CN107614514A - 利用IgG结合肽的抗体特异性修饰 - Google Patents

利用IgG结合肽的抗体特异性修饰 Download PDF

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Abstract

本发明涉及IgG结合肽、用交联剂修饰的IgG结合肽、该用交联剂修饰的IgG结合肽与IgG的复合物，以及生产该复合物的方法等。

Description

利用IgG结合肽的抗体特异性修饰
技术领域
本发明涉及IgG结合肽、用交联剂修饰的IgG结合肽、该用交联剂修饰的IgG结合肽与IgG的复合物，以及生产该复合物的方法等。
背景技术
抗体在目前各种研究、开发中较多地用于靶标分子的检测，作为检测试剂及诊断药在产业方面也非常重要。另外，从针对其靶标分子的特异性方面考虑，抗体作为用于疾病治疗的药品也受到关注。
作为用于对抗体附加功能的化学修饰，目前有碱性磷酸酯酶(AP)及过氧化物酶(HRP)等酶(非专利文献1～2)、还有用于放射性同位素的碘化物及螯合物的附加(非专利文献3)、利用生物素等之类的低分子量化合物的修饰(非专利文献4)。这些修饰主要通过赖氨酸的氨基、半胱氨酸的硫醇基，以及经活化的羧基等进行，这些修饰对官能团是特异性的，但不是位点特异性，因此存在因对抗体的抗原结合位点的修饰等而使抗体的活性降低的问题，以及难以控制结合的化合物的数量等问题。在近年来出现的抗体医药的抗体药物偶联物(ADC)中(非专利文献5～6)，由于使抗癌剂以位点非特异性地与抗体结合，因此存在抗体本身的活性变弱、或因难以控制抗癌剂的结合数而使得随后的制剂化的步骤变得繁琐等问题。
为了克服这样的问题，一直使用位点特异性地导入特定官能团的抗体来对抗体进行修饰。例如，通过向特定位点由基因工程学改变而导入非天然氨基酸(非专利文献7～9)或游离的半胱氨酸(非专利文献10～11)，可以进行特定位点上的修饰。另外，报道有利用谷氨酰胺转胺酶(TG)将抗体中的天然或人工地导入的特定的谷氨酰胺为靶标进行修饰(非专利文献12～13)，已知根据导入的化合物的结构及作为靶标的谷氨酰胺残基的空间环境而使其反应收率受到很大影响。进而，也有利用以抗体Fc上的糖链为靶标的修饰技术(非专利文献14～15)，虽然这些方法是位点特异性，但由于需要糖链的氧化修饰，因此存在反应步骤复杂的问题。这样的位点特异性的抗体修饰技术正在进行开发，但在很多情况下，需要抗体工程学地改变抗体本身，考虑到伴随其改变的抗体功能降低及开发成本高昂，未必是有用的方法。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Imagawa,M.et al.,Journal of Applied Biochemistry,1982,4,pp.41-57
非专利文献2：Hashida,S et al.,Journal of Applied Biochemistry,1984,6,pp.56-63
非专利文献3：Rodwell,J.D.et al.,Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America,1986,83,pp.2632-2636
非专利文献4：Hermanson,G.T.,Bioconjugate Techniques,The third edition,Elsevier,USA,2013
非专利文献5：Lewis Phillips,G.D.et al.,Cancer Research,2008,68,pp.9280-9290
非专利文献6：Boyraz,B.et al.,Current Medical Research and Opinion,2013,29,pp.405-414
非专利文献7：Axup,J.Y.et al.,Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America,2012,109,pp.16101-16106
非专利文献8：Tian,F.et al.,Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America,2014,111,pp.1766-1771
非专利文献9：Zimmerman,E.S.et al.,Bioconjugate chemistry,2014,25,pp.351-361
非专利文献10：Shen,B.Q.et al.,Nature Biotechnology,2012,30,pp.184-189
非专利文献11：Bernardes,G.J.et al.,Nature Protocols,2013,8,pp.2079-2089
非专利文献12：Dennler,P.et al.,Bioconjugate Chemistry,2014,25,pp.569-578
非专利文献13：Jeger,S.et al.,Angewandte Chemie 2010,49,pp.9995-9997
非专利文献14：Bejot,R et al.,J.Labelled.Compd.Rad.,2012,55,pp.346-353
非专利文献15：Zhou,Q.et al.,Bioconjugate Chemistry,2014,25,pp.510-520
发明内容
发明所要解决的问题
由上所述，需要能够特异性且简便地修饰抗体的方法。
解决问题的技术方案
本发明人迄今为止报道了对特异性或选择性地与IgG结合的肽(下面称为“IgG结合肽”)(参照WO2013/027796和WO2008/054030)。为了解决上述问题，本发明人基于IgG结合肽与IgG Fc复合物的X射线晶体结构分析，详细地研究了在结合状态下IgG结合肽的各氨基酸的位置与IgGFc的各氨基酸的位置关系。进而发现了通过将可与交联剂结合的氨基酸导入到肽中，并利用交联剂修饰该氨基酸，可制备利用交联剂以位点特异性地修饰的IgG结合肽，并且能够使用该IgG结合肽修饰IgG，从而完成了本发明。
即，本发明包括以下方式：
(1)一种肽，其特征在于，含有下述式I所示的由13～17个氨基酸残基组成的氨基酸序列，且能够与人IgG和/或兔IgG结合，
(X1-3)-C-(X2)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-(X1-3) (I)
(式中，X各自独立地为除半胱氨酸之外的任意氨基酸残基，
C为半胱氨酸残基，
H为组氨酸残基，
Xaa1为赖氨酸残基、半胱氨酸残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、2-氨基辛二酸或二氨基丙酸，
G为甘氨酸残基，
Xaa2为谷氨酸残基或天冬酰胺残基，
L为亮氨酸残基，
V为缬氨酸残基，且
W为色氨酸残基)。
(2)根据上述(1)所述的肽，其特征在于，含有下述式II所示的由13～17个氨基酸残基组成的氨基酸序列，且能够与人IgG和/或兔IgG结合，
(X1-3)-C-(Xaa3)-(Xaa4)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-(X1-3) (II)
(式中，X各自独立地为除半胱氨酸之外的任意氨基酸残基，
C为半胱氨酸残基，
H为组氨酸残基，
Xaa1为赖氨酸残基、半胱氨酸残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、2-氨基辛二酸或二氨基丙酸，
G为甘氨酸残基，
Xaa2为谷氨酸残基或天冬酰胺残基，
L为亮氨酸残基，
V为缬氨酸残基，
W为色氨酸残基，
Xaa3为丙氨酸残基、丝氨酸残基或苏氨酸残基，且
Xaa4为酪氨酸残基或色氨酸残基)。
(3)根据上述(1)或(2)所述的肽，其特征在于，含有下述式III所示的由13～17个氨基酸残基组成的氨基酸序列，且能够与人IgG和/或兔IgG结合，
(X1-3)-C-A-Y-H-(Xaa1)-G-E-L-V-W-C-(X1-3) (III)
(式中，X各自独立地为除半胱氨酸之外的任意氨基酸残基，
C为半胱氨酸残基，
A为丙氨酸残基，
Y为酪氨酸残基，
H为组氨酸残基，
Xaa1为赖氨酸残基、半胱氨酸残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、2-氨基辛二酸或二氨基丙酸，
G为甘氨酸残基，
E为谷氨酸残基，
L为亮氨酸残基，
V为缬氨酸残基，且
W为色氨酸残基)。
(4)根据上述(1)～(3)中任一项所述的肽，其中，设为17个氨基酸残基时，从N末端起第1～3、15～17位各氨基酸残基为如下：
第1位氨基酸残基为S、G、F，或者无，
第2位氨基酸残基为D、G、A、S、P、高半胱氨酸，或者无，
第3位氨基酸残基为S、D、T、N、E或R，
第15位氨基酸残基为S、T或D，
第16位氨基酸残基为H、G、Y、T、N、D、F、高半胱氨酸，或者无，
第17位氨基酸残基为Y、F、H、M，或者无。
(5)根据上述(4)所述的肽，其包括以下的1)～15)中任一种氨基酸序列，其中，Xaa1为赖氨酸残基、半胱氨酸残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、2-氨基辛二酸或二氨基丙酸，Xaa2为高半胱氨酸，
1)DCAYH(Xaa1)GELVWCT(SEQ ID NO:1)
2)GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(SEQ ID NO:2)
3)RCAYH(Xaa1)GELVWCS(SEQ ID NO:3)
4)GPRCAYH(Xaa1)GELVWCSFH(SEQ ID NO:4)
5)SPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(SEQ ID NO:5)
6)GDDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(SEQ ID NO:6)
7)GPSCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(SEQ ID NO:7)
8)GPDCAYH(Xaa1)GELVWCSFH(SEQ ID NO:8)
9)GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTHH(SEQ ID NO:9)
10)GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY(SEQ ID NO:10)
11)SPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY(SEQ ID NO:11)
12)SDDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY(SEQ ID NO:12)
13)RGNCAYH(Xaa1)GQLVWCTYH(SEQ ID NO:13)
14)G(Xaa2)DCAYH(Xaa1)GELVWCT(Xaa2)H(SEQ ID NO:36)
15)RRGPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(SEQ ID NO:37)。
(6)根据上述(1)或(2)所述的肽，其特征在于，含有下述式IV所示的由13个氨基酸残基组成的氨基酸序列，且能够与人IgG和/或兔IgG结合，
D-C-(Xaa3)-(Xaa4)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-T (IV)
(式中，
D为天冬氨酸残基，
C为半胱氨酸残基，
H为组氨酸残基，
Xaa1为赖氨酸残基、半胱氨酸残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、2-氨基辛二酸或二氨基丙酸，
G为甘氨酸残基，
Xaa2为谷氨酸残基或天冬酰胺残基，
L为亮氨酸残基，
V为缬氨酸残基，
W为色氨酸残基，
T为苏氨酸残基，
Xaa3为丙氨酸残基或苏氨酸残基，且
Xaa4为酪氨酸残基或色氨酸残基)。
(7)根据上述(6)所述的肽，其包括以下的1)～4)中任一种氨基酸序列，其中，Xaa1为赖氨酸残基、半胱氨酸残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、2-氨基辛二酸或二氨基丙酸，
1)DCTYH(Xaa1)GNLVWCT(SEQ ID NO:14)
2)DCAYH(Xaa1)GNLVWCT(SEQ ID NO:15)
3)DCTYH(Xaa1)GELVWCT(SEQ ID NO:16)
4)DCAWH(Xaa1)GELVWCT(SEQ ID NO:17)。
(8)一种肽，其特征在于，含有下述式V所示的由13个氨基酸残基组成的氨基酸序列，且能够与人IgG和/或兔IgG结合，
D-C-(Xaa2)-(Xaa3)-(Xaa4)-(Xaa1)-G-(Xaa5)-L-(Xaa6)-W-C-T (V)
(式中，
D为天冬氨酸残基，
C为半胱氨酸残基，
G为甘氨酸残基，
L为亮氨酸残基，
W为色氨酸残基，
T为苏氨酸残基，
Xaa1为赖氨酸残基、半胱氨酸残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、2-氨基辛二酸或二氨基丙酸，
Xaa2为丙氨酸残基、丝氨酸残基或苏氨酸残基，
Xaa3为色氨酸残基或酪氨酸残基，
Xaa4为组氨酸残基、精氨酸残基、丝氨酸残基或苏氨酸残基，
Xaa5为谷氨酸残基、天冬酰胺残基、精氨酸残基或天冬氨酸残基，且
Xaa6为异亮氨酸残基或缬氨酸残基)。
(9)根据上述(1)～(8)中任一项所述的肽，其中，肽在外侧的2个半胱氨酸(C)残基间形成二硫键，或肽的外侧的2个半胱氨酸残基中的硫醚基由下式：
[化1]
所示的接头进行连接。
(10)根据上述(1)～(9)中任一项所述的肽，其利用标记物进行标记。
(11)根据上述(1)～(10)中任一项所述的肽，其结合有药剂。
(12)根据上述(1)～(11)中任一项所述的肽，其中，Xaa1为赖氨酸残基。
(13)根据上述(1)～(12)中任一项所述的肽，其中，Xaa1用交联剂进行修饰。
(14)根据上述(13)所述的肽，其中，所述交联剂选自由DSG(双琥珀酰亚胺戊二酸酯)、DSS(辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、DMA(己二亚氨酸二甲酯二盐酸盐)、DMP(庚二亚氨酸二甲酯二盐酸盐)、DMS(辛二亚氨酸二甲酯二盐酸盐)、DTBP(3,3'-二硫代双丙二亚氨酸二甲酯二盐酸盐)和DSP(二硫代双琥珀酰亚氨基丙酸酯)组成的组。
(15)根据上述(14)所述的肽，其中，所述交联剂为DSG(双琥珀酰亚胺戊二酸酯)或DSS(辛二酸二琥珀酰亚胺酯)。
(16)一种复合物，其为上述(13)～(15)中任一项所述的肽与IgG的复合物，其通过用交联剂修饰的肽与IgG的交联反应而形成。
(17)一种肽与IgG的复合物的生产方法，其包括如下步骤：将上述(13)～(15)中任一项所述的肽与IgG混合，使用交联剂修饰的肽与IgG进行交联反应。
(18)一种药物组合物，其包含上述(1)～(15)中任一项所述的肽或上述(16)所述的复合物。
(19)一种肽的生产方法，该肽是2个以上半胱氨酸残基通过接头连接而成的，所述方法包括如下步骤：将含有2个以上半胱氨酸残基的肽与下式所示的化合物混合，
[化2]
(式中，R1和R2各自独立地为任意的卤原子)，得到2个以上半胱氨酸残基中的硫醚基由下式：
[化3]
所示的接头连接而成的肽。
(20)如上述(19)所述的方法，其中，在所述化合物中，R1和R2相同，且为Cl、Br或I。
(21)如上述(19)或(20)所述的方法，其中，所述肽为上述(1)～(8)及(10)～(15)中任一项所规定的肽。
本说明书包含作为本申请优先权基础的日本专利申请号2015-103153号公开的内容。
利用本发明的交联剂修饰的IgG结合肽可以在短时间内且几乎无副反应地附加于IgG，因此通过使各种化合物与该IgG结合肽结合，可以利用各种化合物特异性且简便地修饰IgG。另外，利用本发明的交联剂修饰的IgG结合肽可以直接与野生型IgG结合等，无需改变抗体分子的序列，因此可以不导致伴随抗体分子基因改变的功能降低，以较低成本使各种化合物与抗体结合。还可以使导入的化合物预先与IgG结合肽结合，该IgG结合肽与抗体的结合反应可以在温和的反应条件下进行，因此在导入的化合物与IgG直接反应的步骤中不需要现有必需的复杂的反应，另外可以防止该反应导致的抗体功能降低。
附图说明
图1(A)表示IgG结合肽(C35A-3/15：DCAYHRGELVWCT(SEQ ID NO:33))与人IgG Fc复合物的结构。IgG结合肽为空间填充模型，IgG Fc 为带状模型，用线状模型表示Fc的糖链。图1(B)表示利用DSG修饰的IgG结合肽(C35A-3/15(R8K)：DCAYHKGELVWCT(SEQ ID NO:34))和IgG Fc的交联结构的模型。肽的主链用带状模型表示。肽-Lys8表示C35A-3/15(R8K)的第6位赖氨酸残基，肽-Tyr6-Gly9表示C35A-3/15(R8K)的第4位酪氨酸残基至第7位甘氨酸残基。另外，Fc-Lys248表示按照EU编号的Fc的Lys248，Fc-Pro247-Asp249表示按照EU编号的Fc的Pro247至Asp249。
图2表示标记化IgG结合肽与各种蛋白的混合物的SDS-PAGE(A)和蛋白质印迹法(B)的结果。图中，DSG表示供试验用的与DSG(双琥珀酰亚胺戊二酸酯)反应的IgG结合肽，DSS表示供试验用与DSS(辛二酸二琥珀酰亚胺酯)反应的IgG结合肽。另外，图中hIgG表示人IgG，hIgA表示人IgA，HAS表示人血清白蛋白。
图3表示在标记化IgG结合肽与IgG的反应中，反应摩尔比(A)和反应时间(B)的ELISA的研究结果。DSS R8K 0min是在IgG的10倍摩尔比的标记化IgG结合肽中加入Tris-HCl(pH7.0)封闭NHS基后，加入孔而得到的结果。无DSS R8K使用未结合DSS的生物素化IgG结合(R8K)肽，无肽表示未加入肽的对照。
图4表示使用尺寸排除色谱法对标记化IgG结合肽的各蛋白(hIgA、hIgG、BSA(牛血清白蛋白))的反应性的测定结果。(A)表示利用DSS修饰的IgG结合肽的反应性的测定结果，(B)表示利用DSG修饰的IgG结合肽的反应性的测定结果。
图5(A)表示相对于人IgG以摩尔比为0.5、1.0、2.0或5.0向人IgG的Fc溶液加入溶解于DMF中的经DSG修饰的IgG结合肽，搅拌后在室温下进行反应之后的液相色谱法的结果。图5(B)表示使人IgG与经DSG修饰的IgG结合肽以各摩尔比进行反应时，未反应(波峰2)、1个肽的附加物(波峰3)和2个肽的附加物(波峰4)的生成量的变化。
图6表示相对于pH4.0(A)、pH5.5(B)或pH7.0(C)中制备的人IgG的Fc溶液，以摩尔比为1.0加入溶解于DMF中的经DSG修饰的IgG结合肽，搅拌后在室温下进行反应，在反应的1、5、10或30分钟后，未反应(波峰2)、1个肽的附加物(波峰3)和2个肽的附加物(波峰4)的生成量的变化。
图7A表示利用经DSG修饰的生物素化IgG结合肽(生物素化IgG结合肽)或生物素化抗人IgG小鼠抗体(抗hIgG mAb-生物素标记)以及PE标记链霉亲和素(Streptavidin)(SA-PE标记)对4D5-Fc抗体结合乳腺癌细胞株SK-BR3上的HER2抗原的检测结果。图7B表示不加入4D5-Fc抗体进行同样的实验(生物素化IgG结合肽+SA-PE标记或抗hIgG mAb-生物素标记+SA-PE标记)的结果，以及使用4D5-Fc抗体与PE标记抗人IgG小鼠抗体(抗hIgG mAb-PE标记)作为阳性对照的结果。
图8A表示由叠氮化肽抗体与二苯并环辛炔-马来酰亚胺(Dibenzocyclooctyne-maleimide)化VHH的Click反应进行连接后的离子交换色谱法结果得到的3个主要的波峰(a、b和c)。图8B表示在还原状态下用SDS-PAGE对得到的各波峰的分析结果。各电泳结果如下所示：泳道1为抗HER2人IgG抗体，泳道2为抗HER2人IgG抗体-叠氮化肽，泳道3为波峰a(未反应的抗HER2人IgG抗体)，泳道4为波峰b(抗HER2人IgG抗体-1价VHH)，泳道5为波峰c(抗HER2人IgG抗体-2价VHH)，泳道6为VHH，泳道7为分子量标记物。
图9A～C表示使用通过7-AAD染色除去死细胞的细胞组分，使用抗HER2人IgG抗体(图9A)、抗IgA受体VHH(C端加有HIS标签)(图9B)、抗HER2人抗体-1价VHH(C端加有HIS标签)(图9C)作为一级抗体，并使用最终浓度50nM的生物素化抗HIS抗体+经PE标记的SA的混合物作为二级抗体对高表达HER2的SK-BR3细胞进行FACS分析的结果。图9D～F表示使用抗HER2人抗体(图9D)、抗IgA受体VHH(C端加有HIS标签)(图9E)、抗HER2人抗体-1价VHH(图9F)作为一级抗体，并使用PE标记抗人IgG多克隆抗体作为二级抗体对与利用DMSO 1.3％的分化诱导而高表达IgA受体的HL60细胞结合的检测结果。
图10-1表示在0-10nM的药剂(赫赛汀(Herceptin)或实施例11中制备的抗体药物偶联物)的存在下培养SK-BR3细胞，使用细胞测定试剂盒并利用吸光度(Abs.)评价72小时后的细胞数的结果。图中，BG(背景)表示未加入细胞的对照。图10A表示针对SK-BR3细胞的抗HER2抗体-DM1*1的效果，图10B表示针对SK-BR3细胞的抗HER2抗体-DM1*2的效果。
图10-2为图10-1的续图。图10C表示针对C6细胞的抗HER2抗体-DM1*1的效果，图10D表示针对C6细胞的抗HER2抗体-DM1*2的效果。
图11表示实施例12中制备的具有通过二氯丙酮形成的SS交联结构的IgG结合肽的合成流程。
图12表示在0-500nM的药剂的存在下培养SK-BR3细胞，利用细胞测定试剂盒评价72小时后的细胞数的结果。图12A表示添加赫赛汀(Herceptin)或VcMMAE时的结果，图12B表示添加赫赛汀(Herceptin)或实施例12中制备的抗体药物偶联物时的结果。
图13A表示人、小鼠、兔和大鼠的各种IgG抗体利用SDS-PAGE的电泳的结果(泳道1：标记物、泳道2：曲妥珠单抗(Trastuzumab)(IgG1)、泳道3：人IgG1、泳道4：人IgG2、泳道5：人IgG3、泳道6：人IgG4、泳道7：小鼠IgG1、泳道8：小鼠IgG2b、泳道9：小鼠IgG3、泳道10：兔IgG(多克隆抗体)、泳道11：大鼠IgG1、泳道12：大鼠IgG2b、泳道13：大鼠IgG2c)。图13B表示进行电泳之后将凝胶转印到PVDF膜，使用生物素标记IgG结合肽和HRP标记链霉亲和素进行蛋白质印迹法的结果。
具体实施方式
<IgG结合肽>
本说明书中使用的“IgG”是指哺乳动物，例如人和黑猩猩等灵长类，大鼠、小鼠和兔等实验动物，猪、牛、马、绵羊和山羊等家畜动物，以及狗和猫等宠物的IgG，优选人的IgG(IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)。本说明书中的IgG进一步优选为人IgG1、IgG2或IgG4，或者兔IgG，特别优选为人IgG1、IgG2或IgG4。
在一方式中，本发明涉及一种肽，其特征在于，含有下述式I所示的由13～17个氨基酸残基组成的氨基酸序列，且能够与人IgG和/或兔IgG结合，
(X1-3)-C-(X2)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-(X1-3) (I)
(式中，X各自独立地为除半胱氨酸之外的任意氨基酸残基，
C为半胱氨酸残基，
H为组氨酸残基，
Xaa1为赖氨酸残基、半胱氨酸残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、2-氨基辛二酸或二氨基丙酸，
G为甘氨酸残基，
Xaa2为谷氨酸残基或天冬酰胺残基，
L为亮氨酸残基，
V为缬氨酸残基，且
W为色氨酸残基)。
上述式中，N末端或C末端的X1-3的表述是指除半胱氨酸(C或Cys)之外的独立的任意氨基酸残基X连续有1～3个，组成其的氨基酸残基为相同或不同的残基，优选3个全部由不同的残基的序列组成。同样地，X2也是指除半胱氨酸(C或Cys)之外的独立的任意氨基酸残基X连续有2个，组成其的氨基酸残基为相同或不同的残基，优选该2个连续的氨基酸残基由不同的残基的序列组成。
式I的2个半胱氨酸残基可以通过二硫键形成环状肽。通常，在式I的肽中，外侧的2个半胱氨酸残基形成二硫键。或者，在式I的肽中，外侧的2个半胱氨酸残基中的硫醚基可以由下式：
[化4]
所示的接头进行连接。上述式中的虚线部分是指与硫醚基的结合位点。该接头与通常的二硫键相比，对于还原反应等稳定。该肽可以通过例如以下的<利用接头连接半胱氨酸残基的肽的生产方法>中所记载的方法进行制备。
式I的肽的氨基酸序列中，进一步指定了氨基酸残基X的式I'和式I”所示的肽如下所示。
即，式I'所示的肽的特征在于，含有下式所示的由13～17个氨基酸残基组成的氨基酸序列，且能够与人IgG和/或兔IgG结合，
(X1-3)-C-(X1)-Y-H-(Xaa1)-G-N-L-V-W-C-(X1-3) (I')
(式中，X各自独立地为除半胱氨酸之外的任意氨基酸残基，
C为半胱氨酸残基，
Y为酪氨酸残基，
H为组氨酸残基，
Xaa1为赖氨酸残基、半胱氨酸残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、2-氨基辛二酸或二氨基丙酸，
G为甘氨酸残基，
N为天冬酰胺残基，
L为亮氨酸残基，
V为缬氨酸残基，且
W为色氨酸残基)。
式I”所示的肽的特征在于，含有下式所示的由13～17个氨基酸残基组成的氨基酸序列，且能够与人IgG和/或兔IgG结合，
(X1-3)-C-A-(X1)-H-(Xaa1)-G-E-L-V-W-C-(X1-3) (I”)
(式中，X各自独立地为除半胱氨酸之外的任意氨基酸残基，
C为半胱氨酸残基，
A为丙氨酸残基，
H为组氨酸残基，
Xaa1为赖氨酸残基、半胱氨酸残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、2-氨基辛二酸或二氨基丙酸，
G为甘氨酸残基，
E为谷氨酸残基，
L为亮氨酸残基，
V为缬氨酸残基，且
W为色氨酸残基)。
另外，式I的肽的氨基酸序列中，进一步指定了氨基酸残基X的式II所示的肽如下所示。
即，式II所示的肽的特征在于，含有下式所示的由13～17个氨基酸残基组成的氨基酸序列，且能够与人IgG和/或兔IgG结合，
(X1-3)-C-(Xaa3)-(Xaa4)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-(X1-3) (II)
(式中，X各自独立地为除半胱氨酸之外的任意氨基酸残基，
C为半胱氨酸残基，
H为组氨酸残基，
Xaa1为赖氨酸残基、半胱氨酸残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、2-氨基辛二酸或二氨基丙酸，
G为甘氨酸残基，
Xaa2为谷氨酸残基或天冬酰胺残基，
L为亮氨酸残基，
V为缬氨酸残基，
W为色氨酸残基，
Xaa3为丙氨酸残基、丝氨酸残基或苏氨酸残基，且
Xaa4为酪氨酸残基或色氨酸残基)。
在上述的式I'、式I”和式II的肽的氨基酸序列中，设为17个氨基酸残基时，从N末端起第1位和第2位以及第16位和第17位氨基酸残基X可以缺失，这种肽由13个氨基酸长度组成。
本说明书中使用的“设为17个氨基酸残基时”是在用氨基酸编号命名肽的氨基酸残基时，为了从作为式I的肽等中最长氨基酸长度的17个残基的N末端起依次编号为第1位至第17位而方便地表达的术语。
另外，式I的肽的氨基酸序列中，进一步指定了氨基酸残基X的式III所示的肽如下所示。
即，式III所示的肽的特征在于，含有下式所示的由13～17个氨基酸残基组成的氨基酸序列，且能够与人IgG和/或兔IgG结合，
(X1-3)-C-A-Y-H-(Xaa1)-G-E-L-V-W-C-(X1-3) (III)
(式中，X各自独立地为除半胱氨酸之外的任意氨基酸残基，
C为半胱氨酸残基，
A为丙氨酸残基，
Y为酪氨酸残基，
H为组氨酸残基，
Xaa1为赖氨酸残基、半胱氨酸残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、2-氨基辛二酸或二氨基丙酸，
G为甘氨酸残基，
E为谷氨酸残基，
L为亮氨酸残基，
V为缬氨酸残基，且
W为色氨酸残基)。
在上述的式III的肽的氨基酸序列中，设为17个氨基酸残基时，从N末端起第1位和第2位以及第16位和第17位氨基酸残基X可以缺失，这种肽由13个氨基酸长度组成。
进而，上述各式的肽的氨基酸序列除半胱氨酸(C)之外的氨基酸残基，即设为17个氨基酸残基时，从N末端起第1～3、5、6、15～17位各氨基酸残基优选选自以下残基。其中，各大写字母为氨基酸的单字母符号：
第1位氨基酸残基为S、G、F，或者无，
第2位氨基酸残基为D、G、A、S、P、高半胱氨酸，或者无，
第3位氨基酸残基为S、D、T、N、E或R，
第15位氨基酸残基为S、T或D，
第16位氨基酸残基为H、G、Y、T、N、D、F、高半胱氨酸，或者无，
第17位氨基酸残基为Y、F、H、M，或者无，
第5位氨基酸残基为A或T，
第6位氨基酸残基为Y或W。
另外，式I的肽的氨基酸序列中，进一步指定了氨基酸残基X的式IV所示的肽如下所示。
即，式IV所示的肽的特征在于，含有下式所示的由13个氨基酸残基组成的氨基酸序列，且能够与人IgG和/或兔IgG结合，
D-C-(Xaa3)-(Xaa4)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-T (IV)
(式中，
D为天冬氨酸残基，
C为半胱氨酸残基，
H为组氨酸残基，
Xaa1为赖氨酸残基、半胱氨酸残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、2-氨基辛二酸或二氨基丙酸，
G为甘氨酸残基，
Xaa2为谷氨酸残基或天冬酰胺残基，
L为亮氨酸残基，
V为缬氨酸残基，
W为色氨酸残基，
T为苏氨酸残基，
Xaa3为丙氨酸残基或苏氨酸残基，且
Xaa4为酪氨酸残基或色氨酸残基)。
在以下的1)～19)中列举若干式I的肽的具体例，但不言而喻并不限于这些肽：
1)DCAYH(Xaa1)GELVWCT(SEQ ID NO:1)、
2)GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(SEQ ID NO:2)、
3)RCAYH(Xaa1)GELVWCS(SEQ ID NO:3)、
4)GPRCAYH(Xaa1)GELVWCSFH(SEQ ID NO:4)、
5)SPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(SEQ ID NO:5)、
6)GDDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(SEQ ID NO:6)、
7)GPSCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(SEQ ID NO:7)、
8)GPDCAYH(Xaa1)GELVWCSFH(SEQ ID NO:8)、
9)GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTHH(SEQ ID NO:9)、
10)GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY(SEQ ID NO:10)、
11)SPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY(SEQ ID NO:11)、
12)SDDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY(SEQ ID NO:12)、
13)RGNCAYH(Xaa1)GQLVWCTYH(SEQ ID NO:13)、
14)G(Xaa2)DCAYH(Xaa1)GELVWCT(Xaa2)H(SEQ ID NO:36)、
15)RRGPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(SEQ ID NO:37)、
16)DCTYH(Xaa1)GNLVWCT(SEQ ID NO:14)、
17)DCAYH(Xaa1)GNLVWCT(SEQ ID NO:15)、
18)DCTYH(Xaa1)GELVWCT(SEQ ID NO:16)，以及
19)DCAWH(Xaa1)GELVWCT(SEQ ID NO:17)、
(式中，Xaa1为赖氨酸残基、半胱氨酸残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、2-氨基辛二酸或二氨基丙酸，Xaa2为高半胱氨酸，优选高半胱氨酸彼此相互形成二硫键)。
作为式I的肽的优选的具体例，可举出：
1)DCAYH(Xaa1)GELVWCT(SEQ ID NO:1)、
2)GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(SEQ ID NO:2)、
13)RGNCAYH(Xaa1)GQLVWCTYH(SEQ ID NO:13)、
14)G(Xaa2)DCAYH(Xaa1)GELVWCT(Xaa2)H(SEQ ID NO:36)，以及
15)RRGPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(SEQ ID NO:37)
(式中，Xaa1为赖氨酸残基，Xaa2为高半胱氨酸，优选半胱氨酸彼此和/或高半胱氨酸彼此相互形成二硫键)。
另外，本发明的肽作为广义的一级结构，其特征在于，含有下述式V所示的由13个氨基酸残基组成的氨基酸序列，且能够与人IgG和/或兔IgG结合，
D-C-(Xaa2)-(Xaa3)-(Xaa4)-(Xaa1)-G-(Xaa5)-L-(Xaa6)-W-C-T (V)
(式中，
D为天冬氨酸残基，
C为半胱氨酸残基，
G为甘氨酸残基，
L为亮氨酸残基，
W为色氨酸残基，
T为苏氨酸残基，
Xaa1为赖氨酸残基、半胱氨酸残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、2-氨基辛二酸或二氨基丙酸，
Xaa2为丙氨酸残基、丝氨酸残基或苏氨酸残基，
Xaa3为色氨酸残基或酪氨酸残基，
Xaa4为组氨酸残基、精氨酸残基、丝氨酸残基或苏氨酸残基，
Xaa5为谷氨酸残基、天冬酰胺残基、精氨酸残基或天冬氨酸残基、且
Xaa6为异亮氨酸残基或缬氨酸残基)。
式V的2个半胱氨酸残基可以通过二硫键形成环状肽。通常，式V的肽的外侧的2个半胱氨酸残基形成二硫键。或者，在式V的肽中，外侧的2个半胱氨酸残基中的硫醚基可以由下式：
[化5]
所示的接头进行连接。上述式中的虚线部分是指与硫醚基的结合位点。该接头与通常的二硫键相比，对于还原反应等稳定。该肽可以通过例如以下的<利用接头连接半胱氨酸残基的肽的生产方法>中所记载的方法进行制备。
在以下的20)～31)中列举若干式V的肽的具体例，但不言而喻并不限于这些肽：
20)DCTYT(Xaa1)GNLVWCT(SEQ ID NO:18)、
21)DCAYT(Xaa1)GNLVWCT(SEQ ID NO:19)、
22)DCSYT(Xaa1)GNLVWCT(SEQ ID NO:20)、
23)DCTWT(Xaa1)GNLVWCT(SEQ ID NO:21)、
24)DCTYH(Xaa1)GNLVWCT(SEQ ID NO:22)、
25)DCTYR(Xaa1)GNLVWCT(SEQ ID NO:23)、
26)DCTYS(Xaa1)GNLVWCT(SEQ ID NO:24)、
27)DCTYT(Xaa1)GNLVWCT(SEQ ID NO:25)、
28)DCTYT(Xaa1)GELVWCT(SEQ ID NO:26)、
29)DCTYT(Xaa1)GRLVWCT(SEQ ID NO:27)、
30)DCTYT(Xaa1)GDLVWCT(SEQ ID NO:28)，以及
31)DCTYT(Xaa1)GNLIWCT(SEQ ID NO:29)、
(式中，Xaa1为赖氨酸残基、半胱氨酸残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、2-氨基辛二酸或二氨基丙酸)。
如上所述，本发明涉及的上述式的肽的特征在于，在各氨基酸序列中具有隔开的至少2个半胱氨酸(C)残基，并以能够在该半胱氨酸残基间形成二硫键的方式配置半胱氨酸残基，优选的肽是2个半胱氨酸残基通过二硫键形成环状肽，在各半胱氨酸残基的N末端侧和C末端侧可以具有1或2个除半胱氨酸之外的任意氨基酸残基。在各半胱氨酸残基的N末端侧和C末端侧具有1或2个氨基酸残基的情况下，设为17个氨基酸残基时，从N末端起第1～2、16～17位各氨基酸残基为上述例示的氨基酸残基。
如上所述，在本发明的肽中，Xaa1为赖氨酸残基、半胱氨酸残基、天冬氨酸残基和谷氨酸残基等蛋白质氨基酸，以及二氨基丙酸和2-氨基辛二酸等非蛋白质氨基酸，优选赖氨酸残基。Xaa1优选可以利用后述的交联剂修饰。本说明书中“非蛋白质氨基酸”是指在生物体内不用于组成蛋白质的氨基酸。为了提高利用交联剂修饰本发明的肽时的位点特异性，本发明的肽优选在其序列中完全不具有或几乎不具有(例如仅具有1个或2个)与Xaa1相同的残基。例如，在Xaa1为赖氨酸残基情况下，本发明的肽优选在其序列中除Xaa1之外完全不具有或几乎不具有赖氨酸残基。
本发明的肽与人IgG的结合亲和力与其它人免疫球蛋白(IgA、IgE、IgM)相比高约10倍以上，优选约50倍以上，更优选约200倍以上。关于本发明的肽与人IgG的结合的解离常数(Kd)，可以通过表面等离子共振光谱分析(例如使用BIACORE系统)来确定，例如低于1×10-1M～1×10-3M，优选低于1×10-4M，更优选低于1×10-5M。
本发明的IgG结合肽与IgG结合的Fc结构域。本发明的IgG结合肽如在后述的实施例中所示，在上述Xaa1中，IgG Fc的指定区域，即人IgG Fc中按照EU编号的Lys248残基(以下，在本说明书中也简记为“Lys248”，相当于人IgG CH2(SEQ ID NO:30)的第18位残基)或Lys246残基(以下，在本说明书中也简记为“Lys246”，相当于人IgG CH2(SEQ ID NO:30)的第16位残基)，优选靠近Lys248。
本发明的肽可以通过惯用的液相合成法、固相合成法等肽合成法；利用自动肽合成仪的肽合成等进行制造(Kelley et al.,Genetics Engineering Principles andMethods,Setlow,J.K.eds.,Plenum Press NY.(1990)Vol.12,p.1-19；S tewart et al.,Solid-Phase Peptide Synthesis(1989)W.H.Freeman Co.；Houghten,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)82：p.5132、《新生化学实验讲座1蛋白质IV》(1992)日本生化学会编，株式会社东京化学同人)。或者，可以通过使用编码本发明肽的核酸的基因重组法或噬菌体展示法等来制造肽。例如，可以将编码本发明肽的氨基酸序列的DNA整合入表达载体中再导入宿主细胞中培养来制造目标肽。所制造的肽可以通过常规方法例如凝胶过滤色谱法、离子交换色谱法、亲和色谱法、反相柱色谱法、HPLC等色谱法、硫酸铵分级沉淀、超滤和免疫吸附法等进行回收或纯化。
在肽合成中，例如准备各氨基酸(不论是天然的还是非天然的)中的保护有要结合的α-氨基与除α-羧基之外的官能团的氨基酸类，在各自氨基酸的α-氨基与α-羧基之间进行肽键形成反应。通常，先通过适当的间隔基或接头将位于肽C末端的氨基酸残基的羧基与固相结合。选择性地除去这样得到的二肽的氨基末端的保护基，在与下一个氨基酸的α-羧基之间形成肽键。连续进行这样的操作，制造侧基有保护的肽，最后，除去所有的保护基，从固相中分离。保护基的种类及保护方法、肽键法的详细内容详细地记载于上述文献中。
利用基因重组法的制造例如可以通过包括如下步骤的方法进行：将编码本发明肽的DNA插入适当的表达载体中，再将载体导入适当的宿主细胞中，培养细胞，从细胞内或从细胞外液中回收目标肽。载体没有限定，例如为质粒、噬菌体、粘粒、噬菌粒和病毒等载体。
作为质粒载体，没有限定，可举出：源自大肠杆菌(E.coli)的质粒(例如pET22b(+)、pBR322、pBR325、pUC118、pUC119、pUC18、pUC19、pBluescript等)、源自枯草杆菌(Bacillus subtilis)的质粒(例如pUB110、pTP5等)和源自酵母的质粒(例如YEp13、YCp50等)等。
作为噬菌体载体，没有限定，可举出：T7噬菌体展示载体(T7Select10-3b、T7Select1-1b、T7Select1-2a、T7Select1-2b、T7Select1-2c等(Novagen))和λ噬菌体载体(Charon4A、Charon21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11、λZAP、λZAPII等)。作为病毒载体，没有限定，可举出例如：逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、牛痘病毒和仙台病毒等动物病毒，以及杆状病毒等昆虫病毒等。作为粘粒载体，没有限定，可举出Lorist 6、Charomid9-20和Charomid9-42等。
作为噬菌粒载体，没有限定，已知有例如pSKAN、pBluescript、pBK和pComb3H等。载体中可包含调节序列以表达目的DNA，或者用于挑选含有目的DNA的载体的选择标记物、用于插入目的DNA的多克隆位点等。这种调节序列中包含启动子、增强子、终止子、S-D序列或核糖体结合位点、复制起始位点和多聚A位点等。另外，在选择标记物中，可使用例如氨苄青霉素耐性基因、新霉素耐性基因、卡那霉素耐性基因和二氢叶酸还原酶基因等。用于导入载体的宿主细胞为大肠杆菌及枯草杆菌等细菌、酵母细胞、昆虫细胞、动物细胞(例如哺乳动物细胞)和植物细胞等，对这些细胞的转化或转染例如包括磷酸钙法、电穿孔法、脂质体转染法、粒子枪法和PEG法等。转化细胞的培养按照宿主生物的培养中使用的通常的方法进行。例如，大肠杆菌及酵母细胞等微生物的培养液含有宿主微生物可同化的碳源、氮源和无机盐类等。
为了容易回收本发明肽，优选使通过表达生成的肽分泌到细胞外。这可以通过将编码能使肽从该细胞分泌的肽序列的DNA与编码目标肽的DNA的5'末端侧结合进行。转移至细胞膜的融合肽被信号肽酶酶切，从而目标肽分泌释放至培养基中。或者，也可以回收蓄积在细胞内的目标肽。这种情况下，将细胞物理性或化学性地破坏，使用蛋白质纯化技术回收目标肽。
因此，本发明进一步还涉及一种编码本发明肽的核酸。此处，核酸包含DNA或RNA(例如mRNA)。
使本发明的IgG结合肽与其它蛋白融合的情况下，既可以在分别地制备IgG结合肽与其它蛋白之后，根据需要用接头使IgG结合肽与蛋白融合，也可以利用基因重组法根据需要加入适当的接头制作为融合蛋白。这种情况下，优选本发明的IgG结合肽以不影响与IgG的结合力的方式制作融合蛋白。
<用交联剂修饰的肽>
在一方式中，本发明中的上述IgG结合肽优选利用交联剂进行修饰。
如上所述，本发明的IgG结合肽如在后述的实施例中所示，在上述Xaa1中，IgG Fc的指定区域，即人IgG Fc中按照EU编号的Lys248或Lys246，优选靠近Lys248。因此，通过用交联剂修饰本发明的IgG结合肽的Xaa1并与IgG进行交联反应，可以在IgG结合肽的Xaa1与IgG Fc的Lys248或Lys246、优选Lys248之间形成位点特异性地交联结构。如上所述，通过用交联剂和各种化合物修饰本发明的IgG结合肽的Xaa1并与IgG进行交联反应，可以将各种化合物特异性且简便地导入IgG。另外，根据本发明，可以通过IgG结合肽而导入化合物，因此可以将各种结构的化合物导入IgG。进而，本发明的方法也具有如下优点：得到的产物的收率高，此外由于不伴随抗体本身改变，因此使抗体功能降低的可能性低。
本发明的IgG结合肽也可以对除人之外的动物、优选哺乳动物的IgG使用。这种情况下，本发明的IgG结合肽结合的IgG中的位点，只要是阅读本说明书的本领域技术人员，例如通过将人IgG的序列与其它动物的IgG的序列进行比对，可以容易地确定。
在本发明中，“交联剂”是指用于使本发明的IgG结合肽与IgG Fc通过共价键连接的化学物质。就本发明的交联剂而言，只要是本领域技术人员，就可以适当选择，可以设为具有至少2处能够与所期望的氨基酸(例如赖氨酸残基、半胱氨酸残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、2-氨基辛二酸，或者二氨基丙酸和精氨酸等)结合的位点的化合物。作为其实例，没有限定，可举出：DSG(disuccinimidyl glutarate，双琥珀酰亚胺戊二酸酯)、DSS(disuccinimidyl suberate、辛二酸二琥珀酰亚胺酯)等优选含有2个以上琥珀酰亚氨基的交联剂、DMA(dimethyl adipimidate·2HCl，己二亚氨酸二甲酯二盐酸盐)、DMP(dimethylpimelimidate·2HCl，庚二亚氨酸二甲酯二盐酸盐)和DMS(dimethyl suberimidate·2HCl，辛二亚氨酸二甲酯二盐酸盐)等优选含有2个以上酰亚胺酸部分的交联剂，以及DTBP(dimethyl 3,3’-dithiobispropionimidate·2HCl、3,3'-二硫代双丙二亚氨酸二甲酯二盐酸盐)和DSP(dithiobis(succinimidyl propionate)，二硫代双琥珀酰亚氨基丙酸酯)等具有SS键的交联剂。
本发明的IgG结合肽可以利用其它功能性物质、例如IgA或VHH等抗体、标记物和/或其它药剂进行修饰。IgG结合肽与其它功能性物质的连接可以通过本领域技术人员所公知的方法，例如叠氮基与二苯并环辛炔(dibenzocyclooctyne)的反应，或者马来酰亚胺基与硫氢基的反应等进行。利用标记物进行标记的情况下，通过本发明的IgG结合肽与IgG形成复合物，可以通过该标记物进行IgG的检测或定量。标记物没有限定，包含例如荧光色素、化学发光色素、放射性同位元素(例如放射性碘或放射性同位素金属离子的螯合物、例如DOTA或去铁敏(desferoxamine)的螯合物)，以及生物素及GFP(绿色荧光蛋白)等荧光蛋白、发光蛋白，以及过氧化物酶等酶，优选的标记物的实例为荧光素和FITC等荧光素衍生物、罗丹明和四甲基罗丹明等罗丹明衍生物、以及德克萨斯红等荧光色素。将本发明的肽利用其它药剂修饰的情况下，作为药剂，没有限定，可举出例如：澳瑞他汀E等澳瑞他汀、美登素、曲妥珠单抗、阿霉素、博莱霉素或这些衍生物等抗癌剂；以及与血脑屏障上的受体结合而可以进行向中枢神经的转移的药剂，或者与癌细胞等结合而可以进行抗体向细胞内的转移的药剂等靶向剂。连接药剂的情况下，本发明的IgG结合肽通过与例如用作药物抗体的IgG形成复合物，可以提高疾病的治疗效果。
利用本发明的交联剂修饰的IgG结合肽可以通过例如使按照上述<IgG结合肽>的项目中记载的方法得到的IgG结合肽与交联剂反应而制造。这种情况下，需要将IgG结合肽中的上述Xaa1的氨基酸残基的侧链特异性地进行修饰，其可以通过例如选择Xaa1的种类和交联剂的组合进行。例如含有DSS或DSG等琥珀酰亚胺基的交联剂与存在于赖氨酸残基的侧链及聚肽的N末端的伯胺进行反应，因此通过在封闭IgG结合肽的N末端的基础上与DSS或DSG进行反应，可以仅将赖氨酸残基的侧链用DSS或DSG特异性地修饰。就这样的氨基酸残基和交联剂的组合而言，只要是本领域技术人员，就可以适当选择。
利用本发明的交联剂修饰的IgG结合肽例如也可以通过使用利用交联剂修饰的氨基酸残基进行肽合成来制造。同样地，在用标记物和/或其它药剂修饰IgG结合肽的情况下，可以通过使用加入了这些修饰的氨基酸残基进行肽合成而制备用标记物和/或其它药剂修饰的IgG结合肽。
<交联反应>
在一方式中，本发明涉及一种生产IgG结合肽与IgG的复合物的方法，其包括将本发明的用交联剂修饰的IgG结合肽与IgG混合的步骤。通过本步骤，在用交联剂修饰的IgG结合肽与IgG之间可产生交联反应。特别IgG结合肽中的上述Xaa1的氨基酸残基与IgG Fc的Lys248或Lys246、优选与Lys248之间可位点特异性地产生交联反应。
就该混合步骤的条件而言，只要是在本发明的IgG结合肽与IgG之间产生交联反应的条件下进行，就没有特别限定。例如，可以通过将本发明的IgG结合肽与IgG在适当的缓冲液中、室温(例如约15℃～30℃)下混合进行反应。该混合步骤也可以根据需要加入适量促进交联反应的催化剂进行。
该混合步骤中的本发明的IgG结合肽与IgG的混合比率没有特别限定。本发明的IgG结合肽与IgG的摩尔比率例如可以设为1:1～20:1,优选2:1～20:1或5:1～10:1。
该混合步骤中的混合时间(反应时间)只要是在本发明的IgG结合肽与IgG之间产生交联反应，就没有限定，例如可以设为1分钟～5小时，优选10分钟～2小时或15分钟～1小时。
生产本发明的IgG结合肽与IgG的复合物的方法根据需要还可以包括如下纯化步骤：从进行上述步骤之后的混合物中分离杂质例如未反应的IgG结合肽、IgG和试剂等，并将该复合物进行纯化。该步骤可以通过本领域中公知的方法、例如凝胶过滤色谱法、离子交换色谱法、亲和色谱法、反相柱色谱法和HPLC等色谱法等进行。
<复合物>
在一方式中，本发明涉及一种本发明的IgG结合肽与IgG的复合物。该复合物可通过上述交联反应而形成。因此，本发明优选涉及一种复合物，其是IgG结合肽中的上述Xaa1的氨基酸残基与IgG Fc的Lys248或Lys246、优选与Lys248之间通过交联剂位点特异性地结合而成的IgG结合肽与IgG的复合物。
本发明的复合物通过位点特异性的交联反应而形成，因此该交联反应对IgG的活性产生负面影响的可能性少。另外，通过将修饰的IgG结合肽连接于IgG，可以对IgG附加新的功能性。例如，如果使利用标记物修饰的IgG结合肽与IgG结合，则可以通过该标记物进行IgG的检测或定量。标记物的实例如上所述，因此此处省略记载。另外，例如如果使利用药剂修饰的IgG结合肽与作为药物抗体的IgG结合，则可以提高IgG的疾病治疗效果。药剂的实例如上所述，因此此处省略记载。
<药物组合物或诊断剂>
在一方式中，本发明涉及一种药物组合物或诊断剂，其含有上述IgG结合肽、用上述交联剂修饰的IgG结合肽，或者用上述交联剂修饰的IgG结合肽与IgG的复合物。在药物组合物中含有的情况下，优选IgG结合肽例如利用上述的药剂进行修饰，在诊断剂中含有的情况下，IgG结合肽优选例如利用上述的标记物进行修饰。
作为成为本发明的药物组合物和诊断剂的对象的疾病，没有限定，可举出例如：可利用抗体靶标化的疾病或障碍，优选癌、炎症性疾病、感染性疾病和神经变性疾病。
本发明的药物组合物可以通过经口给药或非经口给药(例如静脉注射、肌肉注射、皮下给药、腹腔内给药、直肠给药或经粘膜给药等)进行给药。另外，本发明的药物组合物可以根据给药途径制成适当的剂型。具体而言，可以制备成颗粒剂，片剂，丸剂、胶囊剂，糖浆剂，乳剂、悬浮剂，静脉注射、动脉注射或肌肉注射用的注射剂，点滴剂，外用剂或栓剂等各种制剂形态。就给药方法和剂型而言，根据患者的性别、年龄、体重、症状等，只要是本领域技术人员，就可以适当选择。
本发明的药物组合物可以按照常规方法进行制剂化(例如希望参照《雷明登氏药学全书》(Remington's Pharmaceutical Science)，最新版，麦克出版公司，伊斯顿，美国)，可以同时含有药学上可接受的载体及添加剂。
作为可在本发明的药物组合物中含有的载体和药物添加剂的实例，可举出：水、药学上可接受的有机溶剂、胶原、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷酮、羧基乙烯基聚合物、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸钠、海藻酸钠、水溶性葡聚糖、羧甲基淀粉钠、果胶、甲基纤维素、乙基纤维素、黄原胶、阿拉伯树胶、酪蛋白、琼脂、聚乙二醇、二甘油、甘油、丙二醇、凡士林、石蜡、硬脂醇、硬脂酸、人血清白蛋白(HSA)、甘露醇、山梨醇、乳糖和作为药物添加剂可接受的表面活性剂等。
实际的添加剂根据本发明的药物组合物的剂型从上述中以单独或适当组合地选择，但并不限定于这些。例如，作为注射用制剂使用的情况下，可以使用将本发明的IgG结合蛋白或者IgG结合蛋白与IgG的复合物溶解于溶液，例如生理食盐水、缓冲液、葡萄糖溶液等中，并向其中加入防容器吸附剂、例如Tween80、Tween 20、明胶、人血清白蛋白等而成的溶液。或者，为了制成在使用前进行溶解并重建的剂型，也可以是冷冻干燥所得物，作为用于冷冻干燥的稳定剂，例如可以使用甘露醇、葡萄糖等糖醇和/或糖类。
本发明的药物组合物的有效给药剂量和给药间隔可以根据患者的性别、年龄、体重和症状等进行适当选择。
本发明的药物组合物的给药时间在出现上述疾病临床症状的前后均可，可以是预防性给药，也可以是治疗性给药。
<利用接头连接半胱氨酸残基的肽的生产方法>
在一方式中，本发明涉及一种利用接头连接半胱氨酸残基的肽的生产方法。本方法包括如下步骤：将含有半胱氨酸残基2个以上、优选2个的肽与由以下的式：
[化6]
所示的化合物(式中，R1和R2各自独立地为任意的卤原子)混合，得到2个以上、优选2个半胱氨酸残基中的硫醚基由下式：
[化7]
所示的接头连接而成的肽。上述式中的虚线部分是指与硫醚基的结合位点。半胱氨酸残基利用该接头连接而成的肽与用通常的二硫键连接的肽相比，对于还原反应等稳定。
在所述化合物中，R1和R2优选选自由F、Cl、Br和I组成的组，进一步优选选自由Cl、Br和I组成的组。R1和R2优选相同，进一步优选R1和R2均为Cl。
就本方法中的混合步骤的条件而言，只要是在肽的半胱氨酸残基间产生连接反应的条件，就没有特别限定。例如，可以通过将肽与所述化合物在适当的缓冲液、例如含有盐酸胍的缓冲液中，在室温(例如约15℃～30℃)下混合进行反应。该混合步骤可以根据需要加入适量促进连接反应的催化剂进行。
本方法的混合步骤中的肽与化合物的混合比率没有特别限定。肽与化合物的摩尔比率例如可以设为1:0.2～1:10，优选设为1:0.5～1:5或1:1～1:2。
就该混合步骤中的混合时间(反应时间)而言，只要在肽的半胱氨酸残基间产生连接反应，就没有限定，例如可以设为1分钟～5小时、优选10分钟～2小时或15分钟～1小时。
本发方法根据需要还可以包括如下纯化步骤：从进行上述步骤之后的混合物中分离杂质、例如未反应的肽和化合物等，并将连接半胱氨酸残基的肽进行纯化。该步骤可以通过本领域中公知的方法、例如凝胶过滤色谱法、离子交换色谱法、亲和色谱法、反相柱色谱法和HPLC等色谱法等进行。
就本方法中所使用的肽的种类而言，只要可利用所述化合物连接半胱氨酸残基，就没有特别限定，可举出例如本说明书中记载的IgG结合肽或WO2013/027796的说明书中记载的肽。作为WO2013/027796的说明书中记载的肽的实例，可举出将本说明书中记载的IgG结合肽的Xaa1残基置换为精氨酸残基(R)的肽。
实施例
[实施例1：IgG结合肽与IgG的复合物的X射线晶体结构分析]
<方法>
(1)IgG结合肽溶液的制作
通过利用F-moc法的肽固相合成法，按照常规方法制备具有G(HC)DCAYHRGELVWCT(HC)H-NH2的序列(SEQ ID NO:31，其中，HC为高半胱氨酸，第4位和第14位2个Cys、第2位和第16位2个高半胱氨酸分别在分子内形成二硫键)的环状高半胱氨酸肽。将制备的IgG结合肽0.8mg的粉末溶解于24μL的100％二甲基亚砜(和光纯药)中，制备IgG结合肽溶液。
(2)Fc与IgG结合肽的复合物的制作
在含有10mM EDTA和1mM L-半胱氨酸的20mmol/L磷酸缓冲液(pH7.0)中，在37℃下使用木瓜蛋白酶(罗氏公司制)酶切人IgG(中外制药)的铰链(hinge)部分。接着，使用阳离子交换色谱柱(TSKgel SP5-PW(东曹))，流速为1mL/min，在20mM醋酸钠缓冲液(pH5.0)中，通过0-0.3M NaCl的梯度洗脱并纯化人IgG Fc。将63μL含有16mg/mL的人IgG Fc的溶液(0.1M氯化钠(和光纯药)、0.04M 2-吗啉代乙烷磺酸(和光纯药)(pH6.0))与上述(1)中制作的IgG结合肽溶液2μL混合，制备Fc与IgG结合肽的复合物溶液。
(3)Fc与IgG结合肽的复合物的结晶的制作
Fc与IgG结合肽的复合物的结晶通过坐滴气相扩散法得到。即，上述(2)中制作的Fc与IgG结合肽的复合物溶液0.3μL与结晶剂(20％聚乙二醇3350(Sigma-Aldrich)、0.2M碘化钾(和光纯药)(pH6.9))0.3μL，使用结晶用机器人的HydoraII+(Matrix公司制)，在Intelli结晶板(VERITAS公司制)的S1孔上混合，制成结晶滴。分注上述结晶剂70μL作为储藏溶液。将结晶板用Power Seal CRISTAL VIEW(Greiner Bio-One公司制)密闭后，在20℃的恒温槽内静置约2周，得到结晶。
(4)Fc与IgG结合肽的复合物的结晶的X射线衍射强度数据的收集
将上述(3)中得到的结晶移至稳定母液(22％聚乙二醇3350、0.2M碘化钾、0.1M氯化钠、25％甘油(w/v)、0.04M 2-吗啉代乙烷磺酸(pH6.0))，通入-170℃的氮气流快速冷冻，用振动法测定X射线衍射数据。用X射线的波长为1埃、振动角为1°/帧实施。接着，使用衍射强度数据处理程序HKL2000(HKL Research公司制)，对衍射强度数据用距离分辨率3.0埃进行处理。其结果是结晶的空间群为P21，格子常数为a＝66.1埃、b＝60.5埃、c＝69.5埃，α＝γ＝90°、β＝101.3°。得到的数据的完整度(Completeness)为99.9％，Rmerge为13.8％。
(5)Fc与IgG结合肽的复合物的晶体结构的确定
对DCAYHRGELVWCT(SEQ ID NO:33)，将上述(4)中得到的衍射强度数据尝试利用CCP4(Collaborative Computational Project Number 4)中所含的程序Phaser进行分子置换法的位相确定。分子置换法的搜索模型利用在蛋白质数据库(Protein databank,PDB,URL:http://www.rcsb.org/pdb/)中注册为PDB accession code：1DN2的Fc部分的模型。其结果是可以在非对称单元中发现1个分子的模型。接着，重复实施使用CCP4中所含的结构精密化程序Refmac5的结构精密化和使用模型构建程序X-tal view的模型的修正，得到Fc与IgG结合肽(DCAYHRGELVWCT(SEQ ID NO:33))复合物的晶体结构。在Fc的肽结合位点观测到相当于IgG结合肽的电子密度。确定的晶体结构的精确性指标的R因子为0.216。进而，在精密化的阶段由相当于未纳入计算的全部反射的5％的结构因子计算而得的自由R因子(Rfree)为0.317。
(6)交联结构模型的制作
根据上述的X射线结晶分析的结构，在计算科学软件MOE(Molecular OperatingEnvironment)上制作交联结构模型。将DCAYHRGELVWCT(SEQ ID NO:33)的第6位氨基酸置换为Lys之后，以在该Lys的ε氨基与抗体Fc的第248位Lys的ε氨基之间连接的形式将DSG或DSS的交联结构进行模型化。
<结果>
如图1A所示，认为IgG结合肽结合在与蛋白A的结合位点重叠的CH2与CH3结构域的边界区域，并且以与已经报道的IgG结合肽Fc-III(DeLano,W.L.et al.,Science,2000,287,pp.1279-1283)类似的形式与IgG结合。IgG结合肽与Fc的特征性的相互作用为IgG结合肽的第8位残基Arg的侧链的胍基以2.91埃与Fc的Glu380(按照EU编号，以下相同)的侧链的羧酸进行盐结合这一点。该Glu380的侧链在人IgG Fc中，与Lys248进行盐结合而形成分子内的盐结合的网络，IgG结合肽的Arg8和Fc的Lys248通过与Fc的Glu380的相互作用而接近。因此，考虑将IgG结合肽的第8位残基Arg置换为Lys，以与该盐结合的网络结构类似的形式将肽的Lys8与抗体的Lys248的侧链的氨基用交联剂进行交联。实际上，根据IgG结合肽与人IgG Fc的复合物结构，制作DSG(双琥珀酰亚胺戊二酸酯)或DSS(辛二酸二琥珀酰亚胺酯)的交联结构的模型，结果认为空间上也可以不伴随抗体的主链结构变形地导入交联剂(图1B)。
[实施例2：标记用肽的制备与特性]
<方法>
用生物素(Biotin)或5/6-田村琥珀酰亚胺酯(TAMURA succinimidyl ester)(AnaSpec公司)(荧光色素)对氨基修饰的氨基-PEG4化合成肽GPDCAYHXGELVWCTFH(SEQ IDNO:2)(其中，C末端为酰胺化)利用Fmoc固相合成法按照常规方法合成。除去保护基之后，在pH8.5的水溶液中在氧化条件下形成分子内S-S键，使用反相HPLC，流速为1.0ml/min，通过含有0.1％的TFA的10％至60％的乙腈的梯度洗脱将具有分子内S-S键的肽进行纯化。
将含有经纯化的IgG结合肽1mM的DMF溶液100μL与100mM的DSS或DSG(赛默飞世尔科技公司)的乙腈溶液100μL混合后，在室温下反应一夜。将反应物用0.1％TFA稀释至2.5倍之后，注射到沃特世公司制的μ-Bondasphere 5C18 100埃(直径3.9mm×150mm)中，用含有0.1％TFA的4％至60％的乙腈的梯度进行洗脱。对得到的生成物加成交联剂，在连接BEH300C18(1.7μm、直径2.1mmx 50mm)色谱柱的液质联用系统(LC-Mass spectrometry)(Acquity SQD UPLC system,沃特世公司)上用含有0.1％甲酸的4％至60％的乙腈的梯度进行洗脱，通过测定波峰的分子量进行确认。
得到的标记试剂肽的亲和力分析是在通过加入十分之一量的1MTris-HCl(pH＝7.0)反应15min将NHS基水解后，用以下的方法进行的。在安装在BIAcoreT200(GEHealthcare)的CM5传感器芯片上，将0.4M EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide，1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)与0.1M磺酸基-NHS(Sulfo-N-hydroxysuccinimide，磺酸基-N-羟基琥珀酰亚胺)等量混合后，以10μl/ml的流速注射7分钟到传感器芯片，激活传感器芯片，在pH4.0(10mM醋酸钠)的条件下，固定量按RU值计为4000～5000的方式固定IgG。在使用HBS-EP缓冲液(0.01M HEPES、0.15M NaCl、0.005％Tween 20、3mM EDTA、pH7.0)的同时，通过流速50μl/ml注射180秒从10nM至2μM的浓度的肽监控结合反应，然后通过用缓冲液洗涤600秒来对解离反应测定。结合参数的分析使用BIAevalution T100软件进行。
<结果>
为了研究导入交联结构是否对IgG结合肽的特异性和亲和力产生影响，通过SPR分析对导入交联结构的IgG结合肽的IgG的结合力进行测定(表1)。将第8位残基的精氨酸置换为赖氨酸的IgG结合肽(以下也称为I型(R8K))针对人IgG的亲和力为131nM(Kd)，与置换前的IgG结合肽(以下也称为I型)相比，亲和力降低10倍。在I型(R8K)肽上结合各交联剂的物质中，针对IgG的亲和力，I型(R8K)-DSG-OH约为330nM(Kd)，I型(R8K)-DSS-OH约为390nM(Kd)，未见交联剂结合导致的亲和力的明显减少。即使是对任一种肽，也具有Kd值为μM以下的亲和力，因此认为可以进行充分特异性的标记化。
[表1]
I型(R8K)与各交联剂结合肽的水解物的亲和力(全部使用将肽的N末端用生物素化PEG4封闭的所得物)。I型(R8K)-DSG-OH、I型(R8K)-DSS-OH表示在I型(R8K)中使导入的交联剂的NHS基进行水解的所得物。
[实施例3：利用IgG结合肽的人IgG-Fc的特异性修饰]
<方法>
通过与实施例2同样的方法制备对在N末端附加生物素-PEG4的IgG结合肽(I型(R8K))用DSS或DSG修饰的标记化试剂肽，使其与人IgG Fc反应，研究人IgG Fc的标记化反应。即，通过与实施例2同样的方法利用反相柱对与过量的DSS或DSG反应的IgG结合肽(R8K)(200pmol/5μL于0.1％TFA)进行纯化之后，减压除去乙腈，然后加入约1/8的0.5M Na2HPO4进行中和，立即以摩尔比10倍量加入蛋白样品(hIgG(中外制药)、hIgA(Athens Research&Technology)、HSA(Sigma-Aldrich)，或者血清(采自健康人))(各为40pmol/5μL，血清用PBS稀释10倍)中，用PBS使最终体积为20μL之后，在室温下放置5分钟。然后，加入1M Tris-HCl(pH＝7.0)1μl使反应停止后，加入4×SDS样品溶液6.7μl和2-巯基乙醇1.4μl(最终体积的5％)，在95℃下处理10min后，使用5％-20％的预制凝胶SuperSepTMAce(和光纯药)进行SDS-PAGE电泳。泳动后的凝胶使用Hoefer半干转印电泳仪TE70(Hoefer Semiphor TE70)，以35mA、60分钟转印到PVDF膜之后，用0.5％BSA进行封闭。用生物素化肽标记的蛋白使用HRP-SA共轭物(稀释1000倍、Vector Laboratories)并利用化学发光试剂(Immunostar(注册商标)Basic、和光纯药)进行检测。
<结果>
如图2B所示，在蛋白质印迹法中，仅在与IgG反应的情况下，可观察到视为复合物的条带，因此可知：与DSG或DSS反应的IgG结合肽均不与IgA及HAS、血清中的除IgG之外的蛋白结合，而选择性地与IgG结合。
[实施例4：针对IgG的IgG结合肽的反应条件的研究]
<方法>
(1)反应摩尔比的研究
在96孔微孔板(Nunc(注册商标)MaxiSorp)的孔中，将含有各蛋白(IgG(中外制药)、IgA(Athens Research&Technology)，或者牛明胶(和光纯药))(50ng(0.33pmol)/μl/孔)的0.1M NaHCO3溶液加入微孔板中，在室温下放置一夜，由此使各蛋白吸附在微孔板的表面，用0.5％BSA进行封闭之后，在各孔中加入用与实施例2同样地制备的用DSG修饰的生物素化IgG结合肽(摩尔比为0、1、2、5、10)，经过1小时后，加入1M Tris-HCl(pH7.0)3μL，使反应停止。加入用0.5％BSA稀释2000倍的SA-HRP(Vector Laboratories)50μL，在室温下反应1小时后，用0.1％PBST洗涤5次后，对HRP的发色使用TMB溶液(Wako Chemicals)，进行5分钟的显色反应后，用ELISA板阅读仪(680型微孔板阅读仪(Bio-Rad))测定450nm处的吸光度。
(2)反应时间的研究
用50ng/50μL的溶液对在4℃下固定一夜的hIgG(50ng)，以摩尔比为2加入用DSG修饰的生物素化IgG结合肽，在各反应时间(0～60分钟)内加入1M Tris-HCl(pH7.0)3μL，使反应停止。结合的检测与(A)同样地进行。
<结果>
使用DSS标记化IgG结合肽，利用ELISA对与抗体反应的摩尔数和反应时间的不同导致的反应效率进行研究(图3)。即，使在塑料微孔板上固定的IgG结合肽的摩尔比从1变化至10并与hIgG反应，结果在大致摩尔比为5时可看到饱和，由此认为：如果加入摩尔比为5左右的肽试剂，则对抗体的标记化充分(图3A)。在没有用DSS修饰的生物素化IgG结合(R8K)肽(无DSS R8K)中，可看到非常弱的结合，其认为是用非共价键结合的肽导致的结合活性。进而，即使过量地加入标记化IgG结合肽试剂，完全未检出也对其它蛋白(hIgA、牛明胶或用作封闭剂的BSA)的结合。
接着，对以IgG与IgG结合肽的摩尔比为1:2进行反应时的反应时间进行研究。其结果是约15分钟可看到饱和，因此认为反应在15分钟内基本结束(图3B)。
由以上结果表明：用交联剂修饰的本发明的IgG结合肽在短时间内、且特异性地与IgG结合。
[实施例5：利用荧光IgG结合肽的Fc的标记化]
<方法>
使IgG(中外制药)、IgA(Athens Research&Technology)或BSA(Sigma-Aldrich)(15μg：换算IgG为100pmol)和按照实施例2制备的DSG交联肽或DSS交联肽(500pmol)在200μL中在室温下反应60min，加入1M Tris-HCl(pH＝7.0)10μL，使反应停止。然后，用SuperdexTM200 10/30GL直径1.0cm×30cm(GE Healthcare)；流速：0.3ml/min；电泳缓冲液：PBS pH7.4进行尺寸排除色谱法，使用RF-10A荧光检测器(岛津制作所)(激发光：541nm荧光：565nm)进行测定。
<结果>
使DSS或DSG反应而形成的标记化IgG结合肽以相对于各蛋白的摩尔比为1:5地与蛋白在室温下反应60min，利用尺寸排除色谱法进行分析。即使使用任一种标记化IgG结合肽(DSS或DSG)，对IgG的反应性的特异性也为同等程度，完全未检出对hIgA或BSA等其它蛋白的荧光标记化(图4)。由上述可知：即使使用制作的任一种IgG结合肽，也具有高特异性，可以荧光标记人IgG。
[实施例6：利用IgG结合肽的Fc的修饰物的分析(pH4.5)]
<方法>
加入人IgG(中外制药)的Fc溶液(20μM、0.1M醋酸缓冲液pH4.5)200μL和溶解于DMF中的通过与实施例2同样的方法经DSG修饰的IgG结合肽(RGNCAYHXGQLVWCTYH(SEQ ID NO:35)，X为赖氨酸)(4mM)0.5、1.0、2.0、5.0μL(摩尔比为0.5、1.0、2.0、5.0)，快速搅拌后，在室温下反应15分钟，加入1M Tris-HCl(pH7.0)10μL，使反应停止。将反应物50μL注射到连接Shodex IEC SP-825柱的NGC Chromatography system(Bio-Rad)，进行从25mM醋酸缓冲液(Acetate buffer)(pH4.5)至含有1M NaCl的25mM醋酸缓冲液(pH4.5)的梯度洗脱，通过215nm处的吸光度监控蛋白的洗脱。分别收集得到的各波峰部分，用于利用LC/MS的分子量测定。
在连接Waters ACQUITY UPLC BEH C8(1.7μm2.1mm×100mm)柱的Shimadzu LCMS-8030中注射20μL所得到的波峰洗脱液之后，进行从含有0.1％甲酸的4％乙腈至含有0.1％甲酸的60％乙腈的梯度洗脱。进行所洗脱的波峰的质谱分析，通过由使用分析软件的多价离子波峰的解卷积(deconvolution)计算质量。
<结果>
使人IgG1-Fc与经DSG修饰的IgG结合肽(4mM、生物素-PEG4-RGNCAYHXGQLVWCTYH-NH2；分子量2760，X为经DSG化的赖氨酸，2个Cys形成分子内SS键)以摩尔比为0.5、1.0、2.0或5.0进行反应，结果如图5A所示，出现原来的人IgG1-Fc的洗脱位置的波峰(波峰2)和2个波峰3、4(波峰1认为是经DSG化的IgG结合肽)。为了鉴定这些分子种类，进行LCMS分析。反应前的IgG1-Fc在离子交换色谱中在波峰1时被洗脱，在LCMS分析中，可得到55084的值。对反应后的2、3、4的波峰进行LCMS分析，结果分别可得到55087、57735(55087+2648)、60384(55087+5297)的值。由此可知：反应后的波峰2为未反应的Fc，波峰3和4在Fc上分别结合1个和2个肽。
图5B是各以摩尔比进行反应时，将未反应(波峰2)、1个肽的附加物(波峰3)、2个肽的附加物(波峰4)的生成量的变化予以图表化的图。可知：例如即使在以摩尔比为1:1进行反应的情况下，未反应物为20％以下，在摩尔比为1:2中，未反应物为10％以下，产量非常高。另外可知：即使在过量的摩尔比为1:5的情况下，2个肽的附加物的生成比率也相对地增加，但附加上述摩尔比以上肽的Fc在离子交换色谱上未检出，因此该标记反应非常有特异性。
[实施例7：pH与反应时间对于利用IgG结合肽的Fc的反应的影响]
<方法>
对用pH4.0(25mM醋酸缓冲液)、pH5.5(25mM醋酸缓冲液)或pH7.0(PBS)制备的人IgG的Fc溶液200μL，加入实施例5中制备的溶解于DMF中的经DSG修饰的IgG结合肽(4mM)1.0μL(摩尔比为1.0)，快速搅拌后，在室温下进行反应。在反应后1、5、10或30分钟时加入1MTris-HCl(pH7.0)10μL，使反应停止，将反应物50μL注射到连接Shodex IEC SP-825柱的NGCChromatography system(Bio-Rad)，进行从25mM醋酸缓冲液(pH4.5)至含有1M NaCl的25mM醋酸缓冲液(pH4.5)的梯度洗脱，通过215nm处的吸光度监控蛋白的洗脱。根据得到的色谱，计算各波峰的比率。
<结果>
如图6所示，可知：在试验的pH4.0、pH5.5和pH7.0的任一种中，标记化反应均很快，反应的90％以上在1分钟以内结束。另外，在pH4.0中，未反应物的剩余量超过40％，反应收率低，特别是2个肽的附加物(波峰4)的产量为15％左右，与其它pH的情况(35-40％)相比较低。在pH5.5和pH7.0中，未反应物的产量也低至10％内，可知有效地进行反应。作为pH5.5与pH7.0之差，波峰4的产量在为pH7.0时可看到一些变低的趋势。
[实施例8：使用IgG结合肽的单链Fv-Fc抗体的荧光标记的FACS分析]
<方法>
使用Lipofectamine 2000向HEK293细胞转染具有连接针对Her2的scFv(4D5)与Fc基因的scFv-Fc的pcDNA3.1/Zeo(+)，培养5天后，利用蛋白A柱对分泌于培养液中的scFv-Fc进行纯化，制备4D5-Fc抗体(具有针对HER2的特异性的单链Fv克隆4D5与Fc的融合蛋白)。接着，将用含有3％BSA的PBS 10μL稀释制备的4D5-Fc抗体1.0μg的溶液与通过与实施例2同样的方法经DSG修饰的N末端生物素化IgG结合肽(生物素-PEG4-RGNCAYHXGQLVWCTYH(SEQ IDNO:35)，X为经DSG化的赖氨酸，2个Cys形成分子内SS键)0.16μg(20p mol)混合，反应10分钟。在分散于含有10％FBS的PBS 100μL的乳腺癌细胞株SK-BR3(从ATCC购入)(5.0×105细胞)中加入该反应物，在4℃下放置30分钟。用含有3％BSA的PBS洗涤一次，悬浮于含有3％BSA的PBS 100μL之后，加入PE标记链霉亲和素(Vector Laboratories)0.01μg(0.2pmol)，在4℃下放置30分钟。再次用含有3％BSA的PBS洗涤一次后，分散于含有3％BSA的PBS 100μL，添加7-AAD Viability Dye(贝克曼库尔特)10μL后，放置15分钟。加入PBS 400μL并进行分散，通过35μm的筛孔(Corning)之后，在S3eTM细胞分选仪(Bio-Rad)上进行分析。
<结果>
将利用经DSG修饰的生物素化IgG结合肽与PE标记链霉亲和素对4D5-Fc抗体与乳腺癌细胞株SK-BR3上的HER2抗原的结合的检测结果示于图7A。作为对照，使用生物素化抗人IgG小鼠抗体(抗hIgG mAb-生物素标记)(0.01μg)替换经DSG修饰的生物素化IgG结合肽(生物素化IgG结合肽)时的流式细胞检测分析的结果也一同表示(任一种情况下，也仅使用通过7-AAD染色除去被染色的死细胞的细胞组分进行分析)。在2个体系中，均在荧光强度上几乎不同，因此可知：经SG修饰的生物素化IgG结合肽通过特异性地标记人Fc而可以利用于单链Fv-Fc等FACS染色。另一方面，作为负对照，对未加入4D5-Fc的体系也进行了研究(图7B)，但与未加入SG修饰生物素化IgG结合肽的体系(抗hIgG mAb-生物素标记+SA-PE标记，以及Anti hIgG mAb-PE标记)同样地，完全未见荧光强度的位移，因此可知：经DSG修饰的生物素化IgG结合肽单独不引起针对细胞的非特异性的修饰。
[实施例9：利用IgG结合肽，抗IgA受体VHH与人IgG抗体的共轭形成]
<方法>
经DSG修饰的N末端叠氮化IgG结合肽(叠氮化物-PEG4-GPDCAYHXGELVWCTFH(SEQID NO:2)，X为经DSG化的赖氨酸，2个Cys形成分子内SS键，C末端进行酰胺化)通过与实施例2同样的方法而制备。将该肽以10mM的浓度溶解于DMSO，将该溶液20μL加入25mM醋酸缓冲液(pH5.0)中溶解有16.6μM的抗HER2人IgG抗体(中外制药)的溶液8mL(肽与抗体的摩尔比＝1:1.5)，在室温下反应5小时。反应后，在CIMmultusTM SO3-1(SHOWA DENKO)的柱(1mL)上，通过25mM醋酸缓冲液(pH5.0)的0至1M的NaCl梯度洗脱将叠氮化肽抗HER2人IgG抗体(1价叠氮化肽抗体、2价叠氮化肽抗体的混合物)进行纯化。
源自羊驼的抗IgA受体VHH抗体克隆2b1-L9(在C末端附加HIS标签)将在大肠杆菌HB2151中的分泌表达物使用附加于C末端的HIS标签进行亲和纯化。具体而言，向大肠杆菌HB2151中导入具有VHH基因的噬菌粒载体pKSTV03之后，用2TYAG板选择，在2TYA液体培养基中37℃下培养一夜。向2TYA 500mL中加入该培养液10mL，在37℃下培养1小时后，添加1MIPTG 500μL，振荡培养16小时。将离心后的菌体悬浮于TES缓冲液(0.2M Tris-base、0.5mMEDTA、0.5M蔗糖)10mL，冰上静置2小时。加入稀释4倍的TES缓冲液20mL并进行再悬浮，冰上静置1h后，进行离心，回收上清液组分(周质组分)。上清液利用亲和色谱柱(His trapexcel，GE Healthcare)，使用Profinia(BioRad)的纯化系统对VHH进行纯化(结合流速/洗脱流速为2mL/min、洗涤流速为2mL/min，缓冲液使用平衡缓冲液：0.5M NaCl、20mM磷酸钠、洗涤缓冲液：0.5M NaCl、20mM磷酸钠、洗脱缓冲液：500mM咪唑、0.5M NaCl、20mM磷酸钠。接着，在PBS(pH7.4)中，在0.1mM的DTT的存在下，室温下还原处理1小时后，在IEC SP-825(Shodex)色谱柱(8.0mm×75mm)上通过10mM醋酸缓冲液(pH4.5)的0至1M的NaCl梯度洗脱进行纯化。将进行还原处理的VHH溶液(41.2μM，pH4.5)200μL与溶解于10mM醋酸缓冲液(pH4.5)的870μM 二苯并环辛炔(DBCO)-马来酰亚胺(Click Chemistry Tools)42μL混合(摩尔比为1:4.4)，在室温下反应1小时。将这样制备的二苯并环辛炔-马来酰亚胺化VHH(22μM)290μL与上所述制备的叠氮化肽抗体溶液(17μM、pH4.5)116μL混合(摩尔比为3.3:1)，在4℃下反应14小时。反应物在IEC SP-825(Shodex)色谱柱(8.0mm×75mm)上、在10mM醋酸缓冲液(pH4.5)中用从0至1M的NaCl的梯度洗脱进行纯化。所纯化的组分还原后，在5％-20％的梯度凝胶Super Sep Ace(WAKO)上利用SDS-PAGE分离后，利用CBB进行蛋白染色。
<结果>
叠氮化肽抗体与二苯并环辛炔-马来酰亚胺化VHH的Click反应引起的连接后的离子交换色谱法，结果得到3个(a、b和c)主要波峰(图8A)。图8B中示出将各自在还原状态下利用SDS-PAGE进行分析的结果。在a(泳道3)中，可看到与原来的IgG(泳道1)相同的源自H链的50kDa和源自L链的25kDa的条带。B(泳道4)中，在L链的条带上没有变化，但除原来的IgG抗体的重链(约50kDa)(泳道1)之外，可看到大致等量浓度的在约80kDa位置的新条带。在c(泳道5)中，在L链的条带上没有变化，但原来的重链(约50kDa)的条带消失，仅看到约80kDa的条带。由此可知：a为没有附加VHH的IgG抗体，b为连接1个VHH的IgG抗体(抗HER2人抗体-1价VHH)，c为连接2个VHH的IgG抗体(抗HER2人抗体-2价VHH)。
由上述可知：通过在IgG抗体上使用IgG结合肽试剂导入的叠氮基与导入低分子量抗体VHH的二苯并环辛炔基间的Click反应，可以将低分子量抗体(VHH等)与IgG抗体连接。
[实施例10:通过抗IgA受体VHH与抗HER2人IgG抗体的IgG结合肽进行共轭的FACS抗原结合分析]
<方法>
HL60细胞(从JCRB获得)在含有10％FBS以及100单位/mL青霉素G与100μg/mL链霉素硫酸盐的RPMI1640培养基(Life Technologies公司)中通过添加1.3％DMSO进行6天分化诱导。关于SK-BR3细胞(从ATCC购入)，在含有10％FBS、100单位/mL青霉素G和100μg/mL链霉素硫酸盐的McCoy's 5A(Life Technologies公司)培养基中，在37℃下5％CO2培养箱中培养后，用胰酶-EDTA(Life Technologies公司)对细胞进行剥离、回收。使各2×105的细胞分散于含有200μL的3％BSA的PBS，加入一级抗体(抗HER2人IgG抗体、实施例9中制备的抗IgA受体VHH(C端加有HIS标签)或实施例9中制备的抗HER2人抗体-1价VHH(C端加有HIS标签))最终浓度为200nM，在4℃下放置30分钟。洗涤一次后，在分散于含有3％BSA的PBS的细胞液200μL中加入作为二级抗体的1)生物素化抗HIS标签抗体(MBL生命科学)+经PE标记的SA(最终浓度50nM)(Vector Laboratories)，或者2)经PE标记的抗人IgG多克隆抗体(AffimetrixeBioscience)(最终浓度13nM)，在4℃下放置30分钟。洗涤一次后，在分散于含有3％BSA的PBS的细胞液200μL中加入7-AAD Viability Dye(贝克曼库尔特)10μL并放置15分钟后，加入800μL的PBS，通过35μm的网眼(Corning)之后，在S3eTM细胞分选仪(Bio-Rad)上进行分析。
<结果>
图9A～C中示出使用通过7-AAD染色除去死细胞的细胞组分、使用抗HER2人IgG抗体(图9A)、抗IgA受体VHH(C端加有HIS标签)(图9B)、抗HER2人抗体-1价VHH(C端加有HIS标签)(图9C)作为一级抗体、使用最终浓度50nM的生物素化抗HIS抗体+经PE标记的SA的混合物作为二级抗体对高表达HER2的SK-BR3细胞进行FACS分析的结果。在图9C的情况下，可看到明显荧光位移，因此可知：制备的抗HER2人抗体-1价VHH中的抗HER2抗体具有对SKBR-3细胞的结合活性。
另一方面，图9D～F中示出使用抗HER2人抗体(图9D)、抗IgA受体VHH(C端加有HIS标签)(图9E)、抗HER2人抗体-1价VHH(图9F)作为一级抗体、使用PE标记抗人IgG多克隆抗体作为二级抗体检测了对利用DMSO 1.3％的分化诱导与高表达IgA受体的HL60细胞的结合的结果。在这里，也仅在图9F的抗HER2人抗体-1价VHH中可看到对HL60的结合，由此可知：抗HER2人抗体-1价VHH中的VHH保持针对IgA受体的抗原结合活性。予以说明，图9D中的一些荧光位移显示在进行分化的HL60细胞上HER2少量表达，但与该结合引起的荧光强度相比，图9F中的荧光强度大得多，因此认为对HER2的结合的帮助可以忽视。
[实施例11：利用IgG结合肽的抗体药物偶联物的细胞增殖抑制]
<方法>
用马来酰亚胺乙酰氧基琥珀酰亚胺酯(Maleimideacetoxyl succinimidylester)修饰N末端的氨基的马来酰亚胺-PEG4化合成肽RRGPDCAYHXGELVWCTFH(SEQ ID NO:37：在SEQ ID NO:2的肽的N末端附加2个Arg的肽，X为赖氨酸，C末端进行酰胺化)利用Fmoc固相合成法按照常规方法合成。除去保护基之后，在pH8.5的水溶液中在氧化条件下形成分子内S-S键，使用反相HPLC，流速为1.0ml/min，通过含有0.1％TFA的10％至60％的乙腈的梯度洗脱而纯化具有分子内S-S键的肽。在溶解于DMSO的肽(18.5mM)40μL中加入溶解于相同的DMSO的DM-1(emtansine(XDCExplorer公司)，50mM)24μL(肽与DM-1的摩尔比＝1:1.6)，进一步加入吡啶3.4μL(最终浓度5％)，在50℃下反应3小时。继续加入溶解于乙腈的DSG(500mM)80μL，在50℃下反应3小时，在IgG结合肽的马来酰亚胺基与DM-1的硫氢基之间形成交联结构。将总量在含有0.1％TFA的10％乙腈10ml中进行稀释，将离心后的上清液注射到Inertsustain C18色谱柱(7.6mm 1×250mm,GL Science)，用含有0.1％TFA的10％至70％的乙腈的梯度进行洗脱。对洗脱物进行质量分析并回收目的产物后，除去溶剂，然后进行冷冻干燥。
将溶解于DMSO中的12.0mM的连接DM-1的DSG修饰马来酰亚胺-PEG4化IgG结合肽试剂0.56μL与溶解于10mM醋酸缓冲液(pH5.5)的6.8μM的抗HER2人抗体(中外制药)1mL混合，在室温下反应30分钟(肽与抗体的摩尔比＝1:1)。这样制备的DM-1修饰人抗体(抗体药物偶联物、ADC)用阳离子交换色谱柱Shodex SP825(8.0mm×75mm,Shodex)通过从含有10mM醋酸缓冲液(pH5.5)的0M至1.0M的NaCl的梯度洗脱进行纯化。分别收集除了未反应的抗体之外的2个波峰(波峰A、B)部分之后，在Vivaspin(截留10000Da，赛多利斯)上通过3000g的离心操作进行脱盐浓缩。得到的样品用MALDI-TOF-MAS autoflex speed TOF/TOF-KG(BrukerDaltonics)测定质量，波峰A与原来的抗HER2人抗体相比增加3553(理论值3535)，波峰B与原来的抗HER2人抗体相比增加7092(理论值7070)，因此确认：连接DM-1的马来酰亚胺-PEG4化IgG结合肽分别导入1个(抗HER2抗体-DM1*1)和2个(抗HER2抗体-DM1*2)。
在96孔的细胞培养板的各孔中，以达到10000细胞/100μL的方式在含有10％FBS、100单位/mL青霉素G与100μg/mL链霉素硫酸盐的McCoy's 5A(Life Technologies公司)培养基上播种SK-BR3细胞(从ATCC购入)或C6细胞(从JCRB获得)。在37℃下5％CO2培养箱中培养24小时后，加入含有各浓度的如上所述制备的抗体药物偶联物(ADC)的培养基100μL，进而，在37℃的CO2培养箱中培养72小时。在各孔中加入Cell Counting Kit-8(同人化学)各10μL，在37℃的CO2培养箱中保温2小时后，用微孔板阅读仪测定450nm处的吸光度。
<结果>
为了评价针对乳腺癌细胞株SK-BR3的制备的ADC的细胞增殖抑制效果，在0-10nM的ADC的存在下培养SK-BR3细胞，并利用细胞测定试剂盒评价72小时后的细胞数(图10)。本次制备的抗HER2抗体-DM1*1、抗HER2抗体-DM1*2同时，针对高表达HER2的SK-BR3，在0.4nM以上浓度显示显著的细胞增殖抑制活性。另一方面，关于未表达HER2的C6细胞，在使用的抗体药物偶联物的浓度范围内未见细胞增殖抑制。由上述可知：利用通过IgG结合肽的共价键的抗体药物偶联物可以对癌细胞株表现有效的细胞增殖抑制活性。
[实施例12：具有由二氯丙酮产生的SS交联结构的IgG结合肽的抗体药物偶联物的细胞增殖抑制]
<方法>
N末端乙酰化RRC(Acm保护)-PEG4化合成肽GPDCAYHXGELVWCTFH(SEQ ID NO:2、X为赖氨酸，C末端酰胺化)在肽合成磁珠(Rink-amide-Chemmatrix resin、Biotage)上，利用Fmoc固相合成法按照常规方法合成。从树脂进行肽的切下、脱保护之后，得到肽(图11，a)。对得到的肽65mg(15.6μmol)溶解于含有6M盐酸胍的磷酸缓冲液(pH＝7.3)5mL中，向其中加入溶解于乙腈120μL的1,3-二氯-2-丙酮(2.9mg,23.4μmol,1.5摩尔当量)，在室温下搅拌。1小时后，通过HPLC分析确认反应结束，将反应溶液直接用HPLC进行纯化，由此得到环化肽(图11、b、33mg、7.8μmol、收率为50％)。对该环化肽，加入悬浮于90％醋酸水溶液(8.8mL)的醋酸银(30.8mg,184.5μmol)，在室温下、遮光下搅拌5小时。加入二硫苏糖醇(DTT：352mg,2.3mmol)，通过离心分离除去产生的沉淀，对得到的上清液利用HPLC进行纯化，由此得到环化肽(图11、c、20.5mg、5.2μmol、收率为67％)。
在将如上所述制备的环化肽溶解于DMSO而成的溶液(60mM)6μL中加入相同的溶解于DMSO的27mM的VcMMAE(Maleimidocaproyl-valine-citrulline-p-aminobenzoyloxycarbonyl-monomethylauristatin E,顺丁烯二酰亚胺己酰基-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苯甲基氧羰基-一甲基澳瑞他汀E,MedChem Express)18μL(肽与VcMMAE的摩尔比＝1:1.4)，进一步加入吡啶1.2μL(最终浓度5％)，在50℃下反应3小时。继续加入溶解于乙腈的DSG(500mM)25μL，在50℃下反应3小时。将总量在含有0.1％TFA的10％乙腈10ml中稀释，将离心后的上清液注射到Inertsustain C18色谱柱(7.6mm×250mm,GL Science)，用含有0.1％TFA的10％至80％的乙腈的梯度进行洗脱。对洗脱物进行质量分析，回收目的产物之后，除去溶剂，然后进行冷冻干燥。
将溶解于DMSO中的5.0mM的DSG修饰N末端乙酰化RRC-PEG4化IgG结合肽试剂(R8K)5.4μL与溶解于10mM醋酸缓冲液(pH5.5)的6.8μM的抗HER2人IgG抗体(中外制药)1mL混合，在室温下反应15小时(肽与抗体的摩尔比＝1:4)。这样制备的VcMMAE修饰人IgG抗体(抗体药物偶联物、ADC)用阳离子交换色谱柱Shodex SP825(8.0mm×75mm,Shodex)通过含有10mM醋酸缓冲液(pH4.5)的0M至1.0M的NaCl的梯度洗脱进行纯化。分别收集除了未反应的抗体之外的主要1个波峰部分之后，在Vivaspin(截留10000Da，赛多利斯)上通过3000g的离心操作进行脱盐浓缩。得到的样品用MALDI-TOF-MAS autoflex speed TOF/TOF-KG(BrukerDaltonics)测定质量，与原来的抗HER2人抗体相比增加3941(理论值4178)，因此确认：导入了1个附加VcMMAE的N末端乙酰-RRC-PEG4化IgG结合肽(R8K)。
在96孔的细胞培养板的各孔中，以达到10000细胞/100μL的方式在含有10％FBS、100单位/mL青霉素G与100μg/mL链霉素硫酸盐的McCoy's5A(Life Technologies公司)培养基上播种SK-BR3细胞(从ATCC购入)或C6细胞(从JCRB获得)。在37℃下5％CO2培养箱中培养24小时后，加入含有各浓度的抗体药物偶联物(ADC)的培养基100μL，进一步在37℃的CO2培养箱中培养72小时。在各孔中加入Cell Counting Kit-8(同人化学)各10μL，在37℃的CO2培养箱中保温2小时后，用微孔板阅读仪测定450nm处的吸光度。
<结果>
为了评价针对乳腺癌细胞株SK-BR3的制备的ADC的细胞增殖抑制效果，在0-500nMADC的存在下培养SK-BR3细胞，利用细胞测定试剂盒评价72小时后的细胞数(图12)。关于使用的抗癌剂VcMMAE本身，仅在250nM以上可看到增殖抑制(图12A)，本次制备的ADC对于高表达HER2的SK-BR3，在0.4nM以上浓度显示显著的细胞增殖抑制活性(图12B)，通过与抗体的共轭，细胞增殖抑制活性增强500倍左右。另一方面，这样的细胞增殖抑制仅在原来的抗HER2人抗体中未见到。由上述可知：通过IgG结合肽的共价键的抗体药物偶联物可以对癌细胞株表现有效的细胞增殖抑制活性。
[实施例13：针对各种IgG的IgG结合肽的标记评价]
<方法>
在人、小鼠、兔和大鼠的各种抗体溶液(14μM)1.25μL(相当于抗体2.5μg)中加入PBS 3.15μL，将通过与实施例2同样的方法与经DSG修饰的N末端生物素化IgG结合肽生物素-PEG4-RGNCAYHXGQLVWCTYH(SEQ ID NO:35，X为经DSG化的赖氨酸，2个Cys形成分子内SS键)的DMSO溶液(118μM)0.65μL混合后，在室温下反应30分钟(抗体与肽的摩尔比＝1:4)。向该反应液(5.0μL)中加入SDS-PAGE的样品缓冲液(4×)5.0μL、2-巯基乙醇0.6μL、超纯水9.35μL并混合后，在95℃下加热10分钟，在梯度凝胶(SuperSepTM Ace 5-20％,WakoChemicals)上进行SDS-PAGE。对凝胶用CBB进行蛋白染色，此外从凝胶转印到PVDF膜的蛋白用于蛋白质印迹法(Western Blot)。即，将转印后的PVDF膜用0.5％BSA进行封闭，使HRP标记链霉亲和素(Vector Laboratories)在室温下反应1小时，使用化学发光检测试剂Chemi-Lumi One(NACALAI TESQUE)，用化学发光成像器ChemDock(BioRad)进行检测。标记中使用的抗体如下所述：人IgG1(Clone ID:CB1)、人IgG2(Clone ID:CB2)、人IgG3(Clone ID:CB3)、人IgG4(Clone ID:CB4)、小鼠IgG1(Clone ID:CB5)、小鼠IgG2b(Clone ID:CB8)和小鼠IgG3(Clone ID:CB9)从Crown Bioscience公司购入。大鼠IgG1(Clone#：43414)和IgG2b(Clone#：141945)从R&D公司购入，IgG2c(Clone Name：SB68b)从LifeSpan BioScience公司购入，兔IgG从赛默飞世尔科技公司购入。
<结果>
如图13所示，与曲妥珠单抗(Trastuzumab)(抗HER2人化IgG1抗体)同等程度地在人单克隆IgG1、人IgG2和人IgG4中看到浓条带。另外，使用的动物抗体中的兔多克隆IgG抗体被特别强地染色。由上述可知：在使用本IgG结合肽的标记中，可以有效地标记人IgG1、2和4，以及兔IgG抗体。
工业上的可利用性
使用本发明的IgG结合肽，可以将连接于IgG结合肽的各种化合物在短时间内而且几乎无副反应地附加于IgG的Fc上。由此，可以利用各种化合物对用作检测试剂、诊断药和药物等的IgG进行特异性且简便地修饰。
本说明书中引用的所有的出版物、专利及专利申请直接通过引用而引入于本说明书中。
序列表
<110> 国立大学法人鹿儿岛大学
<120> 利用IgG结合肽的抗体特异性修饰
<130> PH-6549-PCT
<150> JP 2015-103153
<151> 2015-05-20
<160> 37
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> IgG结合肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa是赖氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、2-氨基辛二酸或二氨基丙酸
<400> 1
Asp Cys Ala Tyr His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr
1 5 10
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> IgG结合肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa是赖氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、2-氨基辛二酸或二氨基丙酸
<400> 2
Gly Pro Asp Cys Ala Tyr His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe
1 5 10 15
His
<210> 3
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> IgG结合肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa是赖氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、2-氨基辛二酸或二氨基丙酸
<400> 3
Arg Cys Ala Tyr His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Ser
1 5 10
<210> 4
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> IgG结合肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa是赖氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、2-氨基辛二酸或二氨基丙酸
<400> 4
Gly Pro Arg Cys Ala Tyr His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Ser Phe
1 5 10 15
His
<210> 5
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> IgG结合肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa是赖氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、2-氨基辛二酸或二氨基丙酸
<400> 5
Ser Pro Asp Cys Ala Tyr His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe
1 5 10 15
His
<210> 6
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> IgG结合肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa是赖氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、2-氨基辛二酸或二氨基丙酸
<400> 6
Gly Asp Asp Cys Ala Tyr His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe
1 5 10 15
His
<210> 7
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> IgG结合肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa是赖氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、2-氨基辛二酸或二氨基丙酸
<400> 7
Gly Pro Ser Cys Ala Tyr His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe
1 5 10 15
His
<210> 8
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> IgG结合肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa是赖氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、2-氨基辛二酸或二氨基丙酸
<400> 8
Gly Pro Asp Cys Ala Tyr His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Ser Phe
1 5 10 15
His
<210> 9
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> IgG结合肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa是赖氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、2-氨基辛二酸或二氨基丙酸
<400> 9
Gly Pro Asp Cys Ala Tyr His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr His
1 5 10 15
His
<210> 10
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> IgG结合肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa是赖氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、2-氨基辛二酸或二氨基丙酸
<400> 10
Gly Pro Asp Cys Ala Tyr His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe
1 5 10 15
Tyr
<210> 11
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> IgG结合肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa是赖氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、2-氨基辛二酸或二氨基丙酸
<400> 11
Ser Pro Asp Cys Ala Tyr His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe
1 5 10 15
Tyr
<210> 12
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> IgG结合肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa是赖氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、2-氨基辛二酸或二氨基丙酸
<400> 12
Ser Asp Asp Cys Ala Tyr His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe
1 5 10 15
Tyr
<210> 13
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> IgG结合肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa是赖氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、2-氨基辛二酸或二氨基丙酸
<400> 13
Arg Gly Asn Cys Ala Tyr His Xaa Gly Gln Leu Val Trp Cys Thr Tyr
1 5 10 15
His
<210> 14
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> IgG结合肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa是赖氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、2-氨基辛二酸或二氨基丙酸
<400> 14
Asp Cys Thr Tyr His Xaa Gly Asn Leu Val Trp Cys Thr
1 5 10
<210> 15
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> IgG结合肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa是赖氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、2-氨基辛二酸或二氨基丙酸
<400> 15
Asp Cys Ala Tyr His Xaa Gly Asn Leu Val Trp Cys Thr
1 5 10
<210> 16
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> IgG结合肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa是赖氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、2-氨基辛二酸或二氨基丙酸
<400> 16
Asp Cys Thr Tyr His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr
1 5 10
<210> 17
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> IgG结合肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa是赖氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、2-氨基辛二酸或二氨基丙酸
<400> 17
Asp Cys Ala Trp His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr
1 5 10
<210> 18
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> IgG结合肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa是赖氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、2-氨基辛二酸或二氨基丙酸
<400> 18
Asp Cys Thr Tyr Thr Xaa Gly Asn Leu Val Trp Cys Thr
1 5 10
<210> 19
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> IgG结合肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa是赖氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、2-氨基辛二酸或二氨基丙酸
<400> 19
Asp Cys Ala Tyr Thr Xaa Gly Asn Leu Val Trp Cys Thr
1 5 10
<210> 20
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> IgG结合肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa是赖氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、2-氨基辛二酸或二氨基丙酸
<400> 20
Asp Cys Ser Tyr Thr Xaa Gly Asn Leu Val Trp Cys Thr
1 5 10
<210> 21
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> IgG结合肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa是赖氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、2-氨基辛二酸或二氨基丙酸
<400> 21
Asp Cys Thr Trp Thr Xaa Gly Asn Leu Val Trp Cys Thr
1 5 10
<210> 22
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> IgG结合肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa是赖氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、2-氨基辛二酸或二氨基丙酸
<400> 22
Asp Cys Thr Tyr His Xaa Gly Asn Leu Val Trp Cys Thr
1 5 10
<210> 23
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> IgG结合肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa是赖氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、2-氨基辛二酸或二氨基丙酸
<400> 23
Asp Cys Thr Tyr Arg Xaa Gly Asn Leu Val Trp Cys Thr
1 5 10
<210> 24
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> IgG结合肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa是赖氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、2-氨基辛二酸或二氨基丙酸
<400> 24
Asp Cys Thr Tyr Ser Xaa Gly Asn Leu Val Trp Cys Thr
1 5 10
<210> 25
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> IgG结合肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa是赖氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、2-氨基辛二酸或二氨基丙酸
<400> 25
Asp Cys Thr Tyr Thr Xaa Gly Asn Leu Val Trp Cys Thr
1 5 10
<210> 26
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> IgG结合肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa是赖氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、2-氨基辛二酸或二氨基丙酸
<400> 26
Asp Cys Thr Tyr Thr Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr
1 5 10
<210> 27
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> IgG结合肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa是赖氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、2-氨基辛二酸或二氨基丙酸
<400> 27
Asp Cys Thr Tyr Thr Xaa Gly Arg Leu Val Trp Cys Thr
1 5 10
<210> 28
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> IgG结合肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa是赖氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、2-氨基辛二酸或二氨基丙酸
<400> 28
Asp Cys Thr Tyr Thr Xaa Gly Asp Leu Val Trp Cys Thr
1 5 10
<210> 29
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> IgG结合肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa是赖氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、2-氨基辛二酸或二氨基丙酸
<400> 29
Asp Cys Thr Tyr Thr Xaa Gly Asn Leu Ile Trp Cys Thr
1 5 10
<210> 30
<211> 110
<212> PRT
<213> 智人(Homo Sapiens)
<400> 30
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
100 105 110
<210> 31
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> IgG结合肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> Xaa是高丝氨酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> Xaa是高丝氨酸
<400> 31
Gly Xaa Asp Cys Ala Tyr His Arg Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Xaa
1 5 10 15
His
<210> 32
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> IgG结合肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa是赖氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、2-氨基辛二酸或二氨基丙酸
<400> 32
Gly Pro Asp Cys Ala Tyr His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe
1 5 10 15
His
<210> 33
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> IgG结合肽
<400> 33
Asp Cys Ala Tyr His Arg Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr
1 5 10
<210> 34
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> IgG结合肽
<400> 34
Asp Cys Ala Tyr His Lys Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr
1 5 10
<210> 35
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> IgG结合肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa是赖氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、2-氨基辛二酸或二氨基丙酸
<400> 35
Arg Gly Asn Cys Ala Tyr His Xaa Gly Gln Leu Val Trp Cys Thr Tyr
1 5 10 15
His
<210> 36
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> IgG结合肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> Xaa是高丝氨酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa是赖氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、2-氨基辛二酸或二氨基丙酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> Xaa是高丝氨酸
<400> 36
Gly Xaa Asp Cys Ala Tyr His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Xaa
1 5 10 15
His
<210> 37
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> IgG结合肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> Xaa是赖氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、2-氨基辛二酸或二氨基丙酸
<400> 37
Arg Arg Gly Pro Asp Cys Ala Tyr His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys
1 5 10 15
Thr Phe His

Claims (21)

1.一种肽，其特征在于，含有下述式I所示的由13～17个氨基酸残基组成的氨基酸序列，且能够与人IgG和/或兔IgG结合，
(X1-3)-C-(X2)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-(X1-3) (I)
式中，X各自独立地为除半胱氨酸之外的任意氨基酸残基，
C为半胱氨酸残基，
H为组氨酸残基，
Xaa1为赖氨酸残基、半胱氨酸残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、2-氨基辛二酸或二氨基丙酸，
G为甘氨酸残基，
Xaa2为谷氨酸残基或天冬酰胺残基，
L为亮氨酸残基，
V为缬氨酸残基，且
W为色氨酸残基。
2.根据权利要求1所述的肽，其特征在于，含有下述式II所示的由13～17个氨基酸残基组成的氨基酸序列，且能够与人IgG和/或兔IgG结合，
(X1-3)-C-(Xaa3)-(Xaa4)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-(X1-3) (II)
式中，X各自独立地为除半胱氨酸之外的任意氨基酸残基，
C为半胱氨酸残基，
H为组氨酸残基，
Xaa1为赖氨酸残基、半胱氨酸残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、2-氨基辛二酸或二氨基丙酸，
G为甘氨酸残基，
Xaa2为谷氨酸残基或天冬酰胺残基，
L为亮氨酸残基，
V为缬氨酸残基，
W为色氨酸残基，
Xaa3为丙氨酸残基、丝氨酸残基或苏氨酸残基，且
Xaa4为酪氨酸残基或色氨酸残基。
3.根据权利要求1或2所述的肽，其特征在于，含有下述式III所示的由13～17个氨基酸残基组成的氨基酸序列，且能够与人IgG和/或兔IgG结合，
(X1-3)-C-A-Y-H-(Xaa1)-G-E-L-V-W-C-(X1-3) (III)
式中，X各自独立地为除半胱氨酸之外的任意氨基酸残基，
C为半胱氨酸残基，
A为丙氨酸残基，
Y为酪氨酸残基，
H为组氨酸残基，
Xaa1为赖氨酸残基、半胱氨酸残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、2-氨基辛二酸或二氨基丙酸，
G为甘氨酸残基，
E为谷氨酸残基，
L为亮氨酸残基，
V为缬氨酸残基，且
W为色氨酸残基。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的肽，其中，设为17个氨基酸残基时，从N末端起第1～3位、15～17位各氨基酸残基为如下：
第1位氨基酸残基为S、G、F，或者无，
第2位氨基酸残基为D、G、A、S、P、高半胱氨酸，或者无，
第3位氨基酸残基为S、D、T、N、E或R，
第15位氨基酸残基为S、T或D，
第16位氨基酸残基为H、G、Y、T、N、D、F、高半胱氨酸，或者无，
第17位氨基酸残基为Y、F、H、M，或者无。
5.根据权利要求4所述的肽，其包括以下的1)～15)中任一种氨基酸序列，其中，Xaa1为赖氨酸残基、半胱氨酸残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、2-氨基辛二酸或二氨基丙酸，Xaa2为高半胱氨酸，
1)DCAYH(Xaa1)GELVWCT(SEQ ID NO:1)
2)GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(SEQ ID NO:2)
3)RCAYH(Xaa1)GELVWCS(SEQ ID NO:3)
4)GPRCAYH(Xaa1)GELVWCSFH(SEQ ID NO:4)
5)SPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(SEQ ID NO:5)
6)GDDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(SEQ ID NO:6)
7)GPSCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(SEQ ID NO:7)
8)GPDCAYH(Xaa1)GELVWCSFH(SEQ ID NO:8)
9)GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTHH(SEQ ID NO:9)
10)GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY(SEQ ID NO:10)
11)SPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY(SEQ ID NO:11)
12)SDDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY(SEQ ID NO:12)
13)RGNCAYH(Xaa1)GQLVWCTYH(SEQ ID NO:13)
14)G(Xaa2)DCAYH(Xaa1)GELVWCT(Xaa2)H(SEQ ID NO:36)
15)RRGPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(SEQ ID NO:37)。
6.根据权利要求1或2所述的肽，其特征在于，含有下述式IV所示的由13个氨基酸残基组成的氨基酸序列，且能够与人IgG和/或兔IgG结合，
D-C-(Xaa3)-(Xaa4)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-T (IV)
式中，
D为天冬氨酸残基，
C为半胱氨酸残基，
H为组氨酸残基，
Xaa1为赖氨酸残基、半胱氨酸残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、2-氨基辛二酸或二氨基丙酸，
G为甘氨酸残基，
Xaa2为谷氨酸残基或天冬酰胺残基，
L为亮氨酸残基，
V为缬氨酸残基，
W为色氨酸残基，
T为苏氨酸残基，
Xaa3为丙氨酸残基或苏氨酸残基，且
Xaa4为酪氨酸残基或色氨酸残基。
7.根据权利要求6所述的肽，其包括以下的1)～4)中任一种氨基酸序列，其中，Xaa1为赖氨酸残基、半胱氨酸残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、2-氨基辛二酸或二氨基丙酸，
1)DCTYH(Xaa1)GNLVWCT(SEQ ID NO:14)
2)DCAYH(Xaa1)GNLVWCT(SEQ ID NO:15)
3)DCTYH(Xaa1)GELVWCT(SEQ ID NO:16)
4)DCAWH(Xaa1)GELVWCT(SEQ ID NO:17)。
8.一种肽，其特征在于，含有下述式V所示的由13个氨基酸残基组成的氨基酸序列，且能够与人IgG和/或兔IgG结合，
D-C-(Xaa2)-(Xaa3)-(Xaa4)-(Xaa1)-G-(Xaa5)-L-(Xaa6)-W-C-T (V)
式中，
D为天冬氨酸残基，
C为半胱氨酸残基，
G为甘氨酸残基，
L为亮氨酸残基，
W为色氨酸残基，
T为苏氨酸残基，
Xaa1为赖氨酸残基、半胱氨酸残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、2-氨基辛二酸或二氨基丙酸，
Xaa2为丙氨酸残基、丝氨酸残基或苏氨酸残基，
Xaa3为色氨酸残基或酪氨酸残基，
Xaa4为组氨酸残基、精氨酸残基、丝氨酸残基或苏氨酸残基，
Xaa5为谷氨酸残基、天冬酰胺残基、精氨酸残基或天冬氨酸残基，且
Xaa6为异亮氨酸残基或缬氨酸残基。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的肽，其中，肽在外侧的2个半胱氨酸(C)残基间形成二硫键，或肽的外侧的2个半胱氨酸残基中的硫醚基由下式：
[化1]
所示的接头进行连接。
10.根据权利要求1～9中任一项所述的肽，其利用标记物进行标记。
11.根据权利要求1～10中任一项所述的肽，其结合有药剂。
12.根据权利要求1～11中任一项所述的肽，其中，Xaa1为赖氨酸残基。
13.根据权利要求1～12中任一项所述的肽，其中，Xaa1用交联剂进行修饰。
14.根据权利要求13所述的肽，其中，所述交联剂选自由DSG(双琥珀酰亚胺戊二酸酯)、DSS(辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、DMA(己二亚氨酸二甲酯二盐酸盐)、DMP(庚二亚氨酸二甲酯二盐酸盐)、DMS(辛二亚氨酸二甲酯二盐酸盐)、DTBP(3,3'-二硫代双丙二亚氨酸二甲酯二盐酸盐)和DSP(二硫代双琥珀酰亚氨基丙酸酯)组成的组。
15.根据权利要求14所述的肽，其中，所述交联剂为DSG(双琥珀酰亚胺戊二酸酯)或DSS(辛二酸二琥珀酰亚胺酯)。
16.一种复合物，其为权利要求13～15中任一项所述的肽与IgG的复合物，其通过用交联剂修饰的肽与IgG的交联反应而形成。
17.一种肽与IgG的复合物的生产方法，其包括如下步骤：
将权利要求13～15中任一项所述的肽与IgG混合，使用交联剂修饰的肽与IgG进行交联反应。
18.一种药物组合物，其含有权利要求1～15中任一项所述的肽或权利要求16所述的复合物。
19.一种肽的生产方法，该肽是2个以上半胱氨酸残基通过接头连接而成的，所述方法包括如下步骤：将含有2个以上半胱氨酸残基的肽与下式所示的化合物混合，
[化2]
式中，R1和R2各自独立地为任意的卤原子，
得到2个以上半胱氨酸残基中的硫醚基由下式：
[化3]
所示的接头连接而成的肽。
20.根据权利要求19所述的方法，其中，在所述化合物中，R1和R2相同，且为Cl、Br或I。
21.根据权利要求19或20所述的方法，其中，所述肽为权利要求1～8和10～15中任一项所规定的肽。
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