CN118119640A - 抗体和功能性物质的位点选择性的缀合物或其盐、以及其制造中使用的抗体衍生物和化合物或它们的盐 - Google Patents

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Abstract

本发明提供将抗体与功能性物质的结合比率控制在特定的范围、且所需性质优异的抗体和功能性物质的缀合物或其盐。更具体而言，本发明提供抗体和功能性物质的位点选择性的缀合物或其盐、以及与它们相关的物质，其包含下述式(I)所表示的结构单元：式(I)中，Ig表示包含2个重链和2个轻链的免疫球蛋白单元，且经由2个重链中的赖氨酸残基的侧链中的氨基与邻近Ig的L1位点选择性地键合，HG表示亲水性基团等，RA表示缬氨酸残基的侧链，RB表示瓜氨酸残基等的侧链，环A表示可具有取代基的2价芳族环基，R1和R2分别独立地表示氢原子或1价基团，L1和L2分别独立地表示2价基团，D表示功能性物质，r为1.5～2.5。

Description

抗体和功能性物质的位点选择性的缀合物或其盐、以及其制 造中使用的抗体衍生物和化合物或它们的盐
技术领域
本发明涉及抗体和功能性物质的位点选择性的缀合物或其盐、以及其制造中使用的抗体衍生物和化合物或它们的盐等。
背景技术
近年来，抗体药物复合物(Antibody-Drug Conjugate(抗体药物缀合物)：ADC)的研究开发正在积极地进行。ADC顾名思义是将药物(例如，抗癌药)与抗体缀合(偶联)而成的药剂，对癌细胞等具有直接的杀细胞活性。作为代表性的ADC，有Immunogene公司和Roche公司共同开发的T-DM1(商品名：Kadcyla(注册商标))。
ADC是通过将抗体中存在的特定氨基酸残基的侧链中的官能团与药物结合而制作的。用于制作ADC的这种官能团的例子是抗体中存在的赖氨酸残基的侧链中的氨基。作为对抗体中的赖氨酸基团(例如，246/248位、288/290位或317位的赖氨酸残基)位点选择性地进行修饰的技术，报道了几种技术(例如，专利文献1～4)。
在ADC中，抗体和药物经由接头连接。作为ADC中的接头，存在各种各样的接头。例如，在用作抗癌剂的ADC中，作为在人血浆中是稳定的、且为了在癌细胞内释放药物而具有能够用特定酶切割的结构的接头，存在包含由缬氨酸-瓜氨酸构成的二肽(Val-Cit：VC结构)的接头。包含这种二肽的接头，如下述(A)所示，在人血浆中是稳定的，但如下述(B)所示，通过人癌细胞内的溶酶体中的组织蛋白酶(cathepsin)B识别VC结构，并切割存在于瓜氨酸的羧基末端侧的酰胺键。因此，具有包含这种二肽的接头的ADC可在人癌细胞内释放药物，从而表达药效。
[化学式1]
(A)在人血浆中稳定
[化学式2]
(B)在人癌细胞内的溶酶体中切割
然而，具有包含上述二肽的接头的ADC在小鼠血浆中不稳定(非专利文献1和2)。这是由于，在小鼠血浆中存在Ces1c，所述Ces1c是识别VC结构并切割存在于瓜氨酸的羧基末端侧的酰胺键的羧化酶，故包含上述二肽的接头在血浆中会被Ces1c切割。因此，对于具有包含上述二肽的接头的ADC，在小鼠和人体中的体内动力学大不相同。因此，存在利用小鼠难以评价人体中的药效的问题。
[化学式3]
(C)小鼠血浆中的不希望的反应
如上所述，为了改善具有“抗体-间隔物(spacer)-VC结构-间隔物-药物”这种结构的ADC在小鼠血浆中的不稳定性，尝试了通过修饰接头(即，间隔物-VC结构-间隔物)来稳定ADC，从这种观点出发，报道了经由上述接头连接抗体和药物或其模拟物(mimic)的ADC。例如，作为不是在连接抗体和药物或其模拟物的主链中而是在其主链的侧链中包含上述接头的ADC，有以下报道(专利文献5)。
[化学式4]
Ab：抗体
Cbz：苄氧基羰基
Val：缬氨酸残基
Cit：瓜氨酸残基
然而，非专利文献3中记载了：ADC的疏水度越高，血浆清除率越快，以及可用HIC(疏水作用色谱(Hydrophobic Interaction Chromatography))-HPLC评价ADC的疏水度。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2018/199337号；
专利文献2：国际公开第2019/240288号；
专利文献3：国际公开第2019/240287号；
专利文献4：国际公开第2020/090979号；
专利文献5：国际公开第2015/038426号；
非专利文献
非专利文献1：Dorywalska等人，Bioconjugate Chem.，2015，26(4)，650-659；
非专利文献2：Dorywalska等人，Mol Cancer Ther.，2016，15(5)，958-70；
非专利文献3：Lyon等人，Nat Biotechnol.，2015，33(7)，733-5。
发明内容
发明所要解决的课题
本发明的目的在于提供将抗体与功能性物质的结合比率控制在特定的范围、且所需性质优异的抗体和功能性物质的缀合物或其盐。
用于解决课题的手段
本发明人进行了深入研究，结果发现了：在连接抗体和药物(或药物模拟物)的主链的侧链中包含特定结构的接头、且以所需范围(1.5～2.5)具有免疫球蛋白单元与功能性物质的结合的平均比率(功能性物质/免疫球蛋白单元)的位点选择性的缀合物，具有优异的性质。例如，这种位点选择性的缀合物或其盐具有：优异的清除率(体内停留时间长)、低凝集率(单体比率高)、基于组织蛋白酶B的高切割性(功能性物质在人细胞内的释放能力高)和在小鼠血浆中的稳定性高。这种位点选择性的缀合物或其盐由于在容易暴露于缀合物分子表面的侧链前端或其附近具有亲水性基团，因此可有效地提高分子整体的亲水性，而且可显示出上述优异的性质。
本发明人还成功地开发了对制作这种位点选择性的缀合物有用的抗体衍生物和化合物。式(I)～(VII)这种结构所表示的本发明的位点选择性的缀合物、抗体衍生物和化合物具有下述技术特征：共有式(V)所表示的结构单元中除X和Y以外的部分结构单元。本发明人成功地开发了具有这种技术特征的一系列发明，从而完成了本发明。现有技术没有记载也没有暗示本发明的位点选择性的缀合物的化学结构、和这种化学结构与上述的优异性质的关联性。另外，现有技术没有记载也没有暗示可用于制作这种位点选择性的缀合物的本发明的抗体衍生物和化合物。
即，本发明如下所述。
在第1实施方式中，本发明提供包含下述式(I)所表示的结构单元的抗体和功能性物质的位点选择性的缀合物或其盐：
[化学式5]
式中，
Ig表示包含2个重链和2个轻链的免疫球蛋白单元，且经由2个重链中的赖氨酸残基的侧链中的氨基与邻近Ig的L1位点选择性地键合，
HG表示亲水性基团或包含亲水性基团的1价基团，
RA表示缬氨酸残基的侧链，
RB表示瓜氨酸残基或丙氨酸残基的侧链，
环A表示可具有取代基的2价芳族环基，
R1和R2分别独立地表示氢原子或1价基团，
L1和L2分别独立地表示2价基团，
D表示功能性物质，
每2个重链的所述键合的平均比率r为1.5～2.5。
在特定的实施方式中，式(I)所表示的结构单元可以是下述式(I’)所表示的结构单元：
[化学式6]
式中，
Ig、RA、RB、环A、R1、R2、L1、L2、D和r分别与式(I)中所示的相同，
LHG表示键或可包含亲水性基团的2价基团，
RHG1和RHG2分别独立地表示氢原子、亲水性基团或可包含亲水性基团的1价基团，
至少1个亲水性基团被包含在选自LHG、RHG1和RHG2的1个以上的部位。
在第2实施方式中，本发明提供包含下述式(II)所表示的结构单元的位点选择性地具有生物正交性官能团的抗体衍生物或其盐：
[化学式7]
式中，
Ig表示包含2个重链和2个轻链的免疫球蛋白单元，且经由2个重链中的赖氨酸残基的侧链中的氨基与邻近Ig的L1位点选择性地键合，
HG表示亲水性基团或包含亲水性基团的1价基团，
RA表示缬氨酸残基的侧链，
RB表示瓜氨酸残基或丙氨酸残基的侧链，
环A表示可具有取代基的2价芳族环基，
R1和R2分别独立地表示氢原子或1价基团，
L1和L2分别独立地表示2价基团，
B2表示生物正交性官能团，
每2个重链的所述键合的平均比率r为1.5～2.5。
在特定的实施方式中，式(II)所表示的结构单元可以是下述式(II’)所表示的结构单元：
[化学式8]
式中，
Ig、RA、RB、环A、R1、R2、L1、L2、B2和r分别与式(II)中所示的相同，
LHG表示键或可包含亲水性基团的2价基团，
RHG1和RHG2分别独立地表示氢原子、亲水性基团或可包含亲水性基团的1价基团，
至少1个亲水性基团被包含在选自LHG、RHG1和RHG2的1个以上的部位。
在第3实施方式中，本发明提供下述式(III)所表示的具有生物正交性官能团和功能性物质的化合物或其盐：
[化学式9]
式中，
HG表示亲水性基团或包含亲水性基团的1价基团，
RA表示缬氨酸残基的侧链，
RB表示瓜氨酸残基或丙氨酸残基的侧链，
环A表示可具有取代基的2价芳族环基，
R1和R2分别独立地表示氢原子或1价基团，
L1和L2分别独立地表示2价基团，
B1表示生物正交性官能团，
D表示功能性物质。
在特定的实施方式中，式(III)所表示的化合物可以是下述式(III’)所表示的化合物：
[化学式10]
式中，
RA、RB、环A、R1、R2、L1、L2、B1和D分别与式(III)中所示的相同，
LHG表示键或可包含亲水性基团的2价基团，
RHG1和RHG2分别独立地表示氢原子、亲水性基团或可包含亲水性基团的1价基团，
至少1个亲水性基团被包含在选自LHG、RHG1和RHG2的1个以上的部位。
在第4实施方式中，本发明提供抗体的衍生试剂，其包含依据上述第3实施方式的化合物或其盐。
在第5实施方式中，本发明提供下述式(IV)所表示的具有第1生物正交性官能团和第2生物正交性官能团的化合物或其盐：
[化学式11]
式中，
HG表示亲水性基团或包含亲水性基团的1价基团，
RA表示缬氨酸残基的侧链，
RB表示瓜氨酸残基或丙氨酸残基的侧链，
环A表示可具有取代基的2价芳族环基，
R1和R2分别独立地表示氢原子或1价基团，
L1和L2分别独立地表示2价基团，
B1表示第1生物正交性官能团，
B2表示第2生物正交性官能团。
在特定的实施方式中，式(IV)所表示的化合物可以是下述式(IV’)所表示的化合物：
[化学式12]
式中，
RA、RB、环A、R1、R2、L1、L2、B1和B2分别与式(IV)中所示的相同，
LHG表示键或可包含亲水性基团的2价基团，
RHG1和RHG2分别独立地表示氢原子、亲水性基团或可包含亲水性基团的1价基团，
至少1个亲水性基团被包含在选自LHG、RHG1和RHG2的1个以上的部位。
在第6实施方式中，本发明提供抗体或功能性物质的衍生试剂，其包含依据上述第5实施方式的化合物或其盐。
在第7实施方式中，本发明提供下述式(V)所表示的化合物或其盐：
[化学式13]
式中，
HG表示亲水性基团或包含亲水性基团的1价基团，
RA表示缬氨酸残基的侧链，
RB表示瓜氨酸残基或丙氨酸残基的侧链，
环A表示可具有取代基的2价芳族环基，
X和Y分别独立地表示1价基团。
在特定的实施方式中，下述式(V)所表示的化合物可以是下述式(V’)所表示的化合物：
[化学式14]
式中，
RA、RB、环A、X和Y分别与式(V)中所示的相同，
LHG表示键或可包含亲水性基团的2价基团，
RHG1和RHG2分别独立地表示氢原子、亲水性基团或可包含亲水性基团的1价基团，
至少1个亲水性基团被包含在选自LHG、RHG1和RHG2的1个以上的部位。
在第8实施方式中，本发明提供下述式(VI)所表示的具有生物正交性官能团的化合物或其盐：
[化学式15]
式中，
HG表示亲水性基团或包含亲水性基团的1价基团，
RA表示缬氨酸残基的侧链，
RB表示瓜氨酸残基或丙氨酸残基的侧链，
环A表示可具有取代基的2价芳族环基，
X表示1价基团，
R2表示氢原子或1价基团，
L2表示2价基团，
B2表示生物正交性官能团。
在特定的实施方式中，式(VI)所表示的化合物可以是下述式(VI’)所表示的化合物：
[化学式16]
式中，
RA、RB、环A和X分别与式(VI)中所示的相同，
LHG表示键或可包含亲水性基团的2价基团，
RHG1和RHG2分别独立地表示氢原子、亲水性基团或可包含亲水性基团的1价基团，
至少1个亲水性基团被包含在选自LHG、RHG1和RHG2的1个以上的部位，
R2表示氢原子或1价基团，
L2表示2价基团，
B2表示生物正交性官能团。
在第9实施方式中，本发明提供下述式(VII)所表示的具有生物正交性官能团的化合物或其盐：
[化学式17]
式中，
HG表示亲水性基团或包含亲水性基团的1价基团，
RA表示缬氨酸残基的侧链，
RB表示瓜氨酸残基或丙氨酸残基的侧链，
环A表示可具有取代基的2价芳族环基，
Y表示1价基团，
R1表示氢原子或1价基团，
L1表示2价基团，
B1表示生物正交性官能团。
在特定的实施方式中，式(VII)所表示的化合物可以是下述式(VII’)所表示的化合物：
[化学式18]
式中，
RA、RB、环A和Y分别与式(VII)中所示的相同，
LHG表示键或可包含亲水性基团的2价基团，
RHG1和RHG2分别独立地表示氢原子、亲水性基团或可包含亲水性基团的1价基团，
至少1个亲水性基团被包含在选自LHG、RHG1和RHG2的1个以上的部位，
R1表示氢原子或1价基团，
L1表示2价基团，
B1表示生物正交性官能团。
在优选的实施方式中，上述免疫球蛋白单元可以是人免疫球蛋白单元。
在更优选的实施方式中，上述人免疫球蛋白单元可以是人IgG抗体。
在优选的实施方式中，上述赖氨酸残基可存在于依据EU编号的246/248位、288/290位或317位。
在优选的实施方式中，位点选择性的键合可通过赖氨酸残基的侧链中的氨基和L1中的羰基的键合形成的酰胺键达成。
在优选的实施方式中，上述r可以是1.9～2.1。
在优选的实施方式中，亲水性基团可以是选自羧酸基、磺酸基、羟基、聚乙二醇基、聚肌氨酸基和糖部分的1个以上的基团。
在优选的实施方式中，环A可以是可具有取代基的亚苯基。
在优选的实施方式中，功能性物质可以是药物、标记物质或稳定剂。
在优选的实施方式中，在通过尺寸排阻色谱法分析时，上述位点选择性的缀合物或抗体衍生物可显示2.6％以下的凝集率。
在优选的实施方式中，可包含亲水性基团的2价基团(-LHG-)可以是下述式(a)所表示的2价基团：
-(C(RHG)2)n1-(C＝O)n2-(NRHG)n3-(C(RHG)2)n4- (a)
式中，
多个RHG分别独立地表示氢原子、亲水性基团或可包含亲水性基团的1价基团，
n1为0～3的整数，
n2为0或1的整数，
n3为0或1的整数，
n4为0～3的整数。
在更优选的实施方式中，式(a)所表示的2价基团可以是下述式(a1)、(a2)或(a3)所表示的2价基团：
(a1)-(C(RHG)2)-；
(a2)-(C(RHG)2)-(C＝O)-(NRHG)-(C(RHG)2)-；或
(a3)-(C＝O)-(C(RHG)2)2-；
式中，
多个RHG分别独立地表示氢原子、亲水性基团或包含亲水性基团的碳原子数为1～6的烷基。
在优选的实施方式中，亲水性基团分别独立地可以是羧酸基、磺酸基或羟基。
在更优选的实施方式中，亲水性基团可以是羧酸基。
在优选的实施方式中，生物正交性官能团可以是马来酰亚胺残基、硫醇残基、呋喃残基、卤代羰基残基、烯烃残基、炔烃残基、叠氮残基或四嗪残基。
发明效果
本发明的位点选择性的缀合物或其盐可具有：体内停留时间长、单体比率高(低凝集率)、功能性物质在人细胞内的释放能力高和小鼠血浆中稳定性高等优异的性质。
本发明的抗体衍生物和化合物或它们的盐和试剂例如作为上述位点选择性的缀合物的制造中的合成中间体有用。
附图说明
[图1]图1是显示式(I)所表示的本发明的位点选择性的缀合物、式(II)所表示的本发明的抗体衍生物、以及式(III)～(VII)所表示的本发明的化合物的相互关系的图。这些物质共有式(V)所表示的结构单元中除X和Y以外的部分结构单元。另外，这些物质可通过图1中所示的方案进行合成。因此，本发明提供一系列与合成中间体和最终合成物有关的发明。
[图2]图2是显示式(I)所表示的本发明的位点选择性的缀合物、式(II)所表示的本发明的抗体衍生物、以及式(III)和(IV)所表示的本发明的化合物的合成概要的图。
[图3]图3是显示式(IV)～(VII)所表示的本发明的化合物的合成概要的一个例子的图。DIPEA：N，N-二异丙基乙胺；DMF：N，N-二甲基甲酰胺。
具体实施方式
1.一般术语的定义
在本发明中，术语“抗体”如下所述。另外，术语“免疫球蛋白单元”与作为这种抗体的基本构成要素的2价单体单元对应，是包含2个重链和2个轻链的单元。因此，关于免疫球蛋白单元，其来源、种类(多克隆或单克隆、同种型和全长抗体或抗体片段)、抗原、赖氨酸残基的位点和位点选择性的定义、示例和优选示例与以下说明的抗体同样。
对抗体的来源没有特别限定，例如可以是来源于哺乳动物、鸟类(例如，鸡)等动物的抗体。优选免疫球蛋白单元来源于哺乳动物。作为这种哺乳动物，例如可列举：灵长类(例如，人、猴、黑猩猩)、啮齿类(例如，小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、兔)、宠物(例如，狗、猫)、家畜(例如，牛、猪、山羊)、役用动物(例如，马、绵羊)，优选为灵长类或啮齿类，更优选为人。
抗体的种类可以是多克隆抗体或单克隆抗体。抗体也可以是2价抗体(例如，IgG、IgD、IgE)或4价以上的抗体(例如，IgA抗体、IgM抗体)。优选抗体为单克隆抗体。作为单克隆抗体，例如可列举：嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、添加有规定糖链的抗体(例如，修饰成具有N型糖链结合共有序列等的糖链结合共有序列的抗体)、双特异性抗体、Fc区蛋白、Fc融合蛋白。作为单克隆抗体的同种型，例如可列举：IgG(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgM、IgA、IgD、IgE和IgY。在本发明中，作为单克隆抗体，可利用全长抗体、或包含可变区以及CH1结构域和CH2结构域的抗体片段，但优选全长抗体。抗体优选为人IgG单克隆抗体，更优选为人IgG全长单克隆抗体。
作为抗体的抗原，可使用任意的抗原。例如，作为这种抗原，可列举：蛋白[包括寡肽、多肽。可以是用糖等生物分子修饰的蛋白(例如，糖蛋白)]、糖链、核酸、小分子(低分子)化合物。优选抗体可以是以蛋白为抗原的抗体。作为蛋白，例如可列举：细胞膜受体、除细胞膜受体以外的细胞膜蛋白(例如，细胞外基质蛋白)、配体、可溶性受体。
更具体而言，作为抗体的抗原的蛋白可以是疾病靶蛋白。作为疾病靶蛋白，例如可列举如下。
(1)癌症领域
PD-L1、GD2、PDGFRα(血小板衍生生长因子受体)、CD22、HER2、磷脂酰丝氨酸(PS)、EpCAM、纤连蛋白、PD-1、VEGFR-2、CD33、HGF、gpNMB、CD27、DEC-205、叶酸受体、CD37、CD19、Trop2、CEACAM5、S1P、HER3、IGF-1R、DLL4、TNT-1/B、CPAAs、PSMA、CD20、CD105(内皮糖蛋白)、ICAM-1、CD30、CD16A、CD38、MUC1、EGFR、KIR2DL1、2、NKG2A、腱生蛋白-C、IGF(胰岛素样生长因子)、CTLA-4、间皮素、CD138、c-Met、Ang2、VEGF-A、CD79b、ENPD3、叶酸受体α、TEM-1、GM2、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3、巨噬细胞抑制因子、CD74、Notch1、Notch2、Notch3、CD37、TLR-2、CD3、CSF-1R、FGFR2b、HLA-DR、GM-CSF、EphA3、B7-H3、CD123、gpA33、Frizzled7受体、DLL4、VEGF、RSPO、LIV-1、SLITRK6、Nectin-4、CD70、CD40、CD19、SEMA4D(CD100)、CD25、MET、组织因子、IL-8、EGFR、cMet、KIR3DL2、Bst1(CD157)、P-钙粘着蛋白、CEA、GITR、TAM(肿瘤相关巨噬细胞)、CEA、DLL4、Ang2、CD73、FGFR2、CXCR4、LAG-3、GITR、岩藻糖基GM1、IGF-1、血管生成素2、CSF-1R、FGFR3、OX40、BCMA、ErbB3、CD137(4-1BB)、PTK7、EFNA4、FAP、DR5、CEA、Ly6E、CA6、CEACAM5、LAMP1、组织因子、EPHA2、DR5、B7-H3、FGFR4、FGFR2、α2-PI、A33、GDF15、CAIX、CD166、ROR1、GITR、BCMA、TBA、LAG-3、EphA2、TIM-3、CD-200、EGFRvIII、CD16A、CD32B、PIGF、Axl、MICA/B、Thomsen-Friedenreich、CD39、CD37、CD73、CLEC12A、Lgr3、转铁蛋白受体、TGFβ、IL-17、5T4、RTK、免疫抑制蛋白、NaPi2b、Lewis血型B抗原、A34、赖氨酰氧化酶、DLK-1、TROP-2、α9整联蛋白、TAG-72(CA72-4)、CD70。
(2)自身免疫疾病/炎症性疾病
IL-17、IL-6R、IL-17R、INF-α、IL-5R、IL-13、IL-23、IL-6、ActRIIB、β7-整联蛋白、IL-4αR、HAS、嗜酸性粒细胞趋化因子-1、CD3、CD19、TNF-α、IL-15、CD3ε、纤连蛋白、IL-1β、IL-1α、IL-17、TSLP(胸腺基质淋巴细胞生成素)、LAMP(β4β7整联蛋白)、IL-23、GM-CSFR、TSLP、CD28、CD40、ILR-3、BAFF-R、MAdCAM、IL-31R、IL-33、CD74、CD32B、CD79B、IgE(免疫球蛋白E)、IL-17A、IL-17F、C5、FcRn、CD28、TLR4、MCAM、B7RP1、CXCR1、2配体、IL-21、钙粘着蛋白-11、CX3CL1、CCL20、IL-36R、IL-10R、CD86、TNF-α、IL-7R、Kv1.3、α9整联蛋白、LIFHT。
(3)脑神经疾病
CGRP、CD20、β淀粉样蛋白、β淀粉样蛋白原纤维、降钙素基因相关肽受体、LINGO(包括Ig结构域的1)、α突触核蛋白、细胞外tau、CD52、胰岛素受体、tau蛋白、TDP-43、SOD1、TauC3、JC病毒。
(4)感染症
艰难梭菌(Clostridium Difficile)毒素B、巨细胞病毒、RS病毒、LPS、金黄色葡萄球菌(S.Aureus)α-毒素、M2e蛋白、Psl、PcrV、金黄色葡萄球菌毒素、甲型流感、海藻酸盐、金黄色葡萄球菌、PD-L1、乙型流感、不动杆菌(Acinetobacter)、F-蛋白、Env、CD3、病原性大肠杆菌(Escherichia coli)、克雷伯氏菌(Klebsiella)、肺炎球菌(Pneumococcus)。
(5)遗传病/罕见疾病
淀粉样蛋白AL、SEMA4D(CD100)、胰岛素受体、ANGPTL3、IL4、IL13、FGF23、促肾上腺皮质激素、转甲状腺素蛋白(Transthyretin)、亨廷顿蛋白。
(6)眼病
因子D、IGF-1R、PGDFR、Ang2、VEGF-A、CD-105(内皮糖蛋白)、IGF-1R、β淀粉样蛋白。
(7)骨/整形外科领域
骨硬化蛋白(Sclerostin)、肌肉生长抑制素(Myostatin)、Dickkopf-1、GDF8、RNAKL、HAS、Siglec-15。
(8)血液疾病
vWF、因子IXa、因子X、IFNγ、C5、BMP-6、膜铁转运蛋白(Ferroportin)、TFPI。
(9)其它疾病
BAFF(B细胞活化因子)、IL-1β、PCSK9、NGF、CD45、TLR-2、GLP-1、TNFR1、C5、CD40、LPA、催乳素受体、VEGFR-1、CB1、内皮糖蛋白、PTH1R、CXCL1、CXCL8、IL-1β、AT2-R、IAPP。
作为单克隆抗体的具体例，可列举：特定的嵌合抗体(例如，利妥昔单抗、巴利昔单抗、英夫利昔单抗、西妥昔单抗、司妥昔单抗、达妥昔单抗、奥他妥沙西单抗(オルタトキサシマブ))、特定的人源化抗体(例如，达利珠单抗、帕利珠单抗、曲妥珠单抗、阿仑单抗、奥马珠单抗、依法利珠单抗、贝伐珠单抗、那他珠单抗(IgG4)、托珠单抗、依库珠单抗(IgG2)、莫格利珠单抗、帕妥珠单抗、奥妥珠单抗、维得利珠单抗、帕博利珠单抗(IgG4)、美泊利珠单抗、埃罗妥珠单抗、达雷木单抗、依奇珠单抗(IgG4)、瑞替珠单抗(IgG4)、阿替利珠单抗)、特定的人抗体(例如，阿达木单抗(IgG1)、帕尼单抗、戈利木单抗、乌司奴单抗、卡那单抗、奥法妥木单抗、地舒单抗(IgG2)、伊匹单抗、贝利木单抗、雷昔库单抗、雷莫芦单抗、纳武单抗、杜匹鲁单抗(IgG4)、司库奇尤单抗、依洛尤单抗(IgG2)、阿利西尤单抗、耐昔妥珠单抗、柏达鲁单抗(IgG2)、奥拉单抗)(在未提及IgG亚型的情况下，显示为IgG1)。
关于抗体中的氨基酸残基的位点和重链恒定区的位点(例如，CH2结构域)，依据EU编号(参照http：//www.imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/Hu_IGHGnber.html)。例如，在以人IgG为对象的情况下，246位的赖氨酸残基相当于人IgG CH2区的第16位的氨基酸残基，248位的赖氨酸残基相当于人IgG CH2区的第18位的氨基酸残基，288位的赖氨酸残基相当于人IgG CH2区的第58位的氨基酸残基，290位的赖氨酸残基相当于人IgG CH2区的第60位的氨基酸残基，317位的赖氨酸残基相当于人IgG CH2区的第87位的氨基酸残基。246/248位的表述表示246位或248位的赖氨酸残基是对象。288/290位的表述表示288位或290位的赖氨酸残基是对象。
根据本发明，可位点选择性地修饰构成抗体的免疫球蛋白单元中的重链中的特定的赖氨酸残基(例如，246/248位、288/290位或317位的赖氨酸残基)(例如，参照国际公开第2018/199337号、国际公开第2019/240288号、国际公开第2019/240287号和国际公开第2020/090979号)。本说明书中，“位点选择性的”或“位点选择性”是指，尽管在抗体中特定的氨基酸残基没有偏向于特定的区域，但可与抗体中的特定氨基酸残基结合的规定的结构单元偏向于抗体中的特定区域。因此，“位点选择性地具有”、“位点选择性的结合”、“以位点选择性的结合”等与位点选择性有关的表述是指，包含1个以上的特定氨基酸残基的靶区域中的规定的结构单元的持有率或结合率以显著水平高于包含与靶区域中的该特定氨基酸残基相同种类的多个氨基酸残基的非靶区域中的该结构单元的持有率或结合率。这种位点选择性可以是50％以上、优选为60％以上、更优选为70％以上、更进一步优选为80％以上、特别优选为90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.5％以上或100％。
本发明中，其它位点的特定氨基酸残基也可进一步被位点选择性地修饰，只要抗体中的重链中的特定赖氨酸残基被位点选择性地修饰即可。例如，关于位点选择性地修饰抗体中的规定位点的特定氨基酸残基的方法，记载于国际公开第2018/199337号、国际公开第2019/240288号、国际公开第2019/240287号和国际公开第2020/090979号中。作为这种特定氨基酸残基，可利用具有容易修饰的侧链(例如，氨基、羧基、酰胺基、羟基、硫醇基)的氨基酸残基(例如，赖氨酸残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、天冬酰胺残基、谷氨酰胺残基、苏氨酸残基、丝氨酸残基、酪氨酸残基、半胱氨酸残基)，但优选为具有包含氨基的侧链的赖氨酸残基、具有包含羟基的侧链的酪氨酸残基、丝氨酸残基和苏氨酸残基、或具有包含硫醇基的侧链的半胱氨酸残基，可更优选为赖氨酸残基(即，246/248位的赖氨酸残基、288/290位的赖氨酸残基和317位的赖氨酸残基中的2个赖氨酸残基可位点选择性地双重修饰、3个赖氨酸残基可位点选择性地三重修饰)。
(卤原子)
作为卤原子，例如可列举：氟原子、氯原子、溴原子、碘原子。
(1价基团)
作为1价基团，例如可列举：1价烃基和1价杂环基。
1价基团可被1个以上(例如为1～10个、优选为1～8个、更优选为1～6个、更进一步优选为1～5个、特别优选为1～3个)后述的取代基取代。
(1价烃基和与其相关的术语)
作为1价烃基，例如可列举：1价链状烃基、1价脂环式烃基和1价芳族烃基。
1价链状烃基是指仅由链状结构构成的烃基，主链不含环状结构。其中，链状结构可以是直链状也可以是支链状。作为1价链状烃基，例如可列举：烷基、烯基、炔基。烷基、烯基和炔基可以是直链状或支链状的任一种。
作为烷基，优选碳原子数为1～12的烷基，更优选碳原子数为1～6的烷基，进一步优选碳原子数为1～4的烷基。在烷基具有取代基的情况下，上述碳原子数中不包括取代基的碳原子数。作为碳原子数为1～12的烷基，例如可列举：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十二烷基。
作为烯基，优选碳原子数为2～12的烯基，更优选碳原子数为2～6的烯基，进一步优选碳原子数为2～4的烯基。在烯基具有取代基的情况下，上述碳原子数中不包括取代基的碳原子数。作为碳原子数为2～12的烯基，例如可列举：乙烯基、丙烯基、正丁烯基。
作为炔基，优选碳原子数为2～12的炔基，更优选碳原子数为2～6的炔基，进一步优选碳原子数为2～4的炔基。在炔基具有取代基的情况下，上述碳原子数中不包括取代基的碳原子数。作为碳原子数为2～12的炔基，例如可列举：乙炔基、丙炔基、正丁炔基。
作为1价链状烃基，优选烷基。
1价脂环式烃基是指仅包含脂环式烃作为环结构、而不含芳族环的烃基，脂环式烃可以是单环、多环的任一种。其中，无需仅由脂环式烃构成，其一部分中可包含链状结构。作为1价脂环式烃基，例如可列举：环烷基、环烯基、环炔基，它们可以是单环、多环的任一种。
作为环烷基，优选碳原子数为3～12的环烷基，更优选碳原子数为3～6的环烷基，进一步优选碳原子数为5～6的环烷基。在环烷基具有取代基的情况下，上述碳原子数中不包括取代基的碳原子数。作为碳原子数为3～12的环烷基，例如可列举：环丙基、环丁基、环戊基、环己基。
作为环烯基，优选碳原子数为3～12的环烯基，更优选碳原子数为3～6的环烯基，进一步优选碳原子数为5～6的环烯基。在环烯基具有取代基的情况下，上述碳原子数中不包括取代基的碳原子数。作为碳原子数为3～12的环烯基，例如可列举：环丙烯基、环丁烯基、环戊烯基、环己烯基。
作为环炔基，优选碳原子数为3～12的环炔基，更优选碳原子数为3～6的环炔基，进一步优选碳原子数为5～6的环炔基。在环炔基具有取代基的情况下，上述碳原子数中不包括取代基的碳原子数。作为碳原子数为3～12的环炔基，例如可列举：环丙炔基、环丁炔基、环戊炔基、环己炔基。
作为1价脂环式烃基，优选环烷基。
1价芳族烃基是指包含芳族环结构的烃基。其中，无需仅由芳族环构成，其一部分中可包含链状结构或脂环式烃，芳族环可以是单环、多环的任一种。作为1价芳族烃基，优选碳原子数为6～12的芳基，更优选碳原子数为6～10的芳基，进一步优选碳原子数为6的芳基。在1价芳族烃基具有取代基的情况下，上述碳原子数中不包括取代基的碳原子数。作为碳原子数为6～12的芳基，例如可列举：苯基、萘基。
作为1价芳族烃基，优选苯基。
这些之中，作为1价烃基，优选烷基、环烷基、芳基。
(1价杂环基和与其相关的术语)
1价杂环基是指从杂环化合物的杂环中去除1个氢原子后的基团。1价杂环基为1价芳族杂环基或1价非芳族杂环基。作为构成杂环基的杂原子，优选包含选自氧原子、硫原子、氮原子、磷原子、硼原子和硅原子的1种以上，更优选包含选自氧原子、硫原子和氮原子的1种以上。
作为1价芳族杂环基，优选碳原子数为1～15的芳族杂环基，更优选碳原子数为1～9的芳族杂环基，进一步优选碳原子数为1～6的芳族杂环基。在1价芳族杂环基具有取代基的情况下，上述碳原子数中不包括取代基的碳原子数。作为1价芳族杂环基，例如可列举：吡咯基、呋喃基、噻吩基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、三嗪基、吡唑基、咪唑基、噻唑基、异噻唑基、唑基、异唑基、三唑基、四唑基、吲哚基、嘌呤基、蒽醌基、咔唑基、芴基、喹啉基、异喹啉基、喹唑啉基和酞嗪基。
作为1价非芳族杂环基，优选碳原子数为2～15的非芳族杂环基，更优选碳原子数为2～9的非芳族杂环基，进一步优选碳原子数为2～6的非芳族杂环基。在1价非芳族杂环基具有取代基的情况下，上述碳原子数中不包括取代基的碳原子数。作为1价非芳族杂环基，例如可列举：环氧乙烷基、氮丙啶基、氮杂环丁烷基、氧杂环丁烷基、硫杂环丁烷基、吡咯烷基、二氢呋喃基、四氢呋喃基、二氧戊环基、四氢噻吩基、吡咯啉基、咪唑烷基、唑烷基、哌啶基、二氢吡喃基、四氢吡喃基、四氢噻喃基、吗啉基、硫代吗啉基、哌嗪基、二氢嗪基、四氢嗪基、二氢嘧啶基和四氢嘧啶基。
这些之中，作为1价杂环基，优选5元或6元的杂环基。
(2价基团)
2价基团是具有包含选自2价直链烃基、2价环状烃基、2价杂环基、-C(＝O)-、-C(＝S)-、-NR7-、-C(＝O)-NR7-、-NR7-C(＝O)-、-C(＝S)-NR7-、-NR7-C(＝S)-、-O-、-S-、-(O-R8)m-和-(S-R8)m1-的1个基团或它们的2个以上(例如为2～10个、优选为2～8个、更优选为2～6个、更进一步优选为2～5个、特别优选为2或3个)基团的主链结构的基团。R7表示氢原子或后述的取代基。R8表示2价直链烃基、2价环状烃基或2价杂环基。m1为1～10的整数、优选为1～8的整数、更优选为1～6的整数、更进一步优选为1～5的整数、特别优选为1～3的整数。
2价直链烃基为直链亚烷基、直链亚烯基或直链亚炔基。
直链亚烷基是碳原子数为1～6的直链亚烷基，优选碳原子数为1～4的直链亚烷基。作为直链亚烷基，例如可列举：亚甲基、亚乙基、正亚丙基、正亚丁基、正亚戊基、正亚己基。
直链亚烯基是碳原子数为2～6的直链亚烯基，优选碳原子数为2～4的直链亚烯基。作为直链亚烯基，例如可列举：亚乙烯基、正亚丙烯基、正亚丁烯基、正亚戊烯基、正亚己烯基。
直链亚炔基是碳原子数为2～6的直链亚炔基，优选碳原子数为2～4的直链亚炔基。作为直链亚炔基，例如可列举：亚乙炔基、正亚丙炔基、正亚丁炔基、正亚戊炔基、正亚己炔基。
作为2价直链烃基，优选直链亚烷基。
2价环状烃基为亚芳基或2价非芳族环状烃基。
作为亚芳基，优选碳原子数为6～14的亚芳基，更优选碳原子数为6～10的亚芳基，特别优选碳原子数为6的亚芳基。作为亚芳基，例如可列举：亚苯基、亚萘基、亚蒽基。
作为2价非芳族环状烃基，优选碳原子数为3～12的单环式或多环式的2价非芳族环状烃基，更优选碳原子数为4～10的单环式或多环式的2价非芳族环状烃基，特别优选碳原子数为5～8的单环式的2价非芳族环状烃基。作为2价非芳族环状烃基，例如可列举：亚环丙基、亚环丁基、亚环戊基、亚环己基、亚环庚基、亚环辛基。
作为2价环状烃基，优选亚芳基。
2价杂环基为2价芳族杂环基或2价非芳族杂环基。作为构成杂环的杂原子，优选包含选自氧原子、硫原子、氮原子、磷原子、硼原子和硅原子的1种以上，更优选包含选自氧原子、硫原子和氮原子的1种以上。
作为2价芳族杂环基，优选碳原子数为3～15的二价芳族杂环基，更优选碳原子数为3～9的二价芳族杂环基，特别优选碳原子数为3～6的二价芳族杂环基。作为2价芳族杂环基，例如可列举：吡咯二基、呋喃二基、噻吩二基、吡啶二基、哒嗪二基、嘧啶二基、吡嗪二基、三嗪二基、吡唑二基、咪唑二基、噻唑二基、异噻唑二基、唑二基、异唑二基、三唑二基、四唑二基、吲哚二基、嘌呤二基、蒽醌二基、咔唑二基、芴二基、喹啉二基、异喹啉二基、喹唑啉二基和酞嗪二基。
作为2价非芳族杂环基，优选碳原子数为3～15的非芳族杂环基，更优选碳原子数为3～9的非芳族杂环基，特别优选碳原子数为3～6的非芳族杂环基。作为2价非芳族杂环基，例如可列举：吡咯二酮二基、吡咯啉二酮二基、环氧乙烷二基、氮丙啶二基、氮杂环丁烷二基、氧杂环丁烷二基、硫杂环丁烷二基、吡咯烷二基、二氢呋喃二基、四氢呋喃二基、二氧戊环二基、四氢噻吩二基、吡咯啉二基、咪唑啉二基、唑烷二基、哌啶二基、二氢吡喃二基、四氢吡喃二基、四氢噻喃二基、吗啉二基、硫代吗啉二基、哌嗪二基、二氢嗪二基、四氢嗪二基、二氢嘧啶二基和四氢嘧啶二基。
作为2价杂环基，优选2价芳族杂环基。
优选地，2价基团是具有包含选自亚烷基、亚芳基、-C(＝O)-、-NR7-、-C(＝O)-NR7-、-NR7-C(＝O)-、-O-和-(O-R8)m-的1个基团的主链结构的二价基团；或者是具有包含选自亚烷基、亚芳基、-C(＝O)-、-NR7-、-C(＝O)-NR7-、-NR7-C(＝O)-、-O-和-(O-R8)m1-的2个以上基团的主链结构的二价基团，
R7为氢原子或烷基，
R8为亚烷基或亚芳基，
m1可以是1～5的整数(即，1、2、3、4或5)。
亚烷基、亚芳基、烷基与上述同样。
2价基团中的主链结构可被1个以上(例如为1～10个、优选为1～8个、更优选为1～6个、更进一步优选为1～5个、特别优选为1～3个)后述的取代基取代。
(取代基)
作为取代基，可列举如下：
(i)卤原子；
(ii)1价烃基；
(iii)1价杂环基；
(iv)芳烷基；
(v)Ra-O-、Ra-C(＝O)-、Ra-O-C(＝O)-或Ra-C(＝O)-O-(Ra表示氢原子或1价烃基)；或
(vi)NRbRc-、NRbRc-C(＝O)-、NRbRc-C(＝O)-O-或Rb-C(＝O)-NRc-(Rb和Rc相同或不同地表示氢原子或1价烃基)；
(vii)硝基、硫酸基、磺酸基、氰基和羧基。
上述取代基中的卤原子、1价烃基和1价杂环基的定义、示例和优选示例分别与上述同样。
芳烷基是指芳基烷基。芳基烷基中的芳基和烷基的定义、示例和优选示例如上所述。作为芳烷基，优选碳原子数为3～15的芳烷基。作为这种芳烷基，例如可列举：苯甲酰基、苯乙基、萘基甲基、萘基乙基。
优选地，取代基可如下：
(i)卤原子；
(ii)碳原子数为1～12的烷基、苯基或萘基；
(iii)碳原子数为3～15的芳烷基；
(iv)5元或6元的杂环；
(v)Ra-O-、Ra-C(＝O)-、Ra-O-C(＝O)-或Ra-C(＝O)-O-(Ra表示氢原子或碳原子数为1～12的烷基)；
(vi)NRbRc-、NRbRc-C(＝O)-、NRbRc-C(＝O)-O-或Rb-C(＝O)-NRc-(Rb和Rc相同或不同地表示氢原子或碳原子数为1～12的烷基)；或
(vii)与上述(vii)中列举的基团相同的基团。
更优选地，取代基可如下：
(i)卤原子；
(ii)碳原子数为1～12的烷基；
(iii)Ra-O-、Ra-C(＝O)-、Ra-O-C(＝O)-或Ra-C(＝O)-O-(Ra表示氢原子或碳原子数为1～12的烷基)；
(iv)NRbRc-、NRbRc-C(＝O)-、NRbRc-C(＝O)-O-或Rb-C(＝O)-NRc-(Rb和Rc相同或不同地表示氢原子或碳原子数为1～12的烷基)；或
(v)与上述(vii)中列举的基团相同的基团。
更进一步优选地，取代基可如下：
(i)卤原子；
(ii)碳原子数为1～6的烷基；
(iii)Ra-O-、Ra-C(＝O)-、Ra-O-C(＝O)-或Ra-C(＝O)-O-(Ra表示氢原子或碳原子数为1～6的烷基)；
(iv)NRbRc-、NRbRc-C(＝O)-、NRbRc-C(＝O)-O-或Rb-C(＝O)-NRc-(Rb和Rc相同或不同地表示氢原子或碳原子数为1～6的烷基)；或
(v)与上述(vii)中列举的基团相同的基团。
特别优选地，取代基可如下：
(i)卤原子；
(ii)碳原子数为1～4的烷基；
(iii)Ra-O-、Ra-C(＝O)-、Ra-O-C(＝O)-或Ra-C(＝O)-O-(Ra表示氢原子或碳原子数为1～4的烷基)；
(iv)NRbRc-、NRbRc-C(＝O)-、NRbRc-C(＝O)-O-或Rb-C(＝O)-NRc-(Rb和Rc相同或不同地表示氢原子或碳原子数为1～4的烷基)；或
(v)与上述(vii)中列举的基团相同的基团。
(亲水性基团)
亲水性基团是可使式(I)～(VII)或其下位概念的式所表示的结构单元更具亲水性的基团。通过在该结构单元中的规定部位具有亲水性基团，可使缀合物在小鼠血浆中更稳定。作为这种亲水性基团，例如可列举：羧酸基、磺酸基、羟基、聚乙二醇基、聚肌氨酸基、糖部分。在缀合物中可包含1个以上(例如，1个、2个、3个、4个或5个)亲水性基团。
聚乙二醇(PEG)基是-(CH2-CH2-O-)k1-所表示的2价基团。在缀合物具有聚乙二醇基的情况下，缀合物可具有聚乙二醇基的一个结合键与氢原子或1价基团(例如，1价烃基)键合的1价基团。k1例如可以是3以上的整数，优选为4以上的整数，更优选为5以上的整数，更进一步优选为6以上的整数。k1还可以是15以下的整数，优选为12以下的整数，更优选为10以下的整数，更进一步优选为9个以下的整数。更具体而言，k1可以是3～15的整数，优选为4～12的整数，更优选为5～10的整数，更进一步优选为4～9的整数。
聚肌氨酸基是-(NCH3-CH2-CO-)k2-所表示的2价基团。聚肌氨酸基可用作PEG的替代物。k2例如可以是3以上的整数，优选为4以上的整数，更优选为5以上的整数，更进一步优选为6以上的整数。k2还可以是15以下的整数，优选为12以下的整数，更优选为10以下的整数，更进一步优选为9个以下的整数。更具体而言，k2可以是3～15的整数，优选为4～12的整数，更优选为5～10的整数，更进一步优选为4～9的整数。
糖部分是单糖、低聚糖(例如，二糖、三糖、四糖、五糖)或多糖。糖部分可包含醛糖或酮糖或它们的组合。糖部分可以是核糖、脱氧核糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖或果糖、或氨基糖(例如，葡萄糖胺)等单糖或包含这种单糖的低聚糖或多糖。
在特定的实施方式中，糖部分可以是小分子量的亲水性基团。小分子亲水性基团是指分子量为1500以下的亲水性基团。小分子亲水性基团的分子量可优选为1200以下、1000以下、800以下、700以下、600以下、500以下、400以下、300以下、200以下或100以下。作为小分子亲水性基团，可列举：羧酸基、磺酸基、羟基、以及满足上述分子量的聚乙二醇基、聚肌氨酸基、糖部分(例如，单糖、低聚糖)。
(生物正交性官能团)
生物正交性官能团是指，不与生物构成成分(例如，氨基酸、蛋白、核酸、脂质、糖、磷酸)反应或与生物构成成分的反应速度慢、但选择性地与生物构成成分以外的成分反应的基团。生物正交性官能团在该技术领域中是已知的(例如，参照Sharpless K.B.等人，Angew.Chem.Int.第40版，2004(2015)；Bertozzi C.R.等人，Science 291，2357(2001)；Bertozzi C.R.等人，Nature Chemical Biology 1，13(2005))。
在本发明中，作为生物正交性官能团，使用针对蛋白的生物正交性官能团。这是由于适合用本发明的试剂衍生的引入硫醇基的抗体为蛋白。针对蛋白的生物正交性官能团是不与构成蛋白的20种天然氨基酸残基的侧链反应或与该侧链的反应速度慢、但与目标官能团反应的基团。构成蛋白的20种天然氨基酸为丙氨酸(A)、天冬酰胺(N)、半胱氨酸(C)、谷氨酰胺(Q)、甘氨酸(G)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、苯丙氨酸(F)、脯氨酸(P)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y)、缬氨酸(V)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、精氨酸(R)、组氨酸(H)和赖氨酸(K)。在这些20种天然氨基酸中，不具侧链(即，为氢原子)的甘氨酸、以及侧链为烃基(即，在侧链不含选自硫原子、氮原子和氧原子的杂原子)的丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和缬氨酸对于一般的反应呈惰性。因此，针对蛋白的生物正交性官能团是如下的基团：其不与具有对于一般的反应呈惰性的侧链的这些氨基酸的侧链反应或反应速度慢，而且也不与天冬酰胺、谷氨酰胺、蛋氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、组氨酸和赖氨酸的侧链反应或反应速度慢，但与目标官能团反应。
作为这种生物正交性官能团，例如可列举：叠氮残基、醛残基、硫醇残基、烯烃残基(换言之，只要具有作为具有碳碳双键的最小单元的亚乙烯基(ethenylene)部分即可。下同)、炔烃残基(换言之，只要具有作为具有碳碳三键的最小单元的亚乙炔基部分即可。下同)、卤素残基、四嗪残基、硝酮残基、羟胺残基、腈残基、肼残基、酮残基、硼酸残基、氰基苯并噻唑残基、烯丙基残基、膦残基、马来酰亚胺残基、二硫化物残基、硫酯残基、α-卤代羰基残基(例如，在α位具有氟原子、氯原子、溴原子或碘原子的羰基残基。下同)、异腈残基、悉尼酮残基、硒残基。
更具体而言，生物正交性官能团可与选自下述的任一个化学结构对应。
[化学式19]
在此，
R1a、单个或多个R1b和单个或多个R1c相同或不同，为上述的取代基或吸电子基团，
·为结合键。
作为吸电子基团，例如可列举：卤原子、被卤原子取代的烷基(例如，三氟甲基)、硼酸残基、甲磺酰基(Mesyl)、甲苯磺酰基(Tosyl)、三氟甲磺酸酯(Triflate)、硝基、氰基、苯基、酮基(例如，酰基)，优选卤原子、硼酸残基、甲磺酰基、甲苯磺酰基、三氟甲磺酸酯。
在特定的实施方式中，生物正交性官能团可受保护。可受保护的生物正交性官能团是指，未保护的生物正交性官能团或已受保护的生物正交性官能团。未保护的生物正交性官能团相当于上述的生物正交性官能团。已受保护的生物正交性官能团是通过保护基的切割而生成生物正交性官能团的基团。保护基的切割可在不会引起蛋白的变性/降解(例如，酰胺键的切割)的条件(温和条件)下通过特定处理来进行。作为这种特定处理，例如可列举：(a)利用选自酸性物质、碱性物质、还原剂、氧化剂、酶的1种以上的物质进行的处理；(b)通过选自光的物理化学刺激进行的处理；或(c)在使用了包含自分解的切割性部分的切割性接头的情况下的放置。这种保护基及其切割条件是该领域中的技术常识(例如，G.Leriche，L.Chisholm，A.Wagner，Bioorganic&Medicinal Chemistry.20，571(2012)；Feng P.等人，Jounal of American Chemical Society.132，1500(2010)；Bessodes M.等人，Journal of Controlled Release，99，423(2004)；DeSimone，J.M.，Journal ofAmerican Chemical Society.132，17928(2010)；Thompson，D.H.，Journal of ControlledRelease，91，187(2003)；Schoenmarks，R.G.，Journal of Controlled Release，95，291(2004))。
作为已受保护的生物正交性官能团，例如可列举：二硫化物残基、酯残基、缩醛残基、缩酮残基、亚胺残基、邻二醇(Vicinal diol)残基。
更具体而言，已受保护的生物正交性官能团可与选自以下的任一个化学结构对应。
[化学式20]
在此，与键正交的波浪线表示切割部位，
单个或多个的R2a相同或不同地选自氢原子或上述的取代基，
·为结合键。
优选可受保护的生物正交性官能团为未保护的生物正交性官能团。
(功能性物质)
对功能性物质没有特别限定，只要是对抗体赋予任意功能的物质即可，例如可列举：药物、标记物质、亲和性物质、转运用物质、稳定剂，优选可以是药物、标记物质、亲和性物质或转运用物质，或者也可以是药物或标记物质。另外，功能性物质可以是单一的功能性物质，或者可以是连接有2种以上功能性物质的物质。
作为药物，可以是针对任意疾病的药物。作为这种疾病，例如可列举：癌症(例如，肺癌、胃癌、大肠癌、胰腺癌、肾癌、肝癌、甲状腺癌、前列腺癌、膀胱癌、卵巢癌、子宫癌、骨癌、皮肤癌、脑瘤、黑色素瘤)、自身免疫疾病/炎症性疾病(例如，过敏性疾病、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮)、脑神经疾病(例如，脑梗塞、阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩性侧索硬化症)、感染症(例如，细菌感染症、病毒感染症)、遗传病/罕见疾病(例如，遗传性球形红细胞增多症、非营养不良性肌强直病)、眼病(例如，老年性黄斑变性、糖尿病视网膜病变、视网膜色素变性)、骨/整形外科领域的疾病(例如，变形性关节炎)、血液疾病(例如，白血病、紫癜)、其它疾病(例如，糖尿病、高脂血症等代谢异常症、肝脏疾病、肾病、肺病、循环系统疾病、消化系统疾病)。药物可以是疾病的预防或治疗药、副作用的缓解药。
更具体而言，药物可以是抗癌药。作为抗癌药，例如可列举：化疗药、毒素、放射性同位素或包含其的物质。作为化疗药，例如可列举：DNA损伤剂、代谢拮抗剂、酶抑制剂、DNA嵌入剂、DNA切割剂、拓扑异构酶抑制剂、DNA结合抑制剂、微管蛋白结合抑制剂、细胞毒性核苷、铂化合物。作为毒素，例如可列举：细菌毒素(例如，白喉毒素)、植物毒素(例如，蓖麻毒蛋白)。作为放射性同位素，例如可列举：氢原子的放射性同位素(例如，3H)、碳原子的放射性同位素(例如，14C)、磷原子的放射性同位素(例如，32P)、硫原子的放射性同位素(例如，35s)、钇的放射性同位素(例如，90Y)、锝的放射性同位素(例如，99mTc)、铟的放射性同位素(例如，111In)、碘原子的放射性同位素(例如，123I、125I、129I、131I)、钐的放射性同位素(例如，153Sm)、铼的放射性同位素(例如，186Re)、砹的放射性同位素(例如，211At)、铋的放射性同位素(例如，212Bi)。进一步具体而言，作为药物，可列举：澳瑞他汀(MMAE、MMAF)、美登素(DM1、DM4)、PBD(吡咯并苯并二氮杂)、IGN、喜树碱类似物、卡奇霉素(Calicheamicin)、倍癌霉素(Duocarmycin)、艾日布林(Eribulin)、蒽环类抗生素、dmDNA31、Tubulysin。
标记物质是可检测靶(例如，组织、细胞、物质)的物质。作为标记物质，例如可列举：酶(例如，过氧化物酶、碱性磷酸酶、萤光素酶、β-半乳糖苷酶)、亲和性物质(例如，链霉亲和素、生物素、地高辛、适配体)、荧光物质(例如，荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白)、发光物质(例如，萤光素、水母素、吖啶酯、三(2，2’-联吡啶)钌、鲁米诺)、放射性同位素(例如，上述的同位素)或包含其的物质。
亲和性物质是对靶标具有亲和性的物质。作为亲和性物质，例如可列举：抗体等亲和性蛋白或肽、适配体、凝集素、靶核酸的互补链。亲和性物质优选为亲和性蛋白或亲和性肽，可更优选为抗体。用作功能性物质的抗体所来源的动物种类与上述同样。
用作功能性物质的抗体种类可以是多克隆抗体或单克隆抗体。抗体也可以是2价抗体(例如，IgG、IgD、IgE)或4价以上的抗体(例如，IgA抗体、IgM抗体)。优选抗体为单克隆抗体。作为单克隆抗体，例如可列举：嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、添加了规定糖链的抗体(例如，修饰成具有N型糖链结合共有序列等的糖链结合共有序列的抗体)、双特异性抗体、Fc区蛋白、Fc融合蛋白。作为单克隆抗体的同种型，例如可列举：IgG(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgM、IgA、IgD、IgE和IgY。作为用作功能性物质的抗体，例如可列举：全长抗体及其片段(片段抗体)。片段抗体只要维持与所需抗原的结合性即可，例如可列举：Fab、Fab’、F(ab’)2、scFv。
用作功能性物质的抗体的抗原性可与本发明的抗体、抗体衍生物和缀合物中的免疫球蛋白单元的抗原性相同或不同，优选不同。另外，用作功能性物质的抗体的来源可与该免疫球蛋白单元的来源相同或不同，优选不同。因此，用作功能性物质的抗体可以是在上述单克隆抗体的具体例中提及的特定嵌合抗体、特定人源化抗体或特定人抗体或来自它们的抗体。用作功能性物质的抗体还可以是在上述单克隆抗体的具体例中提及的IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或来自其的抗体。
转运用物质是具有化合物的转运能力的物质。作为转运用物质，优选可在蛋白外壳(例如，多聚体)中内含化合物的物质(例如，人铁蛋白等铁蛋白、病毒颗粒、病毒样颗粒)。
稳定剂是可使抗体稳定的物质。作为稳定剂，例如可列举：二元醇类、甘油、非离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、天然系表面活性剂、糖类和多元醇类。
另外，功能性物质可以是肽、蛋白、核酸、小分子有机化合物、糖链、脂质、高分子聚合物、金属(例如，金)、螯合剂。作为肽，例如可列举：细胞穿透肽、血脑屏障穿透肽、肽药物。作为蛋白，例如可列举：酶、细胞因子、片段抗体、凝集素、干扰素、血清白蛋白、抗体。作为核酸，例如可列举：DNA、RNA、人造核酸。另外，作为核酸，例如可列举：RNA干扰诱导性核酸(例如，siRNA)、适配体、反义核酸。作为小分子有机化合物，例如可列举：蛋白降解诱导嵌合分子、色素、光分解性化合物。
在特定的实施方式中，功能性物质可以是具有芳族环的物质。作为具有芳族环的物质，例如可列举：单甲基澳瑞他汀(Monomethylauristatin)[例如，单甲基澳瑞他汀E(MMAE)、单甲基澳瑞他汀F(MMAF)]或依喜替康(Exatecan)。
(盐)
在本发明中，作为术语“盐”，例如可列举：与无机酸的盐、与有机酸的盐、与无机碱的盐、与有机碱的盐、以及与氨基酸的盐。作为与无机酸的盐，例如可列举：与氯化氢、溴化氢、磷酸、硫酸、硝酸的盐。作为与有机酸的盐，例如可列举：与甲酸、乙酸、三氟乙酸、乳酸、酒石酸、富马酸、草酸、马来酸、柠檬酸、琥珀酸、苹果酸、苯磺酸、对甲苯磺酸的盐。作为与无机碱的盐，例如可列举：与碱金属(例如，钠、钾)、碱土金属(例如，钙、镁)和锌、铝等其它金属、以及铵的盐。作为与有机碱的盐，例如可列举：与三甲胺、三乙胺、丙二胺、乙二胺、吡啶、乙醇胺、单烷基乙醇胺、二烷基乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺的盐。作为与氨基酸的盐，例如可列举：与碱性氨基酸(例如，精氨酸、组氨酸、赖氨酸、鸟氨酸)和酸性氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)的盐。盐优选为与无机酸(例如，氯化氢)的盐、或与有机酸(例如，三氟乙酸)的盐。
2.位点选择性的缀合物或其盐
本发明提供抗体和功能性物质的位点选择性的缀合物或其盐，其包含上述式(I)所表示的结构单元。本发明的缀合物的位点选择性如上所述。
在与本发明相关联而给出的式(I)和其它式中，-(连字符)表示在其两侧存在的2个单元(例如，原子、基团)共价键合。
抗体包含如上所述的免疫球蛋白单元。作为这种抗体，例如可列举：IgG抗体、IgD抗体和IgE抗体，其包含：包含2个重链和2个轻链、且在重链间和重链与轻链之间具有二硫键的免疫球蛋白单元；IgA抗体，其包含：包含4个重链和4个轻链、且在重链间和重链与轻链之间具有二硫键的免疫球蛋白单元；IgM抗体，其包含：包含8个重链和8个轻链、且在重链间和重链与轻链之间具有二硫键的免疫球蛋白单元，优选IgG抗体(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)。抗体优选为人IgG单克隆抗体，更优选为人IgG全长单克隆抗体。
位点选择性的键合优选通过赖氨酸残基的侧链中的氨基和可与其键合的原子或基团(例如，羰基、硫代羰基)之间的键合来达成，更优选通过赖氨酸残基的侧链中的氨基与羰基之间的酰胺键来达成。
式(I)中，HG表示亲水性基团或包含亲水性基团的1价基团。亲水性基团和1价基团如上所述。优选HG可表示包含亲水性基团的1价基团。
RA表示缬氨酸残基的侧链(即，-CH(CH3)2)。或者，RA可以是苯丙氨酸残基、苏氨酸残基、亮氨酸残基或丙氨酸残基的侧链。RA中的氨基酸残基的立体构型可以是L体也可以是D体，优选L体。
RB表示瓜氨酸残基的侧链(即，-CH2CH2CH2NHCONH2)或丙氨酸残基的侧链(即，-CH3)。或者，RB可以是谷氨酸残基、谷氨酰胺残基、赖氨酸残基、精氨酸残基、苏氨酸残基或蛋氨酸残基的侧链。RB中的氨基酸残基的立体构型分别可以是L体也可以是D体，优选L体。
RA和RB的组合优选：RA为缬氨酸残基的侧链、且RB为瓜氨酸残基或丙氨酸残基的侧链。或者，RA和RB的组合的优选其它例如下：
(a)RA为缬氨酸残基的侧链、且RB为谷氨酸残基、赖氨酸残基、精氨酸残基或苏氨酸残基的侧链；
(b)RA为苯丙氨酸残基的侧链、且RB为赖氨酸残基、精氨酸残基或谷氨酰胺残基的侧链；
(c)RA为苏氨酸残基的侧链、且RB为苏氨酸残基或蛋氨酸残基的侧链；
(d)RA为亮氨酸残基的侧链、且RB为谷氨酸残基的侧链；和
(e)RA为丙氨酸残基的侧链、且RB为丙氨酸残基的侧链。
环A表示可具有取代基的2价芳族环基。2价芳族环基为上述的亚芳基或2价芳族杂环。对2个邻近原子(碳原子和氮原子)键合的2价芳族环基的位置没有特别限定，只要在通过组织蛋白酶B切割存在于瓜氨酸的羧基末端侧的酰胺键的情况下，由于π电子的共轭而在-O-(C＝O)-中的氧原子与羰基之间产生开裂即可(例如，参照背景技术中的“(B)在人癌细胞内的溶酶体中说明”所示的切割反应)。这种位置是该领域中的技术常识，根据2价芳族环基的种类等因素，本领域技术人员可容易地确定。
优选环A可以是可具有取代基的2价单环式芳族环基。2价芳族环基为亚苯基或2价单环式芳族杂环基。
更优选环A可以是2价6元环式芳族环基。作为6元环式芳族环基，例如可列举：上述的各种基团。在该情况下，2个邻近原子键合的2价6元环式芳族环基的位置为邻位或对位，优选为对位。
更进一步优选环A可以是可具有取代基的亚苯基。在该情况下，2个邻近原子键合的亚苯基的位置为邻位或对位，优选为对位。
可具有取代基的2价芳族环基中的取代基如上所述。这种取代基可以是如上所述的吸电子基团。
R1和R2分别独立地表示氢原子或1价基团。1价基团如上所述。R1和R2中的1价基团优选可具有取代基的1价烃基，更优选可具有取代基的烷基，更进一步优选烷基。作为烷基，优选上述的基团。
在特定的实施方式中，R1和R2所示的1价基团可以是氨基的保护基。作为这种保护基，例如可列举：烷基羰基(酰基)(例如，乙酰基、丙氧基、叔丁氧基羰基等丁氧基羰基)、烷氧基羰基(例如，芴基甲氧基羰基)、芳氧基羰基、芳基烷基(芳烷基)氧基羰基(例如，苄氧基羰基)。
在优选的实施方式中，R1和R2分别独立地表示氢原子或氨基的保护基。优选R1和R2分别可以是氢原子。
L1和L2所示的2价基团如上所述。
在特定的实施方式中，L1和L2所示的2价基团分别可包含通过可相互反应的2个生物正交性官能团的反应而生成的部分。由于可相互反应的2个生物正交性官能团的组合是已知的，因此本领域技术人员可适宜选择这种组合，从而适宜设定包含通过可相互反应的2个生物正交性官能团的反应而生成的部分的2价基团。作为可相互反应的生物正交性官能团的组合，例如可列举：硫醇残基与马来酰亚胺残基的组合、呋喃残基与马来酰亚胺残基的组合、硫醇残基与卤代羰基残基的组合(通过取代反应，卤素被硫醇取代)、炔烃残基(优选为可被上述取代基取代的具有碳碳三键的环基)与叠氮残基的组合、四嗪残基与烯烃残基的组合、四嗪残基与炔烃残基的组合、硫醇残基与其它硫醇残基的组合(二硫键)。因此，上述部分可以是通过硫醇残基与马来酰亚胺残基的反应而生成的基团、通过呋喃残基与马来酰亚胺残基的反应而生成的基团、通过硫醇残基与卤代羰基残基的反应而生成的基团、通过炔烃残基与叠氮残基的反应而生成的基团或通过四嗪残基与烯烃残基的反应而生成的基团、通过硫醇残基与其它硫醇残基的组合而生成的二硫基(Disulfide group，二硫化物基)。
在特定的实施方式中，上述部分可以是由下述结构式中的任一个结构式表示的2价基团。
[化学式21]
在此，白圆和黑圆表示结合键。
在L1中，在白圆的结合键与存在于Ig结合部侧的原子键合的情况下，黑圆的结合键也可与存在于“N-R1”中的氮原子(N)结合部侧的原子键合，
在白圆的结合键与存在于“N-R1”中的氮原子(N)结合部侧的原子键合的情况下，黑圆的结合键也可与存在于Ig结合部侧的原子键合。
在L2中，在白圆的结合键与存在于“N-R2”中的氮原子(N)结合部侧的原子键合的情况下，黑圆的结合键也可与存在于功能性物质(D)结合部侧的原子键合，
在白圆的结合键与存在于功能性物质(D)结合部侧的原子键合的情况下，黑圆的结合键也可与存在于“N-R2”中的氮原子(N)结合部侧的原子键合。
D所示的功能性物质如上所述。
r表示每2个重链的所述键合的平均比率，为1.5～2.5。这种平均比率可优选为1.6以上，更优选为1.7以上，更进一步优选为1.8以上，特别优选为1.9以上。这种平均比率还可优选为2.4以下，更优选为2.3以下，更进一步优选为2.2以下，特别优选为2.1以下。更具体而言，这种平均比率可优选为1.6～2.4，更优选为1.7～2.3，更进一步优选为1.8～2.2，特别优选为1.9～2.1。
在特定的实施方式中，本发明的位点选择性的缀合物或其盐具有难以凝集的所需性质，因此可通过凝集率来特定。更具体而言，本发明的缀合物或其盐的凝集率可以是5％以下。原因是，根据本发明容易避免抗体的凝集。凝集率优选为4.8％以下，更优选为4.6％以下，更进一步优选为4.4％以下，特别优选为4.2％以下、4.0％以下、3.8％以下、3.6％以下、3.4％以下、3.2％以下、3.0％以下、2.8％以下或2.6％以下。抗体的凝集率可通过尺寸排阻色谱法(SEC)-HPLC进行测定(参照实施例和ChemistrySelect，2020，5，8435-8439)。
在优选的实施方式中，本发明的位点选择性的缀合物或其盐可以是2.6％以下的凝集率。凝集率还可以是2.4％以下、2.2％以下、2.0％以下、1.8％以下或1.6％以下。
优选式(I)所表示的结构单元可由式(I’)表示。式(I’)所示的Ig、RA、RB、环A、R1、R2、L1、L2、D和r分别与式(I)中所示的相同。
式(I’)中，LHG表示键或可包含亲水性基团的2价基团。亲水性基团和2价基团如上所述。可包含亲水性基团的2价基团可被包含在连接邻近LHG的氮原子和碳原子的主链中或该主链的侧链中，优选被包含在该主链的侧链中。
优选可包含亲水性基团的2价基团(-LHG-)可以是下述式(a)所表示的2价基团：
-(C(RHG)2)n1-(C＝O)n2-(NRHG)n3-(C(RHG)2)n4- (a)
配置于两末端的连字符(-)表示结合键。
式(a)中，多个RHG分别独立地表示氢原子或可包含亲水性基团的1价基团。亲水性基团和1价基团如上所述。
n1为0～3的整数，优选为0～2的整数，更优选为0或1的整数。
n2为0或1的整数。
n3为0或1的整数。
n4为0～3的整数，优选为0～2的整数，更优选为0或1的整数。
更进一步优选可包含亲水性基团的2价基团(-LHG-)可以是下述式(a1)、(a2)或(a3)所表示的2价基团：
(a1)-(C(RHG)2)-；
(a2)-(C(RHG)2)-(C＝O)-(NRHG)-(C(RHG)2)-；或
(a3)-(C＝O)-(C(RHG)2)2-。
式(a1)、(a2)或(a3)中，多个RHG分别独立地表示氢原子、亲水性基团或包含亲水性基团的碳原子数为1～6的烷基。亲水性基团和碳原子数为1～6的烷基如上所述。
式(I’)中，RHG1和RHG2分别独立地表示氢原子、亲水性基团或可包含亲水性基团的1价基团。亲水性基团和1价基团如上所述。
在特定的实施方式中，RHG1和RHG2所示的可包含亲水性基团的1价基团可以是氨基的保护基。作为氨基的保护基，可列举：关于R1和R2所述的基团。例如，RHG1和RHG2中的一个为氢原子，另一个可以是氨基的保护基。
或者，RHG1和RHG2中的一个为氢原子，另一个可以是包含亲水性基团的1价基团。作为包含亲水性基团的1价基团，例如可列举：包含亲水性基团的烷基、包含亲水性基团的羧基、包含亲水性基团的烷基羰基(例如，上述的基团)、包含亲水性基团的烷氧基羰基、包含亲水性基团的氧基羰基。
式(I’)中，在选自LHG、RHG1和RHG2的1个以上的部位中包含至少1个亲水性基团。作为包含至少1个亲水性基团的部位及其组合，例如，可列举如下：
(i)LHG单独；
(ii)RHG1单独；
(iii)RHG2单独；
(iv)LHG和LHG1的组合；
(v)LHG和LHG2的组合；
(vi)LHG1和LHG2的组合；以及
(vii)LHG、LHG1和LHG2的组合。
这些LHG部位、RHG1部位、RHG2部位各自可包含1个亲水性基团，也可包含2个以上的亲水性基团。
在上述一系列式中说明的符号和符号中的要素(例如，切割性位点之类的特定要素、或特定式)的定义、示例和优选示例，对于其它式而言也同样。
本发明的位点选择性的缀合物或其盐例如作为药物或试剂(例如，诊断药、研究用试剂)有用。
本发明的缀合物或其盐可以以药物组合物的形式提供。这种药物组合物除了包含本发明的缀合物或其盐以外，还可包含药学上可接受的载体。作为药学上可接受的载体，例如可列举：蔗糖、淀粉、甘露醇、山梨糖醇、乳糖、葡萄糖、纤维素、滑石、磷酸钙、碳酸钙等赋形剂；纤维素、甲基纤维素、羟丙基纤维素、聚丙基吡咯烷酮、明胶、阿拉伯树胶、聚乙二醇、蔗糖、淀粉等粘合剂；淀粉、羧甲基纤维素、羟丙基淀粉、碳酸氢钠、磷酸钙、柠檬酸钙等崩解剂；硬脂酸镁、AEROSIL、滑石、十二烷基硫酸钠等润滑剂；柠檬酸、薄荷醇、甘草酸铵盐(glycyrrhizic acid ammonium salt)、甘氨酸、橙粉等芳香剂；苯甲酸钠、亚硫酸氢钠、尼泊金甲酯、尼泊金丙酯等保存剂；柠檬酸、柠檬酸钠、乙酸等稳定剂；甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、硬脂酸铝等助悬剂；表面活性剂等分散剂；水、生理盐水、橙汁等稀释剂；可可脂、聚乙二醇、灯用煤油等基础蜡等，但并不限定于这些。本发明的缀合物或其盐还可具有实现稳定性的任意修饰(例如，PEG化)。
适合口服给药的制剂为：将有效量的配体溶解于水、生理盐水、橙汁之类的稀释液而得的液体制剂；以固体或颗粒的形式包含有效量的配体的胶囊剂、香囊剂或片剂；在适当的分散介质中悬浮有有效量的有效成分的悬浮液剂；将溶解有有效量的有效成分的溶液在适当的分散介质中分散、乳化而得的乳剂等。
药物组合物适合胃肠外给药(例如，静脉内注射、皮下注射、肌肉注射、局部注入、腹腔内给药)。作为这种适合胃肠外给药的药物组合物，有水性和非水性的等渗无菌注射液剂，其中可包含抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂、等渗剂等。还可列举：水性和非水性的无菌悬浮液剂，其中可包含助悬剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂、防腐剂等。
药物组合物的给药量根据有效成分的种类/活性、疾病的严重程度、成为给药对象的动物种类、给药对象的药物耐受性、体重、年龄等而不同，可适宜设定。
在一个实施方式中，本发明的位点选择性的缀合物或其盐可通过使位点选择性地具有生物正交性官能团的抗体衍生物或其盐与功能性物质反应来制造(图2)。这种反应可通过抗体衍生物中的生物正交性官能团与功能性物质之间的反应来进行。
在功能性物质具有容易与生物正交性官能团反应的官能团的情况下，可使功能性物质的该官能团与抗体衍生物中的生物正交性官能团适宜反应。容易与生物正交性官能团反应的官能团也可根据生物正交性官能团的具体种类而不同。本领域技术人员可适宜选择适当的官能团作为容易与生物正交性官能团反应的官能团(例如，Boutureira等人，Chem.Rev.，2015，115，2174-2195)。作为容易与生物正交性官能团反应的官能团，例如，在生物正交性官能团为叠氮残基的情况下，可列举炔烃残基，在生物正交性官能团为硫醇残基的情况下，可列举马来酰亚胺残基和二硫化物残基，在生物正交性官能团为醛残基或酮残基的情况下，可列举肼残基，在生物正交性官能团为降冰片烯残基的情况下，可列举叠氮残基，在生物正交性官能团为四嗪残基的情况下，可列举炔烃残基，但不限定于这些。当然，在生物正交性官能团和容易与其反应的官能团的上述组合中，也可对组合进行更换。因此，在更换上述组合中的最初的例子的情况下，可使用作为生物正交性官能团的炔烃残基、和作为可容易与生物正交性官能团反应的官能团的叠氮残基的组合。
在功能性物质不具有容易与抗体衍生物中的生物正交性官能团反应的官能团的情况下，药物也可衍生为具有这种官能团。衍生是该领域中的技术常识(例如，国际公开第2004/010957号、美国专利申请公开第2006/0074008号说明书、美国专利申请公开第2005/0238649号说明书)。例如，衍生可使用任意的交联剂来进行。或者，衍生也可使用具有所需官能团的特定接头来进行。在本发明中，衍生的功能性物质也只是功能性物质的一种，因此也简称为“功能性物质”。
上述反应可在不引起蛋白的变性/降解(例如，酰胺键的切割)的条件(温和的条件)下适宜进行。例如，这种反应可在适当的反应体系例如缓冲液中、在室温(例如，约15～30℃)下进行。缓中液的pH例如为5～9，优选为5.5～8.5，更优选为6.0～8.0。缓冲液可包含适当的催化剂。反应时间例如为1分钟～20小时，优选为10分钟～15小时，更优选为20分钟～10小时，更进一步优选为30分钟～8小时。关于这种反应的细节，例如请参照G.J.L.Bernardes等人，Chem.Rev.，115，2174(2015)；G.J.L.Bernardes等人，Chem.Asian.J.，4，630(2009)；B.G.Davies等人，Nat.Commun.，5，4740(2014)；A.Wagner等人，Bioconjugate.Chem.，25，825(2014)。
在另一个实施方式中，本发明的位点选择性的缀合物或其盐可通过使具有生物正交性官能团和功能性物质的化合物或其盐与具有Ig(免疫球蛋白单元)的原料抗体反应来制造(图2)。
上述原料抗体包含用生物正交性官能团进行了位点选择性的修饰的赖氨酸残基。能够以可与具有生物正交性官能团和功能性物质的化合物中的生物正交性官能团相互反应的方式，选择原料抗体中的生物正交性官能团。作为原料抗体中的生物正交性官能团，可利用上述的各种生物正交性官能团。从通用性高等的观点出发，原料抗体中的生物正交性官能团可以是马来酰亚胺残基、硫醇残基、呋喃残基、卤代羰基残基、烯烃残基、炔烃残基、叠氮残基或四嗪残基。
在特定的实施方式中，上述原料抗体可包含下述式(VIII)所表示的免疫球蛋白单元：
[化学式22]
式中，
Ig表示包含2个重链和2个轻链的免疫球蛋白单元，且在2个重链中的赖氨酸残基的侧链中的氨基与邻近Ig的羰基之间位点选择性地形成酰胺键，
L为选自-(C(R)2)m-、-(O-C(R)2-C(R)2)m-和-(C(R)2-C(R)2-O)m-的2价基团，
R分别独立地为氢原子、碳原子数为1～6的烷基、碳原子数为2～6的烯基或碳原子数为2～6的炔基，
m为0～10的整数，
B为可与B1所表示的生物正交性官能团反应的生物正交性官能团，
每2个重链的所述键合的平均比率r为1.5～2.5。
关于上述式(VIII)中的Ig和r的定义、示例和优选示例与上述相同。
m可优选为1以上的整数，更优选为2以上的整数、3以上的整数、4以上的整数或5以上的整数。m还可优选为9以下的整数，更优选为8以下的整数、7以下的整数或6以下的整数。在特定的情况下，m可以是1～8的整数(优选为2～6的整数)。
B所示的生物正交性官能团与上述的生物正交性官能团相同。
具有生物正交性官能团和功能性物质的化合物或其盐与上述原料抗体的反应可在不引起蛋白的变性/降解(例如，酰胺键的切割)的上述条件(温和的条件)下适宜进行。
位点选择性的缀合物或其盐的生成的确认也取决于其具体的原料和产物的分子量，例如可通过还原条件下的反相HPLC或质谱分析来进行。位点选择性的确认例如可通过肽图分析(peptide mapping)来进行。肽图分析例如可通过蛋白酶(例如，胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶)处理和质谱分析来进行。作为蛋白酶，优选内切蛋白酶。作为这种内切蛋白酶，例如可列举：胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、Glu-C、Lys-N、Lys-C、Asp-N。缀合物或其盐可通过色谱法(例如，凝胶过滤色谱法、离子交换色谱法、反相柱色谱法、高效液相色谱法、亲和色谱法)等任意的纯化方法来适宜纯化。
3.抗体衍生物或其盐
本发明还提供位点选择性地具有生物正交性官能团的抗体衍生物或其盐，其包含上述式(II)所表示的结构单元。本发明的抗体衍生物的位点选择性如上所述。
式(II)中，Ig、HG、RA、RB、环A、R1、R2、L1、L2和r如上述式(I)中所述。因此，这些要素和与该要素相关的其它要素的定义、示例和优选示例与上述式(I)中所述的相同。
B2所示的生物正交性官能团如上所述。
在特定的实施方式中，生物正交性官能团可以是马来酰亚胺残基、硫醇残基、呋喃残基、卤代羰基残基、烯烃残基、炔烃残基、叠氮残基或四嗪残基。这些生物正交性官能团的反应效率优异、通用性高，因此优选。
优选式(II)所表示的结构单元可由式(II’)表示。式(II’)所表示的Ig、RA、RB、环A、R1、R2、L1、L2、B2和r分别与式(II)中所示的相同。
式(II’)中，LHG、RHG1和RHG2如上述式(I’)中所述。因此，这些要素和与该要素相关的其它要素的定义、示例和优选示例与上述式(I’)中所述的相同。
本发明的抗体衍生物或其盐例如作为用于制作本发明的位点选择性的缀合物或其盐的中间体有用。
本发明的抗体衍生物或其盐例如可通过使具有第1生物正交性官能团和第2生物正交性官能团的化合物或其盐与具有Ig(免疫球蛋白单元)的原料抗体反应来制造(图2)。原料抗体与上述相同。
具有第1生物正交性官能团和第2生物正交性官能团的化合物或其盐与上述原料抗体的反应可在不引起蛋白的变性/降解(例如，酰胺键切割)的上述条件(温和的条件)下适宜进行。
抗体衍生物或其盐的生成的确认可与关于本发明的位点选择性的缀合物所述的方法同样地进行(位点选择性的确认也同样)。抗体衍生物或其盐可通过关于本发明的位点选择性的缀合物所述的任意的纯化方法来适宜纯化。
4.具有生物正交性官能团和功能性物质的化合物或其盐
本发明还提供具有生物正交性官能团和功能性物质的化合物或其盐，其由上述式(III)表示。
式(III)中，HG、RA、RB、环A、R1、R2、L1、L2和D如上述式(I)中所述。因此，这些要素和与该要素相关的其它要素的定义、示例和优选示例与上述式(I)中所述的相同。
B1表示生物正交性官能团。生物正交性官能团如上所述。
在特定的实施方式中，生物正交性官能团可以是马来酰亚胺残基、硫醇残基、呋喃残基、卤代羰基残基、烯烃残基、炔烃残基、叠氮残基或四嗪残基。这些生物正交性官能团的反应效率优异、通用性高，因此优选。
优选式(III)所表示的化合物可由式(III’)表示。式(III’)中所表示的RA、RB、环A、R1、R2、L1、L2、B1和D分别与式(III)中所示的相同。
式(III’)中，LHG、RHG1和RHG2如上述式(I’)中所述。因此，这些要素和与该要素相关的其它要素的定义、示例和优选示例与上述式(I’)中所述的相同。
式(III)所表示的本发明的化合物或其盐例如作为用于制作本发明的位点选择性的缀合物的中间体有用。式(III)所表示的本发明的化合物或其盐还对例如生物分子(例如，抗体等蛋白、糖类、核酸、脂质)等任意物质的衍生有用。
具有生物正交性官能团和功能性物质的化合物或其盐例如可通过使具有第1生物正交性官能团和第2生物正交性官能团的化合物或其盐与功能性物质反应来制造(图2)。功能性物质的细节如上所述。
具有第1生物正交性官能团和第2生物正交性官能团的化合物或其盐与功能性物质的反应可在适当的反应体系、例如有机溶剂体系或水溶液(例如，缓冲液)体系中、在适当温度(例如，约15～200℃)下进行。反应体系可包含适当的催化剂。反应时间例如为1分钟～20小时，优选为10分钟～15小时，更优选为20分钟～10小时，更进一步优选为30分钟～8小时。当然，这种反应也可在上述的温和条件下进行。
具有生物正交性官能团和功能性物质的化合物或其盐的生成的确认也取决于其具体的原料和产物的分子量，例如可通过NMR、HPLC或质谱分析来进行。这种化合物或其盐可通过色谱法(例如，凝胶过滤色谱法、离子交换色谱法、反相柱色谱法、高效液相色谱法、亲和色谱法)等任意的纯化方法来适宜纯化。
5.具有第1生物正交性官能团和第2生物正交性官能团的化合物或其盐
本发明还提供具有第1生物正交性官能团和第2生物正交性官能团的化合物或其盐，其由上述式(IV)表示。
式(IV)中，HG、RA、RB、环A、R1、R2、L1、L2和D如上述式(I)中所述。因此，这些要素和与该要素相关的其它要素的定义、示例和优选示例与上述式(I)中所述的相同。
B1表示第1生物正交性官能团。第1生物正交性官能团与上述关于生物正交性官能团所述的相同。
B2表示第2生物正交性官能团。第2生物正交性官能团与上述关于生物正交性官能团所述的相同。
优选第2生物正交性官能团可以是不与第1生物正交性官能团反应、或对第1生物正交性官能团的反应性低的生物正交性官能团。在该情况下，可抑制式(IV)所表示的化合物或其盐的分子间反应。因此，第1和第2生物正交性官能团能以相互不反应、或相互反应性低的组合来利用。生物正交性官能团的这种组合在该领域中是已知的。例如，关于作为优选的生物正交性官能团的马来酰亚胺残基、硫醇残基、呋喃残基、卤代羰基残基、烯烃残基、炔烃残基、叠氮残基和四嗪残基，这种组合的例子如下所述。
[表A]
表A.相互不反应、或相互反应性低的第1和第2生物正交性官能团的组合的例子
优选式(IV)所表示的化合物可由式(IV’)表示。式(IV’)所表示的RA、RB、环A、R1、R2、L1、L2、B1和B2分别与式(IV)中所示的相同。
式(IV’)中，LHG、RHG1和RHG2如上述式(I’)中所述。因此，这些要素和与该要素相关的其它要素的定义、示例和优选示例与上述式(I’)中所述的相同。
式(IV)所表示的本发明的化合物或其盐例如作为用于制作本发明的抗体衍生物和式(III)所表示的本发明的化合物的中间体有用。式(IV)所表示的本发明的化合物或其盐还对例如生物分子(例如，抗体等蛋白、糖类、核酸、脂质)和功能性物质等任意物质的衍生有用。
在一个实施方式中，具有第1生物正交性官能团和第2生物正交性官能团的化合物或其盐可通过使具有生物正交性官能团的式(VI)的化合物或其盐与B1-L1-NH-R1所表示的化合物反应来制造(图3)。B1、L1和R1的定义、示例和优选示例如上所述。
在另一个实施方式中，具有第1生物正交性官能团和第2生物正交性官能团的化合物或其盐可通过使具有生物正交性官能团的式(VII)的化合物或其盐与碳酸双(4-硝基苯基)酯和N，N-二异丙基乙胺(DIPEA)反应，然后与B2-L2-NH-R2所表示的化合物反应来制造(图3)。B2、L2和R2的定义、示例和优选示例如上所述。
上述反应可在适当的反应体系、例如有机溶剂体系或水溶液(例如，缓冲液)体系中、在适当温度(例如，约15～200℃)下进行。反应体系可包含适当的催化剂。反应时间例如为1分钟～20小时，优选为10分钟～15小时，更优选为20分钟～10小时，更进一步优选为30分钟～8小时。当然，这种反应也可在上述的温和条件下进行。
具有第1生物正交性官能团和第2生物正交性官能团的化合物或其盐的生成的确认也取决于其具体的原料和产物的分子量，例如可通过NMR、HPLC或质谱分析来进行。这种化合物或其盐可通过色谱法(例如，凝胶过滤色谱法、离子交换色谱法、反相柱色谱法、高效液相色谱法、亲和色谱法)等任意的纯化方法来适宜纯化。
6.一系列化合物或其盐
(1)化合物或其盐
本发明还提供上述式(V)所表示的化合物或其盐。
式(V)中，HG、RA、RB和环A如上述式(I)中所述。因此，这些要素和与该要素相关的其它要素的定义、示例和优选示例与上述式(I)中所述的相同。
X和Y分别独立地表示1价基团。1价基团如上所述。
优选式(V)所表示的化合物可由式(V’)表示。式(V’)中所表示的RA、RB、环A、X和Y分别与式(IV)中所示的相同。
式(V’)中，LHG、RHG1和RHG2如上述式(I’)中所述。因此，这些要素和与该要素相关的其它要素的定义、示例和优选示例与上述式(I’)中所述的相同。
式(V)所表示的化合物或其盐例如作为本发明的位点选择性的缀合物、抗体衍生物和本发明的其它化合物的合成中间体有用。
式(V)所表示的化合物或其盐例如可通过使下述式(V-1)所表示的化合物或其盐与下述式(V-2)所表示的化合物或其盐反应来制造(图3)：
[化学式23]
式中，
HG表示亲水性基团或包含亲水性基团的1价基团，
RA表示缬氨酸残基的侧链，
RB表示瓜氨酸残基或丙氨酸残基的侧链；
[化学式24]
式中，
环A表示可具有取代基的2价芳族环基，
X和Y分别独立地表示1价基团。
式(V-1)中的HG、RA和RB、以及式(V-2)中的环A、X和Y的定义、示例和优选示例如上所述。这种反应可在与上述关于具有第1生物正交性官能团和第2生物正交性官能团的化合物或其盐的制造的反应条件同样的条件下进行。
(2)具有式(VI)所表示的生物正交性官能团的化合物或其盐
本发明还提供上述式(VI)所表示的化合物或其盐。
式(VI)中，HG、RA、RB、环A、R2和L2如上述式(I)中所述。因此，这些要素和与该要素相关的其它要素的定义、示例和优选示例与上述式(I)中所述的相同。
X所示的1价基团如上所述。
B2所示的生物正交性官能团如上所述。
优选式(VI)所表示的化合物可由式(VI’)表示。式(VI’)中所表示的RA、RB、环A、X、R2、L2和B2分别与式(IV)中所示的相同。
式(VI’)中，LHG、RHG1和RHG2如上述式(I’)中所述。因此，这些要素和与该要素相关的其它要素的定义、示例和优选示例与上述式(I’)中所述的相同。
式(VI)所表示的化合物或其盐例如作为本发明的位点选择性的缀合物、抗体衍生物和本发明的规定的化合物的合成中间体有用。这种化合物或其盐还对例如功能性物质的衍生有用。
式(VI)所表示的化合物或其盐例如可通过使式(V)所表示的化合物或其盐与碳酸双(4-硝基苯基)酯和N，N-二异丙基乙胺(DIPEA)反应，然后与B2-L2-NH-R2所表示的化合物反应来制造(图3)。B2、L2和R2的定义、示例和优选示例如上所述。这种反应可在与上述关于具有第1生物正交性官能团和第2生物正交性官能团的化合物或其盐的制造的反应条件同样的条件下进行。
(3)具有式(VII)所表示的生物正交性官能团的化合物或其盐本发明还提供上述式(VII)所表示的化合物或其盐。
式(VII)中，HG、RA、RB、环A、R1和L1如上述式(I)中所述。因此，这些要素和与该要素相关的其它要素的定义、示例和优选示例与上述式(I)中所述的相同。
Y所示的1价基团如上所述。
B1所示的生物正交性官能团如上所述。
优选式(VII)所表示的化合物可由式(VII’)表示。式(VII’)所表示的RA、RB、环A、Y、R1、L1和B1分别与式(IIV)中所示的相同。
式(VII’)中，LHG、RHG1和RHG2如上述式(I’)中所述。因此，这些要素和与该要素相关的其它要素的定义、示例和优选示例与上述式(I’)中所述的相同。
式(VII)所表示的化合物或其盐例如作为本发明的位点选择性的缀合物、抗体衍生物和本发明的规定的化合物的合成中间体有用。这种化合物或其盐还对例如生物分子(例如，抗体等蛋白、糖类、核酸、脂质)等任意物质的衍生有用。
式(VII)所表示的化合物或其盐例如可通过使式(V)所表示的化合物或其盐与B1-L1-NH-R1所表示的化合物反应来制造(图3)。B1、L1和R1的定义、示例和优选示例如上所述。这种反应可在与上述关于具有第1生物正交性官能团和第2生物正交性官能团的化合物或其盐的制造的反应条件同样的条件下进行。
式(V)、(VI)或(VII)所表示的化合物或其盐的生成的确认也取决于其具体的原料和产物的分子量，例如可通过NMR、HPLC或质谱分析来进行。这种化合物或其盐可通过色谱法(例如，凝胶过滤色谱法、离子交换色谱法、反相柱色谱法、高效液相色谱法、亲和色谱法)等任意的纯化方法来适宜纯化。
实施例
接下来，给出实施例以更详细地说明本发明，但本发明并不限定于以下的实施例。
实施例1中的以下肽均以同样的方法调制：Ac-Glu(OtBu)-Val-Cit-OH、Z-Glu(OtBu)-Val-Cit-OH、Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Val-Cit-OH、SCA(OtBu)-Glu(OtBu)-Val-Cit-OH。需要说明的是，SCA(OtBu)是琥珀酸单叔丁酯(mono-tert-butyl succinate)、SCA是琥珀酸(succinic acid)的简称。
通过基于Fmoc法的使用Cl-TCP(Cl)ProTide Resin(CEM公司)的肽固相合成，调制N末端被乙酰基封端的物质、N末端被琥珀酸封端的物质，用20％HFIP/二氯甲烷的溶液搅拌过夜，由此在保护氨基酸侧链的状态下进行了从树脂中的切出。通过过滤去除树脂，浓缩溶液后，将其通过制备型HPLC纯化，得到了作为产物的肽。
Ac-Glu(OtBu)-Val-Cit-OH
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ12.50(brs，1H)，8.22(d，J＝7.2Hz，1H)，8.05(d，J＝8.0Hz，1H)，7.69(d，J＝8.8Hz，1H)，5.95-5.93(m，1H)，5.38(brs，2H)，4.33-4.27(m，1H)，4.22-4.18(m，1H)，4.15-4.10(m，1H)，2.96-2.95(m，2H)，2.25-2.19(m，2H)，2.00-1.93(m，1H)，1.89-1.80(m，4H)，1.73-1.66(m，2H)，1.61-1.51(m，1H)，1.46-1.34(m，11H)，0.86(d，J＝6.8Hz，3H)，0.83(d，J＝6.8Hz，3H).
MS(ESI)m/z：502.30[M+H]+
Z-Glu(OtBu)-Val-Cit-OH
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ12.50(brs，1H)，7.93-7.37(m，8H)，6.05-6.00(m，1H)，5.44(brs，2H)，5.08(s，2H)，4.17-3.81(m，3H)，3.00-2.90(m，2H)，2.31-2.27(m，2H)，2.10-1.34(m，16H)，0.89-0.83(m，6H).
MS(ESI)m/z：594.30[M+H]+
Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Val-Cit-OH
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ12.50(brs，1H)，8.21(d，J＝7.2Hz，1H)，8.08(d，J＝8.0Hz，lH)，8.04(d，J＝8.0Hz，1H)，7.68(d，J＝8.0Hz，1H)，5.95(brs，1H)，5.37(brs，2H)，4.32-4.19(m，3H)，4.16-4.11(m，1H)，2.98-2.94(m，2H)，2.27-2.13(m，4H)，2.00-1.79(m，5H)，1.76-1.52(m，5H)，1.42-1.36(m，20H)，0.86(d，J＝6.8Hz，3H)，0.82(d，J＝6.8Hz，3H).
MS(ESI)m/z：687.35[M+H]+
SCA(OtBu)-Glu(OtBu)-Val-Cit-OH
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ12.70(brs，1H)，8.21(d，J＝7.2Hz，1H)，8.05(d，J＝8.0Hz，1H)，7.68(d，J＝8.8Hz，1H)，5.96(brs，1H)，5.25(brs，2H)，4.35-4.30(m，1H)，4.21-4.18(m，1H)，4.15-4.10(m，1H)，2.98-2.94(m，2H)，2.40-2.28(m，4H)，2.24-2.18(m，2H)，2.01-1.93(m，1H)，1.90-1.81(m，1H)，1.73-1.63(m，2H)，1.61-1.51(m，1H)，1.40-1.31(m，20H)，0.86(d，J＝6.8Hz，3H)，0.83(d，J＝6.8Hz，3H).
MS(ESI)m/z：616.30[M+H]+
Ac-Glu(OtBu)-Val-Ala-OH
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ12.50(brs，1H)，8.25(d，J＝6.8Hz，1H)，8.03(d，J＝8.0Hz，1H)，7.68(d，J＝9.2Hz，1H)，4.33-4.27(m，1H)，4.22-4.16(m，2H)，2.23-2.18(m，2H)，1.99-1.94(m，1H)，1.89-1.80(m，4H)，1.73-1.65(m，1H)，1.39(s，9H)，1.27(d，J＝7.2Hz，3H)，0.87(d，J＝6.8Hz，3H)，0.83(d，J＝6.8Hz，3H).
MS(ESI)m/z：416.20[M+H]+
实施例1：接头-有效载荷模拟物的合成
(1-1)接头-有效载荷模拟物(1)的合成
接头-有效载荷模拟物(1)如下进行合成。
[化学式25]
(1-1-1)醇(2)的合成
[化学式26]
将Ac-Glu(OtBu)-Val-Cit-OH(19.9mg，39.7μmol)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(400μL)，加入1-[双(二甲氨基)亚甲基]-1H-1，2，3-三唑并[4，5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸盐(18.1mg，47.6μmol)、2，4，6-三甲基吡啶(6.27μL，47.6μmol)，在室温下搅拌10分钟。接着，加入4-氨基扁桃酸甲酯(8.63mg，47.6μmol)，在室温下搅拌21.5小时之后，通过反相制备色谱法进行纯化。回收包含产物的馏分，通过减压浓缩去除乙腈，进行冷冻干燥，由此得到了上述醇(2)(28.5mg，定量)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ9.95(s，1H)，8.07(d，J＝7.4Hz，1H)，7.99(d，J＝8.0Hz，1H)，7.66(d，J＝8.4Hz，1H)，7.50(d，J＝8.4Hz，2H)，7.25(d，J＝8.4Hz，2H)，5.92(brs，1H)，5.36(brs，2H)，5.01(s，1H)，4.34-4.29(m，1H)，4.26-4.20(m，1H)，4.14-4.10(m，1H)，3.53(s，3H)，3.00-2.83(m，2H)，2.18-2.13(m，2H)，1.94-1.89(m，2H)，1.84-1.23(m，17H)，0.79(d，J＝6.8Hz，3H)，0.75(d，J＝6.8Hz，3H).
MS(ESI)m/z：665.30[M+H]+
(1-1-2)芘(3)的合成
[化学式27]
将(1-1-1)中得到的醇(2)(28.5mg)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(430μL)，在冰冷下搅拌5分钟之后，加入碳酸双(4-硝基苯基)酯(26.6mg，85.7μmol)、N，N-二异丙基乙胺(11.1μL，64.4μmol)，在室温下搅拌1.5小时。用LCMS追踪反应时发现原料的残留，因此追加碳酸双(4-硝基苯基)酯(13.3mg，42.9μmol)、N，N-二异丙基乙胺(5.54μL，32.2μmol)，在室温下搅拌5小时。之后，进行冰冷，加入肌氨酸-芘(64.9mg，215μmol)、1-羟基苯并三唑(8.7mg，64μmol)、N，N-二异丙基乙胺(57.2μL，333μmol)，在室温下搅拌16小时。反应后，通过反相制备色谱法进行纯化。回收包含产物的馏分，通过减压浓缩去除乙腈，进行冷冻干燥，由此得到了上述芘(3)(26.1mg，26.3μmol)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.09-10.07(m，1H)，8.63-8.60(m，1H)，8.33-7.65(m，13H)，7.60-7.57(m，2H)，7.37-7.32(m，2H)，5.94-5.91(m，1H)，5.72-5.70(m，1H)，5.37(brs，2H)，4.98-4.96(m，1H)，4.93-4.00(m，4H)，3.85-3.75(m，1H)，3.56-3.55(m，3H)，2.97-2.87(m，5H)，2.17-2.13(m，2H)，1.93-1.17(m，19H)，0.80-0.73(m，6H).
MS(ESI)m/z：993.40[M+H]+
(1-1-3)芘(4)的合成
[化学式28]
将芘(3)(10.8mg，10.9μmol)溶解于四氢呋喃(700μL)、水(400μL)，在冰冷下搅拌5分钟之后，加入1M氢氧化锂水溶液(109μL，109μmol)，在室温下搅拌1小时。反应结束后，使用0.1M盐酸调节至约pH6，通过反相制备色谱法进行纯化。回收包含产物的馏分，通过减压浓缩去除乙腈，进行冷冻干燥，由此得到了上述芘(4)(4.5mg，4.6μmol)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ13.05(brs，1H)，10.08-10.05(m，1H)，8.62-8.59(m，1H)，8.33-7.56(m，15H)，7.37-7.35(m，2H)，5.92(brs，1H)，5.61-5.60(m，1H)，5.36(brs，2H)，4.98-4.03(m，5H)，3.88-3.74(m，1H)，2.99-2.83(m，5H)，2.15-2.13(m，2H)，1.93-1.14(m，19H)，0.84-0.73(m，6H).
MS(ESI)m/z：979.40[M+H]+
(1-1-4)芘(5)的合成
[化学式29]
将芘(4)(3.7mg，3.8μmol)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(400μL)之后进行冰冷，加入N，N-二异丙基乙胺(1.9μL，11μmol)、1H-苯并三唑-1-基氧基三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐(2.9mg，5.6μmol)。然后加入N-(5-氨基戊基)马来酰亚胺盐酸盐(1.3mg、5.7μmol)，返回室温并搅拌2小时。反应结束后，通过反相制备色谱法进行纯化。回收包含产物的馏分，减压浓缩去除乙腈之后，进行冷冻干燥，由此得到了芘(5)(1.3mg，1.1μmol)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.02-9.99(m，1H)，8.85-7.88(m，14H)，7.67-7.65(m，1H)，7.60-7.51(m，2H)，7.33-7.27(m，2H)，6.91-6.87(m，2H)，5.92-5.91(m，1H)，5.63-5.62(m，1H)，5.36(brs，2H)，5.07-4.92(m，2H)，4.35-3.76(m，5H)，3.18-3.14(m，1H)，2.99-2.83(m，7H)，2.17-2.13(m，2H)，1.95-1.89(m，1H)，1.85-1.72(m，4H)，1.66-1.45(m，3H)，1.40-1.17(m，15H)，1.05-1.01(m，2H)，0.83-0.73(m，6H).
MS(ESI)m/z：1143.45[M+H]+
(1-1-5)接头-有效载荷模拟物(1)的合成
[化学式30]
向芘(5)(2.2mg，1.9μmol)中依次加入1，4-二烷(380μL)、4M氯化氢/二烷溶液(95μL，380μmol)，在室温下搅拌4小时。冰冷后，加入N，N-二异丙基乙胺(71.8μL，418μmol)，在室温下搅拌10分钟。通过反相制备色谱法纯化反应液，回收包含产物的馏分，减压浓缩去除乙腈之后，进行冷冻干燥，由此得到了接头-有效载荷模拟物(1)(2.1mg，1.9μmol)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ12.06(brs，1H)，10.03-10.00(m，1H)，8.84-7.88(m，14H)，7.67-7.64(m，1H)，7.56-7.51(m，2H)，7.33-7.27(m，2H)，6.90-6.87(m，2H)，5.92-5.90(m，1H)，5.63-5.61(m，1H)，5.36(brs，2H)，5.08-4.96(m，2H)，4.35-3.76(m，5H)，3.18-3.14(m，1H)，2.97-2.83(m，7H)，2.20-2.16(m，2H)，1.93-1.88(m，1H)，1.81-1.78(m，4H)，1.69-1.53(m，3H)，1.35-1.17(m，6H)，1.08-1.01(m，2H)，0.81-0.73(m，6H).
MS(ESI)m/z：1087.45[M+H]+
(1-2)接头-有效载荷模拟物(6)的合成
接头-有效载荷模拟物(6)如下进行合成。
[化学式31]
(1-2-1)醇(7)的合成
[化学式32]
将Z-Glu(t-Bu)-Val-Cit-OH(50.0mg，84.3μmol)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(1.5mL)，加入1-[双(二甲氨基)亚甲基]-1H-1，2，3-三唑并[4，5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸盐(38.4mg，101μmol)、2，4，6-三甲基吡啶(13.3μL，101μmol)，在室温下搅拌10分钟。接着，加入4-氨基扁桃酸甲酯(18.3mg，101μmol)，在室温下搅拌16小时之后，通过反相制备色谱法进行纯化。回收包含产物的馏分，通过减压浓缩去除乙腈，进行冷冻干燥，由此得到了上述醇(7)(49.1mg，64.9μmol)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.04-9.95(m，1H)，8.40-7.28(m，12H)，6.00-5.97(m，1H)，5.43(brs，2H)，5.08-4.97(m，3H)，4.43-4.37(m，1H)，4.24-4.20(m，1H)，4.16-4.05(m，1H)，3.60-3.59(m，3H)，3.04-2.91(m，2H)，2.26-2.20(m，2H)，2.03-1.22(m，16H)，0.88-0.78(m，6H).
MS(ESI)m/z：757.30[M+H]+
(1-2-2)芘(8)的合成
[化学式33]
将醇(7)(44.6mg，58.9μmol)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(650μL)，在冰冷下搅拌5分钟之后，加入碳酸双(4-硝基苯基)酯(53.8mg，177μmol)、N，N-二异丙基乙胺(22.5μL，133μmol)，在室温下搅拌4小时。之后，进行冰冷，加入肌氨酸-芘(89.1mg，295μmol)、1-羟基苯并三唑(11.9mg，88.4μmol)、N，N-二异丙基乙胺(77.7μL，457μmol)，在室温下搅拌18小时。反应后，通过反相制备色谱法进行纯化。回收包含产物的馏分，通过减压浓缩去除乙腈，进行冷冻干燥，由此得到了上述芘(8)(49.2mg，45.3μmol)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.11-9.97(m，1H)，8.64-8.60(m，1H)，8.36-7.95(m，11H)，7.82-7.74(m，1H)，7.65-7.57(m，2H)，7.49-7.19(m，8H)，5.91-5.90(m，1H)，5.72-5.70(m，1H)，5.36(brs，2H)，4.98-4.86(m，4H)，4.41-4.00(m，3H)，3.85-3.75(m，1H)，3.56-3.54(m，3H)，3.00-2.82(m，5H)，2.19-2.12(m，2H)，1.92-1.17(m，16H)，0.80-0.73(m，6H).
MS(ESI)m/z：1085.45[M+H]+
(1-2-3)芘(9)的合成
[化学式34]
将芘(8)(44.8mg，41.3μmol)溶解于四氢呋喃(3.75mL)、水(1.25mL)，在冰冷下搅拌5分钟之后，加入氢氧化锂一水合物(8.7mg，210μmol)，在室温下搅拌4小时。反应结束后，使用0.1M盐酸调节至约pH6，通过反相制备色谱法进行纯化。回收包含产物的馏分，通过减压浓缩去除乙腈，进行冷冻干燥，由此得到了上述芘(9)(18.4mg，17.2μmol)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ13.02(brs，1H)，10.09-9.97(m，1H)，8.62-8.59(m，1H)，8.32-7.78(m，12H)，7.63-7.44(m，3H)，7.37-7.35(m，2H)，7.29-7.20(m，5H)，5.91(brs，1H)，5.61-5.60(m，1H)，5.36(brs，2H)，4.98-4.86(m，4H)，4.45-4.30(m，1H)，4.24-4.15(m，1H)，4.07-4.02(m，1H)，3.84-3.74(m，1H)，2.97-2.82(m，5H)，2.19-2.12(m，2H)，1.93-1.11(m，16H)，0.80-0.72(m，6H).
MS(ESI)m/z：1071.45[M+H]+
(1-2-4)芘(10)的合成
[化学式35]
将芘(9)(15.6mg，14.6μmol)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(1.0mL)之后进行冰冷，加入N，N-二异丙基乙胺(5.0μL，29μmol)、1H-苯并三唑-1-基氧基三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐(11.4mg，21.9μmol)。然后加入N-(5-氨基戊基)马来酰亚胺盐酸盐(4.8mg、22μmol)，返回室温并搅拌3小时。反应结束后，通过反相制备色谱法进行纯化。回收包含产物的馏分，减压浓缩去除乙腈之后，进行冷冻干燥，由此得到了芘(10)(15.4mg，12.5μmol)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.11-10.01(m，1H)，8.91-8.63(m，1H)，8.40-7.96(m，12H)，7.72-7.27(m，11H)，6.97-6.94(m，2H)，5.99(brs，1H)，5.71-5.69(m，1H)，5.43(brs，2H)，5.14-4.96(m，4H)，4.49-4.40(m，1H)，4.30-4.23(m，1H)，4.16-3.83(m，3H)，3.25-3.22(m，1H)，3.02-2.90(m，7H)，2.26-2.22(m，2H)，2.01-1.98(m，1H)，1.92-1.84(m，1H)，1.77-1.66(m，2H)，1.65-1.04(m，16H)，1.12-1.04(m，2H)，0.88-0.80(m，6H).
MS(ESI)m/z：1235.50[M+H]+
(1-2-5)接头-有效载荷模拟物(6)的合成
[化学式36]
向芘(10)(12.1mg，9.79μmol)中依次加入1，4-二烷(2.0mL)、4M氯化氢/二烷溶液(490μL，1.96mmol)，在室温下搅拌4小时。冰冷后，加入N，N-二异丙基乙胺(366μL，2.15mmol)，在室温下搅拌10分钟。通过反相制备色谱法纯化反应液，回收包含产物的馏分，减压浓缩去除乙腈之后，进行冷冻干燥，由此得到了接头-有效载荷模拟物(6)(6.0mg，5.1μmol)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ12.05(brs，1H)，10.04-9.94(m，1H)，8.84-8.57(m，1H)，8.32-7.89(m，12H)，7.72-7.20(m，11H)，6.90-6.86(m，2H)，5.90(brs，1H)，5.64-5.62(m，1H)，5.36(brs，2H)，5.07-4.88(m，4H)，4.42-4.29(m，1H)，4.21-4.15(m，1H)，4.08-3.76(m，3H)，3.18-3.14(m，1H)，2.95-2.82(m，7H)，2.21-2.16(m，2H)，1.92-0.97(m，13H)，0.82-0.74(m，6H).
MS(ESI)m/z：1179.50[M+H]+
(1-3)接头-有效载荷模拟物(11)的合成
接头-有效载荷模拟物(11)如下进行合成。
[化学式37]
(1-3-1)醇(12)的合成
[化学式38]
将Ac-Glu(t-Bu)-Glu(t-Bu)-Val-Cit-OH(50.0mg，72.8μmol)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(800μL)，加入1-[双(二甲氨基)亚甲基]-1H-1，2，3-三唑并[4，5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸盐(33.2mg，87.4μmol)、2，4，6-三甲基吡啶(11.5μL，87.4μmol)，在室温下搅拌10分钟。接着，加入4-氨基扁桃酸甲酯(15.8mg，87.4μmol)，在室温下搅拌16小时之后，通过反相制备色谱法进行纯化。回收包含产物的馏分，通过减压浓缩去除乙腈，进行冷冻干燥，由此得到了上述醇(12)(54.0mg，63.5μmol)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.00(s，1H)，8.26-7.88(m，3H)，7.68-7.60(m，1H)，7.57(d，J＝8.4Hz，2H)，7.32(d，J＝8.4Hz，2H)，6.00-5.97(m，1H)，5.43(brs，2H)，5.08(s，1H)，4.40-4.37(m，1H)，4.32-4.19(m，3H)，3.60(s，3H)，3.09-2.90(m，2H)，2.25-2.18(m，4H)，2.03-1.53(m，10H)，1.46-1.36(m，20H)，0.86(d，J＝6.8Hz，3H)，0.82(d，J＝6.8Hz，3H).
MS(ESI)m/z：850.40[M+H]+
(1-3-2)芘(13)的合成
[化学式39]
将醇(12)(50.3mg，59.2μmol)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(650μL)，在冰冷下搅拌5分钟之后，加入碳酸双(4-硝基苯基)酯(54.0mg，178μmol)、N，N-二异丙基乙胺(22.7μL，133μmol)，在室温下搅拌5小时。之后，进行冰冷，加入肌氨酸-芘(89.5mg，296μmol)、1-羟基苯并三唑(12.0mg，88.8μmol)、N，N-二异丙基乙胺(78.1μL，459μmol)，在室温下搅拌18小时。反应后，通过反相制备色谱法进行纯化。回收包含产物的馏分，通过减压浓缩去除乙腈，进行冷冻干燥，由此得到了上述芘(13)(34.0mg，28.9μmol)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.14-10.12(m，1H)，8.69-8.67(m，1H)，8.40-7.82(m，13H)，7.76-7.72(m，1H)，7.68-7.65(m，2H)，7.44-7.39(m，2H)，5.99(brs，1H)，5.79(d，J＝6.4Hz，1H)，5.44(brs，2H)，5.05-4.97(m，2H)，4.44-4.08(m，4H)，3.93-3.80(m，1H)，3.63-3.62(m，3H)，3.05-2.92(m，5H)，2.25-2.14(m，4H)，2.00-1.28(m，30H)，0.87-0.80(m，6H).
MS(ESI)m/z：1178.50[M+H]+
(1-3-3)芘(14)的合成
[化学式40]
将芘(13)(30.7mg，26.1μmol)溶解于四氢呋喃(2.25mL)、水(0.75mL)，在冰冷下搅拌5分钟之后，加入氢氧化锂一水合物(5.5mg，0.13mmol)，在室温下搅拌4小时。反应结束后，使用0.1M盐酸调节至约pH6，通过反相制备色谱法进行纯化。回收包含产物的馏分，通过减压浓缩去除乙腈，进行冷冻干燥，由此得到了上述芘(14)(17.2mg，14.8μmol)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ13.06(brs，1H)，10.13-10.10(m，1H)，8.69-8.66(m，1H)，8.40-7.85(m，13H)，7.77-7.73(m，1H)，7.67-7.64(m，2H)，7.44-7.42(m，2H)，5.99(brs，1H)，5.68-5.67(m，1H)，5.44(brs，2H)，5.05-4.96(m，2H)，4.46-4.10(m，4H)，3.92-3.81(m，1H)，3.05-2.90(m，5H)，2.25-2.14(m，4H)，2.03-1.29(m，30H)，0.88-0.80(m，6H).
MS(ESI)m/z：1164.55[M+H]+
(1-3-4)芘(15)的合成
[化学式41]
将芘(14)(14.7mg，12.6μmol)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(1.0mL)之后进行冰冷，加入N，N-二异丙基乙胺(4.29μL，25.2μmol)、1H-苯并三唑-1-基氧基三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐(9.8mg，19μmol)。然后加入N-(5-氨基戊基)马来酰亚胺盐酸盐(4.1mg、19μmol)，返回室温并搅拌3.5小时。反应结束后，通过反相制备色谱法进行纯化。回收包含产物的馏分，减压浓缩去除乙腈之后，进行冷冻干燥，由此得到了芘(15)(7.0mg，9.2μmol)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.08-10.05(m，1H)，8.92-7.95(m，15H)，7.75-7.73(m，1H)，7.63-7.59(m，2H)，7.40-7.34(m，2H)，6.97-6.94(m，2H)，6.00-5.98(m，1H)，5.70-5.69(m，1H)，5.43(brs，2H)，5.14-5.01(m，2H)，4.45-4.38(m，1H)，4.32-3.83(m，5H)，3.25-3.20(m，1H)，3.10-2.90(m，7H)，2.25-2.18(m，4H)，2.08-1.24(m，34H)，1.12-1.04(m，2H)，0.88-0.81(m，6H).
MS(ESI)m/z：1328.60[M+H]+
(1-3-5)接头-有效载荷模拟物(11)的合成
[化学式42]
向芘(15)(6.1mg，4.6μmol)中依次加入1，4-二烷(920μL)、4M氯化氢/二烷溶液(230μL，918μmol)，在室温下搅拌4小时。冰冷后，加入N，N-二异丙基乙胺(172μL，1.10mmol)，在室温下搅拌10分钟。通过反相制备色谱法纯化反应液，回收包含产物的馏分，减压浓缩去除乙腈之后，进行冷冻干燥，由此得到了接头-有效载荷模拟物(11)(3.7mg，3.0μmol)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ12.04(brs，2H)，10.01-9.98(m，1H)，8.83-7.89(m，15H)，7.71-7.69(m，1H)，7.56-7.51(m，2H)，7.33-7.26(m，2H)，6.90-6.87(m，2H)，5.91-5.90(m，1H)，5.64-5.62(m，1H)，5.36(brs，2H)，5.08-4.92(m，2H)，4.35-4.32(m，1H)，4.25-3.76(m，5H)，3.18-3.14(m，1H)，2.99-2.82(m，7H)，2.21-2.15(m，4H)，1.93-1.17(m，16H)，1.05-1.01(m，2H)，0.82-0.74(m，6H).
MS(ESI)m/z：1216.45[M+H]+
(1-4)接头-有效载荷模拟物(16)的合成
接头-有效载荷模拟物(16)如下进行合成。
[化学式43]
(1-4-1)醇(17)的合成
[化学式44]
将SCA(t-Bu)-Glu(t-Bu)-Val-Cit-OH(50.0mg，81.2μmol)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(890μL)，加入1-[双(二甲氨基)亚甲基]-1H-1，2，3-三唑并[4，5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸盐(37.0mg，97.4μmol)、2，4，6-三甲基吡啶(12.8μL，97.4μmol)，在室温下搅拌10分钟。接着，加入4-氨基扁桃酸甲酯(17.6mg，97.4μmol)，在室温下搅拌16小时之后，通过反相制备色谱法进行纯化。回收包含产物的馏分，通过减压浓缩去除乙腈，进行冷冻干燥，由此得到了上述醇(17)(60.4mg，77.5μmol)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.01(s，1H)，8.13(d，J＝7.2Hz，1H)，8.07(d，J＝8.4Hz，1H)，7.73(d，J＝8.8Hz，1H)，7.57(d，J＝8.4Hz，2H)，7.32(d，J＝8.4Hz，2H)，5.99(brs，1H)，5.43(brs，2H)，5.08(s，1H)，4.41-4.30(m，2H)，4.21-4.17(m，1H)，3.60(s，3H)，3.04-2.95(m，2H)，2.44-2.15(m，6H)，2.03-1.95(m，1H)，1.92-1.83(m，1H)，1.74-1.58(m，3H)，1.46-1.34(m，20H)，0.86(d，J＝6.8Hz，3H)，0.83(d，J＝6.8Hz，3H).
MS(ESI)m/z：779.40[M+H]+
(1-4-2)芘(18)的合成
[化学式45]
将醇(17)(58.0mg，74.5μmol)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(820μL)，在冰冷下搅拌5分钟之后，加入碳酸双(4-硝基苯基)酯(68.0mg，223μmol)、N，N-二异丙基乙胺(28.5μL，168μmol)，在室温下搅拌6小时。之后，进行冰冷，加入肌氨酸-芘(113mg，373μmol)、1-羟基苯并三唑(15.1mg，112μmol)、N，N-二异丙基乙胺(98.3μL，578μmol)，在室温下搅拌17小时。反应后，通过反相制备色谱法进行纯化。回收包含产物的馏分，通过减压浓缩去除乙腈，进行冷冻干燥，由此得到了上述芘(18)(37.1mg，33.5μmol)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.15-10.13(m，1H)，8.70-8.67(m，1H)，8.40-8.03(m，11H)，7.90-7.86(m，1H)，7.75-7.72(m，1H)，7.68-7.64(m，2H)，7.44-7.39(m，2H)，5.99(brs，1H)，5.79(d，J＝6.8Hz，1H)，5.44(brs，2H)，5.05-4.98(m，2H)，4.40-4.08(m，3H)，3.93-3.80(m，1H)，3.63-3.62(m，3H)，3.05-2.90(m，5H)，2.44-2.15(m，6H)，2.02-1.98(m，1H)，1.91-1.85(m，1H)，1.75-1.55(m，3H)，1.50-1.30(m，20H)，0.88-0.80(m，6H).
MS(ESI)m/z：1107.55[M+H]+
(1-4-3)芘(19)的合成
[化学式46]
将芘(18)(17.4mg，15.7μmol)溶解于四氢呋喃(675μL)、水(225μL)，在冰冷下搅拌5分钟之后，加入1M氢氧化锂水溶液(86.4μL，86.4μmol)，在冰冷下搅拌5小时。反应结束后，使用0.1M盐酸调节至约pH6，通过反相制备色谱法进行纯化。回收包含产物的馏分，通过减压浓缩去除乙腈，进行冷冻干燥，由此得到了上述芘(19)(17.2mg，15.7μmol)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ13.06(brs，1H)，10.14-10.11(m，1H)，8.68-8.66(m，1H)，8.40-8.01(m，11H)，7.89-7.85(m，1H)，7.75-7.72(m，1H)，7.67-7.64(m，2H)，7.44-7.41(m，2H)，5.99(brs，1H)，5.68-5.67(m，1H)，5.44(brs，2H)，5.05-4.93(m，2H)，4.44-4.10(m，3H)，3.92-3.81(m，1H)，3.05-2.94(m，5H)，2.43-2.15(m，6H)，2.02-1.97(m，1H)，1.88-1.85(m，1H)，1.77-1.66(m，3H)，1.61-1.30(m，20H)，0.88-0.80(m，6H).
MS(ESI)m/z：1093.50[M+H]+
(1-4-4)芘(20)的合成
[化学式47]
将芘(19)(16.3mg，14.9μmol)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(1.0mL)之后进行冰冷，加入N，N-二异丙基乙胺(5.1μL，30μmol)、1H-苯并三唑-1-基氧基三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐(11.7mg，22.4μmol)。然后加入N-(5-氨基戊基)马来酰亚胺盐酸盐(4.9mg、22μmol)，返回室温并搅拌3小时。反应结束后，通过反相制备色谱法进行纯化。回收包含产物的馏分，减压浓缩去除乙腈之后，进行冷冻干燥，由此得到了芘(20)(12.1mg，9.62μmol)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.01-9.98(m，1H)，8.85-7.88(m，14H)，7.68-7.65(m，1H)，7.56-7.51(m，2H)，7.33-7.27(m，2H)，6.90-6.87(m，2H)，5.92-5.90(m，1H)，5.63-5.62(m，1H)，5.36(brs，2H)，5.08-4.92(m，2H)，4.36-3.76(m，5H)，3.18-3.14(m，1H)，3.00-2.83(m，7H)，2.36-2.08(m，6H)，1.95-1.89(m，1H)，1.84-1.78(m，1H)，1.68-1.50(m，3H)，1.42-1.17(m，24H)，1.07-0.97(m，2H)，0.81-0.74(m，6H).
MS(ESI)m/z：1257.55[M+H]+
(1-4-5)接头-有效载荷模拟物(16)的合成
[化学式48]
向芘(20)(10.5mg，8.35μmol)中依次加入乙酸乙酯(1.7mL)、4M氯化氢/乙酸乙酯(2.09mL，8.36mmol)，在室温下搅拌4.5小时。冰冷后，加入N，N-二异丙基乙胺(781μL，4.59mmol)，在室温下搅拌10分钟。通过反相制备色谱法纯化反应液，回收包含产物的馏分，减压浓缩去除乙腈之后，进行冷冻干燥，由此得到了接头-有效载荷模拟物(16)(7.5mg，6.6μmol)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ12.02(brs，2H)，10.04-9.98(m，1H)，8.85-7.89(m，14H)，7.65-7.62(m，1H)，7.56-7.52(m，2H)，7.33-7.27(m，2H)，6.90-6.87(m，2H)，5.92(brs，1H)，5.63-5.62(m，1H)，5.37(brs，2H)，5.08-4.93(m，2H)，4.36-3.76(m，5H)，3.18-3.14(m，1H)，3.02-2.80(m，7H)，2.38-2.16(m，6H)，1.96-1.77(m，2H)，1.70-1.17(m，9H)，1.06-0.98(m，2H)，0.81-0.74(m，6H).
MS(ESI)m/z：1145.45[M+H]+
(1-5)接头-有效载荷模拟物(21)的合成
接头-有效载荷模拟物(21)如下进行合成。
[化学式49]
(1-5-1)醇(22)的合成
[化学式50]
将Ac-Glu(OtBu)-Val-Ala-OH(20.9mg，50.3μmol)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(700μL)，加入1-[双(二甲氨基)亚甲基]-1H-1，2，3-三唑并[4，5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸盐(29.0mg，76.3μmol)、2，4，6-三甲基吡啶(10.1μL，76.7μmol)，在室温下搅拌12分钟。接着，加入4-氨基扁桃酸甲酯(11.0mg，60.7μmol)，在室温下搅拌18小时之后，通过反相制备色谱法进行纯化。回收包含产物的馏分，通过减压浓缩去除乙腈，进行冷冻干燥，由此得到了上述醇(22)(20.3mg，35.1μmol)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ9.98-9.89(m，1H)，8.32-8.18(m，1H)，8.07-7.85(m，1H)，7.73-7.59(m，1H)，7.55(d，J＝8.4Hz，2H)，7.32(d，J＝8.4Hz，2H)，5.08(s，1H)，4.45-4.34(m，1H)，4.32-4.27(m，1H)，4.20-4.09(m，1H)，3.59(s，3H)，2.24-2.20(m，2H)，2.01-1.96(m，1H)，1.90-1.80(m，4H)，1.72-1.67(m，1H)，1.39-1.36(m，9H)，1.30(d，J＝7.2Hz，3H)，0.86(d，J＝6.8Hz，3H)，0.82(d，J＝6.8Hz，3H).
MS(ESI)m/z：579.30[M+H]+
(1-5-2)芘(23)的合成
[化学式51]
将醇(22)(17.5mg，30.2μmol)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(174μL)，在冰冷下搅拌5分钟之后，加入碳酸双(4-硝基苯基)酯(18.9mg，60.8μmol)、N，N-二异丙基乙胺(7.80μL，45.4μmol)，在室温下搅拌30分钟。确认LCMS时有原料残留，因此加入碳酸双(4-硝基苯基)酯(9.5mg，31μmol)、N，N-二异丙基乙胺(3.90μL，22.7μmol)，在室温下搅拌1小时。之后，进行冰冷，加入肌氨酸-芘(36.2mg，120μmol)、1-羟基苯并三唑(6.3mg，47μmol)、N，N-二异丙基乙胺(40.3μL，235μmol)，在室温下搅拌1小时。反应后，通过反相制备色谱法进行纯化。回收包含产物的馏分，通过减压浓缩去除乙腈，进行冷冻干燥，由此得到了上述芘(23)(12.9mg，14.2μmol)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.05-10.02(m，1H)，8.61-8.60(m，1H)，8.30-7.78(m，12H)，7.67-7.64(m，1H)，7.57(d，J＝8.8Hz，2H)，7.37-7.33(m，2H)，5.72-5.70(m，1H)，4.98-4.89(m，2H)，4.34-4.00(m，3H)，3.85-3.75(m，1H)，3.56-3.55(m，3H)，2.93-2.87(m，3H)，2.17-2.13(m，2H)，1.94-1.91(m，1H)，1.85-1.75(m，4H)，1.65-1.61(m，1H)，1.31-1.23(m，12H)，0.80-0.73(m，6H).
MS(ESI)m/z：907.35[M+H]+
(1-5-3)芘(24)的合成
[化学式52]
将芘(23)(11.8mg，13.0μmol)溶解于四氢呋喃(800μL)、水(400μL)之后进行冰冷，加入1M氢氧化锂水溶液(65μL，65μmol)，搅拌30分钟。反应结束后，使用0.1M盐酸调节至约pH6，通过反相制备色谱法进行纯化。回收包含产物的馏分，通过减压浓缩去除乙腈，进行冷冻干燥，由此得到了上述芘(24)(8.9mg，10.0μmol)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ13.05(brs，1H)，10.04-9.91(m，1H)，8.63-8.60(m，1H)，8.33-7.77(m，12H)，7.69-7.55(m，3H)，7.37-7.35(m，2H)，5.61-5.60(m，1H)，4.98-4.86(m，2H)，4.26-4.03(m，3H)，3.84-3.74(m，1H)，2.93-2.87(m，3H)，2.18-2.13(m，2H)，1.95-1.92(m，1H)，1.85-1.77(m，4H)，1.67-1.62(m，1H)，1.31-1.24(m，12H)，0.81-0.75(m，6H).
MS(ESI)m/z：893.35[M+H]+
(1-5-4)芘(25)的合成
[化学式53]
将芘(24)(6.7mg，7.5μmol)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(400μL)之后进行冰冷，加入N，N-二异丙基乙胺(3.9μL，22μmol)、1H-苯并三唑-1-基氧基三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐(5.9mg，11μmol)。然后加入N-(5-氨基戊基)马来酰亚胺盐酸盐(2.4mg、11μmol)，返回室温并搅拌1小时。反应结束后，通过反相制备色谱法进行纯化。回收包含产物的馏分，减压浓缩去除乙腈之后，进行冷冻干燥，由此得到了芘(25)(4.1mg，3.9μmol)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ9.98-9.95(m，1H)，8.83-7.77(m，14H)，7.67-7.65(m，1H)，7.56-7.50(m，2H)，7.34-7.27(m，2H)，6.89-6.86(m，2H)，5.63-5.61(m，1H)，5.06-4.93(m，2H)，4.37-3.76(m，5H)，3.17-3.14(m，1H)，2.95-2.83(m，5H)，2.17-2.10(m，2H)，1.95-1.89(m，1H)，1.85-1.75(m，4H)，1.65-1.62(m，1H)，1.31-1.17(m，16H)，1.02-1.00(m，2H)，0.81-0.74(m，6H).
MS(ESI)m/z：1057.45[M+H]+
(1-5-5)接头-有效载荷模拟物(21)的合成
[化学式54]
向芘(25)(2.4mg，2.3μmol)中依次加入1，4-二烷(454μL)、4M氯化氢/二烷溶液(568μL，2.27mmol)，在室温下搅拌4小时。加入N，N-二甲基甲酰胺(300μL)之后，在冰冷下加入N，N-二异丙基乙胺(214μL，1.25mmol)，在室温下搅拌10分钟。通过反相制备色谱法纯化反应液，回收包含产物的馏分，减压浓缩去除乙腈之后，进行冷冻干燥，由此得到了接头-有效载荷模拟物(21)(1.1mg，1.1μmol)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ11.99(brs，1H)，9.98-9.96(m，1H)，8.84-7.88(m，14H)，7.66-7.63(m，1H)，7.54-7.50(m，2H)，7.34-7.27(m，2H)，6.90-6.87(m，2H)，5.63-5.61(m，1H)，5.07-4.93(m，2H)，4.36-3.76(m，5H)，3.17-3.14(m，1H)，2.95-2.83(m，5H)，2.20-2.16(m，2H)，1.95-1.90(m，1H)，1.88-1.76(m，4H)，1.67-1.62(m，1H)，1.32-1.17(m，7H)，1.02-1.01(m，2H)，0.81-0.74(m，6H).
MS(ESI)m/z：999.35[M-H]-
比较例1：接头-有效载荷的合成
(1-1)接头-有效载荷(26)的合成
接头-有效载荷(26)如下进行合成。
[化学式55]
接头-有效载荷(26)依据下述方案进行合成。
[化学式56]
接头-有效载荷(26)的MS分析结果如下。
MS(ESI)m/z：1050.55[M+H]+
实施例2：ADC模拟物的合成
(2-1)ADC模拟物的合成
在以下的比较例和实施例中，作为引入硫醇基的抗体，使用了国际公开第2019/240287号(WO2019/240287A1)的实施例81-7中记载的抗体衍生物(引入硫醇基的曲妥珠单抗)。该抗体衍生物具有下述结构：硫醇基经由抗体重链的246位或248位的赖氨酸残基的侧链的氨基被位点选择性地引入至曲妥珠单抗(人源化IgG1抗体)中(赖氨酸残基的位点依据EU编号)。
[化学式57]
上述结构中，从抗体重链延伸的NH-CH2-CH2-CH2-CH2-对应于赖氨酸残基的侧链，作为含硫醇基团的HS-CH2-CH2-C(＝O)附加在该赖氨酸残基的侧链中的氨基上。由于在肽图分析法中未检测到在其它赖氨酸残基的修饰，因此认为该抗体在抗体重链的246位或248位的位点选择性为100％。
向引入硫醇基的抗体的缓冲液(pH7.4PBS缓冲液)溶液(20μM)中加入10当量的实施例1中合成的接头-有效载荷模拟物的DMF溶液(10mM)，在室温下静置2小时后，使用NAP-5柱(GE HealthCare公司制造)进行纯化，得到了ADC模拟物。
由实施例1-1中合成的接头-有效载荷模拟物(1)和含硫醇的抗体合成了下述结构的ADC模拟物1。进行ESI-TOFMS分析，反应产物为在引入了2个接头-有效载荷模拟物(1)的150350处确认到峰。
[化学式58]
同样地，由实施例1-2的接头-有效载荷模拟物(6)和含硫醇的抗体合成了下述结构的ADC模拟物2。进行ESI-TOFMS分析，反应产物为在引入了2个接头-有效载荷模拟物(6)的150535处确认到峰。
[化学式59]
同样地，由实施例1-3的接头-有效载荷模拟物(11)和含硫醇的抗体合成了下述结构的ADC模拟物3。进行ESI-TOFMS分析，反应产物为在引入了2个接头-有效载荷模拟物(11)的150609处确认到峰。
[化学式60]
同样地，由实施例1-4的接头-有效载荷模拟物(16)和含硫醇的抗体合成了下述结构的ADC模拟物4。进行ESI-TOFMS分析，反应产物为在引入了2个接头-有效载荷模拟物(16)的150466处确认到峰。
[化学式61]
同样地，由比较例1的接头-有效载荷模拟物(26)和含硫醇的抗体合成了下述结构的ADC模拟物5。进行ESI-TOFMS分析，反应产物为在引入了2个接头-有效载荷模拟物(26)的150276处确认到峰。
[化学式62]
(2-2)ADC模拟物的DAR解析
依据已有报道(WO2019/240287A1)进行实施例2-1中合成的ADC模拟物的ESI-TOFMS分析，确认到DAR为2。
[表1]
表1.ADC模拟物的DAR
接头-有效载荷模拟物 实施例/比较例 DAR
ADC模拟物1 接头-有效载荷模拟物(1) 实施例1-1 2
ADC模拟物2 接头-有效载荷模拟物(6) 实施例1-2 2
ADC模拟物3 接头-有效载荷模拟物(11) 实施例1-3 2
ADC模拟物4 接头-有效载荷模拟物(16) 实施例1-4 2
ADC模拟物5 接头-有效载荷模拟物(26) 比较例1 2
实施例3：基于疏水性柱色谱法(HIC-HPLC)来评价ADC和ADC模拟物的疏水度
依据已有报道(Anal.Chem.，2019，91，20，12724-12732)进行了HIC-HPLC分析。采用下述的条件进行测定。可根据HIC色谱图中的ADC的保留时间来评价ADC的疏水度。
测定系统：Chromaster(注册商标)(日立公司制造)
柱：Tosoh Bioscience公司制造Tosoh Biobuthyl NPR 2.5μm 4.6×35mm柱
梯度：洗脱液A/B的线性梯度
流速：0.8mL/分钟
洗脱液A：1.1M(NH4)2SO4，25mM Na2HPO4/NaH2PO4(pH6.0)
洗脱液B：25mM Na2HPO4/NaH2PO4(pH6.0、添加25v/v％异丙醇)
检测器：UV(280nm)
[表2]
表2.采用HIC-HPLC来评价ADC和ADC模拟物的疏水度
其结果，确认了实施例1-1、1-2、1-3、1-4中合成的ADC模拟物具有保留时间快的倾向，可知亲水度高。因此，认为实施例1-1、1-2、1-3、1-4中合成的ADC模拟物的血浆清除率慢，在体内停留的时间长，所以确认为优选的ADC。
实施例4：基于尺寸排阻色谱法(SEC-HPLC)来评价ADC和ADC模拟物的凝集率
依据已有报道(ChemistrySelect，2020，5，8435-8439)进行了SEC-HPLC分析。采用下述的条件进行测定。
测定系统：1260HPLC system(Agilent公司制造)
柱：Agilent公司制造AdvanceBio SEC2.7μm，4.6mm×150mm
流速：0.25mL/分钟
洗脱液：100mM磷酸二氢钠/磷酸氢钠，250mM氯化钠的水溶液(pH6.8)，10％v/v异丙醇
检测器：UV(280nm)
[表3]
表3.采用SEC-HPLC来评价ADC和ADC模拟物的凝集率
实施例5：使用酶组织蛋白酶B来评价ADC模拟物
如下所述，通过解析从ADC模拟物脱落的荧光分子的量来评价各种ADC模拟物的基于组织蛋白酶B的切割能力。
(5-1)组织蛋白酶B切割性試験
依据已有报道(Nature Communications 2018，9，2512)如下实施。向180μL的MES缓冲液(10mM MES，40μM DTT，pH5.0)中加入ADC模拟物使浓度为0.1mg/mL，之后向6支微型离心管中分别注入30μL。6支样本中的3支在0℃下立即各加入100μL乙腈，经涡旋搅拌后进行离心，由此得到了沉淀物。回收所产生的上清液，进行了HPLC分析。剩下的3支在37℃下孵育6小时。向各样本中分别加入100μL乙腈，经涡旋搅拌后进行离心，由此得到了沉淀物。回收所产生的上清液，进行了HPLC分析。
(5-2)采用HPLC分析对脱落的荧光分子的量进行解析
测定是采用液相色谱法/荧光检测法，测定了从ADC模拟物脱落的荧光分子的量。以实施例7-1中在0℃下立即加入乙腈的3支样本作为0小时的样本，以如实施例7-1中所记载的那样在37℃下孵育6小时的3支样本作为6小时的样本，解析了6小时样本与0小时样本的荧光强度的差值。
另外，使用芘，算出了基于HPLC的荧光强度的区域面积与浓度的相关性。利用该计算式将上述各ADC模拟物的荧光强度的差值转换为浓度。将0小时的浓度设为100％时的上述荧光强度的差值的比例作为脱落率算出。
[表4]
表4.ADC模拟物的组织蛋白酶B切割能力的评价
如表4中所示，可知合成的ADC模拟物具有充分的组织蛋白酶B切割。
实施例6：使用小鼠血浆来评价ADC模拟物
(6-1)ADC模拟物的血浆中稳定性试验
向500μL小鼠血浆(Charles River公司制造)中加入ADC模拟物使浓度为0.1mg/mL，之后进行灭菌过滤。向6支微型离心管中分别注入各50μL的该溶液。6支样本中的3支在设定为37℃的恒温箱中保管4天。剩下的3支在-80℃的冷库中同样地保管4天。向各样本中分别加入100μL乙腈，经涡旋搅拌后进行离心，由此得到了沉淀物。回收所产生的上清液，进行了HPLC分析。
(6-2)采用HPLC分析对脱落的荧光分子的量进行解析
测定是采用液相色谱法/荧光检测法，测定了从ADC模拟物脱落的荧光分子的量。以实施例9-1中冷库保管的3支样本作为第0天的样本，以实施例9-1中37℃保管的3支样本作为第4天的样本，解析了第4天与第0天的荧光强度的差值。
依据实施例5-2实施了荧光分子的脱落率的计算。
结果如下表所述，评价了荧光分子的脱落率。
[表5]
表5.使用ADC模拟物的血浆中稳定性试验结果
其结果，相对于比较例1中合成的ADC模拟物，实施例1-1、1-2中合成的ADC模拟物显示出3倍以上的稳定性，实施例1-3、1-4中合成的ADC模拟物显示出10倍以上的稳定性。
实施例7：接头-有效载荷的合成
(7-1)接头-有效载荷(35)的合成
接头-有效载荷(35)如下进行合成。
[化学式63]
(7-1-1)碳酸酯(36)的合成
[化学式64]
将(1-1-1)中得到的醇(2)(105mg，0.158mmol)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(2mL)，在冰冷下搅拌5分钟之后，加入碳酸双(4-硝基苯基)酯(100mg，0.329mmol)、N，N-二异丙基乙胺(83μL，0.48mmol)，在氮气气氛下、室温下搅拌19.5小时。利用蒸发器去除N，N-二甲基甲酰胺之后，向所得的粗产物中加入乙酸乙酯(3mL)进行溶解，然后加入二乙醚(3mL)。将所得的溶液通过过滤去除残渣之后，通过真空泵去除有机溶剂，得到了碳酸酯(36)(102mg，0.123mmol)。
MS(ESI)m/z：830.1[M+H]+，852.1[M+Na]+
(7-1-2)化合物(37)的合成
[化学式65]
将(7-1-1)中得到的化合物(36)(69mg，0.083mmol)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(3.5mL)，在室温下加入1-羟基苯并三唑(16mg，0.10mmol)、市售的单甲基澳瑞他汀E(MMAE，61mg，0.085mmol)。接着，加入二异丙基乙胺(29μL，0.17mmol)之后，在室温、氮气气氛下搅拌22.5小时。利用蒸发器去除有机溶剂之后，加入乙腈∶水＝1∶1的溶液，通过反相制备色谱法进行纯化。回收包含产物的馏分，通过减压浓缩去除乙腈，进行冷冻干燥，由此得到了化合物37(79mg，0.056mmol)。
MS(ESI)m/z：1408.9[M+H]+
(7-1-3)化合物(38)的合成
[化学式66]
将(7-1-2)中得到的化合物(37)(97mg，0.069mmol)溶解于四氢呋喃(7mL)、水(2mL)，在冰冷下加入氢氧化锂(1.0M、1.4mL，1.4mmol)，直接搅拌1小时。向反应溶液中加入盐酸，调节至pH6之后，加入乙腈∶水＝1∶1的溶液，通过反相制备色谱法进行纯化。回收包含产物的馏分，通过减压浓缩去除乙腈，进行冷冻干燥，由此得到了化合物38(70mg，0.050mmol)。
MS(ESI)m/z：1394.7[M+H]+
(7-1-4)化合物(39)的合成
[化学式67]
将(7-1-3)中得到的化合物(38)(34mg，0.024mmol)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(3mL)之后进行冰冷，加入N，N-二异丙基乙胺(25μL，0.14mmol)、1H-苯并三唑-1-基氧基三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐(20mg，0.038mmol)。然后加入N-(5-氨基戊基)马来酰亚胺盐酸盐(8.7mg，0.040mmol)，返回室温并搅拌20小时。反应结束后，通过反相制备色谱法进行纯化。回收包含产物的馏分，减压浓缩去除乙腈之后，进行冷冻干燥，由此得到了化合物(39)(29mg，0.019mmol)。
MS(ESI)m/z：1558.9[M+H]+
(7-1-5)接头-有效载荷(35)的合成
[化学式68]
向(7-1-4)中得到的化合物(39)(29mg，0.019mmol)中依次加入乙腈(500μL)、85wt％磷酸水溶液(0.50mL，7.3mmol)，在室温下搅拌3小时。反应结束后，加入水(2mL)，通过反相制备色谱法纯化反应液，回收包含产物的馏分，减压浓缩去除乙腈之后，进行冷冻干燥，由此得到了接头-有效载荷(35)(18mg，0.012mmol)。
MS(ESI)m/z：1502.9[M+H]+
(7-2)接头-有效载荷(40)的合成
接头-有效载荷(40)如下进行合成。
[化学式69]
(7-2-1)化合物(41)的合成
[化学式70]
将(7-1-3)中得到的化合物(38)(10mg，0.0072mmol)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(1mL)之后进行冰冷，加入N，N-二异丙基乙胺(10μL，0.057mmol)、1H-苯并三唑-1-基氧基三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐(7.0mg，0.013mmol)。然后加入DBCO-己胺(4.7mg，0.015mmol)的N，N-二甲基甲酰胺(0.5mL)溶液，返回室温并搅拌20小时。反应结束后，通过反相制备色谱法进行纯化。回收包含产物的馏分，减压浓缩去除乙腈之后，进行冷冻干燥，由此得到了化合物(41)(5.8mg，0.0034mmol)。
MS(ESI)m/z：1696.0[M+H]+
(7-2-2)接头-有效载荷(40)的合成
[化学式71]
向(7-2-1)中得到的化合物(41)(13mg，0.0077mmol)中依次加入乙腈(500μL)、85wt％磷酸水溶液(0.50mL，7.3mmol)，在室温下搅拌4小时。反应结束后，加入水(2mL)，通过反相制备色谱法纯化反应液，回收包含产物的馏分，减压浓缩去除乙腈之后，进行冷冻干燥，由此得到了接头-有效载荷(40)(7.4mg，0.0045mmol)。
MS(ESI)m/z：1638.9[M+H]+
(7-3)接头-有效载荷(42)的合成
接头-有效载荷(42)如下进行合成。
[化学式72]
(7-3-1)碳酸酯(43)的合成
[化学式73]
将(1-1-1)中得到的醇(2)(140mg，0.165mmol)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(4mL)，在冰冷下搅拌5分钟之后，加入碳酸双(4-硝基苯基)酯(108mg，0.355mmol)、N，N-二异丙基乙胺(100μL，0.574mmol)，在氮气气氛下、室温下搅拌18小时。利用蒸发器去除有机溶剂之后，加入乙腈∶水＝1∶1的溶液，通过反相制备色谱法进行纯化。回收包含产物的馏分，通过减压浓缩去除乙腈，进行冷冻干燥，由此得到了化合物43(130mg，0.128mmol)。
MS(ESI)m/z：1015.6[M+H]+
(7-3-2)化合物(44)的合成
[化学式74]
将(7-3-1)中得到的化合物(43)(85mg，0.084mmol)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(2mL)，在室温下加入1-羟基苯并三唑(20mg，0.13mmol)、市售的单甲基澳瑞他汀E(MMAE，63mg，0.088mmol)。接着，加入二异丙基乙胺(75μL，0.43mmol)之后，在室温、氮气气氛下搅拌23小时。利用蒸发器去除有机溶剂之后，加入乙腈∶水＝1∶1的溶液，通过反相制备色谱法进行纯化。回收包含产物的馏分，通过减压浓缩去除乙腈，进行冷冻干燥，由此得到了化合物44(94mg，0.059mmol)。
MS(ESI)m/z：1593.6[M+H]+
(7-3-3)化合物(45)的合成
[化学式75]
将(7-3-2)中得到的化合物(44)(94mg，0.059mmol)溶解于四氢呋喃(5mL)、水(2mL)，在冰冷下加入氢氧化锂(1.0M、0.6mL，0.6mmol)，直接搅拌1小时。向反应溶液中加入盐酸，调节至pH5之后，加入乙腈∶水＝1∶1的溶液，通过反相制备色谱法进行纯化。回收包含产物的馏分，通过减压浓缩去除乙腈，进行冷冻干燥，由此得到了化合物45(77mg，0.049mmol)。
MS(ESI)m/z：1579.7[M+H]+
(7-3-4)化合物(46)的合成
[化学式76]
将(7-3-3)中得到的化合物(45)(77mg，0.049mmol)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(3mL)之后进行冰冷，加入N，N-二异丙基乙胺(50μL，0.29mmol)、1H-苯并三唑-1-基氧基三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐(87mg，0.17mmol)。然后加入N-(5-氨基戊基)马来酰亚胺盐酸盐(35mg，0.16mmol)，返回室温并搅拌20小时。反应结束后，通过反相制备色谱法进行纯化。回收包含产物的馏分，减压浓缩去除乙腈之后，进行冷冻干燥，由此得到了化合物(46)(65mg，0.037mmol)。
MS(ESI)m/z：1744.7[M+H]+
(7-3-5)接头-有效载荷(42)的合成
[化学式77]
向(7-3-4)中得到的化合物(46)(65mg，0.037mmol)中依次加入乙腈(2mL)、85wt％磷酸水溶液(1.00mL，14.6mmol)，在室温下搅拌6小时。反应结束后，加入水(2mL)，通过反相制备色谱法纯化反应液，回收包含产物的馏分，减压浓缩去除乙腈之后，进行冷冻干燥，由此得到了接头-有效载荷(42)(49mg，0.030mmol)。
MS(ESI)m/z：1631.6[M+H]+
(7-4)接头-有效载荷(47)的合成
接头-有效载荷(47)如下进行合成。
[化学式78]
(7-4-1)化合物(48)的合成
[化学式79]
将(7-3-1)中得到的化合物(43)(67mg，0.066mmol)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(2mL)，在室温下加入1-羟基苯并三唑(17mg，0.11mmol)、市售的依喜替康甲磺酸盐(CAS：169869-90-3、35mg，0.066mmol)。接着，加入二异丙基乙胺(50μL，0.29mmol)后，在室温、氮气气氛下搅拌4小时。利用蒸发器去除有机溶剂之后，加入乙腈∶水＝1∶1的溶液，通过反相制备色谱法进行纯化。回收包含产物的馏分，通过减压浓缩去除乙腈，进行冷冻干燥，由此得到了化合物48(57mg，0.043mmol)。
MS(ESI)m/z：1311.7[M+H]+
(7-4-2)化合物(49)的合成
[化学式80]
将(7-4-1)中得到的化合物(48)(57mg，0.043mmol)溶解于四氢呋喃(3mL)、水(1.5mL)，在冰冷下加入氢氧化锂(1.0M、0.5mL，0.5mmol)，直接搅拌1小时。向反应溶液中加入盐酸，调节至pH5之后，加入乙腈∶水＝1∶1的溶液，通过反相制备色谱法进行纯化。回收包含产物的馏分，通过减压浓缩去除乙腈，进行冷冻干燥，由此得到了化合物49(45mg，0.035mmol)。
MS(ESI)m/z：1297.6[M+H]+
(7-4-3)化合物(50)的合成
[化学式81]
将(7-4-2)中得到的化合物(49)(45mg，0.035mmol)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(3mL)之后进行冰冷，加入N，N-二异丙基乙胺(30μL，0.17mmol)、1H-苯并三唑-1-基氧基三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐(55mg，0.11mmol)。然后加入N-(5-氨基戊基)马来酰亚胺盐酸盐(22mg，0.10mmol)，返回室温并搅拌18小时。反应结束后，通过反相制备色谱法进行纯化。回收包含产物的馏分，减压浓缩去除乙腈之后，进行冷冻干燥，由此得到了化合物(50)(22mg，0.015mmol)。
MS(ESI)m/z：1462.7[M+H]+
(7-3-5)接头-有效载荷(47)的合成
[化学式82]
向(7-4-3)中得到的化合物(50)(22mg，0.015mmol)中依次加入乙腈(1mL)、85wt％磷酸水溶液(1.0mL，14.6mmol)，在室温下搅拌1.5小时。反应结束后，加入水(1mL)，通过反相制备色谱法纯化反应液，回收包含产物的馏分，减压浓缩去除乙腈之后，进行冷冻干燥，由此得到了接头-有效载荷(47)(18.8mg，0.0139mmol)。
1H NMR(300MHz；DMSO-d6)δ10.04(s，1H)，8.10-8.05(m，4H)，7.80-7.77(m，2H)，7.59-7.55(m，2H)，7.35-7.30(m，3H)，6.99(d，J＝8.8Hz，2H)，6.54-6.53(m，1H)，6.01(brs，1H)，5.74(d，J＝9.0Hz，1H)，5.43(brs，4H)，5.33-5.28(m，2H)，4.29-4.15(m，4H)，3.19-2.98(m，5H)，2.43-2.38(m，5H)，2.27-2.20(m，7H)，1.95-1.83(m，8H)，1.73-1.62(m，4H)，1.42-1.30(m，7H)，1.23-1.13(m，3H)，0.84(m，9H).
MS(ESI)m/z：1349.2[M+H]+
(7-5)接头-有效载荷(125)的合成
关于下述所示的接头-有效载荷(125)，在接头-有效载荷模拟物(120)的合成中，使用MMAE代替肌氨酸-芘，以同样的方法进行合成。
[化学式83]
MS(ESI)m/z：1968.14[M+H]+
(7-6)接头-有效载荷(126)的合成
关于下述所示的接头-有效载荷(126)，在接头-有效载荷模拟物(35)的合成中，使用依喜替康甲磺酸盐代替MMAE，以同样的方法进行合成。
[化学式84]
MS(ESI)m/z：1220.50[M+H]+
实施例8：ADC的合成
(8-1)ADC 4的合成
在以下的比较例和实施例中，作为引入硫醇基的抗体，使用了国际公开第2019/240287号(WO2019/240287A1)的实施例81-7中记载的抗体衍生物(引入硫醇基的曲妥珠单抗)。该抗体衍生物具有下述结构：硫醇基经由抗体重链的246位或248位的赖氨酸残基的侧链的氨基被位点选择性地引入至曲妥珠单抗(人源化IgG1抗体)中(赖氨酸残基的位点依据EU编号)。
[化学式85]
上述结构中，从抗体重链延伸的NH-CH2-CH2-CH2-CH2-对应于赖氨酸残基的侧链，作为含硫醇基团的HS-CH2-CH2-C(＝O)附加在该赖氨酸残基的侧链中的氨基上。由于在肽图分析法中未检测到在其它赖氨酸残基的修饰，因此认为该抗体在抗体重链的246位或248位的位点选择性为100％。
向引入硫醇基的抗体的缓冲液(pH7.4 PBS缓冲液)溶液(20μM)中加入10当量的实施例12-1中合成的接头-有效载荷(35)的DMF溶液(10mM)，在室温下静置2小时后，使用NAP-5柱(GE HealthCare公司制造)进行纯化，得到了ADC 4。进行ESI-TOFMS分析，反应产物为在引入了2个接头-有效载荷(35)的151414处确认到峰。
[化学式86]
(8-2)ADC 5的合成
依据(8-1)，由接头-有效载荷(42)得到了ADC 5。进行ESI-TOFMS分析，反应产物为在引入了2个接头-有效载荷(42)的151673处确认到峰。
[化学式87]
(8-3)ADC 6的合成
依据(13-1)，由接头-有效载荷(47)得到了ADC 6。进行ESI-TOFMS分析，反应产物为在引入了2个接头-有效载荷(47)的151109处确认到峰。
[化学式88]
(8-4)ADC 8的合成
依据(13-1)，由接头-有效载荷(125)得到了ADC 8。进行ESI-TOFMS分析，反应产物为在引入了2个接头-有效载荷(125)的150524处确认到峰。
[化学式89]
(8-5)ADC 11的合成
依据(13-1)，由接头-有效载荷(126)得到了ADC 11。进行ESI-TOFMS分析，反应产物为在引入了2个接头-有效载荷(126)的150615处确认到峰。
[化学式90]
实施例9：ADC的HIC-HPLC分析
采用实施例3的条件进行了HIC-HPLC分析。
[表6]
表6.ADC的DAR
接头-有效载荷 实施例 DAR
ADC 4 接头-有效载荷(35) 8-1 2
ADC 5 接头-有效载荷(42) 8-2 2
ADC 6 接头-有效载荷(47) 8-3 2
接着，采用HIC-HPLC进行了ADC的疏水性评价。测定依据实施例3来进行。可根据HIC色谱图中的ADC的保留时间来评价ADC的疏水度。比较对象使用了作为原料抗体的曲妥珠单抗。
[表7]
表7.采用HIC-HPLC来评价基于曲妥珠单抗的ADC的疏水度
作为EXO型ADC的ADC 4、5、6在HIC色谱图中的保留时间不逊色于原料抗体，可知是更亲水性的ADC。
实施例10：基于尺寸排阻色谱法(SEC-HPLC)来评价ADC的凝集率
依据实施例4进行了SEC-HPLC分析。
[表8]
表8.采用SEC-HPLC来评价基于曲妥珠单抗的ADC模拟物的凝集率
接头-有效载荷 实施例 凝集率
ADC 4 接头-有效载荷(35) 8-1 0.6％
ADC 5 接头-有效载荷(42) 8-2 0.8％
ADC 6 接头-有效载荷(47) 8-3 0.5％
曲妥珠单抗 无 无 0.5％
其结果，确认了(8-1)、(8-2)和(8-3)中合成的ADC具有凝集率低的倾向，可知稳定性更高。因此，确认了实施例8中合成的ADC为优选的ADC。
实施例11：接头-有效载荷模拟物的合成
(11-1)接头-有效载荷模拟物(56)的合成
接头-有效载荷模拟物(56)如下进行合成。
[化学式91]
(11-1-1)醇(57)的合成
[化学式92]
将Ac-As p(OtBu)-Val-Cit-OH(51.7mg，103μmol)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(520μL)，加入1-[双(二甲氨基)亚甲基]-1H-1，2，3-三唑并[4，5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸盐(46.9mg，123μmol)、2，4，6-三甲基吡啶(15.9μL，123μmol)，在室温下搅拌10分钟。接着，加入4-氨基扁桃酸甲酯(22.3mg，123μmol)，在室温下搅拌19小时之后，通过反相制备色谱法进行纯化。回收包含产物的馏分，通过减压浓缩去除乙腈，进行冷冻干燥，由此得到了上述醇(57)(56.3mg，86.5μmol)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ9.99(s，1H)，8.27(d，J＝8.4Hz，1H)，8.17(d，J＝8.4Hz，1H)，7.59(d，J＝8.8Hz，1H)，7.56(d，J＝8.8Hz，2H)，7.31(d，J＝8.8Hz，2H)，5.98(brs，1H)，5.41(brs，2H)，5.08(s，1H)，4.64-4.59(m，1H)，4.39-4.34(m，1H)，4.22-4.18(m，1H)，3.59(s，3H)，3.01-2.94(m，2H)，2.69-2.63(m，1H)，2.44-2.38(m，1H)，2.00-1.95(m，1H)，1.83(s，3H)，1.69-1.66(m，1H)，1.62-1.53(m，1H)，1.43-1.34(m，11H)，0.84(d，J＝6.8Hz，3H)，0.79(d，J＝6.8Hz，3H).
MS(ESI)m/z：651.35[M+H]+
(11-1-2)芘(58)的合成
[化学式93]
将醇(57)(55.0mg，84.5μmol)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(423μL)，在冰冷下搅拌5分钟之后，加入碳酸双(4-硝基苯基)酯(77.1mg，254μmol)、N，N-二异丙基乙胺(32.3μL，190μmol)，在室温下搅拌2小时。之后，进行冰冷，加入肌氨酸-芘(76.7mg，254μmol)、1-羟基苯并三唑(17.1mg，127μmol)、N，N-二异丙基乙胺(53.9μL，317μmol)，在室温下搅拌1.5小时。反应后，通过反相制备色谱法进行纯化。回收包含产物的馏分，通过减压浓缩去除乙腈，进行冷冻干燥，由此得到了上述芘(58)(60.9mg，62.2μmol)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.14-10.11(m，1H)，8.68-8.66(m，1H)，8.39-8.01(m，10H)，7.89-7.85(m，1H)，7.67-7.58(m，3H)，7.44-7.39(m，2H)，5.98(brs，1H)，5.79-5.77(m，1H)，5.42(brs，2H)，5.04-4.97(m，2H)，4.65-4.59(m，1H)，4.39-4.36(m，1H)，4.28-4.07(m，2H)，3.92-3.82(m，1H)，3.62-3.61(m，3H)，2.99-2.91(m，5H)，2.69-2.63(m，1H)，2.44-2.38(m，1H)，2.01-1.97(m，1H)，1.83(s，3H)，1.70-1.60(m，2H)，1.44-1.30(m，11H)，0.86-0.77(m，6H).
MS(ESI)m/z：979.45[M+H]+
(11-1-3)芘(59)的合成
[化学式94]
将芘(58)(24.9mg，25.4μmol)溶解于四氢呋喃(1.88mL)、水(625μL)，在冰冷下搅拌5分钟之后，加入1M氢氧化锂水溶液(30.5μL，30.5μmol)，在室温下搅拌50分钟。反应结束后，使用0.1M盐酸调节至约pH6，通过反相制备色谱法进行纯化。回收包含产物的馏分，通过减压浓缩去除乙腈，进行冷冻干燥，由此得到了上述芘(59)(8.3mg，8.6μmol)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ13.06(brs，1H)，10.13-10.09(m，1H)，8.68-8.65(m，1H)，8.39-8.00(m，10H)，7.88-7.84(m，1H)，7.67-7.59(m，3H)，7.44-7.41(m，2H)，5.98(brs，1H)，5.68-5.67(m，1H)，5.42(brs，2H)，5.04-4.93(m，2H)，4.64-4.61(m，1H)，4.41-4.35(m，1H)，4.32-4.09(m，2H)，3.91-3.80(m，1H)，2.99-2.91(m，5H)，2.70-2.64(m，1H)，2.44-2.38(m，1H)，2.01-1.98(m，1H)，1.83(s，3H)，1.70-1.57(m，2H)，1.45-1.30(m，11H)，0.86-0.77(m，6H).
MS(ESI)m/z：965.45[M+H]+
(11-1-4)芘(60)的合成
[化学式95]
将芘(59)(7.2mg，7.5μmol)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(150μL)之后进行冰冷，加入N，N-二异丙基乙胺(2.5μL，14.9μmol)、1H-苯并三唑-1-基氧基三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐(5.8mg，11.2μmol)。然后加入N-(5-氨基戊基)马来酰亚胺盐酸盐(2.4mg、11.2μmol)，返回室温并搅拌1小时。反应结束后，通过反相制备色谱法进行纯化。回收包含产物的馏分，减压浓缩去除乙腈之后，进行冷冻干燥，由此得到了芘(60)(5.7mg，5.1μmol)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.07-10.04(m，1H)，8.91-8.88(m，1H)，8.65-7.95(m，12H)，7.62-7.58(m，3H)，7.40-7.36(m，2H)，6.96-6.94(m，2H)，5.97(brs，1H)，5.70-5.68(m，1H)，5.41(brs，2H)，5.14-5.00(m，2H)，4.65-4.61(m，1H)，4.42-4.37(m，1H)，4.25-4.19(m，1H)，4.15-3.82(m，2H)，3.30-3.21(m，2H)，3.04-2.89(m，7H)，2.70-2.64(m，1H)，2.44-2.38(m，1H)，2.01-1.97(m，1H)，1.83(s，3H)，1.75-1.60(m，2H)，1.48-1.24(m，15H)，1.12-1.03(m，2H)，0.86-0.78(m，6H).
MS(ESI)m/z：1129.50[M+H]+
(11-1-5)接头-有效载荷模拟物(56)的合成
[化学式96]
向芘(60)(4.7mg，4.2μmol)中加入乙腈(208μL)，在冰冷下加入85％磷酸溶液(72.4μL，1.25mmol)，在室温下搅拌3小时。反应结束后，通过反相制备色谱法进行纯化。回收包含产物的馏分，减压浓缩去除乙腈之后，进行冷冻干燥，由此得到了接头-有效载荷模拟物(56)(3.1mg，2.9μmol)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ12.38(brs，1H)，10.05-10.01(m，1H)，8.91-8.88(m，1H)，8.65-7.94(m，12H)，7.63-7.58(m，3H)，7.40-7.34(m，2H)，6.96-6.93(m，2H)，6.00(brs，1H)，5.70-5.68(m，1H)，5.44(brs，2H)，5.15-4.99(m，2H)，4.64-4.60(m，1H)，4.43-4.37(m，1H)，4.25-4.22(m，1H)，4.15-3.82(m，2H)，3.30-3.21(m，2H)，3.04-2.89(m，7H)，2.73-2.69(m，1H)，2.46-2.44(m，1H)，2.04-1.96(m，1H)，1.84-1.83(m，3H)，1.77-1.59(m，2H)，1.44-1.04(m，8H)，0.86-0.77(m，6H).
MS(ESI)m/z：1073.50[M+H]+
(11-2)接头-有效载荷模拟物(66)的合成
接头-有效载荷模拟物(1)如下进行合成。
[化学式97]
(11-2-1)醇(67)的合成
[化学式98]
将Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Val-Cit-OH(50.2mg，47.3μmol)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(237μL)，加入1-[双(二甲氨基)亚甲基]-1H-1，2，3-三唑并[4，5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸盐(21.6mg，56.8μmol)、2，4，6-三甲基吡啶(7.48μL，56.8μmol)，在室温下搅拌10分钟。接着，加入4-氨基扁桃酸甲酯(10.3mg，56.8μmol)，在室温下搅拌20小时之后，通过反相制备色谱法进行纯化。回收包含产物的馏分，通过减压浓缩去除乙腈，进行冷冻干燥，由此得到了上述醇(67)(47.7mg，39.1μmol)。
MS(ESI)m/z：1220.65[M+H]+
(11-2-2)芘(68)的合成
[化学式99]
将(1-1-1)中得到的醇(67)(46.3mg，37.9μmol)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(380μL)，在冰冷下搅拌5分钟之后，加入碳酸双(4-硝基苯基)酯(34.6mg，114μmol)、N，N-二异丙基乙胺(14.5μL，85.3μmol)，在室温下搅拌2小时。之后，冰冷，加入肌氨酸-芘(34.5mg，114μmol)、1-羟基苯并三唑(7.7mg，56.9μmol)、N，N-二异丙基乙胺(24.2μL，142μmol)，在室温下搅拌2小时。反应后，通过反相制备色谱法进行纯化。回收包含产物的馏分，通过减压浓缩去除乙腈，进行冷冻干燥，由此得到了上述芘(68)(37.1mg，24.0μmol)。
MS(ESI)m/z：775.30[M+H]+
(11-2-3)芘(69)的合成
[化学式100]
将芘(68)(20.3mg，13.1μmol)溶解于四氢呋喃(983μL)、水(327μL)，在冰冷下搅拌5分钟之后，加入1M氢氧化锂水溶液(31.4μL，31.4μmol)，在室温下搅拌2.5小时。反应结束后，使用1M盐酸调节至约pH6，通过反相制备色谱法进行纯化。回收包含产物的馏分，通过减压浓缩去除乙腈，进行冷冻干燥，由此得到了上述芘(69)(16.7mg，10.9μmol)。
MS(ESI)m/z：1534.85[M+H]+
(11-2-4)芘(70)的合成
[化学式101]
将芘(69)(14.9mg，9.71μmol)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(486μL)之后进行冰冷，加入N，N-二异丙基乙胺(3.3μL，19.4μmol)、1H-苯并三唑-1-基氧基三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐(7.6mg，14.6μmol)。然后加入N-(5-氨基戊基)马来酰亚胺盐酸盐(3.2mg、14.6μmol)，返回室温并搅拌1小时。反应结束后，通过反相制备色谱法进行纯化。回收包含产物的馏分，减压浓缩去除乙腈之后，进行冷冻干燥，由此得到了芘(70)(13.1mg，7.71μmol)。
MS(ESI)m/z：1698.90[M+H]+
(11-2-5)接头-有效载荷模拟物(66)的合成
[化学式102]
向芘(70)(5.25mg，3.09μmol)中加入乙腈(309μL)，在冰冷下加入85％磷酸溶液(53.8μL，927μmol)，在室温下搅拌25小时。反应结束后，通过反相制备色谱法进行纯化。回收包含产物的馏分，减压浓缩去除乙腈之后，进行冷冻干燥，由此得到了接头-有效载荷模拟物(66)(3.7mg，2.51μmol)。
MS(ESI)m/z：1474.00[M+H]+
(11-3)接头-有效载荷模拟物(11)的合成
如下所述，接头-有效载荷模拟物(11)也可通过与(1-3)不同的路径进行合成。
[化学式103]
(11-3-1)醇(96)的合成
[化学式104]
将实施例(1-3-1)中得到的醇(12)(80.0mg，94.1μmol)溶解于四氢呋喃(7.0mL)、水(2.35mL)，在冰冷下搅拌5分钟之后，加入1M氢氧化锂水溶液(226μL，226μmol)，在室温下搅拌2小时。反应结束后，使用1M盐酸调节至约pH6，通过反相制备色谱法进行纯化。回收包含产物的馏分，通过减压浓缩去除乙腈，进行冷冻干燥，由此得到了上述醇(96)(61.5mg，73.6μmol)。
MS(ESI)m/z：836.40[M+H]+
(11-3-2)醇(97)的合成
[化学式105]
将醇(96)(60.5mg，72.4μmol)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(3.6mL)之后进行冰冷，加入N，N-二异丙基乙胺(25μL，145μmol)、1H-苯并三唑-1-基氧基三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐(56.5mg，109μmol)。然后加入N-(5-氨基戊基)马来酰亚胺盐酸盐(23.7mg、109μmol)，返回室温并搅拌3小时。反应结束后，通过反相制备色谱法进行纯化。回收包含产物的馏分，减压浓缩去除乙腈之后，进行冷冻干燥，由此得到了醇(97)(68.0mg，72.4μmol)。
MS(ESI)m/z：1000.50[M+H]+
(11-3-3)化合物(98)的合成
[化学式106]
将醇(97)(10.0mg，10.0μmol)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(0.1mL)之后进行冰冷，加入碳酸双(4-硝基苯基)酯(30.4mg，100μmol)、N，N-二异丙基乙胺(3.8μL，22.5μmol)，在室温下搅拌3小时。反应后，通过正相制备色谱法进行纯化。回收包含产物的馏分，通过减压浓缩去除乙腈，进行冷冻干燥，由此得到了上述化合物(98)(5.6mg，4.8μmol)。
MS(ESI)m/z：1163.50[M+H]+
(11-3-4)芘(15)的合成
[化学式107]
将化合物(98)(10.0mg，8.6μmol)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(86μL)之后进行冰冷，加入肌氨酸-芘(2.2mg，7.2μmol)、1-羟基苯并三唑(1.5mg，11μmol)、N，N-二异丙基乙胺(1.8μL，11μmol)，在室温下搅拌4小时。反应后，通过正相制备色谱法进行纯化。回收包含产物的馏分，通过减压浓缩去除乙腈，进行冷冻干燥，由此得到了上述芘(15)(3.0mg，2.3μmol)。
MS(ESI)m/z：1328.60[M+H]+
(11-3-5)接头-有效载荷模拟物(15)的合成
以与实施例(1-3-5)同样的方法，合成了接头-有效载荷模拟物(15)。
(11-4)接头-有效载荷模拟物(120)的合成
接头-有效载荷模拟物(120)如下进行合成。
[化学式108]
(11-4-1)化合物(122)的合成
[化学式109]
将21-[(叔丁氧基羰基)氨基]-4，7，10，13，16，19-六氧杂二十一烷酸(121)(70.0mg，154μmol)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(7.72mL)之后进行冰冷，加入N，N-二异丙基乙胺(52.0μL，309μmol)、1H-苯并三唑-1-基氧基三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐(120mg，232μmol)。然后加入N-(5-氨基戊基)马来酰亚胺盐酸盐(50.6mg、232μmol)，返回室温并搅拌4小时。反应结束后，通过反相制备色谱法进行纯化。回收包含产物的馏分，减压浓缩去除乙腈之后，进行冷冻干燥，由此得到了化合物(122)(83.4mg，135μmol)。
MS(ESI)m/z：618.50[M+H]+
(11-4-2)化合物(123)的合成
[化学式110]
将化合物(122)(82.0mg，133μmol)溶解于二氯甲烷(13.3mL)、三氟乙酸(6.64mL)，在室温下搅拌30分钟。反应结束后，通过减压浓缩去除二氯甲烷和三氟乙酸，得到了上述化合物(123)(71.8mg，定量)。
MS(ESI)m/z：518.40[M+H]+
(11-4-3)芘(124)的合成
[化学式111]
将芘(14)(16.0mg，14.0μmol)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(690μL)之后进行冰冷，加入N，N-二异丙基乙胺(9.3μL，55.0μmol)、1H-苯并三唑-1-基氧基三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐(11mg，21.0μmol)。然后加入PEG6(11.0mg、21.0μmol)，返回室温并搅拌2.5小时。反应结束后，通过反相制备色谱法进行纯化。回收包含产物的馏分，减压浓缩去除乙腈之后，进行冷冻干燥，由此得到了芘(124)(11.2mg，6.73μmol)。
MS(ESI)m/z：1664.80[M+H]+
(11-4-4)接头-有效载荷模拟物(120)的合成
[化学式112]
向芘(124)(5.0mg，3.0μmol)中加入乙腈(200μL)，在冰冷下加入85％磷酸溶液(60.0μL，880μmol)，在室温下搅拌25小时。反应结束后，通过反相制备色谱法进行纯化。回收包含产物的馏分，减压浓缩去除乙腈之后，进行冷冻干燥，由此得到了接头-有效载荷模拟物(120)(2.4mg，1.5μmol)。
MS(ESI)m/z：1552.65[M+H]+
实施例12：ADC模拟物的合成
(12-1)ADC模拟物的合成
在以下的实施例中，以与实施例2同样的方法进行了ADC模拟物的调制。
由(11-1)的接头-有效载荷模拟物(56)和含硫醇的抗体合成了下述结构的ADC模拟物22。进行ESI-TOFMS分析，反应产物为在引入了2个接头-有效载荷模拟物(56)的150322处确认到峰。
[化学式113]
同样地，由(11-2)的接头-有效载荷模拟物(66)和含硫醇的抗体合成了下述结构的ADC模拟物24。进行ESI-TOFMS分析，反应产物为在引入了2个接头-有效载荷模拟物(66)的151125处确认到峰。
[化学式114]
同样地，由(11-4)的接头-有效载荷模拟物(120)和含硫醇的抗体合成了下述结构的ADC模拟物33。进行ESI-TOFMS分析，反应产物为在引入了2个接头-有效载荷模拟物(120)的151279处确认到峰。
[化学式115]
(12-2)ADC模拟物的DAR解析
依据已有报道(WO2019/240287A1)进行实施例12-1中合成的ADC模拟物的ESI-TOFMS分析，确认到DAR为2。
[表9]
表9.ADC模拟物的DAR
接头-有效载荷模拟物 实施例/比较例 DAR
ADC模拟物22 接头-有效载荷模拟物(56) 实施例11-1 2
ADC模拟物24 接头-有效载荷模拟物(66) 实施例11-2 2
ADC模拟物33 接头-有效载荷模拟物(120) 实施例11-4 2
ADC模拟物5 接头-有效载荷模拟物(26) 比较例1 2
实施例13：基于疏水性柱色谱法(HIC-HPLC)来评价ADC和ADC模拟物的疏水度
依据已有报道(Anal.Chem.，2019，91，20，12724-12732)进行了HIC-HPLC分析。采用下述的条件进行测定。可根据HIC色谱图中的ADC的保留时间来评价ADC的疏水度。
测定系统：Chromaster(注册商标)(日立公司制造)
柱：Tosoh Bioscience公司制造Tosoh Biobuthyl NPR 2.5μm 4.6×35mm柱
梯度：洗脱液A/B的线性梯度
流速：0.8mL/分钟
洗脱液A：1.1M(NH4)2SO4，25mM Na2HPO4/NaH2PO4(pH6.0)
洗脱液B：25mM Na2HPO4/NaH2PO4(pH6.0、添加25v/v％异丙醇)
检测器：UV(280nm)
[表10]
表10.采用HIC-HPLC来评价ADC和ADC模拟物的疏水度
其结果，确认了实施例11-1、11-2、11-4中合成的ADC模拟物具有保留时间快的倾向，可知亲水度高。因此，认为实施例11-1、11-2、11-4中合成的ADC模拟物的血浆清除率慢，在体内停留的时间长，所以确认为优选的ADC。
实施例14：基于尺寸排阻色谱法(SEC-HPLC)来评价ADC和ADC模拟物的凝集率
依据已有报道(ChemistrySelect，2020，5，8435-8439)进行了SEC-HPLC分析。采用下述的条件进行测定。
测定系统：1260 HPLC system(Agilent公司制造)
柱：Agilent公司制造AdvanceBio SEC2.7μm，4.6mm×150mm
流速：0.25mL/分钟
洗脱液：100mM磷酸二氢钠/磷酸氢钠，250mM氯化钠的水溶液(pH6.8)，10％v/v异丙醇
检测器：UV(280nm)
[表11]
表11.采用SEC-HPLC来评价ADC和ADC模拟物的凝集率
实施例15：使用酶组织蛋白酶B来评价ADC模拟物
如下所述，通过解析从ADC模拟物脱落的荧光分子的量来评价各种ADC模拟物的基于组织蛋白酶B的切割能力。
(15-1)组织蛋白酶B切割性試験
以与实施例5同样的方法进行了试验。
(15-2)采用HPLC分析对脱落的荧光分子的量进行解析
以与实施例5同样的方法进行了分析、解析。
[表12]
表12.ADC模拟物的组织蛋白酶B切割能力的评价
如表12中所示，可知合成的ADC模拟物具有充分的组织蛋白酶B切割。
实施例16：使用小鼠血浆来评价ADC模拟物
(16-1)ADC模拟物的血浆中稳定性试验
以与实施例6同样的方法进行了试验。
(16-2)采用HPLC分析对脱落的荧光分子的量进行解析
以与实施例6同样的方法进行了分析、解析。
[表13]
表13.使用ADC模拟物的血浆中稳定性试验结果
其结果，相对于比较例1中合成的ADC模拟物，实施例12-4中合成的ADC模拟物显示出2倍以上的稳定性，实施例12-1、12-2中合成的ADC模拟物显示出10倍以上的稳定性。
实施例17：接头-有效载荷的合成
实施例(7-3-5)中合成的接头-有效载荷(42)的NMR光谱数据如下。
1H NMR(300MHz；DMSO-d6)δ12.06(brs，2H)，10.05-10.07(m，1H)，8.47-8.28(m，1H)，8.29-8.19(m，1H)，8.13-8.04(m，3H)，7.91-7.56(m，5H)，7.39-7.17(m，7H)，6.99(s，2H)，5.99(s，1H)，5.86-5.67(m，1H)，5.43-5.35(m，3H)，4.77-4.16(m，6H)，4.00-3.98(m，2H)，3.80-3.76(m，1H)，3.52-3.18(m，12H)，3.01-2.73(m，9H)，2.26-2.14(m，6H)，2.12-2.09(m，2H)，1.97-1.90(m，2H)，1.84(s，6H)，1.76-1.69(m，5H)，1.43-1.35(m，10H)，1.23-1.14(m，3H)，1.01-0.96(m，7H)，0.83-0.68(m，24H).
实施例18：ADC的合成
(18-1)接头中间体的合成
(18-1-1)接头中间体(115)的合成
[化学式116]
将5-叠氮戊酸(800mg，5.59mmol)溶解于THF(14mL)，加入氯甲酸异丁酯(808μL，6.15mmol)、N-甲基吗啉(873μL，8.39mmol)，在0℃下搅拌30分之后，加入溶解于1M NaOH水溶液(4mL)的肼水合物(1.36g，6.71mmol)，在室温下搅拌3小时。减压下浓缩之后，加入1MNaOH水溶液，将体系内的pH调节至pH10，用乙酸乙酯洗涤后，向水层中加入1M HCl水溶液，将体系内的pH调节至3.0，加入乙酸乙酯进行洗涤，向所得的乙酸乙酯溶液中加入硫酸钠。通过过滤去除硫酸钠，减压下浓缩，通过柱色谱法(二氯甲烷∶甲醇＝10∶1)进行纯化。回收包含产物的馏分，减压浓缩，由此得到了接头中间体(115)。
1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ6.29(d，J＝7.7Hz，1H)，4.56(td，J＝8.0，4.9Hz，1H)，3.32(t，J＝6.6Hz，2H)，2.53-2.38(m，3H)，2.36-2.16(m，3H)，2.12(s，2H)，1.96(dq，J＝14.7，7.6Hz，1H)，1.84-1.59(m，4H)，1.50(s，9H).
MS(ESI)m/z：329[M+H]+
(18-1-2)接头中间体(117)的合成
[化学式117]
将接头中间体(116)(2.41g，5.59mmol)溶解于二氯甲烷(28mL)，加入苯硫酚(627μL，6.15mmol)、苯并三唑-1-基氧基(3.49g，6.71mmol)、DIPEA(1.42mL，8.39mmol)，在室温下搅拌2小时。之后，减压下浓缩，通过柱色谱法(己烷∶乙酸乙酯＝4∶1)进行纯化。回收包含产物的馏分，减压下浓缩，由此得到了接头中间体(117)(2.20g，5.23mmol)。
1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ7.43(s，5H)，6.10(d，J＝7.8Hz，1H)，4.55(td，J＝7.7，4.9Hz，1H)，3.31(t，J＝6.7Hz，2H)，2.87-2.63(m，2H)，2.28(dd，J＝8.7，5.9Hz，2H)，2.16-1.98(m，1H)，1.83-1.58(m，4H)，1.50(s，9H)，1.37-1.22(m，2H)，0.91(t，J＝6.7Hz，1H).
MS(ESI)m/z：421[M+H]+
(18-1-3)接头中间体(118)的合成
[化学式118]
将接头中间体(117)(2.20g，5.23mmol)溶解于二氯甲烷(10mL)，加入三氟乙酸(10mL)，在室温下搅拌1小时之后，减压下浓缩，去除二氯甲烷，加入水，进行冷冻干燥，由此得到了接头中间体(118)(1.98g，5.43mmol)。
1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ7.44(s，J＝6.3，4.6，2.4Hz，5H)，6.76(s，1H)，4.62(td，J＝7.5，4.9Hz，1H)，3.31(t，J＝6.6Hz，2H)，2.88(qt，J＝16.8，6.8Hz，2H)，2.33(dt，J＝12.4，6.8Hz，3H)，2.18(dq，J＝14.4，7.4Hz，1H)，1.74(dq，J＝11.8，7.5，6.9Hz，2H)，1.63(ddd，J＝17.7，10.5，4.8Hz，2H).
MS(ESI)m/z：365[M+H]+
(18-1-4)接头中间体(119)的合成
[化学式119]
将接头中间体(118)(100mg，0.274mmol)溶解于二氯甲烷(3mL)，加入(40.6μL，0.280mmol)、苯并三唑-1-基氧基(150mg，0.288mmol)、DIPEA(70.1μL，0.412mmol)，在室温下搅拌2小时。加入1M HCl水溶液，将体系内调节至pH3，加入二氯甲烷进行稀释，用水、食盐水洗涤后，加入硫酸钠。通过过滤去除硫酸钠之后，减压下浓缩，通过柱色谱法(己烷∶乙酸乙酯＝4∶1)进行纯化。回收包含产物的馏分，减压下浓缩，由此得到了接头中间体(119)(84.7mg，0.171mmol)。
1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ7.50-7.38(m，5H)，6.33(d，J＝8.4Hz，1H)，4.78(tdd，J＝7.8，4.6，3.0Hz，1H)，3.70-3.54(m，2H)，3.32(dt，J＝9.1，6.7Hz，2H)，2.96-2.67(m，2H)，2.30(pd，J＝7.1，4.5Hz，2H)，1.85-1.60(m，6H)，1.49(d，J＝2.8Hz，9H).
MS(ESI)m/z：495[M+H]+
(18-1-5)接头中间体(120)的合成
[化学式120]
将接头中间体(119)(84.7mg，0.171mmol)溶解于二氯甲烷(5mL)，加入三氟乙酸(5mL)，在室温下搅拌1小时之后，减压下浓缩，去除二氯甲烷，加入水，进行冷冻干燥之后，通过柱色谱法(二氯甲烷∶甲醇＝10∶1)进行纯化。回收包含产物的馏分，减压下浓缩，由此得到了接头中间体(120)(46.8mg，0.107mmol)。
1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δ7.44(dq，J＝2.3，1.5Hz，5H)，4.69-4.57(m，1H)，3.79-3.67(m，2H)，3.40-3.30(m，2H)，2.89-2.71(m，2H)，2.44-2.23(m，4H)，2.08-1.95(m，1H)，1.82-1.61(m，4H).
MS(ESI)m/z：439[M+H]+
(18-2)具有叠氮基的亲和性试剂(18)的调制
[化学式121]
上述氨基酸序列为SEQ ID NO：1的氨基酸序列。
将已有报道(WO2019/240287A1)记载的Ac-RGNCAYHKGQIIWCTYH-NH2(SEQ ID NO：1、30.9mg，14.9μmol、其中第4位和第14位的2个半胱氨酸分别在分子内形成二硫键)溶解于二甲基甲酰胺(468μL)，加入实施例18-1-5中合成的接头中间体(120)(46.8mg，0.107mmol)、WSC-HCl(29.7mg，0.155mmol)，在室温下搅拌5小时之后，通过反相制备色谱法进行洗脱。回收包含产物的馏分，通过减压下浓缩去除乙腈之后，进行冷冻干燥，得到了上述修饰试剂(121)(15.1mg，6.02μmol)。
(18-3)向曲妥珠单抗中引入2分子的肽试剂
[化学式122]
上述氨基酸序列为SEQ ID NO：1的氨基酸序列。
接着，使用实施例18-2中调制的肽试剂(121)，依据已有报道(WO2019/240287A1)的方法，对曲妥珠单抗实施了缀合。结果，得到了引入了修饰试剂(121)的抗体。引入了肽试剂(121)的抗体的DAR分析是依据已有报道(Anal.Chem.，2019，91，20，12724-12732)进行HIC-HPLC分析，确认到引入了2个肽试剂。
(18-4)引入了叠氮基的曲妥珠单抗(T-1)的合成
[化学式123]
上述氨基酸序列为SEQ ID NO：1的氨基酸序列。
参照已有报道(WO2019/240287A1)的方法，向实施例18-3中得到的引入了修饰试剂(121)的抗体中加入甲氧基胺溶液，在室温下振荡3小时，由此实施了切割反应。结果，得到了引入了叠氮基的抗体。分析是依据已有报道(Anal.Chem.，2019，91，20，12724-12732)进行HIC-HPLC分析，确认到引入了叠氮基。
(18-5)ADC 7的合成
向上述引入叠氮的抗体中加入接头-有效载荷(40)，得到了ADC(7)。进行ESI-TOFMS分析，反应产物为在引入了2个接头-有效载荷(40)的151276处确认到峰。另外，依据已有报道(WO2019/240287A1)进行ESI-TOFMS分析，确认到DAR为2。
[化学式124]
实施例19：使用小鼠血浆来评价ADC
(19-1)ADC的血浆中稳定性试验
向500μL小鼠血浆(Charles River公司制造)中加入ADC模拟物使浓度为0.1mg/mL，之后进行灭菌过滤。向6支微型离心管中分别注入50μL的该溶液。6支样本中的3支在设定为37℃的恒温箱中保管4天。剩下的3支在-80℃的冷库中同样地保管4天。向各样本中分别加入100μL乙腈，经涡旋搅拌后进行离心，由此得到了沉淀物。回收所产生的上清液，进行了HPLC分析。
(19-2)采用HPLC分析对脱落的有效载荷的量进行解析
测定是采用液体色谱法质谱分析法(包括串联质谱分析法)，测定了从ADC脱落的有效载荷量。以实施例19-1中在-80℃的冷库中同样地保管4天的样本作为第0天的样本，以实施例19-1中在37℃下孵育4天的3支样本作为第4天的样本，通过提取离子色谱图分别算出从第4天样本和第0天样本检测到的有效载荷的MS强度，并解析了它们的差值。
另外，使用MMAE，算出了基于HPLC的TIC的区域面积与浓度的相关性。利用该计算式将上述各ADC的荧光强度的TIC转换为浓度。将第0天的浓度设为100％时的上述离子色谱图的差值的比例作为脱落率算出。
[表14]
表14.使用ADC的血浆中稳定性试验结果
其结果，可知实施例7-1、7-2、7-3中合成的ADC具有高稳定性。

Claims (26)

1.抗体和功能性物质的位点选择性的缀合物或其盐，其包含下述式(I)所表示的结构单元：
式(I)中，
Ig表示包含2个重链和2个轻链的免疫球蛋白单元，且经由2个重链中的赖氨酸残基的侧链中的氨基与邻近Ig的L1位点选择性地键合，
HG表示亲水性基团或包含亲水性基团的1价基团，
RA表示缬氨酸残基的侧链，
RB表示瓜氨酸残基或丙氨酸残基的侧链，
环A表示可具有取代基的2价芳族环基，
R1和R2分别独立地表示氢原子或1价基团，
L1和L2分别独立地表示2价基团，
D表示功能性物质，
每2个重链的所述键合的平均比率r为1.5～2.5。
2.权利要求1所述的位点选择性的缀合物或其盐，其中，免疫球蛋白单元为人免疫球蛋白单元。
3.权利要求2所述的位点选择性的缀合物或其盐，其中，人免疫球蛋白单元为人IgG抗体。
4.权利要求1所述的位点选择性的缀合物或其盐，其中，赖氨酸残基存在于依据EU编号的246/248位、288/290位或317位。
5.权利要求1所述的位点选择性的缀合物或其盐，其中，
L1具有羰基，
位点选择性的键合通过赖氨酸残基的侧链中的氨基和L1中的羰基的键合形成的酰胺键达成。
6.权利要求1所述的位点选择性的缀合物或其盐，其中，r为1.9～2.1。
7.权利要求1所述的位点选择性的缀合物或其盐，其中，亲水性基团为选自羧酸基、磺酸基、羟基、聚乙二醇基、聚肌氨酸基和糖部分的1个以上的基团。
8.权利要求1所述的位点选择性的缀合物或其盐，其中，环A为可具有取代基的亚苯基。
9.权利要求1所述的位点选择性的缀合物或其盐，其中，功能性物质为药物、标记物质或稳定剂。
10.权利要求1所述的位点选择性的缀合物或其盐，其中，在通过尺寸排阻色谱法分析时，所述位点选择性的缀合物显示2.6％以下的凝集率。
11.权利要求1所述的位点选择性的缀合物或其盐，其中，式(I)所表示的结构单元包含下述式(I’)所表示的结构单元：
式(I’)中，
Ig、RA、RB、环A、R1、R2、L1、L2、D和r分别与式(I)中所示的相同，
LHG表示键或可包含亲水性基团的2价基团，
RHG1和RHG2分别独立地表示氢原子、亲水性基团或可包含亲水性基团的1价基团，
至少1个亲水性基团被包含在选自LHG、RHG1和RHG2的1个以上的部位。
12.权利要求11所述的位点选择性的缀合物或其盐，其中，可包含亲水性基团的2价基团(-LHG-)为下述式(a)所表示的2价基团：
-(C(RHG)2)n1-(C＝O)n2-(NHG)n3-(C(RHG)2)n4- (a)
式(a)中，
多个RHG分别独立地表示氢原子、亲水性基团或可包含亲水性基团的1价基团，
n1为0～3的整数，
n2为0或1的整数，
n3为0或1的整数，
n4为0～3的整数。
13.权利要求12所述的位点选择性的缀合物或其盐，其中，式(a)所表示的2价基团为下述式(a1)、(a2)或(a3)所表示的2价基团：
(a1)-(C(RHG)2)-；
(a2)-(C(RHG)2)-(C＝O)-(NRHG)-(C(RHG)2)-；或
(a3)-(C＝O)-(C(RHG)2)2-，
式中，多个RHG分别独立地表示氢原子、亲水性基团或包含亲水性基团的碳原子数为1～6的烷基。
14.权利要求1～13中任一项所述的位点选择性的缀合物或其盐，其中，亲水性基团分别独立地为羧酸基、磺酸基或羟基。
15.权利要求14所述的位点选择性的缀合物或其盐，其中，亲水性基团为羧酸基。
16.位点选择性地具有生物正交性官能团的抗体衍生物或其盐，其包含下述式(II)所表示的结构单元：
式(II)中，
Ig表示包含2个重链和2个轻链的免疫球蛋白单元，且经由2个重链中的赖氨酸残基的侧链中的氨基与邻近Ig的L1位点选择性地键合，
HG表示亲水性基团或包含亲水性基团的1价基团，
RA表示缬氨酸残基的侧链，
RB表示瓜氨酸残基或丙氨酸残基的侧链，
环A表示可具有取代基的2价芳族环基，
R1和R2分别独立地表示氢原子或1价基团，
L1和L2分别独立地表示2价基团，
B2表示生物正交性官能团，
每2个重链的所述键合的平均比率r为1.5～2.5。
17.权利要求16所述的抗体衍生物或其盐，其中，生物正交性官能团为马来酰亚胺残基、硫醇残基、呋喃残基、卤代羰基残基、烯烃残基、炔烃残基、叠氮残基或四嗪残基。
18.权利要求16所述的抗体衍生物或其盐，其中，式(II)所表示的结构单元包含下述式(II’)所表示的结构单元：
式(II’)中，
Ig、RA、RB、环A、R1、R2、L1、L2、B2和r分别与式(II)中所示的相同，
LHG表示键或可包含亲水性基团的2价基团，
RHG1和RHG2分别独立地表示氢原子、亲水性基团或可包含亲水性基团的1价基团，
至少1个亲水性基团被包含在选自LHG、RHG1和RHG2的1个以上的部位。
19.具有生物正交性官能团和功能性物质的化合物或其盐，其由下述式(III)表示：
式(III)中，
HG表示亲水性基团或包含亲水性基团的1价基团，
RA表示缬氨酸残基的侧链，
RB表示瓜氨酸残基或丙氨酸残基的侧链，
环A表示可具有取代基的2价芳族环基，
R1和R2分别独立地表示氢原子或1价基团，
L1和L2分别独立地表示2价基团，
B1表示生物正交性官能团，
D表示功能性物质。
20.权利要求19所述的化合物或其盐，其中，式(III)所表示的化合物由下述式(III’)表示：
式(III’)中，
RA、RB、环A、R1、R2、L1、L2、B1和D分别与式(III)中所示的相同，
LHG表示键或可包含亲水性基团的2价基团，
RHG1和RHG2分别独立地表示氢原子、亲水性基团或可包含亲水性基团的1价基团，
至少1个亲水性基团被包含在选自LHG、RHG1和RHG2的1个以上的部位。
21.抗体的衍生试剂，其包含权利要求19所述的化合物或其盐。
22.具有第1生物正交性官能团和第2生物正交性官能团的化合物或其盐，其由下述式(IV)表示：
式(IV)中，
HG表示亲水性基团或包含亲水性基团的1价基团，
RA表示缬氨酸残基的侧链，
RB表示瓜氨酸残基或丙氨酸残基的侧链，
环A表示可具有取代基的2价芳族环基，
R1和R2分别独立地表示氢原子或1价基团，
L1和L2分别独立地表示2价基团，
B1表示第1生物正交性官能团，
B2表示第2生物正交性官能团。
23.权利要求22所述的化合物或其盐，其中，式(IV)所表示的结构单元由下述式(IV’)表示：
式(IV’)中，
RA、RB、环A、R1、R2、L1、L2、B1和B2分别与式(IV)中所示的相同，
LHG表示键或可包含亲水性基团的2价基团，
RHG1和RHG2分别独立地表示氢原子、亲水性基团或可包含亲水性基团的1价基团，
至少1个亲水性基团被包含在选自LHG、RHG1和RHG2的1个以上的部位。
24.抗体或功能性物质的衍生试剂，其包含权利要求22所述的化合物或其盐。
25.下述(1)、(2)或(3)的化合物或其盐：
(1)下述式(V)所表示的化合物或其盐：
式(V)中，
HG表示亲水性基团或包含亲水性基团的1价基团，
RA表示缬氨酸残基的侧链，
RB表示瓜氨酸残基或丙氨酸残基的侧链，
环A表示可具有取代基的2价芳族环基，
X和Y分别独立地表示1价基团；
(2)下述式(VI)所表示的具有生物正交性官能团的化合物或其盐：
式(VI)中，
HG、RA、RB、环A和X分别与式(V)中所示的相同，
R2表示氢原子或1价基团，
L2表示2价基团，
B2表示生物正交性官能团；或者
(3)下述式(VII)所表示的具有生物正交性官能团的化合物或其盐：
式(VII)中，
HG、RA、RB、环A和Y分别与式(V)中所示的相同，
R1表示氢原子或1价基团，
L1表示2价基团，
B1表示生物正交性官能团。
26.权利要求25所述的化合物或其盐，其中，所述(1)、(2)或(3)的化合物分别为下述(1’)、(2’)或(3’)的化合物：
(1')下述式(V’)所表示的化合物或其盐：
式(V’)中，
RA、RB、环A、X和Y分别与式(V)中所示的相同，
LHG表示键或可包含亲水性基团的2价基团，
RHG1和RHG2分别独立地表示氢原子、亲水性基团或可包含亲水性基团的1价基团，
至少1个亲水性基团被包含在选自LHG、RHG1和RHG2的1个以上的部位；
(2’)下述式(VI’)所表示的化合物或其盐：
式(VI’)中，
RA、RB、环A和X分别与式(V)中所示的相同，
LHG、RHG1和RHG2分别与式(V’)中所示的相同，R2、L2和B2分别与式(VI)中所示的相同；或者
(3’)由下述式(VII’)表示的权利要求25所述的化合物或其盐：
式(VII’)中，
RA、RB、环A和Y分别与式(V)中所示的相同，
LHG、RHG1和RHG2分别与式(V’)中所示的相同，
R1、L1和B1分别与式(VII)中所示的相同。
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