JP6872181B2 - IgG結合ペプチドによる抗体の特異的修飾 - Google Patents
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Description
(1)下記の式I:
(X1-3)-C-(X2)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-(X1-3) (I)
(式中、Xの各々は独立的にシステイン以外の任意のアミノ酸残基であり、
Cはシステイン残基であり、
Hはヒスチジン残基であり、
Xaa1はリシン残基、システイン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、2-アミノスベリン酸、又はジアミノプロピオン酸であり、
Gはグリシン残基であり、
Xaa2はグルタミン酸残基又はアスパラギン残基であり、
Lはロイシン残基であり、
Vはバリン残基であり、かつ
Wはトリプトファン残基である。)
によって表される、13〜17アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含み、かつヒトIgG及び/又はウサギIgGと結合可能であることを特徴とするペプチド。
(2)下記の式II:
(X1-3)-C-(Xaa3)-(Xaa4)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-(X1-3) (II)
(式中、Xの各々は独立的にシステイン以外の任意のアミノ酸残基であり、
Cはシステイン残基であり、
Hはヒスチジン残基であり、
Xaa1はリシン残基、システイン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、2-アミノスベリン酸、又はジアミノプロピオン酸であり、
Gはグリシン残基であり、
Xaa2はグルタミン酸残基又はアスパラギン残基であり、
Lはロイシン残基であり、
Vはバリン残基であり、
Wはトリプトファン残基であり、
Xaa3はアラニン残基、セリン残基又はトレオニン残基であり、かつ
Xaa4はチロシン残基又はトリプトファン残基である。)
によって表される、13〜17アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含み、かつヒトIgG及び/又はウサギIgGと結合可能であることを特徴とする、上記(1)に記載のペプチド。
(3)下記の式III:
(X1-3)-C-A-Y-H-(Xaa1)-G-E-L-V-W-C-(X1-3) (III)
(式中、Xの各々は独立的にシステイン以外の任意のアミノ酸残基であり、
Cはシステイン残基であり、
Aはアラニン残基であり、
Yはチロシン残基であり、
Hはヒスチジン残基であり、
Xaa1はリシン残基、システイン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、2-アミノスベリン酸、又はジアミノプロピオン酸であり、
Gはグリシン残基であり、
Eはグルタミン酸残基であり、
Lはロイシン残基であり、
Vはバリン残基であり、かつ
Wはトリプトファン残基である。)
によって表される、13〜17アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含み、かつヒトIgG及び/又はウサギIgGと結合可能であることを特徴とする、上記(1)又は(2)に記載のペプチド。
(4)17アミノ酸残基とした場合の、N末端から1〜3、15〜17番目の各アミノ酸残基が、
1番目のアミノ酸残基= S、G、F又は、なし
2番目のアミノ酸残基= D、G、A、S、P、ホモシステイン又は、なし
3番目のアミノ酸残基= S、D、T、N、E又はR、
15番目のアミノ酸残基= S、T又はD、
16番目のアミノ酸残基= H、G、Y、T、N、D、F、ホモシステイン又は、なし、
17番目のアミノ酸残基= Y、F、H、M又は、なし
である、上記(1)〜(3)のいずれかに記載のペプチド。
(5)以下の1)〜15)のいずれかのアミノ酸配列からなる、ただし、Xaa1はリシン残基、システイン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、2-アミノスベリン酸、又はジアミノプロピオン酸であり、Xaa2はホモシステインである、上記(4)に記載のペプチド。
1)DCAYH(Xaa1)GELVWCT(配列番号1)
2)GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(配列番号2)
3)RCAYH(Xaa1)GELVWCS(配列番号3)
4)GPRCAYH(Xaa1)GELVWCSFH(配列番号4)
5)SPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(配列番号5)
6)GDDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(配列番号6)
7)GPSCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(配列番号7)
8)GPDCAYH(Xaa1)GELVWCSFH(配列番号8)
9)GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTHH(配列番号9)
10)GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY(配列番号10)
11)SPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY(配列番号11)
12)SDDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY(配列番号12)
13)RGNCAYH(Xaa1)GQLVWCTYH(配列番号13)
14)G(Xaa2)DCAYH(Xaa1)GELVWCT(Xaa2)H(配列番号36)
15)RRGPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(配列番号37)
(6)下記の式IV:
D-C-(Xaa3)-(Xaa4)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-T (IV)
(式中、
Dはアスパラギン酸残基であり、
Cはシステイン残基であり、
Hはヒスチジン残基であり、
Xaa1はリシン残基、システイン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、2-アミノスベリン酸、又はジアミノプロピオン酸であり、
Gはグリシン残基であり、
Xaa2はグルタミン酸残基又はアスパラギン残基であり、
Lはロイシン残基であり、
Vはバリン残基であり、
Wはトリプトファン残基であり、
Tはトレオニン残基であり、
Xaa3はアラニン残基又はトレオニン残基であり、かつ、
Xaa4はチロシン残基又はトリプトファン残基である。)によって表される、13アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含み、かつヒトIgG及び/又はウサギIgGと結合可能であることを特徴とする、上記(1)又は(2)に記載のペプチド。
(7)以下の1)〜4)のいずれかのアミノ酸配列からなる、ただし、Xaa1はリシン残基、システイン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、2-アミノスベリン酸、又はジアミノプロピオン酸である、上記(6)に記載のペプチド。
1)DCTYH(Xaa1)GNLVWCT(配列番号14)
2)DCAYH(Xaa1)GNLVWCT(配列番号15)
3)DCTYH(Xaa1)GELVWCT(配列番号16)
4)DCAWH(Xaa1)GELVWCT(配列番号17)
(8)下記の式V:
D-C-(Xaa2)-(Xaa3)-(Xaa4)-(Xaa1)-G-(Xaa5)-L-(Xaa6)-W-C-T (V)
(式中、
Dはアスパラギン酸残基であり、
Cはシステイン残基であり、
Gはグリシン残基であり、
Lはロイシン残基であり、
Wはトリプトファン残基であり、
Tはトレオニン残基であり、
Xaa1はリシン残基、システイン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、2-アミノスベリン酸、又はジアミノプロピオン酸であり、
Xaa2はアラニン残基、セリン残基又はトレオニン残基であり、
Xaa3はトリプトファン残基又はチロシン残基であり、
Xaa4はヒスチジン残基、アルギニン残基、セリン残基又はトレオニン残基であり、
Xaa5はグルタミン酸残基、アスパラギン残基、アルギニン残基、又はアスパラギン酸残基であり、かつ
Xaa6はイソロイシン残基又はバリン残基である)によって表される、13アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含み、かつヒトIgG及び/又はウサギIgGと結合可能であることを特徴とするペプチド。
(9)ペプチドが外側の2つのシステイン(C)残基間でジスルフィド結合を形成しているか、又はペプチドの外側の2つのシステイン残基中のスルフィド基が、以下の式:
(10)標識物質により標識されている、上記(1)〜(9)のいずれかに記載のペプチド。
(11)薬剤が結合している、上記(1)〜(10)のいずれかに記載のペプチド。
(12)Xaa1がリシン残基である、上記(1)〜(11)のいずれかに記載のペプチド。
(13)Xaa1が架橋剤で修飾されている、上記(1)〜(12)のいずれかに記載のペプチド。
(14)前記架橋剤が、DSG(ジスクシンイミジルグルタレート)、DSS(ジスクシンイミジルスベレート)、DMA(アジプイミド酸ジメチル二塩酸塩)、DMP(ピメルイミド酸ジメチル二塩酸塩)、DMS(スベルイミド酸ジメチル二塩酸塩)、DTBP(3,3'-ジチオビスプロピオンイミド酸ジメチル二塩酸塩)、及びDSP(ジチオビススクシンイミジルプロピオン酸)からなる群より選択される、上記(13)に記載のペプチド。
(15)前記架橋剤がDSG(ジスクシンイミジルグルタレート)又はDSS(ジスクシンイミジルスベレート)である、上記(14)に記載のペプチド。
(16)上記(13)〜(15)のいずれかに記載のペプチドとIgGとの複合体であって、架橋剤で修飾されているペプチドとIgGの架橋反応によって形成される、前記複合体。
(17)上記(13)〜(15)のいずれかに記載のペプチドとIgGを混合し、架橋剤で修飾されているペプチドとIgGを架橋反応させる工程を含む、ペプチドとIgGの複合体を生産する方法。
(18)上記(1)〜(15)のいずれかに記載のペプチド、又は上記(16)に記載の複合体を含む、医薬組成物。
(19)システイン残基を2つ以上含むペプチドと、以下の式:
(20)前記化合物において、R1及びR2が同一であり、かつCl、Br、又はIである、上記(19)に記載の方法。
(21)前記ペプチドが、上記(1)〜(8)及び(10)〜(15)のいずれかに規定されるペプチドである、上記(19)又は(20)に記載の方法。
本明細書中で使用する「IgG」は、哺乳動物、例えばヒト及びチンパンジーなどの霊長類、ラット、マウス、及びウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、及びヤギ等の家畜動物、並びにイヌ及びネコ等の愛玩動物のIgG、好ましくはヒトのIgG(IgG1、IgG2、IgG3又はIgG4)を指すものとする。本明細書におけるIgGは、さらに好ましくは、ヒトIgG1、IgG2、若しくはIgG4、又はウサギIgGであり、特に好ましくはヒトIgG1、IgG2、又はIgG4である。
(X1-3)-C-(X2)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-(X1-3) (I)
(式中、Xの各々は独立的にシステイン以外の任意のアミノ酸残基であり、
Cはシステイン残基であり、
Hはヒスチジン残基であり、
Xaa1はリシン残基、システイン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、2-アミノスベリン酸、又はジアミノプロピオン酸であり、
Gはグリシン残基であり、
Xaa2はグルタミン酸残基又はアスパラギン残基であり、
Lはロイシン残基であり、
Vはバリン残基であり、かつ
Wはトリプトファン残基である。)
によって表される、13〜17アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含み、かつヒトIgG及び/又はウサギIgGと結合可能であることを特徴とするペプチドに関する。
(X1-3)-C-(X1)-Y-H-(Xaa1)-G-N-L-V-W-C-(X1-3) (I')
(式中、Xの各々は独立的にシステイン以外の任意のアミノ酸残基であり、
Cはシステイン残基であり、
Yはチロシン残基であり、
Hはヒスチジン残基であり、
Xaa1はリシン残基、システイン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、2-アミノスベリン酸、又はジアミノプロピオン酸であり、
Gはグリシン残基であり、
Nはアスパラギン残基であり、
Lはロイシン残基であり、
Vはバリン残基であり、かつ
Wはトリプトファン残基である。)
によって表される、13〜17アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含み、かつヒトIgG及び/又はウサギIgGと結合可能であることを特徴とする。
(X1-3)-C-A-(X1)-H-(Xaa1)-G-E-L-V-W-C-(X1-3) (I'')
(式中、Xの各々は独立的にシステイン以外の任意のアミノ酸残基であり、
Cはシステイン残基であり、
Aはアラニン残基であり、
Hはヒスチジン残基であり、
Xaa1はリシン残基、システイン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、2-アミノスベリン酸、又はジアミノプロピオン酸であり、
Gはグリシン残基であり、
Eはグルタミン酸残基であり、
Lはロイシン残基であり、
Vはバリン残基であり、かつ
Wはトリプトファン残基である。)
によって表される、13〜17アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含み、かつヒトIgG及び/又はウサギIgGと結合可能であることを特徴とする。
(X1-3)-C-(Xaa3)-(Xaa4)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-(X1-3) (II)
(式中、Xの各々は独立的にシステイン以外の任意のアミノ酸残基であり、
Cはシステイン残基であり、
Hはヒスチジン残基であり、
Xaa1はリシン残基、システイン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、2-アミノスベリン酸、又はジアミノプロピオン酸であり、
Gはグリシン残基であり、
Xaa2はグルタミン酸残基又はアスパラギン残基であり、
Lはロイシン残基であり、
Vはバリン残基であり、
Wはトリプトファン残基であり、
Xaa3はアラニン残基、セリン残基又はトレオニン残基であり、かつ
Xaa4はチロシン残基又はトリプトファン残基である。)
によって表される、13〜17アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含み、かつヒトIgG及び/又はウサギIgGと結合可能であることを特徴とする。
(X1-3)-C-A-Y-H-(Xaa1)-G-E-L-V-W-C-(X1-3) (III)
(式中、Xの各々は独立的にシステイン以外の任意のアミノ酸残基であり、
Cはシステイン残基であり、
Aはアラニン残基であり、
Yはチロシン残基であり、
Hはヒスチジン残基であり、
Xaa1はリシン残基、システイン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、2-アミノスベリン酸、又はジアミノプロピオン酸であり、
Gはグリシン残基であり、
Eはグルタミン酸残基であり、
Lはロイシン残基であり、
Vはバリン残基であり、かつ
Wはトリプトファン残基である。)
によって表される、13〜17アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含み、かつヒトIgG及び/又はウサギIgGと結合可能であることを特徴とする。
1番目のアミノ酸残基= S、G、F又は、なし
2番目のアミノ酸残基= D、G、A、S、P、ホモシステイン又は、なし
3番目のアミノ酸残基= S、D、T、N、E又はR、
15番目のアミノ酸残基= S、T又はD、
16番目のアミノ酸残基= H、G、Y、T、N、D、F、ホモシステイン又は、なし、
17番目のアミノ酸残基= Y、F、H、M又は、なし。
5番目のアミノ酸残基= A又はT、
6番目のアミノ酸残基= Y又はW。
D-C-(Xaa3)-(Xaa4)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-T (IV)
(式中、
Dはアスパラギン酸残基であり、
Cはシステイン残基であり、
Hはヒスチジン残基であり、
Xaa1はリシン残基、システイン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、2-アミノスベリン酸、又はジアミノプロピオン酸であり、
Gはグリシン残基であり、
Xaa2はグルタミン酸残基又はアスパラギン残基であり、
Lはロイシン残基であり、
Vはバリン残基であり、
Wはトリプトファン残基であり、
Tはトレオニン残基であり、
Xaa3はアラニン残基又はトレオニン残基であり、かつ、
Xaa4はチロシン残基又はトリプトファン残基である。)によって表される、13アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含み、かつヒトIgG及び/又はウサギIgGと結合可能であることを特徴とする。
1)DCAYH(Xaa1)GELVWCT(配列番号1)、
2)GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(配列番号2)、
3)RCAYH(Xaa1)GELVWCS(配列番号3)、
4)GPRCAYH(Xaa1)GELVWCSFH(配列番号4)、
5)SPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(配列番号5)、
6)GDDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(配列番号6)、
7)GPSCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(配列番号7)、
8)GPDCAYH(Xaa1)GELVWCSFH(配列番号8)、
9)GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTHH(配列番号9)、
10)GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY(配列番号10)、
11)SPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY(配列番号11)、
12)SDDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY(配列番号12)、
13)RGNCAYH(Xaa1)GQLVWCTYH(配列番号13)、
14)G(Xaa2)DCAYH(Xaa1)GELVWCT(Xaa2)H(配列番号36)、
15)RRGPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(配列番号37)、
16)DCTYH(Xaa1)GNLVWCT(配列番号14)、
17)DCAYH(Xaa1)GNLVWCT(配列番号15)、
18)DCTYH(Xaa1)GELVWCT(配列番号16)、及び
19)DCAWH(Xaa1)GELVWCT(配列番号17)、
(式中、Xaa1はリシン残基、システイン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、2-アミノスベリン酸、又はジアミノプロピオン酸であり、Xaa2はホモシステインであり、好ましくはホモシステイン同士は互いにジスルフィド結合を形成している)。
1)DCAYH(Xaa1)GELVWCT(配列番号1)、
2)GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(配列番号2)、
13)RGNCAYH(Xaa1)GQLVWCTYH(配列番号13)、
14)G(Xaa2)DCAYH(Xaa1)GELVWCT(Xaa2)H(配列番号36)、及び
15)RRGPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(配列番号37)
(式中、Xaa1はリシン残基であり、Xaa2はホモシステインであり、好ましくはシステイン同士及び/又はホモシステイン同士は互いにジスルフィド結合を形成している)が挙げられる。
D-C-(Xaa2)-(Xaa3)-(Xaa4)-(Xaa1)-G-(Xaa5)-L-(Xaa6)-W-C-T (V)
(式中、
Dはアスパラギン酸残基であり、
Cはシステイン残基であり、
Gはグリシン残基であり、
Lはロイシン残基であり、
Wはトリプトファン残基であり、
Tはトレオニン残基であり、
Xaa1はリシン残基、システイン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、2-アミノスベリン酸、又はジアミノプロピオン酸であり、
Xaa2はアラニン残基、セリン残基又はトレオニン残基であり、
Xaa3はトリプトファン残基又はチロシン残基であり、
Xaa4はヒスチジン残基、アルギニン残基、セリン残基又はトレオニン残基であり、
Xaa5はグルタミン酸残基、アスパラギン残基、アルギニン残基、又はアスパラギン酸残基であり、かつ
Xaa6はイソロイシン残基又はバリン残基である)によって表される、13アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含み、かつヒトIgG及び/又はウサギIgGと結合可能であることを特徴とするペプチドである。
20)DCTYT(Xaa1)GNLVWCT(配列番号18)、
21)DCAYT(Xaa1)GNLVWCT(配列番号19)、
22)DCSYT(Xaa1)GNLVWCT(配列番号20)、
23)DCTWT(Xaa1)GNLVWCT(配列番号21)、
24)DCTYH(Xaa1)GNLVWCT(配列番号22)、
25)DCTYR(Xaa1)GNLVWCT(配列番号23)、
26)DCTYS(Xaa1)GNLVWCT(配列番号24)、
27)DCTYT(Xaa1)GNLVWCT(配列番号25)、
28)DCTYT(Xaa1)GELVWCT(配列番号26)、
29)DCTYT(Xaa1)GRLVWCT(配列番号27)、
30)DCTYT(Xaa1)GDLVWCT(配列番号28)、及び
31)DCTYT(Xaa1)GNLIWCT(配列番号29)、
(式中、Xaa1はリシン残基、システイン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、2-アミノスベリン酸、又はジアミノプロピオン酸である)。
一態様において、本発明における上記IgG結合ペプチドは、架橋剤により修飾されていることが好ましい。
一態様において、本発明は、本発明の架橋剤で修飾されているIgG結合ペプチドとIgGを混合する工程を含む、IgG結合ペプチドとIgGの複合体を生産する方法に関する。本工程により、架橋剤で修飾されているIgG結合ペプチドとIgGの間で架橋反応が生じ得る。架橋反応は、特にIgG結合ペプチドの上記Xaa1のアミノ酸残基とIgG FcのLys248又はLys246、好ましくはLys248の間で部位特異的に生じ得る。
一態様において、本発明は、本発明のIgG結合ペプチドとIgGとの複合体に関する。該複合体は、上記架橋反応によって形成され得る。よって、本発明は、好ましくは、IgG結合ペプチドの上記Xaa1のアミノ酸残基とIgG FcのLys248又はLys246、好ましくはLys248との間が部位特異的に架橋剤を介して結合したIgG結合ペプチドとIgGとの複合体に関する。
一態様において、本発明は上記IgG結合ペプチド、上記架橋剤で修飾されたIgG結合ペプチド、又は上記架橋剤で修飾されたIgG結合ペプチドとIgGの複合体を含む医薬組成物又は診断剤に関する。医薬組成物に含まれる場合、IgG結合ペプチドは、例えば上記の薬剤により修飾されていることが好ましく、診断剤に含まれる場合、IgG結合ペプチドは、例えば上記の標識物質により修飾されていることが好ましい。
<システイン残基がリンカーにより連結されたペプチドを生産する方法>
一態様において、本発明は、システイン残基がリンカーにより連結されたペプチドを生産する方法に関する。本方法は、システイン残基を2つ以上、好ましくは2つ含むペプチドと、以下の式:
<方法>
(1)IgG結合ペプチド溶液の作製
G(HC)DCAYHRGELVWCT(HC)H-NH2の配列(配列番号31、ただし、HCはホモシステインであり、4番目と14番目の2つのCys、2番目と16番目の2つのホモシステインは、それぞれ分子内でジスルフィド結合を形成する)を有する環状ホモシステインペプチドを、F-moc法によるペプチド固相合成法にて常法に従い調製した。調製したIgG結合ペプチド0.8mgの粉末を24μLの100%ジメチルスルホキシド(和光純薬)で溶かし、IgG結合ペプチド溶液を調製した。
ヒトIgG(中外製薬)のヒンジ部分を、10mM EDTAおよび1mM L-システインを含む20mmol/Lリン酸緩衝液(pH7.0)中において37℃でパパイン(ロシュ社製)を用いて切断した。続いて、ヒトIgG Fcを、陽イオン交換カラム(TSKgel SP5-PW(東ソー))を用いて、流速1mL/min、20mM 酢酸ナトリウム緩衝液 (pH5.0)中、0-0.3 M NaClのグラジエント溶出にて精製した。16mg/mLのヒトIgG Fcを含む63μLの溶液(0.1M 塩化ナトリウム(和光純薬)、0.04M 2−モルホリノエタンスルホン酸(和光純薬)(pH6.0))を、上記(1)で作製したIgG結合ペプチド溶液2μLと混合し、FcとIgG結合ペプチドとの複合体溶液を調製した。
FcとIgG結合ペプチドとの複合体の結晶は、シッティングドロップ蒸気拡散法により得た。すなわち、上記(2)で作製したFcとIgG結合ペプチドとの複合体溶液0.3μLと結晶化剤(20% ポリエチレングリコール3350(シグマアルドリッチ)、0.2Mヨウ化カリウム(和光純薬)(pH6.9))0.3μLを、結晶化用ロボットであるHydoraII+(マトリックス社製)を用いて、インテリ結晶化プレート(ベリタス社製)のS1ウェル上で混合し、結晶化ドロップとした。リザーバー溶液としては、上記結晶化剤70μLを分注した。プレートをPowerSeal CRISTAL VIEW(グライナーバイオ−ワン社製)で密閉後、20℃の恒温槽内に約2週間静置し、結晶を得た。
上記(3)で得られた結晶を、安定化母液(22%ポリエチレングリコール3350、0.2M ヨウ化カリウム、0.1M 塩化ナトリウム、25%グリセロール(w/v)、0.04M 2−モルホリノエタンスルホン酸(pH6.0))に移し、−170℃の窒素ガス気流にて急速凍結し、X線回折データを振動法にて測定した。X線の波長は1オングストローム、振動角は1°/フレームで実施した。次に、回折強度データ処理プログラムHKL2000(HKL Research社製)を使用して、回折強度データを分解能3.0オングストロームで処理した。その結果、結晶の空間群がP21であり、格子定数がa=66.1オングストローム、b=60.5オングストローム、c=69.5オングストローム、α=γ=90°、β=101.3°であった。得られたデータのCompletenessは99.9%、Rmergeは13.8%であった。
DCAYHRGELVWCT(配列番号33)について、上記(4)で得られた回折強度データを、CCP4(Collaborative Computational Project Number 4)に含まれるプログラムPhaserを利用して分子置換法による位相決定を試みた。分子置換法のサーチモデルにはProtein Data Bank(PDB、URL:http://www.rcsb.org/pdb/)にPDB accession code:1DN2として登録されているFc部分のモデルを利用した。その結果、非対称単位中に1分子のモデルを見出すことができた。次にCCP4に含まれる構造精密化プログラムRefmac5を用いた構造精密化とモデル構築プログラムであるX−tal viewを用いたモデルの修正を繰り返し実施し、FcとIgG結合ペプチド(DCAYHRGELVWCT(配列番号33))との複合体の結晶構造を得た。Fcのペプチド結合部位にIgG結合ペプチドに相当する電子密度が観測された。決定した結晶構造の正確さの指標であるR因子は、0.216であった。さらに、精密化の段階で計算に入れなかった全反射の5%に相当する構造因子から計算されるRfree因子は0.317であった。
上記のX線結晶解析の構造を基に、計算科学ソフトウェアMOE(Molecular Operating Environment)上で架橋構造モデルを作成した。DCAYHRGELVWCT(配列番号33)の6番目のアミノ酸をLysに置換後、このLysのεアミノ基と抗体Fcの248番目Lysのεアミノ基の間をつなぐ形で、DSG又はDSSによる架橋構造をモデル化した。
図1Aに示した様に、IgG結合ペプチドは、プロテインAの結合部位と重なるCH2とCH3ドメインの境界領域に結合し、既に報告されているIgG結合ペプチドFc-III(DeLano, W. L. et al., Science, 2000, 287, pp. 1279-1283)と類似した形でIgGと結合していると考えられた。IgG結合ペプチドとFcとの特徴的な相互作用は、IgG結合ペプチドの8番目の残基Argの側鎖のグアニジノ基が、2.91オングストロームでFcのGlu380(EU numberingに基づく。以下同じ)の側鎖のカルボン酸と塩結合している点である。このGlu380の側鎖は、ヒトIgG Fcの中で、Lys248と塩結合して分子内での塩結合のネットワークを形成しており、IgG結合ペプチドのArg8とFcのLys248は、FcのGlu380との相互作用を介して近づいていた。そこで、IgG結合ペプチドの8番目の残基ArgをLysに換え、この塩結合のネットワーク構造に類似した形で、ペプチドのLys8と抗体のLys248の側鎖のアミノ基を架橋剤で架橋することを考案した。実際に、IgG結合ペプチドとヒトIgG Fcとの複合体構造をベースに、DSG(ジスクシンイミジルグルタレート)もしくはDSS(ジスクシンイミジルスベレート)による架橋構造のモデルを作成したところ、空間的にも抗体の主鎖構造のひずみを伴わずに架橋剤の導入が可能であると考えられた(図1B)。
<方法>
アミノ基をBiotinもしくは5/6TAMURA succinimidyl ester(AnaSpec, Inc.)(蛍光色素)で修飾したamino-PEG4化合成ペプチドGPDCAYHXGELVWCTFH(配列番号2)(ただし、C末端はアミド化)はFmoc固相合成法により常法に従って合成した。保護基を除去した後、pH8.5の水溶液中酸化条件下で分子内S-S結合を形成させ、逆相HPLCを用いて、流速1.0ml/min、0.1%のTFAを含む10%から60%のアセトニトリルのグラジエント溶出によって分子内S-S結合を有するペプチドを精製した。
架橋構造の導入が、IgG結合ペプチドの特異性及び親和性に影響を与えるか検討するため、架橋構造を導入したIgG結合ペプチドのIgGへの結合力をSPR解析で測定した(表1)。8残基目のアルギニンをリジンに置換したIgG結合ペプチド(以下、Type I(R8K)とも称する)のヒトIgG に対する親和性は131 nM (Kd) であり、置換前のIgG結合ペプチド(以下、Type Iとも称する)と比べ10倍親和性が低下した。Type I(R8K)ペプチドに各架橋剤を結合させたものでは、ヒトIgG に対する親和性は、Type I(R8K)-DSG-OHで約330 nM (Kd)、Type I(R8K)-DSS-OHで約390 nM (Kd) であり、架橋剤が結合することによる親和性の大きな減少は見られなかった。いずれのペプチドにしても、Kd値でμM以下の親和性を有することから、十分特異的な標識化が可能であると考えられた。
<方法>
実施例2と同様の方法によってN末端にBiotin-PEG4を付加したIgG結合ペプチド(TypeI(R8K))をDSS又はDSGで修飾した標識化試薬ペプチドを調製し、これをヒトIgG Fcを反応させ、ヒトIgG Fcの標識化反応を検討した。即ち、実施例2と同様の方法によって過剰なDSS又はDSGと反応させたIgG結合ペプチド(R8K)(200 pmol/5μL in 0.1% TFA)を逆相カラムにて精製後、減圧下でアセトニトリルを除去した後、0.5M Na2HPO4を約1/8加えて中和し、ただちにタンパク質サンプル(hIgG(中外製薬)、hIgA(Athens Research&Technology)、HSA(シグマアルドリッチ)、又は血清(健常者から採血したもの))(各40 pmol/5μL、血清については、PBSにより10倍希釈したものを使用)に、モル比10倍量で加え、最終量をPBS で20μLにした後、室温で5分放置した。その後、1M Tris-HCl(pH=7.0)を1μl加え反応を停止した後、4xSDSサンプル溶液6.7μl及び2-メルカプトエタノール1.4μl(最終5%)を加え、95℃、10minで処理後、プレキャストゲルSuperSepTMAce,5-20%(和光純薬)を用いてSDS-PAGEを行った。泳動後のゲルは、ホーファー・セミホールTE70(Hoefer Semiphor TE70)トランスブロットシステムを用いて35mA、60分で、PMDF膜に転写後、0.5%BSAでブロッキングを行った。ビオチン化ペプチドで標識されたタンパク質は、SAコンジュゲートHRP(1000倍希釈、Vector Laboratories)を用いて、化学発光試薬(イムノスター(登録商標)ベーシック、和光純薬)により検出した。
図2Bに示した様に、ウエスタンブロッティングにおいて、IgGと反応させた場合にのみ、複合体とみられるバンドが観察されたことから、DSG又はDSSと反応させたIgG結合ペプチドは、ともに、IgAやHAS、血清中のIgG以外のタンパク質とは結合せずに、IgGに選択的に結合していることがわかった。
<方法>
(1)反応モル比の検討
96穴マイクロプレート(Nunc(登録商標)MaxiSorp)のウェルに、各タンパク質(IgG(中外製薬)、IgA(Athens Research & Technology)、又はBovine gelatin(和光純薬))(50 ng(0.33 pmol)/μl/well)を含む0.1 M NaHCO3溶液をプレートに加えて室温で一晩放置することによって、各タンパク質をプレートの表面に吸着させ、0.5 % BSAでブロッキングを行なった後、各ウェルに、実施例2と同様に調製したDSGで修飾したビオチン化IgG結合ペプチド(モル比で、0,1,2,5,10)を加え、1時間経過後、1M Tris-HCl (pH7.0)を3μL加え反応を停止した。0.5 % BSA で2000倍希釈したSA-HRP(Vector Laboratories)を50μL加え、室温で一時間反応後、0.1% PBSTで5回洗浄後、HRPの呈色にTMB溶液(Wako Chemicals)を用いて、5分の発色反応後、450nmの吸光度をELISAプレートリーダー(モデル 680 マイクロプレートリーダー(バイオラッド))にて測定した。
50ng/50μLの溶液により4℃で一晩固定化したhIgG(50 ng)に対しDSGで修飾したビオチン化IgG結合ペプチドをモル比2で加え、各反応時間(0〜60分)で、1M Tris-HCl (pH7.0)を3μL加え反応を停止した。結合の検出は(A)と同様に行った。
DSS標識化IgG結合ペプチドを用いて、抗体と反応させるモル数及び反応時間の違いによる反応効率をELISAにて検討した (図3)。即ち、プラスティックプレートに固定化したIgG結合ペプチドのモル比を1から10まで変化させてhIgGと反応させたところ、ほぼモル比5のあたりで飽和がみられたことから、モル比5程度のペプチド試薬を加えれば、抗体の標識化には充分であると考えられた(図3A)。DSSで修飾していないビオチン化IgG結合(R8K)ペプチド(NO DSS R8K)では極めて弱い結合がみられているが、これは、非共有結合で結合したペプチドによる結合活性と考えられる。さらに、標識化IgG結合ペプチド試薬を過剰に加えても、他のタンパク質(hIgA、Bovine gelatinあるいはブロッキング剤として用いているBSA)への結合は全く検出されなかった。
<方法>
IgG(中外製薬)、IgA(Athens Research & Technology)、又はBSA(シグマアルドリッチ)(15 μg:IgG換算で100 pmol)と実施例2に従って調製したDSG架橋ペプチド又はDSS架橋ペプチド(500 pmol)を200μL中で室温にて60 min反応させ、1M Tris-HCl (pH=7.0)を10μL加え反応を停止させた。その後、SuperdexTM200 10/30GL 直径1.0cm×30cm(GEヘルスケア);流速:0.3ml/min;ランニングバッファー:PBS pH 7.4、にてサイズ排除クロマトグラフィーを行い、蛍光検出器 RF-10A(島津製作所)(励起光:541 nm 蛍光: 565 nm)を用いて測定を行った。
DSS又はDSGを反応させた標識化IgG結合ペプチドを各タンパク質に対するモル比1:5でタンパク質と室温にて60 min反応させ、サイズ排除クロマトグラフィーにて分析した。いずれの標識化IgG結合ペプチド(DSS又はDSG)を用いても、IgGへの反応性の特異性は同程度であり、hIgAやBSA等の他のタンパク質への蛍光標識化は、全く検出されなかった(図4)。以上のことから、作製したいずれのIgG結合ペプチドを用いても、高い特異性を持って、ヒトIgGを蛍光標識できることがわかった。
<方法>
ヒトIgG(中外製薬)のFc溶液(20μM、0.1M酢酸緩衝液pH4.5)200μLと、DMF中に溶解した、実施例2と同様の方法によってDSG修飾したIgG結合ペプチド(RGNCAYHXGQLVWCTYH(配列番号35)、Xはリジン)(4mM)を0.5、1.0、2.0、5.0μL(モル比で0.5、1.0、2.0、5.0)加え、素早く撹拌後、室温で15分反応し、1M Tris-HCl(pH7.0)を10μL加え、反応を停止させた。反応物50μLをShodex IEC SP-825カラムを接続したNGC Chromatography system(バイオラッド)にインジェクトし、25mM Acetate buffer(pH4.5)から1M NaClを含む25mM Acetate buffer(pH4.5)へのグラジエント溶出を行い、タンパク質の溶出を、215nmの吸光度でモニターした。得られた各ピークを分取し、LC/MSによる分子量測定に供した。
ヒトIgG1-FcとDSG修飾したIgG結合ペプチド(4mM、Biotin-PEG4-RGNCAYHXGQLVWCTYH-NH2;分子量2760、XはDSG化したリジンで、2つのCysは分子内SS結合を形成)をモル比で0.5、1.0、2.0、又は5.0で反応させたところ、図5Aに示した様に、元のヒトIgG1-Fcの溶出位置のピーク(ピーク2)と2つのピーク3、4が現れた(ピーク1は、DSG化したIgG結合ペプチドであると考えられる)。これらの分子種を同定するために、LCMS解析を行った。反応前のIgG1-Fcは、イオン交換クロマトグラムではピーク1のところに溶出され、LCMS解析では、55084という値が得られた。反応後の2、3、4のピークのLCMS解析を行ったところ、それぞれ、55087、57735(55087+2648)、60384(55087+5297)という値が得られた。このことから、反応後のピーク2は、未反応のFcであり、ピーク3と4は、Fcにそれぞれ1つ及び2つのペプチドが結合したものであることがわかった。
<方法>
pH4.0(25mM酢酸緩衝液)、pH5.5(25mM酢酸緩衝液)、又はpH7.0(PBS)にて調製したヒトIgGのFc溶液200μLに対し、実施例5で調製した、DMF中に溶解したDSG修飾したIgG結合ペプチド(4 mM)を1.0μL(モル比で1.0)加え、素早く撹拌後、室温で反応した。反応後1、5、10、又は30分に、1M Tris-HCl(pH7.0)を10μL加え、反応を停止させ、反応物50μLをShodex IEC SP-825カラムを接続したNGC Chromatography system(バイオラッド)にインジェクトし、25mM Acetate buffer(pH4.5)から1M NaClを含む25mM Acetate buffer(pH4.5)へのグラジエント溶出を行い、タンパク質の溶出を、215nmの吸光度でモニターした。得られたクロマトグラムを基に各ピークの比率を計算した。
図6に示した様に、試験したpH 4.0、pH 5.5、及びpH 7.0のいずれにおいても標識化反応は早く、反応の90%以上が1分以内に終了していることがわかった。また、pH4.0では、未反応物の残量が40%を超えており反応収率が低く、特に、2つのペプチドの付加物(ピーク4)の収量が15%程度と他のpHの場合(35-40%)に比べ低かった。pH 5.5及び7.0では、未反応物の収量も10%台と低く、効率よく反応していることがわかった。pH5.5と7.0の差としては、若干、ピーク4の収量がpH 7.0で低くなる傾向が見られた。
<方法>
Her2に対するscFv(4D5)とFc遺伝子を連結したscFv-Fcを保有するpcDNA3.1/Zeo(+)を、HEK293細胞へLipofectamine 2000を用いてトランスフェクションし、5日間培養後、培養液中に分泌されたscFv-FcをプロテインAカラムにより精製して、4D5-Fc抗体(HER2に対する特異性を持った単鎖Fvクローン4D5とFcの融合蛋白質)を調製した。続いて、調製した4D5-Fc抗体1.0μgを3%BSAを含むPBS 10μLに希釈したものを、実施例2と同様の方法によってDSG修飾したN末ビオチン化IgG結合ペプチド(Biotin-PEG4-RGNCAYHXGQLVWCTYH(配列番号35)、XはDSG化したリジンで、2つのCysは分子内SS結合を形成)0.16μg(20 p mol)と混合し10分間反応させた。この反応物を、10%FBSを含むPBS 100μLに分散した乳がん細胞株SK-BR3(ATCCから購入)(5.0×105細胞)に加え、30分間4℃で放置した。3%BSAを含むPBSで1回洗浄し、3%BSAを含むPBS 100 μLに懸濁した後、PE標識Streptavidin(Vector Laboratories)0.01μg(0.2 pmol)を加え、30分間4℃で放置した。再度、3%BSAを含むPBSで1回洗浄した後、3%BSAを含むPBS100μLに分散し、7-AAD Viability Dye(ベックマン・コールター)を10μL添加後、15分間放置した。PBS 400μLを加え分散し、35μmのメッシュ(Corning)を通した後、S3eTM セルソーター(バイオラッド)上で分析した。
乳がん細胞株SK-BR3上のHER2抗原への4D5-Fc抗体の結合を、DSG修飾したビオチン化IgG結合ペプチドとPE標識Streptavidinにより検出した結果を図7Aに示す。コントロールとして、DSG修飾したビオチン化IgG結合ペプチド(Biotin化IgG結合ペプチド)の代わりにビオチン化抗ヒトIgGマウス抗体(Anti hIgG mAb-biotin標識)(0.01μg)を使用した場合の、フローサイトメトリー解析の結果も併せて示した(いずれの場合も、7-AAD染色により染色される死細胞を除いた細胞画分のみを使用して分析した)。2つの系ではともに、蛍光強度にはほとんど違いがなかったことから、SG修飾したビオチン化IgG結合ペプチドは、ヒトFcを特異的に標識することにより、単鎖Fv-Fc等のFACS染色に利用できることが分かった。一方、ネガティブコントロールとして、4D5-Fcを加えない系も検討を行ったが(図7B)、SG修飾ビオチン化IgG結合ペプチドを加えていない系(Anti hIgG mAb-biotin標識+SA-PE標識、及びAnti hIgG mAb-PE標識)と同様に、全く蛍光強度のシフトが見られなかったことから、DSG修飾したビオチン化IgG結合ペプチド単独では、細胞に対する非特異的な修飾は起こっていないことが分かった。
<方法>
DSG修飾したN末アジ化IgG結合ペプチド(Azide-PEG4-GPDCAYHXGELVWCTFH(配列番号2)、XはDSG化したリジンで、2つのCysは分子内SS結合を形成、C末端はアミド化)は、実施例2と同様の方法によって調製した。このペプチドを10mMの濃度でDMSOに溶解し、この溶液20μLを25mM酢酸緩衝液(pH5.0)に溶解した16.6μMの抗HER2ヒトIgG抗体(中外製薬)溶液8mLに加え(ペプチドと抗体のモル比=1:1.5)、室温で5時間反応させた。反応後、CIMmultusTM SO3-1(SHOWA DENKO)のカラム(1mL)上で、25mM酢酸緩衝液(pH5.0)の0から1MまでのNaClグラジエント溶出にてアジ化ペプチド抗HER2ヒトIgG抗体(1価アジ化ペプチド抗体、2価アジ化ペプチド抗体の混合物)を精製した。
アジ化ペプチド抗体とDibenzocyclooctyne-maleimide化VHHとのクリック反応による連結後のイオン交換クロマトグラフィーの結果、3本(a、b、及びc)の主要なピークが得られた(図8A)。それぞれを還元状態でSDS-PAGEで分析した結果を図8Bに示す。a(レーン3)では元のIgG(レーン1)と同じH鎖由来の50 kDaとL鎖由来の25kDaのバンドが見られた。b(レーン4)では、L鎖のバンドに変化はなかったが、元のIgG抗体の重鎖(約50kDa)(レーン1)に加え、ほぼ等量の濃さの約80kDaの位置の新たなバンドが見られた。c(レーン5)では、L鎖のバンドに変化はなかったが、元の重鎖(約50kDa)のバンドが消失し、約80kDaのバンドのみが見られた。これらのことから、aはVHHが付加されていないIgG抗体、bは1個のVHHが連結されたIgG抗体(抗HER2ヒト抗体−1価VHH)、cは2個のVHHが連結されたIgG抗体(抗HER2ヒト抗体−2価VHH)であることが分かった。
<方法>
HL60細胞(JCRBから入手)は、10%FBS並びに100units/mLペニシリンGと100μg/mLストレプトマイシン硫酸塩を含むRPMI1640培地(Life Technologies社)にて、1.3%DMSO添加によって6日間分化誘導を行った。SK-BR3細胞(ATCCから購入)については、10%FBS、100units/mLペニシリンG、及び100μg/mLストレプトマイシン硫酸塩を含むMcCoy's 5A (Life Technologies社)培地で、37℃にて5%CO2インキュベーターで培養後、トリプシン−EDTA(Life Technologies社)にて細胞を剥離、回収した。各2×105の細胞を200μLの3%BSAを含むPBSに分散させ、最終濃度が200nMになるように1次抗体(抗HER2ヒトIgG抗体、実施例9で調製した抗IgA受容体VHH(C末HISタグ付加)、又は実施例9で調製した抗HER2ヒト抗体−1価VHH(C末HISタグ付加))を加え、4℃で30分放置した。1回洗浄後、3%BSAを含むPBSに分散した細胞液200μLに、2次抗体として、1)ビオチン化抗HISタグ抗体(MBLライフサイエンス)+PE標識したSA(最終濃度50nM)(Vector Laboratories)、又は2)PE標識した抗ヒトIgGポリクローナル抗体(Affimetrix eBioscience)(最終濃度13nM)を加え、4℃で30分放置した。1回洗浄後、3%BSAを含むPBSに分散した細胞液200μLに、7-AAD Viability Dye(ベックマン・コールター)10μLを加え15分放置後、800μLのPBSを加え、35μmのメッシュ(Corning)を通したのち、S3eTM セルソーター(バイオラッド)上で分析した。
7-AAD染色により死細胞を除いた細胞画分を使って、HER2を高発現するSK-BR3細胞を、1次抗体として、抗HER2ヒトIgG抗体(図9A)、抗IgA受容体VHH(C末HISタグ付加)(図9B)、抗HER2ヒト抗体−1価VHH(C末HISタグ付加)(図9C)を使用し、2次抗体として、最終濃度50 nMのビオチン化抗HIS抗体+PE標識したSAの混合物を用いてFACS解析を行った結果を図9A〜Cに示す。図9Cの場合において、大きな蛍光シフトが見られたことから、調製した抗HER2ヒト抗体−1価VHH中の抗HER2抗体は、SKBR-3細胞への結合活性を有していることが分かった。
<方法>
N末のアミノ基をMaleimideacetoxyl succinimidyl esterで修飾したマレイミド-PEG4化合成ペプチドRRGPDCAYHXGELVWCTFH(配列番号37:配列番号2のペプチドのN末端に2つのArgを付加したもの、Xはリジンで、C末端はアミド化)はFmoc固相合成法により常法に従って合成した。保護基を除去した後、pH8.5の水溶液中酸化条件下で分子内S-S結合を形成させ、逆相HPLCを用いて、流速1.0ml/min、0.1%TFAを含む10%から60%のアセトニトリルのグラジエント溶出によって分子内S-S結合を有するペプチドを精製した。DMSOに溶解したペプチド(18.5mM)40μLに同じくDMSO に溶解したDM-1(emtansine(XDCExplorer社)、50mM)24μL(ペプチドとDM-1のモル比=1:1.6)を加え、さらにピリジン3.4μL(最終濃度5%)を加え、50℃で3時間反応させた。引き続き、アセトニトリルに溶解したDSG(500mM)80μL加え、50℃で3時間反応させ、IgG結合ペプチドのマレイミド基とDM-1のスルフヒドリル基の間で架橋構造を形成させた。全量を0.1%TFAを含む10%アセトニトリル10mlに希釈し、遠心後の上清を、Inertsustain C18 カラム(7.6mm 1×250mm, GL Science)にインジェクションし、0.1%TFAを含む10%から70%までのアセトニトリルのグラジエントで溶出した。溶出物の質量分析を行い、目的物を回収後、溶媒除去後、凍結乾燥した。
乳がん細胞株SK-BR3に対する調製したADCの細胞増殖抑制効果を評価するため、0-10 nMのADCの存在下でSK-BR3細胞を培養し、72時間後の細胞数を細胞測定キットにより評価した(図10)。今回調製した抗HER2抗体−DM1*1、抗HER2抗体−DM1*2ともに、HER2を高発現するSK-BR3に対し、0.4nM以上の濃度で、顕著な細胞増殖抑制活性を示した。一方、HER2を発現していないC6細胞に関しては、使用した抗体薬物複合体の濃度範囲では、細胞増殖抑制は見られなかった。以上のことから、IgG結合ペプチドを介した共有結合による抗体薬物複合体は、がん細胞株に対して、有効な細胞増殖抑制活性を発現できることが分かった。
<方法>
N末アセチル化RRC(Acm保護)-PEG4化合成ペプチドGPDCAYHXGELVWCTFH(配列番号2、Xはリジンで、C末端はアミド化)は、ペプチド合成ビーズ(Rink-amide-Chemmatrix resin、Biotage)上にて、Fmoc固相合成法により常法に従って合成した。樹脂からのペプチドの切り出し、脱保護を行った後、ペプチド(図11、a)を得た。得られたペプチド65mg(15.6μmol)を6 M Gn・HClを含むリン酸緩衝液 (pH =7.3)5 mLに溶解し、これにアセトニトリル120μLに溶解した1, 3-Dichloro-2-propanone (2.9 mg, 23.4 μmol, 1.5等量モル)を加えて、室温で攪拌した。1時間後、HPLC分析によって反応の終了を確認し、反応溶液を直接HPLCにて精製することによって、環化ペプチド(図11、b、33 mg、7.8 μmol、収率50%)を得た。この環化ペプチドに対して、90%酢酸水溶液(8.8 mL)に懸濁した酢酸銀(30.8 mg, 184.5 μmol)を加えて、室温下、遮光で5時間攪拌した。ジチオスレイトール(DTT:352 mg, 2.3 mmol)を加え、生じた沈殿を遠心分離によって除去し、得られた上清をHPLCによって、精製することで、環化ペプチド(図11、c、20.5 mg、5.2 μmol、収率67%)を得た。
乳がん細胞株SK-BR3に対する調製したADCの細胞増殖抑制効果を評価するため、0-500 nM ADCの存在下でSK-BR3細胞を培養し、72時間後の細胞数を細胞測定キットにより評価した(図12)。使用した抗癌剤VcMMAEそのものについては、250nM以上においてのみ増殖抑制が見られたが(図12A)、今回調製したADCでは、HER2を高発現するSK-BR3に対し、0.4nM以上濃度で、顕著な細胞増殖抑制活性を示し(図12B)、抗体とのコンジュゲートによって、500倍程度細胞増殖抑制活性が増強していた。一方、このような細胞増殖抑制は、元の抗HER2ヒト抗体のみでは見られなかった。以上のことから、IgG結合ペプチドを介した共有結合による抗体薬物複合体は、がん細胞株に対して、有効な細胞増殖抑制活性を発揮できることが分かった。
<方法>
ヒト、マウス、ウサギ、及びラットの各種抗体溶液(14μM)1.25μL (抗体2.5μg相当)に、PBS 3.15μLを加え、実施例2と同様の方法によってDSG修飾したN末ビオチン化IgG結合ペプチドBiotin-PEG4-RGNCAYHXGQLVWCTYH(配列番号35、XはDSG化したリジンで、2つのCysは分子内SS結合を形成)のDMSO溶液(118μM)0.65μLを混合後、室温で30分間反応(抗体とペプチドのモル比=1:4)させた。この反応液(5.0μL)に、SDS-PAGEのサンプルバッファー(4×)5.0μL、2-mercaptoethanol 0.6 μL、超純水9.35μLを加え混合後、95℃で10分間加熱し、グラジエントゲル(Super SepTM Ace 5-20%, Wako Chemicals)上で、SDS-PAGEを行った。ゲルは、CBBでタンパク質染色を行い、またゲルからPBDF膜に転写したタンパク質は、Western Blotに供した。すなわち、転写後のPVDF膜を、0.5% BSAでブロッキングを行い、HRP標識ストレプトアビジン(Vector Laboratories)を室温で1時間反応させ、化学発光検出試薬Chemi-Lumi One (NACALAI TESQUE)を用いて、化学発光イメージャーChemDock(BioRad)で検出した。標識に使用した抗体は以下の通りである。ヒトIgG1(Clone ID: CB1)、ヒトIgG2(Clone ID: CB2)、ヒトIgG3(Clone ID: CB3)、ヒトIgG4(Clone ID: CB4)、 マウスIgG1(Clone ID: CB5)、マウスIgG2b(Clone ID: CB8)、及びマウスIgG3(Clone ID: CB9)は、Crown Bioscience Inc.から購入した。ラットIgG1(Clone #: 43414)とIgG2b(Clone #: 141945)はR&D社から、IgG2c(Clone Name: SB68b)はLifeSpan BioScience社から、ウサギIgGは、Thermo Scientific社から、購入した。
図13に示したように、Trastuzumab(抗HER2ヒト化IgG1抗体)と同程度に、ヒトモノクローナルIgG1、ヒトIgG2、及びヒトIgG4において、濃いバンドが認められた。また、使用した動物抗体のうち、ウサギポリクローナルIgG抗体が、特に強く染色された。以上のことから、本IgG結合ペプチドを使った標識では、ヒトIgG1、2、及び4並びにウサギIgG抗体を効率良く標識できることが分かった。
Claims (17)
- 下記の式II:
(X1-3)-C-(Xaa3)-(Xaa4)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-(X1-3) (II)
(式中、Xの各々は独立的にシステイン以外の任意のアミノ酸残基であり、
Cはシステイン残基であり、
Hはヒスチジン残基であり、
Xaa1はリシン残基、システイン残基又はジアミノプロピオン酸であり、
Gはグリシン残基であり、
Xaa2はグルタミン酸残基又はアスパラギン残基であり、
Lはロイシン残基であり、
Vはバリン残基であり、
Wはトリプトファン残基であり、
Xaa3はアラニン残基、セリン残基又はトレオニン残基であり、かつ
Xaa4はチロシン残基又はトリプトファン残基である。)
によって表される、13〜17アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含み、かつヒトIgG及び/又はウサギIgGと結合可能であることを特徴とするペプチドであって、かつXaa1に修飾される架橋剤を介してヒトIgG及び/又はウサギIgGと結合可能であることを特徴とする、前記ペプチド。 - Xaa3がアラニン残基であり、Xaa4がチロシン残基である、請求項1に記載のペプチド。
- 下記の式III:
(X1-3)-C-A-Y-H-(Xaa1)-G-E-L-V-W-C-(X1-3) (III)
(式中、Xの各々は独立的にシステイン以外の任意のアミノ酸残基であり、
Cはシステイン残基であり、
Aはアラニン残基であり、
Yはチロシン残基であり、
Hはヒスチジン残基であり、
Xaa1はリシン残基であり、
Gはグリシン残基であり、
Eはグルタミン酸残基であり、
Lはロイシン残基であり、
Vはバリン残基であり、かつ
Wはトリプトファン残基である。)
によって表される、13〜17アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含み、かつヒトIgG及び/又はウサギIgGと結合可能であることを特徴とするペプチドであって、かつXaa1に修飾される架橋剤を介してヒトIgG及び/又はウサギIgGと結合可能であることを特徴とする、請求項1又は2に記載のペプチド。 - 17アミノ酸残基とした場合の、N末端から1〜3、15〜17番目の各アミノ酸残基が、
1番目のアミノ酸残基= S、G、F又は、なし
2番目のアミノ酸残基= D、G、A、S、P、ホモシステイン、又は、なし
3番目のアミノ酸残基= S、D、T、N、E又はR、
15番目のアミノ酸残基= S、T又はD、
16番目のアミノ酸残基= H、G、Y、T、N、D、F、ホモシステイン、又は、なし、
17番目のアミノ酸残基= Y、F、H、M又は、なし
である、請求項1〜3のいずれか一項に記載のペプチド。 - 以下の1)〜15)のいずれかのアミノ酸配列を含む、ただし、Xaa1はリシン残基であり、Xaa2はホモシステインである、かつヒトIgG及び/又はウサギIgGと結合可能であることを特徴とするペプチドであって、かつXaa1に修飾される架橋剤を介してヒトIgG及び/又はウサギIgGと結合可能であることを特徴とする、ペプチド。
1)DCAYH(Xaa1)GELVWCT(配列番号1)
2)GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(配列番号2)
3)RCAYH(Xaa1)GELVWCS(配列番号3)
4)GPRCAYH(Xaa1)GELVWCSFH(配列番号4)
5)SPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(配列番号5)
6)GDDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(配列番号6)
7)GPSCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(配列番号7)
8)GPDCAYH(Xaa1)GELVWCSFH(配列番号8)
9)GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTHH(配列番号9)
10)GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY(配列番号10)
11)SPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY(配列番号11)
12)SDDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY(配列番号12)
13)RGNCAYH(Xaa1)GQLVWCTYH(配列番号13)
14)G(Xaa2)DCAYH(Xaa1)GELVWCT(Xaa2)H(配列番号36)
15)RRGPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(配列番号37) - 以下のいずれかのアミノ酸配列を含む、ただし、Xaa1はリシン残基であり、Xaa2はホモシステインである、請求項5に記載のペプチド。
DCAYH(Xaa1)GELVWCT(配列番号1)
GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(配列番号2)
RGNCAYH(Xaa1)GQLVWCTYH(配列番号13)
G(Xaa2)DCAYH(Xaa1)GELVWCT(Xaa2)H(配列番号36)
RRGPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(配列番号37) - 以下のいずれかのアミノ酸配列を含む、ただし、Xaa1はリシン残基である、請求項6に記載のペプチド。
GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(配列番号2)
RGNCAYH(Xaa1)GQLVWCTYH(配列番号13)
RRGPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(配列番号37) - 標識物質により標識されている、請求項1〜8のいずれか一項に記載のペプチド。
- 薬剤が結合している、請求項1〜9のいずれか一項に記載のペプチド。
- Xaa1がリシン残基である、請求項1〜10のいずれか一項に記載のペプチド。
- Xaa1が架橋剤で修飾されている、請求項1〜11のいずれか一項に記載のペプチド。
- 前記架橋剤が、DSG(ジスクシンイミジルグルタレート)、DSS(ジスクシンイミジルスベレート)、DMA(アジプイミド酸ジメチル二塩酸塩)、DMP(ピメルイミド酸ジメチル二塩酸塩)、DMS(スベルイミド酸ジメチル二塩酸塩)、DTBP(3,3'-ジチオビスプロピオンイミド酸ジメチル二塩酸塩)、及びDSP(ジチオビススクシンイミジルプロピオン酸)からなる群より選択される、請求項12に記載のペプチド。
- 前記架橋剤がDSG(ジスクシンイミジルグルタレート)又はDSS(ジスクシンイミジルスベレート)である、請求項13に記載のペプチド。
- 請求項12〜14のいずれか一項に記載のペプチドとIgGとの複合体であって、架橋剤で修飾されているペプチドとIgGの架橋反応によって形成される、前記複合体。
- 請求項12〜14のいずれか一項に記載のペプチドとIgGを混合し、架橋剤で修飾されているペプチドとIgGを架橋反応させる工程を含む、ペプチドとIgGの複合体を生産する方法。
- 請求項1〜14のいずれか一項に記載のペプチド、又は請求項15に記載の複合体を含む、医薬組成物。
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