KR20230133289A - 화합물 또는 이의 염, 및 이들에 의해 얻어지는 항체 - Google Patents

화합물 또는 이의 염, 및 이들에 의해 얻어지는 항체 Download PDF

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KR20230133289A
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도모히로 후지이
게이 야마다
유타카 마쓰다
류스케 히라마
노리코 하타다
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아지노모토 가부시키가이샤
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Abstract

본 발명은, 항체에 화학적으로 도입된 티올기의 변성에 의해 원하는 항체 또는 항체 조성물을 제공한다. 보다 구체적으로는, 본 발명은 (A) 하기 화학식 (A):
[화학식 (A)]

(식 중,
Ab는 소정의 항체이고,
S는 황 원자이고,
L은 2가 기이고,
R은 보호되어 있어도 좋은 생체 직교성 관능기이고,
n은 1 내지 8의 정수이다)로 표시되는, 보호되어 있어도 좋은 생체 직교성 관능기를 갖는 항체 중간체 또는 이의 염 및
(B) 하기 화학식 (B):
[화학식 (B)]

(식 중,
Ab, n은 화학식 (A)의 것과 동일하고,
SH는 티올기이다)로 표시되는 티올기 도입 항체 또는 이의 염을 포함하는, 원하는 특성을 갖는 항체 조성물 등을 제공한다.

Description

화합물 또는 이의 염, 및 이들에 의해 얻어지는 항체
본 발명은, 화합물 또는 이의 염, 및 이들에 의해 얻어지는 항체 등에 관한 것이다.
최근, 항체 약물 복합체(Antibody-Drug Conjugate: ADC)의 연구 개발이 한창 행해지고 있다. ADC는, 항체에 약물(예, 항암제)을 콘쥬게이션한 약재이고, 암세포 등에 대하여 직접적인 살세포 활성을 갖는다. 대표적인 ADC로서는, Immunogene사 및 Roche사가 공동 개발한 T-DM1(상품명: 카도사이라(등록상표))이 있다.
ADC는, 항체 중에 존재하는 특정 아미노산 잔기의 측쇄 중의 관능기를 약물에 결합함으로써 제작되고 있다. ADC의 제작에 사용되는 이러한 관능기의 예는, 항체 중에 존재하는 시스테인 잔기의 측쇄 중의 티올기이다. 항체 중의 티올기를 수식(修飾)하는 기술로서는, 3-아릴프로피오니트릴 화합물을 사용하는 기술(특허문헌 1) 및 아릴/헤테로아릴설폰/설폭사이드 화합물을 사용하는 기술(특허문헌 2)이 알려져 있다. 항체 중의 티올기를 수식하는 상기 선행기술은, 항체에서의 시스테인 잔기의 측쇄 중의 티올기(예, 항체 중에 천연으로 존재하는 시스테인 잔기 및 항체에 유전자 공학적으로 도입된 시스테인 잔기의 측쇄 중의 티올기)를 수식하는 것이다.
그러나, 본 발명자들이 파악하는 한, 선행기술은, 항체에 화학적으로 도입된 티올기(예, 항체에서의 시스테인 잔기 이외의 아미노산 잔기의 측쇄를 통하여 항체에 도입된 티올기)를 수식하는 것을 교시도 시사도 하고 있지 않다.
국제공개 제2015/001117호 국제공개 제2014/144878호
본 발명의 목적은, 항체에 화학적으로 도입된 티올기의 수식에 의해 원하는 항체 또는 항체 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명자들은, 예의 검토한 결과, 특정한 화합물이, 항체에 화학적으로 도입된 티올기를 고효율로 수식할 수 있음을 발견하였다. 이러한 특정한 화합물은 반응의 효율성이 우수하므로, 항체에 화학적으로 도입된 티올기의 수식뿐만 아니라, 항체에서의 시스테인 잔기 중의 티올기의 수식에도 유용하다고 생각된다. 또한, 이러한 특정한 화합물에 의하면, 항체 중의 티올기가 고효율로 수식된 원하는 항체를 제작할 수 있다.
본 발명자들은 또한, 상기 특정한 화합물에 의해 수식된 항체가, 낮은 항체 응집성 등의 원하는 성질이 우수한 것을 발견하였다.
본 발명자들은 또한, 본 발명에 의하면, 상기 특징을 갖는 원하는 항체를 포함하는 특수한 항체 조성물을 얻을 수 있음을 발견하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은, 이하이다.
[1] (A) 화학식 (A)로 표시되는, 보호되어 있어도 좋은 생체 직교성 관능기를 갖는 항체 중간체 또는 이의 염, (B) 화학식 (B)로 표시되는, 티올기 도입 항체 또는 이의 염을 포함하고,
화학식 (A)에서 항체(Ab)에 인접해 있는 황 원자(S) 및 화학식 (B)에서 항체(Ab)에 인접해 있는 티올기(SH)가, 항체 중쇄의 정상 영역 중의 동일 위치에 존재하는 동일 아미노산 잔기의 측쇄 중의 원자에 대하여, 직접 결합하고 있거나 또는 링커를 통하여 결합하고 있고,
L-R로 표시되는 부분 구조의 분자량이 700 이하이고,
상기 항체 중간체 또는 이의 염 및 상기 티올기 도입 항체 또는 이의 염의 합계량에 대한 상기 항체 중간체 또는 이의 염의 양의 백분율[100(%)×(상기 항체 중간체 또는 이의 염의 양)/(상기 항체 중간체 또는 이의 염 및 상기 티올기 도입 항체 또는 이의 염의 합계량)]이 80% 이상이고,
상기 항체 중간체 또는 이의 염 및 상기 티올기 도입 항체 또는 이의 염의 응집률이 5% 이하인, 항체 조성물.
[2] 상기 항체 중간체가, 화학식 (I'), (II'), (III') 또는 (IV')로 표시되는, [1]의 항체 조성물.
[3] 상기 아미노산 잔기가 시스테인 잔기 이외의 아미노산 잔기인, [1] 또는 [2]의 항체 조성물.
[4] 화학식 (A)에서 항체(Ab)에 인접해 있는 황 원자(S) 및 화학식 (B)에서 항체(Ab)에 인접해 있는 티올기(SH)가, 항체(Ab) 중쇄의 정상 영역 중의 동일 위치에 존재하는 라이신 잔기의 측쇄 중의 질소 원자에 대하여, 펩타이드를 함유하지 않은 링커를 통하여 위치 선택적으로 결합하고 있는, [1] 내지 [3] 중 어느 하나의 항체 조성물.
[5] 상기 항체가 IgG 항체인, [1] 내지 [4] 중 어느 하나의 항체 조성물.
[6] 라이신 잔기가, EU numbering에서의 인간 IgG 중쇄의 246/248위치, 288/290위치 및 317위치로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1개 이상의 위치에 존재하는, [4] 또는 [5]의 항체 조성물.
[7] 상기 항체 중간체가, 화학식 (1') 내지 (10')로 표시되는 항체 중간체로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는, [1] 내지 [6] 중 어느 하나의 항체 조성물.
[8] 보호되어 있어도 좋은 생체 직교성 관능기가 알킨 잔기 또는 아지드인, [1] 내지 [7] 중 어느 하나의 항체 조성물.
[9] 알킨 잔기가, 치환되어 있어도 좋은, 탄소 원자 사이 3중 결합을 갖는 환기(環基)인, [8]의 항체 조성물.
[10] 화학식 (I), (II), (III) 또는 (IV)로 표시되는 화합물 또는 이의 염을 포함하는, 티올기 도입 항체 또는 이의 염의 유도체화용 시약.
[11] 상기 시약이, 티올기 도입 항체 또는 이의 염에서의 시스테인 잔기 이외의 아미노산 잔기의 측쇄를 통하여 도입된 티올기와 반응함으로써 티올기 도입 항체 또는 이의 염을 유도체화하기 위한 시약인, [10]의 시약.
[12] 티올기 도입 항체에서의 티올기가, 항체 중쇄의 정상 영역 중의 라이신 잔기의 측쇄 중의 질소 원자에 대하여, 펩타이드를 함유하지 않은 링커를 통하여 위치 선택적으로 결합하고 있는, [10] 또는 [11]의 시약.
[13] 티올기 도입 항체가 IgG 항체인, [10] 내지 [12] 중 어느 하나의 시약.
[14] 라이신 잔기가, EU numbering에서의 인간 IgG 중쇄의 246/248위치, 288/290위치 및 317위치로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1개 이상의 위치에 존재하는, [12] 또는 [13]의 시약.
[15] 2가 기가 알킬렌, 아릴렌, -C(=O)-, -NR2-, -C(=O)-NR2-, -NR2-C(=O)-, -O- 및 -(O-R3)m-으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1개의 기이거나, 또는
2가 기가 알킬렌, 아릴렌, -C(=O)-, -NR2-, -C(=O)-NR2-, -NR2-C(=O)-, -O- 및 -(O-R3)m-으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 2개 이상의 기가 연결된 2가 기이고,
R2가 수소 원자 또는 알킬이고,
R3이 알킬렌 또는 아릴렌이고,
m이 1 내지 5의 정수인, [10] 내지 [14] 중 어느 하나의 시약.
[16] 상기 화합물이 화학식 (1) 내지 (10)으로 표시되는 화합물로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는, [10] 내지 [15] 중 어느 하나의 시약.
[17] 화학식 (I), (II), (III) 또는 (IV)로 표시되는, 화합물 또는 이의 염.
[18] 상기 화합물이 화학식 (2) 내지 (10)으로 표시되는 화합물로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는, [17]의 화합물 또는 이의 염.
[19] 화학식 (I'), (II'), (III') 또는 (IV')로 표시되는, 보호되어 있어도 좋은 생체 직교성 관능기를 갖는 항체 중간체 또는 이의 염.
[20] 화학식 (I'), (II'), (III') 또는 (IV')에서 항체(Ab)에 인접해 있는 황 원자(S)가, 항체(Ab) 중쇄의 정상 영역 중의 시스테인 잔기 이외의 아미노산 잔기의 측쇄 중의 원자에 대하여, 직접 결합하고 있거나 또는 링커를 통하여 결합하고 있는, [19]의 항체 중간체 또는 이의 염.
[21] 화학식 (I'), (II'), (III') 또는 (IV')에서 항체(Ab)에 인접해 있는 황 원자(S)가, 항체(Ab) 중쇄의 정상 영역 중의 라이신 잔기의 측쇄 중의 질소 원자에 대하여, 펩타이드를 함유하지 않은 링커를 통하여 위치 선택적으로 결합하고 있는, [20]의 항체 중간체 또는 이의 염.
[22] 상기 항체 중간체가 IgG 항체인, [19] 내지 [21] 중 어느 하나의 항체 중간체 또는 이의 염.
[23] 라이신 잔기가, EU numbering에서의 인간 IgG 중쇄의 246/248위치, 288/290위치 및 317위치로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1개 이상의 위치에 존재하는, [21] 또는 [22]의 항체 중간체 또는 이의 염.
[24] 상기 항체 중간체가 화학식 (1') 내지 (12')로 표시되는 항체 중간체로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는, [19] 내지 [23] 중 어느 하나의 항체 중간체 또는 이의 염.
[25] 화학식 (I), (II), (III) 또는 (IV)로 표시되는 화합물 또는 이의 염을, 티올기 도입 항체 또는 이의 염과 반응시켜서, 화학식 (I'), (II'), (III') 또는 (IV')로 표시되는, 보호되어 있어도 좋은 생체 직교성 관능기를 갖는 항체 중간체 또는 이의 염을 생성하는 것을 포함하는, 보호되어 있어도 좋은 생체 직교성 관능기를 갖는 항체 중간체 또는 이의 염의 제조방법.
[26] 화학식 (I"), (II"), (III") 또는 (IV")로 표시되는, 항체 및 기능성 물질의 콘쥬게이트 또는 이의 염.
[27] 상기 콘쥬게이트가, 화학식 (1") 내지 (12")로 표시되는 콘쥬게이트로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는, [26]의 콘쥬게이트 또는 이의 염.
[28] 화학식 (I'), (II'), (III') 또는 (IV')로 표시되는, 보호되어 있어도 좋은 생체 직교성 관능기를 갖는 항체 중간체 또는 이의 염을, 항체 중간체에 의해 보유되는 생체 직교성 관능기와 반응 가능한 생체 직교성 관능기를 갖는 기능성 물질과 반응시켜서, 화학식 (I"), (II"), (III") 또는 (IV")로 표시되는, 항체 및 기능성 물질의 콘쥬게이트 또는 이의 염을 생성하는 것을 포함하고,
상기 항체 중간체 또는 이의 염이 알킨 잔기를 갖는 경우, 상기 항체 중간체 또는 이의 염은 아지드를 갖는 기능성 물질과 반응하고,
상기 항체 중간체 또는 이의 염이 아지드를 갖는 경우, 상기 항체 중간체 또는 이의 염은 알킨 잔기를 갖는 기능성 물질과 반응되는, 항체 및 기능성 물질의 콘쥬게이트 또는 이의 염의 제조방법.
[29] 화학식 (I), (II), (III) 또는 (IV)로 표시되는 화합물 또는 이의 염을, 티올기 도입 항체 또는 이의 염과 반응시켜서, 화학식 (I'), (II'), (III') 또는 (IV')로 표시되는, 보호되어 있어도 좋은 생체 직교성 관능기를 갖는 항체 중간체 또는 이의 염을 생성하는 것을 추가로 포함하는, [28]의 방법.
본 발명의 항체 조성물은, 항체 및 기능성 물질의 콘쥬게이트 또는 이의 염을, 응집률이 낮은 상태에서 효율적으로 제조할 수 있다.
본 발명의 시약은, 티올기 도입 항체 또는 이의 염을 유도체화할 수 있다.
본 발명의 화합물 또는 이의 염은, 티올기 도입 항체 또는 이의 염의 유도체화에 사용할 수 있다.
본 발명의 항체 중간체 또는 이의 염은, 항체 및 기능성 물질의 콘쥬게이트 또는 이의 염의 제조에 사용할 수 있다.
본 발명의 콘쥬게이트 또는 이의 염은, 의약 또는 시약(예, 진단약, 연구용 시약)으로서 사용할 수 있다.
[도 1] 도 1은, 티올기 도입 항체 및 「탈리기-L-R」로 표시되는 화합물 또는 이의 염(L은 2가 기이고, R은 보호되어 있어도 좋은 생체 직교성 관능기이다)의 반응에 의해 얻어지는 항체 조성물의 개요를 나타내는 도면이다. 이러한 반응에 의해 얻어지는 항체 조성물은, 화학식 (A)로 표시되는, 보호되어 있어도 좋은 생체 직교성 관능기를 갖는 항체 중간체 또는 이의 염 및 화학식 (B)로 표시되는, 티올기 도입 항체 또는 이의 염을 포함한다.
[도 2] 도 2는, 화학식 (I)로 표시되는 본 발명의 화합물 또는 이의 염에 의한 티올기 도입 항체의 수식의 개요를 나타내는 도면이다.
[도 3] 도 3은, 화학식 (II)로 표시되는 본 발명의 화합물 또는 이의 염에 의한 티올기 도입 항체의 수식의 개요를 나타내는 도면이다.
[도 4] 도 4는, 화학식 (III)으로 표시되는 본 발명의 화합물 또는 이의 염에 의한 티올기 도입 항체의 수식의 개요를 나타내는 도면이다.
[도 5] 도 5는, 화학식 (IV)로 표시되는 본 발명의 화합물 또는 이의 염에 의한 티올기 도입 항체의 수식의 개요를 나타내는 도면이다.
[도 6] 도 6은, (1) 트라스투주맙의 중쇄의 아미노산 서열(서열번호 1) 및 (2) 트라스투주맙의 경쇄의 아미노산 서열(서열번호 2)을 나타내는 도면이다.
[도 7] 도 7은, 트라스투주맙의 트립신 소화에 의한 라이신 잔기로의 수식 부위(요오도아세트아미드에 의한 Carbamidomethyl화를 받은 티올 도입체(+145.019Da))를 포함하는 아미노산 18잔기로 이루어진 펩타이드, FNWYVDGVEVHNAKTKPR(서열번호 3)의 펩타이드 프래그먼트의 MS 스펙트럼(실측값: m/z 577.03606, 이론값: 577.03557, 4가)을 나타내는 도면이다.
[도 8] 도 8은, EU numbering에서의 인간 IgG 중쇄의 288/290위치의 라이신 잔기의 수식을 나타내는, 3가 y16에 상당하는 m/z 682.13(이론값: 682.01)의 프로덕트 이온의 CID 스펙트럼을 나타내는 도면이다.
[도 9] 도 9는, 트라스투주맙의 트립신 소화물에 대하여, 라이신 잔기로의 수식(요오도아세트아미드에 의한 Carbamidomethyl화를 받은 티올 도입체(+145.019Da)를 포함하는 펩타이드 프래그먼트를 BioPharma Finder를 사용해서 검색한 결과를 나타내는 도면이다. 가로축은 동정(同定)된 라이신 잔기를 나타내고, 세로축은 Intensity를 나타낸다.
[도 10] 도 10은, 트라스투주맙의 트립신 소화에 의한 라이신 잔기로의 수식 부위(요오도아세트아미드에 의한 Carbamidomethyl화를 통한 티올 도입체(+145.019Da))를 포함하는 아미노산 18잔기로 이루어진 펩타이드, FNWYVDGVEVHNAKTKPR(서열번호 3)의 펩타이드 프래그먼트의 MS 스펙트럼(실측값: m/z 577.03571, 이론값: 577.03557, 4가)을 나타내는 도면이다.
[도 11] 도 11은, EU numbering에서의 인간 IgG 중쇄의 288/290위치의 라이신 잔기의 수식을 나타내는, 3가 y16에 상당하는 m/z 682.41(이론값: 682.01)의 프로덕트 이온의 CID 스펙트럼을 나타내는 도면이다.
[도 12] 도 12는, 트라스투주맙의 트립신 소화물에 대하여, 라이신 잔기로의 수식(요오도아세트아미드에 의한 Carbamidomethyl화를 받은 티올 도입체(+145.019Da)를 포함하는 펩타이드 프래그먼트를 BioPharma Finder를 사용해서 검색한 결과를 나타내는 도면이다. 가로축은 동정된 라이신 잔기를 나타내고, 세로축은 Intensity를 나타낸다.
[도 13] 도 13은, 트라스투주맙의 트립신 소화에 의한 라이신 잔기로의 수식 부위(요오도아세트아미드에 의한 Carbamidomethyl화를 받은 티올 도입체(+145.019Da)를 포함하는 아미노산 18잔기로 이루어진 펩타이드, FNWYVDGVEVHNAKTKPR(서열번호 3)의 펩타이드 프래그먼트의 MS 스펙트럼(실측값: m/z 769.04506, 이론값: 769.04482, 3가)를 나타내는 도면이다.
[도 14] 도 14는, EU numbering에서의 인간 IgG 중쇄의 288/290위치의 라이신 잔기의 수식을 나타내는, 2가 y16에 상당하는 m/z 1022.71(이론값: 1022.51)의 프로덕트 이온의 CID 스펙트럼을 나타내는 도면이다.
[도 15] 도 15는, 트라스투주맙의 트립신 소화물에 대하여, 라이신 잔기로의 수식(요오도아세트아미드에 의한 Carbamidomethyl화를 받은 티올 도입체(+145.019Da)를 포함하는 펩타이드 프래그먼트를 BioPharma Finder를 사용해서 검색한 결과를 나타내는 도면이다. 가로축은 동정된 라이신 잔기를 나타내고, 세로축은 Intensity를 나타낸다.
1. 일반적인 용어의 정의
(항체 및 이에 관련된 용어)
본 발명에 있어서, 용어 「항체」는 이하와 같다. 또한, 용어 「면역 글로불린 단위」는, 상기 항체의 기본 구성 요소인 2가 단량체 단위에 대응하는 것이고, 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하는 단위이다. 따라서, 면역 글로불린 단위에 대하여, 이의 유래, 종류(폴리클로널 또는 모노클로널, 아이소타입 및 전장 항체 또는 항체 단편), 항원, 라이신 잔기의 위치 및 위치 선택성의 정의, 예 및 바람직한 예는 이하에 설명하는 항체의 것과 동일하다.
항체의 유래는, 특별히 한정되지 않고, 예를 들면, 포유 동물, 조류(예, 닭)등의 동물에서 유래하는 것이라도 좋다. 바람직하게는, 면역 글로불린 단위는, 포유 동물에서 유래한다. 이러한 포유 동물로서는, 예를 들면, 영장류(예, 인간, 원숭이, 침팬지), 설치류(예, 마우스, 래트, 모르모트, 햄스터, 토끼), 애완 동물(예, 개, 고양이), 가축(예, 소, 돼지, 염소), 사역 동물(예, 말, 양)을 들 수 있고, 바람직하게는 영장류 또는 설치류이고, 보다 바람직하게는 인간이다.
항체의 종류는 폴리클로널 항체 또는 모노클로널 항체라도 좋다. 항체는 또한, 2가 항체(예, IgG, IgD, IgE) 또는 4가 이상의 항체(예, IgA 항체, IgM 항체)라도 좋다. 바람직하게는, 항체는 모노클로널 항체이다. 모노클로널 항체로서는, 예를 들면, 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 소정의 당쇄가 부가된 항체(예, N형 당쇄 결합 컨센서스 서열 등의 당쇄 결합 컨센서스 서열을 갖도록 개변된 항체), 2중 특이성 항체, Fc 영역 단백질, Fc 융합 단백질을 들 수 있다. 모노클로널 항체의 아이소타입으로서는, 예를 들면, IgG(예, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA, IgD, IgE 및 IgY를 들 수 있다. 본 발명에서는, 모노클로널 항체로서, 전장 항체 또는 가변 영역 및 항체 단편(예, CH1 도메인 및 CH2 도메인을 포함하는 항체 단편 및 정상 영역을 포함하지 않는 항체 단편)을 사용할 수 있지만, 전장 항체가 바람직하다. 항체는, 바람직하게는 인간 IgG 모노클로널 항체이고, 보다 바람직하게는 인간 IgG 전장 모노클로널 항체이다.
항체의 항원으로서는, 임의의 항원을 사용할 수 있다. 예를 들면, 이러한 항원으로서는, 단백질(올리고펩타이드, 폴리펩타이드를 포함한다. 당 등의 생체 분자로 수식된 단백질(예, 당 단백질)이라도 좋다], 당쇄, 핵산, 저분자 화합물을 들 수 있다. 바람직하게는, 항체는, 단백질을 항원으로 하는 항체라도 좋다. 단백질로서는, 예를 들면, 세포막 수용체, 세포막 수용체 이외의 세포막 단백질(예, 세포외 기질 단백질), 리간드, 가용성 수용체를 들 수 있다.
보다 구체적으로는, 항체의 항원인 단백질은 질환 표적 단백질이라도 좋다. 질환 표적 단백질로서는, 예를 들면, 이하를 들 수 있다.
(1) 암 영역
PD-L1, GD2, PDGFRα(혈소판 유래 성장 인자 수용체), CD22, HER2, 포스파티딜세린(PS), EpCAM, 피브로넥틴, PD-1, VEGFR-2, CD33, HGF, gpNMB, CD27, DEC-205, 엽산 수용체, CD37, CD19, Trop2, CEACAM5, S1P, HER3, IGF-1R, DLL4, TNT-1/B, CPAAs, PSMA, CD20, CD105(엔도글린), ICAM-1, CD30, CD16A, CD38, MUC1, EGFR, KIR2DL1,2, NKG2A, tenascin-C, IGF(Insulin-like growth factor), CTLA-4, mesothelin, CD138, c-Met, Ang2, VEGF-A, CD79b, ENPD3, 엽산 수용체 α, TEM-1, GM2, 글리피칸 3, macrophage inhibitory factor, CD74, Notch1, Notch2, Notch3, CD37, TLR-2, CD3, CSF-1R, FGFR2b, HLA-DR, GM-CSF, EphA3, B7-H3, CD123, gpA33, Frizzled7 수용체, DLL4, VEGF, RSPO, LIV-1, SLITRK6, Nectin-4, CD70, CD40, CD19, SEMA4D(CD100), CD25, MET, Tissue Factor, IL-8, EGFR, cMet, KIR3DL2, Bst1(CD157), P-카드헤린, CEA, GITR, TAM(tumor associated macrophage), CEA, DLL4, Ang2, CD73, FGFR2, CXCR4, LAG-3, GITR, Fucosyl GM1, IGF-1, Angiopoietin 2, CSF-1R, FGFR3, OX40, BCMA, ErbB3, CD137(4-1BB), PTK7, EFNA4, FAP, DR5, CEA, Ly6E, CA6, CEACAM5, LAMP1, tissue factor, EPHA2, DR5, B7-H3, FGFR4, FGFR2, α2-PI, A33, GDF15, CAIX, CD166, ROR1, GITR, BCMA, TBA, LAG-3, EphA2, TIM-3, CD-200, EGFRvIII, CD16A, CD32B, PIGF, Axl, MICA/B, Thomsen-Friedenreich, CD39, CD37, CD73, CLEC12A, Lgr3, 트랜스페린 수용체, TGFβ, IL-17, 5T4, RTK, Immune Suppressor Protein, NaPi2b, 루이스 혈액형 B항원, A34, Lysil-Oxidase, DLK-1, TROP-2, α9인테그린, TAG-72(CA72-4), CD70
(2) 자가 면역 질환·염증성 질환
IL-17, IL-6R, IL-17R, INF-α, IL-5R, IL-13, IL-23, IL-6, ActRIIB, β7-Integrin, IL-4αR, HAS, Eotaxin-1, CD3, CD19, TNF-α, IL-15, CD3ε, Fibronectin, IL-1β, IL-1α, IL-17, TSLP(Thymic Stromal Lymphopoietin), LAMP(Alpha4 Beta 7 Integrin), IL-23, GM-CSFR, TSLP, CD28, CD40, TLR-3, BAFF-R, MAdCAM, IL-31R, IL-33, CD74, CD32B, CD79B, IgE(면역 글로불린 E), IL-17A, IL-17F, C5, FcRn, CD28, TLR4, MCAM, B7RP1, CXCR1,2 Ligands, IL-21, Cadherin-11, CX3CL1, CCL20, IL-36R, IL-10R, CD86, TNF-α, IL-7R, Kv1.3, α9인테그린, LIFHT
(3) 뇌신경 질환
CGRP, CD20, β아밀로이드, β아밀로이드 프로토피브린, Calcitonin Gene-Related Peptide Receptor, LINGO(Ig Domain Containing1), α시누클레인, 세포외 tau, CD52, 인슐린 수용체, tau 단백, TDP-43, SOD1, TauC3, JC 바이러스
(4) 감염증
Clostridium Difficile toxin B, 사이토메갈로바이러스, RS바이러스, LPS, S.Aureus Alpha-toxin, M2e 단백질, Psl, PcrV, S.Aureus toxin, 인플루엔자 A, Alginate, 황색 포도구균, PD-L1, 인플루엔자 B, 아시네토박터, F-protein, Env, CD3, 병원성 대장균, 클레브시엘라, 폐렴구균
(5) 유전성·희소 질환
아밀로이드 AL, SEMA4D(CD100), 인슐린 수용체, ANGPTL3, IL4, IL13, FGF23, 부신 피질 자극 호르몬, 트랜스타이레틴, 헌팅틴
(6) 안질환
Factor D, IGF-1R, PGDFR, Ang2, VEGF-A, CD-105(Endoglin), IGF-1R, β아밀로이드
(7) 골·정형외과 영역
Sclerostin, Myostatin, Dickkopf-1, GDF8, RNAKL, HAS, Siglec-15
(8) 혈액 질환
vWF, Factor IXa, Factor X, IFNγ, C5, BMP-6, Ferroportin, TFPI
(9) 기타 질환
BAFF(B cell activating factor), IL-1β, PCSK9, NGF, CD45, TLR-2, GLP-1, TNFR1, C5, CD40, LPA, 프로락틴 수용체, VEGFR-1, CB1, Endoglin, PTH1R, CXCL1, CXCL8, IL-1β, AT2-R, IAPP
모노클로널 항체의 구체예로서는, 특정 키메라 항체(예, 리툭시맙, 바실릭시맙, 인플릭시맙, 세툭시맙, 실툭시맙, 디누툭시맙, 오르타톡사시맙), 특정 인간화 항체(예, 다클리주맙, 팔리비주맙, 트라스투주맙, 알렘투주맙, 오말리주맙, 에팔리주맙, 베바시주맙, 나탈리주맙(IgG4), 토실리주맙, 에쿨리주맙(IgG2), 모가물리주맙, 페르투주맙, 오비누투주맙, 베돌리주맙, 펨브롤리주맙(IgG4), 메폴리주맙, 엘로투주맙, 다라투무맙, 익세키주맙(IgG4), 레슬리주맙(IgG4), 아테졸리주맙), 특정 인간 항체(예, 아달리무맙(IgG1), 파니투무맙, 골리무맙, 우스테키누맙, 카나키누맙, 오파투무맙, 데노수맙(IgG2), 이필리무맙, 벨리무맙, 락시바쿠맙, 라무시루맙, 니볼루맙, 듀필루맙(IgG4), 세쿠키누맙, 에볼로쿠맙(IgG2), 알릴로쿠맙, 네시투무맙, 브로달루맙(IgG2), 올랄라투맙)을 들 수 있다(IgG 서브 타입으로 언급하고 있지 않은 경우, IgG1임을 나타낸다).
항체 중의 아미노산 잔기의 위치 및 중쇄의 정상 영역의 위치(예, CH2 도메인)에 대해서는 EU numbering에 따른다(http://www.imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/Hu_IGHGnber.html을 참조). 예를 들면, 인간 IgG를 대상으로 하는 경우, 246위치의 라이신 잔기는, 인간 IgG CH2 영역의 16번째의 아미노산 잔기에 상당하고, 248위치의 라이신 잔기는, 인간 IgG CH2 영역의 18번째의 아미노산 잔기에 상당하고, 288위치의 라이신 잔기는, 인간 IgG CH2 영역의 58번째의 아미노산 잔기에 상당하고, 290위치의 라이신 잔기는, 인간 IgG CH2 영역의 60번째의 아미노산 잔기에 상당하고, 317위치의 라이신 잔기는, 인간 IgG CH2 영역의 87번째의 아미노산 잔기에 상당한다. 246/248위치의 표기는, 246위치 또는 248위치의 라이신 잔기가 대상임을 나타낸다. 288/290위치의 표기는, 288위치 또는 290위치의 라이신 잔기가 대상임을 나타낸다.
(할로겐 원자)
할로겐 원자로서는, 예를 들면, 블소 원자, 염소 원자, 브롬 원자, 요오드 원자를 들 수 있다.
(1가 탄화수소기 및 이에 관련되는 용어)
1가 탄화수소기로서는, 예를 들면, 1가 쇄상 탄화수소기, 1가 지환식 탄화수소기 및 1가 방향족 탄화수소기를 들 수 있다.
1가 쇄상 탄화수소기란, 연쇄 구조만으로 구성된 탄화수소기를 의미하고, 주쇄에 환상 구조를 포함하지 않는다. 단, 연쇄 구조는 직쇄상이라도 분기상이라도 좋다. 1가 쇄상 탄화수소기로서는, 예를 들면, 알킬, 알케닐, 알키닐을 들 수 있다. 알킬, 알케닐 및 알키닐은, 직쇄상 또는 분기상 중 어느 것이라도 좋다.
알킬로서는, 탄소 원자수 1 내지 12의 알킬이 바람직하고, 탄소 원자수 1 내지 6의 알킬이 보다 바람직하고, 탄소 원자수 1 내지 4의 알킬이 더욱 바람직하다. 알킬이 치환기를 갖는 경우, 상기 탄소 원자수에 치환기의 탄소 원자수는 포함되지 않는다. 탄소 원자수 1 내지 12의 알킬로서는, 예를 들면, 메틸, 에틸, n-프로필, i-프로필, n-부틸, s-부틸, 이소부틸, t-부틸, 펜틸, 헥실, 헵틸, 옥틸, 노닐, 데실, 도데실을 들 수 있다.
알케닐로서는, 탄소 원자수 2 내지 12의 알케닐이 바람직하고, 탄소 원자수 2 내지 6의 알케닐이 보다 바람직하고, 탄소 원자수 2 내지 4의 알케닐이 더욱 바람직하다. 알케닐이 치환기를 갖는 경우, 상기 탄소 원자수에 치환기의 탄소 원자수는 포함되지 않는다. 탄소 원자수 2 내지 12의 알케닐로서는, 예를 들면, 비닐, 프로페닐, n-브테닐을 들 수 있다.
알키닐로서는, 탄소 원자수 2 내지 12의 알키닐이 바람직하고, 탄소 원자수 2 내지 6의 알키닐이 보다 바람직하고, 탄소 원자수 2 내지 4의 알키닐이 더욱 바람직하다. 알키닐이 치환기를 갖는 경우, 상기 탄소 원자수에 치환기의 탄소 원자수는 포함되지 않는다. 탄소 원자수 2 내지 12의 알키닐로서는, 예를 들면, 에티닐, 프로피닐, n-부티닐을 들 수 있다.
1가 쇄상 탄화 수소기로서는 알킬이 바람직하다.
1가 지환식 탄화수소기란, 환 구조로서 지환식 탄화수소만을 포함하고, 방향족환을 포함하지 않는 탄화수소기를 의미하고, 지방식 탄화수소는 단환, 다환 중 어느 것이라도 좋다. 단, 지환식 탄화수소만으로 구성되어 있을 필요는 없고, 이의 일부에 쇄상 구조를 포함하고 있어도 좋다. 1가 지환식 탄화수소기로서는, 예를 들면, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 사이클로알키닐을 들 수 있고, 이들은 단환, 다환 중 어느 것이라도 좋다.
사이클로알킬로서는, 탄소 원자수 3 내지 12의 사이클로알킬이 바람직하고, 탄소 원자수 3 내지 6의 사이클로알킬이 보다 바람직하고, 탄소 원자수 5 내지 6의 사이클로알킬이 더욱 바람직하다. 사이클로알킬이 치환기를 갖는 경우, 상기 탄소 원자수에 치환기의 탄소 원자수는 포함되지 않는다. 탄소 원자수 3 내지 12의 사이클로알킬로서는, 예를 들면, 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실을 들 수 있다.
사이클로알케닐로서는, 탄소 원자수 3 내지 12의 사이클로알케닐이 바람직하고, 탄소 원자수 3 내지 6의 사이클로알케닐이 보다 바람직하고, 탄소 원자수 5 내지 6의 사이클로알케닐이 더욱 바람직하다. 사이클로알케닐이 치환기를 갖는 경우, 상기 탄소 원자수에 치환기의 탄소 원자수는 포함되지 않는다. 탄소 원자수 3 내지 12의 사이클로알케닐로서는, 예를 들면, 사이클로프로페닐, 사이클로부테닐, 사이클로펜테닐, 사이클로헥세닐을 들 수 있다.
사이클로알키닐로서는, 탄소 원자수 3 내지 12의 사이클로알키닐이 바람직하고, 탄소 원자수 3 내지 6의 사이클로알키닐이 보다 바람직하고, 탄소 원자수 5 내지 6의 사이클로알키닐이 더욱 바람직하다. 사이클로알키닐이 치환기를 갖는 경우, 상기 탄소 원자수에 치환기의 탄소 원자수는 포함되지 않는다. 탄소 원자수 3 내지 12의 사이클로알키닐로서는, 예를 들면, 사이클로프로피닐, 사이클로부티닐, 사이클로펜티닐, 사이클로헥시닐을 들 수 있다.
1가 지환식 탄화수소기로서는 사이클로알킬이 바람직하다.
1가 방향족 탄화수소기란, 방향족환 구조를 포함하는 탄화수소기를 의미한다. 단, 방향족환만으로 구성되어 있을 필요는 없고, 이의 일부에 쇄상 구조나 지환식 탄화수소를 포함하도 있어도 좋고, 방향족환은 단환, 다환 중 어느 것이라도 좋고, 1가 방향족 탄화수소기로서는, 탄소 원자수 6 내지 12의 아릴이 바람직하고, 탄소 원자수 6 내지 10의 아릴이 보다 바람직하고, 탄소 원자수 6의 아릴이 더욱 바람직하다. 1가 방향족 탄화 수소기가 치환기를 갖는 경우, 상기 탄소 원자수에 치환기의 탄소 원자수는 포함되지 않는다. 탄소 원자수 6 내지 12의 아릴로서는, 예를 들면, 페닐, 나프틸을 들 수 있다.
1가 방향족 탄화수소기로서는 페닐이 바람직하다.
이들 중에서도, 1가 탄화수소기로서는, 알킬, 사이클로알킬, 아릴이 바람직하다.
(1가 복소환기 및 이에 관련되는 용어)
1가 복소환기란, 복소환식 화합물의 복소환으로부터 수소 원자 1개를 제외한 기를 말한다. 1가 복소환기는, 1가 방향족 복소환기 또는 1가 비방향족 복소환기이다. 복소환기를 구성하는 헤테로 원자로서, 산소 원자, 황 원자, 질소 원자, 인 원자, 붕소 원자 및 규소 원자로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1종 이상을 포함하는 것이 바람직하고, 산소 원자, 황 원자 및 질소 원자로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1종 이상을 포함하는 것이 보다 바람직하다.
1가 방향족 복소환기로서는, 탄소 원자수 1 내지 15의 방향족 복소환기가 바람직하고, 탄소 원자수 1 내지 9의 방향족 복소환기가 보다 바람직하고, 탄소 원자수 1 내지 6의 방향족 복소환기가 더욱 바람직하다. 1가 방향족 복소환기가 치환기를 갖는 경우, 상기 탄소 원자수에 치환기의 탄소 원자수는 포함되지 않는다. 1가 방향족 복소환기로서는, 예를 들면, 피롤릴, 푸라닐, 티오페닐, 피리디닐, 피리다지닐, 피리미디닐, 피라지닐, 트리아지닐, 피라졸릴, 이미다졸릴, 티아졸릴, 이소티아졸릴, 옥사졸릴, 이소옥사졸릴, 트리아졸릴, 테트라졸릴, 인돌릴, 푸리닐, 안트라퀴놀릴, 카바조닐, 플루오레닐, 퀴놀리닐, 이소퀴놀리닐, 퀴나졸리닐 및 프탈라지닐을 들 수 있다.
1가 비방향족 복소환기로서는, 탄소 원자수 2 내지 15의 비방향족 복소환기가 바람직하고, 탄소 원자수 2 내지 9의 비방향족 복소환기가 보다 바람직하고, 탄소 원자수 2 내지 6의 비방향족 복소환기가 더욱 바람직하다. 1가 비방향족 복소환기가 치환기를 갖는 경우, 상기 탄소 원자수에 치환기의 탄소 원자수는 포함되지 않는다. 1가 비방향족 복소환기로서는, 예를 들면, 옥시라닐, 아지리디닐, 아제티디닐, 옥세타닐, 티에타닐, 피롤리디닐, 디하이드로푸라닐, 테트라하이드로푸라닐, 디옥솔라닐, 테트라하이드로티오페닐, 피롤리닐, 이미다졸리디닐, 옥사졸리디닐, 피페리디닐, 디하이드로피라닐, 테트라하이드로피라닐, 테트라하이드로티오피라닐, 모르폴리닐, 티오모르폴리닐, 피페라지닐, 디하이드로옥사지닐, 테트라하이드로옥사지닐, 디하이드로피리미디닐 및 테트라하이드로피리미디닐을 들 수 있다.
이들 중에서도 1가 복소환기로서는, 5원 또는 6원 복소환기가 바람직하다.
(2가 기)
2가 기는, 2가 직쇄 탄화수소기, 2가 환상 탄화수소기, 2가 복소환기, -C(=O)-, -C(=S)-, -NR2-, -C(=O)-NR2-, -NR2-C(=O)-, -C(=S)-NR2-, -NR2-C(=S)-, -O-, -S-, -(O-R3)m- 및 -(S-R3)m-으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1개의 기 또는 이들 중 2개 이상(예를 들면, 2 내지 10개, 바람직하게는 2 내지 8개, 보다 바람직하게는 2 내지 6개, 보다 더 바람직하게는 2 내지 5개, 특히 바람직하게는 2 또는 3개)의 기를 포함하는 주쇄 구조를 갖는 기이다. R2는, 수소 원자 또는 후술하는 치환기를 나타낸다. R3은 2가 직쇄 탄화수소기, 2가 환상 탄화수소기 또는 2가 복소환기를 나타낸다. m은 1 내지 10의 정수이고, 바람직하게는 1 내지 8의 정수이고, 보다 바람직하게는 1 내지 6의 정수이며, 보다 더 바람직하게는 1 내지 5의 정수이고, 특히 바람직하게는 1 내지 3의 정수이다.
2가 직쇄 탄화수소기는, 직쇄 알킬렌, 직쇄 알케닐렌 또는 직쇄 알키닐렌이다.
직쇄 알킬렌은, 탄소 원자수 1 내지 6의 직쇄 알킬렌이고, 탄소 원자수 1 내지 4의 직쇄 알킬렌이 바람직하다. 직쇄 알킬렌으로서는, 예를 들면, 메틸렌, 에틸렌, n-프로필렌, n-부틸렌, n-펜틸렌, n-헥실렌을 들 수 있다.
직쇄 알케닐렌은, 탄소 원자 2 내지 6의 직쇄 알케닐렌이고, 탄소 원자수 2 내지 4의 직쇄 알케닐렌이 바람직하다. 직쇄 알케닐렌으로서는, 예를 들면, 에틸레닐렌, n-프로피닐렌, n-부테닐렌, n-펜테닐렌, n-헥세닐렌을 들 수 있다.
직쇄 알키닐렌은, 탄소 원자수 2 내지 6의 직쇄 알키닐렌이고, 탄소 원자수 2 내지 4의 직쇄 알키닐렌이 바람직하다. 직쇄 알키닐렌으로서는, 예를 들면, 에티닐렌, n-프로피닐렌, n-부티닐렌, n-펜티닐렌, n-헥시닐렌을 들 수 있다.
2가 직쇄 탄화수소기로서는 직쇄 알킬렌이 바람직하다.
2가 환상 탄화수소기는, 아릴렌 또는 2가 비방향족 환상 탄화수소기이다.
아릴렌으로서는, 탄소 원자수 6 내지 14의 아릴렌이 바람직하고, 탄소 원자수 6 내지 10의 아릴렌이 보다 바람직하고, 탄소 원자수 6의 아릴렌이 특히 바람직하다. 아릴렌으로서는, 예를 들면, 페닐렌, 나프틸렌, 안트라세닐렌을 들 수 있다.
2가 비방향족 환상 탄화수소기로서는, 탄소 원자수 3 내지 12의 단환식 또는 다환식인 2가 비방향족 환상 탄화수소기가 바람직하고, 탄소 원자수 4 내지 10의 단환식 또는 다환식인 2가 비방향족 환상 탄화수소기가 보다 바람직하고, 탄소 원자수 5 내지 8의 단환식인 2가 비방향족 환상 탄화수소기가 특히 바람직하다. 2가 비방향족 환상 탄화수소기로서는, 예를 들면, 사이클로프로필렌, 사이클로부틸렌, 사이클로펜틸렌, 사이클로헥실렌, 사이클로헵틸렌, 사이클로옥틸렌을 들 수 있다.
2가 환상 탄화수소기로서는 아릴렌이 바람직하다.
2가 복소환기는, 2가 방향족 복소환기 또는 2가 비방향족 복소환기이다. 복소환을 구성하는 헤테로 원자로서, 산소 원자, 황 원자, 질소 원자, 인 원자, 붕소 원자 및 규소 원자로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1종 이상을 포함하는 것이 바람직하고, 산소 원자, 황 원자 및 질소 원자로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1종 이상을 포함하는 것이 보다 바람직하다.
2가 방향족 복소환기로서는, 탄소 원자수 3 내지 15의 2가 방향족 복소환기가 바람직하고, 탄소 원자수 3 내지 9의 2가 방향족 복소환기가 보다 바람직하고, 탄소 원자수 3 내지 6의 2가 방향족 복소환기가 특히 바람직하다. 2가 방향족 복소환기로서는, 예를 들면, 피롤디일, 푸란디일, 티오펜디일, 피리딘디일, 피리다진디일, 피리미딘디일, 피라진디일, 트리아진디일, 피라졸디일, 이미다졸디일, 티아졸디일, 이소티아졸디일, 옥사졸디일, 이소옥사졸디일, 트리아졸디일, 테트라졸디일, 인돌디일, 푸린디일, 안트라퀴논디일, 카바졸디일, 플루오렌디일, 퀴놀린디일, 이소퀴놀린디일, 퀴나졸린디일 및 프탈라진디일을 들 수 있다.
2가 비방향족 복소환기로서는, 탄소 원자수 3 내지 15의 비방향족 복소환기가 바람직하고, 탄소 원자수 3 내지 9의 비방향족 복소환기가 보다 바람직하고, 탄소 원자수 3 내지 6의 비방향족 복소환기가 특히 바람직하다. 2가 비방향족 복소환기로서는, 예를 들면, 피롤디온디일, 피롤린디온디일, 옥실란디일, 아지리딘디일, 아제티딘디일, 옥세탄디일, 티에탄디일, 피롤리딘디일, 디하이드로푸란디일, 테트라하이드로푸란디일, 디옥솔란디일, 테트라하이드로티오펜디일, 피롤린디일, 이미다졸리딘디일, 옥사졸리딘디일, 피페리딘디일, 디하이드로피란디일, 테트라하이드로피란디일, 테트라하이드로티오피란디일, 모르폴린디일, 티오모르폴린디일, 피페라진디일, 디하이드로옥사진디일, 테트라하이드로옥사진디일, 디하이드로피리미딘디일 및 테트라하이드로피리미딘디일을 들 수 있다.
2가 복소환기로서는 2가 방향족 복소환기가 바람직하다.
바람직하게는, 2가 기는, 알킬렌, 아릴렌, -C(=O)-, -NR2-, -C(=O)-NR2-, -NR2-C(=O)-, -O- 및 -(O-R3)m-으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1개의 기를 포함하는 주쇄 구조를 갖는 2가 기이거나, 또는
알킬렌, 아릴렌, -C(=O)-, -NR2-, -C(=O)-NR2-, -NR2-C(=O)-, -O- 및-(O-R3)m-으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 2개 이상의 기를 포함하는 주쇄 구조를 갖는 2가 기이고,
R2가 수소 원자 또는 알킬이고,
R3이 알킬렌 또는 아릴렌이고,
m이 1 내지 5의 정수(즉, 1, 2, 3, 4 또는 5)라도 좋다.
알킬렌, 아릴렌, 알킬은 상기한 것과 동일하다.
2가 기에서의 주쇄 구조는, 1개 이상(예를 들면, 1 내지 10개, 바람직하게는 1 내지 8개, 보다 바람직하게는 1 내지 6개, 보다 더 바람직하게는 1 내지 5개, 특히 바람직하게는 1 내지 3개)의 후술하는 치환기에 의해 치환되어 있어도 좋다.
(치환기)
치환기로서는, 이하를 들 수 있다:
(i) 할로겐 원자;
(ii) 1가 탄화수소기;
(iii) 1가 복소환기;
(iv) 아르알킬;
(v) Ra-O-, Ra-C(=O)-, Ra-O-C(=O)- 또는 Ra-C(=O)-O-(Ra는 수소 원자 또는 1가 탄화수소기를 나타낸다) 또는
(vi) NRbRc-, NRbRc-C(=O)-, NRbRc-C(=O)-O- 또는 Rb-C(=O)-NRc-(Rb 및 Rc는 동일하거나 상이하고, 수소 원자 또는 1가 탄화수소기를 나타낸다);
(vii) 니트로기, 황산기, 설폰산기, 시아노기 및 카복실기.
상기 치환기에서의 할로겐 원자, 1가 탄화수소기 및 1가 복소환기의 정의, 예 및 바람직한 예는 각각 상기한 것과 동일하다.
아르알킬이란 아릴알킬을 말한다. 아릴알킬에서의 아릴 및 알킬의 정의, 예 및 바람직한 예는 상기한 바와 같다. 아르알킬로서는, 탄소 원자수 3 내지 15의 아르알킬이 바람직하다. 이러한 아르알킬로서는, 예를 들면, 벤조일, 페네틸, 나프틸메틸, 나프틸에틸을 들 수 있다.
바람직하게는, 치환기는 이하라도 좋다:
(i) 할로겐 원자;
(ii) 탄소 원자수 1 내지 12의 알킬, 페닐 또는 나프틸;
(iii) 탄소 원자수 3 내지 15의 아르알킬;
(iv) 5원 또는 6원 복소환;
(v) Ra-O-, Ra-C(=O)-, Ra-O-C(=O)- 또는 Ra-C(=O)-O-(Ra는 수소 원자 또는 탄소 원자수 1 내지 12의 알킬을 나타낸다);
(vi) NRbRc-, NRbRc-C(=O)-, NRbRc-C(=O)-O- 또는 Rb-C(=O)-NRc-(Rb 및 Rc는 동일하거나 상이하고, 수소 원자 또는 탄소 원자수 1 내지 12의 알킬을 나타낸다) 또는
(vii) 상기 (vii)에서 열거한 것과 동일한 기.
보다 더 바람직하게는, 치환기는 이하라도 좋다:
(i) 할로겐 원자;
(ii) 탄소 원자수 1 내지 12의 알킬;
(iii) Ra-O-, Ra-C(=O)-, Ra-O-C(=O)- 또는 Ra-C(=O)-O-(Ra는 수소 원자 또는 탄소 원자수 1 내지 12의 알킬을 나타낸다);
(iv) NRbRc-, NRbRc-C(=O)-, NRbRc-C(=O)-O- 또는 Rb-C(=O)-NRc-(Rb 및 Rc는 동일하거나 상이하고, 수소 원자 또는 탄소 원자수 1 내지 12의 알킬을 나타낸다) 또는
(v) 상기 (vii)에서 열거한 것과 동일한 기.
보다 더 바람직하게는, 치환기는 이하라도 좋다:
(i) 할로겐 원자;
(ii) 탄소 원자수 1 내지 6의 알킬;
(iii) Ra-O-, Ra-C(=O)-, Ra-O-C(=O)- 또는 Ra-C(=O)-O-(Ra는 수소 원자 또는 탄소 원자수 1 내지 6의 알킬을 나타낸다);
(iv) NRbRc-, NRbRc-C(=O)-, NRbRc-C(=O)-O- 또는 Rb-C(=O)-NRc-(Rb 및 Rc는 동일하거나 상이하고, 수소 원자 또는 탄소 원자수 1 내지 6의 알킬을 나타낸다) 또는
(v) 상기 (vii)에서 열거한 것과 동일한 기.
특히 바람직하게는, 치환기는 이하라도 좋다:
(i) 할로겐 원자;
(ii) 탄소 원자수 1 내지 4의 알킬;
(iii) Ra-O-, Ra-C(=O)-, Ra-O-C(=O)- 또는 Ra-C(=O)-O-(Ra는 수소 원자 또는 탄소 원자수 1 내지 4의 알킬을 나타낸다);
(iv) NRbRc-, NRbRc-C(=O)-, NRbRc-C(=O)-O- 또는 Rb-C(=O)-NRc-(Rb 및 Rc는 동일하거나 상이하고, 수소 원자 또는 탄소 원자수 1 내지 4의 알킬을 나타낸다) 또는
(v) 상기 (vii)에서 열거한 것과 동일한 기.
(생체 직교성 관능기)
생체 직교성 관능기는, 생체 구성 성분(예, 아미노산, 단백질, 핵산, 지질, 당, 인산)과는 반응하지 않거나 또는 생체 구성 성분에 대한 반응의 속도가 느리지만, 생체 구성 성분 이외의 성분에 대하여 선택적으로 반응하는 기를 말한다. 생체 직교성 관능기는, 해당 기술 분야에서 주지이다(예, Sharpless K. B. et al., Angew. Chem. Int. Ed. 40, 2004(2015); Bertozzi C. R. et al., Science 291, 2357(2001); Bertozzi C. R. et al., Nature Chemical Biology 1, 13(2005)을 참조).
본 발명에서는, 생체 직교성 관능기로서, 단백질에 대한 생체 직교성 관능기가 사용된다. 본 발명의 시약에 의해 유도체화되어야 하는 티올기 도입 항체는 단백질이기 때문이다. 단백질에 대한 생체 직교성 관능기는, 단백질을 구성하는 천연의 20종의 아미노산 잔기의 측쇄와 반응하지 않거나 또는 상기 측쇄에 대한 반응의 속도가 느리지만, 목적하는 관능기와 반응하는 기이다. 단백질을 구성하는 천연의 20종의 아미노산은, 알라닌(A), 아스파라긴(N), 시스테인(C), 글루타민(Q), 글리신(G), 이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 페닐알라닌(F), 프롤린(P), 세린(S), 스레오닌(T), 트립토판(W), 티로신(Y), 발린(V), 아스파라긴산(D), 글루타민산(E), 아르기닌(R), 히스티딘(H) 및 라이신(L)이다. 이들 천연의 20종의 아미노산 중 측쇄가 없는(즉, 수소 원자인) 글리신 및 측쇄가 탄화수소기인(즉, 황 원자, 질소 원자 및 산소 원자로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 헤테로 원자를 측쇄에 포함하지 않는) 알라닌, 이소류신, 류신, 페닐알라닌 및 발린은, 통상의 반응에 대하여 불활성이다. 따라서, 단백질에 대한 생체 직교성 관능기는, 통상의 반응에 대하여 불활성인 측쇄를 갖는 이들 아미노산의 측쇄에 더하여, 아스파라긴, 글루타민, 메티오닌, 프롤린, 세린, 스레오닌, 트립토판, 티로신, 아스파라긴산, 글루타민산, 아르기닌, 히스티딘 및 라이신의 측쇄에 대하여 반응하지 않거나 또는 반응의 속도가 느리지만, 목적하는 관능기와 반응하는 기이다.
이러한 생체 직교성 관능기로서는, 예를 들면, 아지드 잔기, 알데하이드 잔기, 티올 잔기, 알켄 잔기(바꿔 말하면, 탄소 원자 사이 이중 결합을 갖는 최소 단위인 비닐렌(에테닐렌) 부분을 갖고 있으면 좋다. 이하 동일), 알킨 잔기(바꿔 말하면, 탄소 원자 사이 삼중 결합을 갖는 최소 단위인 에티닐렌 부분을 갖고 있으면 좋다. 이하 동일), 할로겐 잔기, 테트라진 잔기, 니트론 잔기, 하이드록실아민 잔기, 니트릴 잔기, 하이드라진 잔기, 케톤 잔기, 보론산 잔기, 시아노벤조티아졸 잔기, 알릴 잔기, 포스핀 잔기, 말레이미드 잔기, 디설파이드 잔기, 티오에스테르 잔기, α- 할로카보닐 잔기(예, α위치에 불소 원자, 염소 원자, 브롬 원자 또는 요오드 원자를 갖는 카보닐 잔기. 이하 동일), 이소니트릴 잔기, 시드논 잔기, 셀렌 잔기를 들 수 있다.
보다 구체적으로는, 생체 직교성 관능기는, 하기로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나의 화학 구조에 대응하고 있어도 좋다.
[여기서,
R1a, 단일 또는 복수의 R1b 및 단일 또는 복수의 R1c는 동일하거나 상이하고, 상기 치환기 또는 전자 흡인기이고,
·는 결합손이다]
전자 흡인기로서는, 예를 들면, 할로겐 원자, 할로겐 원자로 치환된 알킬(예, 트리플루오로메틸), 보론산 잔기, 메실, 토실, 트리플레이트, 니트로, 시아노, 페닐기, 케토기(예, 아실)를 들 수 있고, 할로겐 원자, 보론산 잔기, 메실, 토실, 트리플레이트가 바람직하다.
바람직하게는, 생체 직교성 관능기는, 알킨 잔기 또는 아지드라도 좋다. 알킨 잔기는, 보다 바람직하게는, 상기한 바와 같은 치환기로 치환되어 있어도 좋은, 탄소 원자 사이 3중 결합을 갖는 환기라도 좋다.
생체 직교성 관능기는 보호되어 있어도 좋다. 보호되어 있어도 좋은 생체 직교성 관능기란, 미보호된 생체 직교성 관능기 또는 보호된 생체 직교성 관능기를 말한다. 미보호된 생체 직교성 관능기는 상기 생체 직교성 관능기에 해당한다. 보호된 생체 직교성 관능기는, 보호기의 절단에 의해 생체 직교성 관능기를 생성하는 기이다. 보호기의 절단은, 단백질의 변성·분해(예, 아미드 결합의 절단)를 일으킬 수 없는 조건(온화한 조건) 하에서의 특정 처리에 의해 행할 수 있다. 이러한 특정 처리로서는, 예를 들면, (a) 산성 물질, 염기성 물질, 환원제, 산화제, 효소로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1종 이상의 물질에 의한 처리, (b) 광으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 물리 화학적 자극에 의한 처리 또는 (c) 자기 분해성 절단성 부분을 포함하는 절단성 링커를 사용한 경우의 방치를 들 수 있다. 이러한 보호기 및 이의 절단 조건은, 상기 분야에서의 기술 상식이다(예, G. Leriche, L. Chisholm, A. Wagner, Bioorganic & Medicinal Chemistry. 20, 571(2012); Feng P. et al., Jounal of American Chemical Society. 132, 1500(2010).; Bessodes M. et al., Journal of Controlled Release, 99, 423(2004).; DeSimone, J.M., Journal of American Chemical Society. 132, 17928(2010); Thompson, D.H., Journal of Controlled Release, 91, 187(2003); Schoenmarks, R.G., Journal of Controlled Release, 95, 291(2004)).
보호된 생체 직교성 관능기로서는, 예를 들면, 디설파이드 잔기, 에스테르 잔기, 아세탈 잔기, 케탈 잔기, 이민 잔기, 비시날 디올 잔기를 들 수 있다.
보다 구체적으로는, 보호된 생체 직교성 관능기는, 이하로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나의 화학 구조에 대응하고 있어도 좋다.
[여기서, 결합에 직교하는 파선은 절단 부위를 나타내고,
단일 또는 복수의 R2a는 동일하거나 상이하고, 수소 원자 또는 상기 치환기로 이루어지는 그룹으로부터 선택되고,
·는 결합손이다]
바람직하게는, 보호되어 있어도 좋은 생체 직교성 관능기는, 미보호된 생체 직교성 관능기이다.
(기능성 물질)
기능성 물질은, 항체에 임의의 기능을 부여하는 물질인 한 특별히 한정되지 않고, 예를 들면, 약물, 표지 물질, 안정화제를 들 수 있지만, 바람직하게는 약물 또는 표지 물질이다. 기능성 물질은 또한, 단일 기능성 물질이라도 좋고, 또는 2종 이상의 기능성 물질이 연결된 물질이라도 좋다.
약물로서는, 임의의 질환에 대한 약물이라도 좋다. 이러한 질환으로서는, 예를 들면, 암(예, 폐암, 위암, 대장암, 췌장암, 신장암, 간장암, 갑상선암, 전립선암, 방광암, 난소암, 자궁암, 골암, 피부암, 뇌종양, 흑색종), 자가 면역 질환·염증성 질환(예, 알레르기 질환, 관절 류마티즘, 전신성 에리테마토데스), 뇌신경 질환(예, 뇌경색, 알츠하이머병, 파킨슨병, 근위축성 측색 경화증), 감염증(예, 세균 감염증, 바이러스 감염증), 유전성·희소 질환(예, 유전성 구상 적혈구증, 비디스트로피 근긴장증), 안질환(예, 가령 황반변성증, 당뇨병 망막증, 망막 색소 변성증), 골·정형외과 영역의 질환(예, 변형성 관절증), 혈액 질환(예, 백혈병, 자반병), 기타 질환(예, 당뇨병, 고지혈증 등의 대사 이상증, 간장 질환, 신장 질환, 폐 질환, 순환기계 질환, 소화기관계 질환)을 들 수 있다. 약물은, 질환의 예방 또는 치료약, 부작용의 완화약이라도 좋다.
보다 구체적으로는, 약물은 항암제라도 좋다. 항암제로서는, 예를 들면, 화학 요법제, 독소, 방사성 동위체 또는 이를 포함하는 물질을 들 수 있다. 화학 요법제로서는, 예를 들면, DNA 손상제, 대사 길항약, 효소 저해제, DNA 인터칼레이트제, DNA 절단제, 토포이소머라아제 저해제, DNA 결합 저해제, 튜불린 결합 저해제, 세포 상해성 뉴클레오시드, 백금 화합물을 들 수 있다. 독소로서는, 예를 들면, 세균 독소(예, 디프테리아 독소), 식물 독소(예, 리신)를 들 수 있다. 방사성 동위체로서는, 예를 들면, 수소 원자의 방사성 동위체(예, 3H), 탄소 원자의 방사성 동위체(예, 14C), 인 원자의 방사성 동위체(예, 32P), 황 원자의 방사성 동위체(예, 35S), 이트륨의 방사성 동위체(예, 90Y), 테크네튬의 방사성 동위체(예, 99mTc), 인듐의 방사성 동위체(예, 111In), 요오드 원자의 방사성 동위체(예, 123I, 125I, 129I, 131I), 사마륨의 방사성 동위체(예, 153Sm), 레늄의 방사성 동위체(예, 186Re), 아스타틴의 방사성 동위체(예, 211At), 비스무트의 방사성 동위체(예, 212Bi)를 들 수 있다. 더욱 구체적으로는, 약물로서 오리스타틴(MMAE, MMAF), 메이탄신(DM1, DM4), PBD(피롤로벤조디아제핀), IGN, 캠토테신 유연체, 칼리키아마이신, 듀오카마이신, 에리불린, 안트라사이클린, dmDNA31, 튜불라이신을 들 수 있다.
표지 물질은, 표적(예, 조직, 세포, 물질)의 검출을 가능하게 하는 물질이다. 표지 물질로서는, 예를 들면, 효소(예, 퍼옥시다아제, 알칼리 포스파타아제, 루시페라아제, β갈락토시다아제), 친화성 물질(예, 스트렙트아비딘, 비오틴, 디곡시게닌, 압타머), 형광 물질(예, 플루오레세인, 플루오레세인이소티오시아네이트, 로다민, 녹색 형광 단백질, 적색 형광 단백질), 발광 물질(예, 루시페린, 에쿼린, 아크리디늄에스테르, 트리스(2,2'-비피리딜)루테늄, 루미놀), 방사성 동위체(예, 상기한 것) 또는 이들을 포함하는 물질을 들 수 있다.
안정화제는 항체의 안정화를 가능하게 하는 물질이다. 안정화제로서는, 예를 들면, 디올류, 글리세린, 비이온 계면활성제, 음이온 계면활성제, 천연계 계면활성제, 사카라이드 및 폴리올류를 들 수 있다.
기능성 물질은 또한, 펩타이드, 단백질, 핵산, 저분자 유기 화합물, 당쇄, 지질, 고분자 폴리머, 금속(예, 금), 킬레이터라도 좋다. 펩타이드로서는, 예를 들면, 세포막 투과 펩타이드, 혈액 뇌관문 투과성 펩타이드, 펩타이드 의약품을 들 수 있다. 단백질로서는, 예를 들면, 효소, 사이토카인, 분절 항체, 렉틴, 인터페론, 혈청 알부민, 항체를 들 수 있다. 핵산으로서는, 예를 들면, DNA, RNA, 인공 핵산을 들 수 있다. 핵산으로서는 또한, 예를 들면, RNA 간섭 유도성 핵산(예, siRNA), 압타머, 안티센스를 들 수 있다. 저분자 유기 화합물로서는, 예를 들면, 단백질 분해 유도 키메라 분자, 색소, 광분해성 화합물을 들 수 있다.
기능성 물질이, 항체 중간체에 의해 보유되는 생체 직교성 관능기와 반응하기 쉬운 생체 직교성 관능기를 갖지 않는 경우, 기능성 물질은, 이러한 생체 직교성 관능기를 갖도록 유도체화되어도 좋다. 기능성 물질 또는 유도체화된 기능성 물질에 의해 보유되는 생체 직교성 관능기는, 항체 중간체에 의해 보유되는 생체 직교성 관능기를 고려하면서, 상기한 바와 같은 생체 직교성 관능기로부터 선택된다. 예를 들면, 항체 중간체에 의해 보유되는 생체 직교성 관능기가 알킨 잔기(바람직하게는, 상기한 바와 같은 치환기에 의해 치환되어 있어도 좋은, 탄소 원자 사이 3중 결합을 갖는 환기)인 경우, 기능성 물질 또는 유도체화된 기능성 물질에 의해 보유되는 생체 직교성 관능기는 아지드라도 좋다. 또한, 항체 중간체에 의해 보유되는 생체 직교성 관능기가 아지드인 경우, 기능성 물질 또는 유도체화된 기능성 물질에 의해 보유되는 생체 직교성 관능기는, 알킨 잔기(바람직하게는, 상기한 바와 같은 치환기에 의해 치환되어 있어도 좋은, 탄소 원자 사이 3중 결합을 갖는 환기)라도 좋다. 유도체화는, 상기 분야에서의 기술 상식이다(예, 국제공개 제2004/010957호, 미국 특허출원공개 제2006/0074008호 명세서, 미국 특허출원공개 제2005/0238649호 명세서). 예를 들면, 유도체화는, 임의의 가교제를 사용하여 행해져도 좋다. 또는 유도체화는, 원하는 관능기를 갖는 특정 링커를 사용하여 행해져도 좋다. 예를 들면, 이러한 링커는, 적절한 환경(예, 세포내 또는 세포외)에서 기능성 물질과 항체를 링커의 절단에 의해 분리 가능한 것이라도 좋다. 이러한 링커로서는, 예를 들면, 특정 프로테아제[예, 세포내 프로테아제(예, 리소좀 또는 엔도좀 중에 존재하는 프로테아제), 세포외 프로테아제(예, 분비성 프로테아제)]로 분해되는 펩티딜 링커 (예, 미국 특허 제6,214,345호. Dubowchik et al., Pharm. Therapeutics 83: 67-123(1999)), 생체 내에 존재하는 국소 산성 부위에서 절단될 수 있는 링커 (예, 미국 특허 제5,622,929호, 미국 특허 제5,122,368호. 미국 특허 제5,824,805호)를 들 수 있다. 링커는, 자괴적(self-immolative)이라도 좋다(예, 국제공개 제02/083180호, 국제공개 제04/043493호, 국제공개 제05/112919호). 본 발명에서는, 유도체화된 기능성 물질도 단순히 「기능성 물질」이라고 호칭된다.
(염)
본 발명에 있어서, 용어 「염」으로서는, 예를 들면, 무기산과의 염, 유기산과의 염, 무기염기와의 염, 유기염기와의 염 및 아미노산과의 염을 들 수 있다. 무기산과의 염으로서는, 예를 들면, 염화 수소, 브롬화 수소, 인산, 황산, 질산과의 염을 들 수 있다. 유기산과의 염으로서는, 예를 들면, 포름산, 아세트산, 트리 플루오로아세트산, 락트산, 주석산, 푸마르산, 옥살산, 말레산, 시트르산, 석신산, 말산, 벤젠설폰산, p-톨루엔설폰산과의 염을 들 수 있다. 무기염기와의 염으로서는, 예를 들면, 알칼리 금속(예, 나트륨, 칼륨), 알칼리 토류 금속(예, 칼슘, 마그네슘) 및 아연, 알루미늄 등의 다른 금속 및 암모늄과의 염을 들 수 있다. 유기염기와의 염으로서는, 예를 들면, 트리메틸아민, 트리에틸아민, 프로필렌디아민, 에틸렌디아민, 피리딘, 에탄올아민, 모노알킬에탄올아민, 디알킬에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민과의 염을 들 수 있다. 아미노산과의 염으로서는, 예를 들면, 염기성 아미노산(예, 아르기닌, 히스티딘, 라이신, 오르니틴) 및 산성 아미노산(예, 아스파라긴산, 글루타민산)과의 염을 들 수 있다. 염은, 바람직하게는, 무기산(예, 염화 수소)와의 염 또는 유기산(예, 트리플루오로아세트산)과의 염이다.
2. 항체 조성물
본 발명은, (A) 하기 화학식 (A):
[화학식 (A)]
(식 중,
Ab는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하고, 또한 중쇄 사이 및 중쇄와 경쇄 사이에 디설파이드 결합을 갖는 면역 글로불린 단위를 포함하는 항체이고,
S는 황 원자이고,
L은 2가 기이고,
R은 보호되어 있어도 좋은 생체 직교성 관능기이고,
n은 1 내지 8의 정수이다)로 표시되는, 보호되어 있어도 좋은 생체 직교성 관능기를 갖는 항체 중간체 또는 이의 염 및
(B) 하기 화학식 (B):
[화학식 (B)]
(식 중,
Ab는 화학식 (A)의 항체와 동일한 항체이고,
SH는 티올기이고,
n은 화학식 (A)의 n과 동일한 정수이다)로 표시되는, 티올기 도입 항체 또는 이의 염을 포함하고,
화학식 (A)에서 항체(Ab)에 인접해 있는 황 원자(S) 및 화학식 (B)에서 항체(Ab)에 인접해 있는 티올기(SH)가, 항체 중쇄의 정상 영역 중의 동일 위치에 존재하는 동일한 아미노산 잔기의 측쇄 중의 원자에 대하여, 직접 결합하고 있거나 또는 링커를 통하여 결합하고 있고,
L-R로 표시되는 부분 구조의 분자량이 700 이하이고,
상기 항체 중간체 또는 이의 염 및 상기 티올기 도입 항체 또는 이의 염의 합계량에 대한 상기 항체 중간체 또는 이의 염의 양의 백분율[100(%)×(상기 항체 중간체 또는 이의 염의 양)/(상기 항체 중간체 또는 이의 염 및 상기 티올기 도입 항체 또는 이의 염의 합계량)]이 80% 이상이고,
상기 항체 중간체 또는 이의 염 및 상기 티올기 도입 항체 또는 이의 염의 응집률이 5% 이하인, 항체 조성물을 제공한다.
본 발명의 항체 조성물은, 티올기 도입 항체를, 「탈리기-L-R」로 표시되는 화합물과 반응시킴으로써 얻을 수 있다(도 1). 따라서, 화학식 (A) 및 (B)에서의 공통 기호인 Ab 및 n은 화학식 (A)와 (B) 사이에서 동일하다. 본 발명에 의하면 이러한 항체 조성물을 얻을 수 있지만, 선행기술에 따라서는 이러한 항체 조성물을 얻는 동기 부여는 없다.
화학식 (A) 및 (B)에서의 Ab는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하고, 또한 중쇄 사이 및 중쇄와 경쇄 사이에 디설파이드 결합을 갖는 면역 글로불린 단위를 포함한 항체이다. 이러한 항체로서는, 예를 들면, 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하고, 또한 중쇄 사이 및 중쇄와 경쇄 사이에 디설파이드 결합을 갖는 면역 글로불린 단위를 포함하는 IgG 항체, IgD 항체 및 IgE 항체, 4개의 중쇄 및 4개의 경쇄를 포함하고, 또한 중쇄 사이 및 중쇄와 경쇄 사이에 디설파이드 결합을 갖는 면역 글로불린 단위를 포함하는 IgA 항체, 8개의 중쇄 및 8개의 경쇄를 포함하고, 또한 중쇄 사이 및 중쇄와 경쇄 사이에 디설파이드 결합을 갖는 면역 글로불린 단위를 포함하는 IgM 항체를 들 수 있지만, IgG 항체(예, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4)가 바람직하다. 항체는, 바람직하게는 인간 IgG 모노클로널 항체이고, 보다 바람직하게는 인간 IgG 전장 모노클로널 항체이다.
화학식 (A)의 L로 표시되는 2가 기는 상기한 것과 동일하다.
화학식 (A)의 R로 표시되는 보호되어 있어도 좋은 생체 직교성 관능기는 상기한 것과 동일하다.
화학식 (A) 및 (B)에서 n은 1 내지 8의 정수이다. n은 바람직하게는 1 내지 6의 정수이고, 보다 바람직하게는 1 내지 4의 정수(즉 1, 2, 3 또는 4)이다.
화학식 (A)에서 항체(Ab)에 인접해 있는 황 원자(S) 및 화학식 (B)에서 항체(Ab)에 인접해 있는 티올기(SH)는, 항체 중쇄의 정상 영역 중의 동일 위치에 존재하는 동일한 아미노산 잔기의 측쇄 중의 원자에 대하여, 직접 결합하고 있거나 또는 링커를 통하여 결합하고 있다. 본 발명의 항체 조성물은, 티올기 도입 항체를, 「탈리기-L-R」로 표시되는 화합물로 수식함으로써 얻을 수 있으므로(도 1), 상기 황 원자(S) 및 상기 티올기(SH)의 항체에 대한 결합 양식은 동일하게 되기 때문이다. 즉, 상기 황 원자(S)가 상기 측쇄 중의 원자에 대하여 동일하게 직접 결합하고 있는 경우, 상기 티올기(SH)도 또한, 동일한 측쇄 중의 동일한 원자에 대하여 직접 결합하고 있는 것이 된다. 또한, 상기 황 원자(S)가 상기 측쇄 중의 원자에 대하여 링커를 통하여 결합하고 있는 경우, 상기 티올기(SH)도 또한, 동일한 측쇄 중의 동일한 원자에 대하여 동일한 링커를 통하여 결합하고 있는 것이 된다.
일 실시형태에서는, 상기 황 원자(S) 및 티올기(SH)의 결합에 사용되는 항체 중의 아미노산 잔기는, 시스테인 잔기 이외의 아미노산 잔기라도 좋다. 시스테인 잔기 이외의 아미노산 잔기로서는, 수식하기 쉬운 측쇄(예, 아미노기, 카복시기, 아미드기, 하이드록시기)를 갖는 아미노산 잔기(예, 라이신 잔기, 아스파라긴산 잔기, 글루타민산 잔기, 아스파라긴 잔기, 글루타민 잔기, 스레오닌 잔기, 세린 잔기, 티로신 잔기)를 사용할 수 있지만, 바람직하게는, 질소 원자(아미노기)를 포함하는 측쇄를 갖는 라이신 잔기, 산소 원자(하이드록시기)를 포함하는 측쇄를 갖는 티로신 잔기, 세린 잔기 및 스레오닌 잔기이고, 보다 바람직하게는, 라이신 잔기이다.
다른 실시형태에서는, 상기 황 원자(S) 및 티올기(SH)의 결합에 사용되는 항체 중의 아미노산 잔기는 시스테인 잔기라도 좋다. 본 발명에서 사용되는 화합물은 반응의 효율성이 우수하므로, 항체에 화학적으로 도입된 티올기의 수식뿐만 아니라, 항체에서의 시스테인 잔기 중의 티올기의 수식에도 유용하다고 생각되기 때문이다.
상기 황 원자(S) 및 티올기(SH)의 결합에 사용되는 항체 중의 아미노산 잔기는, 항체 중쇄의 정상 영역(예를 들면, CH1, CH2 또는 CH3, 바람직하게는 CH2 또는 CH3) 중의 소정 위치에 존재하는 것을 사용할 수 있다.
바람직한 특정 실시형태에서는, 상기 황 원자(S) 및 티올기(SH)의 결합에 사용되는 항체 중의 아미노산 잔기는, 질소 원자(아미노기)를 포함하는 측쇄를 갖는 라이신 잔기이다. 라이신 잔기로서는, 예를 들면, 인간 IgG 중쇄에서의 246/248위치, 288/290위치 및 317위치로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1개 이상의 위치에 존재하는 라이신 잔기를 들 수 있다.
소정의 위치의 특정 아미노산 잔기를 위치 선택적으로 수식하여 소정의 위치에 특정 원자 또는 기를 함유하는 항체를 제작하는 방법은, 예를 들면, 국제공개 제2018/199337호, 국제공개 제2019/240288호, 국제공개 제2019/240287호 및 국제공개 제2020/090979호에 기재되어 있다. 또한, 이들 문헌에 기재되는 방법에 의하면, 펩타이드를 함유하는 링커를 사용하지 않고, 소정 위치의 특정 아미노산 잔기를 위치 선택적으로 수식할 수 있다. 펩타이드 부분은, 잠재적인 면역원성을 갖고, 또한 혈중에서 가수분해되기 쉽다. 따라서, 펩타이드 부분을 포함하는 링커의 사용의 회피는 임상 응용에서 바람직한 것이다.
바람직하게는, 티올기 도입 항체로서, 중쇄의 정상 영역 중의 소정의 위치에 존재하는 특정 아미노산 잔기의 측쇄 중의 원자(바람직하게는, 라이신 잔기의 측쇄 중의 질소 원자)에 대하여, 펩타이드를 함유하지 않는 링커를 통하여 위치 선택적으로 결합하고 있는 티올기를 함유하는 항체를 사용할 수 있다. 이러한 티올기 도입 항체를 「탈리기-L-R」로 표시되는 화합물로 수식함으로써, 화학식 (A)에서 항체(Ab)에 인접하는 황 원자(S) 및 화학식 (B)에서 항체(Ab)에 인접하는 티올기(SH)가, 항체 중쇄의 정상 영역 중의 동일 위치에 존재하는 동일한 아미노산 잔기의 측쇄 중의 원자에 대하여, 위치 선택적으로 직접 결합하고 있거나 또는 링커를 통하여 위치 선택적으로 결합하고 있는 본 발명의 항체 조성물을 얻을 수 있다. 본 명세서에 있어서, 「위치 선택적」 또는 「위치 선택성」이란, 항체에서 특정 아미노산 잔기가 특정 영역에 편재하고 있지 않음에도 불구하고, 항체 중의 특정 아미노산 잔기와 결합할 수 있는 소정의 구조 단위가 항체 중의 특정 영역에 편재하는 것을 말한다. 따라서, 「위치 선택적으로 갖는다」, 「위치 선택적인 결합」, 「위치 선택성에서의 결합」 등의 위치 선택성에 관련되는 표현은, 1개 이상의 특정 아미노산 잔기를 포함하는 표적 영역에서의 소정의 구조 단위의 보유율 또는 결합률이, 표적 영역에서의 상기 특정 아미노산 잔기와 동종인 복수개의 아미노산 잔기를 포함하는 비표적 영역에서의 상기 구조 단위의 보유율 또는 결합률보다도 유의한 레벨로 높은 것을 의미한다. 이러한 위치 선택적인 결합 또는 보유는, 티올기 도입 항체로서, 소정의 위치의 특정 아미노산 잔기를 위치 선택적으로 티올기로 수식할 수 있는 상기 방법에 의해 얻을 수 있는 항체를 사용함으로써 달성할 수 있다. 이러한 위치 선택성은 50% 이상이고, 바람직하게는 60% 이상, 보다 바람직하게는 70% 이상, 보다 더 바람직하게는 80% 이상, 특히 바람직하게는 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상 또는 100%라도 좋다. 위치 선택성의 확인은 예를 들면, 펩타이드 맵핑에 의해 행할 수 있다[예, 국제공개 제2019/240287호(WO2019/240287A1)를 참조].
펩타이드를 함유하지 않는 링커로서는, 상기 2가 기를 사용할 수 있다. 바람직하게는, 상기 황 원자(S) 및 티올기(SH)의 결합에 사용되는 항체 중의 아미노산 잔기가 라이신 잔기인 경우, 펩타이드를 함유하지 않는 링커로서, 라이신 잔기의 측쇄 중의 아미노기와 아미드 결합할 수 있는 -C(=O)- 부분을 포함하는 카보닐 함유 링커를 사용할 수 있다.
카보닐 함유 링커로서는, -C(=O)- 부분을 말단에 갖고, 또한, 2가 직쇄 탄화수소기, 2가 환상 탄화수소기, 2가 복소환기, -C(=O)-, -C(=S)-, -NR4-, -C(=O)-NR4-, -NR4-C(=O)-, -C(=S)-NR4-, -NR4-C(=S)-, -O-, -S-, -(O-R5)m1- 및 -(S-R5)m1-으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1개의 기 또는 이들 중 2개 이상(예를 들면, 2 내지 10개, 바람직하게는 2 내지 8개, 보다 바람직하게는 2 내지 6개, 보다 더 바람직하게는 2 내지 5개, 특히 바람직하게는 2 또는 3개)의 기를 포함하는 주쇄 구조를 갖는 기를 사용할 수 있다. R4는 수소 원자 또는 후술하는 치환기를 나타낸다. R5는 2가 직쇄 탄화수소기, 2가 환상 탄화수소기 또는 2가 복소환기를 나타낸다. m1은 1 내지 10의 정수이고, 바람직하게는 1 내지 8의 정수이고, 보다 바람직하게는 1 내지 6의 정수이고, 보다 더 바람직하게는 1 내지 5의 정수이고, 특히 바람직하게는 1 내지 3의 정수이다.
바람직하게는, 카보닐 함유 링커는, -C(=O)- 부분을 말단에 갖고, 또한, 알킬렌, 아릴렌, -C(=O)-, -NR2-, -C(=O)-NR4-, -NR4-C(=O)-, -O- 및 -(O-R5)m1-으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1개의 기를 포함하는 주쇄 구조를 갖는 2가 기이거나, 또는
-C(=O)-를 말단에 갖고, 또한, 알킬렌, 아릴렌, -C(=O)-, -NR4-, -C(=O)-NR4-, -NR4-C(=O)-, -O- 및 -(O-R5)m-으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 2개 이상의 기를 포함하는 주쇄 구조를 갖는 2가 기이고,
R2가 수소 원자 또는 알킬이고,
R3이 알킬렌 또는 아릴렌이고,
m이 1 내지 5의 정수(즉, 1, 2, 3, 4 또는 5)라도 좋다.
알킬렌, 아릴렌, 알킬은 상기한 것과 동일하다.
보다 바람직하게는, 카보닐 함유 링커는, -C(=O)- 부분을 말단에 갖고, 또한, 알킬렌 또는 아릴렌 또는 이들의 조합을 포함하는 주쇄 구조를 갖는 2가 기라도 좋다.
보다 더 바람직하게는, 카보닐 함유 링커는, -C(=O)- 부분 및 알킬렌을 포함하는 주쇄 구조를 갖는 2가 기(예, -C(=O)-CH2-CH2-)라도 좋다.
카보닐 함유 링커의 주쇄 구조는, 1개 이상(예를 들면, 1 내지 10개, 바람직하게는 1 내지 8개, 보다 바람직하게는 1 내지 6개, 보다 더 바람직하게는 1 내지 5개, 특히 바람직하게는 1 내지 3개)의 상기 치환기에 의해 치환되어 있어도 좋다.
본 발명에서는, 화학식 (A)에서 L-R로 표시되는 부분 구조의 분자량은 700 이하이다. L-R로 표시되는 부분 구조의 분자량이 700 이하인 경우, 보호되어 있어도 좋은 생체 직교성 관능기를 갖는 항체 중간체 또는 이의 염 및 티올기 도입 항체 또는 이의 염은, 항체 전체의 분자량에 대한 상기 부분 구조의 분자량의 비율이 매우 작기 때문에, 분자량의 차이에 기초하는 분리가 곤란하다. L-R로 표시되는 부분 구조의 분자량은, 바람직하게는 600 이하이고, 보다 바람직하게는 500 이하이고, 보다 더 바람직하게는 400 이하이고, 특히 바람직하게는 300 이하, 250 이하, 200 이하 또는 150 이하이다.
본 발명에서는, 항체 중간체 또는 이의 염 및 티올기 도입 항체 또는 이의 염의 합계량에 대한 항체 중간체 또는 이의 염의 양의 백분율[100(%)×(항체 중간체 또는 이의 염의 양)/(항체 중간체 또는 이의 염 및 티올기 도입 항체 또는 이의 염의 합계량)]은 80% 이상이다. 본 발명에서 사용되는 화합물 또는 이의 염은, 티올기 도입 항체 또는 이의 염에 대한 반응 효율이 우수하므로, 이러한 백분율로 표현되는 양호한 반응성을 달성할 수 있다. 이러한 백분율은, 바람직하게는 82% 이상, 보다 바람직하게는 84% 이상, 보다 더 바람직하게는 86% 이상, 특히 바람직하게는 88% 이상, 90% 이상, 92% 이상, 94% 이상 또는 96% 이상이다. 이러한 백분율은, 환원 조건 하의 역상 HPLC 또는 질량 분석에 의한 측정값에 기초하여 결정할 수 있다(실시예를 참조).
본 발명에서는, 항체 중간체 또는 이의 염 및 티올기 도입 항체 또는 이의 염의 응집률은 5% 이하이다. 본 발명에서 사용되는 화합물에 의한 티올기 도입 항체의 수식은, 단백질의 변성·분해(예, 아미드 결합의 절단)를 일으킬 수 없는 조건(온화한 조건) 하에서 행할 수 있고, 항체의 응집을 일으키기 어렵기 때문이다. 응집률은 바람직하게는, 4.8% 이하, 보다 바람직하게는 4.6% 이하, 보다 더 바람직하게는 4.4% 이하, 특히 바람직하게는 4.2% 이하, 4.0% 이하, 3.8% 이하, 3.6% 이하 또는 3.4% 이하이다. 항체의 응집률은 사이즈 배제 크로마토그래피(SEC)-HPLC에 의해 측정할 수 있다(실시예 및 ACS Omega 2020, 5, 7193-7200을 참조).
항체 조성물에 포함되는 항체 중간체 또는 이의 염의 상세는, 항체 중간체 또는 이의 염에 대하여 후술하는 바와 같다.
본 발명의 항체 조성물은, (A) 보호되어 있어도 좋은 생체 직교성 관능기를 갖는 항체 중간체 또는 이의 염 및 (B) 티올기 도입 항체 또는 이의 염에 더하여, 티올기 도입 항체의 제작 원료로서 사용된 항체를 추가로 포함하고 있어도 좋다. 이 경우, 티올기 도입 항체의 제작 원료로서 사용된 항체의 특성은, 「보호되어 있어도 좋은 생체 직교성 관능기를 갖는 항체 중간체」 및 「티올기 도입 항체」에 이어질 수 있다. 따라서, 티올기 도입 항체의 제작 원료로서 사용된 항체는, 「보호되어 있어도 좋은 생체 직교성 관능기를 갖는 항체 중간체」 및 「티올기 도입 항체」에서의 「항체」와 동일하게 정의할 수 있다.
본 발명의 항체 조성물은 티올기 도입 항체를, 「탈리기-L-R」로 표시되는 화합물과 반응시킴으로써 얻을 수 있다(도 1). 이러한 반응으로부터, 티올기 도입 항체에서의 티올기와, 「탈리기-L-R」로 표시되는 화합물에서의 L 중의 탈리기 결합 원자가 결합하고, 또한 탈리기가 탈리기 결합 원자로부터 탈리하여, 항체 중간체 또는 이의 염(반응 생성물) 및 티올기 도입 항체 또는 이의 염(미반응물)을 포함하는 항체 조성물을 얻을 수 있다. 반응에서의, 티올기 도입 항체 또는 이의 염에 대한, 「탈리기-L-R」로 표시되는 화합물 또는 이의 염의 몰 비율(「탈리기-L-R」로 표시되는 화합물 또는 이의 염/티올기 도입 항체 또는 이의 염)은, 「탈리기-L-R」로 표시되는 화합물 또는 이의 염 및 티올기 도입 항체의 종류 등의 인자에 따라서 변동하므로 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 1 내지 100이고 바람직하게는 2 내지 80이고, 보다 바람직하게는 3 내지 50이다.
이러한 반응은, 단백질의 변성·분해(예, 아미드 결합의 절단)를 일으킬 수 없는 조건(온화한 조건) 하에서 적절히 행할 수 있다. 예를 들면, 이러한 반응은, 적절한 반응계, 예를 들면, 완충액 중에서, 실온(예, 약 15 내지 30℃)에서 행할 수 있다. 완충액의 pH는, 예를 들면, 5 내지 9이고, 바람직하게는 5.5 내지 8.5이고, 보다 바람직하게는 6.0 내지 8.0이다. 완충액은, 적절한 촉매를 포함하고 있어도 좋다. 반응 시간은, 예를 들면, 1분 내지 20시간, 바람직하게는 10분 내지 15시간, 보다 바람직하게는 20분 내지 10시간, 보다 더 바람직하게는 30분 내지 8시간이다. 이러한 반응의 상세에 대해서는, 예를 들면, G. J. L. Bernardes et al., Chem. Rev., 115, 2174(2015); G. J. L. Bernardes et al., Chem. Asian. J., 4, 630(2009); B. G. Davies et al., Nat. Commun., 5, 4740(2014); A.Wagner et al., Bioconjugate. Chem., 25, 825(2014)를 참조할 것.
항체 중간체 또는 이의 염의 생성의 확인은, 이의 구체적인 원료 및 생성물의 분자량에도 의하지만, 예를 들면, 환원 조건 하의 역상 HPLC 또는 질량 분석에 의해 행할 수 있다.
본 발명의 항체 조성물은, 보호되어 있어도 좋은 생체 직교성 관능기를 갖는 항체 중간체 또는 이의 염을, 응집률이 낮은 상태에서 높은 함유율로 포함할 수 있다. 보호되어 있어도 좋은 생체 직교성 관능기를 갖는 항체 중간체 또는 이의 염은, 항체 및 기능성 물질의 콘쥬게이트 또는 이의 염의 제조에 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체 조성물은, 항체 및 기능성 물질의 콘쥬게이트 또는 이의 염을, 응집률이 낮은 상태에서 효율적으로 제조할 수 있다.
3. 티올기 도입 항체 또는 이의 염의 유도체화용 시약
본 발명은, 티올기 도입 항체 또는 이의 염의 유도체화용 시약을 제공한다.
일 실시형태에서는, 본 발명의 시약은, 하기 화학식 (I)로 표시되는 화합물 또는 이의 염을 포함한다.
[화학식 (I)]
(식 중,
X는 할로겐 원자이고,
Q는 아릴렌 또는 알킬렌이고,
Y는 결합손 또는 2가 기이고,
R은 보호되어 있어도 좋은 생체 직교성 관능기이다)
화학식 (I)에서 X로 표시되는 할로겐 원자는 상기한 것과 동일하다.
화학식 (I)에서 Q로 표시되는 아릴렌으로서는, 예를 들면, 페닐렌, 나프틸렌, 안트라세닐렌을 들 수 있고, 페닐렌, 나프틸렌이 바람직하고, 페닐렌이 바람직하다. 화학식 (I)에서 Q로 표시되는 알킬렌으로서는, 예를 들면, 직쇄 또는 분기쇄 알킬렌을 들 수 있고, 직쇄 알킬렌이 바람직하다. 직쇄 알킬렌으로서는, 탄소 원자수 1 내지 6의 직쇄 알킬렌이 바람직하고, 탄소 원자수 1 내지 4의 직쇄 알킬렌이 보다 바람직하다.
화학식 (I)에서 Y로 표시되는 2가 기는 상기한 것과 동일하다.
특정 실시형태에서는, 화학식 (I)에서 Y로 표시되는 2가 기는, -(O-R5)m1-를 포함하는 주쇄 구조를 갖는 기라도 좋다. R5 및 m1은 상기한 것과 동일하다.
화학식 (I)에서 R로 표시되는 보호되어 있어도 좋은 생체 직교성 관능기는 상기한 것과 동일하다.
다른 실시형태에서는, 본 발명의 시약은, 하기 화학식 (II)로 표시되는 화합물 또는 이의 염을 포함한다.
[화학식 (II)]
(식 중,
R1은 알킬이고,
Y는 2가 기이고,
R은 보호되어 있어도 좋은 생체 직교성 관능기이다)
화학식 (II)에서 R1로 표시되는 알킬은 상기한 것과 동일하다.
화학식 (II)에서 Y로 표시되는 2가 기는 상기한 것과 동일하다.
화학식 (II)에서 R로 표시되는 보호되어 있어도 좋은 생체 직교성 관능기는 상기한 것과 동일하다.
또 다른 실시형태에서는, 본 발명의 시약은, 하기 화학식 (III)으로 표시되는 화합물 또는 이의 염을 포함한다.
[화학식 (III)]
(식 중,
Y는 2가 기이고,
R은 보호되어 있어도 좋은 생체 직교성 관능기이다)
화학식 (III)에서 Y로 표시되는 2가 기는 상기한 것과 동일하다.
화학식 (III)에서 R로 표시되는 보호되어 있어도 좋은 생체 직교성 관능기는 상기한 것과 동일하다.
또 다른 실시형태에서는, 본 발명의 시약은, 하기 화학식 (IV)로 표시되는 화합물 또는 이의 염을 포함한다.
[화학식 (IV)]
(식 중,
Y는 2가 기이고,
R은 보호되어 있어도 좋은 생체 직교성 관능기이다)
화학식 (IV)에서 Y로 표시되는 2가 기는 상기한 것과 동일하다.
화학식 (IV)에서 R로 표시되는 보호되어 있어도 좋은 생체 직교성 관능기는 상기한 것과 동일하다.
보다 구체적으로는, 화학식 (I) 내지 (IV)로 표시되는 화합물은, 하기 화학식 (1) 내지 (12)로 표시되는 화합물이라도 좋다.
(식 중,
k는 0 또는 1의 정수이고,
m은 1 내지 5의 정수(바람직하게는 1 내지 3의 정수)이고,
m'는 1 내지 5의 정수(바람직하게는 1 내지 3의 정수)이고,
R2 및 R3은 각각 독립적으로, 수소 원자 또는 메틸이고,
R6은 보호되어 있어도 좋은 생체 직교성 관능기이고,
X, R1, Q 및 R은 상기한 것과 동일하다)
본 발명의 시약에 의해 유도체화되는 티올기 도입 항체 또는 이의 염은, 티올기 도입 항체 또는 항체에 대하여 상기한 바와 같다. 예를 들면, 티올기 도입 항체에서의 티올기는, 항체 중쇄의 정상 영역 중의 아미노산 잔기(예, 상기 수식하기 쉬운 측쇄를 갖는 아미노산 잔기)의 측쇄 중의 원자(바람직하게는, 라이신 잔기의 측쇄 중의 질소 원자)에 대하여, 펩타이드를 함유하지 않은 링커를 통하여 위치 선택적으로 결합하고 있어도 좋다. 또한, 티올기 도입 항체는 IgG 항체라도 좋다. 티올기 도입 항체로서 인간 IgG 항체가 사용되는 경우, 이러한 라이신 잔기는, EU numbering에서의 인간 IgG 중쇄의 246/248위치, 288/290위치 및 317위치로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1개 이상의 위치에 존재하는 것이라도 좋다.
본 발명의 시약은, 티올기 도입 항체 또는 이의 염에서의 티올기(바람직하게는, 라이신 잔기의 측쇄를 통하여 도입된 티올기)와 반응함으로써 티올기 도입 항체 또는 이의 염을 유도체화할 수 있다.
본 발명의 시약은, 다른 성분을 추가로 포함하는 조성물 형태로 제공되어도 좋다. 이러한 다른 성분으로서는, 예를 들면, 용액, 안정화제(예, 산화 방지제, 보존제)를 들 수 있다. 용액으로서는, 수용액이 바람직하다. 수용액으로서는, 예를 들면, 물(예, 증류수, 멸균 증류수, 정제수, 생리 식염수), 완충액(예, 인산 수용액, Tris-염산 완충액, 탄산-중탄산 완충 용액, 붕산 수용액, 글리신-수산화나트륨 완충액, 시트르산 완충액)을 들 수 있지만, 완충액이 바람직하다. 용액의 pH는, 예를 들면, 5.0 내지 9.0, 바람직하게는 5.5 내지 8.5이다. 본 발명의 시약은 액상 또는 분말상(예, 동결 건조 분말)으로 제공할 수 있다.
4. 화합물 또는 이의 염
본 발명은 또한, 화합물 또는 이의 염을 제공한다.
일 실시형태에서는, 본 발명의 화합물은 하기 화학식 (I)로 표시되는 화합물 또는 이의 염이다.
[화학식 (I)]
(식 중,
X는 할로겐 원자이고,
Q는 아릴렌 또는 알킬렌이고,
Y는 2가 기이고,
R은 보호되어 있어도 좋은 생체 직교성 관능기이다)
화학식 (I)에서, X로 표시되는 할로겐 원자, Q로 표시되는 아릴렌 또는 알킬렌, Y로 표시되는 2가 기 및 R로 표시되는 보호되어 있어도 좋은 생체 직교성 관능기는 상기한 것과 동일하다.
다른 실시형태에서는, 본 발명의 화합물은 하기 화학식 (II)로 표시되는 화합물 또는 이의 염이다.
[화학식 (II)]
(식 중,
R1은 알킬이고,
Y는 2가 기이고,
R은 보호되어 있어도 좋은 생체 직교성 관능기이다)
화학식 (II)에서, R1로 표시되는 알킬, Y로 표시되는 2가 기 및 R로 표시되는 보호되어 있어도 좋은 생체 직교성 관능기는 상기한 것과 동일하다.
또 다른 실시형태에서는, 본 발명의 화합물은 하기 화학식 (III)으로 표시되는 화합물 또는 이의 염이다.
[화학식 (III)]
(식 중,
Y는 2가 기이고,
R은 보호되어 있어도 좋은 생체 직교성 관능기이다)
화학식 (III)에서, Y로 표시되는 2가 기 및 R로 표시되는 보호되어 있어도 좋은 생체 직교성 관능기는 상기한 것과 동일하다.
또 다른 실시형태에서는, 본 발명의 화합물은 하기 화학식 (IV)로 표시되는 화합물 또는 이의 염이다.
[화학식 (IV)]
(식 중,
Y는 2가 기이고,
R은 보호되어 있어도 좋은 생체 직교성 관능기이다)
화학식 (IV)에서, Y로 표시되는 2가 기 및 R로 표시되는 보호되어 있어도 좋은 생체 직교성 관능기는 상기한 것과 동일하다.
보다 구체적으로는, 화학식 (I) 내지 (IV)로 표시되는 화합물은, 상기 화학식 (2) 내지 (12)로 표시되는 화합물이라도 좋다.
화학식 (I) 내지 (IV)로 표시되는 화합물은, 실시예에 기재한 바와 같은 합성 반응에 의해 얻을 수 있다. 예를 들면, 이러한 반응은, 적절한 유기 용매계에서, 적절한 온도(예, 약 4 내지 90℃)에서 행할 수 있다. 반응 시간은, 예를 들면, 1분 내지 20시간, 바람직하게는 10분 내지 15시간이다.
상기와 같은 일련의 화합물 또는 이의 염의 생성의 확인은, 이의 구체적인 원료 및 생성물의 분자량에도 의하지만, 예를 들면, NMR, 질량 분석에 의해 행할 수 있다. 이러한 화합물 또는 이의 염은, 크로마토그래피, 용매 추출, 재결정 등의 임의의 방법에 의해 적절하게 정제할 수 있다.
본 발명의 화합물 또는 이의 염은, 티올기 도입 항체 또는 이의 염의 유도체화에 사용할 수 있다.
5. 항체 중간체 또는 이의 염
본 발명은, 보호되어 있어도 좋은 생체 직교성 관능기를 갖는 항체 중간체 또는 이의 염을 제공한다.
일 실시형태에서는, 본 발명의 항체 중간체는, 하기 화학식 (I')로 표시되는 보호되어 있어도 좋은 생체 직교성 관능기를 갖는 항체 중간체이다.
[화학식 (I')]
(식 중,
Ab는 항체이고,
S는 황 원자이고,
Q는 아릴렌 또는 알킬렌이고,
Y는 결합손 또는 2가 기이고,
R은 보호되어 있어도 좋은 생체 직교성 관능기이고,
n은 1 내지 8의 정수이다)
화학식 (I')에서 Ab로 표시되는 항체 및 항체와 이에 인접하는 황 원자(S)의 관계는, 티올기 도입 항체 또는 항체에 대하여 상기한 것과 동일하다. 예를 들면, 항체에 인접하는 황 원자(S)는, 항체 중쇄의 정상 영역 중의 아미노산 잔기(예, 상기 수식하기 쉬운 측쇄를 갖는 아미노산 잔기)의 측쇄 중의 원자(바람직하게는, 라이신 잔기의 측쇄 중의 질소 원자)에 대하여, 펩타이드를 함유하지 않은 링커를 통하여 위치 선택적으로 결합하고 있어도 좋다. 또한, 항체는, 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하는 면역 글로불린 단위를 포함하는 항체(바람직하게는, 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하고, 또한 중쇄 사이 및 중쇄와 경쇄 사이에 디설파이드 결합을 갖는 면역 글로불린 단위를 포함하는 항체)라도 좋다. 또한, 항체는 IgG 항체라도 좋다. 항체로서 인간 IgG 항체가 사용되는 경우, 이러한 라이신 잔기는, EU numbering에서의 인간 IgG 중쇄의 246/248위치, 288/290위치 및 317위치로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1개 이상의 위치에 존재하는 것이라도 좋다. 위치 선택성 및 이의 정도는 상기한 것과 동일하다. 위치 선택성의 확인은, 상기 방법에 의해 확인할 수 있다.
화학식 (I')에서 n은 1 내지 8의 정수이고, 바람직하게는 1 내지 6의 정수이고, 보다 바람직하게는 1 내지 4의 정수(즉, 1, 2, 3 또는 4)이다.
화학식 (I')에서 Q로 표시되는 아릴렌으로서는, 예를 들면, 페닐렌, 나프틸렌, 안트라세닐렌을 들 수 있고, 페닐렌, 나프틸렌이 바람직하고, 페닐렌이 바람직하다. 화학식 (I')에서 Q로 표시되는 알킬렌으로서는, 예를 들면, 직쇄 또는 분기쇄 알킬렌을 들 수 있고, 직쇄 알킬렌이 바람직하다. 직쇄 알킬렌으로서는, 탄소 원자수 1 내지 6의 직쇄 알킬렌이 바람직하고, 탄소 원자수 1 내지 4의 직쇄 알킬렌이 보다 바람직하다.
화학식 (I')에서, Y로 표시되는 2가 기 및 R로 표시되는 보호되어 있어도 좋은 생체 직교성 관능기는 상기한 것과 동일하다.
특정 실시형태에서는, 화학식 (I')에서 Y로 표시되는 2가 기는, -(O-R5)m1-를 포함하는 주쇄 구조를 갖는 기라도 좋다. R5 및 m1은 상기한 것과 동일하다.
다른 실시형태에서는, 본 발명의 항체 중간체는, 하기 화학식 (II')로 표시되는, 보호되어 있어도 좋은 생체 직교성 관능기를 갖는 항체 중간체이다.
[화학식 (II')]
(식 중,
Ab는 항체이고,
S는 황 원자이고,
Y는 결합손 또는 2가 기이고,
R은 보호되어 있어도 좋은 생체 직교성 관능기이고,
n은 1 내지 8의 정수이다)
화학식 (II')에서, Ab로 표시되는 항체, 항체와 이에 인접하는 황 원자(S)의 관계, n으로 표시되는 정수, Y로 표시되는 2가 기 및 R로 표시되는 보호되어 있어도 좋은 생체 직교성 관능기는 상기한 것과 동일하다.
또 다른 실시형태에서는, 본 발명의 항체 중간체는, 하기 화학식 (III')로 표시되는, 보호되어 있어도 좋은 생체 직교성 관능기를 갖는 항체 중간체이다.
[식 (III')]
(식 중,
Ab는 항체이고,
S는 황 원자이고,
Y는 결합손 또는 2가 기이고,
R은 보호되어 있어도 좋은 생체 직교성 관능기이고,
n은 1 내지 8의 정수이다)
화학식 (III')에서, Ab로 표시되는 항체, 항체와 이에 인접하는 황 원자(S)의 관계, n으로 표시되는 정수, Y로 표시되는 2가 기 및 R로 표시되는 보호되어 있어도 좋은 생체 직교성 관능기는 상기한 것과 동일하다.
또 다른 실시형태에서는, 본 발명의 항체 중간체는, 하기 화학식 (IV')로 표시되는 보호되어 있어도 좋은 생체 직교성 관능기를 갖는 항체 중간체이다.
[식 (IV')]
(식 중,
Ab는 항체이고,
S는 황 원자이고,
Y는 결합손 또는 2가 기이고,
R은 보호되어 있어도 좋은 생체 직교성 관능기이고,
n은 1 내지 8의 정수이다)
화학식 (IV')에서, Ab로 표시되는 항체, 항체와 이에 인접하는 황 원자(S)의 관계, n으로 표시되는 정수, Y로 표시되는 2가 기 및 R로 표시되는 보호되어 있어도 좋은 생체 직교성 관능기는 상기한 것과 동일하다.
보다 구체적으로는, 화학식 (I') 내지 (IV')로 표시되는 항체 중간체는, 하기 화학식 (1') 내지 (12')로 표시되는 항체 중간체라도 좋다.
(식 중,
k는 0 또는 1의 정수이고,
m은 1 내지 5의 정수(바람직하게는 1 내지 3의 정수)이고,
m'는 1 내지 5의 정수(바람직하게는 1 내지 3의 정수)이고,
R2 및 R3은 각각 독립적으로, 수소 원자 또는 메틸이고,
R6은 보호되어 있어도 좋은 생체 직교성 관능기이고,
Ab, Ab에 인접하는 S, Q, R 및 n은 상기한 것과 동일하다)
본 발명의 항체 중간체 또는 이의 염의 응집률은 5% 이하라도 좋다. 본 발명에서 사용되는 화합물에 의한 티올기 도입 항체의 수식은, 단백질의 변성·분해(예, 아미드 결합의 절단)를 일으킬 수 없는 조건(온화한 조건) 하에서 행할 수 있고, 항체의 응집을 일으키기 어렵기 때문이다. 응집률은 바람직하게는, 4.8% 이하, 보다 바람직하게는 4.6% 이하, 보다 더 바람직하게는 4.4% 이하, 특히 바람직하게는 4.2% 이하, 4.0% 이하, 3.8% 이하, 3.6% 이하 또는 3.4% 이하이다. 항체의 응집률은 사이즈 배제 크로마토그래피-(SEC)-HPLC에 의해 측정할 수 있다(실시예 및 ACS Omega 2020, 5, 7193-7200을 참조).
본 발명의 항체 중간체 또는 이의 염은 또한, 높은 혈중 안정성을 가질 수 있다.
본 발명의 항체 중간체는, 티올기 도입 항체를, 화학식 (I) 내지 (IV)로 표시되는 화합물 또는 이의 염과 반응시킴으로써 얻을 수 있다(도 1). 반응에서의, 티올기 도입 항체 또는 이의 염에 대한, 화학식 (I) 내지 (IV)로 표시되는 화합물 또는 이의 염의 몰 비율(화학식 (I) 내지 (IV)로 표시되는 화합물 또는 이의 염/티올기 도입 항체 또는 이의 염)은, 화학식 (I) 내지 (IV)로 표시되는 화합물 또는 이의 염 및 티올기 도입 항체의 종류 등의 인자에 따라서 변동하므로 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 1 내지 100이고, 바람직하게는 2 내지 80이고, 보다 바람직하게는 3 내지 50이다.
이러한 반응은, 단백질의 변성·분해(예, 아미드 결합의 절단)를 일으킬 수 없는 조건(온화한 조건) 하에서 적절히 행할 수 있다. 예를 들면, 이러한 반응은, 적절한 반응계, 예를 들면, 완충액 중에서, 실온(예, 약 15 내지 30℃)에서 행할 수 있다. 완충액의 pH는, 예를 들면, 5 내지 9이고, 바람직하게는 5.5 내지 8.5이고, 보다 바람직하게는 6.0 내지 8.0이다. 완충액은, 적절한 촉매를 포함하고 있어도 좋다. 반응 시간은, 예를 들면, 1분 내지 20시간, 바람직하게는 10분 내지 15시간, 보다 바람직하게는 20분 내지 10시간, 보다 더 바람직하게는 30분 내지 8시간이다. 이러한 반응의 상세에 대해서는, 예를 들면, G. J. L. Bernardes et al., Chem. Rev., 115, 2174(2015); G. J. L. Bernardes et al., Chem. Asian. J., 4, 630(2009); B. G. Davies et al., Nat. Commun., 5, 4740(2014); A.Wagner et al., Bioconjugate. Chem., 25, 825(2014)를 참조할 것.
항체 중간체 또는 이의 염의 생성의 확인은, 이의 구체적인 원료 및 생성물의 분자량에도 의하지만, 예를 들면, 환원 조건 하의 역상 HPLC 또는 질량 분석에 의해 행할 수 있다.
본 발명의 항체 중간체는, 항체 및 기능성 물질의 콘쥬게이트 또는 이의 염의 제조에 사용할 수 있다.
6. 항체 및 기능성 물질의 콘쥬게이트 또는 이의 염
본 발명은 항체 및 기능성 물질의 콘쥬게이트 또는 이의 염을 제공한다.
일 실시형태에서는, 본 발명의 콘쥬게이트는 하기 화학식 (I")로 표시되는, 항체 및 기능성 물질의 콘쥬게이트이다.
[화학식 (I")]
(식 중,
Ab는 항체이고,
S는 황 원자이고,
Q는 아릴렌 또는 알킬렌이고,
Y는 결합손 또는 2가 기이고,
R'는 서로 반응 가능한 2개의 생체 직교성 관능기 사이의 반응에 의해 생성되는 기이고,
Z는 기능성 물질이고,
n은 1 내지 8의 정수이다)
화학식 (I")에서 Ab로 표시되는 항체 및 항체와 이에 인접하는 황 원자(S)의 관계는, 티올기 도입 항체 또는 항체에 대하여 상기한 것과 동일하다. 예를 들면, 항체에 인접하는 황 원자(S)는, 항체 중쇄의 정상 영역 중의 아미노산 잔기(예, 상기 수식하기 쉬운 측쇄를 갖는 아미노산 잔기)의 측쇄 중의 원자(바람직하게는, 라이신 잔기의 측쇄 중의 질소 원자)에 대하여, 펩타이드를 함유하지 않은 링커를 통하여 위치 선택적으로 결합하고 있어도 좋다. 또한, 항체는, 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하는 면역 글로불린 단위를 포함하는 항체(바람직하게는, 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하고, 또한 중쇄 사이 및 중쇄와 경쇄 사이에 디설파이드 결합을 갖는 면역 글로불린 단위를 포함하는 항체)라도 좋다. 또한, 항체는 IgG 항체라도 좋다. 항체로서 인간 IgG 항체가 사용되는 경우, 이러한 라이신 잔기는, EU numbering에서의 인간 IgG 중쇄의 246/248위치, 288/290위치 및 317위치로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1개 이상의 위치에 존재하는 것이라도 좋다. 위치 선택성 및 이의 정도는 상기한 것과 동일하다. 위치 선택성의 확인은 상기 방법으로 확인할 수 있다.
화학식 (I")에서 n은 1 내지 8의 정수이고, 바람직하게는 1 내지 6의 정수이고, 보다 바람직하게는 1 내지 4의 정수(즉 1, 2, 3 또는 4)이다.
화학식 (I")에서의 R'로 표시되는 서로 반응 가능한 2개의 생체 직교성 관능기 사이의 반응에 의해 생성되는 기는, 항체 중간체에 의해 보유되는 생체 직교성 관능기와, 기능성 물질에 의해 보유되는 생체 직교성 관능기(여기서, 이들 생체 직교성 관능기는 서로 반응 가능한 조합이 되도록 선택된다)와의 반응에 의해 생성되는 기이다. 서로 반응 가능한 2개의 생체 직교성 관능기의 조합은 주지이므로, 당업자는 이러한 조합을 적절히 선택하여, 서로 반응 가능한 2개의 생체 직교성 관능기의 반응에 의해 생성되는 부분을 포함하는 2가 기를 적절히 설정할 수 있다. 서로 반응 가능한 생체 직교성 관능기의 조합으로서는, 예를 들면, 티올 잔기와 말레이미드 잔기의 조합, 푸란 잔기와 말레이미드 잔기의 조합, 티올 잔기와 할로카보닐 잔기의 조합(치환 반응에 의해 할로겐이 티올로 치환된다), 알킨 잔기(바람직하게는, 상기한 바와 같은 치환기에 의해 치환되어 있어도 좋은, 탄소 원자 사이 3중 결합을 갖는 환기)와 아지드 잔기의 조합, 테트라진 잔기와 알켄 잔기의 조합, 테트라진 잔기와 알킨 잔기의 조합, 티올 잔기와 다른 티올 잔기의 조합(디설파이드 결합)을 들 수 있다. 따라서, 상기 부분은, 티올 잔기와 말레이미드 잔기의 반응에 의해 생성되는 기, 푸란 잔기와 말레이미드 잔기의 반응에 의해 생성되는 기, 티올 잔기와 할로카보닐 잔기의 반응에 의해 생성되는 기, 알킨 잔기와 아지드 잔기의 반응에 의해 생성되는 기 또는 테트라진 잔기와 알켄 잔기의 반응에 의해 생성되는 기, 티올 잔기와 다른 티올 잔기의 조합에 의해 생성되는 디설파이드기라도 좋다. 서로 반응 가능한 생체 직교성 관능기의 조합으로서는, 예를 들면, 알킨 잔기(바람직하게는, 상기한 바와 같은 치환기에 의해 치환되어 있어도 좋은, 탄소 원자 사이 3중 결합을 갖는 환기)와 아지드의 조합, 티올과 말레이미드의 조합, 테트라진과 아지드의 조합, 푸란과 말레이미드의 조합을 들 수 있다. 바람직하게는, 서로 반응 가능한 생체 직교성 관능기의 조합은, 알킨 잔기(바람직하게는, 상기한 바와 같은 치환기에 의해 치환되어 있어도 좋은, 탄소 원자 사이 3중 결합을 갖는 환기)와 아지드의 조합이라도 좋다. 서로 반응 가능한 2개의 생체 직교성 관능기로서 알킨 잔기와 아지드의 조합이 사용되는 경우, R'는 2가 트리아졸환기이다. 서로 반응 가능한 2개의 생체 직교성 관능기로서 탄소 원자 사이 3중 결합을 갖는 환기와 아지드의 조합이 사용되는 경우, R'는 상기 환기와 트리아졸환이 축합된 2가 환기이다. 탄소 원자 사이 3중 결합을 갖는 환기는 상기한 바와 같은 치환기에 의해 치환되어 있어도 좋으므로, 상기 환기와 트리아졸환이 축합된 2가 환기도 또한, 상기한 바와 같은 치환기에 의해 치환되어 있어도 좋다.
특정 실시형태에서는, 서로 반응 가능한 2개의 생체 직교성 관능기 간의 반응에 의해 생성되는 기는, 하기 구조식 중 어느 하나의 구조 방식으로 표시되는 2가 기라도 좋다.
[여기서, 흰 원 및 검은 원은 결합손을 나타낸다. 흰 원의 결합손이 Ab 결합부측에 존재하는 원자에 결합하고 있는 경우, 검은 원의 결합손이 Z에 결합하고 있어도 좋고, 흰 원의 결합손이 Z에 결합하고 있는 경우, 검은 원의 결합손이 Ab 결합부측에 존재하는 원자에 결합하고 있어도 좋다]
화학식 (I")에서 Q로 표시되는 아릴렌으로서는, 예를 들면, 페닐렌, 나프틸렌, 안트라세닐렌을 들 수 있고, 페닐렌, 나프틸렌이 바람직하고, 페닐렌이 바람직하다. 화학식 (I")에서 Q로 표시되는 알킬렌으로서는, 예를 들면, 직쇄 또는 분기쇄 알킬렌을 들 수 있고, 직쇄 알킬렌이 바람직하다. 직쇄 알킬렌으로서는, 탄소 원자수 1 내지 6의 직쇄 알킬렌이 바람직하고, 탄소 원자수 1 내지 4의 직쇄 알킬렌이 보다 바람직하다.
화학식 (I")에서 Y로 표시되는 2가 기 및 Z로 표시되는 기능성 물질은 상기한 것과 동일하다.
특정 실시형태에서는, 화학식 (I")에서 Y로 표시되는 2가 기는, -(O-R5)m1-를 포함하는 주쇄 구조를 갖는 기라도 좋다. R5 및 m1은 상기한 것과 동일하다.
다른 실시형태에서는, 본 발명의 콘쥬게이트는 하기 화학식 (II")로 표시되는, 항체 및 기능성 물질의 콘쥬게이트이다.
[화학식 (II")]
(식 중,
Ab는 항체이고,
S는 황 원자이고,
Y는 결합손 또는 2가 기이고,
R'는 서로 반응 가능한 2개의 생체 직교성 관능기 간의 반응에 의해 생성되는 기이고,
Z는 기능성 물질이고,
n은 1 내지 8의 정수이다)
화학식 (II")에서 Ab로 표시되는 항체 및 항체와 이에 인접하는 황 원자(S)의 관계, n으로 표시되는 정수, Y로 표시되는 2가 기, R'로 표시되는, 서로 반응 가능한 2개의 생체 직교성 관능기 간의 반응에 의해 생성되는 기 및 Z로 표시되는 기능성 물질은 상기한 것과 동일하다.
또 다른 실시형태에서는, 본 발명의 콘쥬게이트는 하기 화학식 (III")로 표시되는, 항체 및 기능성 물질의 콘쥬게이트이다.
[화학식 (III")]
(식 중,
Ab는 항체이고,
S는 황 원자이고,
Y는 결합손 또는 2가 기이고,
R'는 서로 반응 가능한 2개의 생체 직교성 관능기 간의 반응에 의해 생성되는 기이고,
Z는 기능성 물질이고,
n은 1 내지 8의 정수이다)
화학식 (III")에서 Ab로 표시되는 항체 및 항체와 이에 인접하는 황 원자(S)의 관계, n으로 표시되는 정수, Y로 표시되는 2가 기, R'로 표시되는, 서로 반응 가능한 2개의 생체 직교성 관능기 간의 반응에 의해 생성되는 기 및 Z로 표시되는 기능성 물질은 상기한 것과 동일하다.
또 다른 실시형태에서는, 본 발명의 콘쥬게이트는 하기 화학식 (IV")로 표시되는, 항체 및 기능성 물질의 콘쥬게이트이다.
[화학식 (IV")]
(식 중,
Ab는 항체이고,
S는 황 원자이고,
Y는 결합손 또는 2가 기이고,
R'는 서로 반응 가능한 2개의 생체 직교성 관능기 간의 반응에 의해 생성되는 기이고,
Z는 기능성 물질이고,
n은 1 내지 8의 정수이다)
화학식 (IV")에서 Ab로 표시되는 항체 및 항체와 이에 인접하는 황 원자(S)의 관계, n으로 표시되는 정수, Y로 표시되는 2가 기, R'로 표시되는, 서로 반응 가능한 2개의 생체 직교성 관능기 간의 반응에 의해 생성되는 기 및 Z로 표시되는 기능성 물질은 상기한 것과 동일하다.
보다 구체적으로는, 화학식 (I") 내지 (IV")로 표시되는 콘쥬게이트는 하기 화학식 (1") 내지 (12")로 표시되는 콘쥬게이트라도 좋다.
(식 중,
k는 0 또는 1의 정수이고,
m은 1 내지 5의 정수(바람직하게는 1 내지 3의 정수)이고,
m'는 1 내지 5의 정수(바람직하게는 1 내지 3의 정수)이고,
R2 및 R3은 각각 독립적으로, 수소 원자 또는 메틸이고,
R6'는, 서로 반응 가능한 2개의 생체 직교성 관능기 간의 반응에 의해 생성되는 기이고,
Z'는 기능성 물질이고,
Ab, Ab에 인접하는 S, Q, R', Z 및 n은 상기한 것과 동일하다)
본 발명의 콘쥬게이트 또는 이의 염의 응집률은 10% 이하라도 좋다. 본 발명에서 사용되는 항체 중간체 또는 이의 염은 응집률이 5% 이하이고, 본 발명의 콘쥬게이트 또는 이의 염은, 이러한 항체 중간체 또는 이의 염을, 단백질의 변성·분해(예, 아미드 결합의 절단)를 일으킬 수 없는 조건(온화한 조건) 하의 반응에 가함으로써 얻을 수 있고, 항체의 응집을 일으키기 어렵기 때문이다. 응집률은 바람직하게는 9% 이하, 보다 바람직하게는 8.5% 이하, 보다 더 바람직하게는 8.0% 이하, 특히 바람직하게는 7.5% 이하, 7.0% 이하, 6.5% 이하, 6.0% 이하, 5.5% 이하, 5% 이하, 4.8% 이하, 4.6% 이하, 4.4% 이하, 4.2% 이하, 4.0% 이하, 3.8% 이하, 3.6% 이하 또는 3.4% 이하라도 좋다. 항체의 응집률은 사이즈 배제 크로마토그래피(SEC)-HPLC에 의해 측정할 수 있다(실시예 및 ACS Omega 2020, 5, 7193-7200을 참조).
본 발명의 콘쥬게이트 또는 이의 염은 또한, 높은 혈중 안정성을 가질 수 있다.
본 발명의 콘쥬게이트 또는 이의 염은, 본 발명의 항체 중간체 또는 이의 염을 기능성 물질과 반응시킴으로써 얻을 수 있다. 이러한 반응은, 단백질(면역 글로불린/항체)의 변성·분해(예, 아미드 결합의 절단)를 일으킬 수 없는 조건(상기한 바와 같은 온화한 조건) 하에서 행할 수 있다. 반응에 있어서, 항체 중간체 또는 이의 염에 대한 기능성 물질의 몰 비율(기능성 물질/항체 중간체 또는 이의 염)은, 항체 중간체 또는 이의 염 및 기능성 물질의 종류 및 반응 시간 등의 인자에 따라서 변동되므로 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 2 이상, 바람직하게는 3 이상, 보다 바람직하게는 5 이상이다. 항체 중간체의 티올기에 대하여 기능성 물질을 짧은 반응 시간으로 충분히 반응시키기 위해서는, 항체 중간체 또는 이의 염에 대한 충분한 양(예, 과잉량)의 기능성 물질을 사용할 수 있다.
콘쥬게이트 또는 이의 염의 생성의 확인은, 이의 구체적인 원료 및 생성물의 분자량에도 의하지만, 예를 들면, 환원 조건 하의 역상 HPLC 또는 질량 분석에 의해 행할 수 있다. 콘쥬게이트 또는 이의 염은 크로마토그래피(예, 어피니티 크로마토그래피) 등의 임의의 방법에 의해 적절하게 정제할 수 있다.
본 발명의 콘쥬게이트 또는 이의 염은, 예를 들면, 의약 또는 시약(예, 진단 약, 연구용 시약)으로서 사용할 수 있다.
본 발명의 콘쥬게이트 또는 이의 염은, 의약 조성물 형태로 제공되어도 좋다. 이러한 의약 조성물은, 본 발명의 콘쥬게이트 또는 이의 염에 더하여, 의약상 허용될 수 있는 담체를 포함하고 있어도 좋다. 의약상 허용될 수 있는 담체로서는, 예를 들면, 수크로오스, 전분, 만니톨, 소르비톨, 락토오스, 글루코오스, 셀룰로오스, 탈크, 인산 칼슘, 탄산 칼슘 등의 부형제, 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 하이드록시프로필셀룰로오스, 폴리프로필피롤리돈, 젤라틴, 아라비아 고무, 폴리에틸렌 글리콜, 수크로오스, 전분 등의 결합제, 전분, 카복시메틸셀룰로오스, 하이드록시프로필 스타치, 탄산수소나트륨, 인산 칼슘, 시트르산 칼슘 등의 붕괴제, 스테아르산 마그네슘, 에어로질, 탈크, 라우릴 황산나트륨 등의 활제, 시트르산, 멘톨, 글리실리신·암모늄염, 글리신, 오렌지분 등의 방향제, 벤조산나트륨, 아황산 수소 나트륨, 메틸파라벤, 프로필파라벤 등의 보존제, 시트르산, 시트르산나트륨, 아세트산 등의 안정제, 메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 스테아르산알루미늄 등의 현탁제, 계면활성제 등의 분산제, 물, 생리 식염수, 오렌지 쥬스 등의 희석제, 카카오 기름, 폴리에틸렌 글리콜, 백등유 등의 베이스 왁스 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 콘쥬게이트 또는 이의 염은 또한, 안정성을 실현하는 임의의 수식(예, PEG화)을 갖고 있어도 좋다.
경구 투여에 적합한 제제는, 물, 생리 식염수, 오렌지 쥬스와 같은 희석액에 유효량의 리간드를 용해시킨 액제, 유효량의 리간드를 고체나 과립으로서 포함하고 있는 캡슐제, 사쉐제 또는 정제, 적당한 분산매 중에 유효량의 유효 성분을 현탁시킨 현탁액제, 유효량의 유효 성분을 용해시킨 용액을 적당한 분산매 중에 분산시키고 유화시킨 유제 등이다.
의약 조성물은, 비경구적인 투여(예, 정맥내 주사, 피하 주사, 근육 주사, 국소 주입, 복강내 투여)에 적합하다. 이러한 비경구적인 투여에 적합한 의약 조성물로서는, 수성 및 비수성의 등장인 무균 주사액제가 있고, 여기에는 항산화제, 완충액, 제균제, 등장화제 등이 포함되어 있어도 좋다. 또한, 수성 및 비수성의 무균 현탁액제를 들 수 있고, 여기에는 현탁제, 가용화제, 증점제, 안정화제, 방부제 등이 포함되어 있어도 좋다.
의약 조성물의 투여량은, 유효 성분의 종류·활성, 병의 중증도, 투여 대상이 되는 동물종, 투여 대상의 약물 수용성, 체중, 연령 등에 따라 다르지만, 적절하게 설정할 수 있다.
실시예
다음에 실시예를 나타내어 본 발명을 더욱 상세히 설명하지만, 본 발명은 이하의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
비교예 1: N-(4-azidophenyl)-2-iodo-acetamide에 의한 아지드기의 도입
이후의 비교예 및 실시예에서는, 티올기 도입 항체로서, 국제공개 제2019/240287호(WO2019/240287A1)의 실시예 81-7에 기재되는 항체 유도체(티올기 도입 트라스투주맙)을 사용하였다. 상기 항체 유도체는, 항체 중쇄의 246위치 또는 248위치의 라이신 잔기의 측쇄의 아미노기를 통해서, 트라스투주맙(인간화 IgG1 항체)에 티올기가 위치 선택적으로 도입되어 있는 하기 구조를 갖는다(라이신 잔기의 위치는 EU numbering에 따른다).
(상기 구조에 있어서, 항체 중쇄로부터 뻗어 있는 NH-CH2-CH2-CH2-CH2-는 라이신 잔기의 측쇄에 대응하고, 상기 라이신 잔기의 측쇄 중의 아미노기에 대하여 티올 함유기인 HS-CH2-CH2-C(=O)가 부가되어 있다)
티올기 도입 항체의 buffer(pH 8.0의 HEPES 버퍼 용액(50μM)에 20등량의 N-(4-azidophenyl)-2-iodo-acetamide의 DMF 용액(12.5mM) 및 50등량의 요오드화 나트륨의 버퍼(pH 8.0의 HEPES 버퍼) 용액(100mM)을 첨가하고, 37℃에서 2시간 정치 후, NAP-5 Columns(GE 헬스케어사 제조)를 사용하여 정제하였다.
생성물에 트리스(2-카복시에틸)포스핀염산염 용액(0.5mM)을 첨가하여 실온에서 10분 교반하고, 이미 공개된 공보(WO2019/240287A1)에 따라서 ESI-TOFMS에 의해 질량을 측정하였다. 원료의 티올기 도입 항체는 50683, 50845에 중쇄 피크, 23439에 경쇄 피크가 관측되고, 생성물은 중쇄에 아지드기가 도입된 50831, 50993 및 원료와 같은 50683, 50845에 중쇄 피크 및 23439에 경쇄 피크가 관측되었다.
비교예 2: N[2[2-(2-Azidoethoxy)ethoxy]ethyl]-2-iodoaacetamide에 의한 아지드기의 도입
티올기 도입 항체의 buffer(pH 8.0의 HEPES 버퍼) 용액(50μM)에 50등량의 N-[2-[2-(2-Azidoethoxy)ethoxy]ethyl]-2-iodoacetamide의 DMF 용액(31.3mM) 및 50등량의 요오드화 나트륨의 버퍼(pH 8.0의 HEPES 버퍼) 용액(100mM)을 첨가하고, 37℃에서 2시간 정치 후, NAP-5 Columns(GE 헬스케어사 제조)를 사용하여 정제하였다.
생성물에 트리스(2-카복시에틸)포스핀염산염 용액(0.5mM)을 첨가하여 실온에서 10분 교반하고, 이미 공개된 공보(WO2019/240287A1)에 따라서 ESI-TOFMS에 의해 질량을 측정하였다. 원료의 티올기 도입 항체는 50683, 50845에 중쇄 피크, 23439에 경쇄 피크가 관측되고, 생성물은 중쇄에 아지드기가 도입된 50896, 51058 및 원료와 같은 50683, 50845에 중쇄 피크 및 23439에 경쇄 피크가 관측되었다.
실시예 1: 아지드 링커 (1)에 의한 아지드기의 도입
티올기 도입 항체의 buffer(pH 7.4 PBS 버퍼, 10mM EDTA) 용액(20μM)에 아지드 링커 (1, Aldrich사 제조)의 DMF 용액(1.25mM)을 5등량 첨가하고, 실온에서 1시간 정치 후, NAP-5 Columns(GE 헬스케어사 제조)를 사용하여 정제하였다.
생성물에 트리스(2-카복시에틸)포스핀염산염 용액(0.5mM)을 첨가하여 실온에서 10분 교반하고, 이미 공개된 공보(WO2019/240287A1)에 따라서 ESI-TOFMS에 의해 질량을 측정하였다. 원료의 티올기 도입 항체는 50683, 50845에 중쇄 피크, 23439에 경쇄 피크가 관측되고, 생성물은 중쇄에 아지드기가 도입된 50816, 50978 및 원료와 동일한 23439에 경쇄 피크가 관측되었다.
실시예 2: 아지드 링커 (2)에 의한 아지드기의 도입
(1) 아지드 링커 (2)의 합성
(1-1) 5-azidopentanehydrazide의 합성
5-azidopentanoic acid(200mg, 1.4mmol)의 THF 용액(10mL)을 0℃로 냉각하고, N-메틸모르폴린(0.32mL, 2.1mmol) 및 클로로포름산 이소부틸(0.22mL, 1.7mmol)을 첨가하였다. 0℃에서 30분간 교반한 후, 하이드라진-수화물(0.087mL, 2.8mmmol) 및 DIPEA(0.71mL, 4.2mmol)를 첨가하였다. 실온에서 16시간 교반한 후, 감압 하 농축을 행하고, 얻어진 조생성물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 생성물이 포함되는 유분(fraction)을 회수하고, 감압 하 농축함으로써, 5-(4-azidobutyl)-1,3,4-oxadiazole-2-thiol을 얻었다(111mg, 0.71mmol, 수율 51%).
MS(ESI) m/z: 158 [M＋H]
(1-2) 5-(4-azidobutyl)-1,3,4-oxadiazole-2-thiol의 합성
5-azidopentanehydrazide(111mg, 0.71mmol)의 에탄올 용액(7.1mL)에 이황화탄소(0.055mL, 0.92mmol) 및 수산화칼륨(192mg, 3.4mmol)을 첨가하고, 70도에서 16시간 교반한 후, 6M 염산 수용액을 첨가하여, 계 내의 pH를 3.0으로 조정하였다. 조정 후, 아세트산 에틸에 의한 분액 추출을 행하고, 유기상을 감압 하 농축함으로써 얻어진 조생성물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 생성물이 포함되는 유분을 회수하고, 감압 하 농축함으로써, 5-(4-azidobutyl)-1,3,4-oxadiazole-2-thiol을 얻었다(35mg, 0.18mmol, 수율 25%).
MS(ESI) m/z: 200［M＋H]
(1-3) 2-(4-azidobutyl)-5-methylsulfanyl-1,3,4-oxadiazole의 합성
5-(4-azidobutyl)-1,3,4-oxadiazole-2-thiol(35mg, 0.18mmol)의 THF 용액(1.8mL)에 요오도메탄(0.033mL, 0.53mmol) 및 트리에틸아민(0.074mL, 0.53mmol)을 첨가하고, 실온에서 16시간 교반하였다. 반응액을 감압 하 농축함으로써 얻어진 조생성물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 생성물이 포함되는 유분을 회수하고, 감압 하 농축함으로써, 2-(4-azidobutyl)-5-methylsulfanyl-1,3,4-oxadiazole을 얻었다(33mg, 0.15mmol, 수율 85%).
MS(ESI) m/z: 214 [M＋H]
(1-4) 아지드 링커 (2)의 합성
2-(4-azidobutyl)-5-methylsulfanyl-1,3,4-oxadiazole(33mg, 0.15mmol)의 디클로로메탄 용액(1.5mL)을 0℃로 냉각하고, mCPBA(0.311g, 1.3mmol)를 첨가하였다. 실온에서 20시간 교반한 후, 포화 탄산수소나트륨 수용액을 첨가하고, 아세트산 에틸에 의한 분액 추출을 행하였다. 유기층을 감압 하 농축함으로써 얻어진 조생성물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 생성물이 포함되는 유분을 회수하고, 감압 하 농축함으로써, 아지드 링커 (2)를 얻었다(26mg, 0.11mmol, 수율 71%).
MS(ESI) m/z: 246［M＋H]
(2) 아지드 링커 (2)에 의한 아지드기의 도입
티올기 도입 항체의 buffer(pH 7.4 PBS 버퍼, 10mM EDTA) 용액(20μM)에 아지드 링커 (2)의 DMF 용액(1.25mM)을 5등량 첨가하고, 실온에서 1시간 정치 후, NAP-5 Columns(GE 헬스케어사 제조)를 사용하여 정제하였다.
생성물에 트리스(2-카복시에틸)포스핀염산염 용액(0.5mM)을 첨가하여 실온에서 10분 교반하고, 이미 공개된 공보(WO2019/240287A1)에 따라서 ESI-TOFMS에 의해 질량을 측정하였다. 원료의 티올기 도입 항체는 50683, 50845에 중쇄 피크, 23439에 경쇄 피크가 관측되고, 생성물은 중쇄에 아지드기가 도입된 50846, 51008 및 원료와 같은 23439에 경쇄 피크가 관측되었다.
실시예 3: 아지드 링커 (3)에 의한 아지드기의 도입
(1) 아지드 링커 (3)의 합성
(1-1) 2-(4-azidophenyl)-5-methylsulfanyl-1,3,4-oxadiazole의 합성
4-(5-methylsulfanyl-1,3,4-oxadiazol-2-yl)aniline의 트리플루오로아세트산염(48mg, 0.15mmol)의 디클로로메탄 용액(3.0mL)에 2-아지드-1,3-디메틸이미다 졸리늄헥사플루오로포스페이트(137mg, 0.48mmol) 및 DMAP(86mg, 0.70mmol)을 첨가하고, 50℃에서 16시간 교반하였다. 반응액을 감압 하 농축함으로써 얻어진 조생성물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 생성물이 포함되는 유분을 회수하고, 감압 하 농축함으로써, 2-(4-azidophenyl)-5-methylsulfanyl-1,3,4-oxadiazole을 얻었다(26mg, 0.11mmol, 수율 73%).
MS(ESI) m/z: 234 [M＋H]
(1-2) 아지드 링커 (3)의 합성
2-(4-azidophenyl)-5-methylsulfanyl-1,3,4-oxadiazole(26mg, 0.11mmol)의 디클로로메탄 용액(1.1mL)을 0℃로 냉각하고, mCPBA(113mg, 0.45mmol)를 첨가하였다. 실온에서 20시간 교반한 후, 포화 탄산수소나트륨 수용액을 첨가하고, 아세트산 에틸에 의한 분액 추출을 행하였다. 유기층을 감압 하 농축함으로써 얻어진 조생성물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 생성물이 포함되는 유분을 회수하고, 감압 하 농축함으로써, 아지드 링커 (3)를 얻었다(23mg, 0.086mmol, 수율 78%).
MS(ESI) m/z: 266 [M＋H]
(2) 아지드 링커 (3)에 의한 아지드기의 도입
실시예 2(2)에 기재된 수법과 동일한 방법으로 티올기 도입 항체에 아지드 링커 (3)을 반응시켰다.
생성물에 트리스(2-카복시에틸)포스핀염산염 용액(0.5mM)을 첨가하여 실온에서 10분 교반하고, 이미 공개된 공보(WO2019/240287A1)에 따라서 ESI-TOFMS에 의해 질량을 측정하였다. 원료의 티올기 도입 항체는 50683, 50845에 중쇄 피크, 23439에 경쇄 피크가 관측되고, 생성물은 중쇄에 아지드기가 도입된 50841, 51002 및 원료와 동일한 23439에 경쇄 피크가 관측되었다.
실시예 4: 아지드 링커 (4)에 의한 아지드기의 도입
(1) 아지드 링커 (4)의 합성
(1-1) tert-butyl N-[4-(hydrazinecarbonyl)phenyl]carbamate의 합성
4-(tert-butoxycarbonylamino)benzoic acid(200mg, 0.84mmol)의 THF 용액(8.4mL)을 0℃로 냉각하고, N-메틸모르폴린(0.14mL, 1.3mmol) 및 클로로포름산 이소부틸(0.13mL, 1.0mmol)을 첨가하였다. 0℃에서 30분간 교반한 후, 하이드라진-수화물(0.078mL, 2.5mmmol) 및 DIPEA(0.30mL, 1.7mmol)를 첨가하였다. 실온에서 16시간 교반한 후, 감압 하 농축을 행하고, 얻어진 조생성물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 생성물이 포함되는 유분을 회수하고, 감압 하 농축함으로써, tert-butyl N-[4-(hydrazinecarbonyl)phenyl]carbamate를 얻었다(187mg, 0.74mmol, 수율 88%).
MS(ESI) m/z: 252［M＋H]
(1-2) tert-butyl N-[4-(5-sulfanyl-1,3,4-oxadiazol-2-yl)phenyl]carbamate의 합성
tert-butyl N-[4-(hydrazinecarbonyl)phenyl]carbamate(187mg, 0.74mmol)의 에탄올 용액(7.4mL)에 이황화탄소(0.058mL, 0.97mmol) 및 수산화칼륨(125mg, 2.2mmol)을 첨가하고, 75℃에서 16시간 교반한 후, 6M 염산 수용액을 첨가하고, 계 내의 pH를 3.0으로 조정하였다. 조정 후, 아세트산 에틸에 의해 분액 추출을 행하고, 유기상을 감압 하 농축함으로써 얻어진 조생성물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 생성물이 포함되는 유분을 회수하고, 감압 하 농축함으로써, tert-butyl N-[4-(5-sulfanyl-1,3,4-oxadiazol-2-yl)phenyl]carbamate를 얻었다(99mg, 0.34mmol, 수율 45%).
MS(ESI) m/z: 294［M＋H]
(1-3)tert-butyl N-[4-(5-methylsulfanyl-1,3,4-oxadiazol-2-yl)phenyl]carbamate의 합성
tert-butyl N-[4-(5-sulfanyl-1,3,4-oxadiazol-2-yl)phenyl]carbamate(99mg, 0.34mmol)의 THF 용액(3.4mL)을 0℃로 냉각하고, 요오도메탄(0.063mL, 1.0mmol) 및 트리에틸아민(0.14mL, 1.0mmol)을 첨가하여 실온에서 3시간 교반하였다. 반응액을 감압 하 농축함으로써 얻어진 조생성물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 생성물이 포함되는 유분을 회수하고, 감압 하 농축함으로써, tert-butyl N-[4-(5-methylsulfanyl-1,3,4-oxadiazol-2-yl)phenyl]carbamate를 얻었다(88mg, 0.29mmol, 수율 84%).
MS(ESI) m/z: 308［M＋H]
(1-4) 4-(5-methylsulfanyl-1,3,4-oxadiazol-2-yl)aniline의 합성
tert-butyl N-[4-(5-methylsulfanyl-1,3,4-oxadiazol-2-yl)phenyl]carbamate
(88mg, 0.29mmol)의 디클로로메탄 용액(2.9mL)에 트리플루오로아세트산(2.9mL)을 첨가하여 실온에서 1시간 교반하였다. 반응액을 감압 하 농축함으로써 4-(5-methylsulfanyl-1,3,4-oxadiazol-2-yl)aniline의 트리플루오로아세트산염을 얻었다(93mg, 0.29mmol, 수율 100%).
(1-5) 2-[2-[2-(2-azidoethoxy)ethoxy]ethoxy]-N-[4-(5-methylsulfanyl-1,3,4-oxadiazol-2-yl)phenyl]acetamide의 합성
4-(5-methylsulfanyl-1,3,4-oxadiazol-2-yl)aniline의 트리플루오로아세트산염(57mg, 0.18mmol)의 디클로로메탄 용액(1.8mL)에 2-[2-[2-(2-azidoethoxy)ethoxy]ethoxy]acetic acid(102mg, 0.43mmol), EDCI(115mg, 0.60mmol), DMAP(9.4mg, 0.077mmol)및 트리에틸아민(0.114mL, 0.82mmol)을 첨가하였다. 실온에서 2시간 교반한 후, 반응액을 감압 하 농축함으로써 얻어진 조생성물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 생성물이 포함되는 유분을 회수하고, 감압 하 농축함으로써, 2-[2-[2-(2-azidoethoxy)ethoxy]ethoxy]-N-[4-(5-methylsulfanyl-1,3,4-oxadiazol-2-yl)phenyl]acetamide를 얻었다(73mg, 0.17mmol, 수율 94%).
MS(ESI) m/z: 423［M＋H]
(1-6) 아지드 링커 (4)의 합성
2-[2-[2-(2-azidoethoxy)ethoxy]ethoxy]-N-[4-(5-methylsulfanyl-1,3,4-oxadiazol-2-yl)phenyl]acetamide(73mg, 0.17mmol)의 디클로로메탄 용액(1.7mL)을 0℃로 냉각하고, mCPBA(185mg, 0.75mmol)를 첨가하였다. 실온에서 20시간 교반한 후, 포화 탄산수소나트륨 수용액을 첨가하고, 아세트산 에틸에 의한 분액 추출을 행하였다. 유기층을 감압 하 농축함으로써 얻어진 조생성물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 생성물이 포함되는 유분을 회수하고, 감압 하 농축함으로써, 아지드 링커 (4)를 얻었다(1.2mg, 0.0026mmol, 수율 1.8%).
MS(ESI) m/z: 455［M＋H]
(2) 아지드 링커 (4)에 의한 아지드기의 도입
실시예 2(2)에 기재된 수법과 동일한 방법으로 티올기 도입 항체에 아지드 링커 (4)를 반응시켰다.
생성물에 트리스(2-카복시에틸)포스핀염산염 용액(0.5mM)을 첨가하여 실온에서 10분 교반하고, 이미 공개된 공보(WO2019/240287A1)에 따라서 ESI-TOFMS에 의해 질량을 측정하였다. 원료의 티올기 도입 항체는 50683, 50845에 중쇄 피크, 23439에 경쇄 피크가 관측되고, 생성물은 중쇄에 아지드기가 도입된 51057, 51219 및 원료와 같은 23439에 경쇄 피크가 관측되었다.
실시예 5: 아지드 링커 (5)에 의한 아지드기의 도입
(1) 아지드 링커 (5)의 합성
(1-1) 4-(5-sulfanyl-1,3,4-oxadiazol-2-yl)benzoic acid의 합성
4-tert-butoxycarbonylbenzoic acid(307.0mg, 1.38mmol)의 디클로로메탄 용액(10mL)에 하이드라진-수화물(0.0558mL, 1.79mmmol), EDCI(411.1mg, 2.14mmol), DMAP(18.1mg, 0.14mmol) 및 트리에틸아민(0.462mL, 3.34mmol)을 첨가하였다. 실온에서 16시간 교반한 후, 감압 하 농축을 행하고, 얻어진 조생성물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 tert-butyl 4-(hydrazinecarbonyl)benzoate의 혼합물을 얻었다.
얻어진 혼합물의 에탄올 용액(10mL)에 이황화탄소(0.0471mL, 0.78mmol) 및 수산화칼륨(103.7mg, 1.80mmol)을 첨가하고, 70℃에서 16시간 교반한 후, 6M 염산 수용액을 첨가하여, 계 내의 pH를 3.0으로 조정하였다. 조정 후, 아세트산 에틸에 의한 분액 추출을 행하고, 유기상을 감압 하 농축함으로써 얻어진 조생성물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 생성물이 포함되는 유분을 회수하고, 감압 하 농축함으로써, 4-(5-sulfanyl-1,3,4-oxadiazol-2-yl)benzoic acid를 얻었다(72.9mg, 0.33mmol, 2공정 수율 24%).
MS(ESI) m/z: 223［M＋H]
(1-2) 4-(5-methylsulfanyl-1,3,4-oxadiazol-2-yl)benzoic acid의 합성
4-(5-sulfanyl-1,3,4-oxadiazol-2-yl)benzoic acid(72.9mg, 0.33mmol)의 THF 용액(3.3mL)을 0℃로 냉각하고, 요오도메탄(0.616mL, 0.99mmol) 및 트리에틸아민(0.228mL, 1.60mmol)을 첨가하고, 실온에서 3시간 교반하였다. 반응액을 감압 하 농축함으로써 얻어진 조생성물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 생성물이 포함되는 유분을 회수하고, 감압 하 농축함으로써, 4-(5-methylsulfanyl-1,3,4-oxadiazol-2-yl)benzoic acid를 얻었다(66.2mg, 0.28mmol, 수율 88%).
MS(ESI) m/z: 237［M＋H]
(1-3) N-[2-[2-[2-[2-[(4-azidobenzoyl)amino]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethyl]-4-(5-methylsulfanyl-1,3,4-oxadiazol-2-yl)benzamide의 합성
4-(5-methylsulfanyl-1,3,4-oxadiazol-2-yl)benzoic acid(66.2mg, 0.28mmol)의 디클로로메탄 용액(2.8mL)에 N-[2-[2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]ethoxy]ethyl]-4-azido-benzamide(0.190mg, 0.42mmol), EDCI(88.5mg, 0.46mmol), DMAP(7.2mg, 0.059mmol) 및 트리에틸아민(0.116mL, 0.84mmol)을 첨가하였다. 실온에서 5시간 교반한 후, 반응액을 감압 하 농축함으로써 얻어진 조생성물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 생성물이 포함되는 유분을 회수하고, 감압 하 농축함으로써, N-[2-[2-[2-[2-[(4-azidobenzoyl)amino]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethyl]-4-(5-methylsulfanyl-1,3,4-oxadiazol-2-yl)benzamide를 얻었다(104mg, 0.19mmol, 수율 67%).
MS(ESI) m/z: 556［M＋H]
(1-4) 아지드 링커 (5)의 합성의 합성
N-[2-[2-[2-[2-[(4-azidobenzoyl)amino]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethyl]-4-(5-methylsulfanyl-1,3,4-oxadiazol-2-yl)benzamide(104mg, 0.19mmol)의 디클로로메탄 용액(1.9mL)을 0℃로 냉각하고, mCPBA(195.4mg, 0.79mmol)을 첨가하였다. 실온에서 20시간 교반한 후, 포화 탄산수소나트륨 수용액을 첨가하고, 아세트산 에틸에 의한 분액 추출을 행하였다. 유기층을 감압 하 농축함으로써 얻어진 조생성물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 생성물이 포함되는 유분을 회수하고, 감압 하 농축함으로써, 아지드 링커 (5)를 얻었다(84.8mg, 0.14mmol, 수율 76%).
MS(ESI) m/z: 588［M＋H]
(2) 아지드 링커 (5)에 의한 아지드기의 도입
실시예 2(2)에 기재된 수법과 동일한 방법으로 티올기 도입 항체에 아지드 링커 (5)를 반응시켰다.
생성물에 트리스(2-카복시에틸)포스핀염산염 용액(0.5mM)을 첨가하여 실온에서 10분 교반하고, 이미 공개된 공보(WO2019/240287A1)에 따라서 ESI-TOFMS에 의해 질량을 측정하였다. 원료의 티올기 도입 항체는 50683, 50845에 중쇄 피크, 23439에 경쇄 피크가 관측되고, 생성물은 중쇄에 아지드기가 도입된 51189, 51350 및 원료와 동일한 23439에 경쇄 피크가 관측되었다.
실시예 6: 아지드 링커 (6)에 의한 아지드기의 도입
(1) 아지드 링커 (6)의 합성
N-Succinimidyl 3-(2-Pyridyldithio)propionate(55.2mg, 0.177mmol)를 CH2Cl2(2.0mL)에 용해하고, 11-Azido-3,6,9-trioxaundecan-1-amine(35μL, 0.177mmol)을 첨가하여 실온에서 18시간 교반하였다. LC/MS로 반응을 확인 후, 0.05% 트리플루오로아세트산 수용액에 용해하고, 옥타도데실기 화학 결합형 실리카 겔을 충전제로 하는 역상 고속 액체 크로마토그래피에 가하고, 트리플루오로아세트산을 0.05% 함유하는 물과 아세토니트릴의 혼합 용액으로 용출하고, 각 유분을 LC-MS에 의해 확인하였다. 생성물이 포함되는 유분을 회수하고, 감압 하 농축함으로써 아세토니트릴을 제거한 후, 동결 건조를 행하여, 아지드 링커 (6)을(72.2mg, 0.173mmol) 얻었다.
1H NMR(400MHz, Chloroform-d) δ = 8.55(s, 1H), 7.78(s, 1H), 7.22(s, 1H), 6.73(s, 1H), 3.76-3.63(m, 10H), 3.60(dd, J = 5.6, 4.5, 2H), 3.49(q, J = 5.2, 2H), 3.41(t, J = 5.0, 2H), 3.13(tt, J = 7.0, 2.4, 2H), 2.66(td, J = 6.9, 2.2, 2H).
MS(ESI) m/z: z = 1 416［M＋H]+
(2) 아지드 링커 (6)에 의한 아지드기의 도입
실시예 2(2)에 기재된 수법과 동일한 방법으로 티올기 도입 항체에 아지드 링커 (6) 시약을 반응시켰다. 반응액을 20mM 아세트산 암모늄 버퍼로 치환하고, 이미 공개된 공보(Anal. Chem., 2019, 91, 20, 12724-12732)의 수법에 따라 ESI-TOFMS에 의해 질량을 측정한 바, 아지드기가 항체에 2개 도입된 149009의 피크가 확인되었다.
실시예 7: 아지드 링커 (7)에 의한 아지드기의 도입
(1) 아지드 링커 (7)의 합성
4-Methyl-4-(pyridin-2-yldisulfanyl)pentanoic acid(100.0mg, 0.39mmol)를 THF(3.0mL)에 용해하고, 11-Azido-3,6,9-trioxaundecan-1-amine(77μL, 0.39mmol), DCC(97.0mg, 0.47mmol), NHS(54.0g, 0.47mmol)를 첨가하여 실온에서 18시간 교반하였다. LC/MS에서 반응을 확인 후, 0.05% 트리플루오로아세트산 수용액에 용해하고, 옥타도데실기 화학 결합형 실리카 겔을 충전제로 하는 역상 고속 액체 크로마토그래피에 가하고, 트리플루오로아세트산을 0.05% 함유하는 물과 아세토니트릴의 혼합 용액으로 용출하고, 각 유분을 LC-MS에 의해 확인하였다. 생성물이 포함되는 유분을 회수하고, 감압 하 농축함으로써 아세토니트릴을 제거한 후, 동결 건조를 행하여, 아지드 링커 (7)을(39.9mg, 0.087mmol) 얻었다.
1H NMR(400MHz, Chloroform-d) δ = 8.52(d, J = 5.0, 1H), 7.81(d, J = 8.2, 1H), 7.72(t, J = 7.9, 1H), 7.17(t, J = 6.2, 1H), 6.15(s, 1H), 3.76-3.62(m, 10H), 3.57(dd, J = 5.6, 4.6, 2H), 3.44(dt, J = 15.2, 5.1, 4H), 2.42-2.27(m, 2H), 2.06-1.94(m, 2H), 1.33(s, 6H).
MS(ESI) m/z: z = 1 458［M＋H]+
(2) 아지드 링커 (7)에 의한 아지드기의 도입
실시예 2(2)에 기재된 수법과 동일한 방법으로 티올기 도입 항체에 아지드 링커 (7) 시약을 반응시킬 수 있다.
실시예 8: 알킨 링커 (8)에 의한 DBCO기의 도입
(1) 알킨 링커 (8)의 합성
3-Amino-1-(11,12-didehydrodibenz[b,f]azocin-5(6H)-yl)-1-propanone(20mg, 0.072mmol)의 디클로로메탄 용액(1mL)에 실온에서 디이소프로필카보디이미드(10.9mg, 0.087mmol) 및 브로모아세틸벤조산(21mg, 0.087mmol)을 첨가하였다. 실온에서 16시간 교반한 후, 감압 하 농축을 행하고, 얻어진 조생성물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 생성물이 포함되는 유분을 회수하고, 감압 하 농축함으로써, 알킨 링커 (8)을 얻었다(12.3mg, 0.25mmol, 수율 34%).
MS(ESI) m/z: 501［M＋H]
(2) 알킨 링커 (8)에 의한 DBCO기의 도입
실시예 2(2)에 기재된 수법과 동일한 방법으로 티올기 도입 항체에 알킨 링커 (7)을 반응시켰다. 생성물에 트리스(2-카복시에틸)포스핀염산염 용액(0.5mM)을 첨가하여 실온에서 10분 교반하고, 이미 공개된 공보(WO2019/240287A1)에 따라서 ESI-TOFMS에 의해 질량을 측정하였다. 원료의 티올기 도입 항체는 50683, 50845에 중쇄 피크, 23439에 경쇄 피크가 관측되고, 생성물은 중쇄에 아지드기가 도입된 51109, 51270 및 원료와 동일한 23439에 경쇄 피크가 관측되었다.
실시예 9: 알킨 링커 (9)에 의한 DBCO기의 도입
실시예 2(2)에 기재된 수법과 동일한 방법으로, 10당량의 상기 알킨 링커 (9, 도쿄 카세이 코교사 제조)를 반응시켰다. 생성물에 트리스(2-카복시에틸)포스핀염산염 용액(0.5mM)을 첨가하여 실온에서 10분 교반하고, 이미 공개된 공보(WO2019/240287A1)에 따라서 ESI-TOFMS에 의해 질량을 측정하였다. 원료의 티올기 도입 항체는 50683, 50845에 중쇄 피크, 23439에 경쇄 피크가 관측되고, 생성물은 중쇄에 아지드기가 도입된 51123, 51291 및 원료와 동일한 23439에 경쇄 피크가 관측되었다.
실시예 10: 알킨 링커 (10)에 의한 DBCO기의 도입
실시예 2(2)에 기재된 수법과 동일한 방법으로, 10당량의 상기 알킨 링커 (10)을 반응시켰다. 생성물에 트리스(2-카복시에틸)포스핀염산염 용액(0.5mM)을 첨가하여 실온에서 10분 교반하고, 이미 공개된 공보(WO2019/240287A1)에 따라서 ESI-TOFMS에 의해 질량을 측정하였다. 원료의 티올기 도입 항체는 50683, 50845에 중쇄 피크, 23439에 경쇄 피크가 관측되고, 생성물은 중쇄에 아지드기가 도입된 51371, 51532 및 원료와 동일한 23439에 경쇄 피크가 관측되었다.
실시예 11: 알킨 링커 (11)에 의한 DBCO기의 도입
(1) 알킨 링커 (11)의 합성
3-Amino-1-(11,12-didehydrodibenz[b,f]azocin-5(6H)-yl)-1-propanone(14mg, 0.051mmol)의 디클로로메탄 용액(1mL)에 실온에서 WSC(15mg, 0.079mmol), HOBT(15mg, 0.111mmol), 트리에틸아민(12μL, 0.162mmol), DMAP(0.5mg, 0.004mmol)및 3-피리딜디티오프로피온산(11mg, 0.050mmol)을 첨가하였다. 실온에서 3시간 교반한 후, 감압 하 농축을 행하고, 얻어진 조생성물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 생성물이 포함되는 유분을 회수하고, 감압 하 농축함으로써, 알킨 링커 (10)을 얻었다(4.2mg, 0.0096mmol, 수율 19%).
MS(ESI) m/z: 501［M＋H]
(2) 알킨 링커 (11)에 의한 DBCO기의 도입
실시예 2(2)에 기재된 수법과 동일한 방법으로 티올기 도입 항체에 상기 알킨 링커 (11)을 반응시켰다. 반응액을 20mM 아세트산 암모늄 버퍼로 치환하고, 이미 공개된 공보(Anal. Chem., 2019, 91, 20, 12724-12732)의 수법에 따라 ESI-TOFMS에 의해 질량을 측정한 바, 아지드기가 항체에 2개 도입된 149151의 피크가 확인되었다.
실시예 12: 생체 직교성 관능기 도입 항체 SEC HPLC에 의한 응집률의 측정
비교예 1, 2 및 실시예 1 내지 6, 8 내지 11에서 합성한 항체의 생체 직교성 관능기 도입 항체에 대하여, 이미 공개된 공보(ACS Omega 2020, 5, 7193-7200)에 따라, 각각의 응집률을 하기 조건으로 측정하였다.
측정 시스템: 1260 HPLC system(Agilent사 제조)
컬럼: Agilent사 제조 AdvanceBio SEC 300Å 2.7μm, 4.6mm×150mm
유속: 0.25mL/분
용리액: 100mM 인산이수소나트륨/인산수소나트륨, 250mM 염화나트륨 수용액(pH 6.8), 10%v/v 이소프로판올
검출기: UV(280nm)
그 결과, 실시예의 화합물을 사용하여 얻어진 생체 직교성 관능기 도입 항체의 응집률은 3.5% 미만이고, 비교예의 화합물을 사용하여 얻어진 생체 직교성 관능기 도입 항체의 응집률보다도 낮았다(표 1).
실시예 13: 환원 조건의 역상 HPLC에 의한 미반응된 중쇄의 비율의 측정
(1) 측정 샘플의 조제
생성물에 DL-디티오트레이롤 수용액(1M의 DL-디티오트레이톨 수용액을 8M 구아니딘 염산염 수용액에 첨가시킨 것)을 첨가하여, 80℃에서 10분 가열하였다.
(2) 역상 HPLC에 의한 분석
비교예 1, 2 및 실시예 1 내지 5 및 8, 9, 10에서 합성한 생체 직교성 관능기 도입 항체에 대하여, 이미 공개된 공보(Anal. Chem., 2019, 91, 20, 12724-12732)에 따라 역상 HPLC 분석을 행하였다. 측정은 하기 조건을 사용하여 행하였다.
측정 시스템: 1260 HPLC system(Agilent사 제조)
컬럼: Agilent사 제조 AdvanceBio RP-mAb Diphenyl 3.5μm, 2.1mm×100mm
그래디언트(Gradient): 용리액 A/B의 선형 그래디언트
유속: 0.4mL/분
용리액 A: 물, 0.1%v/v 트리플루오로아세트산
용리액 B: 아세토니트릴, 0.1%v/v 트리플루오로아세트산
검출기: UV(280nm)
반응의 중쇄의 비율은, (미반응된 중쇄의 피크 면적)/(항체의 전부의 중쇄의 피크 면적)에 의해 산출하였다.
상기 표 2의 결과로부터 실시예 1 내지 5 및 8, 9, 10에서 합성한 생체 직교성 관능기 도입 항체는 원료의 티올 도입 항체로부터의 변환율이 85%를 초과하고 있는 것이 밝혀졌다.
또한, 실시예 6 및 11과 같이 디설파이드 결합을 갖는 화합물은, 역상 HPLC측정의 전처리 공정에서 DTT에 의해 디설파이드 결합이 절단되고, 원료인 티올기 도입 항체로 변환되기 때문에, 본 수법에 따라서는 미반응된 중쇄 비율(%)을 결정할 수는 없다. 따라서, 실시예 6 및 11의 화합물에 대한 미반응된 중쇄 비율(%)의 결정은 다음의 실시예에서 행하였다.
실시예 14: ESI-TOFMS에 의한 미반응된 티올기 도입 항체의 비율의 측정
(1) 생체 직교성 관능기 도입 항체의 당쇄 절단
실시예 6, 11에서 합성한 생체 직교성 관능기 도입 항체를 PNGase F(New England BioLabs, 카탈로그 번호 P0704)를 사용하고, 제조자 프로토콜 및 이미 공개된 공보(WO2019240288A1)의 수법에 따라 당쇄 절단과 후처리를 행하였다. HIC-HPLC 분석을 행하였다.
(2) 당쇄 절단체의 ESI-TOFMS 분석 및 DAR calculator에 의한 미반응된 항체의 비율의 측정
(1)에서 얻어진 당쇄 절단체를 이미 공개된 공보(Anal. Chem., 2019, 91, 20, 12724-12732)의 수법에 따라 ESI-TOFMS에 의해 질량을 측정하였다. 얻어진 MS 데이터에 대하여, DAR calculator(Agilent사 소프트웨어)에 의해 DAR peak와 %Area로부터 산출된 미반응 항체의 비율을 표 3에 나타낸다.
미반응된 항체의 비율은 하기 수학식으로부터 산출하였다.
미반응된 항체의 비율(%) = (A ＋ B/2)/(A ＋ B ＋ C)
A: 원료의 티올 도입 항체(화합물 28)에 해당하는 질량수(mass number)의 피크 면적
B: 원료의 티올 도입 항체(화합물 28)에 생체 직교성 관능기가 하나 도입된 질량수에 해당하는 피크 면적
C: 원료의 티올 도입 항체(화합물 28)에 생체 직교성 관능기가 2개 도입된 질량수에 해당하는 피크 면적
상기 표 3의 결과로부터, 실시예 6 및 11의 화합물을 사용하는 항체 유도체의 합성에 있어서, 생체 직교성 관능기가 도입된 항체 유도체는, 원료의 티올 도입 항체로부터의 변환율이 90%를 초과하는 것이 밝혀졌다.
실시예 15: 생체 직교성 관능기 도입 항체와의 클릭 반응에 의한 ADC 및 ADC mimic의 합성
(1) 클릭 반응에 의한 ADC의 합성
이미 공개된 공보(WO2019/240287A1 및 WO2019/240288A1)에 따라서, 실시예 1 내지 6에서 얻어진 아지드 도입 트라스투주맙에 대하여, DBCO-VC-PAB-MMAE(ABZENA사 제조)의 DMF 용액(5mM)을 7당량 첨가하고, 실온에서 20시간 교반 후, NAP-5 Columns(GE 헬스케어사 제조)를 사용하고 정제하여 ADC를 얻었다.
(2) 클릭 반응에 의한 ADC mimic의 합성
이미 공개된 공보(WO2019/240287A1 및 WO2019/240288A1)에 따라서, 실시예 1 내지 6에서 얻어진 아지드 도입 트라스투주맙에 대하여, Carboxyrhodamine 110-PEG4-DBCO(Broadpharm사 제조)를 첨가하여, ADC mimic을 얻었다.
마찬가지로, 실시예 8 내지 11에서 얻어진 DBCO 도입 트라스투주맙에 대하여, Carboxyrhodamine 110-PEG3-azide(Broadpharm사 제조)를 첨가하여 ADC mimic을 얻었다.
실시예 (3) ADC 및 ADC mimic의 해석
실시예 13(1)에서 합성한 ADC 및 실시예 13(2)에서 합성한 ADC mimic의 ESI-TOFMS 분석은 이미 공개된 공보(WO2019/240287A1)에 따라 행하고, DAR은 2임을 확인하였다.
실시예 16: 래트 혈장을 사용한 안정성 시험에 의한 ADC mimic의 평가
실시예 15(2)에서 합성한 각종 ADC mimic의 혈중 안정성을 평가하였다. 구체적으로는, ADC mimic의 혈중 안정성은, 하기와 같이 래트 혈중에서 ADC mimic을 인큐베이션했을 때에 ADC mimic에서 탈락한 형광 분자의 양을 해석함으로써 평가하였다.
(1) 컨트롤 ADC mimic의 합성
이미 공개된 공보(WO2019/240287A1)에 기재된 하기 아지드 항체를 실시예 15(2)에 따라서 Carboxyrhodamine 110-PEG4-DBCO(Broadpharm사 제조)와 반응시켜 ADC mimic으로 이끌었다.
(2) 혈장 중 안정성 시험
래트 혈장(Charles River사 제조) 700μL에 대하여, 0.1mg/mL의 농도가 되도록 ADC mimic을 첨가한 후 멸균 여과를 행하였다. 상기 용액을 6개의 에펜 튜브에 50μL씩 분주하였다. 6개의 샘플 중 3개는 37℃로 설정한 인큐베이터에서 4일간 보관하였다. 나머지 3개는 -80℃의 냉동고 속에서 동일하게 4일간 보관하였다. 각 샘플에 아세토니트릴을 100uL씩 첨가하여 볼텍스로 교반한 후 원심 분리를 행함으로써 침전물을 얻었다. 발생한 상청 용액을 회수하고 HPLC 분석을 행하였다.
(3) HPLC 분석을 사용한, 탈락한 형광 분자의 양의 해석
측정은, 액체 크로마토그래피/형광 검출법을 사용하여, ADC mimic에서 탈락한 형광 분자량을 측정하였다. 실시예 16(1)에서 냉동고(-80℃) 보관(96시간)한 3개의 샘플을 Day = 0의 것으로 하고, 실시예 14(1)에서 37℃ 보관(96시간)한 3개의 샘플을 Day = 4의 것으로 하고, Day = 4와 Day = 0의 형광 강도의 차분을 해석하였다.
결과는 하기 표와 같이 평가하였다. 컨트롤로서, 실시예 16(1)에서 합성한 ADC mimic을 사용하여 실시예 화합물의 형광 강도를 비교함으로써, 상대 저하율의 비를, 하기 수학식 (A)를 사용하여 산출하였다.
실시예 ADC mimic에서 탈락한 형광 분자의 형광 강도의 상승량 = [(Day = 4의 형광 강도) - (Day = 0의 형광 강도)]
컨트롤 ADC mimic에서 탈락한 형광 분자의 형광 강도의 상승량 = [(Day = 4의 형광 강도) - (Day = 0의 형광 강도)]
상승량의 비 = 실시예 ADC mimic의 형광 강도의 상승량/컨트롤 ADC mimic의 형광 강도의 형광 강도의 상승량
그 결과, 실시예 15(1) 및 (2)에서 합성한 ADC mimic은 모두 실시예 16(1)에서 합성한 컨트롤보다 10배 이상 안정하였다.
실시예 17: 생체 직교성 관능기 도입 항체를 클릭 반응에 의한 항체-단백질 복합체의 합성
(1) 단백질로의 링커 도입
라이소자임(pH 7.4 PBS 버퍼 용액)에 대하여, N-Hydroxysuccinimidyl-4-azidobenzoate의 DMF 용액을 6당량 첨가하고, 실온에서 3시간 교반 후, NAP-5 Columns(GE 헬스케어사 제조)를 사용하여 정제하여, 아지드 도입 라이소자임을 얻었다. 이미 공개된 공보(Anal. Chem., 2019, 91, 20, 12724-12732)의 수법에 준하여 ESI-TOFMS에 의해 질량을 측정한 바, 아지드기가 라이소자임에 도입된 14450의 피크가 확인되었다.
또한, 소 혈청 알부민에 대하여, 동일한 수법으로 아지드기를 도입하였다. ESI-TOFMS에 의해 질량을 측정한 바, 아지드기가 소 혈청 알부민에 도입된 66579의 피크가 확인되었다.
(2) 클릭 반응에 의한 항체-단백질 복합체의 합성
이미 공개된 공보(WO2019/240287A1 및 WO2019/240288A1)에 따라서, 실시예 8에서 얻어진 알킨 도입 트라스투주맙에 대하여, 실시예 17(1)에서 합성한 아지드 도입 라이소자임을 첨가하여, 트라스투주맙-라이소자임 복합체를 얻었다. 이미 공개된 공보(Anal. Chem., 2019, 91, 20, 12724-12732)의 수법에 준하여 ESI-TOFMS에 의해 질량을 측정한 바, 트라스투주맙에 라이소자임이 2개 도입된 178610의 피크가 확인되었다.
또한, 동일한 수법으로 실시예 8에서 얻어진 알킨 도입 트라스투주맙에 대하여, 실시예 17(1)에서 합성한 소 혈청 알부민을 첨가하여, 트라스투주맙-라이소자임 복합체를 얻었다. 이미 공개된 공보(Anal. Chem., 2019, 91, 20, 12724-12732)의 수법에 준하여 ESI-TOFMS에 의해 질량을 측정한 바, 트라스투주맙에 소 혈청 알부민이 2개 도입된 283466의 피크가 확인되었다.
동일한 수법으로 실시예 9에서 얻어진 알킨 도입 트라스투주맙에 대하여, 실시예 17(1)에서 합성한 아지드 도입 라이소자임을 첨가하여, 트라스투주맙-라이소자임 복합체를 얻었다. 이미 공개된 공보(Anal. Chem., 2019, 91, 20, 12724-12732)의 수법에 준하여 ESI-TOFMS에 의해 질량을 측정한 바, 트라스투주맙에 라이소자임이 2개 도입된 178669의 피크가 확인되었다.
동일한 수법으로 실시예 10에서 얻어진 알킨 도입 트라스투주맙에 대하여, 실시예 17(1)에서 합성한 아지드 도입 라이소자임을 첨가하여, 트라스투주맙-라이소자임 복합체를 얻었다. 이미 공개된 공보(Anal. Chem., 2019, 91, 20, 12724-12732)의 수법에 준하여 ESI-TOFMS에 의해 질량을 측정한 바, 트라스투주맙에 라이소자임이 2개 도입된 179154의 피크가 확인되었다.
동일한 수법으로 실시예 11에서 얻어진 알킨 도입 트라스투주맙에 대하여, 실시예 17(1)에서 합성한 아지드 도입 라이소자임을 첨가하여, 트라스투주맙-라이소자임 복합체를 얻었다. 이미 공개된 공보(Anal. Chem., 2019, 91, 20, 12724-12732)의 수법에 준하여 ESI-TOFMS에 의해 질량을 측정한 바, 트라스투주맙에 라이소자임이 2개 도입된 178647의 피크가 확인되었다.
실시예 18: Lys288/290위치로의 생체 직교성 관능기의 도입
(18-1) 가용성 단백질에 대한 친화성 물질, 절단성 부분 및 반응성기를 갖는 화합물(펩타이드 티오에스테르 링커 연결물-티오페놀 활성화)의 합성 및 상기 화합물을 사용한 항HER2 항체 트라스투주맙의 수식 및 이의 해석
(18-1-1) IgG1 Fc 결합성 펩타이드의 합성
가용성 단백질에 대한 친화성 물질인 Ac-FNMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIKDDC-NH2(서열번호 4의 펩타이드를 Fmoc 고상 합성 법에 의해 합성하였다. 펩타이드 합성 장치는 CEM사 제조 Liberty Blue를 사용하였다. 시약은 전부 와타나베 카가쿠코교 제조의 것을 사용하였다. Resin은 Fmoc-NH-SAL-PEG Resin, HL, 아르기닌(R), 시스테인(C), 히스티딘(H)은 더블 커플링을 행하였다. Resin으로부터의 절출(切出)은 트리플루오로아세트산:물:트리이소프로필실란:에탄디티올 = 94:2.5:1.0:2.5의 용액 중 3시간 교반의 조건으로 행하였다. 절출 후 Resin을 여과(filtration)에 의해 제거하고, 트리플루오로아세트산을 제거하였다. 생성된 결정 중에 디에틸에테르를 첨가하여 에테르 침전을 행하고, 생성된 백색 결정을 여과에 의해 회수하였다. 이를 0.1% 트리플루오로아세트산 수용액에 용해하고, 옥타도데실기 화학 결합형 실리카 겔을 충전제로 하는 역상 고속 액체 크로마토그래피에 가하고, 트리플루오로아세트산을 0.1% 함유하는 물과 아세토니트릴의 혼합 용액으로 용출하고, 각 유분을 LC-MS에 의해 확인하였다. 생성물이 포함되는 유분을 회수하고, 감압 하 농축함으로써 아세토니트릴만 제거한 후, 동결 건조하였다.
(18-1-2) Ac-FNMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIKDDC-NH2(서열번호 4)의 5위치와 34위치의 Cys에서의 분자 내 디설파이드 결합의 형성
(18-1-1)에서 합성한 펩타이드를 DMSO에 용해하고, 0.1M Tris-HCl pH 8.0을 첨가하였다. 상기 용액에 글루타치온 산화형을 첨가하여 실온에서 20시간 교반하였다. 반응 용액에 2M 트리플루오로아세트산 수용액을 첨가하여 반응을 정지하고, 이를 0.05% 트리플루오로아세트산 수용액에 용해하고, 옥타도데실기 화학 결합형 실리카 겔을 충전제로 하는 역상 고속 액체 크로마토그래피에 가하고, 트리플루오로아세트산 0.05%를 함유하는 물과 아세토니트릴의 혼합 용액으로 용출하고, 각 유분을 LC-MS에 의해 확인하였다. 생성물이 포함되는 유분을 회수하고, 감압 하 농축함으로써 아세토니트릴을 제거한 후, 동결 건조를 행하여, 목적물(20.0mg, 4.70μmol)를 얻었다.
MS(ESI) m/z: z = 4 1063.65［M＋4H]4+,z = 5 851.15［M＋5H]5+
(18-1-3) 티오에스테르 링커의 합성
(18-1-3-1)
3,3'-DithiodipropionicAcid(1g, 5.0mmol)을 THF(10mL)에 용해하고, 0℃에서 DMF(100μL), OxalylChloride(1.5mL, 15.0mmol)을 첨가하여 0℃에서 15분, 상온에서 1시간 교반하였다. 그 후, 0℃에서 Benzenethiol(1.53mL, 15.0mmol), Pyridine(4mL, 50mmol), CH2Cl2(10mL)을 첨가하여 상온에서 3시간 교반하였다. TLC(헥산/아세트산 에틸 = 5/1)로 반응을 확인 후, 결정을 제거하고, 아세트산 에틸과 1M 염산 수용액으로 추출 후, 유기층을 농축하였다. 헥산과 아세트산 에틸의 혼합 용액으로 용출하고, 각 유분을 TLC(헥산/아세트산 에틸 = 5/1)에 의해 확인하였다. 생성물이 포함되는 유분을 회수하고, 감압 하 농축함으로써 유기 용매를 제거 후, 진공 건조를 행하여, 상기 화합물을(1.2g, 3.04mmol) 얻었다.
(18-1-3-2)
(18-1-3-1)에서 합성한 화합물(1.2g, 3.04mmol)을 DMF/H2O = 5/1의 혼합 용매에 용해하고, TCEP·HCl(1.74g, 6.08mmol)을 첨가하여 상온에서 1시간 교반하였다. TLC(헥산/아세트산 에틸 = 5/1)로 반응을 확인 후, 아세트산 에틸과 물로 추출 후, 유기층을 농축하였다. 헥산과 아세트산 에틸의 혼합 용액으로 용출하고, 각 유분을 TLC(헥산/아세트산 에틸 = 5/1)에 의해 확인하였다. 생성물이 포함되는 유분을 회수하고, 감압 하 농축함으로써 유기 용매를 제거 후, 진공 건조를 행하여, 상기 화합물을(1.18g, 6.5mmol) 얻었다.
(18-1-3-3)
(18-1-3-2)에서 합성한 화합물(200mg, 1.10mmol)을 아세토니트릴(2.0mL)에 용해하고, Glutaric Anhydride(125.5mg, 1.10mmol), DMAP(6.72mg, 0.06mmol), Pyridine(0.22mL)을 첨가하여 상온에서 4시간 교반하였다. TLC(디클로로메탄/메탄올 = 10/1)로 반응을 확인 후, 아세트산 에틸과 0.5M HCl로 추출하고, 유기층을 농축하였다. 디클로로메탄과 메탄올의 혼합 용액으로 용출하고, 각 유분을 TLC(디클로로메탄/메탄올 = 10/1)에 의해 확인하였다. 생성물이 포함되는 유분을 회수하고, 감압 하 농축함으로써 유기 용매를 제거 후, 진공 건조를 행하고, 상기 화합물을(135mg, 0.45mmol) 얻었다.
(18-1-3-4)
(18-1-3-3)에서 합성한 화합물(134mg, 0.45mmol)에 CH2Cl2(2.25mL), 트리에틸아민(157μL, 1.13mmol)을 첨가하여 용해하였다. 0℃에서 펜타플루오로페닐트리플루오로아세트산(154μL, 0.90mmol)을 첨가하여 1시간 교반하였다. TLC(헥산/아세트산 에틸 = 3/1)로 반응을 확인 후, 반응 용액을 농축하였다. 헥산과 아세트산 에틸의 혼합 용액으로 용출하고, 각 유분을 TLC(헥산/아세트산 에틸 = 3/1)에 의해 확인하였다. 생성물이 포함되는 유분을 회수하고, 감압 하 농축함으로써 유기 용매를 제거 후, 진공 건조를 행하여, 상기 화합물을(96mg, 0.20mmol) 얻었다.
1H NMR(400MHz, Chloroform-d) δ = 7.44(s, 5H), 3.23(t, J = 6.9, 2H), 3.01(t, J = 6.9, 2H), 2.77(dt, J = 14.5, 7.3, 4H), 2.16(t, J = 7.3, 2H).
(18-1-4) 펩타이드와 링커의 결합
상기 2개의 아미노산 서열은 모두 서열번호 4의 아미노산 서열이다.
(18-1-2)에서 합성한 Ac-FNMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIKDDC-NH2(서열번호 4)(30.0mg, 7.06μmol, 단, 5번째와 34번째의 2개의 시스테인은 각각 분자 내에서 디설파이드 결합을 형성하고 있다)를 N,N-디메틸포름아미드(1.00mL)에 용해하고, (1-3)에서 합성한 티오에스테르 링커(96.0mg, 201μmol)를 첨가하여 실온에서 24시간 교반하였다. 이를 0.05% 트리플루오로아세트산 수용액에 용해하고, 옥타도데실기 화학 결합형 실리카 겔을 충전제로 하는 역상 고속 액체 크로마토그래피에 가하고, 트리플루오로아세트산을 0.05% 함유하는 물과 아세토니트릴의 혼합 용액으로 용출하고, 각 유분을 LC-MS에 의해 확인하였다. 생성물이 포함되는 유분을 유분을 회수하고, 감압 하 농축함으로써 아세토니트릴을 제거한 후, 동결 건조를 행하고, 상기 펩타이드 티오에스테르 링커 연결물-티오페놀 활성화체(15.8mg, 3.48μmol)를 얻었다.
MS(ESI) m/z: z = 4 1136.80［M＋4H]4+
(18-1-5) 항HER2 IgG 항체 트라스투주맙의 특이적 수식과 ESI-TOFMS에 의한 해석
(18-1-4)에서 합성한 펩타이드 링커 연결물은 디메틸설폭사이드에 용해하고 10mM로 하였다. 항HER2 항체 트라스투주맙(중외제약) 500μg을 HEPES 버퍼(pH 8.2) 200μL(20μM)에 용해시키고 10mM의 펩타이드 시약을 3.38μL(항체에 대하여 10등량) 첨가하여 실온에서 1시간 교반하였다. 반응액을 20mM 아세트산 암모늄 버퍼에 치환하고, ESI-TOFMS에 의해 질량을 측정한 바, 원료의 트라스투주맙은 148223에 피크가 관측되었다. 생성물은 결합성 펩타이드가 1개 도입된 152660, 결합성 펩타이드가 2개 도입된 157093, 3개 도입된 161528의 피크가 확인되었다.
(18-1-6) 트라스투주맙의 특이적 수식체의 환원 조건에서의 ESI-TOFMS 해석에 의한 중쇄 선택성의 확인
(18-1-5)에서 생성한 항체·펩타이드 복합체에 100mM 트리스(2-카복시에틸)포스핀염산염 용액 2μL(항체에 대하여 등량)를 첨가하여 실온에서 15분 교반하였다. ESI-TOFMS에 의해 질량을 측정한 바, 원료의 트라스투주맙은 50596에 중쇄 피크, 23439에 경쇄 피크가 관측되고, 생성물은 중쇄에 링커가 1개 도입된 55033, 경쇄에 원료와 동일한 23439에 피크가 관측되었다.
(18-1-7) 트라스투주맙의 특이적 수식체의 DAR calculator에 의한 펩타이드/항체 결합비의 확인
(18-1-5)에서 해석한 MS 데이터에 대하여, DAR calculator(Agilent사 소프트웨어)에 의해 펩타이드/항체 결합비의 확인을 행한 결과를 표 5에 나타낸다. 표 5의 DAR peak와 %Area로부터 산출된 평균 펩타이드/항체 결합비는 2.0이 되었다. 따라서, 하기 구조식으로 표시되는 항체 중간체(평균 펩타이드/항체 결합비 2.0)의 생성이 확인되었다.
[여기서, Ig는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하는 면역 글로불린 단위(IgG)를 나타내고, 또한, Eu numbering에 따르는 2개의 중쇄 중의 288/290위치에 존재하는 라이신 잔기의 측쇄 중의 아미노기를 통하여, Ig에 인접하는 2개의 카보닐기(C=O)와 아미드 결합을 형성하고 있고,
Y는 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 친화성 펩타이드를 나타내고,
Ig와, Ig에 인접하는 2개의 카보닐기(C=O)와의 사이의 평균 결합 비율 r은 2.0이다)
(18-1-8) 티오에스테르기의 절단에 의한 티올기 도입 항체 유도체의 제조
(18-1-7)에서 얻어진 항체 중간체에 대하여, 이미 공개된 공보(WO2019240287A1)에 따라 하이드록실아민 용액을 첨가하여 실온에서 1시간 정치하였다. 2시간 후, 20mM PBS 버퍼, 10mM EDTA(pH 7.4)로 치환하고, 티올기 도입 항체 유도체를 얻었다. ESI-TOFMS에 의해 질량을 측정한 바, 절단 반응이 진행된 148409에 피크가 확인되었다.
[여기서, Ig는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하는 면역 글로불린 단위(IgG)를 나타내고, 또한, Eu numbering에 따르는 2개의 중쇄 중의 288/290위치에 존재하는 라이신 잔기의 측쇄 중의 아미노기를 통해서, Ig에 인접하는 2개의 카보닐기(C=O)와 아미드 결합을 형성하고 있고,
Ig와, Ig에 인접하는 2개의 카보닐기(C=O)와의 사이의 평균 결합 비율 r은 2.0이다]
(18-1-9) 트립신 처리에 의한 펩타이드 맵핑
(1-8)에서 얻어진 트라스투주맙·티올 도입체에 대하여, 하기 공정으로 펩타이드 맵핑을 행하였다.
(18-1-9-1) 트라스투주맙·티올 도입체의 트립신 처리
1.5mL 저흡착 마이크로 테스트 튜브에 샘플 용액을 10μL, 50mM 탄산수소암모늄 완충액, 40% 트리플루오로에탄올에 용해된 20mM의 디티오트레이톨 수용액 10μL를 첨가하여 65℃에서 1시간 가온 후, 50mM의 요오도아세트아미드 수용액 10μL를 첨가하여, 차광 하 실온에서 30분간 반응시켰다. 반응 후, 50mM 탄산수소암모늄 완충액을 40μL 첨가하여 교반하고, 20ng/μL의 트립신 수용액을 10μL 첨가하여 37℃에서 16시간 효소 소화하였다. 소화 후, 20% 트리플루오로아세트산 수용액을 2μL 첨가하여 반응을 멈추고, LC-MS/MS 측정을 실시하였다.
(18-1-9-2) 트라스투주맙의 LC-MS/MS 측정
(분석 장치)
나노 HPLC: EASY-nLC 1000(서모피셔 사이언티픽사)
질량 분석계: 트라이브리드 질량 분석계 Orbitrap Fusion(서모피셔 사이언티픽사)
(HPLC 분석 조건)
트랩 컬럼: Acclaim PepMap(등록상표) 100, 75μm×2cm(서모피셔 사이언티픽사)
분석 컬럼: ESI-column(NTCC-360/75-3-125, 75μm×12.5cm, 3μm(닛쿄 테크노스사))
이동상 A: 0.1% 포름산 수용액
이동상 B: 0.1% 포름산, 아세토니트릴 용액
로딩 용액: 0.1% 트리플루오로아세트산 수용액
유속: 300nL/min
샘플 주입량: 1μL
그래디언트 조건(B%): 2%(0.0-0.5분), 2%→30%(0.5-23.5분), 30%→75%(23.5-25.5분), 75%(25.5-35.0분)
(질량 분석계 분석 조건)
이온화법: ESI, Positive 모드
스캔 타입: Data Dependent Aquisition
Activation Type: Collision Induced Dissociation(CID)
데이터의 취득은 부속 소프트인 Xcalibur 3.0(서모피셔 사이언티픽사) 및 Thermo Orbitrap Fusion Tune Application 2.0(서모피셔 사이언티픽사)을 사용하여 행하였다.
(18-1-9-3) 트라스투주맙의 수식 부위의 해석
LC-MS/MS측정 결과에 대한 수식 부위 해석에 대해서는, BioPharma Finder 3.0(서모피셔 사이언티픽사)을 사용하여 행하였다.
BioPharma Finder에서의 해석은, S/N Threshold를 1, MS Noise Level을 피크 탑의 강도의 0.01%가 되도록 설정하여 실시하였다. 또한, 소화 효소를 Trypsin으로, Specificity를 High로 설정하였다. Static Modification에는 요오도아세트아미드에 의한 시스테인 잔기의 수식으로서, Carbamidomethyl(+57.021Da)을 설정하였다. Dynamic Modifications에 대해서는, 메티오닌 잔기의 산화(+15.995Da) 및 라이신 잔기로의 수식체(요오도아세트아미드에 의한 Carbamidomethyl화를 받은 티올 도입체(+145.019Da))를 설정하였다. 또한, Confidence Score가 80 이상, 펩타이드 동정 시의 Mass Accuracy가 5ppm 이내, MS/MS가 관측된 것만이 되도록 필터를 설정하였다. 또한, 라이신 잔기의 잔기 번호에 관하여, 중쇄 VH 도메인 및 경쇄 상에 대해서는 서열 중의 번호(즉, N말의 아미노산을 1번째로 한다. 이하 동일)로, 중쇄 CH1, CH2, CH3 도메인 상에 대해서는 EU numbering을 사용하여 표기하였다.
또한, 수식 부위의 검색 대상의 아미노산 서열의 데이터로서, 도 6에 나타내는 (1) 및 (2)를 사용하였다.
(18-1-9-4) 트라스투주맙의 LC-MS/MS에 의한 수식 부위의 해석 결과
LC-MS/MS를 사용한 해석의 결과, 트라스투주맙의 트립신 소화에 의한 라이신 잔기로의 수식 부위(요오도아세트아미드에 의한 Carbamidomethyl화를 받은 티올 도입체(+145.019Da))를 포함하는 아미노산 18잔기로 이루어진 펩타이드, FNWYVDGVEVHNAKTKPR(서열번호 3)의 펩타이드 프래그먼트의 MS 스펙트럼(실측값: m/z 577.03606, 이론값: 577.03557, 4가)이 관측되고(도 7), CID 스펙트럼에 의해 중쇄의 EU numbering에서의 288위치 또는 290위치의 라이신 잔기의 수식을 나타내는, 3가 y16에 상당하는 m/z 682.13(이론값: 682.01)의 프로덕트 이온이 확인되었다(도 8). 또한, BioPharma Finder로의 해석에 의해, 288위치 또는 290위치의 라이신 잔기로의 수식이 고선택적으로 일어나고 있는 것이 나타났다(도 9).
상기 결과로부터, 상기 (18-1-8)에서 얻어진 트라스투주맙·티올 도입체에서는, 항체의 중쇄 상, EU numbering에서의 Lys288 및 Lys290에 위치 선택적으로 콘쥬게이션이 진행되어 있는 것을 알 수 있었다.
(18-2-1) 티오에스테르 링커의 합성
(18-2-1-1)
(18-1-3-2)에서 합성한 화합물(295mg, 1.62mmol)을 CH2Cl2(13.5mL)에 용해하고, 3-(tert-Butoxycarbonyl)benzoic acid(300mg, 1.35mmol), DIPEA(700μL, 2.03mmol), PyBOP(843mg, 1.62mmol)를 첨가하여 상온에서 1시간 교반하였다. TLC(헥산/아세트산 에틸 = 5/1)로 반응을 확인 후, 반응 용액을 농축하였다. 헥산과 아세트산 에틸의 혼합 용액으로 용출하고, 각 유분을 TLC(헥산/아세트산 에틸 = 5/1)에 의해 확인하였다. 생성물이 포함되는 유분을 회수하고, 감압 하 농축함으로써 유기 용매를 제거 후, 진공 건조를 행하여, 상기 화합물을(259mg, 0.64mmol) 얻었다.
(18-2-1-2)
(18-2-1-1)에서 합성한 화합물(259mg, 0.64mmol)을 CH2Cl2/TFA = 1/1의 혼합 용액에 용해하고, 1시간 상온에서 교반하였다. TLC(헥산/아세트산 에틸 = 5/1)로 원점으로 떨어진 것을 확인 후, 반응 용액을 농축 후, 진공 건조를 행하여, 상기 화합물을(227mg, 0.66mmol) 얻었다.
(18-2-1-3)
(18-2-1-2)에서 합성한 화합물(227mg, 0.66mmol)에 CH2Cl2(3.3mL), 트리에틸아민(230μL, 1.65mmol)을 첨가하여 용해하였다. 0℃에서 펜타플루오로페닐트리플루오로아세트산(225μL, 1.32mmol)을 첨가하여 1시간 교반하였다. TLC(헥산/아세트산 에틸 = 3/1)로 반응을 확인 후, 반응 용액을 농축하였다. 헥산과 아세트산 에틸의 혼합 용액으로 용출하여, 각 유분을 TLC(헥산/아세트산 에틸 = 3/1)에 의해 확인하였다. 생성물이 포함되는 유분을 회수하고, 감압 하 농축함으로써 유기 용매를 제거 후, 진공 건조를 행하여, 상기 화합물을(175.3mg, 0.34mmol) 얻었다.
1H NMR(400MHz, Chloroform-d) δ = 8.79(t, J = 1.8, 1H), 8.43(dt, J = 7.8, 1.5, 1H), 8.30(dt, J = 7.9, 1.5, 1H), 7.70(t, J = 7.8, 1H), 7.45(s, 4H), 3.45(t, J = 6.9, 2H), 3.14(t, J = 6.9, 2H).
(18-2-2) 펩타이드와 링커의 결합
상기 2개의 아미노산 서열은 모두 서열번호 4의 아미노산 서열이다.
(18-1-2)에서 합성한 Ac-FNMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIKDDC-NH2(서열번호 4)(30.0mg, 7.06μmol, 단, 5번째와 34번째의 2개의 시스테인은 각각 분자 내에서 디설파이드 결합을 형성하고 있다)를 N,N-디메틸포름아미드(1.00mL)에 용해하고, 링커 (72.0mg, 141μmol)를 첨가하고, 실온에서 24시간 교반하였다. 이를 0.05% 트리플루오로아세트산 수용액에 용해하고, 옥타도데실기 화학 결합형 실리카 겔을 충전제로 하는 역상 고속 액체 크로마토그래피에 가하고, 트리플루오로아세트산을 0.05% 함유하는 물과 아세토니트릴의 혼합 용액으로 용출하고, 각 유분을 LC-MS에 의해 확인하였다. 생성물이 포함되는 유분을 회수하고, 감압 하 농축함으로써 아세토니트릴을 제거한 후, 동결 건조를 행하여, 상기 펩타이드 티오에스테르 링커 연결물-티오페놀 활성화체(10.0mg, 2.19μmol)를 얻었다.
MS(ESI) m/z: z = 4 1145.6［M＋4H]4+
(18-2-3) 항HER2 항체 트라스투주맙의 특이적 수식과 ESI-TOFMS에 의한 해석
(18-2-2)에서 합성한 펩타이드 링커 연결물은 디메틸설폭사이드에 용해하여 10mM로 하였다. 항HER2 항체 트라스투주맙(중외제약) 500μg을 50mM의 HEPES 버퍼(pH 8.2) 200μL(20μM)에 용해시키고, 10mM의 펩타이드 시약을 3.38μL(항체에 대하여 10등량) 첨가하여 실온에서 1시간 교반하였다. 반응액을 20mM 아세트산 암모늄 버퍼로 치환하였다. ESI-TOFMS에 의해 질량을 측정한 바, 원료의 트라스투주맙은 148223에 피크가 관측되었다. 결합성 펩타이드가 1개 도입된 152691, 결합성 펩타이드가 2개 도입된 157163, 3개 도입된 161634의 피크가 확인되었다.
(18-2-4) 트라스투주맙의 특이적 수식체의 환원 조건으로 ESI-TOFMS 해석에 의한 중쇄 선택성의 확인
(18-2-3)에서 생성한 항체·펩타이드 복합체에 100mM 트리스(2-카복시에틸)포스핀염산염 용액 2μL(항체에 대하여 등량)를 첨가하여 실온에서 15분 교반하였다. ESI-TOFMS에 의해 질량을 측정한 바, 원료의 트라스투주맙은 50596에 중쇄 피크, 23439에 경쇄 피크가 관측되었다. 반응물은 중쇄에 링커가 1개 도입된 55067, 경쇄에 원료와 동일한 23439에 피크가 관측되었다.
(18-2-5) 트라스투주맙의 특이적 수식체의 DAR calculator에 의한 펩타이드/항체 결합비의 확인
(18-2-3)에서 해석한 MS 데이터에 대하여, DAR calculator(Agilent사 소프트웨어)에 의해 펩타이드/항체 결합비의 확인을 행한 결과를 표 6에 나타낸다. 표 6의 DAR peak와 %Area로부터 산출된 평균 펩타이드/항체 결합비는 2.0이 되었다. 따라서, 하기 구조식으로 표시되는 항체 중간체(평균 펩타이드/항체 결합비 2.0)의 생성이 확인되었다.
[여기서, Ig는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하는 면역 글로불린 단위(IgG)를 나타내고, 또한, Eu numbering에 따르는 2개의 중쇄 중의 288/290위치에 존재하는 라이신 잔기의 측쇄 중의 아미노기를 통하여, Ig에 인접하는 2개의 카보닐기(C=O)와 아미드 결합을 형성하고 있고,
Y는 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 친화성 펩타이드를 나타내고,
Ig와, Ig에 인접하는 2개의 카보닐기(C=O)와의 사이의 평균 결합 비율 r은 2.0이다]
(18-2-6) 티오에스테르기의 절단에 의한 티올기 도입 항체 유도체의 제조
티올기 도입 항체 유도체는, (18-2-5)에서 얻어진 항체 중간체를, (18-1-8)에 기재되는 티오에스테르기의 절단 반응에 제공함으로써, (18-1-8)에 기재되는 티올기 도입 항체 유도체를 얻었다.
(18-2-7) 트립신 처리에 의한 펩타이드 맵핑
(18-2-6)에서 얻어진 트라스투주맙·티올 도입체에 대하여, 하기 공정으로 펩타이드 맵핑을 행하였다.
(18-2-7-1) 트라스투주맙·티올 도입체의 트립신 처리
(18-1-9-1)과 동일하게 하여 (18-2-6)에서 얻어진 트라스투주맙·티올 도입체의 트립신 처리를 행하였다.
(18-2-7-2) 트라스투주맙의 LC-MS/MS 측정
(18-1-9-2)과 동일한 조건으로 LC-MS/MS 측정을 행하였다.
(18-2-7-3) 트라스투주맙의 수식 부위의 해석
(18-1-9-3)과 동일하게 해석을 행하였다.
(18-2-7-4) 트라스투주맙의 LC-MS/MS에 의한 수식 부위의 해석 결과
LC-MS/MS를 사용한 해석의 결과, 트라스투주맙의 트립신 소화에 의한 라이신 잔기로의 수식 부위(요오도아세트아미드에 의한 Carbamidomethyl화를 받은 티올 도입체(+145.019Da))를 포함하는 아미노산 18잔기로 이루어진 펩타이드, FNWYVDGVEVHNAKTKPR(서열번호 3)의 펩타이드 프래그먼트의 MS 스펙트럼(실측값: m/z 577.03571, 이론값: 577.03557, 4가)이 관측되고(도 10), CID 스펙트럼에 의해 중쇄의 EU numbering에서의 288위치 또는 290위치의 라이신 잔기의 수식을 나타내는, 3가 y16에 상당하는 m/z 682.41(이론값: 682.01)의 프로덕트 이온이 확인되었다(도 11). 또한, BioPharma Finder에서의 해석에 의해, 288위치 또는 290위치의 라이신 잔기로의 수식이 고선택적으로 일어나고 있는 것이 나타났다(도 12).
상기 결과로부터, 상기 (18-2-6)에서 얻어진 트라스투주맙·티올 도입체에서는, 항체의 중쇄 상, EU numbering에서의 Lys288 및 Lys290에 위치 선택적으로 콘쥬게이션이 진행되어 있음을 알 수 있었다.
(18-3-1) 티오에스테르 링커의 합성
(18-3-1-1)
(18-1-3-2)에서 합성한 화합물(220mg, 1.21mmol)을 CH2Cl2(12.0mL)에 용해하고, AdipicAcid(530mg, 3.63mmol), DIPEA(314μL, 1.82mmol), PyBOP(755mg, 1.45mmol)를 첨가하여 상온에서 1시간 교반하였다. TLC(디클로로메탄/메탄올 = 10/1)로 반응을 확인 후, 반응 용액을 농축하였다. 디클로로메탄과 메탄올의 혼합 용액으로 용출하고, 각 유분을 TLC(디클로로메탄/메탄올 = 10/1)에 의해 확인하였다. 생성물이 포함되는 유분을 회수하고, 감압 하 농축함으로써 유기 용매를 제거 후, 진공 건조를 행하여, 상기 화합물을(205mg, 0.63mmol) 얻었다.
(18-3-1-2)
(18-3-1-1)에서 합성한 화합물(205mg, 0.63mmol)에 CH2Cl2(3.15mL), 트리에틸아민(220μL, 1.58mmol)을 첨가하여 용해하였다. 0℃에서 펜타플루오로페닐트리플루오로아세트산(215μL, 1.26mmol)을 첨가하여 1시간 교반하였다. TLC(헥산/아세트산 에틸 = 3/1)로 반응을 확인 후, 반응 용액을 농축하였다. 헥산과 아세트산 에틸의 혼합 용액으로 용출하고, 각 유분을 TLC(헥산/아세트산 에틸 = 3/1)에 의해 확인하였다. 생성물이 포함되는 유분을 회수하고, 감압 하 농축함으로써 유기 용매를 제거 후, 진공 건조를 행하여, 상기 화합물을(200mg, 0.41mmol) 얻었다.
1H NMR(400MHz, Chloroform-d) δ = 7.44(s, 5H), 3.20(t, J = 7.0, 2H), 3.00(t, J = 6.9, 2H), 2.66(dt, J = 28.3, 7.4, 5H), 1.79(ddt, J = 20.4, 15.2, 7.5, 5H), 1.57-1.38(m, 3H).
(18-3-2) 펩타이드와 링커의 결합
상기 2개의 아미노산 서열은 모두 서열번호 4의 아미노산 서열이다.
(18-1-2)에서 합성한 Ac-FNMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIKDDC-NH2(서열번호 4)(30.0mg, 7.06μmol, 단, 5번째와 34번째의 2개의 시스테인은 각각 분자 내에서 디설파이드 결합을 형성하고 있다)를 N,N-디메틸포름아미드(1.00mL)에 용해하고, 링커(69.0mg, 141μmol)를 첨가하고, 실온에서 24시간 교반하였다. 이를 0.05% 트리플루오로아세트산 수용액에 용해하고, 옥타도데실기 화학 결합형 실리카 겔을 충전제로 하는 역상 고속 액체 크로마토그래피에 가하고, 트리플루오로아세트산을 0.05% 함유하는 물과 아세토니트릴의 혼합 용액으로 용출하고, 각 유분을 LC-MS에 의해 확인하였다. 생성물이 포함되는 유분을 회수하고, 감압 하 농축함으로써 아세토니트릴을 제거한 후, 동결 건조를 행하여, 상기 펩타이드 티오에스테르 링커 연결물-티오페놀 활성화체(7.5mg, 1.65μmol)를 얻었다.
MS(ESI) m/z: z = 4 1140.50［M＋4H]4+
(18-3-3) 항HER2 항체 트라스투주맙의 특이적 수식과 ESI-TOFMS에 의한 해석
(18-3-2)에서 합성한 펩타이드 링커 연결물은 디메틸설폭사이드에 용해하여 10mM로 하였다. 항HER2 항체 트라스투주맙(중외제약) 500μg을 50mM의 HEPES 버퍼(pH 8.2) 200μL(20μM)에 용해시키고, 10mM의 펩타이드 시약을 3.38μL(항체에 대하여 10등량) 첨가하여 실온에서 1시간 교반하였다. 반응액을 20mM 아세트산 암모늄 버퍼로 치환하였다. ESI-TOFMS에 의해 질량을 측정한 바, 원료의 트라스투주맙은 148223에 피크가 관측되었다. 결합성 펩타이드가 1개 도입된 152676, 결합성 펩타이드가 2개 도입된 157126, 3개 도입된 161572의 피크가 확인되었다.
(18-3-4) 트라스투주맙의 특이적 수식체의 환원 조건에서의 ESI-TOFMS 해석에 의한 중쇄 선택성의 확인
(18-3-3)에서 생성한 항체·펩타이드 복합체에 100mM 트리스(2-카복시에틸)포스핀염산염 용액 2μL(항체에 대하여 등량)를 첨가하여 실온에서 15분 교반하였다. ESI-TOFMS에 의해 질량을 측정한 바, 원료의 트라스투주맙은 50596에 중쇄 피크, 23439에 경쇄 피크가 관측되었다. 반응물은 중쇄에 링커가 1개 도입된 55048, 경쇄에 원료와 동일한 23439에 피크가 관측되었다.
(18-3-5) 트라스투주맙의 특이적 수식체의 DAR calculator에 의한 펩타이드/항체 결합비의 확인
(18-3-3)에서 해석한 MS 데이터에 대하여, DAR calculator(Agilent사 소프트웨어)에 의해 펩타이드/항체 결합비의 확인을 행한 결과를 표 7에 나타낸다. 표 7의 DAR peak와 %Area로부터 산출된 평균 펩타이드/항체 결합비는 1.9가 되었다. 따라서, 하기 구조식으로 표시되는 항체 중간체(평균 펩타이드/항체 결합비 1.9)의 생성이 확인되었다.
[여기서, Ig는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하는 면역 글로불린 단위(IgG)를 나타내고, 또한, Eu numbering에 따른 2개의 중쇄 중의 288/290위치에 존재하는 라이신 잔기의 측쇄 중의 아미노기를 통하여, Ig에 인접하는 2개의 카보닐기(C=O)와 아미드 결합을 형성하고 있고,
Y는 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 친화성 펩타이드를 나타내고,
Ig와, Ig에 인접하는 2개의 카보닐기(C=O)와의 사이의 평균 결합 비율 r은 1.9이다]
(18-3-6) 티오에스테르기의 절단에 의한 티올기 도입 항체 유도체의 제조
티올기 도입 항체 유도체는, (18-3-5)에서 얻어진 항체 중간체를, (18-1-8)에 기재되는 티오에스테르기의 절단 반응에 제공함으로써, (18-1-8)에 기재되는 티올기 도입 항체 유도체를 얻었다.
(18-4-1) 티오에스테르 링커의 합성
(18-4-1-1)
tBu-3-Sulfanylpropanoate(500mg, 3.08mmol)를 테트라하이드로푸란(7mL)에 용해하고, 트리에틸아민(0.64mL, 4.62mmol)을 첨가한 후, 0℃에서 말로닐클로라이드(0.15mg, 1.54mmol)를 첨가하여 3시간 교반하였다. TLC(헥산/아세트산 에틸 = 5/1)의 반응을 확인 후, 반응 용액을 농축하였다. 헥산과 아세트산 에틸의 혼합 용액으로 용출하고, 각 유분을 TLC(헥산/아세트산 에틸 = 5/1)에 의해 확인하였다. 생성물이 포함되는 유분을 회수하고, 감압 하 농축함으로써 유기 용매를 제거 후, 진공 건조를 행하여, 상기 화합물을(104mg, 0.26mmol) 얻었다.
(18-4-1-2)
(18-4-1-1)에서 합성한 화합물(104mg, 0.26mmol)을 CH2Cl2/TFA = 1/1의 혼합 용액에 용해하고, 1시간 상온에서 교반하였다. TLC(헥산/아세트산 에틸 = 5/1)로 원점으로 떨어진 것을 확인 후, 반응 용액을 농축 후, 진공 건조를 행하여, 상기 화합물을(104mg, 0.37mmol) 얻었다.
(18-4-1-3)
(18-4-1-2)에서 합성한 화합물(104mg, 0.37mmol)에 CH2Cl2(1.85mL), 트리에틸아민(130μL, 0.93mmol)을 첨가하여 용해하였다. 0℃에서 N-SuccinimidylTrifluoroacetate(156mg, 0.74mmol)를 첨가하여 1시간 교반하였다. TLC(헥산/아세트산 에틸 = 1/1)의 반응을 확인 후, 반응 용액을 농축하였다. 헥산과 아세트산 에틸의 혼합 용액으로 용출하고, 각 유분을 TLC(헥산/아세트산 에틸 = 1/1)에 의해 확인하였다. 생성물이 포함되는 유분을 회수하고, 감압 하 농축함으로써 유기 용매를 제거 후, 진공 건조를 행하여, 상기 화합물을(66.8mg, 0.14mmol) 얻었다.
1H NMR(400MHz, Chloroform-d) δ = 3.84(s, 2H), 3.28(t, J = 6.9, 2H), 3.19(t, J = 6.8, 2H), 3.00(t, J = 6.8, 2H), 2.74(t, J = 6.8, 2H).
(18-4-2) 펩타이드와 링커의 결합
상기 2개의 아미노산 서열은 모두 서열번호 4의 아미노산 서열이다.
(18-1-2)에서 합성한 Ac-FNMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIKDDC-NH2(서열번호 4)(29.7mg, 7.00μmol, 단, 5번째와 34번째의 2개의 시스테인은 각각 분자 내에서 디설파이드 결합을 형성하고 있다)를 N,N-디메틸포름아미드(1.00mL)에 용해하고, 링커(66.8mg, 0.14mmol)를 첨가하고, 실온에서 4시간 교반하였다. 이를 0.05% 트리플루오로아세트산 수용액에 용해하고, 옥타도데실기 화학 결합형 실리카 겔을 충전제로 하는 역상 고속 액체 크로마토그래피에 가하고, 트리플루오로아세트산을 0.05% 함유하는 물과 아세토니트릴의 혼합 용액으로 용출하고, 각 유분을 LC-MS에 의해 확인하였다. 생성물이 포함되는 유분을 회수하고, 감압 하 농축함으로써 아세토니트릴을 제거한 후, 동결 건조를 행하여, 상기 펩타이드 티오에스테르 링커 연결물-NHS 활성화체(13mg, 2.82μmol)를 얻었다.
MS(ESI) m/z: z = 4 1153.10［M＋4H]4+
(18-4-3) 항HER2 항체 트라스투주맙의 특이적 수식과 ESI-TOFMS에 의한 해석
(18-4-2)에서 합성한 펩타이드 링커 연결물은 디메틸설폭사이드에 용해하여 10mM로 하였다. 항HER2 항체 트라스투주맙(중외제약) 500μg을 50mM의 HEPES 버퍼(pH 8.2) 200μL(20μM)에 용해시키고, 10mM의 펩타이드 시약을 3.38μL(항체에 대하여 10등량) 첨가하여 실온에서 1시간 교반하였다. 반응액을 20mM 아세트산 암모늄 버퍼로 치환하였다. ESI-TOFMS에 의해 질량을 측정한 바, 원료의 트라스투주맙은 148223에 피크가 관측되었다. 결합성 펩타이드가 1개 도입된 152722, 결합성 펩타이드가 2개 도입된 157215, 3개 도입된 161708의 피크가 확인되었다.
(18-4-4) 트라스투주맙의 특이적 수식체의 환원 조건에서의 ESI-TOFMS 해석에 의한 중쇄 선택성의 확인
(18-4-3)에서 생성한 항체·펩타이드 복합체에 100mM 트리스(2-카복시에틸)포스핀염산염 용액 2μL(항체에 대하여 등량)를 첨가하여 실온에서 15분 교반하였다. ESI-TOFMS에 의해 질량을 측정한 바, 원료의 트라스투주맙은 50594에 중쇄 피크, 23439에 경쇄 피크가 관측되었다. 반응물은 중쇄에 링커가 1개 도입된 55091, 경쇄에 원료와 동일한 23439에 피크가 관측되었다.
(18-4-5) 트라스투주맙의 특이적 수식체의 DAR calculator에 의한 펩타이드/항체 결합비의 확인
(18-4-3)에서 해석한 MS 데이터에 대하여, DAR calculator(Agilent사 소프트웨어)에 의해 펩타이드/항체 결합비의 확인을 행한 결과를 표 8에 나타낸다. 표 8의 DAR peak와 %Area로부터 산출된 평균 펩타이드/항체 결합비는 1.8이 되었다. 따라서, 하기 구조식으로 표시되는 항체 중간체(평균 펩타이드/항체 결합비 1.8)의 생성이 확인되었다.
[여기서, Ig는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하는 면역 글로불린 단위(IgG)를 나타내고, 또한, Eu numbering에 따르는 2개의 중쇄 중의 288/290위치에 존재하는 라이신 잔기의 측쇄 중의 아미노기를 통하여, Ig에 인접하는 2개의 카보닐기(C=O)와 아미드 결합을 형성하고 있고,
Y는 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 친화성 펩타이드를 나타내고,
Ig와, Ig에 인접하는 2개의 카보닐기(C=O)와의 사이의 평균 결합 비율 r은 1.8이다]
(18-4-6) 티오에스테르기의 절단에 의한 티올기 도입 항체 유도체의 제조
티올기 도입 항체 유도체는, (18-4-5)에서 얻어진 항체 중간체를, (18-1-8)에 기재되는 티오에스테르기의 절단 반응에 제공함으로써, (18-1-8)에 기재되는 티올기 도입 항체 유도체를 얻었다.
(18-5-1) 펩타이드와 링커의 결합
상기 2개의 아미노산 서열은 모두 서열번호 5의 아미노산 서열이다.
(18-1-1)에 기재된 방법으로 합성한 Ac-FNMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIKEDC-NH2(서열번호 5)(30.0mg, 7.06μmol, 단, 5번째와 34번째의 2개의 시스테인은 각각 분자 내에서 디설파이드 결합을 형성하고 있다)에 실시예 2(2-2)와 동일한 방법으로 링커를 결합하고, 상기 펩타이드 티오에스테르 링커 연결물-티오페놀 활성화체(10.0mg, 2.19μmol)를 얻었다.
MS(ESI) m/z: z = 4 1145.6［M＋4H]4+
(18-5-2) 항HER2 항체 트라스투주맙의 특이적 수식과 ESI-TOFMS에 의한 해석
(18-5-1)에서 합성한 펩타이드 링커 연결물은 디메틸설폭사이드에 용해하여 10mM로 하였다. 항HER2 항체 트라스투주맙(중외제약) 500μg을 50mM의 HEPES 버퍼(pH 8.2) 200μL(20μM)에 용해시키고, 10mM의 펩타이드 시약을 3.38μL(항체에 대하여 10등량) 첨가하여 실온에서 1시간 교반하였다. 반응액을 20mM 아세트산 암모늄 버퍼로 치환하였다. ESI-TOFMS에 의해 질량을 측정한 바, 원료의 트라스투주맙은 148223에 피크가 관측되었다. 결합성 펩타이드가 1개 도입된 152707, 결합성 펩타이드가 2개 도입된 157188, 3개 도입된 161676의 피크가 확인되었다.
(18-5-3) 트라스투주맙의 특이적 수식체의 환원 조건에서의 ESI-TOFMS 해석에 의한 중쇄 선택성의 확인
(18-5-2)에서 생성한 항체·펩타이드 복합체에 100mM 트리스(2-카복시에틸)포스핀염산염 용액 2μL(항체에 대하여 등량)를 첨가하여 실온에서 15분 교반하였다. ESI-TOFMS에 의해 질량을 측정한 바, 원료의 트라스투주맙은 50596에 중쇄 피크, 23439에 경쇄 피크가 관측되었다. 반응물은 중쇄에 링커가 1개 도입된 55077, 경쇄에 원료와 동일한 23439에 피크가 관측되었다.
(18-5-4) 트라스투주맙의 특이적 수식체의 DAR calculator에 의한 펩타이드/항체 결합비의 확인
(5-2)에서 해석한 MS 데이터에 대하여, DAR calculator(Agilent사 소프트웨어)에 의해 펩타이드/항체 결합비의 확인을 행한 결과를 표 9에 나타낸다. 표 9의 DAR peak와 %Area로부터 산출된 평균 펩타이드/항체 결합비는 2.0이 되었다. 따라서, 하기 구조식으로 표시되는 항체 중간체(평균 펩타이드/항체 결합비 2.0)의 생성이 확인되었다.
[여기서, Ig는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하는 면역 글로불린 단위(IgG)를 나타내고, 또한, Eu numbering에 따르는 2개의 중쇄 중의 288/290위치에 존재하는 라이신 잔기의 측쇄 중의 아미노기를 통하여, Ig에 인접하는 2개의 카보닐기(C=O)와 아미드 결합을 형성하고 있고,
Y는 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 친화성 펩타이드를 나타내고,
Ig와, Ig에 인접하는 2개의 카보닐기(C=O)와의 사이의 평균 결합 비율 r은 2.0이다]
(18-5-5) 티오에스테르기의 절단에 의한 티올기 도입 항체 유도체의 제조
티올기 도입 항체 유도체는, (18-5-4)에서 얻어진 항체 중간체를, (18-1-8)에 기재되는 티오에스테르기의 절단 반응에 제공함으로써, (18-1-8)에 기재되는 티올기 도입 항체 유도체를 얻었다.
(18-6-1) 펩타이드와 링커의 결합
상기 2개의 아미노산 서열은 모두 서열번호 6의 아미노산 서열이다.
(18-1-1)에 기재된 방법으로 합성한 Ac-FNMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIKEEC-NH2(서열번호 6)(30.0mg, 7.06μmol, 단, 5번째와 34번째의 2개의 시스테인은 각각 분자 내에서 디설파이드 결합을 형성하고 있다)에 (18-2-2)와 동일한 방법으로 링커를 결합하고, 상기 펩타이드 티오에스테르 링커 연결물-티오페놀 활성화체(22.2mg, 4.82μmol)를 얻었다.
MS(ESI) m/z: z = 4 1152.4［M＋4H]4+
(18-6-2) 항HER2 항체 트라스투주맙의 특이적 수식과 ESI-TOFMS에 의한 해석
(18-6-1)에서 합성한 펩타이드 링커 연결물은 디메틸설폭사이드에 용해하여 10mM로 하였다. 항HER2 항체 트라스투주맙(중외제약) 500μg을 50mM의 HEPES 버퍼(pH 8.2) 200μL(20μM)에 용해시키고, 10mM의 펩타이드 시약을 3.38μL(항체에 대하여 10등량) 첨가하여 실온에서 1시간 교반하였다. 반응액을 20mM 아세트산 암모늄 버퍼로 치환하였다. ESI-TOFMS에 의해 질량을 측정한 바, 원료의 트라스투주맙은 148223에 피크가 관측되었다. 결합성 펩타이드가 1개 도입된 152720, 결합성 펩타이드가 2개 도입된 157216, 3개 도입된 161716의 피크가 확인되었다.
(18-6-3) 트라스투주맙의 특이적 수식체의 환원 조건에서의 ESI-TOFMS 해석에 의한 중쇄 선택성의 확인
(18-6-2)에서 생성한 항체·펩타이드 복합체에 100mM 트리스(2-카복시에틸)포스핀염산염 용액 2μL(항체에 대하여 등량)를 첨가하여 실온에서 15분 교반하였다. ESI-TOFMS에 의해 질량을 측정한 바, 원료의 트라스투주맙은 50596에 중쇄 피크, 23439에 경쇄 피크가 관측되었다. 반응물은 중쇄에 링커가 1개 도입된 55091, 경쇄에 원료와 동일한 23439에 피크가 관측되었다.
(18-6-4) 트라스투주맙의 특이적 수식체의 DAR calculator에 의한 펩타이드/항체 결합비의 확인
(18-6-2)에서 해석한 MS 데이터에 대하여, DAR calculator(Agilent사 소프트웨어)에 의해 펩타이드/항체 결합비의 확인을 행한 결과를 표 10에 나타낸다. 표 10의 DAR peak와 %Area로부터 산출된 평균 펩타이드/항체 결합비는 2.0이 되었다. 따라서, 하기 구조식으로 표시되는 항체 중간체(평균 펩타이드/항체 결합비 2.0)의 생성이 확인되었다.
[여기서, Ig는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하는 면역 글로불린 단위(IgG)를 나타내고, 또한, Eu numbering에 따르는 2개의 중쇄 중의 288/290위치에 존재하는 라이신 잔기의 측쇄 중의 아미노기를 통하여, Ig에 인접하는 2개의 카보닐기(C=O)와 아미드 결합을 형성하고 있고,
Y는 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 친화성 펩타이드를 나타내고,
Ig와, Ig에 인접하는 2개의 카보닐기(C=O)와의 사이의 평균 결합 비율 r은 2.0이다]
(18-6-5) 티오에스테르기의 절단에 의한 티올기 도입 항체 유도체의 제조
티올기 도입 항체 유도체는, (18-6-4)에서 얻어진 항체 중간체를, (18-1-8)에 기재되는 티오에스테르기의 절단 반응에 제공함으로써, (18-1-8)에 기재되는 티올기 도입 항체 유도체를 얻었다.
(18-7-1) 펩타이드와 링커의 결합
상기 2개의 아미노산 서열은 모두 서열번호 7의 아미노산 서열이다.
(18-1-1)에 기재된 방법으로 합성한 Ac-NMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIKEEC-NH2(서열번호 7)(30.0mg, 7.06μmol, 단, 5번째와 34번째의 2개의 시스테인은 각각 분자 내에서 디설파이드 결합을 형성하고 있다)에 (18-2-2)와 동일한 방법으로 링커를 결합하고, 상기 펩타이드 티오에스테르 링커 연결물-티오페놀 활성화체(12.0mg, 2.69μmol)를 얻었다.
MS(ESI) m/z: z = 4 1115.8［M＋4H]4+
(18-7-2) 항HER2 항체 트라스투주맙의 특이적 수식과 ESI-TOFMS에 의한 해석
(18-7-1)에서 합성한 펩타이드 링커 연결물은 디메틸설폭사이드에 용해하여 10mM로 하였다. 항HER2 항체 트라스투주맙(중외제약) 500μg을 50mM의 HEPES 버퍼(pH 8.2) 200μL(20μM)에 용해시키고, 10mM의 펩타이드 시약을 3.38μL(항체에 대하여 10등량) 첨가하여 실온에서 1시간 교반하였다. 반응액을 20mM 아세트산 암모늄 버퍼로 치환하였다. ESI-TOFMS에 의해 질량을 측정한 바, 원료의 트라스투주맙은 148223에 피크가 관측되었다. 결합성 펩타이드가 1개 도입된 152573, 결합성 펩타이드가 2개 도입된 156927의 피크가 확인되었다.
(18-7-3) 트라스투주맙의 특이적 수식체의 환원 조건에서의 ESI-TOFMS 해석에 의한 중쇄 선택성의 확인
(18-7-2)에서 생성한 항체·펩타이드 복합체에 100mM 트리스(2-카복시에틸)포스핀염산염 용액 2μL(항체에 대하여 등량)를 첨가하여 실온에서 15분 교반하였다. ESI-TOFMS에 의해 질량을 측정한 바, 원료의 트라스투주맙은 50596에 중쇄 피크, 23439에 경쇄 피크가 관측되었다. 반응물은 중쇄에 링커가 1개 도입된 54942, 경쇄에 원료와 동일한 23439에 피크가 관측되었다.
(18-7-4) 트라스투주맙의 특이적 수식체의 DAR calculator에 의한 펩타이드/항체 결합비의 확인
(18-7-2)에서 해석한 MS 데이터에 대하여, DAR calculator(Agilent사 소프트웨어)에 의해 펩타이드/항체 결합비의 확인을 행한 결과를 표 11에 나타낸다. 표 11의 DAR peak와 %Area로부터 산출된 평균 펩타이드/항체 결합비는 2.0이 되었다. 따라서, 하기 구조식으로 표시되는 항체 중간체(평균 펩타이드/항체 결합비 2.0)의 생성이 확인되었다.
[여기서, Ig는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하는 면역 글로불린 단위(IgG)를 나타내고, 또한, Eu numbering에 따르는 2개의 중쇄 중의 288/290위치에 존재하는 라이신 잔기의 측쇄 중의 아미노기를 통하여, Ig에 인접하는 2개의 카보닐기(C=O)와 아미드 결합을 형성하고 있고,
Y는 서열번호 7의 아미노산 서열로 표시되는 친화성 펩타이드를 나타내고,
Ig와, Ig에 인접하는 2개의 카보닐기(C=O)와의 사이의 평균 결합 비율 r은 2.0이다]
(18-7-5) 티오에스테르기의 절단에 의한 티올기 도입 항체 유도체의 제조
티올기 도입 항체 유도체는, (18-7-4)에서 얻어진 항체 중간체를, (18-1-8)에 기재되는 티오에스테르기의 절단 반응에 제공함으로써, (18-1-8)에 기재되는 티올기 도입 항체 유도체를 얻었다.
(18-7-6) 트립신 처리에 의한 펩타이드 맵핑
(18-7-5)에서 얻어진 트라스투주맙·티올 도입체에 대하여, 하기 공정으로 펩타이드 맵핑을 행하였다.
(18-7-6-1) 트라스투주맙·티올 도입체의 트립신 처리
(18-1-9-1)과 동일하게 하여 (18-7-5)에서 얻어진 트라스투주맙·티올 도입체의 트립신 처리를 행하였다.
(18-7-6-2) 트라스투주맙의 LC-MS/MS 측정
(18-1-9-2)와 동일한 조건으로 LC-MS/MS 측정을 행하였다.
(18-7-6-3) 트라스투주맙의 수식 부위의 해석
(18-1-9-3)과 동일하게 해석을 행하였다.
(18-7-6-4) 트라스투주맙의 LC-MS/MS에 의한 수식 부위의 해석 결과
LC-MS/MS를 사용한 해석의 결과, 트라스투주맙의 트립신 소화에 의한 라이신 잔기로의 수식 부위(요오도아세트아미드에 의한 Carbamidomethyl화를 받은 티올 도입체(+145.019Da))를 포함하는 아미노산 18잔기로 이루어진 펩타이드, FNWYVDGVEVHNAKTKPR(서열번호 3)의 펩타이드 프래그먼트의 MS 스펙트럼(실측값: m/z 769.04506, 이론값: 769.04482, 3가)이 관측되고(도 13), CID 스펙트럼에 의해 중쇄의 EU numbering에서의 288위치 또는 290위치의 라이신 잔기의 수식을 나타내는, 2가 y16에 상당하는 m/z 1022.71(이론값: 1022.51)의 프로덕트 이온이 확인되었다(도 14). 또한, BioPharma Finder에서의 해석에 의해, 288위치 또는 290위치의 라이신 잔기로의 수식이 고선택적으로 일어나 있는 것이 나타났다(도 15).
상기 결과로부터, 상기 (18-7-5)에서 얻어진 트라스투주맙·티올 도입체에서는, 항체의 중쇄 상, EU numbering에서의 Lys288 및 Lys290에 위치 선택적으로 콘쥬게이션이 진행되어 있음을 알 수 있었다.
(18-8-1) 펩타이드와 링커의 결합
상기 2개의 아미노산 서열은 모두 서열번호 8의 아미노산 서열이다.
(18-1-1)에 기재된 방법으로 합성한 Ac-MQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIKEEC-NH2(서열번호 8)(30.0mg, 7.06μmol, 단, 5번째와 34번째의 2개의 시스테인은 각각 분자 내에서 디설파이드 결합을 형성하고 있다)에 (18-2-2)와 동일한 방법으로 링커를 결합하고, 상기 펩타이드 티오에스테르 링커 연결물-티오페놀 활성화체(16.8mg, 3.87μmol)를 얻었다.
MS(ESI) m/z: z = 4 1087.3［M＋4H]4+
(18-8-2) 항HER2 항체 트라스투주맙의 특이적 수식과 ESI-TOFMS에 의한 해석
(18-8-1)에서 합성한 펩타이드 링커 연결물은 디메틸설폭사이드에 용해하여 10mM로 하였다. 항HER2 항체 트라스투주맙(중외제약) 500μg을 50mM의 HEPES 버퍼(pH 8.2) 200μL(20μM)에 용해시키고, 10mM의 펩타이드 시약을 3.38μL(항체에 대하여 10등량) 첨가하여 실온에서 1시간 교반하였다. 반응액을 20mM 아세트산 암모늄 버퍼로 치환하였다. ESI-TOFMS에 의해 질량을 측정한 바, 원료의 트라스투주맙은 148223에 피크가 관측되었다. 결합성 펩타이드가 1개 도입된 152457, 결합성 펩타이드가 2개 도입된 156692, 3개 도입된 160929의 피크가 확인되었다.
(18-8-3) 트라스투주맙의 특이적 수식체의 환원 조건에서의 ESI-TOFMS 해석에 의한 중쇄 선택성의 확인
(18-8-2)에서 생성한 항체·펩타이드 복합체에 100mM 트리스(2-카복시에틸)포스핀염산염 용액 2μL(항체에 대하여 등량)를 첨가하여 실온에서 15분 교반하였다. ESI-TOFMS에 의해 질량을 측정한 바, 원료의 트라스투주맙은 50596에 중쇄 피크, 23439에 경쇄 피크가 관측되었다. 반응물은 중쇄에 링커가 1개 도입된 54829, 경쇄에 원료와 동일한 23439에 피크가 관측되었다.
(18-8-4) 트라스투주맙의 특이적 수식체의 DAR calculator에 의한 펩타이드/항체 결합비의 확인
(18-8-2)에서 해석한 MS 데이터에 대하여, DAR calculator(Agilent사 소프트웨어)에 의해 펩타이드/항체 결합비의 확인을 행한 결과를 표 12에 나타낸다. 표 12의 DAR peak와 %Area로부터 산출된 평균 펩타이드/항체 결합비는 2.0이 되었다. 따라서, 하기 구조식으로 표시되는 항체 중간체(평균 펩타이드/항체 결합비 2.0)의 생성이 확인되었다.
[여기서, Ig는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하는 면역 글로불린 단위(IgG)를 나타내고, 또한, Eu numbering에 따르는 2개의 중쇄 중의 288/290위치에 존재하는 라이신 잔기의 측쇄 중의 아미노기를 통하여, Ig에 인접하는 2개의 카보닐기(C=O)와 아미드 결합을 형성하고 있고,
Y는 서열번호 8의 아미노산 서열로 표시되는 친화성 펩타이드를 나타내고,
Ig와, Ig에 인접하는 2개의 카보닐기(C=O)와의 사이의 평균 결합 비율 r은 2.0이다]
(18-8-5) 티오에스테르기의 절단에 의한 티올기 도입 항체 유도체의 제조
티올기 도입 항체 유도체는, (18-8-4)에서 얻어진 항체 중간체를, (18-1-8)에 기재되는 티오에스테르기의 절단 반응에 제공함으로써, (18-1-8)에 기재되는 티올기 도입 항체 유도체를 얻었다.
(18-9-1) 펩타이드와 링커의 결합
상기 2개의 아미노산 서열은 모두 서열번호 9의 아미노산 서열이다.
(18-9-1)에 기재된 방법으로 합성한 Ac-QCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIKEEC-NH2(서열번호 9)(30.0mg, 7.06μmol, 단, 5번째와 34번째의 2개의 시스테인은 각각 분자 내에서 디설파이드 결합을 형성하고 있다)에 (18-2-2)와 동일한 방법으로 링커를 결합하고, 상기 펩타이드 티오에스테르 링커 연결물-티오페놀 활성화체(14.1mg, 3.35μmol)를 얻었다.
MS(ESI) m/z: z = 4 1054.4［M＋4H]4+
(18-9-2) 항HER2 항체 트라스투주맙의 특이적 수식과 ESI-TOFMS에 의한 해석
(18-9-1)에서 합성한 펩타이드 링커 연결물은 디메틸설폭사이드에 용해하여 10mM로 하였다. 항HER2 항체 트라스투주맙(중외제약) 500μg을 50mM의 HEPES 버퍼(pH 8.2) 200μL(20μM)에 용해시키고, 10mM의 펩타이드 시약을 3.38μL(항체에 대하여 10등량) 첨가하여 실온에서 1시간 교반하였다. 반응액을 20mM 아세트산 암모늄 버퍼로 치환하였다. ESI-TOFMS에 의해 질량을 측정한 바, 원료의 트라스투주맙은 148223에 피크가 관측되었다. 결합성 펩타이드가 1개 도입된 152236, 결합성 펩타이드가 2개 도입된 156430, 3개 도입된 160541의 피크가 확인되었다.
(18-9-3) 트라스투주맙의 특이적 수식체의 환원 조건에서의 ESI-TOFMS 해석에 의한 중쇄 선택성의 확인
(18-9-2)에서 생성한 항체·펩타이드 복합체에 100mM 트리스(2-카복시에틸)포스핀염산염 용액 2μL(항체에 대하여 등량)를 첨가하여 실온에서 15분 교반하였다. ESI-TOFMS에 의해 질량을 측정한 바, 원료의 트라스투주맙은 50596에 중쇄 피크, 23439에 경쇄 피크가 관측되었다. 반응물은 중쇄에 링커가 1개 도입된 54698, 경쇄에 원료와 동일한 23439에 피크가 관측되었다.
(18-9-4) 트라스투주맙의 특이적 수식체의 DAR calculator에 의한 펩타이드/항체 결합비의 확인
(18-9-2)에서 해석한 MS 데이터에 대하여, DAR calculator(Agilent사 소프트웨어)에 의해 펩타이드/항체 결합비의 확인을 행한 결과를 표 13에 나타낸다. 표 13의 DAR peak와 %Area로부터 산출된 평균 펩타이드/항체 결합비는 2.0이 되었다. 따라서, 하기 구조식으로 표시되는 항체 중간체(평균 펩타이드/항체 결합비 2.0)의 생성이 확인되었다.
[여기서, Ig는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하는 면역 글로불린 단위(IgG)를 나타내고, 또한, Eu numbering에 따르는 2개의 중쇄 중의 288/290위치에 존재하는 라이신 잔기의 측쇄 중의 아미노기를 통하여, Ig에 인접하는 2개의 카보닐기(C=O)와 아미드 결합을 형성하고 있고,
Y는 서열번호 9의 아미노산 서열로 표시되는 친화성 펩타이드를 나타내고,
Ig와, Ig에 인접하는 2개의 카보닐기(C=O)와의 사이의 평균 결합 비율 r은 2.0이다]
(18-9-5) 티오에스테르기의 절단에 의한 티올기 도입 항체 유도체의 제조
티올기 도입 항체 유도체는, (18-9-4)에서 얻어진 항체 중간체를, (18-1-8)에 기재되는 티오에스테르기의 절단 반응에 제공함으로써, (18-1-8)에 기재되는 티올기 도입 항체 유도체를 얻었다.
(18-10-1) 항체의 Ly288/Lys290위치에 도입된 티올로의 생체 직교성 관능기의 도입
실시예 1의 아지드 링커 (1)을 사용하여, 실시예 (18-1-8)에서 합성한 Ly288/Lys290위치 티올 도입 항체를 수식하였다. 생성물에 트리스(2-카복시에틸)포스핀염산염 용액(0.5mM)을 첨가하여 실온에서 10분 교반하고, 이미 공개된 공보(WO2019/240287A1)에 따라서 ESI-TOFMS에 의해 질량을 측정하였다. 원료의 티올기 도입 항체는 50683, 50845에 중쇄 피크, 23439에 경쇄 피크가 관측되고, 생성물은 중쇄에 아지드기가 도입된 50816, 50978 및 원료와 동일한 23439에 경쇄 피크가 관측되었다.
동일한 수법으로, 실시예 2의 아지드 링커 (2)를 사용하여, 실시예 (18-1-8)에서 합성한 Ly288/Lys290위치 티올 도입 항체를 수식하였다. 생성물에 트리스(2-카복시에틸)포스핀염산염 용액(0.5mM)을 첨가하여 실온에서 10분 교반하고, 이미 공개된 공보(WO2019/240287A1)에 따라서 ESI-TOFMS에 의해 질량을 측정하였다. 원료의 티올기 도입 항체는 50683, 50845에 중쇄 피크, 23439에 경쇄 피크가 관측되고, 생성물은 중쇄에 아지드기가 도입된 50848, 51011 및 원료와 동일한 23439에 경쇄 피크가 관측되었다.
동일한 수법으로, 실시예 6에서 합성한 아지드 링커 (6)를 사용하여, 실시예 (18-1-8)에서 합성한 Ly288/Lys290위치 티올 도입 항체를 수식하였다. 반응액을 20mM 아세트산 암모늄 버퍼에 치환하고, 이미 공개된 공보(Anal. Chem., 2019, 91, 20, 12724-12732)의 수법에 준하여 ESI-TOFMS에 의해 질량을 측정한 바, 아지드기가 항체에 2개 도입된 149023의 피크가 확인되었다.
동일한 수법으로, 실시예 8의 알킨 링커 (8)을 사용하여, 실시예 (18-1-8)에서 합성한 Ly288/Lys290위치 티올 도입 항체를 수식하였다. 생성물에 트리스(2-카복시에틸)포스핀염산염 용액(0.5mM)을 첨가하여 실온에서 10분 교반하고, 이미 공개된 공보(WO2019/240287A1)에 따라서 ESI-TOFMS에 의해 질량을 측정하였다. 원료의 티올기 도입 항체는 50683, 50845에 중쇄 피크, 23439에 경쇄 피크가 관측되고, 생성물은 중쇄에 알킨기가 도입된 51137, 51304 및 원료와 동일한 23439에 경쇄 피크가 관측되었다.
동일한 수법으로, 실시예 11에서 합성한 알킨 링커 (11)을 사용하여, 실시예 (18-1-8)에서 합성한 Ly288/Lys290위치 티올 도입체를 수식하였다. 반응액을 20mM 아세트산 암모늄 버퍼로 치환하고, 이미 공개된 공보(Anal. Chem., 2019, 91, 20, 12724-12732)의 수법에 준하여 ESI-TOFMS에 의해 질량을 측정한 바, 알킨기가 항체에 2개 도입된 149185의 피크가 확인되었다.
실시예 19: 브랜치형 시약을 사용한 DAR = 4형의 ADC 합성
(19-1) 브랜치형 아지드 시약의 합성
(19-1-1)tert-Butyl N-[5-(tert-butoxycarbonylamino)-1-(hydrazinecarbonyl)pentyl]carbamate의 합성
9H-Fluoren-9-ylmethyl N[2,6-bis(tert-butoxycarbonylamino)hexanoylamino]carbamate(191mg, 0.328mmol)에 5% 피페리딘 함유 아세토니트릴 용액 3mL를 첨가하여 실온에서 3시간 교반하였다. TLC로 원료의 소실을 확인 후, 감압 하 농축함으로써 얻어진 조생성물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 생성물이 포함되는 유분을 회수하고, 감압 하 농축함으로써, tert-Butyl N-[5-(tert-butoxycarbonylamino)-1-(hydrazinecarbonyl)pentyl]carbamate를 얻었다(136mg).
MS(ESI) m/z: 361［M＋H]
1H NMR(400MHz, Chloroform-d) δ = 7.97(s, 1H), 5.33(s, 1H), 4.74(s, 1H), 4.12-4.04(m, 1H), 3.95(s, 2H), 3.11(q, J = 6.6, 2H), 1.84-1.77(m, 1H), 1.72-1.65(m, 1H), 1.54-1.37(m, 4H), 1.45(s, 18H).
(19-1-2) tert-butyl N-[5-(tert-butoxycarbonylamino)-1-(5-sulfanyl-1,3,4-oxadiazol-2-yl)pentyl]carbamete의 합성
tert-Butyl N-[5-(tert-butoxycarbonylamino)-1-(hydrazinecarbonyl)pentyl]carbamate(136.2mg, 0.328mmol)의 에탄올 용액(8mL)에 이황화탄소(0.034mL, 0.567mmol) 및 수산화칼륨(66.4mg, 1.18mmol)을 첨가하여 70℃에서 20시간 교반하였다. 반응액에 1N 염산을 첨가하여 감압 하 농축한 후, 아세트산 에틸로 추출하였다. 다음에 유기층을 감압 하 농축하여 얻어진 조생성물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 생성물이 포함되는 유분을 회수하고, 감압 하 농축함으로써, tert-butyl N-[5-(tert-butoxycarbonylamino)-1-(5-sulfanyl-1,3,4-oxadiazol-2-yl)pentyl]carbamete를 얻었다(94mg, 0.234mmol, 2공정 수율 71%).
MS(ESI) m/z: 401［M-H]
1H NMR(400MHz, Chloroform-d) δ = 5.14(s, 1H), 4.74(s, 1H), 4.55(s, 1H), 3.06(d, J = 6.7, 2H), 1.84-1.76(m, 2H), 1.46-1.41(m, 2H), 1.38(s, 18H), 1.22-1.20(m, 2H), 0.81(t, J = 6.8, 1H).
(19-1-3) tert-butyl N-[5-(tert-butoxycarbonylamino)-1-(5-methylsulfanyl-1,3,4-oxadiazol-2-yl)pentyl]carbamate의 합성
tert-butyl N-[5-(tert-butoxycarbonylamino)-1-(5-sulfanyl-1,3,4-oxadiazol-2-yl)pentyl]carbamete(94.1mg, 0.234mmol)의 THF 용액(3mL)을 0℃로 냉각하고, 요오드화 메틸(0.044mL, 0.702mmol) 및 트리에틸아민(0.097mL, 0.702mmol)을 첨가하였다. 실온으로 돌아가서 교반하여 TLC로 원료의 소실을 확인하였다. 반응액을 감압 하 농축해서 얻어진 조생성물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 생성물이 포함되는 유분을 회수하고, 감압 하 농축함으로써, tert-butyl N-[5-(tert-butoxycarbonylamino)-1-(5-methylsulfanyl-1,3,4-oxadiazol-2-yl)pentyl]carbamate를 얻었다(81mg, 0.194mmol, 수율 83%).
MS(ESI) m/z: 417［M＋H]
1H NMR(400MHz, Chloroform-d) δ = 5.08(s, 1H), 4.89(s, 1H), 4.53(s, 1H), 3.05(q, J = 6.6, 2H), 2.64(s, 3H), 1.89-1.74(m, 2H), 1.48-1.41(m, 4H), 1.37(d, J = 2.5, 18H).
(19-1-4) 1-(5-methylsulfanyl-1,3,4-oxadiazol-2-yl)pentane-1,5-diamine의 합성
tert-butyl N-[5-(tert-butoxycarbonylamino)-1-(5-methylsulfanyl-1,3,4-oxadiazol-2-yl)pentyl]carbamate(80.9mg, 0.194mmol)의 디클로로메탄 용액(5mL)에 트리플루오로아세트산(5mL)을 첨가하여 실온에서 2시간 교반한 후, 반응액을 감압 하 농축하였다. 얻어진 잔사에 1N 염산과 아세트산 에틸을 첨가하여 목적물을 수층에 추출하고, 동결 건조함으로써 1-(5-methylsulfanyl-1,3,4-oxadiazol-2-yl)pentane-1,5-diamine을 얻었다(57mg).
MS(ESI) m/z: 217［M＋H]
1H NMR(400MHz, Methanol-d) δ = 4.81(dd, J = 8.3, 5.8, 1H), 2.97(t, J = 7.7, 2H), 2.79(s, 3H), 2.22-2.09(m, 2H), 1.82-1.73(m, 2H), 1.61-1.50(m, 2H).
(19-1-5) 2-[2-[2-(2-azidoethoxy)ethoxy]ethoxy]-N-[5-[[2-[2-[2-(2-azidoethoxy)ethoxy]ethoxy]acetyl]amino]-5-(5-methylsulfanyl-1,3,4-oxadiazol-2-yl)pentyl]acetamide의 합성
1-(5-methylsulfanyl-1,3,4-oxadiazol-2-yl)pentane-1,5-diamine(57.3mg, 0.200mmol)의 DMF 용액(3mL)에 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide, hydrochloride(134.2mg, 0.700mmol), 트리에틸아민(0.139mL, 1.00mmol), N,N-디메틸아미노피리딘(4.9mg, 0.040mmol), 11-Azido-3,6,9-trioxaundecanoic acid(102.0mg, 0.44mmol)을 첨가하였다. 실온에서 3시간 교반한 후, 아직 원료가 남아 있었으므로, 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide, hydrochloride(40.0mg, 0.209mmol), 트리에틸아민(0.070mL, 0.505mmol), 11-Azido-3,6,9-trioxaundecanoic acid(37.0mg, 0.160mmol)을 추가하고 1시간 더 교반하였다. 반응액을 아세토니트릴수로 희석하고 분취 HPLC로 정제하여, 생성물이 포함되는 유분을 회수하였다. 감압 하 농축에 의해 아세토니트릴을 제거한 후, 수용액을 동결 건조함으로써 (1-4) 2-[2-[2-(2-azidoethoxy)ethoxy]ethoxy]-N-[5-[[2-[2-[2-(2-azidoethoxy)ethoxy]ethoxy]acetyl]amino]-5-(5-methylsulfanyl-1,3,4-oxadiazol-2-yl)pentyl]acetamide를 얻었다(48mg, 0.0734mmol, 2공정 수율 38%).
MS(ESI) m/z: 647［M＋H]
1H NMR(400MHz, Chloroform-d) δ = 7.46(d, J = 9.0, 1H), 7.01(t, J = 6.1, 1H), 5.35(td, J = 8.5, 6.2, 1H), 4.07(d, J = 3.2, 2H), 4.00(s, 2H), 3.79-3.58(m, 20H), 3.40(dt, J = 5.7, 4.3, 4H), 3.30(q, J = 6.9, 2H), 2.72(s, 3H), 2.15-2.01(m, 1H), 2.10-1.84(m, 1H), 1.68-1.53(m, 2H), 1.53-1.35(m, 2H).
(19-1-6) 2-[2-[2-(2-azidoethoxy)ethoxy]ethoxy]-N-[5-[[2-[2-[2-(2-azidoethoxy)ethoxy]ethoxy]acetyl]amino]-5-(5-methylsulfonyl-1,3,4-oxadiazol-2-yl)pentyl]acetamide의 합성
2-[2-[2-(2-azidoethoxy)ethoxy]ethoxy]-N-[5-[[2-[2-[2-(2-azidoethoxy)ethoxy]ethoxy]acetyl]amino]-5-(5-methylsulfanyl-1,3,4-oxadiazol-2-yl)pentyl]acetamide(47.5mg, 0.0734mmol)의 디클로로메탄 용액(2mL)에, 3-클로로과벤조산(약 30%의 물을 포함함)(112.4mg, 0.456mmol)을 첨가하였다. 실온에서 5시간 교반한 후, 반응액을 감압 하 농축해서 얻어진 잔사를 분취 HPLC로 정제하였다. 생성물이 포함되는 유분을 회수하고, 감압 하 농축하여 아세토니트릴을 제거한 후, 수용액을 동결 건조함으로써 목적물을 얻었다(92mg). 아직 불순물의 잔류가 확인되었으므로 컬럼 크로마토그래피로 다시 정제하였다. 생성물이 포함되는 유분을 회수하고, 감압 하 농축함으로써, 2-[2-[2-(2-azidoethoxy)ethoxy]ethoxy]-N-[5-[[2-[2-[2-(2-azidoethoxy)ethoxy]ethoxy]acetyl]amino]-5-(5-methylsulfonyl-1,3,4-oxadiazol-2-yl)pentyl]acetamide를 얻었다(31mg, 0.0457mmol, 수율 62%).
MS(ESI) m/z: 679［M＋H]
1H NMR(400MHz, Chloroform-d) δ = 7.67(d, J = 8.6, 1H), 7.04(t, J = 5.6, 1H), 5.46(td, J = 8.5, 6.2, 1H), 4.10(d, J = 5.4, 2H), 4.00(s, 2H), 3.76-3.64(m, 20H), 3.49(s, 3H), 3.44-3.37(m, 4H), 3.32(q, J = 6.8, 2H), 2.23-2.08(m, 1H), 2.08-1.94(m, 1H), 1.56-1.40(m, 2H), 1.38-1.21(m, 2H).
(19-2) 브랜치형 아지드 시약과 티올기 도입 항체의 콘쥬게이션
실시예 2(2)에 기재된 수법과 동일한 방법으로 티올기 도입 항체에 실시예 19-1-6에서 합성한 아지드 링커를 반응시켰다.
이미 공개된 공보(Anal. Chem., 2019, 91, 20, 12724-12732)의 수법에 따라 ESI-TOFMS에 의해 질량을 측정한 바, 아지드기가 항체에 4개 도입된 149620의 피크가 확인되었다.
(19-3) 클릭 반응에 의한 ADC의 합성
이미 공개된 공보(WO2019/240287A1 및 WO2019/240288A1) 및 실시예 15-1에 따라서, 실시예 19-2에서 얻어진 브랜치형 아지드 도입 트라스투주맙에 대하여, DBCO-VC-PAB-MMAE(ABZENA사 제조)의 DMF 용액(5mM)을 20당량 첨가하여 실온에서 20시간 교반 후, NAP-5 Columns(GE 헬스케어사 제조)를 사용하여 정제하여, ADC를 얻었다.
이미 공개된 공보(Anal. Chem., 2019, 91, 20, 12724-12732)의 수법에 준하여 ESI-TOFMS에 의해 질량을 측정한 바, DBCO-VC-PAB-MMAE가 항체에 4개 도입된 155284의 피크가 확인되었다.
(19-4) 브랜치형 보호 티올 시약의 합성
(19-4-1) tert-Butyl(1,3-dihydroxypropan-2-yl)carbamate의 합성
2-Amino-1,3-propanediol(186.2mg, 2.00mmol)의 메탄올 용액(1.8mL)에 t-부틸알코올(1.8mL)을 첨가하여, Di-tert-butyl dicarbonate(597.3mg, 2.60mmol)의 t-부틸알코올 용액(1.4mL)을 적하하였다. 실온에서 17시간 동안 교반한 후, 반응액을 감압 하 농축하였다. 얻어진 조생성물에 헥산(4mL)을 첨가하면 흰 고체가 석출되었다. 여과를 하여 고체를 헥산(3mL)으로 세정 후에 진공 라인에서 건조하고, tert-Butyl(1,3-dihydroxypropan-2-yl)carbamate를 얻었다(352.9mg, 1.845mmol, 수율 92%).
MS(ESI) m/z: 213［M＋Na]
1H NMR(400MHz, Chloroform-d) δ = 5.22(s, 1H), 3.84(qd, J = 11.0, 4.3, 4H), 3.71(s, 1H), 1.48(s, 9H)
(19-4-2) tert-Butyl N[2-allyoxy-1-(allyloxymethyl)ethyl]carbamete의 합성
tert-Butyl(1,3-dihydroxypropan-2-yl)carbamate(324.9mg, 1.70mmol)의 DMF용액(4mL)에 Allyl bromide(0.547mL, 6.34mmol)를 첨가하고, 수산화칼륨(359.0mg, 6.40mmol)을 조금씩 첨가하였다. 실온에서 4시간 교반한 후, 반응액을 감압 하 농축해서 얻어진 잔사에 디클로로메탄과 물을 첨가하여 추출하였다. 유기층을 포화 식염수로 세정 후, 진공 하 농축해서 얻어진 조생성물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 생성물이 포함되는 유분을 회수하고, 감압 하 농축함으로써 tert-Butyl N-[2-allyoxy-1-(allyloxymethyl)ethyl]carbamete를 얻었다(326.6mg, 1.20mmol, 수율 71%).
MS(ESI) m/z: 294［M＋Na]
1H NMR(400MHz, Chloroform-d) δ = 5.95-5.86(m, 2H), 5.29(dq, J = 17.2, 1.7, 2H), 5.20(dq, J = 10.4, 1.4, 2H), 4.94(s, 1H) 4.01(dt, J = 5.5, 1.5, 4H), 3.91(s, 1H), 3.58(dd, J = 9.4, 4.3, 2H), 3.51(dd, J = 9.4, 6.0, 2H), 1.47(s, 9H).
(19-4-3) S-[3-[3-acetylsulfanylpropoxy]-2-(tert-butoxycarbonylamino)propoxy]propyl]ethanethioate의 합성
tert-Butyl N[2-allyoxy-1-(allyloxymethyl)ethyl]carbamete(323.8mg, 1.19mmol)의 톨루엔 용액(7.4mL)에 2,2'-아조비스이소부티로니트릴(1.993g, 25.66mmol)을 첨가하였다. 현탁상의 반응액에 티오아세트산(0.890mL, 11.88mmol)을 5회로 나누어 첨가하고 65℃에서 21시간 교반하였다. 반응액을 실온으로 되돌리고 감압 하 농축함으로써 얻어진 조생성물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 생성물이 포함되는 유분을 회수하고, 감압 하 농축함으로써, S-[3-[3-acetylsulfanylpropoxy]-2-(tert-butoxycarbonylamino)propoxy]propyl]ethanethioate를 얻었다(362.0mg, 0.854mmol, 수율 72%).
MS(ESI) m/z: 446［M＋Na]
1H NMR(400MHz, Chloroform-d) δ = 4.95(s, 1H), 3.87(s, 1H), 3.55-3.44(m, 8H), 3.03-2.89(m, 4H), 2.35(s, 6H), 1.93-1.76(m, 4H), 1.47(s, 9H).
(19-4-4) S-[3-[3-(3-acetylsulfanylpropoxy)-2-amino-propoxy]propyl]ethanethioate의 합성
S-[3-[3-acetylsulfanylpropoxy]-2-(tert-butoxycarbonylamino)propoxy]propyl]ethanethioate(360.1mg, 0.850mmol)의 디클로로메탄 용액(2mL)에 트리플루오로아세트산(2mL)을 첨가하여 실온에서 1시간 교반하였다. 반응액을 감압 하 농축해서 얻어진 잔사에 0.1N 염산(10mL)을 첨가하여, 다시 감압 하 농축해서 얻어진 수용액을 동결 건조하여 S-[3-[3-(3-acetylsulfanylpropoxy)-2-amino-propoxy]propyl]ethanethioate의 염산염을 얻었다(384.4mg).
MS(ESI) m/z: 324［M＋H]
1H NMR(400MHz, Chloroform-d) δ = 4.51(s, 2H), 3.82-3.64(m, 5H), 3.64-3.45(m, 4H), 3.10-2.92(m, 4H), 2.37(s, 6H), 1.95-1.81(m, 4H).
(19-4-5) S-[3-[3-(3-acetylsulfanylpropoxy)-2-[3-(2,5-dioxoppyrrol-1-yl)propanoylamino]propoxy]propyl]ethanethioate의 합성
3-말레이미드프로피온산(17.6mg, 0.10mmol)의 THF 용액(1.5mL)에 o-Benzotriazol-1-yl-tetramethyluronium hexafluorophosphate(56.9mg, 0.15mmol), 트리에틸아민(0.021mL, 0.15mmol) 및 S-[3-[3-(3-acetylsulfanylpropoxy)-2-amino-propoxy]propyl]ethanethioate(53.2mg, 0.11mmol)의 THF 용액(0.5mL)을 첨가하였다. 실온에서 2시간 교반한 후, 반응액을 감압 하 농축해서 얻어진 조생성물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 생성물이 포함되는 유분을 회수하고, 감압 하 농축함으로써, S-[3-[3-(3-acetylsulfanylpropoxy)-2-[3-(2,5-dioxoppyrrol-1-yl)propanoylamino]propoxy]propyl]ethanethioate를 얻었다(18.7mg, 0.039mmol, 수율 41%).
MS(ESI) m/z: 475［M＋H]
1H NMR(400MHz, Chloroform-d) δ = 6.72(s, 2H), 6.43(s, 1H), 4.18(s, 1H), 3.88(t, J = 7.0, 2H), 3.59-3.38(m, 8H), 3.07-2.88(m, 4H), 2.61(t, J = 7.1, 2H) 2.36(s, 6H), 1.88-1.84(m, 4H).
(19-5) 브랜치형 보호 티올 시약과 티올기 도입 항체의 콘쥬게이션
실시예 2(2)에 기재된 수법과 동일한 방법으로 티올기 도입 항체에 실시예 19-4-5에서 합성한 브랜치형 링커를 반응시켰다.
이미 공개된 공보(Anal. Chem., 2019, 91, 20, 12724-12732)의 수법에 준하여 ESI-TOFMS에 의해 질량을 측정한 바, 보호 티올기가 항체에 4개 도입된 149392의 피크가 확인되었다.
(19-6) 티오에스테르기의 절단에 의한 브랜치형 티올기 도입 항체 유도체의 제조
(19-5)에서 얻어진 항체 중간체에 대하여, 이미 공개된 공보(WO2019/240287A1)에 따라 하이드록실아민 용액을 첨가하고 실온에서 1시간 정치하였다. 2시간 후, 20mM PBS 버퍼, 10mM EDTA(pH 7.4)로 치환하고, 티올기 도입 항체 유도체를 얻었다. ESI-TOFMS에 의해 질량을 측정한 바, 탈보호 반응이 진행된 149231에 피크가 확인되었다.
(19-7) ADC mimic의 합성
(19-7-1) Maleimide-VC-Pyrene의 합성
Maleimide-VC-Pyrene은 하기와 같이 합성하였다. 시판 MC-VC-PAB-PNP(CAS No:159857-81-5)와 이미 공지된 Sarcosine-pyrene(WO2018/218004A1)으로부터 1공정으로 합성하였다.
시판 MC-VC-PAB-PNP(CAS No: 159857-81-5)(15.5mg, 0.021mmol)을 디클로로메탄(1mL)에 용해시키고, N,N-디이소프로필에틸아민(0.025mL, 0.142mmol), 이미 공지된 Sarcosine-pyrene(WO2018/218004A1)(7.6mg, 0.025mmol)의 디메틸포름아미드 용액(0.5mL)을 첨가하여 17시간 교반하였다. 역상 분취 크로마토그래피로 정제한 후, 생성물이 포함되는 유분을 회수하고, 진공 농축함으로써 아세토니트릴을 제거하고, 동결 건조를 행함으로써, Maleimide-VC-Pyrene(7.3mg, 0.008mmol)을 얻었다.
1H NMR(400MHz,DMSO-d6) δ 9.98(s, 1H), 8.34(d, J = 9.2Hz, 2H), 8.32-8.23(m, 4H), 8.16(s, 2H), 8.10-8.00(m, 4H), 7.80(d, J = 8.8Hz, 1H), 7.59(d, J = 8.4Hz, 2H), 7.31(d, J = 8.0Hz, 2H), 6.99(s, 2H), 5.96(m, 1H), 5.40(s, 2H), 5.01(s, 2H), 4.95(d, J = 6.0Hz, 2H), 4.38(m, 1H), 4.19(m, 1H), 3.03-2.92(m, 3H), 2.67(m, 1H), 2.33(m, 1H), 2.20-2.07(m, 2H), 1.97(m, 1H), 1.67(m, 1H), 1.59(m, 1H), 1.51-1.45(m, 6H), 1.26-1.15(m, 3H), 0.83(dd, J = 12.8, 6.8Hz, 6H)
MS(ESI) m/z: 901.45［M＋H]+
(19-7-2) ADC mimic의 합성
실시예 19-6에서 얻어진 티올기 도입 항체의 buffer(pH 7.4 PBS 버퍼) 용액(20μM)에 실시예 19-7-1에서 합성한 Maleimide-VC-Pyrene의 DMF 용액(1.25mM)을 10당량 첨가하고 실온에서 2시간 정치 후, NAP-5 Columns(GE 헬스케어사 제조)를 사용하여 정제하여 ADC mimic을 얻었다.
이미 공개된 공보(Anal. Chem., 2019, 91, 20, 12724-12732)의 수법에 준하여 ESI-TOFMS에 의해 질량을 측정한 바, Maleimide-VC-Pyrene이 항체에 4개 도입된 152843의 피크가 확인되었다.
SEQUENCE LISTING <110> Ajinomoto Co., Inc. <120> Compound or salt thereof, and antibody obtained therefrom <130> PAMA-230253 <150> JP2021-005763 <151> 2021-01-18 <160> 9 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 449 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of heavy chain in trastuzumab <400> 1 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asp Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly <210> 2 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of light chain in trastuzumab <400> 2 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 3 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of peptide fragment obtained by cleaving trastuzumab with trypsin <400> 3 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 1 5 10 15 Pro Arg <210> 4 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Affinity peptide capable of binding to CH2 domain of immunoglobulin unit <400> 4 Phe Asn Met Gln Cys Gln Arg Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp Pro 1 5 10 15 Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Arg Ile Arg Ser Ile Lys Asp 20 25 30 Asp Cys <210> 5 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Affinity peptide capable of binding to CH2 domain of immunoglobulin unit <400> 5 Phe Asn Met Gln Cys Gln Arg Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp Pro 1 5 10 15 Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Arg Ile Arg Ser Ile Lys Glu 20 25 30 Asp Cys <210> 6 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Affinity peptide capable of binding to CH2 domain of immunoglobulin unit <400> 6 Phe Asn Met Gln Cys Gln Arg Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp Pro 1 5 10 15 Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Arg Ile Arg Ser Ile Lys Glu 20 25 30 Glu Cys <210> 7 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Affinity peptide capable of binding to CH2 domain of immunoglobulin unit <400> 7 Asn Met Gln Cys Gln Arg Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp Pro Asn 1 5 10 15 Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Arg Ile Arg Ser Ile Lys Glu Glu 20 25 30 Cys <210> 8 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Affinity peptide capable of binding to CH2 domain of immunoglobulin unit <400> 8 Met Gln Cys Gln Arg Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp Pro Asn Leu 1 5 10 15 Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Arg Ile Arg Ser Ile Lys Glu Glu Cys 20 25 30 <210> 9 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Affinity peptide capable of binding to CH2 domain of immunoglobulin unit <400> 9 Gln Cys Gln Arg Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp Pro Asn Leu Asn 1 5 10 15 Glu Glu Gln Arg Asn Ala Arg Ile Arg Ser Ile Lys Glu Glu Cys 20 25 30

Claims (29)

  1. (A) 하기 화학식 (A):
    [화학식 (A)]

    (식 중,
    Ab는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하고, 또한 중쇄 사이 및 중쇄와 경쇄 사이에 디설파이드 결합을 갖는 면역 글로불린 단위를 포함하는 항체이고,
    S는 황 원자이고,
    L은 2가 기이고,
    R은 보호되어 있어도 좋은 생체 직교성 관능기이고,
    n은 1 내지 8의 정수이다)로 표시되는, 보호되어 있어도 좋은 생체 직교성 관능기를 갖는 항체 중간체 또는 이의 염 및
    (B) 하기 화학식 (B):
    [화학식 (B)]

    (식 중,
    Ab는 화학식 (A)의 항체와 동일한 항체이고,
    SH는 티올기이고,
    n은 화학식 (A)의 n과 동일한 정수이다)로 표시되는, 티올기 도입 항체 또는 이의 염을 포함하고,
    화학식 (A)에서 항체(Ab)에 인접해 있는 황 원자(S) 및 화학식 (B)에서 항체(Ab)에 인접해 있는 티올기(SH)가, 항체 중쇄의 정상 영역 중의 동일 위치에 존재하는 동일 아미노산 잔기의 측쇄 중의 원자에 대하여, 직접 결합하고 있거나 또는 링커를 통하여 결합하고 있고,
    L-R로 표시되는 부분 구조의 분자량이 700 이하이고,
    상기 항체 중간체 또는 이의 염 및 상기 티올기 도입 항체 또는 이의 염의 합계량에 대한 상기 항체 중간체 또는 이의 염의 양의 백분율[100(%)×(상기 항체 중간체 또는 이의 염의 양)/(상기 항체 중간체 또는 이의 염 및 상기 티올기 도입 항체 또는 이의 염의 합계량)]이 80% 이상이고,
    상기 항체 중간체 또는 이의 염 및 상기 티올기 도입 항체 또는 이의 염의 응집률이 5% 이하인, 항체 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항체 중간체가 하기 화학식 (I'), (II'), (III') 또는 (IV'):
    [화학식 (I')]

    (식 중,
    Ab는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하고, 또한 중쇄 사이 및 중쇄와 경쇄 사이에 디설파이드 결합을 갖는 면역 글로불린 단위를 포함하는 항체이고,
    S는 황 원자이고,
    Q는 아릴렌 또는 알킬렌이고,
    Y는 결합손 또는 2가 기이고,
    R은 보호되어 있어도 좋은 생체 직교성 관능기이고,
    n은 1 내지 8의 정수이다),
    [화학식 (II')]

    (식 중,
    Ab는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하고, 또한 중쇄 사이 및 중쇄와 경쇄 사이에 디설파이드 결합을 갖는 면역 글로불린 단위를 포함하는 항체이고,
    S는 황 원자이고,
    Y는 결합손 또는 2가 기이고,
    R은 보호되어 있어도 좋은 생체 직교성 관능기이고,
    n은 1 내지 8의 정수이다),
    [화학식 (III')]

    (식 중,
    Ab는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하고, 또한 중쇄 사이 및 중쇄와 경쇄 사이에 디설파이드 결합을 갖는 면역 글로불린 단위를 포함하는 항체이고,
    S는 황 원자이고,
    Y는 결합손 또는 2가 기이고,
    R은 보호되어 있어도 좋은 생체 직교성 관능기이고,
    n은 1 내지 8의 정수이다) 또는
    [화학식 (IV')]

    (식 중,
    Ab는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하고, 또한 중쇄 사이 및 중쇄와 경쇄 사이에 디설파이드 결합을 갖는 면역 글로불린 단위를 포함하는 항체이고,
    S는 황 원자이고,
    Y는 결합손 또는 2가 기이고,
    R은 보호되어 있어도 좋은 생체 직교성 관능기이고,
    n은 1 내지 8의 정수이다)로 표시되는, 항체 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 아미노산 잔기가 시스테인 잔기 이외의 아미노산 잔기인, 항체 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 (A)에서 항체(Ab)에 인접해 있는 황 원자(S) 및 화학식 (B)에서 항체(Ab)에 인접해 있는 티올기(SH)가, 항체(Ab) 중쇄의 정상 영역 중의 동일 위치에 존재하는 라이신 잔기의 측쇄 중의 질소 원자에 대하여, 펩타이드를 함유하지 않는 링커를 통하여 위치 선택적으로 결합하고 있는, 항체 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 IgG 항체인, 항체 조성물.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 라이신 잔기가, EU numbering에서의 인간 IgG 중쇄의 246/248위치, 288/290위치 및 317위치로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1개 이상의 위치에 존재하는, 항체 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 중간체가 하기 화학식 (1') 내지 (12'):


    (식 중,
    k는 0 또는 1의 정수이고,
    m은 1 내지 5의 정수이고,
    m'는 1 내지 5의 정수이고,
    R2 및 R3은 각각 독립적으로, 수소 원자 또는 메틸이고,
    R6은 보호되어 있어도 좋은 생체 직교성 관능기이고,
    Ab, Ab에 인접하는 S, Q, R 및 n은 제2항에서 정의한 것과 같다)로 표시되는 항체 중간체로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는, 항체 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 보호되어 있어도 좋은 생체 직교성 관능기가 알킨 잔기 또는 아지드인, 항체 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 알킨 잔기가, 치환되어 있어도 좋은, 탄소 원자 사이 3중 결합을 갖는 환기(環基)인, 항체 조성물.
  10. 하기 화학식 (I), (II), (III) 또는 (IV):
    [화학식 (I)]

    (식 중,
    X는 할로겐 원자이고,
    Q는 아릴렌 또는 알킬렌이고,
    Y는 결합손 또는 2가 기이고,
    R은 보호되어 있어도 좋은 생체 직교성 관능기이다),
    [화학식 (II)]

    (식 중,
    R1은 알킬이고,
    Y는 2가 기이고,
    R은 보호되어 있어도 좋은 생체 직교성 관능기이다),
    [화학식 (III)]

    (식 중,
    Y는 2가 기이고,
    R은 보호되어 있어도 좋은 생체 직교성 관능기이다) 또는
    [화학식 (IV)]

    (식 중,
    Y는 2가 기이고,
    R은 보호되어 있어도 좋은 생체 직교성 관능기이다)로 표시되는 화합물 또는 이의 염을 포함하는, 티올기 도입 항체 또는 이의 염의 유도체화용 시약.
  11. 제10항에 있어서, 상기 시약이, 티올기 도입 항체 또는 이의 염에서의 시스테인 잔기 이외의 아미노산 잔기의 측쇄를 통하여 도입된 티올기와 반응함으로써 티올기 도입 항체 또는 이의 염을 유도체화하기 위한 시약인, 티올기 도입 항체 또는 이의 염의 유도체화용 시약.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 티올기 도입 항체에서의 티올기가, 항체 중쇄의 정상 영역 중의 라이신 잔기의 측쇄 중의 질소 원자에 대하여, 펩타이드를 함유하지 않는 링커를 통하여 위치 선택적으로 결합하고 있는, 티올기 도입 항체 또는 이의 염의 유도체화용 시약.
  13. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 티올기 도입 항체가 IgG 항체인, 티올기 도입 항체 또는 이의 염의 유도체화용 시약.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 라이신 잔기가, EU numbering에서의 인간 IgG 중쇄의 246/248위치, 288/290위치 및 317위치로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1개 이상의 위치에 존재하는, 티올기 도입 항체 또는 이의 염의 유도체화용 시약.
  15. 제10항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 2가 기가 알킬렌, 아릴렌, -C(=O)-, -NR2-, -C(=O)-NR2-, -NR2-C(=O)-, -O- 및 -(O-R3)m-으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1개의 기이거나, 또는
    2가 기가 알킬렌, 아릴렌, -C(=O)-, -NR2-, -C(=O)-NR2-, -NR2-C(=O)-, -O- 및 -(O-R3)m-으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 2개 이상의 기가 연결된 2가 기이고,
    R2가 수소 원자 또는 알킬이고,
    R3이 알킬렌 또는 아릴렌이고,
    m이 1 내지 5의 정수인, 티올기 도입 항체 또는 이의 염의 유도체화용 시약.
  16. 제10항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물이 하기 화학식 (1) 내지 (12):


    (식 중,
    k는 0 또는 1의 정수이고,
    m은 1 내지 5의 정수이고,
    m'는 1 내지 5의 정수이고,
    R2 및 R3은 각각 독립적으로, 수소 원자 또는 메틸이고,
    R6은 보호되어 있어도 좋은 생체 직교성 관능기이고,
    X, R1, Q 및 R은 제10항에서 정의한 것과 같다)로 표시되는 화합물로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는, 티올기 도입 항체 또는 이의 염의 유도체화용 시약.
  17. 하기 화학식 (I), (II), (III) 또는 (IV):
    [화학식 (I)]

    (식 중,
    X는 할로겐 원자이고,
    Q는 아릴렌 또는 알킬렌이고,
    Y는 2가 기이고,
    R은 보호되어 있어도 좋은 생체 직교성 관능기이다),
    [화학식 (II)]

    (식 중,
    R1은 알킬이고,
    Y는 2가 기이고,
    R은 보호되어 있어도 좋은 생체 직교성 관능기이다),
    [화학식 (III)]

    (식 중,
    Y는 2가 기이고,
    R은 보호되어 있어도 좋은 생체 직교성 관능기이다) 또는
    [화학식 (IV)]

    (식 중,
    Y는 2가 기이고,
    R은 보호되어 있어도 좋은 생체 직교성 관능기이다)로 표시되는, 화합물 또는 이의 염.
  18. 제17항에 있어서, 상기 화합물이 하기 화학식 (2) 내지 (12):


    (식 중,
    k는 0 또는 1의 정수이고,
    m은 1 내지 5의 정수이고,
    m'는 1 내지 5의 정수이고,
    R2 및 R3는 각각 독립적으로, 수소 원자 또는 메틸이고,
    R6은 보호되어 있어도 좋은 생체 직교성 관능기이고,
    X, R1, Q 및 R은 제17항에서 정의한 것과 같다)로 표시되는 화합물로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는, 화합물 또는 이의 염.
  19. 하기 화학식 (I'), (II'), (III') 또는 (IV'):
    [화학식 (I')]

    (식 중,
    Ab는 항체이고,
    S는 황 원자이고,
    Q는 아릴렌 또는 알킬렌이고,
    Y는 결합손 또는 2가 기이고,
    R은 보호되어 있어도 좋은 생체 직교성 관능기이고,
    n은 1 내지 8의 정수이다),
    [화학식 (II')]

    (식 중,
    Ab는 항체이고,
    S는 황 원자이고,
    Y는 결합손 또는 2가 기이고,
    R은 보호되어 있어도 좋은 생체 직교성 관능기이고,
    n은 1 내지 8의 정수이다),
    [화학식 (III')]

    (식 중,
    Ab는 항체이고,
    S는 황 원자이고,
    Y는 결합손 또는 2가 기이고,
    R은 보호되어 있어도 좋은 생체 직교성 관능기이고,
    n은 1 내지 8의 정수이다) 또는
    [화학식 (IV')]

    (식 중,
    Ab는 항체이고,
    S는 황 원자이고,
    Y는 결합손 또는 2가 기이고,
    R은 보호되어 있어도 좋은 생체 직교성 관능기이고,
    n은 1 내지 8의 정수이다)로 표시되는, 보호되어 있어도 좋은 생체 직교성 관능기를 갖는 항체 중간체 또는 이의 염.
  20. 제19항에 있어서, 상기 화학식 (I'), (II'), (III') 또는 (IV')에서 항체(Ab)에 인접해 있는 황 원자(S)가, 항체(Ab) 중쇄의 정상 영역 중의 시스테인 잔기 이외의 아미노산 잔기의 측쇄 중의 원자에 대하여, 직접 결합하고 있거나 또는 링커를 통하여 결합하고 있는, 항체 중간체 또는 이의 염.
  21. 제20항에 있어서, 상기 화학식 (I'), (II'), (III') 또는 (IV')에서 항체(Ab)에 인접해 있는 황 원자(S)가, 항체(Ab) 중쇄의 정상 영역 중의 라이신 잔기의 측쇄 중의 질소 원자에 대하여, 펩타이드를 함유하지 않는 링커를 통하여 위치 선택적으로 결합하고 있는, 항체 중간체 또는 이의 염.
  22. 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 중간체가 IgG 항체인, 항체 중간체 또는 이의 염.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서, 라이신 잔기가, EU numbering에서의 인간 IgG 중쇄의 246/248위치, 288/290위치 및 317위치로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1개 이상의 위치에 존재하는, 항체 중간체 또는 이의 염.
  24. 제19항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 중간체가 하기 화학식 (1') 내지 (12'):


    (식 중,
    k는 0 또는 1의 정수이고,
    m은 1 내지 5의 정수이고,
    m'는 1 내지 5의 정수이고,
    R2 및 R3은 각각 독립적으로, 수소 원자 또는 메틸이고,
    R6은 보호되어 있어도 좋은 생체 직교성 관능기이고,
    Ab, Ab에 인접하는 S, Q, R 및 n은 제18항에서 정의한 것과 같다)로 표시되는 항체 중간체로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는, 항체 중간체 또는 이의 염.
  25. 하기 화학식 (I), (II), (III) 또는 (IV):
    [화학식 (I)]

    (식 중,
    X는 할로겐 원자이고,
    Q는 아릴렌 또는 알킬렌이고,
    Y는 결합손 또는 2가 기이고,
    R은 보호되어 있어도 좋은 생체 직교성 관능기이다),
    [화학식 (II)]

    (식 중,
    R1은 알킬이고,
    Y는 2가 기이고,
    R은 보호되어 있어도 좋은 생체 직교성 관능기이다),
    [화학식 (III)]

    (식 중,
    Y는 2가 기이고,
    R은 보호되어 있어도 좋은 생체 직교성 관능기이다) 또는
    [화학식 (IV)]

    (식 중,
    Y는 2가 기이고,
    R은 보호되어 있어도 좋은 생체 직교성 관능기이다)로 표시되는 화합물 또는 이의 염을, 티올기 도입 항체 또는 이의 염과 반응시켜서
    하기 화학식 (I'), (II'), (III') 또는 (IV'):
    [화학식 (I')]

    (식 중,
    Ab는 항체이고,
    S는 황 원자이고,
    n은 1 내지 8의 정수이고,
    Q, Y 및 R은 화학식 (I)의 것과 동일하다).
    [화학식 (II')]

    (식 중,
    Ab는 항체이고,
    S는 황 원자이고,
    n은 1 내지 8의 정수이고,
    Y 및 R은 화학식 (II)의 것과 동일하다)
    [화학식 (III')]

    (식 중,
    Ab는 항체이고,
    S는 황 원자이고,
    n은 1 내지 8의 정수이고,
    Y 및 R은 화학식 (III)의 것과 동일하다) 또는
    [화학식 (IV')]

    (식 중,
    Ab는 항체이고,
    S는 황 원자이고,
    n은 1 내지 8의 정수이고,
    Y 및 R은 화학식 (IV)의 것과 동일하다)로 표시되는, 보호되어 있어도 좋은 생체 직교성 관능기를 갖는 항체 중간체 또는 이의 염을 생성하는 것을 포함하는, 보호되어 있어도 좋은 생체 직교성 관능기를 갖는 항체 중간체 또는 이의 염의 제조방법.
  26. 하기 화학식 (I"), (II"), (III") 또는 (IV"):
    [화학식 (I")]

    (식 중,
    Ab는 항체이고,
    S는 황 원자이고,
    Q는 아릴렌 또는 알킬렌이고,
    Y는 결합손 또는 2가 기이고,
    R'는 서로 반응 가능한 2개의 생체 직교성 관능기 사이의 반응에 의해 생성되는 기이고,
    Z는 기능성 물질이고,
    n은 1 내지 8의 정수이다),
    [화학식 (II")]

    (식 중,
    Ab는 항체이고,
    S는 황 원자이고,
    Y는 결합손 또는 2가 기이고,
    R'는 서로 반응 가능한 2개의 생체 직교성 관능기 사이의 반응에 의해 생성되는 기이고,
    Z는 기능성 물질이고,
    n은 1 내지 8의 정수이다),
    [화학식 (III")]

    (식 중,
    Ab는 항체이고,
    S는 황 원자이고,
    Y는 결합손 또는 2가 기이고,
    R'는 서로 반응 가능한 2개의 생체 직교성 관능기 사이의 반응에 의해 생성되는 기이고,
    Z는 기능성 물질이고,
    n은 1 내지 8의 정수이다) 또는
    [화학식 (IV")]

    (식 중,
    Ab는 항체이고,
    S는 황 원자이고,
    Y는 결합손 또는 2가 기이고,
    R'는 서로 반응 가능한 2개의 생체 직교성 관능기 사이의 반응에 의해 생성되는 기이고,
    Z는 기능성 물질이고,
    n은 1 내지 8의 정수이다)로 표시되는, 항체 및 기능성 물질의 콘쥬게이트 또는 이의 염.
  27. 제26항에 있어서, 상기 콘쥬게이트가, 하기 화학식 (1") 내지 (12"):


    (식 중,
    k는 0 또는 1의 정수이고,
    m은 1 내지 5의 정수이고,
    m'는 1 내지 5의 정수이고,
    R2 및 R3은 각각 독립적으로, 수소 원자 또는 메틸이고,
    R6'는 서로 반응 가능한 2개의 생체 직교성 관능기 사이의 반응에 의해 생성되는 기이고,
    Z'는 기능성 물질이고,
    Ab, Ab에 인접하는 S, Q, R', Z 및 n은 제26항에서 정의한 것과 같다)로 표시되는 콘쥬게이트로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는, 항체 및 기능성 물질의 콘쥬게이트 또는 이의 염.
  28. 하기 화학식 (I'), (II'), (III') 또는 (IV'):
    [화학식 (I')]

    (식 중,
    Ab는 항체이고,
    S는 황 원자이고,
    Q는 아릴렌 또는 알킬렌이고,
    Y는 결합손 또는 2가 기이고,
    R은 보호되어 있어도 좋은 생체 직교성 관능기이고,
    n은 1 내지 8의 정수이다),
    [화학식 (II')]

    (식 중,
    Ab는 항체이고,
    S는 황 원자이고,
    Y는 결합손 또는 2가 기이고,
    R은 보호되어 있어도 좋은 생체 직교성 관능기이고,
    n은 1 내지 8의 정수이다),
    [화학식 (III')]

    (식 중,
    Ab는 항체이고,
    S는 황 원자이고,
    Y는 결합손 또는 2가 기이고,
    R은 보호되어 있어도 좋은 생체 직교성 관능기이고,
    n은 1 내지 8의 정수이다) 또는
    [화학식 (IV')]

    (식 중,
    Ab는 항체이고,
    S는 황 원자이고,
    Y는 결합손 또는 2가 기이고,
    R은 보호되어 있어도 좋은 생체 직교성 관능기이고,
    n은 1 내지 8의 정수이다)로 표시되는, 보호되어 있어도 좋은 생체 직교성 관능기를 갖는 항체 중간체 또는 이의 염을, 항체 중간체에 의해 보유되는 생체 직교성 관능기와 반응 가능한 생체 직교성 관능기를 갖는 기능성 물질과 반응시켜서,
    하기 화학식 (I"), (II"), (III") 또는 (IV"):
    [화학식 (I")]

    (식 중,
    Ab, Ab에 인접하는 S, Q, Y 및 n은 화학식 (I')의 것과 동일하고,
    R'는 서로 반응 가능한 2개의 생체 직교성 관능기 사이의 반응에 의해 생성되는 기이고,
    Z는 기능성 물질이다),
    [화학식 (II")]

    (식 중,
    Ab, Ab에 인접하는 S, Y 및 n은 화학식 (II')의 것과 동일하고,
    R'는 서로 반응 가능한 2개의 생체 직교성 관능기 사이의 반응에 의해 생성되는 기이고,
    Z는 기능성 물질이다)
    [화학식 (III")]

    (식 중,
    Ab, Ab에 인접하는 S, Y 및 n은 화학식 (III')의 것과 동일하고,
    R'는 서로 반응 가능한 2개의 생체 직교성 관능기 사이의 반응에 의해 생성되는 기이고,
    Z는 기능성 물질이다) 또는
    [화학식 (IV")]

    (식 중,
    Ab, Ab에 인접하는 S, Y 및 n은 화학식 (IV')의 것과 동일하고,
    R'는 서로 반응 가능한 2개의 생체 직교성 관능기 사이의 반응에 의해 생성되는 기이고,
    Z는 기능성 물질이다)로 표시되는, 항체 및 기능성 물질의 콘쥬게이트 또는 이의 염을 생성하는 것을 포함하고,
    상기 항체 중간체 또는 이의 염이 알킨 잔기를 갖는 경우, 상기 항체 중간체 또는 이의 염은 아지드를 갖는 기능성 물질과 반응하고,
    상기 항체 중간체 또는 이의 염이 아지드를 갖는 경우, 상기 항체 중간체 또는 이의 염은 알킨 잔기를 갖는 기능성 물질과 반응되는, 항체 및 기능성 물질의 콘쥬게이트 또는 이의 염의 제조방법.
  29. 제28항에 있어서, 하기 화학식 (I), (II), (III) 또는 (IV):
    [화학식 (I)]

    (식 중,
    X는 할로겐 원자이고,
    Q, Y 및 R은 화학식 (I')의 것과 동일하다),
    [화학식 (II)]

    (식 중,
    R1은 알킬이고,
    Y 및 R은 화학식 (II')의 것과 동일하다)
    [화학식 (III)]

    (식 중,
    Y 및 R은 화학식 (III')의 것과 동일하다) 또는
    [화학식 (IV)]

    (식 중,
    Y 및 R은 화학식 (III')의 것과 동일하다)로 표시되는 화합물 또는 이의 염을, 티올기 도입 항체 또는 이의 염과 반응시켜서,
    상기 화학식 (I'), (II'), (III') 또는 (IV')로 표시되는, 보호되어 있어도 좋은 생체 직교성 관능기를 갖는 항체 중간체 또는 이의 염을 생성하는 것을 추가로 포함하는, 항체 및 기능성 물질의 콘쥬게이트 또는 이의 염의 제조방법.
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014144878A2 (en) 2013-03-15 2014-09-18 The Scripps Research Institute Novel thiol & amino modifying reagents for protein chemistry and methods of use thereof
WO2015001117A1 (en) 2013-07-04 2015-01-08 Universite De Strasbourg 3-aryl propiolonitrile compounds for thiol labeling

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FI102355B (fi) 1988-02-11 1998-11-30 Squibb Bristol Myers Co Menetelmä yhdistävän välikappaleen omaavien antrasykliini-immunokonjug aattien valmistamiseksi
US5622929A (en) 1992-01-23 1997-04-22 Bristol-Myers Squibb Company Thioether conjugates
US6214345B1 (en) 1993-05-14 2001-04-10 Bristol-Myers Squibb Co. Lysosomal enzyme-cleavable antitumor drug conjugates
WO1997011370A1 (en) * 1995-09-22 1997-03-27 Immunomedics, Inc. Recombinant proteins having multiple disulfide bonds and thiol-substituted conjugates thereof
ATE234635T1 (de) 1995-12-22 2003-04-15 Bristol Myers Squibb Co Verzweigte hydrazongruppen enthaltende kuppler
EP1243276A1 (en) 2001-03-23 2002-09-25 Franciscus Marinus Hendrikus De Groot Elongated and multiple spacers containing activatible prodrugs
EP1545613B9 (en) 2002-07-31 2012-01-25 Seattle Genetics, Inc. Auristatin conjugates and their use for treating cancer, an autoimmune disease or an infectious disease
US7705045B2 (en) 2002-11-14 2010-04-27 Syntarga, B.V. Prodrugs built as multiple self-elimination-release spacers
CN107213469A (zh) 2003-11-06 2017-09-29 西雅图基因公司 能够与配体偶联的单甲基缬氨酸化合物
DE102004026304B3 (de) 2004-05-28 2005-08-25 Atlas Elektronik Gmbh Prüfverfahren für ein Verfahren zur passiven Gewinnung von Zielparamentern
US20060246523A1 (en) * 2005-04-28 2006-11-02 Christopher Bieniarz Antibody conjugates
AU2007336897A1 (en) * 2006-12-22 2008-07-03 The Regents Of The University Of California Macromolecular conjugates of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein inhibitors and uses thereof
EP2231201B1 (en) * 2007-12-20 2018-02-14 General Electric Company Selective radiolabeling of biomolecules
MX2016007865A (es) * 2013-12-17 2017-01-11 Novartis Ag Peptidos citotoxicos y conjugados de los mismos.
EP3107563B1 (en) * 2014-02-21 2021-04-07 Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL) EPFL-TTO Glycotargeting therapeutics
KR20240046307A (ko) 2017-04-28 2024-04-08 아지노모토 가부시키가이샤 가용성 단백질에 대한 친화성 물질, 절단성 부분 및 반응성기를 갖는 화합물 또는 이의 염
US11629122B2 (en) 2017-05-24 2023-04-18 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Linkers for antibody drug conjugates
EP3808760A4 (en) 2018-06-14 2022-10-05 Ajinomoto Co., Inc. COMPOUND WITH AFFINITY FOR ANTIBODY, CLEAVAGE SITE AND REACTIVE GROUP OR SALT THEREOF
KR20210020015A (ko) 2018-06-14 2021-02-23 아지노모토 가부시키가이샤 항체에 대한 친화성 물질 및 생체 직교성 관능기를 갖는 화합물 또는 이의 염
EP3882261A4 (en) 2018-10-31 2023-02-08 Ajinomoto Co., Inc. COMPOUND COMPRISING A SUBSTANCE HAVING AN AFFINITY FOR AN ANTIBODY, CLEAVAGE SITE AND CORRESPONDING REACTIVE GROUP OR SALT
CN112098640B (zh) * 2020-09-16 2021-12-14 浙江正熙生物技术股份有限公司 荧光蛋白和/或偶联蛋白单克隆抗体标记方法及其试剂盒

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014144878A2 (en) 2013-03-15 2014-09-18 The Scripps Research Institute Novel thiol & amino modifying reagents for protein chemistry and methods of use thereof
WO2015001117A1 (en) 2013-07-04 2015-01-08 Universite De Strasbourg 3-aryl propiolonitrile compounds for thiol labeling

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