PT93716B - Processo para a preparacao de derivados dissulfureto substituido antitumores e antibacterianos a partir de compostos que processam um grupo metil-tritio e suas formas alvo - Google Patents

Description

MEMÓRIA DESCRITIVA

DA

PATENTE DE INVENÇÃO

N5 .93.716

I

I NOME: AMERICAN CYANAMID COMPANY., norte-americana, indus

I trial, em Wayne, New Jersey, ESTADOS UNIDOS DA

AMERICA DO NORTE

EPIGRAFE: PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE DERIVADOS DIS SULFURETO SUBSTITUIDO ANTITUMORES E ANTIBAC TERIANOS A PARTIR DE COMPOSTOS QUE PROCESSAM UM GRUPO METIL-TRITIO E SUAS FORMAS ALVO

INVENTORES: GEORGE A.ELLESTAD; WILLIAM JAMES MCGAHREN;

MARTIN LEON SASSIVER; PHILIP R. HAMANN;

LOIS M.HIMMAN; JANIS UPESLACIS.

Reivindicação do direito de prioridade ao abrigo do artigo 42 da Convenção da União de Paris de 20 de Março de 1883.

Estados Unidos da América do Norte, em 14 de Abril de 1989, sob os Nos.07/339,343 e 07/339,323.

AMERIC AN CY AN AM ID CuMF'AiN Y

PROCESSO PARA A PREPARACSO DE DERIVADOS DISSULFURETO SUBSTITUÍDO ΑΝΤΙTUMORES E ANTIBACTERIANOS A PARTIR DE COMPOSTOS QUE PROCESSAM UM GRUPO METIL-TRITIO E SUAS FORMAS ALVO

MEMÓRIA DESCRITIVA

Resumo

O invento diz respeito a um processo para a preparação análogos dissu.l furetu de agentes srititumores e antibacterianos conhecidos colectivamente por complexo LL-E332SS, um método para a construção de agentes de suporte-conjugados da droga proveniente dos análogos dissu1fureto s da agentes de suporte-conjugados da forma alvo da. droga.

processo é essenzialmente caracterizado por compreender a reacção de um antibiótico antitumores trissulfureto de metilo com um mercaptano apropriadaments substituído em acetonitrilo ou uma combinação de acetonitrilo e tetra-hidrofurano ou acetonitrilo e dimeti1formamida , a uma temperatura entre -20 ^,5C s cerca de +40 *C, durante um periodo desde uma. hora, a té seis cfias, preferível mente na presença de um equivalente de uma base amina terciária ou uma mistur dS Ltni

£-?qui valente de uina base amina.

terciária e um equivalente de um ácido carboxilico orqSnico

d)

J )

SUMARIO DO INVENTO invsnt;

gterecofuponen t&s „ , <Í-P .

βρ gama, compostos dissulfursto dos S e pseudosq I ícone do complexo L.L-332S8 e seus derivados assim como a compostos dissulfursto dos antibióticos BBM-1Ó75, Fr-900405, FR-9OÔ40Ó, PD114759, F'D-1 15023, CL-1577A, CL.-1577B, CL--1577D, CL-1577E, CL-1724 e seus derivados preparados pela reacção do antibiótico com um aiercaptano de alquilo não substituído ou substituído. Estes compostos dissulfursto são agentes antibactarianos e antitumores eficazes.

invento também descreve agentes de suporte-corijugadas da droga dos análogos dissulfursto preparados a partir dos ma teria i 5 ante r i o rmente 1i stados. A porç ão agente d e suρo r te (alvo) do conjugado à um anticorpo mono ou policlonal, os seus fragmentos, as suas partes correspondentes química ou geneticamente manipuladas, ou factores ds crescimento ou esteróides. 0 invento inclui o método de utilização dos agentes de su.porte-con-DESCR ICÍÍO DOí

DESENHOS de u11 rav i o1et a an ti tumores designado por N-aceti 1-LL~E3328Q.f.j .

í-squra 2:

tumores designado por N-aceti 1 -LL-E332S8S )O i· I rigura o do antibiótico —Spftíutro de rasSunâm-ia magnética de protão do antibiótico antitumores designado por N-acetil-LL.-E3328Só’₁ ¹

Figura 4: Espectro de ressonância magnética nuclear de carbono~13 do antibiótico antitumcres designado per N-acetil-I..L-E3328SS ¹„

Figura 5: Espectro de ultravioleta do antibiótico an ti tumores designado por pseudoag 1 ícone cie LL-E332SS de .iodo.

Figura óx Espectro de infravermelho do antibiótico an ti tumores designada por pseudoaglicone de LL-E33283 cie ioda.

Figura 7: Espectro de ressonância magnética de protão do antibiótico anti tumores designado por pseudoaglicone de L.L-E332S8 de iodo.

Figura. 8: Espectro de ressonância magnética de carbono-13 do antibiótico antitueiores designado por pseudoag 1 Ícone de LL-E33288 de iodo.

DESCRIÇgQ DETALHADA____DO___INVEMTO

A fam.il ia de agentes antibac terie.nes e anti tumores, conhecidos colectivamente por complexo LL-E33288, é descrita e reivindicada no Fedido de Patente EPO N2 O 182 152.A3 publicado em 28 de Maio des 1986 e é utilizada para preparar os agentes antitumores ds dienxofre que constituiem alguns dos materiais de pa r t i.d a para f ormas a 1 vα d os ag en tes an t i t. u mo r es d ο η ossα i n ventc?»

Pedido de Patente EPU N2 '5 132 152A3 descreve o complexo LL-E33288, os

LL-E33283U, ^Sr, l_L-£3328Sa ₁ ¹

LL.-E33288«,^Br, LL-E33238CU¹ τ ' ç>£

LL-E33283E,‘, LL~E33238i^ ,

L.L-E332833ama ¹ e LL-E332S8.S seus componentes, nomeadamente, , LL-E33288«_T ^Br, LL-E33288<x_o ^I , , LL-E332S8C1 ^Èr, LL-E33238B ^ér,

LL-£33288P^ , LL-E33288ciama ’^Br , I ¹

- e métodos para a sua produção por fermentação aeróbica utilizando uma nova estirpe de

Mic rono» iosipora θ c h i η o s ρ o r a ssp· c. a 1. c. u. bei c i s cu υ·ο stus mutantes naturais ou derivados. 0 Pedido de Patente EPO N2 O 182 152A3 também revela estruturas propostas para. alguns dos componentes acima nomeados. Estas estruturas propostas são reproduzidas na

Tabela I.

□

O

.)

J

Lstruturas Frppostas para CH^—SóS—W isolado de fontes naturai.s (eni que U! é o substituinte ligado ao CH-.—SSS— abaixo)

X

^R5

R-, /

D e a ϊ. g n a y ά o

Rj R₂ R

Ε33288σ^Σ	Ar	RU'	H
T	i
E332S8«O'	Ari	H	H
E33288R.1 E332.títíqama, I 1 E3328B6 p, r	«O	Ru'	H
Ari	r2'	H
α,ί	R2'	H
	Ari	K z-,	H
rir E332S8qama,	Ar	RU'	H
P'r· ·*	1	•ú-
E33288í!o	Ar	FU,'	H
Ε33288α_,Σ	«n	H	H
E s p e r a. miei η A ,	CPU	RU'
Esperamicin A.-,	CPU	RU'	FU
	•i»	*-
Fsperam1cin ft,. 1 b	CH^	R2'	FU

H	C2H5	I
V				T X
R4'	íCH^y?CH			I
R4 '	CUFU 4Í. vJ			I
R4 '	ctu			I
R4 '	(CH,5OCK			Br
R4 '	C2H5			Br
FU'	C2H5			Br
R4'	<CI-U)OCH	H	ftro	Br
	(CH^,) OCH	Ar,,	H
	CPUCFU	H	ftr^

SSo descritos e reivindicados no Pedido de Patente ERG NQ 027 485A2 publicado em 3 de Agosto de 1938 membros adicionais do complexo LL-E33288 que são do mesmo modo úteis para a. preparares do nosso invento. Este pedida de patente descreve os pseudoaglicones de LL-E3328Sbromo e iodo das séries que -fora.il preparadas oor meios cu.ímicos.

di-hidro, acessíveis a. partir res mencionados anteriormente to de sódio da. cetona em C ú11 i maε es t rutura s ρ rο ρos tas de todos os antibióticos ant , através dai redução por boro— jj piara um grupo hidroxilo. s ã α r e p r o d u z i d a s na Tabe1a ivados i turnohidreEstas

São ainda descritos e reivindicadas outros membros: da

jedido ds patente con juπtament.e com est.e , e alvo dos agentes família de antibióticos anci utunof es nu nusso copendente (30 553-01) apresentado também são úteis para a preparação da formas an ti tumores do nosso invento. Este? pedido de patente descreve os derivados M-acilo de vários membros do complexo LL-E332S8 que foram preparadas por meios químicos. Estas estruturas propostas são reproduzidas do mesmo modo na Tabela 2.

)

Estruturas Propostas para CH,-5a5~ química do composto da Tabela 1

W derivado por manipulação

V) o substituinte ligado ao CH -SSS- abaixo)

R, ^R5

R-. R R_n X

U v

Di-hidroI

N-acilE->.iz.do«₇

Di-hidro333288*./

Di-hidro8332383_t ¹

N-aci13.332883₁ ¹

Di-hidroE332S8gama

Ar. R< Η H

z. u

Ar R^' H H

Ar_t R₂' H R₄

RCO

Ar R_o' H R ’ (CH^)^CH H

Αι-j R< H R ' (CiU^CH RCO

Α_Γι R₂' H R₄’ C₂H₅

OH Η I =0 I

OH Η I

OH Η I =0 I

OH Η I

T abe1 a 2 (con t. )

Estruturas Propostas para CH-.-5SS-W derivado por manipulação química do composto da Tabela 1 (em que W ã o substituinte ligado ao CH -SSS-)

Designação R R_ri r₃ r₄ R«

RX R, r₇ r₈ r_? X

N-aoilE33238gama₁ Ar^ R

H R₄' C₂H_c

RCO

Di - hid rc

E33288S

N-acilE3323SS.

Iodo LL-E33288 p s e u d o a g 1 i o o n e

Di-hidro-lodo LL-E33288 ρ s e u d o a g 1 i c o n e Di-hidroAr, R,

Ar.

r\,

H

H R₄' CH₃

H R. ' CH-, .j,

Η H

Ar, Η Η H

RCO

E33288B

N-a.ci1 ·

RX

H R ' (CH^)^CH H 4 x« χ

E33288B

EU.--hid ro___Rr

E -·. ç b tí q a m a,

Ar, R^

H R ' (CH-, )_OCH RCO

R,

H R ' Γ. H '₄ “2 5

N—aci1o— E332S8qama, χ

Di-hidrofrn^opp,-, Br N--aoilBr

Ar, RX H RX Γ H

-o

RCO fir, R._.

H R_a' ÍXH_C

E3328 o«,

Br

Ar, R,

H R₄' C₂H₅

RCO =0 I

OH Η I =0 I 0 I

OH Η I

OH H Br =0 Br

OH H Br =0 Br

OH H Br =0 Br

Tabela 2 (	:cont. >	para CH,—SSS—W derivado por	man i pu1ação
Estruturas	Propostas
química do	composto da	Tabela 1
\ em	gue W é o 5:	ubstituinta ligado ao CH,-SS3~)

D a sí i g n a ç Si 0	R1	r2	R, .3	R4	R5	Rr' R, 5 £3	R, f	Ra	R9	X
Di-hidro-
E332S8C!,1	Ari	H	H	R4'				OH	H
Bromo LL-E332SS	Ari	H	H	H					=0	Br
ρ s e u d 0 a g 1 i c o n e
Di-hidro-
Bromo LL-E3328S	Art	H	H	H				OH	H	I
pseudoag1 ícone
N-aceti1—
Esperamicin A^	CHT	r.2'	R,'		(CH,)^CH	CH-.CO H	Arp
N-aceti1-
E s p e r a m i c i η A _	CH,	R?'	R-, '		(CH-,) _CH	CH,CO Aro	H
N-aceti1-
E s p e r a m i c i η A , lb	CH,	r2'	R\'		CH_.CHO	CH-.CO H	Ar

J

R - hidrogénio ou um grupo alquileno (C^-Cj^l ou alquilo (Cj-Cjf,) ramificado ou não ramifiçado, ou um grupo arilo ou heteroarilo, ou urn grupo alquilo (C^—CcO ou heteroanl-alquilo CC| — C=-), todos facultativamente substituídos por um ou mais grupos hidroxilo, amino, carboxilo, alcoxilo (L.J—) inferior, ou tioalcoxilo (C^— C^! inferior.

Alguns outros compostos antiturnores e antibacterianos ão úteis no nosso invento, noraeada,nents:

1? Esperamicina BBM-1675, uma nova classe de potentes antibióticos antituaicrss. I. Dados físico-químicos e estrutura parcia 1. Μ , 1<onishi , et al . , J . An tibiot.ics , 38, 1605 (1985). Um novo complexo antibiótico antituiTiores.

R. B.. 1

M. Konishi.

Pedido uO

R.U.

141 425A, 15 de Maio de 1984.

Novos FR-900 406

FR-900 405 e 1. Taxonomia das estirpes de produção. M. Iwami, et al . , J. Antibiotics, 38, 835 (1985). Novos antibióticos antitumores, FR-900 405 e FR-900 406. II. Produção, isolamento, caracterização e actividade arititumor. S. Kivoto, et al . , J. Antibiotics, 38, 340 ( 19S5 ) .

·, ) .0

PD 114 759 e PD 115 028, novos antibióticos antitumores com potência fenomenal. I. Isolamento e caracterização. R. H. Eíunge, et a I. , 3. Antibiotics, 37, 1566 (1984), Actividades biológicas e bioquímicas do novo antibiótico antitumores PD 114 759 e derivados relacionados. D. W. Fry et a 1., InvestigationaI New Drugs, 4, 3 (1986).

Nu o c o m p 1 e x o ai 111 b i ó 1i l. ; por Streotofnyces sp. ATC Europeia 0 132 082, A2„

Χ-1577Α, CL-1577B produzido 39 363. Pedido cie Patente )

5) compostos antibióticos antitumores a sua produção s utilização.

539 203.

j—· I -í C i — t . » .

•1577E,

Patente dos- EJJ.A.

Compostos antibióticos CL-1724, ;ua produçã.c utilização. Patente dos E.U.A. 4 554 1Ó2.

a.n t i tumores BBM-167 5-A3 por f e r m e n t a ç ã o d s e s t i r ρ e s

N o v o s antibiotic o sΓ;ΟΜ_1 i-— —_^r' 0 ~ í- à- --b&ll-lft/· uuuiuus actinomadura verrucosospora H964-92 (ATCC 39 334) AB27Y (ATCC 39 633). Patente dos E.U.A. 4 675

Q) Novos derivados N-aceti1-esperamicin A,, A_o e A

S actividades an timic robianas e art ti tumores. Europeia 289 030.

e de ou , , c OlTI 1 b

Patente

Toda a. informação relat.iva.mente a ΒΒί'Ί-1075, Fr-900405,

PD 11 4759, PD-115028,, CL.-1577A, CL.-1577B, CL-1577D,

CL-1577E e CL-1724 contida nas citações anteriores é aqui incorporada. por referãncia. As estruturas completas das esperamicinas

FR-90040É, e A., (o complexo BBM—1675) e dos seus respectivos deriva— 1 O dos N-acetilo foram relatadas e são aqui incluídas nas Tabelas í

As características físicas dos outros antibióticos ;s acima nomeados indicam qus todos eles são idênticos ou. mu.ito semelhantes na. estrutura, às esperamicinas e todos contêm

Como pude ser visto a partir das esti uturas reveladas an teriormente, pseudoag1iconí es ι , '-'•o? '-fí! uq ? C | 5 Be· 5 yamS| , í e uompijnentes do complexa LL-332SS, as suas partes

i_urre=-ptjiidentes di—hidr u a N-auilu, bem lciuo cs antibictiLOi BBM-1675, Fr-900405, FR-900406, FD114759, FD-115028, CL-1577A,

CL

1577D, CL-1577E a suas partes pendentes N-acilo, contêm, cada uma delas, um grupo metiltriti· n a s u a e s t r u tura.

Foi agora descoberto que a reacçSo de qualquer u.m dos antibióticos ar, tar iormen te citados com um mercaptano de arilo ou a 1 q u i 1 o n ã o s u b s t i t u í d o o u. s u. bstituído te m c o m o r esu 11 a d o desluLamentu do a,ii3o metilptírtiulato da porç

u.m trissulfureto resultando na formação de um dissulfureto estável, (Esquema I) a seguir. Outros compostos nos quais esta transformação funciona são revelados no pedido EF'0 número 0 313 874A_o publicada em 3 de Maio de 1939,,

CH..-SSS-W

I Q-Sp-EH ί

Q-Sp-SS~W

Esquema I

Os compostos das Tabelas 1 e 2 são transformados com moléculas orgânicas que contêm tiol de acordo com o Esquema I para produzir novas composições úteis por si próprias como agentes antibacterianos e anticancerígenos, em que W, R, R^ , R_,, ? Rq j ^^r-·, ’ R/. ’ Rg 5 Rr * R9 ? Ro' ? R·?' j Rq ' ? ' 5 Ar, Ar_n e X são definidos como anteriormente nas Tabel<

í, U t i. d 5 i. tt JL. _? divalente ou. trivalente de cadeia linear ou. ramificada, radicais arilo ou heteroarilo divalent tri valen ti d i. va 1 en te ou tri va 1 en te ,

Sp são radicais ι te ou radicais cicloalquilo ou heterocicloalquilo (C-r~ Cúp) adiçais aril— ou hetero aril--alquilo (Ci -c_ls) divalente ou. trivalente, radicais cic. loa 1 qui 1 heterocic loalqui 1-alqu.ilo ÍCj-Cjg) divalente ou. trivalente, lquilo insaturado (Í^-C^g) divalente ou trivalente, è um radicais trivalente, pode ser radicais a que se Sp ou ou em adicionalmen te substituído por grupos amino, alquilamino, arilamina, heteroarilamino, carboxilo, alcoxilo intc inferior;

Q é hidrogénio, halogénio, amino, alquilamino, dialquilamino, arilamino, heteroarilamino, psipieridino, ptirrol iclino, iol ou alquiltio piperazmo, •ί Ί. Γni trof s-ni loxicarboni 1 o, car bo:·: aldeído, alcoxilo inferior, hidroxilo, tiol alqui1dicarboxi1o inferior,

-CDMHNH

-NHCOíMHNH,

-CSIMHNH , -NHCSNHNH_O ou -DNH^;

□rn ϊ que quando ίp S etilidina ,-tSiO pode ser hidrogénio; e quando CH^-SaS-W é LL-E33238cí^-Br, α^-Ι, a_Q-Br,

Cí.

^-1 , su-Br, cí-,-1, a„~Br, (3,~Br, β,-Ι .j · o j · 1 · 1 gama^-I, íj-I, gama^-Br, F'D 11475? ,

BBM-1675, Fr-900405,

PD-115028, CL-1577A, CL-1577B, CL-1577D, CL-1577E ou CL-1724 e Sp é divalente, Q não pode ser hidrogénio, halogénio, amino, alqu.ilarilamino, heteroari1amino, piperidino, araino, d i a1q u i1ami no, pirrolidino, piperazina ou carboxilo,

Como enccrpcramerito preferido deste invento, adianta-se que os dissulfuretcs de fórmula Q-Sp~SS-W são preparados a partir de antibióticos antitumores designados por LL—E33288 (CH_SSS-W) em que:

Η Ο · Ί ι ο

OCH, θ_Η

R₅ é CH-,., C^H₅ ou (CH^)^CH;

X é um .átomo de iodo ou de bromo:;

Re á um hidrogénio ou o qrupo RCO, em que w * “ ou um grupo arilo monossubstituido; e >p a u =3o definidos

A transformação dos compostos listados nas Tabelas 1 e 2 para uma variedade de dissulfuretos pode ser conseguida com uma ampla variedade de moléculas orgânicas que contêm tiol para.

produzir novos agentes antitumores e antibacterianos. Além disso, os próprios produtos da reacção são responsáveis por outras transformações dentro da cadeia lateral introduzida recentemente para produzir ainda mais compostos com actividades biológicas.

Os compostos deste invento, em aditamento à sua utilização como agentes antitumores e antibacterianos, são úteis para o lançamento de novos modos de actividade anticancerígena ao nível celular. Os antibióticos derivados naturalmente descritos pelas patentes e pedidos de patente anteriormente referidas não ) contêm unidades cromóforas suficientemente fortes de maneira a que a sua localização intracelular possa ser delineada adequadamente. Quando os derivados tritiometilo nativo reagem com molécu* las que contêm tiol, que adicionalmente contêm uma unidade cromófora que absorve ou emite luz em áreas do espectro electromagnético não obscurecido por cromóforos celulares, podem ser gerados instrumentos bioquímicos úteis para o estudo de roturas de DNA de duplo cordão e localização celular desta classe de compostos.

.)

De um modo semelhante, a introdução de radiomarcadores por esta reacção situa-se no âmbito do nosso invento. Deste modo, por exemplo, quando E-33288gama₁~I reage com 7-(2-tioetilamino)4-metilcumarina, obtém-se um derivado que fluoresce intensamente sobre irradiação com luz ultravioleta, permitindo a localização do composto dentro dos compartimentos celulares.

Nesta encorporação deste invento, os compostos das Tabelas 1 e 2 são transformados com moléculas orgânicas que contêm tiol de acordo com o Esquema I para produzir novas composições adicionalmente úteis como moléculas sonda, em que W, R,

R, ^r9, r₂' ^r3', *'1' ^iX2' ^R3' ^R4' ^R5 · “6' “7' *'8' e X são definidos como anteriormente nas Tabelas 1 e 2,

V'

Ar

Ar,

1' trivalente, radicais cicloalquilo ou heterocicloalquiIo (C--C, a 18 (C_t-C_ig) divalente i_ ... j.. ... ...___t _. .. t i _—, ι ,, .. τ i iet.et ul 1<_ i ues 1 qUi a a i u,U ·

triva1	ente ,	ct d -Ϊ. C ct j. 2 2	ic1oa1qui1-	OU.
(cic	18 1	divalente ou	trivalente,	ou
r-» ' r- 7 u.· l. t—,	~C1 8 }	divalente;

Sp são radicais (C.-C.-,) divalente ou trivalente de cadeia

11b linear ou ramificada, radicais arilo ou heteroarilo divalente ou f ι----------- .

divalente ou trivalente, radicais a.ril- ou heteroaril-alquilo ou

'.o radicais alquilo insaturadc (Cum núcleo fluorescente não substituído ou substituído de dibenzooxacina, rodamina, carbostiri 1 , cuniarina, fluoresceína ou acridina, ou um substituinte que contém um radiomarcador de Ή,

14,

S ou

Τ' como narte da sua estrutura.

Foi também descoberto que o deslocamento da unidade metiltritio dos compostos listados nas Tabelas 1 e 2, e como está esboçado no Esquema I, podem ser utilizados para introduzir um espaçador (Sp>, cuja escolha judiciosa permite a introdução de unidades alvo dentro dos compostos derivados dissulfureto do pedido de patente. A introdução de unidades alvo em outros derivados dissu1 fureto é revelada no Fedido de Patente EPO número 0 313 873A1 oublicado em 3 de Maio de 1989..

<

J o

Assim,, _om referência ao Esquema. I , os compostos de fórmula CH-.S5S-W num antibiótico antitumores designado por

LL-E33288a ^Br, o: ¹ , «_*^Γ, aj Br yaniàj , gama

Br

6<_,

Rr Rr I „ _Br

p.

’ ’ ¹ 1 ’ pseudoaq1icones iodo ou bromo.

I I 1 - 1 partes correspondentes di-Ttidro ou N-acilo, Fr-900405, FR-9O040Ó, PD114759, PD-115028,

OS . -f tr “7 “F Λ I 7 / Η ,

BBM-1675, CL.-1577B, l-L· 15 7 7D , CL-157/L, LL^-1724, ou as suas partes correspondentesN—ac11 o reagem primeiro com um composto de fórmula Q—Sp—SH para ou

produzir um intermediário Q-Sp-SS-W

V em que Sp é um radical (^Ci^_C]_g) divalente ou trivalente de cadeia linear ou ramificada, radical arilo ou heteroarilo divalente ou trivalente, radical cicloalquilo ou heterocicloalquilo (C_-C._o) ) divalente ou trivalente, radical aril- ou heteroaril-alquilo (C,-C,_o) divalente ou trivalente, radical cicloalquil- ou heterocicloalquil-alquilo (C^-Cig) divalente ou trivalente, ou radical alquilo insaturado (C₂-C_lg) divalente ou trivalente, em que se Sp é um radical trivalente, pode ser adicionalmente substituído por grupos amino, alquilamino, arilamino, heteroarilamino, carboxilo, alcoxilo inferior, hidroxilo, tiol ou alquiltio inferior, com a condição de que quando CH -SSS-W é o próprio antibiótico antitu^J τ mores progenitor LL-E33288a₁~Br, α^-l, ^a2^-Br' ^a2~¹' ^a3~^Br' “3 · a4~Br, β^^-Br, B^l, B2~Br, ^β2^-1' gama^^-Br, gama.^-1, ^-l,

BBM-1675, Fr-900405, FR-900406, PD114759, PD-115028, CL-1577A,

CL-1577B, CL-1577D, CL-1577E ou CL-1724, Sp não pode ser divalente; Q é, ou pode ser subsequentemente convertido para, ) halogénio, amino, alquilamino, carboxilo, carboxaldeído, hidroxilo, tiol, α-haloacetiloxilo, alquildicarboxilo inferior, ) -CONHNH₂, -NHCONHNH₂, -NHCSNHNH₂, -ONH₂, -CON₃,

com a condição de que quando Sp é
		-ÇH-CH2- NHCOCHjNB*·	rsA
J
- A
J	e W é como se mostrou	nas Tabelas	1 e 2, anteriores.

Vistu que o prudutu do Esquema contém pelo menos um grupo funcional que pode ser convertido para, ou é directamente reactivo com, uma unidade alvo (Tu), podem ser geradas as formas alvo dos antibióticos. antitumores- das patentes e pedidos de

pstente anteriormente referidas, como se mostra no sequint· Esquema II:

I U.“ *·. V

-> Tu-* Z~Sp~SS-W:

ÍT)

Esquina II em que Q, Sp e W são definidos como anteriormente, .ii í í t j. r po muno ou p.j 1 i c I ljo a I , os seus fragmentos, a t suas partes correspondentes química ou geneticamente manipuladas, ou factores de crescimento ou ssteráides;

Y é uma cadeia lateral amino, carboxilo ou grupo tiol de? uma proteína, ura aldeído derivado da resíduas carbo-hidratos de d 3 £ d ul O ~ x. y KH q1icoproteína, ou um grupo amidoalqui1 tiop e n é um inteiro desde 1 até 100, é formado a. partir da reacção covalente dos grupos 0 directamente ou

-CQNHN--CH-, -CONHNHCH,-, -NHCONHN=CH-,

-NHCSNHN--CH-, -NHCSNHNHCH, —CO_n~·., —, — ss-, após a subsequente redução, s 2 é -CONH-,

-NHCONHNHCH^-, -ON—CH-, -NH-, -NHCH^-, -N-CH--,

J )

-.) ffl é 0,1 5 té 15.

Servindo de exemplo, e com referência ao Esquema II anterior, o derivado do ácido 3-mercaptopropiónico de N-aceti. 1-E~ -33288gama^ (D = CO^H, Sp = -CH^CH^-), quando convertido para a. sua forma hidroxissuccinimida activada (Q ~ CO^Su, Sp - -CH^,CH^-5 , pode ser utilizado para reagir com alguns dos grupos t-amino de resíduos de lisina ía„g.>. Tu = anticorpo monoc 1 ona 1 , Y = -NH,-, em que n - 50-100 a partir de resíduos de lisina disponíveis), a um pH entre 7,0 e 9,5 em soluções tamponi zsd asaquosas a temperaturas entre 4 °C e 40 °C, para produzir formas alvo dos antibióticos ligados aleatoriamente a locais ao longo da espinha dorsal da proteína ( Tu = anticorpo monoclonal, Z - -MHCO-, Sp - -CH^CH^-, m = 1 — 10). Apenas- uma fracção dos resíduos de lisina disponíveis é substituída desta maneira, uma vez que uma elevada carga não é geralmente compatível com a. preservação da imunorreac tivida.de do anticorpo.

Os mesmos imunoconjugados substituídos aleatoriamente podem ser também preparados a partir de derivado do ácido 3-mercaptopropiónico utilizando outros agentes de activação de grupo

J )

LUfliO carbodiisiidas, ou correspondente acilazida. Alternativamente, um derivado 3-mercaptopropioni 1 — hidrazida de N-acetil—E-332SS6j (Q -- H_r,NNHCO—,

-CH_oCH.-,~> , qu.ando rea.gç cont um anticorpo de periodato

1-15) como 4 oxidado (Tu ~ anticorpo ntcnoc 1 onal , Y = -CHO, n está descrita na Patente dos E.U.A. N2 4 671 958 a um pH entra e '7 numa solução tampon i zada. aquosa a uma temperatura entre 4 e 40 °C, reage apenas na função aldeído (derivada da separação de resíduos carbo—hidratas situados na porção Fc dos anticorpos) para gerar conjugados de anticorpo monoclonal que contêm a droga substituída nos locais específicos ao longo da espinha dorsal da proteína ( Tu — anticorpo ntonoclonal, Z

Sp ----- -CH^CH^-, m = 0,5-10).

-CH-NNHCODe modo a bloquear os grupos aldeído que não reagiram e desta maneira evitar o cruzamento, bem coíbo estabilizar as ligações da base de Schiff hidrc-1 iticamente instáveis, é preferível (ainda que não essencial) fazer reagir este último conjugado primeira com um composto tal como acetil-hidrazida ou tirosina-hidrazida, e em seguida reduzir com cianoboro-hidreto de sódio ou boro-hidreto de sódio para produzir os construtos deste (Tu — anticorpo monoclonal, Z — —CH—NNHCO—,

Sp - -CH^CH,

Outros grupos de aldeído reactivo como pa truta da droga estão dentro do nosso invento pa. produtos do Esquema II. Estes grupos funcionais são, mente, ainda que não limitativamente, os que reagem sob condiçSes aquosas acídicas.. A reactividade da proteína sob condiçSes básicas á suficientement maneira a que as suas aminas compitam com os produto· II por aldeídos disponíveis do anticorpo monoclonal.

rte do cons.ra gerar os prefer i ve1 — com aldeídos s lisinas de e grande de s do Esquema Os grupos de aldeído reactivo são, par exemplo, a semicarbasida, a carbazida e as funções de hidroxilaniina o-substituída.

c i o^-seni λ ·

D conjunto de formas alvo dos compostos listados nas Taba las 1 e 2 não se restringe á sequência delineada no Esquema II „ A unidade alvo (Tu) pode ser primeiramente modificada para __A- 1 t o s d a s T a bei a s tioi, que em seguida se faz reagir com os compos 1 e 2 de acordo com o Esquema 111 seguinte:

+ Q-Sp-S-P n

-> Tu-(Z-Sp-SH) (Y) πτ-m

CI-U-SSS-W

Tu-(Z-Sp-SS-W) (Y>

tsouema III n-m

em	que Tu,	V Ί rj W
P	é hidroqé	Ή 7 Ο	ou.
		..
	LJ.ifí j«{· » v		d f
8?	pinha dor	sal	de

cova I ente ip, W, n e m são definidos como anteriormente, e 2~(piridiltio), com a condição de que quando Y parti:

do resíduo de aminoácido da

-Sp tomados conjuntamente são uma ligação

Servindo de exemplo, e com referência ao Esquema III anterior, um anticorpo monoclonal pode reagir com o éster de hicl roxi-succ in imida do ácido 3-(2-ditiopiridi1)propiónico para modificar a proteína através de resíduos de lisina ( Tu “ anticorpo monoclonal, Y ·- NH,, n = 50-100, Q = ~C0_oSu, Sp; = -ΕΗ-,ΟΗς,-, p = 2-p.i ridi 1 tio) .

A seguir è redução com, por exemplo, ditiotreitol, é gerado um intermediário ( Tu = anticorpo monoclonal, Z - -MHCO-,

J )

Sp = —CH_r,CI-L·,·-, rn = 1 até 2 para qe:

15) que pode □5 reagir com oí munoccnjuqados.

i.. Ofít pOS tos

De um modo semelhante·, o 2—iminotiola.no pode reagir com um anticorpo monoclonal para introduzir gropos tiol que requerem uma etapa de redução ( Tu = anticorpo monoclonal,

Sp « -CH_OCH, .i n t e r m e d i á r i o

7. -NHCQ-, pode reagir com os compostos das las 1 e 2 anteriores directamente na reacção do trad ic iona 1 meri te reve 1 ados

Alternativamente, os grupos inerentes de sulfidrilo dentro da estrutura dos anticorpos monoclonais de forma dimérica quando resíduos de cistins podem ser utilizados para participar Esquema III. Estes sulfidrilos são por uma combinação de redução e digestão enzimática de anticorpos monoclonais nativos (Tu = fragmento Fab', Z-Sp - ligação, Y = SH>, mas a utilização de construtos geneticamente alterados de anticorpos monoclonais que contêm resíduos de cistina. desempa.rel hados é do mesmo modo contemplada

Uma encorpcração preferida de derivados alvo deste invento é uma proteína-conjugada de fórmula

Tu-(Z-Sp-SS-W) (Y) n-m preparada a partir da classe de antibióticos antitumores designada LL-E332S8 (CH-rSSS-W) que compreende:

o deslocamento da porção ditiometilo com um composto de fórmula Q-Sp-SH, em que

Sp é um radical divalente ou trivalente de cadeia linear ou ramificada ou radical aril- ou heteroaril-alquilo (C·,heteroari1-a1qu iIo ou divalente ou trivalsnte, em que se Sp é um radical pode ser adicionalmente substituído por grupos amino, amino, hidroxilo ou tiol; e

Q é, ou pode ser subsequentemente convertido para alqu.ildicarboxilanidrido inferior, -CONHNH^ ou.

j trívalente, heteroaril^C02 \Q/ ^tK>2 para produzir um intermediário de fórmula Q-Sp-SS-W, em que Q, Sp e W são definidos como anteriormente, a reacção de Q-Sp-SS-W com uma molécula de fórmula

Tu-(Y) em que n

Tu é um anticorpo monoclonal que mostra reactividade preferencial com um antígeno associado a tumor humano,

Y é um grupo amino de acdeia lateral sobre o anticorpo, ou um aldeído gerado por oxidação dos çjrupos carbo-hidratos do anticorpo, e n é um inteiro desde 1 até ICO, para produzir um composto de fórmula:

Tu-(Z-Sp-SS-W) n-m em que Tu, Y, 5p, W e n são definidos como anteriormente, e

Z se formou directamente da reacção covalente dos grupos; D e ’ ou «pás a subsequente redução, e Z é -CONH-, -CONHN-CH-, -CONHNHCH-,-, ou

-NHCOCH^-ÓH i (ώ-^)_ίΛ l --· ··· Jl ^x

ÓHJd e m έ 0,1 até 15.

Numerosos anticorpos monoclonais diferentes (MoAbs) são utilizados para exemplificar a. formação como alvo dos compostos anticancerígenos meti 1tritio. Os McAbs Lym 1 e Lym 2 reconhecem diferentes antigénios em linfócitos B maduros e os seus produtos 1 infomas. A produção e características destes MoAbs são descritas

por A. L	. Epittíin, ttt a 1 . ,	em Câncer	Research, 47
Os Mo Abe;	B 7 2 „ 3 a j u s t a m—s e	como alvo	principalmen te
-_j ct ϊί)ΗίΤϊΐ3	e do cólon, ainda q	ue também	tenha sido not
da.de com	carcinomas do pSnc	:reas, dos·	ovários e dos

SntiCurpu idi uSSi-Tj.

to por T. L. Klug, et al . , ?s. 0

Cancer

38, 681 (1986).

MoAbs CT-M-01 ia mama 5 descrito no Ped que reconhece principalmente tumores » de patente EPO N9 86 401 482.4 apresentado em 3 de Julho de 1986, e o MaC-68 é produzido por um sub-clcne do hibridoma que produz CT-M-01 e reconhece carcinomas não só da mama como também do cólon. Ds intermedíé.rios dos úteis

M )Tí p zb u U —· Ε fl) <?. ro S U i l C. LJ . ud Q Lo conjugados uCiTi ectes anticorpos, são n a.

descritos na seccão experimental

Contudo não deve ser entendida que esta patente se restringe ou está limitada aos anticorpos è frente .mencionados. Em vez disse, e ao contrário, a. metodologia é su.fieien temente geral para que possa ser aplicada a todos os anticorpos sem olhar à sua classe ou isotipo, aos seus fragmentos enzimáticamente derivados, sos seus fragmentos manipulados e estabilizados quimicamente, assim como às suas respectivas partes correspondentes quiméricas ou humanizadas. Nem estão as unidades alvo restritas apenas aos anticorpos monoclonais. Outras proteínas, bem como moléculas para as quais existem receptores em saídas alvo, estão dentro do alcance da nossa descoberta como entidades alvo.

Os compostos deste invento designados por Q-Sp-SS-W são activos como agentes antibacterianos.

A sua actividade antibacteriana pode ser determinada contra bactérias gram-pcisitivas e gram-negativas por um método de diluição de ágar padrão. Verteu-se em caixas de Petri ágar de Mueller-Hinton qus continha concentrações dos antibióticos diminuídas duas vezes. As superfícies de ágar foram

Λ unidades formam colónias de bactérias por meio de um dispositivo de r e ρ I i c a çao S t e e r concentração mais ba.i:

íe antibiótico antitumor

N—aci1—LL—E332SS que inibiu o crescimento de uma estirpe bacterians após cerca de 18 horas de incubação a aproximadamente 35 °C foi registada como sendo a concentração inibitória mínima (MIO para essa estirpe.

anteriormente descritos são agentes antitumores activos. Certos protocolos e sistemas de teste in vivo tem sido desenvolvidos pelo National Câncer Institu.te para determinar a sua adequação como

3Π t ί -Π eoplásicos. Estes têm sido relata rapy Reports, Parte III, Vol. 3, N2 2 Estes protocolos têm estabelecido testes anti tumores.

) para o me 1anó Estes t r a n s ρ sign i f presente tic o BI6, neoplasmas nvento o eucemia LI são util lantâveis em ratos, icativa, mostrada nest

o fc m '' i_- a n t_ e r C h ε-? m o t h e · (1972), Geran, et al.. de rastreio padronizados io campo de teSí-agem para agentes são particularmente significativos 1 e u cen: .i a 1 i n f o c í t i c a P338, m e 1 a n om a 21© e adenocarcinoma do cólon 26. izados para testaçem como tumores Seralmente, a actividade antitumor es protocolos por um aumento percentual do tempo de sobrevivência médio dos animais tratados (T) sobre os animais de controlo (C), é indicativa de resultados semelhantes em leucemias e tumores sólidos humanos.

tr; U u. e m 1 a.

P3Q3

	Os animais
ou	ó ratos por grupo
por	injecção intrape
que	continha 1x!0~
zer	r\ .

utilizados foram ratos fêmea BDF _χ . Havia 5 de teste. 0 transplante do tumor foi feito itoneal de 0,5 ml de fluido ascítico diluído élulas de leucemia linfocítica F'333 no dia

Os compostos de teste foram administrados intraperitonealmente num volume-? de 0,5 ml de solução salina normal estéril livre de pirogénios nos dias 1, 5 e 9 (relatívamente è inoculação do tumor) nas doses indicadas.

Ds ratos foram numa base regular durante sobrevivência médio s a ra tratados (T)/ de controlo iguais ou superiores a pesados e os sobreviventes registados 30 dias. Foram calculados o tempo de zão tempo de sobrevivência de animais

CC). Considera-se qu.e os valores de T/C 125 refletem actividade antitumores signi ficativa.

J )

J )

Tabela 3

Teste Leucemia Linfocítica P388

Composto	Dose (mg/kg)	Sobrevivência Média (dias)	T/C x 100 (%)
Dissulfureto do ácido	0,005		145
3-mercaptocaptopiónico	0,0025		125
de LL-E33288gama -I
(do Exemplo 1)
Dissulfureto do ácido	0,010		135
p-nitrofenil-3-mercaptopro-	0,005		185
piónico de LL-E33288gama -I	0,0025		150
(do Exemplo 2)	0,00125		130
Dissulfureto de 3-mercapto-	0,005	18,0	164
propionil-hidrazida de	0,0025	25,0	186
de LL-E33288gama -I	0,00125	19,0	173
(do Exemplo 13)	0,0006	15,5	141
Controlo	-	11,0	-
Dissulfureto de 3-mercapto-	0,040	15,0	136
propionil-hidrazida de	0,020		123
de LL-E33288a -I

(do Exemplo 6?

Controlo	—	11,0	*“
Dissulfureto de 3-mercapto-	0,080	21,0	175
propionil-hidrazida de	0,040	18,0	150
de N-acetil-LL-E33288gama -I	0,20	15,0	125
(do Exemplo 7)
Controlo	-	12,0	-
Dissulfureto de 3-mercapto-	0,010	26,5	230
propionil-hidrazida de	0,005	21,0	183
de LL-E33288a -I	0,0025	18,5	161
(do Exemplo 8j	0,00125	18,5	161
Controlo	-	11,5	-

Tabela 3 ícont.)

Teste Leucemia Linfocítica P388

Composto	Dose (mg/kg)	Sobrevivência Média (dias)	T/C X 100 (%)
Dissulfureto de 3-mercapto-	0,005	28,5	190
butiril-hidrazida de	0,0025	23,0	153
de LL-E33288gama -I	0,00125	21,0	140
(do Exemplo 10)	0,0006	19,5	130
Controlo	-	15,0	-
Dissulfureto de 3-mercapto-	0,010	26,5	252
valeril-hidrazida de	0,005	18,0	171
de LL-E33288gama -I	0,0025	17,0	162
(do Exemplo 11)	0,00125	16,0	152
	0,0006	13,0	.124
	0,0003	14,0	133
Controlo	-	10,5	-
Dissulfureto de p-mercapto-	0,005	24,0	200
di-hidrocinamil-hidrazida	0,0025	28,0	233
de LL-E33288gama -I	0,00125	25,5	213
(do Exemplo 12)	0,0006	18,5	154
	0,0003	17,5	146
Controlo	-	12,0	-
Dissulfureto de 3-mercapto-	0,32		118
isovaleril-hidrazida de	0,16		205
N-acetil-LL-E33288gama -I	0,08		166
(do Exemplo 13)	0,04 0,02		133 117
Dissulfureto de 3-mercapto-	0,32		142
butiril-hidrazida de	0,16		155
N-acetil-LL-E33288gama1~I	0,08		115
(do Exemplo 14)	0,04 0,02		102 109
Dissulfureto de p-mercapto-	0,32		75
di-hidrocinamoil-hidrazida	0,16		150
de N-acetil-LL-E33288gama -I	0,08		209
(do Exemplo 15)	0,04 0,02		150 146

Τ a-Ξ- te Ne 1 anoíra «Y*

Qs animais utilizados podem ser ratos fêmea BEU^. Há normalmente 5 ou 6 ratos por grupo de test.e.

Uma porção de um grama de tumor melanoma mslanótico Bló é homogeneizado em 10 ml de uma solução de sal balanceada fria, e são implantadas intraperitonalmente, em cada um dos ratos de teste, alíquotas de O,5 ml do homogeneizado.

Qs compostos de testa são administrados intraperitonealroente nos dias 1 até 9 (relativamente à inoculação do tumor) nas doses indicadas.

Os ratos são pesados e os sobreviventes registados numa base regular durante 6Θ dias. São calculados o tempo de sobrevivência médio e a razão tempo de sobrevivência de tratados CT)/ de controlo OC).Considera-se que as valores de T/C iguais ou superiores a 125 refletem actividade antitumores significativa.

Qs iTié to d d^ste invento utilizados para produzir' conjugados de anticorpos monoclonais dos compostos das Tabelas 1 e 2 e designados por Tu-<Σ-Sp-SS-W) ί

ι ί V i ’ ¹ ‘ n-m produzem construtos que retêm boa imunorreactividade com linhas de células alvo, como se determinou pelos seguintes ensaios in vitro:

como o REMI 1640

Co1laboratiperi .i c i 1 i n a e glutamina de CO-, a 5 7.

Todas as células alvo foram mant reforçado coa Soro Fetal de Vitela (FCS) a ve Research, Cat# 40 351), estreptomicina (50 unidades/sil) , sulfato de gentamicina (0,03 λ). As células foram mantidas numa humidificada a 37 *C.

idas em me cr τ T (50 pg/ml) (50 μι g/ml ) incubadora

I .

Ensaios dg Imuncrreactividade * Foram feitas colheitas de células alvo apropriadas que em seguida foram contadas s suspensas numa solução salina em tampão fosfato Dulhecco (DPBS) a uma. concen tração óptima para serem testados anticorpos (nonoclonais (MoAb). Introduziram-se

0,1 ml de células em cada uma das cavadidades de uma placa de 76 )

cavidades de polistireno para cultura ds tecido estéril. As placas foram centrifuçadas durante 5 minutos a 1000 rpm e o ) sobrenadante foi separado por sacudidelas. As placas foram secas ao ar durante a noite e podem ser armazenadas a 4 ’^:'C até um prazo de tr'ê‘5 meses.

Prscasss I - Elisa

Foram bloqueados os locais de ligação não-específica por adição de 20« μΐ de gelatina a 1 em DPBS por cavidade e por incubação da placa durante 1 hora a 37 ^C'C numa incubadora húmida. (Todas as incubações subsequentes foram feitas sob condições semelhantes). As placas foram lavadas uma vez com 250 pl de TWEEN-20 a «, 25 7. em DBPS (solução de lavagem) utilizando o sistema de lavagem automatizado ELISA da Dynatech (Ultrawash 11).

As amostras a serem testadas foram diluídas até se ter uma. concentração final de 3 μ g/ml de equivalentes de MoAb em gelatina a 0,1 %-DPBS. Preparam—se seis séries de diluições triplas adicionais a partir de cada amostra de 3 μΐ/ml e foi adicionado 100 μΐ às cavidades apropriadas em triplicado. A fila de fundo ce cavidades apenas recebeu 100 μΐ de gelatina a 0,1 como fundo.

placas

minutas farara fts placas farara incubadas durante seguida lavadas por três vezes. Foi feita, uma diluição de 1:1.25 de iraunoglobu.1 inas anti-rato de cabra purificadas de afinidade conjugada de fosfatase alcalina (Cappel Cat # 8611-0231) em gelatina a 0,1 7. e foi adicionado 1.00 μΐ a cada cavidade. As placas foram incubadas durante 45 minutos e em seguida lavadas por três vezes. Foi adicionado a cada cavidade 2Θ0 μϊ de solução de substrato de gç-nitrcfeni 1 fosfato (ver abaixo) . Após 45 minutos à temperatura ambiente parou-se a reacção pela adição de SO μϊ de NaOH 3 M. Foi lida a absorvãncia dos conteúdos de cada cavidade em 4C5 nra no espectrofotómetro automatizado da Dynatech (EIA Autoreader # EL-310).

Substrato de Tampão de Dietanolainina (10 7.)

Distanolamina - 97 ml Água — S00 mI NaN, - 0,2 gramas MgCl.-, „6 H_r,0 - 10© mg

Os foi adiciona total de 1 1 filtro de 0, reagentes foram dissolvidos por agitação contínua e do HC1 1 M até o pH ser 9,3. Foi feito um volume itro com água e estsrilizou-se por filtração com um 2 μ. 0 tampão foi armazenado no escuro a 4 '^:'C.

Imediatamente antes da utilização foi dissolvida çr-nitrofeni 1 fosfato (Sigma, Cat# 1Θ4-40) no tampão de dietanola.mina. a 1© 7. (deve estar à temperatura ambiente) para dar uma concentração final de 1 mg/ml.

Cálculo dcs Valores

A percentagem de ligação de cada amostra foi calculada pela seq u i. n t e eq u aç ão:

A - B

- IDO = X de Ligação

C - B

A - média	de	0.	D.	da	•amostra de teste
B ~ média	de	□»	D.	do	fundo
C = média	de	0.	D.	do	controlo de MoAb não ma	nipulado a	i ·?

igação foi registada numa escala não logarítmisemi-loqarítmico e a concentração de MoAb foi a logarítmica» A <i.e. dose de anticorpo r 50 % de liaacão) da cada amostra ds teste foi

A Â de 1 ca de um gráfico registada na escal necessária para da derivada do gráfico e a quantidade de retenção de imunorreactividade foi calculada pela seguinte equação:

BCc- do controlo de MoAb '00

BIX,-, da amostra de teste

/. de Imunorreac ti vidade retida

Frcicesso 2 — RIA Indirecto

Foram introduzidas ds modo igual em no de 4 ml quantidades apropriadas de células meio FCS a 10 %. As amestras a serem testadas

tubos	de	polistire-
a 1 ν o	ei?;	0,2 m 1 d e
foram	dil	u xdas até

em as uma concentracã·

pg/ml de equivalentes de McAb em meio FCF

1Θ X. Preparam-se cinco séries de diluições triplas adicionais partir

de	cadd ?,)
do	0,2 ml
E4	0 meio
	As cél

a a '2 ng/ml e foi adicionado a cada tuba i amostras de fundo receberam apenas em seguida lavadas por duas vezes (todas as lavagens de RIA foram feitas com um volume de 3 ml) com meio FCS a 2 X. Foi adicionado a cada tubo 0,05 ml de F(ab')_o de carneiro IgG C II (DuPont, Cat# NEX 102-0142) contendo aproximadamente 500 000 de CPM s;; as células foram incubadas durante mais uma hora a 4 *C, lavadas uma. vez com FCS a 2 X e por duas vezes com PBS. Foi adicionado 0,5 ml cie PBS a cada tubo, as células foram turbí1honadas, transferidas para tubos limpos e contadas durante 1 minuto num Packard Gamma 500.

A X de ligação de cada valor foi determinada e registada em gráfico como na equação de Elisa precedente, exceptuando as unidades O.D. que foram substituídas por CPM's, sendo C =^: Média

IPM's de controla de MaAb não manipulado a 1 pg/ml de imunorreactivida.de retida de cada amostra maneira previamente discutida.

foi calculada da

Prccess

V!

RIA directc

Foram introduzidas ds modo igual em tubos de tes polistireno de 4 ml quantidades apropriadas de células alvo em 1 ml de meio FCS a lê dos sobrenadantes até haver uma concentração de 200 pg/ml de equivalentes de McAb em meio FCS a 10 X. Preparairi-se cinco séries de diluições triplas t>== + = 'iadas de células cr. g ί. Π á 3 — ^r~, hs amostras a serem testadas foram diluídas

-)

J )

adicionais a. partir de cada amostra a. 200 pg/ml e :ada yy:

ml ub:

125_T f o i a d :i. c i o n a d a duplicado 0,05 ml. Foi adicionado

W F-.

quantidade óptima determinada para, cada MoAb ε conjunto!

Í25_T meio e Iespscí-ficas, a ri a .nd i v i dua. 1 men te

cstr	õt?»	de contri	□ 1 o	pos i t i vo con t i n ham	us1u1as,
1-,	Λ ... Mb	amostras	ds	•fundo con tinham cé	lulas não
		1 ms
eio	&	^'“I-McAb	-	As células foram	incubadas
a 4	*C,	lavadas uma	vez com meio FCS a	2 X, duas

e contadas cia manei:

an teriormente vezes com PBS, transferidas mencionada.

A 7. de inibição de liqação de foi calculad;

100

12t

I-MoAb de cada amostra jequinte fórmula:

05

7. de inibição de ligação de I-MoAb

A - media	dê?	CPM'	s da	amostra
B = méc!ia	de	CPM'	s do	fundo
C ~ media	dê?	CPM's do	controlo
	0 r	-egisto em	: gráfico

por cada re t i d a amostra foram calculados da maneira anteriorments discutida, excepto que a BD_e._ft •-/V sáris par* dar de inibição da ligaçí agora ΒI Εν.-, ( D o se de Μ o A b de ^'i -M-oAb) .

necesWot ss ::

1) Os tubos foram sempre vi.goross.men te turbi. 1 honados imediatamente depois da adição de qualquer reagente nas RIA' s .

2) IJma amostra de controlo interno igualando 50 7. do controlo da MoAb n'áo manipulado foi incluída em cada

*) conjunto de ensaios para confirmar qual dos processos foi quantitativo na predição da retenção de imunorreactividade dos conjugados.

Ds resultados destes ensaios estão tabulados na seguinte Tabela 4..

>

.)

J )

I muno r reac ti vidade de Conjugados de No Ah

Cunjugaduis r/áu «spauífiuos

u. t i 3. i. z a. n d o o p r o d u. t o d a hidrazida do dissulfureto do ácido 3-mercaptopropiónico do L.L--E332S8U./ (Exemplo &) conjugado para: Preparação

Lym 1 CT-M-õl

.)

*i de Imunorreactividade do controlo do MoAb não m od i f i c ado

Hidrazida do dissulfureto do ácido 3-mercaptopropiónico da N-aceti1-,

...I I ..CTT^QO S? * t_. i_ i_ -«.· x >_» <__> o .

(Exemplo 7) c o n i u cj a d o p a r a :

L-yn?—ΐ 82

CT-M-01 100

B72..3 100

Hidrazida do dissulfureto do á c 5. a o 3-mercaptopropiónico do LL.-E33288a^ (Exemplo 8) c on ju q a d ο ρ a r -a “

CT-N-0Í.....

Hidrazida. do dissulfureto do ácido 3-mercaptopropiónico do pseudoag 1 icone de LL.-33238 de iodo (Exemplo 9) con j uqado d ar a.:

CT-N-01

Hidrazida do dissulfureto do A ci á o 3—mi e r c a do L.L-E33288Ó (Exemplo 10) çonj uQado_ para. s Lym-1 p^obutirico (con t i.

I_m-1-^f~^!õ~c t ividade de Conjugados ds MoAb

,) Hidrazids do dissul fure to do á c i d o 3 - ít: e r captei so va 1 é r i c o do LL-E3323SÍ· (Exemplo 11) ¹ c o n j Li q a d o para:

Lym-1 ) Hidrazida do dissulfureto do ácido 3-mercapto-di-hidrocinântico do LL-E332S36· \ (Exemplo 12) ' ^c- ^i:,r‘4 ^L1 d ^a o P a r s l„.ym-l í de Imunorreactividade do controlo do MoAb não mod i f ic a,d o

Os conjugados de anticorpo monoclonal deste invento são agentes anticancerígenos activos. 0 ensaio a seguir descrito que dá. acesso à citotoxicidade in vitro mostra a dramática preferência dos construtos por filas de células alvo quando opostas a células não alvo, e dá uma medida da utilidade de formas alvo dos compostos quando comparada com as suas partes correspondentes não

t.n_saios de Citotoxicidade

In Vitro

As amostras a serem concentração de @,2 ou @,02 progenitora (a concentração de a ser testada e da potência testadas Toram diluídas até uma pg/ml de equivalentes da droga partida depende da fila de célula a droga progenitora). Preparam—se três ou quatro diluições quíntuplas adicionais a partir de cada diluição de. amostra original e foi adicionado 0,2 ml a tubos de polistireno de 15 ml. Foi incluído em cada ensaia pelo menos um conjugado semelhante costituído pela droga progenitora e um MoAb irrelevante para determinar a especificidade do conjugado relevam re „

Foram colocadas das em 0,2 ml de meio FCS aditamento, foi realizado .i rrβ 1 evantes c omo a 1 vos pa em cada tubo 1©^J células alvo apropriaa 10 7 e sm seguida turbi1honadas. Em um teste idêntico utilizando células .ra posterior confirmação da especificidade do conjugado relevante. Os controlos de Mofib receberam apenas quantidades equivalentes de McAb e as amostras de controlo positivo receberam apenas meio FCS a 10 7.

As células foram incubadas a 37 *C durante 7 minutos, em seguida lavadas quatro vezes com S ml de meio FCS a 2 7. Foi adicionado a cada tubo 0,1 ml de FCS a 10 7, as células foram turbi1honadas e foi distribuído 0,2 ml por cada cavidade de uma placa de cultura de tecidos de polistireno de 96 cavidades.

As placas foram incubadas durante 2 dias numa, incubadora a 37 ’-'C humidificada com CQ._, a meio e substituído por meio recs 2 pCi/ml de Ή timidina (Do.Pont, MEN continuou durante 24 horas, as célul geladas e colhidas por um ceifador ( Cada amostra foi contada durante cintilação Beckman l_S 580© em Canal mento foi calculada como se seque:

7. Foi ntemente r- +- -Μ- κicT-Am removido .metade do preparado contendo as foram congeladas, descon— Cambridge Technology, Inc.). um minuto num contador' de 1. A 7 de inibição de cresciMédia de CPM de valor de teste

100 de Crescimento

Média de CPM de controlo do meio

100 - 7. de Crescimento = Z. de Inibição

A percentagem de inibição foi registada em gráfico numa escala não logarítmica de um gráfico semi-logarítmico e a concen) tração da droga progenitora na escala logarítmica. A IC,-^ íconcentraição da droga progenitora necessária para dar 50 '/. de inibição) de cada amostra de teste foi derivada dc< gráfico e a } quantidade de retenção de citotoxicidade foi. calculada pela s e g u i n te e q uacão:

IC^-^ da droga progenitora ——---x 100 71 de Citotoxicidade retida

ICcjpj da. amostra de teste

Os resultados do ensaio de citotoxicidade in vitro estão tabulados na Tabela 5 seauinte:

')

J )

Tabela 5

C i t. u t ux i c i d a d s I n	Vitro ds Conjugados	ds McAb
	Mo At)	C i t o t o x i c i d a d e

Conjugado da hidrazida preparado utilizando o produ.to do Exemplo 6 com:	Lym 1 CT-M-01	’/. de LL-33288CU1 5Ô0 300
Conjugado da hidrazida preparado utilizando o produto do Exemplo 7 com:	Lym 1 cT-M-ei	7. d e N - ac e t i 1 y -LL-3328SU-, 400 700
Conjugado da hidrazida preparado utilizando o produto do Exemplo 8 com:	CT-M-01	7. do produ.to do Exemplo S -18
Conjugado da hidrazida preparado utilizando o produto do Exemplo 9 com:	CT-M-01	X do produto do Exemplo 9 100
Conjugado da. hidrazida preparada utilizando o produ.to do Exemplo 10 com:	Lym 1	7. do produto do Exemplo 1Θ 400
Conjugado da hidrazida preparada utilizando o produto do Exemplo 11 com:	Lym 1	X do produ.to do Exemplo 11
Conjugado da hidrazida preparada utilizando o produto do Exemplo 12 com:	Lym 1	X do produto do Exemplo 12 560

sistema, de ensaia seguinte foi utilizado para medir actividade in vivo dos conju^sdos deste invento»

Os testes in vivo de actividade antitumor sobre conjugadas de anticorpo monoclonal da droga foram feitos utilizando xenógrafos de tumor humano em ratos atímicos (nu.s) .

Foram feitas colheitas em frascos de cultura de células de mieloma (HS Sultan) e de linfoma (Raji) de Burkitt e inoculaά A das su.bcutaneamen te (>= 8© ;·; 1© células Raji ou 40 x 1© células HS Sultan) em ratos de teste. Tumores sólidos, carcinomas do ovário (CA73, Ovcar-3), carcinoma da mama (MX-1) e carcinoma do cólon (LS174T) propagaram-se nos ratos atímicos, foram removidos, cortados em fragmentos de 2 mm³ e foram implantados subcutaneamente em ratos de teste (5-3 fragmentos por rato).

Foram administradas intraperitonealmente drogas, anticorpos monoclonais e conjugadas de anticorpos monoclonais de drogas, uma vez cada três dias para um total de 3 ou. 5 injecçSes a partir dos dias 2, 3, 4, 6, 7 ou 8 dias após a implantação do tumor. As medidas do tumor (comprimento e largura do tumor) foram feitas por meio de um calibrador electrónico Fowler ultra CAL II cada 7 dias durante 4 a 6 semanas após a implantação do tumor. A massa do tumor em mg foi estimada a partir da fórmula:

Comprimento (mm)

Largura (mm)

A inibição do crescimento do tumor foi calculada para cada gru.po de teste como uma. percentagem do controlo Emédia de mg de tratados (T) dividida pela média de mg do controla (C) χ 1©©3. é considerado necessário um va.lor de T/C ·ί= 42 % em grupos com percentaqem de animais que sobrevivem actividade.

7. para demonstrar

Os resultados deste ensaio aparecem na Tabela ó.

Tabela b

Resultados da Testaqem Antitumor In Vivo

Dosagem (pq) Tamanho do Tumor F/T Mo Ah Droga (T/C) /, do controlo

Hidrazida do dissulfureto 23 0,75 1,3 ó/ó do ácido 3-mercaptopro-j piónico do LL--E332S8u_. conjugado para Lym 1

LL--E33238a,^ isolado		-	O, 75	365	6/Ó
Hidrazida isolada		-	0,75	330	6/6
MoAb Lym isolado		28	-	63	.C / .í_ ·._> / Q
tratamento ip contra filas de Burkitt humano, tre's injecçSes tação do tumor e medidas feitas tumor	célul i n i c i no	as de Raj i adas no dia dia 23 após	TC de linforna 7 após a impl a implantação	de an — do

Hidrazida. do dissulfureto do ácido 3-mercaptopro^ piónico do LL--E33288C!.,* conjugado para CT-ΙΊ-ΌΪ	83	2,0	0,02	6/6
LL-E33288a^.1 isolado	-	2,0	-	0/6
MoAb CT-ΙΊ-ΘΙ isolado	33	-		5/6
Vincristine (controla positivo)	—	20	1,2	5/5

tratamento ip contra filas de células MXOl de cancro da mama humana, três injecçSes iniciadas, no dia 2 após a implantação do tumor e medidas feitas no dia 35 após a implantação do tumor

J )

Tabela ó (continuação)

Dosagem ( p.q ) Tamanho do Tumor F /T MoAb Droga (T/C) */„ do controlo

Hidrazida do dissulfureto de N-CEÍ4-metilcumarin-7-i1)am ino3acetil3-cisteín a de LL-E33208S conjugado para Lym 1	50	0,22	'ÇiT	7/7
Hidrazida isolada		0,22	228	4/7
MoAb Lym 1 isolado	50	-	ώ 1	7/7
Mistura de hidrazida mais MoAb Lym 1	50	0,22	56	7/7

tratamento ip contra -filas de células de Ra j i TC de linfoma de Burkitt humano, trâs injecçSes iniciadas no dia 7 após a implantação do tumor e medidas feitas no dia 35 após a implantação do tumor

Hidrazida do dissulfureto 125 1,0 do ácido 3-mercaptopropió- , nico do N-aceti1-LL-E3328Q£ conjugado para CT-M-01

0/ó

Hidrazida isolada

2,0

Mistura de Nvacetil- 125 1,0 —L.L.-E332886' ¹ mais MoAb CT-M-01

1/6

N-aceti 1-LL-E33288S ¹ -1,0 46 2/Ó tratamento iv contra filas de células MX-1 de cancro da mama humana, trâs injecçSes que se iniciam no dia 2 a seguir à implantação do tumor, medidas feitas no dia 42 após a implantação do tumor

J )

abe la ãn)

.) >

ι continua;

	Dosac	< UQ >	Tamanho do (T/C) 7 do c	Tumor F/T on tro1 o
MoAt	) Droga
Hidrazida do dissulfureto do ácido 3-mercaptopropió- . nico do N-aceti 1-LL--E33288Í;/ conjugado para Lym i	37	1,0	11	6/6
Hidrazida isolada	-	1	517	6/6
N-aceti1-LL-E332S8£ , 1 isolado 1	—	0,5	226	6/6
MoAb Lym 1 isolado	j' /	-	178	6 /6

tratamento iv contra filas de células de Raji TC de linfoma de Burkitt humano, três injecçSes iniciadas no dia 7 após a implantação do tumor e medidas feitas no dia 35 após a implantação do tumor

Hidrazida do dissulfureto 127 2,7 do ácido 3-mercaptopropió- , nico do N-aceti 1-LL~E33288<S conjugado parai E<72.3

N-acet.il-LL-E33283ij - 2,0 iso1ado

1/6

MoAb B72.3 isolado

127

6/6

Vincristine (controlo - 20 positivo) tratamento iv cont hum ano, t res i n j ec do tu.mor e medidas a filas de células LS174T de cancro do cólon Ses iniciadas no dia 8 a seguir a implantação fei. eus no dia ul apos a implansação do tumor

J )

Tabela

Dosaoem (i_tq ) Tamanho do Tumor F/T Mcftb Droga (T/C) 7. do controlo

Hidrazida do dissulfureto do ácido 3-mercaptopropíó11:

2,7 )/ 6 conjugado para CT-M-01

N-acetil-LL-E33233-S i.so 1 eido

Vincristine (controla - 20 positivo) tratamento iv contra filas de célu.las LS174T de carcinoma do cólon humano, três injecçSes iniciadas no dia 3 a seguir à implantação do tumor e medidas feitas no dia 21 após a implantação do tumor

Hidrazida do dissulfureto 24 1,0 0,33 do ácido 3-mercaptoproj piónico do LL—E33283cí,_, con j u g a uo ρ a r a. C T - Id - 0 í

Hidrazida isolada - 1,0 - 0/6 tratamento iv contra filas de células MX-l de cancro da. mama humana, três injecçSes iniciadas no dia 2 a sequ.ir à implantação do tumor e medidas feitas no dia 35 após a implantação do tumor invento será adicionalmente descrito em conjunção com os seguintes exemplos não limitativos.

Exemplo 1

Dissulfureto do ácido 5-mercaptepropiónico do

LL.~E332SSciama¹

-----------------------_j.—

A uma solução de 90 mg de LL-E33233qamaem 90 ml de acetonitrilo foi adicionado 10,ó mg de ácido 3-roercaptopropiónica em 1 ml de acetonitrilo. A solução foi turbilhonada e em seguida armazenada a -20 °C durante 6 dias. 0 solvente foi removido in vacuo e o resíduo foi cromatografado sobre 10 ml de gel de silica em cloreto de metileno. A coluna foi revelada com 50 ml de cloreto de metileno, 50 ml de metanol a 4 X em cloreto de metile— no e finalmente 10Θ ml de metanol a 3 7. em cloreto de metileno,

A evaporação desta última fracção deu. um resíduo que foi recebido em acetato de etilo com a ajuda de um pouco de acetona e adicionado gota a. gota a um excesso de hexano. 0 precipitada foi recolhido a seco, dando 39 mg do produto desejado (EMFAB, M+H 1394).

Ε χ em ρ 1 o___2

Dissu.l furetci do ácido p-nitrcifenil-5~n)erca.ptc?prc)piónicc)_dg (A) Preparação do éster de ρ-nitrofenilo do ácido 3-me r captcprcpiónico

Tratou-se ácido 3-mercaptopropiónico comercial em cloreto de metileno contendo, uma quantidade catalítica de ácido sulfurico concentrado, com isobutileno durante 20 minutos. A solução foi em seguida extractada com solução de bicarbonato de sódio 1 N após o que a solução de cloreto de metileno foi seca utilizando sulfato de magnésio anidro. A solução foi em sequida evaporada até dar um líquido móvel incolai' espectro de massa indicaram ser o éster S -1 - b u t i 1 m e r c a ρ t o p r o p i ó n i c o.

cujos valores de RMN e de t-butilo do ácido

Uma quantidade deste éster foi refluxada com ácido clorídrico ó N em dioxano durante 2,5 horas. 0 solvente foi evaporado, foi adicionado acetato de etilo e esta solução foi extractada com carbonato de sódio. 0 extracto de carbonato de sódio foi tratada com áoido clorídrico ó N ate o pH da suspensão ser 2,0. A suspensão foi etilo, o extracto foi seco em seguida extractada com acetato de sobre sulfato de magnésio anidro e o solvente foi evaporado até dar um líquido incolor cujos valores de? RMN e espectro de massa indicaram ser o ácido S-t-butilmerc a p to p rop i én i c o.

nilo por

Este composto tratamento com foi convertido para o éster de jo-ni.trofequantidades equimolecu1ares de g-nitrofenol e dicic1o-hexi1carbodiimida em tetra-hidrofurano durante 4 horas. □ produto lateral de ureia de diciclo-hexilo foi. removido por filtração e o filtrado foi evaporado até dar um óleo que foi purificado por passagem sobre gel de silica neutra utilizando o sistema solvente hexanoscloreto de metileno (50:50). 0 éster de g-nitrofenilo puro que derivou foi um óleo amarelo muito claro, móvel.

Q mercaptano livre foi desmascarado pelo sequinte processo. 0 éster de p-nitrofenilo do ácido S-t-butilmercaptopropiónico foi dissolvido em ácido trifluoroacético e foi adicionado um ligeira excesso molar (10 '/.) de acetato de mercúrio. A mistura f o i aq i t: trifluor scjlução ada durante '30 minutos, em seguida foi evaporado o ãcido oacético e o resíduo foi recebida em dimeti1formamida. A foi tratada com gás de sulfureto de hidrogénio durante 15 minutos, em seyuida o sulfureto de mercúrio negro foi separado par filtração e o filtrada foi evaporado sob pressão para eliminar até 99 7. da dimetilformamida.

reduzida líquido móvel ligeiramente acastanhado que resultou foi. purificado sobre gel de sílica neutra utilizando hexano cc loreto de metileno (50:50). A componente principal mostrou conter, por RMN , uma pequena quantidade do derivado t-buti 1 --mercapto

A HF'LC analítica sobre duas colunas Perkin-Elmer Fecosphere C_<(_. em tandem C4,ó x 33 mm e 4,6 x 83 mml utilizando i O um sistema gradiente de 37,5/02,5 até 47,5/52,5 de acetonitrilo e tampão de acetato de amónio 0,1 M a pH 6,5 (ácido acético) durante 12 minutos indicou que o produto era 88 X de éster de p-nitrofenilo do ácido 3-mercaptopropiónico e lu X do éster de ρ-nitrofenilo do ácido S-t-butiImerca.ptopropiónico menos polar. Havia também uma pequena, quantidade de g—nitrofenol livre presen(8) Reacção do éster de ρ-nitrofenilo do ácido 3-mer

T captcjpropión.ico com LL-E332.B8ga.ma, ¹

Uma porção de 100 mg de LL-ESoZOBgama^¹ foi dissolvida em 50 ml de acetonitrilo. A esta mistura foi adicionada uma so1uç3 o d e 2/, / mg de és te r d e g—ηιtrof en i1 o do ácido 3—merc a p to— propiónico em 1 ml de acetonitrilo. A mistura de reacção foi deixada a —2u '-’C durante 43 horas. A HF'LC indicou que a reacção e s t a v a c o m ρ 1 e t a .

A rUjlugáo foi evaporada até à secura e o resíduo foi recebido em 4-5 ml de acetato de efectuar a solução. A mistura lançado gota a gota sobre 45 ml etilo utilizando ultra—sons para foi filtrada e o filtrada foi de hexano em agitação. 0 sólido

’)

liqeiramente amarelo que resultou. foi recolhido e pressão reduzida, dando 93 mq de éster de g-nitrafenilo τ ρ r o p i ó r ι i c o d e r i v a d o por RMN HPor EMrf de LL-E3328Sqama, como ficou. est.

o ião ΕΜ+Η3 apareceu em m/z = 151!

5!·?(2ϋ SOt) do ácido abelecido

Tempo de retenção em HPLC de inversão de fases C._Q :

o min com acetonitrilo a 50 '/./acetato de amónio aquoso ©,1 M (LL~E33?.S8i51/: 8,0 min, produto de hidrólise de éster: 1,5 min).

Exemplo 3

Dissulfureto do 3-mercaptopropionat.o de

IM-hidrox i-succinimidi 1 o de LL-E552.'i38qama^

A uma solução de 5 mg do dissulfureto do ácido 3-mercaptopropiánicoanálogo do LL-E33288S_i ¹ do pedido de patente EPO em 0,5 ml de tetra-hidrofurano foi adicionado 0,45 g de N-hidro;·; i-succ in imida em 0,1 ml de tetra-hidrof urano e em seguida 1,8 mq de diciclo-hexilcarbodiimida em 0,2 ml de tetra-hidrofurano. A mistura de reacção foi deixada, em agitação à temperatura ambiente durante 4 horas e foi em seguida extinta com um grande excesso de hex canos.

.) sólido foi isolado por filtração a dissolvido em 1 acetato de etilo. A solução resultante foi lavada por três vezes

J ccm água salgada, foi seca ccm sulfato de magnésio e evaporada para dar 5 mq do produto desejado na forma de um pó cor de bronze

J que foi utilizado sem purificação posterior.

Tempo de retenção em HPLC de inversão de fases CL _o :

3 min com acetonitrilo a 40 7. 7 acetato de amónio aquosa 0,1 M (material de partida: ó,0 min).

Εχ -’ΐτ.ο 1 υ y_i«âsul_fureto de 3-tnercaptopropionil-hidrazida de

LL~E3328Bqaae.*

O

:) )

A 5,4 ml (3 eq) de hidrazina anidra em 100 ml de tetra-hidrofurano em refluxo sob árgon foi adicionado gota a gota 9,2 ml (63 mmol) de 3-merca.ptopropionato de metilo em 50 ml de tetra-hidrofurano durante 2 horas. A solução foi refluxada durante mais duas horas, evaporada e em seguida foi diluída e evaporada por duas vezes a partir de 300 ml de tolueno. O produto foi aplicado a um empastamento de gel de sílica com acetato de etilo a 5 7. / clorofórmio e eluído a partir do empastamento com metanol a 20 7. / clorofórmio.

A 3-mercaptopropioni1-hidrazida resultante era um óleo cor de rosa muito claro que solidificou quando arrefeceu mas fundia à temperatura ambiente.

A 5Θ ml de LL-E3328Qgama¹ em 5C ml de acetonitrilo a -15 °C foi adicionado ó,ó mg de 3-mercaptopropioni1-hidrazida em 1 ml de tetra-hidrofurano. Foi adicionado um equivalente de trietilamina ou um equivalente de trietilamina e um equivalente de ácido acético. A mistura de reacção foi deixada em agitação a 0 °C durante uma hora e em seguida o solvente foi evaporado.

resíduo foi cromatografado sobre gel de sílica com um gradiente de metanol em c 1 orof órmio, 10—15 para se produzir 2ó mg do produto desejado.

EMFAS, m/z = 1408 (M+H); tempo de retenção em HPLC de inversão de fases C^g : 5,0 minutos em acetonitrilo a 41 % / acetato de amónio aquoso 0,1 M„

Diss r, u. 1 f u r s to da N. - Ε E ( 4 - m e t i 1 - c u ;n a r i n-7-il ) amino.1 aceti 11·

I

Exemplo . d r a χ. ι d a de L. L _c7-r-7ORn □ a ÍT1 tUma mistura de 1,0 g (5,7 mmol) de 4-meti 1 -7-cumarina 3,õ ml de bromoacetato de etilo· (5 eq) , 90 mg (0,1 eq ) de iodeto de sódio e 30 ml de dimeti1formamids foi aquecida sob árgon a 80 '^:’C durante 5 horas. A mistura foi arrefecida, diluída com éter etílico, lavada por t.r?s vezes oom água salgada a 50 7., seca com sulfato de magnésio e evaporada até è secura.

.) produto cru foi dissolvido em clorofórmio que contiA nha acetato de etilo a 1 % e filtrado através de um empastamento s de gel de sílica. A recrístalização a partir de éter dietílico que continha um traço de clorofórmio produziu N-E(4-meti1-cumarin-7-i1)aminolacetato de etilo.

(7,5 mmol) do éster anterior em tetra-hidrofurano foi adicionado aquoso 1 N. Após 30 minu.tos, foi ml de 10 m 3. d e adie ionado f oram

A 1,96 g metanol e 15 ml de hidró;·;ido de sódio ácido clorídrica aquoso a 10 7. Os solventes orgânica evaporados e o produto cristalino resultante foi filtrado e lavado com etanol frio e em seguida com éter. Este material foi dissolvido em 20 ml de tetra-hidrofurano e 4 ml de dimeti1formamida. Foi adicionado diciclo-hexi1carbonildiimidazole (1,3 g; 2,2 eq) e a mistura de reacção foi deixada em agitação durante 15 minutos. Foi em seguida adicionado hidrocloreto do éster de cisteína-etilo (1,6 g; 2,5 eq) e trietilamina (1,2 ml).

Após três horas a mistura de reacção foi diluída com éter etílico que continha cloreto de metileno a 5 7 e lavada uma vez com ácido clorídrico aquoso a 10 7 e duas vezes com áqua salgada. Depois de secagem com sulfato de magnésio e evaporação

dos solventes, o produto cru foi cristalizado por dissolução clorofórmio que continha uma quantidade mínima adicionando en>. seouida um excesso de éter.

e t an o 1

Os cristais foram filtrados e secos para N-E C ( 4-meti1-cumarin-7-il )amino3aceti1 Icisteína-etilo purc

Uma mistura de 5 ml de clorofórmio, 2© ml de metanol θ,4 ml de hidrato de hidrazina foi aquecida até refluxar í em de e

;ob ârgon. A esta mistura foi. adicionado 550 mg de éster de N~EE(4~ -meti 1-cuma.r in-7-i 1) aminolaceti 1 3c isteína-eti lo. Depois de refluxar durante 9 horas, a mistura foi arrefecida e o produto sólido foi filtrado e lavado com clorofórmio e em seguida com éter etílico. 0 produto cru (que continha tiol e dissulfureto) foi dissolvido em dimeti1formamida que continha ditiotreitol e trietilamina. Após minutos o produto foi precipitado com excesso de éter etílico e recolhido por filtração.

Este material foi ainda purificado por recristalização a partir de acetonitrilo desgaseado que continha ditiotreitol e um traço de trietilamina para dar N-EE(4-metil-cumarin-7-i1)amino laceti 13 c isteína-hidrazida.

A 12 mg de LL-332S8gamaem 12 ml de acetonitrilo a 0 °c. foi adicionado 4 mg de N-E E (4-meti l-cumarin-7-i 1 ) amino3a.ceί. n a - h i d r a z i d a em 1 ml dimetiltormamida. Depois de agitação durante a noite foram adicionados outros 2 mg de N~EE(4-metil-cumarin-7-i1)amino3aceti13cisteína-hidrazida em 0,6 ml de dimetilformamida. A mistura de reacção foi agitada durante três dias a 0 ^C'C e em seguida foi filtrada, 0 acetonitrilo foi evaporado e a solução de dimeti1formamida resultante foi diluída com um excesso de hexanos/éter 1c1 ,

produto foi isolado por filtração e a seguir purificado por cromatografia sobre gel de sílica com um gradiente de 15-2© 7. de metanol em clorofórmio para produzir 3 mg do produto c! e s e j a d o.

Tempo de retenção em HF'LC de inversão de fases C^g ; 3,5 min utilizando acetonitrilo a. 45 X / acetato de amónio aquoso ©,1 M (LL-E332S86₁ 15,5 min no mesmo sistema)..

E ;·; emp 1 o__ó

Dissulfureto do 5-mercaptopropionil-hidrazida de LL_—E55288.O.-.¹

A 1© mg de LL-E33288u_. em 9 ml de acetonitrilo a *C foi adicionado ó,ó mg de 3-mercaptopropionil-hidrazida em ml de acetonitrilo. Foi adicionado um equivalente de tri.eti.lamina ou um equivalente de trieti1amina e um equivalente de ácido acético. A mistura de reacção foi deixada em agitação a © '^:’C durante uma hora e em seguida o solvente foi evaporado.

resíduo foi cromatografado sobre gel de sílica com um .) gradiente de metanol em clorofórmio de ln—15 X para dar o produto dese j ado.

*

EMPAB, m/z—1251 (M+H) ; temipo de retenção em HPLC de inversão de fases C^p, : 2,1 minutos no sistema em acetonitrilo a. ) 45 7. / acetato de amónio aquoso ©,1 M (LL-E33288u_^I : 5,7 min no mesmo sistema).

Exemplo 7

cid de

IM-aee ti 1 -LL-E3328Sí3S

A IA mg de N-aceti 1~LL-E33288gama^ em Id ml de acetonitrilo a -15 '^:‘C foi adicionado 1,5 eq de 3~mercaptopropion i 1--hidrazida em 85 p.l de acetonítrilo. Foi adicionado um equivalente de trietilamina. A mistura de reacção foi deixada em agitação a 0 *C durante duas horas e em seguida o solvente foi evaporado.

resíduo foi cromatografado sobre gel de sílica com um gradiente de 10-15 7 de metanol em clorofórmio para ss produzir o produto desejado.

EMFAB, ra/z - 1450 (M+H); tempo inversão de fases C^_g : 2,5 minutas com di-hidroqenofosfato de amónio aquoso 0,05 τ gama,: 6,6 min no mesmo sistema).

de retenção em HPLC de acetonítrilo a 50 7 /

M (N~acet.il ~LL~E33288~

Ε x empio 8

Dissul fureto do Z-fflercaptoprogioni I-hidraz id a e?

ι ι i—..

L. L ’ t~ 7 -7 U o

A 10 mg de LL em I0 ml de acetonitrilo a -15 '-'L foi adicionado 1,5 eq de 3-mercaptopropioni 1 -hidrazida em 1 ml de acetonítrilo. Foi adicionado um equivalente de trietilamina. A mistura de reacção foi deixada em aqitação durante uma hora e em seguida o solvente foi evaporado.

*C □ resíduo foi eromatografado sobre gel de sílica cora um gradiente de metanol em clorofórmio de 5-15 7. para se produzir o produto desejado.

EMFAB, m/z = 1248 ; tempo de retenção em HF'LC de inversão de fases C,_n : 2,6 minutos com acetonitrilo a 58 X / j

di-hidrogenofosfato de amónio aquoso 0,05 M (LL~E33288«-, : 7,5 min no mesmo sistema).

Exemplo 9

Dissulfureto do S-mercsptopropioni1-hidrazida_de pseudoag1icone de LL-E332S8 de iodo

A 10 mg de pseudoag1icone de LL-E33288 de iodo em 9 ml de acetonitrilo a -15 -’C foi adicionado 1,5 eq de 3-mercaptopropionil-hidrazida. em 1 ml de acetonitrilo. Foi adicionado um equivalente de trietilamina como catalizador, A mistura de reacção foi deixada em agitação a 0 ^C'C durante uma hora e em seguida o solvente foi evaporado.

resíduo foi eromatografado sobre gel de sílica com um gradiente de metanol em clorofórmio de 10—15 7. para se produzir o produto desejado.

EMFAB, m/z = inversão de fases C₁₍-,

C* o i—h i d r og en o f os f a t o d e

1091 tempo d 8 m i n u t o s c o m e retenção em HPLC de acetonitri1 o a 50 7. / amónio aquoso 0,05 M <pseudoag1icone de m.in no mesmo sistema).

Exemplo 10

3-mercaptobutiri1-hidrazida de

LL.--L53288qama _χ

D i s su1fu re to de

A 17,2 g (0,2 mol) de ácido crotónico foi adicionado 13 ml (0,26 mol) de Acido tioacético. Esta mistura foi aquecida em refluxo sob árgon durante 6 horas. 0 ácido tioacético em excesso foi removido por um aspirador de vácuo e o óleo resultante foi dissolvido em 100 ml de etanol absoluto que continha 200 μ.1 de ácido sulfúrico concentrado. Esta mistura de reacção fo.i. refluxada durante 10 horas e em seguida foi reduzida em volume por um aspirador de vácuo.

Foram adicionados hexanos e a solução resultante foi sucessivamente lavada com duas porções de bicarbonato de sódio saturado e uma porção de água. Esta solução foi em seguida seca com sulfato de magnésio, filtrada e reduzida em volume até dar um óleo. 0 produto cru foi dissolvido em 250 ml de metanol que continha 12 ml de hidrazina e a mistura resultante foi refluxada durante 10 horas sob árgon.

A mistura de reacção foi reduzida em volume e em seguida rapidamente destilada por Kugelrchr e foi cristalizada a partir de uma mistura de clorofórmio—hexanos piara dar 3—inercaptobu. t i r i 1 - h i d r a z i d a.

A 5 mg de LL—E332SSgama_xeni 5 ml de acetonitrilo a -15 ^,:'C foi adicionado 1,5 eq de 3-mercaptcipropionil-hidrzíz.ida em 1 ml de acetonitrilo. Foi adicionado um equivalente de triet.il — amina. A mistura de reacção foi deixada em agitação a. 0 ^,:'C durante uma hora e em seguida o solvente foi evaporado.

resíduo foi cromatografado sobre gel de sílica com um gradiente de metanol em clorofórmio de IO—15 í para se produzir o ρ roduto d ese j ado.

EMFAB, m/z - 1422 (M+H); tempo de retenção em HPLC de inversão de fases C,_p : 3,5 min. com acetonitrilo a 43 7. / lb ' j di-hidrogenof osf ato de amónio apu.oso 0,©5 M (LL~E33289gama :

13,4 min no mesmo sistema).

Exemplo 11

Dissu.l f ureto de 3-mercaptoisovaler.i.l-hidra.zida de LL-E332E;Sqama*

,)

A IO q (0,1 mol) de ácido 3,3-dimet.i 1 acrí 1 ico foi adicionado 9 ml (0,13 mol) de ácido tioacético., Esta mistura foi aquecida em refluxo sob árgon durante 6 horas. 0 ácido tioacético em excesso foi removido por um aspirador de vácuo e o óleo resultante foi dissolvido em 100 ml de etanol absoluto que continha 200 μΐ de ácido sulfúrico concentrado. Esta mistura de reacção foi refluxada durante 34 horas antes da adição de 16 ml d e h .1 d r a z in a ,

A mistura de reacção foi reduzida em volume e em seguida, foi dissolvida numa, mistura de água, salgada e bicarbonato de sódio saturado. 0 produto foi extra.cta.do com vários volumes de clorofórmio. As camadas de clorofórmio combinadas foram secas com sulfato de magnésio, filtradas e reduzidas em volume até darem um óleo. Este óleo foi purificado por cromatografia flash com um gradiente de? metanol em clorofórmio e em seguida foi cristalizado a partir de c 1 orofórmio—hexanos para dar 3—mercaptoisovaleril-hidrazida.

A 15 mg de LL-E33288gama₁ ^I em 5 ml de acetonitrilo a -15 °C foi adicionado 1,5 eq de 3-mercaptoisovaleril-hidrazida em 100 μΐ de acetonitrilo. Foi adicionado um equivalente de trietilamina como catalizador. A mistura de reacção foi deixada em agitação à temperatura ambiente durante 3 horas e em seguida o solvente foi evaporado.

O resíduo foi cromatografado sobre gel de sílica com um gradiente de metanol em clorofórmio de 10-15 % para se produzir o produto desejado.

)

EMFAB, m/z = 1436 (M+H); tempo de retenção em HPLC de inversão de fases C_lg : 3,9 min. com acetonitrilo a 43 % / di-hidrogenofosfato de amónio aquoso 0,05 M (LL-E33288gama₁ ^I:

13,4 min no mesmo sistema).

Exemplo 12

Dissulfureto de 3-mercaptodi-hidrocinamoil-hidrazida de

LL-E33288qama₁ ^I

A 500 mg (2,75 mmol) de ácido p-mercaptodi-hidrocinâmi” co foi adicionado 15 ml de metanol que continha uma gota de ácido sulfúrico concentrado. A mistura de reacção foi refluxada durante ) 5 horas e em seguida foi arrefecida até à temperatura ambiente.

Foi adicionada hidrazina (1,5 ml) e a mistura resultante foi refluxada durante 2 horas sob árgon e em seguida foi agitada durante 10 horas à temperatura ambiente.

Foi adicionada uma porção de 200 mg de ditiotreitol para reduzir quaisquer dissulfuretos presentes e a mistura de reacção foi arrefecida até -15 °. Os cristais resultantes foram filtrados, lavados com uma mistura de éter e metanol e em seguida foram secos num forno de vácuo (50 °/5 microns/10 horas) para dar 3-mercaptodi-hidrocinamoil-hidrazida.

A 25 mg de LL-E33288gama₁ ^I em 25 ml de acetonitrilo a -15 °C foi adicionado 1,5 eq de 3-mercaptodi-hidrocinamoil-hidrazida em 1 ml de acetonitrilo. A mistura de reacção foi deixada em agitação a 0 °C durante 10 horas e em seguida o solvente foi evaporado. O resíduo foi cromatografado sobre gel de sílica com um gradiente de metanol em clorofórmio de 10-15 % para se produzir o produto desejado.

ry EMFAB, m/z = 1484 (M+H); tempo de retenção em HPLC de inversão de fases C : 5,4 min. com acetonitrilo a 43 % / ¹⁸ . I di-hidrogenofosfato de amonio aquoso 0,05 M (LL-E33288gama^ :

13,4 min no mesmo sistema).

Exemplo 13

Dissulfureto de 3-mercaptoisovaleril-hidrazida de

N-acetil-LL-E33288gama₁ ^I

A 20 mg de N-acetil-LL-E33288gama^^ em 15 ml de acetonitrilo a -15 °C foi adicionado 3 eq de 3-mercaptoisovaleril-hidrazida em 6,2 ml de acetonitrilo. Foi adicionado um equivalente de trietilamina. A mistura de reacção foi deixada em agitação à temperatura ambiente durante duas horas e em seguida o solvente foi evaporado.

O resíduo foi cromatografado sobre gel de sílica com um gradiente de metanol em clorofórmio, 10-15 %, para se produzir o produto desejado.

hl

T empo

2,5 minutos com amónio aouoso &

de retenção em KF’LC ds inversão acetonitrilo a 50 7. ί di-hidr

M (N-aceti1-LL-E33238gama ¹: ó de fases C_Je ogenofostato ,ó mm no me de mo sistema),

Exemplo 14

Dissulfureto de 3-mercaptobutirI-hidrazida de

N-ac«til-l.L-E332S8qaina. ¹ □

A 10 mg de N-aceti 1 -LL~E33288gama₁ em 7,5 ml de - acetonitrilo a -15 ^,;'C foi adicionado 3 eq de 3~mercaptobutiri 1-hidrazida. em 5 ml de acstonitri1o. Foi adicionado um equivalente de trietílamina. A mistura de reacção foi deixada em agitação à temperatura ambiente durante 10 horas s em seguida o solvente foi evaporado.

D resíduo foi cromatografado sobre gel de sílica com um gradiente de 10-15 7. de metanol em clorofórmio para se produzir o pro du to d e s ejad o.

Tempo de retenção em HF'LC de inversão de fases Ε_1Π :

I <2/

7,3 minutos com acetonitrilo a 43 7 / di-hidrogenofosfato de amónio aquoso 0,05 Μ (N—aceti 1 — L.L—E33233gama^ : 5,6 min no mesmo sistema).

Exemplo 15

Dissulfureto de 3-mercaptodi-hidrocinamoil-hidrazida de

N-acetil-LL-ESSZSBqama.^¹

A 10 mg de N-acetil-LL-EBBZSSgama^¹ em 7,5 ml de acetonitrilo a -15 °C foi adicionado 3,0 eq de 3-mercaptodi-hidrocinamoil-hidrazida em 2,0 ml de acetonitrilo. Foi adicionado um equivalente de trietilamina. A mistura de reacção foi deixada em agitação à temperatura ambiente durante 2 horas e em seguida o j solvente foi evaporado.

O resíduo foi cromatografado sobre gel de sílica com um gradiente de metanol em clorofórmio de 10-15 % para se produzir o produto desejado.

Tempo de retenção em HPLC de inversão de fases C :

X o

7,3 minutos com acetonitrilo a 43 % / di-hidrogenofosfato de amónio aquoso 0,05 M (N-acetil-LL-E33288gama₁ ^I: 5,6 min no mesmo sistema).

Exemplo 16

Conjugação não especifica a proteínas

J

O éster de hidroxi-succinimida descrito no Exemplo 3 foi ligado covalentemente a anticorpos sob condições ligeiramente alcalinas. O que se segue é um processo geral utilizado para fazer os conjugados de anticorpos listados na Tabela 7.

Fez-se reagir o anticorpo a uma concentração de 3-5 mg/ml em tampão fosfato que contém cloreto de sódio 0,1 M a

pH 7,5 com um excesso 5-20 vezes molar do produto do Exemplo temperatura ambi en te e durante 1-4 horas proteína conjugada foi cromatográficamente dessalgada e a proteína agregada foi separada do material monomérico por HPLC filtração ael. As fracções de monómeros foram reunidas e concentradas.

Tabe 1 a_7

Conjugados não específicos preparados utilizando o produto do Exemplo 5

MoAb

Carga da droga Μ/5Ί

Lvm 1

B72.3

B72.3

6,0 '? ç>

Exemplo 17

Preparação de conjugados de local especí f ico de et na métouo gei· al pa.ra .a drogas a anticorpos oxidados al., na U.S. Patent N2 4 671 preparação de conjugados de dos Exemplos 4 até 15 com mod ligação de derivados de hidrazida está. descrito em T. J. NcKearn,

953. 0 processo tem sido aplicado a i: t i ar ρ o s a p a r t i r d o s p r o cl u t o s :eci ·· -ç ___ mo se descreve a seguir. Os produtos destas reacções rísticas estão sumarizados na Tabela 3.

e as suas caracte— (A) Oxidação do Anticorpo Q anticorpo, a urna concentração de 5 até 10 mg/ml, foi dializado durante a noite sobre um volume 200 vezes maior de tampão de acetato de sódio 50 mM, pH 5,5, contendo cloreto de sódio 0,1 M (Tampão A).

minutos e numa coluna, oxidação do uXidação 11u ttiuUrQ, depois deste Sephadex 3-25

Após a diálise, o MoAb foi oxidado com ácido periódico 15 mM até 200 mM em acetato de sódio 0,1 M„ Deixou-se processar a :om agitação, a 4 °C durante tempo o MoAb oxidado foi dessalgado de volume de cama >~5. 0 grau de anticorpo foi avaliado por reacção com p-nitrofeni1-hidrazina e por comparação da absorvância da proteína a 230 mm vs. Q-nitrofeni1-hidrazina a 395 mm.

(B) Conjugação da Hidrazida da Droga 0 MoAb oxidado reagiu com a. hidrazida da droga em excesso molar de 10 a 2Θ0 vezes. As hidrazidas foram dissolvidas em dimeti1formamida e adicionadas à solução aquosa do MoAb. Para evitar a precipitação do MoAb, o volume final de dimeti1formamida adicionada não excedeu 10 X do volume total da mistura de reacção.

Deixou-se processar a reacção durante 3 horas à temperatura ambiente, com agitação. Para evitar a reticulaç:ão dos aldeídos que não reagiram e a subsequente agregação, foi adicionado um agente de bloqueamento, acetil-hidrazida, num excesso molar de 100 vezes três horas depois da adição da hidrazida da. droga. Para estabilizar o encadeamento da base de Schiff entre o aldeído e a hidrazida da droga, (uma. hidrazona) , o produto foi geralmente reduzido para uma alquil-hidrazina pela adição de cianoboro-hidreto de sódio 10 mM, deixando a reacção processar-se durante uma ou. mais horas ( tempo de conjugação total - 4 horas). □ conjugado foi cromatograficamente dessalgado e exau.sti vamente

dializado (tempo mínimo de 43 horas! num tampão fosfato a pH 6,5 para armazenamento e testagem.

Os conjugados foram analisados à presença de agrecjados por HF’LC de filtração gel e à droga livre por HF'LC de inversão de fases. A carga da droga foi determinada espectroscopicamente utilizando os coeficientes de extinção não só do anticorpo mas também da droga para estimar as concentrações molares da droga η o s c o n j u g a d o s .

□

□

I

J )

Tabela 8

do Exemplo 4
MoAb	Preparação	Carga da Droga 1
CT-M-01	#1	3,1
	#2	2,3
	#3	2,9
MAC-68	#1	1,7
	#2	3,1
	#3	2,4

Conjugados de hidrazida preparados a partir do produto

Lym 1	#1	0,15
	#2	0,76
	#3	3,2
Conjugados	de hidrazida preparados	a partir do produto
	do Exemplo 6
Lym 1		3,0
CT-M-01	#1	2,4
	#2	2,9

Tabela 8 (continuação)

Conjugados de hidrazida preparados a partir do produto do Exemplo 7

MoAb Preparação Carga da Droga M/M

Lym 1	2,8
Lym 1		1,4
B72.3	#1	2,1
	#2	2,4
CT-M-01	#1	1,6
	#2	3,6
	#3	2,5
	#4	2,4
Conjugados	de hidrazida preparados	a partir do produto
	do Exemplo 8
CT-M-01		4,8

□

Conjugados de hidrazida preparados a partir do produto do Exemplo 9

CT-M-01

3,0

Tabela 8 (continuação)

Conjugados de hidrazida preparados a partir do produto do Exemplo 10

/)

MoAb Preparação Carga da Droga M/M

Lym 1 3,7

Conjugados de hidrazida preparados a partir do produto do Exemplo 11

Lym 1 6,2

Conjugados de hidrazida preparados a partir do produto do Exemplo 12

Lym 1

3,5

Processo psra a preparação de um dissulfureto substituido de fórmu.la Q-Sp-SS-W caracterizado por se partir de um composto de fórmula CH^SSS-W designado par L.I_-E33238cí ^-Br,

u.-n-Br, ao-I, oí^-Br, a7-I	, c	’< — Fí *·- P. — t-i f” 4 q « n J X ? ·	’^-ι, d2-	Γ<κ- ΓΪ — T *- ► n ijq J· π
gamaBr, gama^-I, —I,	os	pseudoag1 ícones	ÍOdO OL·	bromo, as
suas partes corresponden	tes	di-hidro ou Γ	4-aci 1 o,	BBN-1Ó75,

Fr-900405, FR-9O0406, PD114759, PD-115023, CL-1577A, CL-1577B, CL-1577D, CL-1577E, CL-1724, ou as suas partes correspondentes N-acetilo, em que

HO·.,, •-R.

OR₂

R,

ou H;

Ri e

CH

HO

OU

H;

^OCH» OH

R,_ é CH-,, C_,H,_ lju ( CH ;

._’t ._·» · êj . \

Fc é OH e R,_ é H, ou R' e R‘ , conjuritamente, são um qrupo carbonilo:

X é um átomo de iodo ou de bromo;

R^ á um hidrogénio ou o qrupo RCO, em que R é hidrogénio ou um grupo alquileno (C^-C^) ou alquilo ramificado ou não ramificado, ou um grupo arilo ou heteroarilo, ou um grupo arilalquilo (C,-C_r) ou heteroari 1 ~alqui 1 o (C.-C,-), todos facultativa1 1 mente substituídos por carboxilo.

um ou mais grupos ^:i hidroxilo, amino.

(C -Cr, ) i n f er i o r;

Sp são radicais linear ou ramificada

ÍC^-C^_R) divalente ou trivalente de cadeia radicais arilo ou heteroarilo divalente ou trivalente, radicais cicloalquilo ou heterocicloalquilo (C_-C,_o) •2* 10 divalente ou trivalente, radicais aril- ou heteroari1-alquilo ^ÍC1 Ha’ heter dívalente ou trivalente, radicais cicloalquiloalqui1-alquílo (C^~C^_R) divalente ou trivalente, radicais alquilo insaturado (C^-C^g) divalente ou trivalente, que se ou ou em é um radical trivalente, pode ser adicionalmente substituído por grupos amino, alquilamino, arilamino, heteroarilamino, carboxilo, alcoxilo inferior, hidroxilo, tiol ou alquiltio inferior;

Q é hidrogénio, halogénio, amino, alquilamino, dialquilamino, arilamino, heteroarilamino, piperidino, pirrolidina, piperazino, carboxilo, nitrofeniloxicarbonilo, carboxaldeido, alcoxilo inferior, hidroxilo, tiol alquiIdicarboxilo inferior, -cowhhh₂, -nhconkhh₂, -csnhnh₂, -HHCSNHNH.-, ou -ONH-,;

com as condiçSes de que quando Sp ê etilidina, Q não pode êi.-oBi, ser hidroqènio, e quando CH-r-SSS-W é LL-E3323Su, -Br, α,-I i 1

I a-r-tir,

I, Uq~Br, β,-Br, β,-Ι,

BBM-1675,

F'D-1 15023, CL-1577A, CL-1577B, CL-1577D, CL-1577E ou CL-1724 e Sp é divalente, Q não pode ser hidrogénio, halogénio, amino, gama,-I, ó'i-1

I ’ ’-Ί

Fr-900405, βο-Br, β₂-Ι, FR-900406, gama-Br, PD114759, alquilamino, dialquilamino, arilamino, heteroari1amino, piperidirio, pirrolidino, piperazino ou carboxilo;

e por compreender a reacção de um antibiótico antitumores trissulfureto de metilo a partir dos anteriores com um mercaptano apropriadamente substituído em acetonitrilo ou uma combinação de acetonitrilo e tetra-hidrofurano ou acetonitrilo e dimeti1formamida, a uma temperatura entre -28 *C e cerca de +48 '^:'C, durante um período desde uma hora atê seis dias, preferivelmente presença de um equivalente de uma base amina terciária ou

~) mistura de um equivalente de uma base amina terciária na uma um equivalente de um ãcido carboxílico orgânico.

2*. Processo para a preparação de derivados alvo

Tu-(Z-Sp-SS-W) ' I (Y).

n-m de compostos de fórmula CH^SSS-W, em que CFUS co antitumores LL-E33238cí-Br , -1 , a^-Br, β^-Br, β^-Ι, {3^-Br, β^,-Ι gamaj-Br, gama^-I,

W é um an ti biót i— I , Br, cí-,~1 os;

iseudoag1 ícones iodo ou bromo, as suas partes correspondentes 1—1675, Fr-900405, FR-900406, PD114759, Ϊ77Β, CL-1577D, CL-1577E, CL-1724, ou as ces N-acetilo, caracterizado por comde CH-.SSS-W com um composto de fórmula

	d i-hi d r o ou	N-acetilo, ί
)	PD-115023, ι	CL-1577A, CL’
	suara partes	correspondi
	preender:
J	a	reacção de
	Q-Sp-SH, em	que
	jp são	radicais (C

HS linear ou ramificada, radica ) divalente ou trivalente de cadeia arilo ou heteroarilo divalente ou. trivalente, radicais cicloalquilo ou. heterocic loalqu.i lo (C-t-Cjo) divalente ou trivalente, radicais aril- ou heteroari1-alquilo (C|-'C|g) divalente ou trivalente, radicais cic 1 oal qui 1 — ou heterocic1oalqui1-alqui1 o (Cj-Cjg) divalente ou trivalente, ou radicais alquilo insaturado divalente ou trivalente.

em

') que se Sp é um radical trivalente, pode ser adicionalmente substituído por grupos amino, alquilamino, arilamino, heteroarilamino, carboxilo, alcoxilo inferior, hidroxilo, tiol ou alquiltio inferior, com a condição de que quando CH^-SSS-W è o próprio ancioioLico ancicumores progenitor '1 •I, x-,-Br, k

'1

P^-Br

P^-Br, p_o-l, F R - 9 õ O 4 0 ó, gama-Br„ —Τ X q

BBM-1675, Fr-900405,

PD-115Θ28, CL-1577A, CL-1577B, CL-1577D, não pode ser divalente; e

Q è halogénio, amino, alquilamino, carboxilo, carboxaldsído, hidroxilo, anidrido alqui ldicarboxíl ico inferior, -CONHNH^,, ~NHC0NHNH_o, -NHCSNHNH^, -ONH^ ou gama,-!, δ^-Ι, =’D114759,,

CL-1577E ou CL-1724, Sp

-SS lo) em acetonitrilo na presença, de um equivalente de trietilamina ou de um equivalente de trietilamina e um equivalente de ácido acético a -10 ’^:,C até -30 °C durante 1-4S horas, o isolamento do intermediária de fórmula D-Sp-SS-W, em que Q, Sp e W são definidos como anteriormente; em seguida a reacção do composto de fórmula Q-Sp-SS-W, em que

Sp e W são definidos como anteriormente e t?: e Haloqe.iio, amin^?, axqui 1 ameno, Cãrboxi 1 o, carboxa 1 d&ido, hidroxilo, anidrido alquildicarboxí1ico inferior; com uma molécula de fórmula Tu-(Y)_ em que

Tu é u.m anticorpo mono ou policlonal, os seus fraqmentos, as suas partes correspondentes quimica ou geneticamente manipuladas.

ou tactore;

ds crescimento ou esteróides;

Ύ é uma função amino de cadeia lateral ou carboxilo;

n é 1-10Ã, num tampão aquoso a um pH entre 6,5 e 8, a 4° até *C quer directamente quer na presença de uma carbodiimida solúvel em ãqu.a, até gerar o composto

Tu-(Z-Sp-SS-W) m

r v ·, ' ' 'n-m em que Tu, Sp, W, n e Y são definidos como anteriormente, m é 1-15 e Σ é formado a partir da reacção covalente dos grupos Q e Y e é -CONH-, -NH-,

-NHCDCH^-CH <™2>0,1

ÓH —N-^:cH- uu — b0_,— ou a reacção do composto de fórmula Q-Sp-SS-W, em que Sp e W são definidos como anteriormente e j Q é um á.cido carboxilico, com N-hidroxissuocinimida, 2,3»5,ώ-tetrafluorofenol„ pentafluoro' fenol ou 4-nitrofenol na presença de um aoente de activação carboxilo tal como uma carbodiimida para gerar um composto de fórmula Q-Sp-SS--W em que Sp e W são definidos como anteriormente ) e Q é

) )

ou

CO com uma molécula de fórmula Tu-(Y) , n ' onde Tu e n são definidos como anteriormente, e Y é um grupo amino de cadeia lateral numa solução aquos tamponizada a um pH entre 0,5 e 9, a uma temperatura entre 4 °C 40 ’^:'C, inclusive, para gerar compostos de fórmula:

Tu-Í Z-Sp-S3-W)

J

Ί

J )

n-m em que Tu, Ξρ, Y e n Z é formado a partir do como -CONHsão definidos como anteriormente, m é 1-15 da reacção covalente entre Q e Y e é defini ou a reacção de um composto de fórmula Q~Sp~S3-W, em que Sp e W são definidos como anteriormente e Q é -CONHNH-, com ácido nitroso em acetonitrilo aquoso para gerar um compost de fórmula G-Sp-SS-W, em que Sp e W são definidos como anterior mente e B é -CDN^ com um composto da fórmula Tu-(Y) , em que Tu

Y e π são definidos como anteriormente para produzir um composto ci e formula

T u - ( 2 - S ρ - S S - W)

I (Y ) n-m em que Tu, Z, Sp, W, m, Y e n são definidos como anteriormente; ou a reacção de um composto de fórmula Q-Sp-SS~W em que Sp) e W são definidos como anteriormente e Q é hidroxilo, com um anidrido o-haloacètico para produzir um composto em que 5 é Q-haloacetiloxilo, e fazendo reagir o *-haloacetiloxi-Sp--SS--W, ou um composto de fórmula D—Ξρ-SS-W em que

Sp e W são definidos como anteriormente e Q é

com u.ma molécula de fórmula TU-(Y) em que lu anteriormente, Y é um grupo tiol de cadeia lateral de uma proteína , ou um grupo amidoalqui1 tio introduzido numa amina de Tu utilizando reagentes tais como ácido 3-(2—diticpiridil)propiónico, éster hidroxissuccinimida seguido por redução com um aciente tal como ditiotrsitol, ou um grupo amidoalqui1 tio introduzido numa amina. de Tu utilizando 2-iminotiolano, e n é 1 — 10, sob 5 tamponizadas a um pH entre 4,5 é definido como uma.

temperatura entre 4 *C e 40 C, inclusive, para produzir composto de fórmula:

um

Tu-CZ-Sp-SS-W)

n-m em que Tu, Sp, W e π são definidos como anteriormente, e

Z é formado a partir da reacção covalente dos grupos Q e Y e

X

Z. ttf

e n é 0,1 a té 10;

ou a reacção de um composto de fórmula Q-Sp-SS-W em que

Sp e W são definidos como anteriormente e

Q é -NH_n, -CONHNH.^, -NHCONHNH^, -NHCSNHNH_O ou -0NH_o com uma. molécula de fórmula TU-(Y) em que Tu é definido como n anteriormente, Y é um aldeído gerado a. partir de resíduos de

carbo-hidrato sobre Tu por o;	•ci dação	na pres.	Ξ’ í i Ç cí. í J ¢8	um	periodato
alcalino-terroso,	nu.m tampão	a. quo sc;	a. u.m pH	en tre	4,0	e ό , 5 , a
4 *C até 40 *C, in	C I Ll .1. Vtf j t'	n é 1 até 20 pa	ra gerar	um	composto

de fórmula:

n-m em que Tu, Sp, W, Yen são definidos luiTio imediatamsnte atrás e

Tu->Z-3p-SS•W) m

Z é formado a. partir da reacção covalente de O e

V a i-j

-ON--CH-, -CONHN=CH-, -NHCGNHN=CH- ou -NHCSNHN=CH- e m é 0,1 até 15; ou tratando o composto imediatamente ant.er 5.or de f órmu 1 a :

T u—(Z-Sp-SS-W) (Ti n-m

em que Tu, Z, Sp, W, Y, n e m são definidos como imediatamente antes o foram, com aceti. 1-hidrazina ou tirosina-hidrazina num tampão aquoso a um pH entre 4,© e 6,5, a 4 ^,;'C até 4© C, inclusive, para gerar um composto de fórmula:

T u—(Z—Sp—SS—W)

I (Yl· „ n-m em que Tu, Z, Sp, W, n e m são definidos como imediatamente antes e Y é -CH-NNHCOCH- ou

CH=NNHCO-CH(NH₂)-CH₂ —(O/—oh e

a reacção deste composto com cianoboro-hidreto de sódio ou boro-hidreto de sódio, num tampão aquoso a um pH entre 4,© e 6,5, a uma temperatura de 4 *C até 4© '^:‘C, inclusive, para gerar um composto de fórmula:

Tu-<Ζ—Sp—SS—W) m

(Y) n-m em que Tu, Sp, W, m e n são definidos como anteriormente;,

Σ é -NH-CH._,~, -CONHNKCH..,-, -MHCONHNHCH^- ou -NHCSWHNHCH.^-, e Y é -CH_ONHNHCCCH_? ou ·-) ------

n) -CH₂NHNHCOCH (NH₂)CH₂ —<0/—OH

3:3. Processo para a preparação de um dissulfureto substituído de fórmula Q—Sp—SS—W, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por se partir ds um composto de fórmula CH^SSS-W t*{Tí qij.ss ο

Η Ο · > 11

OCH, θ_{Η ;} á CH^, C^H₅ ou (CH^l^CH;

X é um átomo de iodo ou de bromo;

R₅ é um hidrogénio ou o grupo RCO, em que R é hidrogénio CH ou um grupo arilo monossubstituído; e

Sp e Q são definidos como anteriormente.

J

4é„ Processo para a preparação de um agente de supor te-conjugado da droga de fórmula

Tu-( ΣΙ (v') η- ιτι

5S-W) carac terizado por se partir de um composto de fórmula CH-,S3S~W em um antibiótico anti tumores designada -I, a₉-Br, -3.-,-1, í ¹ , , r>, i,I , gama j. B: , gama iodo ou bromo, as suas partes correspondemtes di-hidro ou N-aciFR-90040Ó, FDI14759, PD-11502S,

1577E, CL-1724, ou as suas partes correspondentes N-acetilo, em que W é descrito como anteriormente e que compreendas a reacção de CH-.SSS-W com um composta de fórmula geral Q-Sp-SH, em que

Sp são radicais (C -C_1O) divalente ou trivalente de cadeia 1 lo linear ou ramificada, radicais arilo ou heteroarilo divalente ou que CH-.SSS-W

L.L.~E33288a i~Br, I, B₂-Br, [3, ) U b r ÍJ tT;!

lo, BBM-1Ó75, ai ι ti tuniursb a_T-Br, -3-.-1 , ój-I, os ^J.r ‘ »1

S^-Br, pseudoag1icones

F r-900405, trivalente, radicais cicloalquilo ou. heterocic 1 oa 1 qui 1 o •2· i O divalente ou trivalente, radicais arilou beteroari1-alquilo

ΊΕ _L) divalente ou trivalente radicais cicloalquilou ou hetsrocicloalquil-alquilo CC.-C_ÍO> divalente ou trivalente, lio radicais alquilo insaturado ÍC^-C_1O) divalente ou trivalente, que se Sp ê um radical trivalente, pode ser adicionalmente substituído por grupos amino, alquilamino, arilamino, beteroari1awino, carboxilo, alcoxilo inferior, hidroxilo, tiol ou alquiltio inferior, com a condição ds que quando CH^-SSS-W é o próprio antibió:o antitumores progenitor LL-ESSSSSOj-Br, cij-I, a_o-Br, -3.,-1, tico ry.-T-tír ,

3^-Br, i,l I

P,o-I qama em gama j-I,

Fr—900405,

ΓΜ —.1 pf _ f cr-7~7o .-.1 _< ιζγ“7“7Γ-,

L,l_ i -.J 7 7 ri rj bL 1 :J S J- Z· _? L^Lser divalente; e

Q é, ou pode ser subsequentemente convertido para, balogénio, amino, al qui 1 amino , carboxilo, carboxa 1 deído , hidroxilo.

Ój-I, BBM-1S75

FR-900406, PD 114759 , CL-1577E ou CL-1724,

PD-115023, >p não pode tiol, <a~ha loacet i lox i 1 o, alqui Idicarboxi lo inferior, -CONHNH._,, -NHCONHNH.-,, -NHCSNHNH_O, -ONH_n , -CON^ ,

para produzir um intermediário de fórmula Q-Sp-SS-W, em que D, Sp e W são definidos como anterícrrcenta, a reacção de Q-Sp-SS-W com uma molécula de fórmula

Tu-(Y) em que π o agente de suporte Tu é definido como o anticorpo mono du. policlonal, os seus fragmentos, as suas partes correspondentes quimica ou geneticamente manipuladas;, ou factores de crescimento ou esteróides;

Y é um grupo amino de cadeia lateral, carboxilo ou tiol de uma proteína, um aldeído derivado de resíduos carbo-hidratos de glicoproteina, ou um grupo amidoalquiltio; e n é um inteiro desde 1 até ίΘΘ, para produzir um composto de fórmula;;

Tu-(Z-Sp-SS-W)

I m

n—m era que Tu, Y, Sp, W e n são definidos como anteriormente, e covalente dos grupos Q e Y e Z è -CONH-, -NHCONHNHCH^-, NHCH„-, -N=CH-,

Z é formado a partir da reacção directamente ou após a subsequente redução, -CONHN--CH-, -C0NHNHCH_o~, -NHCONHN=CH-, ~NHCSNHN=CH-, -NHCSNHNHCH^-, -ON=CH-, -NH-, -CO,,-, ~NHCH_oC0_o-, -SS-,

Claims (4)

1. e m é 0,1 até 15
2. 5ê „ Processo para a preparação de uma proteí na-conjLigada da droga de acordo com a Reivindicação 4 de fórmula

   Tu—(Z —So—SS—W) {Y) n-m caracterizado por se partir da classe de antibióticas antitumoreí designada 1_.1_·--ίΞ3Ζ'288 (CH-^SSS—W) e que compreende:

   α deslocamento da porção ditiometilo cosi um composto de fórmula Q-Sp-SH, an que

   Sp são radicais divalente ou trivalente de cadeia linear ou ramificada ou radicais aril— ou heteroari1-a1qui1o (C^-Cc-) divalente ou trivalente, em que se Sp é um radical trivalente, pode ser adicionalmente substituído por grupos amino, heteroari1amino, hidroxilo ou tiol; e

   Q é, ou pode ser subsequentemente convertido para carboxilo, anidrido a 1 qui 1 d icíirbox ί 1 ico inferior, -CONHNH-, ou

   .) '•3 -COj—ÇO/^-f,02 para produzir um intermediário de fórmula Q-Sp-SS-W, em que

   Q, Sp e W são definidos como anteriormente, a reacção de Q-Sp-SS-W com uma molécula de fórmula

   Tu-(Y) em que n

   Tu. é u.m anticorpo monoclonal que mostra reactividade preferencial com um antígeno associado a tumor humano,

   Y é um qrupo amino de cadeia lateral sobre o anticorpo, ou um aldeído gerado por oxidação dos grupos carbo-hidratos do anticorpo, e n é um inteiro desde 1 até ÍOV, para produzir um composto de fórmula:

   n-m

   Tu-(Z-Sp-SS-W) m

   em que Tu, Y, Sp, W e n são definidos como anteriormente, e

   Z formou—se directamente ds reacção covalente dos grupos 0 e Y ou após a subsequente redução, e Z é -CDNH-, -CONHN=CH-, -CONHNHCH -, ou

   -NHCOCH^-CH

   1 ·“ - ’¹

   CH~H e ni é 0,1 até 15 _L~E332S3a -Br, óê. Método de tratamento de infecçSes hacterianas em animais de sangue quente caracterizado por compreender a administração aos referidos animais de uma quantidade eficaz de um análogo ds dissulfureto substituído de fórmula Q-Sp-SS-W, preparado a. partir de um composto de fórmula CH-.SSS-W e designado por -I, «„-I , «,-Br, a^-I, α.-Br, {3,-Br, ama^-Br, qsma^-I, 6^-1, os pseudoag1 ícones iodo ou bromo, as suas partes correspondentes di-hidro ou N-acilo, BBM-1675, Fr-900405, FR-900406, PD114759, FD-115028,

   CL™1577A, CL-1577B, CL-1577D, CL-1577E, CL-1724, ou as suas ‘1 β^-Br, fl„-I , par ;s oorrespOítde>ιtes N—acetilo, em que

   :)

   J

   Η

   CH

   HO

   Τ// ^OCH> OH

   U\z\z» ou

   H;

   R,ou R, é· H

   R,- é CH,, C^H^ ou (CH^)_PCH;

   <8 é UH e R^ é H, ou R_ e fc>

   carbonilo;

   R,_, conjuntamerite, são um grupo

   X é um átomo de iodo ou de bromo;

   R_r_ é um hidroqénio ou o grupo RCO, em que R é hidroqénio ou um grupo alquileno ou alquilo ramificado ou não ramificado, ou um grupo arilo ou heteroarilo, ou um grupo arililquilo (Cj-C,_) ou heteroar.il-alqui 1 o (C^-C_E me n t e s ub sti tu íd os por um ou mar grupos todos facultativahidroxilo, amino, carboxilo, halo, nitro, alcoxilo (C^-C^) inferior, ou tioalcoxilo (C^-C^) inferior;

   Sp são radicais (C^-C^g) divalente ou trivalente de cadeia linear ou ramificada, radicais arilo ou heteroarilo divalente ou trivalente, radicais cicloalquilo ou heterocicloalquilo (C,-C^g) divalente ou trivalente, radicais aril- ou heteroari 1-alqu.i lo (C.-C') divalente ou. trivalente, radicais cicloalquil- ou heterocicloalquiI-alquilo (C^-C^g) divalente ou trivalente, ou radicais alquilo insatura.do (C^-C,_o) divalente ou trivalente, se z. ι y

   Sp é um radical trivalente, pode ser adicionalmente substituído por grupas amino, alquilamino, arilamino, heteroari1amino, carboxilo, alcoxilo inferior, hidroxilo, tiol ou alquiltio inferior;

   Q é hidrogénio, halogénio, amino, alquilamino, dialquilamino, arilamino, beteroarilamino, piperidina, pirrolidina, pi perasina, carboxilo, nitrofeni1oxicarboni1 o, carboxaldeído, alcoxilo inferior, hidroxilo, tiol alquildicarboxilo inferior, ~C0NHNH₂, -NHC0NHNH₂, -CSNHNH₂, -NHCSNHNH, ou -ONHo;

   com as condições de que quando Sp é etilidina, Q não pode '1' !> R₂-Br, β₂-Ι, FR-9O04Ô6,

   I, .:;;₂-Rr, gama -Br, RD11475?, ©o f ? ΰ— B r, p— ι , ©q’ S r, (1 Sr, íl * j. , gamsj-l, S/-I, BBM-1675, Fr~?0©4©5,

   PD-11502S, CL-1577A, CL-1577B, CL-1577D, CL-1577E ou CL-1724 e Sp é divalente, 0 não pode ser hidrogénio, halogénio, amino,

   -94 a1qui1amino, dia1qui1amino, dina, pirrolidina, piperasino ou dosaqem de administação de 0,2 < 0,1 a θ,0003 mg.

   arilamino, hsterosri1amino, piperi:arboxi1 o; situando-se a gama de 0,00005 mg, de preferência de '/£?.„ Método de inibição do crescimento de tumores num mamífero caracterizado por compreender a administração ao referido mamífero ae uma quantidade oncolítica de um dissulfureto substituído de fórmula Q-Sp-SS-W, preparado partir de um c o m ρ o s t o d e u^-I, u._,-Br, 1 , α,-Br, u^-I, c^-Br , ^-Er, β,-Ι, β^-Br, Ρ>^~1 , fórmula CH-^SSS-W e designado por LL-E33238a^-Br, qania a^-Br, qama,~I, »j-I, os pseudoag 1 ícones iodo ou b remo, suas

   -OC partes correspondentes di-hidro ou N-acilo,

   BBM-1Ó75, CL-1577B,

   CL—1577D, CL~ 1577E, CL—1724, ou a.s suas partes correspondentes N-acetilo, em que dr-900405, FR-90Ô40Ó, F‘D114759, F‘D-1 15023, CL-1577A,

   CH,

   R_r._T é Ci-L,, ou (CH_?)_r,CH;

   R' é OH e R 'P é H, ou R,_, conjuntamente, são um qrupo carboni1 o;

   X é um átomo de iodo ou de bromo;

   R_c. é um hidrogénio ou o grupo RCO, em que R é hidrogénio ou um grupo upo alquileno ou alquilo ramificado ou não ramificado, ou. um gru.po arilo ou heteroarilo, ou um grupo aril-alquilo (0^-0^.) ou heteroari 1 -alqui 1 o (0,-8^.), todos facultativamente substituídos por um ou mais grupe hidroxilo, a m i ηo, )

   carboxilo, halo, nitro, alcoxilo (C^-C.,) inferior, ou. tioalcoxilo

   Sp são radicais divalente ou trivalente de cadeia

   OU.

   linear ou ramificada, radicais arilo ou heteroarilo divalente (C,--C divalente ou. trivalente, radicais cicloalquil1 I Cj trivalente, radicais cicloalquilo ou he teroc ic loa Iqu.i 1 o (C_,-C^_g5 divalente ou trivalente, radicais aril- ou. heteroaril-alquilo ou heterocicloalqui1-alquilo (C,-C_1O) divalente ou. trivalente, ou radicais alquilo insaturado (C_n-Cjg) divalente ou trivalente, em que se Sp é um radical trivalente, pode ser adicionalmente substituído por grupos amino, alquilamino, arilamino, heteraar.ilamino, carboxilo, alcoxilo inferior, hidroxilo, tiol ou alquiltio

   Q é hidrogénio, halogénio, amino, alquilamino, dialquilamino, arilamino, heteroarilamino, piperidina, pirrolidino, pi perazinc, carboxilo, n i trofeniloxicarbonilo, carboxaldeído, aiLuXiiO infericir, hidroxilo, tiol aiquildicarboxilo inferior, -CONHMH_?, -NHCDNHNH₂, -CSNHNH_q, -NHCSNHNH^ ou -DNHo?

   com as condiçSes de que quando Sp é etilidina, Q não pode '1 ·^Βγ> Cj-I , -yBr, gamaB r, ser hidrogénio, e quando CH---SSS-W é L.Líg-,-1, «--Br, ch,-!, a.-Br, β.-Βτ '•4 pi , |jj- pr , j:> 2 i , <2 x, 6j~I, BBM-1Ó75, Fr-900405,

   PD-115028, CL-1577A, CL-1577B, CL-1577D, CL-1577E ou CL-1724 e Sp é divalente, Q não pode ser hidrogénio, halogénio, amino, gama,-I

   FR-9004Θά, ='D 1 1 4759 , alquilamino, dialquilamino, arilemino, heteroarilamino, piperidino, pirrolidino, piperazino ou carboxilo; situando-se a gama de dosagem de administaçSo de 0,2 a 0,00005 mg, de preferência de 0,1 a 0,0003 mg..
3. 8?íMétodo de inibição do crescimento de tumores num mamífero caracterizado por compreender a administração ao referido mamífero de uma quantidade oncolítica de um produto

   Tu-<Z-Sp-SS-W) n ~m preparado a partir de um composto de fórmula geral EI-LSSS-W em designado

   a. , ^,a4 j í>i^Bf , B₁I, R .. pseudoag1 ícones iodD ou bromo, as di-hidro ou N-acilo, BBM-1675, F_f—-900405, ff-900400, PD114759, PD-115023, CL-1577A, CL-1577B,

   CI..-1577D, EL-1577E, CL-1724, ou as suas partes correspondentes N-acetilo que compreende:

   a reacção de EH^SSS-W com um composto de fórmula geral Q~3p-3H, em que

   Sp é um radical (Ε^-Ε^θ) divalente ou trivalente de cadeia linear ou ramificada, radical arilo ou heteroarilo divalente ou trivalente, radicei cicloalquilo ou (Εγ-Ejg) divalente ou trivalente, radical aril- ou heteroari1-alquilo (Ej-E,g) divalente ou trivalente, radical cicloalqu.il:>u heterocicloalqui1-alqui1 o (E|-E^g) divalente ou trivalente, ou que L L — E33233 α í?>

   CKSSS-W Br

   1 ' partes um

   Ci..

   Br

   a.

   Br an ti tumor I por

   Br :o r r es pond en te h e t e roc ic 1 o a 1 q u i 1 o radical alquilo insaturado (E_o—E lí divalente ou trivalente.

   em

   Γ1 f I l-J (?

   é um radical trivalente, pode ser adiei on a1mente

   '.LÍiuO μυΓ am iη o, aIq ui1 amino, arilamino carboxilo, alcoxilo íriTerior .

   a r i 1 a m i η α , h e t e r o hidroxilo, tiol ou alquiltio inferior, com a condição do que quando CH^SSS-W é ele próprio o antibiótica antitumor progenitor designado par L!_-E332SQa -Br, a^-I, a_?-Br, ^a-?~I ? a₇-Br, a^-Br, P^-Br, Bj-I, fi_o-Br, P^-I, gama₁~Br, gama^-I, Íj-I , BBM-1675, Fr-900405, FR--900406, PD114759, PD-1Í5023, CL-1577A, CL-1577B, CL-1577D, CL-1577E ou CL-Í724, Sp não pode ser divalente; e

   Q á, ou pode ser subsequentements convertido para, halogénio, amino, alquilamino, carboxilo, carboxaldeído, hidroxilo, tiol, α-haloacetiloxilo, alquildicarbcxilo inferior, -CONHNH^, -NHCONHNH^, -NrlCSNHNH^, -ONH^, -CON^,

   -“r(O j

   )

   J )

   para produzir um intermediário de fórmula Q-Sp-SS-W, em que Q, Sp e W são definidos como anteriormente, a reacção de Q-Sp-SS-W com uma molécula de fórmula

   Tu-(Y) em que

   Tu. é definido como um anticorpo mono ou policlonal, fragmentos, as suas partes correspondentes quimica ou os seus geneticamente manipuladas, factores. de

   U. i cimento ou esteróides ·}

   Y é um grupo amino de cadeia lateral, carboxilo ou tiol de uma proteína, um aldeído derivado de resíduos carbo-hidratos de g1iooproteína, ou um grupo amidoaIqui1 tio; e n é um inteiro desde 1 até 100, para produzir um composto de 'fórmula:

   Tu-(Z-Sp-SS-W)

   I 'Tl (Y ) n-m em que Tu, Y, Sp, W e n são definidos como anteriormente, e

   Z é formado a partir da reacção covalente dos grupos 0 e Y directamente ou. após a subsequente redução, e Z é -CONH-,

   -CONHN-CH-, -CDNHNHCH_O-,

   -NHCSNHN=CH- , -NHCSNHNHCH.-,- , -CO,-,-, -MHCH^.CO^-, -SS-,

   -NHCONHN-CH-NHCOMHMHCH.-,-,

   -ON=CH

   -NH-, -NHCK-,-, -N=CH-, e m é y,l até 15; si tuando—-,e a gama de dosagem de administação de 0,2 a 0,00005 mg, de preferência de 0,1 a 0,0003 mg.
4. 9sS. Método para a. libertação in vivo de um composto num local antigénico caracterizado por compreender a administração a um mamífero de uma quantidade oncolítica eficaz de uma proteína-conjugada de fórmula

   Tu-(Z-Sp-SS-W) (Y) n-m preparada a partir do antibiótico antitumores designado por N-acetil-LL~E33288S ¹ (CH^SSS-W) que tem

   a) um espectro de ultravioleta como se mostra na Figura 1;

   b) um espectro de infravermelho como se mostra na Figura 2;

   c) um espectro de ressonância magnética de protão como se mostra na Figura 3; e

   d) um espectro de ressonância magnética nuclear de carbono-13 como se mostra na Figura 2; ou preparada a partir do antibiótico antitumores designado por pseudoag 1 icone de LL-E3328Q de iodo (CI-USSS-W) que tem

   a) um espectro de ultravioleta como se mostra na Figura 5;

   b) um espectro de infravermelho como se mestra na Figura 6;

   c) um espectro de ressonância magnética de protão como se mostra na Figura. 7;

   d) um espectro de ressonância magnética nuclear de carbono-13 como se mostra na Figura 8;

   que compreen de:

   o deslocamento da porção ditiometilo com um composto de fórmula Q-Sp-SH, em que

   Sp são radicais 'C_Q-C,J divalente ou trivalente de cadeia

   -lC- \-J linear ou ramificada cu radicais aril- cu heteroaril-alquilo (CL,~Cç-) trivalente, em que se Sp é um radical trivalente, pode ser adicionalmente substituído por grupos amino, heteroari1amino, hidroxilo ou tiol; e

   D é, ou pode ser subsequentemente convertido para, carboxilo, anidrido alquildicarboxí1ico inferior, -CONHNH^ ou

   -^C02“-\C) )— N0₂ para produzir um intermediária de fórmula geral Q-Sp-SS-W, em que Q, Sp e W são definidos como anteriormente, a reacção de Q-Sp-SS-W com uma molécula de fórmula Tu-(Y) em que

   Tu é u.m anticorpo monoclonal que mostra rea.ctivida.de preferencial com um antígeno associado a tumor humano,

   Y é um grupo amino de cadeia lateral sobre o anticorpo, ou um aldeído gerado por oxidação dos grupos carbo-hidratos do •anticorpo, e n é u.m inteiro desde i até 100, para produzir um composto de fórmula:

   102

   Tu-(Z-So-SS-W) (Y) n-m em que Tu, Y, Sp, W e n são definidos como anteriormente, e

   Z formou-se da reacção covalente dos grupas Q e Y, directamente ou após a subsequente redução, e Z é -CONH-, -CONHN-CH—, —CONHNHCH -, ou

   NHCOCH.

   (CH^).-, ,

   1 ’ CO^H e m é 0,l até 15; situando-se a gama de dcsaqem de ídministação de 0,2 a 0,00005 mg, de preferência de 0,1 a 0,0003 mg.