KR20210018208A - 세포독성 약물의 접합체 및 상기 접합체의 전구약물 형태 - Google Patents

세포독성 약물의 접합체 및 상기 접합체의 전구약물 형태 Download PDF

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KR20210018208A
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세르기 콜로디치
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Abstract

본 발명은 암 및 염증성 질환을 치료하는데 사용하기 위한 세포독성 약물의 특이적인 접합체 및 상기 접합체의 전구약물 형태에 관한 것이다. 접합체는 식 (I), 및 이의 약학적으로 허용가능한 염으로 나타낸다:
Figure pct00047

[식 중, A 는 세포독성 약물에서 유래하는 라디칼을 나타내고, G 는 자가-희생성 모이어티이고, m 은 0 또는 1 임].

Description

세포독성 약물의 접합체 및 상기 접합체의 전구약물 형태
본 발명은 암 및 염증성 질환을 치료하는데 사용하기 위한, 세포독성 약물의 특이적인 접합체, 및 상기 접합체의 전구약물 형태에 관한 것이다.
암 및 염증성 질환은 오늘날 가장 흔한 질병 중 하나이다. 특히, 암은 선진국에서 가장 중요한 사망 원인 중 하나이며, 암으로 진단된 사람의 수는 현재 지속적으로 증가하고 있다.
지금까지 여러 치료 모드가 개발되었으나, 화학요법은 림프종, 백혈병 및 전이와 같은 순환하는 종양에 대해 사용할 수 있는 유일한 방법이다.
화학요법에서, 한 가지 전략은 튜불린의 중합을 억제하여 세포 분열을 방지하는 것이다 (유사분열억제제). 이는 돌라스타틴 계열의 화합물, 특히 인도양 군소 (Indian Ocean sea hare) 원뿔군소 (Dolabella auricularia) 에서 분리될 수 있으며 4 개의 아미노산으로 이루어지고 이들 중 3 개가 이에 특이적인 것인, 천연 돌라스타틴 10 을 사용하여 달성될 수 있다. 아우리스타틴 PE, 아우리스타틴 E 및 모노메틸 아우리스타틴 E (MMAE) 와 같은 돌라스타틴 10 의 합성 유도체가 또한 존재하며 효율적인 억제제인 것으로 입증되었다. 이러한 화합물의 주요 결함은 암 세포에 대한 선택성이 부족하여 건강한 조직이 파괴되고, 그에 따라 탈모 또는 메스꺼움과 같은 심각한 부작용을 초래한다는 것이다. 이러한 활성제의 단백질-약물 접합체의 개발은 선택성의 부족을 극복하기 위한 우아하고 효율적인 전략으로서 나타났다.
단백질-약물 접합체는 월등히 가장 빠르게 성장하고 있는 매우 강력한 활성 약학 성분 계열이다. 단백질-약물 접합체 구축물은 일반적으로 링커 기의 한쪽 말단에 공유적으로 부착된 항체와 같은 단백질을 포함하며, 다른 한쪽 말단은 세포독소, 즉 매우 강력한 세포 살상 독소이다. 생체분자의 단백질 성분은 표적 특이성을 제공한다. 접합체가 세포에 들어가면, 예를 들어 세포 효소의 작용에 의해 독소가 방출된다. 대부분의 단백질-약물 접합체는 실제로 암 치료를 위한 것이다. 시판되는 트라스투주맙 엠탄신 (T-DM1 또는 Kadcyla® 로서 나타냄) 및 브렌툭시맙 베도틴 (Adcetris®) 외에, 다수의 단백질-약물 접합체가 현재 다양한 암 징후에 대한 임상 시험을 거치고 있다.
이러한 접합체의 활성을 위한 주요 전제조건 중 하나는, 암 세포에 의한 내재화시 세포독성 약물이 효율적으로 방출되면서, 접합체가 생물학적 표적에 도달하기 전에 단백질과 약물 사이의 링커가 혈액 순환에서 안정해야 한다는 것이다.
이런 점에 있어서, 효소-절단가능 링커를 접합체 구축물에 도입함으로써 진정한 돌파구가 달성되었다.
따라서 WO 2015/118497 는 식 (I) 의 β-글루쿠로니다아제-반응성 알부민-결합 접합체를 기재하고 있다:
Figure pct00001
.
식 중에서, A 는 전형적으로 MMAE 이다. 이의 말레이미드 말단 모이어티는 정맥내 투여 후 순환하는 알부민과의 선택적인 커플링을 제공하는 것으로 의도된다. 글루쿠로니다아제 감응성인 글루쿠로니드 모이어티가 또한 분자에 존재하며 자가-반응성 완부 (arm) 에 연결된다. 알부민이 종양에 축적되며 β-글루쿠로니다아제가 종양 환경에 존재하므로, 화합물이 종양 위치에 도달하여 촉매가 글리코시드 결합의 절단을 촉매화하고 이어서 약물 (MMAE) 의 방출을 촉발시킨다. 접합체는 두 이성질체의 1:1 혼합물로서 존재하는데, 이의 가변적인 입체발생 중심이 자가-반응성 완부 상에 존재한다 (식 (I) 에서 별표로 표시함).
본 발명자들은 종래 기법에 의해 분리할 수 없었던 상기 접합체의 두 이성질체가 초기 중간체의 HPLC 거울상이성질체 분리로부터 수득될 수 있음을 입증하였다. 두 분리된 이성질체는 특히 인간 혈장에서 안정한 것으로 입증되었으나, 가변적인 입체발생 중심이 R 구성을 갖는 이성질체는 다른 것보다 더 높은 효소 절단 동역학을 나타내었다. 하나의 이성질체로 관찰된 이러한 더 높은 동역학은, 입체발생 중심이 효소에 의해 인식되는 약물 분자 구조 (pharmacophore) 의 일부가 아니라는 점에서 더욱 예상치 못한 것이다. 이러한 예상치 못한 특징은 더 낮은 효소 발현을 갖는 환자에게 특히 유익할 수 있다.
발명자들은 또한, 자가-희생성 모이어티의 구조, 보다 특히 세포독성 약물과 접합체 나머지 사이로의 삽입이, 접합체의 안정성을 증가시키면서 절단하는 (즉, 세포독성 약물을 방출하는) 능력을 보존할 수 있다는 것을 입증하였다.
본 발명이 이에 관한 것인 상기 이성질체는 식 (I) 로 나타내는 접합체, 및 이의 약학적으로 허용가능한 염이다:
Figure pct00002
[식 중,
A 는 세포독성 약물에서 유래하는 라디칼을 나타내고,
G 는 자가-희생성 모이어티이고,
m 은 0 또는 1 임].
본 발명은 또한, 하기 단계를 포함하는, 상기 정의한 바와 같은 접합체의 제조 방법을 제공한다:
a) 4-히드록시-3-니트로벤즈알데히드로부터 rac-4-(1-히드록시부트-3-인-1-일)-2-니트로-페놀을 제조하는 단계;
b) 바람직하게는 키랄 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 (R)-4-(1-히드록시부트-3-인-1-일)-2-니트로-페놀을 분리 및 단리하는 단계;
c) 염기성 조건 하에 (R)-4-(1-히드록시부트-3-인-1-일)-2-니트로-페놀을 글루쿠론산 유도체, 예컨대 메틸 아세토브로모-α-D-글루쿠로네이트와 반응시키는 단계;
d) 단계 (c) 에서 수득한 화합물을 4-니트로페닐 클로로포르메이트와 반응시키는 단계;
e) 단계 (d) 에서 수득한 화합물을 세포독성 약물 또는 A-G-H 모이어티와 커플링시키는 단계로서, A 는 세포독성 약물에서 유래하는 라디칼을 나타내고, G 는 자가-희생성 모이어티를 나타내는 것인 단계;
f) 바람직하게는 염기성 조건 하에 단계 (e) 에서 수득한 화합물의 글루쿠로니드 모이어티를 탈보호하는 단계; 및
g) 단계 (f) 에서 수득한 화합물을 식 N3-(CH2-CH2-O)10-(CH2)2-NH-(CO)-(CH2)5-X (식 중, X 는 말레이미드 기임) 의 아자이드와 커플링시키는 단계.
본 발명은 또한, 상기 정의한 바와 같은 접합체의 적어도 하나의 분자를 포함하는 전구약물에 관한 것이며, 접합체의 상기 분자는 공유 결합을 통해 단백질 분자, 바람직하게는 알부민, 또는 이의 단편 또는 유도체에 연결된다.
이는 또한 적어도 유효량의 상기 정의한 바와 같은 적어도 하나의 접합체 또는 상기 정의한 바와 같은 적어도 하나의 전구약물, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 독립적으로, 암 및/또는 염증성 질환의 치료에 사용하기 위한, 상기 정의한 바와 같은 접합체, 상기 정의한 바와 같은 전구약물, 또는 상기 정의한 바와 같은 약학 조성물에 관한 것이다.
도 1 은 X-선 결정학으로부터의 화합물 R1a 의 분자 구조를 나타낸다. 변위 타원체 (displacement ellipsoid) 를 50% 확률 수준으로 도시한다.
도 2 는 화합물 R5 및 S5 의 혈장 용액 중 MMAE 의 β-글루쿠로니다아제-유도 방출의 동역학을 나타낸다.
도 3 은 화합물 R6 및 S6 의 혈장 용액 중 MMAF 의 β-글루쿠로니다아제-유도 방출의 동역학을 나타낸다.
도 4 는 화합물 R7 및 S7 의 혈장 용액 중 SN-38 의 β-글루쿠로니다아제-유도 방출의 동역학을 나타낸다.
도 5 는 화합물 R8 및 S8 의 혈장 용액 중 독소루비신의 β-글루쿠로니다아제-유도 방출의 동역학을 나타낸다.
도 6 은 pH 7.4 에서 PBS 중 화합물 R5 및 S5 의 안정성을 나타낸다.
도 7 은 화합물 R5 및 S5 의 혈장-결합 동역학을 나타낸다.
도 8 은 알부민-결합 R5 및 S5 의 혈장 안정성을 나타낸다.
도 9 는 R5 및 S5 의 1:1 혼합물의 HPLC 프로필을 나타낸다.
도 10 은 R4 및 S4 의 1:1 혼합물의 HPLC 프로필을 나타낸다.
발명의 상세한 설명
접합체
본 발명은 하기 식 (I) 을 갖는 접합체, 및 이의 약학적으로 허용가능한 염에 관한 것이다:
Figure pct00003
[식 중,
A 는 세포독성 약물에서 유래하는 라디칼을 나타내고,
G 는 자가-희생성 모이어티이고,
m 은 0 또는 1 임].
본 발명의 맥락에서, "약학적으로 허용가능한 염" 은 유기 암모늄 염기로 수득한 염, 또는 본 발명에 따른 접합체, 또는 전구약물 또는 약물, 및 유기산 또는 무기산의 염을 포함하는, 본 발명에 따른 접합체 또는 전구약물 또는 약물, 및 알칼리 금속, 알칼리 토금속, 또는 암모늄의 염을 나타낸다.
본 발명에 보다 특히 적합한 염은 소듐, 포타슘, 칼슘, 마그네슘 염, 사차 암모늄 염 예컨대 테트라메틸암모늄 또는 테트라에틸암모늄, 및 약학적으로 허용가능한 유기 아민, 예컨대 메틸아민, 디메틸아민, 트리메틸아민, 에틸아민, 트리에틸아민, 에탄올아민 또는 트리스(2-히드록시에틸)아민 및 암모니아와의 부가염일 수 있다.
본 발명에 따른 접합체, 또는 전구약물 또는 약물, 및 본 발명에 적합한 무기산의 염은 염산, 히드로브롬산, 황산, 질산 또는 인산으로 수득될 수 있다.
본 발명에 따른 접합체, 또는 전구약물 또는 약물, 및 본 발명에 적합한 유기산의 염은 카르복실산 및 술폰산, 예컨대 포름산, 아세트산, 옥살산, 시트르산, 락트산, 말산, 숙신산, 말론산, 벤조산, 말레산, 푸마르산, 타르타르산, 메탄술폰산, 벤젠술폰산 또는 p-톨루엔술폰산으로 수득될 수 있다.
본 발명에 따르면, "자가-희생성 모이어티" 는 세포독성 약물에서 유래하는 라디칼을 접합체의 나머지와 연결하며 활성화시 불안정해져 (예를 들어, 글루쿠로니드 잔기의 효소적 절단), 유리 (free) 모이어티, 특히 세포독성 약물의 방출을 초래하는, 이가 화학 기를 나타낸다. 자가 희생성 모이어티는 숙련된 기술자에게 널리 공지되어 있다 (Polym. Chem. 2011, 2, 773-790).
한 구현예에서, m 은 0 이다.
또 다른 구현예에서, m 은 1 이고, G 는 하기에서 선택되는 식으로 표시된다:
Figure pct00004
바람직한 구현예에서, G 는 하기 식으로 표시된다:
Figure pct00005
.
본 발명에 따르면, "세포독성 약물에서 유래하는 라디칼" 은 접합체의 나머지와 반응하는 그의 작용기 중 하나의 하나 이상의 원자 (예를 들어, H 원자) 가 제거된 세포독성 약물로 이루어지는 모이어티를 나타낸다.
본 발명에 따른 약물은 세포독성 약물이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "세포독성 약물" 은 세포와 접촉시, 임의로는 세포 내로 내재화시, 세포 기능 (예를 들어, 세포 성장 및/또는 증식 및/또는 분화 및/또는 대사 예컨대 단백질 및/또는 DNA 합성) 을 유해한 방식으로 변경시키거나 세포 사멸을 초래하는 분자를 나타낸다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "세포독성 약물" 은 독소, 특히 세포독소를 포함한다. 원칙적으로, 세포독성 약물은 LO1 ATC 분자 ("Anatomical Therapeutic Chemical Classification System", 여기서 LO1 은 WHO 의약품통계협력센터 (Collaborating Centre for Drug Statistics Methodology) 에 의해 정의된 항신생물제 및 면역조절제를 정의하는 하위군임) 로서 정의된다.
본 발명에 따른 세포독성 약물은 돌라스타틴 예컨대 돌라스타틴 10, 돌라스타틴 15, 아우리스타틴 E, 아우리스타틴 EB (AEB), 아우리스타틴 EFP (AEFP), 모노메틸 아우리스타틴 F (MMAF), 모노메틸아우리스타틴-D (MMAD), 모노메틸 아우리스타틴 E (MMAE), 5-벤조일발레르산-AE 에스테르 (AEVB) 또는 이의 유도체에서 선택될 수 있다.
바람직한 돌라스타틴은 MMAF, MMAD, MMAE, 또는 이의 유도체이다.
보다 바람직한 돌라스타틴은 MMAE, MMAF, 또는 이의 유도체이다.
특정 구현예에서, 본 발명에 따른 세포독성 약물은 안트라사이클린 예컨대 독소루비신, 이다루비신, 에피루비신, 다우노루비신 또는 발루비신, 바람직하게는 독소루비신이다.
또 다른 특정 구현예에서, 본 발명에 따른 세포독성 약물은 캄프토테신 계열 (본원에서 "캄프토테신 유사체" 로도 나타냄) 의 약물, 예컨대 캄프토테신, SN-38, 토포테칸, 이리노테칸, 엑사테칸, 실라테칸, 코시테칸, 루르토테칸, 지마테칸, 벨로테칸 또는 루비테칸, 바람직하게는 SN-38, 엑사테칸, 벨로테칸, 보다 바람직하게는 SN-38 이다.
바람직한 구현예에서, 세포독성 약물은 독소루비신, SN-38, MMAE, MMAF, MMAD, 및 이의 유도체에서 선택된다.
돌라스타틴은 자연적으로 흔히 발견되는 20 개의 아미노산과 상이하므로, 적어도 4 개의 아미노산, 바람직하게는 4 개의 아미노산 (그 중 적어도 3 개가 이에 특이적임) 의 구조를 갖는 화합물의 계열이다. 본 발명에 따르면, 돌라스타틴의 유도체는 돌라스타틴 계열의 적어도 하나의 화합물과 매우 관련된 화학 구조를 가지며 유사한 유사분열억제 특성을 나타낸다. 상기 유도체와 돌라스타틴 계열 화합물 사이의 구조적 차이는 흔히 발견되는 임의의 적합한 치환기에 의한 적어도 하나의 아미노산의 적어도 하나의 측쇄 상의 치환에 있을 수 있다. 예를 들어, 상기 치환기는 하기의 것일 수 있다:
- 알킬 기, 즉, 선형 또는 분지형 포화 탄화수소 사슬, 예컨대 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, sec-부틸, tert-부틸, 펜틸, 헥실, 헵틸, 옥틸, 노닐 또는 데실 기;
- 헤테로알킬 기, 즉, 하나 이상의 헤테로원자(들), 주로 O, N 및 S 에 의해 개재된 선형 또는 분지형 탄화수소 사슬, 예컨대 메톡시 또는 에톡시 기;
- 아릴 기, 즉, 방향족 카르보시클릭 기, 예컨대 페닐 또는 나프틸 기, 이는 -COOH, -SO3H, -OCH3, -F, -Cl, -Br, -I, -OH, -NH2, -NO2, -CN 을 포함하나 이에 제한되지 않는 4 개 이하의 기로 임의 치환될 수 있음;
- 헤테로아릴 기, 즉, 하나 이상의 헤테로원자를 함유하는 방향족 기, 예컨대 피리딜, 옥사졸릴, 푸라닐 또는 티아졸릴 기; 또는
- 할로겐 원자, 예컨대 -F, -Cl, -Br, -I.
구조적 차이는 또한, 이러한 기능이 고려되는 링커 완부와의 공유 결합의 확립과 양립가능하게 되도록, 예를 들어 N-말단 위치에서 그의 삼차 아민의 수준에서의, 돌라스타틴 예컨대 돌라스타틴 10, 돌라스타틴 15, 아우리스타틴 E, 아우리스타틴 EB (AEB), 아우리스타틴 EFP (AEFP), 모노메틸 아우리스타틴 F (MMAF), 모노메틸아우리스타틴-D (MMAD), 모노메틸 아우리스타틴 E (MMAE), 또는 5-벤조일발레르산-AE 에스테르 (AEVB) 의 변형으로 이루어질 수 있다.
당업자는 이러한 목적을 위해 적합한 변형, 특히 적합한 치환기를 선택할 수 있다.
또 다른 구현예에 따르면, 약물은 미탄신 예컨대 DM1 및 DM4, 안트라사이클린 예컨대 독소루비신, 네모루비신 및 PNU-159682, 칼리케아미신, 듀오카르마이신 예컨대 CC-1065 및 듀오카르마이신 A, 피롤로벤조디아제핀, 피롤로벤조디아제핀 이량체, 인돌리노-벤조디아제핀, 인돌리노-벤조디아제핀 이량체, α-아마니틴, 에리불린, 아칼라브루티닙, 블레오마이신, 베리티닙, 클라드리빈, 클로파라빈, 코비메티닙, 코판리십, 크리조티닙, 시타라빈, 다브라페닙, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데시타빈, 에피루비신, 이브루티닙, 이다루비신, 라파티닙, 레날리도미드, 미토마이신 C, 미톡산트론, 넬라라빈, 니라파립, 파클리탁셀, 파노비노스타트, 포말리도미드, 프레드니손, 리보시클립, 팔보시클립, 롤라피탄트, 루카파리브, 소니데깁, 타목시펜, 템시롤리무스, 토포테칸, 트라벡테딘, 발루비신, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 및 이의 약학적으로 허용가능한 염에서 선택될 수 있다.
특정 구현예에서, 세포독성 약물은 SN-38 이며, m 은 1 이고 G 는
Figure pct00006
이다.
또 다른 특정 구현예에서, 세포독성 약물은 돌라스타틴 또는 안트라사이클린이며, m 은 0 이다.
방법
용어 "용매" 는 유기 용매, 무기 용매 예컨대 물, 또는 이의 혼합물을 나타낸다. 유기 용매의 예는 지방족 탄화수소 예컨대 펜탄 또는 헥산, 지환식 탄화수소 예컨대 시클로헥산, 방향족 탄화수소 예컨대 벤젠, 스티렌, 톨루엔, 오르토-자일렌, 메타-자일렌 또는 파라-자일렌, 할로겐화 탄화수소 예컨대 디클로로메탄, 클로로포름 또는 클로로벤젠, 질소-기반 용매 예컨대 피리딘, 아세토니트릴 또는 트리에틸아민, 산소-기반 용매, 특히 케톤 예컨대 아세톤, 에테르 예컨대 디에틸 에테르, tert-부틸 메틸 에테르 (TBME), 시클로펜틸 메틸 에테르 (CPME), 테트라히드로푸란 (THF) 또는 메틸 테트라히드로푸란 (Me-THF), 및 알코올 예컨대 메탄올 또는 에탄올, 에스테르 예컨대 n-부틸 아세테이트, 또는 아미드 예컨대 디메틸포름아미드 (DMF), 및 이의 혼합물을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.
"산 조건" 은 하나 이상의 산이 사용되는 조건을 나타낸다. 산의 예는 염산, 히드로브롬산, 히드리오딕산 (hydriodic acid), 히드로플루오르산, 질산, 황산, 헥사플루오로인산, 테트라플루오로붕산, 트리플루오로아세트산, 아세트산, 술폰산 예컨대 메탄술폰산, 모노- 또는 폴리카르복실산, 또는 이의 혼합물, 바람직하게는 염산을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.
"염기성 조건" 은 하나 이상의 염기가 사용되는 조건을 나타낸다. 염기의 예는 리튬 히드록시드 또는 소듐 히드록시드, 카르보네이트 예컨대 포타슘 카르보네이트, 소듐 카르보네이트 또는 소듐 히드로게노카르보네이트, 알콕시드 예컨대 소듐 메톡시드, 아민 예컨대 트리에틸아민, 및 질소-기반 시클릭 염기, 예컨대 이미다졸, N-메틸이미다졸, 피리딘 또는 디메틸-아미노-피리딘 (DMAP), 바람직하게는 리튬 히드록시드를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 접합체는 키랄 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 에 의한 rac-4-(1-히드록시부트-3-인-1-일)-2-니트로-페놀 중간체의 거울상이성질체 분리 단계를 포함하는 다단계 합성을 통해 상업적인 4-히드록시-3-니트로벤즈알데히드로부터 제조될 수 있다.
각각의 단계에 대해 하기 기재된 조건 (온도, 농도, 용매, 반응물, 반응물의 등가물) 은 숙련된 기술자의 유기 합성에 있어서의 일반적인 배경을 사용하여 그들에 의해 조정될 수 있다. 단계 말미에서 수득된 각각의 중간체 또는 생성물은 단리될 수 있고, 임의로는 정제될 수 있거나, 대안적으로는, 상기 중간체 또는 생성물의 단리 없이 여러 단계가 원-폿 (one-pot) 으로 실행될 수 있다. 하기 기재된 방법 단계의 순서는 변경될 수 있다.
단계 (a)
한 구현예에서, rac-4-(1-히드록시부트-3-인-1-일)-2-니트로-페놀은 4-히드록시-3-니트로벤즈알데히드로부터 1 단계로 제조될 수 있다. 반응은 4-히드록시-3-니트로벤즈알데히드의 알데히드 작용기 상에 이를 첨가하여 프로파르길 기를 도입하는 것으로 이루어진다. 전형적으로, 상기 반응은 4-히드록시-3-니트로벤즈알데히드를 친핵성 프로파르길 기, 즉, 친전자성 위치에 첨가될 수 있는, 프로파르길 기의 임의의 음이온성 또는 유기금속성 형태와 반응시킴으로써 수행될 수 있다. 상기 반응은 HgCl2 와 같은 촉매로 보조될 수 있다. 상기 친핵성 프로파르길 기는 프로파르길 브로마이드와 같은 임의의 프로파르길 공급원으로부터, 별개의 용기에서 사전에 제조되거나 제자리 (in situ) 형성될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 반응은 알루미늄 금속 및 HgCl2 의 존재 하에 4-히드록시-3-니트로벤즈알데히드 및 프로파르길 브로마이드를 사용하여 수행된다.
단계 (b)
이후, rac-4-(1-히드록시부트-3-인-1-일)-2-니트로-페놀의 2 개 거울상이성질체는 키랄 HPLC, 부분입체이성질체 염의 형성 및 분리, 결정화, 촉매 분해 (catalytic resolution) 또는 효소 분해 (enzymatic resolution), 또는 이의 조합과 같은 기법에 의해 분리될 수 있다. 바람직하게는, 2 개의 거울상이성질체는 키랄 HPLC 에 의해 분리된다. 키랄 HPLC 는 정지상이 키랄인 크로마토그래피 기법이다. 키랄 정지상은 아밀로오스-기반, 시클로덱스트린-기반 또는 셀룰로오스-기반 상일 수 있다. 바람직하게는, 키랄 정지상은 아밀로오스-기반 상이다.
이러한 거울상이성질체 분리 단계는 (R)-4-(1-히드록시부트-3-인-1-일)-2-니트로-페놀이 단리되게 한다. 분리 단계 후 (R)-4-(1-히드록시부트-3-인-1-일)-2-니트로-페놀의 거울상이성질체 순도는 유리하게는 90% 초과, 바람직하게는 95% 초과이다. 거울상이성질체 순도는 분석 키랄 HPLC 에 의해 측정될 수 있다.
단계 (c)
글루쿠로니드 모이어티를 도입시키기 위해, (R)-4-(1-히드록시부트-3-인-1-일)-2-니트로-페놀은 페놀 기의 선택적 O-글루쿠론산화 (glucuronidation) 를 허용하는 조건 하에 글루쿠론산 유도체와 반응할 수 있다. 바람직하게는, 상기 글루쿠론산 유도체는 완전히 보호된 글루쿠론산, 전형적으로 아세틸화된 글루쿠로네이트이며, 작용화되어, 페놀 기와 반응할 수 있다. 상기 글루쿠론산 유도체는 바람직하게는 알킬 아세토브로모-α-D-글루쿠로네이트, 보다 바람직하게는 메틸 아세토브로모-α-D-글루쿠로네이트이다. 바람직한 구현예에서, 페놀 기의 O-글루쿠론산화는 염기성 조건 하에 실행된다. 예를 들어, 반응은 Ag2CO3 및 HMTTA (1,1,4,7,10,10-헥사메틸트리에틸렌테트라민) 의 존재 하에 실행될 수 있다.
단계 (d)
단계 (c) 에서 수득된 O-글루쿠론산화 생성물은 커플링 단계 (e) 의 목적으로 전환될 수 있다. 이를 위해, 상기 생성물의 이차 알코올 작용기는 클로로포르메이트, 바람직하게는 4-니트로페닐 클로로포르메이트와 반영하여, 카르보네이트의 형성을 초래할 수 있다. 반응은 피리딘과 같은 염기로서 또한 작용할 수 있는 친핵체에 의해 촉매화될 수 있다.
단계 (e), (f) 및 (g)
단계 (e) 에서, 단계 (d) 에서 수득된 화합물은 이후 상기 정의된 바와 같은 세포독성 약물 (예컨대 MMAE) 에, 또는 A-G-H 모이어티 (A 는 세포독성 약물에서 유래하는 라디칼을 나타내고, G 는 자가-희생성 모이어티를 나타냄) 와 연결된다. 세포독성 약물이 단계 (d) 에서 수득된 화합물에 직접 연결되는 제 1 구현예에서, 상기 세포독성 약물의 아민 기 (또는 히드록시 기) 는 단계 (d) 에서 수득된 화합물의 카르보네이트와 반응하여 아미드 기를 생성시킨다. HOAt, HOBt, HOCt 와 같은 활성화제가 사용될 수 있다. 바람직하게는, 상기 활성화제는 HOBt 이다.
이러한 제 1 구현예 이후 하기 기재된 바와 같은 단계 (f) 및 (g) 의 실행은, 상기 정의된 바와 같은 식 (I) (식 중, m 은 0 임) 의 접합체를 이끌어낸다.
세포독성 약물이 자가-희생성 모이어티를 통해 단계 (d) 에서 수득된 화합물에 연결되는 제 2 구현예에서, 단계 (d) 에서 수득된 화합물은 A-G-H 모이어티 (A 는 세포독성 약물에서 유래하는 라디칼을 나타내고, G 는 자가-희생성 모이어티를 나타냄) 와 반응한다.
A-G-H 는 유리하게는 -NH2 또는 -NH- 인 작용기를 통해 단계 (d) 에서 수득된 화합물에 연결된다.
A-G-H 모이어티의 예는 하기를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다:
Figure pct00007
상기 A-G-H 모이어티는 전형적으로 세포독성 약물과 식 X-G-H 의 화합물을 반응시킴으로써 제조될 수 있는데, 상기 식 중에서 X 는 이탈기, 예컨대 술포네이트 (예를 들어, 메탄술포네이트, 트리플루오로메탄술포네이트, 톨루엔술포네이트, 니트로벤젠술포네이트), 또는 할로겐 (예를 들어, 염소, 브롬, 요오드) 을 나타낸다. 바람직하게는, X 는 브롬이다. 세포독성 약물은 전형적으로 X-G-H 와, 그의 아민 또는 히드록시 기 (또는 그의 아민 또는 히드록시 기 중 하나) 를 통해 반응하여, 상기 정의된 바와 같은 A-G-H 를 형성한다. 특정 구현예에서, X-G-H 는 세포독성 약물과 반응시 보호된 형태이다. "보호된 형태" 는 화합물의 하나 이상의 반응성 작용기가 미반응성 형태로 존재하는 형태를 나타낸다 (예컨대 N3 기의 형태로 보호된 NH2 기). X-G-H 를 세포독성 약물과 반응시킨 후, A-G-H 가 수득되며 또한 "보호된 형태" 일 수 있다. 상기 A-G-H 는 반응성 작용기 (들) 를 유리시키기 위해 "탈보호" 될 수 있다 (예를 들어, N3 기를 NH2 기로 전환시킴).
이러한 제 2 구현예 이후 하기 기재된 바와 같은 단계 (f) 및 (g) 의 실행은, 상기 정의된 바와 같은 식 (I) (식 중, m 은 1 임) 의 접합체를 이끌어낸다.
한 구현예에서, 글루쿠로니드 모이어티 상의 아세틸 및 에스테르 작용기의, 히드록시 및 카르복실산 작용기 각각으로의 탈보호는 단계 (f) 에서 실행된다. 단계 (e) 에서 수득된 화합물의 글루쿠로니드 모이어티를 탈보호하는 상기 단계 (f) 는 바람직하게는 염기성 조건, 보다 바람직하게는 저온에서의 염기성 조건 하에 실행된다. 대안적으로, 상기 단계 (f) 는 산 조건 하, 및 아세토니트릴과 같은 임의의 유기 용매 중에서 실행될 수 있다. 그런 다음, 단계 (f) 에서 수득된 화합물의 알킨 작용기는 식 N3-(CH2-CH2-O)10-(CH2)2-NH-CO-(CH2)5-X (식 중, X 는 말레이미드 기임) 의 아자이드와 널리 공지된 클릭-화학 (click-chemistry) 조건 하에 커플링되어, 1,4-이치환된 트리아졸 위치이성질체의 선택적 형성이 허용되고, 그에 따라 본 발명의 접합체가 형성된다.
식 N3-(CH2-CH2-O)10-(CH2)2-NH-CO-(CH2)5-X (식 중, X 는 말레이미드 기임) 의 아자이드는, 전형적으로 N3-(CH2-CH2-O)10-(CH2)2-NH2 를 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥사노에이트와 반응시킴으로써 수득될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 단계 (f) 는 단계 (e) 에서 수득된 화합물을 식 N3-(CH2-CH2-O)10-(CH2)2-NH2 의 아자이드와 클릭-화학 조건 하에 커플링시켜, 1,4-이치환된 트리아졸 위치이성질체의 선택적 형성을 허용하는 것으로 이루어진다. 단계 (g) 에서, -NH2 기는, 전형적으로 단계 (f) 에서 수득된 화합물을 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥사노에이트와 반응시켜, 알킬 사슬의 말단에서 말레이미드 기로 치환된 알킬아미드로 전환된다. 그런 다음, 단계 (g) 에서 수득된 화합물의 글루쿠로니드 모이어티의 최종 탈보호가 실행된다. 이러한 탈보호는 바람직하게는 염기성 조건 하, 보다 바람직하게는 저온에서의 염기성 조건 하에 실행된다.
본 발명에 따른 방법은 순도가 유리하게는 90% 초과, 바람직하게는 95% 초과인 단일 이성질체로서 존재하는 접합체에 대한 접근을 제공한다.
전구약물
본 발명에 따른 접합체는 친핵성 기, 보다 특히 티올 기 (-SH) 에 대해 매우 반응성인 말레이미드 기를 함유한다. 이러한 기는 전형적으로 마이클 첨가 (Michael addition) 를 통해 말레이미드 모이어티에 추가된다. 따라서, 말레이미드 기는 본 발명의 접합체를 거대분자와 커플링시키기 위해 선택되는 반응성 기이다. 본 발명의 맥락에서, 거대분자는 바람직하게는 내인성 분자이다.
본 발명에 따르면, 전구약물은 거대분자, 보다 특히 단백질에 공유적으로 연결된 적어도 하나의 접합체를 나타낸다. 상기 전구약물은, 불활성화된 형태로, 유기체 중의 세포독성 약물을 이동시킬 수 있으며, 상기 약물을 β-글루쿠로니다아제의 작용 하에 특이적으로 표적화되는 기관, 조직 또는 세포에 방출할 수 있다. 전구약물은 거대분자, 보다 특히 단백질과 반응시킴으로써 생체내 (in vivo) 또는 생체외 (in vitro) 형성될 수 있다.
특히, 단백질은 암 세포의 멤브레인에 존재하는 분자, 바람직하게는 단백질, 당단백질, 당지질, 탄수화물, 또는 이의 조합으로 이루어지는 군에서 선택되는 분자에 특이적으로 결합하는 것들에서 선택되며, 보다 더 바람직하게는 단백질은 암 세포의 멤브레인에 존재하는 단백질에 특이적으로 결합한다. 단백질이 결합할 수 있는 멤브레인 분자는 암 세포의 멤브레인에 주로 또는 독점적으로 존재하는 분자이다. 특정 구현예에서, 단백질에 의해 인식되는 멤브레인 분자는 암 세포의 멤브레인에서 과발현되는 단백질이다.
바람직한 구현예에서, 단백질은 항체 및 알부민으로 이루어지는 군에서 선택될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항체" 는 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자의 면역학적으로 활성인 부분, 즉, 항원에 면역학적으로 결합하는 항원-결합 위치를 함유하는 분자를 지칭한다. 따라서, 항체라는 용어는 전체 항체 분자 뿐만 아니라 항원-결합 항체 단편 및 항체 및 항체 단편의 변이체 (유도체 포함) 도 포함한다. 특히, 본 발명에 따른 항체는 단클론 항체 (예를 들어, 키메라, 인간화 또는 인간 항체), 또는 단클론 항체의 단편에 상응할 수 있다. 항체라는 용어는 고전적인 항체 뿐만 아니라 중쇄 항체 및 이의 단편 및 유도체 예컨대 (VHH)2 단편 및 단일 도메인 항체를 지칭한다.
특정한 에피토프를 인식하는 항체 단편은 공지된 기법에 의해 생성될 수 있다. 항체 단편은 F(ab')2, Fab, Fv, scFv 등과 같은 항체의 항원 결합 부분이다. 다른 항체 단편은: 항체 분자의 펩신 소화에 의해 생성될 수 있는 F(ab')2 단편, 및 F(ab')2 단편의 디술피드 브릿지 (bridge) 를 환원시켜 생성될 수 있는 Fab' 단편을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 대안적으로, Fab' 발현 라이브러리가 구축되어 (Huse et al., 1989, Science, 246:1274-1281), 원하는 특이성을 갖는 단클론 Fab' 단편의 신속하고 용이한 확인이 허용되게 할 수 있다.
본 발명에 따른 항체는 당업계에 공지된 임의의 기법, 예컨대 비제한적으로, 임의의 화학적, 생물학적, 유전적 또는 효소 기법 (단독으로 또는 조합으로) 에 의해 생성될 수 있다. 본 발명의 항체는 하이브리도마를 생성하고 배양함으로써 수득될 수 있다. 합성 단일 도메인 항체의 생성에 대해서는 WO 2015/063331 을 또한 참조한다.
본 발명에 따른 항체는 단량체 항체 또는 다량체 항체일 수 있으며, 특히 항체가 단량체인 경우 적어도 가변 도메인을 포함할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 항체는 IgG, 바람직하게는 하위유형 IgG1 또는 IgG4, 예를 들어 트라스투주맙 또는 리툭시맙이다.
본 발명의 가장 바람직한 구현예에서, 단백질은 유리 티올 작용기를 갖는 알부민 분자이다. 내인성 또는 외인성 알부민, 및 특히 인간 혈청 알부민, 재조합 알부민 또는 알부민의 단편이 고려될 수 있다.
내인성 알부민은 고형 종양의 미세환경에서 "EPR" ("증진된 투과 및 유지 (Enhanced Permeability and Retention)") 효과를 통해 축적되는 것으로 알려져 있어, 따라서 본 발명에 따른 접합체와 내인성 알부민 분자의 제자리 (in situ) 커플링이 전구약물로도 지칭되는, 그에 따라 형성된 커플링된 독립체 (entity) 를 종양 미세환경으로 표적화하여, 돌라스타틴과 같은 일부 세포독성 약물 유도체의 유리 형태의 선택성 부족이 극복될 수 있게 한다. 이러한 "EPR" 효과는 염증이 생긴 조직의 미세환경에 적용된다는 것에 유의해야 한다.
따라서 전구약물은 그의 반응성 말레이미드 기를 통해, 접합체와, 단백질, 바람직하게는 내인성 알부민 분자, 보다 바람직하게는 인간 혈청 알부민, 또는 이의 유도체의 유리 및 상보적인 반응성 작용기, 전형적으로는 티올 작용기 사이의 공유 결합의 생체내 선택적 형성을 통해 수득될 수 있다. 상기 전구약물은 단백질 분자 또는 분자의 단편 또는 유도체에 공유적으로 연결된, 본 발명에 따른 접합체의 적어도 하나의 분자를 포함할 수 있다.
알부민의 경우, 상기 공유 결합은 알부민의 위치 34 에서 시스테인의 티올 작용기로 확립될 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명의 전구약물은 그의 투여 전에 제조될 수 있다. 본 발명의 전구약물은 본 발명의 적어도 하나의 접합체와 단백질 예컨대 알부민 분자, 재조합 알부민 분자 또는 이의 단편 또는 유도체의 유리 및 상보적인 작용기, 전형적으로는 티올 작용기 사이의 공유 결합의 형성을 통해 생체외 형성될 수 있다. 상기 공유 결합은 알부민의 위치 34 에서 시스테인의 티올 작용기로 확립될 수 있다.
본 발명의 맥락에서, "알부민 분자의 단편" 은 만족스러운 생체이용률, 종양 조직에 대한 투과성 및 건강한 조직의 내피 장벽에 대한 불투과성을 보장하기에 충분한 크기를 갖는 알부민 분자, 이에 따라 생성된 전구약물의 단편을 나타낸다. 특정 구현예에서, 알부민 분자의 단편은 내인성 알부민 서열의 시스테인 34 에 상응하는 시스테인을 함유한다.
본 발명에 따른 전구약물은 식 (II), 및 이의 약학적으로 허용가능한 염으로 나타낼 수 있다:
Figure pct00008
[식 중,
A, G 및 m 은 상기 정의된 바와 같고,
Prt 는 단백질에서 유래하는 라디칼을 나타내고,
n 은 0.1 내지 16, 바람직하게는 0.1 내지 8 로 구성됨].
한 특정 구현예에서, Prt 는 항체에서 유래하는 라디칼을 나타내고, n 은 상기 항체에 부착된 접합체의 평균 수이며 0.1 내지 16, 바람직하게는 0.1 내지 8 로 구성된다.
또 다른 특정 구현예에서, Prt 는 알부민에서 유래하는 라디칼을 나타내고, n 은 1 이다.
n 은 질량 분석법 (MS (Mass Spectrometry)) 및 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC (hydrophobic Interaction Chromatography)) 에 의해 측정될 수 있다.
본 발명에 따르면, "단백질에서 유래하는 라디칼" 은 접합체의 나머지와 반응하는 그의 작용기 중 하나의 하나 이상의 원자가 제거된 단백질로 이루어지는 모이어티를 나타낸다. 보다 구체적으로, "단백질에서 유래하는 라디칼" 은 그의 -SH 기의 수소 원자가 제거된 적어도 하나의 시스테인 모이어티를 포함하는 단백질을 나타낸다.
약학 조성물
본 발명의 접합체 또는 전구약물은 적어도 유효량의 본 발명의 적어도 하나의 접합체 또는 본 발명의 적어도 하나의 전구약물, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물 중 전달될 수 있다. 약학 조성물은 고체 또는 액체 상태일 수 있으며 인간 및/또는 수의학에서 흔히 사용되는 임의의 약학적 형태, 예를 들어 알약, 로젠지, 겔 캡슐, 드롭스, 과립, 주사가능 제제, 연고, 크림 또는 겔의 단순 정제 또는 당의정 형태일 수 있다. 약학 조성물은 통상의 방법에 따라 제조될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "약학적으로 허용가능한 담체" 는 약학 조성물에 존재하는 활성 성분 (즉 부형제) 를 제외한 임의의 성분을 지칭한다. 이의 첨가는 최종 생성물에 특정 일관성 또는 기타 물리적 또는 미각적 특성을 부여하는 것을 목표로 할 수 있다. 부형제 또는 약학적으로 허용가능한 담체는 활성 성분과의 임의의 상호작용, 특히 특정 화학적 상호작용이 없어야 한다. 종래의 부형제는 당업자에게 잘 알려진 기법에 따라 사용될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "유효량" 은 질환의 유해한 효과를 예방, 제거 또는 감소시키는 활성 성분의 양을 지칭한다.
용도
본 발명의 접합체 또는 본 발명의 전구약물은 암 및/또는 염증성 질환을 치료하는데 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "치료", "치료하다" 또는 "치료하는" 은 질환의 치료, 방지, 예방 및 지연과 같은 환자의 건강 상태를 개선시키는 것으로 의도된 임의의 행위를 지칭한다. 특정 구현예에서, 이러한 용어는 질환 또는 질환과 관련된 증상의 개선 또는 근절을 지칭한다. 다른 구현예에서, 이 용어는 하나 이상의 치료제를 이러한 질환을 갖는 대상체에게 투여함으로써 발생하는 질환의 확산 또는 악화를 최소화하는 것을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "대상체", "개체" 또는 "환자" 는 상호교환가능하며 동물, 바람직하게는 포유동물, 보다 더 바람직하게는 인간을 지칭한다. 그러나, 용어 "대상체" 는 또한 비-인간 동물, 특히 포유동물을 지칭할 수 있다. 본 발명에 따른 대상체는 동물, 바람직하게는 포유동물, 보다 더 바람직하게는 인간이다. 대상체는 그 중에서도 특히 포유동물 예컨대 개, 고양이, 말, 소, 돼지, 양 및 비-인간 영장류와 같은 포유동물에서 선택되는 비-인간 동물일 수 있다. 바람직하게는, 대상체는 인간, 바람직하게는 성인, 보다 바람직하게는 적어도 40 세의 성인, 보다 더 바람직하게는 적어도 50 세의 성인, 더욱 더 바람직하게는 적어도 60 세의 성인이다.
본 발명은 또한 약제의 제조를 위한, 본 발명에 따른 접합체, 본 발명에 따른 전구약물 또는 본 발명에 따른 약학 조성물의 용도에 관한 것이다. 바람직하게는, 이는 대상체에서의 암 및/또는 염증성 질환 치료용 약제의 제조를 위한, 본 발명에 따른 접합체, 본 발명에 따른 전구약물 또는 본 발명에 따른 약학 조성물에 관한 것이다.
이는 또한 대상체에서의 암 및/또는 염증성 질환을 치료하는 방법에 관한 것이며, 여기서 치료적 유효량의 본 발명에 따른 접합체, 치료적 유효량의 본 발명에 따른 전구약물 또는 치료적 유효량의 본 발명에 따른 약학 조성물이, 암 및/또는 염증성 질환을 앓고 있는 상기 대상체에게 투여된다.
이는 또한 대상체에서의 암 및/또는 염증성 질환을 치료하는 방법에 관한 것이며, 여기서 치료적 유효량의 본 발명에 따른 접합체, 치료적 유효량의 본 발명에 따른 전구약물 또는 치료적 유효량의 본 발명에 따른 약학 조성물이, 화학요법, 방사선요법, 적어도 하나의 항염증제로의 치료, 및 이의 조합으로 이루어지는 군에서 선택되는 또 다른 치료와 조합으로, 암 및/또는 염증성 질환을 앓고 있는 상기 대상체에게 투여된다.
본 발명에 따른 접합체, 본 발명에 따른 전구약물 또는 본 발명에 따른 약학 조성물은 이를 필요로 하는 대상체에게 임의의 편리한 경로로 투여될 수 있다. 예를 들어, 이는 전신 경로, 특히 피하, 근육내, 정맥내 또는 피내, 바람직하게는 정맥내 주사에 의해 투여될 수 있다. 본 발명에 따른 접합체, 본 발명에 따른 전구약물 또는 본 발명에 따른 약학 조성물은 단일 용량 또는 다수 용량으로서 투여될 수 있다. 본 발명에 따른 접합체, 본 발명에 따른 전구약물 또는 본 발명에 따른 약학 조성물은 매일 및 매월, 바람직하게는 매주 또는 2 주마다, 보다 바람직하게는 매주 투여될 수 있다. 본 발명에 따른 접합체, 본 발명에 따른 전구약물 또는 본 발명에 따른 약학 조성물을 사용한 치료 기간은 바람직하게는 1 내지 20 주, 바람직하게는 1 내지 10 주로 구성된다. 대안적으로, 치료는 질환의 증상이 계속되는 한, 지속될 수 있다. 본 발명에 따른 접합체, 본 발명에 따른 전구약물 또는 본 발명에 따른 약학 조성물의 투여량은 당업자에게 잘 알려져 있는 표준 절차에 의해 결정되어야 한다. 치료적 유효량이 환자에게 투여될 것이므로, 환자의 생리학적 데이터 (예를 들어, 연령, 크기 및 체중) 및 투여 경로를 고려하여 적절한 투약량을 결정해야 한다.
암
용어 "암" 또는 "종양" 은, 본원에서 사용되는 바와 같이, 암-유발 세포의 전형적인 특징, 예컨대 제어되지 않는 증식, 및/또는 불멸성, 및/또는 전이 가능성, 및/또는 빠른 성장 및/또는 증식 속도, 및/또는 특정한 특징적인 형태학적 특성을 갖는 세포의 존재를 지칭한다. 이 용어는 임의 유형의 대상체에서의 임의 유형의 악성 종양 (일차 또는 전이) 을 지칭한다. 이는 조혈 종양 뿐만 아니라 고형 종양을 지칭할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 암은 전립선암, 폐암, 유방암, 위암, 신장암, 난소암, 간세포암, 골육종, 흑색종, 하인두암, 식도암, 자궁내막암, 자궁경부암, 췌장암, 간암, 결장 또는 결장직장암, 신경내분비 종양, 근육의 악성 종양, 부신암, 갑상선암, 자궁암, 피부암, 방광암, 두경부암, 림프종 및 백혈병으로 이루어지는 군에서 선택된다.
본 발명의 접합체, 본 발명의 전구약물 또는 본 발명의 약학 조성물은 특히 유방암, 결장암, 난소암, 전립선암, 췌장암 및 폐암을 치료하는 것을 목표로 한다.
본 발명에서의 이의 용도 및/또는 전이의 치료를 위해 본 발명의 접합체, 본 발명의 전구약물 또는 본 발명의 약학 조성물을 이용할 수 있다.
염증성 질환
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "염증성 질환" 은 특히 장의 만성 병리학적 상태 또는 류마티스 병리학적 상태를 지칭한다.
실시예
본 발명은 설명 목적으로만 제공되는 다음의 실시예를 고려하여 더 잘 이해될 것이다.
방법 1 - 분취용 HPLC
분취용 HPLC 시스템은 2 개의 Shimadzu LC-8A 펌프, SPD-10A VP 검출기 (Shimadzu), SCL-10A VP 컨트롤러 (Shimadzu), SIL-10A 오토샘플러, 2 mL 샘플 루프 및 SunFire C18 컬럼 (150 mm x 19 mm i.d., 5 μm, Waters) 로 이루어졌다. 샘플을 샘플 루프에 주입하고 17 ml/분 유속 (50 분 실행, 254 nm 에서 검출; 완충제 A: H2O miliQ + 0.05% 의 TFA; 완충제 B: 아세토니트릴; 구배: 40 분 - 5% 에서 95% B, 5 분 - 95% B, 5 분 - 5% B) 으로 용리하였다.
방법 2 - 분석용 HPLC
분석용 HPLC 를 Waters 2487 UV 검출기 및 Gemini-NX, 5 μm, C18, 150 x 4.6 mm 컬럼이 장착된 Waters 2695 분리 모듈에서 실행하였다. 유속은 1 ml/분이었다. 용매 A: 물 중 0.05% TFA. 용매 B: 아세토니트릴 중 0.05% TFA. 구배 실행: 0-1 분 - 30% B; 1-11 분 - 30% 에서 80% B; 11-12 분 - 80% 에서 95% B; 12-14.5 분 - 95% B; 14.5-14.7 분 - 95% 에서 30% B; 14.7-17 분 - 30% B.
방법 3 - LCMS
LCMS 를 Waters 2487 UV 검출기, Waters Acquity QDa 질량 검출기 및 CORTECS, 2.7 μm, C18, 50 x 4.6 mm 컬럼이 장착된 Waters 2695 분리 모듈에서 실행하였다. 유속은 1 ml/분이었다. 용매 A: 물 중 0.05% HCOOH. 용매 B: 아세토니트릴 중 0.05% HCOOH. 구배 실행: 0-5 분 - 5% 에서 95% B; 5-6 분 - 95% B; 6-7.8 분 - 5% B. 질량 검출기를 600℃ 프로브 온도, 1.5 kV 모세관 전압 및 10 V 콘 (cone) 전압으로 포지티브 MS 스캔 모드에서 작동시켰다.
방법 4 - 키랄 HPLC
키랄 HPLC 를 Shimadzu SIL-10A 오토샘플러, Shimadzu SCL-10AVP UV 검출기 (254 nm 로 설정), 2 개의 Shimadzu LC-8A 펌프, CHIRALPAK® IG Semi-Prep 컬럼 (5 μm, ID 20mm x L 250mm) 및 2 mL 샘플 루프가 장착된 Shimadzu SCL-10AVP 시스템에서 실행하였다. 유속은 20 ml/분이었다. 용리액은 디클로로메탄이었다. 분리를 5 분 동안 실행하였다.
방법 5 - 키랄 HPLC
키랄 HPLC 를 Shimadzu SIL-10A 오토샘플러, Shimadzu SCL-10AVP UV 검출기 (254 nm 로 설정), 2 개의 Shimadzu LC-8A 펌프, CHIRALPAK® IG Semi-Prep 컬럼 (5 μm, ID 20mm x L 250mm) 및 2 mL 샘플 루프가 장착된 Shimadzu SCL-10AVP 시스템에서 실행하였다. 유속은 20 ml/분이었다. 용리액은 헵탄 및 에탄올의 혼합물 (70:30) 이었다. 분리를 25 분 동안 실행하였다.
화합물 R1 및 S1 의 라세미 혼합물의 합성
Figure pct00009
냉매 및 투입 깔때기가 장착된 플라스크에, 알루미늄 분말 (6.17 eq., 14156 mg, 524 mmol) 및 촉매량의 HgCl2 (0.00248 eq., 57.2 mg, 0.211 mmol) 를 무수 THF (218 mL) 로 덮었다. 그런 다음, 톨루엔 중 프로파르길 브로마이드 (6.2 eq., 78439 mg, 58.8 mL, 527 mmol) 80% 용액을 적가하였다 (주의: 발열 반응; 발열의 피크 및 이의 강도는 알루미늄 분말의 분산도에 따라 좌우됨). 첨가가 끝났을 때, 생성된 반응 혼합물을 6 시간 동안 환류시켰다. 그런 다음, 용액을 0℃ 로 냉각시키고, THF (109 mL) 중 4-히드록시-3-니트로벤즈알데히드 (1 eq., 14210 mg, 85 mmol) 의 용액을 적가하였다. 30 분 교반한 후, 알데히드는 완전히 사라졌으며 (TLC 에 의해 제어됨), 반응을 0℃ 로 냉각시켰다. 1 N HCl (10 mL) 을 적가하여 반응 혼합물을 켄칭한 후, EtOAc 로 3 회 추출하였다. 유기층을 MgSO4 로 건조시킨 다음, 증발시켜 갈색 오일을 수득하고, 이를 플래시 크로마토그래피 (시클로헥산/EtOAc - 70/30) 에 의해 정제하였다. 미량의 Wurtz 반응 부산물을 제거하기 위해, 생성된 황색 오일을 DCM (655 mL) 에 가용화시키고, 유기층을 1 N NaOH 용액 (매회 DCM 부피의 1/3) 으로 3 회 추출하였다. 수득한 조합된 수성상에, DCM (동일 부피) 을 첨가하였다. 반응 혼합물을 pH 1 이 될 때까지 농축 HCl 로 산성화시켰다. 수성상을 DCM (매회 수용액 부피의 1/3) 으로 3 회 더 추출하였다. 조합된 유기층을 MgSO4 로 건조시키고, 증발시켜 (R)-4-(1-히드록시부트-3-인-1-일)-2-니트로페놀 및 (S)-4-(1-히드록시부트-3-인-1-일)-2-니트로페놀 혼합물 (7927 mg, 38.3 mmol, 45%) 의 라세미 혼합물을 수득하였다.
Figure pct00010
MS ( ESI , 방법 3) m/z : 230.1 [M+Na]+
거울상이성질체 R1 및 S1 의 분리
거울상이성질체 R1 및 S1 을 키랄 크로마토그래피를 사용하여 분리하였다. 키랄 크로마토그래피를 Shimadzu SIL-10A 오토샘플러, Shimadzu SCL-10AVP UV 검출기 (254 nm 로 설정), Shimadzu FRC-10A 분액 수집기, 2 개의 Shimadzu LC-8A 펌프, CHIRALPAK® IG Semi-Prep 컬럼 (5 μm, ID 20mm x L 250mm) 및 2 mL 샘플 루프가 장착된 Shimadzu SCL-10AVP 시스템에서 수행하였다. 헵탄 및 에탄올의 혼합물 (70:30) 을 용리액으로서 사용하여 20 ml/min 유속에서 정제를 수행하였다. R1 및 S1 의 혼합물 250 mg 에 0.15 mL 의 에탄올 및 0.35 mL 의 헵탄을 첨가하였다. 생성 혼합물을 샘플 루프에 주입하고, 정제를 25 분 동안 실행하였다. 순수 R1 이성질체를 함유하는 제 1 분획을 4 분과 8 분 사이에 수집하였다. 순수 S1 이성질체를 함유하는 제 2 분획을 10 분과 22 분 사이에 수집하였다. 용리액을 증발시키고, 순수 거울상이성질체 R1 및 S1 을 다음 단계에서 사용하였다. R1 및 S1 의 거울상이성질체 순도를 키랄 HPLC (방법 5) 에 의해 확인하였다.
화합물 R1 HPLC (방법 5) RT: 6.53 분
화합물 S1 HPLC (방법 5) RT: 16. 79 분
화합물 R2
Figure pct00011
무수 아세토니트릴 (20 mL) 중 HMTTA (0.7 eq., 2.11 g, 2.5 mL, 9.17 mmol; 1,1,4,7,10,10-헥사메틸트리에틸렌테트라민, CAS 3083-10-1) 및 Ag2CO3 (3.7 eq., 13.4 g, 48.5 mmol) 의 용액을 실온에서 2 시간 동안 교반하였다. 아세토니트릴 (11.9 mL) 중 (R)-4-(1-히드록시부트-3-인-1-일)-2-니트로페놀 (1 eq., 2.71 g, 13.1 mmol) 및 (2R,3R,4S,5S,6S)-2-브로모-6-(메톡시카르보닐)테트라히드로-2H-피란-3,4,5-트리일 트리아세테이트 (1.1 eq., 5.7 g, 14.3 mmol) 용액을 0℃ 에서 첨가고, 생성 혼합물을 실온에서 4 시간 동안 교반하였다. 반응을 물로 켄칭한 후, EtOAc (50 mL) 를 첨가하였다. 수득한 반응 혼합물을 3 분 동안 교반한 후, 여과하여 은염을 제거하였다. 4 이상 부분의 Et2O 로 추출을 실시하고; 통합된 유기 분획을 MgSO4 로 건조시키고 증발시켰다. 생성 미정제 물질을 플래시 크로마토그래피 (시클로헥산/EtOAc 구배 0-100% 의 EtOAc, 20 분 내; 30 컬럼 부피) 에 의해 정제하여, 메틸 R2 (3428 mg, 6.55 mmol, 50%) 를 담황색 고체로서 수득하였다.
Figure pct00012
MS (방법 3) m/z : 546.2 [M+Na]+
화합물 S2
Figure pct00013
무수 아세토니트릴 (30 mL) 중 HMTTA (0.7 eq., 3.4 g, 4 mL, 14.76 mmol; 1,1,4,7,10,10-헥사메틸트리에틸렌테트라민, CAS 3083-10-1) 및 Ag2CO3 (3.7 eq., 21.5 g, 78 mmol) 의 용액을 실온에서 2 시간 동안 교반하였다. 아세토니트릴 (20 mL) 중 (S)-4-(1-히드록시부트-3-인-1-일)-2-니트로페놀 (1 eq., 4.37 g, 21.1 mmol) 및 메틸 (2R,3R,4S,5S,6S)-2-브로모-6-(메톡시카르보닐)테트라히드로-2H-피란-3,4,5-트리일 트리아세테이트 (1.1 eq., 10 g, 25.3 mmol) 용액을 0℃ 에서 첨가하고, 생성 혼합물을 실온에서 4 시간 동안 교반하였다. 반응을 물로 켄칭한 후, EtOAc (80 mL) 를 첨가하였다. 수득한 반응 혼합물을 3 분 동안 교반한 후, 여과하여 은염을 제거하였다. 4 이상 부분의 Et2O 로 추출을 실시하고; 통합된 유기 분획을 MgSO4 로 건조시키고 증발시켰다. 생성 미정제 물질을 플래시 크로마토그래피 (시클로헥산/EtOAc 구배 0-100% 의 EtOAc, 20 분 내; 30 컬럼 부피) 에 의해 정제하여, S2 (6100 mg, 11.6 mmol, 55%) 를 담황색 고체로서 수득하였다.
Figure pct00014
MS (방법 3) m/z : 546.3 [M+Na]+
화합물 R3
Figure pct00015
건조 DCM (30 mL) 중 R2 (1 eq., 1600 mg, 3.05 mmol) 및 4-니트로페닐 클로로포르메이트 (2 eq., 1230 mg, 6.1 mmol) 의 용액에 피리딘 (2.5 eq., 0.62 mL, 7.62 mmol) 을 0℃ 에서 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 1 시간 동안 교반한 후, 포화 수성 NaHCO3 으로 켄칭하였다. 혼합물을 DCM (반응 부피와 동일) 으로 3 회 추출하고, 조합된 유기층을 MgSO4 로 건조시키고, 진공 하 여과 및 농축하였다. 플래시 크로마토그래피 (시클로헥산/EtOAc 구배 0-100% 의 EtOAc, 20 분 내; 30 컬럼 부피) 에 의해 정제하여, R3 (1469 mg, 2.13 mmol, 70%) 을 황백색 고체로서 수득하였다.
Figure pct00016
MS (방법 3) m/z : 711.2 [M+Na]+
HPLC (방법 4) RT: 2.77 분
화합물 S3
Figure pct00017
건조 DCM (50 mL) 중 S2 (1 eq., 2600 mg, 5.0 mmol) 및 4-니트로페닐 클로로포르메이트 (2 eq., 2000 mg, 9.9 mmol) 의 용액에 피리딘 (2.5 eq., 1 mL, 12.42 mmol) 을 0℃ 에서 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 1 시간 동안 교반하고, 포화 수성 NaHCO3 으로 켄칭하였다. 혼합물을 DCM (반응 부피와 동일함) 으로 3 회 추출하고, 조합된 유기층을 MgSO4 로 건조시키고, 진공 하 여과 및 농축하였다. 시클로헥산/에틸 아세테이트 중 플래시 크로마토그래피 (시클로헥산/EtOAc 구배 0-100% 의 EtOAc, 20 분 내; 30 컬럼 부피) 에 의해 정제하여, S3 (2300 mg, 2.13 mmol, 68%) 을 황백색 고체로서 수득하였다.
Figure pct00018
MS (방법 3) m/z : 711.2 [M+Na]+
HPLC (방법 4) RT: 2.84 분
화합물 R4
Figure pct00019
DMF (1.15 mL) 중 R3 (1 eq., 41.3 mg, 0.06 mmol) 및 MMAE (1 eq., 43.1 mg, 0.06 mmol) 의 용액에 피리딘 (0.287 mL) 중 HOBt (1 eq., 8.11 mg, 0.06 mmol) 의 용액을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 24 시간 동안 교반한 후, MeOH (11.5 mL) 로 희석하고 0℃ 로 냉각시켰다. 생성 용액에 LiOH (10 eq., H2O 중 1 M, 0.6 mL, 0.6 mmol) 를 첨가하고, 혼합물을 4℃ 에서 16 시간 동안 인큐베이션하였다. 생성 용액을 HCOOH (20 eq., H2O 중 1 M, 1.2 mL, 1.2 mmol) 로 켄칭하고, 감압 하에 3 mL 로 농축하였다. 잔류물을 분취용 HPLC (방법 1) 에 의해 정제하여, R4 (41.9 mg, 0.0372 mmol, 62%) 를 담황색 고체로서 수득하였다.
HPLC (방법 2) RT: 7.81 분
MS (방법 3) m/z : 1127.7 [M+H]+
화합물 S4
Figure pct00020
DMF (1.05 mL) 중 S3 (1 eq., 37.9 mg, 0.055 mmol) 및 MMAE (1 eq., 39.5 mg, 0.055 mmol) 의 용액에 피리딘 (0.263 mL) 중 HOBt (1 eq., 7.43 mg, 0.055 mmol) 의 용액을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 24 시간 동안 교반한 후, MeOH (10.5 mL) 로 희석하고 0℃ 로 냉각시켰다. 생성 용액에 LiOH (10 eq., H2O 중 1 M, 0.55 mL, 0.55 mmol) 를 첨가하고, 혼합물을 4℃ 에서 16 시간 동안 인큐베이션하였다. 생성 용액을 HCOOH (20 eq., H2O 중 1 M, 1.1 mL, 1.1 mmol) 로 켄칭하고, 감압 하에 3 mL 로 농축하였다. 잔류물을 분취용 HPLC (방법 1) 에 의해 정제하여, S4 (36.6 mg, 0.0325 mmol, 59%) 를 담황색 고체로서 수득하였다.
HPLC (방법 2) RT: 7.66 분
MS (방법 3) m/z : 1127.9 [M+H]+
화합물 R5
Figure pct00021
건조 DMF (0.5 mL) 중 32-아지도-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30-데카옥사도트리아콘탄-1-아민 (1.2 eq., 19 mg, 0.036 mmol) 의 용액에 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥사노에이트 (1.2 eq., 11.1 mg, 0.036 mmol) 를 첨가하였다. 혼합물을 21℃ 에서 1 시간 동안 교반한 후, R4 (1 eq., 33.8 mg, 0.03 mmol) 를 첨가하였다. 트리스[(1-벤질-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메틸]아민 (0.2 eq., DMF 중 0.2 M, 0.03 mL, 0.006 mmol) 및 카파 술페이트 펜타히드레이트 (0.2 eq., H2O 중 0.2 M, 0.03 mL, 0.006 mmol) 를 혼합하고 21℃ 에서 2 분 동안 인큐베이션하여, TBTA-Cu(II) 복합체를 제조하였다. TBTA-Cu(II) 복합체 (0.2 eq., DMF/H2O 50/50 중 0.1 M, 0.06 mL, 0.006 mmol) 를 반응 혼합물에 첨가한 후 소듐 아스코르베이트 (1 eq., H2O 중 1 M, 0.03 mL, 0.03 mmol) 를 첨가하였다. 생성 혼합물을 21℃ 에서 1 시간 동안 인큐베이션하고, 분취용 HPLC 에 의해 정제하여, R5 (30.5 mg, 0.0165 mmol, 55%) 를 백색 고체로서 수득하였다.
HPLC (방법 2) RT: 6.85 분
MS (방법 3) m/z : 924.2 [M+2H]2+/2
화합물 S5
Figure pct00022
건조 DMF (0.417 mL) 중 32-아지도-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30-데카옥사도트리아콘탄-1-아민 (1.2 eq., 15.8 mg, 0.03 mmol) 의 용액에 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥사노에이트 (1.2 eq., 9.25 mg, 0.03 mmol) 를 첨가하였다. 혼합물을 21℃ 에서 1 시간 동안 교반한 후, S4 (1 eq., 28.2 mg, 0.025 mmol) 를 첨가하였다. 트리스[(1-벤질-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메틸]아민 (0.2 eq., DMF 중 0.2 M, 0.025 mL, 0.005 mmol) 및 카파 술페이트 펜타히드레이트 (0.2 eq., H2O 중 0.2 M, 0.025 mL, 0.005 mmol) 를 혼합하고 21℃ 에서 2 분 동안 인큐베이션하여, TBTA-Cu(II) 복합체를 제조하였다. TBTA-Cu(II) 복합체 (0.2 eq., DMF/H2O 50/50 중 0.1 M, 0.05 mL, 0.005 mmol) 를 반응 혼합물에 첨가한 후, 소듐 아스코르베이트 (1 eq., 1 M, 0.025 mL, 0.025 mmol) 를 첨가하였다. 생성 혼합물을 21℃ 에서 1 시간 동안 인큐베이션하고, 분취용 HPLC 에 의해 정제하여, S5 (26.8 mg, 0.0145 mmol, 58%) 를 백색 고체로서 수득하였다.
HPLC (방법 2) RT: 6.65 분
MS (방법 3) m/z : 924.1 [M+2H]2+/2
화합물 R6a
Figure pct00023
DMF (1.3 mL) 중 R3 (1 eq., 41.5 mg, 0.06 mmol) 및 MMAF (1 eq., 47.5 mg, 0.06 mmol) 의 용액에 피리딘 (0.291 mL) 중 HOBt (1 eq., 8.14 mg, 0.06 mmol) 의 용액을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 66 시간 동안 교반하고, HCOOH (3 eq., 6.8 μL, 0.18 mmol) 로 켄칭하고, 분취용 HPLC (방법 1) 에 의해 정제하여, R6a (57 mg, 0.043 mmol, 71% 수율) 를 백색 고체로서 수득하였다.
HPLC (방법 2) RT: 6.0 분
MS (방법 3) m/z : 669.5 [M+2H]2+/2
화합물 S6a
Figure pct00024
DMF (1.3 mL) 중 S3 (1 eq., 41.5 mg, 0.06 mmol) 및 MMAF (1 eq., 47.5 mg, 0.06 mmol) 의 용액에 피리딘 (0.291 mL) 중 HOBt (1 eq., 8.14 mg, 0.06 mmol) 의 용액을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 66 시간 동안 교반하고, HCOOH (3 eq., 6.8 μL, 0.18 mmol) 로 켄칭하고, 분취용 HPLC (방법 1) 에 의해 정제하여, S6a (26.6 mg, 0.02 mmol, 33% 수율) 를 백색 고체로서 수득하였다.
HPLC (방법 2) RT: 6.0 분
MS (방법 3) m/z : 669.4 [M+2H]2+/2
화합물 R6b
Figure pct00025
MeCN (233 μL) 중 R6a (1 eq. 26.5 mg, 0.02 mmol) 의 용액에 농축 수성 HCl (233 μL) 을 첨가하고, 용액을 40℃ 에서 20 시간 동안 교반하였다. 그런 다음, 혼합물을 0.5 mL 의 MeCN 으로 희석하고 원심분리하여, 침전물을 분리하였다. 상청액을 분취용 HPLC (방법 1) 에 의해 정제하여, R6b (6.7 mg, 5.9 μmol, 30% 수율) 를 황백색 고체로서 수득하였다.
HPLC (방법 2) RT: 4.4 분
MS (방법 3) m/z : 1141.6 [M+H]+
화합물 S6b
Figure pct00026
MeCN (233 μL) 중 S6a (1 eq. 26.5 mg, 0.02 mmol) 의 용액에 농축 수성 HCl (233 μL) 을 첨가하고, 용액을 40℃ 에서 20 시간 동안 교반하였다. 그런 다음, 혼합물을 0.5 mL 의 MeCN 으로 희석하고 원심분리하여, 침전물을 분리하였다. 상청액을 분취용 HPLC (방법 1) 에 의해 정제하여, S6b (10.4 mg, 9.1 μmol, 46% 수율) 를 황백색 고체로서 수득하였다.
HPLC (방법 2) RT: 4.4 분
MS (방법 3) m/z : 1141.6 [M+H]+
화합물 R6
Figure pct00027
건조 DMF (0.15 mL) 중 32-아지도-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30-데카옥사도트리아콘탄-1-아민 (1.2 eq., 3.53 mg, 6.7 μmol) 의 용액에 건조 DMF (0.15 mL) 중 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥사노에이트 (1.2 eq., 2.07 mg, 6.7 μmol) 의 용액을 첨가하였다. 혼합물을 21℃ 에서 1 시간 동안 교반한 후, DMSO (0.15 mL) 중 R6b (1 eq., 6.4 mg, 5.6 μmol) 를 첨가하였다. 트리스(3-히드록시프로필트리아졸릴메틸)아민 (1.5 eq., DMF 중 0.1 M, 0.084 mL, 8.4 μmol) 및 카파 술페이트 펜타히드레이트 (1.5 eq., H2O 중 0.1 M, 0.084 mL, 8.4 μmol) 를 혼합하고 21℃ 에서 1 분 동안 인큐베이션하여, THPTA-Cu(II) 복합체를 제조하였다. THPTA-Cu(II) 복합체 (1.5 eq., DMF/H2O 50/50 중 0.05 M, 0.168 mL, 8.4 μmol) 를 반응 혼합물에 첨가한 후, 소듐 아스코르베이트 (7.46 eq., H2O 중 0.5 M, 0.084 mL, 41.5 μmol) 를 첨가하였다. 생성 혼합물을 21℃ 에서 15 분 동안 인큐베이션하고, 분취용 HPLC (방법 1) 에 의해 정제하여, R6 (3.7 mg, 1.99 μmol, 36%) 을 백색 고체로서 수득하였다.
HPLC (방법 2) RT: 4.18 분
MS (방법 3) m/z : 931.1 [M+2H]2+/2
화합물 S6
Figure pct00028
건조 DMF (0.15 mL) 중 32-아지도-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30-데카옥사도트리아콘탄-1-아민 (1.2 eq., 4.63 mg, 8.8 μmol) 의 용액에 건조 DMF (0.15 mL) 중 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥사노에이트 (1.2 eq., 2.71 mg, 8.8 μmol) 의 용액을 첨가하였다. 혼합물을 21℃ 에서 1 시간 동안 교반한 후, DMSO (0.15 mL) 중 S6b (1 eq., 8.3 mg, 7.3 μmol) 를 첨가하였다. 트리스(3-히드록시프로필트리아졸릴메틸)아민 (1.5 eq., DMF 중 0.1 M, 0.109 mL, 10.9 μmol) 및 카파 술페이트 펜타히드레이트 (1.5 eq., H2O 중 0.1 M, 0.109 mL, 10.9 μmol) 를 혼합하고 21℃ 에서 1 분 동안 인큐베이션하여, THPTA-Cu(II) 복합체를 제조하였다. THPTA-Cu(II) 복합체 (1.5 eq., DMF/H2O 50/50 중 0.05 M, 0.218 mL, 10.9 μmol) 를 반응 혼합물에 첨가한 후, 소듐 아스코르베이트 (7.46 eq., H2O 중 0.5 M, 0.109 mL, 54.4 μmol) 를 첨가하였다. 생성 혼합물을 21℃ 에서 15 분 동안 인큐베이션하고, 분취용 HPLC (방법 1) 에 의해 정제하여, S6 (6.2 mg, 3.33 μmol, 46%) 을 백색 고체로서 수득하였다.
HPLC (방법 2) RT: 4.14 분
MS (방법 3) m/z : 931.1 [M+2H]2+/2
화합물 7a
Figure pct00029
DMF (7.22 mL) 중 SN-38 (1 eq., 72.2 mg, 0.18 mmol) 및 1-아지도-4-(브로모메틸)벤젠 (1 eq., 39 mg, 0.18 mmol) 의 용액에 K2CO3 (3 eq., 76.3 mg, 0.55 mmol) 을 첨가하였다. 생성 용액을 질소로 퍼징하고, 실온에서 1 시간 동안 교반하여, 7a 가 형성되게 하였다. 미정제물 7a (92 mg, 0.18 mmol, 96%) 를 추가 정제 없이 다음 단계에서 사용하였다.
MS (방법 3) m/z : 524.2 [M+H]+
화합물 7b
Figure pct00030
DMF (3 mL) 중 7a (1 eq., 96 mg, 0.18 mmol) 의 용액에 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 히드로클로라이드 (TCEP, 1.3 eq., 68.33 mg, 0.24 mmol) 를 첨가한 후, K2CO3 (3 eq., 76 mg, 0.55 mmol) 을 첨가하였다. 혼합물을 1 시간 동안 교반한 후, 5x 부피의 EtOAc 를 첨가한 후, 1x 부피의 물을 첨가하였다. 유기층을 분리하고, 수성층을 추가 5x 부피의 EtOAc 로 추출하였다. 조합된 유기층을 MgSO4 로 건조시키고, 진공 하 농축하여, 7b (90 mg, 0.18 mmol, 99%) 를 담황색 고체로서 수득하였다. 미정제물 7b 를 추가 정제 없이 다음 단계에서 사용하였다.
MS (방법 3) m/z : 498.2 [M+H]+
화합물 R7c
Figure pct00031
DMF (2.4 mL) 중 R3 (1 eq., 82 mg, 0.12 mmol), 7b (1 eq., 59 mg, 0.12 mmol) 및 HOBt (1 eq., 16 mg, 0.12 mmol) 의 용액을 25℃ 에서 16 시간 동안 교반하였다. 생성 혼합물을 분취용 HPLC (방법 1) 에 의해 정제하여, R7c (45 mg, 0.043 mmol, 36%) 를 담황색 고체로서 수득하였다.
MS (방법 3) m/z : 1047.3 [M+H]+
화합물 S7c
Figure pct00032
DMF (2.4 mL) 중 S3 (1 eq., 82 mg, 0.12 mmol), 7b (1 eq., 59 mg, 0.12 mmol) 및 HOBt (1 eq., 16 mg, 0.12 mmol) 의 용액을 25℃ 에서 16 시간 동안 교반하였다. 생성 혼합물을 분취용 HPLC (방법 1) 에 의해 정제하여, S7c (63 mg, 0.06 mmol, 50%) 를 담황색 고체로서 수득하였다.
MS (방법 3) m/z : 1047.3 [M+H]+
화합물 R7d
Figure pct00033
MeOH (20 mL) 중 R7c (1 eq., 23 mg, 22 μmol) 의 용액에 LiOH 의 1M 수용액 (200 eq., 4.4 mL, 4.4 mmol) 을 첨가하였다. 생성 반응 혼합물을 25℃ 에서 4 시간 동안 교반하고, 분취용 HPLC 에 의해 정제하여, R7d (16 mg, 0.018 mmol, 80%) 를 담황색 고체로서 수득하였다.
MS (방법 3) m/z : 907.3 [M+H]+
화합물 S7d
Figure pct00034
MeOH (20 mL) 중 S7c (1 eq., 23 mg, 22 μmol) 의 용액에 LiOH 의 1M 수용액 (200 eq., 4.4 mL, 4.4 mmol) 을 첨가하였다. 생성 반응 혼합물을 25℃ 에서 4 시간 동안 교반하고, 분취용 HPLC 에 의해 정제하여, S7d (13.9 mg, 0.016 mmol, 69.6%) 를 담황색 고체로서 수득하였다.
MS (방법 3) m/z : 907.3 [M+H]+
화합물 R7
Figure pct00035
건조 DMF (0.1 mL) 중 32-아지도-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30-데카옥사도트리아콘탄-1-아민 (1.5 eq., 5.92 mg, 11.3 μmol) 의 용액에 건조 DMF (0.1 mL) 중 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥사노에이트 (1.5 eq., 3.47 mg, 11.3 μmol) 의 용액을 첨가하였다. 혼합물을 21℃ 에서 1 시간 동안 교반한 후, DMSO (0.1 mL) 중 R7d (1 eq., 6.8 mg, 7.5 μmol) 를 첨가하였다. 트리스(3-히드록시프로필트리아졸릴메틸)아민 (0.5 eq., DMF 중 0.1 M, 37.5 μL, 3.75 μmol) 및 카파 술페이트 펜타히드레이트 (0.5 eq., H2O 중 0.1 M, 37.5 μL, 3.75 μmol) 를 혼합하고 21℃ 에서 1 분 동안 인큐베이션하여, THPTA-Cu(II) 복합체를 제조하였다. THPTA-Cu(II) 복합체 (0.5 eq., DMF/H2O 50/50 중 0.05 M, 75 μL, 3.75 μmol) 를 반응 혼합물에 첨가한 후, 소듐 아스코르베이트 (2.5 eq., H2O 중 0.5 M, 37.5 μL, 18.75 μmol) 를 첨가하였다. 생성 혼합물을 21℃ 에서 15 분 동안 인큐베이션하고, 분취용 HPLC (방법 1) 에 의해 정제하여, R7 (6.95 mg, 4.28 μmol, 57%) 를 백색 고체로서 수득하였다.
HPLC (방법 2) RT: 3.92 분
MS (방법 3) m/z : 813.9 [M+2H]2+/2
화합물 S7
Figure pct00036
건조 DMF (0.1 mL) 중 32-아지도-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30-데카옥사도트리아콘탄-1-아민 (1.5 eq., 5.92 mg, 11.3 μmol) 의 용액에 건조 DMF (0.1 mL) 중 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥사노에이트 (1.5 eq., 3.47 mg, 11.3 μmol) 의 용액을 첨가하였다. 혼합물을 21℃ 에서 1 시간 동안 교반한 후, DMSO (0.1 mL) 중 S7d (1 eq., 6.8 mg, 7.5 μmol) 를 첨가하였다. 트리스(3-히드록시프로필트리아졸릴메틸)아민 (0.5 eq., DMF 중 0.1 M, 37.5 μL, 3.75 μmol) 및 카파 술페이트 펜타히드레이트 (0.5 eq., H2O 중 0.1 M, 37.5 μL, 3.75 μmol) 를 혼합하고 21℃ 에서 1 분 동안 인큐베이션하여, THPTA-Cu(II) 복합체를 제조하였다. THPTA-Cu(II) 복합체 (0.5 eq., DMF/H2O 50/50 중 0.05 M, 75 μL, 3.75 μmol) 를 반응 혼합물에 첨가한 후, 소듐 아스코르베이트 (2.5 eq., H2O 중 0.5 M, 37.5 μL, 18.75 μmol) 를 첨가하였다. 생성 혼합물을 21℃ 에서 15 분 동안 인큐베이션하고, 분취용 HPLC (방법 1) 에 의해 정제하여, S7 (7.44 mg, 4.58 μmol, 61%) 을 백색 고체로서 수득하였다.
HPLC (방법 2) RT: 3.95 분
MS (방법 3) m/z : 813.9 [M+2H]2+/2
화합물 R8a
Figure pct00037
아세토니트릴 (2 mL) 중 R3 (1 eq., 317 mg, 0.46 mmol) 의 용액에 농축 HCl (52.2 eq., 2 mL, 24 mmol) 을 첨가하고, 혼합물을 37℃ 에서 16 시간 동안 교반하였다. 생성 혼합물에 EtOAc (8 mL) 를 첨가한 후, 물 (8 mL) 을 첨가하였다. 유기층을 분리하고, 수성층을 EtOAc 로 3 회 추출하였다. 조합된 유기층을 MgSO4 로 건조시키고, 진공 하 농축하여, 미정제물 R8a (250 mg, 0.46 mmol, 99%) 을 수득하고, 이를 추가 정제 없이 다음 단계에서 사용하였다.
MS (방법 3) m/z : 549.1 [M+H]+
화합물 S8a
Figure pct00038
아세토니트릴 (2 mL) 중 S3 (1 eq., 317 mg, 0.46 mmol) 의 용액에 농축 HCl (52.2 eq., 2 mL, 24 mmol) 을 첨가하고, 혼합물을 37℃ 에서 16 시간 동안 교반하였다. 생성 혼합물에 EtOAc (8 mL)를 첨가한 후, 물 (8 mL) 을 첨가하였다. 유기층을 분리하고, 수성층을 EtOAc 로 3 회 추출하였다. 조합된 유기층을 MgSO4 로 건조시키고, 감압 하 농축하여, 미정제물 S8a (247 mg, 0.45 mmol, 98%) 를 수득하였고, 이를 추가 정제 없이 다음 단계에서 사용하였다.
MS (방법 3) m/z : 549.1 [M+H]+
화합물 R8b
Figure pct00039
DMF (0.35 mL) 중 독소루비신 히드로클로라이드 (1 eq., 10 mg, 0.017 mmol) 의 용액에 TEA 의 용액 (2 eq., 0.35 mL, DMF 중 0.1 M, 0.035 mmol) 을 첨가한 후, R8a (1 eq., 9.5 mg, 0.017 mmol) 를 첨가하였다. 생성 혼합물을 25℃ 에서 16 시간 동안 교반하고, 분취용 HPLC (방법 1) 에 의해 정제하여, R8b (12.2 mg, 0.013 mmol, 74%) 를 적색 고체로서 수득하였다.
MS (방법 3) m/z : 953.3 [M+H]+
화합물 S8b
Figure pct00040
DMF (0.35 mL) 중 독소루비신 히드로클로라이드 (1 eq., 10 mg, 0.017 mmol) 의 용액에 TEA 의 용액 (2 eq., 0.35 mL, DMF 중 0.1 M, 0.035 mmol) 을 첨가한 후, S8a (1 eq., 9.5 mg, 0.017 mmol) 를 첨가하였다. 생성 혼합물을 25℃ 에서 16 시간 동안 교반하고, 분취용 HPLC (방법 1) 에 의해 정제하여, S8b (13.2 mg, 0.014 mmol, 80%) 를 적색 고체로서 수득하였다.
MS (방법 3) m/z : 953.3 [M+H]+
화합물 R8
Figure pct00041
건조 DMF (0.2 mL) 중 32-아지도-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30-데카옥사도트리아콘탄-1-아민 (1.5 eq., 11.82 mg, 22.45 μmol) 의 용액에 건조 DMF (0.2 mL) 중 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥사노에이트 (1.5 eq., 6.92 mg, 22.45 μmol) 를 첨가하였다. 혼합물을 21℃ 에서 1 시간 동안 교반한 후, DMSO (0.2 mL) 중 R8b (1 eq., 12 mg, 14.97 μmol) 를 첨가하였다. 트리스(3-히드록시프로필트리아졸릴메틸)아민 (1 eq., DMF 중 0.1 M, 150 μL, 14.97 μmol) 및 카파 술페이트 펜타히드레이트 (1 eq., H2O 중 0.1 M, 150 μL, 14.97 μmol) 를 혼합하고 21℃ 에서 1 분 동안 인큐베이션하여, THPTA-Cu(II) 복합체를 제조하였다. THPTA-Cu(II) 복합체 (1 eq., DMF/H2O 50/50 중 0.05 M, 300 μL, 14.97 μmol) 를 반응 혼합물에 첨가한 후, 소듐 아스코르베이트 (2 eq., H2O 중 0.5 M, 60 μL, 29.94 μmol) 를 첨가하였다. 생성 혼합물을 21℃ 에서 15 분 동안 인큐베이션하고, 분취용 HPLC (방법 1) 에 의해 정제하여, R8 (14.35 mg, 9.43 μmol, 63%) 을 적색 고체로서 수득하였다.
HPLC (방법 2) RT: 3.70 분
MS (방법 3) m/z : 836.9 [M+2H]2+/2
화합물 S8
Figure pct00042
건조 DMF (0.2 mL) 중 32-아지도-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30-데카옥사도트리아콘탄-1-아민 (1.5 eq., 11.82 mg, 22.45 μmol) 의 용액에 건조 DMF (0.2 mL) 중 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥사노에이트 (1.5 eq., 6.92 mg, 22.45 μmol) 를 첨가하였다. 혼합물을 21℃ 에서 1 시간 동안 교반한 후, DMSO (0.2 mL) 중 S8b (1 eq., 12 mg, 14.97 μmol) 를 첨가하였다. 트리스(3-히드록시프로필트리아졸릴메틸)아민 (1 eq., DMF 중 0.1 M, 150 μL, 14.97 μmol) 및 카파 술페이트 펜타히드레이트 (1 eq., H2O 중 0.1 M, 150 μL, 14.97 μmol) 를 혼합하고 21℃ 에서 1 분 동안 인큐베이션하여, THPTA-Cu(II) 복합체를 제조하였다. THPTA-Cu(II) 복합체 (1 eq., DMF/H2O 50/50 중 0.05 M, 300 μL, 14.97 μmol) 를 반응 혼합물에 첨가한 후, 소듐 아스코르베이트 (2 eq., H2O 중 0.5 M, 60 μL, 29.94 μmol) 를 첨가하였다. 생성 혼합물을 21℃ 에서 15 분 동안 인큐베이션하고, 분취용 HPLC (방법 1) 에 의해 정제하여, S8 (15.5 mg, 10.18 μmol, 68%) 을 적색 고체로서 수득하였다.
HPLC (방법 2) RT: 3.65 분
MS (방법 3) m/z : 836.9 [M+2H]2+/2
X-선 결정학에 의한 R1 ~ R1a 의 절대 배열 (absolute configuration) 의 결정
1) R1a 의 제조
Figure pct00043
R1 의 절대 배열을 결정하기 위해, 에스테르 R1a 를 합성하고, 결정화하고, X-선 결정학에 의해 분석하였다. 0℃ 로 냉각된 THF (3.61 mL) 중 R1 (1 eq., 111 mg, 0.536 mmol) 및 트리에틸아민 (2 eq., 108 mg, 0.149 mL, 1.07 mmol) 의 용액에 THF (3.61 mL) 중 4-니트로벤조일 클로라이드 (1.5 eq., 149 mg, 0.804 mmol) 의 용액을 적가하였다. 생성 용액을 실온으로 가온하고 30 분 동안 두었다. 에틸 아세테이트 (22 mL) 를 첨가한 후, 7 mL 의 물을 첨가하였다. 유기층을 분리하고, 포화 NaCl 용액으로 세척하였다. 유기층을 증발시키고, 잔류물을 플래시 크로마토그래피 (시클로헥산/EtOAc 구배 0-100% 의 EtOAc, 20 분 내; 30 컬럼 부피) 에 의해 정제하여, R1a (60.5 mg, 0.17 mmol, 88% 수율) 를 수득하였다.
2) X-선 결정학에 의한 R1a 의 절대 배열의 결정
R1a (60 mg) 를 3 mL 의 디클로로메탄에 용해하고, 3 mL 의 헵탄으로 희석하였다. 혼합물을 2 주의 기간에 걸쳐 천천히 증발시켜, R1a 결정의 형성을 유도하였다. 결정을 오일 중에 두고, 치수 0.50 x 0.40 x 0.18 mm 의 무색 판 단결정을 선별하여, 유리 섬유에 고정시키고 저온 N2 스트림에 두었다. Cu-Kα 방사선 (λ = 1.54178 Å) 을 사용하여, Oxford Cryosystem 액체 N2 장치가 장착된 Bruker APEX II DUO Kappa-CCD 회절계에서 X-선 회절 데이터 수집을 실행하였다. 결정-검출기 거리는 40 mm 였다. 각각 10 초 노출에서, 20 프레임의 3 개 세트로부터 취한 반사로부터 셀 매개변수를 결정하였다 (APEX3 소프트웨어). 프로그램 SHELXT-2014 를 사용하여 구조를 풀이하였다. 개선 및 모든 추가 계산을 SHELXL-2014 를 사용하여 실행하였다. 하나의 OH 기의 수소 원자는 푸리에 차이 (Fourier difference) 로부터 위치하였다. 다른 H-원자는 계산된 위치에 포함되었으며 SHELXL 디폴트 매개변수를 사용하여 라이딩 원자 (riding atom) 로서 처리되었다. 비-H 원자는, F2 에 대한 가중 전체 매트릭스 최소 제곱을 사용하여 이방성으로 정제되었다. APEX3 에서 SADABS 를 사용하여 반경험적 흡수 보정 (semi-empirical absorption correction) 을 적용하였다; 투과 인자: Tmin /Tmax = 0.6111/0.7528.
X-선 결정학의 결과를 도 1 에 나타낸다.
MMAE 의 β- 글루쿠로니다아제 -유도 방출의 동역학 측정
ㆍ 10 μL 의 R5 (DMSO 중 10 mM) 를 990 μL 의 인간 혈장에 첨가하고 37℃ 에서 20 분 동안 인큐베이션하여, R 이성질체의 샘플 용액을 제조하였다.
ㆍ 10 μL 의 S5 (DMSO 중 10 mM) 를 990 μL 의 인간 혈장에 첨가하고 37℃ 에서 20 분 동안 인큐베이션하여, S 이성질체의 샘플 용액을 제조하였다.
ㆍ 50 μL 의 1 M 수성 HCl 을 1.5 mL 의 아세토니트릴에 첨가하여, 켄칭 용액 (Q) 을 제조하였다.
ㆍ 대장균 (Escherichia coli) 으로부터의 β-글루쿠로니다아제의 글리세롤 수용액 20 μL (6.5 mg/mL) 를 180 μL 의 H2O 에 첨가하여, β-글루쿠로니다아제 용액 (Glu) 을 제조하였다.
ㆍ 10 μL 의 MMAE (DMSO 중 10 mM) 를 990 μL 의 인간 혈장에 첨가하고 37℃ 에서 20 분 동안 인큐베이션하여, 참조 용액 (Ref) 을 제조하였다.
1 mL 의 각각의 이성질체 및 참조 용액에 40.9 uL 의 Glu 를 첨가하였다. 생성 혼합물을 37℃ 에서 인큐베이션하였다. 각각의 용액의 45 μL 분취액을 하기 시점에서 155 μL 의 Q 로 켄칭하였다: 1 분, 2 분, 3 분, 4 분, 5 분, 6 분 및 7 분. 켄칭된 분취액을 15000 g 에서 5 분 동안 원심분리하고, 상청액을 719 Da ([MMAE+H]+ 에 상응함) 으로 설정된 선택적 이온 분석 (Selected ion recording) 으로 LCMS (방법 3) 에 의해 분석하였다. 각각의 시점에서 방출된 MMAE 의 양을 (샘플 피크 면적)/(참조 피크 면적) x 100% 로서 계산하였다 (도 2).
세포독성 약물의 β- 글루쿠로니다아제 -유도 방출의 동역학 측정을 위한 일반적인 절차
ㆍ 5 μL 의 화합물 R6, R7 또는 R8 (DMSO 중 10 mM) 을 인간 혈장 및 포타슘 포스페이트 완충제 (0.1M, pH 7.0) 의 50/50 혼합물 500 μL 에 첨가하고 37℃ 에서 20 분 동안 인큐베이션하여, R 이성질체의 샘플 용액을 제조하였다.
ㆍ 5 μL 의 화합물 S6, S7 또는 S8 (DMSO 중 10 mM) 을 인간 혈장 및 포타슘 포스페이트 완충제 (0.1M, pH 7.0) 의 50/50 혼합물 500 μL 에 첨가하고 37℃ 에서 20 분 동안 인큐베이션하여, S 이성질체의 샘플 용액을 제조하였다.
ㆍ 50 μL 의 1 M 수성 HCl 을 1.5 mL 의 아세토니트릴에 첨가하여, 켄칭 용액 (Q) 을 제조하였다.
ㆍ 대장균으로부터의 β-글루쿠로니다아제의 글리세롤 수용액 20 μL (6.5 mg/mL) 를 180 μL 의 H2O 에 첨가하여, β-글루쿠로니다아제 용액 (Glu) 을 제조하였다.
ㆍ 5 μL 의 상응하는 유리 세포독성 약물 (DMSO 중 10 mM) 을 인간 혈장 및 포타슘 포스페이트 완충제 (0.1M, pH 7.0) 의 50/50 혼합물 500 μL 에 첨가하고 37℃ 에서 20 분 동안 인큐베이션하여, 참조 용액 (Ref) 을 제조하였다.
각각의 샘플 및 참조 용액에 10 uL 의 Glu 를 첨가하였다. 생성 혼합물을 25℃ 에서 인큐베이션하였다. 각각의 용액의 45 μL 분취액을 그래프에서 표시한 정확한 시점에서 155 μL 의 Q 로 켄칭하였다 (도 3-5). 켄칭된 분취액을 15000 g 에서 5 분 동안 원심분리하고, 상청액을 [M+H]+ (여기서, M 은 유리 세포독성제의 몰 질량에 상응함) 로 설정된 선택적 이온 분석으로 LCMS (방법 3) 에 의해 분석하였다. 각각의 시점에서 방출된 세포독성제의 양을 (샘플 피크 면적)/(참조 피크 면적) x 100% 로서 계산하였다.
결과를 도 2 ~ 5 에서 설명한다:
도 2. R5 및 S5 의 혈장 용액 중 MMAE 의 β-글루쿠로니다아제-유도 방출의 동역학은, S5 와 비교하여, 혈장-결합 R5 의 상당히 더 빠른 절단을 입증한다: 7 분의 인큐베이션 후, 24% 의 MMAE 가 혈장-결합 R5 로부터 방출되었으며 12% 만이 혈장-결합 S5 로부터 방출되었다.
도 3. R6 및 S6 의 혈장 용액 중 MMAF 의 β-글루쿠로니다아제-유도 방출의 동역학은, S6 과 비교하여, 혈장-결합 R6 의 상당히 더 빠른 절단을 입증한다: 40 분의 인큐베이션 후, 86% 의 MMAF 가 혈장-결합 R6 으로부터 방출되었으며 57% 만이 혈장-결합 S6 으로부터 방출되었다.
도 4. R7 및 S7 의 혈장 용액 중 SN-38 의 β-글루쿠로니다아제-유도 방출의 동역학은, S7 과 비교하여, 혈장-결합 R7 의 더 빠른 절단을 입증한다: 40 분의 인큐베이션 후, 24% 의 SN-38 이 혈장-결합 R7 로부터 방출되었으며 18% 만이 혈장-결합 S7 로부터 방출되었다.
도 5. R8 및 S8 의 혈장 용액 중 독소루비신의 β-글루쿠로니다아제-유도 방출의 동역학은, S8 과 비교하여, 혈장-결합 R8 의 더 빠른 절단을 입증하였다: 40 분의 인큐베이션 후, 99% 의 독소루비신이 혈장-결합 R8 로부터 방출되었으며 80% 만이 혈장-결합 S8 로부터 방출되었다.
pH 7.4 에서의 수성 완충제 중 R5 및 S5 의 안정성 측정
ㆍ 20 μL 의 R5 (DMSO 중 10 mM) 를 180 μL 의 인산 완충 식염수 (pH 7.4) 에 첨가하여, 샘플 용액 R5- PBS 를 제조하였다.
ㆍ 20 μL 의 S5 (DMSO 중 10 mM) 를 180 μL 의 인산 완충 식염수 (pH 7.4) 에 첨가하여, 샘플 용액 S5-PBS 를 제조하였다.
ㆍ 샘플을 25℃ 에서 인큐베이션하고, 924 Da ([R5+2H]2+/2 및 [S5+2H]2+/2 에 상응함) 및 933 Da (형성된 주요 불순물은 가수분해된 생성물 [R5+H2O+2H]2+/2 및 [S5+H2O+2H]2+/2 에 상응함) 로 설정된 선택적 이온 분석으로 LCMS (방법 3) 에 의해 분석하였다. 샘플을 하기의 시점에서 주입하였다: 0 분, 99 분, 195 분, 291 분, 387 분, 543 분, 699 분, 855 분, 980 분. 0 분에 주입된 샘플의 피크 면적을 참조 피크 면적으로서 간주하였다.
ㆍ 피크 면적% 를 (924 Da 피크 면적)/((924 Da 피크 면적 + (933 Da 피크 면적)) x 100% 로서 계산하였다.
결과를 도 6 에서 설명한다. 샘플 둘 모두에 대해, 화합물 (R5 또는 S5) 의 느린 가수분해가 pH 7.4 에서 관찰되었다: 30-40% 의 화합물이 1000 분 후 가수분해된다.
동일한 실험을 pH 6.0 에서의 인산 완충 식염수에서 실행하였다. 어떠한 시점에서도 이들 조건에서 R5 또는 S5 의 분해는 관찰되지 않았다.
R5 및 S5 의 혈장-결합 동역학
ㆍ 50 μL 의 1 M 수성 HCl 을 1.5 mL 의 아세토니트릴에 첨가하여, 켄칭 용액 (Q) 을 제조하였다.
ㆍ 10 μL 의 R5 (DMSO 중 10 mM) 를 990 μL 의 인간 혈장에 첨가하고 37℃ 에서 인큐베이션하여, 샘플 용액 R- Alb 를 제조하였다.
ㆍ 10 μL 의 S5 (DMSO 중 10 mM) 를 990 μL 의 인간 혈장에 첨가하고 37℃ 에서 인큐베이션하여, 샘플 용액 S-Alb 를 제조하였다.
ㆍ 각각의 샘플 용액의 45 μL 분취액을 하기 시점에서 155 μL 의 켄칭 용액에 첨가하였다: 0 분, 1 분, 2 분, 3 분, 4 분, 5 분, 6 분, 7 분.
ㆍ 켄칭된 분취액을 15000 g 에서 5 분 동안 원심분리하고, 상청액을 924 Da ([R5+2H]2+/2 및 [S5+2H]2+/2 에 상응함) 으로 설정된 선택적 이온 분석으로 LCMS (방법 3) 에 의해 분석하였다. 0 분에 켄칭된 분취액의 피크 면적을 참조 피크 면적으로서 간주하였다.
ㆍ 각각의 시점에서 남아 있는 유리 약물% 를 (샘플 피크 면적)/(참조 피크 면적) x 100% 로서 계산하였다.
화합물 R5 및 S5 둘 모두는 도 7 에서 나타낸 바와 같이, 혈청 알부민과의 빠른 결합 반응을 거쳐, 그의 유리 형태의 농도의 급격한 감소를 초래한다. 2 분의 인큐베이션 후, 약 90% 의 S5 또는 R5 가 혈청 알부민에 결합하였고, 4 분 후 총 전환이 수득되었다.
알부민-결합 R5 및 S5 의 혈장 안정성
ㆍ 10 μL 의 R5 (DMSO 중 10 mM) 를 990 μL 의 인간 혈장에 첨가하여, 샘플 용액 R5- Alb 를 제조하였다.
ㆍ 10 μL 의 S5 (DMSO 중 10 mM) 를 990 μL 의 인간 혈장에 첨가하여, 샘플 용액 S5- Alb 를 제조하였다.
ㆍ 50 μL 의 1 M 수성 HCl 을 1.5 mL 의 아세토니트릴에 첨가하여, 켄칭 용액 (Q) 을 제조하였다.
ㆍ 10 μL 의 MMAE (DMSO 중 10 mM) 를 990 μL 의 인간 혈장에 첨가하여, 참조 용액 (Ref) 을 제조하였다.
ㆍ 샘플 용액 및 참조 용액을 37℃ 에서 인큐베이션하였다.
ㆍ 각각의 샘플 용액의 45 μL 분취액을 하기 시점에서 155 μL 의 켄칭 용액에 첨가하였다: 0 시간, 8 시간, 24 시간, 48 시간, 102 시간, 192 시간.
ㆍ 켄칭된 분취액을 15000 g 에서 5 분 동안 원심분리하고, 상청액을 719 Da ([MMAE+H]+ 에 상응함) 으로 설정된 선택적 이온 분석으로 LCMS (방법 3) 에 의해 분석하였다.
ㆍ 각각의 시점에서 방출된 MMAE% 를 (샘플 피크 면적)/(참조 피크 면적) x 100% 로서 계산하였다.
도 8 에서 나타낸 바와 같이, 오직 미량의 세포독성 약물 (MMAE) 만이 장기간 인큐베이션시 방출되었으므로 (192 시간, 즉, 8 일 인큐베이션 후 10% 미만), 알부민-결합 R5 및 S5 는 혈장에서 안정하게 남아 있다.
분리 시험
1:1 혼합물 중 화합물 R5 및 S5 를 분리하는 것을 목표로 하는 시험을 방법 2 에 따라 HPLC 에 의해 실행하였으나, 성공하지 못한 것으로 입증되었다: 도 9 에서 나타낸 바와 같이, 6.72 분 및 6.83 분의 매우 밀접한 RT 가 수득되었다.
R4 및 S4 의 1:1 혼합물로 유사한 시험을 실행하였으나, 7.56 분 및 7.72 분의 RT 가 수득되었으므로, 분리는 또한 성공하지 못한 것으로 입증되었다 (도 10).

Claims (13)

  1. 식 (I) 으로 나타내는 접합체 및 이의 약학적으로 허용가능한 염:
    Figure pct00044

    [식 중,
    A 는 세포독성 약물에서 유래하는 라디칼을 나타내고,
    G 는 자가-희생성 모이어티이고,
    m 은 0 또는 1 임].
  2. 제 1 항에 있어서, 세포독성 약물이 안트라사이클린, 예컨대 독소루비신, 돌라스타틴 예컨대 돌라스타틴 10, 돌라스타틴 15, 아우리스타틴 E, 아우리스타틴 EB (AEB), 아우리스타틴 EFP (AEFP), 모노메틸 아우리스타틴 F (MMAF), 모노메틸 아우리스타틴 D (MMAD), 모노메틸 아우리스타틴 E (MMAE), 5-벤조일발레르산-AE 에스테르 (AEVB) 또는 이의 유도체, 및 캄프토테신 유사체 예컨대 SN-38 에서 선택되는, 접합체 및 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  3. 제 2 항에 있어서, 세포독성 약물이 SN-38, 독소루비신, MMAF, MMAE, MMAD 및 이의 유도체로 이루어지는 군에서 선택되는, 접합체 및 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, G 를 하기에서 선택되는 식으로 나타내는 것인 접합체 및 이의 약학적으로 허용가능한 염:
    Figure pct00045
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 따른 접합체의 적어도 하나의 분자를 포함하는 전구약물로서, 접합체의 상기 분자가 공유 결합을 통해 단백질 분자, 바람직하게는 알부민, 또는 이의 단편 또는 유도체에 연결되는 것인 전구약물.
  6. 제 5 항에 있어서, 공유 결합이 알부민의 위치 34 에서 시스테인의 티올 작용기로 확립되는 것인 전구약물.
  7. 제 5 항에 있어서, 식 (II) 로 나타내는 전구약물 및 이의 약학적으로 허용가능한 염:
    Figure pct00046

    [식 중,
    A 는 세포독성 약물에서 유래하는 라디칼을 나타내고,
    Prt 는 단백질에서 유래하는 라디칼을 나타내고,
    n 은 0.1 내지 16, 바람직하게는 0.1 내지 8 로 구성되고,
    G 는 자가-희생성 모이어티이고,
    m 은 0 또는 1 임].
  8. 제 7 항에 있어서, Prt 가 알부민에서 유래하는 라디칼을 나타내고, n 이 1 인, 전구약물 및 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  9. 적어도 유효량의 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 접합체 또는 제 5 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 전구약물, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
  10. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 암 및/또는 염증성 질환을 치료하는데 사용하기 위한 접합체 및 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  11. 제 5 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 암 및/또는 염증성 질환을 치료하는데 사용하기 위한 전구약물.
  12. 제 9 항에 있어서, 암 및/또는 염증성 질환을 치료하는데 사용하기 위한 약학 조성물.
  13. 하기 단계를 포함하는, 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 따른 접합체의 제조 방법:
    a) 4-히드록시-3-니트로벤즈알데히드로부터 rac-4-(1-히드록시부트-3-인-1-일)-2-니트로-페놀을 제조하는 단계;
    b) 바람직하게는 키랄 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 (R)-4-(1-히드록시부트-3-인-1-일)-2-니트로-페놀을 분리 및 단리하는 단계;
    c) 염기성 조건 하에 (R)-4-(1-히드록시부트-3-인-1-일)-2-니트로-페놀을 글루쿠론산 유도체, 예컨대 메틸 아세토브로모-α-D-글루쿠로네이트와 반응시키는 단계;
    d) 단계 (c) 에서 수득한 화합물을 4-니트로페닐 클로로포르메이트와 반응시키는 단계;
    e) 단계 (d) 에서 수득한 화합물을 세포독성 약물 또는 A-G-H 모이어티 (A 는 세포독성 약물에서 유래하는 라디칼을 나타내고, G 는 자가-희생성 모이어티를 나타냄) 와 커플링시키는 단계;
    f) 바람직하게는 염기성 조건 하에 단계 (e) 에서 수득한 화합물의 글루쿠로니드 모이어티를 탈보호하는 단계; 및
    g) 단계 (f) 에서 수득한 화합물을 식 N3-(CH2-CH2-O)10-(CH2)2-NH-(CO)-(CH2)5-X (X 는 말레이미드 기임) 의 아자이드와 커플링시키는 단계.
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