CN112262152A - 具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物或其盐 - Google Patents

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Abstract

本发明提供抗体的修饰、特别是可实现抗体的区域选择性修饰的技术。更具体来说，本发明提供一种具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物或其盐，其中，所述化合物以下述式(I)：A‑L‑B‑R (I)表示，式中，A为针对抗体的亲和性物质，L为切割性连接体，该切割性连接体为包含切割性部分的二价基团，B为(a)包含生物正交性官能团的二价基团、或者(b)不含生物正交性官能团的二价基团，R为针对所述抗体的反应性基团；并且，针对抗体的亲和性物质为规定的肽。

Description

具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化 合物或其盐
技术领域
本发明涉及具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物或其盐等。
背景技术
近年来，进行了大量抗体药物偶联物(Antibody Drug Conjugate:ADC)的研究开发。如其名称所示，ADC是在抗体上偶联药物(例如抗癌剂)而得的药剂，对于癌细胞等具有直接的细胞杀伤活性。作为代表性的ADC，有T-DM1(商品名:Kadcyla(注册商标))(非专利文献1～3)。
以T-DM1为代表的ADC从开发初期就存在其不均一性的问题。即，由于使低分子药物随机与抗体中存在70～80个左右的Lys残基反应，因此药物抗体比(Drug/AntibodyRatio:DAR)和偶联位置不确定。已知通常如果是这样的随机偶联法，则DAR在0～8的范围内，产生药物的结合数不同的多种药剂。近年来，有报道称，如果改变ADC的药物的结合数和结合位置，则体内动力学和药物的释放速度、效果会发生变化。基于这些情况，对于下一代的ADC，要求控制偶联药物的个数和位置。一般认为如果个数和位置确定，则符合期待的功效、偶联药剂的多样性、批次差异即所谓标准化(regulation)的问题得到解决(非专利文献4)。
全球都在研究抗体的区域选择性(位置选择性，regioselectively)修饰方法，但几乎全都是使用基因工程手段或酶的修饰方法。关于基因工程修饰方法，虽然可以控制区域选择性、个数选择性，但被指出存在抗体本身的表达效率下降(制备ADC时的总收率下降)等问题。此外，抗体表达体系的构建等需要较长的时间也成为问题(非专利文献5～7)。
此外，近年来报道有利用小分子探针在细胞内这样混杂的环境下对蛋白质进行化学修饰的方法。本方法在进行成像或低分子药物的重新定位方面被用于受体的鉴定等。此外，生化领域中，使用合成小分子探针的有机化学蛋白质修饰方法受到关注(非专利文献8～10)。
最近，开发出了CCAP(亲和肽化学偶联，Chemical Conjugation by AffinityPeptide)法。本方法通过使在亲和肽(Affinity Peptide)上连接了NHS活性酯和药物的肽试剂与抗体反应的方法(即，介以含肽部分的连接体(linker)的ADC的制作方法)，成功地实现了抗体的区域选择性修饰。本方法是世界上首次通过化学合成手段用药物成功地对抗体Fc区域进行区域选择性修饰的方法，而且实际使用中也确认了良好的结果[反应时间30分钟，收率70％(DAR1的情况)，区域选择性100％]。证实了可通过加入5当量(等量，equivalents)左右的肽试剂而将DAR控制为2，还可控制修饰位置，在这方面是划时代的(专利文献1)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2016/186206号
非专利文献
非专利文献1：Reichert JM等,Nat Biotechnol 2005；23:1073-8
非专利文献2：Kubota T等,Cancer Sci 2009；100:1566-72
非专利文献3：Wu AM等,Nat Biotechnol 2005；23:1137-46
非专利文献4：Junutula JR等,Nat Biotechnol 2008；26:925-32
非专利文献5：Shen BQ等,Nat Biotechnol 2012；30:184-9
非专利文献6：Hofer T等,Biochemistry 2009；48:12047-57
非专利文献7：Liu W等,Nat Methods 2007；4:239-44
非专利文献8：S.T.Laughlin等,Science 2008；320,664
非专利文献9：A.E.Speers等,ChemBioChem 2004；5,41
非专利文献10：Y.Takaoka等,Angew.Chem.Int.Ed.2013；52,4088
发明内容
发明所要解决的技术问题
本发明的目的在于开发可实现抗体的修饰、特别是抗体的区域选择性修饰(位置選択的な修飾)的技术。
解决技术问题所采用的技术方案
本发明人等进行了认真研究，结果发现，具有(1)针对抗体的亲和性物质(与抗体具有亲和性的物质)、及(2)针对构成该抗体的氨基酸残基的反应性基团、以及(3)在该亲和性物质与该反应性基团之间包含切割性部分、(4)可通过在切割性部分的切割而生成在反应性基团侧具有生物正交性官能团的结构单元(即，包含生物正交性官能团及反应性基团的结构单元)这样的结构特征的基于独创性的新的设计思想开发的化合物，可用于抗体的区域特异性修饰(例如图1-1、图1-2、图1-3、图2)。本发明人等还发现通过使用这样的化合物，可制备不含肽部分作为连接体(linker)且区域选择性地具有功能性物质(例如药物)的抗体(例如抗体药物偶联物(ADC))等。避免使用具有潜在的免疫原性且包含血中易水解的肽部分的连接体，在ADC的临床应用上理想的。即，本发明人等开发的方法，在全球首次能够成功地通过化学合成手段，且不使用含肽部分的连接体，用药物对抗体Fc区域进行区域选择性修饰。本发明人等还成功地开发了具备如上述(1)～(4)的结构特征的各种化合物等(例如图1-1、图1-2、图1-3、图2)，从而完成了本发明。
即，本发明如下。
第一实施方式中，本发明提供一种具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物或其盐，以及包含该化合物或其盐的抗体的区域选择性修饰试剂。
[1]一种具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物或其盐，其中，
所述化合物以下述式(I)表示，
A-L-B-R (I)
式中，
A为针对抗体的亲和性物质，
L为切割性连接体，该切割性连接体为包含切割性部分的二价基团，
B为(a)包含生物正交性官能团的二价基团、或者(b)不含生物正交性官能团的二价基团，
R为针对所述抗体的反应性基团(对所述抗体具有反应性的基团)；
并且，针对抗体的亲和性物质为包含以下的任一氨基酸序列的肽：
式1-1：(X0-3)a-C-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-I-I-W-C-(X0-3)b(SEQ ID NO:58)
式1-2：(X0-3)a-C-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-I-V-W-C-(X0-3)b(SEQ ID NO:59)
式1-3：(X0-3)a-C-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-V-V-W-C-(X0-3)b(SEQ ID NO:60)
式1-4：(X0-3)a-C-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-A-V-W-C-(X0-3)b(SEQ ID NO:61)
式1-5：(X0-3)a-C-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-L-L-W-C-(X0-3)b(SEQ ID NO:62)
式1-6：(X0-3)a-C-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-L-I-W-C-(X0-3)b(SEQ ID NO:63)
式1-7：(X0-3)a-C-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-L-V-F-C-(X0-3)b(SEQ ID NO:64)
式1-8：(X0-3)a-C-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Q-V-W-C-(X0-3)b(SEQ ID NO:65)
式1-9：(X0-3)a-C-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-E-V-W-C-(X0-3)b(SEQ ID NO:66)，
式中，
(X0-3)a不存在、或者为1～3个连续的相同或不同的任意的氨基酸残基(除赖氨酸残基和半胱氨酸残基以外)，
(X0-3)b不存在、或者为1～3个连续的相同或不同的任意的氨基酸残基(除赖氨酸残基和半胱氨酸残基以外)，
Xaa1为丙氨酸残基、甘氨酸残基、亮氨酸残基、脯氨酸残基、精氨酸残基、缬氨酸残基、天冬酰胺残基、谷氨酸残基、或苯丙氨酸残基，
Xaa2为酪氨酸残基、色氨酸残基、组氨酸残基、或苯丙氨酸残基，
Xaa3为组氨酸残基、苯丙氨酸残基、酪氨酸残基、色氨酸残基、精氨酸残基、或甘氨酸残基，
Xaa4为赖氨酸残基，
Xaa5为甘氨酸残基、丝氨酸残基、天冬酰胺残基、谷氨酰胺残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、苯丙氨酸残基、酪氨酸残基、色氨酸残基、组氨酸残基、苏氨酸残基、亮氨酸残基、丙氨酸残基、缬氨酸残基、异亮氨酸残基、或精氨酸残基，
Xaa6为谷氨酰胺残基、谷氨酸残基、天冬酰胺残基、天冬氨酸残基、脯氨酸残基、甘氨酸残基、精氨酸残基、苯丙氨酸残基、或组氨酸残基；或者
式2-1：(X0-3')a-C-Xaa1'-Xaa2'-Xaa3'-Xaa4'-Xaa5'-Xaa6'-L-V-W-C-(X0-3')b(SEQID NO:67)，
式中，
(X0-3')a和(X0-3')b分别与所述(X0-3)a和(X0-3)b含义相同，
Xaa1'、Xaa2'、Xaa3'、Xaa4'、Xaa5'、Xaa6'分别与所述Xaa1、Xaa2、Xaa3、Xaa4、Xaa5、Xaa6含义相同，
但是，不包括(X0-3')a为1～3个连续的相同或不同的任意氨基酸残基、(X0-3')b为1～3个连续的相同或不同的任意氨基酸残基、Xaa3'为组氨酸残基、且Xaa5'为甘氨酸残基的情况。
[2]根据[1]的化合物或其盐，其中，(X0-3)a不存在、或者为精氨酸残基-甘氨酸残基-天冬酰胺残基、天冬氨酸残基、或天冬酰胺残基，
(X0-3)b不存在、或者为苏氨酸残基-酪氨酸残基-组氨酸残基、或苏氨酸残基，
Xaa1为丙氨酸残基，
Xaa2为酪氨酸残基、色氨酸残基、或组氨酸残基，
Xaa6为谷氨酰胺残基、谷氨酸残基、天冬酰胺残基、或天冬氨酸残基。
[3]根据[1]的化合物或其盐，其中，(X0-3)a为甘氨酸残基-天冬酰胺残基、甘氨酸残基、甘氨酸残基-甘氨酸残基、或甘氨酸残基-甘氨酸残基-甘氨酸残基，
(X0-3)b为苏氨酸残基-酪氨酸残基、甘氨酸残基、甘氨酸残基-甘氨酸残基、或甘氨酸残基-甘氨酸残基-甘氨酸残基，
Xaa1为甘氨酸残基、亮氨酸残基、脯氨酸残基、精氨酸残基、缬氨酸残基、天冬酰胺残基、谷氨酸残基、或苯丙氨酸残基，
Xaa2为苯丙氨酸残基，
Xaa6为脯氨酸残基、甘氨酸残基、精氨酸残基、苯丙氨酸残基、或组氨酸残基。
[4]根据[1]～[3]中任一项的化合物或其盐，其中，针对抗体的亲和性物质为包含选自下述组中的氨基酸序列的肽：
(1)RGNCAYHKGQIIWCTYH(SEQ ID NO:5)；
(2)RGNCAYHKGQIVWCTYH(SEQ ID NO:8)；
(3)RGNCAYHKGQVVWCTYH(SEQ ID NO:9)；
(4)RGNCAYHKGQAVWCTYH(SEQ ID NO:10)；
(5)RGNCAYHKGQLLWCTYH(SEQ ID NO:11)；
(6)RGNCAYHKGQLIWCTYH(SEQ ID NO:12)；
(7)DCAYHKGQIVWCT(SEQ ID NO:13)；
(8)DCAYHKGQVVWCT(SEQ ID NO:14)；
(9)DCAYHKGQAVWCT(SEQ ID NO:15)；
(10)RGNCAYHKSQIIWCTYH(SEQ ID NO:16)；
(11)RGNCAYHKNQIIWCTYH(SEQ ID NO:17)；
(12)RGNCAYHKDQIIWCTYH(SEQ ID NO:18)；
(13)RGNCAYHKQQIIWCTYH(SEQ ID NO:19)；
(14)RGNCAYHKEQIIWCTYH(SEQ ID NO:20)；
(15)RGNCAYHKFQIIWCTYH(SEQ ID NO:21)；
(16)RGNCAYHKYQIIWCTYH(SEQ ID NO:22)；
(17)RGNCAYHKWQIIWCTYH(SEQ ID NO:23)；
(18)RGNCAYHKHQIIWCTYH(SEQ ID NO:24)；
(19)RGNCAYHKTQIIWCTYH(SEQ ID NO:25)；
(20)RGNCAYHKLQIIWCTYH(SEQ ID NO:26)；
(21)CAYHKLQIVWC(SEQ ID NO:27)；
(22)CAYHKLQLIWC(SEQ ID NO:28)；
(23)CAYHKSQIVWC(SEQ ID NO:29)；
(24)RGNCAYHKGQLVFCTYH(SEQ ID NO:30)；
(25)RGNCAYHKGQQVWCTYH(SEQ ID NO:31)；
(26)RGNCAYHKGQEVWCTYH(SEQ ID NO:32)；
(27)CAYHKGQLVWC(SEQ ID NO:33)；
(28)RGNCAYHKAQLVWCTYH(SEQ ID NO:34)；
(29)RGNCAYHKVQLVWCTYH(SEQ ID NO:35)；
(30)RGNCAYHKLQLVWCTYH(SEQ ID NO:36)；
(31)RGNCAYHKIQLVWCTYH(SEQ ID NO:37)；
(32)RGNCAYHKSQLVWCTYH(SEQ ID NO:38)；
(33)RGNCAYHKTQLVWCTYH(SEQ ID NO:39)；
(34)RGNCAYHKNQLVWCTYH(SEQ ID NO:40)；
(35)RGNCAYHKDQLVWCTYH(SEQ ID NO:41)；
(36)RGNCAYHKQQLVWCTYH(SEQ ID NO:42)；
(37)RGNCAYHKEQLVWCTYH(SEQ ID NO:43)；
(38)RGNCAYHKFQLVWCTYH(SEQ ID NO:44)；
(39)RGNCAYHKRQLVWCTYH(SEQ ID NO:45)；
(40)RGNCAYHKHQLVWCTYH(SEQ ID NO:46)；
(41)RGNCAYHKWQLVWCTYH(SEQ ID NO:47)；
(42)RGNCAYHKYQLVWCTYH(SEQ ID NO:48)；
(43)RGNCAYFKGQLVWCTYH(SEQ ID NO:49)；
(44)RGNCAYYKGQLVWCTYH(SEQ ID NO:50)；
(45)RGNCAYWKGQLVWCTYH(SEQ ID NO:51)；
(46)RGNCAYRKGQLVWCTYH(SEQ ID NO:52)；
(47)RGNCAYGKGQLVWCTYH(SEQ ID NO:53)；
(48)DCAYHKGQLVWC(SEQ ID NO:54)；
(49)NCAYHKGQLVWC(SEQ ID NO:55)；
(50)CAYHKGQLVWCT(SEQ ID NO:56)；
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(58)RGNCRYHKGQIIWCTYH(SEQ ID NO:74)；
(59)RGNCVYHKGQIIWCTYH(SEQ ID NO:75)；
(60)RGNCNYHKGQIIWCTYH(SEQ ID NO:76)；
(61)RGNCEYHKGQIIWCTYH(SEQ ID NO:77)；
(62)RGNCFYHKGQIIWCTYH(SEQ ID NO:78)；
(63)RGNCAYHKGEIIWCTYH(SEQ ID NO:79)；
(64)RGNCAYHKGNIIWCTYH(SEQ ID NO:80)；
(65)RGNCAYHKGPIIWCTYH(SEQ ID NO:81)；
(66)RGNCAYHKGGIIWCTYH(SEQ ID NO:82)；
(67)RGNCAYHKGDIIWCTYH(SEQ ID NO:83)；
(68)RGNCAYHKGRIIWCTYH(SEQ ID NO:84)；
(69)RGNCAYHKGFIIWCTYH(SEQ ID NO:85)；
(70)RGNCAYHKGHIIWCTYH(SEQ ID NO:86)；
(71)DCAYHKGQIIWCT(SEQ ID NO:87)；
(72)NCAYHKGQIIWCT(SEQ ID NO:88)；
(73)GNCAYHKGQIIWCTY(SEQ ID NO:89)；
(74)GCAYHKGQIIWCG(SEQ ID NO:90)；
(75)GGCAYHKGQIIWCGG(SEQ ID NO:91)；以及
(76)GGGCAYHKGQIIWCGGG(SEQ ID NO:92)。
[5]根据[1]～[4]中任一项的化合物或其盐，其中，L为：
(i)切割性连接体，该切割性连接体是包含切割性部分的二价基团，该切割性部分具有通过切割而在反应性基团侧生成生物正交性官能团的能力；或者
(ii)切割性连接体，该切割性连接体是包含切割性部分的二价基团，该切割性部分不具有通过切割而在反应性基团侧生成生物正交性官能团的能力。
[6]根据[5]的化合物或其盐，其中，L为所述(i)的切割性连接体。
[7]根据[5]或[6]的化合物或其盐，其中，L为所述(i)的切割性连接体，且B为所述(b)的二价基团。
[8]根据[5]的化合物或其盐，其中，L为所述(ii)的切割性连接体，且B为所述(a)的二价基团。
[9]根据[1]～[8]中任一项的化合物或其盐，其中，肽为针对单克隆抗体的Fc区域的结合性肽(结合肽)。
[10]根据[9]的化合物或其盐，其中，肽为针对IgG Fc区域的结合性肽。
[11]根据[1]～[10]中任一项的化合物或其盐，其中，所述亲和性物质包含选自下述(A)～(C)中的任一种Fc区域蛋白质，且为针对具有抗原结合能力的抗体的亲和性物质：
(A)包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的Fc区域蛋白质；
(B)包含在SEQ ID NO:1的氨基酸序列中插入、添加、缺失或取代1个或数个氨基酸残基而形成的氨基酸序列的Fc区域蛋白质；或者
(C)包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列显示90％以上的同一性的氨基酸序列的Fc区域蛋白质。
[12]根据[1]～[11]中任一项的化合物或其盐，其特征在于，肽可与人IgG结合。
[13]根据[1]～[12]中任一项的化合物或其盐，其中，切割性部分为可通过下述(a)～(c)中的任一种处理进行切割的部分，
(a)采用选自酸性物质、碱性物质、还原剂、氧化剂、酶中的1种以上的物质进行的处理；
(b)采用选自光的物理化学刺激进行的处理；或者
(c)在使用包含可自体分解的切割性部分的切割性连接体的情况下进行的放置。
[14]根据[1]～[13]中任一项的化合物或其盐，其中，所述切割性部分选自二硫残基、缩醛残基、缩酮残基、酯残基、氨甲酰基残基、烷氧基烷基残基、亚胺残基、叔烷基氧基氨基甲酸酯残基、硅烷残基、含有腙的残基、氨基磷酸酯残基、乌头酰基残基、三苯甲基残基、偶氮残基、邻二醇残基、硒残基、含有具有吸电子基团的芳环的残基、含有香豆素的残基、含有砜的残基、含有不饱和键的链残基、糖基残基。
[15]根据[5]～[14]中任一项的化合物或其盐，其中，所述(i)的切割性部分选自二硫残基、酯残基、缩醛残基、缩酮残基、亚胺残基、邻二醇残基。
[16]根据[5]～[14]中任一项的化合物或其盐，其中，所述(ii)的切割性部分选自酯残基、氨甲酰基残基、烷氧基烷基残基、亚胺残基、叔烷基氧基氨基甲酸酯残基、硅烷残基、含有腙的残基、氨基磷酸酯残基、乌头酰基残基、三苯甲基残基、偶氮残基、邻二醇残基、硒残基、含有具有吸电子基团的芳环的残基、含有香豆素的残基、含有砜的残基、含有不饱和键的链残基、糖基残基。
[17]根据[1]～[16]中任一项的化合物或其盐，其中，切割性部分对应于选自下述组的任一化学结构：
[化学式1]
Figure BDA0002827785710000081
在此，与键正交的波浪线表示切割位点(切割部位)，
多个R2a、多个R2b和多个R2c相同或不同，选自
(i)氢原子或卤素原子，
(ii)一价烃基，
(iii)芳烷基，
(iv)一价杂环基，
(v)Rc-O-、Rc-C(＝O)-、Rc-O-C(＝O)-或Rc-C(＝O)-O-，Rc表示氢原子或一价烃基，
(vi)NRdRe-、NRdRe-C(＝O)-、NRdRe-C(＝O)-O-或Rd-C(＝O)-NRe-，Rd和Re相同或不同，表示氢原子或一价烃基，或者
(vii)硝基、硫酸基、磺酸基、氰基或羧基，
J为-CH2-、-O-或-S-，
r为1～4的任意的整数，
○(白色圆)表示与A结合的键，●(黑色圆)表示与B结合的键，
化学结构以切割位点为中心呈不对称的情况下，可以是●表示与A结合的键，○表示与B结合的键。
[18]根据[5]～[13]、[15]、[17]中任一项的化合物或其盐，其中，所述(i)的切割性部分对应于选自以下组的任一化学结构；
[化学式2]
Figure BDA0002827785710000091
在此，与键正交的波浪线表示切割位点，
R2a与[17]中相应符号的含义相同，
○(白色圆)表示与A结合的键，●(黑色圆)表示与B结合的键，
化学结构以切割位点为中心呈不对称的情况下，可以是●表示与A结合的键，○表示与B结合的键。
[19]根据[5]～[13]、[16]、[17]中任一项的化合物或其盐，其中，所述(ii)的切割性部分对应于选自以下组的任一化学结构；
[化学式3]
Figure BDA0002827785710000101
在此，与键正交的波浪线表示切割位点；
R2b、R2c、J、r与[17]中相应符号的含义相同，
○(白色圆)表示与A结合的键，●(黑色圆)表示与B结合的键，
化学结构以切割位点为中心呈不对称的情况下，可以是●表示与A结合的键，○表示与B结合的键。
[20]根据[1]～[19]中任一项的化合物或其盐，其中，L以下述式(L1)～(L3)中的任一式表示；
La-C-Lb (L1)
La-C (L2)
C-Lb (L3)
式中，
La和Lb分别为二价基团，
C为切割性部分。
[21]根据[20]所述的化合物或其盐，其中，所述La和Lb分别以下述(La')和(Lb')表示；
[化学式4]
Figure BDA0002827785710000102
式中，
p和p'相同或不同，为0～10的任意的整数，
q和q'相同或不同，为0～10的任意的整数，
X和X'相同或不同，为碳原子、氮原子或单键，在此，X为氮原子的情况下，R1b不存在，X'为氮原子的情况下，R1b'不存在，X为单键的情况下，R1a和R1b不存在，X'为单键的情况下，R1a'和R1b'不存在，
R1a、R1b、R1a'和R1b'相同或不同，为选自所述(i)～(vii)的原子或基团。
[22]根据[1]～[21]中任一项的化合物或其盐，其中，包含生物正交性官能团的二价基团为在主链中包含选自叠氮残基、醛残基、硫醇残基、炔烃残基、烯烃残基、四嗪残基、硝酮残基、羟胺残基、腈残基、肼残基、酮残基、硼酸残基、氰基苯并噻唑残基、烯丙基残基、膦残基、马来酰亚胺残基、二硫残基、硫酯残基、α-卤代羰基残基、异腈残基、斯德酮(Sydnone)残基、硒残基中的生物正交性官能团的二价基团。
[23]根据[1]～[21]中任一项的化合物或其盐，其中，包含生物正交性官能团的二价基团为在侧链中包含选自叠氮残基、醛残基、硫醇残基、炔烃残基、烯烃残基、卤素残基、四嗪残基、硝酮残基、羟胺残基、腈残基、肼残基、酮残基、硼酸残基、氰基苯并噻唑残基、烯丙基残基、膦残基、马来酰亚胺残基、二硫残基、α-卤代羰基残基、异腈残基、斯德酮(Sydnone)残基、硒残基中的生物正交性官能团的二价基团。
[24]根据[1]～[23]中任一项的化合物或其盐，其中，生物正交性官能团为以下述式表示的任一基团；
[化学式5]
Figure BDA0002827785710000111
式中，
R1f、一个或多个R1g和一个或多个R1h相同或不同，为选自所述(i)～(vii)中的原子或基团、或者吸电子基团，
·表示键。
[25]根据[1]～[24]中任一项的化合物或其盐，其中，所述(b)的二价基团选自可取代的亚烷基、可取代的亚环烷基、可取代的芳基、可取代的二价杂环基、-NRa-、-O-或这些基团中的2个以上的组合，Ra表示氢原子或取代基。
[26]根据[1]～[25]中任一项的化合物或其盐，其中，B以下述式(B-1)表示；
[化学式6]
Figure BDA0002827785710000121
式中，
Y为-NH-、-O-、-CH2-或下述式(B-2)，
[化学式7]
Figure BDA0002827785710000122
式(B-2)中，
V和V'相同或不同，为-NH-、-O-、-CH2-或单键，
V1为包含生物正交性官能团的二价基团，
s为0～10的任意的整数，
式(B-2)中的○和●的取向分别为与式(B-1)中的○和●的取向相同，
Z为氧原子、硫原子或氢原子，Z为氢原子的情况下，-C(＝Z)-表示-CH2-，
式(B-1)中的○(白色圆)表示与L侧的部分结合的键，●(黑色圆)表示与R侧的部分结合的键。
[27]根据[1]～[26]中任一项的化合物或其盐，其中，反应性基团为对于赖氨酸残基、酪氨酸残基或色氨酸残基中的任一残基的侧链具有特异性的反应性基团。
[28]根据[27]的化合物或其盐，其中，反应性基团为对于赖氨酸残基的侧链具有特异性的反应性基团。
[29]根据[1]～[28]中任一项的化合物或其盐，其中，反应性基团对应于选自下述组的任一化学结构；
[化学式8]
Figure BDA0002827785710000123
在此，
R5a和R5c为选自所述(i)～(vii)中的原子或基团，
R5b为吸电子基团，
j为1～5的任意的整数，
k为1～4的任意的整数。
[30]根据[1]～[29]中任一项的化合物或其盐，其中，连结A和R的主链的原子数为4～20个。
[31]根据[1]～[30]中任一项的化合物或其盐，其中，连结A和R的主链不含环结构。
[32]根据[1]～[31]中任一项的化合物或其盐，其中，以L-B表示的部分结构不含肽部分。
[33]根据[1]～[32]中任一项的化合物或其盐，其中，所述以式(I)表示的化合物为以下述式(I')表示的化合物；
A-B2-L'-B1-R(I')
式中，
A和R与所述式(I)的A和R含义相同，
L'为切割性连接体，该切割性连接体为包含切割性部分的二价基团，
B1和B2相同或不同，为(a)包含生物正交性官能团的二价基团、或者(b)不含生物正交性官能团的二价基团，
B1和B2可具有以L'为中心的对称结构。
[34]根据[33]的化合物或其盐，其中，所述以式(I')表示的化合物以下述式(I”)表示；
[化学式9]
Figure BDA0002827785710000131
式中，
A和R与[1]所述的式(I)的A和R含义相同，
C为切割性部分，
p、p'、q、q'、X、X'、R1a、R1a'、R1b和R1b'与[19]所述的式(La')和(Lb')中相应符号的含义相同，
Y和Y'相同或不同，与[24]所述的式(B-1)的Y含义相同，
Z和Z'相同或不同，与所述式(B-1)的Z含义相同。
[35]一种试剂，其为抗体的区域选择性修饰试剂，其中，包含以下述式(I)表示且具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物或其盐，
A-L-B-R (I)
式中，
A为针对抗体的亲和性物质，
L为切割性连接体，该切割性连接体为包含切割性部分的二价基团，
B为(a)包含生物正交性官能团的二价基团、或者(b)不含生物正交性官能团的二价基团，
R为针对所述抗体的反应性基团；
并且，针对抗体的亲和性物质为包含上述式1-1～1-9和式2-1中的任一氨基酸序列的肽(较好是包含选自上述(1)～(76)中的氨基酸序列的肽，下同)。
[36]一种具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物或其盐，其中，
所述化合物以下述式(I)表示，
A-L-B-R (I)
式中，
A为针对抗体的亲和性物质，
L为切割性连接体，该切割性连接体为包含切割性部分的二价基团，
B为(a)包含生物正交性官能团的二价基团、或者(b)不含生物正交性官能团的二价基团，
R为对于赖氨酸残基的侧链具有特异性的反应性基团；
并且，针对抗体的亲和性物质为包含上述式1-1～1-9和式2-1中的任一氨基酸序列的肽。
[37]一种试剂，其为抗体的区域选择性修饰试剂，其中，包含以下述式(I)表示且具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物或其盐，
A-L-B-R (I)
式中，
A为针对抗体的亲和性物质，
L为切割性连接体，该切割性连接体为包含切割性部分的二价基团，
B为(a)包含生物正交性官能团的二价基团、或者(b)不含生物正交性官能团的二价基团，
R为对于赖氨酸残基的侧链具有特异性的反应性基团；
并且，针对抗体的亲和性物质为包含上述式1-1～1-9和式2-1中的任一氨基酸序列的肽。
第二实施方式中，本发明提供具有针对抗体的亲和性物质及切割性部分的抗体或其盐、以及其制造方法。
(具有针对抗体的亲和性物质及切割性部分的抗体或其盐)
[38]一种具有针对抗体的亲和性物质及切割性部分的抗体或其盐，其中，
所述抗体以下述式(II)表示，
A-L-B-R'-T (II)
式中，
A为针对抗体的亲和性物质，
L为切割性连接体，该切割性连接体为包含切割性部分的二价基团，
B为(a)包含生物正交性官能团的二价基团、或者(b)不含生物正交性官能团的二价基团，
R'为通过抗体与反应性基团之间的反应而生成的部分，
T为抗体；
并且，针对抗体的亲和性物质为包含上述式1-1～1-9和式2-1中的任一氨基酸序列的肽。
[39]根据[38]的抗体或其盐，其中，抗体为单克隆抗体。
[40]根据[38]或[39]的抗体或其盐，其中，抗体为IgG抗体。
[41]根据[38]～[40]中任一项的抗体或其盐，其中，抗体来源于人。
[42]根据[38]～[41]中任一项的抗体或其盐，其中，抗体为包含选自下述(A)～(C)中的任一种Fc区域蛋白质，且具有抗原结合能力的抗体：
(A)包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的Fc区域蛋白质；
(B)包含在SEQ ID NO:1的氨基酸序列中插入、添加、缺失或取代1个或数个氨基酸残基而形成的氨基酸序列的Fc区域蛋白质；或者
(C)包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列显示90％以上的同一性的氨基酸序列的Fc区域蛋白质。
[43]根据[38]～[42]中任一项的抗体或其盐，其中，抗体在由连续的1～50个氨基酸残基形成的靶区中包含1个以上的特定氨基酸残基，且在除所述靶区以外的非靶区中包含5个以上的所述特定氨基酸残基，
以A-L-B-R'表示的结构单元与所述靶区中所含的1个以上的特定氨基酸残基以30％以上的区域选择性结合。
[44]根据[43]的抗体或其盐，其中，所述靶区为由连续的1～10个氨基酸残基形成的区域。
[45]根据[44]的抗体或其盐，其中，所述靶区为由连续的1～3个氨基酸残基形成的区域。
[46]根据[45]的抗体或其盐，其中，所述靶区为由人IgG Fc区域中的第246～248位的氨基酸残基形成的区域。
[47]根据[43]～[46]中任一项的抗体或其盐，其中，所述区域选择性为50％以上。
[48]根据[47]的抗体或其盐，其中，所述区域选择性为70％以上。
[49]根据[48]的抗体或其盐，其中，所述区域选择性为90％以上。
[50]根据[43]～[49]中任一项的抗体或其盐，其中，所述特定氨基酸残基在以存在于特定位置的特定氨基酸为中心时分别从N末端侧和C末端侧起到相隔a个氨基酸残基的位置为止的区域中，除所述存在于特定位置的特定氨基酸残基以外，不含与特定氨基酸残基同种的氨基酸残基；在此，a为1～10的任意的整数。
[51]根据[38]～[50]中任一项的抗体或其盐，其中，所述抗体为包含多个重链的抗体，
T在多个重链中的对应的多个靶区中具有以A-L-B-R'表示的结构单元，因而所述抗体具有多个以A-L-B-R'表示的结构单元。
[52]根据[51]的抗体或其盐，其中，重链的个数为2个。
[53]根据[38]～[52]中任一项的抗体或其盐，其中，通过抗体与反应性基团之间的反应而生成的部分为：通过赖氨酸残基、酪氨酸残基或色氨酸残基与对于赖氨酸残基、酪氨酸残基或色氨酸残基中的任一残基的侧链具有特异性的反应性基团之间的反应而生成的部分。
[54]根据[38]～[53]中任一项的抗体或其盐，其中，通过抗体与反应性基团之间的反应而生成的部分为：通过赖氨酸残基与对于赖氨酸残基的侧链具有特异性的反应性基团之间的反应而生成的部分。
[55]根据[38]～[54]中任一项的抗体或其盐，其中，通过所述反应而生成的部分对应于选自下述组的任一化学结构；
[化学式10]
Figure BDA0002827785710000161
在此，●(黑色圆)表示与T侧的部分结合的键，○(白色圆)表示与B侧的部分结合的键，与键正交的直线表示通过反应而生成的键。
[56]根据[38]～[55]中任一项的抗体或其盐，其中，连结A和R'的主链的原子数为4～20个。
[57]根据[38]～[56]中任一项的抗体或其盐，其中，连结A和R的主链不含环结构。
[58]根据[38]～[57]中任一项的抗体或其盐，其中，以L-B表示的部分结构不含肽部分。
[59]根据[38]～[58]中任一项的抗体或其盐，其中，所述以式(II)表示的化合物为以下述式(II')表示的化合物；
A-B2-L'-B1-R'-T (II')
式中，
A、R'和T与所述式(II)中相应符号的含义相同，
L'为切割性连接体，该切割性连接体为包含切割性部分的二价基团，
B1和B2相同或不同，为(a)包含生物正交性官能团的二价基团、或者(b)不含生物正交性官能团的二价基团，
B1和B2可具有以L'为中心的对称结构。
[60]根据[59]的抗体或其盐，其中，所述以式(II')表示的化合物以下述式(II”)表示；
[化学式11]
Figure BDA0002827785710000171
式中，
A、R'和T与[38]所述的式(II)中相应符号的含义相同，
C为切割性部分，
p和p'相同或不同，为0～10的任意的整数，
q和q'相同或不同，为0～10的任意的整数，
X和X'相同或不同，为碳原子、氮原子或单键，在此，X为氮原子的情况下，R1b不存在，X'为氮原子的情况下，R1b'不存在，X为单键的情况下，R1a和R1b不存在，X'为单键的情况下，R1a'和R1b'不存在，
R1a、R1b、R1a'和R1b'相同或不同，选自
(i)氢原子或卤素原子，
(ii)一价烃基，
(iii)芳烷基，
(iv)一价杂环基，
(v)Rc-O-、Rc-C(＝O)-、Rc-O-C(＝O)-或Rc-C(＝O)-O-，Rc表示氢原子或一价烃基，
(vi)NRdRe-、NRdRe-C(＝O)-、NRdRe-C(＝O)-O-或Rd-C(＝O)-NRe-，Rd和Re相同或不同，表示氢原子或一价烃基，或者
(vii)硝基、硫酸基、磺酸基、氰基或羧基，
Y和Y'相同或不同，与[26]所述的式(B-1)的Y相同，
Z和Z'相同或不同，与所述式(B-1)的Z相同。
[61]一种具有针对抗体的亲和性物质及切割性部分的抗体或其盐，其中，
所述抗体以下述式(II)表示，
A-L-B-R'-T (II)
式中，
A为针对抗体的亲和性物质，
L为切割性连接体，该切割性连接体为包含切割性部分的二价基团，
B为(a)包含生物正交性官能团的二价基团、或者(b)不含生物正交性官能团的二价基团，
R'为通过抗体与对于赖氨酸残基的侧链具有特异性的反应性基团之间的反应而生成的部分，
T为抗体；
并且，针对抗体的亲和性物质为包含上述式1-1～1-9和式2-1中的任一氨基酸序列的肽。
(具有针对抗体的亲和性物质及切割性部分的抗体或其盐的制造方法)
[62]一种具有针对抗体的亲和性物质及切割性部分的抗体或其盐的制造方法，其中，包括：
使以下述式(I)表示且具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物或其盐与抗体反应，生成以下述式(II)表示且具有针对抗体的亲和性物质及切割性部分的抗体或其盐，
A-L-B-R (I)
式中，
A为针对抗体的亲和性物质，
L为切割性连接体，该切割性连接体为包含切割性部分的二价基团，
B为(a)包含生物正交性官能团的二价基团、或者(b)不含生物正交性官能团的二价基团，
R为针对所述抗体的反应性基团；
A-L-B-R'-T (II)
式中，
A、L和B与所述式(I)的A、L和B含义相同，
R'为通过抗体与反应性基团之间的反应而生成的部分，
T为抗体；
并且，针对抗体的亲和性物质为包含上述式1-1～1-9和式2-1中的任一氨基酸序列的肽。
[63]根据[62]的方法，其中，反应性基团为对于赖氨酸残基的侧链具有特异性的反应性基团。
第三实施方式中，本发明提供具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分、功能性物质及抗体的复合物或其盐、以及其制造方法。
(具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分、功能性物质及抗体的复合物或其盐)
[64]一种具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分、功能性物质及抗体的复合物或其盐，其中，
所述复合物以下述式(III)表示，
A-L-B'(-F)-R'-T (III)
式中，
A为针对抗体的亲和性物质，
L为切割性连接体，该切割性连接体为包含切割性部分的二价基团，
B'为包含通过功能性物质与生物正交性官能团之间的反应而生成的部分的三价基团，
F为功能性物质，
R'为通过抗体与反应性基团之间的反应而生成的部分，
T为抗体；
并且，针对抗体的亲和性物质为包含上述式1-1～1-9和式2-1中的任一氨基酸序列的肽。
[65]根据[64]的复合物或其盐，其中，抗体为单克隆抗体。
[66]根据[64]或[65]的复合物或其盐，其中，抗体为IgG抗体。
[67]根据[64]～[66]中任一项的复合物或其盐，其中，抗体来源于人。
[68]根据[64]～[67]中任一项的复合物或其盐，其中，抗体为包含选自下述(A)～(C)中的任一种Fc区域蛋白质，且具有抗原结合能力的抗体：
(A)包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的Fc区域蛋白质；
(B)包含在SEQ ID NO:1的氨基酸序列中插入、添加、缺失或取代1个或数个氨基酸残基而形成的氨基酸序列的Fc区域蛋白质；或者
(C)包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列显示90％以上的同一性的氨基酸序列的Fc区域蛋白质。
[69]根据[64]～[68]中任一项的复合物或其盐，其中，抗体在由连续的1～50个氨基酸残基形成的靶区中包含1个以上的特定氨基酸残基，且在除所述靶区以外的非靶区中包含5个以上的所述特定氨基酸残基，
以A-L-B'(-F)-R'表示的结构单元与所述靶区中所含的1个以上的特定氨基酸残基以30％以上的区域选择性结合。
[70]根据[69]的复合物或其盐，其中，所述特定氨基酸残基在以存在于特定位置的特定氨基酸为中心时分别从N末端侧和C末端侧起到相隔a个氨基酸残基的位置为止的区域中，除所述存在于特定位置的特定氨基酸残基以外，不含与特定氨基酸残基同种的氨基酸残基；在此，a为1～10的任意的整数。
[71]根据[64]～[70]中任一项的复合物或其盐，其中，所述抗体为包含多个重链的抗体，
T在多个重链中的对应的多个靶区中具有以A-L-B'(-F)-R'表示的结构单元，因而所述抗体具有多个以A-L-B'(-F)-R'表示的结构单元。
[72]根据[64]～[71]中任一项的复合物或其盐，其中，所述功能性物质在具有容易与生物正交性官能团反应的官能团的情况下、或者在以具有容易与生物正交性官能团反应的官能团的方式衍生物化的情况下，所述容易与生物正交性官能团反应的基团为选自叠氮残基、醛残基、硫醇残基、炔烃残基、烯烃残基、卤素残基、四嗪残基、硝酮残基、羟胺残基、腈残基、肼残基、酮残基、硼酸残基、氰基苯并噻唑残基、烯丙基残基、膦残基、马来酰亚胺残基、二硫残基、硫酯残基、α-卤代羰基残基、异腈残基、斯德酮残基、硒残基中的基团。
[73]根据[64]～[71]中任一项的复合物或其盐，其中，所述功能性物质在具有容易与生物正交性官能团反应的官能团的情况下、或者在以具有容易与生物正交性官能团反应的官能团的方式衍生物化的情况下，所述容易与生物正交性官能团反应的基团为选自以下述式表示的基团中的基团；
[化学式12]
Figure BDA0002827785710000201
式中，
R1f、一个或多个R1g和一个或多个R1h相同或不同，为选自所述(i)～(vii)中的原子或基团、或者吸电子基团，·为与功能性物质结合的键。
[74]根据[64]～[73]中任一项的复合物或其盐，其中，通过抗体与反应性基团之间的反应而生成的部分为：通过赖氨酸残基、酪氨酸残基或色氨酸残基与对于赖氨酸残基、酪氨酸残基或色氨酸残基中的任一残基的侧链具有特异性的反应性基团之间的反应而生成的部分。
[75]根据[64]～[74]中任一项的复合物或其盐，其中，通过抗体与反应性基团之间的反应而生成的部分为：通过赖氨酸残基与对于赖氨酸残基的侧链具有特异性的反应性基团之间的反应而生成的部分。
[76]根据[64]～[75]中任一项的复合物或其盐，其中，通过所述反应而生成的部分对应于选自下述组的任一化学结构；
[化学式13]
Figure BDA0002827785710000202
在此，●(黑色圆)表示与T侧的部分结合的键，○(白色圆)表示与B侧的部分结合的键。
[77]根据[64]～[76]中任一项的复合物或其盐，其中，功能性物质为药物或标记物质。
[78]根据[64]～[77]中任一项的复合物或其盐，其中，功能性物质为低分子化合物。
[79]根据[77]或[78]所述的复合物或其盐，其中，药物为抗癌剂。
[80]根据[64]～[79]中任一项的复合物或其盐，其中，连结A和R'的主链的原子数为4～20个。
[81]根据[64]～[80]中任一项的复合物或其盐，其中，连结A和R的主链不含环结构。
[82]根据[64]～[81]中任一项的复合物或其盐，其中，以L-B表示的部分结构不含肽部分。
[83]根据[64]～[82]中任一项的复合物或其盐，其中，所述以式(III)表示的化合物以下述式(III')表示；
A-B2'(-F2)-L'-B1'(-F1)-R'-T (III')
式中，
A、R'和T与所述式(II)的A、R'和T含义相同，
L'为切割性连接体，该切割性连接体为包含切割性部分的二价基团，
B1'和B2'相同或不同，为包含通过功能性物质与生物正交性官能团之间的反应而生成的部分的三价基团，
F1和F2相同或不同，为功能性物质，
B1'(-F1)和B2'(-F2)可具有以L'为中心的对称结构。
[84]根据[83]的复合物或其盐，其中，所述以式(III')表示的化合物以下述式(III”)表示；
[化学式14]
Figure BDA0002827785710000211
式中，
A、R'和T与[64]所述的式(III)的A、R'和T含义相同，
C为切割性部分，
p和p'相同或不同，为0～10的任意的整数，
q和q'相同或不同，为0～10的任意的整数，
X和X'相同或不同，为碳原子、氮原子或单键，在此，X为氮原子的情况下，R1b不存在，X'为氮原子的情况下，R1b'不存在，X为单键的情况下，R1a和R1b不存在，X'为单键的情况下，R1a'和R1b'不存在，
R1a、R1b、R1a'和R1b'相同或不同，选自所述(i)～(vii)，
Y和Y'相同或不同，为从所述式(B-1)的Y除去1个氢原子而得的残基，
Z和Z'相同或不同，与所述式(B-1)的Z相同，
F和F'相同或不同，为功能性物质。
[85]一种具有亲和性物质、功能性物质及抗体的复合物或其盐，其中，
所述复合物以下述式(III)表示，
A-L-B'(-F)-R'-T (III)
式中，
A为针对抗体的亲和性物质，
L为切割性连接体，该切割性连接体为包含切割性部分的二价基团，
B'为包含通过功能性物质与生物正交性官能团之间的反应而生成的部分的三价基团，
F为功能性物质，
R'为通过抗体与对于赖氨酸残基的侧链具有特异性的反应性基团之间的反应而生成的部分，
T为抗体；
并且，针对抗体的亲和性物质为包含上述式1-1～1-9和式2-1中的任一氨基酸序列的肽。
(具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分、功能性物质及抗体的复合物或其盐的制造方法)
[86]一种具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分、功能性物质及抗体的复合物或其盐的制造方法，其中，包括：
使以下述式(II)表示且具有针对抗体的亲和性物质及切割性部分的抗体或其盐与功能性物质反应，生成以下述式(III)表示且具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分、功能性物质及抗体的复合物或其盐，
A-L-B-R'-T (II)
式中，
A为针对抗体的亲和性物质，
L为切割性连接体，该切割性连接体为包含切割性部分的二价基团，
B为(a)包含生物正交性官能团的二价基团，
R'为通过抗体与反应性基团之间的反应而生成的部分，
T为抗体；
A-L-B'(-F)-R'-T (III)
式中，
A、L、R'和T与所述式(II)的A、L、R'和T含义相同，
B'为包含通过功能性物质与生物正交性官能团之间的反应而生成的部分的三价基团，
F为功能性物质；
并且，针对抗体的亲和性物质为包含上述式1-1～1-9和式2-1中的任一氨基酸序列的肽。
[87]根据[86]的方法，其中，反应性基团为对于赖氨酸残基的侧链具有特异性的反应性基团。
[88]一种具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分、功能性物质及抗体的复合物或其盐的制造方法，其中，包括：
(A)使以下述式(I)表示的化合物或其盐与抗体反应，生成以下述式(II)表示且具有针对抗体的亲和性物质及切割性部分的抗体或其盐；以及
(B)使所述具有针对抗体的亲和性物质及切割性部分的抗体或其盐与功能性物质反应，生成以下述式(III)表示且具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分、功能性物质及抗体的复合物或其盐，
A-L-B-R (I)
式中，
A为针对抗体的亲和性物质，
L为切割性连接体，该切割性连接体为包含切割性部分的二价基团，
B为(a)包含生物正交性官能团的二价基团，
R为针对所述抗体的反应性基团；
A-L-B-R'-T (II)
式中，
A、L和B与所述式(I)的A、L和B含义相同，
R'为通过抗体与反应性基团之间的反应而生成的部分，
T为抗体；
A-L-B'(-F)-R'-T (III)
式中，
A和L与所述式(I)的A和L含义相同，
R'和T与所述式(II)的R'和T含义相同，
B'为包含通过功能性物质与生物正交性官能团之间的反应而生成的部分的三价基团，
F为功能性物质；
并且，针对抗体的亲和性物质为包含上述式1-1～1-9和式2-1中的任一氨基酸序列的肽，
第四实施方式中，本发明提供具有生物正交性官能团的抗体的制造方法。
[89]一种具有生物正交性官能团的抗体或其盐的制造方法，其中，包括：
对以下述式(II)表示且具有针对抗体的亲和性物质及切割性部分的抗体或其盐的切割性部分进行切割，生成以下述式(IV)表示且具有生物正交性官能团的抗体或其盐，
A-L-B-R'-T (II)
式中，
A为针对抗体的亲和性物质，
L为切割性连接体，该切割性连接体为包含切割性部分的二价基团，
B为(a)包含生物正交性官能团的二价基团、或者(b)不含生物正交性官能团的二价基团，
R'为通过抗体与反应性基团之间的反应而生成的部分，
T为抗体；
L1-B-R'-T (IV)
式中，
B、R'和T与所述式(II)的B、R'和T含义相同，
L1为(i')包含生物正交性官能团的一价基团、或者(ii')不含生物正交性官能团的一价基团；
并且，针对抗体的亲和性物质为包含上述式1-1～1-9和式2-1中的任一氨基酸序列的肽。
[90]根据[89]的方法，其中，L为：
(i)切割性连接体，该切割性连接体是包含切割性部分的二价基团，该切割性部分具有通过切割而在反应性基团侧生成生物正交性官能团的能力；或者
(ii)切割性连接体，该切割性连接体是包含切割性部分的二价基团，该切割性部分不具有通过切割而在反应性基团侧生成生物正交性官能团的能力。
[91]根据[89]的方法，其中，L为所述(i)的切割性连接体，
L1为(i')包含生物正交性官能团的一价基团，
B为所述(a)或(b)的二价基团。
[92]根据[90]或[91]的方法，其中，L为所述(i)的切割性连接体，
L1为(i')包含生物正交性官能团的一价基团，
B为所述(b)的二价基团。
[93]根据[90]的方法，其中，L为所述(ii)的切割性连接体，
L1为(i')不含生物正交性官能团的一价基团，
B为所述(a)的二价基团。
[94]根据[89]～[93]中任一项的方法，其中，反应性基团为对于赖氨酸残基的侧链具有特异性的反应性基团。
[95]一种具有生物正交性官能团的抗体或其盐的制造方法，其中，包括：
(A)使以下述式(I)表示的化合物或其盐与抗体反应，生成以下述式(II)表示且具有针对抗体的亲和性物质及切割性部分的抗体或其盐；以及
(B)对所述具有针对抗体的亲和性物质及切割性部分的抗体或其盐的切割性部分进行切割，生成以下述式(IV)表示且具有生物正交性官能团的抗体或其盐，
A-L-B-R (I)
式中，
A为针对抗体的亲和性物质，
L为切割性连接体，该切割性连接体为包含切割性部分的二价基团，
B为(a)包含生物正交性官能团的二价基团、或者(b)不含生物正交性官能团的二价基团，
R为针对所述抗体的反应性基团；
A-L-B-R'-T (II)
式中，
A、L和B与所述式(I)的A、L和B含义相同，
R'为通过抗体与反应性基团之间的反应而生成的部分，
T为抗体；
L1-B-R'-T (IV)
式中，
B、R'和T与所述式(II)的B、R'和T含义相同，
L1为(i')包含生物正交性官能团的一价基团、或者(ii')不含生物正交性官能团的一价基团；
并且，针对抗体的亲和性物质为包含上述式1-1～1-9和式2-1中的任一氨基酸序列的肽。
第五实施方式中，本发明提供具有功能性物质的抗体或其盐的制造方法。
[96]一种具有功能性物质的抗体或其盐的制造方法，其中，包括：
对以下述式(III)表示且具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分、功能性物质及抗体的复合物或其盐的切割性部分进行切割，生成以下述式(V)表示的具有功能性物质的抗体或其盐，
A-L-B'(-F)-R'-T (III)
式中，
A为针对抗体的亲和性物质，
L为切割性连接体，该切割性连接体为包含切割性部分的二价基团，
B'为包含通过功能性物质与生物正交性官能团之间的反应而生成的部分的三价基团，
F为功能性物质，
R'为通过抗体与反应性基团之间的反应而生成的部分，
T为抗体；
F-(L1-B)'-R'-T (V)
式中，
L1为(i')包含生物正交性官能团的一价基团、或者(ii')不含生物正交性官能团的一价基团，
B为(a)包含生物正交性官能团的二价基团、或者(b)不含生物正交性官能团的二价基团，
以(L1-B)'表示的结构单元为包含通过功能性物质与(i')和(a)中的生物正交性官能团中的任一者或两者之间的反应而生成的部分的二价结构单元，
F为功能性物质，
R'为通过抗体与反应性基团之间的反应而生成的部分，
T为抗体；
并且，针对抗体的亲和性物质为包含上述式1-1～1-9和式2-1中的任一氨基酸序列的肽。
[97]根据[96]的方法，其中，包括：对所述具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分、功能性物质及抗体的复合物或其盐的切割性部分进行切割，生成以下述式(V1)表示的具有功能性物质的抗体或其盐；
L1-B'(-F)-R'-T (V1)
式中，
L1为(i')包含生物正交性官能团的一价基团、或者(ii')不含生物正交性官能团的一价基团，
B'、F、R'和T与所述式(III)的相应符号的含义相同。
[98]根据[96]的方法，其中，该方法包括：使所述具有生物正交性官能团的抗体或其盐与1种或2种功能性物质反应，生成以下述式(V2)或下述式(V3)表示的具有功能性物质的抗体或其盐，
F-L1'-B-R'-T (V2)
式中，
B、R'和T与所述式(IV)的B、R'和T含义相同，
L1'为包含通过功能性物质与(i')包含生物正交性官能团的一价基团之间的反应而生成的部分的二价基团，
F为功能性物质；
Fa-L1'-B'(-Fb)-R'-T (V3)
式中，
R'和T与所述式(IV)的R'和T含义相同，
L1'与所述式(V2)的L1'含义相同，
B'为包含通过功能性物质与生物正交性官能团之间的反应而生成的部分的三价基团，
Fa和Fb分别为相同或不同的功能性物质。
[99]根据[96]～[98]中任一项的方法，其中，反应性基团为对于赖氨酸残基的侧链具有特异性的反应性基团。
[100]一种具有功能性物质的抗体或其盐的制造方法，其中，包括：
(A)使以下述式(II)表示且具有针对抗体的亲和性物质及切割性部分的抗体或其盐与功能性物质反应，生成以下述式(III)表示且具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分、功能性物质及抗体的复合物或其盐；以及
(B)对所述具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分、功能性物质及抗体的复合物或其盐的切割性部分进行切割，生成以下述式(V1)表示且具有功能性物质的抗体或其盐；
A-L-B-R'-T (II)
式中，
A为针对抗体的亲和性物质，
L为切割性连接体，该切割性连接体为包含切割性部分的二价基团，
B为(a)包含生物正交性官能团的二价基团，
R'为通过抗体与反应性基团之间的反应而生成的部分，
T为抗体；
A-L-B'(-F)-R'-T (III)
式中，
A、L、R'和T与所述式(II)的A、L、R'和T含义相同，
B'为包含通过功能性物质与生物正交性官能团之间的反应而生成的部分的三价基团，
F为功能性物质；
L1-B'(-F)-R'-T (V1)
式中，
L1为(i')包含生物正交性官能团的一价基团、或者(ii')不含生物正交性官能团的一价基团，
B'、F、R'和T与所述式(III)的B'、F、R'和T含义相同；
并且，针对抗体的亲和性物质为包含上述式1-1～1-9和式2-1中的任一氨基酸序列的肽。
[101]一种具有功能性物质的抗体或其盐的制造方法，其中，包括：
(A)使以下述式(I)表示且具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物或其盐与抗体反应，生成以下述式(II)表示且具有针对抗体的亲和性物质及切割性部分的抗体或其盐；
(B)使所述具有针对抗体的亲和性物质及切割性部分的抗体或其盐与功能性物质反应，生成以下述式(III)表示且具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分、功能性物质及抗体的复合物或其盐；以及
(C)对所述具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分、功能性物质及抗体的复合物或其盐的切割性部分进行切割，生成以下述式(V1)表示且具有功能性物质的抗体或其盐；
A-L-B-R (I)
式中，
A为针对抗体的亲和性物质，
L为切割性连接体，该切割性连接体为包含切割性部分的二价基团，
B为(a)包含生物正交性官能团的二价基团，
R为针对所述抗体的反应性基团；
A-L-B-R'-T (II)
式中，
A、L和B与所述式(I)的A、L和B含义相同，
R'为通过抗体与反应性基团之间的反应而生成的部分，
T为抗体；
A-L-B'(-F)-R'-T(III)
式中，
A和L与所述式(I)的A和L含义相同，
R'和T与所述式(II)的R'和T含义相同，
B'为包含通过功能性物质与生物正交性官能团之间的反应而生成的部分的三价基团，
F为功能性物质；
L1-B'(-F)-R'-T (V1)
式中，
L1为(i')包含生物正交性官能团的一价基团、或者(ii')不含生物正交性官能团的一价基团，
B'、F、R'和T与所述式(III)的B'、F、R'和T含义相同；
并且，针对抗体的亲和性物质为包含上述式1-1～1-9和式2-1中的任一氨基酸序列的肽。
[102]一种具有功能性物质的抗体或其盐的制造方法，其中，包括：
(A)对以下述式(II)表示且具有针对抗体的亲和性物质及切割性部分的抗体或其盐的切割性部分进行切割，生成以下述式(IV)表示且具有生物正交性官能团的抗体或其盐；以及
(B)使所述具有生物正交性官能团的抗体或其盐与1种或2种以上的功能性物质反应，生成以下述式(V2)或下述式(V3)表示且具有功能性物质的抗体或其盐；
A-L-B-R'-T (II)
式中，
A为针对抗体的亲和性物质，
L为切割性连接体，该切割性连接体为包含切割性部分的二价基团，
B为(a)包含生物正交性官能团的二价基团、或者(b)不含生物正交性官能团的二价基团，
R'为通过抗体与反应性基团之间的反应而生成的部分，
T为抗体；
L1-B-R'-T (IV)
式中，
B、R'和T与所述式(II)的B、R'和T含义相同，
L1为(i')包含生物正交性官能团的一价基团、或者(ii')不含生物正交性官能团的一价基团；
F-L1'-B-R'-T (V2)
式中，
B、R'和T与所述式(IV)的B、R'和T含义相同，
L1'为包含通过功能性物质与(i')包含生物正交性官能团的一价基团之间的反应而生成的部分的二价基团，
F为功能性物质；
Fa-L1'-B'(-Fb)-R'-T (V3)
式中，
R'和T与所述式(IV)的R'和T含义相同，
L1'与所述式(V2)的L1'含义相同，
B'为包含通过功能性物质与生物正交性官能团之间的反应而生成的部分的三价基团，
Fa和Fb分别为相同或不同的功能性物质；
并且，针对抗体的亲和性物质为包含上述式1-1～1-9和式2-1中的任一氨基酸序列的肽。
[103]一种具有功能性物质的抗体或其盐的制造方法，其中，包括：
(A)使以下述式(I)表示的化合物或其盐与抗体反应，生成以下述式(II)表示且具有针对抗体的亲和性物质及切割性部分的抗体或其盐；
(B)对所述具有针对抗体的亲和性物质及切割性部分的抗体或其盐的切割性部分进行切割，生成以下述式(IV)表示且具有生物正交性官能团的抗体或其盐；以及
(C)使所述具有生物正交性官能团的抗体或其盐与1种或2种以上的功能性物质反应，生成以下述式(V2)或下述式(V3)表示且具有功能性物质的抗体或其盐；
A-L-B-R (I)
式中，
A为针对抗体的亲和性物质，
L为切割性连接体，该切割性连接体为包含切割性部分的二价基团，
B为(a)包含生物正交性官能团的二价基团、或者(b)不含生物正交性官能团的二价基团，
R为针对所述抗体的反应性基团；
A-L-B-R'-T (II)
式中，
A、L和B与所述式(I)的A、L和B含义相同，
R'为通过抗体与反应性基团之间的反应而生成的部分，
T为抗体；
L1-B-R'-T (IV)
式中，
B、R'和T与所述式(II)的B、R'和T含义相同，
L1为(i')包含生物正交性官能团的一价基团、或者(ii')不含生物正交性官能团的一价基团；
F-L1'-B-R'-T (V2)
式中，
B、R'和T与所述式(IV)的B、R'和T含义相同，
L1'为包含通过功能性物质与(i')包含生物正交性官能团的一价基团之间的反应而生成的部分的二价基团，
F为功能性物质；
Fa-L1'-B'(-Fb)-R'-T (V3)
式中，
R'和T与所述式(IV)的R'和T含义相同，
L1'与所述式(V2)的L1'含义相同，
B'为包含通过功能性物质与生物正交性官能团之间的反应而生成的部分的三价基团，
Fa和Fb分别为相同或不同的功能性物质；
并且，针对抗体的亲和性物质为包含上述式1-1～1-9和式2-1中的任一氨基酸序列的肽。
发明的效果
(I)具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的本发明的化合物或其盐可用于例如抗体的区域选择性修饰。
(I)本发明的化合物或其盐、(II)(区域选择性地)具有针对抗体的亲和性物质及切割性部分的本发明的抗体或其盐、(III)(区域选择性地)具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分、功能性物质及抗体的本发明的复合物或其盐，可用作：例如用于制备(区域选择性地)具有生物正交性官能团的抗体或其盐、以及(区域选择性地)具有功能性物质的抗体或其盐的中间体。(区域选择性地)具有功能性物质的抗体或其盐可用作例如药物或者试剂(例如诊断药物、研究用试剂)。(区域选择性地)具有生物正交性官能团的抗体或其盐可用作：用于制备(区域选择性地)具有功能性物质的抗体或其盐的中间体。因此，(I)本发明的化合物或其盐、(II)本发明的抗体或其盐、以及(III)本发明的复合物或其盐，可用作例如药物或试剂的合成中间体。
附图的简单说明
图1-1是表示采用本发明的化合物[具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物:A-L-B-R(I)]的抗体的区域选择性修饰的概念(构思)的示意图(其一)。首先，本发明的化合物介以针对抗体的亲和性物质(A)与抗体(T)缔合。接着，本发明的化合物介以反应性基团(R)(图中为活性酯)与存在于亲和性物质和抗体的缔合部位附近的靶区中的特定氨基酸残基的侧链(图中为赖氨酸残基的侧链)反应，生成本发明的化合物与抗体的偶联物[区域选择性地具有包含针对抗体的亲和性物质及切割性部分的结构单元的抗体:A-L-B-R'-T(II)]。
图1-2是表示采用本发明的化合物的抗体的区域选择性修饰的概念的示意图(其二)。通过连接体(L)中的切割性部分的切割，生成以生物正交性官能团区域选择性地进行了修饰的抗体。
图1-3是表示采用本发明的化合物的抗体的区域选择性修饰的概念的示意图(其三)。通过生物正交性官能团与功能性物质(例如药物)的反应，生成以功能性物质位置特异性地进行了修饰的抗体。
图2是表示本发明的各发明的相关性的图(省略关于盐的表记)。反应(1)中，使具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物与抗体反应，生成具有针对抗体的亲和性物质及切割性部分的抗体。反应(2)中，使具有针对抗体的亲和性物质及切割性部分的抗体与功能性物质反应，生成具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分、功能性物质及抗体的复合物。反应(3)中，对具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分、功能性物质及抗体的复合物的切割性部分进行切割，生成具有功能性物质的抗体(这时，作为副产物生成亲和性物质的含有部分)。反应(4)中，对具有针对抗体的亲和性物质及切割性部分的抗体的切割性部分进行切割，生成具有生物正交性官能团的抗体(这时，作为副产物生成亲和性物质的含有部分)。反应(5)中，使具有生物正交性官能团的抗体与功能性物质反应，生成具有功能性物质的抗体。反应(2)和(5)可同样地进行。此外，反应(3)和(5)也可同样地进行。
图3是表示曲妥珠单抗(Trastuzumab)的重链中的Fc区域、及IgG1 Fc区域的共有氨基酸序列(SEQ ID NO:1)的图。
图4是表示(1)曲妥珠单抗的重链的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)、(2)将糖链用PNGase切割后的IgG1 Fc区域的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)、及(3)曲妥珠单抗的轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO:4)的图。
图5是表示曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC(Hydrophobic InteractionChromatography，疏水相互作用层析)-UPLC分析的结果(检测波长：UV280nm)的图(实施例1)。纵轴的AU表示吸光度(以下的附图中同样)。
图6是表示曲妥珠单抗的经胰蛋白酶消化的包含对赖氨酸残基的修饰部位(经受了采用碘乙酰胺的脲甲基化(Carbamidomethylation)的巯基(thiol)引入体(+145.019Da))的由33个氨基酸残基形成的肽THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISR(SEQ ID NO:6)的肽片段的MS谱(实测值:m/z 1269.30717，理论值:1269.30273，三价)的图(实施例2)。
图7-1是表示显示EU numbering中的人IgG重链的第248位的赖氨酸残基的修饰的对应于二价的y9的m/z 603.29(理论值:603.30)的产物离子的CID谱的图(实施例2)。
图7-2是表示对于曲妥珠单抗的胰蛋白酶消化产物，用Proteome Discoverer(赛默飞世尔科技公司)检索包含对赖氨酸残基的修饰(经受了采用碘乙酰胺的脲甲基化的巯基引入体(+145.019Da))的肽片段而得到的结果的图(实施例2)。横轴表示所鉴定的赖氨酸残基，纵轴表示肽匹配图谱(PSM，Peptide Spectrum Match)。其中，关于赖氨酸残基的残基编号，对于重链VH结构域和轻链上用序列中的编号(即，将N末端的氨基酸作为第1位，下同)表记，对于重链CH1、CH2、CH3结构域上用EU numbering表记。
图8是表示曲妥珠单抗的经Glu-C蛋白酶消化的包含对赖氨酸残基的修饰部位(经受了采用碘乙酰胺的脲甲基化的巯基引入体(+145.019Da))的由16个氨基酸残基形成的肽LLGGPSVFLFPPKPKD(SEQ ID NO:7)的肽片段的MS谱(实测值:m/z 619.67299，理论值:619.67112，三价)的图(实施例2)。
图9-1是表示显示EU numbering中的人IgG重链的第246位或第248位的赖氨酸残基的修饰的对应于一价的y5的m/z 729.49(理论值:729.36)的产物离子的CID谱的图(实施例2)。
图9-2是表示对于曲妥珠单抗的Glu-C蛋白酶消化产物，用Proteome Discoverer(赛默飞世尔科技公司)检索包含对赖氨酸残基的修饰(经受了采用碘乙酰胺的脲甲基化的巯基引入体(+145.019Da))的肽片段而得到的结果的图(实施例2)。横轴表示所鉴定的赖氨酸残基，纵轴表示肽匹配图谱(PSM，Peptide Spectrum Match)。其中，关于赖氨酸残基的残基编号，对于重链VH结构域和轻链上用序列中的编号表记，对于重链CH1、CH2、CH3结构域上用EUnumbering表记。
图10是表示曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析的结果(检测波长：UV280nm)的图(实施例3)。
图11是表示曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析的结果(检测波长：UV280nm)的图(实施例4)。
图12是表示曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析的结果(检测波长：UV280nm)的图(实施例5)。
图13是表示曲妥珠单抗的经胰蛋白酶消化的包含对赖氨酸残基的修饰部位(经受了采用碘乙酰胺的脲甲基化的巯基引入体(+145.019Da))的由33个氨基酸残基形成的肽THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISR(SEQ ID NO:6)的肽片段的MS谱(实测值:m/z 952.23170，理论值:952.22900，4价)的图(实施例6)。
图14-1是表示显示EU numbering中的人IgG重链的第246位或第248位的赖氨酸残基的修饰的对应于二价的y20的m/z 1166.88(理论值:1166.61)的产物离子的CID谱的图(实施例6)。
图14-2是表示对于曲妥珠单抗的胰蛋白酶消化产物，用Proteome Discoverer(赛默飞世尔科技公司)检索包含对赖氨酸残基的修饰(经受了采用碘乙酰胺的脲甲基化的巯基引入体(+145.019Da))的肽片段而得到的结果的图(实施例6)。横轴表示所鉴定的赖氨酸残基，纵轴表示肽匹配图谱(PSM，Peptide Spectrum Match)。其中，关于赖氨酸残基的残基编号，对于重链VH结构域和轻链上用序列中的编号表记，对于重链CH1、CH2、CH3结构域上用EUnumbering表记。
图15是表示曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析的结果(检测波长：UV280nm)的图(实施例7)。
图16是表示曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析的结果(检测波长：UV280nm)的图(实施例8)。
图17是表示曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析的结果(检测波长：UV280nm)的图(实施例9)。
图18是表示曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析的结果(检测波长：UV280nm)的图(实施例10)。
图19是表示曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析的结果(检测波长：UV280nm)的图(实施例11)。
图20是表示曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析的结果(检测波长：UV280nm)的图(实施例12)。
图21是表示曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析的结果(检测波长：UV280nm)的图(实施例13)。
图22是表示曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析的结果(检测波长：UV280nm)的图(实施例14)。
图23是表示曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析的结果(检测波长：UV280nm)的图(实施例15)。
图24是表示曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析的结果(检测波长：UV280nm)的图(实施例16)。
图25是表示曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析的结果(检测波长：UV280nm)的图(实施例17)。
图26是表示曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析的结果(检测波长：UV280nm)的图(实施例18)。
图27是表示曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析的结果(检测波长：UV280nm)的图(实施例19)。
图28是表示曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析的结果(检测波长：UV280nm)的图(实施例20)。
图29是表示曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析的结果(检测波长：UV280nm)的图(实施例21)。
图30是表示曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析的结果(检测波长：UV280nm)的图(实施例22)。
图31是表示曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析的结果(检测波长：UV280nm)的图(实施例23)。
图32是表示曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析的结果(检测波长：UV280nm)的图(实施例24)。
图33是表示曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析的结果(检测波长：UV280nm)的图(实施例25)。
图34是表示曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析的结果(检测波长：UV280nm)的图(实施例26)。
图35是表示曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析的结果(检测波长：UV280nm)的图(实施例27)。
图36是表示曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析的结果(检测波长：UV280nm)的图(实施例28)。
图37是表示曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析的结果(检测波长：UV280nm)的图(实施例29)。
图38是表示曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析的结果(检测波长：UV280nm)的图(实施例30)。
图39是表示曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析的结果(检测波长：UV280nm)的图(实施例31)。
图40是表示曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析的结果(检测波长：UV280nm)的图(实施例32)。
图41是表示曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析的结果(检测波长：UV280nm)的图(实施例33)。
图42是表示曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析的结果(检测波长：UV280nm)的图(实施例34)。
图43是表示曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析的结果(检测波长：UV280nm)的图(实施例35)。
图44是表示曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析的结果(检测波长：UV280nm)的图(实施例36)。
图45是表示曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析的结果(检测波长：UV280nm)的图(实施例37)。
图46是表示曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析的结果(检测波长：UV280nm)的图(实施例38)。
图47是表示曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析的结果(检测波长：UV280nm)的图(实施例39)。
图48是表示曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析的结果(检测波长：UV280nm)的图(实施例40)。
图49是表示曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析的结果(检测波长：UV280nm)的图(实施例41)。
图50是表示曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析的结果(检测波长：UV280nm)的图(实施例42)。
图51是表示曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析的结果(检测波长：UV280nm)的图(实施例43)。
图52是表示曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析的结果(检测波长：UV280nm)的图(实施例44)。
图53是表示曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析的结果(检测波长：UV280nm)的图(实施例45)。
图54是表示曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析的结果(检测波长：UV280nm)的图(实施例46)。
图55是表示曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析的结果(检测波长：UV280nm)的图(实施例47)。
图56是表示曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析的结果(检测波长：UV280nm)的图(实施例48)。
图57是表示曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析的结果(检测波长：UV280nm)的图(实施例49)。
图58是表示曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析的结果(检测波长：UV280nm)的图(实施例50)。
图59是表示曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析的结果(检测波长：UV280nm)的图(实施例51)。
图60是表示曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析的结果(检测波长：UV280nm)的图(实施例52)。
图61是表示曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析的结果(检测波长：UV280nm)的图(实施例53)。
图62是表示曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析的结果(检测波长：UV280nm)的图(实施例54)。
图63是表示曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析的结果(检测波长：UV280nm)的图(实施例55)。
图64是表示曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析的结果(检测波长：UV280nm)的图(实施例56)。
图65是表示曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析的结果(检测波长：UV280nm)的图(实施例57)。
图66是表示曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析的结果(检测波长：UV280nm)的图(实施例58)。
图67是表示曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析的结果(检测波长：UV280nm)的图(实施例59)。
图68是表示曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析的结果(检测波长：UV280nm)的图(实施例60)。
图69是表示曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析的结果(检测波长：UV280nm)的图(实施例61)。
图70是表示曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析的结果(检测波长：UV280nm)的图(实施例62)。
图71是表示曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析的结果(检测波长：UV280nm)的图(实施例63)。
图72是表示曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析的结果(检测波长：UV280nm)的图(实施例64)。
图73是表示曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析的结果(检测波长：UV280nm)的图(实施例65)。
图74是表示曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析的结果(检测波长：UV280nm)的图(实施例66)。
图75是表示曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析的结果(检测波长：UV280nm)的图(实施例67)。
图76是表示曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析的结果(检测波长：UV280nm)的图(实施例68)。
图77是表示曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析的结果(检测波长：UV280nm)的图(实施例69)。
图78是表示曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析的结果(检测波长：UV280nm)的图(实施例70)。
图79是表示曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析的结果(检测波长：UV280nm)的图(实施例71)。
图80是表示曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析的结果(检测波长：UV280nm)的图(实施例72)。
图81是表示曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析的结果(检测波长：UV280nm)的图(实施例73)。
图82是表示曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析的结果(检测波长：UV280nm)的图(实施例74)。
图83是表示曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析的结果(检测波长：UV280nm)的图(实施例75)。
图84是表示曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析的结果(检测波长：UV280nm)的图(实施例76)。
图85是表示曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析的结果(检测波长：UV280nm)的图(实施例77)。
图86是表示曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析的结果(检测波长：UV280nm)的图(实施例78)。
图87是表示曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析的结果(检测波长：UV280nm)的图(实施例79)。
图88是表示曲妥珠单抗的特异性修饰体的还原条件下的基于ESI-TOFMS分析的重链选择性的确认的图(实施例80)。
图89是表示曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析的结果(检测波长：UV280nm)的图(实施例80)。
图90是表示曲妥珠单抗/巯基引入体的特异性修饰体的还原条件下的基于ESI-TOFMS分析的重链选择性的确认的图(实施例80)。
图91是表示曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析的结果(检测波长：UV280nm)的图(实施例80)。
图92是表示曲妥珠单抗荧光标记体的还原条件下的基于ESI-TOFMS分析的重链选择性的确认的图(实施例80)。
图93是表示ADC mimic的还原条件下的基于ESI-TOFMS分析的重链选择性的确认的图(实施例80)。
图94是表示实施例80的结果汇总的图。
图95是表示曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析的结果(检测波长：UV280nm)的图(实施例81)。
图96是表示曲妥珠单抗的经胰蛋白酶消化的包含对赖氨酸残基的修饰部位(经受了采用碘乙酰胺的脲甲基化的巯基引入体(+145.019Da))的由33个氨基酸残基形成的肽THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISR(SEQ ID NO:6)的肽片段的MS谱(实测值:m/z1269.30359，理论值:1269.30273，三价)的图(实施例81)。
图97-1是表示显示EU numbering中的人IgG重链的第246位或第248位的赖氨酸残基的修饰的对应于一价的y9的m/z 1205.86(理论值:1205.60)的产物离子的CID谱的图(实施例81)。
图97-2是表示对于曲妥珠单抗的胰蛋白酶消化产物，用Proteome Discoverer(赛默飞世尔科技公司)检索包含对赖氨酸残基的修饰(经受了采用碘乙酰胺的脲甲基化的巯基引入体(+145.019Da))的肽片段而得到的结果的图(实施例81)。横轴表示所鉴定的赖氨酸残基，纵轴表示肽匹配图谱(PSM，Peptide Spectrum Match)。其中，关于赖氨酸残基的残基编号，对于重链VH结构域和轻链上用序列中的编号表记，对于重链CH1、CH2、CH3结构域上用EUnumbering表记。
图98是表示抗体-核酸偶联物的基于SDS-PAGE的分析结果的图(实施例82)。
图99是表示曲妥珠单抗/叠氮引入体的还原条件下的基于ESI-TOFMS分析的重链选择性的确认的图(实施例83)。
图100是表示ADC mimic的还原条件下的基于ESI-TOFMS分析的重链选择性的确认的图(实施例83)。
图101是表示曲妥珠单抗的特异性修饰体的还原条件下的基于ESI-TOFMS分析的重链选择性的确认的图(实施例84)。
图102是表示曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析的结果(检测波长：UV280nm)的图(实施例84)。
图103是表示曲妥珠单抗/叠氮引入体的特异性修饰体的还原条件下的基于ESI-TOFMS分析的重链选择性的确认的图(实施例84)。
图104是表示曲妥珠单抗/叠氮引入体的特异性修饰的HIC-UPLC分析的结果(检测波长：UV280nm)的图(实施例84)。
图105是表示曲妥珠单抗的经胰蛋白酶消化的包含对赖氨酸残基的修饰部位(叠氮羧酸引入体(+240.086))的由33个氨基酸残基形成的肽THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISR(SEQ ID NO:6)的肽片段的MS谱(实测值:m/z 1300.99241，理论值:m/z 1300.99173，三价)的图(实施例84)。
图106-1是表示显示EU numbering中的第246位或第248位的赖氨酸残基的修饰的对应于一价的y12的m/z 1622.92(理论值:1622.87)的产物离子的CID谱的图(实施例84)。
图106-2是表示对于曲妥珠单抗的胰蛋白酶消化产物，用Proteome Discoverer(赛默飞世尔科技公司)检索包含对赖氨酸残基的修饰(叠氮引入体(+255.097Da)、胺引入体(+229.106)、叠氮羧酸引入体(+240.086)、胺羧酸引入体(+214.095))的肽片段而得到的结果的图(实施例84)。横轴表示所鉴定的赖氨酸残基，纵轴表示肽匹配图谱(PSM，PeptideSpectrum Match)。其中，关于赖氨酸残基的残基编号，对于重链VH结构域和轻链上用序列中的编号表记，对于重链CH1、CH2、CH3结构域上用EU numbering表记。
图107是表示ADC mimic的还原条件下的基于ESI-TOFMS分析的重链选择性的确认的图(实施例85)。
图108是表示曲妥珠单抗/叠氮引入体的特异性修饰的HIC-UPLC分析(检测波长：UV280nm)的图(实施例85)。
图109是表示曲妥珠单抗的经胰蛋白酶消化的包含对赖氨酸残基的修饰部位(DBCO-Acid羧酸引入体(+559.207))的由33个氨基酸残基形成的肽THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISR(SEQ ID NO:6)的肽片段的MS谱(实测值:m/z 1055.77631，理论值:m/z1055.77600，4价)的图(实施例85)。
图110-1是表示显示EU numbering中的第246位或第248位的赖氨酸残基的修饰的对应于二价的y12的m/z 971.71(理论值:971.50)的产物离子的CID谱的图(实施例85)。
图110-2是表示对于曲妥珠单抗的胰蛋白酶消化产物，用Proteome Discoverer(赛默飞世尔科技公司)检索包含对赖氨酸残基的修饰(DBCO-Acid引入体(+574.218)、DBCO-Acid羧酸引入体(+559.207)、叠氮引入体(+255.097)、叠氮羧酸引入体(+240.086))的肽片段而得到的结果的图(实施例85)。横轴表示所鉴定的赖氨酸残基，纵轴表示肽匹配图谱(PSM，Peptide Spectrum Match)。其中，关于赖氨酸残基的残基编号，对于重链VH结构域和轻链上用序列中的编号表记，对于重链CH1、CH2、CH3结构域上用EU numbering表记。
图111是表示抗TNF-αIgG1抗体阿达木单抗(Adalimumab)的特异性修饰和基于ESI-TOFMS的分析的图(实施例86)。
图112是表示阿达木单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析(检测波长：UV280nm)的图(实施例86)。
图113是表示阿达木单抗/肽复合物的连接体切割的图(实施例86)。
图114是表示阿达木单抗/巯基引入体的HIC-UPLC分析(检测波长：UV280nm)的图(实施例86)。
图115是表示对阿达木单抗/巯基引入体的荧光标记的图(实施例86)。
图116是表示抗RANKL IgG2抗体地诺单抗(Denosumab)的特异性修饰和基于ESI-TOFMS的分析的图(实施例87)。
图117是表示地诺单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析(检测波长：UV280nm)的图(实施例87)。
图118是表示地诺单抗/肽复合物的连接体切割的图(实施例87)。
图119是表示地诺单抗/巯基引入体的HIC-UPLC分析(检测波长：UV280nm)的图(实施例87)。
图120是表示对地诺单抗/巯基引入体的荧光标记的图(实施例87)。
图121是表示抗IL-4/13受体IgG4抗体度匹鲁单抗(Dupilumab)的特异性修饰和基于ESI-TOFMS的分析的图(实施例88)。
图122是表示度匹鲁单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析(检测波长：UV280nm)的图(实施例88)。
图123是表示度匹鲁单抗/肽复合物的连接体切割的图(实施例88)。
图124是表示度匹鲁单抗/巯基引入体的HIC-UPLC分析(检测波长：UV280nm)的图(实施例88)。
图125是表示度匹鲁单抗荧光标记体的还原条件下的基于ESI-TOFMS分析的重链选择性的确认的图(实施例88)。
具体实施方式
1.包含针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物或其盐
1-1.概要
本发明提供以式(I)表示且包含针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物或其盐。
A-L-B-R (I)
式中，
A为针对抗体的亲和性物质，
L为切割性连接体，该切割性连接体为包含切割性部分的二价基团，
B为(a)包含生物正交性官能团的二价基团、或者(b)不含生物正交性官能团的二价基团，
R为针对所述抗体的反应性基团。
关于本发明所示出的式(I)及其他式中，-(连字符)表示存在于其两侧的2个单元共价结合(共价键合)。因此，式(I)中，A与L共价结合，L与A及B共价结合，B与L及R共价结合，R与B共价结合。
1-2.针对抗体的亲和性物质(A)
式(I)中，A为针对抗体的亲和性物质。亲和性物质是指对于抗体具有基于非共价结合的结合能力的物质。
本发明中所用的亲和性物质以抗体为目标。抗体可以是经生物分子(例如糖)修饰的蛋白质(例如糖蛋白)，也可以是未经生物分子修饰的蛋白质。作为抗体，可使用针对来源于生物的成分、来源于病毒的成分和环境中所发现的成分等任意的成分的任意的抗体，较好是针对来源于生物的成分或来源于病毒的成分的抗体。作为来源于生物的成分，可例举例如来源于哺乳动物、鸟类(例如鸡)等动物、昆虫、微生物、植物、菌类及鱼类的成分(例如蛋白质)。来源于生物的成分较好是来源于哺乳动物的成分。作为哺乳动物，可例举例如灵长类(例如人、猴、黑猩猩)、啮齿类(例如小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、兔)、玩赏动物(例如狗、猫)、家畜(例如牛、猪、山羊)、役用动物(例如马、绵羊)。来源于生物的成分更好是来源于灵长类或啮齿类的成分(例如蛋白质)，从本发明的临床应用的观点来看，进一步更好是来源于人的成分(例如蛋白质)。作为来源于病毒的成分，可例举例如来源于流感病毒(例如禽流感病毒、猪流感病毒)、艾滋病病毒、埃博拉病毒、噬菌体病毒的成分(例如蛋白质)。
此外，抗体为多克隆抗体或者单克隆抗体，较好是单克隆抗体。作为单克隆抗体，可例举例如嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、附加了规定糖链的抗体(例如以具有N型糖链结合共有序列等糖链结合共有序列的方式进行了改造的抗体)、双特异性抗体、scFv抗体、Fab抗体、F(ab')2抗体、VHH抗体、Fc区域蛋白、Fc融合蛋白。抗体还可以是2价的抗体(例如IgG、IgD、IgE)、或者4价以上的抗体(例如IgA抗体、IgM抗体)。
作为亲和性物质的目标的抗体还可由任意的氨基酸残基构成，较好是由通常构成蛋白质的天然的20种L-α-氨基酸残基构成。作为这样的氨基酸残基，可例举例如L-丙氨酸(A)、L-天冬酰胺(N)、L-半胱氨酸(C)、L-谷氨酰胺(Q)、L-异亮氨酸(I)、L-亮氨酸(L)、L-甲硫氨酸(M)、L-苯丙氨酸(F)、L-脯氨酸(P)、L-丝氨酸(S)、L-苏氨酸(T)、L-色氨酸(W)、L-酪氨酸(Y)、L-缬氨酸(V)、L-天冬氨酸(D)、L-谷氨酸(E)、L-精氨酸(R)、L-组氨酸(H)、或L-赖氨酸(K)、及甘氨酸(G)(以下省略L的表记)。抗体例如可由100个以上、较好是120个以上、更好是150个以上、进一步更好是180个以上、特别好是200个以上的氨基酸残基构成。抗体还可以是例如1000个以下，较好是900个以下，更好是800个以下，进一步更好是700个以下，特别好是600个以下。更具体来说，抗体例如可由100～1000个、较好是120～900个、更好是150～800个、进一步更好是180～700个、特别好是200～600个的氨基酸残基构成。抗体为抗体(例如上述的单克隆抗体)的情况下，上述个数的氨基酸残基可以相当于抗体的重链的氨基酸残基。
作为亲和性物质的目标的抗体还可以是在1个位置或多个位置(较好是多个位置)包含具有能与如后所述的反应性基团反应的侧链或末端(N末端和/或C末端)、较好是侧链的特定氨基酸残基的蛋白质。作为这样的特定氨基酸残基，可例举例如如后所述的14种氨基酸残基，较好是选自赖氨酸残基、酪氨酸残基、色氨酸残基及半胱氨酸残基中的氨基酸残基。如果考虑到本发明的化合物可区域选择性地修饰抗体，较好是在多个位置包含这样的特定氨基酸残基的抗体。作为多个位置，只要是2个以上的位置即可，无特别限定，例如可以是3个以上的位置，较好是5个以上的位置，更好是10个以上的位置，进一步更好是20个以上的位置，特别好是30个以上的位置。多个位置还例如可以是200个以下的位置，较好是180个以下的位置，更好是150个以下的位置，进一步更好是120个以下的位置，特别好是100个以下的位置。更具体来说，多个位置例如可以是3～200个位置，较好是5～180个位置，更好是10～150个位置，进一步更好是20～120个位置，特别好是30～100个位置。即使是这样的在多个位置包含特定氨基酸残基的抗体，本发明的化合物也可对存在于特定的一个位置的特定氨基酸残基区域选择性地进行修饰。例如，人IgG1的赖氨酸残基数一般被认为是70～90个左右，但也根据可变区中的氨基酸组成而不同。本发明中，成功实现了对存在于这样的人IgG1的特定位置的赖氨酸残基进行区域选择性修饰。
更具体来说，本发明中，从维持抗体的功能的同时(即，在不使抗体变性的情况下维持原有折叠的同时)，对存在于抗体中的特定位置的氨基酸残基进行修饰的观点来看，较好是露出于抗体表面的氨基酸残基的区域选择性修饰。例如，人IgG1等人IgG中，露出赖氨酸残基及露出酪氨酸残基存在于以下的位置(基于EU numbering，参照http://www.imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/Hu_IGHGnber.html)。其中，本申请中，为了便于说明，对于重链CH1、CH2、CH3结构域上用EU numbering表记，对于重链VH结构域和轻链上用序列中的编号(即，将N末端的氨基酸作为第1位)表记。
(1)露出赖氨酸残基
CH2结构域(246位、248位、274位、288位、290位、317位、320位、322位、338位)
CH3结构域(360位、414位、439位)
(2)露出酪氨酸残基
CH2结构域(278位、296位、300位)
CH3结构域(436位)
因此，人IgG1等人IgG在赖氨酸残基或酪氨酸残基被修饰的情况下，较好是位于上述位置的修饰。
较好是人IgG1等人IgG在赖氨酸残基或酪氨酸残基被修饰的情况下，上述(1)及(2)的位置中，可以是存在于对表面的露出性高的以下的位置的赖氨酸残基或酪氨酸残基被修饰。
(1')露出赖氨酸残基
CH2结构域(246位、248位、274位、288位、290位、317位、320位、322位)
CH3结构域(360位、414位、439位)
(2')露出酪氨酸残基
CH2结构域(278位、296位、300位)
CH3结构域(436位)
因此，人IgG1等人IgG在赖氨酸残基或酪氨酸残基被修饰的情况下，更好是位于上述位置的修饰。
更好是人IgG1等人IgG在赖氨酸残基被修饰的情况下，上述(1)的位置中，可以是存在于在本发明中可高效地进行修饰的CH2结构域中的规定位置(例如246位、248位、288位、290位、317位)的赖氨酸残基被修饰。
特定的实施方式中，作为亲和性物质的目标(靶标)的抗体在如上所述在多个位置包含特定氨基酸残基的情况下，可以是在由连续的1～50个氨基酸残基形成的靶区中包含1个以上的特定氨基酸残基，且在除所述靶区以外的非靶区中包含5个以上的特定氨基酸残基。靶区可以由较好是1～30个、更好是1～20个、进一步更好是1～10个、1～5个、或1～3个(即1个、2个、或3个)氨基酸残基形成。特别好是，靶区可以是由存在于特定位置的特定氨基酸残基形成的区域。这样的特定位置也根据目标蛋白质及亲和性物质的种类等而变动，例如可以是抗体的恒定区中的特定区域(例如CH1、CH2、CH3)中的特定位置，较好是抗体的CH2中的位置。更具体来说，靶区可以是人IgG Fc中的基于EU numbering的下述残基：
(1)Lys248残基(以下，本说明书中也略作“Lys248”，相当于人IgG CH2区域(SEQ IDNO:1)的第18位的残基)或者Lys246残基(以下，本说明书中也略作“Lys246”，相当于人IgGCH2区域(SEQ ID NO:1)的第16位的残基)；
(2)Lys288残基(以下，本说明书中也略作“Lys288”，相当于人IgG CH2区域(SEQ IDNO:1)的第58位的残基)或者Lys290残基(以下，本说明书中也略作“Lys290”，相当于人IgGCH2区域(SEQ ID NO:1)的第60位的残基)；
(3)Lys317残基(以下，本说明书中也略作“Lys317”，相当于人IgG CH2区域(SEQ IDNO:1)的第87位的残基)。
如果采用本发明，可对上述靶区中的特定氨基酸残基高度区域选择性地进行修饰。这样的区域选择性可以是例如30％以上，较好是40％以上，更好是50％以上，进一步更好是60％以上，特别好是70％以上、80％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、或100％以上。
靶区还可以是存在于特定位置的特定氨基酸残基在以该特定位置为中心时分别从N末端侧和C末端侧起到相隔a个氨基酸残基的位置为止的区域中，除存在于该特定位置的特定氨基酸残基以外，不含与特定氨基酸残基同种的氨基酸残基的区域；在此，a为1～10的任意的整数。a较好是1～5的整数，更好是1～3的整数，进一步更好是1或2，特别好是1。
优选的实施方式中，抗体为单克隆抗体。作为单克隆抗体等抗体的同型，可例举例如IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgM、IgA、IgD、IgE和IgY。单克隆抗体为全长抗体或者抗体片段(例如F(ab')2、Fab'、Fab、Fv、单链抗体)，较好是全长抗体。
抗体是针对任意抗原的抗体。例如，这样的抗原可以是如上所述的生物或病毒中所发现的成分。作为这样的抗原，还可例举例如蛋白质[包括寡肽、多肽。可以是经糖等生物分子修饰的蛋白质(例如糖蛋白)]、糖链、核酸、低分子化合物。
较好是抗体可为以蛋白质为抗原的抗体。作为蛋白质，可例举例如细胞膜受体、除细胞膜受体以外的细胞膜蛋白质(例如细胞外基质蛋白质)、配体、可溶性受体。
更具体来说，作为抗体的抗原的蛋白质可以是疾病靶向蛋白质。作为疾病靶向蛋白质，可例举例如以下的蛋白质。
(1)癌症领域
PD-L1、GD2、PDGFRα(血小板衍生生长因子受体)、CD22、HER2、磷脂酰丝氨酸(PS)、EpCAM、纤维连接蛋白、PD-1、VEGFR-2、CD33、HGF、gpNMB、CD27、DEC-205、叶酸受体、CD37、CD19、Trop2、CEACAM5、S1P、HER3、IGF-1R、DLL4、TNT-1/B、CPAAs、PSMA、CD20、CD105(内皮因子)、ICAM-1、CD30、CD16A、CD38、MUC1、EGFR、KIR2DL1,2,、NKG2A、肌腱蛋白C(tenascin-C)、IGF(胰岛素样生长因子，Insulin-like growth factor)、CTLA-4、间皮素(mesothelin)、CD138、c-Met、Ang2、VEGF-A、CD79b、ENPD3、叶酸受体α、TEM-1、GM2、Glypican-3、巨噬细胞迁移抑制因子(macrophage inhibitory factor)、CD74、Notch1、Notch2、Notch3、CD37、TLR-2、CD3、CSF-1R、FGFR2b、HLA-DR、GM-CSF、EphA3、B7-H3、CD123、gpA33、Frizzled7受体、DLL4、VEGF、RSPO、LIV-1、SLITRK6、结合素4(Nectin-4)、CD70、CD40、CD19、SEMA4D(CD100)、CD25、MET、组织因子(Tissue Factor)、IL-8、EGFR、cMet、KIR3DL2、Bst1(CD157)、P-钙粘蛋白、CEA、GITR、TAM(肿瘤相关巨噬细胞，tumor associated macrophage)、CEA、DLL4、Ang2、CD73、FGFR2、CXCR4、LAG-3、GITR、Fucosyl GM1、IGF-1、血管生成素2(Angiopoietin 2)、CSF-1R、FGFR3、OX40、BCMA、ErbB3、CD137(4-1BB)、PTK7、EFNA4、FAP、DR5、CEA、Ly6E、CA6、CEACAM5、LAMP1、组织因子(tissue factor)、EPHA2、DR5、B7-H3、FGFR4、FGFR2、α2-PI、A33、GDF15、CAIX、CD166、ROR1、GITR、BCMA、TBA、LAG-3、EphA2、TIM-3、CD-200、EGFRvIII、CD16A、CD32B、PIGF、Axl、MICA/B、Thomsen-Friedenreich、CD39、CD37、CD73、CLEC12A、Lgr3、转铁蛋白受体、TGFβ、IL-17、5T4、RTK、免疫抑制蛋白(Immune Suppressor Protein)、NaPi2b、路易斯血型B抗原、A34、赖氨酰氧化酶(Lysil-Oxidase)、DLK-1、TROP-2、整合素α9、TAG-72(CA72-4)、CD70
(2)自身免疫疾病-炎症性疾病
IL-17、IL-6R、IL-17R、INF-α、IL-5R、IL-13、IL-23、IL-6、ActRIIB、整合素β7(β7-Integrin)、IL-4αR、HAS、嗜酸性粒细胞趋化因子1(Eotaxin-1)、CD3、CD19、TNF-α、IL-15、CD3ε、纤维连接蛋白(Fibronectin)、IL-1β、IL-1α、IL-17、TSLP(胸腺基质淋巴细胞生成素，Thymic Stromal Lymphopoietin)、LAMP(整合素α4β7)、IL-23、GM-CSFR、TSLP、CD28、CD40、TLR-3、BAFF-R、MAdCAM、IL-31R、IL-33、CD74、CD32B、CD79B、IgE(免疫球蛋白E)、IL-17A、IL-17F、C5、FcRn、CD28、TLR4、MCAM、B7RP1、CXCR1,2配体、IL-21、钙粘蛋白11(Cadherin-11)、CX3CL1、CCL20、IL-36R、IL-10R、CD86、TNF-α、IL-7R、Kv1.3、整合素α9、LIFHT
(3)脑神经疾病
CGRP、CD20、β-淀粉样蛋白、β-淀粉样蛋白原纤维、降钙素基因相关肽受体(CalcitoninGene-Related Peptide Receptor)、LINGO(Ig Domain Containing1)、α突触核蛋白(synuclein)、细胞外tau、CD52、胰岛素受体、tau蛋白、TDP-43、SOD1、TauC3、JC病毒
(4)传染病
艰难梭菌毒素B(Clostridium Difficile toxin B)、巨细胞病毒、RS病毒、LPS、金黄色葡萄球菌α毒素(S.Aureus Alpha-toxin)、M2e蛋白、Psl、PcrV、金黄色葡萄球菌毒素(S.Aureus toxin)、甲型流感、藻蛋白酸盐(Alginate)、金黄色葡萄球菌、PD-L1、乙型流感、不动杆菌、F蛋白、Env、CD3、病原性大肠杆菌、克雷白氏杆菌、肺炎球菌
(5)遗传性-罕见疾病
淀粉样蛋白AL、SEMA4D(CD100)、胰岛素受体、ANGPTL3、IL4、IL13、FGF23、促肾上腺皮质激素、甲状腺素转运蛋白(transthyretin)、亨廷顿舞蹈病(huntingtin)
(6)眼部疾病
D因子、IGF-1R、PGDFR、Ang2、VEGF-A、CD-105(内皮因子,Endoglin)、IGF-1R、β淀粉样蛋白
(7)骨科-整形外科领域
硬骨素(Sclerostin)、肌抑素(Myostatin)、Dickkopf-1、GDF8、RNAKL、HAS、Siglec-15
(8)血液疾病
vWF、IXa因子、X因子、IFNγ、C5、BMP-6、铁转运蛋白(Ferroportin)、TFPI
(9)其他疾病
BAFF(B细胞活化因子，B cell activating factor)、IL-1β、PCSK9、NGF、CD45、TLR-2、GLP-1、TNFR1、C5、CD40、LPA、催乳素受体、VEGFR-1、CB1、内皮因子(Endoglin)、PTH1R、CXCL1、CXCL8、IL-1β、AT2-R、IAPP
更优选的实施方式中，针对抗体的亲和性物质为针对单克隆抗体的亲和性物质。单克隆抗体的同型，与关于抗体的上述内容相同，较好是IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)。较好是单克隆抗体为全长单克隆抗体。
进一步更优选的实施方式中，针对抗体的亲和性物质为针对作为全长单克隆抗体的嵌合抗体、人源化抗体、或人抗体(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4等IgG)的亲和性物质。
特别优选的实施方式中，针对抗体的亲和性物质为包含选自下述(A)～(C)中的任一种Fc区域蛋白质，且针对具有抗原结合能力的抗体的亲和性物质：
(A)包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的Fc区域蛋白质；
(B)包含在SEQ ID NO:1的氨基酸序列中插入、添加、缺失或取代1个或数个氨基酸残基而形成的氨基酸序列的Fc区域蛋白质；或者
(C)包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列显示90％以上的同一性的氨基酸序列的Fc区域蛋白质。
SEQ ID NO:1的氨基酸序列为Fc区域蛋白质。已知这样的Fc区域蛋白质具有分泌能力。因此，上述(A)～(C)的Fc区域蛋白质可具有分泌能力。此外，包含这样的Fc区域蛋白质的抗体可具有抗原结合能力。SEQ ID NO:1中的18位的氨基酸残基为任意的氨基酸残基，较好是中性氨基酸残基，更好是如后所述的具有非极性侧链的氨基酸残基，进一步更好是亮氨酸、异亮氨酸或丙氨酸，特别好是亮氨酸或丙氨酸。SEQ ID NO:1中的19位的氨基酸残基为任意的氨基酸残基，较好是中性氨基酸残基或酸性氨基酸残基，更好是具有非极性侧链的氨基酸残基或酸性氨基酸残基，进一步更好是亮氨酸或谷氨酸。SEQ ID NO:1中的21位的氨基酸残基为任意的氨基酸残基，较好是中性氨基酸残基，更好是具有非极性侧链的氨基酸残基，进一步更好是甘氨酸或丙氨酸。SEQ ID NO:1中的140位的氨基酸残基为任意的氨基酸残基，较好是酸性氨基酸残基，更好是谷氨酸或天冬氨酸。SEQ ID NO:1中的142位的氨基酸残基为任意的氨基酸残基，较好是中性氨基酸残基，更好是具有非极性侧链的氨基酸残基，进一步更好是甲硫氨酸、亮氨酸或异亮氨酸，特别好是甲硫氨酸或亮氨酸。SEQ IDNO:1中的177位的氨基酸残基为任意的氨基酸残基，较好是中性氨基酸残基，更好是如后所述的具有不带电的极性侧链的氨基酸残基或具有非极性侧链的氨基酸残基，进一步更好是苏氨酸、丙氨酸或甘氨酸，特别好是苏氨酸或丙氨酸。
优选的实施方式中，SEQ ID NO:1的氨基酸序列可以是由SEQ ID NO:2的氨基酸序列中的第220～449位的氨基酸残基形成的氨基酸序列。
另一优选的实施方式中，SEQ ID NO:1的氨基酸序列可以是由SEQ ID NO:3的氨基酸序列中的第7～236位的氨基酸残基形成的氨基酸序列。
特定的实施方式中，包含“含有如上所述的氨基酸序列的Fc区域蛋白质”的抗体可以是：包含“含有如上所述的氨基酸序列的Fc区域蛋白质”及“抗体的恒定区”的抗体。作为这样的抗体的恒定区，可以是嵌合抗体、人源化抗体、或人抗体(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4等IgG)的恒定区。
Fc区域蛋白质(B)中，1个或数个氨基酸残基可通过选自氨基酸残基的缺失、取代、添加及插入中的1、2、3或4种变异而改变。氨基酸残基的变异可被引入至氨基酸序列中的1个区域，也可被引入至多个不同的区域。术语“1个或数个”表示不会较大损害蛋白质活性的个数。术语“1个或数个”所示的数量例如为1～100个，较好是1～80个，更好是1～50个、1～30个、1～20个、1～10个或1～5个(例如1个、2个、3个、4个或5个)。
Fc区域蛋白质(C)中，与SEQ ID NO:1的氨基酸序列的同一性％可以是70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或99％以上。本发明中，肽或多肽(蛋白质)的同一性％的计算可通过算法blastp进行。更具体来说，多肽的同一性％的计算可使用NationalCenter for Biotechnology Information(NCBI)所提供的算法blastp中默认设定的评分参数(Matrix:BLOSUM62；Gap Costs:Existence＝11Extension＝1；CompositionalAdjustments:Conditional compositional score matrix adjustment)进行。此外，多核苷酸(基因)的同一性％的计算可通过算法blastn进行。更具体来说，多核苷酸的同一性％的计算可使用NCBI所提供的算法blastn中默认设定的评分参数(Match/Mismatch Scores＝1，-2；Gap Costs＝Linear)进行。
分泌能力中的分泌是与分泌蛋白的分泌(所谓的可溶性)同样的含义。因此，“具有分泌能力”是指与通常的抗体同样，作为抗体发挥作用。
上述包含Fc区域蛋白质的抗体，只要保持目标特性(例如分泌能力、抗原结合能力)，则可在特定的部位引入有变异。可保持目标特性的可引入变异的氨基酸残基的位置对本领域技术人员不言自明。具体来说，对于本领域技术人员而言，1)比较具有同种特性的多种蛋白质的氨基酸序列，2)明确相对保守(保存)的区域和相对不保守的区域，接着3)由相对保守的区域和相对不保守的区域可分别预测能发挥对于功能重要的作用的区域和不能发挥对于功能重要的作用的区域，所以能够识别结构及功能的相关性。因此，本领域技术人员能够对上述包含Fc区域蛋白质的抗体的氨基酸序列中可引入变异的氨基酸残基的位置进行特定。
氨基酸残基通过取代(置换)变异的情况下，氨基酸残基的取代可以是保守性取代。本说明书中使用的情况下，术语“保守性取代”是指，将规定的氨基酸残基用具有类似侧链的氨基酸残基进行取代。具有类似侧链的氨基酸残基的家族在该领域中周知。例如，作为这样的家族，可例举具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电的极性侧链的氨基酸(例如天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β位分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)、具有芳香族侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)、具有含羟基(例如醇性、酚性)的侧链的氨基酸(例如丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸)、及具有含硫的侧链的氨基酸(例如半胱氨酸、甲硫氨酸)。较好是氨基酸的保守性取代可以是天冬氨酸与谷氨酸之间的取代，精氨酸与赖氨酸与组氨酸之间的取代，色氨酸与苯丙氨酸之间的取代，苯丙氨酸与缬氨酸之间的取代，亮氨酸与异亮氨酸与丙氨酸之间的取代，以及甘氨酸与丙氨酸之间的取代。
作为包含选自上述(A)～(C)中的任一种Fc区域的抗体，可例举例如嵌合抗体(例如利妥昔单抗(Rituximab)、巴利昔单抗(Basiliximab)、英夫利昔单抗(Infliximab)、西妥昔单抗(Cetuximab)、司妥昔单抗(Siltuximab)、达妥昔单抗(Dinutuximab)、奥塔昔单抗(altertoxaximab))、人源化抗体(例如达利珠单抗(Daclizumab)、帕利珠单抗(Palivizumab)、曲妥珠单抗(Trastuzumab)、阿伦单抗(Alemtuzumab)、奥马珠单抗(Omalizumab)、依法利珠单抗(Efalizumab)、贝伐珠单抗(Bevacizumab)、那他珠单抗(Natalizumab)(IgG4)、托珠单抗(Tocilizumab)、依库珠单抗(Eculizumab)(IgG2)、莫加木珠单抗(Mogamulizumab)、帕妥珠单抗(Pertuzumab)、奥滨尤妥珠单抗(Obinutuzumab)、维多珠单抗(Vedolizumab)、派姆单抗(Pembrolizumab)(IgG4)、美泊利单抗(Mepolizumab)、埃罗妥珠单抗(Elotuzumab)、达雷木单抗(Daratumumab)、依奇珠单抗(Ixekizumab)(IgG4)、瑞利珠单抗(Reslizumab)(IgG4)、阿特珠单抗(Atezolizumab))、人抗体(例如阿达木单抗(Adalimumab)(IgG1)、帕尼单抗(Panitumumab)、戈利木单抗(Golimumab)、优特克单抗(Ustekinumab)、卡纳单抗(Canakinumab)、奥法木单抗(Ofatumumab)、地诺单抗(Denosumab)(IgG2)、伊匹单抗(Ipirimumab)、贝利木单抗(Belimumab)、雷昔库单抗(Raxibacumab)、雷莫芦单抗(Ramucirumab)、纳武单抗(Nivolumab)(IgG4)、苏金单抗(Secukinumab)、依伏库单抗(Evolocumab)(IgG2)、阿利珠单抗(Alirocumab)、耐昔妥珠单抗(Necitumumab)、布洛鲁单抗(Brodalumab)(IgG2)、奥拉单抗(Olaratumab))(未提及IgG型的情况下表示是IgG1)。
本发明中所用的针对抗体的亲和性物质为包含以下的任一氨基酸序列的肽：
式1-1:(X0-3)a-C-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-I-I-W-C-(X0-3)b(SEQ ID NO:58)
式1-2:(X0-3)a-C-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-I-V-W-C-(X0-3)b(SEQ ID NO:59)
式1-3:(X0-3)a-C-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-V-V-W-C-(X0-3)b(SEQ ID NO:60)
式1-4:(X0-3)a-C-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-A-V-W-C-(X0-3)b(SEQ ID NO:61)
式1-5:(X0-3)a-C-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-L-L-W-C-(X0-3)b(SEQ ID NO:62)
式1-6:(X0-3)a-C-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-L-I-W-C-(X0-3)b(SEQ ID NO:63)
式1-7:(X0-3)a-C-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-L-V-F-C-(X0-3)b(SEQ ID NO:64)
式1-8:(X0-3)a-C-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Q-V-W-C-(X0-3)b(SEQ ID NO:65)
式1-9:(X0-3)a-C-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-E-V-W-C-(X0-3)b(SEQ ID NO:66)，
式中，
(X0-3)a不存在、或者为1～3个连续的相同或不同的任意氨基酸残基(除赖氨酸残基和半胱氨酸残基以外)，
(X0-3)b不存在、或者为1～3个连续的相同或不同的任意氨基酸残基(除赖氨酸残基和半胱氨酸残基以外)，
Xaa1为丙氨酸残基、甘氨酸残基、亮氨酸残基、脯氨酸残基、精氨酸残基、缬氨酸残基、天冬酰胺残基、谷氨酸残基、或苯丙氨酸残基，
Xaa2为酪氨酸残基、色氨酸残基、组氨酸残基、或苯丙氨酸残基，
Xaa3为组氨酸残基、苯丙氨酸残基、酪氨酸残基、色氨酸残基、精氨酸残基、或甘氨酸残基，
Xaa4为赖氨酸残基，
Xaa5为甘氨酸残基、丝氨酸残基、天冬酰胺残基、谷氨酰胺残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、苯丙氨酸残基、酪氨酸残基、色氨酸残基、组氨酸残基、苏氨酸残基、亮氨酸残基、丙氨酸残基、缬氨酸残基、异亮氨酸残基、或精氨酸残基，
Xaa6为谷氨酰胺残基、谷氨酸残基、天冬酰胺残基、天冬氨酸残基、脯氨酸残基、甘氨酸残基、精氨酸残基、苯丙氨酸残基、或组氨酸残基；或者
式2-1：(X0-3')a-C-Xaa1'-Xaa2'-Xaa3'-Xaa4'-Xaa5'-Xaa6'-L-V-W-C-(X0-3')b(SEQID NO:67)，
式中，
(X0-3')a和(X0-3')b分别与所述(X0-3)a和(X0-3)b含义相同，
Xaa1'、Xaa2'、Xaa3'、Xaa4'、Xaa5'、Xaa6'分别与所述Xaa1、Xaa2、Xaa3、Xaa4、Xaa5、Xaa6含义相同，
但是，不包括(X0-3')a为1～3个氨基酸残基、(X0-3')b为1～3个氨基酸残基、Xaa3'为组氨酸残基、且Xaa5'为甘氨酸残基的情况。
(X0-3)a、(X0-3)b、(X0-3')a和(X0-3')b分别独立地不存在、或者为相同或不同的1～3个连续的任意的氨基酸残基(除赖氨酸残基和半胱氨酸残基以外)。因此，这样的任意的氨基酸残基为丙氨酸残基、天冬酰胺残基、谷氨酰胺残基、甘氨酸残基、异亮氨酸残基、亮氨酸残基、甲硫氨酸残基、苯丙氨酸残基、脯氨酸残基、丝氨酸残基、苏氨酸残基、色氨酸残基、酪氨酸残基、缬氨酸残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、精氨酸残基、或组氨酸残基。
特定的实施方式中，(X0-3)a可以不存在、或者为精氨酸残基-甘氨酸残基-天冬酰胺残基、天冬氨酸残基、天冬酰胺残基、甘氨酸残基-天冬酰胺残基、甘氨酸残基、甘氨酸残基-甘氨酸残基、或甘氨酸残基-甘氨酸残基-甘氨酸残基。
特定的实施方式中，(X0-3)b可以不存在、或者为苏氨酸残基-酪氨酸残基-组氨酸残基、苏氨酸残基、苏氨酸残基-酪氨酸残基、甘氨酸残基、甘氨酸残基-甘氨酸残基、或甘氨酸残基-甘氨酸残基-甘氨酸残基。
特定的实施方式中，以上述式1-1～1-9和式2-1表示的氨基酸序列中可以如下所示：
(X0-3)a不存在、或者为精氨酸残基-甘氨酸残基-天冬酰胺残基、天冬氨酸残基、或天冬酰胺残基，
(X0-3)b不存在、或者为苏氨酸残基-酪氨酸残基-组氨酸残基、或苏氨酸残基，
Xaa1为丙氨酸残基，
Xaa2为酪氨酸残基、色氨酸残基、或组氨酸残基，
Xaa6为谷氨酰胺残基、谷氨酸残基、天冬酰胺残基、或天冬氨酸残基。
另一特定的实施方式中，以上述式1-1～1-9和式2-1表示的氨基酸序列中可以如下所示：
(X0-3)a为甘氨酸残基-天冬酰胺残基、甘氨酸残基、甘氨酸残基-甘氨酸残基、或甘氨酸残基-甘氨酸残基-甘氨酸残基，
(X0-3)b为苏氨酸残基-酪氨酸残基、甘氨酸残基、甘氨酸残基-甘氨酸残基、或甘氨酸残基-甘氨酸残基-甘氨酸残基，
Xaa1为甘氨酸残基、亮氨酸残基、脯氨酸残基、精氨酸残基、缬氨酸残基、天冬酰胺残基、谷氨酸残基、或苯丙氨酸残基，
Xaa2为苯丙氨酸残基，
Xaa6为脯氨酸残基、甘氨酸残基、精氨酸残基、苯丙氨酸残基、或组氨酸残基。
以上述式1-1～1-9和式2-1表示的氨基酸序列中，Xaa3为组氨酸残基、苯丙氨酸残基、酪氨酸残基、色氨酸残基、精氨酸残基、或甘氨酸残基，较好是组氨酸残基。
以上述式1-1～1-9和式2-1表示的氨基酸序列中，Xaa5为甘氨酸残基、丝氨酸残基、天冬酰胺残基、谷氨酰胺残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、苯丙氨酸残基、酪氨酸残基、色氨酸残基、组氨酸残基、苏氨酸残基、亮氨酸残基、丙氨酸残基、缬氨酸残基、异亮氨酸残基、或精氨酸残基，较好是甘氨酸残基、苏氨酸残基、亮氨酸残基。
较好是，包含以上述式1-1～1-9和式2-1表示的任一氨基酸序列的肽为包含选自下述组的氨基酸序列的肽：
(1)RGNCAYHKGQIIWCTYH(SEQ ID NO:5)；
(2)RGNCAYHKGQIVWCTYH(SEQ ID NO:8)；
(3)RGNCAYHKGQVVWCTYH(SEQ ID NO:9)；
(4)RGNCAYHKGQAVWCTYH(SEQ ID NO:10)；
(5)RGNCAYHKGQLLWCTYH(SEQ ID NO:11)；
(6)RGNCAYHKGQLIWCTYH(SEQ ID NO:12)；
(7)DCAYHKGQIVWCT(SEQ ID NO:13)；
(8)DCAYHKGQVVWCT(SEQ ID NO:14)；
(9)DCAYHKGQAVWCT(SEQ ID NO:15)；
(10)RGNCAYHKSQIIWCTYH(SEQ ID NO:16)；
(11)RGNCAYHKNQIIWCTYH(SEQ ID NO:17)；
(12)RGNCAYHKDQIIWCTYH(SEQ ID NO:18)；
(13)RGNCAYHKQQIIWCTYH(SEQ ID NO:19)；
(14)RGNCAYHKEQIIWCTYH(SEQ ID NO:20)；
(15)RGNCAYHKFQIIWCTYH(SEQ ID NO:21)；
(16)RGNCAYHKYQIIWCTYH(SEQ ID NO:22)；
(17)RGNCAYHKWQIIWCTYH(SEQ ID NO:23)；
(18)RGNCAYHKHQIIWCTYH(SEQ ID NO:24)；
(19)RGNCAYHKTQIIWCTYH(SEQ ID NO:25)；
(20)RGNCAYHKLQIIWCTYH(SEQ ID NO:26)；
(21)CAYHKLQIVWC(SEQ ID NO:27)；
(22)CAYHKLQLIWC(SEQ ID NO:28)；
(23)CAYHKSQIVWC(SEQ ID NO:29)；
(24)RGNCAYHKGQLVFCTYH(SEQ ID NO:30)；
(25)RGNCAYHKGQQVWCTYH(SEQ ID NO:31)；
(26)RGNCAYHKGQEVWCTYH(SEQ ID NO:32)；
(27)CAYHKGQLVWC(SEQ ID NO:33)；
(28)RGNCAYHKAQLVWCTYH(SEQ ID NO:34)；
(29)RGNCAYHKVQLVWCTYH(SEQ ID NO:35)；
(30)RGNCAYHKLQLVWCTYH(SEQ ID NO:36)；
(31)RGNCAYHKIQLVWCTYH(SEQ ID NO:37)；
(32)RGNCAYHKSQLVWCTYH(SEQ ID NO:38)；
(33)RGNCAYHKTQLVWCTYH(SEQ ID NO:39)；
(34)RGNCAYHKNQLVWCTYH(SEQ ID NO:40)；
(35)RGNCAYHKDQLVWCTYH(SEQ ID NO:41)；
(36)RGNCAYHKQQLVWCTYH(SEQ ID NO:42)；
(37)RGNCAYHKEQLVWCTYH(SEQ ID NO:43)；
(38)RGNCAYHKFQLVWCTYH(SEQ ID NO:44)；
(39)RGNCAYHKRQLVWCTYH(SEQ ID NO:45)；
(40)RGNCAYHKHQLVWCTYH(SEQ ID NO:46)；
(41)RGNCAYHKWQLVWCTYH(SEQ ID NO:47)；
(42)RGNCAYHKYQLVWCTYH(SEQ ID NO:48)；
(43)RGNCAYFKGQLVWCTYH(SEQ ID NO:49)；
(44)RGNCAYYKGQLVWCTYH(SEQ ID NO:50)；
(45)RGNCAYWKGQLVWCTYH(SEQ ID NO:51)；
(46)RGNCAYRKGQLVWCTYH(SEQ ID NO:52)；
(47)RGNCAYGKGQLVWCTYH(SEQ ID NO:53)；
(48)DCAYHKGQLVWC(SEQ ID NO:54)；
(49)NCAYHKGQLVWC(SEQ ID NO:55)；
(50)CAYHKGQLVWCT(SEQ ID NO:56)；
(51)CAYHKSQLVWC(SEQ ID NO:57)；
(52)RGNCAWHKGQIIWCTYH(SEQ ID NO:68)；
(53)RGNCAFHKGQIIWCTYH(SEQ ID NO:69)；
(54)RGNCAHHKGQIIWCTYH(SEQ ID NO:70)；
(55)RGNCGYHKGQIIWCTYH(SEQ ID NO:71)；
(56)RGNCLYHKGQIIWCTYH(SEQ ID NO:72)；
(57)RGNCPYHKGQIIWCTYH(SEQ ID NO:73)；
(58)RGNCRYHKGQIIWCTYH(SEQ ID NO:74)；
(59)RGNCVYHKGQIIWCTYH(SEQ ID NO:75)；
(60)RGNCNYHKGQIIWCTYH(SEQ ID NO:76)；
(61)RGNCEYHKGQIIWCTYH(SEQ ID NO:77)；
(62)RGNCFYHKGQIIWCTYH(SEQ ID NO:78)；
(63)RGNCAYHKGEIIWCTYH(SEQ ID NO:79)；
(64)RGNCAYHKGNIIWCTYH(SEQ ID NO:80)；
(65)RGNCAYHKGPIIWCTYH(SEQ ID NO:81)；
(66)RGNCAYHKGGIIWCTYH(SEQ ID NO:82)；
(67)RGNCAYHKGDIIWCTYH(SEQ ID NO:83)；
(68)RGNCAYHKGRIIWCTYH(SEQ ID NO:84)；
(69)RGNCAYHKGFIIWCTYH(SEQ ID NO:85)；
(70)RGNCAYHKGHIIWCTYH(SEQ ID NO:86)；
(71)DCAYHKGQIIWCT(SEQ ID NO:87)；
(72)NCAYHKGQIIWCT(SEQ ID NO:88)；
(73)GNCAYHKGQIIWCTY(SEQ ID NO:89)；
(74)GCAYHKGQIIWCG(SEQ ID NO:90)；
(75)GGCAYHKGQIIWCGG(SEQ ID NO:91)；和
(76)GGGCAYHKGQIIWCGGG(SEQ ID NO:92)。
上述肽的各氨基酸序列中隔开的至少2个半胱氨酸残基可通过二硫键而形成环状肽。或者，上述肽中，2个半胱氨酸中的硫醚基(sulfide group)可通过以下所示的含羰基的连接体连接。
[化学式15]
Figure BDA0002827785710000521
上述所示的含羰基的连接体的虚线部分表示与硫醚基的结合部分。该连接体对于还原反应等比通常的二硫键更稳定。这样的肽可通过例如国际公开第2016/186206号中所记载的方法制备。
具有这样的特定结构的新型肽可用于人IgG Fc中基于Eu numbering的Lys248残基或Lys246残基、或者除Lys248残基或Lys246残基以外的其他氨基酸残基的区域选择性修饰(实施例)。构成上述肽的氨基酸为L体或D体中的任一种，但较好是L体(实施例中构成肽的氨基酸残基全部为L体)。
上述肽可通过交联剂对特定的氨基酸残基进行了修饰。作为这样的特定的氨基酸残基，可例举例如赖氨酸残基、天冬氨酸残基和谷氨酸残基，较好是赖氨酸残基。作为交联剂，可例举例如DSG(disuccinimidyl glutarate、双琥珀酰亚胺戊二酸酯)、DSS(disuccinimidyl suberate、双琥珀酰亚胺辛二酸酯)等的优选包含2个以上的琥珀酰亚胺基的交联剂，DMA(dimethyl adipimidate·2HCl、二亚胺代己二酸二甲酯二盐酸盐)、DMP(dimethyl pimelimidate·2HCl、庚二亚氨酸二甲酯二盐酸盐)、及DMS(dimethylsuberimidate·2HCl、辛二亚氨酸二甲酯二盐酸盐)等的优选包含2个以上的亚氨酸部分的交联剂，以及DTBP(dimethyl 3,3'-dithiobispropionimidate·2HCl、3,3'-二硫代双丙亚氨酸二甲酯二盐酸盐)及DSP(dithiobis(succinimidyl propionate)、二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯))等的具有SS键的交联剂(例如国际公开第2016/186206号)。
关于上述肽，位于末端的氨基和羧基可被保护。作为N-末端氨基的保护基，可例举例如烷基羰基(酰基)(例如乙酰基、丙氧基、叔丁氧基羰基等丁氧基羰基)、烷氧基羰基(例如芴基甲氧基羰基)、芳氧基羰基、芳基烷基(芳烷基)氧基羰基(例如苄氧基羰基)。作为N-末端氨基的保护基，较好是乙酰基。作为C-末端羧基的保护基，可例举例如可形成酯或酰胺的基团。作为可形成酯或酰胺的基团，可例举例如烷氧基(例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、戊氧基、己氧基)、芳氧基(例如苯氧基、萘氧基)、芳烷基氧基(例如苄氧基)、氨基。作为C-末端羧基的保护基，较好是氨基。
1-3.连接体(L)
式(I)中，L为作为包含切割性部分的二价基团的切割性连接体。
以L表示的切割性连接体为包含切割性部分的二价基团。切割性部分是可通过在不会引起蛋白质的变性、分解(例如酰胺键的断裂)的条件(温和条件)下的特定处理进行切割的位点。因此，切割性部分可以是通过在温和条件下的特定的切割处理进行切割的位点(除酰胺键以外的键)。作为这样的特定处理，可例举例如(a)采用选自酸性物质、碱性物质、还原剂、氧化剂、酶中的1种以上的物质的处理，(b)采用选自光的物理化学刺激进行的处理，或者(c)在使用包含可自体分解的切割性部分的切割性连接体的情况下进行的放置。这样的切割性连接体及其切割条件是该领域的技术常识(例如G.Leriche，L.Chisholm，A.Wagner，Bioorganic&Medicinal Chemistr y.20，571(2012)；Feng P.et al.，JounalofAmerican Chemical Societ y.132，1500(2010).；Bessodes M.et al.，Journal ofControlled Release，99，423(2004).；DeSimone，J.M.，Journal ofAmerican ChemicalSociety.132，17928(2010)；Thompson，D.H.，Journal of Controlled Release，91，187(2003)；Schoenmarks，R.G.，Journal ofControlled Release，95，291(2004))。作为这样的切割性部分，可例举例如二硫残基、缩醛残基、缩酮残基、酯残基、氨甲酰基残基、烷氧基烷基残基、亚胺残基、叔烷基氧基氨基甲酸酯残基(例如叔丁基氧基氨基甲酸酯残基)、硅烷残基、含有腙的残基(例如腙残基、酰基腙残基、双芳基腙残基)、氨基磷酸酯残基、乌头酰基残基、三苯甲基残基、偶氮残基、邻二醇残基、硒残基、含有具有吸电子基团的芳环的残基、含有香豆素的残基、含有砜的残基、含有不饱和键的链残基、糖基残基。
具有吸电子基团的芳环基较好是选自芳基、芳烷基、芳香族杂环基、具有芳香族杂环基的烷基中的具有芳环基的基团，更好是芳烷基、具有芳香族杂环基的烷基。吸电子基团较好是结合于环的2位。更优选地，含有具有吸电子基团的芳环的残基例如为在2位具有吸电子基团的芳烷基(例如苄基)。作为吸电子基团，可例举例如卤素原子、被卤素原子取代的烷基(例如三氟甲基)、硼酸残基、甲磺酰基、甲苯磺酰基、三氟甲磺酸盐或酯(三氟甲磺酰基)、硝基、氰基、苯基、酮基(例如酰基)。
作为与切割性部分的残基的名称相关被用作接头词、接尾词等术语的烷基、酰基(即，烷基羰基)、烷氧基(即，烷基氧基)、芳基、芳烷基等基团的定义、例子及优选例与后述相同。
作为酯残基，可例举例如由碳原子和氧原子构成的通常的酯残基[例如烷基酯(例如叔丁氧基羰基等叔烷基氧基羰基)、芳基酯(例如苯甲酰甲基酯、2-(二苯基膦)苯甲酸酯)、糖基酯残基、原酸酯残基]、含硫原子和氧原子的酯残基(例如α-硫代苯基酯残基、烷硫基酯残基等硫酯残基)、含磷原子和氧原子的酯残基(例如磷酸二酯残基、磷酸三酯残基)、活性酯残基(例如N-羟基琥珀酰亚胺残基)。
作为含有砜的残基，可例举例如砜残基、喹啉基苯磺酸酯残基。
硅烷残基较好是具有选自烷基、芳基、芳烷基和烷氧基中的基团的硅烷残基。作为这样的硅烷残基，可例举例如二烷基二烷氧基硅烷残基(例如二甲基二烷氧基硅烷、二乙基二烷氧基硅烷)、或者二芳基二烷氧基硅烷残基(例如二苯基二烷氧基硅烷)。
作为烷氧基烷基(即烷基氧基烷基)残基，是将后述的烷氧基和烷基组合而得的基团(烷氧基和烷基的定义、例子和优选例与后述相同)，可例举例如甲氧基甲基残基、乙氧基甲基残基、甲氧基乙基残基、乙氧基乙基残基，但并不仅限于这些例子。
含有不饱和键的链残基是包含仅由碳原子形成的不饱和键部分的残基(例如作为具有碳原子间双键的最小单元的乙烯基(vinyl/ethenyl)、或者作为具有碳原子间三键的最小单元的乙炔基(acetylenyl/ethynyl))、或者包含由碳原子和杂原子(例如氮原子、硫原子、氧原子)形成的不饱和键部分(例如醛、氰基)的残基。作为含有不饱和键的链残基，可例举例如乙烯基醚残基、氰基乙基残基、乙烯残基、丙二醛残基。
作为酸性物质(也称为亲电子试剂)，可例举例如盐酸、硫酸、硝酸等无机酸性物质，以及甲酸、乙酸、4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪丙磺酸、3-吗啉丙磺酸、磷酸二氢钠、柠檬酸、十二烷基硫酸、N-十二烷酰基肌氨酸、三氟乙酸等有机酸性物质。作为可通过酸性物质进行切割的位点，可例举例如烷氧基芳基烷基残基、叔烷基氧基氨基甲酸酯残基、缩醛残基、硅烷残基、亚胺残基、乙烯基醚残基、β-硫代丙酸酯残基、三苯甲基残基、腙残基、乌头酰基残基、原酸酯残基、氨甲酰基残基、2-(二苯基膦)苯甲酸酯残基。
作为碱性物质(也称为亲核试剂)，可例举例如氢氧化钠、氢氧化钾、乙酸钠、乙酸钾、乙酸铵等无机碱性物质，以及羟胺、三乙胺、N,N'-二异丙基胺等有机碱性物质。作为可通过碱性物质进行切割的位点，可例举例如硅烷残基、氰基乙基残基、砜残基、乙烯残基、糖基二琥珀酸酯残基、α-硫代苯基酯残基、不饱和乙烯基硫醚残基、丙二醛残基、酰基腙残基、烷硫基酯残基。
作为还原剂，可例举例如半胱氨酸、二硫苏糖醇、还原型谷胱甘肽、β-巯基乙醇。作为可通过还原剂进行切割的位点，可例举例如二硫残基、烷氧基烷基残基、偶氮残基。
作为氧化剂，可例举例如高碘酸钠、氧化型谷胱甘肽。作为可通过氧化剂进行切割的位点，可例举例如邻二醇残基、硒残基。
作为酶，可例举例如胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、TEV、凝血酶、组织蛋白酶B、组织蛋白酶D、组织蛋白酶K、半胱天冬酶、蛋白酶、基质金属蛋白酶、脂肪酶、内切糖苷酶、肽N糖苷酶F(PNGase F)。作为可通过酶进行切割的位点(部位)，可例举例如酯残基、磷酸二酯残基、糖基残基。
作为可通过光进行切割的位点，可例举例如2-硝基苄基残基、苯甲酰甲基酯残基、8-喹啉苯磺酸酯残基、香豆素残基、磷酸三酯残基、双芳基腙残基、Bimane二硫代丙酸残基(Bimane dithiopropionic acid residue)。
作为自体分解性的切割性部分，可例举例如活性酯残基(例如N-羟基琥珀酰亚胺残基)。
更具体来说，切割性部分可对应于选自下述组的任一化学结构。
[化学式16]
Figure BDA0002827785710000561
在此，与键正交的波浪线表示切割位点，
多个R2a、多个R2b和多个R2c相同或不同，选自氢原子或后述的取代基，
J为-CH2-、-O-或-S-，
r为1～4的任意的整数，
○(白色圆)表示与A(或后述的La)结合的键，●(黑色圆)表示与B(或后述的Lb)结合的键，
化学结构以切割位点为中心呈不对称的情况下，可以是●表示与A(或后述的La)结合的键，○表示与B(或后述的Lb)结合的键。
J为-CH2-、-O-或-S-。J较好是-CH2-或-O-，更好是-CH2-。
r为1～4的任意整数，较好是1～3的任意整数，更好是1或2。
一个实施方式中，切割性连接体可以是：
(i)切割性连接体，该切割性连接体是包含切割性部分的二价基团，该切割性部分具有通过切割而在反应性基团侧生成生物正交性官能团的能力；或者
(ii)切割性连接体，该切割性连接体是包含切割性部分的二价基团，该切割性部分不具有通过切割而在反应性基团侧生成生物正交性官能团的能力。
作为(i)的切割性部分，可例举例如二硫残基、酯残基、缩醛残基、缩酮残基、亚胺残基、邻二醇残基。
更具体来说，(i)的切割性部分可对应于例如选自下述组的任一化学结构。
[化学式17]
Figure BDA0002827785710000571
在此，与键正交的波浪线表示切割位点，
多个R2a相同或不同，选自氢原子或者后述的取代基，
○(白色圆)表示与A(或后述的La)结合的键，●(黑色圆)表示与B(或后述的Lb)结合的键，
化学结构以切割位点为中心呈不对称的情况下，可以是●表示与A(或后述的La)结合的键，○表示与B(或后述的Lb)结合的键。
作为(ii)的切割性部分，可例举例如酯残基、氨甲酰基残基、烷氧基烷基残基、亚胺残基、叔烷基氧基氨基甲酸酯残基、硅烷残基、含有腙的残基、氨基磷酸酯残基、乌头酰基残基、三苯甲基残基、偶氮残基、邻二醇残基、硒残基、含有具有吸电子基团的芳环的残基、含有香豆素的残基、含有砜的残基、含有不饱和键的链残基、糖基残基。
更具体来说，(ii)的切割性部分可对应于例如选自下述组的任一化学结构。
[化学式18]
Figure BDA0002827785710000581
在此，与键正交的波浪线表示切割位点，
多个R2b、多个R2c、J、r选自氢原子或后述的取代基，
○(白色圆)表示与A(或后述的La)结合的键，●(黑色圆)表示与B(或后述的Lb)结合的键，
化学结构以切割位点为中心呈不对称的情况下，可以是●表示与A(或后述的La)结合的键，○表示与B(或后述的Lb)结合的键。
特定的实施方式中，切割性连接体(L)可以下述式(L1)～(L3)中的任一个表示。
La-C-Lb (L1)
La-C (L2)
C-Lb (L3)
式中，
La和Lb分别为二价基团，
C为切割性部分。
作为二价基团，可例举例如可具有取代基的二价烃基、可具有取代基的二价杂环基、-C(＝O)-、-NRa-、-O-、-S-、-C(＝S)-、及它们的2个以上(例如2～8、较好是2～6、更好是2～4)的组合，Ra表示氢原子或取代基。
作为二价烃基，是直链、支链或环状的二价烃基，较好是直链或支链的二价烃基。作为二价烃基，可例举亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚芳基。
作为亚烷基，较好是碳原子数1～12的亚烷基，更好是碳原子数1～6的亚烷基，特别好是碳原子数1～4的亚烷基。上述碳原子数不包括取代基的碳原子数。亚烷基可以是直链、支链或环状中的任一种，较好是直链的亚烷基。作为这样的亚烷基，可例举例如亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基、亚戊基、亚己基。
作为亚烯基，较好是碳原子数2～12的亚烯基，更好是碳原子数2～6的亚烯基，特别好是碳原子数2～4的亚烯基。上述碳原子数不包括取代基的碳原子数。亚烯基可以是直链、支链或环状中的任一种，较好是直链的亚烯基。作为这样的亚烯基，可例举例如亚乙烯基、亚丙烯基、亚丁烯基、亚戊烯基、亚己烯基。
作为亚炔基，较好是碳原子数2～12的亚炔基，更好是碳原子数2～6的亚炔基，特别好是碳原子数2～4的亚炔基。上述碳原子数不包括取代基的碳原子数。亚炔基可以是直链、支链或环状中的任一种，较好是直链的亚炔基。作为这样的亚炔基，可例举例如亚乙炔基、亚丙炔基、亚丁炔基、亚戊炔基、亚己炔基。
作为亚芳基，较好是碳原子数6～24的亚芳基，更好是碳原子数6～18的亚芳基，进一步更好是碳原子数6～14的亚烷基，再进一步更好是碳原子数6～10的亚烷基。上述碳原子数不包括取代基的碳原子数。作为亚芳基，可例举例如亚苯基、亚萘基、亚蒽基。
二价杂环基是二价芳香族杂环基或者二价非芳香族杂环基。作为构成杂环的杂原子，较好是包括选自氧原子、硫原子、氮原子、磷原子、硼原子和硅原子中的1种以上，更好是包括选自氧原子、硫原子和氮原子中的1种以上。
作为二价芳香族杂环基，较好是碳原子数1～21的二价芳香族杂环基，更好是碳原子数1～15的二价芳香族杂环基，进一步更好是碳原子数1～9的二价芳香族杂环基，再进一步更好是碳原子数1～6的二价芳香族杂环基。上述碳原子数不包括取代基的碳原子数。更具体来说，作为二价芳香族杂环基，可例举例如吡咯二基、呋喃二基、噻吩二基、吡啶二基、哒嗪二基、嘧啶二基、吡嗪二基、三嗪二基、吡唑二基、咪唑二基、噻唑二基、异噻唑二基、噁唑二基、异噁唑二基、三唑二基、四唑二基、吲哚二基、嘌呤二基、蒽醌二基、咔唑二基、芴二基、喹啉二基、异喹啉二基、喹唑啉二基和酞嗪二基。
作为二价非芳香族杂环基，较好是碳原子数2～21的非芳香族杂环基，更好是碳原子数2～15的非芳香族杂环基，进一步更好是碳原子数2～9的非芳香族杂环基，再进一步更好是碳原子数2～6的非芳香族杂环基。上述碳原子数不包括取代基的碳原子数。更具体来说，作为二价非芳香族杂环基，可例举例如吡咯二酮二基、吡咯啉二酮二基、氧杂环丙烷二基、氮丙啶二基、氮杂环丁烷二基、氧杂环丁烷二基、硫杂环丁烷二基、吡咯烷二基、二氢呋喃二基、四氢呋喃二基、二氧戊环二基、四氢噻吩二基、吡咯啉二基、咪唑烷二基、噁唑烷二基、哌啶二基、二氢吡喃二基、四氢吡喃二基、四氢噻喃二基、吗啉二基、硫代吗啉二基、吡嗪二基、二氢噁嗪二基、四氢噁嗪二基、二氢嘧啶二基及四氢嘧啶二基。
以La和Lb表示的二价基团可具有例如1～5个、较好是1～3个、更好是1或2个取代基。这样的取代基与以上述Ra和Rb表示的取代基含义相同。作为这样的取代基，可例举例如以下的取代基：
(i)卤素原子，
(ii)一价烃基，
(iii)芳烷基，
(iv)一价杂环基，
(v)Rc-O-、Rc-C(＝O)-、Rc-O-C(＝O)-或Rc-C(＝O)-O-，Rc表示氢原子或一价烃基，或者
(vi)NRdRe-、NRdRe-C(＝O)-、NRdRe-C(＝O)-O-或Rd-C(＝O)-NRe-，Rd和Re相同或不同，表示氢原子或一价烃基，
(vii)硝基、硫酸基、磺酸基、氰基和羧基。
作为卤素原子，可例举例如氟原子、氯原子、溴原子、碘原子。
作为一价烃基，可例举例如一价链状烃基、一价脂环族烃基及一价芳香族烃基。
一价链状烃基是指仅由链状结构构成的烃基，主链不含环状结构。其中，链状结构可以是直链状，也可以是支链状。作为一价链状烃基，可例举例如烷基、烯基、炔基。烷基、烯基及炔基可以是直链状或支链状中的任一种。
作为烷基，较好是碳原子数1～12的烷基，更好是碳原子数1～6的烷基，进一步更好是碳原子数1～4的烷基。上述碳原子数不包括取代基的碳原子数。作为碳原子数1～12的烷基，可例举例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十二烷基。
作为烯基，较好是碳原子数2～12的烯基，更好是碳原子数2～6的烯基，进一步更好是碳原子数2～4的烯基。上述碳原子数不包括取代基的碳原子数。作为碳原子数2～12的烯基，可例举例如乙烯基、丙烯基、正丁烯基。
作为炔基，较好是碳原子数2～12的炔基，更好是碳原子数2～6的炔基，进一步更好是碳原子数2～4的炔基。上述碳原子数不包括取代基的碳原子数。作为碳原子数2～12的炔基，可例举例如乙炔基、丙炔基、正丁炔基。
作为一价链状烃基，较好是烷基。
作为一价脂环族烃基，是指作为环结构仅含脂环族烃且不含芳环的烃基，脂环族烃可以是单环、多环中的任一种。其中，不需要仅由脂环族烃构成，其一部分可含链状结构。作为一价脂环族烃基，可例举例如环烷基、环烯基、环炔基，这些基团可以是单环、多环中的任一种。
作为环烷基，较好是碳原子数3～12的环烷基，更好是碳原子数3～6的环烷基，进一步更好是碳原子数5～6的环烷基。上述碳原子数不包括取代基的碳原子数。作为碳原子数3～12的环烷基，可例举例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基。
作为环烯基，较好是碳原子数3～12的环烯基，更好是碳原子数3～6的环烯基，进一步更好是碳原子数5～6的环烯基。上述碳原子数不包括取代基的碳原子数。作为碳原子数3～12的环烯基，可例举例如环丙烯基、环丁烯基、环戊烯基、环己烯基。
作为环炔基，较好是碳原子数3～12的环炔基，更好是碳原子数3～6的环炔基，进一步更好是碳原子数5～6的环炔基。上述碳原子数不包括取代基的碳原子数。作为碳原子数3～12的环炔基，可例举例如环丙炔基、环丁炔基、环戊炔基、环己炔基。
作为一价脂环族烃基，较好是环烷基。
一价芳香族烃基是指含芳环结构的烃基。其中，不需要仅由芳环构成，其一部分可含链状结构或脂环族烃，芳环可以是单环、多环中的任一种。作为一价芳香族烃基，较好是碳原子数6～12的芳基，更好是碳原子数6～10的芳基，进一步更好是碳原子数6的芳基。上述碳原子数不包括取代基的碳原子数。作为碳原子数6～12的芳基，可例举例如苯基、萘基。
作为一价芳香族烃基，较好是苯基。
其中，作为一价烃基，较好是烷基、环烷基、芳基，更好是烷基。
芳烷基是指芳基烷基。芳基烷基中的芳基和烷基的定义、例子和优选例如上所述。作为芳烷基，较好是碳原子数3～15的芳烷基。作为这样的芳烷基，可例举例如苯甲酰基、苯乙基、萘甲基、萘乙基。
一价杂环基是指从杂环式化合物的杂环除去1个氢原子而得的基团。一价杂环基是一价芳香族杂环基或者一价非芳香族杂环基。作为构成杂环基的杂原子，较好是包括选自氧原子、硫原子、氮原子、磷原子、硼原子和硅原子中的1种以上，更好是包括选自氧原子、硫原子和氮原子中的1种以上。
作为一价芳香族杂环基，较好是碳原子数1～15的芳香族杂环基，更好是碳原子数1～9的芳香族杂环基，进一步更好是碳原子数1～6的芳香族杂环基。上述碳原子数不包括取代基的碳原子数。作为一价芳香族杂环基，可例举例如吡咯基、呋喃基、噻吩基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、三嗪基、吡唑基、咪唑基、噻唑基、异噻唑基、噁唑基、异噁唑基、三唑基、四唑基、吲哚基、嘌呤基、蒽醌基、咔唑基、芴基、喹啉基、异喹啉基、喹唑啉基和酞嗪基。
作为一价非芳香族杂环基，较好是碳原子数2～15的非芳香族杂环基，更好是碳原子数2～9的非芳香族杂环基，进一步更好是碳原子数2～6的非芳香族杂环基。上述碳原子数不包括取代基的碳原子数。作为一价非芳香族杂环基，可例举例如氧杂环丙烷基、氮丙啶基、氮杂环丁烷基、氧杂环丁烷基、硫杂环丁烷基、吡咯烷基、二氢呋喃基、四氢呋喃基、二氧戊环基、四氢噻吩基、吡咯啉基、咪唑烷基、噁唑烷基、哌啶基、二氢吡喃基、四氢吡喃基、四氢噻喃基、吗啉基、硫代吗啉基、哌嗪基、二氢噁嗪基、四氢噁嗪基、二氢嘧啶基及四氢嘧啶基。
其中，作为一价杂环基，较好是5元或6元的杂环基。
优选地，取代基可以是以下的基团：
(i')卤素原子，
(ii')碳原子数1～12的烷基、苯基或萘基，
(iii')碳原子数3～15的芳烷基，
(iv')5元或6元的杂环，
(v')Rc-O-、Rc-C(＝O)-、Rc-O-C(＝O)-或Rc-C(＝O)-O-，Rc表示氢原子或碳原子数1～12的烷基，或者
(vi')NRdRe-、NRdRe-C(＝O)-、NRdRe-C(＝O)-O-或Rd-C(＝O)-NRe-，Rd和Re相同或不同，表示氢原子或碳原子数1～12的烷基，
(vii')与上述(vii)中列举的基团相同的基团。
更优选地，取代基可以是以下的基团：
(i”)卤素原子，
(ii”)碳原子数1～12的烷基，
(iii”)Rc-O-、Rc-C(＝O)-、Rc-O-C(＝O)-或Rc-C(＝O)-O-，Rc表示氢原子或碳原子数1～12的烷基，或者
(iv”)NRdRe-、NRdRe-C(＝O)-、NRdRe-C(＝O)-O-或Rd-C(＝O)-NRe-，Rd和Re相同或不同，表示氢原子或碳原子数1～12的烷基，
(v”)与上述(vii)中列举的基团相同的基团。
进一步更优选地，取代基可以是以下的基团：
(i”')卤素原子，
(ii”')碳原子数1～6的烷基，
(iii”')Rc-O-、Rc-C(＝O)-、Rc-O-C(＝O)-或Rc-C(＝O)-O-，Rc表示氢原子或碳原子数1～6的烷基，或者
(iv”')NRdRe-、NRdRe-C(＝O)-、NRdRe-C(＝O)-O-或Rd-C(＝O)-NRe-，Rd和Re相同或不同，表示氢原子或碳原子数1～6的烷基，
(v”')与上述(vii)中列举的基团相同的基团。
特别优选地，取代基可以是以下的基团：
(i””)卤素原子，
(ii””)碳原子数1～4的烷基，
(iii””)Rc-O-、Rc-C(＝O)-、Rc-O-C(＝O)-或Rc-C(＝O)-O-，Rc表示氢原子或碳原子数1～4的烷基，或者
(iv””)NRdRe-、NRdRe-C(＝O)-、NRdRe-C(＝O)-O-或Rd-C(＝O)-NRe-，Rd和Re相同或不同，表示氢原子或碳原子数1～4的烷基，
(v””)与上述(vii)中列举的基团相同的基团。
特定的实施方式中，La和Lb可分别以下述(La')和(Lb')表示。
[化学式19]
Figure BDA0002827785710000631
式中，
p和p'相同或不同，为0～10的任意的整数，
q和q'相同或不同，为0～10的任意的整数，
X和X'相同或不同，为碳原子、氮原子或单键，在此，X为氮原子的情况下，R1b不存在，X'为氮原子的情况下，R1b'不存在，X为单键的情况下，R1a和R1b不存在，X'为单键的情况下，R1a'和R1b'不存在，
R1a、R1b、R1a'和R1b'相同或不同，选自氢原子或者上述的取代基。
p和p'相同或不同，为0～10的任意整数，较好是0～8的整数，更好是0～6的整数，进一步更好是0～4的整数，特别好是0、1或2。较好是p和p'相同。
q和q'相同或不同，为0～10的任意整数，较好是0～8的整数，更好是0～6的整数，进一步更好是0～4的整数，特别好是0、1或2。较好是q和q'相同。
X和X'相同或不同，为碳原子、氮原子或单键，较好是碳原子或单键。较好是X和X'相同。
R1a、R1b、R1a'和R1b'相同或不同，选自氢原子或者后述的取代基。取代基的定义、例子和优选例如上所述。较好是R1a、R1b、R1a'和R1b'为氢原子。
1-4.(a)包含生物正交性官能团的二价基团或者(b)不含生物正交性官能团的二价基团(B)
式(I)中，B为(a)包含生物正交性官能团的二价基团、或者(b)不含生物正交性官能团的二价基团。
生物正交性官能团是指不会与生物构成成分(例如氨基酸、核酸、脂质、糖、磷酸)反应，或者与生物构成成分的反应速度慢，但选择性地与除生物构成成分以外的成分反应的基团。生物正交性官能团在该技术领域中周知(参照例如Sharpless K.B.等,Angew.Chem.Int.Ed.40,2004(2015)；Bertozzi C.R.等,Science 291,2357(2001)；Bertozzi C.R.等,Nature Chemical Biology 1,13(2005))。
亲和性物质的目标为抗体的情况下，生物正交性官能团是针对蛋白质的生物正交性官能团。针对蛋白质的生物正交性官能团是指不与构成蛋白质的天然的20种氨基酸残基的侧链反应，而与规定的官能团反应的基团。构成蛋白质的天然的20种氨基酸为丙氨酸(A)、天冬酰胺(N)、半胱氨酸(C)、谷氨酰胺(Q)、甘氨酸(G)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、苯丙氨酸(F)、脯氨酸(P)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y)、缬氨酸(V)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、精氨酸(R)、组氨酸(H)、及赖氨酸(L)。这些天然的20种氨基酸中，无侧链(即为氢原子)的甘氨酸以及侧链为烃基(即，侧链不含选自硫原子、氮原子和氧原子中的杂原子)的丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸及缬氨酸对于通常的反应呈惰性。因此，针对蛋白质的生物正交性官能团是，与“具有对于通常的反应呈惰性的侧链的这些氨基酸的侧链”不会发生反应，并且与天冬酰胺、谷氨酰胺、甲硫氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、组氨酸及赖氨酸的侧链也不会发生反应的官能团。
作为与蛋白质不会发生反应的这样的生物正交性官能团，可例举例如叠氮残基、醛残基、硫醇残基、烯烃残基(换言之，具有作为具有碳原子间双键的最小单元的乙烯基部分即可，下同)、炔烃残基(换言之，具有作为具有碳原子间三键的最小单元的乙炔基部分即可，下同)、卤素残基、四嗪残基、硝酮残基、羟胺残基、腈残基、肼残基、酮残基、硼酸残基、氰基苯并噻唑残基、烯丙基残基、膦残基、马来酰亚胺残基、二硫残基、硫酯基、α-卤化羰基残基(例如在α位具有氟原子、氯原子、溴原子或碘原子的羰基残基，下同)、异腈残基、斯德酮残基、硒残基。作为蛋白质，存在可含游离的巯基(thiol)(半胱氨酸)的蛋白质(例如除抗体以外的蛋白质)和不会含游离的巯基的蛋白质(例如抗体)。不会含游离的巯基的蛋白质中，巯基可起到生物正交性官能团的作用。因此，作为亲和性物质的目标为不会含游离的巯基的抗体，因而生物正交性官能团中含巯基。可1种或2种以上(例如2种、3种、4种)生物正交性官能团含于二价基团，较好是1种生物正交性官能团含于二价基团。
一个实施方式中，包含生物正交性官能团的二价基团为主链中包含选自叠氮残基、醛基、硫醇残基、炔烃残基、烯烃残基、四嗪残基、硝酮残基、羟胺残基、腈残基、肼残基、酮残基、硼酸残基、氰基苯并噻唑残基、烯丙基残基、膦残基、马来酰亚胺残基、二硫残基、硫酯残基、α-卤代羰基残基、异腈残基、斯德酮残基、硒残基中的生物正交性官能团的二价基团。
另一个实施方式中，包含生物正交性官能团的二价基团为侧链中包含选自叠氮残基、醛残基、硫醇残基、炔烃残基、烯烃残基、卤素残基、四嗪残基、硝酮残基、羟胺残基、腈残基、肼残基、酮残基、硼酸残基、氰基苯并噻唑残基、烯丙基残基、膦残基、马来酰亚胺残基、二硫残基、α-卤代羰基残基、异腈残基、斯德酮残基、硒残基中的生物正交性官能团的二价基团。
更具体来说，生物正交性官能团可对应于选自下述组的任一化学结构。
[化学式20]
Figure BDA0002827785710000661
式中，
R1f、一个或多个R1g和一个或多个R1h相同或不同，为选自所述(i)～(vii)中的原子或基团、或者吸电子基团，
·表示键。
作为吸电子基团，可例举例如上述的例子，较好是卤素原子、硼酸残基、甲磺酰基、甲苯磺酰基、三氟甲磺酸盐或酯。
一个实施方式中，B可以是(a)包含生物正交性官能团的二价基团。二价基团所含的生物正交性官能团的数量为一个或多个，例如为1～5个，较好是1～3个，更好是1或2个，进一步更好是1个。二价基团所含的生物正交性官能团的数量为多个的情况下，多个生物正交性官能团可以为同种，也可以为不同种，但从采用简单的结构等的观点来看，较好是同种。
特定的实施方式中，B可以是(a1)主链中包含生物正交性官能团的二价基团。主链中包含生物正交性官能团的二价基团为，将选自叠氮残基、醛基、硫醇残基、炔烃残基、烯烃残基、四嗪残基、硝酮残基、羟胺残基、腈残基、肼残基、酮残基、硼酸残基、氰基苯并噻唑残基、烯丙基残基、膦残基、马来酰亚胺残基、二硫残基、硫酯残基、α-卤代羰基残基、异腈残基、斯德酮残基、硒残基中的生物正交性官能团作为二价基团的基团，或者在这样的二价生物正交性官能团的任一方的末端或两端连接有上述的二价基团的基团。待连接的二价基团的定义、例子和优选例与上述的二价基团相同。
另一特定的实施方式中，B可以是(a2)侧链中包含生物正交性官能团的二价基团。侧链中包含生物正交性官能团的二价基团为，被选自叠氮残基、醛残基、硫醇残基、炔烃残基、烯烃残基、卤素残基、四嗪残基、硝酮残基、羟胺残基、腈残基、肼残基、酮残基、硼酸残基、氰基苯并噻唑残基、烯丙基残基、膦残基、马来酰亚胺残基、二硫残基、α-卤代羰基残基、异腈残基、斯德酮残基、硒残基中的生物正交性官能团或者包含其的基团取代的二价基团。待取代的二价基团的定义、例子和优选例与上述的二价基团相同。
另一个实施方式中，B可以是(b)不含生物正交性官能团的二价基团。这样的二价基团可以是可取代的亚烷基、可取代的亚环烷基、可取代的芳基、可取代的二价杂环基、-NRa-、-O-及由这些基团中的2个以上(例如2～8个、较好是2～6个、更好是2～4个)的组合形成的基团，Ra表示氢原子或取代基。可取代的情况下的取代基及Ra的取代基为除生物正交性官能团以外的取代基。作为这样的取代基，可例举例如烷基、环烷基、芳烷基、一价杂环基、羟基、氨基、烷基氧基(烷氧基)、环烷基氧基、芳烷基氧基。这样的取代基的数量例如为1～5个，较好是1～3个，更好是1或2个，进一步更好是1个。
对于除生物正交性官能团以外的取代基，烷基、环烷基、芳烷基、一价杂环基的定义、例子和优选例如上所述。
对于除生物正交性官能团以外的取代基，烷基氧基(烷氧基)中的烷基、环烷基氧基中的环烷基和芳烷基氧基中的芳烷基的定义、例子和优选例如上所述。更具体来说，作为烷氧基，可例举例如甲氧基、乙氧基、丙氧基(例如正丙氧基、异丙氧基)、丁氧基(例如正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基)、戊氧基(例如正戊氧基)、己氧基(例如正己氧基)。作为环烷基氧基，可例举例如环丙氧基、环丁氧基、环戊氧基、环己氧基。作为芳烷基氧基，可例举例如苯甲酰氧基、苯乙氧基、萘甲氧基、萘乙氧基。
不含生物正交性官能团的二价基团还可以是对反应高度惰性的基团。因此，这样的二价基团可以是仅由碳原子和氢原子构成的基团。这样的二价基团是亚烷基、亚环烷基或芳基以及这些基团中的2个以上(例如2或3个)的组合形成的基团。不含生物正交性官能团的二价基团为对反应高度惰性的基团的情况下，这样的二价基团可具有选自亚烷基、亚环烷基和芳基中的取代基作为对反应高度惰性的取代基。对反应高度惰性的取代基的数量例如为1～5个，较好是1～3个，更好是1或2个。
特定的实施方式中，B可以下述式(B-1)表示。
[化学式21]
Figure BDA0002827785710000671
式中，
Y为-NH-、-O-、-CH2-或下述式(B-2)，
[化学式22]
Figure BDA0002827785710000681
式(B-2)中，
V和V'相同或不同，为-NH-、-O-、-CH2-或单键，
V1为(a)包含生物正交性官能团的二价基团、或者(b)不含生物正交性官能团的二价基团，
s为0～10的任意的整数，
式(B-2)中的○和●分别为与式(B-1)中的○和●同样的取向，
Z为氧原子、硫原子或氢原子，Z为氢原子的情况下，-C(＝Z)-表示-CH2-，
式(B-1)中的○(白色圆)表示与L侧的部分结合的键，●(黑色圆)表示与R侧的部分结合的键。
Y为-NH-、-O-、-CH2-或以上述式(B-2)表示的基团。从结构简化等观点来看，Y可以是-NH-、-O-或-CH2-。或者，从以碳原子为基调的结构的设计等观点来看，Y可以是-CH2-或以上述式(B-2)表示的基团。
Z为氧原子、硫原子或氢原子，较好是氧原子或硫原子。
V和V'为-NH-、-O-、-CH2-或单键，较好是-CH2-或单键。
V1为(a)包含生物正交性官能团的二价基团、或者(b)不含生物正交性官能团的二价基团。这样的二价基团与上述的二价基团含义相同。
较好是V1中的二价基团为可取代的二价烃基或者可取代的二价杂环基。二价烃基的定义、例子及优选例与上述相同，V1的情况下，较好是亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚环烷基、亚环烯基、亚环炔基、亚芳基。例如，未被含有生物正交性官能团的部分取代的情况下，较好是亚烯基、亚炔基、亚环烯基、亚环炔基。另一方面，被含有生物正交性官能团的部分取代的情况下，较好是亚烷基、亚环烷基、亚芳基。这些基团的例子和优选例如上所述。二价杂环基的定义、例子及优选例与上述相同，V1的情况下，较好是5元或6元的杂环基。5元或6元的杂环基的例子及优选例与上述相同。取代基的定义、例子和优选例如上所述。V1可具有例如1～5个、较好是1～3个、更好是1个或2个、进一步更好是1个的(a)生物正交性官能团。二价基团所含的生物正交性官能团的数量为多个的情况下，多个生物正交性官能团可以为同种，也可以为不同种。从采用简单的结构和提高反应性等观点来看，较好是同种。从确保差异化的反应等观点来看，较好是不同种。V1还可具有1～5个、较好是1～3个、更好是1或2个的(b)取代基。
s为0～10的任意整数，较好是0～8的整数，更好是0～6的整数，进一步更好是0～4的整数，特别好是0、1或2。
另外，特定的实施方式中，V1可以是具有以下述式(B-3)表示的基团作为侧链的二价基团。
[化学式23]
Figure BDA0002827785710000691
式中，
G和G'相同或不同，为-NH-、-O-、-CH2-、单键或以下述式(B-4)表示的基团，
[化学式24]
Figure BDA0002827785710000692
式(B-4)中，
W和W'相同或不同，为-NH-、-O-、-CH2-或单键，
W1为(a)包含生物正交性官能团的二价基团、或者(b)不含生物正交性官能团的二价基团，
t为0～10的任意的整数，
式(B-4)中的○(白色圆)表示对于式(B-3)中的键(·)的方向的键(结合)，●(黑色圆)表示对于b侧方向的键；
H为-CH2-、-C＝O-、-C＝S-、-NH-或单键；
I为二价烃基、二价杂环或单键；
b为下述所示的任一基团，
[化学式25]
Figure BDA0002827785710000701
式中，
R1f、一个或多个R1g和一个或多个R1h相同或不同，为选自所述(i)～(vii)中的原子或基团、或者吸电子基团，
·表示键。这样的二价基团是二价烃基或二价杂环基，较好是可取代的二价烃基，更好是亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚环烷基、亚环烯基、亚环炔基或亚芳基，进一步更好是亚烷基、亚环烷基或亚芳基，特别好是亚烷基。这些基团的例子和优选例如上所述。这些基团可被除上述侧链以外的取代基取代。这样的取代基的数量为1～5个，较好是1～3个，更好是1或2个。取代基的例子和优选例如上所述。
G和G'相同或不同，为-NH-、-O-、-CH2-、单键或以上述式(B-4)表示的基团。从结构简化等观点来看，G和G'可以是-NH-、-O-、-CH2-或单键。或者，从以碳原子为基调的结构的设计等观点来看，G和G'可以是-CH2-、单键或者以上述式(B-4)表示的基团。
H为-CH2-、-C＝O-、-C＝S-、-NH-或单键。较好是H为-CH2-或单键。
I为二价烃基、二价杂环或单键。二价烃基和二价杂环可被取代基取代，也可未被取代。二价烃基、二价杂环和取代基的定义、例子及优选例与以上的V1中记载的相同。
W和W'相同或不同，为-NH-、-O-、-CH2-或单键，较好是-CH2-或单键。
W1为(a)包含生物正交性官能团的二价基团、或者(b)不含生物正交性官能团的二价基团。这样的二价基团与上述的二价基团含义相同。
t为0～10的任意整数，较好是0～8的整数，更好是0～6的整数，进一步更好是0～4的整数，特别好是0、1或2。
1-5.反应性基团(R)
式(I)中，R为针对抗体的反应性基团。这样的反应性基团在该技术领域中是技术常识。
反应性基团是与生物正交性官能团同种或不同种的基团。
例如，B为(a)包含生物正交性官能团的二价基团的情况下，反应性基团可以是与该生物正交性官能团不同种的基团。这是因为如果反应性基团是与生物正交性官能团同种的基团，则无法确保针对抗体的反应性基团的反应特异性。此外原因还在于，原本生物正交性官能团就是不会与构成抗体的天然的20种氨基酸残基的侧链发生反应的基团。
更具体来说，构成蛋白质的如上所述的天然的20种氨基酸中，无侧链的甘氨酸以及侧链为烃基的丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸及缬氨酸对于通常的反应呈惰性。因此，针对蛋白质的反应性基团是可与天冬酰胺、谷氨酰胺、甲硫氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、组氨酸及赖氨酸这14种氨基酸中的任意1种或2种以上(例如2种、3种、4种)的侧链反应的基团。根据蛋白质的氨基酸组成等条件，以式(I)表示的化合物中可包含1种或2种以上(例如2种、3种、4种)的反应性基团，较好是以式(I)表示的化合物中可包含1种反应性基团。
优选地，反应性基团为可与构成蛋白质的如上所述的14种氨基酸中的任意1种氨基酸的侧链反应的基团。
更优选地，反应性基团可以是对于赖氨酸、酪氨酸、色氨酸或半胱氨酸中的任意1种氨基酸的侧链具有特异性的反应性基团。
进一步更优选地，反应性基团可以是对于赖氨酸、酪氨酸或色氨酸中的任意1种氨基酸的侧链具有特异性的反应性基团。
此外，蛋白质为人IgG1等人IgG的情况下，反应性基团较好是对于赖氨酸或酪氨酸的侧链具有特异性的反应性基团。
对于赖氨酸残基的侧链具有特异性的反应性基团是可与存在于赖氨酸残基的侧链中的氨基(NH2)特异性反应的基团，可例举例如活性酯残基(例如N-羟基琥珀酰亚胺残基)、乙烯基砜残基、磺酰氯残基、异氰酸酯残基、异硫氰酸酯残基、醛残基、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸残基、2-亚氨基-2-甲氧基乙基残基、重氮对苯二甲酸残基。
作为通过“对于赖氨酸残基的侧链具有特异性的上述的反应性基团”与“存在于赖氨酸残基的侧链中的氨基(NH2)”之间的反应而生成的连接部分，可例举例如酰胺残基、脲残基、吡啶残基、氨基甲酸酯残基、磺酰胺残基。
更具体来说，对于赖氨酸残基的侧链具有特异性的反应性基团可对应于选自下述组的任一化学结构。
[化学式26]
Figure BDA0002827785710000721
在此，
R5a及R5c为氢原子或上述的取代基，
R5b为吸电子基团，
j为1～5的任意的整数，
k为1～4的任意的整数。
R5a及R5c为氢原子或上述的取代基。取代基的定义、例子和优选例与上述相同。
R5b为吸电子基团。作为这样的吸电子基团，可例举例如上述的例子，较好是卤素原子、硼酸残基、甲磺酰基、甲苯磺酰基、三氟甲磺酸盐或酯。
j为1～5的任意的整数，较好是1～3的整数，更好是1或2。
k为1～4的任意的整数，较好是1～3的整数，更好是1或2。
通过“作为对于赖氨酸残基的侧链具有特异性的反应性基团的上述化学结构”与“存在于赖氨酸残基的侧链中的氨基(NH2)”之间的反应而生成的连接部分，可对应于选自下述组中的任一化学结构。
[化学式27]
Figure BDA0002827785710000731
在此，●(黑色圆)表示与T侧的部分结合的键，○(白色圆)表示与B侧的部分结合的键，与键正交的直线表示通过反应而生成的键(结合)。
对于酪氨酸残基的侧链具有特异性的反应性基团是可与存在于酪氨酸残基的侧链中的酚式羟基(OH)的邻位原子特异性反应的基团，可例举例如重氮残基、偶氮二甲酸酯残基、2,3-二氢-1H-吡嗪-6-酮残基。
更具体来说，对于酪氨酸残基的侧链具有特异性的反应性基团可对应于选自下述组中的任一化学结构。
[化学式28]
Figure BDA0002827785710000732
在此，R4a为氢原子或上述的取代基，○表示与B结合的键。
R4a为氢原子或上述的取代基。取代基的定义、例子和优选例与上述相同。
通过“作为对于酪氨酸残基的侧链具有特异性的反应性基团的上述化学结构”与“存在于酪氨酸残基的侧链中的酚式羟基(OH)的邻位原子”之间的反应而生成的连接部分，可对应于选自下述组中的任一化学结构。
[化学式29]
Figure BDA0002827785710000733
在此，R4a为氢原子或上述的取代基，●表示与T结合的键，○表示与B结合的键。
R4a为氢原子或上述的取代基。取代基的定义、例子和优选例与上述相同。
对于色氨酸残基的侧链具有特异性的反应性基团是可与存在于色氨酸残基的侧链中的吲哚基的3位的成环原子特异性反应的基团，可例举例如9-氮杂双环[3.3.1]壬-3-酮-N-氧基自由基残基。
更具体来说，对于色氨酸残基的侧链具有特异性的反应性基团可对应于选自下述组的任一化学结构。
[化学式30]
Figure BDA0002827785710000741
在此，○表示与B结合的键。
通过“作为对于色氨酸残基的侧链具有特异性的反应性基团的上述化学结构”与“存在于色氨酸残基的侧链中的吲哚基的3位的成环原子”之间的反应而生成的连接部分，可对应于选自下述组中的任一化学结构。
[化学式31]
Figure BDA0002827785710000742
在此，●表示与T结合的键，○表示与B结合的键。
特别好地，反应性基团可以是对于赖氨酸的侧链具有特异性的反应性基团。
1-6.部分结构“L-B”
1-6-1.连接A和R的部分结构“L-B”中的主链的长度
式(I)中，连接A(亲和性物质)和R(反应性基团)的主链(L-B中的直链部分)的长度，可根据抗体和亲和性物质的种类、及抗体中的亲和性物质的目标部位与R欲反应结合的如上所述的靶区(例如特定位置)中的特定氨基酸残基的位置及数量的关系等各种因素而适当进行设计。关于以式(I)表示的化合物，亲和性物质与抗体缔合，接着，介以L-B与亲和性物质共价结合的反应性基团通过与存在于上述目标部位附近的特定氨基酸残基的侧链中的基团(例如赖氨酸残基的侧链中的氨基)反应，从而与抗体共价结合。这时，R欲反应结合的特定氨基酸残基的附近区域、上述目标部位的附近区域、及该特定氨基酸残基与上述目标部位之间的区域中不另外存在该特定氨基酸残基的情况下，即使不严格控制主链的长度，反应性基团也可与该特定氨基酸侧链区域选择性地结合。当然，即使是这样的区域中另外存在该特定氨基酸残基的情况下，通过控制主链的长度，反应性基团也可与该特定氨基酸残基区域选择性地结合。
连接A和R的主链的长度可根据抗体及针对其的亲和性物质的种类、以及抗体中的目标部位中的特定氨基酸残基的位置及数量的关系等因素而改变，但可以是约
Figure BDA0002827785710000751
以上，较好是约
Figure BDA0002827785710000752
更好是约
Figure BDA0002827785710000753
以上。这样的主链的长度例如为约
Figure BDA0002827785710000754
以下，较好是约
Figure BDA0002827785710000755
以下，更好是约
Figure BDA0002827785710000756
以下。更具体来说，这样的主链的长度例如为约
Figure BDA0002827785710000757
较好是约
Figure BDA0002827785710000758
更好是约
Figure BDA0002827785710000759
另外，关于原子间的长度(距离)的关系，如下表所示的内容为该技术领域中的技术常识。因此，如果是本领域技术人员，可将下表的原子间的长度作为参考，适当设计具有与如上所述的主链的长度
Figure BDA00028277857100007510
对应的个数的原子的主链。
[表1]
表1.直链亚烷基中的两末端的碳原子间的长度(距离)的关系
Figure BDA00028277857100007511
更具体来说，连接A和R的主链的长度也可按照构成主链(除氢原子及取代基外)的原子数规定。构成主链的原子数例如可以是4个(约
Figure BDA00028277857100007512
)以上，较好是6个(约
Figure BDA00028277857100007513
)以上，更好是8个(约
Figure BDA00028277857100007514
)以上。此外，主链的原子数例如可以是20个(约
Figure BDA00028277857100007515
)以下，较好是16个(约
Figure BDA00028277857100007516
)以下，更好是12个(约
Figure BDA00028277857100007517
)以下。更具体来说，主链的原子数例如可以是4～20个，较好是6～16个，更好是8～12个。
主链为不含环结构的结构的情况下，主链的原子数可通过计数链状结构中的原子数来决定。
另一方面，主链为含环结构的结构的情况下，主链的原子数与上述的长度并不一定对应，存在可根据主链的原子数规定的长度比上述的长度短的倾向。即使是这样的情况下，从规定主链的长度的观点来看，可简便地计数主链的原子数。具体来说，这样的情况下的主链的原子数可通过在主链中不含二价环结构的链状结构中的原子数的基础上，再计数连通环结构中的2个键的最短路径的原子数来决定(参照例如以下的(a)～(d)中的粗体路径)。
[化学式32]
Figure BDA0002827785710000761
·表示键。
(a)的情况下，最短路径为粗体(粗体字)路径，因此作为主链的原子数计数的二价环结构中的原子数为2。
(b)的情况下，最短路径为粗体路径，因此作为主链的原子数计数的二价环结构中的原子数为3。
(c)的情况下，所有路径均为最短路径(等距离)，因此作为主链的原子数计数的二价环结构中的原子数为4。
(d)的情况下，稠合部位的路径为最短路径，因此作为主链的原子数计数的二价环结构中的原子数为4。
优选地，以L-B表示的A与R的连接部分(不包括侧链)可以是不含二价环结构的链状结构。该情况下，可按照以L-B表示的A与R的连接链部分中不含二价环基的条件适当设计L和B。
1-6-2.部分结构“L-B”的具体结构
上述式(I)中，L和B为可相互关联的结构。因此，上述式(I)中，L和B可作为以“L-B”表示的部分结构规定。
一个实施方式中，切割性连接体可以是(i)作为包含具有通过切割在反应性基团侧生成生物正交性官能团的能力的切割性部分的二价基团的切割性连接体、或者(ii)作为包含不具有通过切割在反应性基团侧生成生物正交性官能团的能力的切割性部分的二价基团的切割性连接体。
特定的实施方式中，L为上述(i)的切割性连接体的情况下，B为(a)包含生物正交性官能团的二价基团、或者(b)不含生物正交性官能团的二价基团。
优选地，L为上述(i)的切割性连接体的情况下，B为(a)包含生物正交性官能团的二价基团。该情况下，(i)中所生成的生物正交性官能团与(a)中的生物正交性官能团可以为同种，也可以为不同种。从采用更简单的结构和/或提高对于单一的功能性物质的反应性等观点来看，(i)中所生成的生物正交性官能团可与(a)中的生物正交性官能团为同种。另一方面，从确保对于2种以上的功能性物质的差别化的反应性、以及不使用反应中的一部分生物正交性官能团等观点来看，(i)中所生成的生物正交性官能团可与(a)中的生物正交性官能团为不同种。
或者，L为上述(i)的切割性连接体的情况下，B可以是(b)不含生物正交性官能团的二价基团。该情况下，以式(I)表示的化合物或其盐具有更简单的结构，所以合成容易。
另一特定的实施方式中，L为上述(ii)的切割性连接体的情况下，B为(a)包含生物正交性官能团的二价基团。
特定的实施方式中，以L-B表示的部分结构较好是不含肽部分。该情况下，使用本发明的化合物得到的本发明的具有功能性物质的抗体(例如抗体药物复合物)具有不会包含可具有免疫原性的肽部分作为连接体的优点。
特定的实施方式中，以“L-B”表示的部分结构，可将存在于连接A和R的主链(L-B中的直链部分)的中心位置的原子(例如构成主链的原子数为奇数的情况)、或者存在于该主链的中心位置的结合部位(例如构成主链的原子数为偶数的情况)作为基准，具有对称结构[例如顺式(即Z)、反式(即E)]。例如，也可将存在于中心位置的结合部位设计为如上所述的切割连接体中的切割性部分。以“L-B”表示的部分结构具有对称结构的情况下，以“L-B”表示的部分结构可容易地合成。例如，可通过使在一侧末端具有能够反应而形成切割性部分的官能团的同样的二价基团(例如在一侧末端具有SH基的链状二价基团)相互反应，从而实现在主链的中心位置包含切割性部分的对称结构(链状的二价基团-S-S-链状的二价基团)。
因此，以“L-B”表示的部分结构可以是以“B2-L'-B1”表示的部分结构(即，L为以B2-L'表示的二价基团，B为B1)。该情况下，以上述式(I)表示的化合物可规定为以下述式(I')表示的化合物；
A-B2-L'-B1-R (I')
式中，
A和R与所述式(I)的A和R含义相同，
L'为切割性连接体，该切割性连接体为包含切割性部分的二价基团，
B1和B2相同或不同，为(a)包含生物正交性官能团的二价基团、或者(b)不含生物正交性官能团的二价基团，
B1和B2可具有以L'为中心的对称结构。
B1和B2相同或不同，与B的定义、例子和优选例相同。
特定的实施方式中，L'可以下述式(L1')～(L3')中的任一个表示。
La'-C'-Lb' (L1')
La'-C' (L2')
C'-Lb' (L3')
式中，
La'和Lb'分别为二价基团，
C'为切割性部分。
以La'和Lb'表示的二价基团分别与以La和Lb表示的二价基团的定义、例子和优选例相同。
以C'表示的切割性部分与以C表示的切割性部分的定义、例子和优选例相同。
另一特定的实施方式中，以L-B表示的结构单元可以下述式(LB')表示。
[化学式33]
Figure BDA0002827785710000781
式中，
C、p、p'、q、q'、X、X'、R1a、R1a'、R1b、R1b'、Y、Y'、Z和Z'的定义、例子和优选例与上述相同，
○(白色圆)表示与A结合的键，●(黑色圆)表示与R结合的键。
因此，上述式(I)可规定以下述式(I”)。
[化学式34]
Figure BDA0002827785710000782
式中，
A、R、C、p、p'、q、q'、X、X'、R1a、R1b、R1a'、R1b'、Y、Y'、Z和Z'的定义、例子和优选例与上述相同。
上述式(LB')和(I")中，从C＝Z中的C(碳原子)至C＝Z'中的C(碳原子)的长度与连接A和R的主链的长度相同。这些式中，从C＝Z中的C至C＝Z'中的C的长度也可按照构成连接C＝Z中的C至C＝Z'中的C的部分结构的连接链(除氢原子及取代基外)的原子数规定。这样的原子数与构成连接A和R的主链的原子数相同。连接C＝Z中的C至C＝Z'中的C的部分结构的连接链(除氢原子及取代基外)可包含环结构，也可不包含环结构，但较好是不包含环结构。该连接链(除氢原子及取代基外)可优选不含肽部分。
1-7.制造方法
包含针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物或其盐可适当地进行制备。包含针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物以式(I)、较好是式(I')、更好是式(I”)表示。
作为亲和性物质，可适当选择具有任意的官能团的物质。因此，通过利用可与该官能团反应的反应性基团，使亲和性物质与以L-B-R表示的结构单元、或者以R-L-B-R表示的结构单元(2个反应性基团相同或不同)反应，可制备以A-L-B-R表示的结构单元。例如，这样的反应可在适当的反应体系、例如有机溶剂体系或水溶液体系中在适当温度(例如约15～200℃)下进行。反应体系可包含适当的催化剂。反应时间例如为1分钟～20小时，较好是10分钟～15小时，更好是20分钟～10小时，进一步更好是30分钟～8小时。
反应体系中，以L-B-R表示的结构单元、或者以R-L-B-R表示的结构单元(Y)相对于亲和性物质(X)的摩尔比(Y/X)，根据该结构单元及亲和性物质的种类、待通过该结构单元修饰的亲和性物质中的部位的数量等而变动，所以无特别限定，例如为0.1～50，较好是0.5～40，更好是1～35，进一步更好是2～25，特别好是3～15。
包含针对抗体的亲和性物质和切割性部分的抗体或其盐的生成的确认，虽也依赖于其具体的原料及产物的分子量，但可通过例如电泳法、色谱法(例如凝胶过滤层析法、离子交换色谱法、反相柱色谱法、HPLC)或质谱分析进行，较好是通过质谱分析进行。包含针对抗体的亲和性物质及切割性部分的抗体或其盐可通过色谱法(例如上述的色谱法及亲和色谱法)等任意的方法适当纯化。
1-8.其他
后述的发明[例如式(II)～(v)及其下位概念的式、以及部分结构式(例如(L1)～(L3)、(La')、(Lb')、(B-1)～(B-4))表示的发明]中，任意的符号(例如A、L、B、R)、以该符号表示的术语及它们的详细说明(例如定义、例子及优选例)与以上述式(I)表示的化合物或其盐的发明共通。此外，对于可规定后述发明的特定部分(例如切割性部分、具有通过切割在反应性基团侧生成生物正交性官能团的能力的部分)、特定基团(例如生物正交性官能团、二价基团、烷基、取代基、吸电子基团)及特定数值以及盐等任意的技术要素(例如定义、例子及优选例)，也可与上文中说明的内容共通。因此，在无特别说明的情况下，这些事项可在后述的发明中适当援引。同样地，后述的发明中记述的特定的发明的技术要素可作为本发明及其他发明的技术要素适当援引。
2.包含针对抗体的亲和性物质及切割性部分的抗体或其盐
2-1.概要
本发明提供以式(II)表示的包含针对抗体的亲和性物质及切割性部分的抗体或其盐。
A-L-B-R'-T (II)
式中，
A为针对抗体的亲和性物质，
L为切割性连接体，该切割性连接体为包含切割性部分的二价基团，
B为(a)包含生物正交性官能团的二价基团、或者(b)不含生物正交性官能团的二价基团，
R'为通过抗体与反应性基团之间的反应而生成的部分，
T为抗体。
2-2.通过抗体与反应性基团之间的反应而生成的部分(R')
通过抗体与反应性基团之间的反应而生成的部分中，抗体及反应性基团的定义、例子及优选例如上所述。通过抗体与反应性基团之间的反应而生成的部分，在该技术领域中为技术常识，可根据抗体及反应性基团的种类适当决定。
优选地，通过抗体与反应性基团之间的反应而生成的部分是通过抗体可包含的14种氨基酸(天冬酰胺、谷氨酰胺、甲硫氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、组氨酸及赖氨酸)中的任意1种氨基酸的侧链与针对其的反应性基团之间的反应而生成的部分。
更优选地，通过抗体与反应性基团之间的反应而生成的部分可以是赖氨酸、酪氨酸、色氨酸或半胱氨酸中的任意1种氨基酸的侧链与对其具有特异性的反应性基团之间的反应而生成的部分。
进一步更优选地，通过抗体与反应性基团之间的反应而生成的部分可以是赖氨酸、酪氨酸或色氨酸中的任意1种氨基酸的侧链与对其具有特异性的反应性基团之间的反应而生成的部分。作为通过赖氨酸、酪氨酸或色氨酸中的任意1种氨基酸的侧链与对其具有特异性的反应性基团之间的反应而生成的部分，可例举例如上述“1-5.反应性基团(R)”中记述的连接部分和/或化学结构。
再进一步更优选地，通过抗体与反应性基团之间的反应而生成的部分可以是赖氨酸或酪氨酸的侧链与对其具有特异性的反应性基团之间的反应而生成的部分(特别是抗体为人IgG1等人IgG的情况)。作为通过赖氨酸或酪氨酸的侧链与对其具有特异性的反应性基团之间的反应而生成的部分，可例举例如上述“1-5.反应性基团(R)”中记述的连接部分和/或化学结构。
特别优选地，通过抗体与反应性基团之间的反应而生成的部分可以是赖氨酸的侧链与对其具有特异性的反应性基团之间的反应而生成的部分。
2-3.部分结构“L-B”
部分结构“L-B”的详细内容如上述“1-6.部分结构‘L-B’”所述。
特定的实施方式中，以“L-B”表示的部分结构可以是以“B2-L'-B1”表示的部分结构(即，L为以B2-L'表示的二价基团，B为B1)。该情况下，以上述式(II)表示的包含针对抗体的亲和性物质及切割性部分的抗体或其盐可以下述式(II')表示。
A-B2-L'-B1-R'-T (II')
式中，
A、R'和T与所述式(II)的A、R'和T相同，
L'为切割性连接体，该切割性连接体为包含切割性部分的二价基团，
B1和B2相同或不同，为(a)包含生物正交性官能团的二价基团、或者(b)不含生物正交性官能团的二价基团，
B1和B2可具有以L'为中心的对称结构。
上述式(II')中，L'可以上述的式(L1')～(L3')中的任一个表示。
另一特定的实施方式中，以L-B表示的结构单元可以下述式(LB')表示。
[化学式35]
Figure BDA0002827785710000811
式中，
C、p、p'、q、q'、X、X'、R1a、R1a'、R1b、R1b'、Y、Y'、Z和Z'的定义、例子和优选例与上述相同，
○(白色圆)表示与A结合的键，●(黑色圆)表示与R'结合的键。
因此，上述式(II)可规定为下述式(II”)。
[化学式36]
Figure BDA0002827785710000812
式中，
A、R'、T、C、p、p'、q、q'、X、X'、R1a、R1b、R1a'、R1b'、Y、Y'、Z和Z'的定义、例子和优选例与上述相同。
上述式(LB')和(II”)中，从C＝Z中的C(碳原子)至C＝Z'中的C(碳原子)的长度与如上所述的连接A和R的主链的长度相同。这些式中，从C＝Z中的C至C＝Z'中的C的长度也可按照构成连接C＝Z中的C至C＝Z'中的C的部分结构的连接链(除氢原子及取代基外)的原子数规定。这样的原子数与构成连接A和R的主链的原子数相同。连接C＝Z中的C至C＝Z'中的C的部分结构的连接链(除氢原子及取代基外)可包含环结构，也可不含环结构，但较好是不含环结构。该连接链(除氢原子及取代基外)可优选不含肽部分。
2-4.抗体所具有的除抗体以外的部分结构的结合部位(区域选择性)
除抗体以外的部分结构(例如A-L-B-R')可区域选择性地与抗体(T)中的如上所述的靶区结合。
本说明书中，“区域选择性地”或“区域选择性”是指，尽管抗体中特定氨基酸残基未集中存在于特定区域，可与抗体中的特定氨基酸残基结合的规定的结构单元却集中存在于抗体中的特定区域。因此，“区域选择性地具有”、“区域选择性的结合”、“基于区域选择性的结合”等与区域选择性相关的表述是指，“包含1个以上的特定氨基酸残基的靶区中的规定的结构单元的保有率或结合率”以显著的水平高于“包含与靶区中的该特定氨基酸残基同种的多个氨基酸残基的非靶区中的该结构单元的保有率或结合率”。这样的区域选择性的结合或保有，可通过能够使规定的结构单元不随机与抗体中的特定氨基酸残基反应，而使规定的结构单元优先与抗体中的靶区中的特定氨基酸残基反应的本发明来实现。
具体来说，T在由连续的1～50个氨基酸残基形成的靶区中包含1个以上的特定氨基酸残基且在除所述靶区以外的非靶区中包含5个以上的所述特定氨基酸残基的情况下，除抗体以外的部分结构可按照30％以上的区域选择性与该靶区中所含的1个以上的特定氨基酸残基结合。靶区及区域选择性的定义、例子和优选例如上所述。
2-5.抗体所具有的除抗体以外的部分结构的个数
抗体(T)所保有的除抗体以外的部分结构(例如A-L-B-R')的个数可变化。例如，T为包含多个单体蛋白质的多聚体蛋白质的情况下，T可在多个单体蛋白质中对应的多个靶区中具有除T以外的部分结构。因而，T可具有多个除T以外的部分结构。因此，以式(II)、(II')或(II”)表示的结构，表示T可具有1个或多个除T以外的部分结构。T所具有的除T以外的部分结构的个数，可通过适当设定抗体的种类、及抗体与对其引入的结构单元的反应比例等条件来进行调节。这样的个数也根据抗体的种类而不同，例如可以是1～8个，较好是1～4个，更好是1或2个。
特定的实施方式中，抗体所保有的除抗体以外的部分结构的个数，在抗体为由多个单体蛋白质构成的多聚体蛋白质的情况下，可以是多个。如果采用本发明，可对于多个单体蛋白质的同一靶区引入多个除抗体以外的部分结构。
优选的实施方式中，抗体可以是包含多个重链的抗体。抗体的定义、例子和优选例如上所述。重链的个数根据抗体的种类而不同。例如，IgG、IgE和IgD可具有2个重链。IgA可具有2个或4个重链。IgM可具有8个重链。抗体(抗体)所保有的除抗体以外的部分结构的个数可作为与DAR同义的参数进行考虑。本发明中，抗体所保有的除抗体以外的部分结构的个数，对于IgG、IgE和IgD可以是1个或2个(较好是2个)，对于IgA可以是1～4个(较好是4个)，对于IgM可以是1～8个(较好是8个)。
2-6.制造方法
本发明提供包括以下工序的包含针对抗体的亲和性物质及切割性部分的抗体或其盐的制造方法：
(A1)使包含针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物或其盐与抗体反应，生成包含针对抗体的亲和性物质及切割性部分的抗体或其盐。
包含针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物以式(I)、较好是式(I')、更好是式(I”)表示。包含针对抗体的亲和性物质及切割性部分的抗体以式(II)、较好是式(II')、更好是式(II”)表示。
包含针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物或其盐具有反应性基团，因此可与抗体反应。这样的反应可在不会引起蛋白质的变性、分解(例如酰胺基的断裂)的条件(温和条件)下适当进行。例如，这样的反应可在适当的反应体系例如缓冲液中在室温(例如约15～30℃)下进行。缓冲液的pH例如为5～9，较好是5.5～8.5，更好是6.0～8.0。缓冲液可包含适当的催化剂。反应时间例如为1分钟～20小时，较好是10分钟～15小时，更好是20分钟～10小时，进一步更好是30分钟～8小时。关于这样的反应的具体情况，可参照例如G.J.L.Bernardes等，Chem.Rev.，115,2174(2015)；G.J.L.Bernardes等，Chem.Asian.J.，4,630(2009)；B.G.Davies等，Nat.Commun.，5,4740(2014)；A.Wagner等，Bioconjugate.Chem.,25,825(2014)。
反应体系中，包含针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物或其盐(Y)相对于抗体(X)的摩尔比(Y/X)，根据包含针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物和抗体的种类、待通过包含针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物进行修饰的抗体中的部位的数量(例如DAR)等而变化，故无特别限定，例如为0.1～100，较好是0.5～80，更好是1～70、进一步更好是2～50，特别好是3～30。
包含针对抗体的亲和性物质和切割性部分的抗体或其盐的生成的确认，虽也依赖于其具体的原料及产物的分子量，但可通过例如电泳法、色谱法(例如凝胶过滤层析法、离子交换色谱法、反相柱色谱法、HPLC)或质谱分析进行，较好是通过质谱分析进行。区域选择性的确认例如可通过肽谱分析(peptide mapping)进行。关于肽谱分析，例如可通过蛋白酶(例如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶)处理和质谱分析进行。作为蛋白酶，较好是胞内蛋白酶。作为这样的胞内蛋白酶，可例举例如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、Glu-C、Lys-N、Lys-C、Asp-N。抗体所具有的除抗体以外的部分结构的个数的确认可通过例如电泳法、色谱法或质谱分析进行，较好是通过质谱分析进行。包含针对抗体的亲和性物质及切割性部分的抗体或其盐可通过色谱法(例如上述的色谱法及亲和色谱法)等任意的方法适当纯化。
3.具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分、功能性物质及抗体的复合物或其盐
3-1.概要
本发明提供以下述式(III)表示的具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分、功能性物质及抗体的复合物或其盐。
A-L-B'(-F)-R'-T (III)
式中，
A为针对抗体的亲和性物质，
L为切割性连接体，该切割性连接体为包含切割性部分的二价基团，
B'为包含通过功能性物质与生物正交性官能团之间的反应而生成的部分的三价基团，
F为功能性物质，
R'为通过抗体与反应性基团之间的反应而生成的部分，
T为抗体。
式(III)或其他式中，R'不为F，与B'共价结合。
3-2.功能性物质(F)
作为功能性物质，只要是赋予抗体任意功能的物质，则无特别限定，可例举例如药物、标记物质、稳定剂，较好是药物或标记物质。此外，功能性物质可以是单一的功能性物质，或者也可以是2个以上的功能性物质连接而成的物质。
作为药物，可以是针对任意疾病的药物。作为这样的疾病，可例举例如癌症(例如肺癌、胃癌、大肠癌、胰腺癌、肾脏癌、肝癌、甲状腺癌、前列腺癌、膀胱癌、卵巢癌、子宫癌、骨癌、皮肤癌、脑肿瘤、黑色素瘤)、自身免疫疾病及炎性疾病(例如过敏性疾病、风湿性关节炎、全身性红斑狼疮)、脑神经疾病(例如脑梗塞、阿尔茨海默氏症、帕金森氏症、肌肉萎缩性侧索硬化症)、传染病(例如细菌传染病、病毒传染病)、遗传性疾病及罕见疾病(例如遗传性球形红细胞增多症、非营养不良性肌强直综合征)、眼部疾病(例如老年性黄斑变性、糖尿病性视网膜病变、视网膜色素变性)、骨科及整形外科领域的疾病(例如变形性关节炎)、血液疾病(例如白血病、紫斑症)、其他疾病(例如糖尿病、高脂血症等代谢异常疾病、肝脏疾病、肾脏疾病、肺疾病、循环系统疾病、消化系统疾病)。抗体为针对规定疾病的目标蛋白质的抗体的情况下，药物可以是与该规定疾病相关的药物(例如治疗该规定疾病的药物、缓和伴随针对该规定疾病的目标蛋白质的抗体的使用的副作用的药物)。
更具体来说，药物为抗癌剂。作为抗癌剂，可例举例如化疗剂、毒素、放射性同位素或包含其的物质。作为化疗剂，可例举例如DNA损伤剂、代谢拮抗剂、酶抑制剂、DNA嵌入剂、DNA切割剂、拓扑异构酶抑制剂、DNA结合抑制剂、微管蛋白结合抑制剂、细胞毒性核苷、铂化合物。作为毒素，可例举例如细菌毒素(例如白喉毒素)、植物毒素(例如蓖麻毒素)。作为放射性同位素，可例举例如氢原子的放射性同位素(例如3H)、碳原子的放射性同位素(例如14C)、磷原子的放射性同位素(例如32P)、硫原子的放射性同位素(例如35S)、钇的放射性同位素(例如90Y)、锝的放射性同位素(例如99mTc)、铟的放射性同位素(例如111In)、碘原子的放射性同位素(例如123I、125I、129I、131I)、钐的放射性同位素(例如153Sm)、铼的放射性同位素(例如186Re)、砹的放射性同位素(例如211At)、铋的放射性同位素(例如212Bi)。更具体来说，作为药物，可例举澳瑞他汀(auristatin)(MMAE、MMAF)、美登素(maytansine)(DM1、DM4)、PBD(pyrrolobenzodiazepine，吡咯并苯并二氮
Figure BDA0002827785710000851
)、IGN、喜树碱类似物(camptothecinanalog)、卡奇霉素(calicheamicin)、倍癌霉素(duocarmicin)、艾日布林(eribulin)、蒽环类药物(anthracycline)、dmDNA31、抗微管蛋白(tubulysin)。
作为标记物质，可例举例如酶(例如过氧化物酶、碱性磷酸酶、荧光素酶、β-半乳糖苷酶)、亲和性物质(例如链霉亲和素、生物素、地高辛、适体)、荧光物质(例如荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白)、发光物质(例如荧光素、水母发光蛋白(aequorin)、吖啶酯(Acridinium ester)、三(2,2'-联吡啶)钌、鲁米诺)、放射性同位素(例如上述的放射性同位素)或含其的物质。
此外，功能性物质为高分子化合物、中分子化合物或低分子化合物，较好是低分子化合物。低分子化合物是指分子量1500以下的化合物。低分子化合物为天然化合物或合成化合物。低分子化合物的分子量可以是1200以下、1000以下、900以下、800以下、700以下、600以下、500以下、400以下或300以下。此外，低分子化合物的分子量可以是30以上、40以上或50以上。低分子化合物可以是如上所述的药物或标记物质。此外，作为低分子化合物，可例举例如氨基酸、寡肽、维生素、核苷、核苷酸、低聚核苷酸、单糖、寡糖、脂质、脂肪酸及它们的盐。
3-3.包含通过功能性物质与生物正交性官能团之间的反应而生成的部分的三价基团(B')
关于B'，除了(a)的生物正交性官能团与功能性物质反应以外，与上述的B中的(a)包含生物正交性官能团的二价基团相同。因此，B'中的三价基团及正交性官能团的定义、例子及优选例，除了与(a)的生物正交性官能团与功能性物质反应之外，与B中相同。
功能性物质具有与其结构相应的各种官能团。功能性物质具有容易与生物正交性官能团反应的官能团的情况下，可使功能性物质的该官能团与生物正交性官能团适当反应。容易与生物正交性官能团反应的官能团可根据生物正交性官能团的具体种类而不同。如果是本领域技术人员，可适当选择适当的官能团作为容易与生物正交性官能团反应的官能团(例如，Boutureira等,Chem.Rev.,2015,115,2174-2195)。作为容易与生物正交性官能团反应的官能团，例如，生物正交性官能团为硫醇残基的情况下可例举马来酰亚胺残基及二硫残基，生物正交性官能团为炔烃残基的情况下可例举叠氮残基，生物正交性官能团为醛残基或酮残基的情况下可例举肼残基，但并不仅限于这些。例如，生物正交性官能团为硫醇残基且容易与生物正交性官能团反应的官能团为马来酰亚胺残基或二硫残基的情况下(或者与之相反的情况下)，包含通过功能性物质与生物正交性官能团之间的反应而生成的部分的三价基团可以是：包含硫代琥珀酰亚胺残基的三价基团、或包含二硫残基的三价基团；生物正交性官能团为炔烃残基且容易与生物正交性官能团反应的官能团为叠氮残基的情况下(或者与之相反的情况下)，包含通过功能性物质与生物正交性官能团之间的反应而生成的部分的三价基团可以是：包含三唑残基(可与其他环稠合，也可不与其他环稠合)的三价基团；生物正交性官能团为醛残基或酮残基且容易与生物正交性官能团反应的官能团为肼残基的情况下(或者与之相反的情况下)，包含通过功能性物质与生物正交性官能团之间的反应而生成的部分的三价基团可以是：包含腙残基的三价基团(例如，Boutureira等,Chem.Rev.,2015,115,2174-2195)。包含硫代琥珀酰亚胺残基的三价基团、包含二硫残基的三价基团、包含三唑残基(可与其他环稠合，也可不与其他环稠合)的三价基团、或包含腙残基的三价基团是：包含通过功能性物质与生物正交性官能团之间的反应而生成的部分的三价基团的优选例。
另一方面，功能性物质不具有容易与生物正交性官能团反应的官能团的情况下，作为功能性物质，可使用衍生物化而具有所期望的官能团的物质。例如，功能性物质为抗体的情况下，可使用衍生物化而具有抗体天然不具有的官能团的物质。该情况下，抗体的衍生物化可通过本发明的方法进行。该情况下，可将衍生物化而区域选择性地具有所期望的生物正交性官能团的抗体用作功能性物质。
衍生物化是该领域中的技术常识(例如国际公开第2004/010957号、美国专利申请公开第2006/0074008号说明书、美国专利申请公开第2005/0238649号说明书)。例如，衍生物化可使用如上所述的交联剂进行。或者，衍生物化可使用具有所期望的官能团的特定连接体进行。例如，这样的连接体可以是能在适当的环境(例如细胞内或细胞外)中通过连接体的切割将功能性物质与抗体分离的连接体。作为这样的连接体，可例举例如通过特定的蛋白酶[例如，细胞内蛋白酶(例如溶酶体或者核内体中存在的蛋白酶)、细胞外蛋白酶(例如分泌性蛋白酶)]分解的肽基连接体(例如美国专利第6214345号；Dubowchik等,Pharm.Therapeutics 83:67-123(1999))、可在存在于生物体内的局部酸性部位被切割的连接体(例如美国专利第5622929号、美国专利第5122368号、美国专利第5824805号)。连接体可以是自解构的(self-immolative)(例如国际公开第02/083180号、国际公开第04/043493号、国际公开第05/112919号)。本发明中，衍生物化的功能性物质也可简称为“功能性物质”。
包含通过功能性物质与生物正交性官能团之间的反应而生成的部分的三价基团中，功能性物质及生物正交性官能团的定义、例子及优选例如上所述。通过功能性物质与生物正交性官能团之间的反应而生成的部分在该技术领域中为技术常识，可根据功能性物质(功能性物质被衍生物化的情况下为其衍生物化部分)和生物正交性官能团的种类适当决定。
包含通过功能性物质与生物正交性官能团之间的反应而生成的部分的三价基团可以是：(1)包含作为上述的优选例中提及的残基的硫代琥珀酰亚胺残基、三唑残基或腙残基的三价基团，或者(2)例如可以是包含选自二硫残基(该残基为上述的优选例中提及的残基)、缩醛残基、缩酮残基、酯残基、氨甲酰基残基、烷氧基烷基残基、亚胺残基、叔烷基氧基氨基甲酸酯残基、硅烷残基、含有腙的残基、氨基磷酸酯残基、乌头酰基残基、三苯甲基残基、偶氮残基、邻二醇残基、硒残基、含有具有吸电子基团的芳环的残基、含有香豆素的残基、含有砜的残基、含有不饱和键的链残基、糖基残基中的残基的三价基团，但无特别限定。
此外，包含通过功能性物质与生物正交性官能团之间的反应而生成的部分的三价基团并无特别限定，例如，可以是包含与选自下述组的任一化学结构对应的残基的三价基团。
[化学式37]
Figure BDA0002827785710000881
在此，黑色方形表示与功能性物质侧的部分结合的键，
○(白色圆)表示与L侧的部分结合的键，●(黑色圆)表示与R'侧的部分结合的键，
化学结构以切割位点为中心呈不对称的情况下，可以是●表示与L侧的部分结合的键，○表示与R'侧的部分结合的键。
3-4.部分结构“L-B'(-F)”
部分结构“L-B'(-F)”的详细内容，除了B变更为B'(-F)以外，如上述“1-6.部分结构‘L-B’”中所述。
一个实施方式中，切割性连接体可以是(i)作为包含具有通过切割而在反应性基团侧生成生物正交性官能团的能力的切割性部分的二价基团的切割性连接体、或者(ii)作为包含不具有通过切割而在反应性基团侧生成生物正交性官能团的能力的切割性部分的二价基团的切割性连接体。
特定的实施方式中，切割性连接体可以是上述(ii)的切割性连接体。这是因为由于B'已与功能性物质(F)结合，因此不需要在反应性基团侧生成生物正交性官能团。
另一特定的实施方式中，以L-B'(-F)表示的部分结构可以是以B2'(-F2)-L'-B1'(-F1)表示的部分结构(即，L为B2'(-F2)-L'，B'为B1')。该情况下，以上述式(III)表示的具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分、功能性物质及抗体的复合物或其盐可以下述式(III')表示；
A-B2'(-F2)-L'-B1'(-F1)-R'-T (III')
式中，
A、R'和T与所述式(III)的A、R'和T含义相同，
L'为切割性连接体，该切割性连接体为包含切割性部分的二价基团，
B1'和B2'相同或不同，为包含通过功能性物质与生物正交性官能团之间的反应而生成的部分的三价基团，
F1和F2相同或不同，为功能性物质，
B1'(-F1)和B2'(-F2)可具有以L'为中心的对称结构。
B1'和B2'相同或不同，与B'的定义、例子和优选例相同。
上述式(III')中，L'可以上述的式(L1')～(L3')中的任一个表示。
另一特定的实施方式中，以L-B'(-F)表示的结构单元可以下述式(LB'(F)')表示。
[化学式38]
Figure BDA0002827785710000891
式中，
C、F1、F2、p、p'、q、q'、X、X'、R1a、R1a'、R1b、R1b'、Z和Z'的定义、例子和优选例与上述相同，
Y和Y'相同或不同，为从所述式(B-1)的Y除去1个氢原子而得的残基，
○(白色圆)表示与A结合的键，●(黑色圆)表示与R'结合的键。
更具体来说，Y和Y'中的从所述式(B-1)的Y除去1个氢原子而得的残基为-N(-)-、-CH(-)-或从上述式(B-2)除去1个氢原子而得的基团。从结构简化等观点来看，Y可以是-N(-)-或-CH(-)-。或者，从以碳原子为基调的结构的设计等观点来看，Y可以是-CH(-)-或从上述式(B-2)除去1个氢原子而得的基团。
从上述式(B-2)除去1个氢原子而得的基团是从下述式(B-2')除去1个氢原子而得的基团。
[化学式39]
Figure BDA0002827785710000892
式中，
V和V'相同或不同，为-NH-、-O-、-CH2-或单键，
V1为(a)包含生物正交性官能团的二价基团、或者(b)不含生物正交性官能团的二价基团，
s为0～10的任意的整数，
式(B-2')中的○和●分别为与式(B-1)中的○和●同样的取向。式(B-2')中的s的定义、例子和优选例与式(B-2)中相同。因此，式(B-2')中，V和V'中的一方可以是-N(-)-或-CH(-)-。或者，式(B-2')中，V1可以是从上述(a)或(b)的二价基团除去1个氢原子而得的三价基团。或者，式(B-2')中，s个-CH2-中的1个可以是-CH(-)-。
该情况下，上述式(III)可规定为下述式(III”)。
[化学式40]
Figure BDA0002827785710000901
式中，
A、R、C、F1、F2、p、p'、q、q'、X、X'、R1a、R1b、R1a'、R1b'、Y、Y'、Z和Z'的定义、例子和优选例与上述相同。
上述式(LB'(F)')和(III”)中，从C＝Z中的C(碳原子)至C＝Z'中的C(碳原子)的长度与如上所述的连接A和R的主链的长度相同。这些式中，从C＝Z中的C至C＝Z'中的C的长度也可按照构成连接C＝Z中的C至C＝Z'中的C的部分结构的连接链(除氢原子及取代基外)的原子数规定。这样的原子数与构成连接A和R的主链的原子数相同。连接C＝Z中的C至C＝Z'中的C的部分结构的连接链(除氢原子及取代基外)可包含环结构，也可不含环结构，但较好是不含环结构。该连接链(除氢原子及取代基外)可优选不含肽部分。
3-5.抗体所具有的除抗体以外的部分结构的结合部位(区域选择性)
除抗体以外的部分结构(例如A-L-B'(-F)-R')可区域选择性地与抗体(T)中的如上所述的靶区结合。具体来说，T在由连续的1～50个氨基酸残基形成的靶区中包含1个以上的特定氨基酸残基且在除所述靶区以外的非靶区中包含5个以上的所述特定氨基酸残基的情况下，除抗体以外的部分结构可按照30％以上的区域选择性与该靶区中所含的1个以上的特定氨基酸残基结合。靶区及区域选择性的定义、例子和优选例如上所述。
3-6.抗体所具有的除抗体以外的部分结构的个数
抗体(T)所保有的除抗体以外的部分结构(例如A-L-B'(-F)-R')的个数可变化。例如，T为包含多个单体蛋白质的多聚体蛋白质的情况下，T可在多个单体蛋白质中的对应的多个靶区中具有除T以外的部分结构。因而，T可具有多个除T以外的部分结构。因此，以式(III)、(III')或(III”)表示的结构表示T可具有1个或多个除T以外的部分结构。T所具有的除T以外的部分结构的个数可通过适当设定抗体的种类、及抗体与对其引入的结构单元的反应比例等条件来进行调节。这样的个数也根据抗体的种类而不同，例如可以是1～8个，较好是1～4个，更好是1或2个。
特定的实施方式中，抗体所保有的除抗体以外的部分结构的个数，在抗体为由多个单体蛋白质构成的多聚体蛋白质的情况下可以是多个。如果采用本发明，可对于多个单体蛋白质的同一靶区引入多个除抗体以外的部分结构。
优选的实施方式中，抗体可以是包含多个重链的抗体。抗体的定义、例子和优选例如上所述。本发明中，抗体所保有的除抗体以外的部分结构的个数，对于IgG、IgE和IgD可以是1个或2个(较好是2个)，对于IgA可以是1～4个(较好是4个)，对于IgM可以是1～8个(较好是8个)。
3-7.制造方法
本发明提供包含以下工序的具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分、功能性物质及抗体的复合物或其盐的制造方法：
(B1)使包含针对抗体的亲和性物质及切割性部分的抗体或其盐与功能性物质反应，生成具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分、功能性物质及抗体的复合物或其盐。
包含针对抗体的亲和性物质及切割性部分的抗体以式(II)、较好是式(II')、更好是式(II”)表示。包含针对抗体的亲和性物质、切割性部分、功能性物质及抗体的复合物以式(III)、较好是式(III')、更好是式(III”)表示。
包含针对抗体的亲和性物质及切割性部分的抗体或其盐具有可与功能性物质反应的生物正交性官能团，因此可与功能性物质反应。这样的反应可在如上述“2-6.制造方法”中所述的不会引起蛋白质的变性、分解(例如酰胺基的断裂)的条件(温和条件)下适当进行。
反应体系中，“功能性物质(Y)”相对于“包含针对抗体的亲和性物质及切割性部分的抗体或其盐(X)”的摩尔比(Y/X)，根据抗体及功能性物质的种类、待通过功能性物质进行修饰的抗体中的部位的数量(例如DAR)等而变化，无特别限定，例如为0.1～100，较好是0.5～80，更好是1～70、进一步更好是2～50，特别好是3～30。
具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分、功能性物质及抗体的复合物或其盐的生成的确认，虽也依赖于其具体的原料及产物的分子量，但可通过例如电泳法、色谱法(例如凝胶过滤层析法、离子交换色谱法、反相柱色谱法、HPLC)或质谱分析进行，较好是通过质谱分析进行。区域选择性的确认、除抗体以外的部分结构的个数的确认及纯化，可通过上述“2-6.制造方法”中所述的方法适当进行。
本发明还提供包含以下工序的具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分、功能性物质及抗体的复合物或其盐的制造方法：
(B2)使包含针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物或其盐与抗体反应，生成包含针对抗体的亲和性物质及切割性部分的抗体或其盐；以及
(B3)使包含针对抗体的亲和性物质及切割性部分的抗体或其盐与功能性物质反应，生成具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分、功能性物质及抗体的复合物或其盐。
上述(B2)的工序可与上述“2-6.制造方法”中所述的上述(A1)的工序同样地进行。上述(B3)的工序可与上述(B1)的工序同样地进行。上述(B2)和(B3)的工序可分别进行。或者，上述(B2)和(B3)的工序可根据作为抗体中的反应目标的特定氨基酸残基与反应性基团的反应对以及功能性物质中的官能团与生物正交性官能团的反应对的组合同时进行。即，上述(B2)和(B3)的工序同时进行的情况下，可不分离上述(B2)的工序中得到的产物，将上述(B2)的工序中得到的含产物的反应液供于上述(B3)的工序。
4.具有生物正交性官能团的抗体或其盐
4-1.制造方法的概要
本发明提供以式(IV)表示的具有生物正交性官能团的抗体或其盐的制造方法。
L1-B-R'-T (IV)
式中，
L1为(i')包含生物正交性官能团的一价基团、或者(ii')不含生物正交性官能团的一价基团，
B为(a)包含生物正交性官能团的二价基团、或者(b)不含生物正交性官能团的二价基团，
R'为通过抗体与反应性基团之间的反应而生成的部分，
T为抗体。
4-2.(i')包含生物正交性官能团的一价基团、或者(ii')不含生物正交性官能团的一价基团(L1)
式(IV)中，L1为(i')包含生物正交性官能团的一价基团、或者(ii')不含生物正交性官能团的一价基团。这样的一价基团是可通过作为如上所述的包含切割性部分的二价基团的切割性连接体的切割而生成的一价基团。因此，L1可以是可通过如上所述的切割性部分的残基或化学结构的切割而生成的一价基团。更具体来说，(i')包含生物正交性官能团的一价基团可以是能通过上述的“(i)作为包含具有通过切割而在反应性基团侧生成生物正交性官能团的能力的切割性部分的二价基团的切割性连接体”的切割而生成的一价基团，(ii')不含生物正交性官能团的一价基团可以是能通过“(ii)作为包含不具有通过切割而在反应性基团侧生成生物正交性官能团的能力的切割性部分的二价基团的切割性连接体”的切割而生成的一价基团。
特定的实施方式中，L1可以下述式(L1-1)或(L1-2)中的任一个表示。
C1-Lb (L1-1)
C1 (L1-2)
式中，
Lb为二价基团，
C1为生物正交性官能团、或者除生物正交性官能团以外的基团。
作为二价基团，可例举例如可具有取代基的二价烃基、可具有取代基的二价杂环基、-C(＝O)-、-NRa-、-O-、-S-、-C(＝S)-、及它们的2个以上(例如2～8、较好是2～6、更好是2～4)的组合，Ra表示氢原子或取代基。二价烃基、二价杂环基和取代基的定义、例子及优选例与如上所述。
生物正交性官能团的定义、例子和优选例如上所述。
作为除生物正交性官能团以外的基团，可例举例如上述的取代基中的除生物正交性官能团以外的基团。作为除生物正交性官能团以外的这样的基团，可例举例如烷基、环烷基、芳烷基、一价杂环基、羟基、氨基、烷基氧基(烷氧基)、环烷氧基、芳烷氧基。对于这些基团及这些基团的构成要素(例如烷基氧基(烷氧基)中的烷基、环烷氧基中的环烷基和芳烷氧基中的芳烷基)的定义、例子和优选例，与上述相同。
特定的实施方式中，Lb可以下述式(Lb')表示。
[化学式41]
Figure BDA0002827785710000931
式中，
p为0～10的任意的整数，
q为0～10的任意的整数，
X为碳原子、氮原子或单键，在此，X为氮原子的情况下，R1b不存在，X为单键的情况下，R1a和R1b不存在，
R1a和R1b相同或不同，选自氢原子或者上述的取代基，
○(白色圆)表示与C1结合的键，●(黑色圆)表示与B结合的键。
p、q和X以及R1a和R1b(取代基)的定义、例子和优选例如上所述。
4-3.部分结构“L1-B”
4-3-1.连接L1末端部分和R'的部分结构“L1-B”的长度
式(IV)中，连接通过切割生成的L1末端部分(或C1末端部分)和R'的部分结构(“L1-B”中的直链部分)的长度(或者，不仅限于式(IV)等特定式的区域选择性地具有生物正交性官能团的抗体或其盐中的连接“生物正交性官能团”和“特定氨基酸残基的侧链”的主链的原子数，下同)可根据如上述“1-6-1.连接A和R的部分结构‘L-B’中的主链的长度”中所述的各种因素适当地进行设计。
连接通过切割生成的L1末端部分(或C1末端部分)和R'的部分结构的长度例如为约
Figure BDA0002827785710000941
以上，较好是约
Figure BDA0002827785710000942
以上，更好是约
Figure BDA0002827785710000943
以上。部分结构的长度例如为约
Figure BDA0002827785710000944
以下，较好是约
Figure BDA0002827785710000945
以下，更好是约
Figure BDA0002827785710000946
以下。更具体来说，部分结构的长度例如为约
Figure BDA0002827785710000947
较好是约
Figure BDA0002827785710000948
更好是约
Figure BDA0002827785710000949
更具体来说，连接通过切割生成的L1末端部分(或C1末端部分)和R'的部分结构的长度也可按照构成部分结构的连接链(除氢原子及取代基外)的原子数规定。构成连接链的原子数例如可以是2个(约
Figure BDA00028277857100009410
)以上，较好是3个(约
Figure BDA00028277857100009411
)以上，更好是4个(约
Figure BDA00028277857100009412
)以上。此外，构成连接链的原子数例如可以是10个(约
Figure BDA00028277857100009413
)以下，较好是8个(约
Figure BDA00028277857100009414
)以下，更好是6个(约
Figure BDA00028277857100009415
)以下。更具体来说，构成连接链的原子数例如可以是2～10个，较好是3～8个，更好是4～6个。
连接通过切割生成的L1末端部分(或C1末端部分)和R'的部分结构的连接链为不含二价环结构的链状结构的情况下，连接链的原子数可通过计数连接链中的原子数来决定。
另一方面，连接通过切割生成的L1末端部分(或C1末端部分)和R'的部分结构的连接链为含二价环结构的结构的情况下，连接链的原子数与上述的长度并不一定对应，存在可根据连接链的原子数规定的长度比上述的长度短的倾向。即使是这样的情况下，从通过原子数规定连接链的长度的观点来看，可简便地计数连接链的原子数。具体来说，这样的情况下的连接链的原子数可如上所述通过在连接链中不含二价环结构的链状结构中的原子数的基础上，再计数连通二价环结构中的2个键的最短路径的原子数来决定。
优选地，连接通过切割生成的L1末端部分(或C1末端部分)和R'的部分结构的连接链可以是不含二价环结构的链状结构。该情况下，可按照连接通过切割生成的末端部分和R'的部分结构的连接链中不含二价环基的条件适当设计L1-B。
特定的实施方式中，以L1-B表示的部分结构较好是不含肽部分。该情况下，使用本发明的具有生物正交性官能团的抗体得到的本发明的具有功能性物质的抗体(例如抗体药物复合物)具有不会包含可具有免疫原性的肽部分作为连接体的优点。
4-3-2.部分结构“L1-B”的具体结构
上述式(IV)中，L1和B为可相互关联的结构。因此，上述式(IV)中，L1和B可作为以“L1-B”表示的部分结构规定。
特定的实施方式中，L1为(i')包含生物正交性官能团的一价基团的情况下，B为(a)包含生物正交性官能团的二价基团、或者(b)不含生物正交性官能团的二价基团。
优选地，L1为(i')包含生物正交性官能团的一价基团的情况下，B为(a)包含生物正交性官能团的二价基团。该情况下，(i')中的生物正交性官能团与(a)中的生物正交性官能团可以为同种，也可以为不同种。从采用更简单的结构和/或提高对于单一的功能性物质的反应性等观点来看，(i')中的生物正交性官能团可与(a)中的生物正交性官能团为同种。另一方面，从确保对于2种以上的功能性物质的差别化的反应性等、和不使用反应中的部分生物正交性官能团的观点来看，(i')中的生物正交性官能团可与(a)中的生物正交性官能团为不同种。
或者，L1为(i')包含生物正交性官能团的一价基团的情况下，B可以是(b)不含生物正交性官能团的二价基团。该情况下，以式(IV)表示的具有生物正交性官能团的抗体或其盐具有更简单的结构，所以合成容易。
另一特定的实施方式中，L1为(ii')不含生物正交性官能团的一价基团的情况下，B为(a)包含生物正交性官能团的二价基团。
特定的实施方式中，以L1-B表示的结构单元可以下述式(L1B')表示。
[化学式42]
Figure BDA0002827785710000951
式中，
C1、p、q、X、R1a、R1b、Y和Z的定义、例子和优选例与上述相同，
●(黑色圆)表示与R'结合的键。
因此，上述式(IV)可规定为下述式(IV')；
[化学式43]
Figure BDA0002827785710000952
式中，
C1、p、q、X、R1a、R1b、Y、Z、R'和T的定义、例子和优选例与上述相同。
上述式(L1B')和(IV')中，从C＝Z中的C至C1的长度与连接通过切割生成的L1末端部分(或C1末端部分)和R'的部分结构的长度相同。这些式中，从C＝Z中的C至C1的长度也可按照构成C＝Z中的C至C1的部分结构的连接链(除氢原子及取代基外)的原子数规定。这样的原子数与构成“连接通过切割生成的L1末端部分(或C1末端部分)和R'的部分结构(除氢原子及取代基外)”的原子数相同。连接C＝Z中的C至C1的部分结构的连接链(除氢原子及取代基外)可包含环结构，也可不含环结构，但较好是不含环结构。该连接链(除氢原子及取代基外)可优选不含肽部分。
4-4.抗体所具有的除抗体以外的部分结构的结合部位(区域选择性)
除抗体以外的部分结构(例如L1-B-R')可区域选择性地与抗体(T)中的如上所述的靶区结合。具体来说，T在由连续的1～50个氨基酸残基形成的靶区中包含1个以上的特定氨基酸残基且在除所述靶区以外的非靶区中包含5个以上的所述特定氨基酸残基的情况下，除抗体以外的部分结构可按照30％以上的区域选择性与该靶区中所含的1个以上的特定氨基酸残基结合。靶区及区域选择性的定义、例子和优选例如上所述。
4-5.抗体所具有的除抗体以外的部分结构的个数
抗体(T)所保有的除抗体以外的部分结构(例如L1-B-R')的个数可变化。例如，T为包含多个单体蛋白质的多聚体蛋白质的情况下，T可在多个单体蛋白质中的对应的多个靶区中具有除T以外的部分结构。因而，T可具有多个除T以外的部分结构。因此，以式(IV)、(IV')或(IV”)表示的结构表示T可具有1个或多个除T以外的部分结构。T所具有的除T以外的部分结构的个数可通过适当设定抗体的种类、及抗体与对其引入的结构单元的反应比例等条件来进行调节。这样的个数也根据抗体的种类而不同，例如可以是1～8个，较好是1～4个，更好是1或2个。
特定的实施方式中，抗体所保有的除抗体以外的部分结构的个数，在抗体为由多个单体蛋白质构成的多聚体蛋白质的情况下，可以是多个。如果采用本发明，可对于多个单体蛋白质的同一靶区引入多个除抗体以外的部分结构。
优选的实施方式中，抗体可以是包含多个重链的抗体。抗体的定义、例子和优选例如上所述。本发明中，抗体所保有的除抗体以外的部分结构的个数，对于IgG、IgE和IgD可以是1个或2个(较好是2个)，对于IgA可以是1～4个(较好是4个)，对于IgM可以是1～8个(较好是8个)。
4-6.制造方法
本发明提供包括以下工序的具有生物正交性官能团的抗体或其盐的制造方法：
(C1)对包含针对抗体的亲和性物质及切割性部分的抗体或其盐的切割性部分进行切割，生成具有生物正交性官能团的抗体或其盐。
包含针对抗体的亲和性物质及切割性部分的抗体以式(II)、较好是式(II')、更好是式(II”)表示。具有生物正交性官能团的抗体以式(IV)、较好是式(IV')、更好是式(IV")表示。
包含针对抗体的亲和性物质及切割性部分的抗体或其盐具有可通过如上所述的切割处理进行切割的切割性部分，因此可以进行切割。这样的切割反应可在如上述“2-6.制造方法”中所述的不会引起蛋白质的变性、分解(例如酰胺基的断裂)的条件(温和条件)下适当进行。
作为切割处理，可例举例如：(a)采用选自酸性物质、碱性物质、还原剂、氧化剂、酶中的1种以上的物质进行的处理，(b)采用选自光的物理化学刺激进行的处理，或者(c)在使用包含可自体分解的切割性部分的切割性连接体的情况下进行的放置。这样的切割处理的条件为该领域中的技术常识(例如，G.Leriche，L.Chisholm，A.Wagner，Bioorganic&Medicinal Chemistr y.20，571(2012)；Feng P.等，Jounal of American ChemicalSociet y.132，1500(2010).；Bessodes M.等，Journal of Controlled Release，99，423(2004).；DeSimone，J.M.，Journal of American Chemical Society.132，17928(2010)；Thompson，D.H.，Journal of Controlled Release，91，187(2003)；Schoenmarks，R.G.，Journal of Controlled Release，95，291(2004))。
具有生物正交性官能团的抗体或其盐的生成的确认，虽也依赖于其具体的原料及产物的分子量，但可通过例如电泳法、色谱法(例如凝胶过滤层析法、离子交换色谱法、反相柱色谱法、HPLC)或质谱分析进行，较好是通过质谱分析进行。区域选择性的确认、除抗体以外的部分结构的个数的确认及纯化可通过上述“2-6.制造方法”中所述的方法适当进行。
本发明还提供包括以下工序的具有生物正交性官能团的抗体或其盐的制造方法：
(C2)使包含针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物或其盐与抗体反应，生成包含针对抗体的亲和性物质及切割性部分的抗体或其盐；以及
(C3)对包含针对抗体的亲和性物质及切割性部分的抗体或其盐的切割性部分进行切割，生成具有生物正交性官能团的抗体或其盐。
上述(C2)的工序可与上述“2-6.制造方法”中所述的上述(A1)的工序同样地进行。上述(C3)的工序可与上述(C1)的工序同样地进行。上述(C2)和(C3)的工序可分别进行。或者，上述(C2)和(C3)的工序可根据反应性基团与可通过切割生成的生物正交性官能团的组合(非反应性)等因素而同时进行。即，上述(C2)和(C3)的工序同时进行的情况下，可不分离上述(C2)的工序中得到的产物，将上述(C2)的工序中得到的含产物的反应液供于上述(C3)的工序[参照例如，对于上述(C2)的工序中得到的含产物的反应液，为了对存在于产物的切割性连接体中的切割性部分进行切割而添加碱性物质(作为亲核试剂的羟胺)的实施例(81-9)及(84-8)]。
5.具有功能性物质的抗体或其盐的制造方法
5-1.概要
本发明提供以式(V)表示的具有功能性物质的抗体或其盐的制造方法；
F-(L1-B)'-R'-T (V)
式中，
L1为(i')包含生物正交性官能团的一价基团、或者(ii')不含生物正交性官能团的一价基团，
B为(a)包含生物正交性官能团的二价基团、或者(b)不含生物正交性官能团的二价基团，
以(L1-B)'表示的结构单元为包含通过“功能性物质”与“(i')和(a)中的生物正交性官能团中的任一者或两者”之间的反应而生成的部分的二价结构单元，
F为功能性物质，
R'为通过抗体与反应性基团之间的反应而生成的部分，
T为抗体。
5-2.部分结构“F-(L1-B)'”
5-2-1.连接F和R'的部分结构“L1-B”的长度
式(V)中，连接F和R'的部分结构“L1-B”(“L1-B”中的直链部分)的长度(或者，不仅限于式(V)等特定式的、区域选择性地具有功能性物质的抗体或其盐中连接“功能性物质”和“特定氨基酸残基的侧链”的主链的原子数，或功能性物质介以生物正交性官能团与抗体结合的情况下为连接“生物正交性官能团”和“特定氨基酸残基的侧链”的主链的原子数。下同)可根据如上述“1-6-1.连接A和R的部分结构‘L-B’中的主链的长度”中所述的各种因素适当地进行设计。
连接F和R'的部分结构的长度例如为约
Figure BDA0002827785710000981
以上，较好是约
Figure BDA0002827785710000982
以上，更好是约
Figure BDA0002827785710000983
以上。部分结构的长度例如为约
Figure BDA0002827785710000984
以下，较好是约
Figure BDA0002827785710000985
以下，更好是约
Figure BDA0002827785710000991
以下。更具体来说，部分结构的长度例如可为约
Figure BDA0002827785710000992
较好是约
Figure BDA0002827785710000993
Figure BDA0002827785710000994
更好是约
Figure BDA0002827785710000995
更具体来说，连接F和R'的部分结构的长度也可按照构成部分结构的连接链(除氢原子及取代基外)的原子数规定。构成连接链的原子数例如可以是2个(约
Figure BDA0002827785710000996
)以上，较好是3个(约
Figure BDA0002827785710000997
)以上，更好是4个(约
Figure BDA0002827785710000998
)以上。构成连接链的原子数例如可以是10个(约
Figure BDA0002827785710000999
)以下，较好是8个(约
Figure BDA00028277857100009910
)以下，更好是6个(约
Figure BDA00028277857100009911
)以下。更具体来说，构成连接链的原子数例如可以是2～10个，较好是3～8个，更好是4～6个。
连接F和R'的部分结构的连接链为不含二价环结构的链状结构的情况下，连接链的原子数可通过计数连接链中的原子数来决定。
另一方面，连接F和R'的部分结构的连接链为含二价环结构的结构的情况下，连接链的原子数与上述的长度不一定对应，存在可根据连接链的原子数规定的长度比上述的长度短的倾向。即使是这样的情况下，从通过原子数规定连接链的长度的观点来看，可简便地计数连接链的原子数。具体来说，这样的情况下的连接链的原子数可如上所述通过在连接链中不含二价环结构的链状结构中的原子数的基础上，再计数连通二价环结构中的2个键的最短路径的原子数来决定。
优选地，连接F和R'的部分结构的连接链可以是不含二价环结构的链状结构。该情况下，可按照连接F和R'的部分结构的连接链中不含二价环基的条件适当设计L1-B。
特定的实施方式中，以L1-B表示的部分结构较好是不含肽部分。该情况下，使用本发明的具有功能性物质的抗体(例如抗体药物复合物)具有不含可具有免疫原性的肽部分作为连接体的优点。
5-2-2.部分结构“F-(L1-B)'”的具体结构
式(V)中，F-(L1-B)'中的L1和B为可相互关联的结构。因此，上述式(V)中，L1和B可作为以“L1-B”表示的部分结构规定。
此外，以F-(L1-B)'表示的结构单元为通过“功能性物质”与“(i')和(a)中的生物正交性官能团中的任一者或两者”之间的反应而生成的部分。供于反应的生物正交性官能团在式(V)中不存在。因此，式(V)中，不存在(i')和(a)中的生物正交性官能团中的任一者或两者。通过“功能性物质”与“(i')和(a)中的生物正交性官能团中的任一者或两者”之间的反应而生成的部分，与通过功能性物质与生物正交性官能团之间的反应而生成的部分相同。因此，本说明书中，通过“功能性物质”与“(i')和(a)中的生物正交性官能团中的任一者或两者”之间的反应而生成的部分的例子(残基的名称)和具体例子(化学结构式)，与上文中关于通过功能性物质与生物正交性官能团之间的反应而生成的部分所述相同。
一个实施方式中，L1为(i')包含生物正交性官能团的一价基团的情况下，B为(a)包含生物正交性官能团的二价基团、或者(b)不含生物正交性官能团的二价基团。
优选的实施方式中，L1为(i')包含生物正交性官能团的一价基团的情况下，B为(a)包含生物正交性官能团的二价基团。该情况下，(i')中的生物正交性官能团与(a)中的生物正交性官能团可以为同种，也可以为不同种。从采用更简单的结构和/或提高对于单一的功能性物质的反应性等观点来看，(i')中的生物正交性官能团可与(a)中的生物正交性官能团为同种。另一方面，从确保对于2种以上的功能性物质的差别化的反应性和不使用反应中的一部分生物正交性官能团等观点来看，(i')中的生物正交性官能团可与(a)中的生物正交性官能团为不同种。
另一优选的实施方式中，L1为(i')包含生物正交性官能团的一价基团的情况下，B可以是(b)不含生物正交性官能团的二价基团。该情况下，以式(V)表示的具有功能性物质的抗体或其盐具有更简单的结构，所以合成容易。
另一实施方式中，L1为(ii')不含生物正交性官能团的一价基团的情况下，B为(a)包含生物正交性官能团的二价基团。
特定的实施方式中，(i')和(a)中的生物正交性官能团为不同种的情况下，以式(V)表示的具有功能性物质的抗体或其盐可以式(V1)或(V2)表示；
L1-B'(-F)-R'-T (V1)
式中，
L1为(i')包含生物正交性官能团的一价基团、或者(ii')不含生物正交性官能团的一价基团，
B'为包含通过功能性物质与生物正交性官能团之间的反应而生成的部分的三价基团，
F为功能性物质，
R'为通过抗体与反应性基团之间的反应而生成的部分，
T为抗体。
F-L1'-B-R'-T (V2)
式中，
L1'为包含通过功能性物质与(i')包含生物正交性官能团的一价基团之间的反应而生成的部分的二价基团，
B为(a)包含生物正交性官能团的二价基团、或者(b)不含生物正交性官能团的二价基团，
F为功能性物质，
R'为通过抗体与反应性基团之间的反应而生成的部分，
T为抗体。
L1'为包含通过功能性物质与(i')包含生物正交性官能团的一价基团之间的反应而生成的部分的二价基团。通过功能性物质与(i')包含生物正交性官能团的一价基团之间的反应而生成的部分，与通过功能性物质与生物正交性官能团之间的反应而生成的部分相同。因此，本说明书中，通过功能性物质与(i')包含生物正交性官能团的一价基团之间的反应而生成的部分的例子(残基的名称)和具体例子(化学结构式)，与上文中关于通过功能性物质与生物正交性官能团之间的反应而生成的部分所述相同。因此，由于功能性物质与生物正交性官能团反应，所以包含通过功能性物质与(i')包含生物正交性官能团的一价基团之间的反应而生成的部分的二价基团(L1')也可表述为包含通过功能性物质与生物正交性官能团之间的反应而生成的部分的二价基团(下同)。更具体而言，关于包含通过功能性物质与生物正交性官能团之间的反应而生成的部分的二价基团，(1)可以是包含作为上述的优选例中提及的残基的硫代琥珀酰亚胺残基、三唑残基或腙残基的二价基团，或者(2)例如可以是包含选自二硫残基(该残基为上述的优选例中提及的残基)、缩醛残基、缩酮残基、酯残基、氨甲酰基残基、烷氧基烷基残基、亚胺残基、叔烷基氧基氨基甲酸酯残基、硅烷残基、含有腙的残基、氨基磷酸酯残基、乌头酰基残基、三苯甲基残基、偶氮残基、邻二醇残基、硒残基、含有具有吸电子基团的芳环的残基、含有香豆素的残基、含有砜的残基、含有不饱和键的链残基、糖基残基中的残基的二价基团，但无特别限定；较好是(1)包含硫代琥珀酰亚胺残基、三唑残基或腙残基的二价基团。
另一特定的实施方式中，(i')和(a)中的生物正交性官能团为同种或不同种的情况下，以式(V)表示的具有功能性物质的抗体或其盐可以式(V3)表示。
Fa-L1'-B'(-Fb)-R'-T (V3)
式中，
L1'为包含通过功能性物质与(i')包含生物正交性官能团的一价基团之间的反应而生成的部分的二价基团，
B'为包含通过功能性物质与生物正交性官能团之间的反应而生成的部分的三价基团，
Fa和Fb分别为相同或不同的功能性物质，
R'为通过抗体与反应性基团之间的反应而生成的部分，
T为抗体。
特定的实施方式中，上述式(V1)中，以L1-B'(-F)表示的结构单元可以下述式(L1B'(F))表示。
[化学式44]
Figure BDA0002827785710001021
式中，
F、C1、p、q、X、R1a、R1b和Z的定义、例子和优选例与上述相同，
Y'为从所述式(B-1)的Y除去1个氢原子而得的残基，
●(黑色圆)表示与R'结合的键。
从所述式(B-1)的Y除去1个氢原子而得的残基的定义、例子和优选例与上述相同。
因此，上述式(V1)可规定为下述式(V1')。
[化学式45]
Figure BDA0002827785710001022
式中，
F、C1、p、q、X、R1a、R1b、Z、R'和T的定义、例子和优选例与上述相同，
Y'为从所述式(B-1)的Y除去1个氢原子而得的残基。
特定的实施方式中，上述式(V2)中，以F-L1'-B表示的结构单元可以下述式(FL1'B)表示。
[化学式46]
Figure BDA0002827785710001023
式中，
F、p、q、X、R1a、R1b、Y和Z的定义、例子和优选例与上述相同，
C1'为通过功能性物质与生物正交性官能团之间的反应而生成的部分，
●(黑色圆)表示与R'结合的键。
C1'为通过功能性物质与生物正交性官能团之间的反应而生成的部分。C1'中的通过功能性物质与生物正交性官能团之间的反应而生成的部分的定义、例子及优选例与上述“包含通过功能性物质与生物正交性官能团之间的反应而生成的部分的二价基团”中所述相同(下同)。
因此，上述式(V2)可规定为下述式(V2')。
[化学式47]
Figure BDA0002827785710001031
式中，
F、p、q、X、R1a、R1b、Y、Z、R'和T的定义、例子和优选例与上述相同，C1'为通过功能性物质与生物正交性官能团之间的反应而生成的部分。
特定的实施方式中，上述式(V3)中，以Fa-L1'-B'(-Fb)表示的结构单元可以下述式(FaL1'B'(Fb))表示。
[化学式48]
Figure BDA0002827785710001032
式中，
Fa、Fb、p、q、X、R1a、R1b、和Z的定义、例子和优选例与上述相同，
C1'为通过功能性物质与生物正交性官能团之间的反应而生成的部分，
Y'为从所述式(B-1)的Y除去1个氢原子而得的残基，
●(黑色圆)表示与R'结合的键。
因此，上述式(V3)可规定为下述式(V3')。
[化学式49]
Figure BDA0002827785710001033
式中，
Fa、Fb、p、q、X、R1a、R1b、Z、R'和T的定义、例子和优选例与上述相同，
C1'为通过功能性物质与生物正交性官能团之间的反应而生成的部分，
Y'为从所述式(B-1)的Y除去1个氢原子而得的残基。
上述式(L1B'(F))、(FL1'B)和(FaL1'B'(F2))、以及(V1')、(V2')和(V3')中，从C＝Z中的C至C1的长度与连接通过切割生成的L1末端部分(或C1末端部分)和R'的部分结构的长度相同。这些式中，从C＝Z中的C至C1的长度也可按照构成C＝Z中的C至C1的部分结构的连接链(除氢原子及取代基外)的原子数规定。这样的原子数与构成连接通过切割生成的L1末端部分(或C1末端部分)和R'的部分结构(除氢原子及取代基外)的原子数相同。连接C＝Z中的C至C1的部分结构的连接链(除氢原子及取代基外)可包含环结构，也可不含环结构，但较好是不含环结构。该连接链(除氢原子及取代基外)可优选不含肽部分。
5-3.抗体所具有的除抗体以外的部分结构的结合部位(区域选择性)
除抗体以外的部分结构(例如F-(L1-B)'-R')可区域选择性地与抗体(T)中的如上所述的靶区结合。具体来说，T在由连续的1～50个氨基酸残基形成的靶区中包含1个以上的特定氨基酸残基且在除所述靶区以外的非靶区中包含5个以上的所述特定氨基酸残基的情况下，除抗体以外的部分结构可按照30％以上的区域选择性与该靶区中所含的1个以上的特定氨基酸残基结合。靶区及区域选择性的定义、例子和优选例如上所述。
5-4.抗体所具有的除抗体以外的部分结构的个数
抗体(T)所保有的除抗体以外的部分结构(例如F-(L1-B)'-R')的个数可变化。例如，T为包含多个单体蛋白质的多聚体蛋白质的情况下，T可在多个单体蛋白质中的对应的多个靶区中具有除T以外的部分结构。因而，T可具有多个除T以外的部分结构。因此，以式(V)、(V1)、(V2)、(V3)、(V1')、(V2')或(V3')表示的结构表示T可具有1个或多个除T以外的部分结构。T所具有的除T以外的部分结构的个数可通过适当设定抗体的种类及抗体与对其引入的结构单元的反应比例等条件来进行调节。这样的个数也根据抗体的种类而不同，例如可以是1～8个，较好是1～4个，更好是1或2个。
特定的实施方式中，抗体所保有的除抗体以外的部分结构的个数，在抗体为由多个单体蛋白质构成的多聚体蛋白质的情况下，可以是多个。如果采用本发明，可对于多个单体蛋白质的同一靶区引入多个除抗体以外的部分结构。
优选的实施方式中，抗体可以是包含多个重链的抗体。抗体的定义、例子和优选例如上所述。本发明中，抗体所保有的除抗体以外的部分结构的个数，对于IgG、IgE和IgD可以是1个或2个(较好是2个)，对于IgA可以是1～4个(较好是4个)，对于IgM可以是1～8个(较好是8个)。
5-5.制造方法
本发明提供具有功能性物质的抗体或其盐的制造方法。本制造方法可分类为：(D)使用具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分、功能性物质及抗体的复合物或其盐作为原料的方法(参照图2的反应(3))；以及(E)使用具有生物正交性官能团的抗体或其盐作为原料的方法(参照图2的反应(5))。
(D)使用具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分、功能性物质及抗体的复合物或其盐作为原料的方法包括以下工序：
(D1)对具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分、功能性物质及抗体的复合物或其盐的切割性部分进行切割，生成具有功能性物质的抗体或其盐。
“具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分、功能性物质及抗体的复合物”以式(III)、较好是式(III')、更好是式(III”)表示。具有功能性物质的抗体以式(V)表示，较好是以式(V1)、(V2)或(V3)表示，更好是以式(V1')、(V2')或(V3')表示。
“具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分、功能性物质及抗体的复合物或其盐”具有可通过如上所述的切割处理进行切割的切割性部分，因此可以进行切割。这样的切割反应可在如上述“4-6.制造方法”中所述的方式下进行。
具有功能性物质的抗体或其盐的生成的确认，虽也依赖于其具体的原料及产物的分子量，但可通过例如电泳法、色谱法(例如凝胶过滤层析法、离子交换色谱法、反相柱色谱法、HPLC)或质谱分析进行，较好是通过质谱分析进行。区域选择性的确认、除抗体以外的部分结构的个数的确认及纯化可通过上述“2-6.制造方法”中所述的方法适当进行。
本发明还提供包含以下工序的具有功能性物质的抗体或其盐的制造方法：
(D2)使包含针对抗体的亲和性物质及切割性部分的抗体或其盐与功能性物质反应，生成具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分、功能性物质及抗体的复合物或其盐；以及
(D3)对具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分、功能性物质及抗体的复合物或其盐的切割性部分进行切割，生成具有功能性物质的抗体或其盐。
上述(D2)的工序可与上述“3-7.制造方法”中所述的上述(B1)的工序同样地进行。上述(D3)的工序可与上述(D1)的工序同样地进行。上述(D2)和(D3)的工序可分别进行。或者，上述(D2)和(D3)的工序可根据与切割性部分、功能性物质及生物正交性官能团的组合等因素同时进行。即，上述(D2)和(D3)的工序同时进行的情况下，可不分离上述(D2)的工序中得到的产物，将上述(D2)的工序中得到的含产物的反应液供于上述(D3)的工序。
本发明还提供包含以下工序的具有功能性物质的抗体或其盐的制造方法：
(D4)使包含针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物或其盐与抗体反应，生成包含针对抗体的亲和性物质及切割性部分的抗体或其盐；
(D5)使包含针对抗体的亲和性物质及切割性部分的抗体或其盐与功能性物质反应，生成具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分、功能性物质及抗体的复合物或其盐；以及
(D6)对具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分、功能性物质及抗体的复合物或其盐的切割性部分进行切割，生成具有功能性物质的抗体或其盐。
上述(D4)的工序可与上述“2-6.制造方法”中所述的上述(A1)的工序同样地进行。上述(D5)和(D6)的工序可与上述(D2)和(D3)的工序同样地进行。上述(D5)的工序可与上述“3-7.制造方法”中所述的上述(B1)的工序同样地进行。上述(D6)的工序可与上述(D1)的工序同样地进行。上述(D4)～(D6)的工序可分别进行。或者，上述(D4)～(D6)的工序中的至少一部分可根据与反应性基团、切割性部分、功能性物质及生物正交性官能团的组合等因素同时进行。即，上述(D4)～(D6)的工序中的2个以上的工序同时进行的情况下，可不分离前一工序中得到的产物，将前一工序中得到的含产物的反应液供于后一工序。
(E)使用具有生物正交性官能团的抗体或其盐作为原料的方法包括以下工序：
(E1)使具有生物正交性官能团的抗体或其盐与功能性物质反应，生成具有功能性物质的抗体或其盐。
具有生物正交性官能团的抗体以式(IV)、较好是式(IV')表示。具有功能性物质的抗体以式(V)表示，较好是以式(V1)、(V2)或(V3)表示，更好是以式(V1')、(V2')或(V3')表示。
具有生物正交性官能团的抗体或其盐具有生物正交性官能团，因此可与功能性物质反应。这样的反应可在如上述“3-7.制造方法”中所述的方式下进行。
具有功能性物质的抗体或其盐的生成的确认可通过如上所述的方法进行。区域选择性的确认、除抗体以外的部分结构的个数的确认、及纯化可通过上述“2-6.制造方法”中所述的方法适当进行。
本发明还提供包含以下工序的具有功能性物质的抗体或其盐的制造方法：
(E2)对包含针对抗体的亲和性物质及切割性部分的抗体或其盐的切割性部分进行切割，生成具有生物正交性官能团的抗体或其盐；以及
(E3)使具有生物正交性官能团的抗体或其盐与功能性物质反应，生成具有功能性物质的抗体或其盐。
上述(E2)的工序可与上述“4-6.制造方法”中所述的上述(C1)的工序同样地进行。上述(E3)的工序可与上述(E1)的工序同样地进行。上述(E2)和(E3)的工序可分别进行。或者，上述(E2)和(E3)的工序可根据与切割性部分、功能性物质及生物正交性官能团的组合等因素同时进行。即，上述(E2)和(E3)的工序同时进行的情况下，可不分离上述(E2)的工序中得到的产物，将上述(E2)的工序中得到的含产物的反应液供于上述(E3)的工序。
本发明还提供包含以下工序的具有功能性物质的抗体或其盐的制造方法：
(E4)使包含针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物或其盐与抗体反应，生成包含针对抗体的亲和性物质及切割性部分的抗体或其盐；
(E5)对包含针对抗体的亲和性物质及切割性部分的抗体或其盐的切割性部分进行切割，生成具有生物正交性官能团的抗体或其盐；以及
(E6)使具有生物正交性官能团的抗体或其盐与功能性物质反应，生成具有功能性物质的抗体或其盐。
上述(E4)的工序可与上述“2-6.制造方法”中所述的上述(A1)的工序同样地进行。上述(E5)和(E6)的工序可与上述(E2)和(E3)的工序同样地进行。上述(E4)～(E6)的工序可分别进行。或者，上述(E4)～(E6)的工序中的至少一部分可根据与反应性基团、切割性部分、功能性物质及生物正交性官能团的组合等因素同时进行。即，上述(E4)～(E6)的工序中的2个以上的工序同时进行的情况下，可不分离前一工序中得到的产物，将前一工序中得到的含产物的反应液供于后一工序。
6.盐
本发明中，作为盐，可例举例如与无机酸的盐、与有机酸的盐、与无机碱的盐、与有机碱的盐、及与氨基酸的盐。作为与无机酸的盐，可例举例如与盐酸、溴化氢、磷酸、硫酸、硝酸的盐。作为与有机酸的盐，可例举例如与甲酸、乙酸、三氟乙酸、乳酸、酒石酸、富马酸、乙二酸、马来酸、柠檬酸、琥珀酸、苹果酸、苯磺酸、对甲苯磺酸的盐。作为与无机碱的盐，可例举例如与碱金属(例如钠、钾)、碱土金属(例如钙、镁)及锌、铝等其他金属以及铵的盐。作为与有机碱的盐，可例举例如与三甲胺、三乙胺、丙二胺、乙二胺、吡啶、乙醇胺、单烷基乙醇胺、二烷基乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺的盐。作为与氨基酸的盐，可例举例如与碱性氨基酸(例如精氨酸、组氨酸、赖氨酸、鸟氨酸)及酸性氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)的盐。关于盐，较好是与无机酸(例如盐酸)的盐、或与有机酸(例如三氟乙酸)的盐。
7.用途
具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的本发明的化合物或其盐可用于例如抗体的区域选择性修饰。因此，本发明提供：包含“具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物或其盐”的、抗体的区域选择性修饰试剂。
本发明的区域选择性修饰试剂能以进一步包含其他成分的组合物的形态提供。作为这样的其他成分，可例举例如溶液、稳定剂(例如抗氧化剂、防腐剂(保存剂))。作为溶液，较好是水溶液。作为水溶液，可例举例如：水(例如蒸馏水、灭菌蒸馏水、纯化水、生理盐水)、缓冲液(例如磷酸缓冲液、Tris-盐酸缓冲液、碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液、硼酸水溶液、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液、柠檬酸缓冲液)，较好是缓冲液。溶液的pH例如为5.0～9.0，较好是5.5～8.5。本发明的区域选择性修饰试剂可以液状或粉末状(例如冻干粉末)提供。
(区域选择性地)具有针对抗体的亲和性物质及切割性部分的本发明的抗体或其盐、(区域选择性地)具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分、功能性物质及抗体的本发明的复合物或其盐、以及(区域选择性地)具有生物正交性官能团的本发明的抗体或其盐，可用作例如用于制备(区域选择性地)具有功能性物质的抗体或其盐的中间体。
(区域选择性地)具有功能性物质的本发明的抗体或其盐可用作例如药物或者试剂(例如诊断药物、研究用试剂)。
特别是(区域选择性地)具有功能性物质的本发明的抗体或其盐可用作药物。如上所述，有报道称，如果改变抗体药物复合物(ADC)的药物的结合数和结合位置，则体内动力学和药物的释放速度、效果会发生变化。基于这些情况，对于下一代的ADC，要求控制偶联的药物的个数和位置。认为如果个数和位置固定，则所期待的功效、偶联药剂的多样性、批次差异即标准化(regulation)的问题得到解决。具有功能性物质的本发明的抗体或其盐可解决这样的标准化的问题。因此，具有功能性物质的本发明的抗体或其盐可以药物组合物的形态提供。这样的药物组合物除包含“具有功能性物质的抗体或其盐”之外，还可包含药学上可允许的载体。作为药学上可允许的载体，可例举例如蔗糖、淀粉、甘露糖醇、山梨糖醇、乳糖、葡萄糖、纤维素、滑石、磷酸钙、碳酸钙等赋形剂，纤维素、甲基纤维素、羟丙基纤维素、聚丙基吡咯烷酮、明胶、阿拉伯胶、聚乙二醇、蔗糖、淀粉等粘合剂，淀粉、羧甲基纤维素、羟丙基淀粉、碳酸氢钠、磷酸钙、柠檬酸钙等崩解剂，硬脂酸镁、二氧化硅气凝胶(Aerosil)、滑石、十二烷基硫酸钠等润滑剂，柠檬酸、薄荷醇、甘氨酰赖氨酸铵盐、甘氨酸、甜橙粉等芳香剂，苯甲酸钠、亚硫酸氢钠、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯等防腐剂，柠檬酸、柠檬酸钠、乙酸等稳定剂，甲基纤维素、聚乙烯基吡咯烷酮、硬脂酸铝等悬浮剂，表面活性剂等分散剂，水、生理盐水、橙汁等稀释剂，可可脂、聚乙二醇、白煤油等基质蜡(base wax)等，但并不仅限于这些例子。此外，具有功能性物质的本发明的抗体或其盐还可具有实现稳定性的任意的修饰(例如PEG化)。
适合于口服给药的制剂为：使有效量的配体(ligand)溶解于水、生理盐水、橙汁等稀释液而得的液体制剂，作为固体或颗粒包含有效量的配体的胶囊剂、药囊(sachet)或片剂，使有效量的有效成分悬浮于适当的分散介质中的悬浮液剂，使溶解了有效量的有效成分的溶液分散于适当的分散介质并乳化的乳剂等。
药物组合物适合于非口服给药(胃肠外给药)(例如静脉注射、皮下注射、肌肉注射、局部注入、腹腔内给药)。作为这样的适合于非口服给药的药物组合物，有水性和非水性的等渗无菌注射液剂，其中可含抗氧化剂、缓冲液、抗菌剂、等渗剂等。此外，可例举水性和非水性的无菌悬浮液剂，其中可含悬浮剂、助溶剂、增稠剂、稳定剂、防腐剂等。
药物组合物的给药量根据有效成分的种类及活性、疾病的严重程度、作为给药对象的动物种类、以及给药对象的药物耐受性、体重、年龄等而不同，可适当设定。
实施例
以下，示出实施例对本发明进行更详细的说明，但本发明并不限定于以下的实施例。
[实施例1：具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物(肽二硫连接体偶联物-NHS活化体，Peptide-and Disulfide Linker-Coupled NHS-ActivationCompound)的合成、以及使用该化合物的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的修饰及其分析]
(1-1)IgG1 Fc结合性肽的合成
通过Fmoc固相合成法合成了Ac-RGNCAYHKGQIIWCTYH-NH2(SEQ ID NO:5)的肽。肽合成装置使用了CEM公司制的Liberty Blue。试剂全部使用渡边化学工业株式会社制的试剂。树脂为Fmoc-NH-SAL-PEG树脂HL，精氨酸(R)、半胱氨酸(C)、组氨酸(H)进行了双偶合(doublecoupling)。关于从树脂的切取，以在三氟乙酸:水:三异丙基硅烷:乙二硫醇＝94:2.5:1.0:2.5的溶液中搅拌3小时的条件进行。切取后，将树脂通过过滤除去，除去三氟乙酸。向生成的结晶中加入二乙醚进行醚沉淀，通过过滤回收生成的白色结晶。将其溶解于0.1％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基(octadodecyl group)化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.1％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而仅除去乙腈后，进行冷冻干燥。获得了目标物(215mg，103μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 698.00[M+3H]3+,z＝4 532.80[M+4H]4+
(1-2)Ac-RGNCAYHKGQIIWCTYH-NH2(SEQ ID NO:5)的第4位和第14位的Cys处的分子内二硫键的形成
[化学式50]
Figure BDA0002827785710001101
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:5。
将(1-1)中合成的肽(215mg，103μmol)溶解于DMSO成为100mM后，加入2当量的2MNH3-MeOH、1当量的过氧化氢水溶液，在室温下进行20小时搅拌。向反应溶液中加入2M三氟乙酸水溶液停止反应，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而仅除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽(33.3mg，15.9μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 697.45[M+3H]3+,z＝4 523.35[M+4H]4+
(1-3)二硫连接体与肽的偶联(Coupling)
[化学式51]
Figure BDA0002827785710001102
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:5。
将(1-2)中合成的Ac-RGNCAYHKGQIIWCTYH-NH2(SEQ ID NO:5)(33.3mg，15.9μmol，其中，第4位和第14位的2个半胱氨酸分别在分子内形成二硫键)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(1.00mL)，加入将3,3'-二硫代二丙酸二(N-琥珀酰亚胺酯)(3,3'-dithiodipropionicacid di(N-succinimidyl))(257mg，636μmol)溶解于乙腈(1.00mL)而得的溶液，室温下搅拌24小时。通过减压浓缩而除去乙腈后，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽二硫连接体偶联物-NHS活化体(9.20mg，3.87μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 793.75[M+3H]3+
HPLC纯度:79％
(1-4)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰和基于ESI-TOFMS的分析
将(1-3)中合成的肽二硫连接体偶联物-NHS活化体溶解于N,N'-二甲基甲酰胺成为21.6mM。使500μg的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗(中外制药株式会社)溶解于46.9μL的60mM的乙酸钠缓冲液(pH 4.7)，加入4.7μL的21.6mM的肽试剂(相对于抗体为30当量)，室温下搅拌1小时。将反应液添加至NAP-5柱，使反应停止，置换为20mM的PBS缓冲液。通过ESI-TOFMS测定质量时，关于引入了2个结合性肽的产物，在152600观测到峰。
(1-5)曲妥珠单抗的特异性修饰体的还原条件下的基于ESI-TOFMS分析的重链选择性的确认
向(1-4)中生成的抗体-肽复合物中加入5μL的7mM的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐溶液(相对于抗体为等量)，室温下搅拌20分钟。通过ESI-TOFMS测定质量时，关于原料的曲妥珠单抗，在50595、50756观测到重链峰，并在23440观测到轻链峰；关于产物，在重链中引入了硫代丙酰基(thiopropionyl)在50682、50844观测到峰、并且与原料同样在23439观测到轻链峰。
(1-6)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC(HydrophobicInteraction Chromatography，疏水相互作用层析)-UPLC分析
通过HIC对(1-5)中生成的未进行糖链切割(糖酵解)的抗体-肽复合物和原料的抗体进行了分析。柱使用了Protein-Pak Hi Res HIC柱(沃特世(Waters)公司)4.6×100mm 2.5μm。使用A_Buffer(A缓冲液):0.1M PiNa,2.3M(NH4)2SO4,pH7.0、B_Buffer(B缓冲液):0.1MPiNa,pH7.0，流速为0.6mL/分钟，梯度设为A 60％B40％→A0％B 100％、16分钟(数据采集20分钟)，柱温为40℃，恒温器(thermostat)温度为40℃，检测器用280nm的波长进行了检测。
对于样品，按照以下的条件进行反应。
a:曲妥珠单抗原料；
b:曲妥珠单抗+肽二硫连接体偶联物-NHS活化体30当量。
保留时间(retension time)11.3913分钟被认为是曲妥珠单抗中引入了2个肽的化合物(图5)。
[实施例2：曲妥珠单抗的巯基引入体的肽谱分析]
(2-1)曲妥珠单抗的巯基引入体的基于消化酶的处理
对于实施例1的(1-3)中得到的抗体-肽复合物通过PNGaseF(新英格兰生物实验室(NewEngland BioLabs)公司制)进行了糖链切割(glycosylate，糖基化)后，进行了肽谱分析(peptide mapping)。向1.5mL低吸附微试管中加入10μL样品溶液、50mM碳酸氢铵缓冲液、10μL溶解于40％三氟乙醇的20mM的二硫苏糖醇水溶液，在65℃加温1小时后，添加10μL的50mM的碘乙酰胺水溶液，遮光下于室温以300rpm振荡反应30分钟。反应后，加入40μL的50mM碳酸氢铵缓冲液并搅拌，添加10μL的20ng/μL的胰蛋白酶水溶液、或者12.5μL的200ng/μL的Glu-C蛋白酶水溶液并在37℃进行了18小时的酶消化。消化后，向胰蛋白酶消化样品中加入2μL的20％三氟乙酸水溶液，向Glu-C蛋白酶消化样品中加入2.12μL的20％三氟乙酸水溶液，停止反应，实施LC-MS/MS测定。
(2-2)曲妥珠单抗的LC-MS/MS测定条件
(分析装置)
纳米HPLC：EASY-nLC 1000(赛默飞世尔科技公司)
质谱仪：Tribrid质谱仪Orbitrap Fusion(赛默飞世尔科技公司)
(HPLC分析条件)
捕集柱：Acclaim PepMap(注册商标)100，75μm×2cm(赛默飞世尔科技公司)
分析柱：ESI-column(NTCC-360/75-3-125,75μm×12.5cm,3μm(日京技术株式会社，Nikkyo Technos Co.,Ltd.))
流动相A：0.1％甲酸水溶液
流动相B：0.1％甲酸、乙腈溶液
加样溶液：0.1％三氟乙酸水溶液
流速：300nL/分钟
样品注入量：1μL
梯度条件(B％)：2％(0.0-0.5分钟)、2％→30％(0.5-23.5分钟)、30％→75％(23.5-25.5分钟)、75％(25.5-35.0分钟)
(质谱仪的分析条件)
离子化方法：ESI，正离子化(Positive)模式
扫描类型：数据依赖性获取(Data Dependent Acquisition)
活化类型：碰撞诱导离解(Collision Induced Dissociation，CID)
数据的获取使用作为附带软件的Xcalibur 3.0(赛默飞世尔科技公司)及ThermoOrbitrap Fusion Tune Application 2.0(赛默飞世尔科技公司)进行。
(2-3)曲妥珠单抗的修饰部位的分析条件
关于对LC-MS/MS测定结果的修饰部位分析，使用Proteome Discoverer version 1.4(赛默飞世尔科技公司)进行。
关于采用Proteome Discoverer的分析，使用Sequest HT作为搜索引擎，前体离子的范围设为350～5000Da。此外，将胰蛋白酶或Glu-C蛋白酶设定为消化酶，最大漏切位点(Maximum Missed Cleavage Site)设为3。此外，前体和碎片离子的质量容差(MassTolerance)分别设为5ppm和0.5Da。关于静态修饰(Static Modification)，作为采用碘乙酰胺的半胱氨酸残基的修饰，设定脲甲基(+57.021Da)。关于动态修饰(DynamicModification)，设定甲硫氨酸的氧化(+15.995Da)和对赖氨酸残基的修饰体(经受了采用碘乙酰胺的脲甲基化的巯基引入体(+145.019Da))。进而，设置筛选器(filter)以使肽置信度(peptide confidence)仅为高。
此外，作为修饰部位的检索对象的氨基酸序列的数据，使用图4所示的(1)、(3)。
(2-4)曲妥珠单抗的基于LC-MS/MS的修饰部位的分析结果
使用LC-MS/MS的分析的结果是，观测了曲妥珠单抗的采用胰蛋白酶消化的包含对赖氨酸残基的修饰部位(经受了采用碘乙酰胺的脲甲基化的巯基引入体(+145.019Da))的由33个氨基酸残基形成的肽、THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISR(SEQ ID NO:6)的肽片段的MS谱(实测值:m/z 1269.30717，理论值:1269.30273，三价)(图6)，根据CID谱确认了表示重链的EU numbering中的248位的赖氨酸残基的修饰的、对应于二价的y9的m/z 603.29(理论值:603.30)的产物离子(product ion)(图7-1)。此外，通过采用Proteome Discoverer的分析，表明高选择性地发生了对第246位或第248位的赖氨酸残基的修饰(图7-2)。
此外，观测了曲妥珠单抗的采用Glu-C蛋白酶消化的包含对赖氨酸残基的修饰部位(经受了采用碘乙酰胺的脲甲基化的巯基引入体(+145.019Da))的由16个氨基酸残基形成的肽、LLGGPSVFLFPPKPKD(SEQ ID NO:7)的肽片段的MS谱(实测值:m/z 619.67299，理论值:619.67112，三价)(图8)，根据CID谱确认了表示重链的EU numbering中的第246位或第248位的赖氨酸残基的修饰的、对应于一价的y5的m/z 729.49(理论值:729.36)的产物离子(图9-1)。此外，通过采用Proteome Discoverer的分析，表明高选择性地发生了对第246位或第248位的赖氨酸残基的修饰(图9-2)。
由该结果可知，实施例1的(1-3)中，抗体上在重链的EU numbering中的Lys246及Lys248处区域选择性地进行偶联。
[实施例3：曲妥珠单抗-肽复合物的二硫连接体切割及再氧化、荧光标记及它们的产物的分析]
(3-1)曲妥珠单抗-肽复合物的连接体切割及再氧化以及它们的产物的基于ESI-TOFMS的分析
首先，将1.9mg实施例1的(1-4)中合成的曲妥珠单抗-肽复合物溶解于60mM的磷酸缓冲液(pH 7.0)，调整至18μM后，添加51.4μL的10mM的三(2-羧基乙基)膦(相对于曲妥珠单抗-肽复合物为40当量)，室温下搅拌1小时，切割连接体中的二硫键。
接着，为了使与连接体中的二硫键一起被切割的抗体中的二硫键再次形成，进行了再氧化的工序(Jagath R Junutula等,NATURE BIOTECHNOLOGY,26(8),925-932(2008))。具体来说，将反应液用Amicon 10K溶剂置换为9.57mM的PBS缓冲液(pH 7.0)，将曲妥珠单抗-肽复合物的浓度调整为18μM后，加入48.6μL的10mM的脱氢抗坏血酸(相对于曲妥珠单抗-肽复合物为40当量)并搅拌3小时，从而进行了再氧化。通过ESI-TOFMS测定质量时，关于产物，引入了2个硫代丙酰基在145329观测到峰。
接着，对于区域选择性地引入的硫代丙酰基进行荧光标记。将引入了硫代丙酰基的曲妥珠单抗溶剂置换为9.57mM的PBS缓冲液(pH 7.0)，将曲妥珠单抗-肽复合物的浓度调整为18μM后，加入6.8μL的5mM的荧光素-5-马来酰亚胺(相对于曲妥珠单抗-硫代丙酰基引入体为10当量)并搅拌2小时，从而进行了荧光标记。向生成的曲妥珠单抗荧光标记体中加入5μL的7mM的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐溶液(相对于抗体为等量)，室温下搅拌20分钟，通过ESI-TOFMS测定了质量。关于原料的硫代丙酰基曲妥珠单抗，在50682、50844观测到重链峰，并在23440观测到轻链峰；关于产物，在重链中引入了荧光标记体在51109、51272观测到峰，并且与原料同样在23440观测到轻链峰。应予说明，测定产物时，重链原料的50682、50844的峰消失，所以认为荧光素-5-马来酰亚胺与所有的重链进行了反应。根据本结果，认为实际合成ADC时也可按照DAR(Drug Antibody Ratio，药物抗体比)2.0进行控制。
(3-2)连接体切割、再氧化后的HIC-UPLC分析
通过HIC对(3-1)中生成的抗体-肽复合物和原料的抗体进行了分析。柱使用了Protein-Pak Hi Res HIC柱(沃特世公司)4.6×100mm 2.5μm。使用A_Buffer:0.1M PiNa,2.3M(NH4)2SO4,pH7.0、B_Buffer:0.1M PiNa,pH7.0，流速为0.6mL/分钟，梯度设为A 60％B40％→A0％B 100％、16分钟(数据采集20分钟)，柱温为40℃，恒温器温度为40℃，检测器用280nm的波长进行了检测。
对于样品，按照以下的条件进行反应。
a:曲妥珠单抗+肽二硫连接体偶联物-NHS活化体30当量；
b:曲妥珠单抗+连接体切割、再氧化后样品。
保留时间12.7157分钟被认为是曲妥珠单抗中引入了2个肽的化合物，11.2909分钟被认为是曲妥珠单抗中引入了2个硫代丙酰基的化合物(图10)。
[实施例4：具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物(肽二硫连接体偶联物-NHS活化体)的合成、以及使用该化合物的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的修饰及其分析]
(4-1)IgG1 Fc结合性肽的合成
通过与实施例1(1-1)同样的方法合成了Ac-RGNCAYHKGQIVWCTYH-NH2(SEQ ID NO:8)的肽，并进行纯化，获得了目标物(63.2mg，30.4μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 693.35[M+3H]3+,z＝4 520.30[M+4H]4+
(4-2)Ac-RGNCAYHKGQIVWCTYH-NH2(SEQ ID NO:8)的第4位和第14位的Cys处的分子内二硫键的形成
[化学式52]
Figure BDA0002827785710001151
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:8。
将(4-1)中合成的肽(63.2mg，30.4μmol)溶解于DMSO成为100mM后，加入2当量的2MNH3-MeOH、1当量的过氧化氢水溶液，在室温下进行20小时搅拌。向反应溶液中加入2M三氟乙酸水溶液停止反应，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而仅除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽(25.3mg，12.2μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 692.70[M+3H]3+,z＝4 520.30[M+4H]4+
(4-3)二硫连接体与肽的偶联
[化学式53]
Figure BDA0002827785710001161
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:8。
将(4-2)中合成的Ac-RGNCAYHKGQIVWCTYH-NH2(SEQ ID NO:8)(25.3mg，12.2μmol，其中，第4位和第14位的2个半胱氨酸分别在分子内形成二硫键)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(1.00mL)，加入将3,3'-二硫代二丙酸二(N-琥珀酰亚胺酯)(197mg，488μmol)溶解于乙腈(1.50mL)而得的溶液，室温下搅拌24小时。通过减压浓缩而除去乙腈后，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽二硫连接体偶联物-NHS活化体(6.0mg，2.54μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 789.20[M+3H]3+
HPLC纯度:89％
(4-4)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰和基于ESI-TOFMS的分析
将(4-3)中合成的肽二硫连接体偶联物-NHS活化体溶解于N,N'-二甲基甲酰胺成为21.6mM。使500μg的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗(中外制药株式会社)溶解于46.9μL的60mM的乙酸钠缓冲液(pH 4.7)，加入4.7μL的21.6mM的肽试剂(相对于抗体为30当量)，室温下搅拌1小时。将反应液添加至NAP-5柱，使反应停止，置换为20mM的PBS缓冲液。通过ESI-TOFMS测定质量时，引入了1个结合性肽的产物在150314确认到峰，引入了2个结合性肽的产物在152568确认到峰。
(4-5)曲妥珠单抗的特异性修饰体的还原条件下的基于ESI-TOFMS分析的重链选择性的确认
向(4-4)中生成的抗体-肽复合物中加入5μL的7mM的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐溶液(相对于抗体为等量)，室温下搅拌20分钟。通过ESI-TOFMS测定质量时，关于原料的曲妥珠单抗，在50595、50756观测到重链峰，并在23439观测到轻链峰；关于产物，在重链中引入了硫代丙酰基在50682、50844观测到峰，并且与原料同样在23439观测到轻链峰。
(4-6)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析
通过HIC对(4-5)中生成的抗体-肽复合物和原料的抗体进行了分析。柱使用了Protein-Pak Hi Res HIC柱(沃特世公司)4.6×100mm 2.5μm。使用A_Buffer:0.1M PiNa,2.3M(NH4)2SO4,pH7.0、B_Buffer:0.1M PiNa,pH7.0，流速为0.6mL/分钟，梯度设为A 60％B40％→A0％B 100％、16分钟(数据采集20分钟)，柱温为40℃，恒温器温度为40℃，检测器用280nm的波长进行了检测。
对于样品，按照以下的条件进行反应。
a:曲妥珠单抗原料；
b:曲妥珠单抗+肽二硫连接体偶联物-NHS活化体30当量。
保留时间10.6944分钟被认为是引入了1个肽的化合物，11.3287分钟被认为是引入了2个肽的化合物(图11)。
(4-7)曲妥珠单抗-肽复合物的连接体切割和再氧化
通过实施例3的(3-1)记载的方法进行(4-4)中得到的抗体-肽复合物的连接体切割和再氧化，就可获得对EU numbering中的Lys246及Lys248区域选择性地引入了硫代丙酰基的抗体。
[实施例5：具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物(肽二硫连接体偶联物-NHS活化体)的合成、以及使用该化合物的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的修饰及其分析]
(5-1)IgG1 Fc结合性肽的合成
通过与实施例1(1-1)同样的方法合成了Ac-RGNCAYHKGQVVWCTYH-NH2(SEQ ID NO:9)的肽，并进行纯化，获得了目标物(69.3mg，33.6μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 688.80[M+3H]3+,z＝4 516.85[M+4H]4+
(5-2)Ac-RGNCAYHKGQVVWCTYH-NH2(SEQ ID NO:9)的第4位和第14位的Cys处的分子内二硫键的形成
[化学式54]
Figure BDA0002827785710001181
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:9。
将(5-1)中合成的肽(69.3mg，33.6μmol)溶解于DMSO成为100mM后，加入2当量的2MNH3-MeOH、1当量的过氧化氢水溶液，在室温下进行20小时搅拌。向反应溶液中加入2M三氟乙酸水溶液停止反应，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽(35.8mg，17.3μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 688.05[M+3H]3+,z＝4 516.30[M+4H]4+
(5-3)二硫连接体与肽的偶联
[化学式55]
Figure BDA0002827785710001182
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:9。
将(5-2)中合成的Ac-RGNCAYHKGQVVWCTYH-NH2(SEQ ID NO:9)(35.8mg，17.3μmol，其中，第4位和第14位的2个半胱氨酸分别在分子内形成二硫键)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(1.00mL)，加入将3,3'-二硫代二丙酸二(N-琥珀酰亚胺酯)(280mg，692μmol)溶解于乙腈(2.00mL)而得的溶液，室温下搅拌24小时。通过减压浓缩而除去乙腈后，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽二硫连接体偶联物-NHS活化体(5.5mg，2.34μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 784.55[M+3H]3+
HPLC纯度:71％
(5-4)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰和基于ESI-TOFMS的分析
将(5-3)中合成的肽二硫连接体偶联物-NHS活化体溶解于N,N'-二甲基甲酰胺成为21.6mM。使500μg的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗(中外制药株式会社)溶解于46.9μL的60mM的乙酸钠缓冲液(pH 4.7)，加入4.7μL的21.6mM的肽试剂(相对于抗体为30当量)，室温下搅拌1小时。将反应液添加至NAP-5柱，使反应停止，置换为20mM的PBS缓冲液。通过ESI-TOFMS测定质量时，引入了1个结合性肽的产物在150314确认到峰，引入了2个结合性肽的产物在152568确认到峰。
(5-5)曲妥珠单抗的特异性修饰体的还原条件下的基于ESI-TOFMS分析的重链选择性的确认
向(5-4)中生成的抗体-肽复合物中加入5μL的7mM的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐溶液(相对于抗体为等量)，室温下搅拌20分钟。通过ESI-TOFMS测定质量时，关于原料的曲妥珠单抗，在50595、50756观测到重链峰，并在23439观测到轻链峰；关于产物，在重链中引入了硫代丙酰基在50683、50845观测到峰，并且与原料同样在23439观测到轻链峰。
(5-6)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析
通过HIC对(5-5)中生成的抗体-肽复合物和原料的抗体进行了分析。柱使用了Protein-Pak Hi Res HIC柱(沃特世公司)4.6×100mm 2.5μm。使用A_Buffer:0.1M PiNa,2.3M(NH4)2SO4,pH7.0、B_Buffer:0.1M PiNa,pH7.0，流速为0.6mL/分钟，梯度设为A 60％B40％→A0％B 100％、16分钟(数据采集20分钟)，柱温为40℃，恒温器温度为40℃，检测器用280nm的波长进行了检测。
对于样品，按照以下的条件进行反应。
a:曲妥珠单抗原料；
b:曲妥珠单抗+肽二硫连接体偶联物-NHS活化体30当量。
保留时间10.1410分钟被认为是引入了1个肽的化合物，10.7091分钟被认为是引入了2个肽的化合物(图12)。
(5-7)曲妥珠单抗-肽复合物的连接体切割和再氧化
通过实施例3的(3-1)记载的方法进行(5-4)中得到的抗体-肽复合物的连接体切割和再氧化，就可获得对EU numbering中的Lys246及Lys248区域选择性地引入了硫代丙酰基的抗体。
[实施例6：曲妥珠单抗的巯基引入体的肽谱分析]
(6-1)曲妥珠单抗的巯基引入体的胰蛋白酶处理
对于实施例5的(5-3)中得到的抗体-肽复合物通过PNGaseF(新英格兰生物实验室公司制)进行了糖链切割(糖基化)后，进行了肽谱分析。向1.5mL低吸附微试管中加入10μL样品溶液、50mM碳酸氢铵缓冲液、10μL溶解于40％三氟乙醇的20mM的二硫苏糖醇水溶液，在65℃加温1小时后，添加10μL的50mM的碘乙酰胺水溶液，遮光下于室温以300rpm振荡反应30分钟。反应后，加入40μL的50mM碳酸氢铵缓冲液搅拌，添加10μL的20ng/μL的胰蛋白酶水溶液并在37℃进行了18小时的酶消化。消化后，加入2μL的20％三氟乙酸水溶液，停止反应，实施了LC-MS/MS测定。
(6-2)曲妥珠单抗的LC-MS/MS测定条件
(分析装置)
纳米HPLC：EASY-nLC 1000(赛默飞世尔科技公司)
质谱仪：Tribrid质谱仪Orbitrap Fusion(赛默飞世尔科技公司)
(HPLC分析条件)
捕集柱：Acclaim PepMap(注册商标)100，75μm×2cm(赛默飞世尔科技公司)
分析柱：ESI-column(NTCC-360/75-3-125,75μm×12.5cm,3μm(日京技术株式会社))
流动相A：0.1％甲酸水溶液
流动相B：0.1％甲酸，乙腈溶液
加样溶液：0.1％三氟乙酸水溶液
流速：300nL/分钟
样品注入量：1μL
梯度条件(B％)：2％(0.0-0.5分)、2％→30％(0.5-23.5分)、30％→75％(23.5-25.5分)、75％(25.5-35.0分)
(质谱仪的分析条件)
离子化方法：ESI，正离子化模式
扫描类型：数据依赖性获取
活化类型：碰撞诱导离解(Collision Induced Dissociation，CID)
数据的获取使用作为附属软件的Xcalibur 3.0(赛默飞世尔科技公司)及ThermoOrbitrap Fusion Tune Application 2.0(赛默飞世尔科技公司)进行。
(6-3)曲妥珠单抗的修饰部位的分析条件
关于对LC-MS/MS测定结果的修饰部位分析，使用Proteome Discoverer version 1.4(赛默飞世尔科技公司)进行。
关于采用Proteome Discoverer的分析，使用Sequest HT作为搜索引擎，前体离子的范围设为350～5000Da，总强度阈值(Total Intensity Threshold)设为50000。此外，将胰蛋白酶设定为消化酶，最大漏切位点(Maximum Missed Cleavage Site)设为3。此外，前体和碎片离子(fragment ion)的质量容差(Mass Tolerance)分别设为5ppm和0.5Da。关于静态修饰(Static Modification)，作为采用碘乙酰胺的半胱氨酸残基的修饰，设定脲甲基(+57.021Da)。关于动态修饰，设定甲硫氨酸的氧化(+15.995Da)和对赖氨酸残基的修饰体(经受了采用碘乙酰胺的脲甲基化的巯基引入体(+145.019Da))。进而，设置筛选器以使肽置信度仅为高。
此外，作为修饰部位的检索对象的氨基酸序列的数据，使用图4所示的(1)、(3)。
(6-4)曲妥珠单抗的基于LC-MS/MS的修饰部位的分析结果
使用LC-MS/MS的分析的结果是，观测了曲妥珠单抗的采用胰蛋白酶消化的包含对赖氨酸残基的修饰部位(经受了采用碘乙酰胺的脲甲基化的巯基引入体(+145.019Da))的由33个氨基酸残基形成的肽、THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISR(SEQ ID NO:6)的肽片段的MS谱(实测值:m/z 952.23170，理论值:952.22900，4价)(图13)，根据CID谱确认了表示重链的EU numbering中的第246位或第248位的赖氨酸残基的修饰的、对应于二价的y20的m/z1166.88(理论值:1166.61)的产物离子(图14-1)。此外，通过采用Proteome Discoverer的分析，表明高选择性地发生了对第246位或第248位的赖氨酸残基的修饰(图14-2)。由该结果可知，实施例5的(5-3)中，抗体上在重链上EU numbering中的Lys246及Lys248区域选择性地进行偶联。
[实施例7：具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物(肽二硫连接体偶联物-NHS活化体)的合成、以及使用该化合物的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的修饰及其分析]
(7-1)IgG1 Fc结合性肽的合成
通过与实施例1(1-1)同样的方法合成了Ac-RGNCAYHKGQAVWCTYH-NH2(SEQ ID NO:10)的肽，并进行纯化，获得了目标物(73.1mg，35.9μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 674.70[M+3H]3+,z＝4 506.30[M+4H]4+
(7-2)Ac-RGNCAYHKGQAVWCTYH-NH2(SEQ ID NO:10)的第4位和第14位的Cys处的分子内二硫键的形成
[化学式56]
Figure BDA0002827785710001221
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:10。
将(7-1)中合成的肽(73.1mg，35.9μmol)溶解于DMSO成为100mM后，加入2当量的2MNH3-MeOH、1当量的过氧化氢水溶液，在室温下进行20小时搅拌。向反应溶液中加入2M三氟乙酸水溶液停止反应，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽(30.5mg，15.0μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 678.75[M+3H]3+,z＝4 509.30[M+4H]4+
(7-3)二硫连接体与肽的偶联
[化学式57]
Figure BDA0002827785710001222
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:10。
将(7-2)中合成的Ac-RGNCAYHKGQAVWCTYH-NH2(SEQ ID NO:10)(30.5mg，15.0μmol，其中，第4位和第14位的2个半胱氨酸分别在分子内形成二硫键)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(1.00mL)，加入将3,3'-二硫代二丙酸二(N-琥珀酰亚胺酯)(243mg，600μmol)溶解于乙腈(1.50mL)而得的溶液，室温下搅拌24小时。通过减压浓缩而除去乙腈后，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽二硫连接体偶联物-NHS活化体(5.4mg，2.32μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 775.15[M+3H]3+
HPLC纯度:89％
(7-4)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰和基于ESI-TOFMS的分析
将(7-3)中合成的肽二硫连接体偶联物-NHS活化体溶解于N,N'-二甲基甲酰胺成为21.6mM。使500μg的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗(中外制药株式会社)溶解于46.9μL的60mM的乙酸钠缓冲液(pH 4.7)，加入4.7μL的21.6mM的肽试剂(相对于抗体为30当量)，室温下搅拌1小时。将反应液添加至NAP-5柱，使反应停止，置换为20mM的PBS缓冲液。通过ESI-TOFMS测定质量时，引入了1个结合性肽的产物在150268确认到峰，引入了2个结合性肽的产物在152630确认到峰。
(7-5)曲妥珠单抗的特异性修饰体的还原条件下的基于ESI-TOFMS分析的重链选择性的确认
向(7-4)中生成的抗体-肽复合物中加入5μL的7mM的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐溶液(相对于抗体为等量)，室温下搅拌20分钟。通过ESI-TOFMS测定质量时，关于原料的曲妥珠单抗，在50595、50756观测到重链峰，并在23440观测到轻链峰；关于产物，在重链中引入了硫代丙酰基在50683、50844观测到峰，并且与原料同样在23439观测到轻链峰。
(7-6)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析
通过HIC对(7-5)中生成的抗体-肽复合物和原料的抗体进行了分析。柱使用了Protein-Pak Hi Res HIC柱(沃特世公司)4.6×100mm 2.5μm。使用A_Buffer:0.1M PiNa,2.3M(NH4)2SO4,pH7.0、B_Buffer:0.1M PiNa,pH7.0，流速为0.6mL/分钟，梯度设为A 60％B40％→A0％B 100％、16分钟(数据采集20分钟)，柱温为40℃，恒温器温度为40℃，检测器用280nm的波长进行了检测。
对于样品，按照以下的条件进行反应。
a:曲妥珠单抗原料；
b:曲妥珠单抗+肽二硫连接体偶联物-NHS活化体30当量。
保留时间10.2505分钟被认为是引入了1个肽的化合物，10.7621分钟被认为是引入了2个肽的化合物(图15)。
(7-7)曲妥珠单抗-肽复合物的连接体切割和再氧化
通过实施例3的(3-1)记载的方法进行(7-4)中得到的抗体-肽复合物的连接体切割和再氧化，就可获得对EU numbering中的Lys246及Lys248区域选择性地引入了硫代丙酰基的抗体。
[实施例8：具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物(肽二硫连接体偶联物-NHS活化体)的合成、以及使用该化合物的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的修饰及其分析]
(8-1)IgG1 Fc结合性肽的合成
通过与实施例1(1-1)同样的方法合成了Ac-RGNCAYHKGQLLWCTYH-NH2(SEQ ID NO:11)的肽，并进行纯化，获得了目标物(30.3mg，14.5μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 698.05[M+3H]3+,z＝4 532.80[M+4H]4+
(8-2)Ac-RGNCAYHKGQLLWCTYH-NH2(SEQ ID NO:11)的第4位和第14位的Cys处的分子内二硫键的形成
[化学式58]
Figure BDA0002827785710001241
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:11。
将(8-1)中合成的肽(30.3mg，14.5μmol)溶解于DMSO成为100mM后，加入2当量的2MNH3-MeOH、1当量的过氧化氢水溶液，在室温下进行20小时搅拌。向反应溶液中加入2M三氟乙酸水溶液停止反应，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽(11.9mg，5.70μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 697.35[M+3H]3+,z＝4 523.30[M+4H]4+
(8-3)二硫连接体与肽的偶联
[化学式59]
Figure BDA0002827785710001251
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:11。
将(8-2)中合成的Ac-RGNCAYHKGQLLWCTYH-NH2(SEQ ID NO:11)(11.9mg，5.70μmol，其中，第4位和第14位的2个半胱氨酸分别在分子内形成二硫键)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(1.00mL)，加入将3,3'-二硫代二丙酸二(N-琥珀酰亚胺酯)(92mg，228μmol)溶解于乙腈(1.00mL)而得的溶液，室温下搅拌24小时。通过减压浓缩而除去乙腈后，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽二硫连接体偶联物-NHS活化体(6.0mg，2.52μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 793.85[M+3H]3+
HPLC纯度:75％
(8-4)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰和基于ESI-TOFMS的分析
将(8-3)中合成的肽二硫连接体偶联物-NHS活化体溶解于N,N'-二甲基甲酰胺成为21.6mM。使500μg的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗(中外制药株式会社)溶解于46.9μL的60mM的乙酸钠缓冲液(pH 4.7)，加入4.7μL的21.6mM的肽试剂(相对于抗体为30当量)，室温下搅拌1小时。将反应液添加至NAP-5柱，使反应停止，置换为20mM的PBS缓冲液。通过ESI-TOFMS测定质量时，原料的曲妥珠单抗在148073观测到峰，引入了1个结合性肽的产物在150495观测到峰，引入了2个结合性肽的产物在152752确认到峰。
(8-5)曲妥珠单抗的特异性修饰体的还原条件下的基于ESI-TOFMS分析的重链选择性的确认
向(8-4)中生成的抗体-肽复合物中加入5μL的7mM的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐溶液(相对于抗体为等量)，室温下搅拌20分钟。通过ESI-TOFMS测定质量时，关于原料的曲妥珠单抗，在50595、50756观测到重链峰，并在23440观测到轻链峰；关于产物，在重链中引入了硫代丙酰基在50682、50844观测到峰，并且与原料同样在23439观测到轻链峰。
(8-6)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析
通过HIC对(8-5)中生成的抗体-肽复合物和原料的抗体进行了分析。柱使用了Protein-Pak Hi Res HIC柱(沃特世公司)4.6×100mm 2.5μm。使用A_Buffer:0.1M PiNa,2.3M(NH4)2SO4,pH7.0、B_Buffer:0.1M PiNa,pH7.0，流速为0.6mL/分钟，梯度设为A 60％B40％→A0％B 100％、16分钟(数据采集20分钟)，柱温为40℃，恒温器温度为40℃，检测器用280nm的波长进行了检测。
对于样品，按照以下的条件进行反应。
a:曲妥珠单抗原料；
b:曲妥珠单抗+肽二硫连接体偶联物-NHS活化体30当量。
保留时间10.4200分钟被认为是引入了1个肽的化合物，11.0303分钟被认为是引入了2个肽的化合物(图16)。
(8-7)曲妥珠单抗-肽复合物的连接体切割和再氧化
通过实施例3的(3-1)记载的方法进行(8-4)中得到的抗体-肽复合物的连接体切割和再氧化，就可获得对EU numbering中的Lys246及Lys248区域选择性地引入了硫代丙酰基的抗体。
[实施例9：具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物(肽二硫连接体偶联物-NHS活化体)的合成、以及使用该化合物的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的修饰及其分析]
(9-1)IgG1 Fc结合性肽的合成
通过与实施例1(1-1)同样的方法合成了Ac-RGNCAYHKGQLIWCTYH-NH2(SEQ ID NO:12)的肽，并进行纯化，获得了目标物(40.0mg，19.1μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 698.10[M+3H]3+,z＝4 532.80[M+4H]4+
(9-2)Ac-RGNCAYHKGQLIWCTYH-NH2(SEQ ID NO:12)的第4位和第14位的Cys处的分子内二硫键的形成
[化学式60]
Figure BDA0002827785710001271
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:12。
将(9-1)中合成的肽(40.0mg，19.1μmol)溶解于DMSO成为100mM后，加入2当量的2MNH3-MeOH、1当量的过氧化氢水溶液，在室温下进行20小时搅拌。向反应溶液中加入2M三氟乙酸水溶液停止反应，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽(13.5mg，6.46μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 697.40[M+3H]3+,z＝4 523.30[M+4H]4+
(9-3)二硫连接体与肽的偶联
[化学式61]
Figure BDA0002827785710001272
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:12。
将(9-2)中合成的Ac-RGNCAYHKGQLIWCTYH-NH2(SEQ ID NO:12)(13.5mg，6.46μmol，其中，第4位和第14位的2个半胱氨酸分别在分子内形成二硫键)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(1.00mL)，加入将3,3'-二硫代二丙酸二(N-琥珀酰亚胺酯)(104mg，258μmol)溶解于乙腈(1.00mL)而得的溶液，室温下搅拌24小时。通过减压浓缩而除去乙腈后，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽二硫连接体偶联物-NHS活化体(5.5mg，2.31μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 793.75[M+3H]3+
HPLC纯度:90％
(9-4)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰和基于ESI-TOFMS的分析
将(9-3)中合成的肽二硫连接体偶联物-NHS活化体溶解于N,N'-二甲基甲酰胺成为21.6mM。使500μg的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗(中外制药株式会社)溶解于46.9μL的60mM的乙酸钠缓冲液(pH 4.7)，加入4.7μL的21.6mM的肽试剂(相对于抗体为30当量)，室温下搅拌1小时。将反应液添加至NAP-5柱，使反应停止，置换为20mM的PBS缓冲液。通过ESI-TOFMS测定质量时，引入了2个结合性肽的产物在152758确认到峰。
(9-5)曲妥珠单抗的特异性修饰体的还原条件下的基于ESI-TOFMS分析的重链选择性的确认
向(9-4)中生成的抗体-肽复合物中加入5μL的7mM的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐溶液(相对于抗体为等量)，室温下搅拌20分钟。通过ESI-TOFMS测定质量时，关于原料的曲妥珠单抗，在50595、50756观测到重链峰，并在23440观测到轻链峰；关于产物，在重链中引入了硫代丙酰基在50682、50844观测到峰，并且与原料同样在23439观测到轻链峰。
(9-6)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析
通过HIC对(9-5)中生成的抗体-肽复合物和原料的抗体进行了分析。柱使用了Protein-Pak Hi Res HIC柱(沃特世公司)4.6×100mm 2.5μm。使用A_Buffer:0.1M PiNa,2.3M(NH4)2SO4,pH7.0、B_Buffer:0.1M PiNa,pH7.0，流速为0.6mL/分钟，梯度设为A 60％B40％→A0％B 100％、16分钟(数据采集20分钟)，柱温为40℃，恒温器温度为40℃，检测器用280nm的波长进行了检测。
对于样品，按照以下的条件进行反应。
a:曲妥珠单抗原料；
b:曲妥珠单抗+肽二硫连接体偶联物-NHS活化体30当量。
保留时间11.2883分钟被认为是引入了2个肽的化合物(图17)。
(9-7)曲妥珠单抗-肽复合物的连接体切割和再氧化
通过实施例3的(3-1)记载的方法进行(9-4)中得到的抗体-肽复合物的连接体切割和再氧化，就可获得对EU numbering中的Lys246及Lys248区域选择性地引入了硫代丙酰基的抗体。
[实施例10：具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物(肽二硫连接体偶联物-NHS活化体)的合成、以及使用该化合物的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的修饰及其分析]
(10-1)IgG1 Fc结合性肽的合成
通过与实施例1(1-1)同样的方法合成了Ac-DCAYHKGQIVWCT-NH2(SEQ ID NO:13)的肽，并进行纯化，获得了目标物(314mg，200μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝2 783.30[M+2H]2+
(10-2)Ac-DCAYHKGQIVWCT-NH2(SEQ ID NO:13)的第2位和第12位的Cys处的分子内二硫键的形成
[化学式62]
Figure BDA0002827785710001291
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:13。
将(10-1)中合成的肽(314mg，200μmol)溶解于DMSO成为100mM后，加入2当量的2MNH3-MeOH、1当量的过氧化氢水溶液，在室温下进行20小时搅拌。向反应溶液中加入2M三氟乙酸水溶液停止反应，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽(47.8mg，30.6μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝2 782.20[M+2H]2+
(10-3)二硫连接体与肽的偶联
[化学式63]
Figure BDA0002827785710001301
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:13。
将(10-2)中合成的Ac-DCAYHKGQIVWCT-NH2(SEQ ID NO:13)(47.8mg，30.6μmol，其中，第2位和第12位的2个半胱氨酸分别在分子内形成二硫键)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(1.00mL)，加入将3,3'-二硫代二丙酸二(N-琥珀酰亚胺酯)(493mg，1.22mmol)溶解于乙腈(2.00mL)而得的溶液，室温下搅拌24小时。通过减压浓缩而除去乙腈后，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽二硫连接体偶联物-NHS活化体(14.0mg，7.59μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝2 926.70[M+2H]2+
HPLC纯度:90％
(10-4)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰和基于ESI-TOFMS的分析
将(10-3)中合成的肽二硫连接体偶联物-NHS活化体溶解于N,N'-二甲基甲酰胺成为21.6mM。使500μg的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗(中外制药株式会社)溶解于46.9μL的60mM的乙酸钠缓冲液(pH 4.7)，加入4.7μL的21.6mM的肽试剂(相对于抗体为30当量)，室温下搅拌1小时。将反应液添加至NAP-5柱，使反应停止，置换为20mM的PBS缓冲液。通过ESI-TOFMS测定质量时，引入了2个结合性肽的产物在152053确认到峰。
(10-5)曲妥珠单抗的特异性修饰体的还原条件下的基于ESI-TOFMS分析的重链选择性的确认
向(10-4)中生成的抗体-肽复合物中加入5μL的7mM的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐溶液(相对于抗体为等量)，室温下搅拌20分钟。通过ESI-TOFMS测定质量时，关于原料的曲妥珠单抗，在50595、50756观测到重链峰，并在23440观测到轻链峰；关于产物，在重链中引入了硫代丙酰基在50682、50844观测到峰，并且与原料同样在23439观测到轻链峰。
(10-6)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析
通过HIC对(10-5)中生成的抗体-肽复合物和原料的抗体进行了分析。柱使用了Protein-Pak Hi Res HIC柱(沃特世公司)4.6×100mm 2.5μm。使用A_Buffer:0.1M PiNa,2.3M(NH4)2SO4,pH7.0、B_Buffer:0.1M PiNa,pH7.0，流速为0.6mL/分钟，梯度设为A 60％B40％→A0％B 100％、16分钟(数据采集20分钟)，柱温为40℃，恒温器温度为40℃，检测器用280nm的波长进行了检测。
对于样品，按照以下的条件进行反应。
a:曲妥珠单抗原料；
b:曲妥珠单抗+肽二硫连接体偶联物-NHS活化体30当量。
保留时间12.9609分钟被认为是引入了2个肽的化合物(图18)。
(10-7)曲妥珠单抗-肽复合物的连接体切割和再氧化
通过实施例3的(3-1)记载的方法进行(10-4)中得到的抗体-肽复合物的连接体切割和再氧化，就可获得对EU numbering中的Lys246及Lys248区域选择性地引入了硫代丙酰基的抗体。
[实施例11：具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物(肽二硫连接体偶联物-NHS活化体)的合成、以及使用该化合物的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的修饰及其分析]
(11-1)IgG1 Fc结合性肽的合成
通过与实施例1(1-1)同样的方法合成了Ac-DCAYHKGQVVWCT-NH2(SEQ ID NO:14)的肽，并进行纯化，获得了目标物(180mg，116μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝1 1551.0[M+H]+,z＝2 776.30[M+2H]2+
(11-2)Ac-DCAYHKGQVVWCT-NH2(SEQ ID NO:14)的第2位和第12位的Cys处的分子内二硫键的形成
[化学式64]
Figure BDA0002827785710001321
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:14。
将(11-1)中合成的肽(180mg，116μmol)溶解于DMSO成为100mM后，加入2当量的2MNH3-MeOH、1当量的过氧化氢水溶液，在室温下进行20小时搅拌。向反应溶液中加入2M三氟乙酸水溶液停止反应，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽(36.4mg，23.5μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝1 1549.95[M+H]+,z＝2 775.30[M+2H]2+
(11-3)二硫连接体与肽的偶联
[化学式65]
Figure BDA0002827785710001322
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:14。
将(11-2)中合成的Ac-DCAYHKGQVVWCT-NH2(SEQ ID NO:14)(36.4mg，23.5μmol，其中，第2位和第12位的2个半胱氨酸分别在分子内形成二硫键)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(1.50mL)，加入将3,3'-二硫代二丙酸二(N-琥珀酰亚胺酯)(380mg，0.94mmol)溶解于乙腈(2.50mL)而得的溶液，室温下搅拌24小时。通过减压浓缩而除去乙腈后，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽二硫连接体偶联物-NHS活化体(16.0mg，8.70μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝2 919.95[M+2H]2+
HPLC纯度:90％
(11-4)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰和基于ESI-TOFMS的分析
将(11-3)中合成的肽二硫连接体偶联物-NHS活化体溶解于N,N'-二甲基甲酰胺成为21.6mM。使500μg的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗(中外制药株式会社)溶解于46.9μL的60mM的乙酸钠缓冲液(pH 4.7)，加入4.7μL的21.6mM的肽试剂(相对于抗体为30当量)，室温下搅拌1小时。将反应液添加至NAP-5柱，使反应停止，置换为20mM的PBS缓冲液。通过ESI-TOFMS测定质量时，引入了1个结合性肽的产物在149220确认到峰，引入了2个结合性肽的产物在151861确认到峰。
(11-5)曲妥珠单抗的特异性修饰体的还原条件下的基于ESI-TOFMS分析的重链选择性的确认
向(11-4)中生成的抗体-肽复合物中加入5μL的7mM的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐溶液(相对于抗体为等量)，室温下搅拌20分钟。通过ESI-TOFMS测定质量时，关于原料的曲妥珠单抗，在50595、50756观测到重链峰，并在23440观测到轻链峰；关于产物，在重链中引入了硫代丙酰基在50682、50844观测到峰，并且与原料同样在23439观测到轻链峰。
(11-6)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析
通过HIC对(11-5)中生成的抗体-肽复合物和原料的抗体进行了分析。柱使用了Protein-Pak Hi Res HIC柱(沃特世公司)4.6×100mm 2.5μm。使用A_Buffer:0.1M PiNa,2.3M(NH4)2SO4,pH7.0、B_Buffer:0.1M PiNa,pH7.0，流速为0.6mL/分钟，梯度设为A 60％B40％→A0％B 100％、16分钟(数据采集20分钟)，柱温为40℃，恒温器温度为40℃，检测器用280nm的波长进行了检测。
对于样品，按照以下的条件进行反应。
a:曲妥珠单抗原料；
b:曲妥珠单抗+肽二硫连接体偶联物-NHS活化体30当量。
保留时间11.1071分钟被认为是在曲妥珠单抗中引入了1个肽的化合物，12.5114分钟被认为是引入了2个肽的化合物(图19)。
(11-7)曲妥珠单抗-肽复合物的连接体切割和再氧化
通过实施例3的(3-1)记载的方法进行(11-4)中得到的抗体-肽复合物的连接体切割和再氧化，就可获得对EU numbering中的Lys246及Lys248区域选择性地引入了硫代丙酰基的抗体。
[实施例12：具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物(肽二硫连接体偶联物-NHS活化体)的合成、以及使用该化合物的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的修饰及其分析]
(12-1)IgG1 Fc结合性肽的合成
通过与实施例1(1-1)同样的方法合成了Ac-DCAYHKGQAVWCT-NH2(SEQ ID NO:15)的肽，并进行纯化，获得了目标物(158mg，104μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝1 1523.95[M+H]+,z＝2 762.25[M+2H]2+
(12-2)Ac-DCAYHKGQAVWCT-NH2(SEQ ID NO:15)的第2位和第12位的Cys处的分子内二硫键的形成
[化学式66]
Figure BDA0002827785710001341
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:15。
将(12-1)中合成的肽(158mg，104μmol)溶解于DMSO成为100mM后，加入2当量的2MNH3-MeOH、1当量的过氧化氢水溶液，在室温下进行20小时搅拌。向反应溶液中加入2M三氟乙酸水溶液停止反应，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽(26.7mg，17.6μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝1 1521.80[M+H]+,z＝2 761.20[M+2H]2+
(12-3)二硫连接体与肽的偶联
[化学式67]
Figure BDA0002827785710001351
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:15。
将(12-2)中合成的Ac-DCAYHKGQAVWCT-NH2(SEQ ID NO:15)(26.7mg，17.6μmol，其中，第2位和第12位的2个半胱氨酸分别在分子内形成二硫键)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(1.50mL)，加入将3,3'-二硫代二丙酸二(N-琥珀酰亚胺酯)(380mg，0.94mmol)溶解于乙腈(2.00mL)而得的溶液，室温下搅拌24小时。通过减压浓缩而除去乙腈后，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽二硫连接体偶联物-NHS活化体(6.50mg，3.59μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝2 906.10[M+2H]2+
HPLC纯度:93％
(12-4)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰和基于ESI-TOFMS的分析
将(12-3)中合成的肽二硫连接体偶联物-NHS活化体溶解于N,N'-二甲基甲酰胺成为21.6mM。使500μg的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗(中外制药株式会社)溶解于46.9μL的60mM的乙酸钠缓冲液(pH 4.7)，加入4.7μL的21.6mM的肽试剂(相对于抗体为30当量)，室温下搅拌1小时。将反应液添加至NAP-5柱，使反应停止，置换为20mM的PBS缓冲液。通过ESI-TOFMS测定质量时，引入了1个结合性肽的产物在148897确认到峰，引入了2个结合性肽的产物在151619确认到峰。
(12-5)曲妥珠单抗的特异性修饰体的还原条件下的基于ESI-TOFMS分析的重链选择性的确认
向(12-4)中生成的抗体-肽复合物中加入5μL的7mM的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐溶液(相对于抗体为等量)，室温下搅拌20分钟。通过ESI-TOFMS测定质量时，关于原料的曲妥珠单抗，在50595、50756观测到重链峰，并在23440观测到轻链峰；关于产物，在重链中引入了硫代丙酰基在50684、50844观测到峰，并且与原料同样在23439观测到轻链峰。
(12-6)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析
通过HIC对(12-5)中生成的抗体-肽复合物和原料的抗体进行了分析。柱使用了Protein-Pak Hi Res HIC柱(沃特世公司)4.6×100mm 2.5μm。使用A_Buffer:0.1M PiNa,2.3M(NH4)2SO4,pH7.0、B_Buffer:0.1M PiNa,pH7.0，流速为0.6mL/分钟，梯度设为A 60％B40％→A0％B 100％、16分钟(数据采集20分钟)，柱温为40℃，恒温器温度为40℃，检测器用280nm的波长进行了检测。
对于样品，按照以下的条件进行反应。
a:曲妥珠单抗原料；
b:曲妥珠单抗+肽二硫连接体偶联物-NHS活化体30当量。
保留时间10.8489分钟被认为是在曲妥珠单抗中引入了1个肽的化合物，11.7649分钟被认为是引入了2个肽的化合物(图20)。
(12-7)曲妥珠单抗-肽复合物的连接体切割和再氧化
通过实施例3的(3-1)记载的方法进行(12-4)中得到的抗体-肽复合物的连接体切割和再氧化，就可获得对EU numbering中的Lys246及Lys248区域选择性地引入了硫代丙酰基的抗体。
[实施例13：具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物(肽二硫连接体偶联物-NHS活化体)的合成、以及使用该化合物的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的修饰及其分析]
(13-1)IgG1 Fc结合性肽的合成
通过与实施例1(1-1)同样的方法合成了Ac-RGNCAYHKSQIIWCTYH-NH2(SEQ ID NO:16)的肽，并进行纯化，获得了目标物(20.0mg，9.43μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 708.00[M+3H]3+,z＝4 531.35[M+4H]4+
(13-2)Ac-RGNCAYHKSQIIWCTYH-NH2(SEQ ID NO:16)的第4位和第14位的Cys处的分子内二硫键的形成
[化学式68]
Figure BDA0002827785710001371
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:16。
将(13-1)中合成的肽(20.0mg，9.43μmol)溶解于DMSO成为100mM后，加入2当量的2M NH3-MeOH、1当量的过氧化氢水溶液，在室温下进行20小时搅拌。向反应溶液中加入2M三氟乙酸水溶液停止反应，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽(12.0mg，5.66μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 707.50[M+3H]3+,z＝4 530.85[M+4H]4+
(13-3)二硫连接体与肽的偶联
[化学式69]
Figure BDA0002827785710001372
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:16。
将(13-2)中合成的Ac-RGNCAYHKSQIIWCTYH-NH2(SEQ ID NO:16)(12.0mg，5.66μmol，其中，第4位和第14位的2个半胱氨酸分别在分子内形成二硫键)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(0.40mL)，加入将3,3'-二硫代二丙酸二(N-琥珀酰亚胺酯)(45.7mg，113μmol)溶解于乙腈(0.40mL)而得的溶液，室温下搅拌24小时。通过减压浓缩而除去乙腈后，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽二硫连接体偶联物-NHS活化体(3.20mg，1.33μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 803.80[M+3H]3+
HPLC纯度:92％
(13-4)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰和基于ESI-TOFMS的分析
将(13-3)中合成的肽二硫连接体偶联物-NHS活化体溶解于N,N'-二甲基甲酰胺成为21.6mM。使500μg的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗(中外制药株式会社)溶解于46.9μL的60mM的乙酸钠缓冲液(pH 4.7)，加入4.7μL的21.6mM的肽试剂(相对于抗体为30当量)，室温下搅拌1小时。将反应液添加至NAP-5柱，使反应停止，置换为20mM的PBS缓冲液。通过ESI-TOFMS测定质量时，引入了2个结合性肽的产物在152864确认到峰。
(13-5)曲妥珠单抗的特异性修饰体的还原条件下的基于ESI-TOFMS分析的重链选择性的确认
向(13-4)中生成的抗体-肽复合物中加入5μL的7mM的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐溶液(相对于抗体为等量)，室温下搅拌20分钟。通过ESI-TOFMS测定质量时，关于原料的曲妥珠单抗，在50595、50756观测到重链峰，并在23440观测到轻链峰；关于产物，在重链中引入了硫代丙酰基在50682、50844观测到峰，并且与原料同样在23439观测到轻链峰。
(13-6)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析
通过HIC对(13-5)中生成的抗体-肽复合物和原料的抗体进行了分析。柱使用了Protein-Pak Hi Res HIC柱(沃特世公司)4.6×100mm 2.5μm。使用A_Buffer:0.1M PiNa,2.3M(NH4)2SO4,pH7.0、B_Buffer:0.1M PiNa,pH7.0，流速为0.6mL/分钟，梯度设为A 60％B40％→A0％B 100％、16分钟(数据采集20分钟)，柱温为40℃，恒温器温度为40℃，检测器用280nm的波长进行了检测。
对于样品，按照以下的条件进行反应。
a:曲妥珠单抗原料；
b:曲妥珠单抗+肽二硫连接体偶联物-NHS活化体30当量。
保留时间11.1885分钟被认为是引入了2个肽的化合物(图21)。
(13-7)曲妥珠单抗-肽复合物的连接体切割和再氧化
通过实施例3的(3-1)记载的方法进行(13-4)中得到的抗体-肽复合物的连接体切割和再氧化，就可获得对EU numbering中的Lys246及Lys248区域选择性地引入了硫代丙酰基的抗体。
[实施例14：具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物(肽二硫连接体偶联物-NHS活化体)的合成、以及使用该化合物的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的修饰及其分析]
(14-1)IgG1 Fc结合性肽的合成
通过与实施例1(1-1)同样的方法合成了Ac-RGNCAYHKNQIIWCTYH-NH2(SEQ ID NO:17)的肽，并进行纯化，获得了目标物(26.4mg，12.3μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 717.00[M+3H]3+,z＝4 537.95[M+4H]4+
(14-2)Ac-RGNCAYHKNQIIWCTYH-NH2(SEQ ID NO:17)的第4位和第14位的Cys处的分子内二硫键的形成
[化学式70]
Figure BDA0002827785710001391
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:17。
将(14-1)中合成的肽(26.4mg，12.3μmol)溶解于DMSO成为100mM后，加入2当量的2M NH3-MeOH、1当量的过氧化氢水溶液，在室温下进行20小时搅拌。向反应溶液中加入2M三氟乙酸水溶液停止反应，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽(13.0mg，6.06μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 716.15[M+3H]3+,z＝4 537.55[M+4H]4+
(14-3)二硫连接体与肽的偶联
[化学式71]
Figure BDA0002827785710001401
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:17。
将(14-2)中合成的Ac-RGNCAYHKNQIIWCTYH-NH2(SEQ ID NO:17)(13.0mg，6.06μmol，其中，第4位和第14位的2个半胱氨酸分别在分子内形成二硫键)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(0.40mL)，加入将3,3'-二硫代二丙酸二(N-琥珀酰亚胺酯)(49.0mg，121μmol)溶解于乙腈(0.40mL)而得的溶液，室温下搅拌24小时。通过减压浓缩而除去乙腈后，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽二硫连接体偶联物-NHS活化体(1.30mg，0.53μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 812.85[M+3H]3+
HPLC纯度:100％
(14-4)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰和基于ESI-TOFMS的分析
将(14-3)中合成的肽二硫连接体偶联物-NHS活化体溶解于N,N'-二甲基甲酰胺成为21.6mM。使500μg的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗(中外制药株式会社)溶解于46.9μL的60mM的乙酸钠缓冲液(pH 4.7)，加入4.7μL的21.6mM的肽试剂(相对于抗体为30当量)，室温下搅拌1小时。将反应液添加至NAP-5柱，使反应停止，置换为20mM的PBS缓冲液。通过ESI-TOFMS测定质量时，引入了1个结合性肽的产物在150549确认到峰，引入了2个结合性肽的产物在152869确认到峰。
(14-5)曲妥珠单抗的特异性修饰体的还原条件下的基于ESI-TOFMS分析的重链选择性的确认
向(14-4)中生成的抗体-肽复合物中加入5μL的7mM的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐溶液(相对于抗体为等量)，室温下搅拌20分钟。通过ESI-TOFMS测定质量时，关于原料的曲妥珠单抗，在50595、50756观测到重链峰，并在23440观测到轻链峰；关于产物，在重链中引入了硫代丙酰基在50682、50844观测到峰，并且与原料同样在23439观测到轻链峰。
(14-6)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析
通过HIC对(14-5)中生成的抗体-肽复合物和原料的抗体进行了分析。柱使用了Protein-Pak Hi Res HIC柱(沃特世公司)4.6×100mm 2.5μm。使用A_Buffer:0.1M PiNa,2.3M(NH4)2SO4,pH7.0、B_Buffer:0.1M PiNa,pH7.0，流速为0.6mL/分钟，梯度设为A 60％B40％→A0％B 100％、16分钟(数据采集20分钟)，柱温为40℃，恒温器温度为40℃，检测器用280nm的波长进行了检测。
对于样品，按照以下的条件进行反应。
a:曲妥珠单抗原料；
b:曲妥珠单抗+肽二硫连接体偶联物-NHS活化体30当量。
保留时间9.8295分钟被认为是曲妥珠单抗原料，10.7107分钟被认为是在曲妥珠单抗中引入了1个肽的化合物，11.4407分钟被认为是引入了2个肽的化合物(图22)。
(14-7)曲妥珠单抗-肽复合物的连接体切割和再氧化
通过实施例3的(3-1)记载的方法进行(14-4)中得到的抗体-肽复合物的连接体切割和再氧化，就可获得对EU numbering中的Lys246及Lys248区域选择性地引入了硫代丙酰基的抗体。
[实施例15：具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物(肽二硫连接体偶联物-NHS活化体)的合成、以及使用该化合物的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的修饰及其分析]
(15-1)IgG1 Fc结合性肽的合成
通过与实施例1(1-1)同样的方法合成了Ac-RGNCAYHKDQIIWCTYH-NH2(SEQ ID NO:18)的肽，并进行纯化，获得了目标物(37.2mg，17.3μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝4 538.20[M+4H]4+
(15-2)Ac-RGNCAYHKDQIIWCTYH-NH2(SEQ ID NO:18)的第4位和第14位的Cys处的分子内二硫键的形成
[化学式72]
Figure BDA0002827785710001421
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:18。
将(15-1)中合成的肽(37.2mg，17.3μmol)溶解于DMSO成为100mM后，加入2当量的2M NH3-MeOH、1当量的过氧化氢水溶液，在室温下进行20小时搅拌。向反应溶液中加入2M三氟乙酸水溶液停止反应，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽(17.2mg，8.01μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 716.75[M+3H]3+,z＝4 537.80[M+4H]4+
(15-3)二硫连接体与肽的偶联
[化学式73]
Figure BDA0002827785710001422
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:18。
将(15-2)中合成的Ac-RGNCAYHKDQIIWCTYH-NH2(SEQ ID NO:18)(17.2mg，8.01μmol，其中，第4位和第14位的2个半胱氨酸分别在分子内形成二硫键)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(0.30mL)，加入将3,3'-二硫代二丙酸二(N-琥珀酰亚胺酯)(65.0mg，160μmol)溶解于乙腈(0.40mL)而得的溶液，室温下搅拌24小时。通过减压浓缩而除去乙腈后，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽二硫连接体偶联物-NHS活化体(3.00mg，1.23μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 813.05[M+3H]3+
HPLC纯度:100％
(15-4)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰和基于ESI-TOFMS的分析
将(15-3)中合成的肽二硫连接体偶联物-NHS活化体溶解于N,N'-二甲基甲酰胺成为21.6mM。使500μg的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗(中外制药株式会社)溶解于46.9μL的60mM的乙酸钠缓冲液(pH 4.7)，加入4.7μL的21.6mM的肽试剂(相对于抗体为30当量)，室温下搅拌1小时。将反应液添加至NAP-5柱，使反应停止，置换为20mM的PBS缓冲液。通过ESI-TOFMS测定质量时，引入了2个结合性肽的产物在152864确认到峰。
(15-5)曲妥珠单抗的特异性修饰体的还原条件下的基于ESI-TOFMS分析的重链选择性的确认
向(15-4)中生成的抗体-肽复合物中加入5μL的7mM的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐溶液(相对于抗体为等量)，室温下搅拌20分钟。通过ESI-TOFMS测定质量时，关于原料的曲妥珠单抗，在50595、50756观测到重链峰，并在23440观测到轻链峰；关于产物，在重链中引入了硫代丙酰基在50682、50844观测到峰，并且与原料同样在23439观测到轻链峰。
(15-6)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析
通过HIC对(15-5)中生成的抗体-肽复合物和原料的抗体进行了分析。柱使用了Protein-Pak Hi Res HIC柱(沃特世公司)4.6×100mm 2.5μm。使用A_Buffer:0.1M PiNa,2.3M(NH4)2SO4,pH7.0、B_Buffer:0.1M PiNa,pH7.0，流速为0.6mL/分钟，梯度设为A 60％B40％→A0％B 100％、16分钟(数据采集20分钟)，柱温为40℃，恒温器温度为40℃，检测器用280nm的波长进行了检测。
对于样品，按照以下的条件进行反应。
a:曲妥珠单抗原料；
b:曲妥珠单抗+肽二硫连接体偶联物-NHS活化体30当量。
保留时间11.2108分钟被认为是引入了2个肽的化合物(图23)。
(15-7)曲妥珠单抗-肽复合物的连接体切割和再氧化
通过实施例3的(3-1)记载的方法进行(15-4)中得到的抗体-肽复合物的连接体切割和再氧化，就可获得对EU numbering中的Lys246及Lys248区域选择性地引入了硫代丙酰基的抗体。
[实施例16：具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物(肽二硫连接体偶联物-NHS活化体)的合成、以及使用该化合物的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的修饰及其分析]
(16-1)IgG1 Fc结合性肽的合成
通过与实施例1(1-1)同样的方法合成了Ac-RGNCAYHKQQIIWCTYH-NH2(SEQ ID NO:19)的肽，并进行纯化，获得了目标物(32.2mg，14.9μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 541.55[M+3H]3+
(16-2)Ac-RGNCAYHKQQIIWCTYH-NH2(SEQ ID NO:19)的第4位和第14位的Cys处的分子内二硫键的形成
[化学式74]
Figure BDA0002827785710001441
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:19。
将(16-1)中合成的肽(32.2mg，14.9μmol)溶解于DMSO成为100mM后，加入2当量的2M NH3-MeOH、1当量的过氧化氢水溶液，在室温下进行20小时搅拌。向反应溶液中加入2M三氟乙酸水溶液停止反应，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽(14.3mg，6.62μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 721.20[M+3H]3+,z＝4 541.00[M+4H]4+
(16-3)二硫连接体与肽的偶联
[化学式75]
Figure BDA0002827785710001451
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:19。
将(16-2)中合成的Ac-RGNCAYHKQQIIWCTYH-NH2(SEQ ID NO:19)(14.3mg，6.62μmol，其中，第4位和第14位的2个半胱氨酸分别在分子内形成二硫键)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(0.30mL)，加入将3,3'-二硫代二丙酸二(N-琥珀酰亚胺酯)(53.0mg，132μmol)溶解于乙腈(0.30mL)而得的溶液，室温下搅拌24小时。通过减压浓缩而除去乙腈后，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽二硫连接体偶联物-NHS活化体(4.00mg，1.63μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 817.50[M+3H]3+
HPLC纯度:89％
(16-4)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰和基于ESI-TOFMS的分析
将(16-3)中合成的肽二硫连接体偶联物-NHS活化体溶解于N,N'-二甲基甲酰胺成为21.6mM。使500μg的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗(中外制药株式会社)溶解于46.9μL的60mM的乙酸钠缓冲液(pH 4.7)，加入4.7μL的21.6mM的肽试剂(相对于抗体为30当量)，室温下搅拌1小时。将反应液添加至NAP-5柱，使反应停止，置换为20mM的PBS缓冲液。通过ESI-TOFMS测定质量时，引入了1个结合性肽的产物在150212确认到峰，引入了2个结合性肽的产物在152897确认到峰。
(16-5)曲妥珠单抗的特异性修饰体的还原条件下的基于ESI-TOFMS分析的重链选择性的确认
向(16-4)中生成的抗体-肽复合物中加入5μL的7mM的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐溶液(相对于抗体为等量)，室温下搅拌20分钟。通过ESI-TOFMS测定质量时，关于原料的曲妥珠单抗，在50595、50756观测到重链峰，并在23440观测到轻链峰；关于产物，在重链中引入了硫代丙酰基在50686、50844观测到峰，并且与原料同样在23439观测到轻链峰。
(16-6)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析
通过HIC对(16-5)中生成的抗体-肽复合物和原料的抗体进行了分析。柱使用了Protein-Pak Hi Res HIC柱(沃特世公司)4.6×100mm 2.5μm。使用A_Buffer:0.1M PiNa,2.3M(NH4)2SO4,pH7.0、B_Buffer:0.1M PiNa,pH7.0，流速为0.6mL/分钟，梯度设为A 60％B40％→A0％B 100％、16分钟(数据采集20分钟)，柱温为40℃，恒温器温度为40℃，检测器用280nm的波长进行了检测。
对于样品，按照以下的条件进行反应。
a:曲妥珠单抗原料；
b:曲妥珠单抗+肽二硫连接体偶联物-NHS活化体30当量。
保留时间10.7230分钟被认为是在曲妥珠单抗中引入了1个肽的化合物，11.4259分钟被认为是引入了2个肽的化合物(图24)。
(16-7)曲妥珠单抗-肽复合物的连接体切割和再氧化
通过实施例3的(3-1)记载的方法进行(16-4)中得到的抗体-肽复合物的连接体切割和再氧化，就可获得对EU numbering中的Lys246及Lys248区域选择性地引入了硫代丙酰基的抗体。
[实施例17：具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物(肽二硫连接体偶联物-NHS活化体)的合成、以及使用该化合物的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的修饰及其分析]
(17-1)IgG1 Fc结合性肽的合成
通过与实施例1(1-1)同样的方法合成了Ac-RGNCAYHKEQIIWCTYH-NH2(SEQ ID NO:20)的肽，并进行纯化，获得了目标物(38.0mg，17.6μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 722.00[M+3H]3+,z＝4 541.75[M+4H]4+
(17-2)Ac-RGNCAYHKEQIIWCTYH-NH2(SEQ ID NO:20)的第4位和第14位的Cys处的分子内二硫键的形成
[化学式76]
Figure BDA0002827785710001471
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:20。
将(17-1)中合成的肽(38.0mg，17.6μmol)溶解于DMSO成为100mM后，加入2当量的2M NH3-MeOH、1当量的过氧化氢水溶液，在室温下进行20小时搅拌。向反应溶液中加入2M三氟乙酸水溶液停止反应，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽(16.0mg，7.40μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 721.40[M+3H]3+,z＝4 541.25[M+4H]4+
(17-3)二硫连接体与肽的偶联
[化学式77]
Figure BDA0002827785710001472
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:20。
将(17-2)中合成的Ac-RGNCAYHKEQIIWCTYH-NH2(SEQ ID NO:20)(16.0mg，7.40μmol，其中，第4位和第14位的2个半胱氨酸分别在分子内形成二硫键)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(0.30mL)，加入将3,3'-二硫代二丙酸二(N-琥珀酰亚胺酯)(60.0mg，148μmol)溶解于乙腈(0.30mL)而得的溶液，室温下搅拌24小时。通过减压浓缩而除去乙腈后，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽二硫连接体偶联物-NHS活化体(4.50mg，1.84μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 817.80[M+3H]3+
HPLC纯度:100％
(17-4)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰和基于ESI-TOFMS的分析
将(17-3)中合成的肽二硫连接体偶联物-NHS活化体溶解于N,N'-二甲基甲酰胺成为21.6mM。使500μg的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗(中外制药株式会社)溶解于46.9μL的60mM的乙酸钠缓冲液(pH 4.7)，加入4.7μL的21.6mM的肽试剂(相对于抗体为30当量)，室温下搅拌1小时。将反应液添加至NAP-5柱，使反应停止，置换为20mM的PBS缓冲液。通过ESI-TOFMS测定质量时，引入了2个结合性肽的产物在152900确认到峰。
(17-5)曲妥珠单抗的特异性修饰体的还原条件下的基于ESI-TOFMS分析的重链选择性的确认
向(17-4)中生成的抗体-肽复合物中加入5μL的7mM的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐溶液(相对于抗体为等量)，室温下搅拌20分钟。通过ESI-TOFMS测定质量时，关于原料的曲妥珠单抗，在50595、50756观测到重链峰，并在23440观测到轻链峰；关于产物，在重链中引入了硫代丙酰基在50686、50844观测到峰，并且与原料同样在23439观测到轻链峰。
(17-6)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析
通过HIC对(17-5)中生成的抗体-肽复合物和原料的抗体进行了分析。柱使用了Protein-Pak Hi Res HIC柱(沃特世公司)4.6×100mm 2.5μm。使用A_Buffer:0.1M PiNa,2.3M(NH4)2SO4,pH7.0、B_Buffer:0.1M PiNa,pH7.0，流速为0.6mL/分钟，梯度设为A 60％B40％→A0％B 100％、16分钟(数据采集20分钟)，柱温为40℃，恒温器温度为40℃，检测器用280nm的波长进行了检测。
对于样品，按照以下的条件进行反应。
a:曲妥珠单抗原料；
b:曲妥珠单抗+肽二硫连接体偶联物-NHS活化体30当量。
保留时间11.1843分钟被认为是引入了2个肽的化合物(图25)。
(17-7)曲妥珠单抗-肽复合物的连接体切割和再氧化
通过实施例3的(3-1)记载的方法进行(17-4)中得到的抗体-肽复合物的连接体切割和再氧化，就可获得对EU numbering中的Lys246及Lys248区域选择性地引入了硫代丙酰基的抗体。
[实施例18：具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物(肽二硫连接体偶联物-NHS活化体)的合成、以及使用该化合物的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的修饰及其分析]
(18-1)IgG1 Fc结合性肽的合成
通过与实施例1(1-1)同样的方法合成了Ac-RGNCAYHKFQIIWCTYH-NH2(SEQ ID NO:21)的肽，并进行纯化，获得了目标物(23.0mg，10.5μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 728.05[M+3H]3+,z＝4 546.40[M+4H]4+
(18-2)Ac-RGNCAYHKFQIIWCTYH-NH2(SEQ ID NO:21)的第4位和第14位的Cys处的分子内二硫键的形成
[化学式78]
Figure BDA0002827785710001491
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:21。
将(18-1)中合成的肽(23.0mg，10.5μmol)溶解于DMSO成为100mM后，加入2当量的2M NH3-MeOH、1当量的过氧化氢水溶液，在室温下进行20小时搅拌。向反应溶液中加入2M三氟乙酸水溶液停止反应，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而仅除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽(9.80mg，4.50μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 727.35[M+3H]3+,z＝4 545.85[M+4H]4+
(18-3)二硫连接体与肽的偶联
[化学式79]
Figure BDA0002827785710001501
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:21。
将(18-2)中合成的Ac-RGNCAYHKFQIIWCTYH-NH2(SEQ ID NO:21)(9.80mg，4.50μmol，其中，第4位和第14位的2个半胱氨酸分别在分子内形成二硫键)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(0.30mL)，加入将3,3'-二硫代二丙酸二(N-琥珀酰亚胺酯)(36.0mg，90.0μmol)溶解于乙腈(0.30mL)而得的溶液，室温下搅拌24小时。通过减压浓缩而除去乙腈后，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽二硫连接体偶联物-NHS活化体(2.50mg，1.01μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 823.85[M+3H]3+
HPLC纯度:93％
(18-4)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰和基于ESI-TOFMS的分析
将(18-3)中合成的肽二硫连接体偶联物-NHS活化体溶解于N,N'-二甲基甲酰胺成为21.6mM。使500μg的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗(中外制药株式会社)溶解于46.9μL的60mM的乙酸钠缓冲液(pH 4.7)，加入4.7μL的21.6mM的肽试剂(相对于抗体为30当量)，室温下搅拌1小时。将反应液添加至NAP-5柱，使反应停止，置换为20mM的PBS缓冲液。通过ESI-TOFMS测定质量时，引入了2个结合性肽的产物在153317确认到峰。
(18-5)曲妥珠单抗的特异性修饰体的还原条件下的基于ESI-TOFMS分析的重链选择性的确认
向(18-4)中生成的抗体-肽复合物中加入5μL的7mM的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐溶液(相对于抗体为等量)，室温下搅拌20分钟。通过ESI-TOFMS测定质量时，关于原料的曲妥珠单抗，在50595、50756观测到重链峰，并在23440观测到轻链峰；关于产物，在重链中引入了硫代丙酰基在50686、50844观测到峰，并且与原料同样在23439观测到轻链峰。
(18-6)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析
通过HIC对(18-5)中生成的抗体-肽复合物和原料的抗体进行了分析。柱使用了Protein-Pak Hi Res HIC柱(沃特世公司)4.6×100mm 2.5μm。使用A_Buffer:0.1M PiNa,2.3M(NH4)2SO4,pH7.0、B_Buffer:0.1M PiNa,pH7.0，流速为0.6mL/分钟，梯度设为A 60％B40％→A0％B 100％、16分钟(数据采集20分钟)，柱温为40℃，恒温器温度为40℃，检测器用280nm的波长进行了检测。
对于样品，按照以下的条件进行反应。
a:曲妥珠单抗原料；
b:曲妥珠单抗+肽二硫连接体偶联物-NHS活化体30当量。
保留时间13.8013分钟被认为是引入了2个肽的化合物(图26)。
曲妥珠单抗-肽复合物的连接体切割和再氧化
通过实施例3的(3-1)记载的方法进行(18-4)中得到的抗体-肽复合物的连接体切割和再氧化，就可获得对EU numbering中的Lys246及Lys248区域选择性地引入了硫代丙酰基的抗体。
[实施例19：具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物(肽二硫连接体偶联物-NHS活化体)的合成、以及使用该化合物的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的修饰及其分析]
(19-1)IgG1 Fc结合性肽的合成
通过与实施例1(1-1)同样的方法合成了Ac-RGNCAYHKYQIIWCTYH-NH2(SEQ ID NO:22)的肽，并进行纯化，获得了目标物(30.8mg，14.0μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 733.20[M+3H]3+,z＝4 550.40[M+4H]4+
(19-2)Ac-RGNCAYHKYQIIWCTYH-NH2(SEQ ID NO:22)的第4位和第14位的Cys处的分子内二硫键的形成
[化学式80]
Figure BDA0002827785710001511
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:22。
将(19-1)中合成的肽(30.8mg，14.0μmol)溶解于DMSO成为100mM后，加入2当量的2M NH3-MeOH、1当量的过氧化氢水溶液，在室温下进行20小时搅拌。向反应溶液中加入2M三氟乙酸水溶液停止反应，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽(17.5mg，7.97μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 732.75[M+3H]3+,z＝4 549.90[M+4H]4+
(19-3)二硫连接体与肽的偶联
[化学式81]
Figure BDA0002827785710001521
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:22。
将(19-2)中合成的Ac-RGNCAYHKYQIIWCTYH-NH2(SEQ ID NO:22)(17.5mg，7.97μmol，其中，第4位和第14位的2个半胱氨酸分别在分子内形成二硫键)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(0.30mL)，加入将3,3'-二硫代二丙酸二(N-琥珀酰亚胺酯)(97.0mg，239μmol)溶解于乙腈(0.30mL)而得的溶液，室温下搅拌24小时。通过减压浓缩而除去乙腈后，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽二硫连接体偶联物-NHS活化体(3.50mg，1.41μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 829.15[M+3H]3+
HPLC纯度:89％
(19-4)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰和基于ESI-TOFMS的分析
将(19-3)中合成的肽二硫连接体偶联物-NHS活化体溶解于N,N'-二甲基甲酰胺成为21.6mM。使500μg的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗(中外制药株式会社)溶解于46.9μL的60mM的乙酸钠缓冲液(pH 4.7)，加入4.7μL的21.6mM的肽试剂(相对于抗体为30当量)，室温下搅拌1小时。将反应液添加至NAP-5柱，使反应停止，置换为20mM的PBS缓冲液。通过ESI-TOFMS测定质量时，引入了2个结合性肽的产物在152965确认到峰。
(19-5)曲妥珠单抗的特异性修饰体的还原条件下的基于ESI-TOFMS分析的重链选择性的确认
向(19-4)中生成的抗体-肽复合物中加入5μL的7mM的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐溶液(相对于抗体为等量)，室温下搅拌20分钟。通过ESI-TOFMS测定质量时，关于原料的曲妥珠单抗，在50595、50756观测到重链峰，并在23440观测到轻链峰；关于产物，在重链中引入了硫代丙酰基在50686、50844观测到峰，并且与原料同样在23439观测到轻链峰。
(19-6)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析
通过HIC对(19-5)中生成的抗体-肽复合物和原料的抗体进行了分析。柱使用了Protein-Pak Hi Res HIC柱(沃特世公司)4.6×100mm 2.5μm。使用A_Buffer:0.1M PiNa,2.3M(NH4)2SO4,pH7.0、B_Buffer:0.1M PiNa,pH7.0，流速为0.6mL/分钟，梯度设为A 60％B40％→A0％B 100％、16分钟(数据采集20分钟)，柱温为40℃，恒温器温度为40℃，检测器用280nm的波长进行了检测。
对于样品，按照以下的条件进行反应。
a:曲妥珠单抗原料；
b:曲妥珠单抗+肽二硫连接体偶联物-NHS活化体30当量。
保留时间13.7628分钟被认为是引入了2个肽的化合物(图27)。
(19-7)曲妥珠单抗-肽复合物的连接体切割和再氧化
通过实施例3的(3-1)记载的方法进行(19-4)中得到的抗体-肽复合物的连接体切割和再氧化，就可获得对EU numbering中的Lys246及Lys248区域选择性地引入了硫代丙酰基的抗体。
[实施例20：具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物(肽二硫连接体偶联物-NHS活化体)的合成、以及使用该化合物的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的修饰及其分析]
(20-1)IgG1 Fc结合性肽的合成
通过与实施例1(1-1)同样的方法合成了Ac-RGNCAYHKWQIIWCTYH-NH2(SEQ ID NO:23)的肽，并进行纯化，获得了目标物(23.0mg，10.4μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 741.15[M+3H]3+,z＝4 556.00[M+4H]4+
(20-2)Ac-RGNCAYHKWQIIWCTYH-NH2(SEQ ID NO:23)的第4位和第14位的Cys处的分子内二硫键的形成
[化学式82]
Figure BDA0002827785710001541
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:23。
将(20-1)中合成的肽(23.0mg，10.4μmol)溶解于DMSO成为100mM后，加入2当量的2M NH3-MeOH、1当量的过氧化氢水溶液，在室温下进行20小时搅拌。向反应溶液中加入2M三氟乙酸水溶液停止反应，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽(8.20mg，3.70μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 740.40[M+3H]3+,z＝4 555.65[M+4H]4+
(20-3)二硫连接体与肽的偶联
[化学式83]
Figure BDA0002827785710001542
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:23。
将(20-2)中合成的Ac-RGNCAYHKWQIIWCTYH-NH2(SEQ ID NO:23)(8.20mg，3.70μmol，其中，第4位和第14位的2个半胱氨酸分别在分子内形成二硫键)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(0.30mL)，加入将3,3'-二硫代二丙酸二(N-琥珀酰亚胺酯)(60.0mg，148μmol)溶解于乙腈(0.30mL)而得的溶液，室温下搅拌24小时。通过减压浓缩而除去乙腈后，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽二硫连接体偶联物-NHS活化体(2.2mg，0.88μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 836.80[M+3H]3+
HPLC纯度:93％
(20-4)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰和基于ESI-TOFMS的分析
将(20-3)中合成的肽二硫连接体偶联物-NHS活化体溶解于N,N'-二甲基甲酰胺成为21.6mM。使500μg的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗(中外制药株式会社)溶解于46.9μL的60mM的乙酸钠缓冲液(pH 4.7)，加入4.7μL的21.6mM的肽试剂(相对于抗体为30当量)，室温下搅拌1小时。将反应液添加至NAP-5柱，使反应停止，置换为20mM的PBS缓冲液。通过ESI-TOFMS测定质量时，引入了2个结合性肽的产物在153121确认到峰。
(20-5)曲妥珠单抗的特异性修饰体的还原条件下的基于ESI-TOFMS分析的重链选择性的确认
向(20-4)中生成的抗体-肽复合物中加入5μL的7mM的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐溶液(相对于抗体为等量)，室温下搅拌20分钟。通过ESI-TOFMS测定质量时，关于原料的曲妥珠单抗，在50595、50756观测到重链峰，并在23440观测到轻链峰；关于产物，在重链中引入了硫代丙酰基在50682、50844观测到峰，并且与原料同样在23439观测到轻链峰。
(20-6)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析
通过HIC对(20-5)中生成的抗体-肽复合物和原料的抗体进行了分析。柱使用了Protein-Pak Hi Res HIC柱(沃特世公司)4.6×100mm 2.5μm。使用A_Buffer:0.1M PiNa,2.3M(NH4)2SO4,pH7.0、B_Buffer:0.1M PiNa,pH7.0，流速为0.6mL/分钟，梯度设为A 60％B40％→A0％B 100％、16分钟(数据采集20分钟)，柱温为40℃，恒温器温度为40℃，检测器用280nm的波长进行了检测。
对于样品，按照以下的条件进行反应。
a:曲妥珠单抗原料；
b:曲妥珠单抗+肽二硫连接体偶联物-NHS活化体30当量。
保留时间14.8203分钟被认为是引入了2个肽的化合物(图28)。
(20-7)曲妥珠单抗-肽复合物的连接体切割和再氧化
通过实施例3的(3-1)记载的方法进行(20-4)中得到的抗体-肽复合物的连接体切割和再氧化，就可获得对EU numbering中的Lys246及Lys248区域选择性地引入了硫代丙酰基的抗体。
[实施例21：具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物(肽二硫连接体偶联物-NHS活化体)的合成、以及使用该化合物的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的修饰及其分析]
(21-1)IgG1 Fc结合性肽的合成
通过与实施例1(1-1)同样的方法合成了Ac-RGNCAYHKHQIIWCTYH-NH2(SEQ ID NO:24)的肽，并进行纯化，获得了目标物(68.7mg，31.6μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 724.70[M+3H]3+,z＝4 543.85[M+4H]4+
(21-2)Ac-RGNCAYHKHQIIWCTYH-NH2(SEQ ID NO:24)的第4位和第14位的Cys处的分子内二硫键的形成
[化学式84]
Figure BDA0002827785710001561
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:24。
将(21-1)中合成的肽(68.7mg，31.6μmol)溶解于DMSO成为100mM后，加入2当量的2M NH3-MeOH、1当量的过氧化氢水溶液，在室温下进行20小时搅拌。向反应溶液中加入2M三氟乙酸水溶液停止反应，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽(44.9mg，20.7μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝4 543.55[M+4H]4+
(21-3)二硫连接体与肽的偶联
[化学式85]
Figure BDA0002827785710001571
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:24。
将(21-2)中合成的Ac-RGNCAYHKHQIIWCTYH-NH2(SEQ ID NO:24)(44.9mg，20.7μmol，其中，第4位和第14位的2个半胱氨酸分别在分子内形成二硫键)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(0.40mL)，加入将3,3'-二硫代二丙酸二(N-琥珀酰亚胺酯)(60.0mg，148μmol)溶解于乙腈(0.60mL)而得的溶液，室温下搅拌24小时。通过减压浓缩而除去乙腈后，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽二硫连接体偶联物-NHS活化体(3.30mg，1.34μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝4 615.55[M+3H]4+
HPLC纯度:68％
(21-4)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰和基于ESI-TOFMS的分析
将(21-3)中合成的肽二硫连接体偶联物-NHS活化体溶解于N,N'-二甲基甲酰胺成为21.6mM。使500μg的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗(中外制药株式会社)溶解于46.9μL的60mM的乙酸钠缓冲液(pH 4.7)，加入4.7μL的21.6mM的肽试剂(相对于抗体为30当量)，室温下搅拌1小时。将反应液添加至NAP-5柱，使反应停止，置换为20mM的PBS缓冲液。通过ESI-TOFMS测定质量时，引入了2个结合性肽的产物在152909确认到峰。
(21-5)曲妥珠单抗的特异性修饰体的还原条件下的基于ESI-TOFMS分析的重链选择性的确认
向(21-4)中生成的抗体-肽复合物中加入5μL的7mM的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐溶液(相对于抗体为等量)，室温下搅拌20分钟。通过ESI-TOFMS测定质量时，关于原料的曲妥珠单抗，在50595、50756观测到重链峰，并在23440观测到轻链峰；关于产物，在重链中引入了硫代丙酰基在50684、50844观测到峰，并且与原料同样在23439观测到轻链峰。
(21-6)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析
通过HIC对(21-5)中生成的抗体-肽复合物和原料的抗体进行了分析。柱使用了Protein-Pak Hi Res HIC柱(沃特世公司)4.6×100mm 2.5μm。使用A_Buffer:0.1M PiNa,2.3M(NH4)2SO4,pH7.0、B_Buffer:0.1M PiNa,pH7.0，流速为0.6mL/分钟，梯度设为A 60％B40％→A0％B 100％、16分钟(数据采集20分钟)，柱温为40℃，恒温器温度为40℃，检测器用280nm的波长进行了检测。
对于样品，按照以下的条件进行反应。
a:曲妥珠单抗原料；
b:曲妥珠单抗+肽二硫连接体偶联物-NHS活化体30当量。
保留时间12.5579分钟被认为是引入了2个肽的化合物(图29)。
(21-7)曲妥珠单抗-肽复合物的连接体切割和再氧化
通过实施例3的(3-1)记载的方法进行(21-4)中得到的抗体-肽复合物的连接体切割和再氧化，就可获得对EU numbering中的Lys246及Lys248区域选择性地引入了硫代丙酰基的抗体。
[实施例22：具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物(肽二硫连接体偶联物-NHS活化体)的合成、以及使用该化合物的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的修饰及其分析]
(22-1)IgG1 Fc结合性肽的合成
通过与实施例1(1-1)同样的方法合成了Ac-RGNCAYHKTQIIWCTYH-NH2(SEQ ID NO:25)的肽，并进行纯化，获得了目标物(46.5mg，21.8μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 712.80[M+3H]3+,z＝4 534.85[M+4H]4+
(22-2)Ac-RGNCAYHKTQIIWCTYH-NH2(SEQ ID NO:25)的第4位和第14位的Cys处的分子内二硫键的形成
[化学式86]
Figure BDA0002827785710001591
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:25。
将(22-1)中合成的肽(46.5mg，21.8μmol)溶解于DMSO成为100mM后，加入2当量的2M NH3-MeOH、1当量的过氧化氢水溶液，在室温下进行20小时搅拌。向反应溶液中加入2M三氟乙酸水溶液停止反应，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽(31.6mg，14.8μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 711.95[M+3H]3+,z＝4 534.30[M+4H]4+
(22-3)二硫连接体与肽的偶联
[化学式87]
Figure BDA0002827785710001592
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:25。
将(22-2)中合成的Ac-RGNCAYHKTQIIWCTYH-NH2(SEQ ID NO:25)(31.6mg，14.8μmol，其中，第4位和第14位的2个半胱氨酸分别在分子内形成二硫键)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(0.40mL)，加入将3,3'-二硫代二丙酸二(N-琥珀酰亚胺酯)(120mg，296μmol)溶解于乙腈(0.60mL)而得的溶液，室温下搅拌24小时。通过减压浓缩而除去乙腈后，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽二硫连接体偶联物-NHS活化体(5.50mg，2.27μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 808.45[M+3H]3+
HPLC纯度:89％
(22-4)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰和基于ESI-TOFMS的分析
将(22-3)中合成的肽二硫连接体偶联物-NHS活化体溶解于N,N'-二甲基甲酰胺成为21.6mM。使500μg的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗(中外制药株式会社)溶解于46.9μL的60mM的乙酸钠缓冲液(pH 4.7)，加入4.7μL的21.6mM的肽试剂(相对于抗体为30当量)，室温下搅拌1小时。将反应液添加至NAP-5柱，使反应停止，置换为20mM的PBS缓冲液。通过ESI-TOFMS测定质量时，引入了2个结合性肽的产物在152837确认到峰。
(22-5)曲妥珠单抗的特异性修饰体的还原条件下的基于ESI-TOFMS分析的重链选择性的确认
向(19-4)中生成的抗体-肽复合物中加入5μL的7mM的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐溶液(相对于抗体为等量)，室温下搅拌20分钟。通过ESI-TOFMS测定质量时，关于原料的曲妥珠单抗，在50595、50756观测到重链峰，并在23440观测到轻链峰；关于产物，在重链中引入了硫代丙酰基在50686、50844观测到峰，并且与原料同样在23439观测到轻链峰。
(22-6)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析
通过HIC对(22-5)中生成的抗体-肽复合物和原料的抗体进行了分析。柱使用了Protein-Pak Hi Res HIC柱(沃特世公司)4.6×100mm 2.5μm。使用A_Buffer:0.1M PiNa,2.3M(NH4)2SO4,pH7.0、B_Buffer:0.1M PiNa,pH7.0，流速为0.6mL/分钟，梯度设为A 60％B40％→A0％B 100％、16分钟(数据采集20分钟)，柱温为40℃，恒温器温度为40℃，检测器用280nm的波长进行了检测。
对于样品，按照以下的条件进行反应。
a:曲妥珠单抗原料；
b:曲妥珠单抗+肽二硫连接体偶联物-NHS活化体30当量。
保留时间12.5231分钟被认为是引入了2个肽的化合物(图30)。
(22-7)曲妥珠单抗-肽复合物的连接体切割和再氧化
通过实施例3的(3-1)记载的方法进行(22-4)中得到的抗体-肽复合物的连接体切割和再氧化，就可获得对EU numbering中的Lys246及Lys248区域选择性地引入了硫代丙酰基的抗体。
[实施例23：具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物(肽二硫连接体偶联物-NHS活化体)的合成、以及使用该化合物的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的修饰及其分析]
(23-1)IgG1 Fc结合性肽的合成
通过与实施例1(1-1)同样的方法合成了Ac-RGNCAYHKLQIIWCTYH-NH2(SEQ ID NO:26)的肽，并进行纯化，获得了目标物(32.2mg，15.0μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 716.70[M+3H]3+,z＝4 537.85[M+4H]4+
(23-2)Ac-RGNCAYHKLQIIWCTYH-NH2(SEQ ID NO:26)的第4位和第14位的Cys处的分子内二硫键的形成
[化学式88]
Figure BDA0002827785710001611
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:26。
将(23-1)中合成的肽(32.2mg，15.0μmol)溶解于DMSO成为100mM后，加入2当量的2M NH3-MeOH、1当量的过氧化氢水溶液，在室温下进行20小时搅拌。向反应溶液中加入2M三氟乙酸水溶液停止反应，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而仅除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽(9.40mg，4.38μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 716.10[M+3H]3+,z＝4 537.35[M+4H]4+
(23-3)二硫连接体与肽的偶联
[化学式89]
Figure BDA0002827785710001621
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:26。
将(23-2)中合成的Ac-RGNCAYHKLQIIWCTYH-NH2(SEQ ID NO:26)(9.40mg，4.38μmol，其中，第4位和第14位的2个半胱氨酸分别在分子内形成二硫键)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(0.40mL)，加入将3,3'-二硫代二丙酸二(N-琥珀酰亚胺酯)(70.7mg，175μmol)溶解于乙腈(0.40mL)而得的溶液，室温下搅拌24小时。通过减压浓缩而除去乙腈后，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽二硫连接体偶联物-NHS活化体(2.80mg，1.15μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 812.40[M+3H]3+
HPLC纯度:80％
(23-4)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰和基于ESI-TOFMS的分析
将(23-3)中合成的肽二硫连接体偶联物-NHS活化体溶解于N,N'-二甲基甲酰胺成为21.6mM。使500μg的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗(中外制药株式会社)溶解于46.9μL的60mM的乙酸钠缓冲液(pH 4.7)，加入4.7μL的21.6mM的肽试剂(相对于抗体为30当量)，室温下搅拌1小时。将反应液添加至NAP-5柱，使反应停止，置换为20mM的PBS缓冲液。通过ESI-TOFMS测定质量时，引入了2个结合性肽的产物在153053确认到峰。
(23-5)曲妥珠单抗的特异性修饰体的还原条件下的基于ESI-TOFMS分析的重链选择性的确认
向(23-4)中生成的抗体-肽复合物中加入5μL的7mM的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐溶液(相对于抗体为等量)，室温下搅拌20分钟。通过ESI-TOFMS测定质量时，关于原料的曲妥珠单抗，在50595、50756观测到重链峰，并在23440观测到轻链峰；关于产物，在重链中引入了硫代丙酰基在50685、50844观测到峰，并且与原料同样在23439观测到轻链峰。
(23-6)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析
通过HIC对(23-5)中生成的抗体-肽复合物和原料的抗体进行了分析。柱使用了Protein-Pak Hi Res HIC柱(沃特世公司)4.6×100mm 2.5μm。使用A_Buffer:0.1M PiNa,2.3M(NH4)2SO4,pH7.0、B_Buffer:0.1M PiNa,pH7.0，流速为0.6mL/分钟，梯度设为A 60％B40％→A0％B 100％、16分钟(数据采集20分钟)，柱温为40℃，恒温器温度为40℃，检测器用280nm的波长进行了检测。
对于样品，按照以下的条件进行反应。
a:曲妥珠单抗原料；
b:曲妥珠单抗+肽二硫连接体偶联物-NHS活化体30当量。
保留时间13.5717分钟被认为是引入了2个肽的化合物(图31)。
(23-7)曲妥珠单抗-肽复合物的连接体切割和再氧化
通过实施例3的(3-1)记载的方法进行(23-4)中得到的抗体-肽复合物的连接体切割和再氧化，就可获得对EU numbering中的Lys246及Lys248区域选择性地引入了硫代丙酰基的抗体。
[实施例24：具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物(肽二硫连接体偶联物-NHS活化体)的合成、以及使用该化合物的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的修饰及其分析]
(24-1)IgG1 Fc结合性肽的合成
通过与实施例1(1-1)同样的方法合成了Ac-CAYHKLQIVWC-NH2(SEQ ID NO:27)的肽，并进行纯化，获得了目标物(65.3mg，48.4μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝2 675.20[M+2H]2+
(24-2)Ac-CAYHKLQIVWC-NH2(SEQ ID NO:27)的第1位和第11位的Cys处的分子内二硫键的形成
[化学式90]
Figure BDA0002827785710001631
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:27。
将(24-1)中合成的肽(65.3mg，48.4μmol)溶解于DMSO成为100mM后，加入2当量的2M NH3-MeOH、1当量的过氧化氢水溶液，在室温下进行20小时搅拌。向反应溶液中加入2M三氟乙酸水溶液停止反应，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽(36.8mg，27.3μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝2 674.35[M+2H]2+
(24-3)二硫连接体与肽的偶联
[化学式91]
Figure BDA0002827785710001641
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:27。
将(24-2)中合成的Ac-CAYHKLQIVWC-NH2(SEQ ID NO:27)(36.8mg，27.3μmol，其中，第1位和第11位的2个半胱氨酸分别在分子内形成二硫键)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(0.40mL)，加入将3,3'-二硫代二丙酸二(N-琥珀酰亚胺酯)(442mg，1.09mmol)溶解于乙腈(0.40mL)而得的溶液，室温下搅拌24小时。通过减压浓缩而除去乙腈后，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽二硫连接体偶联物-NHS活化体(24.5mg，15.0μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝2 818.85[M+2H]2+
HPLC纯度:85％
(24-4)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰和基于ESI-TOFMS的分析
将(24-3)中合成的肽二硫连接体偶联物-NHS活化体溶解于N,N'-二甲基甲酰胺成为21.6mM。使500μg的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗(中外制药株式会社)溶解于46.9μL的60mM的乙酸钠缓冲液(pH 4.7)，加入4.7μL的21.6mM的肽试剂(相对于抗体为30当量)，室温下搅拌1小时。将反应液添加至NAP-5柱，使反应停止，置换为20mM的PBS缓冲液。通过ESI-TOFMS测定质量时，引入了1个结合性肽的产物在149590确认到峰，引入了2个结合性肽的产物在151270确认到峰。
(24-5)曲妥珠单抗的特异性修饰体的还原条件下的基于ESI-TOFMS分析的重链选择性的确认
向(24-4)中生成的抗体-肽复合物中加入5μL的7mM的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐溶液(相对于抗体为等量)，室温下搅拌20分钟。通过ESI-TOFMS测定质量时，关于原料的曲妥珠单抗，在50595、50756观测到重链峰，并在23440观测到轻链峰；关于产物，在重链中引入了硫代丙酰基在50685、50844观测到峰，并且与原料同样在23439观测到轻链峰。
(24-6)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析
通过HIC对(24-5)中生成的抗体-肽复合物和原料的抗体进行了分析。柱使用了Protein-Pak Hi Res HIC柱(沃特世公司)4.6×100mm 2.5μm。使用A_Buffer:0.1M PiNa,2.3M(NH4)2SO4,pH7.0、B_Buffer:0.1M PiNa,pH7.0，流速为0.6mL/分钟，梯度设为A 60％B40％→A0％B 100％、16分钟(数据采集20分钟)，柱温为40℃，恒温器温度为40℃，检测器用280nm的波长进行了检测。
对于样品，按照以下的条件进行反应。
a:曲妥珠单抗原料；
b:曲妥珠单抗+肽二硫连接体偶联物-NHS活化体30当量。
保留时间11.5053分钟被认为是在曲妥珠单抗中引入了1个肽的化合物，12.9410分钟被认为是引入了2个肽的化合物(图32)。
(24-7)曲妥珠单抗-肽复合物的连接体切割和再氧化
通过实施例3的(3-1)记载的方法进行(24-4)中得到的抗体-肽复合物的连接体切割和再氧化，就可获得对EU numbering中的Lys246及Lys248区域选择性地引入了硫代丙酰基的抗体。
[实施例25：具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物(肽二硫连接体偶联物-NHS活化体)的合成、以及使用该化合物的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的修饰及其分析]
(25-1)IgG1 Fc结合性肽的合成
通过与实施例1(1-1)同样的方法合成了Ac-CAYHKLQLIWC-NH2(SEQ ID NO:28)的肽，并进行纯化，获得了目标物(54.3mg，39.8μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝2 682.25[M+2H]2+
(25-2)Ac-CAYHKLQLIWC-NH2(SEQ ID NO:28)的第1位和第11位的Cys处的分子内二硫键的形成
[化学式92]
Figure BDA0002827785710001661
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:28。
将(25-1)中合成的肽(54.3mg，39.8μmol)溶解于DMSO成为100mM后，加入2当量的2M NH3-MeOH、1当量的过氧化氢水溶液，在室温下进行20小时搅拌。向反应溶液中加入2M三氟乙酸水溶液停止反应，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽(34.6mg，25.4μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝2 681.20[M+2H]2+
(25-3)二硫连接体与肽的偶联
[化学式93]
Figure BDA0002827785710001662
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:28。
将(25-2)中合成的Ac-CAYHKLQLIWC-NH2(SEQ ID NO:28)(34.6mg，25.4μmol，其中，第1位和第11位的2个半胱氨酸分别在分子内形成二硫键)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(0.40mL)，加入将3,3'-二硫代二丙酸二(N-琥珀酰亚胺酯)(411mg，1.02mmol)溶解于乙腈(0.40mL)而得的溶液，室温下搅拌24小时。通过减压浓缩而除去乙腈后，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽二硫连接体偶联物-NHS活化体(22.0mg，13.3μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝2 835.85[M+2H]2+
HPLC纯度:88％
(25-4)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰和基于ESI-TOFMS的分析
将(25-3)中合成的肽二硫连接体偶联物-NHS活化体溶解于N,N'-二甲基甲酰胺成为21.6mM。使500μg的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗(中外制药株式会社)溶解于46.9μL的60mM的乙酸钠缓冲液(pH 4.7)，加入4.7μL的21.6mM的肽试剂(相对于抗体为30当量)，室温下搅拌1小时。将反应液添加至NAP-5柱，使反应停止，置换为20mM的PBS缓冲液。通过ESI-TOFMS测定质量时，引入了1个结合性肽的产物在149756确认到峰，引入了2个结合性肽的产物在151131确认到峰。
(25-5)曲妥珠单抗的特异性修饰体的还原条件下的基于ESI-TOFMS分析的重链选择性的确认
向(25-4)中生成的抗体-肽复合物中加入5μL的7mM的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐溶液(相对于抗体为等量)，室温下搅拌20分钟。通过ESI-TOFMS测定质量时，关于原料的曲妥珠单抗，在50595、50756观测到重链峰，并在23440观测到轻链峰；关于产物，在重链中引入了硫代丙酰基在50685、50844观测到峰，并且与原料同样在23439观测到轻链峰。
(25-6)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析
通过HIC对(25-5)中生成的抗体-肽复合物和原料的抗体进行了分析。柱使用了Protein-Pak Hi Res HIC柱(沃特世公司)4.6×100mm 2.5μm。使用A_Buffer:0.1M PiNa,2.3M(NH4)2SO4,pH7.0、B_Buffer:0.1M PiNa,pH7.0，流速为0.6mL/分钟，梯度设为A 60％B40％→A0％B 100％、16分钟(数据采集20分钟)，柱温为40℃，恒温器温度为40℃，检测器用280nm的波长进行了检测。
对于样品，按照以下的条件进行反应。
a:曲妥珠单抗原料；
b:曲妥珠单抗+肽二硫连接体偶联物-NHS活化体30当量。
保留时间11.4271分钟被认为是在曲妥珠单抗中引入了1个肽的化合物，12.7939分钟被认为是引入了2个肽的化合物(图33)。
(25-7)曲妥珠单抗-肽复合物的连接体切割和再氧化
通过实施例3的(3-1)记载的方法进行(25-4)中得到的抗体-肽复合物的连接体切割和再氧化，就可获得对EU numbering中的Lys246及Lys248区域选择性地引入了硫代丙酰基的抗体。
[实施例26：具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物(肽二硫连接体偶联物-NHS活化体)的合成、以及使用该化合物的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的修饰及其分析]
(26-1)IgG1 Fc结合性肽的合成
通过与实施例1(1-1)同样的方法合成了Ac-CAYHKSQIVWC-NH2(SEQ ID NO:29)的肽，并进行纯化，获得了目标物(53.3mg，38.7μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝2 690.05[M+2H]2+
(26-2)Ac-CAYHKSQIVWC-NH2(SEQ ID NO:29)的第1位和第11位的Cys处的分子内二硫键的形成
[化学式94]
Figure BDA0002827785710001681
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:29。
将(26-1)中合成的肽(53.3mg，38.7μmol)溶解于DMSO成为100mM后，加入2当量的2M NH3-MeOH、1当量的过氧化氢水溶液，在室温下进行20小时搅拌。向反应溶液中加入2M三氟乙酸水溶液停止反应，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽(22.8mg，16.6μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝2 689.20[M+2H]2+
(26-3)二硫连接体与肽的偶联
[化学式95]
Figure BDA0002827785710001691
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:29。
将(26-2)中合成的Ac-CAYHKSQIVWC-NH2(SEQ ID NO:29)(22.8mg，16.6μmol，其中，第1位和第11位的2个半胱氨酸分别在分子内形成二硫键)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(0.40mL)，加入将3,3'-二硫代二丙酸二(N-琥珀酰亚胺酯)(134mg，332μmol)溶解于乙腈(0.40mL)而得的溶液，室温下搅拌24小时。通过减压浓缩而除去乙腈后，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽二硫连接体偶联物-NHS活化体(8.50mg，5.10μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝2 833.75[M+2H]2+
HPLC纯度:92％
(26-4)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰和基于ESI-TOFMS的分析
将(26-3)中合成的肽二硫连接体偶联物-NHS活化体溶解于N,N'-二甲基甲酰胺成为21.6mM。使500μg的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗(中外制药株式会社)溶解于46.9μL的60mM的乙酸钠缓冲液(pH 4.7)，加入4.7μL的21.6mM的肽试剂(相对于抗体为30当量)，室温下搅拌1小时。将反应液添加至NAP-5柱，使反应停止，置换为20mM的PBS缓冲液。通过ESI-TOFMS测定质量时，引入了1个结合性肽的产物在149772确认到峰，引入了2个结合性肽的产物在151323确认到峰。
(26-5)曲妥珠单抗的特异性修饰体的还原条件下的基于ESI-TOFMS分析的重链选择性的确认
向(26-4)中生成的抗体-肽复合物中加入5μL的7mM的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐溶液(相对于抗体为等量)，室温下搅拌20分钟。通过ESI-TOFMS测定质量时，关于原料的曲妥珠单抗，在50595、50756观测到重链峰，并在23440观测到轻链峰；关于产物，在重链中引入了硫代丙酰基在50685、50844观测到峰，并且与原料同样在23439观测到轻链峰。
(26-6)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析
通过HIC对(26-5)中生成的抗体-肽复合物和原料的抗体进行了分析。柱使用了Protein-Pak Hi Res HIC柱(沃特世公司)4.6×100mm 2.5μm。使用A_Buffer:0.1M PiNa,2.3M(NH4)2SO4,pH7.0、B_Buffer:0.1M PiNa,pH7.0，流速为0.6mL/分钟，梯度设为A 60％B40％→A0％B 100％、16分钟(数据采集20分钟)，柱温为40℃，恒温器温度为40℃，检测器用280nm的波长进行了检测。
对于样品，按照以下的条件进行反应。
a:曲妥珠单抗原料；
b:曲妥珠单抗+肽二硫连接体偶联物-NHS活化体30当量。
保留时间11.8301分钟被认为是在曲妥珠单抗中引入了1个肽的化合物，13.2565分钟被认为是引入了2个肽的化合物(图34)。
(26-7)曲妥珠单抗-肽复合物的连接体切割和再氧化
通过实施例3的(3-1)记载的方法进行(26-4)中得到的抗体-肽复合物的连接体切割和再氧化，就可获得对EU numbering中的Lys246及Lys248区域选择性地引入了硫代丙酰基的抗体。
[实施例27：具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物(肽二硫连接体偶联物-NHS活化体)的合成、以及使用该化合物的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的修饰及其分析]
(27-1)IgG1 Fc结合性肽的合成
通过与实施例1(1-1)同样的方法合成了Ac-RGNCAYHKGQLVFCTYH-NH2(SEQ ID NO:30)的肽，并进行纯化，获得了目标物(168mg，82.4μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 680.30[M+3H]3+,z＝4 510.55[M+4H]4+
(27-2)Ac-RGNCAYHKGQLVFCTYH-NH2(SEQ ID NO:30)的第4位和第14位的Cys处的分子内二硫键的形成
[化学式96]
Figure BDA0002827785710001711
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:30。
将(27-1)中合成的肽(168mg，82.4μmol)溶解于DMSO成为100mM后，加入2当量的2MNH3-MeOH、1当量的过氧化氢水溶液，在室温下进行20小时搅拌。向反应溶液中加入2M三氟乙酸水溶液停止反应，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽(22.1mg，10.9μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 679.55[M+3H]3+,z＝4 510.10[M+4H]4+
(27-3)二硫连接体与肽的偶联
[化学式97]
Figure BDA0002827785710001712
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:30。
将(27-2)中合成的Ac-RGNCAYHKGQLVFCTYH-NH2(SEQ ID NO:30)(22.1mg，10.9μmol，其中，第4位和第14位的2个半胱氨酸分别在分子内形成二硫键)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(1.00mL)，加入将3,3'-二硫代二丙酸二(N-琥珀酰亚胺酯)(176mg，436μmol)溶解于乙腈(1.00mL)而得的溶液，室温下搅拌24小时。通过减压浓缩而除去乙腈后，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽二硫连接体偶联物-NHS活化体(8.00mg，3.34μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 776.05[M+3H]3+
HPLC纯度:89％
(27-4)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰和基于ESI-TOFMS的分析
将(27-3)中合成的肽二硫连接体偶联物-NHS活化体溶解于N,N'-二甲基甲酰胺成为21.6mM。使500μg的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗(中外制药株式会社)溶解于46.9μL的60mM的乙酸钠缓冲液(pH 4.7)，加入4.7μL的21.6mM的肽试剂(相对于抗体为30当量)，室温下搅拌1小时。将反应液添加至NAP-5柱，使反应停止，置换为20mM的PBS缓冲液。通过ESI-TOFMS测定质量时，原料的曲妥珠单抗在148069观测到峰，引入了1个结合性肽的产物在150279确认到峰，引入了2个结合性肽的产物在152490确认到峰。
(27-5)曲妥珠单抗的特异性修饰体的还原条件下的基于ESI-TOFMS分析的重链选择性的确认
向(27-4)中生成的抗体-肽复合物中加入5μL的7mM的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐溶液(相对于抗体为等量)，室温下搅拌20分钟。通过ESI-TOFMS测定质量时，关于原料的曲妥珠单抗，在50595、50756观测到重链峰，并在23440观测到轻链峰；关于产物，在重链中引入了硫代丙酰基在50685、50844观测到峰，并且与原料同样在23439观测到轻链峰。
(27-6)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析
通过HIC对(27-5)中生成的抗体-肽复合物和原料的抗体进行了分析。柱使用了Protein-Pak Hi Res HIC柱(沃特世公司)4.6×100mm 2.5μm。使用A_Buffer:0.1M PiNa,2.3M(NH4)2SO4,pH7.0、B_Buffer:0.1M PiNa,pH7.0，流速为0.6mL/分钟，梯度设为A 60％B40％→A0％B 100％、16分钟(数据采集20分钟)，柱温为40℃，恒温器温度为40℃，检测器用280nm的波长进行了检测。
对于样品，按照以下的条件进行反应。
a:曲妥珠单抗原料；
b:曲妥珠单抗+肽二硫连接体偶联物-NHS活化体30当量。
保留时间9.6408分钟被认为是曲妥珠单抗原料，10.3664分钟被认为是在曲妥珠单抗中引入了1个肽的化合物，10.9759分钟被认为是在曲妥珠单抗中引入了2个肽的化合物(图35)。
(27-7)曲妥珠单抗-肽复合物的连接体切割和再氧化
通过实施例3的(3-1)记载的方法进行(27-4)中得到的抗体-肽复合物的连接体切割和再氧化，就可获得对EU numbering中的Lys246及Lys248区域选择性地引入了硫代丙酰基的抗体。
[实施例28：具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物(肽二硫连接体偶联物-NHS活化体)的合成、以及使用该化合物的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的修饰及其分析]
(28-1)IgG1 Fc结合性肽的合成
通过与实施例1(1-1)同样的方法合成了Ac-RGNCAYHKGQQVWCTYH-NH2(SEQ ID NO:31)的肽，并进行纯化，获得了目标物(51.3mg，24.5μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 689.45[M+3H]3+,z＝4 524.05[M+4H]4+
(28-2)Ac-RGNCAYHKGQQVWCTYH-NH2(SEQ ID NO:31)的第4位和第14位的Cys处的分子内二硫键的形成
[化学式98]
Figure BDA0002827785710001731
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:31。
将(28-1)中合成的肽(51.3mg，24.5μmol)溶解于DMSO成为100mM后，加入2当量的2M NH3-MeOH、1当量的过氧化氢水溶液，在室温下进行20小时搅拌。向反应溶液中加入2M三氟乙酸水溶液停止反应，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽(31.6mg，15.1μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 697.60[M+3H]3+,z＝4 523.60[M+4H]4+
(28-3)二硫连接体与肽的偶联
[化学式99]
Figure BDA0002827785710001741
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:31。
将(28-2)中合成的Ac-RGNCAYHKGQQVWCTYH-NH2(SEQ ID NO:31)(31.6mg，15.1μmol，其中，第4位和第14位的2个半胱氨酸分别在分子内形成二硫键)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(1.40mL)，加入将3,3'-二硫代二丙酸二(N-琥珀酰亚胺酯)(244mg，604μmol)溶解于乙腈(1.00mL)而得的溶液，室温下搅拌24小时。通过减压浓缩而除去乙腈后，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽二硫连接体偶联物-NHS活化体(6.00mg，2.52μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 794.40[M+3H]3+
HPLC纯度:91％
(28-4)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰和基于ESI-TOFMS的分析
将(28-3)中合成的肽二硫连接体偶联物-NHS活化体溶解于N,N'-二甲基甲酰胺成为21.6mM。使500μg的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗(中外制药株式会社)溶解于46.9μL的60mM的乙酸钠缓冲液(pH 4.7)，加入4.7μL的21.6mM的肽试剂(相对于抗体为30当量)，室温下搅拌1小时。将反应液添加至NAP-5柱，使反应停止，置换为20mM的PBS缓冲液。通过ESI-TOFMS测定质量时，原料的曲妥珠单抗在148057观测到峰，引入了1个结合性肽的产物在150484确认到峰，引入了2个结合性肽的产物在152587确认到峰。
(28-5)曲妥珠单抗的特异性修饰体的还原条件下的基于ESI-TOFMS分析的重链选择性的确认
向(28-4)中生成的抗体-肽复合物中加入5μL的7mM的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐溶液(相对于抗体为等量)，室温下搅拌20分钟。通过ESI-TOFMS测定质量时，关于原料的曲妥珠单抗，在50595、50756观测到重链峰，并在23440观测到轻链峰；关于产物，在重链中引入了硫代丙酰基在50685、50844观测到峰，并且与原料同样在23439观测到轻链峰。
(28-6)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析
通过HIC对(28-5)中生成的抗体-肽复合物和原料的抗体进行了分析。柱使用了Protein-Pak Hi Res HIC柱(沃特世公司)4.6×100mm 2.5μm。使用A_Buffer:0.1M PiNa,2.3M(NH4)2SO4,pH7.0、B_Buffer:0.1M PiNa,pH7.0，流速为0.6mL/分钟，梯度设为A 60％B40％→A0％B 100％、16分钟(数据采集20分钟)，柱温为40℃，恒温器温度为40℃，检测器用280nm的波长进行了检测。
对于样品，按照以下的条件进行反应。
a:曲妥珠单抗原料；
b:曲妥珠单抗+肽二硫连接体偶联物-NHS活化体30当量。
保留时间9.8954分钟被认为是在曲妥珠单抗中引入了1个肽的化合物，10.1116分钟被认为是在曲妥珠单抗中引入了2个肽的化合物(图36)。
(28-7)曲妥珠单抗-肽复合物的连接体切割和再氧化
通过实施例3的(3-1)记载的方法进行(28-4)中得到的抗体-肽复合物的连接体切割和再氧化，就可获得对EU numbering中的Lys246及Lys248区域选择性地引入了硫代丙酰基的抗体。
[实施例29：具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物(肽二硫连接体偶联物-NHS活化体)的合成、以及使用该化合物的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的修饰及其分析]
(29-1)IgG1 Fc结合性肽的合成
通过与实施例1(1-1)同样的方法合成了Ac-RGNCAYHKGQEVWCTYH-NH2(SEQ ID NO:32)的肽，并进行纯化，获得了目标物(54.0mg，25.8μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 698.80[M+3H]3+,z＝4 524.40[M+4H]4+
(29-2)Ac-RGNCAYHKGQEVWCTYH-NH2(SEQ ID NO:32)的第4位和第14位的Cys处的分子内二硫键的形成
[化学式100]
Figure BDA0002827785710001761
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:32。
将(29-1)中合成的肽(54.0mg，25.8μmol)溶解于DMSO成为100mM后，加入2当量的2M NH3-MeOH、1当量的过氧化氢水溶液，在室温下进行20小时搅拌。向反应溶液中加入2M三氟乙酸水溶液停止反应，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽(22.2mg，10.6μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 698.00[M+3H]3+,z＝4 523.85[M+4H]4+
(29-3)二硫连接体与肽的偶联
[化学式101]
Figure BDA0002827785710001762
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:32。
将(29-2)中合成的Ac-RGNCAYHKGQEVWCTYH-NH2(SEQ ID NO:32)(22.2mg，10.6μmol，其中，第4位和第14位的2个半胱氨酸分别在分子内形成二硫键)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(1.00mL)，加入将3,3'-二硫代二丙酸二(N-琥珀酰亚胺酯)(171mg，424μmol)溶解于乙腈(0.50mL)而得的溶液，室温下搅拌24小时。通过减压浓缩而除去乙腈后，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽二硫连接体偶联物-NHS活化体(4.50mg，1.89μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 794.45[M+3H]3+
HPLC纯度:92％
(29-4)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰和基于ESI-TOFMS的分析
将(29-3)中合成的肽二硫连接体偶联物-NHS活化体溶解于N,N'-二甲基甲酰胺成为21.6mM。使500μg的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗(中外制药株式会社)溶解于46.9μL的60mM的乙酸钠缓冲液(pH 4.7)，加入4.7μL的21.6mM的肽试剂(相对于抗体为30当量)，室温下搅拌1小时。将反应液添加至NAP-5柱，使反应停止，置换为20mM的PBS缓冲液。通过ESI-TOFMS测定质量时，引入了1个结合性肽的产物在150036确认到峰，引入了2个结合性肽的产物在152599确认到峰。
(29-5)曲妥珠单抗的特异性修饰体的还原条件下的基于ESI-TOFMS分析的重链选择性的确认
向(29-4)中生成的抗体-肽复合物中加入5μL的7mM的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐溶液(相对于抗体为等量)，室温下搅拌20分钟。通过ESI-TOFMS测定质量时，关于原料的曲妥珠单抗，在50595、50756观测到重链峰，并在23440观测到轻链峰；关于产物，在重链中引入了硫代丙酰基在50685、50844观测到峰，并且与原料同样在23439观测到轻链峰。
(29-6)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析
通过HIC对(29-5)中生成的抗体-肽复合物和原料的抗体进行了分析。柱使用了Protein-Pak Hi Res HIC柱(沃特世公司)4.6×100mm 2.5μm。使用A_Buffer:0.1M PiNa,2.3M(NH4)2SO4,pH7.0、B_Buffer:0.1M PiNa,pH7.0，流速为0.6mL/分钟，梯度设为A 60％B40％→A0％B 100％、16分钟(数据采集20分钟)，柱温为40℃，恒温器温度为40℃，检测器用280nm的波长进行了检测。
对于样品，按照以下的条件进行反应。
a:曲妥珠单抗原料；
b:曲妥珠单抗+肽二硫连接体偶联物-NHS活化体30当量。
保留时间9.8060分钟被认为是在曲妥珠单抗中引入了1个肽的化合物，11.1940分钟被认为是在曲妥珠单抗中引入了2个肽的化合物(图37)。
(29-7)曲妥珠单抗-肽复合物的连接体切割和再氧化
通过实施例3的(3-1)记载的方法进行(29-4)中得到的抗体-肽复合物的连接体切割和再氧化，就可获得对EU numbering中的Lys246及Lys248区域选择性地引入了硫代丙酰基的抗体。
[实施例30：具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物(肽二硫连接体偶联物-NHS活化体)的合成、以及使用该化合物的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的修饰及其分析]
(30-1)IgG1 Fc结合性肽的合成
通过与实施例1(1-1)同样的方法合成了Ac-CAYHKGQLVWC-NH2(SEQ ID NO:33)的肽，并进行纯化，获得了目标物(171mg，118μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝2 675.20[M+2H]2+
(30-2)Ac-CAYHKGQLVWC-NH2(SEQ ID NO:33)的第1位和第11位的Cys处的分子内二硫键的形成
[化学式102]
Figure BDA0002827785710001781
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:33。
将(30-1)中合成的肽(171mg，118μmol)溶解于DMSO(5.00mL)，加入2M NH3-MeOH(118μL，236mmol)、过氧化氢水溶液(241μL，2.36mmol)，在室温下进行20小时搅拌。向反应溶液中加入2M三氟乙酸水溶液停止反应，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽(23.2mg，17.2μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝1 1347.8[M+H]+,z＝2 674.15[M+2H]2+
(30-3)二硫连接体与肽的偶联
[化学式103]
Figure BDA0002827785710001791
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:33。
将(30-2)中合成的Ac-CAYHKGQLVWC-NH2(SEQ ID NO:33)(23.2mg，17.2μmol，其中，第1位和第11位的2个半胱氨酸分别在分子内形成二硫键)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(1.50mL)，加入将3,3'-二硫代二丙酸二(N-琥珀酰亚胺酯)(278mg，688μmol)溶解于乙腈(2.00mL)而得的溶液，室温下搅拌24小时。通过减压浓缩而除去乙腈后，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽二硫连接体偶联物-NHS活化体(9.00mg，5.50μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝2 818.65[M+2H]2+
HPLC纯度:92％
(30-4)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰和基于ESI-TOFMS的分析
将(30-3)中合成的肽二硫连接体偶联物-NHS活化体溶解于N,N'-二甲基甲酰胺成为21.6mM。使500μg的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗(中外制药株式会社)溶解于46.9μL的60mM的乙酸钠缓冲液(pH 4.7)，加入4.7μL的21.6mM的肽试剂(相对于抗体为30当量)，室温下搅拌1小时。将反应液添加至NAP-5柱，使反应停止，置换为20mM的PBS缓冲液。通过ESI-TOFMS测定质量时，引入了1个结合性肽的产物在149591确认到峰，引入了2个结合性肽的产物在151112确认到峰。
(30-5)曲妥珠单抗的特异性修饰体的还原条件下的基于ESI-TOFMS分析的重链选择性的确认
向(30-4)中生成的抗体-肽复合物中加入5μL的7mM的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐溶液(相对于抗体为等量)，室温下搅拌20分钟。通过ESI-TOFMS测定质量时，关于原料的曲妥珠单抗，在50595、50756观测到重链峰，并在23440观测到轻链峰；关于产物，在重链中引入了硫代丙酰基在50685、50844观测到峰，并且与原料同样在23439观测到轻链峰。
(30-6)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析
通过HIC对(30-5)中生成的抗体-肽复合物和原料的抗体进行了分析。柱使用了Protein-Pak Hi Res HIC柱(沃特世公司)4.6×100mm 2.5μm。使用A_Buffer:0.1M PiNa,2.3M(NH4)2SO4,pH7.0、B_Buffer:0.1M PiNa,pH7.0，流速为0.6mL/分钟，梯度设为A 60％B40％→A0％B 100％、16分钟(数据采集20分钟)，柱温为40℃，恒温器温度为40℃，检测器用280nm的波长进行了检测。
对于样品，按照以下的条件进行反应。
a:曲妥珠单抗原料；
b:曲妥珠单抗+肽二硫连接体偶联物-NHS活化体30当量。
保留时间11.7171分钟被认为是在曲妥珠单抗中引入了1个肽的化合物，13.0646分钟被认为是引入了2个肽的化合物(图38)。
(30-7)曲妥珠单抗-肽复合物的连接体切割和再氧化
通过实施例3的(3-1)记载的方法进行(30-4)中得到的抗体-肽复合物的连接体切割和再氧化，就可获得对EU numbering中的Lys246及Lys248区域选择性地引入了硫代丙酰基的抗体。
[实施例31：具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物(肽二硫连接体偶联物-NHS活化体)的合成、以及使用该化合物的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的修饰及其分析]
(31-1)IgG1 Fc结合性肽的合成
通过与实施例1(1-1)同样的方法合成了Ac-RGNCAYHKAQLVWCTYH-NH2(SEQ ID NO:34)的肽，并进行纯化，获得了目标物(58.8mg，28.1μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 697.90[M+3H]3+
(31-2)Ac-RGNCAYHKAQLVWCTYH-NH2(SEQ ID NO:34)的第4位和第14位的Cys处的分子内二硫键的形成
[化学式104]
Figure BDA0002827785710001811
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:34。
将(31-1)中合成的肽(58.8mg，28.1μmol)溶解于DMSO(5.00mL)，加入2M NH3-MeOH(28.1μL，56.2μmol)、过氧化氢水溶液(57.4μL，562μmol)，在室温下进行20小时搅拌。向反应溶液中加入2M三氟乙酸水溶液停止反应，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽(21.2mg，10.1μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 697.50[M+3H]3+
(31-3)二硫连接体与肽的偶联
[化学式105]
Figure BDA0002827785710001812
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:34。
将(31-2)中合成的Ac-RGNCAYHKAQLVWCTYH-NH2(SEQ ID NO:34)(21.2mg，10.1μmol，其中，第4位和第14位的2个半胱氨酸分别在分子内形成二硫键)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(1.00mL)，加入将3,3'-二硫代二丙酸二(N-琥珀酰亚胺酯)(163mg，404μmol)溶解于乙腈(1.50mL)而得的溶液，室温下搅拌24小时。通过减压浓缩而除去乙腈后，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽二硫连接体偶联物-NHS活化体(8.00mg，3.36μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 794.00[M+3H]3+
HPLC纯度:91％
(31-4)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰和基于ESI-TOFMS的分析
将(31-3)中合成的肽二硫连接体偶联物-NHS活化体溶解于N,N'-二甲基甲酰胺成为21.6mM。使500μg的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗(中外制药株式会社)溶解于46.9μL的60mM的乙酸钠缓冲液(pH 4.7)，加入4.7μL的21.6mM的肽试剂(相对于抗体为30当量)，室温下搅拌1小时。将反应液添加至NAP-5柱，使反应停止，置换为20mM的PBS缓冲液。通过ESI-TOFMS测定质量时，原料的曲妥珠单抗在148057观测到峰，引入了1个结合性肽的产物在150492确认到峰，引入了2个结合性肽的产物在152755确认到峰。
(31-5)曲妥珠单抗的特异性修饰体的还原条件下的基于ESI-TOFMS分析的重链选择性的确认
向(31-4)中生成的抗体-肽复合物中加入5μL的7mM的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐溶液(相对于抗体为等量)，室温下搅拌20分钟。通过ESI-TOFMS测定质量时，关于原料的曲妥珠单抗，在50595、50756观测到重链峰，并在23440观测到轻链峰；关于产物，在重链中引入了硫代丙酰基在50685、50844观测到峰，并且与原料同样在23439观测到轻链峰。
(31-6)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析
通过HIC对(31-5)中生成的抗体-肽复合物和原料的抗体进行了分析。柱使用了Protein-Pak Hi Res HIC柱(沃特世公司)4.6×100mm 2.5μm。使用A_Buffer:0.1M PiNa,2.3M(NH4)2SO4,pH7.0、B_Buffer:0.1M PiNa,pH7.0，流速为0.6mL/分钟，梯度设为A 60％B40％→A0％B 100％、16分钟(数据采集20分钟)，柱温为40℃，恒温器温度为40℃，检测器用280nm的波长进行了检测。
对于样品，按照以下的条件进行反应。
a:曲妥珠单抗原料；
b:曲妥珠单抗+肽二硫连接体偶联物-NHS活化体30当量。
保留时间10.5613分钟被认为是在曲妥珠单抗中引入了1个肽的化合物，11.2219分钟被认为是引入了2个肽的化合物(图39)。
(31-7)曲妥珠单抗-肽复合物的连接体切割和再氧化
通过实施例3的(3-1)记载的方法进行(31-4)中得到的抗体-肽复合物的连接体切割和再氧化，就可获得对EU numbering中的Lys246及Lys248区域选择性地引入了硫代丙酰基的抗体。
[实施例32：具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物(肽二硫连接体偶联物-NHS活化体)的合成、以及使用该化合物的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的修饰及其分析]
(32-1)IgG1 Fc结合性肽的合成
通过与实施例1(1-1)同样的方法合成了Ac-RGNCAYHKVQLVWCTYH-NH2(SEQ ID NO:35)的肽，并进行纯化，获得了目标物(52.2mg，24.6μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝4 530.60[M+4H]4+
(32-2)Ac-RGNCAYHKVQLVWCTYH-NH2(SEQ ID NO:35)的第4位和第14位的Cys处的分子内二硫键的形成
[化学式106]
Figure BDA0002827785710001831
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:35。
将(32-1)中合成的肽(52.2mg，24.6μmol)溶解于DMSO(5.00mL)，加入2M NH3-MeOH(24.6μL，49.2μmol)、过氧化氢水溶液(50.2μL，492μmol)，在室温下进行20小时搅拌。向反应溶液中加入2M三氟乙酸水溶液停止反应，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽(17.3mg，8.17μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝4 530.30[M+4H]4+
(32-3)二硫连接体与肽的偶联
[化学式107]
Figure BDA0002827785710001841
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:35。
将(32-2)中合成的Ac-RGNCAYHKVQLVWCTYH-NH2(SEQ ID NO:35)(17.3mg，8.17μmol，其中，第4位和第14位的2个半胱氨酸分别在分子内形成二硫键)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(1.00mL)，加入将3,3'-二硫代二丙酸二(N-琥珀酰亚胺酯)(132mg，327μmol)溶解于乙腈(1.00mL)而得的溶液，室温下搅拌24小时。通过减压浓缩而除去乙腈后，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽二硫连接体偶联物-NHS活化体(6.80mg，2.83μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 803.45[M+3H]3+
HPLC纯度:82％
(32-4)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰和基于ESI-TOFMS的分析
将(32-3)中合成的肽二硫连接体偶联物-NHS活化体溶解于N,N'-二甲基甲酰胺成为21.6mM。使500μg的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗(中外制药株式会社)溶解于46.9μL的60mM的乙酸钠缓冲液(pH 4.7)，加入4.7μL的21.6mM的肽试剂(相对于抗体为30当量)，室温下搅拌1小时。将反应液添加至NAP-5柱，使反应停止，置换为20mM的PBS缓冲液。通过ESI-TOFMS测定质量时，原料的曲妥珠单抗在148057观测到峰，原料的曲妥珠单抗在148062观测到峰，引入了1个结合性肽的产物在150517确认到峰，引入了2个结合性肽的产物在152998确认到峰。
(32-5)曲妥珠单抗的特异性修饰体的还原条件下的基于ESI-TOFMS分析的重链选择性的确认
向(32-4)中生成的抗体-肽复合物中加入5μL的7mM的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐溶液(相对于抗体为等量)，室温下搅拌20分钟。通过ESI-TOFMS测定质量时，关于原料的曲妥珠单抗，在50595、50756观测到重链峰，并在23440观测到轻链峰；关于产物，在重链中引入了硫代丙酰基在50685、50844观测到峰，并且与原料同样在23439观测到轻链峰。
(32-6)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析
通过HIC对(32-5)中生成的抗体-肽复合物和原料的抗体进行了分析。柱使用了Protein-Pak Hi Res HIC柱(沃特世公司)4.6×100mm 2.5μm。使用A_Buffer:0.1M PiNa,2.3M(NH4)2SO4,pH7.0、B_Buffer:0.1M PiNa,pH7.0，流速为0.6mL/分钟，梯度设为A 60％B40％→A0％B 100％、16分钟(数据采集20分钟)，柱温为40℃，恒温器温度为40℃，检测器用280nm的波长进行了检测。
对于样品，按照以下的条件进行反应。
a:曲妥珠单抗原料；
b:曲妥珠单抗+肽二硫连接体偶联物-NHS活化体30当量。
保留时间9.8551分钟被认为是曲妥珠单抗原料，11.0564分钟被认为是在曲妥珠单抗中引入了1个肽的化合物，11.9854分钟被认为是引入了2个肽的化合物(图40)。
(32-7)曲妥珠单抗-肽复合物的连接体切割和再氧化
通过实施例3的(3-1)记载的方法进行(32-4)中得到的抗体-肽复合物的连接体切割和再氧化，就可获得对EU numbering中的Lys246及Lys248区域选择性地引入了硫代丙酰基的抗体。
[实施例33：具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物(肽二硫连接体偶联物-NHS活化体)的合成、以及使用该化合物的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的修饰及其分析]
(33-1)IgG1 Fc结合性肽的合成
通过与实施例1(1-1)同样的方法合成了Ac-RGNCAYHKLQLVWCTYH-NH2(SEQ ID NO:36)的肽，并进行纯化，获得了目标物(155mg，72.7μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 712.40[M+3H]3+
(33-2)Ac-RGNCAYHKLQLVWCTYH-NH2(SEQ ID NO:36)的第4位和第14位的Cys处的分子内二硫键的形成
[化学式108]
Figure BDA0002827785710001861
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:36。
将(33-1)中合成的肽(155mg，72.7μmol)溶解于DMSO(5.00mL)，加入2M NH3-MeOH(72.7μL，145μmol)、过氧化氢水溶液(148μL，1.45mmol)，在室温下进行20小时搅拌。向反应溶液中加入2M三氟乙酸水溶液停止反应，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽(13.3mg，6.24μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 711.50[M+3H]3+
(33-3)二硫连接体与肽的偶联
[化学式109]
Figure BDA0002827785710001862
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:36。
将(33-2)中合成的Ac-RGNCAYHKLQLVWCTYH-NH2(SEQ ID NO:36)(13.3mg，6.24μmol，其中，第4位和第14位的2个半胱氨酸分别在分子内形成二硫键)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(1.00mL)，加入将3,3'-二硫代二丙酸二(N-琥珀酰亚胺酯)(101mg，250μmol)溶解于乙腈(1.00mL)而得的溶液，室温下搅拌24小时。通过减压浓缩而除去乙腈后，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽二硫连接体偶联物-NHS活化体(7.00mg，2.89μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 807.80[M+3H]3+
HPLC纯度:89％
(33-4)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰和基于ESI-TOFMS的分析
将(33-3)中合成的肽二硫连接体偶联物-NHS活化体溶解于N,N'-二甲基甲酰胺成为21.6mM。使500μg的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗(中外制药株式会社)溶解于46.9μL的60mM的乙酸钠缓冲液(pH 4.7)，加入4.7μL的21.6mM的肽试剂(相对于抗体为30当量)，室温下搅拌1小时。将反应液添加至NAP-5柱，使反应停止，置换为20mM的PBS缓冲液。通过ESI-TOFMS测定质量时，原料的曲妥珠单抗在148057观测到峰，引入了1个结合性肽的产物在150899确认到峰，引入了2个结合性肽的产物在153025确认到峰。
(33-5)曲妥珠单抗的特异性修饰体的还原条件下的基于ESI-TOFMS分析的重链选择性的确认
向(33-4)中生成的抗体-肽复合物中加入5μL的7mM的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐溶液(相对于抗体为等量)，室温下搅拌20分钟。通过ESI-TOFMS测定质量时，关于原料的曲妥珠单抗，在50595、50756观测到重链峰，并在23440观测到轻链峰；关于产物，在重链中引入了硫代丙酰基在50685、50844观测到峰，并且与原料同样在23439观测到轻链峰。
(33-6)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析
通过HIC对(33-5)中生成的抗体-肽复合物和原料的抗体进行了分析。柱使用了Protein-Pak Hi Res HIC柱(沃特世公司)4.6×100mm 2.5μm。使用A_Buffer:0.1M PiNa,2.3M(NH4)2SO4,pH7.0、B_Buffer:0.1M PiNa,pH7.0，流速为0.6mL/分钟，梯度设为A 60％B40％→A0％B 100％、16分钟(数据采集20分钟)，柱温为40℃，恒温器温度为40℃，检测器用280nm的波长进行了检测。
对于样品，按照以下的条件进行反应。
a:曲妥珠单抗原料；
b:曲妥珠单抗+肽二硫连接体偶联物-NHS活化体30当量。
保留时间11.2079分钟被认为是在曲妥珠单抗中引入了1个肽的化合物，12.2377分钟被认为是引入了2个肽的化合物(图41)。
(33-7)曲妥珠单抗-肽复合物的连接体切割和再氧化
通过实施例3的(3-1)记载的方法进行(33-4)中得到的抗体-肽复合物的连接体切割和再氧化，就可获得对EU numbering中的Lys246及Lys248区域选择性地引入了硫代丙酰基的抗体。
[实施例34：具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物(肽二硫连接体偶联物-NHS活化体)的合成、以及使用该化合物的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的修饰及其分析]
(34-1)IgG1 Fc结合性肽的合成
通过与实施例1(1-1)同样的方法合成了Ac-RGNCAYHKIQLVWCTYH-NH2(SEQ ID NO:37)的肽，并进行纯化，获得了目标物(153mg，71.7μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 712.10[M+3H]3+
(34-2)Ac-RGNCAYHKIQLVWCTYH-NH2(SEQ ID NO:37)的第4位和第14位的Cys处的分子内二硫键的形成
[化学式110]
Figure BDA0002827785710001881
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:37。
将(34-1)中合成的肽(153mg，71.7μmol)溶解于DMSO(5.00mL)，加入2M NH3-MeOH(71.7μL，143μmol)、过氧化氢水溶液(146μL，1.43mmol)，在室温下进行20小时搅拌。向反应溶液中加入2M三氟乙酸水溶液停止反应，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽(15.7mg，7.37μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 711.40[M+3H]3+
(34-3)二硫连接体与肽的偶联
[化学式111]
Figure BDA0002827785710001891
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:37。
将(34-2)中合成的Ac-RGNCAYHKIQLVWCTYH-NH2(SEQ ID NO:37)(15.7mg，7.37μmol，其中，第4位和第14位的2个半胱氨酸分别在分子内形成二硫键)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(1.00mL)，加入将3,3'-二硫代二丙酸二(N-琥珀酰亚胺酯)(119mg，295μmol)溶解于乙腈(1.00mL)而得的溶液，室温下搅拌24小时。通过减压浓缩而除去乙腈后，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽二硫连接体偶联物-NHS活化体(5.00mg，2.07μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 807.75[M+3H]3+
HPLC纯度:94％
(34-4)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰和基于ESI-TOFMS的分析
将(34-3)中合成的肽二硫连接体偶联物-NHS活化体溶解于N,N'-二甲基甲酰胺成为21.6mM。使500μg的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗(中外制药株式会社)溶解于46.9μL的60mM的乙酸钠缓冲液(pH 4.7)，加入4.7μL的21.6mM的肽试剂(相对于抗体为30当量)，室温下搅拌1小时。将反应液添加至NAP-5柱，使反应停止，置换为20mM的PBS缓冲液。通过ESI-TOFMS测定质量时，引入了1个结合性肽的产物在150720确认到峰，引入了2个结合性肽的产物在153210确认到峰。
(34-5)曲妥珠单抗的特异性修饰体的还原条件下的基于ESI-TOFMS分析的重链选择性的确认
向(34-4)中生成的抗体-肽复合物中加入5μL的7mM的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐溶液(相对于抗体为等量)，室温下搅拌20分钟。通过ESI-TOFMS测定质量时，关于原料的曲妥珠单抗，在50595、50756观测到重链峰，并在23440观测到轻链峰；关于产物，在重链中引入了硫代丙酰基在50685、50844观测到峰，并且与原料同样在23439观测到轻链峰。
(34-6)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析
通过HIC对(34-5)中生成的抗体-肽复合物和原料的抗体进行了分析。柱使用了Protein-Pak Hi Res HIC柱(沃特世公司)4.6×100mm 2.5μm。使用A_Buffer:0.1M PiNa,2.3M(NH4)2SO4,pH7.0、B_Buffer:0.1M PiNa,pH7.0，流速为0.6mL/分钟，梯度设为A 60％B40％→A0％B 100％、16分钟(数据采集20分钟)，柱温为40℃，恒温器温度为40℃，检测器用280nm的波长进行了检测。
对于样品，按照以下的条件进行反应。
a:曲妥珠单抗原料；
b:曲妥珠单抗+肽二硫连接体偶联物-NHS活化体30当量。
保留时间9.8355分钟被认为是曲妥珠单抗原料，11.2645分钟被认为是在曲妥珠单抗中引入了1个肽的化合物，12.4388分钟被认为是引入了2个肽的化合物(图42)。
(34-7)曲妥珠单抗-肽复合物的连接体切割和再氧化
通过实施例3的(3-1)记载的方法进行(34-4)中得到的抗体-肽复合物的连接体切割和再氧化，就可获得对EU numbering中的Lys246及Lys248区域选择性地引入了硫代丙酰基的抗体。
[实施例35：具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物(肽二硫连接体偶联物-NHS活化体)的合成、以及使用该化合物的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的修饰及其分析]
(35-1)IgG1 Fc结合性肽的合成
通过与实施例1(1-1)同样的方法合成了Ac-RGNCAYHKSQLVWCTYH-NH2(SEQ ID NO:38)的肽，并进行纯化，获得了目标物(167mg，79.2μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 703.45[M+3H]3+
(35-2)Ac-RGNCAYHKSQLVWCTYH-NH2(SEQ ID NO:38)的第4位和第14位的Cys处的分子内二硫键的形成
[化学式112]
Figure BDA0002827785710001911
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:38。
将(35-1)中合成的肽(167mg，79.2μmol)溶解于DMSO(5.00mL)，加入2M NH3-MeOH(79.2μL，158μmol)、过氧化氢水溶液(161μL，1.58mmol)，在室温下进行20小时搅拌。向反应溶液中加入2M三氟乙酸水溶液停止反应，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽(19.6mg，9.31μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 702.90[M+3H]3+
(35-3)二硫连接体与肽的偶联
[化学式113]
Figure BDA0002827785710001912
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:38。
将(35-2)中合成的Ac-RGNCAYHKSQLVWCTYH-NH2(SEQ ID NO:38)(19.6mg，9.31μmol，其中，第4位和第14位的2个半胱氨酸分别在分子内形成二硫键)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(1.00mL)，加入将3,3'-二硫代二丙酸二(N-琥珀酰亚胺酯)(150mg，372μmol)溶解于乙腈(1.50mL)而得的溶液，室温下搅拌24小时。通过减压浓缩而除去乙腈后，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽二硫连接体偶联物-NHS活化体(7.50mg，3.13μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 799.10[M+3H]3+
HPLC纯度:92％
(35-4)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰和基于ESI-TOFMS的分析
将(35-3)中合成的肽二硫连接体偶联物-NHS活化体溶解于N,N'-二甲基甲酰胺成为21.6mM。使500μg的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗(中外制药株式会社)溶解于46.9μL的60mM的乙酸钠缓冲液(pH 4.7)，加入4.7μL的21.6mM的肽试剂(相对于抗体为30当量)，室温下搅拌1小时。将反应液添加至NAP-5柱，使反应停止，置换为20mM的PBS缓冲液。通过ESI-TOFMS测定质量时，引入了1个结合性肽的产物在150505确认到峰，引入了2个结合性肽的产物在152784确认到峰。
(35-5)曲妥珠单抗的特异性修饰体的还原条件下的基于ESI-TOFMS分析的重链选择性的确认
向(35-4)中生成的抗体-肽复合物中加入5μL的7mM的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐溶液(相对于抗体为等量)，室温下搅拌20分钟。通过ESI-TOFMS测定质量时，关于原料的曲妥珠单抗，在50595、50756观测到重链峰，并在23440观测到轻链峰；关于产物，在重链中引入了硫代丙酰基在50685、50844观测到峰，并且与原料同样在23439观测到轻链峰。
(35-6)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析
通过HIC对(35-5)中生成的抗体-肽复合物和原料的抗体进行了分析。柱使用了Protein-Pak Hi Res HIC柱(沃特世公司)4.6×100mm 2.5μm。使用A_Buffer:0.1M PiNa,2.3M(NH4)2SO4,pH7.0、B_Buffer:0.1M PiNa,pH7.0，流速为0.6mL/分钟，梯度设为A 60％B40％→A0％B 100％、16分钟(数据采集20分钟)，柱温为40℃，恒温器温度为40℃，检测器用280nm的波长进行了检测。
对于样品，按照以下的条件进行反应。
a:曲妥珠单抗原料；
b:曲妥珠单抗+肽二硫连接体偶联物-NHS活化体30当量。
保留时间10.3834分钟被认为是在曲妥珠单抗中引入了1个肽的化合物，10.9723分钟被认为是引入了2个肽的化合物(图43)。
(35-7)曲妥珠单抗-肽复合物的连接体切割和再氧化
通过实施例3的(3-1)记载的方法进行(35-4)中得到的抗体-肽复合物的连接体切割和再氧化，就可获得对EU numbering中的Lys246及Lys248区域选择性地引入了硫代丙酰基的抗体。
[实施例36：具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物(肽二硫连接体偶联物-NHS活化体)的合成、以及使用该化合物的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的修饰及其分析]
(36-1)IgG1 Fc结合性肽的合成
通过与实施例1(1-1)同样的方法合成了Ac-RGNCAYHKTQLVWCTYH-NH2(SEQ ID NO:39)的肽，并进行纯化，获得了目标物(164mg，77.3μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 708.40[M+3H]3+
(36-2)Ac-RGNCAYHKTQLVWCTYH-NH2(SEQ ID NO:39)的第4位和第14位的Cys处的分子内二硫键的形成
[化学式114]
Figure BDA0002827785710001931
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:39。
将(36-1)中合成的肽(164mg，77.3μmol)溶解于DMSO(5.00mL)，加入2M NH3-MeOH(77.3μL，155μmol)、过氧化氢水溶液(158μL，1.55mmol)，在室温下进行20小时搅拌。向反应溶液中加入2M三氟乙酸水溶液停止反应，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽(16.3mg，7.69μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 707.60[M+3H]3+
(36-3)二硫连接体与肽的偶联
[化学式115]
Figure BDA0002827785710001941
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:39。
将(36-2)中合成的Ac-RGNCAYHKTQLVWCTYH-NH2(SEQ ID NO:39)(16.3mg，7.69μmol，其中，第4位和第14位的2个半胱氨酸分别在分子内形成二硫键)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(1.00mL)，加入将3,3'-二硫代二丙酸二(N-琥珀酰亚胺酯)(125mg，308μmol)溶解于乙腈(1.50mL)而得的溶液，室温下搅拌24小时。通过减压浓缩而除去乙腈后，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽二硫连接体偶联物-NHS活化体(4.50mg，1.87μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 803.70[M+3H]3+
HPLC纯度:89％
(36-4)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰和基于ESI-TOFMS的分析
将(36-3)中合成的肽二硫连接体偶联物-NHS活化体溶解于N,N'-二甲基甲酰胺成为21.6mM。使500μg的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗(中外制药株式会社)溶解于46.9μL的60mM的乙酸钠缓冲液(pH 4.7)，加入4.7μL的21.6mM的肽试剂(相对于抗体为30当量)，室温下搅拌1小时。将反应液添加至NAP-5柱，使反应停止，置换为20mM的PBS缓冲液。通过ESI-TOFMS测定质量时，引入了2个结合性肽的产物在152814确认到峰。
(36-5)曲妥珠单抗的特异性修饰体的还原条件下的基于ESI-TOFMS分析的重链选择性的确认
向(36-4)中生成的抗体-肽复合物中加入5μL的7mM的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐溶液(相对于抗体为等量)，室温下搅拌20分钟。通过ESI-TOFMS测定质量时，关于原料的曲妥珠单抗，在50595、50756观测到重链峰，并在23440观测到轻链峰；关于产物，在重链中引入了硫代丙酰基在50685、50844观测到峰，并且与原料同样在23439观测到轻链峰。
(36-6)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析
通过HIC对(36-5)中生成的抗体-肽复合物和原料的抗体进行了分析。柱使用了Protein-Pak Hi Res HIC柱(沃特世公司)4.6×100mm 2.5μm。使用A_Buffer:0.1M PiNa,2.3M(NH4)2SO4,pH7.0、B_Buffer:0.1M PiNa,pH7.0，流速为0.6mL/分钟，梯度设为A 60％B40％→A0％B 100％、16分钟(数据采集20分钟)，柱温为40℃，恒温器温度为40℃，检测器用280nm的波长进行了检测。
对于样品，按照以下的条件进行反应。
a:曲妥珠单抗原料；
b:曲妥珠单抗+肽二硫连接体偶联物-NHS活化体30当量。
保留时间10.5115分钟被认为是在曲妥珠单抗中引入了1个肽的化合物，11.1143分钟被认为是引入了2个肽的化合物(图44)。
(36-7)曲妥珠单抗-肽复合物的连接体切割和再氧化
通过实施例3的(3-1)记载的方法进行(36-4)中得到的抗体-肽复合物的连接体切割和再氧化，就可获得对EU numbering中的Lys246及Lys248区域选择性地引入了硫代丙酰基的抗体。
[实施例37：具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物(肽二硫连接体偶联物-NHS活化体)的合成、以及使用该化合物的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的修饰及其分析]
(37-1)IgG1 Fc结合性肽的合成
通过与实施例1(1-1)同样的方法合成了Ac-RGNCAYHKNQLVWCTYH-NH2(SEQ ID NO:40)的肽，并进行纯化，获得了目标物(51.4mg，24.1μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 712.40[M+3H]3+,z＝4 534.65[M+4H]4+
(37-2)Ac-RGNCAYHKNQLVWCTYH-NH2(SEQ ID NO:40)的第4位和第14位的Cys处的分子内二硫键的形成
[化学式116]
Figure BDA0002827785710001961
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:40。
将(37-1)中合成的肽(51.4mg，24.1μmol)溶解于DMSO(5.00mL)，加入2M NH3-MeOH(24.1μL，48.2μmol)、过氧化氢水溶液(49.2μL，482μmol)，在室温下进行20小时搅拌。向反应溶液中加入2M三氟乙酸水溶液停止反应，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽(20.0mg，9.38μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 711.75[M+3H]3+,z＝4 534.10[M+4H]4+
(37-3)二硫连接体与肽的偶联
[化学式117]
Figure BDA0002827785710001962
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:40。
将(37-2)中合成的Ac-RGNCAYHKNQLVWCTYH-NH2(SEQ ID NO:40)(20.0mg，9.38μmol，其中，第4位和第14位的2个半胱氨酸分别在分子内形成二硫键)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(1.00mL)，加入将3,3'-二硫代二丙酸二(N-琥珀酰亚胺酯)(152mg，375μmol)溶解于乙腈(0.50mL)而得的溶液，室温下搅拌24小时。通过减压浓缩而除去乙腈后，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽二硫连接体偶联物-NHS活化体(8.7mg，3.59μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 808.10[M+3H]3+
HPLC纯度:93％
(37-4)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰和基于ESI-TOFMS的分析
将(37-3)中合成的肽二硫连接体偶联物-NHS活化体溶解于N,N'-二甲基甲酰胺成为21.6mM。使500μg的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗(中外制药株式会社)溶解于46.9μL的60mM的乙酸钠缓冲液(pH 4.7)，加入4.7μL的21.6mM的肽试剂(相对于抗体为30当量)，室温下搅拌1小时。将反应液添加至NAP-5柱，使反应停止，置换为20mM的PBS缓冲液。引入了1个结合性肽的产物在150370确认到峰，引入了2个结合性肽的产物在152678确认到峰。
(37-5)曲妥珠单抗的特异性修饰体的还原条件下的基于ESI-TOFMS分析的重链选择性的确认
向(37-4)中生成的抗体-肽复合物中加入5μL的7mM的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐溶液(相对于抗体为等量)，室温下搅拌20分钟。通过ESI-TOFMS测定质量时，关于原料的曲妥珠单抗，在50595、50756观测到重链峰，并在23440观测到轻链峰；关于产物，在重链中引入了硫代丙酰基在50685、50844观测到峰，并且与原料同样在23439观测到轻链峰。
(37-6)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析
通过HIC对(37-5)中生成的抗体-肽复合物和原料的抗体进行了分析。柱使用了Protein-Pak Hi Res HIC柱(沃特世公司)4.6×100mm 2.5μm。使用A_Buffer:0.1M PiNa,2.3M(NH4)2SO4,pH7.0、B_Buffer:0.1M PiNa,pH7.0，流速为0.6mL/分钟，梯度设为A 60％B40％→A0％B 100％、16分钟(数据采集20分钟)，柱温为40℃，恒温器温度为40℃，检测器用280nm的波长进行了检测。
对于样品，按照以下的条件进行反应。
a:曲妥珠单抗原料；
b:曲妥珠单抗+肽二硫连接体偶联物-NHS活化体30当量。
保留时间10.5287分钟被认为是曲妥珠单抗原料，11.0490分钟被认为是在曲妥珠单抗中引入了1个肽的化合物(图45)。
(37-7)曲妥珠单抗-肽复合物的连接体切割和再氧化
通过实施例3的(3-1)记载的方法进行(37-4)中得到的抗体-肽复合物的连接体切割和再氧化，就可获得对EU numbering中的Lys246及Lys248区域选择性地引入了硫代丙酰基的抗体。
[实施例38：具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物(肽二硫连接体偶联物-NHS活化体)的合成、以及使用该化合物的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的修饰及其分析]
(38-1)IgG1 Fc结合性肽的合成
通过与实施例1(1-1)同样的方法合成了Ac-RGNCAYHKDQLVWCTYH-NH2(SEQ ID NO:41)的肽，并进行纯化，获得了目标物(50.8mg，23.7μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 712.55[M+3H]3+,z＝4 534.75[M+4H]4+
(38-2)Ac-RGNCAYHKDQLVWCTYH-NH2(SEQ ID NO:41)的第4位和第14位的Cys处的分子内二硫键的形成
[化学式118]
Figure BDA0002827785710001981
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:41。
将(38-1)中合成的肽(50.8mg，23.7μmol)溶解于DMSO(5.00mL)，加入2M NH3-MeOH(23.8μL，47.4μmol)、过氧化氢水溶液(48.6μL，474μmol)，在室温下进行20小时搅拌。向反应溶液中加入2M三氟乙酸水溶液停止反应，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽(36.8mg，17.2μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 712.05[M+3H]3+,z＝4 534.35[M+4H]4+
(38-3)二硫连接体与肽的偶联
[化学式119]
Figure BDA0002827785710001991
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:41。
将(38-2)中合成的Ac-RGNCAYHKDQLVWCTYH-NH2(SEQ ID NO:41)(36.8mg，17.2μmol，其中，第4位和第14位的2个半胱氨酸分别在分子内形成二硫键)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(1.70mL)，加入将3,3'-二硫代二丙酸二(N-琥珀酰亚胺酯)(278mg，688μmol)溶解于乙腈(1.00mL)而得的溶液，室温下搅拌24小时。通过减压浓缩而除去乙腈后，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽二硫连接体偶联物-NHS活化体(5.80mg，2.39μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 808.45[M+3H]3+
HPLC纯度:91％
(38-4)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰和基于ESI-TOFMS的分析
将(38-3)中合成的肽二硫连接体偶联物-NHS活化体溶解于N,N'-二甲基甲酰胺成为21.6mM。使500μg的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗(中外制药株式会社)溶解于46.9μL的60mM的乙酸钠缓冲液(pH 4.7)，加入4.7μL的21.6mM的肽试剂(相对于抗体为30当量)，室温下搅拌1小时。将反应液添加至NAP-5柱，使反应停止，置换为20mM的PBS缓冲液。引入了1个结合性肽的产物在150367确认到峰，引入了2个结合性肽的产物在152831确认到峰。
(38-5)曲妥珠单抗的特异性修饰体的还原条件下的基于ESI-TOFMS分析的重链选择性的确认
向(38-4)中生成的抗体-肽复合物中加入5μL的7mM的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐溶液(相对于抗体为等量)，室温下搅拌20分钟。通过ESI-TOFMS测定质量时，关于原料的曲妥珠单抗，在50595、50756观测到重链峰，并在23440观测到轻链峰；关于产物，在重链中引入了硫代丙酰基在50685、50844观测到峰，并且与原料同样在23439观测到轻链峰。
(38-6)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析
通过HIC对(38-5)中生成的抗体-肽复合物和原料的抗体进行了分析。柱使用了Protein-Pak Hi Res HIC柱(沃特世公司)4.6×100mm 2.5μm。使用A_Buffer:0.1M PiNa,2.3M(NH4)2SO4,pH7.0、B_Buffer:0.1M PiNa,pH7.0，流速为0.6mL/分钟，梯度设为A 60％B40％→A0％B 100％、16分钟(数据采集20分钟)，柱温为40℃，恒温器温度为40℃，检测器用280nm的波长进行了检测。
对于样品，按照以下的条件进行反应。
a:曲妥珠单抗原料；
b:曲妥珠单抗+肽二硫连接体偶联物-NHS活化体30当量。
保留时间10.1365分钟被认为是曲妥珠单抗原料，10.5156分钟被认为是在曲妥珠单抗中引入了1个肽的化合物(图46)。
(38-7)曲妥珠单抗-肽复合物的连接体切割和再氧化
通过实施例3的(3-1)记载的方法进行(38-4)中得到的抗体-肽复合物的连接体切割和再氧化，就可获得对EU numbering中的Lys246及Lys248区域选择性地引入了硫代丙酰基的抗体。
[实施例39：具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物(肽二硫连接体偶联物-NHS活化体)的合成、以及使用该化合物的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的修饰及其分析]
(39-1)IgG1 Fc结合性肽的合成
通过与实施例1(1-1)同样的方法合成了Ac-RGNCAYHKQQLVWCTYH-NH2(SEQ ID NO:42)的肽，并进行纯化，获得了目标物(42.1mg，19.6μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 716.95[M+3H]3+,z＝4 538.10[M+4H]4+
(39-2)Ac-RGNCAYHKQQLVWCTYH-NH2(SEQ ID NO:42)的第4位和第14位的Cys处的分子内二硫键的形成
[化学式120]
Figure BDA0002827785710002011
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:42。
将(39-1)中合成的肽(42.1mg，19.6μmol)溶解于DMSO(5.00mL)，加入2M NH3-MeOH(19.6μL，39.2μmol)、过氧化氢水溶液(40.0μL，392μmol)，在室温下进行20小时搅拌。向反应溶液中加入2M三氟乙酸水溶液停止反应，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽(18.1mg，8.39μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 716.30[M+3H]3+,z＝4 537.50[M+4H]4+
(39-3)二硫连接体与肽的偶联
[化学式121]
Figure BDA0002827785710002012
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:42。
将(39-2)中合成的Ac-RGNCAYHKQQLVWCTYH-NH2(SEQ ID NO:42)(18.1mg，8.39μmol，其中，第4位和第14位的2个半胱氨酸分别在分子内形成二硫键)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(0.50mL)，加入将3,3'-二硫代二丙酸二(N-琥珀酰亚胺酯)(34.0mg，83.9μmol)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(0.50mL)而得的溶液，室温下搅拌24小时。通过减压浓缩而除去乙腈后，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽二硫连接体偶联物-NHS活化体(3.70mg，1.52μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 812.75[M+3H]3+
HPLC纯度:91％
(39-4)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰和基于ESI-TOFMS的分析
将(39-3)中合成的肽二硫连接体偶联物-NHS活化体溶解于N,N'-二甲基甲酰胺成为21.6mM。使500μg的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗(中外制药株式会社)溶解于46.9μL的60mM的乙酸钠缓冲液(pH 4.7)，加入4.7μL的21.6mM的肽试剂(相对于抗体为30当量)，室温下搅拌1小时。将反应液添加至NAP-5柱，使反应停止，置换为20mM的PBS缓冲液。引入了1个结合性肽的产物在150540确认到峰，引入了2个结合性肽的产物在152862确认到峰。
(39-5)曲妥珠单抗的特异性修饰体的还原条件下的基于ESI-TOFMS分析的重链选择性的确认
向(39-4)中生成的抗体-肽复合物中加入5μL的7mM的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐溶液(相对于抗体为等量)，室温下搅拌20分钟。通过ESI-TOFMS测定质量时，关于原料的曲妥珠单抗，在50595、50756观测到重链峰，并在23440观测到轻链峰；关于产物，在重链中引入了硫代丙酰基在50685、50844观测到峰，并且与原料同样在23439观测到轻链峰。
(39-6)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析
通过HIC对(39-5)中生成的抗体-肽复合物和原料的抗体进行了分析。柱使用了Protein-Pak Hi Res HIC柱(沃特世公司)4.6×100mm 2.5μm。使用A_Buffer:0.1M PiNa,2.3M(NH4)2SO4,pH7.0、B_Buffer:0.1M PiNa,pH7.0，流速为0.6mL/分钟，梯度设为A 60％B40％→A0％B 100％、16分钟(数据采集20分钟)，柱温为40℃，恒温器温度为40℃，检测器用280nm的波长进行了检测。
对于样品，按照以下的条件进行反应。
a:曲妥珠单抗原料；
b:曲妥珠单抗+肽二硫连接体偶联物-NHS活化体30当量。
保留时间10.8637分钟被认为是在曲妥珠单抗中引入了1个肽的化合物，11.3445分钟被认为是在曲妥珠单抗中引入了2个肽的化合物(图47)。
(39-7)曲妥珠单抗-肽复合物的连接体切割和再氧化
通过实施例3的(3-1)记载的方法进行(39-4)中得到的抗体-肽复合物的连接体切割和再氧化，就可获得对EU numbering中的Lys246及Lys248区域选择性地引入了硫代丙酰基的抗体。
[实施例40：具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物(肽二硫连接体偶联物-NHS活化体)的合成、以及使用该化合物的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的修饰及其分析]
(40-1)IgG1 Fc结合性肽的合成
通过与实施例1(1-1)同样的方法合成了Ac-RGNCAYHKEQLVWCTYH-NH2(SEQ ID NO:43)的肽，并进行纯化，获得了目标物(38.3mg，17.8μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 717.30[M+3H]3+,z＝4 538.30[M+4H]4+
(40-2)Ac-RGNCAYHKEQLVWCTYH-NH2(SEQ ID NO:43)的第4位和第14位的Cys处的分子内二硫键的形成
[化学式122]
Figure BDA0002827785710002031
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:43。
将(40-1)中合成的肽(38.3mg，17.8μmol)溶解于DMSO(5.00mL)，加入2M NH3-MeOH(17.8μL，35.6μmol)、过氧化氢水溶液(36.4μL，356μmol)，在室温下进行20小时搅拌。向反应溶液中加入2M三氟乙酸水溶液停止反应，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽(18.6mg，8.70μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 716.65[M+3H]3+,z＝4 537.80[M+4H]4+
(40-3)二硫连接体与肽的偶联
[化学式123]
Figure BDA0002827785710002041
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:43。
将(40-2)中合成的Ac-RGNCAYHKEQLVWCTYH-NH2(SEQ ID NO:43)(18.6mg，8.70μmol，其中，第4位和第14位的2个半胱氨酸分别在分子内形成二硫键)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(0.50mL)，加入将3,3'-二硫代二丙酸二(N-琥珀酰亚胺酯)(34.0mg，87.0μmol)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(0.50mL)而得的溶液，室温下搅拌24小时。通过减压浓缩而除去乙腈后，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽二硫连接体偶联物-NHS活化体(5.50mg，2.26μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 813.15[M+3H]3+
HPLC纯度:100％
(40-4)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰和基于ESI-TOFMS的分析
将(40-3)中合成的肽二硫连接体偶联物-NHS活化体溶解于N,N'-二甲基甲酰胺成为21.6mM。使500μg的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗(中外制药株式会社)溶解于46.9μL的60mM的乙酸钠缓冲液(pH 4.7)，加入4.7μL的21.6mM的肽试剂(相对于抗体为30当量)，室温下搅拌1小时。将反应液添加至NAP-5柱，使反应停止，置换为20mM的PBS缓冲液。通过ESI-TOFMS测定质量时，引入了1个结合性肽的产物在150535确认到峰，引入了2个结合性肽的产物在152865确认到峰。
(40-5)曲妥珠单抗的特异性修饰体的还原条件下的基于ESI-TOFMS分析的重链选择性的确认
向(40-4)中生成的抗体-肽复合物中加入5μL的7mM的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐溶液(相对于抗体为等量)，室温下搅拌20分钟。通过ESI-TOFMS测定质量时，关于原料的曲妥珠单抗，在50595、50756观测到重链峰，并在23440观测到轻链峰；关于产物，在重链中引入了硫代丙酰基在50685、50844观测到峰，并且与原料同样在23439观测到轻链峰。
(40-6)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析
通过HIC对(40-5)中生成的抗体-肽复合物和原料的抗体进行了分析。柱使用了Protein-Pak Hi Res HIC柱(沃特世公司)4.6×100mm 2.5μm。使用A_Buffer:0.1M PiNa,2.3M(NH4)2SO4,pH7.0、B_Buffer:0.1M PiNa,pH7.0，流速为0.6mL/分钟，梯度设为A 60％B40％→A0％B 100％、16分钟(数据采集20分钟)，柱温为40℃，恒温器温度为40℃，检测器用280nm的波长进行了检测。
对于样品，按照以下的条件进行反应。
a:曲妥珠单抗原料；
b:曲妥珠单抗+肽二硫连接体偶联物-NHS活化体30当量。
保留时间10.4891分钟被认为是在曲妥珠单抗中引入了1个肽的化合物，10.8444分钟被认为是在曲妥珠单抗中引入了2个肽的化合物(图48)。
(40-7)曲妥珠单抗-肽复合物的连接体切割和再氧化
通过实施例3的(3-1)记载的方法进行(40-4)中得到的抗体-肽复合物的连接体切割和再氧化，就可获得对EU numbering中的Lys246及Lys248区域选择性地引入了硫代丙酰基的抗体。
[实施例41：具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物(肽二硫连接体偶联物-NHS活化体)的合成、以及使用该化合物的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的修饰及其分析]
(41-1)IgG1 Fc结合性肽的合成
通过与实施例1(1-1)同样的方法合成了Ac-RGNCAYHKFQLVWCTYH-NH2(SEQ ID NO:44)的肽，并进行纯化，获得了目标物(19.5mg，9.00μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 723.25[M+3H]3+,z＝4 542.90[M+4H]4+
(41-2)Ac-RGNCAYHKFQLVWCTYH-NH2(SEQ ID NO:44)的第4位和第14位的Cys处的分子内二硫键的形成
[化学式124]
Figure BDA0002827785710002061
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:44。
将(41-1)中合成的肽(19.5mg，9.00μmol)溶解于DMSO(5.00mL)，加入2M NH3-MeOH(9.00μL，18.0μmol)、过氧化氢水溶液(18.4μL，180μmol)，在室温下进行20小时搅拌。向反应溶液中加入2M三氟乙酸水溶液停止反应，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽(8.60mg，3.97μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 722.75[M+3H]3+,z＝4 542.30[M+4H]4+
(41-3)二硫连接体与肽的偶联
[化学式125]
Figure BDA0002827785710002062
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:44。
将(41-2)中合成的Ac-RGNCAYHKFQLVWCTYH-NH2(SEQ ID NO:44)(8.60mg，3.97μmol，其中，第4位和第14位的2个半胱氨酸分别在分子内形成二硫键)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(0.50mL)，加入将3,3'-二硫代二丙酸二(N-琥珀酰亚胺酯)(32.0mg，79.4μmol)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(0.50mL)而得的溶液，室温下搅拌24小时。通过减压浓缩而除去乙腈后，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽二硫连接体偶联物-NHS活化体(2.50mg，1.02μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 819.20[M+3H]3+
HPLC纯度:90％
(41-4)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰和基于ESI-TOFMS的分析
将(41-3)中合成的肽二硫连接体偶联物-NHS活化体溶解于N,N'-二甲基甲酰胺成为21.6mM。使500μg的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗(中外制药株式会社)溶解于46.9μL的60mM的乙酸钠缓冲液(pH 4.7)，加入4.7μL的21.6mM的肽试剂(相对于抗体为30当量)，室温下搅拌1小时。将反应液添加至NAP-5柱，使反应停止，置换为20mM的PBS缓冲液。通过ESI-TOFMS测定质量时，引入了1个结合性肽的产物在150972确认到峰，引入了2个结合性肽的产物在153454确认到峰。
(41-5)曲妥珠单抗的特异性修饰体的还原条件下的基于ESI-TOFMS分析的重链选择性的确认
向(41-4)中生成的抗体-肽复合物中加入5μL的7mM的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐溶液(相对于抗体为等量)，室温下搅拌20分钟。通过ESI-TOFMS测定质量时，关于原料的曲妥珠单抗，在50595、50756观测到重链峰，并在23440观测到轻链峰；关于产物，在重链中引入了硫代丙酰基在50685、50844观测到峰，并且与原料同样在23439观测到轻链峰。
(41-6)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析
通过HIC对(41-5)中生成的抗体-肽复合物和原料的抗体进行了分析。柱使用了Protein-Pak Hi Res HIC柱(沃特世公司)4.6×100mm 2.5μm。使用A_Buffer:0.1M PiNa,2.3M(NH4)2SO4,pH7.0、B_Buffer:0.1M PiNa,pH7.0，流速为0.6mL/分钟，梯度设为A 60％B40％→A0％B 100％、16分钟(数据采集20分钟)，柱温为40℃，恒温器温度为40℃，检测器用280nm的波长进行了检测。
对于样品，按照以下的条件进行反应。
a:曲妥珠单抗原料；
b:曲妥珠单抗+肽二硫连接体偶联物-NHS活化体30当量。
保留时间11.6662分钟被认为是在曲妥珠单抗中引入了1个肽的化合物，13.0537分钟被认为是在曲妥珠单抗中引入了2个肽的化合物(图49)。
(41-7)曲妥珠单抗-肽复合物的连接体切割和再氧化
通过实施例3的(3-1)记载的方法进行(41-4)中得到的抗体-肽复合物的连接体切割和再氧化，就可获得对EU numbering中的Lys246及Lys248区域选择性地引入了硫代丙酰基的抗体。
[实施例42：具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物(肽二硫连接体偶联物-NHS活化体)的合成、以及使用该化合物的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的修饰及其分析]
(42-1)IgG1 Fc结合性肽的合成
通过与实施例1(1-1)同样的方法合成了Ac-RGNCAYHKRQLVWCTYH-NH2(SEQ ID NO:45)的肽，并进行纯化，获得了目标物(46.2mg，21.2μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 726.30[M+3H]3+,z＝4 545.10[M+4H]4+
(42-2)Ac-RGNCAYHKRQLVWCTYH-NH2(SEQ ID NO:45)的第4位和第14位的Cys处的分子内二硫键的形成
[化学式126]
Figure BDA0002827785710002081
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:45。
将(42-1)中合成的肽(46.2mg，21.2μmol)溶解于DMSO(5.00mL)，加入2M NH3-MeOH(21.2μL，42.4μmol)、过氧化氢水溶液(43.4μL，424μmol)，在室温下进行20小时搅拌。向反应溶液中加入2M三氟乙酸水溶液停止反应，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽(29.6mg，13.6μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 725.10[M+3H]3+,z＝4 544.65[M+4H]4+
(42-3)二硫连接体与肽的偶联
[化学式127]
Figure BDA0002827785710002091
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:45。
将(42-2)中合成的Ac-RGNCAYHKRQLVWCTYH-NH2(SEQ ID NO:45)(29.6mg，13.6μmol，其中，第4位和第14位的2个半胱氨酸分别在分子内形成二硫键)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(0.50mL)，加入将3,3'-二硫代二丙酸二(N-琥珀酰亚胺酯)(55.0mg，136μmol)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(0.50mL)而得的溶液，室温下搅拌24小时。通过减压浓缩而除去乙腈后，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽二硫连接体偶联物-NHS活化体(6.00mg，2.44μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝4 616.85[M+4H]4+
HPLC纯度:100％
(42-4)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰和基于ESI-TOFMS的分析
将(42-3)中合成的肽二硫连接体偶联物-NHS活化体溶解于N,N'-二甲基甲酰胺成为21.6mM。使500μg的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗(中外制药株式会社)溶解于46.9μL的60mM的乙酸钠缓冲液(pH 4.7)，加入4.7μL的21.6mM的肽试剂(相对于抗体为30当量)，室温下搅拌1小时。将反应液添加至NAP-5柱，使反应停止，置换为20mM的PBS缓冲液。通过ESI-TOFMS测定质量时，引入了1个结合性肽的产物在150577确认到峰，引入了2个结合性肽的产物在152923确认到峰。
(42-5)曲妥珠单抗的特异性修饰体的还原条件下的基于ESI-TOFMS分析的重链选择性的确认
向(42-4)中生成的抗体-肽复合物中加入5μL的7mM的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐溶液(相对于抗体为等量)，室温下搅拌20分钟。通过ESI-TOFMS测定质量时，关于原料的曲妥珠单抗，在50595、50756观测到重链峰，并在23440观测到轻链峰；关于产物，在重链中引入了硫代丙酰基在50685、50844观测到峰，并且与原料同样在23439观测到轻链峰。
(42-6)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析
通过HIC对(42-5)中生成的抗体-肽复合物和原料的抗体进行了分析。柱使用了Protein-Pak Hi Res HIC柱(沃特世公司)4.6×100mm 2.5μm。使用A_Buffer:0.1M PiNa,2.3M(NH4)2SO4,pH7.0、B_Buffer:0.1M PiNa,pH7.0，流速为0.6mL/分钟，梯度设为A 60％B40％→A0％B 100％、16分钟(数据采集20分钟)，柱温为40℃，恒温器温度为40℃，检测器用280nm的波长进行了检测。
对于样品，按照以下的条件进行反应。
a:曲妥珠单抗原料；
b:曲妥珠单抗+肽二硫连接体偶联物-NHS活化体30当量。
保留时间10.6918分钟被认为是在曲妥珠单抗中引入了2个肽的化合物(图50)。
(42-7)曲妥珠单抗-肽复合物的连接体切割和再氧化
通过实施例3的(3-1)记载的方法进行(42-4)中得到的抗体-肽复合物的连接体切割和再氧化，就可获得对EU numbering中的Lys246及Lys248区域选择性地引入了硫代丙酰基的抗体。
[实施例43：具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物(肽二硫连接体偶联物-NHS活化体)的合成、以及使用该化合物的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的修饰及其分析]
(43-1)IgG1 Fc结合性肽的合成
通过与实施例1(1-1)同样的方法合成了Ac-RGNCAYHKHQLVWCTYH-NH2(SEQ ID NO:46)的肽，并进行纯化，获得了目标物(44.3mg，20.5μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 720.05[M+3H]3+,z＝4 540.30[M+4H]4+
(43-2)Ac-RGNCAYHKHQLVWCTYH-NH2(SEQ ID NO:46)的第4位和第14位的Cys处的分子内二硫键的形成
[化学式128]
Figure BDA0002827785710002111
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:46。
将(43-1)中合成的肽(44.3mg，20.5μmol)溶解于DMSO(5.00mL)，加入2M NH3-MeOH(20.5μL，41.0μmol)、过氧化氢水溶液(41.9μL，410μmol)，在室温下进行20小时搅拌。向反应溶液中加入2M三氟乙酸水溶液停止反应，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽(26.0mg，12.0μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 719.60[M+3H]3+,z＝4 540.10[M+4H]4+
(43-3)二硫连接体与肽的偶联
[化学式129]
Figure BDA0002827785710002112
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:46。
将(43-2)中合成的Ac-RGNCAYHKHQLVWCTYH-NH2(SEQ ID NO:46)(26.0mg，12.0μmol，其中，第4位和第14位的2个半胱氨酸分别在分子内形成二硫键)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(0.50mL)，加入将3,3'-二硫代二丙酸二(N-琥珀酰亚胺酯)(49.0mg，120μmol)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(0.50mL)而得的溶液，室温下搅拌24小时。通过减压浓缩而除去乙腈后，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽二硫连接体偶联物-NHS活化体(5.00mg，2.05μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝4 612.15[M+4H]4+
HPLC纯度:69％
(43-4)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰和基于ESI-TOFMS的分析
将(43-3)中合成的肽二硫连接体偶联物-NHS活化体溶解于N,N'-二甲基甲酰胺成为21.6mM。使500μg的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗(中外制药株式会社)溶解于46.9μL的60mM的乙酸钠缓冲液(pH 4.7)，加入4.7μL的21.6mM的肽试剂(相对于抗体为30当量)，室温下搅拌1小时。将反应液添加至NAP-5柱，使反应停止，置换为20mM的PBS缓冲液。通过ESI-TOFMS测定质量时，引入了1个结合性肽的产物在150549确认到峰，引入了2个结合性肽的产物在152879确认到峰。
(43-5)曲妥珠单抗的特异性修饰体的还原条件下的基于ESI-TOFMS分析的重链选择性的确认
向(43-4)中生成的抗体-肽复合物中加入5μL的7mM的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐溶液(相对于抗体为等量)，室温下搅拌20分钟。通过ESI-TOFMS测定质量时，关于原料的曲妥珠单抗，在50595、50756观测到重链峰，并在23440观测到轻链峰；关于产物，在重链中引入了硫代丙酰基在50685、50844观测到峰，并且与原料同样在23439观测到轻链峰。
(43-6)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析
通过HIC对(43-5)中生成的抗体-肽复合物和原料的抗体进行了分析。柱使用了Protein-Pak Hi Res HIC柱(沃特世公司)4.6×100mm 2.5μm。使用A_Buffer:0.1M PiNa,2.3M(NH4)2SO4,pH7.0、B_Buffer:0.1M PiNa,pH7.0，流速为0.6mL/分钟，梯度设为A 60％B40％→A0％B 100％、16分钟(数据采集20分钟)，柱温为40℃，恒温器温度为40℃，检测器用280nm的波长进行了检测。
对于样品，按照以下的条件进行反应。
a:曲妥珠单抗原料；
b:曲妥珠单抗+肽二硫连接体偶联物-NHS活化体30当量。
保留时间10.8257分钟被认为是在曲妥珠单抗中引入了1个肽的化合物，11.4630分钟被认为是在曲妥珠单抗中引入了2个肽的化合物(图51)。
(43-7)曲妥珠单抗-肽复合物的连接体切割和再氧化
通过实施例3的(3-1)记载的方法进行(43-4)中得到的抗体-肽复合物的连接体切割和再氧化，就可获得对EU numbering中的Lys246及Lys248区域选择性地引入了硫代丙酰基的抗体。
[实施例44：具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物(肽二硫连接体偶联物-NHS活化体)的合成、以及使用该化合物的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的修饰及其分析]
(44-1)IgG1 Fc结合性肽的合成
通过与实施例1(1-1)同样的方法合成了Ac-RGNCAYHKWQLVWCTYH-NH2(SEQ ID NO:47)的肽，并进行纯化，获得了目标物(29.0mg，13.1μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 736.25[M+3H]3+,z＝4 552.65[M+4H]4+
(44-2)Ac-RGNCAYHKWQLVWCTYH-NH2(SEQ ID NO:47)的第4位和第14位的Cys处的分子内二硫键的形成
[化学式130]
Figure BDA0002827785710002131
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:47。
将(44-1)中合成的肽(29.0mg，13.1μmol)溶解于DMSO(5.00mL)，加入2M NH3-MeOH(13.1μL，26.2μmol)、过氧化氢水溶液(26.8μL，262μmol)，在室温下进行20小时搅拌。向反应溶液中加入2M三氟乙酸水溶液停止反应，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽(11.5mg，5.22μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 735.80[M+3H]3+,z＝4 552.10[M+4H]4+
(44-3)二硫连接体与肽的偶联
[化学式131]
Figure BDA0002827785710002141
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:47。
将(44-2)中合成的Ac-RGNCAYHKWQLVWCTYH-NH2(SEQ ID NO:47)(11.5mg，5.22μmol，其中，第4位和第14位的2个半胱氨酸分别在分子内形成二硫键)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(0.40mL)，加入将3,3'-二硫代二丙酸二(N-琥珀酰亚胺酯)(21.0mg，52.0μmol)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(0.40mL)而得的溶液，室温下搅拌24小时。通过减压浓缩而除去乙腈后，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽二硫连接体偶联物-NHS活化体(3.00mg，1.20μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 832.05[M+3H]3+
HPLC纯度:93％
(44-4)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰和基于ESI-TOFMS的分析
将(44-3)中合成的肽二硫连接体偶联物-NHS活化体溶解于N,N'-二甲基甲酰胺成为21.6mM。使500μg的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗(中外制药株式会社)溶解于46.9μL的60mM的乙酸钠缓冲液(pH 4.7)，加入4.7μL的21.6mM的肽试剂(相对于抗体为30当量)，室温下搅拌1小时。将反应液添加至NAP-5柱，使反应停止，置换为20mM的PBS缓冲液。通过ESI-TOFMS测定质量时，引入了1个结合性肽的产物在15.0595确认到峰，引入了2个结合性肽的产物在15.3133确认到峰。
(44-5)曲妥珠单抗的特异性修饰体的还原条件下的基于ESI-TOFMS分析的重链选择性的确认
向(44-4)中生成的抗体-肽复合物中加入5μL的7mM的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐溶液(相对于抗体为等量)，室温下搅拌20分钟。通过ESI-TOFMS测定质量时，关于原料的曲妥珠单抗，在50595、50756观测到重链峰，并在23440观测到轻链峰；关于产物，在重链中引入了硫代丙酰基在50685、50844观测到峰，并且与原料同样在23439观测到轻链峰。
(44-6)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析
通过HIC对(44-5)中生成的抗体-肽复合物和原料的抗体进行了分析。柱使用了Protein-Pak Hi Res HIC柱(沃特世公司)4.6×100mm 2.5μm。使用A_Buffer:0.1M PiNa,2.3M(NH4)2SO4,pH7.0、B_Buffer:0.1M PiNa,pH7.0，流速为0.6mL/分钟，梯度设为A 60％B40％→A0％B 100％、16分钟(数据采集20分钟)，柱温为40℃，恒温器温度为40℃，检测器用280nm的波长进行了检测。
对于样品，按照以下的条件进行反应。
a:曲妥珠单抗原料；
b:曲妥珠单抗+肽二硫连接体偶联物-NHS活化体30当量。
保留时间12.3049分钟被认为是在曲妥珠单抗中引入了1个肽的化合物，14.1365分钟被认为是在曲妥珠单抗中引入了2个肽的化合物(图52)。
(44-7)曲妥珠单抗-肽复合物的连接体切割和再氧化
通过实施例3的(3-1)记载的方法进行(44-4)中得到的抗体-肽复合物的连接体切割和再氧化，就可获得对EU numbering中的Lys246及Lys248区域选择性地引入了硫代丙酰基的抗体。
[实施例45：具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物(肽二硫连接体偶联物-NHS活化体)的合成、以及使用该化合物的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的修饰及其分析]
(45-1)IgG1 Fc结合性肽的合成
通过与实施例1(1-1)同样的方法合成了Ac-RGNCAYHKYQLVWCTYH-NH2(SEQ ID NO:48)的肽，并进行纯化，获得了目标物(25.5mg，11.7μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 728.65[M+3H]3+,z＝4 546.85[M+4H]4+
(45-2)Ac-RGNCAYHKYQLVWCTYH-NH2(SEQ ID NO:48)的第4位和第14位的Cys处的分子内二硫键的形成
[化学式132]
Figure BDA0002827785710002161
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:48。
将(45-1)中合成的肽(25.5mg，11.7μmol)溶解于DMSO(5.00mL)，加入2M NH3-MeOH(11.7μL，23.4μmol)、过氧化氢水溶液(23.9μL，234μmol)，在室温下进行20小时搅拌。向反应溶液中加入2M三氟乙酸水溶液停止反应，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽(13.0mg，6.0μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 728.05[M+3H]3+,z＝4 546.35[M+4H]4+
(45-3)二硫连接体与肽的偶联
[化学式133]
Figure BDA0002827785710002162
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:48。
将(45-2)中合成的Ac-RGNCAYHKYQLVWCTYH-NH2(SEQ ID NO:48)(13.0mg，6.00μmol，其中，第4位和第14位的2个半胱氨酸分别在分子内形成二硫键)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(0.40mL)，加入将3,3'-二硫代二丙酸二(N-琥珀酰亚胺酯)(24.0mg，60.0μmol)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(0.40mL)而得的溶液，室温下搅拌24小时。通过减压浓缩而除去乙腈后，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽二硫连接体偶联物-NHS活化体(3.80mg，1.54μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 824.50[M+3H]3+
HPLC纯度:100％
(45-4)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰和基于ESI-TOFMS的分析
将(45-3)中合成的肽二硫连接体偶联物-NHS活化体溶解于N,N'-二甲基甲酰胺成为21.6mM。使500μg的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗(中外制药株式会社)溶解于46.9μL的60mM的乙酸钠缓冲液(pH 4.7)，加入4.7μL的21.6mM的肽试剂(相对于抗体为30当量)，室温下搅拌1小时。将反应液添加至NAP-5柱，使反应停止，置换为20mM的PBS缓冲液。通过ESI-TOFMS测定质量时，引入了1个结合性肽的产物在150569确认到峰，引入了2个结合性肽的产物在153086确认到峰。
(45-5)曲妥珠单抗的特异性修饰体的还原条件下的基于ESI-TOFMS分析的重链选择性的确认
向(45-4)中生成的抗体-肽复合物中加入5μL的7mM的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐溶液(相对于抗体为等量)，室温下搅拌20分钟。通过ESI-TOFMS测定质量时，关于原料的曲妥珠单抗，在50595、50756观测到重链峰，并在23440观测到轻链峰；关于产物，在重链中引入了硫代丙酰基在50685、50844观测到峰，并且与原料同样在23439观测到轻链峰。
(45-6)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析
通过HIC对(45-5)中生成的抗体-肽复合物和原料的抗体进行了分析。柱使用了Protein-Pak Hi Res HIC柱(沃特世公司)4.6×100mm 2.5μm。使用A_Buffer:0.1M PiNa,2.3M(NH4)2SO4,pH7.0、B_Buffer:0.1M PiNa,pH7.0，流速为0.6mL/分钟，梯度设为A 60％B40％→A0％B 100％、16分钟(数据采集20分钟)，柱温为40℃，恒温器温度为40℃，检测器用280nm的波长进行了检测。
对于样品，按照以下的条件进行反应。
a:曲妥珠单抗原料；
b:曲妥珠单抗+肽二硫连接体偶联物-NHS活化体30当量。
保留时间11.5483分钟被认为是在曲妥珠单抗中引入了1个肽的化合物，12.8948分钟被认为是在曲妥珠单抗中引入了2个肽的化合物(图53)。
(45-7)曲妥珠单抗-肽复合物的连接体切割和再氧化
通过实施例3的(3-1)记载的方法进行(45-4)中得到的抗体-肽复合物的连接体切割和再氧化，就可获得对EU numbering中的Lys246及Lys248区域选择性地引入了硫代丙酰基的抗体。
[实施例46：具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物(肽二硫连接体偶联物-NHS活化体)的合成、以及使用该化合物的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的修饰及其分析]
(46-1)IgG1 Fc结合性肽的合成
通过与实施例1(1-1)同样的方法合成了Ac-RGNCAYFKGQLVWCTYH-NH2(SEQ ID NO:49)的肽，并进行纯化，获得了目标物(19.5mg，9.35μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 696.70[M+3H]3+
(46-2)Ac-RGNCAYFKGQLVWCTYH-NH2(SEQ ID NO:49)的第4位和第14位的Cys处的分子内二硫键的形成
[化学式134]
Figure BDA0002827785710002181
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:49。
将(46-1)中合成的肽(19.5mg，9.35μmol)溶解于DMSO(5.00mL)，加入2M NH3-MeOH(9.35μL，18.7μmol)、过氧化氢水溶液(19.1μL，187μmol)，在室温下进行20小时搅拌。向反应溶液中加入2M三氟乙酸水溶液停止反应，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽(9.20mg，4.41μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 696.05[M+3H]3+
(46-3)二硫连接体与肽的偶联
[化学式135]
Figure BDA0002827785710002191
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:49。
将(46-2)中合成的Ac-RGNCAYFKGQLVWCTYH-NH2(SEQ ID NO:49)(9.20mg，4.41μmol，其中，第4位和第14位的2个半胱氨酸分别在分子内形成二硫键)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(0.40mL)，加入将3,3'-二硫代二丙酸二(N-琥珀酰亚胺酯)(71.4mg，176μmol)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(0.40mL)而得的溶液，室温下搅拌24小时。通过减压浓缩而除去乙腈后，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽二硫连接体偶联物-NHS活化体(1.50mg，0.63μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 792.40[M+3H]3+
HPLC纯度:75％
(46-4)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰和基于ESI-TOFMS的分析
将(46-3)中合成的肽二硫连接体偶联物-NHS活化体溶解于N,N'-二甲基甲酰胺成为21.6mM。使500μg的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗(中外制药株式会社)溶解于46.9μL的60mM的乙酸钠缓冲液(pH 4.7)，加入4.7μL的21.6mM的肽试剂(相对于抗体为30当量)，室温下搅拌1小时。将反应液添加至NAP-5柱，使反应停止，置换为20mM的PBS缓冲液。通过ESI-TOFMS测定质量时，引入了1个结合性肽的产物在150661确认到峰，引入了2个结合性肽的产物在153059确认到峰。
(46-5)曲妥珠单抗的特异性修饰体的还原条件下的基于ESI-TOFMS分析的重链选择性的确认
向(46-4)中生成的抗体-肽复合物中加入5μL的7mM的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐溶液(相对于抗体为等量)，室温下搅拌20分钟。通过ESI-TOFMS测定质量时，关于原料的曲妥珠单抗，在50595、50756观测到重链峰，并在23440观测到轻链峰；关于产物，在重链中引入了硫代丙酰基在50685、50844观测到峰，并且与原料同样在23439观测到轻链峰。
(46-6)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析
通过HIC对(46-5)中生成的抗体-肽复合物和原料的抗体进行了分析。柱使用了Protein-Pak Hi Res HIC柱(沃特世公司)4.6×100mm 2.5μm。使用A_Buffer:0.1M PiNa,2.3M(NH4)2SO4,pH7.0、B_Buffer:0.1M PiNa,pH7.0，流速为0.6mL/分钟，梯度设为A 60％B40％→A0％B 100％、16分钟(数据采集20分钟)，柱温为40℃，恒温器温度为40℃，检测器用280nm的波长进行了检测。
对于样品，按照以下的条件进行反应。
a:曲妥珠单抗原料；
b:曲妥珠单抗+肽二硫连接体偶联物-NHS活化体30当量。
保留时间10.7238分钟被认为是曲妥珠单抗原料，11.4697分钟被认为是在曲妥珠单抗中引入了1个肽的化合物，12.0713分钟被认为是引入了2个肽的化合物(图54)。
(46-7)曲妥珠单抗-肽复合物的连接体切割和再氧化
通过实施例3的(3-1)记载的方法进行(46-4)中得到的抗体-肽复合物的连接体切割和再氧化，就可获得对EU numbering中的Lys246及Lys248区域选择性地引入了硫代丙酰基的抗体。
[实施例47：具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物(肽二硫连接体偶联物-NHS活化体)的合成、以及使用该化合物的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的修饰及其分析]
(47-1)IgG1 Fc结合性肽的合成
通过与实施例1(1-1)同样的方法合成了Ac-RGNCAYYKGQLVWCTYH-NH2(SEQ ID NO:50)的肽，并进行纯化，获得了目标物(29.6mg，14.1μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 702.05[M+3H]3+
(47-2)Ac-RGNCAYYKGQLVWCTYH-NH2(SEQ ID NO:50)的第4位和第14位的Cys处的分子内二硫键的形成
[化学式136]
Figure BDA0002827785710002211
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:50。
将(47-1)中合成的肽(29.6mg，14.1μmol)溶解于DMSO(5.00mL)，加入2M NH3-MeOH(14.1μL，28.2μmol)、过氧化氢水溶液(28.8μL，282μmol)，在室温下进行20小时搅拌。向反应溶液中加入2M三氟乙酸水溶液停止反应，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而仅除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽(12.1mg，5.76μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 701.40[M+3H]3+
(47-3)二硫连接体与肽的偶联
[化学式137]
Figure BDA0002827785710002212
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:50。
将(47-2)中合成的Ac-RGNCAYYKGQLVWCTYH-NH2(SEQ ID NO:50)(12.1mg，5.76μmol，其中，第4位和第14位的2个半胱氨酸分别在分子内形成二硫键)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(0.40mL)，加入将3,3'-二硫代二丙酸二(N-琥珀酰亚胺酯)(70.0mg，173μmol)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(0.40mL)而得的溶液，室温下搅拌24小时。通过减压浓缩而除去乙腈后，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽二硫连接体偶联物-NHS活化体(2.70mg，1.13μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 797.65[M+3H]3+
HPLC纯度:77％
(47-4)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰和基于ESI-TOFMS的分析
将(47-3)中合成的肽二硫连接体偶联物-NHS活化体溶解于N,N'-二甲基甲酰胺成为21.6mM。使500μg的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗(中外制药株式会社)溶解于46.9μL的60mM的乙酸钠缓冲液(pH 4.7)，加入4.7μL的21.6mM的肽试剂(相对于抗体为30当量)，室温下搅拌1小时。将反应液添加至NAP-5柱，使反应停止，置换为20mM的PBS缓冲液。通过ESI-TOFMS测定质量时，引入了1个结合性肽的产物在150497确认到峰，引入了2个结合性肽的产物在152779确认到峰。
(47-5)曲妥珠单抗的特异性修饰体的还原条件下的基于ESI-TOFMS分析的重链选择性的确认
向(47-4)中生成的抗体-肽复合物中加入5μL的7mM的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐溶液(相对于抗体为等量)，室温下搅拌20分钟。通过ESI-TOFMS测定质量时，关于原料的曲妥珠单抗，在50595、50756观测到重链峰，并在23440观测到轻链峰；关于产物，在重链中引入了硫代丙酰基在50685、50844观测到峰，并且与原料同样在23439观测到轻链峰。
(47-6)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析
通过HIC对(47-5)中生成的抗体-肽复合物和原料的抗体进行了分析。柱使用了Protein-Pak Hi Res HIC柱(沃特世公司)4.6×100mm 2.5μm。使用A_Buffer:0.1M PiNa,2.3M(NH4)2SO4,pH7.0、B_Buffer:0.1M PiNa,pH7.0，流速为0.6mL/分钟，梯度设为A 60％B40％→A0％B 100％、16分钟(数据采集20分钟)，柱温为40℃，恒温器温度为40℃，检测器用280nm的波长进行了检测。
对于样品，按照以下的条件进行反应。
a:曲妥珠单抗原料；
b:曲妥珠单抗+肽二硫连接体偶联物-NHS活化体30当量。
保留时间10.6845分钟被认为是曲妥珠单抗原料，11.2951分钟被认为是在曲妥珠单抗中引入了1个肽的化合物，12.1562分钟被认为是引入了2个肽的化合物(图55)。
(47-7)曲妥珠单抗-肽复合物的连接体切割和再氧化
通过实施例3的(3-1)记载的方法进行(47-4)中得到的抗体-肽复合物的连接体切割和再氧化，就可获得对EU numbering中的Lys246及Lys248区域选择性地引入了硫代丙酰基的抗体。
[实施例48：具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物(肽二硫连接体偶联物-NHS活化体)的合成、以及使用该化合物的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的修饰及其分析]
(48-1)IgG1 Fc结合性肽的合成
通过与实施例1(1-1)同样的方法合成了Ac-RGNCAYWKGQLVWCTYH-NH2(SEQ ID NO:51)的肽，并进行纯化，获得了目标物(36.5mg，17.2μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 709.65[M+3H]3+
(48-2)Ac-RGNCAYWKGQLVWCTYH-NH2(SEQ ID NO:51)的第4位和第14位的Cys处的分子内二硫键的形成
[化学式138]
Figure BDA0002827785710002231
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:51。
将(48-1)中合成的肽(36.5mg，17.2μmol)溶解于DMSO(5.00mL)，加入2M NH3-MeOH(17.2μL，34.4μmol)、过氧化氢水溶液(35.1μL，344μmol)，在室温下进行20小时搅拌。向反应溶液中加入2M三氟乙酸水溶液停止反应，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽(15.9mg，7.48μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 805.60[M+3H]3+
(48-3)二硫连接体与肽的偶联
[化学式139]
Figure BDA0002827785710002241
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:51。
将(48-2)中合成的Ac-RGNCAYWKGQLVWCTYH-NH2(SEQ ID NO:51)(15.9mg，7.48μmol，其中，第4位和第14位的2个半胱氨酸分别在分子内形成二硫键)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(0.30mL)，加入将3,3'-二硫代二丙酸二(N-琥珀酰亚胺酯)(60.7mg，150μmol)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(0.60mL)而得的溶液，室温下搅拌24小时。通过减压浓缩而除去乙腈后，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽二硫连接体偶联物-NHS活化体(6.0mg，2.49μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 795.35[M+3H]3+
HPLC纯度:97％
(48-4)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰和基于ESI-TOFMS的分析
将(48-3)中合成的肽二硫连接体偶联物-NHS活化体溶解于N,N'-二甲基甲酰胺成为21.6mM。使500μg的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗(中外制药株式会社)溶解于46.9μL的60mM的乙酸钠缓冲液(pH 4.7)，加入4.7μL的21.6mM的肽试剂(相对于抗体为30当量)，室温下搅拌1小时。将反应液添加至NAP-5柱，使反应停止，置换为20mM的PBS缓冲液。通过ESI-TOFMS测定质量时，引入了1个结合性肽的产物在150529确认到峰，引入了2个结合性肽的产物在152819确认到峰。
(48-5)曲妥珠单抗的特异性修饰体的还原条件下的基于ESI-TOFMS分析的重链选择性的确认
向(48-4)中生成的抗体-肽复合物中加入5μL的7mM的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐溶液(相对于抗体为等量)，室温下搅拌20分钟。通过ESI-TOFMS测定质量时，关于原料的曲妥珠单抗，在50595、50756观测到重链峰，并在23440观测到轻链峰；关于产物，在重链中引入了硫代丙酰基在50685、50844观测到峰，并且与原料同样在23439观测到轻链峰。
(48-6)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析
通过HIC对(48-5)中生成的抗体-肽复合物和原料的抗体进行了分析。柱使用了Protein-Pak Hi Res HIC柱(沃特世公司)4.6×100mm 2.5μm。使用A_Buffer:0.1M PiNa,2.3M(NH4)2SO4,pH7.0、B_Buffer:0.1M PiNa,pH7.0，流速为0.6mL/分钟，梯度设为A 60％B40％→A0％B 100％、16分钟(数据采集20分钟)，柱温为40℃，恒温器温度为40℃，检测器用280nm的波长进行了检测。
对于样品，按照以下的条件进行反应。
a:曲妥珠单抗原料；
b:曲妥珠单抗+肽二硫连接体偶联物-NHS活化体30当量。
保留时间11.6714分钟被认为是在曲妥珠单抗中引入了1个肽的化合物，12.3776分钟被认为是引入了2个肽的化合物(图56)。
(48-7)曲妥珠单抗-肽复合物的连接体切割和再氧化
通过实施例3的(3-1)记载的方法进行(48-4)中得到的抗体-肽复合物的连接体切割和再氧化，就可获得对EU numbering中的Lys246及Lys248区域选择性地引入了硫代丙酰基的抗体。
[实施例49：具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物(肽二硫连接体偶联物-NHS活化体)的合成、以及使用该化合物的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的修饰及其分析]
(49-1)IgG1 Fc结合性肽的合成
通过与实施例1(1-1)同样的方法合成了Ac-RGNCAYRKGQLVWCTYH-NH2(SEQ ID NO:52)的肽，并进行纯化，获得了目标物(46.6mg，22.2μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 699.65[M+3H]3+,z＝4 525.15[M+4H]4+
(49-2)Ac-RGNCAYRKGQLVWCTYH-NH2(SEQ ID NO:52)的第4位和第14位的Cys处的分子内二硫键的形成
[化学式140]
Figure BDA0002827785710002261
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:52。
将(49-1)中合成的肽(46.6mg，22.2μmol)溶解于DMSO(5.00mL)，加入2M NH3-MeOH(22.2μL，44.4μmol)、过氧化氢水溶液(45.4μL，444μmol)，在室温下进行20小时搅拌。向反应溶液中加入2M三氟乙酸水溶液停止反应，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽(32.2mg，15.4μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 699.00[M+3H]3+,z＝4 524.50[M+4H]4+
(49-3)二硫连接体与肽的偶联
[化学式141]
Figure BDA0002827785710002262
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:52。
将(49-2)中合成的Ac-RGNCAYRKGQLVWCTYH-NH2(SEQ ID NO:52)(32.2mg，15.4μmol，其中，第4位和第14位的2个半胱氨酸分别在分子内形成二硫键)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(0.30mL)，加入将3,3'-二硫代二丙酸二(N-琥珀酰亚胺酯)(125mg，308μmol)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(0.60mL)而得的溶液，室温下搅拌24小时。通过减压浓缩而除去乙腈后，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽二硫连接体偶联物-NHS活化体(10.2mg，4.28μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 795.35[M+3H]3+
HPLC纯度:97％
(49-4)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰和基于ESI-TOFMS的分析
将(49-3)中合成的肽二硫连接体偶联物-NHS活化体溶解于N,N'-二甲基甲酰胺成为21.6mM。使500μg的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗(中外制药株式会社)溶解于46.9μL的60mM的乙酸钠缓冲液(pH 4.7)，加入4.7μL的21.6mM的肽试剂(相对于抗体为30当量)，室温下搅拌1小时。将反应液添加至NAP-5柱，使反应停止，置换为20mM的PBS缓冲液。通过ESI-TOFMS测定质量时，原料的曲妥珠单抗在148222观测到峰，引入了1个结合性肽的产物在150492确认到峰，引入了2个结合性肽的产物在152761确认到峰。
(49-5)曲妥珠单抗的特异性修饰体的还原条件下的基于ESI-TOFMS分析的重链选择性的确认
向(49-4)中生成的抗体-肽复合物中加入5μL的7mM的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐溶液(相对于抗体为等量)，室温下搅拌20分钟。通过ESI-TOFMS测定质量时，关于原料的曲妥珠单抗，在50595、50756观测到重链峰，并在23440观测到轻链峰；关于产物，在重链中引入了硫代丙酰基在50685、50844观测到峰，并且与原料同样在23439观测到轻链峰。
(49-6)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析
通过HIC对(49-5)中生成的抗体-肽复合物和原料的抗体进行了分析。柱使用了Protein-Pak Hi Res HIC柱(沃特世公司)4.6×100mm 2.5μm。使用A_Buffer:0.1M PiNa,2.3M(NH4)2SO4,pH7.0、B_Buffer:0.1M PiNa,pH7.0，流速为0.6mL/分钟，梯度设为A 60％B40％→A0％B 100％、16分钟(数据采集20分钟)，柱温为40℃，恒温器温度为40℃，检测器用280nm的波长进行了检测。
对于样品，按照以下的条件进行反应。
a:曲妥珠单抗原料；
b:曲妥珠单抗+肽二硫连接体偶联物-NHS活化体30当量。
保留时间10.7246分钟被认为是曲妥珠单抗原料，11.4944分钟被认为是在曲妥珠单抗中引入了1个肽的化合物，12.1645分钟被认为是引入了2个肽的化合物(图57)。
(49-7)曲妥珠单抗-肽复合物的连接体切割和再氧化
通过实施例3的(3-1)记载的方法进行(49-4)中得到的抗体-肽复合物的连接体切割和再氧化，就可获得对EU numbering中的Lys246及Lys248区域选择性地引入了硫代丙酰基的抗体。
[实施例50：具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物(肽二硫连接体偶联物-NHS活化体)的合成、以及使用该化合物的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的修饰及其分析]
(50-1)IgG1 Fc结合性肽的合成
通过与实施例1(1-1)同样的方法合成了Ac-RGNCAYGKGQLVWCTYH-NH2(SEQ ID NO:53)的肽，并进行纯化，获得了目标物(31.9mg，16.0μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 666.70[M+3H]3+
(50-2)Ac-RGNCAYGKGQLVWCTYH-NH2(SEQ ID NO:53)的第4位和第14位的Cys处的分子内二硫键的形成
[化学式142]
Figure BDA0002827785710002281
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:53。
将(50-1)中合成的肽(31.9mg，16.0μmol)溶解于DMSO(5.00mL)，加入2M NH3-MeOH(16.0μL，32.0μmol)、过氧化氢水溶液(32.7μL，320μmol)，在室温下进行20小时搅拌。向反应溶液中加入2M三氟乙酸水溶液停止反应，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽(17.4mg，8.72μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 665.95[M+3H]3+
(50-3)二硫连接体与肽的偶联
[化学式143]
Figure BDA0002827785710002291
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:53。
将(50-2)中合成的Ac-RGNCAYGKGQLVWCTYH-NH2(SEQ ID NO:53)(17.4mg，8.72μmol，其中，第4位和第14位的2个半胱氨酸分别在分子内形成二硫键)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(0.30mL)，加入将3,3'-二硫代二丙酸二(N-琥珀酰亚胺酯)(70.3mg，174μmol)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(0.60mL)而得的溶液，室温下搅拌24小时。通过减压浓缩而除去乙腈后，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽二硫连接体偶联物-NHS活化体(4.70mg，2.06μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 762.30[M+3H]3+
HPLC纯度:94％
(50-4)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰和基于ESI-TOFMS的分析
将(50-3)中合成的肽二硫连接体偶联物-NHS活化体溶解于N,N'-二甲基甲酰胺成为21.6mM。使500μg的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗(中外制药株式会社)溶解于46.9μL的60mM的乙酸钠缓冲液(pH 4.7)，加入4.7μL的21.6mM的肽试剂(相对于抗体为30当量)，室温下搅拌1小时。将反应液添加至NAP-5柱，使反应停止，置换为20mM的PBS缓冲液。通过ESI-TOFMS测定质量时，原料的曲妥珠单抗在148219观测到峰，引入了1个结合性肽的产物在150402确认到峰，引入了2个结合性肽的产物在152561确认到峰。
(50-5)曲妥珠单抗的特异性修饰体的还原条件下的基于ESI-TOFMS分析的重链选择性的确认
向(50-4)中生成的抗体-肽复合物中加入5μL的7mM的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐溶液(相对于抗体为等量)，室温下搅拌20分钟。通过ESI-TOFMS测定质量时，关于原料的曲妥珠单抗，在50595、50756观测到重链峰，并在23440观测到轻链峰；关于产物，在重链中引入了硫代丙酰基在50685、50844观测到峰，并且与原料同样在23439观测到轻链峰。
(50-6)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析
通过HIC对(50-5)中生成的抗体-肽复合物和原料的抗体进行了分析。柱使用了Protein-Pak Hi Res HIC柱(沃特世公司)4.6×100mm 2.5μm。使用A_Buffer:0.1M PiNa,2.3M(NH4)2SO4,pH7.0、B_Buffer:0.1M PiNa,pH7.0，流速为0.6mL/分钟，梯度设为A 60％B40％→A0％B 100％、16分钟(数据采集20分钟)，柱温为40℃，恒温器温度为40℃，检测器用280nm的波长进行了检测。
对于样品，按照以下的条件进行反应。
a:曲妥珠单抗原料；
b:曲妥珠单抗+肽二硫连接体偶联物-NHS活化体30当量。
保留时间10.6965分钟被认为是曲妥珠单抗原料，11.3624分钟被认为是在曲妥珠单抗中引入了1个肽的化合物，11.9441分钟被认为是引入了2个肽的化合物(图58)。
(50-7)曲妥珠单抗-肽复合物的连接体切割和再氧化
通过实施例3的(3-1)记载的方法进行(50-4)中得到的抗体-肽复合物的连接体切割和再氧化，就可获得对EU numbering中的Lys246及Lys248区域选择性地引入了硫代丙酰基的抗体。
[实施例51：具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物(肽二硫连接体偶联物-NHS活化体)的合成、以及使用该化合物的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的修饰及其分析]
(51-1)IgG1 Fc结合性肽的合成
通过与实施例1(1-1)同样的方法合成了Ac-DCAYHKGQLVWC-NH2(SEQ ID NO:54)的肽，并进行纯化，获得了目标物(76.9mg，52.5μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝2 732.65[M+2H]2+
(51-2)Ac-DCAYHKGQLVWC-NH2(SEQ ID NO:54)的第2位和第12位的Cys处的分子内二硫键的形成
[化学式144]
Figure BDA0002827785710002311
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:54。
将(51-1)中合成的肽(76.9mg，52.5μmol)溶解于DMSO(5.00mL)，加入2M NH3-MeOH(52.5μL，105μmol)、过氧化氢水溶液(107μL，1.05mmol)，在室温下进行20小时搅拌。向反应溶液中加入2M三氟乙酸水溶液停止反应，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽(35.9mg，24.6μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝2 731.60[M+2H]2+
(51-3)二硫连接体与肽的偶联
[化学式145]
Figure BDA0002827785710002312
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:54。
将(51-2)中合成的Ac-DCAYHKGQLVWC-NH2(SEQ ID NO:54)(35.9mg，24.6μmol，其中，第2位和第12位的2个半胱氨酸分别在分子内形成二硫键)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(1.00mL)，加入将3,3'-二硫代二丙酸二(N-琥珀酰亚胺酯)(398mg，984μmol)溶解于乙腈(1.50mL)而得的溶液，室温下搅拌24小时。通过减压浓缩而除去乙腈后，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽二硫连接体偶联物-NHS活化体(16.0mg，9.14μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝2 876.50[M+2H]2+
HPLC纯度:89％
(51-4)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰和基于ESI-TOFMS的分析
将(51-3)中合成的肽二硫连接体偶联物-NHS活化体溶解于N,N'-二甲基甲酰胺成为21.6mM。使500μg的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗(中外制药株式会社)溶解于46.9μL的60mM的乙酸钠缓冲液(pH 4.7)，加入4.7μL的21.6mM的肽试剂(相对于抗体为30当量)，室温下搅拌1小时。将反应液添加至NAP-5柱，使反应停止，置换为20mM的PBS缓冲液。通过ESI-TOFMS测定质量时，引入了2个结合性肽的产物在151487确认到峰。
(51-5)曲妥珠单抗的特异性修饰体的还原条件下的基于ESI-TOFMS分析的重链选择性的确认
向(51-4)中生成的抗体-肽复合物中加入5μL的7mM的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐溶液(相对于抗体为等量)，室温下搅拌20分钟。通过ESI-TOFMS测定质量时，关于原料的曲妥珠单抗，在50595、50756观测到重链峰，并在23440观测到轻链峰；关于产物，在重链中引入了硫代丙酰基在50685、50844观测到峰，并且与原料同样在23439观测到轻链峰。
(51-6)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析
通过HIC对(51-5)中生成的抗体-肽复合物和原料的抗体进行了分析。柱使用了Protein-Pak Hi Res HIC柱(沃特世公司)4.6×100mm 2.5μm。使用A_Buffer:0.1M PiNa,2.3M(NH4)2SO4,pH7.0、B_Buffer:0.1M PiNa,pH7.0，流速为0.6mL/分钟，梯度设为A 60％B40％→A0％B 100％、16分钟(数据采集20分钟)，柱温为40℃，恒温器温度为40℃，检测器用280nm的波长进行了检测。
对于样品，按照以下的条件进行反应。
a:曲妥珠单抗原料；
b:曲妥珠单抗+肽二硫连接体偶联物-NHS活化体30当量。
保留时间12.5802分钟被认为是在曲妥珠单抗中引入了2个肽的化合物(图59)。
(51-7)曲妥珠单抗-肽复合物的连接体切割和再氧化
通过实施例3的(3-1)记载的方法进行(51-4)中得到的抗体-肽复合物的连接体切割和再氧化，就可获得对EU numbering中的Lys246及Lys248区域选择性地引入了硫代丙酰基的抗体。
[实施例52：具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物(肽二硫连接体偶联物-NHS活化体)的合成、以及使用该化合物的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的修饰及其分析]
(52-1)IgG1 Fc结合性肽的合成
通过与实施例1(1-1)同样的方法合成了Ac-NCAYHKGQLVWC-NH2(SEQ ID NO:55)的肽，并进行纯化，获得了目标物(78.6mg，53.7μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝2 732.25[M+2H]2+
(52-2)Ac-NCAYHKGQLVWC-NH2(SEQ ID NO:55)的第2位和第12位的Cys处的分子内二硫键的形成
[化学式146]
Figure BDA0002827785710002331
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:55。
将(52-1)中合成的肽(78.6mg，53.7μmol)溶解于DMSO(5.00mL)，加入2M NH3-MeOH(53.7μL，107μmol)、过氧化氢水溶液(109μL，1.07mmol)，在室温下进行20小时搅拌。向反应溶液中加入2M三氟乙酸水溶液停止反应，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽(28.0mg，19.2μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝2 731.20[M+2H]2+
(52-3)二硫连接体与肽的偶联
[化学式147]
Figure BDA0002827785710002341
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:55。
将(52-2)中合成的Ac-NCAYHKGQLVWC-NH2(SEQ ID NO:55)(28.0mg，19.2μmol，其中，第2位和第12位的2个半胱氨酸分别在分子内形成二硫键)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(1.00mL)，加入将3,3'-二硫代二丙酸二(N-琥珀酰亚胺酯)(311mg，768μmol)溶解于乙腈(1.50mL)而得的溶液，室温下搅拌24小时。通过减压浓缩而除去乙腈后，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽二硫连接体偶联物-NHS活化体(11.5mg，6.57μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝2 875.75[M+2H]2+
HPLC纯度:93％
(52-4)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰和基于ESI-TOFMS的分析
将(52-3)中合成的肽二硫连接体偶联物-NHS活化体溶解于N,N'-二甲基甲酰胺成为21.6mM。使500μg的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗(中外制药株式会社)溶解于46.9μL的60mM的乙酸钠缓冲液(pH 4.7)，加入4.7μL的21.6mM的肽试剂(相对于抗体为30当量)，室温下搅拌1小时。将反应液添加至NAP-5柱，使反应停止，置换为20mM的PBS缓冲液。通过ESI-TOFMS测定质量时，引入了2个结合性肽的产物在151322确认到峰。
(52-5)曲妥珠单抗的特异性修饰体的还原条件下的基于ESI-TOFMS分析的重链选择性的确认
向(52-4)中生成的抗体-肽复合物中加入5μL的7mM的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐溶液(相对于抗体为等量)，室温下搅拌20分钟。通过ESI-TOFMS测定质量时，关于原料的曲妥珠单抗，在50595、50756观测到重链峰，并在23440观测到轻链峰；关于产物，在重链中引入了硫代丙酰基在50685、50844观测到峰，并且与原料同样在23439观测到轻链峰。
(52-6)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析
通过HIC对(52-5)中生成的抗体-肽复合物和原料的抗体进行了分析。柱使用了Protein-Pak Hi Res HIC柱(沃特世公司)4.6×100mm 2.5μm。使用A_Buffer:0.1M PiNa,2.3M(NH4)2SO4,pH7.0、B_Buffer:0.1M PiNa,pH7.0，流速为0.6mL/分钟，梯度设为A 60％B40％→A0％B 100％、16分钟(数据采集20分钟)，柱温为40℃，恒温器温度为40℃，检测器用280nm的波长进行了检测。
对于样品，按照以下的条件进行反应。
a:曲妥珠单抗原料；
b:曲妥珠单抗+肽二硫连接体偶联物-NHS活化体30当量。
保留时间10.9785分钟被认为是在曲妥珠单抗中引入了1个肽的化合物，11.9575分钟被认为是引入了2个肽的化合物(图60)。
(52-7)曲妥珠单抗-肽复合物的连接体切割和再氧化
通过实施例3的(3-1)记载的方法进行(52-4)中得到的抗体-肽复合物的连接体切割和再氧化，就可获得对EU numbering中的Lys246及Lys248区域选择性地引入了硫代丙酰基的抗体。
[实施例53：具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物(肽二硫连接体偶联物-NHS活化体)的合成以及使用该化合物的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的修饰及其分析]
(53-1)IgG1 Fc结合性肽的合成
通过与实施例1(1-1)同样的方法合成了Ac-CAYHKGQLVWCT-NH2(SEQ ID NO:56)的肽，并进行纯化，获得了目标物(63.8mg，44.0μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝2 725.70[M+2H]2+
(53-2)Ac-CAYHKGQLVWCT-NH2(SEQ ID NO:56)的第1位和第11位的Cys处的分子内二硫键的形成
[化学式148]
Figure BDA0002827785710002361
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:56。
将(53-1)中合成的肽(63.8mg，44.0μmol)溶解于DMSO(5.00mL)，加入2M NH3-MeOH(44.0μL，88.0μmol)、过氧化氢水溶液(89.9μL，880mmol)，在室温下进行20小时搅拌。向反应溶液中加入2M三氟乙酸水溶液停止反应，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽(24.7mg，17.1μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝2 724.35[M+2H]2+
(53-3)二硫连接体与肽的偶联
[化学式149]
Figure BDA0002827785710002362
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:56。
将(53-2)中合成的Ac-CAYHKGQLVWCT-NH2(SEQ ID NO:56)(24.7mg，17.1μmol，其中，第1位和第11位的2个半胱氨酸分别在分子内形成二硫键)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(1.00mL)，加入将3,3'-二硫代二丙酸二(N-琥珀酰亚胺酯)(277mg，684μmol)溶解于乙腈(1.50mL)而得的溶液，室温下搅拌24小时。通过减压浓缩而除去乙腈后，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽二硫连接体偶联物-NHS活化体(9.00mg，5.18μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝2 869.30[M+2H]2+
HPLC纯度:77％
(53-4)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰和基于ESI-TOFMS的分析
将(53-3)中合成的肽二硫连接体偶联物-NHS活化体溶解于N,N'-二甲基甲酰胺成为21.6mM。使500μg的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗(中外制药株式会社)溶解于46.9μL的60mM的乙酸钠缓冲液(pH 4.7)，加入4.7μL的21.6mM的肽试剂(相对于抗体为30当量)，室温下搅拌1小时。将反应液添加至NAP-5柱，使反应停止，置换为20mM的PBS缓冲液。通过ESI-TOFMS测定质量时，引入了2个结合性肽的产物在151305确认到峰。
(53-5)曲妥珠单抗的特异性修饰体的还原条件下的基于ESI-TOFMS分析的重链选择性的确认
向(53-4)中生成的抗体-肽复合物中加入5μL的7mM的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐溶液(相对于抗体为等量)，室温下搅拌20分钟。通过ESI-TOFMS测定质量时，关于原料的曲妥珠单抗，在50595、50756观测到重链峰，并在23440观测到轻链峰；关于产物，在重链中引入了硫代丙酰基在50685、50844观测到峰，并且与原料同样在23439观测到轻链峰。
(53-6)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析
通过HIC对(53-5)中生成的抗体-肽复合物和原料的抗体进行了分析。柱使用了Protein-Pak Hi Res HIC柱(沃特世公司)4.6×100mm 2.5μm。使用A_Buffer:0.1M PiNa,2.3M(NH4)2SO4,pH7.0、B_Buffer:0.1M PiNa,pH7.0，流速为0.6mL/分钟，梯度设为A 60％B40％→A0％B 100％、16分钟(数据采集20分钟)，柱温为40℃，恒温器温度为40℃，检测器用280nm的波长进行了检测。
对于样品，按照以下的条件进行反应。
a:曲妥珠单抗原料；
b:曲妥珠单抗+肽二硫连接体偶联物-NHS活化体30当量。
保留时间11.6359分钟被认为是在曲妥珠单抗中引入了1个肽的化合物，13.0051分钟被认为是引入了2个肽的化合物(图61)。
(53-7)曲妥珠单抗-肽复合物的连接体切割和再氧化
通过实施例3的(3-1)记载的方法进行(53-4)中得到的抗体-肽复合物的连接体切割和再氧化，就可获得对EU numbering中的Lys246及Lys248区域选择性地引入了硫代丙酰基的抗体。
[实施例54：具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物(肽二硫连接体偶联物-NHS活化体)的合成、以及使用该化合物的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的修饰及其分析]
(54-1)IgG1 Fc结合性肽的合成
通过与实施例1(1-1)同样的方法合成了Ac-CAYHKSQLVWC-NH2(SEQ ID NO:57)的肽，并进行纯化，获得了目标物(68.3mg，49.5μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝2 690.20[M+2H]2+
(54-2)Ac-CAYHKSQLVWC-NH2(SEQ ID NO:57)的第1位和第11位的Cys处的分子内二硫键的形成
[化学式150]
Figure BDA0002827785710002381
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:57。
将(54-1)中合成的肽(68.3mg，49.5μmol)溶解于DMSO(5.00mL)，加入2M NH3-MeOH(49.5μL，99.0μmol)、过氧化氢水溶液(101μL，990mmol)，在室温下进行20小时搅拌。向反应溶液中加入2M三氟乙酸水溶液停止反应，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽(30.4mg，22.1μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝2 689.15[M+2H]2+
(54-3)二硫连接体与肽的偶联
[化学式151]
Figure BDA0002827785710002391
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:57。
将(54-2)中合成的Ac-CAYHKSQLVWC-NH2(SEQ ID NO:57)(30.4mg，22.1μmol，其中，第1位和第11位的2个半胱氨酸分别在分子内形成二硫键)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(0.50mL)，加入将3,3'-二硫代二丙酸二(N-琥珀酰亚胺酯)(179mg，442μmol)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(0.50mL)而得的溶液，室温下搅拌24小时。通过减压浓缩而除去乙腈后，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽二硫连接体偶联物-NHS活化体(12.0mg，7.20μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝2 833.85[M+2H]2+
HPLC纯度:96％
(54-4)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰和基于ESI-TOFMS的分析
将(54-3)中合成的肽二硫连接体偶联物-NHS活化体溶解于N,N'-二甲基甲酰胺成为21.6mM。使500μg的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗(中外制药株式会社)溶解于46.9μL的60mM的乙酸钠缓冲液(pH 4.7)，加入4.7μL的21.6mM的肽试剂(相对于抗体为30当量)，室温下搅拌1小时。将反应液添加至NAP-5柱，使反应停止，置换为20mM的PBS缓冲液。通过ESI-TOFMS测定质量时，引入了1个结合性肽的产物在149771确认到峰，引入了2个结合性肽的产物在151326确认到峰。
(54-5)曲妥珠单抗的特异性修饰体的还原条件下的基于ESI-TOFMS分析的重链选择性的确认
向(54-4)中生成的抗体-肽复合物中加入5μL的7mM的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐溶液(相对于抗体为等量)，室温下搅拌20分钟。通过ESI-TOFMS测定质量时，关于原料的曲妥珠单抗，在50595、50756观测到重链峰，并在23440观测到轻链峰；关于产物，在重链中引入了硫代丙酰基在50685、50844观测到峰，并且与原料同样在23439观测到轻链峰。
(54-6)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析
通过HIC对(54-5)中生成的抗体-肽复合物和原料的抗体进行了分析。柱使用了Protein-Pak Hi Res HIC柱(沃特世公司)4.6×100mm 2.5μm。使用A_Buffer:0.1M PiNa,2.3M(NH4)2SO4,pH7.0、B_Buffer:0.1M PiNa,pH7.0，流速为0.6mL/分钟，梯度设为A 60％B40％→A0％B 100％、16分钟(数据采集20分钟)，柱温为40℃，恒温器温度为40℃，检测器用280nm的波长进行了检测。
对于样品，按照以下的条件进行反应。
a:曲妥珠单抗原料；
b:曲妥珠单抗+肽二硫连接体偶联物-NHS活化体30当量。
保留时间11.7194分钟被认为是在曲妥珠单抗中引入了1个肽的化合物，13.0651分钟被认为是引入了2个肽的化合物(图62)。
(54-7)曲妥珠单抗-肽复合物的连接体切割和再氧化
通过实施例3的(3-1)记载的方法进行(54-4)中得到的抗体-肽复合物的连接体切割和再氧化，就可获得对EU numbering中的Lys246及Lys248区域选择性地引入了硫代丙酰基的抗体。
[实施例55：具有针对可溶性蛋白质的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物(肽二硫连接体偶联物-NHS活化体)的合成、以及使用该化合物的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的修饰及其分析]
(55-1)IgG1 Fc结合性肽的合成
通过与实施例1(1-1)同样的方法合成了Ac-RGNCAWHKGQIIWCTYH-NH2(SEQ ID NO:68)的肽，并进行纯化，获得了目标物(58.4mg，27.6μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝4 529.65[M+3H]3+
(55-2)Ac-RGNCAWHKGQIIWCTYH-NH2(SEQ ID NO:68)的第4位和第14位的Cys处的分子内二硫键的形成
[化学式152]
Figure BDA0002827785710002411
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:68。
将(55-1)中合成的肽(58.4mg，27.6μmol)溶解于DMSO(5.00mL)，加入2M NH3-MeOH(27.6μL，55.2μmol)、过氧化氢水溶液(56.4μL，552μmol)，在室温下进行20小时搅拌。向反应溶液中加入2M三氟乙酸水溶液停止反应，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽(29.3mg，13.9μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝4 529.05[M+3H]3+
(55-3)二硫连接体与肽的偶联
[化学式153]
Figure BDA0002827785710002412
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:68。
将(55-2)中合成的Ac-RGNCAWHKGQIIWCTYH-NH2(SEQ ID NO:68)(29.3mg，13.9μmol，其中，第4个和第14个的2个半胱氨酸分别在分子内形成二硫键)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(0.40mL)，加入将3,3'-二硫代二丙酸二(N-琥珀酰亚胺酯)(112mg，278μmol)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(0.60mL)而得的溶液，室温下搅拌24小时。将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽二硫连接体偶联物-NHS活化体(14.5mg，6.04mol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 801.40[M+3H]3+
HPLC纯度:88％
(55-4)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰和基于ESI-TOFMS的分析
将(55-3)中合成的肽二硫连接体偶联物-NHS活化体溶解于N,N'-二甲基甲酰胺成为21.6mM。使500μg的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗(中外制药株式会社)溶解于46.9μL的60mM的乙酸钠缓冲液(pH 4.7)，加入4.7μL的21.6mM的肽试剂(相对于抗体为30当量)，室温下搅拌1小时。将反应液置换为100mM柠檬酸钠缓冲液(pH 2.9)而使反应停止，进而置换为20mM的PBS缓冲液。通过ESI-TOFMS测定质量时，引入了1个结合性肽的产物在150690观测到峰，引入了2个结合性肽的产物在152796确认到峰。
(55-5)曲妥珠单抗的特异性修饰体的还原条件下的基于ESI-TOFMS分析的重链选择性的确认
向(55-4)中生成的抗体-肽复合物中加入5μL的7mM的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐溶液(相对于抗体为等量)，室温下搅拌20分钟。通过ESI-TOFMS测定质量时，关于原料的曲妥珠单抗，在50595、50756观测到重链峰，并在23439观测到轻链峰；关于产物，在重链中引入了硫代丙酰基在50682、50844观测到峰，并且与原料同样在23439观测到轻链峰。
(55-6)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析
通过HIC对(55-4)中生成的抗体-肽复合物和原料的抗体进行了分析。柱使用了Protein-Pak Hi Res HIC柱(沃特世公司)4.6×100mm 2.5μm。使用A_Buffer:0.1M PiNa,2.3M(NH4)2SO4,pH7.0、B_Buffer:0.1M PiNa,pH7.0，流速为0.6mL/分钟，梯度设为A 60％B40％→A0％B 100％、16分钟(数据采集20分钟)，柱温为40℃，恒温器温度为40℃，检测器用280nm的波长进行了检测。
对于样品，按照以下的条件进行反应。
a:曲妥珠单抗原料；
b:曲妥珠单抗+肽二硫连接体偶联物-NHS活化体30当量。
保留时间12.3918分钟被认为是引入了1个肽的化合物，13.5178分钟被认为是引入了2个肽的化合物(图63)。
(55-7)曲妥珠单抗-肽复合物的连接体切割和再氧化
通过实施例3的(3-1)记载的方法进行(55-4)中得到的抗体-肽复合物的连接体切割和再氧化，就可获得对EU numbering中的Lys246及Lys248区域选择性地引入了硫代丙酰基的抗体。
[实施例56：具有针对可溶性蛋白质的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物(肽二硫连接体偶联物-NHS活化体)的合成、以及使用该化合物的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的修饰及其分析]
(56-1)IgG1 Fc结合性肽的合成
通过与实施例1(1-1)同样的方法合成了Ac-RGNCAFHKGQIIWCTYH-NH2(SEQ ID NO:69)的肽，并进行纯化，获得了目标物(78.2mg，37.7μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝4 519.80[M+3H]3+
(56-2)Ac-RGNCAFHKGQIIWCTYH-NH2(SEQ ID NO:69)的第4位和第14位的Cys处的分子内二硫键的形成
[化学式154]
Figure BDA0002827785710002431
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:69。
将(56-1)中合成的肽(78.2mg，37.7μmol)溶解于DMSO(5.00mL)，加入2M NH3-MeOH(37.7μL，75.4μmol)、过氧化氢水溶液(77.0μL，754μmol)，在室温下进行20小时搅拌。向反应溶液中加入2M三氟乙酸水溶液停止反应，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽(46.9mg，22.6μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝4 519.40[M+3H]3+
(56-3)二硫连接体与肽的偶联
[化学式155]
Figure BDA0002827785710002441
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:69。
将(56-2)中合成的Ac-RGNCAFHKGQIIWCTYH-NH2(SEQ ID NO:69)(46.9mg，22.6μmol，其中，第4位和第14位的2个半胱氨酸分别在分子内形成二硫键)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(0.40mL)，加入将3,3'-二硫代二丙酸二(N-琥珀酰亚胺酯)(183mg，452μmol)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(0.80mL)而得的溶液，室温下搅拌24小时。将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽二硫连接体偶联物-NHS活化体(18.5mg，7.83mol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 788.60[M+3H]3+
HPLC纯度:89％
(56-4)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰和基于ESI-TOFMS的分析
将(56-3)中合成的肽二硫连接体偶联物-NHS活化体溶解于N,N'-二甲基甲酰胺成为21.6mM。使500μg的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗(中外制药株式会社)溶解于46.9μL的60mM的乙酸钠缓冲液(pH 4.7)，加入4.7μL的21.6mM的肽试剂(相对于抗体为30当量)，室温下搅拌1小时。将反应液置换为100mM柠檬酸钠缓冲液(pH 2.9)而使反应停止，进而置换为20mM的PBS缓冲液。通过ESI-TOFMS测定质量时，引入了1个结合性肽的产物在150368观测到峰，引入了2个结合性肽的产物在152717确认到峰。
(56-5)曲妥珠单抗的特异性修饰体的还原条件下的基于ESI-TOFMS分析的重链选择性的确认
向(56-4)中生成的抗体-肽复合物中加入5μL的7mM的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐溶液(相对于抗体为等量)，室温下搅拌20分钟。通过ESI-TOFMS测定质量时，关于原料的曲妥珠单抗，在50595、50756观测到重链峰，并在23440观测到轻链峰；关于产物，在重链中引入了硫代丙酰基在50682、50845观测到峰，并且与原料同样在23439观测到轻链峰。
(56-6)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析
通过HIC对(56-4)中生成的抗体-肽复合物和原料的抗体进行了分析。柱使用了Protein-Pak Hi Res HIC柱(沃特世公司)4.6×100mm 2.5μm。使用A_Buffer:0.1M PiNa,2.3M(NH4)2SO4,pH7.0、B_Buffer:0.1M PiNa,pH7.0，流速为0.6mL/分钟，梯度设为A 60％B40％→A0％B 100％、16分钟(数据采集20分钟)，柱温为40℃，恒温器温度为40℃，检测器用280nm的波长进行了检测。
对于样品，按照以下的条件进行反应。
a:曲妥珠单抗原料；
b:曲妥珠单抗+肽二硫连接体偶联物-NHS活化体30当量。
保留时间12.2498分钟被认为是引入了1个肽的化合物，13.1829分钟被认为是引入了2个肽的化合物(图64)。
(56-7)曲妥珠单抗-肽复合物的连接体切割和再氧化
通过实施例3的(3-1)记载的方法进行(56-4)中得到的抗体-肽复合物的连接体切割和再氧化，就可获得对EU numbering中的Lys246及Lys248区域选择性地引入了硫代丙酰基的抗体。
[实施例57：具有针对可溶性蛋白质的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物(肽二硫连接体偶联物-NHS活化体)的合成、以及使用该化合物的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的修饰及其分析]
(57-1)IgG1 Fc结合性肽的合成
通过与实施例1(1-1)同样的方法合成了Ac-RGNCAHHKGQIIWCTYH-NH2(SEQ ID NO:70)的肽，并进行纯化，获得了目标物(98.6mg，47.7μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝4 517.25[M+3H]3+
(57-2)Ac-RGNCAHHKGQIIWCTYH-NH2(SEQ ID NO:70)的第4位和第14位的Cys处的分子内二硫键的形成
[化学式156]
Figure BDA0002827785710002461
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:70。
将(57-1)中合成的肽(98.6mg，47.7μmol)溶解于DMSO(5.00mL)，加入2M NH3-MeOH(47.7μL，95.4μmol)、过氧化氢水溶液(97.4μL，954μmol)，在室温下进行20小时搅拌。向反应溶液中加入2M三氟乙酸水溶液停止反应，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽(90.3mg，43.7μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝4 516.85[M+3H]3+
(57-3)二硫连接体与肽的偶联
[化学式157]
Figure BDA0002827785710002462
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:70。
将(57-2)中合成的Ac-RGNCAHHKGQIIWCTYH-NH2(SEQ ID NO:70)(90.3mg，43.7μmol，其中，第4位和第14位的2个半胱氨酸分别在分子内形成二硫键)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(0.40mL)，加入将3,3'-二硫代二丙酸二(N-琥珀酰亚胺酯)(353mg，874μmol)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(1.20mL)而得的溶液，室温下搅拌24小时。将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽二硫连接体偶联物-NHS活化体(22.5mg，9.56mol)。
MS(ESI)m/z:z＝4 589.10[M+3H]3+
HPLC纯度:60％
(57-4)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰和基于ESI-TOFMS的分析
将(57-3)中合成的肽二硫连接体偶联物-NHS活化体溶解于N,N'-二甲基甲酰胺成为21.6mM。使500μg的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗(中外制药株式会社)溶解于46.9μL的60mM的乙酸钠缓冲液(pH 4.7)，加入4.7μL的21.6mM的肽试剂(相对于抗体为30当量)，室温下搅拌1小时。将反应液置换为100mM柠檬酸钠缓冲液(pH 2.9)而使反应停止，进而置换为20mM的PBS缓冲液。通过ESI-TOFMS测定质量时，原料的曲妥珠单抗在148236观测到峰，引入了1个结合性肽的产物在150466观测到峰，引入了2个结合性肽的产物在152702确认到峰。
(57-5)曲妥珠单抗的特异性修饰体的还原条件下的基于ESI-TOFMS分析的重链选择性的确认
向(57-4)中生成的抗体-肽复合物中加入5μL的7mM的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐溶液(相对于抗体为等量)，室温下搅拌20分钟。通过ESI-TOFMS测定质量时，关于原料的曲妥珠单抗，在50595、50756观测到重链峰，并在23439观测到轻链峰；关于产物，在重链中引入了硫代丙酰基在50682、50844观测到峰，并且与原料同样在23439观测到轻链峰。
(57-6)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析
通过HIC对(57-4)中生成的抗体-肽复合物和原料的抗体进行了分析。柱使用了Protein-Pak Hi Res HIC柱(沃特世公司)4.6×100mm 2.5μm。使用A_Buffer:0.1M PiNa,2.3M(NH4)2SO4,pH7.0、B_Buffer:0.1M PiNa,pH7.0，流速为0.6mL/分钟，梯度设为A 60％B40％→A0％B 100％、16分钟(数据采集20分钟)，柱温为40℃，恒温器温度为40℃，检测器用280nm的波长进行了检测。
对于样品，按照以下的条件进行反应。
a:曲妥珠单抗原料；
b:曲妥珠单抗+肽二硫连接体偶联物-NHS活化体30当量。
保留时间11.0753分钟被认为是曲妥珠单抗原料，11.6420分钟被认为是引入了1个肽的化合物，12.1118分钟被认为是引入了2个肽的化合物(图65)。
(57-7)曲妥珠单抗-肽复合物的连接体切割和再氧化
通过实施例3的(3-1)记载的方法进行(57-4)中得到的抗体-肽复合物的连接体切割和再氧化，就可获得对EU numbering中的Lys246及Lys248区域选择性地引入了硫代丙酰基的抗体。
[实施例58：具有针对可溶性蛋白质的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物(肽二硫连接体偶联物-NHS活化体)的合成、以及使用该化合物的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的修饰及其分析]
(58-1)IgG1 Fc结合性肽的合成
通过与实施例1(1-1)同样的方法合成了Ac-RGNCGYHKGQIIWCTYH-NH2(SEQ ID NO:71)的肽，并进行纯化，获得了目标物(88.7mg，42.7μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝4 520.25[M+3H]3+
(58-2)Ac-RGNCGYHKGQIIWCTYH-NH2(SEQ ID NO:71)的第4位和第14位的Cys处的分子内二硫键的形成
[化学式158]
Figure BDA0002827785710002481
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:71。
将(58-1)中合成的肽(88.7mg，42.7μmol)溶解于DMSO(5.00mL)，加入2M NH3-MeOH(42.7μL，85.4μmol)、过氧化氢水溶液(87.2μL，854μmol)，在室温下进行20小时搅拌。向反应溶液中加入2M三氟乙酸水溶液停止反应，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽(66.3mg，31.9μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝4 519.75[M+3H]3+
(58-3)二硫连接体与肽的偶联
[化学式159]
Figure BDA0002827785710002491
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:71。
将(58-2)中合成的Ac-RGNCGYHKGQIIWCTYH-NH2(SEQ ID NO:71)(66.3mg，31.9μmol，其中，第4位和第14位的2个半胱氨酸分别在分子内形成二硫键)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(0.40mL)，加入将3,3'-二硫代二丙酸二(N-琥珀酰亚胺酯)(258mg，638μmol)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(0.80mL)而得的溶液，室温下搅拌24小时。将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽二硫连接体偶联物-NHS活化体(24.5mg，10.4mol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 789.25[M+3H]3+
HPLC纯度:85％
(58-4)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰和基于ESI-TOFMS的分析
将(58-3)中合成的肽二硫连接体偶联物-NHS活化体溶解于N,N'-二甲基甲酰胺成为21.6mM。使500μg的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗(中外制药株式会社)溶解于46.9μL的60mM的乙酸钠缓冲液(pH 4.7)，加入4.7μL的21.6mM的肽试剂(相对于抗体为30当量)，室温下搅拌1小时。将反应液置换为100mM柠檬酸钠缓冲液(pH 2.9)而使反应停止，进而置换为20mM的PBS缓冲液。通过ESI-TOFMS测定质量时，原料的曲妥珠单抗在148229观测到峰，引入了1个结合性肽的产物在150477观测到峰，引入了2个结合性肽的产物在152892确认到峰。
(58-5)曲妥珠单抗的特异性修饰体的还原条件下的基于ESI-TOFMS分析的重链选择性的确认
向(58-4)中生成的抗体-肽复合物中加入5μL的7mM的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐溶液(相对于抗体为等量)，室温下搅拌20分钟。通过ESI-TOFMS测定质量时，关于原料的曲妥珠单抗，在50595、50757观测到重链峰，并在23439观测到轻链峰；关于产物，在重链中引入了硫代丙酰基在50685、50845观测到峰，并且与原料同样在23439观测到轻链峰。
(58-6)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析
通过HIC对(58-4)中生成的抗体-肽复合物和原料的抗体进行了分析。柱使用了Protein-Pak Hi Res HIC柱(沃特世公司)4.6×100mm 2.5μm。使用A_Buffer:0.1M PiNa,2.3M(NH4)2SO4,pH7.0、B_Buffer:0.1M PiNa,pH7.0，流速为0.6mL/分钟，梯度设为A 60％B40％→A0％B 100％、16分钟(数据采集20分钟)，柱温为40℃，恒温器温度为40℃，检测器用280nm的波长进行了检测。
对于样品，按照以下的条件进行反应。
a:曲妥珠单抗原料；
b:曲妥珠单抗+肽二硫连接体偶联物-NHS活化体30当量。
保留时间10.4246分钟被认为是曲妥珠单抗原料，11.4281分钟被认为是引入了1个肽的化合物，12.2920分钟被认为是引入了2个肽的化合物(图66)。
(58-7)曲妥珠单抗-肽复合物的连接体切割和再氧化
通过实施例3的(3-1)记载的方法进行(58-4)中得到的抗体-肽复合物的连接体切割和再氧化，就可获得对EU numbering中的Lys246及Lys248区域选择性地引入了硫代丙酰基的抗体。
[实施例59：具有针对可溶性蛋白质的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物(肽二硫连接体偶联物-NHS活化体)的合成、以及使用该化合物的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的修饰及其分析]
(59-1)IgG1 Fc结合性肽的合成
通过与实施例1(1-1)同样的方法合成了Ac-RGNCLYHKGQIIWCTYH-NH2(SEQ ID NO:72)的肽，并进行纯化，获得了目标物(54.8mg，25.7μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝4 534.45[M+3H]3+
(59-2)Ac-RGNCLYHKGQIIWCTYH-NH2(SEQ ID NO:72)的第4位和第14位的Cys处的分子内二硫键的形成
[化学式160]
Figure BDA0002827785710002511
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:72。
将(59-1)中合成的肽(54.8mg，25.7μmol)溶解于DMSO(5.00mL)，加入2M NH3-MeOH(25.7μL，51.4μmol)、过氧化氢水溶液(52.5μL，514μmol)，在室温下进行20小时搅拌。向反应溶液中加入2M三氟乙酸水溶液停止反应，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽(27.8mg，13.0μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝4 533.85[M+3H]3+
(59-3)二硫连接体与肽的偶联
[化学式161]
Figure BDA0002827785710002512
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:72。
将(59-2)中合成的Ac-RGNCLYHKGQIIWCTYH-NH2(SEQ ID NO:72)(27.8mg，13.0μmol，其中，第4位和第14位的2个半胱氨酸分别在分子内形成二硫键)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(0.40mL)，加入将3,3'-二硫代二丙酸二(N-琥珀酰亚胺酯)(105mg，260μmol)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(0.60mL)而得的溶液，室温下搅拌24小时。将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽二硫连接体偶联物-NHS活化体(18.8mg，7.77mol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 807.80[M+3H]3+
HPLC纯度:84％
(59-4)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰和基于ESI-TOFMS的分析
将(59-3)中合成的肽二硫连接体偶联物-NHS活化体溶解于N,N'-二甲基甲酰胺成为21.6mM。使500μg的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗(中外制药株式会社)溶解于46.9μL的60mM的乙酸钠缓冲液(pH 4.7)，加入4.7μL的21.6mM的肽试剂(相对于抗体为30当量)，室温下搅拌1小时。将反应液置换为100mM柠檬酸钠缓冲液(pH 2.9)而使反应停止，进而置换为20mM的PBS缓冲液。通过ESI-TOFMS测定质量时，引入了1个结合性肽的产物在150691观测到峰，引入了2个结合性肽的产物在152838确认到峰。
(59-5)曲妥珠单抗的特异性修饰体的还原条件下的基于ESI-TOFMS分析的重链选择性的确认
向(59-4)中生成的抗体-肽复合物中加入5μL的7mM的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐溶液(相对于抗体为等量)，室温下搅拌20分钟。通过ESI-TOFMS测定质量时，关于原料的曲妥珠单抗，在50595、50757观测到重链峰，并在23439观测到轻链峰；关于产物，在重链中引入了硫代丙酰基在50682、50844观测到峰，并且与原料同样在23439观测到轻链峰。
(59-6)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析
通过HIC对(59-4)中生成的抗体-肽复合物和原料的抗体进行了分析。柱使用了Protein-Pak Hi Res HIC柱(沃特世公司)4.6×100mm 2.5μm。使用A_Buffer:0.1M PiNa,2.3M(NH4)2SO4,pH7.0、B_Buffer:0.1M PiNa,pH7.0，流速为0.6mL/分钟，梯度设为A 60％B40％→A0％B 100％、16分钟(数据采集20分钟)，柱温为40℃，恒温器温度为40℃，检测器用280nm的波长进行了检测。
对于样品，按照以下的条件进行反应。
a:曲妥珠单抗原料；
b:曲妥珠单抗+肽二硫连接体偶联物-NHS活化体30当量。
保留时间11.4592分钟被认为是引入了1个肽的化合物，12.2146分钟被认为是引入了2个肽的化合物(图67)。
(59-7)曲妥珠单抗-肽复合物的连接体切割和再氧化
通过实施例3的(3-1)记载的方法进行(59-4)中得到的抗体-肽复合物的连接体切割和再氧化，就可获得对EU numbering中的Lys246及Lys248区域选择性地引入了硫代丙酰基的抗体。
[实施例60：具有针对可溶性蛋白质的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物(肽二硫连接体偶联物-NHS活化体)的合成、以及使用该化合物的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的修饰及其分析]
(60-1)IgG1 Fc结合性肽的合成
通过与实施例1(1-1)同样的方法合成了Ac-RGNCPYHKGQIIWCTYH-NH2(SEQ ID NO:73)的肽，并进行纯化，获得了目标物(83.0mg，39.2μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝4 530.45[M+3H]3+
(60-2)Ac-RGNCPYHKGQIIWCTYH-NH2(SEQ ID NO:73)的第4位和第14位的Cys处的分子内二硫键的形成
[化学式162]
Figure BDA0002827785710002531
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:73。
将(60-1)中合成的肽(83.0mg，39.2μmol)溶解于DMSO(5.00mL)，加入2M NH3-MeOH(39.2μL，78.4μmol)、过氧化氢水溶液(80.1μL，784μmol)，在室温下进行20小时搅拌。向反应溶液中加入2M三氟乙酸水溶液停止反应，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽(49.1mg，23.2μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝4 529.95[M+3H]3+
(60-3)二硫连接体与肽的偶联
[化学式163]
Figure BDA0002827785710002541
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:73。
将(60-2)中合成的Ac-RGNCPYHKGQIIWCTYH-NH2(SEQ ID NO:73)(49.1mg，23.2μmol，其中，第4位和第14位的2个半胱氨酸分别在分子内形成二硫键)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(0.40mL)，加入将3,3'-二硫代二丙酸二(N-琥珀酰亚胺酯)(188mg，464μmol)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(0.80mL)而得的溶液，室温下搅拌24小时。将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽二硫连接体偶联物-NHS活化体(19.4mg，8.07mol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 802.45[M+3H]3+
HPLC纯度:87％
(60-4)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰和基于ESI-TOFMS的分析
将(60-3)中合成的肽二硫连接体偶联物-NHS活化体溶解于N,N'-二甲基甲酰胺成为21.6mM。使500μg的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗(中外制药株式会社)溶解于46.9μL的60mM的乙酸钠缓冲液(pH 4.7)，加入4.7μL的21.6mM的肽试剂(相对于抗体为30当量)，室温下搅拌1小时。将反应液置换为100mM柠檬酸钠缓冲液(pH 2.9)而使反应停止，进而置换为20mM的PBS缓冲液。通过ESI-TOFMS测定质量时，原料的曲妥珠单抗在148225观测到峰，引入了1个结合性肽的产物在150513观测到峰，引入了2个结合性肽的产物在153398确认到峰。
(60-5)曲妥珠单抗的特异性修饰体的还原条件下的基于ESI-TOFMS分析的重链选择性的确认
向(60-4)中生成的抗体-肽复合物中加入5μL的7mM的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐溶液(相对于抗体为等量)，室温下搅拌20分钟。通过ESI-TOFMS测定质量时，关于原料的曲妥珠单抗，在50595、50756观测到重链峰，并在23439观测到轻链峰；关于产物，在重链中引入了硫代丙酰基在50684、50845观测到峰，并且原料同样在23439观测到轻链峰。
(60-6)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析
通过HIC对(60-4)中生成的抗体-肽复合物和原料的抗体进行了分析。柱使用了Protein-Pak Hi Res HIC柱(沃特世公司)4.6×100mm 2.5μm。使用A_Buffer:0.1M PiNa,2.3M(NH4)2SO4,pH7.0、B_Buffer:0.1M PiNa,pH7.0，流速为0.6mL/分钟，梯度设为A 60％B40％→A0％B 100％、16分钟(数据采集20分钟)，柱温为40℃，恒温器温度为40℃，检测器用280nm的波长进行了检测。
对于样品，按照以下的条件进行反应。
a:曲妥珠单抗原料；
b:曲妥珠单抗+肽二硫连接体偶联物-NHS活化体30当量。
保留时间10.5842分钟被认为是曲妥珠单抗原料，11.6024分钟被认为是引入了1个肽的化合物，12.4613分钟被认为是引入了2个肽的化合物(图68)。
(60-7)曲妥珠单抗-肽复合物的连接体切割和再氧化
通过实施例3的(3-1)记载的方法进行(60-4)中得到的抗体-肽复合物的连接体切割和再氧化，就可获得对EU numbering中的Lys246及Lys248区域选择性地引入了硫代丙酰基的抗体。
[实施例61：具有针对可溶性蛋白质的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物(肽二硫连接体偶联物-NHS活化体)的合成、以及使用该化合物的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的修饰及其分析]
(61-1)IgG1 Fc结合性肽的合成
通过与实施例1(1-1)同样的方法合成了Ac-RGNCRYHKGQIIWCTYH-NH2(SEQ ID NO:74)的肽，并进行纯化，获得了目标物(47.8mg，22.0μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝4 545.00[M+3H]3+
(61-2)Ac-RGNCRYHKGQIIWCTYH-NH2(SEQ ID NO:74)的第4位和第14位的Cys处的分子内二硫键的形成
[化学式164]
Figure BDA0002827785710002561
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:74。
将(61-1)中合成的肽(47.8mg，22.0μmol)溶解于DMSO(5.00mL)，加入2M NH3-MeOH(22.0μL，44.0μmol)、过氧化氢水溶液(44.9μL，440μmol)，在室温下进行20小时搅拌。向反应溶液中加入2M三氟乙酸水溶液停止反应，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽(52.5mg，24.1μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝4 544.65[M+3H]3+
(61-3)二硫连接体与肽的偶联
[化学式165]
Figure BDA0002827785710002562
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:74。
将(61-2)中合成的Ac-RGNCRYHKGQIIWCTYH-NH2(SEQ ID NO:74)(52.5mg，24.1μmol，其中，第4位和第14位的2个半胱氨酸分别在分子内形成二硫键)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(0.40mL)，加入将3,3'-二硫代二丙酸二(N-琥珀酰亚胺酯)(195mg，482μmol)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(0.60mL)而得的溶液，室温下搅拌24小时。将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽二硫连接体偶联物-NHS活化体(20.0mg，8.12mol)。
MS(ESI)m/z:z＝4 617.10[M+3H]3+
HPLC纯度:74％
(61-4)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰和基于ESI-TOFMS的分析
将(61-3)中合成的肽二硫连接体偶联物-NHS活化体溶解于N,N'-二甲基甲酰胺成为21.6mM。使500μg的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗(中外制药株式会社)溶解于46.9μL的60mM的乙酸钠缓冲液(pH 4.7)，加入4.7μL的21.6mM的肽试剂(相对于抗体为30当量)，室温下搅拌1小时。将反应液置换为100mM柠檬酸钠缓冲液(pH 2.9)而使反应停止，进而置换为20mM的PBS缓冲液。通过ESI-TOFMS测定质量时，原料的曲妥珠单抗在148387观测到峰，引入了1个结合性肽的产物在150730观测到峰，引入了2个结合性肽的产物在153089确认到峰。
(61-5)曲妥珠单抗的特异性修饰体的还原条件下的基于ESI-TOFMS分析的重链选择性的确认
向(61-4)中生成的抗体-肽复合物中加入5μL的7mM的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐溶液(相对于抗体为等量)，室温下搅拌20分钟。通过ESI-TOFMS测定质量时，原料的曲妥珠单抗在50595、50757观测到重链峰，在23440观测到轻链峰，关于产物，在重链中引入了硫代丙酰基在50682、50845观测到峰，并且与原料同样在23439观测到轻链峰。
(61-6)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析
通过HIC对(61-4)中生成的抗体-肽复合物和原料的抗体进行了分析。柱使用了Protein-Pak Hi Res HIC柱(沃特世公司)4.6×100mm 2.5μm。使用A_Buffer:0.1M PiNa,2.3M(NH4)2SO4,pH7.0、B_Buffer:0.1M PiNa,pH7.0，流速为0.6mL/分钟，梯度设为A 60％B40％→A0％B 100％、16分钟(数据采集20分钟)，柱温为40℃，恒温器温度为40℃，检测器用280nm的波长进行了检测。
对于样品，按照以下的条件进行反应。
a:曲妥珠单抗原料；
b:曲妥珠单抗+肽二硫连接体偶联物-NHS活化体30当量。
保留时间10.7014分钟被认为是曲妥珠单抗原料，11.4239分钟被认为是引入了1个肽的化合物，12.0250分钟被认为是引入了2个肽的化合物(图69)。
(61-7)曲妥珠单抗-肽复合物的连接体切割和再氧化
通过实施例3的(3-1)记载的方法进行(61-4)中得到的抗体-肽复合物的连接体切割和再氧化，就可获得对EU numbering中的Lys246及Lys248区域选择性地引入了硫代丙酰基的抗体。
[实施例62：具有针对可溶性蛋白质的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物(肽二硫连接体偶联物-NHS活化体)的合成、以及使用该化合物的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的修饰及其分析]
(62-1)IgG1 Fc结合性肽的合成
通过与实施例1(1-1)同样的方法合成了Ac-RGNCVYHKGQIIWCTYH-NH2(SEQ ID NO:75)的肽，并进行纯化，获得了目标物(71.0mg，33.5μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝4 530.95[M+3H]3+
(62-2)Ac-RGNCVYHKGQIIWCTYH-NH2(SEQ ID NO:75)的第4位和第14位的Cys处的分子内二硫键的形成
[化学式166]
Figure BDA0002827785710002581
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:75。
将(62-1)中合成的肽(71.0mg，33.5μmol)溶解于DMSO(5.00mL)，加入2M NH3-MeOH(33.5μL，67.0μmol)、过氧化氢水溶液(68.0μL，670μmol)，在室温下进行20小时搅拌。向反应溶液中加入2M三氟乙酸水溶液停止反应，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽(38.9mg，18.4μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝4 530.35[M+3H]3+
(62-3)二硫连接体与肽的偶联
[化学式167]
Figure BDA0002827785710002591
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:75。
将(62-2)中合成的Ac-RGNCVYHKGQIIWCTYH-NH2(SEQ ID NO:75)(38.9mg，18.4μmol，其中，第4位和第14位的2个半胱氨酸分别在分子内形成二硫键)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(0.40mL)，加入将3,3'-二硫代二丙酸二(N-琥珀酰亚胺酯)(149mg，368μmol)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(0.60mL)而得的溶液，室温下搅拌24小时。将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽二硫连接体偶联物-NHS活化体(11.2mg，4.65mol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 803.05[M+3H]3+
HPLC纯度:88％
(62-4)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰和基于ESI-TOFMS的分析
将(62-3)中合成的肽二硫连接体偶联物-NHS活化体溶解于N,N'-二甲基甲酰胺成为21.6mM。使500μg的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗(中外制药株式会社)溶解于46.9μL的60mM的乙酸钠缓冲液(pH 4.7)，加入4.7μL的21.6mM的肽试剂(相对于抗体为30当量)，室温下搅拌1小时。将反应液置换为100mM柠檬酸钠缓冲液(pH 2.9)而使反应停止，进而置换为20mM的PBS缓冲液。通过ESI-TOFMS测定质量时，引入了1个结合性肽的产物在150358观测到峰，引入了2个结合性肽的产物在152961确认到峰。
(62-5)曲妥珠单抗的特异性修饰体的还原条件下的基于ESI-TOFMS分析的重链选择性的确认
向(62-4)中生成的抗体-肽复合物中加入5μL的7mM的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐溶液(相对于抗体为等量)，室温下搅拌20分钟。通过ESI-TOFMS测定质量时，关于原料的曲妥珠单抗，在50595、50756观测到重链峰，并在23439观测到轻链峰；关于产物，在重链中引入了硫代丙酰基在50684、50846观测到峰，并且与原料同样在23439观测到轻链峰。
(62-6)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析
通过HIC对(62-4)中生成的抗体-肽复合物和原料的抗体进行了分析。柱使用了Protein-Pak Hi Res HIC柱(沃特世公司)4.6×100mm 2.5μm。使用A_Buffer:0.1M PiNa,2.3M(NH4)2SO4,pH7.0、B_Buffer:0.1M PiNa,pH7.0，流速为0.6mL/分钟，梯度设为A 60％B40％→A0％B 100％、16分钟(数据采集20分钟)，柱温为40℃，恒温器温度为40℃，检测器用280nm的波长进行了检测。
对于样品，按照以下的条件进行反应。
a:曲妥珠单抗原料；
b:曲妥珠单抗+肽二硫连接体偶联物-NHS活化体30当量。
保留时间10.9065分钟被认为是引入了1个肽的化合物，11.7157分钟被认为是引入了2个肽的化合物(图70)。
(62-7)曲妥珠单抗-肽复合物的连接体切割和再氧化
通过实施例3的(3-1)记载的方法进行(62-4)中得到的抗体-肽复合物的连接体切割和再氧化，就可获得对EU numbering中的Lys246及Lys248区域选择性地引入了硫代丙酰基的抗体。
[实施例63：具有针对可溶性蛋白质的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物(肽二硫连接体偶联物-NHS活化体)的合成、以及使用该化合物的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的修饰及其分析]
(63-1)IgG1 Fc结合性肽的合成
通过与实施例1(1-1)同样的方法合成了Ac-RGNCNYHKGQIIWCTYH-NH2(SEQ ID NO:76)的肽，并进行纯化，获得了目标物(102mg，47.7μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝4 534.55[M+3H]3+
(63-2)Ac-RGNCNYHKGQIIWCTYH-NH2(SEQ ID NO:76)的第4位和第14位的Cys处的分子内二硫键的形成
[化学式168]
Figure BDA0002827785710002611
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:76。
将(63-1)中合成的肽(102mg，47.7μmol)溶解于DMSO(5.00mL)，加入2M NH3-MeOH(47.7μL，95.4μmol)、过氧化氢水溶液(97.4μL，954μmol)，在室温下进行20小时搅拌。向反应溶液中加入2M三氟乙酸水溶液停止反应，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽(51.0mg，23.9μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝4 533.90[M+3H]3+
(63-3)二硫连接体与肽的偶联
[化学式169]
Figure BDA0002827785710002612
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:76。
将(63-2)中合成的Ac-RGNCNYHKGQIIWCTYH-NH2(SEQ ID NO:76)(51.0mg，23.9μmol，其中，第4位和第14位的2个半胱氨酸分别在分子内形成二硫键)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(0.40mL)，加入将3,3'-二硫代二丙酸二(N-琥珀酰亚胺酯)(193mg，478μmol)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(1.00mL)而得的溶液，室温下搅拌24小时。将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽二硫连接体偶联物-NHS活化体(19.5mg，8.05mol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 808.15[M+3H]3+
HPLC纯度:100％
(63-4)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰和基于ESI-TOFMS的分析
将(63-3)中合成的肽二硫连接体偶联物-NHS活化体溶解于N,N'-二甲基甲酰胺成为21.6mM。使500μg的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗(中外制药株式会社)溶解于46.9μL的60mM的乙酸钠缓冲液(pH 4.7)，加入4.7μL的21.6mM的肽试剂(相对于抗体为30当量)，室温下搅拌1小时。将反应液置换为100mM柠檬酸钠缓冲液(pH 2.9)而使反应停止，进而置换为20mM的PBS缓冲液。通过ESI-TOFMS测定质量时，引入了1个结合性肽的产物在150530观测到峰，引入了2个结合性肽的产物在152839确认到峰。
(63-5)曲妥珠单抗的特异性修饰体的还原条件下的基于ESI-TOFMS分析的重链选择性的确认
向(63-4)中生成的抗体-肽复合物中加入5μL的7mM的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐溶液(相对于抗体为等量)，室温下搅拌20分钟。通过ESI-TOFMS测定质量时，关于原料的曲妥珠单抗，在50595、50756观测到重链峰，并在23439观测到轻链峰；关于产物，在重链中引入了硫代丙酰基在50682、50845观测到峰，并且与原料同样在23439观测到轻链峰。
(63-6)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析
通过HIC对(63-4)中生成的抗体-肽复合物和原料的抗体进行了分析。柱使用了Protein-Pak Hi Res HIC柱(沃特世公司)4.6×100mm 2.5μm。使用A_Buffer:0.1M PiNa,2.3M(NH4)2SO4,pH7.0、B_Buffer:0.1M PiNa,pH7.0，流速为0.6mL/分钟，梯度设为A 60％B40％→A0％B 100％、16分钟(数据采集20分钟)，柱温为40℃，恒温器温度为40℃，检测器用280nm的波长进行了检测。
对于样品，按照以下的条件进行反应。
a:曲妥珠单抗原料；
b:曲妥珠单抗+肽二硫连接体偶联物-NHS活化体30当量。
保留时间10.8348分钟被认为是引入了1个肽的化合物，11.5379分钟被认为是引入了2个肽的化合物(图71)。
(63-7)曲妥珠单抗-肽复合物的连接体切割和再氧化
通过实施例3的(3-1)记载的方法进行(63-4)中得到的抗体-肽复合物的连接体切割和再氧化，就可获得对EU numbering中的Lys246及Lys248区域选择性地引入了硫代丙酰基的抗体。
[实施例64：具有针对可溶性蛋白质的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物(肽二硫连接体偶联物-NHS活化体)的合成、以及使用该化合物的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的修饰及其分析]
(64-1)IgG1 Fc结合性肽的合成
通过与实施例1(1-1)同样的方法合成了Ac-RGNCEYHKGQIIWCTYH-NH2(SEQ ID NO:77)的肽，并进行纯化，获得了目标物(77.7mg，36.1μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝4 538.20[M+3H]3+
(64-2)Ac-RGNCEYHKGQIIWCTYH-NH2(SEQ ID NO:77)的第4位和第14位的Cys处的分子内二硫键的形成
[化学式170]
Figure BDA0002827785710002631
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:77。
将(64-1)中合成的肽(77.7mg，36.1μmol)溶解于DMSO(5.00mL)，加入2M NH3-MeOH(36.1μL，72.2μmol)、过氧化氢水溶液(73.7μL，722μmol)，在室温下进行20小时搅拌。向反应溶液中加入2M三氟乙酸水溶液停止反应，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽(47.5mg，22.1μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝4 537.70[M+3H]3+
(64-3)二硫连接体与肽的偶联
[化学式171]
Figure BDA0002827785710002641
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:77。
将(64-2)中合成的Ac-RGNCEYHKGQIIWCTYH-NH2(SEQ ID NO:77)(47.5mg，22.1μmol，其中，第4位和第14位的2个半胱氨酸分别在分子内形成二硫键)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(0.40mL)，加入将3,3'-二硫代二丙酸二(N-琥珀酰亚胺酯)(179mg，442μmol)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(0.60mL)而得的溶液，室温下搅拌24小时。将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽二硫连接体偶联物-NHS活化体(20.0mg，8.21mol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 813.15[M+3H]3+
HPLC纯度:83％
(64-4)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰和基于ESI-TOFMS的分析
将(64-3)中合成的肽二硫连接体偶联物-NHS活化体溶解于N,N'-二甲基甲酰胺成为21.6mM。使500μg的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗(中外制药株式会社)溶解于46.9μL的60mM的乙酸钠缓冲液(pH 4.7)，加入4.7μL的21.6mM的肽试剂(相对于抗体为30当量)，室温下搅拌1小时。将反应液置换为100mM柠檬酸钠缓冲液(pH 2.9)而使反应停止，进而置换为20mM的PBS缓冲液。通过ESI-TOFMS测定质量时，原料的曲妥珠单抗在148073观测到峰，引入了1个结合性肽的产物在150667观测到峰，引入了2个结合性肽的产物在153031确认到峰。
(64-5)曲妥珠单抗的特异性修饰体的还原条件下的基于ESI-TOFMS分析的重链选择性的确认
向(64-4)中生成的抗体-肽复合物中加入5μL的7mM的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐溶液(相对于抗体为等量)，室温下搅拌20分钟。通过ESI-TOFMS测定质量时，关于原料的曲妥珠单抗，在50595、50756观测到重链峰，并在23439观测到轻链峰；关于产物，在重链中引入了硫代丙酰基在50682、50844观测到峰，并且与原料同样在23439观测到轻链峰。
(64-6)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析
通过HIC对(64-4)中生成的抗体-肽复合物和原料的抗体进行了分析。柱使用了Protein-Pak Hi Res HIC柱(沃特世公司)4.6×100mm 2.5μm。使用A_Buffer:0.1M PiNa,2.3M(NH4)2SO4,pH7.0、B_Buffer:0.1M PiNa,pH7.0，流速为0.6mL/分钟，梯度设为A 60％B40％→A0％B 100％、16分钟(数据采集20分钟)，柱温为40℃，恒温器温度为40℃，检测器用280nm的波长进行了检测。
对于样品，按照以下的条件进行反应。
a:曲妥珠单抗原料；
b:曲妥珠单抗+肽二硫连接体偶联物-NHS活化体30当量。
保留时间10.9760分钟被认为是引入了1个肽的化合物，11.7317分钟被认为是引入了2个肽的化合物(图72)。
(64-7)曲妥珠单抗-肽复合物的连接体切割和再氧化
通过实施例3的(3-1)记载的方法进行(64-4)中得到的抗体-肽复合物的连接体切割和再氧化，就可获得对EU numbering中的Lys246及Lys248区域选择性地引入了硫代丙酰基的抗体。
[实施例65：具有针对可溶性蛋白质的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物(肽二硫连接体偶联物-NHS活化体)的合成、以及使用该化合物的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的修饰及其分析]
(65-1)IgG1 Fc结合性肽的合成
通过与实施例1(1-1)同样的方法合成了Ac-RGNCFYHKGQIIWCTYH-NH2(SEQ ID NO:78)的肽，并进行纯化，获得了目标物(61.9mg，28.6μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝4 542.85[M+3H]3+
(65-2)Ac-RGNCFYHKGQIIWCTYH-NH2(SEQ ID NO:78)的第4位和第14位的Cys处的分子内二硫键的形成
[化学式172]
Figure BDA0002827785710002661
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:78。
将(65-1)中合成的肽(61.9mg，28.6μmol)溶解于DMSO(5.00mL)，加入2M NH3-MeOH(28.6μL，57.2μmol)、过氧化氢水溶液(58.4μL，572μmol)，在室温下进行20小时搅拌。向反应溶液中加入2M三氟乙酸水溶液停止反应，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽(30.2mg，13.9μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝4 542.35[M+3H]3+
(65-3)二硫连接体与肽的偶联
[化学式173]
Figure BDA0002827785710002662
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:78。
将(65-2)中合成的Ac-RGNCFYHKGQIIWCTYH-NH2(SEQ ID NO:78)(30.2mg，13.9μmol，其中，第4位和第14位的2个半胱氨酸分别在分子内形成二硫键)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(0.40mL)，加入将3,3'-二硫代二丙酸二(N-琥珀酰亚胺酯)(112mg，278μmol)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(0.60mL)而得的溶液，室温下搅拌24小时。将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽二硫连接体偶联物-NHS活化体(12.0mg，4.89mol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 819.05[M+3H]3+
HPLC纯度:78％
(65-4)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰和基于ESI-TOFMS的分析
将(65-3)中合成的肽二硫连接体偶联物-NHS活化体溶解于N,N'-二甲基甲酰胺成为21.6mM。使500μg的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗(中外制药株式会社)溶解于46.9μL的60mM的乙酸钠缓冲液(pH 4.7)，加入4.7μL的21.6mM的肽试剂(相对于抗体为30当量)，室温下搅拌1小时。将反应液置换为100mM柠檬酸钠缓冲液(pH 2.9)而使反应停止，进而置换为20mM的PBS缓冲液。通过ESI-TOFMS测定质量时，原料的曲妥珠单抗在148164观测到峰，引入了1个结合性肽的产物在150725观测到峰，引入了2个结合性肽的产物在153072确认到峰。
(65-5)曲妥珠单抗的特异性修饰体的还原条件下的基于ESI-TOFMS分析的重链选择性的确认
向(65-4)中生成的抗体-肽复合物中加入5μL的7mM的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐溶液(相对于抗体为等量)，室温下搅拌20分钟。通过ESI-TOFMS测定质量时，关于原料的曲妥珠单抗，在50595、50756观测到重链峰，并在23439观测到轻链峰；关于产物，在重链中引入了硫代丙酰基在50678、50845观测到峰，并且与原料同样在23439观测到轻链峰。
(65-6)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析
通过HIC对(65-4)中生成的抗体-肽复合物和原料的抗体进行了分析。柱使用了Protein-Pak Hi Res HIC柱(沃特世公司)4.6×100mm 2.5μm。使用A_Buffer:0.1M PiNa,2.3M(NH4)2SO4,pH7.0、B_Buffer:0.1M PiNa,pH7.0，流速为0.6mL/分钟，梯度设为A 60％B40％→A0％B 100％、16分钟(数据采集20分钟)，柱温为40℃，恒温器温度为40℃，检测器用280nm的波长进行了检测。
对于样品，按照以下的条件进行反应。
a:曲妥珠单抗原料；
b:曲妥珠单抗+肽二硫连接体偶联物-NHS活化体30当量。
保留时间9.9298分钟被认为是曲妥珠单抗原料，10.8757分钟被认为是引入了1个肽的化合物，11.6875分钟被认为是引入了2个肽的化合物(图73)。
(65-7)曲妥珠单抗-肽复合物的连接体切割和再氧化
通过实施例3的(3-1)记载的方法进行(65-4)中得到的抗体-肽复合物的连接体切割和再氧化，就可获得对EU numbering中的Lys246及Lys248区域选择性地引入了硫代丙酰基的抗体。
[实施例66：具有针对可溶性蛋白质的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物(肽二硫连接体偶联物-NHS活化体)的合成、以及使用该化合物的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的修饰及其分析]
(66-1)IgG1 Fc结合性肽的合成
通过与实施例1(1-1)同样的方法合成了Ac-RGNCAYHKGEIIWCTYH-NH2(SEQ ID NO:79)的肽，并进行纯化，获得了目标物(82.3mg，39.3μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝4 523.90[M+3H]3+
(66-2)Ac-RGNCAYHKGEIIWCTYH-NH2(SEQ ID NO:79)的第4位和第14位的Cys处的分子内二硫键的形成
[化学式174]
Figure BDA0002827785710002681
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:79。
将(66-1)中合成的肽(82.3mg，39.3μmol)溶解于DMSO(5.00mL)，加入2M NH3-MeOH(39.3μL，78.6μmol)、过氧化氢水溶液(80.3μL，786μmol)，在室温下进行20小时搅拌。向反应溶液中加入2M三氟乙酸水溶液停止反应，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽(48.7mg，23.3μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝4 523.60[M+3H]3+
(66-3)二硫连接体与肽的偶联
[化学式175]
Figure BDA0002827785710002691
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:79。
将(66-2)中合成的Ac-RGNCAYHKGEIIWCTYH-NH2(SEQ ID NO:79)(48.7mg，23.3μmol，其中，第4位和第14位的2个半胱氨酸分别在分子内形成二硫键)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(0.40mL)，加入将3,3'-二硫代二丙酸二(N-琥珀酰亚胺酯)(188mg，466μmol)溶解于乙腈(0.60mL)而得的溶液，室温下搅拌24小时。将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽二硫连接体偶联物-NHS活化体(18.0mg，7.56mol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 794.10[M+3H]3+
HPLC纯度:88％
(66-4)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰和基于ESI-TOFMS的分析
将(66-3)中合成的肽二硫连接体偶联物-NHS活化体溶解于N,N'-二甲基甲酰胺成为21.6mM。使500μg的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗(中外制药株式会社)溶解于46.9μL的60mM的乙酸钠缓冲液(pH 4.7)，加入4.7μL的21.6mM的肽试剂(相对于抗体为30当量)，室温下搅拌1小时。将反应液置换为100mM柠檬酸钠缓冲液(pH 2.9)而使反应停止，进而置换为20mM的PBS缓冲液。通过ESI-TOFMS测定质量时，引入了2个结合性肽的产物在152753确认到峰。
(66-5)曲妥珠单抗的特异性修饰体的还原条件下的基于ESI-TOFMS分析的重链选择性的确认
向(66-4)中生成的抗体-肽复合物中加入5μL的7mM的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐溶液(相对于抗体为等量)，室温下搅拌20分钟。通过ESI-TOFMS测定质量时，关于原料的曲妥珠单抗，在50594、50756观测到重链峰，并在23439观测到轻链峰；关于产物，在重链中引入了硫代丙酰基在50682、50844观测到峰，并且与原料同样在23439观测到轻链峰。
(66-6)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析
通过HIC对(66-4)中生成的抗体-肽复合物和原料的抗体进行了分析。柱使用了Protein-Pak Hi Res HIC柱(沃特世公司)4.6×100mm 2.5μm。使用A_Buffer:0.1M PiNa,2.3M(NH4)2SO4,pH7.0、B_Buffer:0.1M PiNa,pH7.0，流速为0.6mL/分钟，梯度设为A 60％B40％→A0％B 100％、16分钟(数据采集20分钟)，柱温为40℃，恒温器温度为40℃，检测器用280nm的波长进行了检测。
对于样品，按照以下的条件进行反应。
a:曲妥珠单抗原料；
b:曲妥珠单抗+肽二硫连接体偶联物-NHS活化体30当量。
保留时间11.4119分钟被认为是引入了2个肽的化合物(图74)。
(66-7)曲妥珠单抗-肽复合物的连接体切割和再氧化
通过实施例3的(3-1)记载的方法进行(66-4)中得到的抗体-肽复合物的连接体切割和再氧化，就可获得对EU numbering中的Lys246及Lys248区域选择性地引入了硫代丙酰基的抗体。
[实施例67：具有针对可溶性蛋白质的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物(肽二硫连接体偶联物-NHS活化体)的合成、以及使用该化合物的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的修饰及其分析]
(67-1)IgG1 Fc结合性肽的合成
通过与实施例1(1-1)同样的方法合成了Ac-RGNCAYHKGNIIWCTYH-NH2(SEQ ID NO:80)的肽，并进行纯化，获得了目标物(85.2mg，41.0μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝4 520.35[M+3H]3+
(67-2)Ac-RGNCAYHKGNIIWCTYH-NH2(SEQ ID NO:80)的第4位和第14位的Cys处的分子内二硫键的形成
[化学式176]
Figure BDA0002827785710002701
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:80。
将(67-1)中合成的肽(85.2mg，41.0μmol)溶解于DMSO(5.00mL)，加入2M NH3-MeOH(41.0μL，82.0μmol)、过氧化氢水溶液(83.8μL，820μmol)，在室温下进行20小时搅拌。向反应溶液中加入2M三氟乙酸水溶液停止反应，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽(100mg，48.2μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝4 519.65[M+3H]3+
(67-3)二硫连接体与肽的偶联
[化学式177]
Figure BDA0002827785710002711
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:80。
将(67-2)中合成的Ac-RGNCAYHKGNIIWCTYH-NH2(SEQ ID NO:80)(100mg，48.2μmol，其中，第4位和第14位的2个半胱氨酸分别在分子内形成二硫键)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(0.60mL)，加入将3,3'-二硫代二丙酸二(N-琥珀酰亚胺酯)(390mg，964μmol)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(1.20mL)而得的溶液，室温下搅拌24小时。将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽二硫连接体偶联物-NHS活化体(18.5mg，7.82mol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 789.20[M+3H]3+
HPLC纯度:89％
(67-4)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰和基于ESI-TOFMS的分析
将(67-3)中合成的肽二硫连接体偶联物-NHS活化体溶解于N,N'-二甲基甲酰胺成为21.6mM。使500μg的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗(中外制药株式会社)溶解于46.9μL的60mM的乙酸钠缓冲液(pH 4.7)，加入4.7μL的21.6mM的肽试剂(相对于抗体为30当量)，室温下搅拌1小时。将反应液置换为100mM柠檬酸钠缓冲液(pH 2.9)而使反应停止，进而置换为20mM的PBS缓冲液。通过ESI-TOFMS测定质量时，引入了2个结合性肽的产物在152886确认到峰。
(67-5)曲妥珠单抗的特异性修饰体的还原条件下的基于ESI-TOFMS分析的重链选择性的确认
向(67-4)中生成的抗体-肽复合物中加入5μL的7mM的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐溶液(相对于抗体为等量)，室温下搅拌20分钟。通过ESI-TOFMS测定质量时，关于原料的曲妥珠单抗，在50594、50756观测到重链峰，并在23439观测到轻链峰；关于产物，在重链中引入了硫代丙酰基在50682、50844观测到峰，并且与原料同样在23439观测到轻链峰。
(67-6)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析
通过HIC对(67-4)中生成的抗体-肽复合物和原料的抗体进行了分析。柱使用了Protein-Pak Hi Res HIC柱(沃特世公司)4.6×100mm 2.5μm。使用A_Buffer:0.1M PiNa,2.3M(NH4)2SO4,pH7.0、B_Buffer:0.1M PiNa,pH7.0，流速为0.6mL/分钟，梯度设为A 60％B40％→A0％B 100％、16分钟(数据采集20分钟)，柱温为40℃，恒温器温度为40℃，检测器用280nm的波长进行了检测。
对于样品，按照以下的条件进行反应。
a:曲妥珠单抗原料；
b:曲妥珠单抗+肽二硫连接体偶联物-NHS活化体30当量。
保留时间11.5382分钟被认为是引入了2个肽的化合物(图75)。
(67-7)曲妥珠单抗-肽复合物的连接体切割和再氧化
通过实施例3的(3-1)记载的方法进行(67-4)中得到的抗体-肽复合物的连接体切割和再氧化，就可获得对EU numbering中的Lys246及Lys248区域选择性地引入了硫代丙酰基的抗体。
[实施例68：具有针对可溶性蛋白质的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物(肽二硫连接体偶联物-NHS活化体)的合成、以及使用该化合物的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的修饰及其分析]
(68-1)IgG1 Fc结合性肽的合成
通过与实施例1(1-1)同样的方法合成了Ac-RGNCAYHKGPIIWCTYH-NH2(SEQ ID NO:81)的肽，并进行纯化，获得了目标物(86.8mg，42.1μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝4 516.10[M+3H]3+
(68-2)Ac-RGNCAYHKGPIIWCTYH-NH2(SEQ ID NO:81)的第4位和第14位的Cys处的分子内二硫键的形成
[化学式178]
Figure BDA0002827785710002731
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:81。
将(68-1)中合成的肽(86.8mg，42.1μmol)溶解于DMSO(5.00mL)，加入2M NH3-MeOH(42.1μL，84.2μmol)、过氧化氢水溶液(86.0μL，842μmol)，在室温下进行20小时搅拌。向反应溶液中加入2M三氟乙酸水溶液停止反应，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽(44.1mg，21.4μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝4 515.55[M+3H]3+
(68-3)二硫连接体与肽的偶联
[化学式179]
Figure BDA0002827785710002732
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:81。
将(68-2)中合成的Ac-RGNCAYHKGPIIWCTYH-NH2(SEQ ID NO:81)(44.1mg，21.4μmol，其中，第4位和第14位的2个半胱氨酸分别在分子内形成二硫键)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(0.40mL)，加入将3,3'-二硫代二丙酸二(N-琥珀酰亚胺酯)(173mg，428μmol)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(0.60mL)而得的溶液，室温下搅拌24小时。将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽二硫连接体偶联物-NHS活化体(12.5mg，5.32mol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 783.40[M+3H]3+
HPLC纯度:89％
(68-4)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰和基于ESI-TOFMS的分析
将(68-3)中合成的肽二硫连接体偶联物-NHS活化体溶解于N,N'-二甲基甲酰胺成为21.6mM。使500μg的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗(中外制药株式会社)溶解于46.9μL的60mM的乙酸钠缓冲液(pH 4.7)，加入4.7μL的21.6mM的肽试剂(相对于抗体为30当量)，室温下搅拌1小时。将反应液置换为100mM柠檬酸钠缓冲液(pH 2.9)而使反应停止，进而置换为20mM的PBS缓冲液。通过ESI-TOFMS测定质量时，原料的曲妥珠单抗在148394观测到峰。
(68-5)曲妥珠单抗的特异性修饰体的还原条件下的基于ESI-TOFMS分析的重链选择性的确认
向(68-4)中生成的抗体-肽复合物中加入5μL的7mM的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐溶液(相对于抗体为等量)，室温下搅拌20分钟。通过ESI-TOFMS测定质量时，关于原料的曲妥珠单抗，在50594、50756观测到重链峰，并在23439观测到轻链峰；关于产物，与原料同样在50594、50756观测到重链峰，并在23439观测到轻链峰。
(68-6)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析
通过HIC对(68-4)中生成的抗体-肽复合物和原料的抗体进行了分析。柱使用了Protein-Pak Hi Res HIC柱(沃特世公司)4.6×100mm 2.5μm。使用A_Buffer:0.1M PiNa,2.3M(NH4)2SO4,pH7.0、B_Buffer:0.1M PiNa,pH7.0，流速为0.6mL/分钟，梯度设为A 60％B40％→A0％B 100％、16分钟(数据采集20分钟)，柱温为40℃，恒温器温度为40℃，检测器用280nm的波长进行了检测。
对于样品，按照以下的条件进行反应。
a:曲妥珠单抗原料；
b:曲妥珠单抗+肽二硫连接体偶联物-NHS活化体30当量。
保留时间9.9216分钟被认为是曲妥珠单抗原料(图76)。
(68-7)曲妥珠单抗-肽复合物的连接体切割和再氧化
通过实施例3的(3-1)记载的方法进行(68-4)中得到的抗体-肽复合物的连接体切割和再氧化，就可获得对EU numbering中的Lys246及Lys248区域选择性地引入了硫代丙酰基的抗体。
[实施例69：具有针对可溶性蛋白质的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物(肽二硫连接体偶联物-NHS活化体)的合成、以及使用该化合物的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的修饰及其分析]
(69-1)IgG1 Fc结合性肽的合成
通过与实施例1(1-1)同样的方法合成了Ac-RGNCAYHKGGIIWCTYH-NH2(SEQ ID NO:82)的肽，并进行纯化，获得了目标物(68.9mg，34.1μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝4 506.00[M+3H]3+
(69-2)Ac-RGNCAYHKGGIIWCTYH-NH2(SEQ ID NO:82)的第4位和第14位的Cys处的分子内二硫键的形成
[化学式180]
Figure BDA0002827785710002751
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:82。
将(69-1)中合成的肽(68.9mg，34.1μmol)溶解于DMSO(5.00mL)，加入2M NH3-MeOH(34.1μL，68.2μmol)、过氧化氢水溶液(69.7μL，682μmol)，在室温下进行20小时搅拌。向反应溶液中加入2M三氟乙酸水溶液停止反应，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽(34.6mg，17.1μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝4 506.00[M+3H]3+
(69-3)二硫连接体与肽的偶联
[化学式181]
Figure BDA0002827785710002761
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:82。
将(69-2)中合成的Ac-RGNCAYHKGGIIWCTYH-NH2(SEQ ID NO:82)(34.6mg，17.1μmol，其中，第4位和第14位的2个半胱氨酸分别在分子内形成二硫键)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(0.40mL)，加入将3,3'-二硫代二丙酸二(N-琥珀酰亚胺酯)(138mg，342μmol)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(0.60mL)而得的溶液，室温下搅拌24小时。将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽二硫连接体偶联物-NHS活化体(10.5mg，4.55mol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 770.15[M+3H]3+
HPLC纯度:91％
(69-4)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰和基于ESI-TOFMS的分析
将(69-3)中合成的肽二硫连接体偶联物-NHS活化体溶解于N,N'-二甲基甲酰胺成为21.6mM。使500μg的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗(中外制药株式会社)溶解于46.9μL的60mM的乙酸钠缓冲液(pH 4.7)，加入4.7μL的21.6mM的肽试剂(相对于抗体为30当量)，室温下搅拌1小时。将反应液置换为100mM柠檬酸钠缓冲液(pH 2.9)而使反应停止，进而置换为20mM的PBS缓冲液。通过ESI-TOFMS测定质量时，引入了1个结合性肽的产物在150075观测到峰，引入了2个结合性肽的产物在152612确认到峰。
(69-5)曲妥珠单抗的特异性修饰体的还原条件下的基于ESI-TOFMS分析的重链选择性的确认
向(69-4)中生成的抗体-肽复合物中加入5μL的7mM的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐溶液(相对于抗体为等量)，室温下搅拌20分钟。通过ESI-TOFMS测定质量时，关于原料的曲妥珠单抗，在50594、50757观测到重链峰，并在23439观测到轻链峰；关于产物，在重链中引入了硫代丙酰基在50683、50845观测到峰，并与原料同样在23439观测到轻链峰。
(69-6)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析
通过HIC对(69-4)中生成的抗体-肽复合物和原料的抗体进行了分析。柱使用了Protein-Pak Hi Res HIC柱(沃特世公司)4.6×100mm 2.5μm。使用A_Buffer:0.1M PiNa,2.3M(NH4)2SO4,pH7.0、B_Buffer:0.1M PiNa,pH7.0，流速为0.6mL/分钟，梯度设为A 60％B40％→A0％B 100％、16分钟(数据采集20分钟)，柱温为40℃，恒温器温度为40℃，检测器用280nm的波长进行了检测。
对于样品，按照以下的条件进行反应。
a:曲妥珠单抗原料；
b:曲妥珠单抗+肽二硫连接体偶联物-NHS活化体30当量。
保留时间11.2073分钟被认为是引入了1个肽的化合物，12.1181分钟被认为是引入了2个肽的化合物(图77)。
(69-7)曲妥珠单抗-肽复合物的连接体切割和再氧化
通过实施例3的(3-1)记载的方法进行(69-4)中得到的抗体-肽复合物的连接体切割和再氧化，就可获得对EU numbering中的Lys246及Lys248区域选择性地引入了硫代丙酰基的抗体。
[实施例70：具有针对可溶性蛋白质的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物(肽二硫连接体偶联物-NHS活化体)的合成、以及使用该化合物的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的修饰及其分析]
(70-1)IgG1 Fc结合性肽的合成
通过与实施例1(1-1)同样的方法合成了Ac-RGNCAYHKGDIIWCTYH-NH2(SEQ ID NO:83)的肽，并进行纯化，获得了目标物(78.1mg，37.6μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝4 520.65[M+3H]3+
(70-2)Ac-RGNCAYHKGDIIWCTYH-NH2(SEQ ID NO:83)的第4位和第14位的Cys处的分子内二硫键的形成
[化学式182]
Figure BDA0002827785710002781
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:83。
将(70-1)中合成的肽(78.2mg，37.6μmol)溶解于DMSO(5.00mL)，加入2M NH3-MeOH(37.6μL，75.2μmol)、过氧化氢水溶液(76.8μL，752μmol)，在室温下进行20小时搅拌。向反应溶液中加入2M三氟乙酸水溶液停止反应，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽(38.8mg，18.7μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝4 520.20[M+3H]3+
(70-3)二硫连接体与肽的偶联
[化学式183]
Figure BDA0002827785710002782
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:83。
将(70-2)中合成的Ac-RGNCAYHKGDIIWCTYH-NH2(SEQ ID NO:83)(38.8mg，18.7μmol，其中，第4位和第14位的2个半胱氨酸分别在分子内形成二硫键)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(0.40mL)，加入将3,3'-二硫代二丙酸二(N-琥珀酰亚胺酯)(151mg，374μmol)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(0.60mL)而得的溶液，室温下搅拌24小时。将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽二硫连接体偶联物-NHS活化体(17.5mg，7.40mol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 789.60[M+3H]3+
HPLC纯度:88％
(70-4)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰和基于ESI-TOFMS的分析
将(70-3)中合成的肽二硫连接体偶联物-NHS活化体溶解于N,N'-二甲基甲酰胺成为21.6mM。使500μg的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗(中外制药株式会社)溶解于46.9μL的60mM的乙酸钠缓冲液(pH 4.7)，加入4.7μL的21.6mM的肽试剂(相对于抗体为30当量)，室温下搅拌1小时。将反应液置换为100mM柠檬酸钠缓冲液(pH 2.9)而使反应停止，进而置换为20mM的PBS缓冲液。通过ESI-TOFMS测定质量时，引入了1个结合性肽的产物在150682观测到峰，引入了2个结合性肽的产物在153085确认到峰。
(70-5)曲妥珠单抗的特异性修饰体的还原条件下的基于ESI-TOFMS分析的重链选择性的确认
向(70-4)中生成的抗体-肽复合物中加入5μL的7mM的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐溶液(相对于抗体为等量)，室温下搅拌20分钟。通过ESI-TOFMS测定质量时，关于原料的曲妥珠单抗，在50594、50757观测到重链峰，并在23439观测到轻链峰；关于产物，在重链中引入了硫代丙酰基在50682、50845观测到峰，并且与原料同样在23439观测到轻链峰。
(70-6)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析
通过HIC对(70-4)中生成的抗体-肽复合物和原料的抗体进行了分析。柱使用了Protein-Pak Hi Res HIC柱(沃特世公司)4.6×100mm 2.5μm。使用A_Buffer:0.1M PiNa,2.3M(NH4)2SO4,pH7.0、B_Buffer:0.1M PiNa,pH7.0，流速为0.6mL/分钟，梯度设为A 60％B40％→A0％B 100％、16分钟(数据采集20分钟)，柱温为40℃，恒温器温度为40℃，检测器用280nm的波长进行了检测。
对于样品，按照以下的条件进行反应。
a:曲妥珠单抗原料；
b:曲妥珠单抗+肽二硫连接体偶联物-NHS活化体30当量。
保留时间10.5729分钟被认为是引入了1个肽的化合物，11.1577分钟被认为是引入了2个肽的化合物(图78)。
(70-7)曲妥珠单抗-肽复合物的连接体切割和再氧化
通过实施例3的(3-1)记载的方法进行(70-4)中得到的抗体-肽复合物的连接体切割和再氧化，就可获得对EU numbering中的Lys246及Lys248区域选择性地引入了硫代丙酰基的抗体。
[实施例71：具有针对可溶性蛋白质的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物(肽二硫连接体偶联物-NHS活化体)的合成、以及使用该化合物的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的修饰及其分析]
(71-1)IgG1 Fc结合性肽的合成
通过与实施例1(1-1)同样的方法合成了Ac-RGNCAYHKGRIIWCTYH-NH2(SEQ ID NO:84)的肽，并进行纯化，获得了目标物(70.1mg，33.1μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝4 530.75[M+3H]3+
(71-2)Ac-RGNCAYHKGRIIWCTYH-NH2(SEQ ID NO:84)的第4位和第14位的Cys处的分子内二硫键的形成
[化学式184]
Figure BDA0002827785710002801
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:84。
将(71-1)中合成的肽(70.1mg，33.1μmol)溶解于DMSO(5.00mL)，加入2M NH3-MeOH(33.1μL，66.2μmol)、过氧化氢水溶液(67.6μL，662μmol)，在室温下进行20小时搅拌。向反应溶液中加入2M三氟乙酸水溶液停止反应，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽(36.8mg，17.4μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝4 530.40[M+3H]3+
(71-3)二硫连接体与肽的偶联
[化学式185]
Figure BDA0002827785710002811
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:84。
将(71-2)中合成的Ac-RGNCAYHKGRIIWCTYH-NH2(SEQ ID NO:84)(36.8mg，17.4μmol，其中，第4位和第14位的2个半胱氨酸分别在分子内形成二硫键)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(0.40mL)，加入将3,3'-二硫代二丙酸二(N-琥珀酰亚胺酯)(141mg，348μmol)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(0.60mL)而得的溶液，室温下搅拌24小时。将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽二硫连接体偶联物-NHS活化体(6.90mg，2.87mol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 803.10[M+3H]3+
HPLC纯度:81％
(71-4)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰和基于ESI-TOFMS的分析
将(71-3)中合成的肽二硫连接体偶联物-NHS活化体溶解于N,N'-二甲基甲酰胺成为21.6mM。使500μg的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗(中外制药株式会社)溶解于46.9μL的60mM的乙酸钠缓冲液(pH 4.7)，加入4.7μL的21.6mM的肽试剂(相对于抗体为30当量)，室温下搅拌1小时。将反应液置换为100mM柠檬酸钠缓冲液(pH 2.9)而使反应停止，进而置换为20mM的PBS缓冲液。通过ESI-TOFMS测定质量时，引入了1个结合性肽的产物在150674观测到峰，引入了2个结合性肽的产物在153338确认到峰。
(71-5)曲妥珠单抗的特异性修饰体的还原条件下的基于ESI-TOFMS分析的重链选择性的确认
向(71-4)中生成的抗体-肽复合物中加入5μL的7mM的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐溶液(相对于抗体为等量)，室温下搅拌20分钟。通过ESI-TOFMS测定质量时，关于原料的曲妥珠单抗，在50594、50757观测到重链峰，并在23439观测到轻链峰；关于产物，在重链中引入了硫代丙酰基在50682、50844观测到峰，并且与原料同样在23439观测到轻链峰。
(71-6)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析
通过HIC对(71-4)中生成的抗体-肽复合物和原料的抗体进行了分析。柱使用了Protein-Pak Hi Res HIC柱(沃特世公司)4.6×100mm 2.5μm。使用A_Buffer:0.1M PiNa,2.3M(NH4)2SO4,pH7.0、B_Buffer:0.1M PiNa,pH7.0，流速为0.6mL/分钟，梯度设为A 60％B40％→A0％B 100％、16分钟(数据采集20分钟)，柱温为40℃，恒温器温度为40℃，检测器用280nm的波长进行了检测。
对于样品，按照以下的条件进行反应。
a:曲妥珠单抗原料；
b:曲妥珠单抗+肽二硫连接体偶联物-NHS活化体30当量。
保留时间10.7319分钟被认为是引入了1个肽的化合物，11.3816分钟被认为是引入了2个肽的化合物(图79)。
(71-7)曲妥珠单抗-肽复合物的连接体切割和再氧化
通过实施例3的(3-1)记载的方法进行(71-4)中得到的抗体-肽复合物的连接体切割和再氧化，就可获得对EU numbering中的Lys246及Lys248区域选择性地引入了硫代丙酰基的抗体。
[实施例72：具有针对可溶性蛋白质的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物(肽二硫连接体偶联物-NHS活化体)的合成、以及使用该化合物的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的修饰及其分析]
(72-1)IgG1 Fc结合性肽的合成
通过与实施例1(1-1)同样的方法合成了Ac-RGNCAYHKGFIIWCTYH-NH2(SEQ ID NO:85)的肽，并进行纯化，获得了目标物(61.2mg，29.0μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝4 528.65[M+3H]3+
(72-2)Ac-RGNCAYHKGFIIWCTYH-NH2(SEQ ID NO:85)的第4位和第14位的Cys处的分子内二硫键的形成
[化学式186]
Figure BDA0002827785710002831
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:85。
将(72-1)中合成的肽(61.2mg，29.0μmol)溶解于DMSO(5.00mL)，加入2M NH3-MeOH(29.0μL，58.0μmol)、过氧化氢水溶液(59.2μL，580μmol)，在室温下进行20小时搅拌。向反应溶液中加入2M三氟乙酸水溶液停止反应，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽(33.3mg，15.8μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝4 528.00[M+3H]3+
(72-3)二硫连接体与肽的偶联
[化学式187]
Figure BDA0002827785710002832
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:85。
将(72-2)中合成的Ac-RGNCAYHKGFIIWCTYH-NH2(SEQ ID NO:85)(33.3mg，15.8μmol，其中，第4位和第14位的2个半胱氨酸分别在分子内形成二硫键)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(0.40mL)，加入将3,3'-二硫代二丙酸二(N-琥珀酰亚胺酯)(128mg，316μmol)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(0.60mL)而得的溶液，室温下搅拌24小时。将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽二硫连接体偶联物-NHS活化体(14.0mg，5.84mol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 800.20[M+3H]3+
HPLC纯度:83％
(72-4)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰和基于ESI-TOFMS的分析
将(72-3)中合成的肽二硫连接体偶联物-NHS活化体溶解于N,N'-二甲基甲酰胺成为21.6mM。使500μg的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗(中外制药株式会社)溶解于46.9μL的60mM的乙酸钠缓冲液(pH 4.7)，加入4.7μL的21.6mM的肽试剂(相对于抗体为30当量)，室温下搅拌1小时。将反应液置换为100mM柠檬酸钠缓冲液(pH 2.9)而使反应停止，进而置换为20mM的PBS缓冲液。通过ESI-TOFMS测定质量时，引入了1个结合性肽的产物在150706观测到峰，引入了2个结合性肽的产物在152979确认到峰。
(72-5)曲妥珠单抗的特异性修饰体的还原条件下的基于ESI-TOFMS分析的重链选择性的确认
向(72-4)中生成的抗体-肽复合物中加入5μL的7mM的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐溶液(相对于抗体为等量)，室温下搅拌20分钟。通过ESI-TOFMS测定质量时，关于原料的曲妥珠单抗，在50594、50757观测到重链峰，并在23439观测到轻链峰；关于产物，在重链中引入了硫代丙酰基在50682、50845观测到峰，并且与原料同样在23439观测到轻链峰。
(72-6)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析
通过HIC对(72-4)中生成的抗体-肽复合物和原料的抗体进行了分析。柱使用了Protein-Pak Hi Res HIC柱(沃特世公司)4.6×100mm 2.5μm。使用A_Buffer:0.1M PiNa,2.3M(NH4)2SO4,pH7.0、B_Buffer:0.1M PiNa,pH7.0，流速为0.6mL/分钟，梯度设为A 60％B40％→A0％B 100％、16分钟(数据采集20分钟)，柱温为40℃，恒温器温度为40℃，检测器用280nm的波长进行了检测。
对于样品，按照以下的条件进行反应。
a:曲妥珠单抗原料；
b:曲妥珠单抗+肽二硫连接体偶联物-NHS活化体30当量。
保留时间9.8295分钟被认为是曲妥珠单抗原料，12.2498分钟被认为是引入了1个肽的化合物，13.1829分钟被认为是引入了2个肽的化合物(图80)。
(72-7)曲妥珠单抗-肽复合物的连接体切割和再氧化
通过实施例3的(3-1)记载的方法进行(72-4)中得到的抗体-肽复合物的连接体切割和再氧化，就可获得对EU numbering中的Lys246及Lys248区域选择性地引入了硫代丙酰基的抗体。
[实施例73：具有针对可溶性蛋白质的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物(肽二硫连接体偶联物-NHS活化体)的合成、以及使用该化合物的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的修饰及其分析]
(73-1)IgG1 Fc结合性肽的合成
通过与实施例1(1-1)同样的方法合成了Ac-RGNCAYHKGHIIWCTYH-NH2(SEQ ID NO:86)的肽，并进行纯化，获得了目标物(94.0mg，44.8μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝4 526.20[M+3H]3+
(73-2)Ac-RGNCAYHKGHIIWCTYH-NH2(SEQ ID NO:86)的第4位和第14位的Cys处的分子内二硫键的形成
[化学式188]
Figure BDA0002827785710002851
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:86。
将(73-1)中合成的肽(94.0mg，44.8μmol)溶解于DMSO(5.00mL)，加入2M NH3-MeOH(44.8μL，89.6μmol)、过氧化氢水溶液(91.5μL，896μmol)，在室温下进行20小时搅拌。向反应溶液中加入2M三氟乙酸水溶液停止反应，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽(56.0mg，26.7μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝4 525.70[M+3H]3+
(73-3)二硫连接体与肽的偶联
[化学式189]
Figure BDA0002827785710002861
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:86。
将(73-2)中合成的Ac-RGNCAYHKGHIIWCTYH-NH2(SEQ ID NO:86)(56.0mg，26.7μmol，其中，第4位和第14位的2个半胱氨酸分别在分子内形成二硫键)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(0.40mL)，加入将3,3'-二硫代二丙酸二(N-琥珀酰亚胺酯)(216mg，534μmol)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(0.60mL)而得的溶液，室温下搅拌24小时。将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽二硫连接体偶联物-NHS活化体(16.8mg，7.04mol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 796.75[M+3H]3+
HPLC纯度:100％
(73-4)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰和基于ESI-TOFMS的分析
将(73-3)中合成的肽二硫连接体偶联物-NHS活化体溶解于N,N'-二甲基甲酰胺成为21.6mM。使500μg的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗(中外制药株式会社)溶解于46.9μL的60mM的乙酸钠缓冲液(pH 4.7)，加入4.7μL的21.6mM的肽试剂(相对于抗体为30当量)，室温下搅拌1小时。将反应液置换为100mM柠檬酸钠缓冲液(pH 2.9)而使反应停止，进而置换为20mM的PBS缓冲液。通过ESI-TOFMS测定质量时，引入了1个结合性肽的产物在150686观测到峰，引入了2个结合性肽的产物在152951确认到峰。
(73-5)曲妥珠单抗的特异性修饰体的还原条件下的基于ESI-TOFMS分析的重链选择性的确认
向(73-4)中生成的抗体-肽复合物中加入5μL的7mM的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐溶液(相对于抗体为等量)，室温下搅拌20分钟。通过ESI-TOFMS测定质量时，关于原料的曲妥珠单抗，在50594、50757观测到重链峰，并在23439观测到轻链峰；关于产物，在重链中引入了硫代丙酰基在50682、50845观测到峰，并且与原料同样在23439观测到轻链峰。
(73-6)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析
通过HIC对(73-4)中生成的抗体-肽复合物和原料的抗体进行了分析。柱使用了Protein-Pak Hi Res HIC柱(沃特世公司)4.6×100mm 2.5μm。使用A_Buffer:0.1M PiNa,2.3M(NH4)2SO4,pH7.0、B_Buffer:0.1M PiNa,pH7.0，流速为0.6mL/分钟，梯度设为A 60％B40％→A0％B 100％、16分钟(数据采集20分钟)，柱温为40℃，恒温器温度为40℃，检测器用280nm的波长进行了检测。
对于样品，按照以下的条件进行反应。
a:曲妥珠单抗原料；
b:曲妥珠单抗+肽二硫连接体偶联物-NHS活化体30当量。
保留时间10.8450分钟被认为是引入了1个肽的化合物，11.5542分钟被认为是引入了2个肽的化合物(图81)。
(73-7)曲妥珠单抗-肽复合物的连接体切割和再氧化
通过实施例3的(3-1)记载的方法进行(73-4)中得到的抗体-肽复合物的连接体切割和再氧化，就可获得对EU numbering中的Lys246及Lys248区域选择性地引入了硫代丙酰基的抗体。
[实施例74：具有针对可溶性蛋白质的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物(肽二硫连接体偶联物-NHS活化体)的合成、以及使用该化合物的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的修饰及其分析]
(74-1)IgG1 Fc结合性肽的合成
通过与实施例1(1-1)同样的方法合成了Ac-DCAYHKGQIIWCT-NH2(SEQ ID NO:87)的肽，并进行纯化，获得了目标物(66.7mg，42.2μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝2 790.20[M+3H]3+
(74-2)Ac-DCAYHKGQIIWCT-NH2(SEQ ID NO:87)的第2位和第12位的Cys处的分子内二硫键的形成
[化学式190]
Figure BDA0002827785710002871
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:87。
将(74-1)中合成的肽(66.7mg，42.2μmol)溶解于DMSO(5.00mL)，加入2M NH3-MeOH(42.2μL，84.4μmol)、过氧化氢水溶液(86.2μL，844μmol)，在室温下进行20小时搅拌。向反应溶液中加入2M三氟乙酸水溶液停止反应，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽(25.0mg，15.9μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝2 788.95[M+3H]3+
(74-3)二硫连接体与肽的偶联
[化学式191]
Figure BDA0002827785710002881
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:87。
将(74-2)中合成的Ac-DCAYHKGQIIWCT-NH2(SEQ ID NO:87)(25.0mg，15.9μmol，其中，第2位和第12位的2个半胱氨酸分别在分子内形成二硫键)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(0.40mL)，加入将3,3'-二硫代二丙酸二(N-琥珀酰亚胺酯)(129mg，318μmol)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(0.60mL)而得的溶液，室温下搅拌24小时。将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽二硫连接体偶联物-NHS活化体(11.0mg，5.89mol)。
MS(ESI)m/z:z＝2 933.80[M+3H]3+
HPLC纯度:92％
(74-4)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰和基于ESI-TOFMS的分析
将(74-3)中合成的肽二硫连接体偶联物-NHS活化体溶解于N,N'-二甲基甲酰胺成为21.6mM。使500μg的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗(中外制药株式会社)溶解于46.9μL的60mM的乙酸钠缓冲液(pH 4.7)，加入4.7μL的21.6mM的肽试剂(相对于抗体为30当量)，室温下搅拌1小时。将反应液置换为100mM柠檬酸钠缓冲液(pH 2.9)而使反应停止，进而置换为20mM的PBS缓冲液。通过ESI-TOFMS测定质量时，引入了1个结合性肽的产物在149462观测到峰，引入了2个结合性肽的产物在152084确认到峰。
(74-5)曲妥珠单抗的特异性修饰体的还原条件下的基于ESI-TOFMS分析的重链选择性的确认
向(74-4)中生成的抗体-肽复合物中加入5μL的7mM的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐溶液(相对于抗体为等量)，室温下搅拌20分钟。通过ESI-TOFMS测定质量时，关于原料的曲妥珠单抗，在50594、50757观测到重链峰，并在23439观测到轻链峰；关于产物，在重链中引入了硫代丙酰基在50682、50845观测到峰，并且与原料同样在23439观测到轻链峰。
(74-6)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析
通过HIC对(74-5)中生成的抗体-肽复合物和原料的抗体进行了分析。柱使用了Protein-Pak Hi Res HIC柱(沃特世公司)4.6×100mm 2.5μm。使用A_Buffer:0.1M PiNa,2.3M(NH4)2SO4,pH7.0、B_Buffer:0.1M PiNa,pH7.0，流速为0.6mL/分钟，梯度设为A 60％B40％→A0％B 100％、16分钟(数据采集20分钟)，柱温为40℃，恒温器温度为40℃，检测器用280nm的波长进行了检测。
对于样品，按照以下的条件进行反应。
a:曲妥珠单抗原料；
b:曲妥珠单抗+肽二硫连接体偶联物-NHS活化体30当量。
保留时间12.0543分钟被认为是引入了1个肽的化合物，13.5009分钟被认为是引入了2个肽的化合物(图82)。
(74-7)曲妥珠单抗-肽复合物的连接体切割和再氧化
通过实施例3的(3-1)记载的方法进行(74-4)中得到的抗体-肽复合物的连接体切割和再氧化，就可获得对EU numbering中的Lys246及Lys248区域选择性地引入了硫代丙酰基的抗体。
[实施例75：具有针对可溶性蛋白质的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物(肽二硫连接体偶联物-NHS活化体)的合成、以及使用该化合物的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的修饰及其分析]
(75-1)IgG1 Fc结合性肽的合成
通过与实施例1(1-1)同样的方法合成了Ac-NCAYHKGQIIWCT-NH2(SEQ IDNO:88)的肽，并进行纯化，获得了目标物(75.1mg，47.6μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝2 789.65[M+3H]3+
(75-2)Ac-NCAYHKGQIIWCT-NH2(SEQ ID NO:88)的第2位和第12位的Cys处的分子内二硫键的形成
[化学式192]
Figure BDA0002827785710002901
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:88。
将(75-1)中合成的肽(75.1mg，47.6μmol)溶解于DMSO(5.00mL)，加入2M NH3-MeOH(47.6μL，95.2μmol)、过氧化氢水溶液(97.2μL，952μmol)，在室温下进行20小时搅拌。向反应溶液中加入2M三氟乙酸水溶液停止反应，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽(27.7mg，17.6μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝2 788.90[M+3H]3+
(75-3)二硫连接体与肽的偶联
[化学式193]
Figure BDA0002827785710002902
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:88。
将(75-2)中合成的Ac-NCAYHKGQIIWCT-NH2(SEQ ID NO:88)(27.7mg，17.6μmol，其中，第2位和第12位的2个半胱氨酸分别在分子内形成二硫键)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(0.40mL)，加入将3,3'-二硫代二丙酸二(N-琥珀酰亚胺酯)(142mg，352μmol)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(0.60mL)而得的溶液，室温下搅拌24小时。将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽二硫连接体偶联物-NHS活化体(10.0mg，5.36mol)。
MS(ESI)m/z:z＝2 933.10[M+3H]3+
HPLC纯度:89％
(75-4)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰和基于ESI-TOFMS的分析
将(75-3)中合成的肽二硫连接体偶联物-NHS活化体溶解于N,N'-二甲基甲酰胺成为21.6mM。使500μg的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗(中外制药株式会社)溶解于46.9μL的60mM的乙酸钠缓冲液(pH 4.7)，加入4.7μL的21.6mM的肽试剂(相对于抗体为30当量)，室温下搅拌1小时。将反应液置换为100mM柠檬酸钠缓冲液(pH 2.9)而使反应停止，进而置换为20mM的PBS缓冲液。通过ESI-TOFMS测定质量时，引入了1个结合性肽的产物在149662观测到峰，引入了2个结合性肽的产物在152266确认到峰。
(75-5)曲妥珠单抗的特异性修饰体的还原条件下的基于ESI-TOFMS分析的重链选择性的确认
向(75-4)中生成的抗体-肽复合物中加入5μL的7mM的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐溶液(相对于抗体为等量)，室温下搅拌20分钟。通过ESI-TOFMS测定质量时，关于原料的曲妥珠单抗，在50594、50757观测到重链峰，并在23439观测到轻链峰；关于产物，在重链中引入了硫代丙酰基在50682、50845观测到峰，并且与原料同样在23439观测到轻链峰。
(75-6)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析
通过HIC对(75-4)中生成的抗体-肽复合物和原料的抗体进行了分析。柱使用了Protein-Pak Hi Res HIC柱(沃特世公司)4.6×100mm 2.5μm。使用A_Buffer:0.1M PiNa,2.3M(NH4)2SO4,pH7.0、B_Buffer:0.1M PiNa,pH7.0，流速为0.6mL/分钟，梯度设为A 60％B40％→A0％B 100％、16分钟(数据采集20分钟)，柱温为40℃，恒温器温度为40℃，检测器用280nm的波长进行了检测。
对于样品，按照以下的条件进行反应。
a:曲妥珠单抗原料；
b:曲妥珠单抗+肽二硫连接体偶联物-NHS活化体30当量。
保留时间11.8807分钟被认为是引入了1个肽的化合物，13.2467分钟被认为是引入了2个肽的化合物(图83)。
(75-7)曲妥珠单抗-肽复合物的连接体切割和再氧化
通过实施例3的(3-1)记载的方法进行(75-4)中得到的抗体-肽复合物的连接体切割和再氧化，就可获得对EU numbering中的Lys246及Lys248区域选择性地引入了硫代丙酰基的抗体。
[实施例76：具有针对可溶性蛋白质的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物(肽二硫连接体偶联物-NHS活化体)的合成、以及使用该化合物的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的修饰及其分析]
(76-1)IgG1 Fc结合性肽的合成
通过与实施例1(1-1)同样的方法合成了Ac-GNCAYHKGQIIWCTY-NH2(SEQ ID NO:89)的肽，并进行纯化，获得了目标物(44.7mg，24.9μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝2 899.70[M+3H]3+
(76-2)Ac-GNCAYHKGQIIWCTY-NH2(SEQ ID NO:89)的第3位和第13位的Cys处的分子内二硫键的形成
[化学式194]
Figure BDA0002827785710002921
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:89。
将(76-1)中合成的肽(44.7mg，24.9μmol)溶解于DMSO(5.00mL)，加入2M NH3-MeOH(24.9μL，49.8μmol)、过氧化氢水溶液(50.9μL，498μmol)，在室温下进行20小时搅拌。向反应溶液中加入2M三氟乙酸水溶液停止反应，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽(20.0mg，11.1μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝2 899.00[M+3H]3+
(76-3)二硫连接体与肽的偶联
[化学式195]
Figure BDA0002827785710002931
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:89。
将(76-2)中合成的Ac-GNCAYHKGQIIWCTY-NH2(SEQ ID NO:89)(20.0mg，11.1μmol，其中，第3位和第13位的2个半胱氨酸分别在分子内形成二硫键)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(0.20mL)，加入将3,3'-二硫代二丙酸二(N-琥珀酰亚胺酯)(90mg，222μmol)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(0.60mL)而得的溶液，室温下搅拌24小时。将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽二硫连接体偶联物-NHS活化体(9.40mg，4.51mol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 696.00[M+3H]3+
HPLC纯度:95％
(76-4)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰和基于ESI-TOFMS的分析
将(76-3)中合成的肽二硫连接体偶联物-NHS活化体溶解于N,N'-二甲基甲酰胺成为21.6mM。使500μg的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗(中外制药株式会社)溶解于46.9μL的60mM的乙酸钠缓冲液(pH 4.7)，加入4.7μL的21.6mM的肽试剂(相对于抗体为30当量)，室温下搅拌1小时。将反应液置换为100mM柠檬酸钠缓冲液(pH 2.9)而使反应停止，进而置换为20mM的PBS缓冲液。通过ESI-TOFMS测定质量时，引入了2个结合性肽的产物在152165确认到峰。
(76-5)曲妥珠单抗的特异性修饰体的还原条件下的基于ESI-TOFMS分析的重链选择性的确认
向(76-4)中生成的抗体-肽复合物中加入5μL的7mM的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐溶液(相对于抗体为等量)，室温下搅拌20分钟。通过ESI-TOFMS测定质量时，关于原料的曲妥珠单抗，在50594、50757观测到重链峰，并在23439观测到轻链峰；关于产物，在重链中引入了硫代丙酰基在50682、50844观测到峰，并且与原料同样在23439观测到轻链峰。
(76-6)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析
通过HIC对(76-4)中生成的抗体-肽复合物和原料的抗体进行了分析。柱使用了Protein-Pak Hi Res HIC柱(沃特世公司)4.6×100mm 2.5μm。使用A_Buffer:0.1M PiNa,2.3M(NH4)2SO4,pH7.0、B_Buffer:0.1M PiNa,pH7.0，流速为0.6mL/分钟，梯度设为A 60％B40％→A0％B 100％、16分钟(数据采集20分钟)，柱温为40℃，恒温器温度为40℃，检测器用280nm的波长进行了检测。
对于样品，按照以下的条件进行反应。
a:曲妥珠单抗原料；
b:曲妥珠单抗+肽二硫连接体偶联物-NHS活化体30当量。
保留时间14.1364分钟被认为是引入了2个肽的化合物(图84)。
(76-7)曲妥珠单抗-肽复合物的连接体切割和再氧化
通过实施例3的(3-1)记载的方法进行(76-4)中得到的抗体-肽复合物的连接体切割和再氧化，就可获得对EU numbering中的Lys246及Lys248区域选择性地引入了硫代丙酰基的抗体。
[实施例77：具有针对可溶性蛋白质的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物(肽二硫连接体偶联物-NHS活化体)的合成、以及使用该化合物的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的修饰及其分析]
(77-1)IgG1 Fc结合性肽的合成
通过与实施例1(1-1)同样的方法合成了Ac-GCAYHKGQIIWCG-NH2(SEQ ID NO:90)的肽，并进行纯化，获得了目标物(53.5mg，36.2μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝2 739.20[M+3H]3+
(77-2)Ac-GCAYHKGQIIWCG-NH2(SEQ ID NO:90)的第2位和第12位的Cys处的分子内二硫键的形成
[化学式196]
Figure BDA0002827785710002941
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:90。
将(77-1)中合成的肽(53.5mg，36.2μmol)溶解于DMSO(5.00mL)，加入2M NH3-MeOH(36.2μL，72.4μmol)、过氧化氢水溶液(74.0μL，724μmol)，在室温下进行20小时搅拌。向反应溶液中加入2M三氟乙酸水溶液停止反应，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽(28.7mg，19.5μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝2 738.20[M+3H]3+
(77-3)二硫连接体与肽的偶联
[化学式197]
Figure BDA0002827785710002951
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:90。
将(77-2)中合成的Ac-GCAYHKGQIIWCG-NH2(SEQ ID NO:90)(28.7mg，19.5μmol，其中，第2位和第12位的2个半胱氨酸分别在分子内形成二硫键)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(0.40mL)，加入将3,3'-二硫代二丙酸二(N-琥珀酰亚胺酯)(158mg，390μmol)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(0.60mL)而得的溶液，室温下搅拌24小时。将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽二硫连接体偶联物-NHS活化体(11.0mg，6.24mol)。
MS(ESI)m/z:z＝2 882.90[M+3H]3+
HPLC纯度:85％
(77-4)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰和基于ESI-TOFMS的分析
将(77-3)中合成的肽二硫连接体偶联物-NHS活化体溶解于N,N'-二甲基甲酰胺成为21.6mM。使500μg的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗(中外制药株式会社)溶解于46.9μL的60mM的乙酸钠缓冲液(pH 4.7)，加入4.7μL的21.6mM的肽试剂(相对于抗体为30当量)，室温下搅拌1小时。将反应液置换为100mM柠檬酸钠缓冲液(pH 2.9)而使反应停止，进而置换为20mM的PBS缓冲液。通过ESI-TOFMS测定质量时，原料的曲妥珠单抗在148398观测到峰，引入了1个结合性肽的产物在149874观测到峰，引入了2个结合性肽的产物在151522确认到峰。
(77-5)曲妥珠单抗的特异性修饰体的还原条件下的基于ESI-TOFMS分析的重链选择性的确认
向(77-4)中生成的抗体-肽复合物中加入5μL的7mM的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐溶液(相对于抗体为等量)，室温下搅拌20分钟。通过ESI-TOFMS测定质量时，关于原料的曲妥珠单抗，在50594、50757观测到重链峰，并在23439观测到轻链峰；关于产物，在重链中引入了硫代丙酰基在50682、50844观测到峰，并且与原料同样在23439观测到轻链峰。
(77-6)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析
通过HIC对(77-4)中生成的抗体-肽复合物和原料的抗体进行了分析。柱使用了Protein-Pak Hi Res HIC柱(沃特世公司)4.6×100mm 2.5μm。使用A_Buffer:0.1M PiNa,2.3M(NH4)2SO4,pH7.0、B_Buffer:0.1M PiNa,pH7.0，流速为0.6mL/分钟，梯度设为A 60％B40％→A0％B 100％、16分钟(数据采集20分钟)，柱温为40℃，恒温器温度为40℃，检测器用280nm的波长进行了检测。
对于样品，按照以下的条件进行反应。
a:曲妥珠单抗原料；
b:曲妥珠单抗+肽二硫连接体偶联物-NHS活化体30当量。
保留时间10.0293分钟被认为是曲妥珠单抗原料，11.9107分钟被认为是引入了1个肽的化合物，13.5054分钟被认为是引入了2个肽的化合物(图85)。
(77-7)曲妥珠单抗-肽复合物的连接体切割和再氧化
通过实施例3的(3-1)记载的方法进行(77-4)中得到的抗体-肽复合物的连接体切割和再氧化，就可获得对EU numbering中的Lys246及Lys248区域选择性地引入了硫代丙酰基的抗体。
[实施例78：具有针对可溶性蛋白质的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物(肽二硫连接体偶联物-NHS活化体)的合成、以及使用该化合物的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的修饰及其分析]
(78-1)IgG1 Fc结合性肽的合成
通过与实施例1(1-1)同样的方法合成了Ac-GGCAYHKGQIIWCGG-NH2(SEQ ID NO:91)的肽，并进行纯化，获得了目标物(16.5mg，10.4μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝2 796.20[M+3H]3+
(78-2)Ac-GGCAYHKGQIIWCGG-NH2(SEQ ID NO:91)的第3位和第13位的Cys的分子内二硫键的形成
[化学式198]
Figure BDA0002827785710002971
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:91。
将(78-1)中合成的肽(16.5mg，10.4μmol)溶解于DMSO(5.00mL)，加入2M NH3-MeOH(10.4μL，20.8μmol)、过氧化氢水溶液(21.2μL，208μmol)，在室温下进行20小时搅拌。向反应溶液中加入2M三氟乙酸水溶液停止反应，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽(3.70mg，2.33μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝2 795.35[M+3H]3+
(78-3)二硫连接体与肽的偶联
[化学式199]
Figure BDA0002827785710002972
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:91。
将(78-2)中合成的Ac-GGCAYHKGQIIWCGG-NH2(SEQ ID NO:91)(3.70mg，2.33μmol，其中，第3位和第13位的2个半胱氨酸分别在分子内形成二硫键)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(0.40mL)，加入将3,3'-二硫代二丙酸二(N-琥珀酰亚胺酯)(19.0mg，46.6μmol)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(0.20mL)而得的溶液，室温下搅拌24小时。将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽二硫连接体偶联物-NHS活化体(1.20mg，0.64mol)。
MS(ESI)m/z:z＝2 939.95[M+3H]3+
HPLC纯度:60％
(78-4)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰和基于ESI-TOFMS的分析
将(78-3)中合成的肽二硫连接体偶联物-NHS活化体溶解于N,N'-二甲基甲酰胺成为21.6mM。使500μg的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗(中外制药株式会社)溶解于46.9μL的60mM的乙酸钠缓冲液(pH 4.7)，加入4.7μL的21.6mM的肽试剂(相对于抗体为30当量)，室温下搅拌1小时。将反应液置换为100mM柠檬酸钠缓冲液(pH 2.9)而使反应停止，进而置换为20mM的PBS缓冲液。通过ESI-TOFMS测定质量时，原料的曲妥珠单抗在148790观测到峰，引入了1个结合性肽的产物在150561观测到峰，引入了2个结合性肽的产物在152305确认到峰。
(78-5)曲妥珠单抗的特异性修饰体的还原条件下的基于ESI-TOFMS分析的重链选择性的确认
向(78-4)中生成的抗体-肽复合物中加入5μL的7mM的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐溶液(相对于抗体为等量)，室温下搅拌20分钟。通过ESI-TOFMS测定质量时，关于原料的曲妥珠单抗，在50594、50756观测到重链峰，并在23439观测到轻链峰；关于产物，在重链中引入了硫代丙酰基在50682、50844观测到峰，并且与原料同样在23439观测到轻链峰。
(78-6)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析
通过HIC对(78-5)中生成的抗体-肽复合物和原料的抗体进行了分析。柱使用了Protein-Pak Hi Res HIC柱(沃特世公司)4.6×100mm 2.5μm。使用A_Buffer:0.1M PiNa,2.3M(NH4)2SO4,pH7.0、B_Buffer:0.1M PiNa,pH7.0，流速为0.6mL/分钟，梯度设为A 60％B40％→A0％B 100％、16分钟(数据采集20分钟)，柱温为40℃，恒温器温度为40℃，检测器用280nm的波长进行了检测。
对于样品，按照以下的条件进行反应。
a:曲妥珠单抗原料；
b:曲妥珠单抗+肽二硫连接体偶联物-NHS活化体30当量。
保留时间10.2122分钟被认为是曲妥珠单抗原料，11.6858分钟被认为是引入了1个肽的化合物，12.9546分钟被认为是引入了2个肽的化合物(图86)。
(78-7)曲妥珠单抗-肽复合物的连接体切割和再氧化
通过实施例3的(3-1)记载的方法进行(78-4)中得到的抗体-肽复合物的连接体切割和再氧化，就可获得对EU numbering中的Lys246及Lys248区域选择性地引入了硫代丙酰基的抗体。
[实施例79：具有针对可溶性蛋白质的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物(肽二硫连接体偶联物-NHS活化体)的合成、以及使用该化合物的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的修饰及其分析]
(79-1)IgG1 Fc结合性肽的合成
通过与实施例1(1-1)同样的方法合成了Ac-GGGCAYHKGQIIWCGGG-NH2(SEQ ID NO:92)的肽，并进行纯化，获得了目标物(69.9mg，41.0μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝2 853.25[M+3H]3+
(79-2)Ac-GGGCAYHKGQIIWCGGG-NH2(SEQ ID NO:92)的第4位和第14位的Cys处的分子内二硫键的形成
[化学式200]
Figure BDA0002827785710002991
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:92。
将(79-1)中合成的肽(69.9mg，41.0μmol)溶解于DMSO(5.00mL)，加入2M NH3-MeOH(41.0μL，82.0μmol)、过氧化氢水溶液(83.8μL，820μmol)，在室温下进行20小时搅拌。向反应溶液中加入2M三氟乙酸水溶液停止反应，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽(28.3mg，16.6μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝2 852.30[M+3H]3+
(79-3)二硫连接体与肽的偶联
[化学式201]
Figure BDA0002827785710003001
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:92。
将(79-2)中合成的Ac-GGGCAYHKGQIIWCGGG-NH2(SEQ ID NO:92)(28.3mg，16.6μmol，其中，第4位和第14位的2个半胱氨酸分别在分子内形成二硫键)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(0.80mL)，加入将3,3'-二硫代二丙酸二(N-琥珀酰亚胺酯)(134mg，332μmol)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(0.60mL)而得的溶液，室温下搅拌24小时。将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽二硫连接体偶联物-NHS活化体(2.00mg，1.00mol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 664.75[M+3H]3+
HPLC纯度:62％
(79-4)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰和基于ESI-TOFMS的分析
将(79-3)中合成的肽二硫连接体偶联物-NHS活化体溶解于N,N'-二甲基甲酰胺成为21.6mM。使500μg的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗(中外制药株式会社)溶解于46.9μL的60mM的乙酸钠缓冲液(pH 4.7)，加入4.7μL的21.6mM的肽试剂(相对于抗体为30当量)，室温下搅拌1小时。将反应液置换为100mM柠檬酸钠缓冲液(pH 2.9)而使反应停止，进而置换为20mM的PBS缓冲液。通过ESI-TOFMS测定质量时，原料的曲妥珠单抗在148225观测到峰，引入了1个结合性肽的产物在150102观测到峰，引入了2个结合性肽的产物在151977确认到峰。
(79-5)曲妥珠单抗的特异性修饰体的还原条件下的基于ESI-TOFMS分析的重链选择性的确认
向(79-4)中生成的抗体-肽复合物中加入5μL的7mM的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐溶液(相对于抗体为等量)，室温下搅拌20分钟。通过ESI-TOFMS测定质量时，关于原料的曲妥珠单抗，在50595、50757观测到重链峰，并在23439观测到轻链峰；关于产物，在重链中引入了硫代丙酰基在50682、50844观测到峰，并且与原料同样在23439观测到轻链峰。
(79-6)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析
通过HIC对(79-4)中生成的抗体-肽复合物和原料的抗体进行了分析。柱使用了Protein-Pak Hi Res HIC柱(沃特世公司)4.6×100mm 2.5μm。使用A_Buffer:0.1M PiNa,2.3M(NH4)2SO4,pH7.0、B_Buffer:0.1M PiNa,pH7.0，流速为0.6mL/分钟，梯度设为A 60％B40％→A0％B 100％、16分钟(数据采集20分钟)，柱温为40℃，恒温器温度为40℃，检测器用280nm的波长进行了检测。
对于样品，按照以下的条件进行反应。
a:曲妥珠单抗原料；
b:曲妥珠单抗+肽二硫连接体偶联物-NHS活化体30当量。
保留时间10.0599分钟被认为是曲妥珠单抗原料，11.3794分钟被认为是引入了1个肽的化合物，12.4804分钟被认为是引入了2个肽的化合物(图87)。
(79-7)曲妥珠单抗-肽复合物的连接体切割和再氧化
通过实施例3的(3-1)记载的方法进行(79-4)中得到的抗体-肽复合物的连接体切割和再氧化，就可获得对EU numbering中的Lys246及Lys248区域选择性地引入了硫代丙酰基的抗体。
[实施例80：切割性连接体的合成和与IgG1 Fc结合性肽的偶联(coupling)]
(80)切割性连接体的合成和与肽的偶联
(80-1)硫酯连接体的合成和与肽的偶联
(80-1-1)硫酯连接体的合成
[化学式202]
Figure BDA0002827785710003021
使3,3'-二硫代二丙酸(1.0g，5.0mmol)溶解于10mL THF、100μL DMF，在冰冷下滴加吡啶(4.0mL，50mmol)和草酰氯(1.5mL，15.0mmol)，在室温下搅拌2小时。2小时后，滴加巯基乙酸甲酯(1.1mL，15.0mmol)，进而在室温下搅拌2小时。将反应液减压浓缩，用己烷/乙酸乙酯的正相色谱进行纯化，从而获得作为目标的2-[3-[[3-(2-甲氧基-2-氧代乙基)硫基-3-氧代丙基]二硫基]丙酰基硫基]乙酸甲酯(1.74g，4.5mmol)。
MS(ESI)m/z:387.0[M+H]+
[化学式203]
Figure BDA0002827785710003022
使2-[3-[[3-(2-甲氧基-2-氧代乙基)硫基-3-氧代丙基]二硫基]丙酰基硫基]乙酸甲酯(1.74g，4.5mmol)溶解于5.0mL H2O、1.0mL DMSO，加入三(2-羧基乙基)膦盐酸盐(1.93g，6.75mmol)并在室温下搅拌2小时。2小时后，用乙酸乙酯萃取，从而获得作为目标的2-(3-硫基丙酰基硫基)乙酸甲酯(1.20g，6.2mmol)。
MS(ESI)m/z:195.0[M+H]+
[化学式204]
Figure BDA0002827785710003031
向2-(3-硫基丙酰基硫基)乙酸甲酯(1.20g，6.2mmol)中加入2.7mL乙腈、0.3mL吡啶溶解。然后，加入琥珀酸酐(0.65g，6.5mmol)、4-二甲基氨基吡啶(12.2mg，0.1mmol)搅拌1小时。加入20mL的1M盐酸水溶液，用乙酸乙酯萃取。通过减压浓缩而获得4-[3-(2-甲氧基-2-氧代乙基)硫基-3-氧代丙基]硫基-4-氧代丁酸(1.18g，4.0mmol)。
MS(ESI)m/z:295.0[M+H]+
(80-1-2)硫酯连接体与肽的偶联
[化学式205]
Figure BDA0002827785710003032
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:5。
将(80-1)中合成的Ac-RGNCAYHKGQIIWCTYH-NH2(SEQ ID NO:5)(30mg，14.4μmol，其中，第4位和第14位的2个半胱氨酸分别在分子内形成二硫键)溶解于1mL的N,N'-二甲基甲酰胺，加入4-[3-(2-甲氧基-2-氧代乙基)硫基-3-氧代丙基]硫基-4-氧代丁酸(65mg，0.22mmol)、WSC·HCl(41mg，0.22mmol)。在室温下搅拌12小时后，加入0.1％三氟乙酸水溶液并用反相制备色谱洗脱。回收含产物的级分，通过减压浓缩而仅除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽-连接体偶联物-苯硫酚(thiophenol)活化体(24.1mg，10.2μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 789[M+3H]3+,z＝4 592[M+4H]4+
(80-4)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰和基于ESI-TOFMS的分析
将(80-3)中合成的肽-连接体偶联物-苯硫酚活化体溶解于N,N'-二甲基甲酰胺成为21.6mM。使500μg的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗(中外制药株式会社)溶解于46.9μL的50mM的乙酸钠缓冲液(pH 4.7)，加入4.7μL的21.6mM的肽试剂(相对于抗体为10当量)，室温下搅拌1小时。将反应液置换为100mM柠檬酸钠缓冲液(pH 2.9)而使反应停止，进而置换为20mM的PBS缓冲液。
(80-5)曲妥珠单抗的特异性修饰体的还原条件下的基于ESI-TOFMS分析的重链选择性的确认
向(80-4)中生成的抗体-肽复合物中加入5μL的7mM的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐溶液(相对于抗体为等量)，室温下搅拌20分钟。通过ESI-TOFMS测定质量时，关于原料的曲妥珠单抗，在50594、50756观测到重链峰，并在23439观测到轻链峰；关于产物，在重链中引入了肽-连接体偶联物(peptide-and linker-coupled compound)在52855、53017观测到峰，并且与原料同样在23439观测到轻链峰(图88)。
(80-6)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析
通过HIC对(80-4)中生成的抗体-肽复合物和原料的抗体进行了分析。柱使用了Protein-Pak Hi Res HIC柱(沃特世公司)4.6×100mm 2.5μm。使用A_Buffer:0.1M PiNa,2.3M(NH4)2SO4,pH7.0、B_Buffer:0.1M PiNa,pH7.0，流速为0.6mL/分钟，梯度设为A 60％B40％→A0％B 100％、16分钟(数据采集20分钟)，柱温为40℃，恒温器温度为40℃，检测器用280nm的波长进行了检测。
对于样品，按照以下的条件进行反应。
a:曲妥珠单抗原料；
b:曲妥珠单抗+肽-连接体偶联物-苯硫酚活化体10当量。
保留时间10.6216分钟被认为是引入了1个肽的化合物，11.1941分钟被认为是引入了2个肽的化合物(图89)。
(80-7)曲妥珠单抗-肽复合物的连接体切割
将(80-4)中得到的曲妥珠单抗-肽复合物(20mM PBS缓冲液)通过Amicon3K置换为0.5M羟胺、10mM EDTA(pH5.5)溶液，在室温下静置2小时。2小时后，置换为20mM PBS缓冲液、10mMEDTA(pH7.4)，获得曲妥珠单抗巯基引入体。
(80-8)曲妥珠单抗巯基引入体的特异性修饰体的还原条件下的基于ESI-TOFMS分析的重链选择性的确认
向(80-7)中生成的曲妥珠单抗巯基引入体中加入5μL的7mM的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐溶液(相对于抗体为等量)，室温下搅拌20分钟。通过ESI-TOFMS测定质量时，关于原料的曲妥珠单抗，在50594、50756观测到重链峰，并在23439观测到轻链峰；关于产物，在重链中引入了硫代丙酰基在50682、50844观测到峰，并且与原料同样在23439观测到轻链峰(图90)。
(80-9)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析
通过HIC对(80-4)中生成的曲妥珠单抗巯基引入体和曲妥珠单抗-肽复合物的抗体进行了分析。柱使用了Protein-Pak Hi Res HIC柱(沃特世公司)4.6×100mm2.5μm。使用A_Buffer:0.1M PiNa,2.3M(NH4)2SO4,pH7.0、B_Buffer:0.1M PiNa,pH7.0，流速为0.6mL/分钟，梯度设为A 60％B 40％→A0％B 100％、16分钟(数据采集20分钟)，柱温为40℃，恒温器温度为40℃，检测器用280nm的波长进行了检测。
对于样品，按照以下的条件进行反应。
a:曲妥珠单抗-肽复合物；
b:曲妥珠单抗巯基引入体。
保留时间10.2950分钟被认为是引入了2个硫代丙酰基的化合物(图91)。
(80-10)对曲妥珠单抗巯基引入体的荧光标记
对于(80-7)中得到的曲妥珠单抗巯基引入体(20mM PBS缓冲液、10mM EDTA)，加入5当量的荧光素-5-马来酰亚胺(10mM，溶解于DMSO)。室温下静置1小时后，置换为20mM的PBS缓冲液，获得曲妥珠单抗荧光标记体(ADC mimic)。
(80-11)曲妥珠单抗荧光标记体的还原条件下的基于ESI-TOFMS分析的重链选择性的确认
向(80-10)中生成的曲妥珠单抗荧光标记体(ADC mimic)中加入5μL的7mM的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐溶液(相对于抗体为等量)，室温下搅拌20分钟。通过ESI-TOFMS测定质量时，关于原料的曲妥珠单抗巯基引入体，在50682、50844观测到重链峰，并在23439观测到轻链峰；关于产物，在重链中引入了荧光素在51110、51272观测到峰，并与原料同样在23439观测到轻链峰(图92)。
(80-12)从曲妥珠单抗巯基引入体利用点击反应(click reaction)的ADC mimic的合成
对于(80-7)中得到的曲妥珠单抗巯基引入体(20mM PBS缓冲液、10mM EDTA)，加入10当量的N-(4-叠氮苯基)-2-碘乙酰胺(10mM，溶解于DMSO)。室温下静置1小时后，置换为20mM的PBS缓冲液，加入5当量的二苯并环辛炔酸(dibenzocyclooctynoic acid)(DBCO-Acid，10mM，溶解于DMSO)进行点击反应，获得ADC mimic。
(80-13)ADC mimic的还原条件下的基于ESI-TOFMS分析的重链选择性的确认
向(80-12)中生成的ADC mimic中加入5μL的7mM的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐溶液(相对于抗体为等量)，室温下搅拌20分钟。通过ESI-TOFMS测定质量时，关于原料的曲妥珠单抗巯基引入体，在50682、50844观测到重链峰，并在23439观测到轻链峰；关于产物，在重链中引入了点击反应产物在51176、51338观测到峰，并且与原料同样在23439观测到轻链峰(图93)。
(80-14)汇总
对曲妥珠单抗、(80-5)、(80-8)、(80-10)、(80-12)的结果进行汇总(图94)。
[实施例81：切割性连接体的合成和与IgG1 Fc结合性肽的偶联]
(81)切割性连接体的合成和与肽的偶联
(81-1)硫酯连接体的合成和与肽的偶联
(81-1-1)硫酯连接体的合成
[化学式206]
Figure BDA0002827785710003061
使3,3'-二硫代二丙酸(1.0g，5.0mmol)溶解于10mL THF、100μL DMF，在冰冷下滴加吡啶(4.0mL，50mmol)和草酰氯(1.5mL，15.0mmol)，在室温下搅拌2小时。2小时后，滴加苯硫酚(1.53mL，15.0mmol)，进而在室温下搅拌2小时。将反应液减压浓缩，通过己烷/乙酸乙酯的正相色谱纯化，从而获得3-[(3-氧代-3-苯基硫基丙基)二硫基]硫代丙酸-S-苯基酯(1.77g，4.5mmol)。
MS(ESI)m/z:395.1[M+H]+
[化学式207]
Figure BDA0002827785710003071
使3-[(3-氧代-3-苯基硫基丙基)二硫基]硫代丙酸-S-苯基酯(1.77g，4.5mmol)溶解于5.0mL H2O、1.0mL DMSO，加入三(2-羧基乙基)膦盐酸盐(1.93g，6.75mmol)，在室温下搅拌2小时。2小时后，用乙酸乙酯萃取，从而获得作为目标的3-硫基硫代丙酸-S-苯基酯(1.29g，6.5mmol)。
MS(ESI)m/z:199.2[M+H]+
[化学式208]
Figure BDA0002827785710003072
向3-硫基硫代丙酸-S-苯基酯(1.29g，6.5mmol)中加入2.7mL乙腈、0.3mL吡啶溶解。然后，加入琥珀酸酐(0.65g，6.5mmol)、4-二甲基氨基吡啶(12.2mg，0.1mmol)搅拌1小时。加入20mL的1M盐酸水溶液，用乙酸乙酯萃取。通过减压浓缩而获得(4-氧代-4-(3-氧代-3-苯基硫基丙基)硫基丁酸(1.25g，4.2mmol)。
MS(ESI)m/z:299.0[M+H]+
(81-1-2)硫酯连接体与肽的偶联
[化学式209]
Figure BDA0002827785710003073
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:5。
将(81-1)中合成的Ac-RGNCAYHKGQIIWCTYH-NH2(SEQ ID NO:5)(30mg，14.4μmol，其中，第4位和第14位的2个半胱氨酸分别在分子内形成二硫键)溶解于1mL的N,N'-二甲基甲酰胺，加入((4-氧代-4-(3-氧代-3-苯基硫基丙基)硫基丁酸(64mg，0.22mmol)、WSC·HCl(41mg，0.22mmol)。在室温下搅拌12小时后，加入0.1％三氟乙酸水溶液并用反相制备色谱洗脱。回收含产物的级分，通过减压浓缩而仅除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽-连接体偶联物-苯硫酚活化体(22.3mg，9.4μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝3 790[M+3H]3+,z＝4 593[M+4H]4+
(81-4)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰和基于ESI-TOFMS的分析
将(81-3)中合成的肽-连接体偶联物-苯硫酚活化体溶解于N,N'-二甲基甲酰胺成为21.6mM。使500μg的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗(中外制药株式会社)溶解于46.9μL的60mM的乙酸钠缓冲液(pH 4.7)，加入4.7μL的21.6mM的肽试剂(相对于抗体为30当量)，室温下搅拌1小时。将反应液置换为100mM柠檬酸钠缓冲液(pH 2.9)而使反应停止，进而置换为20mM的PBS缓冲液。
(81-5)曲妥珠单抗的特异性修饰体的还原条件下的基于ESI-TOFMS分析的重链选择性的确认
向(81-4)中生成的抗体-肽复合物中加入5μL的7mM的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐溶液(相对于抗体为等量)，室温下搅拌20分钟。通过ESI-TOFMS测定质量时，关于原料的曲妥珠单抗，在50594、50756观测到重链峰，并在23439观测到轻链峰；关于产物，在重链中引入了肽-连接体偶联物在52855、53017观测到峰，并且与原料同样在23439观测到轻链峰。
(81-6)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析
通过HIC对(81-4)中生成的抗体-肽复合物和原料的抗体进行了分析。柱使用了Protein-Pak Hi Res HIC柱(沃特世公司)4.6×100mm 2.5μm。使用A_Buffer:0.1M PiNa,2.3M(NH4)2SO4,pH7.0、B_Buffer:0.1M PiNa,pH7.0，流速为0.6mL/分钟，梯度设为A 60％B40％→A0％B 100％、16分钟(数据采集20分钟)，柱温为40℃，恒温器温度为40℃，检测器用280nm的波长进行了检测。
对于样品，按照以下的条件进行反应。
a:曲妥珠单抗原料；
b:曲妥珠单抗+肽二硫连接体偶联物-NHS活化体30当量。
保留时间10.5580分钟被认为是引入了1个肽的化合物，11.1331分钟被认为是引入了2个肽的化合物(图95)。
(81-7)曲妥珠单抗-肽复合物的连接体切割
将(81-4)中得到的曲妥珠单抗-肽复合物(20mM PBS缓冲液)通过Amicon3K置换为0.5M羟胺、10mM EDTA(pH5.5)溶液，在室温下静置2小时。2小时后，置换为20mM PBS缓冲液、10mMEDTA(pH7.4)，获得曲妥珠单抗巯基引入体。
(81-8)曲妥珠单抗巯基引入体的特异性修饰体的还原条件下的基于ESI-TOFMS分析的重链选择性的确认
向(81-7)中生成的曲妥珠单抗巯基引入体中加入5μL的7mM的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐溶液(相对于抗体为等量)，室温下搅拌20分钟。通过ESI-TOFMS测定质量时，关于原料的曲妥珠单抗，在50594、50756观测到重链峰，并在23439观测到轻链峰；关于产物，在重链中引入了硫代丙酰基在50682、50844观测到峰，并且与原料同样在23439观测到轻链峰。
(81-9)基于一锅(one-pot)法的曲妥珠单抗巯基引入体的合成
将(81-3)中合成的肽-连接体偶联物-苯硫酚活化体溶解于N,N'-二甲基甲酰胺成为21.6mM。使500μg的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗(中外制药株式会社)溶解于46.9μL的60mM的乙酸钠缓冲液(pH 5.5)，加入4.7μL的21.6mM的肽试剂(相对于抗体为30当量)，室温下搅拌1小时。然后，与乙酸钠等量地添加0.5M羟胺、10mM EDTA(pH5.5)溶液，在室温下静置2小时。2小时后，置换为20mM PBS缓冲液、10mM EDTA(pH7.4)，获得曲妥珠单抗巯基引入体。
(81-10)曲妥珠单抗巯基引入体的胰蛋白酶处理
对于(81-9)中得到的曲妥珠单抗巯基引入体通过PNGaseF(新英格兰生物实验室公司制)进行了糖链切割后，进行了肽谱分析。向1.5mL低吸附微试管中加入10μL样品溶液、50mM碳酸氢铵缓冲液、10μL溶解于40％三氟乙醇的20mM的二硫苏糖醇水溶液，在65℃加温1分钟后，添加10μL的50mM的碘乙酰胺水溶液，遮光下于室温反应30分钟。反应后，加入40μL的50mM碳酸氢铵缓冲液并搅拌，添加10μL的20ng/μL的胰蛋白酶水溶液并在37℃进行了16小时的酶消化。消化后，加入2μL的20％三氟乙酸水溶液，停止反应，实施了LC-MS/MS测定。
(81-11)胰蛋白酶消化产物的LC-MS/MS测定条件
(分析装置)
纳米HPLC：EASY-nLC 1000(赛默飞世尔科技公司)
质谱仪：Tribrid质谱仪Orbitrap Fusion(赛默飞世尔科技公司)
(HPLC分析条件)
捕集柱：Acclaim PepMap(注册商标)100，75μm×2cm(赛默飞世尔科技公司)
分析柱：ESI-column(NTCC-360/75-3-125,75μm×12.5cm,3μm(日京技术株式会社))
流动相A：0.1％甲酸水溶液
流动相B：0.1％甲酸，乙腈溶液
加样溶液：0.1％三氟乙酸水溶液
流速：300nL/分钟
样品注入量：1μL
梯度条件(B％)：2％(0.0-0.5分钟)、2％→30％(0.5-23.5分钟)、30％→75％(23.5-25.5分钟)、75％(25.5-35.0分钟)
(质谱仪的分析条件)
离子化方法：ESI，正离子化模式
扫描类型：数据依赖性获取
活化类型：碰撞诱导离解(Collision Induced Dissociation，CID)
关于数据的获取，使用作为附属软件的Xcalibur 3.0(赛默飞世尔科技公司)及ThermoOrbitrap Fusion Tune Application 2.0(赛默飞世尔科技公司)进行。
(81-12)曲妥珠单抗的修饰部位的分析条件
关于对LC-MS/MS测定结果的修饰部位分析，使用Proteome Discoverer version 1.4(赛默飞世尔科技公司)进行。
关于采用Proteome Discoverer的分析，使用Sequest HT作为搜索引擎，前体离子的范围设为350～5000Da，总强度阈值(Total Intensity Threshold)设为峰顶的强度的0.01％。此外，将胰蛋白酶设定为消化酶，最大漏切位点(Maximum Missed Cleavage Site)设为3。此外，前体和碎片离子的质量容差(Mass Tolerance)分别设为5ppm和0.5Da。对于静态修饰(Static Modification)，作为采用碘乙酰胺的半胱氨酸残基的修饰，设定脲甲基(Carbamidomethyl)(+57.021Da)。关于动态修饰(Dynamic Modifications)，设定甲硫氨酸残基的氧化(+15.995Da)和对赖氨酸残基的修饰体(经受了采用碘乙酰胺的脲甲基化的巯基引入体(+145.019Da))。进而，设置筛选器以使肽置信度仅为高。
此外，作为修饰部位的检索对象的氨基酸序列的数据，使用图4所示的(1)、(3)。
(81-13)曲妥珠单抗的基于LC-MS/MS的修饰部位的分析结果
使用LC-MS/MS的分析的结果是，观测了曲妥珠单抗的采用胰蛋白酶消化的包含对赖氨酸残基的修饰部位(经受了采用碘乙酰胺的脲甲基化的巯基引入体(+145.019Da))的由33个氨基酸残基形成的肽、THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISR(SEQ ID NO:6)的肽片段的MS谱(实测值:m/z 1269.30359，理论值:1269.30273，三价)(图96)，根据CID谱确认了表示重链的EU numbering中的第246位或第248位的赖氨酸残基的修饰的、对应于一价的y9的m/z 1205.86(理论值:1205.60)的产物离子(图97-1)。此外，通过采用Proteome Discoverer的分析，表明高选择性地发生了对第246位或第248位的赖氨酸残基的修饰(图97-2)。
由该结果可知，(81-9)中，抗体上在重链上的EU numbering中的Lys246及Lys248区域选择性地进行了偶联(conjugation)。
实施例82：抗体-核酸偶联物的合成
(82-1-1)对核酸引入连接体
[化学式210]
Figure BDA0002827785710003111
对于siRNA(pH7.4，PBS缓冲液)，加入100当量的3-(2,5-二氧代吡咯-1-基)丙酸(2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯)(200mM，溶解于DMF)。在4℃静置20小时后，用NAP-5柱(GE医疗集团)纯化。
使用以下的序列的siRNA。
有义链：5’-6-FAM-A(M)C(M)AGC(M)AAAU(M)U(M)C(M)C(M)AU(M)C(M)GU(M)GU(M)-N(6)(SEQ ID NO:93)
反义链：5’-p-AC(F)AC(F)GAU(F)GGAAU(F)U(F)U(F)GC(F)U(F)GU(F)UU(SEQ ID NO:94)
·p：磷酸化(Phosphorylation)，(F)：2'-氟，(M)：2'-O-Me(甲基)，N(6)：在3'末端添加氨基C6连接体(amino C6 linker)
(82-1-2)曲妥珠单抗巯基引入体-核酸偶联物的合成
[化学式211]
Figure BDA0002827785710003121
对于(81-7)中得到的曲妥珠单抗巯基引入体(20mM PBS缓冲液，10mM EDTA)，加入10当量的(210-1-1)中得到的连接体引入siRNA，在4℃静置40小时。将混合液用AmiconUltra-0.5mL3kDa(默克密理博公司制)纯化后，用AKTApurifier(GE医疗集团制)进一步纯化。经纯化的偶联物通过SDS-PAG进行了分析。
采用AKTApurifier(GE医疗集团制)的纯化以下述的条件进行。
柱：Superdex 200 Increase 10/300GL(GE医疗集团制)
缓冲液：pH7.4的PBS缓冲液
流速：0.4ml/分钟
检测器：以215和280nm的波长检测。
(82-2)抗体-核酸偶联物的基于SDS-PAGE的分析
通过SDS-PAGE对(82-1-2)中合成的偶联物进行了分析。作为标准品，使用PrecisionPlus ProteinTM预染标准品(BIO-RAD公司制)，染色用Barrett CBB Stain One(NacalaiTesque公司制)进行(图98)。
其结果是，由SDS-PAGE可知，对于未修饰抗体，可区域选择性地偶联核酸。即，显示作为效应分子(Payload)，不仅限于低分子，还可引入核酸。
实施例83：对曲妥珠单抗巯基引入体引入叠氮基及利用点击反应的ADC mimic的合成
(83-1)对曲妥珠单抗巯基引入体引入叠氮基及ADC mimic的合成
(83-1-1)对曲妥珠单抗巯基引入体引入叠氮基
对于(81-7)中得到的曲妥珠单抗巯基引入体(20mM PBS缓冲液、10mM EDTA)，加入50当量的N-[2-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]乙基]-2-碘乙酰胺(50mM，溶解于DMF)。在37℃静置3小时后，置换为20mM PBS缓冲液，获得曲妥珠单抗叠氮引入体。
(83-1-2)曲妥珠单抗叠氮引入体的还原条件下的基于ESI-TOFMS分析的重链选择性的确认
向(83-1-1)中生成的曲妥珠单抗叠氮引入体中加入5μL的7mM的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐溶液(相对于抗体为等量)，室温下搅拌20分钟。通过ESI-TOFMS测定质量时，关于原料的曲妥珠单抗巯基引入体，在50682、50844观测到重链峰，并在23439观测到轻链峰；关于产物，在重链中引入了点击反应产物在50895、51057观测到峰，并且与原料同样在23439观测到轻链峰(图99)。
(83-1-3)曲妥珠单抗叠氮引入体向ADC mimic的转化
向(83-1-1)中得到的曲妥珠单抗叠氮引入体(20mM PBS缓冲液、10mM EDTA)中，加入10当量的二苯并环辛炔酸(DBCO-Acid，10mM，溶解于DMF)并进行点击反应，获得ADC mimic。
(83-1-4)ADC mimic的还原条件下的基于ESI-TOFMS分析的重链选择性的确认
向(83-1-3)中生成的ADC mimic中加入5μL的7mM的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐溶液(相对于抗体为等量)，室温下搅拌20分钟。通过ESI-TOFMS测定质量时，关于原料的曲妥珠单抗叠氮引入体，在50896、51058观测到重链峰，并在23439观测到轻链峰，关于产物，在重链中引入了点击反应产物在51216、51378观测到峰，并且与原料同样在23439观测到轻链峰(图100)。
其结果是，显示在曲妥珠单抗巯基引入体与效应分子(Payload)之间插入连接体(linker)也可合成ADC mimic。
[实施例84：切割性连接体的合成和与IgG1 Fc结合性肽的偶联]
(84)含叠氮基切割性连接体的合成和与肽的偶联
(84-1)含叠氮基硫酯连接体的合成和与肽的偶联
(84-1-1)含叠氮基硫酯连接体的合成
[化学式212]
Figure BDA0002827785710003131
使5-叠氮戊酸(200mg，1.40mmol)溶解于THF溶剂(7.0mL)，在0℃下加入氯甲酸异丁酯(0.220mL，1.68mmol)、N-甲基吗啉(0.230mL，2.10mmol)并搅拌30分钟，制备5-叠氮戊酸的混合酸酐。使(3S)-3-氨基-4-叔丁氧基-4-氧代丁酸(0.397mg，2.10mmol)溶解于1M氢氧化钠水溶液(7.0mL)，室温下将混合液滴加至上述的5-叠氮戊酸的混合酸酐的THF溶液中。室温下搅拌16小时后，加入6M盐酸水溶液，将体系内的pH调节至3.0。调节后，进行采用乙酸乙酯的分液萃取，减压浓缩有机相，将由此得到的粗产物通过柱色谱(二氯甲烷:甲醇＝10:1)纯化。回收含产物的级分，通过减压浓缩，获得(3S)-3-(5-叠氮戊酰基氨基)-4-叔丁氧基-4-氧代丁酸(0.380g，1.21mmol)。
MS(ESI)m/z:337[M+Na]+
[化学式213]
Figure BDA0002827785710003141
使(3S)-3-(5-叠氮戊酰基氨基)-4-叔丁氧基-4-氧代丁酸(0.380g，1.21mmol)溶解于6.0mL二氯甲烷，在冰冷下滴加草酰氯(0.125mL，1.45mmol)和N,N'-二甲基甲酰胺(4.68μL，0.0605mmol)，搅拌30分钟。30分钟后，滴加吡啶(0.196mL，2.42mmol)和苯硫酚(0.185mL，1.81mmol)与二甲基氨基吡啶(14.8mg，0.121mmol)的混合液，室温下搅拌2小时。2小时后，加入6.0mL的0.1M盐酸水溶液，进行采用二氯甲烷的分液萃取后，对有机层进行减压浓缩，通过柱色谱(己烷/乙酸乙酯)纯化。回收含产物的级分，减压浓缩，向由此得到的残渣中加入3.0mL二氯甲烷和3.0mL三氟乙酸，室温下搅拌1小时。1小时后，对反应液进行减压浓缩，从而获得(2S)-2-(5-叠氮戊酰基氨基)-4-氧代-4-苯基硫基丁酸(150mg，0.428mmol)。
MS(ESI)m/z:351[M+H]+
[化学式214]
Figure BDA0002827785710003151
使(2S)-2-(5-叠氮戊酰基氨基)-4-氧代-4-苯基硫基丁酸(0.150g，0.428mmol)溶解于THF溶剂(4.3mL)，在0℃下加入氯甲酸异丁酯(0.0674mL，0.514mmol)、N-甲基吗啉(0.0706mL，0.642mmol)并搅拌30分钟，制备混合酸酐。使吡啶(0.0695mL，0.857mmol)和3-巯基丙酸叔丁酯(0.139mL，0.857mmol)与二甲基氨基吡啶(5.20mg，0.0428mmol)溶解于THF溶剂(1.0mL)，室温下将混合液滴加至上述的混合酸酐的THF溶液。室温下搅拌3小时后，加入4.3mL的0.1M盐酸水溶液，进行采用乙酸乙酯的分液萃取后，减压浓缩有机层，通过柱色谱(己烷/乙酸乙酯)纯化。回收含产物的级分，减压浓缩，向由此得到的残渣中加入2.0mL二氯甲烷和2.0mL三氟乙酸，室温下搅拌1小时。1小时后，对反应液进行减压浓缩，从而获得3-[(2S)-2-(5-叠氮戊酰基氨基)-4-氧代-4-苯基硫基-丁酰基]硫基丙酸(43.8mg，0.100mmol)。
MS(ESI)m/z:439[M+H]+
(84-1-2)硫酯连接体与肽的偶联
[化学式215]
Figure BDA0002827785710003161
上述氨基酸序列为SEQ ID NO:5。
将(84-1)中合成的Ac-RGNCAYHKGQIIWCTYH-NH2(SEQ ID NO:5)(9.8mg，4.7μmol，其中，第4位和第14位的2个半胱氨酸分别在分子内形成二硫键)溶解于1mL的N,N'-二甲基甲酰胺，加入3-[(2S)-2-(5-叠氮戊酰基氨基)-4-氧代-4-苯基硫基-丁酰基]硫基丙酸(30.9mg，0.0704mmol)、WSC·HCl(13.5mg，0.0704mmol)。在室温下搅拌3小时后，加入0.1％三氟乙酸水溶液并用反相制备色谱洗脱。回收含产物的级分，通过减压浓缩而仅除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽-连接体偶联物-苯硫酚活化体(3.76mg，1.50μmol)。
MS(ESI)m/z:z＝2 1255[M+2H]2+,z＝3 837[M+3H]3+
(84-2)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰和基于ESI-TOFMS的分析
将(84-1)中合成的肽-连接体偶联物-苯硫酚活化体溶解于N,N'-二甲基甲酰胺成为5.01mM。使707μg的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗(中外制药株式会社)溶解于220μL的60mM的乙酸钠缓冲液(pH 5.5)，加入19.1μL的5.01mM的肽试剂(相对于抗体为10当量)，室温下搅拌1小时。将反应液置换为100mM柠檬酸钠缓冲液(pH 2.9)而使反应停止，进而置换为20mM的PBS缓冲液。
(84-3)曲妥珠单抗的特异性修饰体的还原条件下的基于ESI-TOFMS分析的重链选择性的确认
向(84-2)中生成的抗体-肽复合物中加入5μL的7mM的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐溶液(相对于抗体为等量)，室温下搅拌20分钟。通过ESI-TOFMS测定质量时，关于原料的曲妥珠单抗，在50594、50756观测到重链峰，并在23439观测到轻链峰；关于产物，在重链中引入了肽-连接体偶联物在52996、53158观测到峰，并且与原料同样在23439观测到轻链峰(图101)。
(84-4)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析
通过HIC对(84-2)中生成的抗体-肽复合物和原料的抗体进行了分析。柱使用了Protein-Pak Hi Res HIC柱(沃特世公司)4.6×100mm 2.5μm。使用A_Buffer:0.1M PiNa,2.3M(NH4)2SO4,pH7.0、B_Buffer:0.1M PiNa,pH7.0，流速为0.6mL/分钟，梯度设为A 60％B40％→A0％B 100％、16分钟(数据采集20分钟)，柱温为40℃，恒温器温度为40℃，检测器用280nm的波长进行了检测。
对于样品，按照以下的条件进行反应。
a:曲妥珠单抗原料；
b:曲妥珠单抗+肽叠氮连接体偶联物-NHS活化体10当量。
保留时间11.2765分钟被认为是引入了2个肽的化合物(图102)。
(84-5)曲妥珠单抗-肽复合物的连接体切割
将(84-2)中得到的曲妥珠单抗-肽复合物(20mM PBS缓冲液)通过Amicon10K置换为0.5M羟胺、10mM EDTA(pH6.0)溶液，室温下静置2小时。2小时后，置换为20mM PBS缓冲液、10mM EDTA(pH7.4)，获得曲妥珠单抗巯基引入体。
(84-6)曲妥珠单抗叠氮引入体的特异性修饰体的还原条件下的基于ESI-TOFMS分析的重链选择性的确认
向(84-5)中生成的曲妥珠单抗巯基引入体中加入5μL的7mM的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐溶液(相对于抗体为等量)，室温下搅拌20分钟。通过ESI-TOFMS测定质量时，关于原料的曲妥珠单抗，在50594、50756观测到重链峰，并在23439观测到轻链峰；关于产物，在重链中引入了硫代丙酰基在50850、51012观测到峰，并且与原料同样在23439观测到轻链峰(图103)。
(84-7)曲妥珠单抗叠氮引入体的特异性修饰的HIC-UPLC分析
通过HIC对(84-5)中生成的抗体叠氮引入体和原料的抗体-肽复合物进行了分析。柱使用了Protein-Pak Hi Res HIC柱(沃特世公司)4.6×100mm 2.5μm。使用A_Buffer:0.1MPiNa,2.3M(NH4)2SO4,pH7.0、B_Buffer:0.1M PiNa,pH7.0，流速为0.6mL/分钟，梯度设为A60％B 40％→A0％B 100％、16分钟(数据采集20分钟)，柱温为40℃，恒温器温度为40℃，检测器用280nm的波长进行了检测。
对于样品，按照以下的条件进行反应。
a:曲妥珠单抗-肽复合物；
b:曲妥珠单抗叠氮引入体。
保留时间9.8588分钟被认为是引入了2个叠氮基的化合物(图104)。
(84-8)采用一锅(One-pot)法的曲妥珠单抗叠氮引入体的合成
将(84-1)中合成的肽-连接体偶联物-苯硫酚活化体溶解于N,N'-二甲基甲酰胺成为21.1mM。使1.29mg的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗(中外制药株式会社)溶解于123.8μL的60mM的乙酸钠缓冲液(pH 5.5)，加入10.8μL的21.1mM的肽试剂(相对于抗体为15当量)，室温下搅拌1小时。然后，添加与乙酸钠等量的0.5M羟胺、10mM EDTA(pH5.5)溶液，室温下静置2小时。2小时后，置换为20mM PBS缓冲液、10mM EDTA(pH7.4)，获得曲妥珠单抗叠氮引入体。
(84-9)曲妥珠单抗叠氮引入体的胰蛋白酶处理
对(84-8)中得到的曲妥珠单抗叠氮引入体与上述(81-10)同样地进行处理，实施LC-MS/MS测定。
(84-10)胰蛋白酶消化产物的LC-MS/MS测定条件
分析装置、HPLC分析条件、质谱仪的分析条件与上述(81-11)相同。
(84-11)曲妥珠单抗的修饰部位的分析条件
关于针对LC-MS/MS测定结果的修饰部位分析，除了动态修饰的设定，与上述(81-12)相同。关于动态修饰，设定甲硫氨酸残基的氧化(+15.995Da)和对赖氨酸残基的修饰体(叠氮引入体(+255.097Da)、胺引入体(+229.106)、叠氮羧酸引入体(+240.086)、胺羧酸引入体(+214.095))。进而，设置筛选器以使肽置信度仅为高。
(84-12)曲妥珠单抗的基于LC-MS/MS的修饰部位的分析结果
使用LC-MS/MS的分析的结果是，观测了曲妥珠单抗的采用胰蛋白酶消化的包含对赖氨酸残基的修饰部位(叠氮羧酸引入体(+240.086))的由33个氨基酸残基形成的肽、THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISR(SEQ ID NO:6)的肽片段的MS谱(实测值:m/z 1300.99241，理论值:1300.99173，三价)(图105)，根据CID谱确认了表示重链的EU numbering中的第246位或第248位的赖氨酸残基的修饰的、对应于一价的y12的m/z 1622.92(理论值:1622.87)的产物离子(图106-1)。此外，通过采用Proteome Discoverer的分析，表明高选择性地发生了对第246位或第248位的赖氨酸残基的修饰(图106-2)。
由该结果可知，(84-8)中，抗体上在重链上的EU numbering中的Lys246及Lys248区域选择性地进行了偶联。
实施例85：对于曲妥珠单抗叠氮引入体的利用点击反应的ADC mimic的合成
(85-1)向曲妥珠单抗叠氮引入体引入低分子
对于(84-5)中得到的曲妥珠单抗叠氮引入体(20mM PBS缓冲液、10mM EDTA)，加入10当量的二苯并环辛炔酸(DBCO-Acid，10mM，溶解于DMF)并进行点击反应，获得ADC mimic。
(85-2)ADC mimic的还原条件下的基于ESI-TOFMS分析的重链选择性的确认
向(85-1)中生成的ADC mimic中加入5μL的7mM的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐溶液(相对于抗体为等量)，室温下搅拌20分钟。通过ESI-TOFMS测定质量时，关于原料的曲妥珠单抗叠氮引入体，在50850、51012观测到重链峰，并在23439观测到轻链峰，关于产物，在重链中引入了点击反应产物在51169、51330观测到峰，并且与原料同样在23439观测到轻链峰(图107)。
(85-3)曲妥珠单抗叠氮引入体的特异性修饰的HIC-UPLC分析
通过HIC对(85-1)中生成的抗体叠氮引入体和原料的抗体-肽复合物进行了分析。柱使用了Protein-Pak Hi Res HIC柱(沃特世公司)4.6×100mm 2.5μm。使用A_Buffer:0.1MPiNa,2.3M(NH4)2SO4,pH7.0、B_Buffer:0.1M PiNa,pH7.0，流速为0.6mL/分钟，梯度设为A60％B 40％→A0％B 100％、16分钟(数据采集20分钟)，柱温为40℃，恒温器温度为40℃，检测器用280nm的波长进行了检测。
对于样品，按照以下的条件进行反应。
a:曲妥珠单抗叠氮引入体；
b:ADC mimic。
保留时间10.3216分钟被认为是引入了2个低分子的化合物(图108)。
(85-4)ADC mimic的胰蛋白酶处理
对于(85-1)中得到的ADC mimic，与上述(81-10)同样地进行处理，实施LC-MS/MS测定。
(85-5)曲妥珠单抗的LC-MS/MS测定条件
分析装置、HPLC分析条件、质谱仪分析条件与上述(81-11)相同。
(85-6)曲妥珠单抗的修饰部位的分析条件
关于针对LC-MS/MS测定结果的修饰部位分析，除了动态修饰的设定，与上述(81-12)相同。对于动态修饰，设定甲硫氨酸残基的氧化(+15.995Da)和对赖氨酸残基的修饰体(DBCO-Acid引入体(+574.218)、DBCO-Acid羧酸引入体(+559.207)、叠氮引入体(+255.097)、叠氮羧酸引入体(+240.086))。进而，设置筛选器以使肽置信度仅为高。
(85-7)曲妥珠单抗的基于LC-MS/MS的修饰部位的分析结果
使用LC-MS/MS的分析的结果是，观测了曲妥珠单抗的采用胰蛋白酶消化的包含对赖氨酸残基的修饰部位(DBCO-Acid羧酸引入体(+559.207))的由33个氨基酸残基形成的肽、THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISR(SEQ ID NO:6)的肽片段的MS谱(实测值:m/z1055.77631，理论值:1055.77600，4价)(图109)，根据CID谱确认了表示重链的EUnumbering中的第246位或第248位的赖氨酸残基的修饰的、对应于二价的y12的m/z 971.71(理论值:971.50)的产物离子(图110-1)。此外，通过采用Proteome Discoverer的分析，表明高选择性地发生了对第246位或第248位的赖氨酸残基的修饰(图110-2)。
由该结果可知，(85-1)中，抗体上在重链上的EU numbering中的Lys246及Lys248区域选择性地进行了偶联。
实施例86：抗TNF-αIgG1抗体阿达木单抗的特异性修饰
(86-1)抗TNF-αIgG1抗体阿达木单抗的特异性修饰和基于ESI-TOFMS的分析
将(81-3)中合成的肽-连接体偶联物-苯硫酚活化体溶解于N,N'-二甲基甲酰胺成为21.6mM。使500μg的抗TNF-αIgG1抗体阿达木单抗(卫材株式会社)溶解于200μL的50mM的乙酸钠缓冲液(pH5.5)，加入4.7μL的4mM的肽试剂(相对于抗体为10当量)，室温下搅拌1小时。将反应液置换为100mM柠檬酸钠缓冲液(pH 2.9)而使反应停止，进而置换为20mM的PBS缓冲液。通过ESI-TOFMS测定质量时，原料的阿达木单抗在148086观测到峰，关于反应产物，引入了2个结合性肽的产物在152605确认到峰(图111)。
(86-2)抗TNF-αIgG1抗体阿达木单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析
通过HIC对(86-1)中生成的阿达木单抗-肽复合物和原料的抗体进行了分析。柱使用了Protein-Pak Hi Res HIC柱(沃特世公司)4.6×100mm 2.5μm。使用A_Buffer:0.1M PiNa,2.3M(NH4)2SO4,pH7.0、B_Buffer:0.1M PiNa,pH7.0，流速为0.6mL/分钟，梯度设为A 60％B40％→A0％B 100％、16分钟(数据采集20分钟)，柱温为40℃，恒温器温度为40℃，检测器用280nm的波长进行了检测。
对于样品，按照以下的条件进行反应。
a:阿达木单抗原料
b:阿达木单抗+肽-连接体偶联物-苯硫酚活化体10当量。
保留时间10.5137分钟被认为是引入了2个肽的化合物(图112)。
(86-3)阿达木单抗-肽复合物的连接体切割
将(86-2)中得到的阿达木单抗-肽复合物(20mM PBS缓冲液)通过Amicon3K置换为0.5M羟胺、10mM EDTA(pH5.5)溶液，在室温下静置2小时。2小时后，置换为20mM PBS缓冲液、10mMEDTA(pH7.4)，获得阿达木单抗巯基引入体。通过ESI-TOFMS测定质量时，关于原料的阿达木单抗-肽复合物，在152606观测到峰，关于反应产物的阿达木单抗巯基引入体，在148264确认到峰(图113)。
(86-4)阿达木单抗巯基引入体的HIC-UPLC分析
通过HIC对(86-3)中生成的阿达木单抗-肽复合物和原料的抗体进行了分析。柱使用了Protein-Pak Hi Res HIC柱(沃特世公司)4.6×100mm 2.5μm。使用A_Buffer:0.1M PiNa,2.3M(NH4)2SO4,pH7.0、B_Buffer:0.1M PiNa,pH7.0，流速为0.6mL/分钟，梯度设为A 60％B40％→A0％B 100％、16分钟(数据采集20分钟)，柱温为40℃，恒温器温度为40℃，检测器用280nm的波长进行了检测。
对于样品，按照以下的条件进行反应。
a:阿达木单抗-肽-连接体偶联物；
b:阿达木单抗巯基引入体。
保留时间8.9039分钟被认为是引入了2个巯基的化合物(图114)。
(86-5)对阿达木单抗巯基引入体的荧光标记
对于(86-3)中得到的阿达木单抗巯基引入体(20mM PBS缓冲液、10mM EDTA)，加入5当量的荧光素-5-马来酰亚胺(10mM，溶解于DMSO)。室温下静置1小时后，置换为20mM PBS缓冲液，获得阿达木单抗荧光标记体(ADC mimic)。
(86-6)阿达木单抗荧光标记体的还原条件下的基于ESI-TOFMS分析的重链选择性的确认
向(86-5)中生成的阿达木单抗荧光标记体(ADC mimic)中加入5μL的7mM的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐溶液(相对于抗体为等量)，室温下搅拌20分钟。通过ESI-TOFMS测定质量时，关于原料、产物均观测到同样的轻链峰，关于原料的阿达木单抗在50730观测到重链峰，关于产物在重链中引入了荧光素在51156观测到峰(图115)。
实施例87：抗RANKL IgG2抗体地诺单抗的特异性修饰
(87-1)抗RANKL IgG2抗体地诺单抗的特异性修饰和基于ESI-TOFMS的分析
将(81-3)中合成的肽-连接体偶联物-苯硫酚活化体溶解于N,N'-二甲基甲酰胺成为21.6mM。使500μg的抗RANKL IgG2抗体地诺单抗(第一三共株式会社)溶解于200μL的50mM的乙酸钠缓冲液(pH 5.5)，加入4.7μL的4mM的肽试剂(相对于抗体为10当量)，室温下搅拌1小时。将反应液置换为100mM柠檬酸钠缓冲液(pH 2.9)而使反应停止，进而置换为20mM的PBS缓冲液。通过ESI-TOFMS测定质量时，原料的地诺单抗在147358.97观测到峰，关于反应产物，引入了2个结合性肽的产物在151878.61确认到峰(图116)。
(87-2)抗RANKL IgG2抗体地诺单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析
通过HIC对(87-1)中生成的地诺单抗-肽复合物和原料的抗体进行了分析。柱使用了Protein-Pak Hi Res HIC柱(沃特世公司)4.6×100mm 2.5μm。使用A_Buffer:0.1M PiNa,2.3M(NH4)2SO4,pH7.0、B_Buffer:0.1M PiNa,pH7.0，流速为0.6mL/分钟，梯度设为A 60％B40％→A0％B 100％、16分钟(数据采集20分钟)，柱温为40℃，恒温器温度为40℃，检测器用280nm的波长进行了检测。
对于样品，按照以下的条件进行反应。
a:地诺单抗原料
b:地诺单抗+肽-连接体偶联物-苯硫酚活化体10当量。
保留时间10.1314分钟被认为是引入了2个肽的化合物(图117)。
(87-3)地诺单抗-肽复合物的连接体切割
将(87-2)中得到的地诺单抗-肽复合物(20mM PBS缓冲液)通过Amicon3K置换为0.5M羟胺、10mM EDTA(pH5.5)溶液，在室温下静置2小时。2小时后，置换为20mM PBS缓冲液、10mMEDTA(pH7.4)，获得地诺单抗巯基引入体。通过ESI-TOFMS测定质量时，原料的地诺单抗-肽复合物在151878观测到峰，反应产物的地诺单抗巯基引入体在147535确认到峰(图118)。
(87-4)地诺单抗巯基引入体的HIC-UPLC分析
通过HIC对(87-3)中生成的地诺单抗-肽复合物和原料的抗体进行了分析。柱使用了Protein-Pak Hi Res HIC柱(沃特世公司)4.6×100mm 2.5μm。使用A_Buffer:0.1M PiNa,2.3M(NH4)2SO4,pH7.0、B_Buffer:0.1M PiNa,pH7.0，流速为0.6mL/分钟，梯度设为A 60％B40％→A0％B 100％、16分钟(数据采集20分钟)，柱温为40℃，恒温器温度为40℃，检测器用280nm的波长进行了检测。
对于样品，按照以下的条件进行反应。
a:地诺单抗-肽-连接体偶联物
b:地诺单抗巯基引入体。
保留时间8.6368分钟被认为是引入了2个巯基的化合物(图119)。
(87-5)对地诺单抗巯基引入体的荧光标记
对于(87-3)中得到的地诺单抗巯基引入体(20mM PBS缓冲液、10mM EDTA)，加入5当量的荧光素-5-马来酰亚胺(10mM，溶解于DMSO)。室温下静置1小时后，置换为20mM PBS缓冲液，获得地诺单抗荧光标记体(ADC mimic)。
(87-6)地诺单抗荧光标记体的还原条件下的基于ESI-TOFMS分析的重链选择性的确认
向(87-5)中生成的地诺单抗荧光标记体(ADC mimic)中加入5μL的7mM的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐溶液(相对于抗体为等量)，室温下搅拌20分钟。通过ESI-TOFMS测定质量时，关于原料、产物均观测到同样的轻链峰，关于原料的地诺单抗在50292观测到重链峰，关于产物在重链中引入了荧光素在50717观测到峰(图120)。
实施例88：抗IL-4/13受体IgG4抗体度匹鲁单抗的特异性修饰
(88-1)抗IL-4/13受体IgG4抗体度匹鲁单抗的特异性修饰和基于ESI-TOFMS的分析
将(81-3)中合成的肽-连接体偶联物-苯硫酚活化体溶解于N,N'-二甲基甲酰胺成为21.6mM。使500μg的抗IL-4/13受体IgG4抗体度匹鲁单抗(赛诺菲再生元制药(SanofiRegeneron))溶解于200μL的50mM的乙酸钠缓冲液(pH5.5)，加入4.7μL的4mM的肽试剂(相对于抗体为10当量)，室温下搅拌1小时。将反应液置换为100mM柠檬酸钠缓冲液(pH 2.9)而使反应停止，进而置换为20mM的PBS缓冲液。通过ESI-TOFMS测定质量时，原料的度匹鲁单抗在149796观测到峰，关于反应产物，引入了2个结合性肽的产物在154315确认到峰(图121)。
(88-2)抗IL-4/13受体IgG4抗体度匹鲁单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析
通过HIC对(88-1)中生成的度匹鲁单抗-肽复合物和原料的抗体进行了分析。柱使用了Protein-Pak Hi Res HIC柱(沃特世公司)4.6×100mm 2.5μm。使用A_Buffer:0.1M PiNa,2.3M(NH4)2SO4,pH7.0、B_Buffer:0.1M PiNa,pH7.0，流速为0.6mL/分钟，梯度设为A 60％B40％→A0％B 100％、16分钟(数据采集20分钟)，柱温为40℃，恒温器温度为40℃，检测器用280nm的波长进行了检测。
对于样品，按照以下的条件进行反应。
a:度匹鲁单抗原料；
b:度匹鲁单抗+肽-连接体偶联物-苯硫酚活化体10当量。
保留时间12.5569分钟被认为是引入了2个肽的化合物(图122)。
(88-3)度匹鲁单抗-肽复合物的连接体切割
将(88-2)中得到的度匹鲁单抗-肽复合物(20mM PBS缓冲液)通过Amicon3K置换为0.5M羟胺、10mM EDTA(pH5.5)溶液，在室温下静置2小时。2小时后，置换为20mM PBS缓冲液、10mMEDTA(pH7.4)，获得度匹鲁单抗巯基引入体。通过ESI-TOFMS测定质量时，原料的度匹鲁单抗-肽复合物在154315观测到峰，反应产物的度匹鲁单抗巯基引入体在149975确认到峰(图123)。
(88-4)度匹鲁单抗巯基引入体的HIC-UPLC分析
通过HIC对(88-3)中生成的度匹鲁单抗-肽复合物和原料的抗体进行了分析。柱使用了Protein-Pak Hi Res HIC柱(沃特世公司)4.6×100mm 2.5μm。使用A_Buffer:0.1M PiNa,2.3M(NH4)2SO4,pH7.0、B_Buffer:0.1M PiNa,pH7.0，流速为0.6mL/分钟，梯度设为A 60％B40％→A0％B 100％、16分钟(数据采集20分钟)，柱温为40℃，恒温器温度为40℃，检测器用280nm的波长进行了检测。
对于样品，按照以下的条件进行反应。
a:度匹鲁单抗-肽-连接体偶联物；
b:度匹鲁单抗巯基引入体。
保留时间11.4941分钟被认为是引入了2个巯基的化合物(图124)。
(88-5)对度匹鲁单抗巯基引入体的荧光标记
对于(88-3)中得到的度匹鲁单抗巯基引入体(20mM PBS缓冲液、10mM EDTA)，加入5当量的荧光素-5-马来酰亚胺(10mM，溶解于DMSO)。室温下静置1小时后，置换为20mM PBS缓冲液，获得度匹鲁单抗荧光标记体(ADC mimic)。
(88-6)度匹鲁单抗荧光标记体的还原条件下的基于ESI-TOFMS分析的重链选择性的确认
向(88-5)中生成的度匹鲁单抗荧光标记体(ADC mimic)中加入5μL的7mM的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐溶液(相对于抗体为等量)，室温下搅拌20分钟。通过ESI-TOFMS测定质量时，关于原料、产物均观测到同样的轻链峰，关于原料的度匹鲁单抗巯基引入体，在50973观测到重链峰，关于产物，在重链中引入了荧光素在51399观测到峰(图125)。
(汇总)
以上的结果汇总如下。
[表2]
表2.亲和性肽的汇总(其一)
Figure BDA0002827785710003251
[表3]
表3.亲和性肽的汇总(其二)
氨基酸序列 SEQ ID NO： 实施例
CAYHKGQLVWC 33 30
RGNCAYHKAQLVWCTYH 34 31
RGNCAYHKVQLVWCTYH 35 32
RGNCAYHKLQLVWCTYH 36 33
RGNCAYHKIQLVWCTYH 37 34
RGNCAYHKSQLVWCTYH 38 35
RGNCAYHKTQLVWCTYH 39 36
RGNCAYHKNQLVWCTYH 40 37
RGNCAYHKDQLVWCTYH 41 38
RGNCAYHKQQLVWCTYH 42 39
RGNCAYHKEQLVWCTYH 43 40
RGNCAYHKFQLVWCTYH 44 41
RGNCAYHKRQLVWCTYH 45 42
RGNCAYHKHQLVWCTYH 46 43
RGNCAYHKWQLVWCTYH 47 44
RGNCAYHKYQLVWCTYH 48 45
RGNCAYFKGQLVWCTYH 49 46
RGNCAYYKGQLVWCTYH 50 47
RGNCAYWKGQLVWCTYH 51 48
RGNCAYRKGQLVWCTYH 52 49
RGNCAYGKGQLVWCTYH 53 50
DCAYHKGQLVWC 54 51
NCAYHKGQLVWC 55 52
CAYHKGQLVWCT 56 53
CAYHKSQLVWC 57 54
[表4]
表4.亲和性肽的汇总(其三)
氨基酸序列 SEQ ID NO： 实施例
RGNCAWHKGQIIWCTYH 68 55
RGNCAFHKGQIIWCTYH 69 56
RGNCAHHKGQIIWCTYH 70 57
RGNCGYHKGQIIWCTYH 71 58
RGNCLYHKGQIIWCTYH 72 59
RGNCPYHKGQIIWCTYH 73 60
RGNCRYHKGQIIWCTYH 74 61
RGNCVYHKGQIIWCTYH 75 62
RGNCNYHKGQIIWCTYH 76 63
RGNCEYHKGQIIWCTYH 77 64
RGNCFYHKGQIIWCTYH 78 65
RGNCAYHKGEIIWCTYH 79 66
RGNCAYHKGNIIWCTYH 80 67
RGNCAYHKGPIIWCTYH 81 68
RGNCAYHKGGIIWCTYH 82 69
RGNCAYHKGDIIWCTYH 83 70
RGNCAYHKGRIIWCTYH 84 71
RGNCAYHKGFIIWCTYH 85 72
RGNCAYHKGHIIWCTYH 86 73
DCAYHKGQIIWCT 87 74
NCAYHKGQIIWCT 88 75
GNCAYHKGQIIWCTY 89 76
GCAYHKGQIIWCG 90 77
GGCAYHKGQIIWCGG 91 78
GGGCAYHKGQIIWCGGG 92 79
此外，关于抗体，显示可实现以第246位和/或第248位的赖氨酸残基(例如，实施例2、6、81、84、85)为代表的特定氨基酸残基的区域选择性修饰。
继而，关于以下述式(I)表示的具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的下述的化合物，举出部分实施例为例进行说明时，如以下的表5所示。
A-L-B-R (I)
式中，
A为针对抗体的亲和性物质，
L为切割性连接体，该切割性连接体为包含切割性部分的二价基团，
B为(a)包含生物正交性官能团的二价基团、或者(b)不含生物正交性官能团的二价基团，
R为针对所述抗体的反应性基团。
L为：(i)切割性连接体，该切割性连接体是包含切割性部分的二价基团，该切割性部分具有通过切割而在反应性基团侧生成生物正交性官能团的能力；或者(ii)切割性连接体，该切割性连接体是包含切割性部分的二价基团，该切割性部分不具有通过切割而在反应性基团侧生成生物正交性官能团的能力。
[表5]
表5.“具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物”与“可由其制造的具有生物正交性官能团的抗体”的关系
Figure BDA0002827785710003281
*从抗体延伸的NH-C4烷基部分来自于抗体的赖氨酸残基侧链(下同)
对于具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的各种化合物，如上所述，可通过适当改变针对抗体的亲和性物质(A)、作为包含切割性部分的二价基团的切割性连接体(L)、(a)包含生物正交性官能团的二价基团或者(b)不含生物正交性官能团的二价基团(B)、针对抗体的反应性基团(R)的种类，按照周知的有机合成方法制备。本发明中可制备的“具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物的进一步的例子”与“可由其制造的具有生物正交性官能团的抗体”的关系如下。
[表6]
表6.“具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的进一步的例子”与“可由其制造的具有生物正交性官能团的抗体”的关系(其一)
Figure BDA0002827785710003291
[表7]
表7.“具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的进一步的例子”与“可由其制造的具有生物正交性官能团的抗体”的关系(其二)
Figure BDA0002827785710003301
[表8]
表8.“具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的进一步的例子”与“可由其制造的具有生物正交性官能团的抗体”的关系(其三)
Figure BDA0002827785710003311
[表9]
表9.“具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的进一步的例子”与“可由其制造的具有生物正交性官能团的抗体”的关系(其四)
Figure BDA0002827785710003321
[表10]
表10.“具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的进一步的例子”与“可由其制造的具有生物正交性官能团的抗体”的关系(其五)
Figure BDA0002827785710003331
以上内容显示，通过在具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物中，适当调节亲和性物质的种类、亲和性物质与反应性基团之间的连接体的长度、以及连接体所引入的亲和性物质中的位置等因素，可区域选择性地修饰抗体。
工业上利用的可能性
本发明可用于例如区域选择性地进行了修饰的抗体的制造。
Figure IDA0002827785790000011
Figure IDA0002827785790000021
Figure IDA0002827785790000031
Figure IDA0002827785790000041
Figure IDA0002827785790000051
Figure IDA0002827785790000061
Figure IDA0002827785790000071
Figure IDA0002827785790000081
Figure IDA0002827785790000091
Figure IDA0002827785790000101
Figure IDA0002827785790000111
Figure IDA0002827785790000121
Figure IDA0002827785790000131
Figure IDA0002827785790000141
Figure IDA0002827785790000151
Figure IDA0002827785790000161
Figure IDA0002827785790000171
Figure IDA0002827785790000181
Figure IDA0002827785790000191
Figure IDA0002827785790000201
Figure IDA0002827785790000211
Figure IDA0002827785790000221
Figure IDA0002827785790000231
Figure IDA0002827785790000241
Figure IDA0002827785790000251
Figure IDA0002827785790000261
Figure IDA0002827785790000271
Figure IDA0002827785790000281
Figure IDA0002827785790000291
Figure IDA0002827785790000301
Figure IDA0002827785790000311
Figure IDA0002827785790000321
Figure IDA0002827785790000331
Figure IDA0002827785790000341
Figure IDA0002827785790000351
Figure IDA0002827785790000361
Figure IDA0002827785790000371
Figure IDA0002827785790000381
Figure IDA0002827785790000391
Figure IDA0002827785790000401
Figure IDA0002827785790000411
Figure IDA0002827785790000421
Figure IDA0002827785790000431
Figure IDA0002827785790000441
Figure IDA0002827785790000451
Figure IDA0002827785790000461
Figure IDA0002827785790000471
Figure IDA0002827785790000481
Figure IDA0002827785790000491
Figure IDA0002827785790000501
Figure IDA0002827785790000511
Figure IDA0002827785790000521
Figure IDA0002827785790000531

Claims (31)

1.一种具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物或其盐，其中，
所述化合物以下述式(I)表示，
A-L-B-R (I)
式中，
A为针对抗体的亲和性物质，
L为切割性连接体，该切割性连接体为包含切割性部分的二价基团，
B为(a)包含生物正交性官能团的二价基团、或者(b)不含生物正交性官能团的二价基团，
R为针对所述抗体的反应性基团；
并且，针对抗体的亲和性物质为包含以下的任一氨基酸序列的肽：
式1-1：(X0-3)a-C-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-I-I-W-C-(X0-3)b(SEQ ID NO:58)
式1-2：(X0-3)a-C-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-I-V-W-C-(X0-3)b(SEQ ID NO:59)
式1-3：(X0-3)a-C-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-V-V-W-C-(X0-3)b(SEQ ID NO:60)
式1-4：(X0-3)a-C-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-A-V-W-C-(X0-3)b(SEQ ID NO:61)
式1-5：(X0-3)a-C-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-L-L-W-C-(X0-3)b(SEQ ID NO:62)
式1-6：(X0-3)a-C-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-L-I-W-C-(X0-3)b(SEQ ID NO:63)
式1-7：(X0-3)a-C-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-L-V-F-C-(X0-3)b(SEQ ID NO:64)
式1-8：(X0-3)a-C-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Q-V-W-C-(X0-3)b(SEQ ID NO:65)
式1-9：(X0-3)a-C-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-E-V-W-C-(X0-3)b(SEQ ID NO:66)，
式中，
(X0-3)a不存在、或者为1～3个连续的相同或不同的任意氨基酸残基(除赖氨酸残基和半胱氨酸残基以外)，
(X0-3)b不存在、或者为1～3个连续的相同或不同的任意氨基酸残基(除赖氨酸残基和半胱氨酸残基以外)，
Xaa1为丙氨酸残基、甘氨酸残基、亮氨酸残基、脯氨酸残基、精氨酸残基、缬氨酸残基、天冬酰胺残基、谷氨酸残基、或苯丙氨酸残基，
Xaa2为酪氨酸残基、色氨酸残基、组氨酸残基、或苯丙氨酸残基，
Xaa3为组氨酸残基、苯丙氨酸残基、酪氨酸残基、色氨酸残基、精氨酸残基、或甘氨酸残基，
Xaa4为赖氨酸残基，
Xaa5为甘氨酸残基、丝氨酸残基、天冬酰胺残基、谷氨酰胺残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、苯丙氨酸残基、酪氨酸残基、色氨酸残基、组氨酸残基、苏氨酸残基、亮氨酸残基、丙氨酸残基、缬氨酸残基、异亮氨酸残基、或精氨酸残基，
Xaa6为谷氨酰胺残基、谷氨酸残基、天冬酰胺残基、天冬氨酸残基、脯氨酸残基、甘氨酸残基、精氨酸残基、苯丙氨酸残基、或组氨酸残基；或者
式2-1：(X0-3')a-C-Xaa1'-Xaa2'-Xaa3'-Xaa4'-Xaa5'-Xaa6'-L-V-W-C-(X0-3')b(SEQ IDNO:67)，
式中，
(X0-3')a和(X0-3')b分别与所述(X0-3)a和(X0-3)b含义相同，
Xaa1'、Xaa2'、Xaa3'、Xaa4'、Xaa5'、Xaa6'分别与所述Xaa1、Xaa2、Xaa3、Xaa4、Xaa5、Xaa6含义相同，
但是，不包括(X0-3')a为1～3个连续的相同或不同的任意氨基酸残基、(X0-3')b为1～3个连续的相同或不同的任意氨基酸残基、Xaa3'为组氨酸残基、且Xaa5'为甘氨酸残基的情况。
2.根据权利要求1所述的化合物或其盐，其中，
(X0-3)a不存在、或者为精氨酸残基-甘氨酸残基-天冬酰胺残基、天冬氨酸残基、或天冬酰胺残基，
(X0-3)b不存在、或者为苏氨酸残基-酪氨酸残基-组氨酸残基、或苏氨酸残基，
Xaa1为丙氨酸残基，
Xaa2为酪氨酸残基、色氨酸残基、或组氨酸残基，
Xaa6为谷氨酰胺残基、谷氨酸残基、天冬酰胺残基、或天冬氨酸残基。
3.根据权利要求1所述的化合物或其盐，其中，
(X0-3)a为甘氨酸残基-天冬酰胺残基、甘氨酸残基、甘氨酸残基-甘氨酸残基、或甘氨酸残基-甘氨酸残基-甘氨酸残基，
(X0-3)b为苏氨酸残基-酪氨酸残基、甘氨酸残基、甘氨酸残基-甘氨酸残基、或甘氨酸残基-甘氨酸残基-甘氨酸残基，
Xaa1为甘氨酸残基、亮氨酸残基、脯氨酸残基、精氨酸残基、缬氨酸残基、天冬酰胺残基、谷氨酸残基、或苯丙氨酸残基，
Xaa2为苯丙氨酸残基，
Xaa6为脯氨酸残基、甘氨酸残基、精氨酸残基、苯丙氨酸残基、或组氨酸残基。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的化合物或其盐，其中，针对抗体的亲和性物质为包含选自下述组中的氨基酸序列的肽：
(1)RGNCAYHKGQIIWCTYH(SEQ ID NO:5)；
(2)RGNCAYHKGQIVWCTYH(SEQ ID NO:8)；
(3)RGNCAYHKGQVVWCTYH(SEQ ID NO:9)；
(4)RGNCAYHKGQAVWCTYH(SEQ ID NO:10)；
(5)RGNCAYHKGQLLWCTYH(SEQ ID NO:11)；
(6)RGNCAYHKGQLIWCTYH(SEQ ID NO:12)；
(7)DCAYHKGQIVWCT(SEQ ID NO:13)；
(8)DCAYHKGQVVWCT(SEQ ID NO:14)；
(9)DCAYHKGQAVWCT(SEQ ID NO:15)；
(10)RGNCAYHKSQIIWCTYH(SEQ ID NO:16)；
(11)RGNCAYHKNQIIWCTYH(SEQ ID NO:17)；
(12)RGNCAYHKDQIIWCTYH(SEQ ID NO:18)；
(13)RGNCAYHKQQIIWCTYH(SEQ ID NO:19)；
(14)RGNCAYHKEQIIWCTYH(SEQ ID NO:20)；
(15)RGNCAYHKFQIIWCTYH(SEQ ID NO:21)；
(16)RGNCAYHKYQIIWCTYH(SEQ ID NO:22)；
(17)RGNCAYHKWQIIWCTYH(SEQ ID NO:23)；
(18)RGNCAYHKHQIIWCTYH(SEQ ID NO:24)；
(19)RGNCAYHKTQIIWCTYH(SEQ ID NO:25)；
(20)RGNCAYHKLQIIWCTYH(SEQ ID NO:26)；
(21)CAYHKLQIVWC(SEQ ID NO:27)；
(22)CAYHKLQLIWC(SEQ ID NO:28)；
(23)CAYHKSQIVWC(SEQ ID NO:29)；
(24)RGNCAYHKGQLVFCTYH(SEQ ID NO:30)；
(25)RGNCAYHKGQQVWCTYH(SEQ ID NO:31)；
(26)RGNCAYHKGQEVWCTYH(SEQ ID NO:32)；
(27)CAYHKGQLVWC(SEQ ID NO:33)；
(28)RGNCAYHKAQLVWCTYH(SEQ ID NO:34)；
(29)RGNCAYHKVQLVWCTYH(SEQ ID NO:35)；
(30)RGNCAYHKLQLVWCTYH(SEQ ID NO:36)；
(31)RGNCAYHKIQLVWCTYH(SEQ ID NO:37)；
(32)RGNCAYHKSQLVWCTYH(SEQ ID NO:38)；
(33)RGNCAYHKTQLVWCTYH(SEQ ID NO:39)；
(34)RGNCAYHKNQLVWCTYH(SEQ ID NO:40)；
(35)RGNCAYHKDQLVWCTYH(SEQ ID NO:41)；
(36)RGNCAYHKQQLVWCTYH(SEQ ID NO:42)；
(37)RGNCAYHKEQLVWCTYH(SEQ ID NO:43)；
(38)RGNCAYHKFQLVWCTYH(SEQ ID NO:44)；
(39)RGNCAYHKRQLVWCTYH(SEQ ID NO:45)；
(40)RGNCAYHKHQLVWCTYH(SEQ ID NO:46)；
(41)RGNCAYHKWQLVWCTYH(SEQ ID NO:47)；
(42)RGNCAYHKYQLVWCTYH(SEQ ID NO:48)；
(43)RGNCAYFKGQLVWCTYH(SEQ ID NO:49)；
(44)RGNCAYYKGQLVWCTYH(SEQ ID NO:50)；
(45)RGNCAYWKGQLVWCTYH(SEQ ID NO:51)；
(46)RGNCAYRKGQLVWCTYH(SEQ ID NO:52)；
(47)RGNCAYGKGQLVWCTYH(SEQ ID NO:53)；
(48)DCAYHKGQLVWC(SEQ ID NO:54)；
(49)NCAYHKGQLVWC(SEQ ID NO:55)；
(50)CAYHKGQLVWCT(SEQ ID NO:56)；
(51)CAYHKSQLVWC(SEQ ID NO:57)；
(52)RGNCAWHKGQIIWCTYH(SEQ ID NO:68)；
(53)RGNCAFHKGQIIWCTYH(SEQ ID NO:69)；
(54)RGNCAHHKGQIIWCTYH(SEQ ID NO:70)；
(55)RGNCGYHKGQIIWCTYH(SEQ ID NO:71)；
(56)RGNCLYHKGQIIWCTYH(SEQ ID NO:72)；
(57)RGNCPYHKGQIIWCTYH(SEQ ID NO:73)；
(58)RGNCRYHKGQIIWCTYH(SEQ ID NO:74)；
(59)RGNCVYHKGQIIWCTYH(SEQ ID NO:75)；
(60)RGNCNYHKGQIIWCTYH(SEQ ID NO:76)；
(61)RGNCEYHKGQIIWCTYH(SEQ ID NO:77)；
(62)RGNCFYHKGQIIWCTYH(SEQ ID NO:78)；
(63)RGNCAYHKGEIIWCTYH(SEQ ID NO:79)；
(64)RGNCAYHKGNIIWCTYH(SEQ ID NO:80)；
(65)RGNCAYHKGPIIWCTYH(SEQ ID NO:81)；
(66)RGNCAYHKGGIIWCTYH(SEQ ID NO:82)；
(67)RGNCAYHKGDIIWCTYH(SEQ ID NO:83)；
(68)RGNCAYHKGRIIWCTYH(SEQ ID NO:84)；
(69)RGNCAYHKGFIIWCTYH(SEQ ID NO:85)；
(70)RGNCAYHKGHIIWCTYH(SEQ ID NO:86)；
(71)DCAYHKGQIIWCT(SEQ ID NO:87)；
(72)NCAYHKGQIIWCT(SEQ ID NO:88)；
(73)GNCAYHKGQIIWCTY(SEQ ID NO:89)；
(74)GCAYHKGQIIWCG(SEQ ID NO:90)；
(75)GGCAYHKGQIIWCGG(SEQ ID NO:91)；和
(76)GGGCAYHKGQIIWCGGG(SEQ ID NO:92)。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的化合物或其盐，其中，L为：
(i)切割性连接体，该切割性连接体是包含切割性部分的二价基团，该切割性部分具有通过切割而在反应性基团侧生成生物正交性官能团的能力；或者
(ii)切割性连接体，该切割性连接体是包含切割性部分的二价基团，该切割性部分不具有通过切割而在反应性基团侧生成生物正交性官能团的能力。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的化合物或其盐，其中，所述切割性部分为可通过下述(a)～(c)中的任一种处理进行切割的部分，
(a)采用选自酸性物质、碱性物质、还原剂、氧化剂、酶中的1种以上的物质进行的处理；
(b)采用选自光的物理化学刺激进行的处理；或者
(c)在使用包含可自体分解的切割性部分的切割性连接体的情况下进行的放置。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的化合物或其盐，其中，所述切割性部分选自二硫残基、缩醛残基、缩酮残基、酯残基、氨甲酰基残基、烷氧基烷基残基、亚胺残基、叔烷基氧基氨基甲酸酯残基、硅烷残基、含有腙的残基、氨基磷酸酯残基、乌头酰基残基、三苯甲基残基、偶氮残基、邻二醇残基、硒残基、含有具有吸电子基团的芳环的残基、含有香豆素的残基、含有砜的残基、含有不饱和键的链残基、糖基残基。
8.根据权利要求5～7中任一项所述的化合物或其盐，其中，所述(i)的切割性部分选自二硫残基、酯残基、缩醛残基、缩酮残基、亚胺残基、邻二醇残基。
9.根据权利要求5～7中任一项所述的化合物或其盐，其中，所述(ii)的切割性部分选自酯残基、氨甲酰基残基、烷氧基烷基残基、亚胺残基、叔烷基氧基氨基甲酸酯残基、硅烷残基、含有腙的残基、氨基磷酸酯残基、乌头酰基残基、三苯甲基残基、偶氮残基、邻二醇残基、硒残基、含有具有吸电子基团的芳环的残基、含有香豆素的残基、含有砜的残基、含有不饱和键的链残基、糖基残基。
10.根据权利要求1～9中任一项所述的化合物或其盐，其中，生物正交性官能团选自叠氮残基、醛残基、硫醇残基、炔烃残基、烯烃残基、卤素残基、四嗪残基、硝酮残基、羟胺残基、腈残基、肼残基、酮残基、硼酸残基、氰基苯并噻唑残基、烯丙基残基、膦残基、马来酰亚胺残基、二硫残基、硫酯残基、α-卤代羰基残基、异腈残基、斯德酮残基、及硒残基。
11.根据权利要求1～10中任一项所述的化合物或其盐，其中，反应性基团为对于赖氨酸残基、酪氨酸残基或色氨酸残基中的任一残基的侧链具有特异性的反应性基团。
12.根据权利要求11所述的化合物或其盐，其中，反应性基团为对于赖氨酸残基的侧链具有特异性的反应性基团。
13.根据权利要求1～12中任一项所述的化合物或其盐，其中，具有选自下述(a)～(c)中的1个以上的特征：
(a)连结A和R的主链的原子数为4～20个；
(b)连结A和R的主链不含环结构；
(c)以L-B表示的部分结构不含肽部分。
14.一种抗体的区域选择性修饰试剂，其中，该试剂包含以下述式(I)表示且具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物或其盐，
A-L-B-R (I)
式中，
A为针对抗体的亲和性物质，
L为切割性连接体，该切割性连接体为包含切割性部分的二价基团，
B为(a)包含生物正交性官能团的二价基团、或者(b)不含生物正交性官能团的二价基团，R为针对所述抗体的反应性基团；
并且，针对抗体的亲和性物质为包含以下的任一氨基酸序列的肽：
式1-1：(X0-3)a-C-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-I-I-W-C-(X0-3)b(SEQ ID NO:58)
式1-2：(X0-3)a-C-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-I-V-W-C-(X0-3)b(SEQ ID NO:59)
式1-3：(X0-3)a-C-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-V-V-W-C-(X0-3)b(SEQ ID NO:60)
式1-4：(X0-3)a-C-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-A-V-W-C-(X0-3)b(SEQ ID NO:61)
式1-5：(X0-3)a-C-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-L-L-W-C-(X0-3)b(SEQ ID NO:62)
式1-6：(X0-3)a-C-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-L-I-W-C-(X0-3)b(SEQ ID NO:63)
式1-7：(X0-3)a-C-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-L-V-F-C-(X0-3)b(SEQ ID NO:64)
式1-8：(X0-3)a-C-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Q-V-W-C-(X0-3)b(SEQ ID NO:65)
式1-9：(X0-3)a-C-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-E-V-W-C-(X0-3)b(SEQ ID NO:66)，
式中，
(X0-3)a不存在、或者为1～3个连续的相同或不同的任意氨基酸残基(除赖氨酸残基和半胱氨酸残基以外)，
(X0-3)b不存在、或者为1～3个连续的相同或不同的任意氨基酸残基(除赖氨酸残基和半胱氨酸残基以外)，
Xaa1为丙氨酸残基、甘氨酸残基、亮氨酸残基、脯氨酸残基、精氨酸残基、缬氨酸残基、天冬酰胺残基、谷氨酸残基、或苯丙氨酸残基，
Xaa2为酪氨酸残基、色氨酸残基、组氨酸残基、或苯丙氨酸残基，
Xaa3为组氨酸残基、苯丙氨酸残基、酪氨酸残基、色氨酸残基、精氨酸残基、或甘氨酸残基，
Xaa4为赖氨酸残基，
Xaa5为甘氨酸残基、丝氨酸残基、天冬酰胺残基、谷氨酰胺残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、苯丙氨酸残基、酪氨酸残基、色氨酸残基、组氨酸残基、苏氨酸残基、亮氨酸残基、丙氨酸残基、缬氨酸残基、异亮氨酸残基、或精氨酸残基，
Xaa6为谷氨酰胺残基、谷氨酸残基、天冬酰胺残基、天冬氨酸残基、脯氨酸残基、甘氨酸残基、精氨酸残基、苯丙氨酸残基、或组氨酸残基；或者
式2-1：(X0-3')a-C-Xaa1'-Xaa2'-Xaa3'-Xaa4'-Xaa5'-Xaa6'-L-V-W-C-(X0-3')b(SEQ IDNO:67)，
式中，
(X0-3')a和(X0-3')b分别与所述(X0-3)a和(X0-3)b含义相同，
Xaa1'、Xaa2'、Xaa3'、Xaa4'、Xaa5'、Xaa6'分别与所述Xaa1、Xaa2、Xaa3、Xaa4、Xaa5、Xaa6含义相同，
但是，不包括(X0-3')a为1～3个连续的相同或不同的任意氨基酸残基、(X0-3')b为1～3个连续的相同或不同的任意氨基酸残基、Xaa3'为组氨酸残基、且Xaa5'为甘氨酸残基的情况。
15.一种具有针对抗体的亲和性物质、及切割性部分的抗体或其盐，其中，
所述抗体以下述式(II)表示，
A-L-B-R'-T (II)
式中，
A为针对抗体的亲和性物质，
L为切割性连接体，该切割性连接体为包含切割性部分的二价基团，
B为(a)包含生物正交性官能团的二价基团、或者(b)不含生物正交性官能团的二价基团，
R'为通过抗体与反应性基团之间的反应而生成的部分，
T为抗体；
并且，针对抗体的亲和性物质为包含以下的任一氨基酸序列的肽：
式1-1：(X0-3)a-C-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-I-I-W-C-(X0-3)b(SEQ ID NO:58)
式1-2：(X0-3)a-C-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-I-V-W-C-(X0-3)b(SEQ ID NO:59)
式1-3：(X0-3)a-C-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-V-V-W-C-(X0-3)b(SEQ ID NO:60)
式1-4：(X0-3)a-C-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-A-V-W-C-(X0-3)b(SEQ ID NO:61)
式1-5：(X0-3)a-C-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-L-L-W-C-(X0-3)b(SEQ ID NO:62)
式1-6：(X0-3)a-C-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-L-I-W-C-(X0-3)b(SEQ ID NO:63)
式1-7：(X0-3)a-C-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-L-V-F-C-(X0-3)b(SEQ ID NO:64)
式1-8：(X0-3)a-C-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Q-V-W-C-(X0-3)b(SEQ ID NO:65)
式1-9：(X0-3)a-C-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-E-V-W-C-(X0-3)b(SEQ ID NO:66)，
式中，
(X0-3)a不存在、或者为1～3个连续的相同或不同的任意氨基酸残基(除赖氨酸残基和半胱氨酸残基以外)，
(X0-3)b不存在、或者为1～3个连续的相同或不同的任意氨基酸残基(除赖氨酸残基和半胱氨酸残基以外)，
Xaa1为丙氨酸残基、甘氨酸残基、亮氨酸残基、脯氨酸残基、精氨酸残基、缬氨酸残基、天冬酰胺残基、谷氨酸残基、或苯丙氨酸残基，
Xaa2为酪氨酸残基、色氨酸残基、组氨酸残基、或苯丙氨酸残基，
Xaa3为组氨酸残基、苯丙氨酸残基、酪氨酸残基、色氨酸残基、精氨酸残基、或甘氨酸残基，
Xaa4为赖氨酸残基，
Xaa5为甘氨酸残基、丝氨酸残基、天冬酰胺残基、谷氨酰胺残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、苯丙氨酸残基、酪氨酸残基、色氨酸残基、组氨酸残基、苏氨酸残基、亮氨酸残基、丙氨酸残基、缬氨酸残基、异亮氨酸残基、或精氨酸残基，
Xaa6为谷氨酰胺残基、谷氨酸残基、天冬酰胺残基、天冬氨酸残基、脯氨酸残基、甘氨酸残基、精氨酸残基、苯丙氨酸残基、或组氨酸残基；或者
式2-1：(X0-3')a-C-Xaa1'-Xaa2'-Xaa3'-Xaa4'-Xaa5'-Xaa6'-L-V-W-C-(X0-3')b(SEQ IDNO:67)，
式中，
(X0-3')a和(X0-3')b分别与所述(X0-3)a和(X0-3)b含义相同，
Xaa1'、Xaa2'、Xaa3'、Xaa4'、Xaa5'、Xaa6'分别与所述Xaa1、Xaa2、Xaa3、Xaa4、Xaa5、Xaa6含义相同，
但是，不包括(X0-3')a为1～3个连续的相同或不同的任意氨基酸残基、(X0-3')b为1～3个连续的相同或不同的任意氨基酸残基、Xaa3'为组氨酸残基、且Xaa5'为甘氨酸残基的情况。
16.根据权利要求15所述的抗体或其盐，其中，抗体为单克隆抗体。
17.根据权利要求15或16所述的抗体或其盐，其中，抗体为IgG抗体。
18.根据权利要求15～17中任一项所述的抗体或其盐，其中，抗体来源于人。
19.根据权利要求15～18中任一项所述的抗体或其盐，其中，抗体包含选自下述(A)～(C)中的任一种Fc区域蛋白质，且具有抗原结合能力：
(A)包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的Fc区域蛋白质；
(B)包含在SEQ ID NO:1的氨基酸序列中插入、添加、缺失或取代1个或数个氨基酸残基而形成的氨基酸序列的Fc区域蛋白质；或者
(C)包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列显示90％以上的同一性的氨基酸序列的Fc区域蛋白质。
20.根据权利要求15～19中任一项所述的抗体或其盐，其中，
抗体在由连续的1～50个氨基酸残基形成的靶区中包含1个以上的特定氨基酸残基，且在除所述靶区以外的非靶区中包含5个以上的所述特定氨基酸残基，
以A-L-B-R'表示的结构单元与所述靶区中所含的1个以上的特定氨基酸残基以30％以上的区域选择性结合。
21.根据权利要求20所述的抗体或其盐，其中，所述靶区为由连续的1～10个氨基酸残基形成的区域。
22.根据权利要求21所述的抗体或其盐，其中，所述靶区为由连续的1～3个氨基酸残基形成的区域。
23.根据权利要求22所述的抗体或其盐，其中，所述靶区为由人IgG Fc区域中的第246～248位的氨基酸残基形成的区域。
24.根据权利要求20～23中任一项所述的抗体或其盐，其中，所述区域选择性为50％以上。
25.根据权利要求24所述的抗体或其盐，其中，所述区域选择性为70％以上。
26.根据权利要求25所述的抗体或其盐，其中，所述区域选择性为90％以上。
27.根据权利要求15～26中任一项所述的抗体或其盐，其中，通过抗体与反应性基团之间的反应而生成的部分为：通过赖氨酸残基、酪氨酸残基或色氨酸残基与对于赖氨酸残基、酪氨酸残基或色氨酸残基中的任一残基的侧链具有特异性的反应性基团之间的反应而生成的部分。
28.根据权利要求15～27中任一项所述的抗体或其盐，其中，通过抗体与反应性基团之间的反应而生成的部分为：通过赖氨酸残基与对于赖氨酸残基的侧链具有特异性的反应性基团之间的反应而生成的部分。
29.一种具有生物正交性官能团的抗体或其盐的制造方法，其中，该方法包括：
对以下述式(II)表示的具有针对抗体的亲和性物质及切割性部分的抗体或其盐的切割性部分进行切割，生成以下述式(IV)表示的具有生物正交性官能团的抗体或其盐；
所述式(II)为：
A-L-B-R'-T (II)
式中，
A为针对抗体的亲和性物质，
L为切割性连接体，该切割性连接体为包含切割性部分的二价基团，
B为(a)包含生物正交性官能团的二价基团、或者(b)不含生物正交性官能团的二价基团，
R'为通过抗体与反应性基团之间的反应而生成的部分，
T为抗体；
所述式(IV)为：
L1-B-R'-T (IV)
式中，
B、R'和T与所述式(II)中相应符号的含义相同，
L1为(i')包含生物正交性官能团的一价基团、或者(ii')不含生物正交性官能团的一价基团；
并且，针对抗体的亲和性物质为包含以下的任一氨基酸序列的肽：
式1-1：(X0-3)a-C-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-I-I-W-C-(X0-3)b(SEQ ID NO:58)
式1-2：(X0-3)a-C-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-I-V-W-C-(X0-3)b(SEQ ID NO:59)
式1-3：(X0-3)a-C-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-V-V-W-C-(X0-3)b(SEQ ID NO:60)
式1-4：(X0-3)a-C-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-A-V-W-C-(X0-3)b(SEQ ID NO:61)
式1-5：(X0-3)a-C-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-L-L-W-C-(X0-3)b(SEQ ID NO:62)
式1-6：(X0-3)a-C-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-L-I-W-C-(X0-3)b(SEQ ID NO:63)
式1-7：(X0-3)a-C-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-L-V-F-C-(X0-3)b(SEQ ID NO:64)
式1-8：(X0-3)a-C-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Q-V-W-C-(X0-3)b(SEQ ID NO:65)
式1-9：(X0-3)a-C-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-E-V-W-C-(X0-3)b(SEQ ID NO:66)，
式中，
(X0-3)a不存在、或者为1～3个连续的相同或不同的任意氨基酸残基(除赖氨酸残基和半胱氨酸残基以外)，
(X0-3)b不存在、或者为1～3个连续的相同或不同的任意氨基酸残基(除赖氨酸残基和半胱氨酸残基以外)，
Xaa1为丙氨酸残基、甘氨酸残基、亮氨酸残基、脯氨酸残基、精氨酸残基、缬氨酸残基、天冬酰胺残基、谷氨酸残基、或苯丙氨酸残基，
Xaa2为酪氨酸残基、色氨酸残基、组氨酸残基、或苯丙氨酸残基，
Xaa3为组氨酸残基、苯丙氨酸残基、酪氨酸残基、色氨酸残基、精氨酸残基、或甘氨酸残基，
Xaa4为赖氨酸残基，
Xaa5为甘氨酸残基、丝氨酸残基、天冬酰胺残基、谷氨酰胺残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、苯丙氨酸残基、酪氨酸残基、色氨酸残基、组氨酸残基、苏氨酸残基、亮氨酸残基、丙氨酸残基、缬氨酸残基、异亮氨酸残基、或精氨酸残基，
Xaa6为谷氨酰胺残基、谷氨酸残基、天冬酰胺残基、天冬氨酸残基、脯氨酸残基、甘氨酸残基、精氨酸残基、苯丙氨酸残基、或组氨酸残基；或者
式2-1：(X0-3')a-C-Xaa1'-Xaa2'-Xaa3'-Xaa4'-Xaa5'-Xaa6'-L-V-W-C-(X0-3')b(SEQ IDNO:67)，
式中，
(X0-3')a和(X0-3')b分别与所述(X0-3)a和(X0-3)b含义相同，
Xaa1'、Xaa2'、Xaa3'、Xaa4'、Xaa5'、Xaa6'分别与所述Xaa1、Xaa2、Xaa3、Xaa4、Xaa5、Xaa6含义相同，
但是，不包括(X0-3')a为1～3个连续的相同或不同的任意氨基酸残基、(X0-3')b为1～3个连续的相同或不同的任意氨基酸残基、Xaa3'为组氨酸残基、且Xaa5'为甘氨酸残基的情况。
30.一种具有功能性物质的抗体或其盐的制造方法，其中，该方法包括：
对以下述式(III)表示的具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分、功能性物质及抗体的复合物或其盐的切割性部分进行切割，生成以下述式(V1)表示的具有功能性物质的抗体或其盐；
所述式(III)为：
A-L-B'(-F)-R'-T (III)
式中，
A为针对抗体的亲和性物质，
L为切割性连接体，该切割性连接体为包含切割性部分的二价基团，
B'为包含通过功能性物质与生物正交性官能团之间的反应而生成的部分的三价基团，
F为功能性物质，
R'为通过抗体与反应性基团之间的反应而生成的部分，
T为抗体；
所述式(V1)为：
L1-B'(-F)-R'-T (V1)
式中，
L1为(i')包含生物正交性官能团的一价基团、或者(ii')不含生物正交性官能团的一价基团，
B'、F、R'和T与所述式(III)中相应符号的含义相同；
并且，针对抗体的亲和性物质为包含以下的任一氨基酸序列的肽：
式1-1：(X0-3)a-C-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-I-I-W-C-(X0-3)b(SEQ ID NO:58)
式1-2：(X0-3)a-C-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-I-V-W-C-(X0-3)b(SEQ ID NO:59)
式1-3：(X0-3)a-C-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-V-V-W-C-(X0-3)b(SEQ ID NO:60)
式1-4：(X0-3)a-C-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-A-V-W-C-(X0-3)b(SEQ ID NO:61)
式1-5：(X0-3)a-C-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-L-L-W-C-(X0-3)b(SEQ ID NO:62)
式1-6：(X0-3)a-C-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-L-I-W-C-(X0-3)b(SEQ ID NO:63)
式1-7：(X0-3)a-C-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-L-V-F-C-(X0-3)b(SEQ ID NO:64)
式1-8：(X0-3)a-C-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Q-V-W-C-(X0-3)b(SEQ ID NO:65)
式1-9：(X0-3)a-C-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-E-V-W-C-(X0-3)b(SEQ ID NO:66)，
式中，
(X0-3)a不存在、或者为1～3个连续的相同或不同的任意氨基酸残基(除赖氨酸残基和半胱氨酸残基以外)，
(X0-3)b不存在、或者为1～3个连续的相同或不同的任意氨基酸残基(除赖氨酸残基和半胱氨酸残基以外)，
Xaa1为丙氨酸残基、甘氨酸残基、亮氨酸残基、脯氨酸残基、精氨酸残基、缬氨酸残基、天冬酰胺残基、谷氨酸残基、或苯丙氨酸残基，
Xaa2为酪氨酸残基、色氨酸残基、组氨酸残基、或苯丙氨酸残基，
Xaa3为组氨酸残基、苯丙氨酸残基、酪氨酸残基、色氨酸残基、精氨酸残基、或甘氨酸残基，
Xaa4为赖氨酸残基，
Xaa5为甘氨酸残基、丝氨酸残基、天冬酰胺残基、谷氨酰胺残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、苯丙氨酸残基、酪氨酸残基、色氨酸残基、组氨酸残基、苏氨酸残基、亮氨酸残基、丙氨酸残基、缬氨酸残基、异亮氨酸残基、或精氨酸残基，
Xaa6为谷氨酰胺残基、谷氨酸残基、天冬酰胺残基、天冬氨酸残基、脯氨酸残基、甘氨酸残基、精氨酸残基、苯丙氨酸残基、或组氨酸残基；或者
式2-1：(X0-3')a-C-Xaa1'-Xaa2'-Xaa3'-Xaa4'-Xaa5'-Xaa6'-L-V-W-C-(X0-3')b(SEQ IDNO:67)，
式中，
(X0-3')a和(X0-3')b分别与所述(X0-3)a和(X0-3)b含义相同，
Xaa1'、Xaa2'、Xaa3'、Xaa4'、Xaa5'、Xaa6'分别与所述Xaa1、Xaa2、Xaa3、Xaa4、Xaa5、Xaa6含义相同，
但是，不包括(X0-3')a为1～3个连续的相同或不同的任意氨基酸残基、(X0-3')b为1～3个连续的相同或不同的任意氨基酸残基、Xaa3'为组氨酸残基、且Xaa5'为甘氨酸残基的情况。
31.一种具有功能性物质的抗体或其盐的制造方法，其中，该方法包括：
(A)对以下述式(II)表示的具有针对抗体的亲和性物质及切割性部分的抗体或其盐的切割性部分进行切割，生成以下述式(IV)表示的具有生物正交性官能团的抗体或其盐；以及
(B)使所述具有生物正交性官能团的抗体或其盐与1种或2种以上的功能性物质反应，生成以下述式(V2)或下述式(V3)表示的具有功能性物质的抗体或其盐，
所述式(II)为：
A-L-B-R'-T (II)
式中，
A为针对抗体的亲和性物质，
L为切割性连接体，该切割性连接体为包含切割性部分的二价基团，
B为(a)包含生物正交性官能团的二价基团、或者(b)不含生物正交性官能团的二价基团，
R'为通过抗体与反应性基团之间的反应而生成的部分，
T为抗体；
所述式(IV)为：
L1-B-R'-T (IV)
式中，
B、R'和T与所述式(II)中相应符号的含义相同，
L1为(i')包含生物正交性官能团的一价基团、或者(ii')不含生物正交性官能团的一价基团；
所述式(V2)为：
F-L1'-B-R'-T (V2)
式中，
B、R'和T与所述式(IV)中相应符号的含义相同，
L1'为包含通过功能性物质与(i')包含生物正交性官能团的一价基团之间的反应而生成的部分的二价基团，
F为功能性物质；
所述式(V3)为：
Fa-L1'-B'(-Fb)-R'-T (V3)
式中，
R'和T与所述式(IV)中相应符号的含义相同，
L1'与所述式(V2)中相应符号的含义相同，
B'为包含通过功能性物质与生物正交性官能团之间的反应而生成的部分的三价基团，
Fa和Fb分别为相同或不同的功能性物质；
并且，针对抗体的亲和性物质为包含以下的任一氨基酸序列的肽：
式1-1：(X0-3)a-C-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-I-I-W-C-(X0-3)b(SEQ ID NO:58)
式1-2：(X0-3)a-C-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-I-V-W-C-(X0-3)b(SEQ ID NO:59)
式1-3：(X0-3)a-C-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-V-V-W-C-(X0-3)b(SEQ ID NO:60)
式1-4：(X0-3)a-C-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-A-V-W-C-(X0-3)b(SEQ ID NO:61)
式1-5：(X0-3)a-C-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-L-L-W-C-(X0-3)b(SEQ ID NO:62)
式1-6：(X0-3)a-C-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-L-I-W-C-(X0-3)b(SEQ ID NO:63)
式1-7：(X0-3)a-C-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-L-V-F-C-(X0-3)b(SEQ ID NO:64)
式1-8：(X0-3)a-C-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Q-V-W-C-(X0-3)b(SEQ ID NO:65)
式1-9：(X0-3)a-C-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-E-V-W-C-(X0-3)b(SEQ ID NO:66)，
式中，
(X0-3)a不存在、或者为1～3个连续的相同或不同的任意氨基酸残基(除赖氨酸残基和半胱氨酸残基以外)，
(X0-3)b不存在、或者为1～3个连续的相同或不同的任意氨基酸残基(除赖氨酸残基和半胱氨酸残基以外)，
Xaa1为丙氨酸残基、甘氨酸残基、亮氨酸残基、脯氨酸残基、精氨酸残基、缬氨酸残基、天冬酰胺残基、谷氨酸残基、或苯丙氨酸残基，
Xaa2为酪氨酸残基、色氨酸残基、组氨酸残基、或苯丙氨酸残基，
Xaa3为组氨酸残基、苯丙氨酸残基、酪氨酸残基、色氨酸残基、精氨酸残基、或甘氨酸残基，
Xaa4为赖氨酸残基，
Xaa5为甘氨酸残基、丝氨酸残基、天冬酰胺残基、谷氨酰胺残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、苯丙氨酸残基、酪氨酸残基、色氨酸残基、组氨酸残基、苏氨酸残基、亮氨酸残基、丙氨酸残基、缬氨酸残基、异亮氨酸残基、或精氨酸残基，
Xaa6为谷氨酰胺残基、谷氨酸残基、天冬酰胺残基、天冬氨酸残基、脯氨酸残基、甘氨酸残基、精氨酸残基、苯丙氨酸残基、或组氨酸残基；或者
式2-1：(X0-3')a-C-Xaa1'-Xaa2'-Xaa3'-Xaa4'-Xaa5'-Xaa6'-L-V-W-C-(X0-3')b(SEQ IDNO:67)，
式中，
(X0-3')a和(X0-3')b分别与所述(X0-3)a和(X0-3)b含义相同，
Xaa1'、Xaa2'、Xaa3'、Xaa4'、Xaa5'、Xaa6'分别与所述Xaa1、Xaa2、Xaa3、Xaa4、Xaa5、Xaa6含义相同，
但是，不包括(X0-3')a为1～3个连续的相同或不同的任意氨基酸残基、(X0-3')b为1～3个连续的相同或不同的任意氨基酸残基、Xaa3'为组氨酸残基、且Xaa5'为甘氨酸残基的情况。
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