 과정을 포함하는 치료방법.
  99. 제26항에 있어서의, 메이탠시노이드-세포-결합 물질, 또는 상기 물질의 약제학적으로 수용할 수 있는 염 또는 용매 화합물의 적절한 양을 치료가 필요한 환자에게 복용시키는 과정을 포함하는 치료방법.
  100. 제27항에 있어서의, 메이탠시노이드-세포-결합 물질, 또는 상기 물질의 약제학적으로 수용할 수 있는 염 또는 용매 화합물의 적절한 양을 치료가 필요한 환자에게 복용시키는 과정을 포함하는 치료방법.
  101. 제34항에 있어서의, 메이탠시노이드-세포-결합 물질, 또는 상기 물질의 약제학적으로 수용할 수 있는 염 또는 용매 화합물의 적절한 양을 치료가 필요한 환자에게 복용시키는 과정을 포함하는 치료방법.
  102. 제35항에 있어서의, 메이탠시노이드-세포-결합 물질, 또는 상기 물질의 약제학적으로 수용할 수 있는 염 또는 용매 화합물의 적절한 양을 치료가 필요한 환자에게 복용시키는 과정을 포함하는 치료방법.
  103. 제36항에 있어서의, 메이탠시노이드-세포-결합 물질, 또는 상기 물질의 약제학적으로 수용할 수 있는 염 또는 용매 화합물의 적절한 양을 치료가 필요한 환자에게 복용시키는 과정을 포함하는 치료방법.
  104. 제40항에 있어서의, 메이탠시노이드-세포-결합 물질, 또는 상기 물질의 약제학적으로 수용할 수 있는 염 또는 용매 화합물의 적절한 양을 치료가 필요한 환자에게 복용시키는 과정을 포함하는 치료방법.
  105. 제41항에 있어서의, 메이탠시노이드-세포-결합 물질, 또는 상기 물질의 약제학적으로 수용할 수 있는 염 또는 용매 화합물의 적절한 양을 치료가 필요한 환자에게 복용시키는 과정을 포함하는 치료방법.
  106. 제42항에 있어서의, 메이탠시노이드-세포-결합 물질, 또는 상기 물질의 약제학적으로 수용할 수 있는 염 또는 용매 화합물의 적절한 양을 치료가 필요한 환자에게 복용시키는 과정을 포함하는 치료방법.
  107. 식 Ⅲ의 화합물.
    Figure 112005066719031-PCT00046
    (Ⅲ)
    여기서, Y₂는 (CR7CR8)1(CR5CR6)m(CR3CR4)nCR1R2SZ2 로 표현되며, 상기 R1과 R2는 각각 독립적으로 CH3, C2H5, 1 내지 10의 탄소원자를 가지는 선형 알킬 또는 알케닐, 가지형 또는 3 내지 10 탄소원자를 가지는 싸이클로 알킬 또는 알케닐이 있으며, 페닐, 치환된 페닐 또는 헤테로싸이클로 방향족화합물 또는 헤테로사이클로알킬 라디컬, 추가적으로 R2는 H일 수 있으며;
    R3, R4, R5, R6, R7과 R8는 각각 독립적으로 H, CH3, C2H5, 1 내지 10의 탄소원자를 가지는 선형 알킬 또는 알케닐, 가지형 또는 3 내지 10 탄소원자를 가지는 싸이클로 알킬 또는 알케닐이 있으며, 페닐, 치환된 페닐 또는 헤테로싸이클로 방향족화합물 또는 헤테로사이클로알킬 라디컬;
    l, m, n은 각각 독립적으로 1부터 5까지의 정수로 주어지며, 추가로 n은 0일 수 있고;
    Z₂는 SR 또는 -COR이고, 상기 R은 1 내지 10의 탄소원자를 가지는 선형 알킬 또는 알케닐, 가지형 또는 싸이클로 알킬 또는 알케닐, 또는 간단하거나 치환된 아릴 또는 헤테로싸이클로 방향족화합물 또는 헤테로사이클로알킬 라디컬인 화학식Ⅲ의 화합물.
  108. 10(S), 10(R) 또는 라세믹 10의 화합물.
  109. N-메틸-L-알라닌, N-메틸-D-알라닌, 라세믹 N-메틸알라닌을 포함하는 화합물 10이 다음 과정에 의해 제조되는 화합물 10의 제조방법.
    (1) 이소부틸렌 설파이드(5)를 아세토니드릴의 음이온과 반응시켜 화합물 6을 만들고;
    (2) 화합물 6을 4-메캡토-4-메틸펜태노익 산(7)으로 가수분해하고;
    (3) 화합물 7을 이황화물 8로 메틸메탄티올설포네이트와 반응시켜 변환하며;
    (4) 화합물 8을 N-히드록시석시니마이드 에스테르 9로 변환하고;
    (5) N-메틸-L-알라닌, N-메틸-D-알라닌, 또는 라세믹 N-메틸알라닌을 포함하는 화합물 10을 만들기 위해 화합물 9를 N-메틸-L-알라닌, N-메틸-D-알라닌, 또는 라세믹 N-메틸알라닌과 반응시킨다.
  110. 화합물 15a(S,S)와 15b(S,R)의 혼합물.
  111. 다음 과정으로 이루어진 화합물 15a(S,S)와 15b(S,R)의 혼합물을 제조하는 방법.
    (1) 4-메캡토펜타노익 산(12)을 메틸 메탄티올설포네이트와 반응시켜 화합물 13을 만들고;
    (2) 화합물 13을 N-히드록시석시니마이드 에스테르 (14)로 변환하며;
    (3) 15a(S,S)와 15b(S,R)의 화합물의 혼합물을 만들기 위해 화합물 14를 N-메틸-L-알라닌과 반응시킨다.
  112. 화합물 15(R,S)와 15(R,R)의 화합물의 혼합물.
  113. 다음 과정으로 이루어진 화합물 15(R,S)와 15(R,R)의 혼합물을 제조하는 방법.
    (1) 4-메캡토펜타노익 산(12)을 메틸 메탄티올설포네이트와 반응시켜 화합물 13을 만들고;
    (2) 화합물 13을 N-히드록시석시니마이드 에스테르 14로 변환하며;
    (3) 15(R,S)와 15(R,R)의 화합물의 혼합물을 만들기 위해 화합물 14를 N-메틸-D-알라닌과 반응시킨다.
  114. 보호된 티올기를 가지는 카르복실 족에 의해 아실화된 N-메틸알라닌, 상기에서 황원자를 가지는 탄소중심은 라세믹 또는 R 또는 S 키랄성 중의 어느 하나인 것의 제조방법.
  115. 구조 15의 화합물을 제공하기 위해, 황 원자를 갖는 탄소중심은 라세믹 또는 R 또는 S 키랄성 중의 어느 하나이며, 보호된 티올기를 가지는 카르복실족에 의해 아실화된 N-메틸알라닌의 제조방법.
    (1) 4-메캡토펜타노익 산(12)을 메틸 메탄티올설포네이트와 반응시켜 화합물 13을 만들고;
    (2) 화합물 13을 N-히드록시석시니마이드 에스테르 14로 변환하며;
    (3) 보호된 티올기를 갖는 카르복실족에 의해 아실화된 라세믹 N-메틸알라닌을 만들기 위해 화합물 14와 라세믹 N-메틸알라닌을 반응시키고, 구조 15의 화합물을 지공하기 위해, 황원자를 갖는 탄소중심은 라세믹 또는 R 또는 S 키랄성 중 어느 하나이다.
  116. 화합물 15a(S,S)
  117. 다음 과정으로 이루어진 화합물 15a(S,S)의 제조방법.
    (1) (R)-1,3-부테인디올을 (S)-4-(메티디티오)펜태노익 산 19로 변환하고;
    (2) 화합물 19를 N-히드록시석시니마이드 에스테르(20)으로 변환하며;
    (3) 화합물 15a(S,S)을 만들기 위해 화합물 20을 N-메틸-L-알라닌과 반응시킨다.
  118. 화합물 15b(S,R)
  119. 다음 과정으로 이루어진 화합물 15b(S,R)의 제조 방법.
    (1) (S)-1,3-부테인디올을 (R)-4-(메티디씨오)펜태노익 산 24로 변환하고;
    (2) 화합물 24를 N-히드록시석시니마이드 에스테르(25)로 변환하며;
    (3) 화합물 15b(S,R)을 만들기 위해 화합물 25를 N-메틸-L-알라닌과 반응시킨다.
  120. 제2항, 제8항, 제13항, 또는 제108항 중 어느 한 항에 있어서의 메이탠시노이드-세포-결합 물질의 효과적인 양과 상기 물질의 약제학적으로 수용할 수 있는 염 또는 용매화합물, 그리고 캐리어, 희석제, 결합제를 포함하는 약제학적 조성물.
  121. 제120항에 있어서, 항체를 더 포함하는 약제학적 조성물.
  122. 제18항 내지 제24항, 제28항 내지 제33항, 제37항 내지 제41항 중 어느 한 항의 메이탠시노이드-세포-결합 물질, 상기 물질의 염 또는 용매화합물을 표적세포 또는 표적세포를 포함하는 조직과 접촉시키는 과정을 포함하여 이루어진 선택된 세포 집단의 세포소멸을 유도하는 방법.
  123. 제25항의 메이탠시노이드-세포-결합 물질, 상기 물질의 염 또는 용매화합물을 표적세포 또는 표적세포를 포함하는 조직과 접촉시키는 과정을 포함하여 이루어진 선택된 세포 집단의 세포소멸을 유도하는 방법.
  124. 제26항의 메이탠시노이드-세포-결합 물질, 염 또는 그 용매를 가진 표적 세포를 포함하는 접촉하는 표적 세포 또는 조직을 구성하는 선택된 세포 개체군에서 세포 소멸을 유도하는 방법.
  125. 제27항의 메이탠시노이드-세포-결합 물질, 상기 물질의 염 또는 용매화합물을 표적세포 또는 표적세포를 포함하는 조직과 접촉시키는 과정을 포함하여 이루어 진 선택된 세포 집단의 세포소멸을 유도하는 방법.
  126. 제34항의 메이탠시노이드-세포-결합 물질, 상기 물질의 염 또는 용매화합물을 표적세포 또는 표적세포를 포함하는 조직과 접촉시키는 과정을 포함하여 이루어진 선택된 세포 집단의 세포소멸을 유도하는 방법.
  127. 제35항의 메이탠시노이드-세포-결합 물질, 상기 물질의 염 또는 용매화합물을 표적세포 또는 표적세포를 포함하는 조직과 접촉시키는 과정을 포함하여 이루어진 선택된 세포 집단의 세포소멸을 유도하는 방법.
  128. 제36항의 메이탠시노이드-세포-결합 물질, 상기 물질의 염 또는 용매화합물을 표적세포 또는 표적세포를 포함하는 조직과 접촉시키는 과정을 포함하여 이루어진 선택된 세포 집단의 세포소멸을 유도하는 방법.
  129. 제42항의 메이탠시노이드-세포-결합 물질, 상기 물질의 염 또는 용매화합물을 표적세포 또는 표적세포를 포함하는 조직과 접촉시키는 과정을 포함하여 이루어 진 선택된 세포 집단의 세포소멸을 유도하는 방법.
  130. 제43항의 메이탠시노이드-세포-결합 물질, 상기 물질의 염 또는 용매화합물을 표적세포 또는 표적세포를 포함하는 조직과 접촉시키는 과정을 포함하여 이루어진 선택된 세포 집단의 세포소멸을 유도하는 방법.
  131. 제44항의 메이탠시노이드-세포-결합 물질, 상기 물질의 염 또는 용매화합물을 표적세포 또는 표적세포를 포함하는 조직과 접촉시키는 과정을 포함하여 이루어진 선택된 세포 집단의 세포소멸을 유도하는 방법.
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