JP7393810B2 - 部位特異的抗体コンジュゲーション及びその具体例としての抗体－薬物コンジュゲート - Google Patents

部位特異的抗体コンジュゲーション及びその具体例としての抗体－薬物コンジュゲート Download PDF

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Description

本発明は、抗体のある特定のアミノ酸残基を、物質(低分子量化合物、合成ポリマー、バイオポリマー(即ちペプチド、炭水化物、タンパク質等))で選択的に標識化する、又は、ある特定の標的細胞若しくは組織に送達される分子(以下、「カーゴ」と称す)を抗体に連結するための技術に関する。その上、本発明は、抗体のある特定の部位を、所望の数の物質で標識化する、又は、所望の数のカーゴを、抗体のある特定のアミノ酸残基に連結するための技術に関する。加えて、本発明は、この方法、又は抗体の断片複合体を使用する方法により調製される抗体複合体を包含する。
抗体は、ある特定の分子を認識する機能を有する生体分子であり、様々な産業用途で使用されている。例えば、抗体を使用して、ある特定の物質を検出又はスクリーニングし、ある特定の物質が体内又は細胞内を移動する経路をチェックすることができる。その上、抗体は、ある特定の物質に対して免疫応答を誘導することにより、治療目的で使用することができる。
このような抗体の機能を拡張するために、抗体の能力を改善することが試みられてきた。典型的には、抗体の機能を補足又は拡張するために、外来性物質で抗体を標識化することが試みられてきた。典型的には、抗体が、蛍光体で標識化される場合、抗体は、蛍光アッセイで使用することができる、又は、抗体が、ある特定の疾患を処置するための薬剤で標識化される場合、抗体は、抗体の治療効果を最大限にするために使用することができる。これらの試み及び技術は、一般に、「抗体標識」と称す。本発明は、抗体を標識化する新規の方法に関する。
当初、抗体標識は、外来性物質を抗体に無作為に付着させることにより達成させた。しかし、この方法は、多くの課題を有する。このように調製される抗体は、均質性が不十分であるという課題を有する。これらの抗体は、抗体の各々に付着した物質の数の差、及び抗体に対する結合部位の差が存在するので、その効果が不均等のままであるという課題を有する。この課題は、高い安全性及び再現性を必要とする抗体-薬物コンジュゲート(ADC)技術の開発にとって大きな障壁である。
その上、この方法は、認識する抗体の能力が著しく低下しうるという課題を有する。抗体は、抗原を認識する抗原結合ドメインを含むFabドメイン、及び抗体の結晶化に関与するFcドメインからなる。無作為標識化により、外来性物質が抗体の抗原結合ドメイン又は抗原結合ドメインに隣接する部位に結合することを可能にすることで、認識する抗体の能力が極めて低下するという結果をもたらす。
従って、関連分野において、部位特異的手法で抗体を均一に標識化するための技術に対する需要がある。例えば、抗体を遺伝的に変化又は修飾すること等のいくつかの技術が開発されたが、これらの多くは、技術的及び経済的な側面において効果的ではない。従って、本発明は、課題を解決するために設計され、ある特定の物質(又は「部分」)を、抗体の任意の追加の変化を伴わずに抗体のある特定の部位に特異的に結合すること、及び同様の抗体を使用してある特定の物質(薬物又は標識化した物質)を細胞又は組織に送達することを可能にする技術に関する。
US 2018/0141976 A1 WO 2018/199337 A1 米国特許第6,350,466号 米国特許第6,316,024号 米国特許第6,019,968号 米国特許第5,985,320号 米国特許第5,985,309号 米国特許第5,934,272号 米国特許第5,874,064号 米国特許第5,855,913号 米国特許第5,290,540号 米国特許第4,880,078号 WO 92/19244 WO 97/32572 WO 97/44013 WO 98/31346 WO 99/66903 米国特許第5,679,377号 米国特許第5,916,597号 米国特許第5,912,015号 米国特許第5,989,463号 米国特許第5,128,326号 WO 99/15154 WO 99/20253 米国特許第4,526,938号 WO 91/05548 WO 96/20698 米国特許第4,522,811号 米国特許第5,374,548号 米国特許第5,399,331号 米国特許第5,416,016号
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本発明は、化学官能基を抗体の特定の部位に特異的に転移させるための技術を提供する。具体的な一実施形態では、本発明は、化学官能基を抗体のリジン246に特異的に転移させるための技術を提供する。別の具体的な実施形態では、本発明は、化学官能基を抗体のリジン248に特異的に転移させるための技術を提供する。更に別の具体的な実施形態では、本発明は、化学官能基を抗体のリジン246及び248に特異的に転移させるための技術を提供する。
本発明は、所望の数の化学官能基を抗体に結合することを可能にする技術を提供する。具体的な一実施形態では、本発明は、2つの特定の部位が結合している抗体又はその断片を提供する。別の具体的な実施形態では、本発明は、4つの特定の部位が結合している抗体又はその断片を提供する。
本発明は、カーゴ部分を抗体の特定の部位に特異的に結合させるための技術を提供する。具体的な一実施形態では、本発明は、カーゴ部分を抗体のリジン246に特異的に結合させるための技術を提供する。別の具体的な実施形態では、本発明は、カーゴ部分を抗体のリジン248に特異的に結合させるための技術を提供する。更に別の具体的な実施形態では、本発明は、カーゴ部分を抗体のリジン246及び248に特異的に結合させるための技術を提供する。
本発明は、所望の数のカーゴ部分を抗体に結合させるための技術を提供する。具体的な一実施形態では、本発明は、2つのカーゴ部分が結合している抗体又はその断片を提供する。別の具体的な実施形態では、本発明は、4つのカーゴ部分が結合している抗体又はその断片を提供する。
本発明は、前述の抗体又はその断片を使用する方法を提供する。具体的な一実施形態では、本発明は、抗体-薬物複合体を使用してある特定の疾患を処置する方法を提供する。
本出願は、式2:
Figure 0007393810000001
(式中、H1は、第1のクリック反応性官能基であり、D1は、共有結合、C1～4アルキレン、C2～4アルケニレン、C2～4アルキンレン(alkynlene)、及びC3～8シクロアルキレンから選択され、X1は、Sであり、D2は、C1～7アルキレン、C2～7アルケニレン、C2～7アルキニレン、及びC3～8シクロアルキンレン(cycloalkynlene)から選択され、X2は、Oであり、R2'は、N-スクシンイミド、p-ニトロフェニル、又はペンタフルオロフェニルである)
の化合物を提供する。
その上、本出願は、H1が、末端アルキン、アジド、歪んだアルキン、ジエン、ジエノフィル、アルケン、チオール、及びテトラジンから選択される、化合物を提供する。更に、本出願は、H1が、ノルボルネン、テトラジン、アジド、及びジベンゾシクロオクチン-アミンから選択される、化合物を提供する。
加えて、本出願は、R2'が、N-スクシンイミドである、化合物を提供する。
加えて、本出願は、式2が、式2-1、2-2、又は2-3:
Figure 0007393810000002
である、化合物を提供する。
本出願は、式4-2:
[式4-2]
(Xaa)1-3-C-(Xaa)2-H-Xa1-G-Xa2-L-V-Xa3-C-(Xaa)1-3
[式中、各Xaaは、独立して、システイン残基ではない任意のアミノ酸残基であり、Cは、システイン残基であり、Hは、ヒスチジン残基であり、Gは、グリシン残基であり、Xa2は、グルタミン酸残基又はアスパラギン残基であり、Lは、ロイシン残基であり、Vは、バリン残基であり、Xa3は、トリプトファン残基、ナフチルアラニン残基、及びフェニルアラニン残基から選択され、Xa1は、
Figure 0007393810000003
(式中、D3は、共有結合又はC1～3アルキレンであり、X3は、NH2である)である]
のペプチドであって、13～17個のアミノ酸残基からなり、ヒト免疫グロブリンG(IgG)に対する結合活性を呈し、式4-2のN末端から2～4個のアミノ酸にあるシステイン残基、及び式4-2のC末端から2～4個のアミノ酸にあるシステイン残基が、任意で連結している、ペプチドを提供する。
その上、本出願は、D3が、共有結合、メチレン、又はエチレンである、ペプチドを提供する。
加えて、本出願は、式4-2が、式4-6:
[式4-6]
D-C-A-W-H-Xa1-G-E-L-V-W-C-T
(式中、Dは、アスパラギン酸残基であり、Aは、アラニン残基であり、Eは、グルタミン酸残基であり、Wは、トリプトファン残基であり、Tは、スレオニン残基である)
である、ペプチドを提供する。
本出願は、式6-2:
[式6-2]
(Xaa)1-3-C-(Xaa)2-H-(Xa1)'-G-Xa2-L-V-Xa3-C-(Xaa)1-3
[式中、各Xaaは、独立して、システイン残基ではない任意のアミノ酸残基であり、Cは、システイン残基であり、Hは、ヒスチジン残基であり、Gは、グリシン残基であり、Xa2は、グルタミン酸残基又はアスパラギン残基であり、Lは、ロイシン残基であり、Vは、バリン残基であり、Xa3は、トリプトファン残基、ナフチルアラニン残基、及びフェニルアラニン残基から選択され、
(Xa1)'は、
Figure 0007393810000004
(式中、H1は、第1のクリック反応性官能基であり、D1は、共有結合、C1～4アルキレン、C2～4アルケニレン、C2～4アルキニレン、及びC3～8シクロアルキンレンから選択され、X1は、Sであり、D2は、C1～7アルキレン、C2～7アルケニレン、C2～7アルキニレン、及びC3～8シクロアルキンレンから選択され、D3は、共有結合又はC1～3アルキレンであり、X3は、NHである)である]
のペプチド-化合物コンジュゲートであって、ペプチドが、13～17個のアミノ酸残基からなり、ヒト免疫グロブリンG(IgG)に対する結合活性を呈し、式6-2のN末端から2～4個のアミノ酸にあるシステイン残基、及び式6-2のC末端から2～4個のアミノ酸にあるシステイン残基が、任意で連結している、ペプチド-化合物コンジュゲートを提供する。
その上、本出願は、(Xa1)'のβ炭素から(Xa1)'の第1のカルボニル炭素までの距離が、およそ11.668Å未満である、ペプチド-化合物コンジュゲートを提供する。
加えて、本出願は、D2が、Cyアルキレン、Cyアルケニレン、又はCyアルキニレンであり、D3が、Cxアルキレンであり、yが、1以上の整数で、1≦x+y≦5である、ペプチド-化合物コンジュゲートを提供する。
加えて、本出願は、(Xa1)'のβ炭素から(Xa1)'の第1のカルボニル炭素までの距離が、およそ16.208Å超である、ペプチド-化合物コンジュゲートを提供する。
加えて、本出願は、D2が、Cyアルキレン、Cyアルケニレン、又はCyアルキニレンであり、D3が、Cxアルキレンであり、yが、1以上の整数で、9≦x+y≦12である、ペプチド-化合物コンジュゲートを提供する。更に、本出願は、D2が、Cyアルケニレン、又はCyアルキニレンである、ペプチド-化合物コンジュゲートを提供する。
加えて、本出願は、(Xa1)'のβ炭素から(Xa1)'の第1のカルボニル炭素までの距離が、およそ11.668Å～およそ16.208Åである、ペプチド-化合物コンジュゲートを提供する。
加えて、本出願は、D2が、Cyアルキレン、Cyアルケニレン、又はCyアルキニレンであり、D3が、Cxアルキレンであり、yが、1以上の整数で、6≦x+y≦8である、ペプチド-化合物コンジュゲートを提供する。
加えて、本出願は、式6-2が、式6-3:
[式6-3]
D-C-A-W-H-(Xa1)'-G-E-L-V-W-C-T
(式中、Dは、アスパラギン酸残基であり、Aは、アラニン残基であり、Eは、グルタミン酸残基であり、Wは、トリプトファン残基であり、Tは、スレオニン残基である)
である、ペプチド-化合物コンジュゲートを提供する。
その上、本出願は、D1が、共有結合であり、D2が、メチレンである、ペプチド-化合物コンジュゲートを提供する。
本出願は、第1のクリック反応性官能基を抗体に転移するための薬剤を調製するための方法であって、式2:
Figure 0007393810000005
(式中、H1は、第1のクリック反応性官能基であり、D1は、共有結合、C1～4アルキレン、C2～4アルケニレン、C2～4アルキニレン、及びC3～8シクロアルキンレンから選択され、X1は、Sであり、D2は、C1～7アルキレン、C2～7アルケニレン、C2～7アルキニレン、及びC3～8シクロアルキンレンから選択され、X2は、Oであり、R2'は、N-スクシンイミド、p-ニトロフェニル、又はペンタフルオロフェニルである)
の化合物を、式4-2:
[式4-2]
(Xaa)1-3-C-(Xaa)2-H-Xa1-G-Xa2-L-V-Xa3-C-(Xaa)1-3
[式中、各Xaaは、独立して、システイン残基ではない任意のアミノ酸残基であり、Cは、システイン残基であり、Hは、ヒスチジン残基であり、Gは、グリシン残基であり、Xa2は、グルタミン酸残基又はアスパラギン残基であり、Lは、ロイシン残基であり、Vは、バリン残基であり、Xa3は、トリプトファン残基、ナフチルアラニン残基、及びフェニルアラニン残基から選択され、
Xa1は、
Figure 0007393810000006
(式中、D3は、共有結合又はC1～3アルキレンであり、X3は、NH2である)である]
のペプチドであって、ペプチドが、13～17個のアミノ酸残基からなり、ヒト免疫グロブリンG(IgG)に対する結合活性を呈し、式4-2のN末端から2～4個のアミノ酸にあるシステイン残基、及び式4-2のC末端から2～4個のアミノ酸にあるシステイン残基が、任意で連結しているペプチドと反応させる工程を含む、方法を提供する。
その上、本出願は、第1のクリック反応性官能基を抗体に転移するための薬剤を調製するための方法であって、D2が、Cyアルキレン、Cyアルケニレン、又はCyアルキニレンであり、D3が、Cxアルキレンであり、yが、1以上の整数で、1≦x+y≦5であり、本方法により調製される第1のクリック反応性官能基を抗体に転移するための薬剤が、抗体と反応して、第1のクリック反応性官能基を、特異的に抗体のFcドメインの248リジン残基に送達することができることを特徴とする、方法を提供する。
加えて、本出願は、第1のクリック反応性官能基を抗体に転移するための薬剤を調製するための方法であって、D2が、Cyアルキレン、Cyアルケニレン、又はCyアルキニレンであり、D3が、Cxアルキレンであり、yが、1以上の整数で、1≦x+y≦5であり、本方法により調製される第1のクリック反応性官能基を抗体に転移するための薬剤が、抗体と反応して、第1のクリック反応性官能基を、特異的に抗体のFcドメインの248リジン残基に送達することができることを特徴とする、方法を提供する。
加えて、本出願は、第1のクリック反応性官能基を抗体に転移するための薬剤を調製するための方法であって、D2が、Cyアルキレン、Cyアルケニレン、又はCyアルキニレンであり、D3が、Cxアルキレンであり、yが、1以上の整数で、9≦x+y≦12であり、本方法により調製される第1のクリック反応性官能基を抗体に転移するための薬剤が、抗体と反応して、第1のクリック反応性官能基を、特異的に抗体のFcドメインの246リジン残基に送達することができることを特徴とする、方法を提供する。
加えて、本出願は、第1のクリック反応性官能基を抗体に転移するための薬剤を調製するための方法であって、D2が、Cyアルキレン、Cyアルケニレン、又はCyアルキニレンであり、D3が、Cxアルキレンであり、yが、1以上の整数で、6≦x+y≦8であり、本方法により調製される第1のクリック反応性官能基を抗体に転移するための薬剤が、抗体と反応して、第1のクリック反応性官能基を、選択的に抗体のFcドメインの246リジン残基又は248リジン残基に送達することができることを特徴とする、方法を提供する。
本出願は、抗体に転移する第1のクリック反応性官能基を調製するためのキットであって、式2:
Figure 0007393810000007
(式中、H1は、第1のクリック反応性官能基であり、D1は、共有結合、C1～4アルキレン、C2～4アルケニレン、C2～4アルキニレン、及びC3～8シクロアルキンレンから選択され、X1は、Sであり、D2は、C1～7アルキレン、C2～7アルケニレン、C2～7アルキニレン、及びC3～8シクロアルキンレンから選択され、X2は、Oであり、R2'は、N-スクシンイミド、p-ニトロフェニル、又はペンタフルオロフェニルである)
の化合物、並びに、式4-2:
[式4-2]
(Xaa)1-3-C-(Xaa)2-H-Xa1-G-Xa2-L-V-Xa3-C-(Xaa)1-3
[式中、各Xaaは、独立して、システイン残基ではない任意のアミノ酸残基であり、Cは、システイン残基であり、Hは、ヒスチジン残基であり、Gは、グリシン残基であり、Xa2は、グルタミン酸残基又はアスパラギン残基であり、Lは、ロイシン残基であり、Vは、バリン残基であり、Xa3は、トリプトファン残基、ナフチルアラニン残基、及びフェニルアラニン残基から選択され、
Xa1は、
Figure 0007393810000008
(式中、D3は、共有結合又はC1～3アルキレンであり、X3は、NH2である)である]
のペプチドであって、ペプチドが、13～17個のアミノ酸残基からなり、ヒト免疫グロブリンG(IgG)に対する結合活性を呈し、式4-2のN末端から2～4個のアミノ酸にあるシステイン残基、及び式4-2のC末端から2～4個のアミノ酸にあるシステイン残基が、任意で連結しているペプチドを含む、キットを提供する。
本出願は、式8-1、式8-2、及び式8-3:
[式8-1]
G-P-S-V-F-L-F-P-P-(K)'-P-K-D-T-L-M-I
[式8-2]
G-P-S-V-F-L-F-P-P-K-P-(K)'-D-T-L-M-I
[式8-3]
G-P-S-V-F-L-F-P-P-(K)'-P-(K)'-D-T-L-M-I
[式中、Gは、グリシン残基であり、Pは、プロリン残基であり、Sは、セリン残基であり、Vは、バリン残基であり、Fは、フェニルアラニン残基であり、Lは、ロイシン残基であり、Kは、リジン残基であり、Dは、アスパラギン酸残基であり、Tは、スレオニン残基であり、Mは、メチオニン残基であり、Iは、イソロイシン残基であり、
(K)'は、
Figure 0007393810000009
(式中、H1は、第1のクリック反応性官能基であり、D1は、共有結合、C1～4アルキレン、C2～4アルケニレン、C2～4アルキニレン、及びC3～8シクロアルキンレンから選択される)
である]
から選択される1つ又は複数のアミノ酸配列を含む抗体又はその断片を提供する。
その上、本出願は、D1が、共有結合である、抗体又はその断片を提供する。
加えて、本出願は、式8-1のアミノ酸配列を含み、式8-2及び8-3のアミノ酸配列を含まない抗体又はその断片を提供する。更に、本出願は、2つのFcドメイン両方に式8-1のアミノ酸配列を含む抗体又はその断片を提供する。
加えて、本出願は、式8-2のアミノ酸配列を含み、式8-1及び8-3のアミノ酸配列を含まない抗体又はその断片を提供する。更に、本出願は、2つのFcドメイン両方に式8-2のアミノ酸配列を含む抗体又はその断片を提供する。
加えて、本出願は、式8-3のアミノ酸配列を含み、式8-1及び8-2のアミノ酸配列を含まない抗体又はその断片を提供する。更に、本出願は、2つのFcドメイン両方に式8-3のアミノ酸配列を含む抗体又はその断片を提供する。
本出願は、第1のクリック反応性官能基を含む抗体又はその断片を調製するための方法であって、式6-2:
[式6-2]
(Xaa)1-3-C-(Xaa)2-H-(Xa1)'-G-Xa2-L-V-Xa3-C-(Xaa)1-3
[式中、各Xaaは、独立して、システイン残基ではない任意のアミノ酸残基であり、Cは、システイン残基であり、Hは、ヒスチジン残基であり、Gは、グリシン残基であり、Xa2は、グルタミン酸残基又はアスパラギン残基であり、Lは、ロイシン残基であり、Vは、バリン残基であり、Xa3は、トリプトファン残基、ナフチルアラニン残基、及びフェニルアラニン残基から選択され、
(Xa1)'は、
Figure 0007393810000010
(式中、H1は、第1のクリック反応性官能基であり、D1は、共有結合、C1～4アルキレン、C2～4アルケニレン、C2～4アルキニレン、及びC3～8シクロアルキンレンから選択され、X1は、Sであり、D2は、C1～7アルキレン、C2～7アルケニレン、C2～7アルキニレン、及びC3～8シクロアルキンレンから選択され、D3は、共有結合又はC1～3アルキレンであり、X3は、NHである)である]
のペプチド-化合物コンジュゲートであって、ペプチドが、13～17個のアミノ酸残基からなり、ヒト免疫グロブリンG(IgG)に対する結合活性を呈し、式6-2のN末端から2～4個のアミノ酸にあるシステイン残基、及び式6-2のC末端から2～4個のアミノ酸にあるシステイン残基が、任意で連結しているペプチド-化合物コンジュゲートを、抗体又はその断片と反応させる工程を含む、方法を提供する。
本出願は、第1のクリック反応性官能基を含む抗体又はその断片を調製するためのキットであって、
式6-2:
[式6-2]
(Xaa)1-3-C-(Xaa)2-H-(Xa1)'-G-Xa2-L-V-Xa3-C-(Xaa)1-3
[式中、各Xaaは、独立して、システイン残基ではない任意のアミノ酸残基であり、Cは、システイン残基であり、Hは、ヒスチジン残基であり、Gは、グリシン残基であり、Xa2は、グルタミン酸残基又はアスパラギン残基であり、Lは、ロイシン残基であり、Vは、バリン残基であり、Wは、トリプトファン残基であり、
(Xa1)'は、
Figure 0007393810000011
(式中、H1は、第1のクリック反応性官能基であり、D1は、共有結合、C1～4アルキレン、C2～4アルケニレン、C2～4アルキニレン、及びC3～8シクロアルキンレンから選択され、X1は、Sであり、D2は、C1～7アルキレン、C2～7アルケニレン、C2～7アルキニレン、及びC3～8シクロアルキンレンから選択され、D3は、共有結合又はC1～3アルキレンであり、X3は、NHである)である]
のペプチド-化合物コンジュゲートであって、ペプチドが、13～17個のアミノ酸残基からなり、ヒト免疫グロブリンG(IgG)に対する結合活性を呈し、式6-2のN末端から2～4個のアミノ酸にあるシステイン残基、及び式6-2のC末端から2～4個のアミノ酸にあるシステイン残基が、任意で結合している、ペプチド-化合物コンジュゲート;並びに、抗体又はその断片
を含むキットを提供する。
本出願は、式9:
[式9]
Cm-H2
(式中、Cmは、カーゴ部分であり、H2は、第2のクリック反応性官能基である)
の化合物を提供する。
本出願は、抗体-薬物コンジュゲートを調製するための方法であって、式8-1、式8-2、及び式8-3:
[式8-1]
G-P-S-V-F-L-F-P-P-(K)'-P-K-D-T-L-M-I
[式8-2]
G-P-S-V-F-L-F-P-P-K-P-(K)'-D-T-L-M-I
[式8-3]
G-P-S-V-F-L-F-P-P-(K)'-P-(K)'-D-T-L-M-I
[式中、Gは、グリシン残基であり、Pは、プロリン残基であり、Sは、セリン残基であり、Vは、バリン残基であり、Fは、フェニルアラニン残基であり、Lは、ロイシン残基であり、Kは、リジン残基であり、Dは、アスパラギン酸残基であり、Tは、スレオニン残基であり、Mは、メチオニン残基であり、Iは、イソロイシン残基であり、
(K)'は、
Figure 0007393810000012
(式中、H1は、第1のクリック反応性官能基であり、D1は、共有結合、C1～4アルキレン、C2～4アルケニレン、C2～4アルキニレン、及びC3～8シクロアルキンレンから選択される)である]
から選択される1つ又は複数のアミノ酸配列を含む抗体又はその断片を、式9:
[式9]
Cm-H2
(式中、Cmは、カーゴ部分であり、H2は、第1のクリック反応性官能基と相補的である第2のクリック反応性官能基である)
の化合物と反応させる工程を含む方法を提供する。
本出願は、式8-1、式8-2、及び式8-3:
[式8-1]
G-P-S-V-F-L-F-P-P-(K)'-P-K-D-T-L-M-I
[式8-2]
G-P-S-V-F-L-F-P-P-K-P-(K)'-D-T-L-M-I
[式8-3]
G-P-S-V-F-L-F-P-P-(K)'-P-(K)'-D-T-L-M-I
[式中、Gは、グリシン残基であり、Pは、プロリン残基であり、Sは、セリン残基であり、Vは、バリン残基であり、Fは、フェニルアラニン残基であり、Lは、ロイシン残基であり、Kは、リジン残基であり、Dは、アスパラギン酸残基であり、Tは、スレオニン残基であり、Mは、メチオニン残基であり、Iは、イソロイシン残基であり、
(K)'は、
Figure 0007393810000013
(式中、H1は、第1のクリック反応性官能基であり、D1は、共有結合、C1～4アルキレン、C2～4アルケニレン、C2～4アルキニレン、及びC3～8シクロアルキンレンから選択される)である]
から選択される1つ又は複数のアミノ酸配列を含む抗体又はその断片;並びに、式9:
[式9]
Cm-H2
(式中、Cmは、カーゴ部分であり、H2は、第1のクリック反応性官能基と相補的である第2のクリック反応性官能基である)
の化合物を含む抗体-薬物コンジュゲートを調製するためのキットを提供する。
本出願は、式10-1、式10-2、及び式10-3:
[式10-1]
G-P-S-V-F-L-F-P-P-(K)"-P-K-D-T-L-M-I
[式10-2]
G-P-S-V-F-L-F-P-P-K-P-(K)"-D-T-L-M-I
[式10-3]
G-P-S-V-F-L-F-P-P-(K)"-P-(K)"-D-T-L-M-I
[式中、Gは、グリシン残基であり、Pは、プロリン残基であり、Sは、セリン残基であり、Vは、バリン残基であり、Fは、フェニルアラニン残基であり、Lは、ロイシン残基であり、Kは、リジン残基であり、Dは、アスパラギン酸残基であり、Tは、スレオニン残基であり、Mは、メチオニン残基であり、Iは、イソロイシン残基であり、
(K)"は、
Figure 0007393810000014
(式中、Cmは、カーゴ部分であり、Bは、
Figure 0007393810000015
(式中、A1及びA2は、カーゴ部分又はD1と接続し、これらは、両方が同じものに接続せず、Rxは、H、ハロゲン、及びC1～3アルキルから選択される)
から選択され、
D1は、共有結合、C1～4アルキレン、C2～4アルケニレン、C2～4アルキニレン、及びC3～8シクロアルキンレンから選択される)である]
から選択される1つ又は複数のアミノ酸配列を含む抗体又はその断片を提供する。
その上、本出願は、式10-1のアミノ酸配列を含み、式10-2及び10-3のアミノ酸配列を含まない抗体又はその断片を提供する。更に、本出願は、2つのFcドメイン両方に式10-1のアミノ酸配列を含む抗体又はその断片を提供する。
加えて、本出願は、式10-2のアミノ酸配列を含み、式10-1及び10-3のアミノ酸配列を含まない抗体又はその断片を提供する。更に、本出願は、2つのFcドメイン両方に式10-2のアミノ酸配列を含む抗体又はその断片を提供する。
加えて、本出願は、式10-3のアミノ酸配列を含み、式10-1及び10-2のアミノ酸配列を含まない抗体又はその断片を提供する。更に、本出願は、2つのFcドメイン両方に式10-3のアミノ酸配列を含む抗体又はその断片を提供する。
加えて、本出願は、カーゴ部分が、薬物部分を含む抗体又はその断片を提供する。更に、本出願は、カーゴ部分が、2つ以上の薬物部分を含む抗体又はその断片を提供する。又は更に、本出願は、薬物部分が、抗がん剤である、抗体又はその断片を提供する。更に、本出願は、抗がん剤が、DM1、DM3、DM4、アブリン、リシンA、シュードモナス外毒素、コレラ毒素、ジフテリア毒素、腫瘍壊死因子、α-インターフェロン、β-インターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子、組織プラスミノゲン活性化因子、サイトカイン、アポトーシス剤(apoptotic agen)、抗血管新生剤、リンホカイン、タキサン、DNA-アルキル化剤、アントラサイクリン、ツブリシン類似体、デュオカルマイシン類似体、アウリスタチンE、アウリスタチンF、メイタンシノイド、反応性ポリエチレングリコール部分を含む細胞毒性剤、タクソン、サイトカラシンB、グラミシジンD、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、t.コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシン(anthracin)ジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンD、1-ジヒドロテストステロン(1-dehydrotestosterone)、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシン、メソトレキセート、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、シタラビン、5-フルオロウラシルデカルバジン、メクロレタミン、チオテパ、クロラムブシル、メイファラン(meiphalan)、カルムスチン、ロムスチン、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンC、シスプラチン、ダクチノマイシン、ブレオマイシン、アントラマイシン、カリケアミシン、ゲムシタビン(Gemcitabine)、ベンダムスチン、ボルテゾミブ、カルボプラチン、カバジタキセル、ダサチニブ、ドセタキセル、エピルビシン、エルロチニブ、エベロリムス、ゲムシタビン(gemcitabine)、ゲフィチニブ、イダルビシン、イマチニブ、ヒドロキシ尿素、ラパチニブ、リュープロレリン、メルファラン、ネダプラチン、ニロチニブ、オキサリプラチン、パゾパニブ、ペメトレキセド、
ピコプラチン、ロミデプシン、サトラプラチン、ソラフェニブ、ベムラフェニブ、スニチニブ、テニポシド、トリプラチン、及びビノレルビンから選択される少なくとも1つである、抗体又はその断片を提供する。
本出願は、前述の抗体-薬物コンジュゲートを含む、がんを処置するための医薬組成物を提供する。
その上、本出願は、がんを処置するための医薬組成物であって、がんが、膀胱がん、骨がん、脳腫瘍、乳がん、心臓がん、子宮頚部がん、結腸直腸がん、直腸がん、食道がん、線維肉腫、胃がん、消化器がん、頭頚部がん、カポジ肉腫、腎がん、白血病、肝がん、肺がん、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、卵巣がん、膵がん、陰茎がん、前立腺がん、精巣生殖細胞がん、胸腺腫、及び胸腺癌から選択される、医薬組成物を提供する。
加えて、本出願は、がんを処置するための医薬組成物であって、がんが、乳がんである、医薬組成物を提供する。
本出願は、がんを処置するための方法であって、前述の抗体-薬物コンジュゲートを含む医薬組成物を対象に投与する工程を含む方法を提供する。
その上、本出願は、がんを処置するための方法であって、がんが、膀胱がん、骨がん、脳腫瘍、乳がん、心臓がん、子宮頚部がん、結腸直腸がん、直腸がん、食道がん、線維肉腫、胃がん、消化器がん、頭頚部がん、カポジ肉腫、腎がん、白血病、肝がん、肺がん、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、卵巣がん、膵がん、陰茎がん、前立腺がん、精巣生殖細胞がん、胸腺腫、及び胸腺癌から選択される、方法を提供する。
更に、本出願は、がんを処置するための方法であって、がんが、乳がんである、方法を提供する。
本発明による抗体生成物は、そのある特定の部位で標識化された、特定の数の化学官能基又はカーゴ部分を有することができる。従って、本発明は、高い均一性を有する抗体生成物を提供することができる。その上、本発明は、その抗体の機能が低下しない抗体生成物を提供することができる。即ち、本発明は、その抗体の結合親和性及び半減期が低下しない抗体生成物を提供することができる。本発明は、いかなる複雑なプロセスも伴わないで抗体の部位特異的標識化を可能にする最初の技術として非常に重要である。
Fcドメインの部分的な配列、及びEUナンバリングシステムに従ってナンバリングした配列の数字を示す。 リジン246及び248を含む、Fcドメインのリジン残基の位置を示す。 SSFIとFcドメインとの間のトポロジーを示す。 SSFIとFcドメインとの間のトポロジーを示す。 FcドメインにおけるSSFIのXa1並びにリジン246及びリジン248を示す。 リジン246のアミン基とSSFIのXa1のβ炭素との間の距離を示す。 リジン248のアミン基とSSFIのXa1のβ炭素との間の距離を示す。 R1'-L2-SSFIの構造、及び(Xa1)'のβ炭素と第1のカルボニル炭素との間の距離(Lc)を示す。 (Xa1)'の側鎖が、図のx軸に平行な方向(点線の矢印)を有するような、R1'-L2-SSFIとFcドメインとの間のトポロジーを示す。 第1のカルボニル炭素がリジン248と十分に反応することを可能にするような、使用される条件を示す。 第1のカルボニル炭素がリジン246と十分に反応することを可能にするような、使用される条件を示す。 第1のカルボニル炭素がリジン246又はリジン248と選択的に反応することを可能にするような、使用される条件を示す。 FcRn結合部位、並びにFcドメインのリジン246及びリジン248を示す。 FcとFcRnとの間の結合部位と比較した、SSFIとFcドメインとの間の結合構造の解析を示す。 化合物Iを合成する方法を示す。 質量分析により化合物Iの構造を確認した結果を示す。 化合物IIを合成する方法を示す。 質量分析により化合物IIの構造を確認した結果を示す。 化合物IIIを合成する方法を示す。 質量分析により化合物IIIの構造を確認した結果を示す。 化合物IVを合成する方法を示す。 化合物IVを合成する方法を示す。 質量分析により化合物IVの構造を確認した結果を示す。 質量分析によりSSFI(6Lys)の構造を確認した結果を示す。 質量分析によりSSFI(6Orn)の構造を確認した結果を示す。 質量分析によりSSFI(6Dab)の構造を確認した結果を示す。 質量分析によりSSFI(6Dap)の構造を確認した結果を示す。 質量分析によりDD2の構造を確認した結果を示す。 質量分析によりDD3の構造を確認した結果を示す。 質量分析によりDD4の構造を確認した結果を示す。 質量分析によりDD5の構造を確認した結果を示す。 質量分析によりDD6の構造を確認した結果を示す。 質量分析により化合物I-SSFI(6Lys)の構造を確認した結果を示す。 質量分析により化合物II-SSFI(6Lys)の構造を確認した結果を示す。 質量分析により化合物III-SSFI(6Lys)の構造を確認した結果を示す。 質量分析により化合物III-SSFI(6Orn)の構造を確認した結果を示す。 質量分析により化合物III-SSFI(6Dab)の構造を確認した結果を示す。 質量分析により化合物III-SSFI(6Dap)の構造を確認した結果を示す。 質量分析により化合物IV-SSFI(6Dap)の構造を確認した結果を示す。 HIC-HPLCによりトラスツズマブ及び化合物I-SSFI(6Lys)を使用して結合反応を観察した結果を示す。 HIC-HPLCによりトラスツズマブ及び化合物II-SSFI(6Lys)を使用して結合反応を観察した結果を示す。 化合物III-SSFI(6Dap、Dab、Orn、又はLys)との抗体の反応を示す。 最終生成物としてAb(246/248)-ノルボルネンの構造を示す。 HIC-HPLCによりトラスツズマブ及び化合物III-SSFI(6Dap)を使用して結合反応を観察した結果を示す。 HIC-HPLCによりトラスツズマブ及び化合物III-SSFI(6Dab)を使用して結合反応を観察した結果を示す。 HIC-HPLCによりトラスツズマブ及び化合物III-SSFI(6Orn)を使用して結合反応を観察した結果を示す。 HIC-HPLCによりトラスツズマブ及び化合物III-SSFI(6Lys)を使用して結合反応を観察した結果を示す。 HIC-HPLCによりトラスツズマブ及び化合物IV-SSFI(6Dap)を使用して結合反応を観察した結果を示す。 抗体-ノルボルネン結合による分子量スペクトルの増加を示す。 抗体-ノルボルネン結合による分子量スペクトルの増加を示す。 トラスツズマブ及び抗体-ノルボルネン複合体のMS/MSクロマトグラム結果を示す。 トラスツズマブ及び抗体-ノルボルネン複合体のMS/MSクロマトグラム結果を示す。 トラスツズマブ及び抗体-ノルボルネン複合体のMS/MSクロマトグラム結果を示す。 トラスツズマブ及び抗体-ノルボルネン複合体のMS/MSクロマトグラム結果を示す。 MS/MSスペクトルによる配列マッチング結果を示す。 トラスツズマブ-アジド構造を確認するために測定したトラスツズマブの質量スペクトルを示す。 トラスツズマブ-アジド構造を確認するために測定したトラスツズマブ-アジド複合体の質量スペクトルを示す。 質量分析によりテトラジン-DM1の構造を確認した結果を示す。 化合物III-SSFI(6Dap)に基づくトラスツズマブ-DM1コンジュゲートの構造を示す。 HIC-HPLCによりトラスツズマブ-DM1コンジュゲートの形成反応を観察した結果を示す。 ノルボルネン-テトラジン-DM1結合による分子量スペクトルの増加を示す。 ノルボルネン-テトラジン-DM1結合による分子量スペクトルの増加を示す。 ノルボルネンで標識化された抗体に結合したペイロードの3つの設計の構造を示す。 抗体-薬物コンジュゲートの抗原結合親和性を解析した結果を示す。 抗体-薬物コンジュゲートの血清安定性を解析した結果を示す。 抗体-薬物コンジュゲートの血清安定性を解析した結果を示す。 抗体-薬物コンジュゲートの血清安定性を解析した結果を示す。 細胞レベルでの抗体-薬物コンジュゲートの薬効を評価した結果を示す。 細胞レベルでの抗体-薬物コンジュゲートの薬効を評価した結果を示す。 細胞レベルでの抗体-薬物コンジュゲートの薬効を評価した結果を示す。 動物レベルでの抗体-薬物コンジュゲートの薬効を評価した結果を示す。 動物レベルでの抗体-薬物コンジュゲートの薬効を評価した結果を示す。 抗体-薬物コンジュゲートの薬物動態試験の結果を示す。
定義
別段の定義がない限り、本発明で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解されるのと同じ意味を有する。以下の引用は、本発明で使用される用語のいくつかの一般的な定義を当業者にもたらすために提供される:Singleton等、Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (第2版、1994年); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker編、1988年); The Glossary of Genetics、第5版、R. Rieger等(編)、Springer Verlag社(1991);及び、Hale & Marham、The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)。別段明確に特定されない限り、本発明で使用される以下の用語は、以下の通り、これらに帰する意味を有する。
いくつかの実施形態では、化学構造は、対応する化学名と共に開示される。用語が、互いに矛盾又は対立する場合、化学構造は、化学構造を通して化合物の意味を理解するために、化学名より優先される。
本発明で使用される用語「ヘテロ」とは、少なくとも1つのヘテロ原子を含む、化合物又は化合物の群を指す。用語「ヘテロ原子」とは、炭素又は水素原子以外の原子を指し、例えばB、Si、N、P、O、S、及びSeを含む。好ましくは、ヘテロ原子は、とりわけ、N、O、及びSのような多価元素、又はF、Cl、Br、及びIのような一価元素を含むが、本発明では、これらに限定されない。
本発明で使用される用語「低級」とは、炭化水素、例えば、アルキレン等を修飾するのに使用されるので、対応する炭化水素が、6以下の炭素原子を有することを意味する。例えば、C1～6直鎖又は分岐鎖アルキル基とは、「低級アルキル」基のような別名を指す。
本発明で使用される用語「オキシ」とは、酸素原子の二次の基(-O-)を指す。
用語「アルキル」又は「アルカン」とは、完全に飽和されている直鎖又は分岐鎖の非芳香族炭化水素を指す。別段定義がない限り、直鎖又は分岐鎖アルキル基は、典型的には、1～およそ20個の炭素原子、好ましくは1～およそ10個の炭素原子を有する。直鎖及び分岐鎖アルキル基とは、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、ペンチル、ヘキシル、ペンチル、及びオクチルが挙げられる。
用語「アルケニル」又は「アルケン」とは、少なくとも1つの二重結合を含有する直鎖又は分岐鎖の非芳香族炭化水素を指す。別段定義がない限り、直鎖又は分岐鎖アルケニル基は、典型的には、1～およそ20個の炭素原子、好ましくは1～およそ10個の炭素原子を有する。
用語「アルキニル」又は「アルキン」とは、少なくとも1つの三重結合を有する直鎖又は分岐鎖の非芳香族炭化水素を指す。別段定義がない限り、直鎖又は分岐鎖アルキニル基は、典型的には、1～およそ20個の炭素原子、好ましくは1～およそ10個の炭素原子を有する。
用語「シクロアルカン」基又は「シクロアルキル」基とは、完全に飽和されている環状炭化水素を指す。「シクロアルキル」は、単環式及び多環式環を含む。別段定義がない限り、単環式シクロアルキル基は、一般に3～およそ10個の炭素原子、より一般には3～8個の炭素原子を有する。多環式シクロアルキルの第1の環以外の環は、飽和、不飽和、及び芳香族環から選択されうる。シクロアルキルは、2つの環の間で共有する、1、2、若しくは3個、又はそれ以上の原子を含有する二環式分子を含む。用語「縮合シクロアルキル」とは、1つの環が、別の環と2つの隣接する原子を共有する多環式シクロアルキルを指す。縮合多環式シクロアルキルの第1の環以外の環は、飽和、不飽和、及び芳香族環から選択されうる。
用語「シクロアルキン」又は「シクロアルキニル」とは、少なくとも1つの三重結合を含有する環状炭化水素を指し、「歪んだアルキン」とも称される。「シクロアルキニル」は、単環式及び多環式環を含む。別段定義がない限り、単環式シクロアルキニルは、一般に3～およそ10個の炭素原子、より一般には3～8個の炭素原子を有する。多環式シクロアルキニルの第1の環以外の環は、飽和、不飽和、及び芳香族環から選択されうる。シクロアルキニルは、2つの環の間で共有する、1、2、若しくは3個、又はそれ以上の原子を含有する二環式分子である。用語「縮合シクロアルキニル」とは、1つの環が、別の環と2つの隣接する原子を共有する多環式シクロアルキニルを指す。縮合多環式シクロアルキニルの第1の環以外の環は、飽和、不飽和、及び芳香族環から選択されうる。
分子そのものとして使用される、又は別の分子の一部として使用される用語「アルキレン」とは、アルカン由来の二価基を指す。例えば、基は、-CH2CH2-、及び-CH2CH2CH2CH2-を含み、その全てが、10個以下の炭素原子を含有するが、本発明では、これらに限定されない。用語「低級アルキレン」とは、一般に6個以下の炭素原子を有する短いアルキレン基を指す。別段記載がない限り、用語「アルキレン」は、本発明での「ヘテロアルキレン」で表される基を包含することを意図する。
用語「ヘテロアルキレン」とは、ヘテロアルキル由来の二価基を指し、例えば、-CH2-CH2-S-CH2-CH2-、及び-CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-を含むが、本発明では、これらに限定されない。ヘテロアルキレン基は、各末端又はその鎖の全ての末端に同じ又は異なるヘテロ原子を含有しうる(アルキレンオキシ、アルキレンジオキシ、アルキレンアミノ、アルキレンジアミノ、アミノオキシアルキレン等を含むが、本発明では、これらに限定されない)。更に、鎖の両末端の接続の表示は、式の基の配置と独立する。例えば、式-C(O)2R'-とは、-C(O)2R'-及び-R'(O)2C-の両方を指す。
分子そのものとして使用される、又は別の分子の一部として使用される用語「アルケニレン」とは、アルケン由来の二価基を指す。例えば、基は、-CH=CH-、-CH2CH=CHCH2-、及び-CH=CH-CH=CH-を含み、その全てが、10個以下の炭素原子を含有するが、本発明では、これらに限定されない。別段記載がない限り、用語「アルケニレン」は、本発明でのヘテロアルケニレンを包含することを意図する。
分子そのものとして使用される、又は別の分子の一部として使用される用語「アルキニレン」とは、アルキン由来の二価基を指す。例えば、基は、-C≡C-、-CH2C≡CCH2-、及び-C≡C-C≡C-を含み、その全てが、10個以下の炭素原子を含有するが、本発明では、これらに限定されない。別段記載がない限り、用語「アルキニレン」は、本発明でのヘテロアルキニレンを包含することを意図する。
分子そのものとして使用される、又は別の分子の一部として使用される用語「シクロアルキレン」とは、シクロアルケン由来の二価基を指す。別段記載がない限り、「シクロアルキレン」は、本発明でのヘテロシクロアルキレンを包含することを意図する。
本明細書、実施例、及び特許請求の範囲で使用される用語「アルキレン」は、「非置換アルキレン」及び「置換アルキレン」の両方を包含することを意図する。これらのうち、後者は、炭化水素の1つ又は複数の炭素原子上の水素原子を置き換える置換基を有するアルキレン基を指す。別段明確に特定されない限り、置換基は、例えば、ハロゲン、ヒドロキシル基、カルボニル基(例えば、カルボキシル、アルコキシカルボニル、ホルミル、又はアシル)、チオカルボニル基(例えば、チオエステル、チオアセテート、又はチオホルメート)、アルコキシ基、ホスホリル基、ホスフェート基、ホスホネート基、ホスフィネート基、アミノ基、アミド基、アミジン基、イミン基、シアノ基、ニトロ基、アジド基、スルフヒドリル基、アルキルチオ基、スルフェート基、スルホネート基、スルファモイル基、スルホンアミド基、スルホニル基、ヘテロシクリル基、アラルキル基、又は芳香族若しくはヘテロ芳香族基を含みうる。適切に置換される場合、炭化水素鎖の置換残基が、それ自体置換されうることは、当業者により理解されうる。例えば、置換アルキレンの置換基は、置換及び非置換のアミノ、アジド、イミノ、アミド、ホスホリル(ホスホネート及びホスフィネートを含む)、スルホニル(スルフェート、スルホンアミド、スルファモイル、及びスルホネートを含む)、及びシリル基を含むことができ、エーテル、アルキルチオ、カルボニル(ケトン、アルデヒド、カルボキシレート、及びエステルを含む)、-CF3、-CN、及びその等価物も含みうる。例示的な置換アルキルは、以下に記載する。シクロアルキレンは、アルキル、アルケニル、アルコキシ、アルキルチオ、アミノアルキル、カルボニル置換アルキル、-CF3、-CN、及びその等価物で更に置換されうる。この内容はまた、アルケニレン及びアルキニレンに対しても等しく適用することができる。
アルキレン、アルケニレン、又はアルキニレンのような残基と共に使用される場合、用語「Cx～y」は、例えば、その鎖にx～y個の炭素原子を含有する残基を包含することを意図する。例えば、用語「Cx～yアルキレン」とは、その鎖にx～y個の炭素原子を含有する、置換又は非置換、直鎖又は分岐鎖のアルキレン基を指す。例えば、ジフルオロメチレン、2,2,2-トリフルオロエチレン等のようなハロアルキレン基を典型的に含むことを意味する。C0アルキレンとは、共有結合を指す。用語「C2～yアルケニレン」及び「C2～yアルキニレン」とは、置換又は非置換の不飽和脂肪族残基を指し、長さ及び可能な置換の定義は、アルキレンの定義で記載した通りに適用する。しかし、これは、各々が、少なくとも1つの二重又は三重結合を含有することを意味する。
用語「クリック化学反応」は、相補的な化学官能基、及び2つの分子が迅速且つ安定して共有結合を形成することができるように設計された化学反応を説明する、Scripps Research InstituteのK. Barry Sharplessにより導入された化学的な概念として使用される。クリック化学反応は、ある特定の反応を指さないが、このような迅速且つ安定な反応の概念を指す。任意の実施形態では、クリック化学反応は、モジュール式であり、広範囲であり、高い収率を得られ、わずかな副生物しか生成せず、立体特異的であり、生理学的に安定であり、熱力学的な駆動力(例えば、84kJ/mol超)で駆動し、及び/又は、高いアトムエコノミーを有する必要がある。いくつかの反応は、要件を満たしていることが知られている:
(1)Huisgen 1,3-双極性付加環化(例えば、Cu(I)触媒性付加環化反応、通常「クリック反応」と称される、Tornoe等、Journal of Organic Chemistry (2002) 67: 3057～3064頁を参照):銅及びルテニウムは、一般に触媒として使用される;
[Huisgen 1,3-双極性付加環化の模式図]
Figure 0007393810000016
(2)ディールズ-アルダー反応、例えば、正常電子要請型ディールズ-アルダー反応、及び逆電子要請型ディールズ-アルダー反応を含むが、本発明では、これらに限定されない、付加環化(例えば、歪み促進型付加環化(SPAAC));
[ディールズ-アルダー反応の模式図]
Figure 0007393810000017
[ディールズ-アルダー反応の例;TCO及びテトラジン]
Figure 0007393810000018
[歪み促進型付加環化の模式図]
Figure 0007393810000019
[歪み促進型付加環化の例;アジド及びDBCO]
Figure 0007393810000020
(3)エポキシド及びアジリジンのような小さく歪んだ環への求核付加;
(4)活性化したカルボニル基への求核付加;
(5)炭素-炭素の二重結合又は三重結合への付加。
[チオール及びアルケンの付加]
Figure 0007393810000021
本発明で使用される用語「クリック反応性官能基」とは、クリック化学反応に関与する官能基を指す。例えば、歪んだアルキン(例えば、シクロオクチン)は、クリック反応性官能基に相当する。一般に、クリック化学反応は、少なくとも2つの分子を必要とし、その各々は、互いに相補的なクリック反応性官能基を含有する。こうして、互いとの反応性を有するクリック反応性官能基の対は、多くの場合、本発明では「パートナークリック反応性官能基」と称す。シクロオクチンのアジドとの歪み促進型付加環化では、例えば、アジドは、シクロオクチン及び他のアルキンに対するパートナークリック反応性官能基である。本発明で使用される例示的なクリック反応性官能基とは、末端アルキン、アジド、歪んだアルキン、ジエン、ジエノフィル、trans-シクロオクテン、アルケン、チオール、及びテトラジンが挙げられるが、本発明では、これらに限定されない。他のクリック反応性官能基は、当業者に知られている。
本発明で使用される用語「脱離基」は、当業者に周知されるのと同じ概念を有し(Advanced Organic Chemistry: reactions, mechanisms and structure-Jerry March、John Wiley、及びSons編の第4版; 1992年、351～357頁)、任意の反応剤と結合する化学官能基を指し、これは、反応剤を置換反応(substitution reaction、displacement reaction)、例えば、求核置換反応に供する場合に移動する。良好な脱離基とは、求核置換反応の間に容易に移動する脱離基を指す。例示的な良好な脱離基とは、ハロゲン(F、Cl、Br、及びI)、トシレート、メシレート、トリフレート、アセテート、トリフルオロメチルアセテート、カンファースルホネート、2-チオキソベンゾ[d]チアゾール-3(2H)-イル、N-ヒドロスクシンイミド、N-アリールオキシド、並びに、1つ又は複数の電子求引基(EWG)で置換されるアリールオキシドが挙げられるが、本発明では、これらに限定されない。例えば、1つ又は複数の電子求引基(EWG)で置換されるアリールオキシドは、2-ニトロフェノキシド、4-ニトロフェノキシド、2,4-ジニトロフェノキシド、ペンタフルオロフェノキシド、2-クロロ-4-ニトロフェノキシド、2,4-ジクロロフェノキシド、及び2,4,6-クロロフェノキシドを含み、電子求引基は、例えば、ハロゲン(F、Cl、Br、又はI)、-NO2、-CN、-C(O)(C1～6アルキル)、-C(O)(アリール)、-C(O)O(C1～6アルキル)、-C(O)O(アリール)等を含む。
本発明で使用される用語「インタラクトーム」とは、タンパク質間又はペプチド間にタンパク質-タンパク質相互作用(PPI)が存在する場合のタンパク質-タンパク質相互作用に関与するタンパク質又はペプチドを指す。例えば、シャペロンタンパク質及びそのパッセンジャータンパク質は、相互のインタラクトームである。「タンパク質-タンパク質相互作用」とは、2つ以上のタンパク質又はペプチド分子が、相互作用して、高い特異性を伴って互いに物理的に接触することを意味する。この場合、原因となる相互作用として、電磁力、水素結合、及び疎水性相互作用が挙げられるが、本発明では、これらに限定されない。
本発明で使用される用語「抗体インタラクトーム」とは、免疫グロブリンを含む抗体に対するインタラクトームを指す。例示的な抗体インタラクトームは、Table 1(表1)に列挙する。これらのうち、Fc-III等のペプチドは、免疫グロブリンのFcドメインに対する結合活性を有することが知られている。この場合、ペプチドもまた、「Fcインタラクトーム」と称される。
Figure 0007393810000022
Figure 0007393810000023
本発明によると、用語「抗体」とは、免疫グロブリン分子又はその断片を指す。免疫グロブリンは、一般に周知されており、ある特定の抗原に特異的に結合する能力を有する。しかし、本発明による抗体が、その断片も包含する概念であるので、抗体は、Fc断片の場合のように、ある特定の抗原への結合能を示す必要はない。天然に存在する免疫グロブリンに加えて、抗体はまた、全ての組換えタンパク質、融合タンパク質、キメラタンパク質、ヒト免疫グロブリン、非ヒト動物免疫グロブリン等を包含することを意図し、これらは同じ又は類似の構造を有する。
本発明によると、用語「コンジュゲート」とは、コンジュゲートパートナーが、共に共有結合を形成する場合に作製される不均一な分子を指す。共有結合は、好ましくは、クリック化学反応により形成することができる。用語「コンジュゲートパートナー」とは、コンジュゲートを形成することを意図する分子の各々を指す。この場合、コンジュゲーションを実施する意思のあるものが、ある特定の分子を任意の他の分子に結合させることを意図する場合、その特定の分子は、一般に、「標的分子」又は「標的タンパク質」と称することができ、任意の他の分子は、一般に、便宜上「カーゴ分子」又は「カーゴ部分」と称することができる。
本発明によると、用語「担体部分」とは、コンジュゲートを構成する分子、即ち、それに連結する分子の血清安定性を向上する、又は分子の半減期を延長するように機能する分子の一部を指す。担体部分として使用することができる分子は、関連分野で周知されている。担体部分の代表的な例として、アルブミン、ゼラチン、エラスチン(トロポエラスチンを含む)、エラスチン由来のポリペプチド(α-エラスチン及びエラスチン様ポリペプチド(ELP))、グリアジン、レグミン、ゼイン、ダイズタンパク質(例えば、ダイズタンパク質単離物(SPI))、乳タンパク質、ホエイタンパク質、ビリルビン等が挙げられるが、本発明では、これらに限定されない。
本発明によると、用語「蛍光部分」とは、蛍光のために使用される色素又は色素試薬を包含することを意図する。色素又は色素試薬として使用することができる分子は、関連分野で周知されている。蛍光部分の代表的な例は、Table 2(表2)に列挙されるが、本発明では、これらに限定されない(Immunotech-Coulter Corp.社カタログ、「Cytometry Monoclonal Reagent Guide」、8/95、3頁)。
Figure 0007393810000024
本発明によると、用語「薬物部分」とは、任意の疾患に対する治療効果を有する分子を指す。本発明による薬物部分は、任意の疾患に対して効果的であるとして当業者に知られているものを含む。典型的には、抗がん効果を有する薬物部分は、DM1、DM3、DM4、アブリン、リシンA、シュードモナス外毒素、コレラ毒素、ジフテリア毒素、腫瘍壊死因子、α-インターフェロン、β-インターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子、組織プラスミノゲン活性化因子、サイトカイン、アポトーシス誘導剤、抗血管新生剤、リンホカイン、タキサン、DNA-アルキル化剤、アントラサイクリン、ツブリシン類似体、デュオカルマイシン類似体、アウリスタチンE、アウリスタチンF、メイタンシノイド、反応性ポリエチレングリコール残基を含む細胞毒性剤、タクソン、サイトカラシンB、グラミシジンD、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、T.コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンD、1-ジヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシン、メソトレキセート、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、シタラビン、5-フルオロウラシルデカルバジン、メクロレタミン、チオテパ、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン、ロムスチン、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンC、シスプラチン、ダクチノマイシン、ブレオマイシン、アントラマイシン、カリケアミシン、アビラテロン、ベンダムスチン、ボルテゾミブ、カルボプラチン、カバジタキセル、ダサチニブ、ドセタキセル(doxetaxel)、エピルビシン、エルロチニブ、エベロリムス、ゲムシタビン、ゲフィチニブ、イダルビシン、イマチニブ、ヒドロキシ尿素、ラパチニブ、リュープロレリン、メルファラン、ネダプラチン、ニロチニブ、オキサリプラチン、パゾパニブ、ペメトレキセド、ピコプラチン、ロミデプシン、サトラプラチン、ソラフェニブ、ベムラフェニブ、スニチニブ、テニポシド、トリプラチン、及びビノレルビンを含むが、本発明は、これらに限定されない。
本発明によると、用語「放射性部分」とは、放射性同位体を含む部分を指す。放射性同位体の標識化は、画像診断及び放射線療法に有用である。代表的な放射性部分として、18F、11C、125I、123I、124I、131I、及び99mTcが挙げられるが、本発明では、これらに限定されない。
用語「薬学的に許容される担体」は、添加剤、賦形剤、又は補助剤を含むという意味で使用することができる。担体は、例えば、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリトリトール、マルチトール、デンプン、アカシアゴム、アルギネート、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、水、生理食塩水、緩衝剤、例としてPBS、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム、及び鉱物油からなる群から選択することができる。担体は、充填剤、抗凝集剤、滑沢剤、湿潤化剤、着香剤、乳化剤、保存剤、又はその組合せを含むことができる。
用語「薬学的に許容される塩」とは、プロテオーム及び本発明による化合物の生物学的効果及び特性が保存され、生物学的又は他の側面で望ましくないことはない塩を指す。多くの場合、プロテオーム及び本発明による化合物は、荷電した基、例えば荷電したアミノ及び/又はカルボニル基等の存在下で、酸性及び/又は塩基性塩を形成することができる。薬学的に許容される酸付加塩は、無機及び有機酸から調製することができ、薬学的に許容される塩基付加塩は、無機及び有機塩基から調製することができる。
用語「処置」とは、有益又は望ましい臨床転帰を得るためのアプローチを指す。本発明の目的のために、有益又は望ましい臨床転帰の非限定例として、症状の緩解、疾患の範囲の低下、疾患状態の安定化(即ち、増悪しない)、疾患の進行の遅延又は進行速度の低下、疾患状態の(部分的若しくは全面的な)改善又は時間的な緩解及び緩和、並びに検出可能か否かが挙げられる。処置は、全ての治療的処置、及び予防的又は防止的な方法を指す。処置は、予防されるべき障害、及び既に発症している障害に必要な処置を含む。疾患を「緩解すること」とは、疾患が処置されない場合と比較して、疾患状態の範囲及び/若しくは望ましくない臨床徴候が低下する、並びに/又は、疾患の進行の時間経過が、遅延若しくは伸長されることを意味する。
「治療有効量」(又は「有効量」)とは、対象又は患者に投与する場合、処置を達成するのに十分な活性成分、例えば本発明による薬剤の量を指す。従って、本発明による治療有効量の組成物を構成するものは、当業者により容易に決定することができる。視力治療の文脈では、「治療有効量」とは、眼疾患又は状態の処置に関連する1つ又は複数のパラメーターで客観的に測定できる変化を引き起こす量であり、これは、眼疾患又は状態に関連する1つ又は複数の遺伝子の発現の増減、アポトーシス又は他の細胞死の経路の誘導、症状の臨床的改善、異常な血管新生又は炎症の低減等を含む。当然のことながら、治療有効量は、処置されるある特定の対象及び状態、対象の体重及び年齢、疾患状態の重症度、選択されるある特定の化合物、続く投与スケジュール、投与時間の調整、投与の様式等に依存して変化することができ、これらの全ては、当業者により容易に決定することができる。併用療法の文脈では、治療有効量のある特定の活性成分を構成するものが、単独療法(即ち、活性成分として1つの化学物質を使用する処置レジメン)で投与される治療有効量の活性成分を構成するものと異なりうることは理解すべきである。
「対象」又は「患者」とは、本発明の分子により達成されうる処置を必要とする動物を指す。本発明に従って処置される動物は、脊椎動物を含む。動物の特に好ましい例として、哺乳動物、例えばウシ、イヌ、ウマ、ネコ、ヒツジ、ブタ、及び霊長類動物(ヒト及び非ヒト霊長類を含む)が挙げられる。
用語「約」又は「およそ」とは、基準の量(amount)、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、サイズ、量(quantity)、質量、又は長さに対して30、25、20、25、10、9、8、7、6、5、4、3、2、又は1%で変化する量(amount)、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、サイズ、量(quantity)、質量、又は長さを指す。
1. 抗体
本発明の記載が、本発明を理解する助けとなる、抗体の構造、学問的なシステム、及び生物学的作用の記載を提供することを意図することは理解すべきであり、本発明の権利の範囲にある抗体は、本発明の記載を限定することを意図しない。
抗体は、当該技術分野で公知の2つの重鎖及び2つの軽鎖からなる。抗体を、単純に機能的な側面で分ける場合、抗体は、軽鎖を含む断片抗原-結合可変領域(Fab)、及び重鎖の部分で構成される断片結晶性領域に分けられる。Fabは、抗原に結合するパラトープを含み、抗体が当該技術分野に公知の抗原に対する特異的な結合活性を有するのを可能にする領域を指す。Fcドメインが、細胞内のFc受容体(FcR)に対するリガンドであるので、免疫応答を誘導するのに重要な役割を担う。その上、Fcドメインは、抗体が細胞内に繰返し内在化するように新生児Fc受容体に結合することにより、抗体の半減期を延長するのに重要な役割を担う。
これらの事実から、抗体を標識化するいくつかの望ましい方向性を推定することが可能である。(1)第一に、抗体のパラトープから離間している位置で抗体を標識化するのが望ましい。標識化が、パラトープ又はパラトープに隣接する位置で実施される場合、抗原に対する抗体の結合親和性は、著しく低下しうる。(2)第二に、FcRnを含むFcRの認識部位から離間している位置で抗体を標識化するのが望ましい。標識化が、受容体の認識部位又は認識部位に隣接する位置で実施される場合、抗体の免疫応答を誘導する機能は、低下しうる、又は抗体の半減期は、短縮しうる。Fcドメインの結合活性モチーフの情報は、DeLano, W.L. (2000): Convergent Solutions to Binding at a Protein-Protein Interface; Science、287(5456)、1279～1283頁、及び、W. Lance Martin等(2001)、Molecular Cell, 第7巻、867～877頁、2001年4月で見出すことができる。
本発明では、抗体のFcドメインのアミノ酸配列を参照する場合、配列の番号は、別段記載がない限り、EUナンバリングシステムに従って番号付けられる。EUナンバリングシステムは、IgGの配列の調査後、Fcドメインに対する配列決定システムとして広く使用されており、Edelman GM等、The covalent structure of an entire gamma-G immunoglobulin molecule; Proc. Natl. Acad. Sci. USA.、1969年5月、63(1): 78～85頁に記載される通りである。
1.1. 望ましい標識部位の調査
抗体の標識部位は、標識部位、即ち、(1)パラトープから離間している部位;及び(2)FcRnを含むFcRの認識部位から離間している部位に対する基準を考慮して設計されうる。バイオコンジュゲーション反応で使用されるアミノ酸の例として、典型的には、リジン、システイン、及びチロシンが挙げられる。抗体のFcドメインに存在するリジン246(Lys246)及びリジン248(Lys248)は、全ての要件を満たす残基であるので、両方とも望ましい標識部位である。Lys246及びLys248残基を含むFcドメインの配列は、GPSVFLFPPKPKDTLMIであり、配列、及びEUナンバリングシステムに従って番号付けられる配列の番号は、図1に示す(図1、配列番号1)。
具体的な実施形態では、本発明による抗体は、配列番号1の配列、又はその誘導体を含みうる。その上、本発明による抗体は、リジン246が置換されている配列番号1の誘導体を含みうる。加えて、本発明による抗体は、リジン248が置換されている配列番号1の誘導体を含みうる。更に、本発明による抗体は、リジン246及び248が置換されている配列番号1の誘導体を含みうる。
配列番号1の配列、又はその誘導体は、許容される範囲で変異した配列を含む。具体的な実施形態では、変異した配列は、配列番号1の配列、又はその誘導体に対して、およそ90%、およそ85%、およそ80%、およそ75%、又はおよそ70%以上である相同性を有しうる。以下で説明される具体的な実施形態では、式7-1～7-3、8-1～8-3、及び10-1～10-3で表される配列番号1の誘導体がまた、許容される範囲で変異した配列も含むことは理解すべきである。
図2は、リジン246及び248を含む、Fcドメインのリジン残基の位置を示す。
2. リンカー(R1'-L1)
本発明は、抗体を標識化するのに使用することができる新規の化合物を開示する。便宜上、このような化合物は、本明細書では、リンカーと称し、記号「R1'-L1」で示される。
本発明は、以下の式1:
Figure 0007393810000025
(式中、R1'は、第1の化学官能基であり、
D1は、任意のアルキレン、アルケニレン、又はアルキニレンであり、
X1は、炭素よりも電気陰性である元素であり、
D2は、任意のアルキレン、アルケニレン、又はアルキニレンであり、
X2は、炭素よりも電気陰性である元素であり、
R2'は、第2の化学官能基である)
の構造を有する化合物を提供する。
式1では、D1に接続するカルボニル基は、第1のカルボニル基を指す。その上、D2に接続するカルボニル基は、第2のカルボニル基を指す。
具体的な実施形態では、R1'は、クリック反応性官能基を含むことができる。その上、クリック反応性官能基は、アルキン、アジド、歪んだアルキン、ジエン、ジエノフィル、アルケン、チオール、及びテトラジンから選択される1つ又は複数を含みうる。更に、クリック反応性官能基は、アジド、又は歪んだアルキンから選択することができる。更に、クリック反応性官能基は、アジド、又はジベンゾシクロオクチン-アミンから選択することができる。加えて、クリック反応性官能基は、ジエン、又はジエノフィルから選択することができる。更に、クリック反応性官能基は、テトラジン、又はノルボルネンから選択することができる。或いは、クリック反応性官能基は、テトラジン、又はtrans-シクロオクテンから選択することができる。加えて、R1'は、2つ以上のクリック反応性官能基を含むことができる。
他の具体的な実施形態では、R1'は、担体部分、蛍光部分、薬物部分、又は放射性部分を含みうる。その上、R1'は、薬物部分を含みうる。加えて、R1'は、VCリンカーを含みうる。他の具体的な実施形態では、R1'は、パラトープを含む抗体又はその類似体を含みうる。
具体的な実施形態では、D1は、共有結合、C1～4アルキレン、C2～4アルケニレン、C2～4アルキニレン、及びC3～8シクロアルキレンから選択される任意の1つを含みうる。その上、D1は、-CH2OCH2-でありうる。加えて、D1は、共有結合でありうる。D1が、共有結合である場合、R1'及び第1のカルボニル基の炭素は、互いに直接接続している。以下、化合物の構造を説明する場合、全てのアルキレン、アルケニレン、アルキニレン、及びシクロアルキレンは、それぞれ、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニレン、ヘテロアルキニレン、及びヘテロシクロアルキレンを含むことを意図し、その内容はまた、節「定義」で説明される。
具体的な実施形態では、X1は、NR1、S、又はOでありえ、R1は、H、ハロゲン、又は置換若しくは非置換C1～3アルキレンでありうる。その上、X1は、Sでありうる。X1は、第1のカルボニル基の炭素から電子を引き付けて、第1のカルボニル基を活性化することができる。
具体的な実施形態では、D2は、C1～7アルキレン、C2～7アルケニレン、C2～7アルキニレン、及びC3～8シクロアルキレンから選択される任意の1つを含みうる。その上、D2は、C1～2アルキレンでありうる。更に、D2は、メチレンでありうる。
具体的な実施形態では、X2は、NR1、S、又はOでありえ、R1は、H、ハロゲン、又は置換若しくは非置換C1～3アルキレンでありうる。その上、X2は、Oでありうる。X2は、第2のカルボニル基の炭素から電子を引き付けて、第2のカルボニル基を活性化することができる。
具体的な実施形態では、R2'は、ハロゲン、N-スクシンイミド、p-ニトロフェニル、又はペンタフルオロフェニルでありうる。
具体的な実施形態では、R2'及びX2は一緒に、脱離基を形成することができる。例えば、X2は、Oでありえ、R2'は、N-スクシンイミド、p-ニトロフェニル、又はペンタフルオロフェニルでありうる。その上、R2'は、N-スクシンイミドでありうる。良好な脱離基が、第2のカルボニル基と接続する場合、第2のカルボニル基の反応性は、向上することができる。例えば、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(NHSエステル)は、非常に高い反応性を示すことが知られている。
本発明は、以下の式1-2:
Figure 0007393810000026
(式中、R1'は、第1の化学官能基であり、
D1は、任意のアルキレン、アルケニレン、又はアルキニレンであり、
R2'は、第2の化学官能基である)
の構造を有する化合物を提供する。
具体的な実施形態では、R1'は、クリック反応性官能基を含むことができる。その上、クリック反応性官能基は、アルキン、アジド、歪んだアルキン、ジエン、ジエノフィル、アルケン、チオール、及びテトラジンから選択される1つ又は複数を含みうる。更に、クリック反応性官能基は、アジド、又は歪んだアルキンから選択することができる。更に、クリック反応性官能基は、アジド、又はジベンゾシクロオクチン-アミンから選択することができる。加えて、クリック反応性官能基は、ジエン、又はジエノフィルから選択することができる。更に、クリック反応性官能基は、テトラジン、又はノルボルネンから選択することができる。或いは、クリック反応性官能基は、テトラジン、又はtrans-シクロオクテンから選択することができる。加えて、R1'は、2つ以上のクリック反応性官能基を含むことができる。
他の具体的な実施形態では、R1'は、担体部分、蛍光部分、薬物部分、又は放射性部分を含みうる。その上、R1'は、薬物部分を含みうる。加えて、R1'は、VCリンカーを含みうる。他の具体的な実施形態では、R1'は、パラトープを含む抗体又はその類似体を含みうる。
具体的な実施形態では、D1は、C1～7アルキレン、C2～7アルケニレン、C2～7アルキニレン、及びC3～8シクロアルキレンから選択される任意の1つを含みうる。その上、D1は、C1～2アルキレンでありうる。更に、D1は、メチレンでありうる。
具体的な実施形態では、R2'及びOは一緒に脱離基を形成することができる。この場合、R2'は、N-スクシンイミド、p-ニトロフェニル、又はペンタフルオロフェニルでありうる。その上、R2'は、N-スクシンイミドでありうる。
具体的な実施形態では、式1-2で表される化合物は、以下の式1-3:
Figure 0007393810000027
の構造を有しうる。
2.1. 第1のクリック反応性官能基を含むリンカー(H1-L1)
本発明は、以下の式2:
Figure 0007393810000028
(式中、H1は、第1のクリック反応性官能基であり、
D1は、任意のアルキレン、アルケニレン、又はアルキニレンであり、
X1は、炭素よりも電気陰性である元素であり、
D2は、任意のアルキレン、アルケニレン、又はアルキニレンであり、
X2は、炭素よりも電気陰性である元素であり、
R2'は、第2の化学官能基である)
の構造を有する化合物を提供する。式2の構造を有するリンカーは、本発明では、「第1のクリック反応性官能基を含むリンカー」と称し、記号「H1-L1」で示される。
式2では、D1に接続するカルボニル基は、第1のカルボニル基を指す。その上、D2に接続するカルボニル基は、第2のカルボニル基を指す。
具体的な実施形態では、H1は、アルキン、アジド、歪んだアルキン、ジエン、ジエノフィル、アルケン、チオール、及びテトラジンから選択される任意の1つを含みうる。更に、H1は、アジド、又は歪んだアルキンでありうる。更に、H1は、アジド、又はジベンゾシクロオクチン-アミンでありうる。加えて、H1は、ジエン、又はジエノフィルでありうる。更に、H1は、テトラジン、又はノルボルネンでありうる。或いは、H1は、テトラジン、又はtrans-シクロオクテンでありうる。
具体的な実施形態では、D1は、共有結合、C1～4アルキレン、C2～4アルケニレン、C2～4アルキニレン、及びC3～8シクロアルキレンから選択される任意の1つを含みうる。その上、D1は、-CH2OCH2-でありうる。加えて、D1は、共有結合でありうる。
具体的な実施形態では、X1は、NR1、S、又はOでありえ、R1は、H、ハロゲン、又は置換若しくは非置換C1～3アルキレンでありうる。その上、X1は、Sでありうる。
具体的な実施形態では、D2は、C1～7アルキレン、C2～7アルケニレン、C2～7アルキニレン、及びC3～8シクロアルキレンから選択される任意の1つを含みうる。その上、D2は、C1～2アルキレンでありうる。更に、D2は、メチレンでありうる。
具体的な実施形態では、X2は、NR1、S、又はOでありえ、R1は、H、ハロゲン、又は置換若しくは非置換C1～3アルキレンでありうる。その上、X2は、Oでありうる。
具体的な実施形態では、R2'は、ハロゲン、N-スクシンイミド、p-ニトロフェニル、又はペンタフルオロフェニルでありうる。
具体的な実施形態では、R2'及びX2は一緒に、脱離基を形成することができる。例えば、X2は、Oでありえ、R2'は、N-スクシンイミド、p-ニトロフェニル、又はペンタフルオロフェニルでありうる。その上、R2'は、N-スクシンイミドでありうる。
具体的な実施形態では、式2で表される化合物は、以下の式2-1～2-3:
Figure 0007393810000029
から選択される任意の1つの構造を有しうる。
2.2. 置換反応が起きる位置は、第1のカルボニル基と第2のカルボニル基との間の反応性の差により具体的に決定することができる
式1及び2のリンカー、及びその下位の例が設計される場合、置換反応に関する部位は、X1、X2、及びR2'の設計に基づいて特定することができる。
本発明に開示されるリンカーは、活性化した第1及び/又は第2のカルボニル基の間で起こる置換反応により、R1'を標的分子に転移させるように機能する。このような置換反応は、以下のスキーム1に模式的に示す。
Figure 0007393810000030
スキーム1では、標的分子は、便宜上、「Nu:」で示す。求核分子として働くNu:は、非共有電子対を有するので、第1のカルボニル基及び/又は第2のカルボニル基と求核性アシル置換反応を引き起こして、リンカーとの結合を形成する。求核性アシル置換反応では、カルボニル基の反応性は、脱離基の塩基性により決定することができる。従って、カルボニル基の反応性は、カルボキシレート、アミド、カルボン酸、エステル、チオエステル、及びアシルホスフェートの順で増加することが知られている。その上、NHSエステル等のようなカルボニル基は、カルボニル基が非常に安定な脱離基を形成するので、高い反応性を有することが知られている。
具体的な実施形態では、X1及びX2は、炭素よりも電気陰性である元素でありうる。その上、X1及びX2は、NR1、S、又はOでありえ、R1は、H、ハロゲン、又は置換若しくは非置換C1～3アルキレンでありうる。X1及びX2が、それらに結合する残基と共に、脱離基を形成する場合、カルボニル基は、活性化することができる。
この場合、カルボニル基の活性化は、任意で、Nu:が、i)優先的に第1のカルボニル基と反応する、又はii)優先的に第2のカルボニル基と反応することを可能にする。反応のこの傾向は、第1のカルボニル基と第2のカルボニル基との間の反応性の差に依存して決定することができる。例えば、X1を含む脱離基の塩基性が、X2を含む脱離基の塩基性より低い場合、第1のカルボニル基が、最初に反応しうる。別の実施形態では、X2を含む脱離基の塩基性が、X1を含む脱離基の塩基性より低い場合、第2のカルボニル基が、最初に反応しうる。
好ましい実施形態では、第2のカルボニル基の反応性は、好ましくは、本発明によるリンカーにおいて第1のカルボニル基の反応性より高い。本発明によると、選択的反応は、第2のカルボニル基に接続するX2-R2'が良好な脱離基を形成するのを可能にすることにより達成され、第1のカルボニル基が、軽度の反応性を示す、アミド、チオエステル、エステル等であるように設計された。例えば、式1-3のリンカーの場合、第2のカルボニル基は、NHSエステルでありうるので、第1のカルボニル基(チオエステル)より早く反応することができる。
出願番号US 2018/0141976 A1及びWO 2018/199337 A1に開示される先行技術は、第1の化学官能基を抗体に転移させるための薬剤の形態の点で本発明と類似しているが(以下の第4節を参照)、架橋剤が2つのNHSエステルを含む点で本発明と異なる。架橋剤の2つのカルボニル基は、同じ反応性を有し、化学官能基を転移させるための所望の薬剤を高収率で調製することは難しい。その上、架橋剤は、NHSエステルの高い反応性により、2つのSSFIと反応する確率が高い。本発明によると、このような課題は、軽度の反応性を有する、チオエステル等である第1のカルボニル基を設計することにより解決している。
3. 部位特異的抗体インタラクトーム(SSAI)
本発明によると、標識化される分子を抗体のある特定の部位に密着させるための新規のペプチドが開示される。便宜上、このようなペプチドは、本明細書では、部位特異的抗体インタラクトームと称し、記号「SSAI」で示される。
本発明により提供されるSSAIは、抗体のある特定の部位に対する結合活性を有しうる。
具体的な実施形態では、SSAIは、抗体のFabドメインに対する結合活性を有しうる。この場合、SSAIは、好ましくは、抗体のパラトープから離間している部位に対する結合活性を有しうる。
具体的な実施形態では、SSAIは、抗体のFcドメインに対する結合活性を有しうる。この場合、SSAIは、好ましくは、抗体のFcRn結合部位、又は抗体のFcRn結合部位に影響を及ぼす抗体の残基から離間している部位に対する結合活性を有しうる。
3.1. 部位特異的Fcインタラクトーム(SSFI)
SSAIでは、Fcドメインに対する特異的な結合活性を有するペプチドは、本明細書では、「部位特異的Fcインタラクトーム」と称し、記号「SSFI」で示される。
具体的な実施形態では、SSFIは、以下の式3:
[式3]
(Xaa)2-H-Xa1-G-Xa2-L-V-Xa3(配列番号3)
[式中、各Xaaは、独立して、システイン以外の任意のアミノ酸であり、
Hは、ヒスチジンであり、Gは、グリシンであり、Xa2は、グルタミン酸又はアスパラギンであり、Lは、ロイシンであり、Vは、バリンであり、Xa3は、トリプトファン、ナフチルアラニン、及びフェニルアラニンから選択され、
Xa1は、
Figure 0007393810000031
(式中、D3は、共有結合又はC1～3アルキレンであり、X3は、NH2、OH、又はSHである)である]
で表されるアミノ酸配列を含みうる。論文「Dias, R. L. A.等(2006)、Protein Ligand Design: From Phage Display to Synthetic Protein Epitope Mimetics in Human Antibody Fc-Binding Peptidomimetics; Journal of the American Chemical Society、128(8)、2726～2732頁;及び、DeLano, W.L.等、Convergent solutions to binding at a protein-protein interface; Science 2000年、287、1279～1283頁」においてFcドメインに対する結合活性を有すると見出された配列である、配列AWHLGELVW(配列番号2)の類似体として、これは、Fcドメインに対する結合活性を有する。本発明によるFc結合活性のモチーフは、以下のような特徴を有する:1)第一に、Fc結合活性を有する重要な残基が特定される。2)モチーフはまた、配列番号2の第4のロイシンを、遊離電子対を有するXa1に変化させることにより、リンカーとの求核置換反応を可能にするように設計される。(X)nは、n個のXからなることを意味し、(X)n-mは、n個以上m個以下のXからなることを意味する。以下、D3に接続する炭素は、「ベータ炭素(β炭素)」と称す。
その上、式3のアミノ酸配列は、以下の式3-1:
[式3-1]
A-W-H-Xa1-G-Xa2-L-V-Xa3(配列番号4)
[式中、Aは、アラニンであり、Hは、ヒスチジンであり、Gは、グリシンであり、Xa2は、グルタミン酸又はアスパラギンであり、Lは、ロイシンであり、Vは、バリンであり、Xa3は、トリプトファン、ナフチルアラニン、及びフェニルアラニンから選択され、
Xa1は、
Figure 0007393810000032
(式中、D3は、共有結合又はC1～3アルキレンであり、X3は、NH2、OH、又はSHである)である]
で表される構造を有しうる。式3及び3-1では、X3は、NH2でありうる。或いは、Xa2は、グルタミン酸でありうる。或いは、Xa3は、トリプトファンでありうる。
式3のアミノ酸配列の各々及びその下位の例を含むペプチドが、内部残基が互いに接続する環状ペプチド形態である場合、ペプチドは、より良好な結合活性を有することが知られている。本発明は、式3のアミノ酸配列を含む環状ペプチドを提供する。
本発明は、以下の式4-1:
[式4-1]
LP-(Xaa)2-H-Xa1-G-Xa2-L-V-Xa3-DP(配列番号5)
[式中、N末端LP及びDPは、D-プロリン-L-プロリンテンプレートを形成し、
各Xaaは、独立して、システイン以外の任意のアミノ酸であり、Hは、ヒスチジンであり、Gは、グリシンであり、Xa2は、グルタミン酸又はアスパラギンであり、Lは、ロイシンであり、Vは、バリンであり、Xa3は、トリプトファン、ナフチルアラニン、及びフェニルアラニンから選択され、
Xa1は、
Figure 0007393810000033
(式中、D3は、共有結合又はC1～3アルキレンであり、X3は、NH2、OH、又はSHである) である]
の構造を有する環状ペプチドを提供する。
具体的な実施形態では、X3は、NH2でありうる。具体的な実施形態では、(X)2は、AWでありうる。具体的な実施形態では、Xa2は、グルタミン酸でありうる。具体的な実施形態では、Xa3は、トリプトファンでありうる。
本発明は、以下の式4-2:
[式4-2]
(Xaa)1-3-C-(Xaa)2-H-Xa1-G-Xa2-L-V-Xa3-C-(Xaa)1-3(配列番号6)
[式中、各Xaaは、独立して、システイン以外の任意のアミノ酸であり、
Cは、システインであり、Hは、ヒスチジンであり、Gは、グリシンであり、Xa2は、グルタミン酸又はアスパラギンであり、Lは、ロイシンであり、Vは、バリンであり、Xa3は、トリプトファン、ナフチルアラニン、及びフェニルアラニンから選択され、
Xa1は、
Figure 0007393810000034
(式中、D3は、共有結合又はC1～3アルキレンであり、X3は、NH2、OH、又はSHである)である]
の構造を有する環状ペプチドを提供する。
具体的な実施形態では、ペプチドは、13個以上17個以下のアミノ酸残基からなりうる。
具体的な実施形態では、N末端から2～4個のアミノ酸に位置するシステイン、及びC末端から2～4個のアミノ酸に位置するシステインは、任意で、互いに接続しうる。
具体的な実施形態では、X3は、NH2でありうる。具体的な実施形態では、(X)2は、AWでありうる。具体的な実施形態では、Xa2は、グルタミン酸でありうる。具体的な実施形態では、Xa3は、トリプトファンでありうる。
具体的な実施形態では、N末端(X)1-3を構成する残基の1つ及びC末端(X)1-3を構成する残基の1つは、互いに結合することができる。具体的な一実施形態では、式4-2のペプチドは、以下の式4-3:
[式4-3]
LP-D-C-(Xaa)2-H-Xa1-G-Xa2-L-V-Xa3-C-T-DP(配列番号7)
(式中、N末端LP及びDPは、D-プロリン-L-プロリンテンプレートを形成する)
の構造を有しうる。
別の具体的な実施形態では、式4-2のペプチドは、以下の式4-4:
[式4-4]
C-D-C-(Xaa)2-H-Xa1-G-Xa2-L-V-Xa3-C-T-C(配列番号8)
(式中、N末端システイン及びC末端システインは、互いに接続しうる)
の構造を有しうる。
本発明は、以下の式4-5:
[式4-5]
D-C-(Xaa)2-H-Xa1-G-Xa2-L-V-Xa3-C-T(配列番号9)
[式中、Dは、アスパラギン酸であり、Tは、スレオニンであり、
各Xaaは、独立して、システイン以外の任意のアミノ酸であり、
Cは、システインであり、Hは、ヒスチジンであり、Gは、グリシンであり、Xa2は、グルタミン酸又はアスパラギンであり、Lは、ロイシンであり、Vは、バリンであり、Xa3は、トリプトファン、ナフチルアラニン、及びフェニルアラニンから選択され、
Xa1は、
Figure 0007393810000035
(式中、D3は、共有結合又はC1～3アルキレンであり、X3は、NH2、OH、又はSHである)である]
の構造を有する環状ペプチドを提供する。
具体的な実施形態では、ペプチドは、13個以上17個以下のアミノ酸残基からなりうる。
具体的な実施形態では、N末端から2個のアミノ酸に位置するシステイン、及びC末端から2個のアミノ酸に位置するシステインは、任意で、互いに接続しうる。具体的な実施形態では、X3は、NH2でありうる。具体的な実施形態では、(X)2は、AWでありうる。具体的な実施形態では、Xa2は、グルタミン酸でありうる。具体的な実施形態では、Xa3は、トリプトファンでありうる。
具体的な実施形態では、式4-5は、以下の式4-6:
[式4-6](配列番号10)
D-C-A-W-H-Xa1-G-E-L-V-W-C-T(配列番号10)
(式中、Aは、アラニンであり、Eは、グルタミン酸である)
と同一でありうる。
式4-1～4-6の構造を有するペプチドは、抗体に対する結合活性を有しうる。その上、ペプチドは、免疫グロブリンG(IgG)に対する結合活性を有しうる。加えて、ペプチドは、抗体のFcドメインに対する結合活性を有しうる。
具体的な実施形態では、本発明によるSSFIのN末端は、スクシニル化されうる。具体的な実施形態では、本発明によるSSFIは、そのN末端(X)1-3で、極性アミノ酸残基を含みうる。他の具体的な実施形態では、本発明によるSSFIは、そのC末端(X)1-3で、極性アミノ酸残基を含みうる。この場合、極性アミノ酸残基は、酸性アミノ酸及び塩基性アミノ酸を含む。その上、極性アミノ酸残基は、グルタミン酸又はアスパラギン酸を含みうる。
3.2. 本発明による部位特異的Fcインタラクトームは、特異的なトポロジーで、抗体のFcドメインと共に配置されうる。
本内容では、式4-6の化合物は、本発明を理解する助けとなる一例として提供されるが、本発明の範囲は、これらに限定されない。以下の説明がまた、式3、3-1、及び4-1～4-6の化合物に適用され、式4-6の化合物のみが、便宜上、一例として提供されることに留意されたい。
前述の通り、本発明によるSSFIは、抗体のFcドメインに対する結合活性を有する。この場合、SSFIは、アミノ酸残基間の相互作用により、特異的なトポロジーで、Fcドメインと共に配置されうる。本発明によるSSFI配列とFcドメインとの間の代表的な相互作用として、(1)Fcドメインのヒスチジン433とのSSFIの塩結合、(2)アスパラギン434とのSSFIの水素結合、(3)グルタミン酸380とのSSFIの塩結合、(4)アルギニン255とのSSFIの塩結合等が挙げられる。このように形成されるこれらの相互作用及び特異的なトポロジーは、当該技術分野で既に知られている調査結果から決定することができる(DeLano, W.L.等、Convergent solutions to binding at a protein-protein interface、Science 2000年、287、1279～1283頁を参照)。
本発明によるSSFIが設計される場合、Fcドメインとの安定なトポロジーを形成することがSSFIには重要である。これは、本発明による第1の化学官能基を抗体に転移させるための薬剤、及びこれを使用する標識化の過程が、調査で見出されたSSFIとFcドメインとの間のトポロジーに基づいて設計されるからである(以下の第5.2節、第5.3節、及び第5.4節を参照)。SSFIとFcドメインとの間の相互作用が、SSFIの設計の間に不安定になってこれらの分子間のトポロジーを妨害する場合、相互作用が標識化の過程で悪影響を及ぼす可能性があるので好ましくない。
設計原理の一実施形態は、例示的な化合物について説明する。式4-6で表されるSSFIは、以下の構造:
[式4-6]
D-C-A-W-H-Xa1-G-E-L-V-W-C-T(配列番号10)
を有する。
論文のデータに基づく配列番号10に示すSSFIとFcドメインとの間のトポロジーをシミュレートした結果等は、図3及び図4に示す(DeLano, W.L.等、Convergent solutions to binding at a protein-protein interface; Science 2000年、287、1279～1283頁を参照)。この場合、SSFIの5位のヒスチジン残基は、Fcドメインのグルタミン酸380と塩結合を形成し、この塩形成が、SSFIとFcドメインとの間のトポロジーで著しい効果を有することを示す(図4の点線を参照)。従って、ヒスチジン残基、及びその位置が、SSFIの設計の間に変化しないことが望ましい(式3、3-1、及び4-1～4-6の残基Xa1の隣の「H」を参照)。加えて、グルタミン酸8が、電気陰性度を示す残基であるので、Fcドメインのアルギニン255と塩結合を形成することを確認したが、これは、電気陽性度を示すので、SSFIとFcドメインとの間のトポロジーで著しい効果を発揮する(図4の点線を参照)。従って、対応する残基は、好ましくは、グルタミン酸に相当しうる酸性アミノ酸であり、アスパラギンと置き換わることができる(式3、式3-1、及び4-1～4-6の残基Xa2を参照)。アミノ酸残基が、他のアミノ酸残基と置き換わる、又は任意の官能基で置換される場合、これは、分子間相互作用に対して効果を有するので、SSFIとFcドメインとの間のトポロジーに対して効果を発揮する。
加えて、配列番号10の配列の7位のグリシンは、SSFIの屈曲構造を形成する必要がある小さいアミノ酸である。従って、グリシン残基、及びその位置が、SSFIの設計の間に変化しないことが望ましい(式3、3-1、及び4-1～4-6の残基Xa1と残基Xa2との間の「G」を参照)。
図5は、Fcドメインのリジン残基とSSFIとの間のトポロジー示す。トポロジーに基づいて、残基Xa1に最近接して位置するFcドメインのリジン残基は、リジン246及び248であることが分かる(図5)。
リジン246のアミン基とXa1のβ炭素との間の距離を測定した。結果として、リジンの側鎖を構成する結合が回転するので、最小距離は、およそ11.668Å(以下、「D246,最小（D246,min）」と称す)であると測定され、最大距離は、およそ20.765Å(以下、「D246,最大（D246,max）」と称す)であると測定されることを確認した(図6)。
リジン248のアミン基とXa1のβ炭素との間の距離を測定した。結果として、リジンの側鎖を構成する結合が回転するので、最小距離は、およそ6.723Å(以下、「D248,最小（D248,min）」と称す)であると測定され、最大距離は、およそ16.208Å(以下、「D248,最大（D248,max）」と称す)であると測定されることを確認した(図7)。
以下の第5.3節に記載される通り、距離関係は、リンカー及びSSFI、並びに第1の化学官能基を抗体に転移させるための薬剤の設計において、重要な考慮事項でありうる。
4. 第1の化学官能基を抗体に転移させるための薬剤;R1'-L1及びSSAIのコンジュゲート(R1'-L2-SSAI)
本発明によると、第1の化学官能基を抗体に転移させるための薬剤が開示される。このような化合物は、本明細書では、記号「R1'-L2-SSAI」で示される。化合物はまた、その構造に依存する、R1'-L1及びSSAIのコンジュゲート(R1'-L2-SSAIコンジュゲート)とも称される。
本発明は、以下の式5:
Figure 0007393810000036
(式中、R1'は、第1の化学官能基であり、
D1は、任意のアルキレン、アルケニレン、又はアルキニレンであり、
X1は、炭素よりも電気陰性である元素であり、
D2は、任意のアルキレン、アルケニレン、又はアルキニレンであり、
D3は、共有結合又はC1～3アルキレンであり、
X3は、NH、O、又はSであり、
SSAIは、部位特異的抗体インタラクトームである)
の構造を有するR1'-L2-SSAIを提供する。
具体的な実施形態では、R1'は、クリック反応性官能基を含むことができる。その上、クリック反応性官能基は、アルキン、アジド、歪んだアルキン、ジエン、ジエノフィル、アルケン、チオール、及びテトラジンから選択される1つ又は複数を含みうる。更に、クリック反応性官能基は、アジド、又は歪んだアルキンから選択することができる。更に、クリック反応性官能基は、アジド、又はジベンゾシクロオクチン-アミンから選択することができる。加えて、クリック反応性官能基は、ジエン、又はジエノフィルから選択することができる。更に、クリック反応性官能基は、テトラジン、又はノルボルネンから選択することができる。或いは、クリック反応性官能基は、テトラジン、又はtrans-シクロオクテンから選択することができる。加えて、R1'は、2つ以上のクリック反応性官能基を含むことができる。
他の具体的な実施形態では、R1'は、担体部分、蛍光部分、薬物部分、又は放射性部分を含みうる。その上、R1'は、薬物部分を含みうる。加えて、R1'は、VCリンカーを含みうる。他の具体的な実施形態では、R1'は、パラトープを含む抗体又はその類似体を含みうる。
具体的な実施形態では、D1は、共有結合、C1～4アルキレン、C2～4アルケニレン、C2～4アルキニレン、及びC3～8シクロアルキレンから選択される任意の1つを含みうる。その上、D1は、-CH2OCH2-でありうる。加えて、D1は、共有結合でありうる。
具体的な実施形態では、X1は、NR1、S、又はOでありえ、R1は、H、ハロゲン、又は置換若しくは非置換C1～3アルキレンでありうる。その上、X1は、Sでありうる。
具体的な実施形態では、D2は、C1～7アルキレン、C2～7アルケニレン、C2～7アルキニレン、及びC3～8シクロアルキレンから選択される任意の1つを含みうる。その上、D2は、C1～2アルキレンでありうる。更に、D2は、メチレンでありうる。
具体的な実施形態では、X3は、NHでありうる。
具体的な実施形態では、SSAIは、Fabに対する結合活性を有するペプチド配列でありうる。他の具体的な実施形態では、SSAIは、Fcドメインに対する結合活性を有するペプチド配列でありうる。
式5のSSAIが、SSFIである場合、これは、記号「R1'-L2-SSFI」で示される。本発明によるR1'-L2-SSFIは、本発明によるSSFIのXa1のR1'-L1の第2のカルボニル基との求核置換反応により生成される(以下の第4-2節及びスキーム2を参照)。従って、本発明によるR1'-L2-SSFIは、式3、式3-1、及び式4-1～式4-6のSSFIのXa1が、(Xa1)'で置換されるものを含むが、本発明では、以下の具体的なその実施形態に限定されない。
本発明は、以下の式5-1:
[式5-1]
(Xaa)2-H-(Xa1)'-G-Xa2-L-V-Xa3(配列番号11)
[式中、各Xaaは、独立して、システイン以外の任意のアミノ酸であり、
Hは、ヒスチジンであり、Gは、グリシンであり、Xa2は、グルタミン酸又はアスパラギンであり、Lは、ロイシンであり、Vは、バリンであり、Xa3は、トリプトファン、ナフチルアラニン、及びフェニルアラニンから選択され、
(Xa1)'は、
Figure 0007393810000037
(式中、R1'は、第1の化学官能基であり、
D1は、任意のアルキレン、アルケニレン、又はアルキニレンであり、
X1は、炭素よりも電気陰性である元素であり、
D2は、任意のアルキレン、アルケニレン、又はアルキニレンであり、
D3は、共有結合又はC1～3アルキレンであり、
X3は、NH、O、又はSである)である]
のアミノ酸配列を含む、R1'-L2-SSFIを提供する。
具体的な実施形態では、R1'は、クリック反応性官能基を含むことができる。その上、クリック反応性官能基は、アルキン、アジド、歪んだアルキン、ジエン、ジエノフィル、アルケン、チオール、及びテトラジンから選択される1つ又は複数を含みうる。更に、クリック反応性官能基は、アジド、又は歪んだアルキンから選択することができる。更に、クリック反応性官能基は、アジド、又はジベンゾシクロオクチン-アミンから選択することができる。加えて、クリック反応性官能基は、ジエン、又はジエノフィルから選択することができる。更に、クリック反応性官能基は、テトラジン、又はノルボルネンから選択することができる。或いは、クリック反応性官能基は、テトラジン、又はtrans-シクロオクテンから選択することができる。加えて、R1'は、2つ以上のクリック反応性官能基を含むことができる。
他の具体的な実施形態では、R1'は、担体部分、蛍光部分、又は薬物部分を含みうる。その上、R1'は、VCリンカーを含みうる。加えて、R1'は、放射性部分を含みうる。その上、R1'は、薬物部分を含みうる。他の具体的な実施形態では、R1'は、パラトープを含む抗体又はその類似体を含みうる。
具体的な実施形態では、D1は、共有結合、C1～4アルキレン、C2～4アルケニレン、C2～4アルキニレン、及びC3～8シクロアルキレンから選択される任意の1つを含みうる。その上、D1は、-CH2OCH2-でありうる。加えて、D1は、共有結合でありうる。
具体的な実施形態では、X1は、NR1、S、又はOでありえ、R1は、H、ハロゲン、又は置換若しくは非置換C1～3アルキレンでありうる。
具体的な実施形態では、D2は、C1～7アルキレン、C2～7アルケニレン、C2～7アルキニレン、及びC3～8シクロアルキレンから選択される任意の1つを含みうる。その上、D2は、C1～2アルキレンでありうる。更に、D2は、メチレンでありうる。
具体的な実施形態では、X3は、NHでありうる。
具体的な実施形態では、(X)2は、AWでありうる。具体的な実施形態では、Xa2は、グルタミン酸でありうる。具体的な実施形態では、Xa3は、トリプトファンでありうる。
本発明は、以下の式5-2:
[式5-2]
(Xaa)1-3-C-(Xaa)2-H-(Xa1)'-G-Xa2-L-V-Xa3-C-(Xaa)1-3(配列番号12)
[式中、各Xaaは、独立して、システイン以外の任意のアミノ酸であり、
Cは、システインであり、Hは、ヒスチジンであり、Gは、グリシンであり、Xa2は、グルタミン酸又はアスパラギンであり、Lは、ロイシンであり、Vは、バリンであり、Xa3は、トリプトファン、ナフチルアラニン、及びフェニルアラニンから選択され、
(Xa1)'は、
Figure 0007393810000038
(式中、R1'は、第1の化学官能基であり、
D1は、任意のアルキレン、アルケニレン、又はアルキニレンであり、
X1は、炭素よりも電気陰性である元素であり、
D2は、任意のアルキレン、アルケニレン、又はアルキニレンであり、
D3は、共有結合又はC1～3アルキレンであり、
X3は、NH、O、又はSである)である]
の構造を有するR1'-L2-SSFIを提供する。
具体的な実施形態では、R1'は、クリック反応性官能基を含むことができる。その上、クリック反応性官能基は、アルキン、アジド、歪んだアルキン、ジエン、ジエノフィル、アルケン、チオール、及びテトラジンから選択される1つ又は複数を含みうる。更に、クリック反応性官能基は、アジド、又は歪んだアルキンから選択することができる。更に、クリック反応性官能基は、アジド、又はジベンゾシクロオクチン-アミンから選択することができる。加えて、クリック反応性官能基は、ジエン、又はジエノフィルから選択することができる。更に、クリック反応性官能基は、テトラジン、又はノルボルネンから選択することができる。或いは、クリック反応性官能基は、テトラジン、又はtrans-シクロオクテンから選択することができる。加えて、R1'は、2つ以上のクリック反応性官能基を含むことができる。
他の具体的な実施形態では、R1'は、担体部分、蛍光部分、薬物部分、又は放射性部分を含みうる。その上、R1'は、薬物部分を含みうる。加えて、R1'は、VCリンカーを含みうる。他の具体的な実施形態では、R1'は、パラトープを含む抗体又はその類似体を含みうる。
具体的な実施形態では、D1は、共有結合、C1～4アルキレン、C2～4アルケニレン、C2～4アルキニレン、及びC3～8シクロアルキレンから選択される任意の1つを含みうる。その上、D1は、-CH2OCH2-でありうる。加えて、D1は、共有結合でありうる。
具体的な実施形態では、X1は、NR1、S、又はOでありえ、R1は、H、ハロゲン、又は置換若しくは非置換C1～3アルキレンでありうる。
具体的な実施形態では、D2は、C1～7アルキレン、C2～7アルケニレン、C2～7アルキニレン、及びC3～8シクロアルキレンから選択される任意の1つを含みうる。その上、D2は、C1～2アルキレンでありうる。更に、D2は、メチレンでありうる。
具体的な実施形態では、式5-2は、13個以上17個以下のアミノ酸残基からなりうる((Xa1)'を含む)。
具体的な実施形態では、N末端から2～4個のアミノ酸に位置するシステイン、及びC末端から2～4個のアミノ酸に位置するシステインは、任意で、互いに接続しうる。
具体的な実施形態では、X3は、NHでありうる。具体的な実施形態では、(X)2は、AWでありうる。具体的な実施形態では、Xa2は、グルタミン酸でありうる。具体的な実施形態では、Xa3は、トリプトファンでありうる。
具体的な実施形態では、N末端(X)1-3を構成する残基の1つ及びC末端(X)1-3を構成する残基の1つは、互いに結合することができる。
具体的な実施形態では、式5-2は、式5-3:
[式5-3]
D-C-A-W-H-(Xa1)'-G-E-L-V-W-C-T(配列番号13)
(式中、Aは、アラニンであり、Eは、グルタミン酸である)
と同一でありうる。
式5、及び5-1～5-3の構造を有するR1'-L2-SSAI又はR1'-L2-SSFIは、抗体に対する結合活性を有しうる。その上、R1'-L2-SSAI又はR1'-L2-SSFIは、免疫グロブリンG(IgG)に対する結合活性を有しうる。加えて、R1'-L2-SSAI又はR1'-L2-SSFIは、抗体のFcドメインに対する結合活性を有しうる。
4.1. 第1のクリック反応性官能基を抗体に転移させるための薬剤;H1-L1及びSSAIのコンジュゲート(H1-L2-SSAI)
本発明によると、第1のクリック反応性官能基を抗体に転移させるための薬剤が開示される。このような化合物は、本明細書では、記号「H1-L2-SSAI」で示される。化合物はまた、その構造に依存する、H1-L1及びSSAIのコンジュゲート(H1-L2-SSAIコンジュゲート)とも称される。この場合、SSAIが、SSFIである場合、これは、記号「H1-L2-SSFI」で示される。
本発明によるH1-L2-SSAI又はH1-L2-SSFIは、R1'が、節「4. 第1の化学官能基を抗体に転移させるための薬剤」でのクリック反応性官能基を含有するものを含むが、本発明では、以下の具体的なその実施形態に限定されない。
本発明は、以下の式6-1:
[式6-1]
(Xaa)2-H-(Xa1)'-G-Xa2-L-V-Xa3(配列番号14)
[式中、各Xaaは、独立して、システイン以外の任意のアミノ酸であり、
Hは、ヒスチジンであり、Gは、グリシンであり、Xa2は、グルタミン酸又はアスパラギンであり、Lは、ロイシンであり、Vは、バリンであり、Xa3は、トリプトファン、ナフチルアラニン、及びフェニルアラニンから選択され、
(Xa1)'は、
Figure 0007393810000039
(式中、H1は、第1のクリック反応性官能基であり、
D1は、任意のアルキレン、アルケニレン、又はアルキニレンであり、
X1は、炭素よりも電気陰性である元素であり、
D2は、任意のアルキレン、アルケニレン、又はアルキニレンであり、
D3は、共有結合又はC1～3アルキレンであり、
X3は、NH、O、又はSである)である]
のアミノ酸配列を含む、H1-L2-SSFIを提供する。
具体的な実施形態では、H1は、アルキン、アジド、歪んだアルキン、ジエン、ジエノフィル、アルケン、チオール、及びテトラジンから選択される任意の1つを含みうる。更に、H1は、アジド、又は歪んだアルキンでありうる。更に、H1は、アジド、又はジベンゾシクロオクチン-アミンでありうる。加えて、H1は、ジエン、又はジエノフィルでありうる。更に、H1は、テトラジン、又はノルボルネンでありうる。或いは、H1は、テトラジン、又はtrans-シクロオクテンでありうる。
具体的な実施形態では、D1は、共有結合、C1～4アルキレン、C2～4アルケニレン、C2～4アルキニレン、及びC3～8シクロアルキレンから選択される任意の1つを含みうる。その上、D1は、-CH2OCH2-でありうる。加えて、D1は、共有結合でありうる。
具体的な実施形態では、X1は、NR1、S、又はOでありえ、R1は、H、ハロゲン、又は置換若しくは非置換C1～3アルキレンでありうる。
具体的な実施形態では、D2は、C1～7アルキレン、C2～7アルケニレン、C2～7アルキニレン、及びC3～8シクロアルキレンから選択される任意の1つを含みうる。その上、D2は、C1～2アルキレンでありうる。更に、D2は、メチレンでありうる。
具体的な実施形態では、X3は、NHでありうる。
具体的な実施形態では、(X)2は、AWでありうる。具体的な実施形態では、Xa2は、グルタミン酸でありうる。具体的な実施形態では、Xa3は、トリプトファンでありうる。
本発明は、以下の式6-2:
[式6-2]
(Xaa)1-3-C-(Xaa)2-H-(Xa1)'-G-Xa2-L-V-Xa3-C-(Xaa)1-3(配列番号15)
[式中、各Xaaは、独立して、システイン以外の任意のアミノ酸であり、
Cは、システインであり、Hは、ヒスチジンであり、Gは、グリシンであり、Xa2は、グルタミン酸又はアスパラギンであり、Lは、ロイシンであり、Vは、バリンであり、Xa3は、トリプトファン、ナフチルアラニン、及びフェニルアラニンから選択され、
(Xa1)'は、
Figure 0007393810000040
(式中、H1は、第1のクリック反応性官能基であり、
D1は、任意のアルキレン、アルケニレン、又はアルキニレンであり、
X1は、炭素よりも電気陰性である元素であり、
D2は、任意のアルキレン、アルケニレン、又はアルキニレンであり、
D3は、共有結合又はC1～3アルキレンであり、
X3は、NH、O、又はSである)である]
の構造を有するH1-L2-SSFIを提供する。
具体的な実施形態では、H1は、アルキン、アジド、歪んだアルキン、ジエン、ジエノフィル、アルケン、チオール、及びテトラジンから選択される任意の1つを含みうる。更に、H1は、アジド、又は歪んだアルキンでありうる。更に、H1は、アジド、又はジベンゾシクロオクチン-アミンでありうる。加えて、H1は、ジエン、又はジエノフィルでありうる。更に、H1は、テトラジン、又はノルボルネンでありうる。或いは、H1は、テトラジン、又はtrans-シクロオクテンでありうる。
具体的な実施形態では、D1は、共有結合、C1～4アルキレン、C2～4アルケニレン、C2～4アルキニレン、及びC3～8シクロアルキレンから選択される任意の1つを含みうる。その上、D1は、-CH2OCH2-でありうる。加えて、D1は、共有結合でありうる。
具体的な実施形態では、X1は、NR1、S、又はOでありえ、R1は、H、ハロゲン、又は置換若しくは非置換C1～3アルキレンでありうる。
具体的な実施形態では、D2は、C1～7アルキレン、C2～7アルケニレン、C2～7アルキニレン、及びC3～8シクロアルキレンから選択される任意の1つを含みうる。その上、D2は、C1～2アルキレンでありうる。更に、D2は、メチレンでありうる。
具体的な実施形態では、式5-2は、13個以上17個以下のアミノ酸残基からなりうる((Xa1)'を含む)。
具体的な実施形態では、N末端から2～4個のアミノ酸に位置するシステイン、及びC末端から2～4個のアミノ酸に位置するシステインは、任意で、互いに接続しうる。
具体的な実施形態では、X3は、NHでありうる。具体的な実施形態では、(X)2は、AWでありうる。具体的な実施形態では、Xa2は、グルタミン酸でありうる。具体的な実施形態では、Xa3は、トリプトファンでありうる。
具体的な実施形態では、N末端(X)1-3を構成する残基の1つ及びC末端(X)1-3を構成する残基の1つは、互いに結合することができる。
具体的な実施形態では、式6-2は、式6-3:
[式6-3](配列番号16)
D-C-A-W-H-(Xa1)'-G-E-L-V-W-C-T(配列番号16)
(式中、Aは、アラニンであり、Eは、グルタミン酸である)
と同一でありうる。
式6-1～6-3の構造を有するH1-L2-SSAI又はH1-L2-SSFIは、抗体に対する結合活性を有しうる。その上、H1-L2-SSAI又はH1-L2-SSFIは、免疫グロブリンG(IgG)に対する結合活性を有しうる。加えて、H1-L2-SSAI又はH1-L2-SSFIは、抗体のFcドメインに対する結合活性を有しうる。
4.2. 第1の化学官能基を抗体に転移するための薬剤を調製する方法
本発明によると、R1'-L2-SSAI、R1'-L2-SSFI、H1-L2-SSAI、及びH1-L2-SSFIを調製する方法が開示される(以下、「R1'-L2-SSAI」と総称される)。以下の調製方法の記載が、本発明を理解する助けとなることには留意されたい。
例えば、式5の化合物を調製する方法が、記載される。具体的な実施形態では、式5の化合物は、以下のスキーム2の反応を通して調製することができる。
Figure 0007393810000041
本発明によるR1'-L2-SSAIは、部位特異的抗体インタラクトーム(SSAI)が、本発明によるリンカー(R1'-L1)と反応させることを可能にすることにより調製することができる。本発明によるSSAIは、求核性X3を含むように設計される。X3は、リンカーに含まれる活性化したカルボニル基を攻撃して、求核置換反応を引き起こしうる。この場合、X3が、第2のカルボニル基を攻撃するので、本発明によるR1'-L2-SSAIが、調製される。
より具体的な例として、式6-3の化合物を調製する方法が、記載される。具体的な実施形態では、式6-3の化合物は、以下のスキーム3の反応を通して調製することができる。
Figure 0007393810000042
本発明による式3又は3-1のアミノ酸配列を含み、式4-1～4-6の構造の各々を有するSSAIは、求核性X3を含むXa1残基を含む。X3が、リンカーに含まれる第2のカルボニル基を攻撃するので、本発明によるR1'-L2-SSAIは、調製される。
具体的な実施形態では、X2を含む脱離基の塩基性は、本発明によるリンカーにおいて、X1を含む脱離基の塩基性より低い可能性がある。具体的な実施形態では、本発明によるリンカーは、X2-R2'が第2のカルボニル基と接続して、良好な脱離基を形成することを可能にしうる。その上、X2は、Oでありえ、R2'は、N-スクシンイミド、p-ニトロフェニル、又はペンタフルオロフェニルでありうる。この場合、第2のカルボニル基の反応性は、第1のカルボニル基の反応性より高い。従って、SSAIのX3は、リンカーの第2のカルボニル基を特異的に攻撃しうる。
本発明によると、第1の化学官能基を抗体に転移させるための薬剤を調製する方法が開示される。
本発明は、R1'-L2-SSAIを調製する方法であって、
本発明によるリンカーを、本発明による部位特異的抗体インタラクトームと反応させる工程
を含む方法を提供する。
具体的な実施形態では、リンカーは、式1、2、及び2-1～2-3から選択される任意の1つでありうる。
具体的な実施形態では、部位特異的抗体インタラクトームは、式3、3-1、及び4-1～4-6から選択される任意の1つの構造を含む、又は有することができる。
その上、リンカーは、式2の構造を有しえ、部位特異的抗体インタラクトームは、式4-2～4-6から選択される任意の1つの構造を有しうる。更に、部位特異的抗体インタラクトームは、式4-6の構造を有しうる。
本発明によると、第1のクリック反応性官能基を抗体に転移させるための薬剤を調製する方法が開示される。
本発明は、H1-L2-SSAIを調製する方法であって、
本発明によるリンカーを、本発明による部位特異的抗体インタラクトームと反応させる工程
を含む方法を提供する。
具体的な実施形態では、リンカーは、式2、及び2-1～2-3から選択される任意の1つでありうる。
具体的な実施形態では、部位特異的抗体インタラクトームは、式3、3-1、及び4-1～4-6から選択される任意の1つの構造を含む、又は有することができる。
その上、リンカーは、式2の構造を有しえ、部位特異的抗体インタラクトームは、式4-2～4-6から選択される任意の1つの構造を有しうる。更に、部位特異的抗体インタラクトームは、式4-6の構造を有しうる。
本発明によると、第1の化学官能基を抗体に転移させるための薬剤を調製するためのキットが開示される。
本発明は、第1の化学官能基を抗体に転移させるための薬剤を調製するためのキットであって、本発明によるリンカー及び本発明による部位特異的抗体インタラクトームを含むキットを提供する。
具体的な実施形態では、リンカーは、式1、2、及び2-1～式2-3から選択される任意の1つでありうる。
具体的な実施形態では、部位特異的抗体インタラクトームは、式3、3-1、及び4-1～4-6から選択される任意の1つの構造を含む、又は有することができる。
その上、リンカーは、式2の構造を有しえ、部位特異的抗体インタラクトームは、式4-2～4-6から選択される任意の1つの構造を有しうる。更に、部位特異的抗体インタラクトームは、式4-6の構造を有しうる。
本発明によると、第1のクリック反応性官能基を抗体に転移させるための薬剤を調製するためのキットが開示される。
本発明は、第1のクリック反応性官能基を抗体に転移させるための薬剤を調製するためのキットであって、本発明による第1のクリック反応性官能基を含有するリンカー、及び部位特異的抗体インタラクトームを含むキットを提供する。
具体的な実施形態では、リンカーは、式2、及び2-1～2-3から選択される任意の1つでありうる。
具体的な実施形態では、部位特異的抗体インタラクトームは、式3、3-1、及び4-1～4-6から選択される任意の1つの構造を含む、又は有することができる。
その上、リンカーは、式2の構造を有しえ、部位特異的抗体インタラクトームは、式4-2～4-6から選択される任意の1つの構造を有しうる。更に、部位特異的抗体インタラクトームは、式4-6の構造を有しうる。
5. 第1の化学官能基を含有する抗体(R1'-Ab)
本発明によると、第1の化学官能基を含有する抗体が開示される。このような化合物は、本明細書では、記号「R1'-Ab」で示される。
本出願は、式7:
Figure 0007393810000043
(式中、R1'は、第1の化学官能基であり、
D1は、任意のアルキレン、アルケニレン、又はアルキニレンであり、
X4は、NH、O、又はSであり、
Abは、抗体である)
で表されるR1'-Abを提供する。
具体的な実施形態では、R1'は、クリック反応性官能基でありうる。その上、R1'は、アルキン、アジド、歪んだアルキン、ジエン、ジエノフィル、アルケン、チオール、及びテトラジンから選択される任意の1つを含みうる。更に、R1'は、アジド、又は歪んだアルキンでありうる。更に、R1'は、アジド、又はジベンゾシクロオクチン-アミンでありうる。加えて、R1'は、ジエン、又はジエノフィルでありうる。更に、R1'は、テトラジン、又はノルボルネンでありうる。或いは、R1'は、テトラジン、又はtrans-シクロオクテンでありうる。
他の具体的な実施形態では、R1'は、担体部分、蛍光部分、薬物部分、又は放射性部分を含みうる。その上、R1'は、薬物部分を含みうる。加えて、R1'は、VCリンカーを含みうる。他の具体的な実施形態では、R1'は、パラトープを含む抗体又はその類似体を含みうる。
具体的な実施形態では、D1は、共有結合、C1～4アルキレン、C2～4アルケニレン、C2～4アルキニレン、及びC3～8シクロアルキレンから選択される任意の1つを含みうる。その上、D1は、-CH2OCH2-でありうる。加えて、D1は、共有結合でありうる。
具体的な一実施形態では、X4は、NHでありうる。
具体的な実施形態では、Abは、ヒト抗体でありうる。他の具体的な実施形態では、Abは、非ヒト動物抗体でありうる。具体的な実施形態では、Abは、免疫グロブリンG(IgG)でありうる。具体的な実施形態では、Abは、完全な抗体でありうる。他の具体的な実施形態では、Abは、抗体の断片でありうる。
具体的な実施形態では、X4及びAbは、AbのFabドメインを介して接続することができる。他の具体的な実施形態では、X4及びAbは、AbのFcドメインを介して接続することができる。その上、X4及びAbは、AbのFcドメインのリジン246又は248を介して接続することができる。更に、X4及びAbは、AbのFcドメインのリジン246を介して接続することができる。更に、X4及びAbは、AbのFcドメインのリジン248を介して接続することができる。或いは、X4及びAbは、AbのFcドメインのリジン246及び248を介して接続することができる。具体的な実施形態では、X4及びAbは、Abの2つのFcドメインの1つのみを介して接続することができる。他の具体的な実施形態では、X4及びAbは、Abの2つのFcドメインの両方を介して接続することができる。
本発明は、以下の式7-1:
[式7-1]
G-P-S-V-F-L-F-P-P-(K)'-P-K-D-T-L-M-I(配列番号17)
[式中、Gは、グリシンであり、Pは、プロリンであり、Sは、セリンであり、Vは、バリンであり、Fは、フェニルアラニンであり、Lは、ロイシンであり、Kは、リジンであり、Dは、アスパラギン酸であり、Tは、スレオニンであり、Mは、メチオニンであり、Iは、イソロイシンであり、
(K)'は、
Figure 0007393810000044
(式中、R1'は、第1の化学官能基であり、
D1は、任意のアルキレン、アルケニレン、又はアルキニレンである)である]
のアミノ酸配列を含む抗体又はその断片を提供する。抗体又はその断片は、そのFcドメインのリジン246を介して接続されるR1'、又はリジン246に相当する部位を有する。
具体的な実施形態では、R1'は、クリック反応性官能基を含むことができる。その上、クリック反応性官能基は、アルキン、アジド、歪んだアルキン、ジエン、ジエノフィル、アルケン、チオール、及びテトラジンから選択される1つ又は複数を含みうる。更に、クリック反応性官能基は、アジド、又は歪んだアルキンから選択することができる。更に、クリック反応性官能基は、アジド、又はジベンゾシクロオクチン-アミンから選択することができる。加えて、クリック反応性官能基は、ジエン、又はジエノフィルから選択することができる。更に、クリック反応性官能基は、テトラジン、又はノルボルネンから選択することができる。或いは、クリック反応性官能基は、テトラジン、又はtrans-シクロオクテンから選択することができる。加えて、R1'は、2つ以上のクリック反応性官能基を含むことができる。
他の具体的な実施形態では、R1'は、担体部分、蛍光部分、薬物部分、又は放射性部分を含みうる。その上、R1'は、薬物部分を含みうる。加えて、R1'は、VCリンカーを含みうる。他の具体的な実施形態では、R1'は、パラトープを含む抗体又はその類似体を含みうる。
具体的な実施形態では、D1は、共有結合、C1～4アルキレン、C2～4アルケニレン、C2～4アルキニレン、及びC3～8シクロアルキレンから選択される任意の1つを含みうる。その上、D1は、-CH2OCH2-でありうる。加えて、D1は、共有結合でありうる。
具体的な実施形態では、抗体は、ヒト抗体でありうる。他の具体的な実施形態では、抗体は、非ヒト動物抗体でありうる。具体的な実施形態では、抗体は、免疫グロブリンG(IgG)でありうる。具体的な実施形態では、抗体は、完全な抗体でありうる。他の具体的な実施形態では、抗体は、抗体の断片でありうる。
具体的な実施形態では、抗体は、2つのそのFcドメインの1つのみにおいて式7-1のアミノ酸配列を含みうる。他の具体的な実施形態では、抗体は、2つのそのFcドメインの両方において式7-1のアミノ酸配列を含みうる。
本発明は、以下の式7-2:
[式7-2]
G-P-S-V-F-L-F-P-P-K-P-(K)'-D-T-L-M-I(配列番号18)
[式中、Gは、グリシンであり、Pは、プロリンであり、Sは、セリンであり、Vは、バリンであり、Fは、フェニルアラニンであり、Lは、ロイシンであり、Kは、リジンであり、Dは、アスパラギン酸であり、Tは、スレオニンであり、Mは、メチオニンであり、Iは、イソロイシンであり、
(K)'は、
Figure 0007393810000045
(式中、R1'は、第1の化学官能基であり、
D1は、任意のアルキレン、アルケニレン、又はアルキニレンである)である]
のアミノ酸配列を含む抗体又はその断片を提供する。抗体又はその断片は、そのFcドメインのリジン248を介して接続されるR1'、又はリジン248に相当する部位を有する。
具体的な実施形態では、R1'は、クリック反応性官能基を含むことができる。その上、クリック反応性官能基は、アルキン、アジド、歪んだアルキン、ジエン、ジエノフィル、アルケン、チオール、及びテトラジンから選択される1つ又は複数を含みうる。更に、クリック反応性官能基は、アジド、又は歪んだアルキンから選択することができる。更に、クリック反応性官能基は、アジド、又はジベンゾシクロオクチン-アミンから選択することができる。加えて、クリック反応性官能基は、ジエン、又はジエノフィルから選択することができる。更に、クリック反応性官能基は、テトラジン、又はノルボルネンから選択することができる。或いは、クリック反応性官能基は、テトラジン、又はtrans-シクロオクテンから選択することができる。加えて、R1'は、2つ以上のクリック反応性官能基を含むことができる。
他の具体的な実施形態では、R1'は、担体部分、蛍光部分、薬物部分、又は放射性部分を含みうる。その上、R1'は、薬物部分を含みうる。加えて、R1'は、VCリンカーを含みうる。他の具体的な実施形態では、R1'は、パラトープを含む抗体又はその類似体を含みうる。
具体的な実施形態では、D1は、共有結合、C1～4アルキレン、C2～4アルケニレン、C2～4アルキニレン、及びC3～8シクロアルキレンから選択される任意の1つを含みうる。その上、D1は、-CH2OCH2-でありうる。加えて、D1は、共有結合でありうる。
具体的な実施形態では、抗体は、ヒト抗体でありうる。他の具体的な実施形態では、抗体は、非ヒト動物抗体でありうる。具体的な実施形態では、抗体は、免疫グロブリンG(IgG)でありうる。具体的な実施形態では、抗体は、完全な抗体でありうる。他の具体的な実施形態では、抗体は、抗体の断片でありうる。
具体的な実施形態では、抗体は、2つのそのFcドメインの1つのみにおいて式7-2のアミノ酸配列を含みうる。他の具体的な実施形態では、抗体は、2つのそのFcドメインの両方において式7-2のアミノ酸配列を含みうる。
本発明は、以下の式7-3:
[式7-3](配列番号19)
G-P-S-V-F-L-F-P-P-(K)'-P-(K)'-D-T-L-M-I(配列番号19)
[式中、Gは、グリシンであり、Pは、プロリンであり、Sは、セリンであり、Vは、バリンであり、Fは、フェニルアラニンであり、Lは、ロイシンであり、Kは、リジンであり、Dは、アスパラギン酸であり、Tは、スレオニンであり、Mは、メチオニンであり、Iは、イソロイシンであり、
(K)'は、
Figure 0007393810000046
(式中、R1'は、第1の化学官能基であり、
D1は、任意のアルキレン、アルケニレン、又はアルキニレンである)である]
のアミノ酸配列を含む抗体又はその断片を提供する。抗体又はその断片は、そのFcドメインのリジン246及び248を介して接続されるR1'、又はリジン246及び248に相当する部位を有する。
具体的な実施形態では、R1'は、クリック反応性官能基を含むことができる。その上、クリック反応性官能基は、アルキン、アジド、歪んだアルキン、ジエン、ジエノフィル、アルケン、チオール、及びテトラジンから選択される1つ又は複数を含みうる。更に、クリック反応性官能基は、アジド、又は歪んだアルキンから選択することができる。更に、クリック反応性官能基は、アジド、又はジベンゾシクロオクチン-アミンから選択することができる。加えて、クリック反応性官能基は、ジエン、又はジエノフィルから選択することができる。更に、クリック反応性官能基は、テトラジン、又はノルボルネンから選択することができる。或いは、クリック反応性官能基は、テトラジン、又はtrans-シクロオクテンから選択することができる。加えて、R1'は、2つ以上のクリック反応性官能基を含むことができる。
他の具体的な実施形態では、R1'は、担体部分、蛍光部分、薬物部分、又は放射性部分を含みうる。その上、R1'は、薬物部分を含みうる。加えて、R1'は、VCリンカーを含みうる。他の具体的な実施形態では、R1'は、パラトープを含む抗体又はその類似体を含みうる。
具体的な実施形態では、D1は、共有結合、C1～4アルキレン、C2～4アルケニレン、C2～4アルキニレン、及びC3～8シクロアルキレンから選択される任意の1つを含みうる。その上、D1は、-CH2OCH2-でありうる。加えて、D1は、共有結合でありうる。
具体的な実施形態では、抗体は、ヒト抗体でありうる。他の具体的な実施形態では、抗体は、非ヒト動物抗体でありうる。具体的な実施形態では、抗体は、免疫グロブリンG(IgG)でありうる。具体的な実施形態では、抗体は、完全な抗体でありうる。他の具体的な実施形態では、抗体は、抗体の断片でありうる。
具体的な実施形態では、抗体は、2つのそのFcドメインの1つのみにおいて式7-3のアミノ酸配列を含みうる。他の具体的な実施形態では、抗体は、2つのそのFcドメインの両方において式7-3のアミノ酸配列を含みうる。
本発明は、式7-1、7-2、及び7-3から選択される1つ又は複数のアミノ酸配列を含む抗体又はその断片を提供する。この場合、式7-1～7-3の配列の内容は、上述した通りである。
具体的な実施形態では、D1は、共有結合でありうる。
具体的な実施形態では、抗体又はその断片は、式7-1のアミノ酸配列のみを含み、式7-2及び7-3のアミノ酸配列を含まない。その上、抗体又はその断片は、2つのそのFcドメインの1つのみにおいて式7-1のアミノ酸配列を含みうる。加えて、抗体は、2つのそのFcドメインの両方において式7-1のアミノ酸配列を含みうる。
他の具体的な実施形態では、抗体又はその断片は、式7-2のアミノ酸配列のみを含み、式7-1及び7-3のアミノ酸配列を含まない。その上、抗体又はその断片は、2つのそのFcドメインの1つのみにおいて式7-2のアミノ酸配列を含みうる。加えて、抗体は、2つのそのFcドメインの両方において式7-2のアミノ酸配列を含みうる。
具体的な実施形態では、抗体又はその断片は、式7-3のアミノ酸配列のみを含み、式7-1及び7-2のアミノ酸配列を含まない。その上、抗体又はその断片は、2つのそのFcドメインの1つのみにおいて式7-3のアミノ酸配列を含みうる。加えて、抗体は、2つのそのFcドメインの両方において式7-3のアミノ酸配列を含みうる。
5.1. 第1のクリック反応性官能基を含有する抗体
本発明によると、第1のクリック反応性官能基を含有する抗体が開示される。このような化合物は、本明細書では、記号「H1-Ab」で示される。
本出願は、式8:
Figure 0007393810000047
(式中、H1は、第1のクリック反応性官能基であり、
D1は、任意のアルキレン、アルケニレン、又はアルキニレンであり、
X4は、NH、O、又はSであり、
Abは、抗体である)
で表されるH1-Abを提供する。
具体的な実施形態では、H1は、アルキン、アジド、歪んだアルキン、ジエン、ジエノフィル、アルケン、チオール、及びテトラジンから選択される任意の1つを含みうる。更に、H1は、アジド、又は歪んだアルキンでありうる。更に、H1は、アジド、又はジベンゾシクロオクチン-アミンでありうる。加えて、H1は、ジエン、又はジエノフィルでありうる。更に、H1は、テトラジン、又はノルボルネンでありうる。或いは、H1は、テトラジン、又はtrans-シクロオクテンでありうる。
具体的な実施形態では、D1は、共有結合、C1～4アルキレン、C2～4アルケニレン、C2～4アルキニレン、及びC3～8シクロアルキレンから選択される任意の1つを含みうる。その上、D1は、-CH2OCH2-でありうる。加えて、D1は、共有結合でありうる。
具体的な一実施形態では、X4は、NHでありうる。
具体的な実施形態では、Abは、ヒト抗体でありうる。他の具体的な実施形態では、Abは、非ヒト動物抗体でありうる。具体的な実施形態では、Abは、免疫グロブリンG(IgG)でありうる。具体的な実施形態では、Abは、完全な抗体でありうる。他の具体的な実施形態では、Abは、抗体の断片でありうる。具体的な実施形態では、Abは、野生型抗体でありうる。他の具体的な実施形態では、Abは、操作抗体でありうる。
具体的な実施形態では、X4及びAbは、AbのFabドメインを介して接続することができる。他の具体的な実施形態では、X4及びAbは、AbのFcドメインを介して接続することができる。その上、X4及びAbは、AbのFcドメインのリジン246又は248を介して接続することができる。更に、X4及びAbは、AbのFcドメインのリジン246を介して接続することができる。更に、X4及びAbは、AbのFcドメインのリジン248を介して接続することができる。或いは、X4及びAbは、AbのFcドメインのリジン246及び248を介して接続することができる。具体的な実施形態では、X4及びAbは、Abの2つのFcドメインの1つのみを介して接続することができる。他の具体的な実施形態では、X4及びAbは、Abの2つのFcドメインの両方を介して接続することができる。
本発明は、以下の式8-1:
[式8-1]
G-P-S-V-F-L-F-P-P-(K)'-P-K-D-T-L-M-I(配列番号20)
[式中、Gは、グリシンであり、Pは、プロリンであり、Sは、セリンであり、Vは、バリンであり、Fは、フェニルアラニンであり、Lは、ロイシンであり、Kは、リジンであり、Dは、アスパラギン酸であり、Tは、スレオニンであり、Mは、メチオニンであり、Iは、イソロイシンであり、
(K)'は、
Figure 0007393810000048
(式中、H1は、第1のクリック反応性官能基であり、
D1は、任意のアルキレン、アルケニレン、又はアルキニレンである)である]
のアミノ酸配列を含む抗体又はその断片を提供する。抗体又はその断片は、そのFcドメインのリジン246を介して接続されるH1、又はリジン246に相当する部位を有する。
具体的な実施形態では、H1は、アルキン、アジド、歪んだアルキン、ジエン、ジエノフィル、アルケン、チオール、及びテトラジンから選択される任意の1つを含みうる。更に、H1は、アジド、又は歪んだアルキンでありうる。更に、H1は、アジド、又はジベンゾシクロオクチン-アミンでありうる。加えて、H1は、ジエン、又はジエノフィルでありうる。更に、H1は、テトラジン、又はノルボルネンでありうる。或いは、H1は、テトラジン、又はtrans-シクロオクテンでありうる。
具体的な実施形態では、D1は、共有結合、C1～4アルキレン、C2～4アルケニレン、C2～4アルキニレン、及びC3～8シクロアルキレンから選択される任意の1つを含みうる。その上、D1は、-CH2OCH2-でありうる。加えて、D1は、共有結合でありうる。
具体的な実施形態では、抗体は、ヒト抗体でありうる。他の具体的な実施形態では、抗体は、非ヒト動物抗体でありうる。具体的な実施形態では、抗体は、免疫グロブリンG(IgG)でありうる。具体的な実施形態では、抗体は、完全な抗体でありうる。他の具体的な実施形態では、抗体は、抗体の断片でありうる。具体的な実施形態では、抗体は、野生型抗体でありうる。他の具体的な実施形態では、抗体は、操作抗体でありうる。
具体的な実施形態では、抗体は、2つのそのFcドメインの1つのみにおいて式8-1のアミノ酸配列を含みうる。他の具体的な実施形態では、抗体は、2つのそのFcドメインの両方において式8-1のアミノ酸配列を含みうる。
本発明は、以下の式8-2:
[式8-2]
G-P-S-V-F-L-F-P-P-K-P-(K)'-D-T-L-M-I(配列番号21)
[式中、Gは、グリシンであり、Pは、プロリンであり、Sは、セリンであり、Vは、バリンであり、Fは、フェニルアラニンであり、Lは、ロイシンであり、Kは、リジンであり、Dは、アスパラギン酸であり、Tは、スレオニンであり、Mは、メチオニンであり、Iは、イソロイシンであり、
(K)'は、
Figure 0007393810000049
(式中、H1は、第1のクリック反応性官能基であり、
D1は、任意のアルキレン、アルケニレン、又はアルキニレンである)である]
のアミノ酸配列を含む抗体又はその断片を提供する。抗体又はその断片は、そのFcドメインのリジン248を介して接続されるH1、又はリジン248に相当する部位を有する。
具体的な実施形態では、H1は、アルキン、アジド、歪んだアルキン、ジエン、ジエノフィル、アルケン、チオール、及びテトラジンから選択される任意の1つを含みうる。更に、H1は、アジド、又は歪んだアルキンでありうる。更に、H1は、アジド、又はジベンゾシクロオクチン-アミンでありうる。加えて、H1は、ジエン、又はジエノフィルでありうる。更に、H1は、テトラジン、又はノルボルネンでありうる。或いは、H1は、テトラジン、又はtrans-シクロオクテンでありうる。
具体的な実施形態では、D1は、共有結合、C1～4アルキレン、C2～4アルケニレン、C2～4アルキニレン、及びC3～8シクロアルキレンから選択される任意の1つを含みうる。その上、D1は、-CH2OCH2-でありうる。加えて、D1は、共有結合でありうる。
具体的な実施形態では、抗体は、ヒト抗体でありうる。他の具体的な実施形態では、抗体は、非ヒト動物抗体でありうる。具体的な実施形態では、抗体は、免疫グロブリンG(IgG)でありうる。具体的な実施形態では、抗体は、完全な抗体でありうる。他の具体的な実施形態では、抗体は、抗体の断片でありうる。具体的な実施形態では、抗体は、野生型抗体でありうる。他の具体的な実施形態では、抗体は、操作抗体でありうる。
具体的な実施形態では、抗体は、2つのそのFcドメインの1つのみにおいて式8-2のアミノ酸配列を含みうる。他の具体的な実施形態では、抗体は、2つのそのFcドメインの両方において式8-2のアミノ酸配列を含みうる。
本発明は、以下の式8-3:
[式8-3]
G-P-S-V-F-L-F-P-P-(K)'-P-(K)'-D-T-L-M-I(配列番号22)
[式中、Gは、グリシンであり、Pは、プロリンであり、Sは、セリンであり、Vは、バリンであり、Fは、フェニルアラニンであり、Lは、ロイシンであり、Kは、リジンであり、Dは、アスパラギン酸であり、Tは、スレオニンであり、Mは、メチオニンであり、Iは、イソロイシンであり、
(K)'は、
Figure 0007393810000050
(式中、H1は、第1のクリック反応性官能基であり、
D1は、任意のアルキレン、アルケニレン、又はアルキニレンである)である]
のアミノ酸配列を含む抗体又はその断片を提供する。抗体又はその断片は、そのFcドメインのリジン246及び248を介して接続されるH1、又はリジン246及び248に相当する部位を有する。
具体的な実施形態では、H1は、アルキン、アジド、歪んだアルキン、ジエン、ジエノフィル、アルケン、チオール、及びテトラジンから選択される任意の1つを含みうる。更に、H1は、アジド、又は歪んだアルキンでありうる。更に、H1は、アジド、又はジベンゾシクロオクチン-アミンでありうる。加えて、H1は、ジエン、又はジエノフィルでありうる。更に、H1は、テトラジン、又はノルボルネンでありうる。或いは、H1は、テトラジン、又はtrans-シクロオクテンでありうる。
具体的な実施形態では、D1は、共有結合、C1～4アルキレン、C2～4アルケニレン、C2～4アルキニレン、及びC3～8シクロアルキレンから選択される任意の1つを含みうる。その上、D1は、-CH2OCH2-でありうる。加えて、D1は、共有結合でありうる。
具体的な実施形態では、抗体は、ヒト抗体でありうる。他の具体的な実施形態では、抗体は、非ヒト動物抗体でありうる。具体的な実施形態では、抗体は、免疫グロブリンG(IgG)でありうる。具体的な実施形態では、抗体は、完全な抗体でありうる。他の具体的な実施形態では、抗体は、抗体の断片でありうる。具体的な実施形態では、抗体は、野生型抗体でありうる。他の具体的な実施形態では、抗体は、操作抗体でありうる。
具体的な実施形態では、抗体は、2つのそのFcドメインの1つのみにおいて式8-3のアミノ酸配列を含みうる。他の具体的な実施形態では、抗体は、2つのそのFcドメインの両方において式8-3のアミノ酸配列を含みうる。
本発明は、式8-1、8-2、及び8-3から選択される1つ又は複数のアミノ酸配列を含む抗体又はその断片を提供する。この場合、式8-1～8-3の配列の内容は、上述した通りである。
具体的な実施形態では、D1は、共有結合でありうる。
具体的な実施形態では、抗体又はその断片は、式8-1のアミノ酸配列のみを含み、式8-2及び8-3のアミノ酸配列を含まない。その上、抗体又はその断片は、2つのそのFcドメインの1つのみにおいて式8-1のアミノ酸配列を含みうる。加えて、抗体は、2つのそのFcドメインの両方において式8-1のアミノ酸配列を含みうる。
他の具体的な実施形態では、抗体又はその断片は、式8-2のアミノ酸配列のみを含み、式8-1及び8-3のアミノ酸配列を含まない。その上、抗体又はその断片は、2つのそのFcドメインの1つのみにおいて式8-2のアミノ酸配列を含みうる。加えて、抗体は、2つのそのFcドメインの両方において式8-2のアミノ酸配列を含みうる。
具体的な実施形態では、抗体又はその断片は、式8-3のアミノ酸配列のみを含み、式8-1及び8-2のアミノ酸配列を含まない。その上、抗体又はその断片は、2つのそのFcドメインの1つのみにおいて式8-3のアミノ酸配列を含みうる。加えて、抗体は、2つのそのFcドメインの両方において式8-3のアミノ酸配列を含みうる。
具体的な実施形態では、抗体は、ヒト抗体でありうる。他の具体的な実施形態では、抗体は、非ヒト動物抗体でありうる。具体的な実施形態では、抗体は、免疫グロブリンG(IgG)でありうる。具体的な実施形態では、抗体は、完全な抗体でありうる。他の具体的な実施形態では、抗体は、抗体の断片でありうる。具体的な実施形態では、抗体は、野生型抗体でありうる。他の具体的な実施形態では、抗体は、操作抗体でありうる。
5.2. 第1の化学官能基を含有する抗体を調製する方法
本発明によると、R1'-Ab、及びH1-Abを調製する方法が開示される(以下、「R1'-Ab」と総称される)。以下の調製方法の記載が、本発明を理解する助けとなることには留意されたい。
例えば、式7の化合物を調製する方法が、記載される。具体的な実施形態では、式7の化合物は、以下のスキーム4の反応を通して調製することができる。
Figure 0007393810000051
本発明によるリンカーの第1のカルボニル基が軽度の反応性を有するので、リンカーの第1のカルボニル基が抗体のアミン基と近接した位置関係を有する場合に、架橋は実現されうる。第一に、式5で表されるR1'-L2-SSAIは、抗体のある特定の部位に密着して、反応が起こり得る環境を創出する。本発明によるR1'-L2-SSAIが、リンカーの第1のカルボニル基に相当する、活性化したカルボニル基(即ち、X1に接続するカルボニル基)を有するので、本発明のR1'-L2-SSAIは、求核置換反応を引き起こしうる。この場合、式7の化合物は、抗体に存在する遊離電子対を有する原子(X4)が、カルボニル基を攻撃する求核分子として働くので、調製することができる。この場合、リンカーでの設計により、部位特異的抗体インタラクトーム(SSAI)は、脱離基に含まれる間に脱離し、SSAIは、最終生成物から除去される。これらの特徴は、以下の第5.8節に示す通り、抗体生成物の物理的特性に好影響を及ぼす。
具体的な実施形態では、X4は、NH2でありうる。その上、X4は、リジン残基のNH2でありうる。他の具体的な実施形態では、X4は、SHでありうる。その上、X4は、システイン残基のSHでありうる。他の具体的な実施形態では、X4は、OHでありうる。
より具体的な例として、式8-3のアミノ酸配列を含む抗体又はその断片を調製する方法が、記載される。具体的な実施形態では、式8-3のアミノ酸配列を含む化合物は、以下のスキーム5の反応を通して調製することができる。
Figure 0007393810000052
式6-3の構造(2つのシステイン残基が任意に接続する構造)を有する化合物は、化合物がSSFI配列を有するので、抗体のFcドメインに向けられる(第3.2節参照)。この場合、配列番号1のアミノ酸配列を含む抗体は、そのFcドメインのリジン残基を含み、このようなリジン残基は、求核分子として役立ちうる。例示的な実施形態は、Fcドメインのリジン246、又はリジン246に相当する残基(以下、「リジン246」と称す)が、求核分子として役立つ場合を示す。この場合、リジン246のアミン基は、式6-3の第1のカルボニル基を攻撃して、式8-1の化合物を生成する。こうして、H1又はR1は、抗体のFcドメインのリジン残基に転移することができる。この場合、いずれのある特定のリジン残基に化学官能基が転移されるかは、以下の第5.3節及び第5.4節に記載のリンカー、SSAI、及びR1'-L2-SSAIの設計に依存しうる。
本発明によると、第1の化学官能基を含有する抗体を調製する方法が開示される。
本発明は、R1'-Abを調製する方法であって、
第1の化学官能基を本発明による抗体に転移させるための薬剤を、抗体又はその断片と反応させる工程
を含む方法を提供する。
具体的な実施形態では、第1の化学官能基を抗体に転移させるための薬剤は、式5、5-1～5-3、及び6-1～6-3から選択される任意の1つでありうる。
具体的な実施形態では、抗体又はその断片は、ヒト抗体でありうる。他の具体的な実施形態では、抗体又はその断片は、非ヒト動物抗体でありうる。具体的な実施形態では、抗体又はその断片は、免疫グロブリンG(IgG)でありうる。具体的な実施形態では、抗体又はその断片は、完全な抗体でありうる。他の具体的な実施形態では、抗体又はその断片は、抗体の断片でありうる。具体的な実施形態では、抗体又はその断片は、野生型抗体でありうる。他の具体的な実施形態では、抗体又はその断片は、操作抗体でありうる。
具体的な実施形態では、本発明は、そのFcドメインの特定のリジン残基に転移された第1の化学官能基を有する抗体を調製する方法を提供する。この場合、以下の第5.4節に記載の態様のものは、第1の化学官能基を抗体に転移させるための薬剤として使用することができる。
本発明によると、第1のクリック反応性官能基を含有する抗体を調製する方法が開示される。
本発明は、H1-Abを調製する方法であって、
第1のクリック反応性官能基を本発明による抗体に転移させるための薬剤を、抗体又はその断片と反応させる工程
を含む方法を提供する。
具体的な実施形態では、第1のクリック反応性官能基を抗体に転移させるための薬剤は、式6-1～6-3から選択される任意の1つでありうる。その上、第1のクリック反応性官能基を抗体に転移させるための薬剤は、式6-3の構造を有しうる。
具体的な実施形態では、抗体又はその断片は、ヒト抗体でありうる。他の具体的な実施形態では、抗体又はその断片は、非ヒト動物抗体でありうる。具体的な実施形態では、抗体又はその断片は、免疫グロブリンG(IgG)でありうる。具体的な実施形態では、抗体又はその断片は、完全な抗体でありうる。他の具体的な実施形態では、抗体又はその断片は、抗体の断片でありうる。具体的な実施形態では、抗体又はその断片は、野生型抗体でありうる。他の具体的な実施形態では、抗体又はその断片は、操作抗体でありうる。
具体的な実施形態では、本発明は、そのFcドメインの特定のリジン残基に転移された第1のクリック反応性官能基を有する抗体を調製する方法を提供する。この場合、以下の第5.4節に記載の態様のものは、第1のクリック反応性官能基を抗体に転移させるための薬剤として使用することができる。
本発明によると、第1の化学官能基を含有する抗体又はその断片を調製するためのキットが開示される。
本発明は、第1の化学官能基を含有する抗体又はその断片を調製するためのキットであって、第1の化学官能基を本発明による抗体に転移させるための薬剤、及び抗体又はその断片を含むキットを提供する。
具体的な実施形態では、第1の化学官能基を抗体に転移させるための薬剤は、式5、5-1～5-3、及び6-1～6-3から選択される任意の1つでありうる。
具体的な実施形態では、抗体又はその断片は、ヒト抗体でありうる。他の具体的な実施形態では、抗体又はその断片は、非ヒト動物抗体でありうる。具体的な実施形態では、抗体又はその断片は、免疫グロブリンG(IgG)でありうる。具体的な実施形態では、抗体又はその断片は、完全な抗体でありうる。他の具体的な実施形態では、抗体又はその断片は、抗体の断片でありうる。具体的な実施形態では、抗体又はその断片は、野生型抗体でありうる。他の具体的な実施形態では、抗体又はその断片は、操作抗体でありうる。
その上、本発明は、第1の化学官能基を含有する抗体又はその断片を調製するためのキットであって、
本発明によるリンカー(R1'-L1);
本発明による部位特異的抗体インタラクトーム;及び
抗体又はその断片
を含むキットを提供する。
具体的な実施形態では、リンカーは、式1、2、及び2-1～2-3から選択される任意の1つでありうる。
具体的な実施形態では、部位特異的抗体インタラクトームは、式3、3-1、及び4-1～4-6から選択される任意の1つでありうる。
具体的な実施形態では、抗体又はその断片は、ヒト抗体でありうる。他の具体的な実施形態では、抗体又はその断片は、非ヒト動物抗体でありうる。具体的な実施形態では、抗体又はその断片は、免疫グロブリンG(IgG)でありうる。具体的な実施形態では、抗体又はその断片は、完全な抗体でありうる。他の具体的な実施形態では、抗体又はその断片は、抗体の断片でありうる。具体的な実施形態では、抗体又はその断片は、野生型抗体でありうる。他の具体的な実施形態では、抗体又はその断片は、操作抗体でありうる。
本発明は、そのFcドメインの特定のリジン残基に転移された第1の化学官能基を有する抗体を調製するためのキットを提供する。この場合、以下の第5.4節に記載の態様のものは、第1の化学官能基を抗体に転移させるための薬剤、リンカー、及び部位特異的抗体インタラクトームとして使用することができる。
本発明によると、第1のクリック反応性官能基を含有する抗体又はその断片を調製するためのキットが開示される。
本発明は、第1のクリック反応性官能基を含有する抗体又はその断片を調製するためのキットであって、第1のクリック反応性官能基を本発明による抗体に転移させるための薬剤、及び抗体又はその断片を含むキットを提供する。
具体的な実施形態では、第1のクリック反応性官能基を抗体に転移させるための薬剤は、式6-1～6-3から選択される任意の1つでありうる。その上、第1のクリック反応性官能基を抗体に転移させるための薬剤は、式6-3の構造を有しうる。
具体的な実施形態では、抗体又はその断片は、ヒト抗体でありうる。他の具体的な実施形態では、抗体又はその断片は、非ヒト動物抗体でありうる。具体的な実施形態では、抗体又はその断片は、免疫グロブリンG(IgG)でありうる。具体的な実施形態では、抗体又はその断片は、完全な抗体でありうる。他の具体的な実施形態では、抗体又はその断片は、抗体の断片でありうる。具体的な実施形態では、抗体又はその断片は、野生型抗体でありうる。他の具体的な実施形態では、抗体又はその断片は、操作抗体でありうる。
その上、本発明は、第1のクリック反応性官能基を含有する抗体又はその断片を調製するためのキットであって、
本発明によるリンカー(H1-L1);
本発明による部位特異的抗体インタラクトーム;及び
抗体又はその断片
を含むキットを提供する。
具体的な実施形態では、リンカーは、式2、及び2-1～2-3から選択される任意の1つでありうる。
具体的な実施形態では、部位特異的抗体インタラクトームは、式3、3-1、及び4-1～4-6から選択される任意の1つでありうる。
具体的な実施形態では、抗体又はその断片は、ヒト抗体でありうる。他の具体的な実施形態では、抗体又はその断片は、非ヒト動物抗体でありうる。具体的な実施形態では、抗体又はその断片は、免疫グロブリンG(IgG)でありうる。具体的な実施形態では、抗体又はその断片は、完全な抗体でありうる。他の具体的な実施形態では、抗体又はその断片は、抗体の断片でありうる。具体的な実施形態では、抗体又はその断片は、野生型抗体でありうる。他の具体的な実施形態では、抗体又はその断片は、操作抗体でありうる。
本発明は、そのFcドメインの特定のリジン残基に転移された第1のクリック反応性官能基を有する抗体を調製するためのキットを提供する。この場合、以下の第5.4節に記載の態様のものは、第1のクリック反応性官能基を抗体に転移させるための薬剤、リンカー、及び部位特異的抗体インタラクトームとして使用することができる。
5.3. (Xa1)'の機能、及びR1'-L2-SSFIでの(Xa1)'の位置の設計原理
本内容では、式6-3の化合物は、本発明を理解する助けとなる一例として提供されるが、本発明の範囲は、これらに限定されない。以下の説明がまた、式5、5-1～5-3、及び6-1～6-3の化合物に適用され、式6-3の化合物が、便宜上、単に一例として提供されることに留意されたい。
第5.2節に議論した通り、R1'-L2-SSFIの(Xa1)'は、求核置換反応により、R1'を抗体に転移させるように機能する。本発明によると、求核置換反応を促進するための条件が、以下の要件を満たすと仮定する。(1)(Xa1)'は、Fcドメインのリジン残基に隣接する、及び(2)R1'が結合する側鎖は、リジン残基に向けられている。プロセスの収率及び均一性が、(Xa1)'の位置及び側鎖の方向が、Fcドメインのリジン残基から遠ざかると低下することが予期された。その上、(3)(Xa1)'の置換位置は、SSFIとFcドメインとの間の相互作用に大きな影響を及ぼさないことが好ましい(第3.2節参照)。
図3及び図5で間接的に見られる通り、Fcドメインのリジン246及び248に関して(1)の要件を満たすSSFIの位置が、以下の式6-3に基づいた5、6、7、及び8位であることを確認した。
[式6-3]
D-C-A-W-H-(Xa1)'-G-E-L-V-W-C-T
この場合、5位に相当するヒスチジンが、Fcドメインでグルタミン酸380と塩結合を形成するので、ヒスチジンの置換えは、SSFIとFcドメインとの間の相互作用に影響を及ぼしうる。従って、これは、(3)の要件を満たさない。その上、この側鎖の方向が、リジン246及び248に近接していないので、これは、(2)の要件を満たさない。7位に相当するグリシンが、SSFIの屈曲構造を形成する助けとなるので、グリシン残基を大きな(Xa1)'残基と置き換えることは望ましくない。8位に相当するグルタミン酸が、Fcドメインのアルギニン255と塩結合を形成するので、グルタミン酸の置換えは、SSFIとFcドメインとの間の相互作用に影響を及ぼしうる。従って、これは、(3)の要件を満たさない(第3.2節参照)。6位が、(1)、(2)、及び(3)の要件全てを満たすので、6位が、(Xa1)'の位置に最も好適であると判断した。従って、本発明によるR1'-L2-SSFIは、これらの事実に基づいて完成した。
5.4. 抗体に転移されるR1'の位置は、R1'-L1のD2及びSSFIのD3の長さに依存して変化しうる。
本内容は、本発明によるR1'-L2-SSFIの好ましい設計原理を説明することを意図する。R1'-L2-SSFIの設計によると、R1'をFcドメインの特定のリジン残基に特異的に転移させることは可能である。その上、本内容は、好ましいR1'-L2-SSFIを調製する、R1'-L1及びSSFIの設計原理を説明することを意図する。
上述の第5.2節を読んだ当業者は、R1'-L2-SSFIの(Xa1)'の第1のカルボニル基が、Fcドメインのリジンのアミン基に隣接して位置する場合に、求核置換反応が起こり得ることを認識することができる。上述の第3.2節の記載に基づいて、当業者はまた、R1'-L2-SSFIが、特異的なトポロジーで、Fcドメインと共に配置され、Fcドメインのリジン246及び248のアミン基が、(Xa1)'のβ炭素からある特定の距離、離間していることを認識することができる(図5)。R1'-L2-SSFIを設計するこの組合せを使用することにより、(1)(Xa1)'のβ炭素と第1のカルボニル炭素との間の距離(以下、「Lc」と総称される)が、(2)特異的なトポロジーにおける、(Xa1)'のβ炭素とFcドメインのリジン246及び248のアミン基との間の距離と同じ又は類似である場合、所望のリジン残基を特異的に標識化することが可能になることが予期された。
本発明によるR1'-L2-SSFIの構造及びLcは、図8に示す。図8に示す通り、D3、X3、炭素原子、D2、及びX1は、(Xa1)'のβ炭素と第1のカルボニル基との間に位置する。これらのうち、D3及びX3は、SSFIの設計に関連し、D2及びX1は、L1-R1'の設計に関連する。
便宜上、本発明は、D3が、Cxアルキレンであり、X3が、Nであり、D2が、Cyアルキレン、Cyアルケニレン、又はCyアルキニレンであり、X1が、Sであり、yが、1以上の整数であるという想定で実施した。この場合、アルキレン、アルケニレン、及びアルキニレンは、同じ長さを有すると想定した。図8に示すリンカーの構造は、Lc値を計算するためにソフトウェアDiscovery Studioを使用してモデル化した。結果として、x+y値に対して決定されたLc値は、Table 3(表3)に列挙する。計算の過程では、鎖は、最大長の場合でモデル化した。
Figure 0007393810000053
以下、R1'-L2-SSFIとFcドメインのリジン残基との間のトポロジーを示すのに提供される添付の図面は、図9に基づいて提供される。図9は、(Xa1)'の側鎖の方向(点線)が、図のx軸と平行であるように、R1'-L2-SSFIとFcドメインとの間のトポロジーを示す。図9に示す通り、(Xa1)'の側鎖が、リジン246及び248のアミン基に向けられていることが分かる(第5.3節参照)。その上、(Xa1)'の側鎖が、Lcの長さに依存して、リジン246又は248と特異的に反応することが図からも分かる。図10～図12は、Lcの例示的な長さに沿う図でのy軸に平行な方向(太い実線の矢印)における、図9の図面を示す図面である。
(Xa1)'のβ炭素とFcドメインのリジン246及び248のアミン基との間の距離(D246,最小、D246,最大、D248,最小、及びD248,最大)は、第3.2節に記載する。(Xa1)'のβ炭素は、246位でのリジン残基より、Fcドメインのリジン248に近接する。従って、Lc値がD246,最小より短い場合、第1のカルボニル炭素がリジン248と十分に反応し(図10)、Lc値がD248,最大より長い場合、第1のカルボニル炭素がリジン246と十分に反応し(図11)、Lc値がD246,最小以上、D248,最大以下である場合、第1のカルボニル炭素がリジン246及び248と選択的に反応する(図12)ことが予期された。
本発明によると、第1の化学官能基を抗体のFcドメインのリジン248に特異的に転移させるためのR1'-L2-SSFIが開示される(図11を参照)。
本発明は、第1の化学官能基を抗体に転移させるための薬剤であって、(Xa1)'のβ炭素と第1のカルボニル炭素との間の距離(Lc)が、D246,最小(およそ11.668Å)より短いことを特徴とする、薬剤を提供する。この場合、Lcは、およそ6.5Å、およそ7Å、およそ8Å、およそ9Å、およそ10Å、およそ11Å、又はおよそ11.5Åの値を有しうる。
具体的な実施形態では、R1'-L2-SSFIが、式5、5-1～5-3、及び6-1～6-3から選択される任意の1つの構造を有する場合、D3は、Cxアルキレンであり、X3は、Nであり、D2は、Cyアルキレン、Cyアルケニレン、又はCyアルキニレンであり、X1は、Sであり、yは、1以上の整数であり、x及びyの合計は、1≦x+y≦5でありうる。その上、x及びyの合計は、1、2、3、4、又は5でありうる。例えば、xは、0でありえ、yは、1≦y≦5でありうる。別の具体的な実施形態では、xは、1でありえ、yは、1≦y≦4でありうる。更に別の具体的な実施形態では、xは、2でありえ、yは、1≦y≦3でありうる。また別の具体的な実施形態では、xは、3でありえ、yは、1≦y≦2でありうる。対応する数値範囲は、Table 3(表3)に列挙した値に基づいて決定される。
本発明によると、第1の化学官能基を抗体のFcドメインのリジン246に特異的に転移させるためのR1'-L2-SSFIが開示される。
本発明の一態様によると、本発明は、第1の化学官能基を抗体に転移させるための薬剤であって、(Xa1)'のβ炭素と第1のカルボニル炭素との間の距離(Lc)が、D248,最大(およそ16.208Å)より長いことを特徴とする、薬剤を提供する。例えば、Lcは、およそ16.5Å、およそ17Å、およそ18Å、およそ19Å、およそ20Å、又はおよそ20.5Åの値を有しうる。
具体的な実施形態では、R1'-L2-SSFIが、式5、5-1～5-3、及び6-1～6-3から選択される任意の1つの構造を有する場合、D3は、Cxアルキレンであり、X3は、Nであり、D2は、Cyアルキレン、Cyアルケニレン、又はCyアルキニレンであり、X1は、Sであり、yは、1以上の整数であり、x及びyの合計は、9以上でありうる。その上、x及びyの合計は、9、10、11、又は12でありうる。例えば、xは、0でありえ、yは、9≦y≦12でありうる。別の具体的な実施形態では、xは、1でありえ、yは、8≦y≦11でありうる。更に別の具体的な実施形態では、xは、2でありえ、yは、7≦y≦10でありうる。また別の具体的な実施形態では、xは、3でありえ、yは、6≦y≦9でありうる。任意で、D2は、アルキニレンでありうる。D2が、アルキニレンである場合、(Xa1)'の側鎖は、立体的に硬くなるので、側鎖の屈曲を防止することができる。
本発明によると、第1の化学官能基を抗体のFcドメインのリジン246又は248に選択的に転移させるためのR1'-L2-SSFIが開示される。
本発明の一態様によると、本発明は、第1の化学官能基を抗体に転移させるための薬剤であって、(Xa1)'のβ炭素と第1のカルボニル炭素との間の距離(Lc)が、D246,最小(およそ11.668Å)以上、D248,最大(およそ16.208Å)以下である値を有することを特徴とする、薬剤を提供する。この場合、Lcは、およそ11.668Å、およそ12Å、およそ13Å、およそ14Å、およそ15Å、およそ15.5Å、およそ16Å、又はおよそ16.208Åの値を有しうる。
具体的な実施形態では、R1'-L2-SSFIが、式5、5-1～5-3、及び6-1～6-3から選択される任意の1つの構造を有する場合、D3は、Cxアルキレンであり、X3は、Nであり、D2は、Cyアルキレン、Cyアルケニレン、又はCyアルキニレンであり、X1は、Sであり、yは、1以上の整数であり、x及びyの合計は、6≦x+y≦8でありうる。この場合、x及びyの合計は、6、7、又は8でありうる。例えば、xは、0でありえ、yは、6≦y≦8でありうる。別の具体的な実施形態では、xは、1でありえ、yは、5≦y≦7でありうる。更に別の具体的な実施形態では、xは、2でありえ、yは、4≦y≦6でありうる。また別の具体的な実施形態では、xは、3でありえ、yは、3≦y≦5でありうる。
本発明によると、第1の化学官能基を抗体のFcドメインのリジン248に特異的に転移させるためのR1'-L2-SSFIを調製する方法が開示される。
第4.2節に記載の第1の化学官能基を抗体に転移させるための薬剤を調製する方法の一例として、本発明は、R1'-L2-SSAIを調製する方法であって、
本発明によるリンカーを、本発明による部位特異的抗体インタラクトームと反応させる工程
を含み、
リンカーのD2が、Cyアルキレン、Cyアルケニレン、又はCyアルキニレンであり、
部位特異的抗体インタラクトームのD3が、Cxアルキレンであり、
yが、1以上の整数であり、x及びyの合計が、1≦x+y≦5である
ことを特徴とする、方法を提供する。その上、方法により調製されるR1'-L2-SSAIは、抗体と反応して、第1の化学官能基を抗体のFcドメインのリジン248に特異的に転移させることができる。
本発明によると、第1の化学官能基を抗体のFcドメインのリジン248に特異的に転移させるためのR1'-L2-SSFIを調製するためのキットが開示される。
第4.2節に記載の第1の化学官能基を抗体に転移させるための薬剤を調製する方法の一例として、本発明は、R1'-L2-SSAIを調製するためのキットであって、
本発明によるリンカー;及び
本発明による部位特異的抗体インタラクトーム
を含み、
リンカーのD2が、Cyアルキレン、Cyアルケニレン、又はCyアルキニレンであり、
部位特異的抗体インタラクトームのD3が、Cxアルキレンであり、
yが、1以上の整数であり、x及びyの合計が、1≦x+y≦5である
ことを特徴とする、キットを提供する。
本発明によると、第1の化学官能基を抗体のFcドメインのリジン246に特異的に転移させるためのR1'-L2-SSFIを調製する方法が開示される。
第4.2節に記載の第1の化学官能基を抗体に転移させるための薬剤を調製する方法の一例として、本発明は、R1'-L2-SSAIを調製する方法であって、
本発明によるリンカーを、本発明による部位特異的抗体インタラクトームと反応させる工程
を含み、
リンカーのD2が、Cyアルキレン、Cyアルケニレン、又はCyアルキニレンであり、
部位特異的抗体インタラクトームのD3が、Cxアルキレンであり、
yが、1以上の整数であり、x及びyの合計が、9≦x+y≦12である
ことを特徴とする、方法を提供する。その上、方法により調製されるR1'-L2-SSAIは、抗体と反応して、第1の化学官能基を抗体のFcドメインのリジン246に特異的に転移させることができる。
本発明によると、第1の化学官能基を抗体のFcドメインのリジン246に特異的に転移させるためのR1'-L2-SSFIを調製するためのキットが開示される。
第4.2節に記載の第1の化学官能基を抗体に転移させるための薬剤を調製する方法の一例として、本発明は、R1'-L2-SSAIを調製するためのキットであって、
本発明によるリンカー;及び
本発明による部位特異的抗体インタラクトーム
を含み、
リンカーのD2が、Cyアルキレン、Cyアルケニレン、又はCyアルキニレンであり、
部位特異的抗体インタラクトームのD3が、Cxアルキレンであり、
yが、1以上の整数であり、x及びyの合計が、9≦x+y≦12である
ことを特徴とする、キットを提供する。
本発明によると、第1の化学官能基を抗体のFcドメインのリジン246又は248に選択的に転移させるためのR1'-L2-SSFIを調製する方法が開示される。
第4.2節に記載の第1の化学官能基を抗体に転移させるための薬剤を調製する方法の一例として、本発明は、R1'-L2-SSAIを調製する方法であって、
本発明によるリンカーを、本発明による部位特異的抗体インタラクトームと反応させる工程
を含み、
リンカーのD2が、Cyアルキレン、Cyアルケニレン、又はCyアルキニレンであり、
部位特異的抗体インタラクトームのD3が、Cxアルキレンであり、
yが、1以上の整数であり、x及びyの合計が、6≦x+y≦8である
ことを特徴とする、方法を提供する。その上、方法により調製されるR1'-L2-SSAIは、抗体と反応して、第1の化学官能基を抗体のFcドメインのリジン246又は248に選択的に転移させることができる。
本発明によると、第1の化学官能基を抗体のFcドメインのリジン246又は248に選択的に転移させるためのR1'-L2-SSFIを調製するためのキットが開示される。
第4.2節に記載の第1の化学官能基を抗体に転移させるための薬剤を調製する方法の一例として、本発明は、R1'-L2-SSAIを調製するためのキットであって、
本発明によるリンカー;及び
本発明による部位特異的抗体インタラクトーム
を含み、
リンカーのD2が、Cyアルキレン、Cyアルケニレン、又はCyアルキニレンであり、
部位特異的抗体インタラクトームのD3が、Cxアルキレンであり、
yが、1以上の整数であり、x及びyの合計が、6≦x+y≦8である
ことを特徴とする、キットを提供する。
本発明によると、そのFcドメインのリジン248に特異的に転移される第1の化学官能基を有する抗体を調製する方法が開示される。
第5.2節に記載の第1の化学官能基を含有する抗体を調製する方法の一例として、本発明は、R1'-Abを調製する方法であって、
第1の化学官能基を本発明による抗体に転移させるための薬剤を、抗体又はその断片と反応させる工程
を含み、
第1の化学官能基を抗体に転移させるための薬剤では、(Xa1)'のβ炭素と第1のカルボニル炭素との間の距離(Lc)が、およそ11.668Åより短い
ことを特徴とする、方法を提供する。
具体的な実施形態では、第1の化学官能基を抗体に転移させるための薬剤において、D3は、Cxアルキレンであり、D2は、Cyアルキレン、Cyアルケニレン、又はCyアルキニレンであり、
yは、1以上の整数でありえ、x及びyの合計は、1≦x+y≦5でありうる。
本発明によると、そのFcドメインのリジン248に特異的に転移された第1の化学官能基を有する抗体を調製するためのキットが開示される。
第5.2節に記載の第1の化学官能基を含有する抗体を調製する方法の一例として、本発明は、R1'-Abを調製するためのキットであって、
第1の化学官能基を本発明による抗体に転移させるための薬剤;及び
抗体又はその断片
を含み、
第1の化学官能基を抗体に転移させるための薬剤では、(Xa1)'のβ炭素と第1のカルボニル炭素との間の距離(Lc)が、およそ11.668Åより短い
ことを特徴とする、キットを提供する。
具体的な実施形態では、第1の化学官能基を抗体に転移させるための薬剤において、D3は、Cxアルキレンであり、D2は、Cyアルキレン、Cyアルケニレン、又はCyアルキニレンであり、
yは、1以上の整数でありえ、x及びyの合計は、1≦x+y≦5でありうる。
任意で、第5.2節に記載の第1の化学官能基を含有する抗体を調製する方法の一例として、本発明は、R1'-Abを調製するためのキットであって、
本発明によるリンカー;
本発明による部位特異的抗体インタラクトーム;及び
抗体又はその断片
を含み、
リンカーのD2が、Cyアルキレン、Cyアルケニレン、又はCyアルキニレンであり、
部位特異的抗体インタラクトームのD3が、Cxアルキレンであり、
yが、1以上の整数であり、x及びyの合計が、1≦x+y≦5である
ことを特徴とする、キットを提供する。
本発明によると、そのFcドメインのリジン246に特異的に転移された第1の化学官能基を有する抗体を調製する方法が開示される。
第5.2節に記載の第1の化学官能基を含有する抗体を調製する方法の一例として、本発明は、R1'-Abを調製する方法であって、
抗体又はその断片が、第1の化学官能基を本発明による抗体に転移させるための薬剤と反応させることを可能にする工程
を含み、
第1の化学官能基を抗体に転移させるための薬剤では、(Xa1)'のβ炭素と第1のカルボニル炭素との間の距離(Lc)が、およそ16.208Åより長い
ことを特徴とする、方法を提供する。
具体的な実施形態では、第1の化学官能基を抗体に転移させるための薬剤において、D3は、Cxアルキレンであり、D2は、Cyアルキレン、Cyアルケニレン、又はCyアルキニレンであり、
yは、1以上の整数でありえ、x及びyの合計は、9≦x+y≦12でありうる。
本発明によると、そのFcドメインのリジン246に特異的に転移された第1の化学官能基を有する抗体を調製するためのキットが開示される。
第5.2節に記載の第1の化学官能基を含有する抗体を調製する方法の一例として、本発明は、R1'-Abを調製するためのキットであって、
第1の化学官能基を本発明による抗体に転移させるための薬剤;及び
抗体又はその断片
を含み、
第1の化学官能基を抗体に転移させるための薬剤では、(Xa1)'のβ炭素と第1のカルボニル炭素との間の距離(Lc)が、およそ16.208Åより長い
ことを特徴とする、キットを提供する。
具体的な実施形態では、第1の化学官能基を抗体に転移させるための薬剤において、D3は、Cxアルキレンであり、D2は、Cyアルキレン、Cyアルケニレン、又はCyアルキニレンであり、
yは、1以上の整数でありえ、x及びyの合計は、9≦x+y≦12でありうる。
任意で、第5.2節に記載の第1の化学官能基を含有する抗体を調製する方法の一例として、本発明は、R1'-Abを調製するためのキットであって、
本発明によるリンカー;
本発明による部位特異的抗体インタラクトーム;及び
抗体又はその断片
を含み、
リンカーのD2が、Cyアルキレン、Cyアルケニレン、又はCyアルキニレンであり、
部位特異的抗体インタラクトームのD3が、Cxアルキレンであり、
yが、1以上の整数であり、x及びyの合計が、9≦x+y≦12である
ことを特徴とする、キットを提供する。
本発明によると、そのFcドメインのリジン246又は248に選択的に転移された第1の化学官能基を有する抗体を調製する方法が開示される。
第5.2節に記載の第1の化学官能基を含有する抗体を調製する方法の一例として、本発明は、R1'-Abを調製する方法であって、
第1の化学官能基を本発明による抗体に転移させるための薬剤を、抗体又はその断片と反応させる工程
を含み、
第1の化学官能基を抗体に転移させるための薬剤では、(Xa1)'のβ炭素と第1のカルボニル炭素との間の距離(Lc)が、およそ11.668Å以上、且つおよそ16.208Å以下である
ことを特徴とする、方法を提供する。
具体的な実施形態では、第1の化学官能基を抗体に転移させるための薬剤において、D3は、Cxアルキレンであり、D2は、Cyアルキレン、Cyアルケニレン、又はCyアルキニレンであり、
yは、1以上の整数でありえ、x及びyの合計は、6≦x+y≦8でありうる。
本発明によると、そのFcドメインのリジン246又は248に選択的に転移された第1の化学官能基を有する抗体を調製するためのキットが開示される。
第5.2節に記載の第1の化学官能基を含有する抗体を調製する方法の一例として、本発明は、R1'-Abを調製するためのキットであって、
第1の化学官能基を本発明による抗体に転移させるための薬剤;及び
抗体又はその断片
を含み、
第1の化学官能基を抗体に転移させるための薬剤では、(Xa1)'のβ炭素と第1のカルボニル炭素との間の距離(Lc)が、およそ11.668Å以上、且つおよそ16.208Å以下である
ことを特徴とする、キットを提供する。
具体的な実施形態では、第1の化学官能基を抗体に転移させるための薬剤において、D3は、Cxアルキレンであり、D2は、Cyアルキレン、Cyアルケニレン、又はCyアルキニレンであり、
yは、1以上の整数でありえ、x及びyの合計は、6≦x+y≦8でありうる。
任意で、第5.2節に記載の第1の化学官能基を含有する抗体を調製する方法の一例として、本発明は、R1'-Abを調製するためのキットであって、
本発明によるリンカー;
本発明による部位特異的抗体インタラクトーム;及び
抗体又はその断片
を含み、
リンカーのD2が、Cyアルキレン、Cyアルケニレン、又はCyアルキニレンであり、
部位特異的抗体インタラクトームのD3が、Cxアルキレンであり、
yが、1以上の整数であり、x及びyの合計が、6≦x+y≦8である
ことを特徴とする、キットを提供する。
本発明によると、そのFcドメインのリジン246及び248の両方に転移された第1の化学官能基を有する抗体を調製する方法が開示される。
本発明は、R1'-Abを調製する方法であって、
第1の化学官能基を抗体に転移させるための第1の薬剤を、抗体又はその断片と反応させる工程;及び
第1の化学官能基を抗体に転移させるための第2の薬剤を、抗体又はその断片と反応させる工程
を含む方法を提供する。
具体的な実施形態では、第1の化学官能基を抗体に転移させるための第1の薬剤は、上述の第1の化学官能基をFcドメインのリジン248に特異的に転移させるためのR1'-L2-SSFIでありえ、第1の化学官能基を抗体に転移させるための第2の薬剤は、上述の第1の化学官能基をFcドメインのリジン246に特異的に転移させるためのR1'-L2-SSFIでありうる。
具体的な実施形態では、第1の化学官能基を抗体に転移させるための第1の薬剤は、上述の第1の化学官能基をFcドメインのリジン246に特異的に転移させるためのR1'-L2-SSFIでありえ、第1の化学官能基を抗体に転移させるための第2の薬剤は、上述の第1の化学官能基をFcドメインのリジン248に特異的に転移させるためのR1'-L2-SSFIでありうる。
具体的な実施形態では、第1の化学官能基を抗体に転移させるための第1の薬剤を、抗体又はその断片と反応させる工程;及び、第1の化学官能基を抗体に転移させるための第2の薬剤を、抗体又はその断片と反応させる工程は、逐次実施しうる。
本発明によると、そのFcドメインのリジン246及び248の両方に転移された第1の化学官能基を有する抗体を調製するためのキットが開示される。
本発明は、R1'-Abを調製するためのキットであって、
第1の化学官能基を抗体に転移させるための第1の薬剤;
第1の化学官能基を抗体に転移させるための第2の薬剤;及び
抗体又はその断片
を含むキットを提供する。
具体的な実施形態では、第1の化学官能基を抗体に転移させるための第1の薬剤は、上述の第1の化学官能基をFcドメインのリジン248に特異的に転移させるためのR1'-L2-SSFIでありえ、第1の化学官能基を抗体に転移させるための第2の薬剤は、上述の第1の化学官能基をFcドメインのリジン246に特異的に転移させるためのR1'-L2-SSFIでありうる。
具体的な実施形態では、第1の化学官能基を抗体に転移させるための第1の薬剤は、上述の第1の化学官能基をFcドメインのリジン246に特異的に転移させるためのR1'-L2-SSFIでありえ、第1の化学官能基を抗体に転移させるための第2の薬剤は、上述の第1の化学官能基をFcドメインのリジン248に特異的に転移させるためのR1'-L2-SSFIでありうる。
5.5. 第1のカルボニル基の反応性を修飾することで、第1の化学官能基をより部位特異的に転移させることが可能になる。
第5.2節に上述した通り、第1の化学官能基を含有する抗体は、R1'-L2-SSFIの第1の化学官能基を攻撃する抗体の求核分子により調製することができる。第1のカルボニル基は、リンカーの第2のカルボニル基より軽度の反応性を有することを特徴とする(第2.2節参照)。第1のカルボニル基の反応性は、抗体のある特定のアミン基が、そのある特定のアミン基が第1のカルボニル基の近傍にある場合のみ、第1のカルボニル基と反応することができるように修飾されうる。こうして、本発明は、反応についての近傍条件により、第1のカルボニル基が任意のアミン基と十分に反応しないことを可能にし、反応の高い位置特異性を可能にする。
出願番号US 2018/0141976 A1及びWO 2018/199337 A1に開示される先行技術は、Fc-IIIの類似体を使用して、Fcドメインのリジン246又は248を部位選択的に修飾することを目的とする。先行技術が、ジスクシンイミジル架橋剤を使用するので、第1のカルボニル基及び第2のカルボニル基は、等しく高い反応性がある(第2.2節参照)。従って、第1のカルボニル基が、高い反応性を有し、反応についての近傍条件を有さないので、いかなるリジン残基も、標識化される可能性が高い。
5.6. 本発明に従って調製される第1の化学官能基を含有する抗体は、高い均一性及び収率を有する。
(1)「所望の数」の第1の化学官能基を(2)「抗体のある特定の部位」に特異的に転移させるための技術的課題及び技術的解決法は、第5.3節及び第5.4節を参照して詳述している。以下の実施例から分かる通り、技術的解決法により調製される第1の化学官能基を含有する抗体の化学官能基が、Fcドメインのある特定のリジン残基に高い均一性及び収率で転移することが分かる(実施例3.3参照)。従って、本発明は、これらの事実に基づいて完成した。
背景技術で示した通り、抗体標識化による高い均一性を有するコンジュゲート生成物は、(1)抗体コンジュゲートの機能は、均一に保証される、(2)抗体コンジュゲートは、その効果が予測可能なため、安全である、及び(3)抗体の機能性領域を避けながら抗体を標識化することが可能なので、抗体の機能の低下を避けることができるという利点を有する。
出願番号US 2018/0141976 A1及びWO 2018/199337 A1に開示される先行技術は、Fc-IIIの類似体を使用して、Fcドメインのリジン246又は248を部位選択的に修飾することを目的とする。しかし、先行技術によると、抗体の均一性及び収率は、2つの理由により必然的に低い。先行技術によると、第一に、(Xa1)'のβ炭素と第1のカルボニル炭素との間の距離(Lc)が、およそ15Åであるので、246位又は248位のいずれかでリジンを選択的に標識化することが可能であるが、リジン246及び248の1つを特異的に選択して標識化することは不可能である。第二に、先行技術による架橋剤の第1のカルボニル基は、高い反応性により反応についての近傍条件を有さない(第5.5節参照)。結果として、第1のカルボニル基は、いかなるリジン残基とも反応する可能性が高い。従って、先行技術は、抗体標識化生成物の均一性及び収率が本発明のものより劣っているという欠点を有する。
5.7. 本発明による第1の化学官能基を含有する抗体が、そのFcRn結合部位が遮断されていないので、抗体の機能は低下しない。
(1)パラトープから離間している;及び(2)FcRnを含むFcRの認識部位から離間している抗体標識化部位に対する設計原理は、第1.1節に上述している。リジン246及び248が、Fcドメインに含まれるので、リジン246及び248は、パラトープから離間しているが、対応する部位は、問題がある可能性のある、FcRnの認識部位に重なりうる。
FcRnが、様々な機能を有し、特に、IgGリサイクリングに関与することで抗体の半減期を延長するのに重要な役割を担うことが知られている。抗体をin vivoで使用する場合、即ち、抗体を治療剤、造影剤等として使用する場合、FcRnと抗体との間の相互作用は、円滑に起こりえず、それにより、抗体の半減期が短いことで抗体が正常に機能することが不可能になる。
5.7.1. リジン246及びリジン248は、抗体のFcRn結合部位から離間している
Fcドメインのリジン残基とFcのFcRn結合部位との間の間隔は、Fcドメインのリジン残基を選択するのに重要な考慮事項であった。図13は、FcドメインとFcRnとの間の結合構造、並びに、FcRn結合部位並びにFcドメインのリジン246及び248の位置を示す。論文及びコンピュータモデリングを、FcドメインとFcRnとの間の結合構造を示すために利用した(Ying T、Ju TW、Wang Y、Prabakaran P、Dimitrov DS.、Interactions of IgG1 CH2 and CH3 Domains with FcRn; Front Immunol. 2014年; 5:146頁、Monnet C、Jorieux S、Urbain R等、Selection of IgG Variants with Increased FcRn Binding Using Random and Directed Mutagenesis: Impact on Effector Functions. Front Immunol. 2015年; 6:39頁)(図13の左図を参照)。同じ論文データに開示されるFcRn結合部位、並びにリジン246及び248は、Fcドメインで示される(図13の右図を参照)。2つの図面を参照して、リジン246及び248の側鎖が、FcRn結合部位と反対の方向に向いていることが分かる。
これらの事実から、抗体標識化部位を選ぶ場合、抗体標識化部位は、FcRnとFcドメインとの間の相互作用に影響を及ぼさないことを考慮した。実際に、抗体標識化部位が意図した通りにFcRnの結合に影響を及ぼさないように、調製した抗体の半減期が短縮しないことを確認した(実施例5を参照)。
5.8. 本発明による第1の化学官能基を含有する抗体を調製するプロセスは、SSAI脱離を特徴とする。
第5.2節のスキーム4及び5から分かる通り、本発明によるR1'-Abを調製するプロセスは、SSAIが求核置換反応の脱離基に含まれるので、SSAIが、最終生成物R1'-Abから脱離することを特徴とする。本発明によるFcドメインとSSFIとの間の結合構造(第3.2節参照)は、Fc及びFcRnとの間の結合部位と比較することで解析した。結果として、FcRn結合部位の一部が、SSFIをカバーすることを確認した(図14)。これに関して、SSFIが、R1'-Abを調製するプロセスで脱離しない場合、SSFIは、抗体の物理的特性(例えば、半減期等)に悪影響を及ぼすことが予期されうる。
出願番号US 2018/0141976 A1に開示される先行技術は、Fc-IIIの類似体を使用して、Fcドメインのリジン246又は248を部位選択的に修飾することを目的とする。しかし、対応する先行技術は、SSFIが調製の過程で脱離しないので、SSFIが、最終的な抗体標識化生成物に含まれる点で、本発明と異なる。
出願番号WO 2018/199337 A1に開示される先行技術は、Fc-III、式中IIIの類似体を使用して、Fcドメインのリジン246又は248を部位選択的に修飾することを目的とし、SSFIは、最終的な抗体標識化生成物に含まれない。しかし、対応する先行技術は、調製の過程でSSFIを除去するために「二価基である切断可能なリンカー」を切断する工程を更に含むが、本発明は、任意の追加のプロセスを伴わずにコンジュゲーション反応の間にSSFIが脱離するという利点を有する。その上、対応する発明による二価基である切断可能なリンカーの切断は、抗体の構造を形成するジスルフィド結合が切断されうるという欠点を有する。本発明が、任意の特別な条件なしに容易に起こる求核置換反応を使用するので、この課題は、劇的に改善することができる。
5.9. 本発明による第1のクリック反応性官能基を含有する抗体が、高い生体反応性の化学官能基を含有しないので、コンジュゲート形成反応以外の副反応は起こらない。
本発明によるR1'-Abを調製する方法により調製される抗体は、式7:
Figure 0007393810000054
(式中、R1'は、リジン246又は248に転移され、X4は、NHでありえ、D1は、任意のアルキレン、アルケニレン、又はアルキニレンでありうる)
で表される構造を有する。この場合、抗体に接続する-NH-(CO)-は、一般にin vivoで安定なアミド結合である。その上、D1は、一般に、高い生体反応性ではない構造を有する。従って、高い生体反応性の構造が標識化した分子(R1')以外の分子に添加されないので、本発明に従って調製されるR1'-Abが高い安全性を有することが予期される。
特に、R1'-Abが、それに転移されたクリック反応性残基を有するH1-Abである場合、高い生体反応性構造は、R1'-Abに添加されない。従って、クリック化学反応の収率は、クリック化学反応以外の二次反応が起きないので改善することができる。
出願番号WO 2018/199337 A1に開示される先行技術は、Fc-IIIの類似体を使用して、Fcドメインのリジン246又は248を部位選択的に修飾し、生体直交性(biorthogonal)官能基を使用することを目的とする。しかし、対応する先行技術は、対応する先行技術による抗体生成物が、「二価基である切断可能なリンカー」を切断する間に、チオール、ヒドロキシ、カルボン酸、リン酸、アミン等のような追加の化学官能基を有することが可能になる点で、本発明と異なる。このような追加の化学官能基は、生体反応性官能基であるので、抗体生成物の安全性に影響を及ぼしうる。
6. ペイロード(Cm-H2)
本発明によると、ペイロードが開示される。このような化合物は、本明細書では、記号「Cm-H2」で示される。
本出願は、式9:
[式9]
Cm-H2
(式中、Cmは、カーゴ部分であり、
H2は、第2のクリック反応性官能基である)
で表されるCm-H2を提供する。
具体的な実施形態では、Cmは、担体部分、蛍光部分、薬物部分、又は放射性部分を含みうる。その上、R1'は、薬物部分を含みうる。加えて、R1'は、VCリンカーを含みうる。他の具体的な実施形態では、R1'は、パラトープを含む抗体又はその類似体を含みうる。
具体的な実施形態では、Cmが、薬物部分を含む場合、薬物部分は、抗がん薬でありうる。その上、抗がん薬は、DM1、DM3、DM4、アブリン、リシンA、シュードモナス外毒素、コレラ毒素、ジフテリア毒素、腫瘍壊死因子、α-インターフェロン、β-インターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子、組織プラスミノゲン活性化因子、サイトカイン、アポトーシス誘導剤、抗血管新生剤、リンホカイン、タキサン、DNA-アルキル化剤、アントラサイクリン、ツブリシン類似体、デュオカルマイシン類似体、アウリスタチンE、アウリスタチンF、メイタンシノイド、反応性ポリエチレングリコール残基を含む細胞毒性剤、タクソン、サイトカラシンB、グラミシジンD、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、T.コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンD、1-ジヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシン、メソトレキセート、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、シタラビン、5-フルオロウラシルデカルバジン、メクロレタミン、チオテパ、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン、ロムスチン、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンC、シスプラチン、ダクチノマイシン、ブレオマイシン、アントラマイシン、カリケアミシン、アビラテロン、ベンダムスチン、ボルテゾミブ、カルボプラチン、カバジタキセル、ダサチニブ、ドセタキセル、エピルビシン、エルロチニブ、エベロリムス、ゲムシタビン、ゲフィチニブ、イダルビシン、イマチニブ、ヒドロキシ尿素、ラパチニブ、リュープロレリン、メルファラン、ネダプラチン、ニロチニブ、オキサリプラチン、パゾパニブ、ペメトレキセド、ピコプラチン、ロミデプシン、サトラプラチン、ソラフェニブ、ベムラフェニブ、スニチニブ、テニポシド、トリプラチン、及びビノレルビンから選択される1つ又は複数を含みうる。
具体的な実施形態では、Cmは、複数の担体部分、蛍光部分、薬物部分、又は放射性部分を含みうる。その上、Cmは、2つ以上の薬物部分を含みうる。加えて、Cmは、VCリンカーを含みうる。
具体的な実施形態では、H2は、アルキン、アジド、歪んだアルキン、ジエン、ジエノフィル、アルケン、チオール、及びテトラジンから選択される任意の1つを含みうる。更に、H2は、アジド、又は歪んだアルキンでありうる。更に、H2は、アジド、又はジベンゾシクロオクチン-アミンでありうる。加えて、H2は、ジエン、又はジエノフィルでありうる。更に、H2は、テトラジン、又はノルボルネンでありうる。或いは、H2は、テトラジン、又はtrans-シクロオクテンでありうる。
具体的な実施形態では、H2が、本発明によるH1-Abと反応する場合、H2は、第1のクリック反応性官能基(H1)に相補的でありうる。
7.抗体-ペイロードコンジュゲート(Cm-Ab)
本発明によると、抗体及びペイロードのコンジュゲート(即ち、抗体-ペイロードコンジュゲート)が開示される。このような化合物は、本明細書では、記号「Cm-Ab」で示される。
本出願は、式10:
Figure 0007393810000055
(式中、Cmは、カーゴ部分であり、
Bは、第1のクリック反応性官能基と第2のクリック反応性官能基との間のクリック化学反応により形成される構造であり、
D1は、任意のアルキレン、アルケニレン、又はアルキニレンであり、
X4は、NH、O、又はSであり、
Abは、抗体である)
で表されるCm-Abを提供する。
カーゴ部分の内容は、節「6.ペイロード」に開示される内容を適用する。
具体的な実施形態では、Bは、アルキン、アジド、歪んだアルキン、ジエン、ジエノフィル、アルケン、チオール、及びテトラジンから選択される任意の1つと、そのパートナー「クリック反応性官能基」との間のクリック化学反応により形成される構造でありうる。その上、Bは、
Figure 0007393810000056
(式中、A1及びA2の両方は、A1及びA2が同じ部分に接続しないように、カーゴ部分又はD1と接続し、Rxは、H、ハロゲン、及びC1～3アルキルから選択されうる)
から選択される任意の1つでありうる。更に、Bは、
Figure 0007393810000057
でありうる。加えて、Bは、
Figure 0007393810000058
でありうる。
具体的な実施形態では、D1は、共有結合、C1～4アルキレン、C2～4アルケニレン、C2～4アルキニレン、及びC3～8シクロアルキレンから選択される任意の1つを含みうる。その上、D1は、-CH2OCH2-でありうる。加えて、D1は、共有結合でありうる。
具体的な一実施形態では、X4は、NHでありうる。
具体的な実施形態では、Abは、ヒト抗体でありうる。他の具体的な実施形態では、Abは、非ヒト動物抗体でありうる。具体的な実施形態では、Abは、免疫グロブリンG(IgG)でありうる。具体的な実施形態では、Abは、完全な抗体でありうる。他の具体的な実施形態では、Abは、抗体の断片でありうる。
具体的な実施形態では、X4及びAbは、AbのFabドメインを介して接続することができる。他の具体的な実施形態では、X4及びAbは、AbのFcドメインを介して接続することができる。その上、X4及びAbは、AbのFcドメインのリジン246又は248を介して接続することができる。更に、X4及びAbは、AbのFcドメインのリジン246を介して接続することができる。更に、X4及びAbは、AbのFcドメインのリジン248を介して接続することができる。或いは、X4及びAbは、AbのFcドメインのリジン246及び248を介して接続することができる。具体的な実施形態では、X4及びAbは、Abの2つのFcドメインの1つのみを介して接続することができる。他の具体的な実施形態では、X4及びAbは、Abの2つのFcドメインの両方を介して接続することができる。
本発明は、以下の式10-1:
[式10-1]
G-P-S-V-F-L-F-P-P-(K)"-P-K-D-T-L-M-I(配列番号23)
[式中、Gは、グリシンであり、Pは、プロリンであり、Sは、セリンであり、Vは、バリンであり、Fは、フェニルアラニンであり、Lは、ロイシンであり、Kは、リジンであり、Dは、アスパラギン酸であり、Tは、スレオニンであり、Mは、メチオニンであり、Iは、イソロイシンであり、
(K)"は、
Figure 0007393810000059
(式中、Cmは、カーゴ部分であり、
Bは、第1のクリック反応性官能基と第2のクリック反応性官能基との間のクリック化学反応により形成される構造であり、
D1は、任意のアルキレン、アルケニレン、又はアルキニレンである)である]
のアミノ酸配列を含む抗体又はその断片を提供する。抗体又はその断片は、そのFcドメインのリジン246にコンジュゲートするカーゴ部分、又はリジン246に相当する部位を有する。
カーゴ部分の内容は、節「6.ペイロード」に開示される内容を適用する。
具体的な実施形態では、Bは、アルキン、アジド、歪んだアルキン、ジエン、ジエノフィル、アルケン、チオール、及びテトラジンから選択される任意の1つと、そのパートナー「クリック反応性官能基」との間のクリック化学反応により形成される構造でありうる。その上、Bは、
Figure 0007393810000060
(式中、A1及びA2の両方は、A1及びA2が同じ部分に接続しないように、カーゴ部分又はD1と接続し、Rxは、H、ハロゲン、及びC1～3アルキルから選択されうる)
から選択される任意の1つでありうる。更に、Bは、
Figure 0007393810000061
でありうる。加えて、Bは、
Figure 0007393810000062
でありうる。
具体的な実施形態では、D1は、共有結合、C1～4アルキレン、C2～4アルケニレン、C2～4アルキニレン、及びC3～8シクロアルキレンから選択される任意の1つを含みうる。その上、D1は、-CH2OCH2-でありうる。加えて、D1は、共有結合でありうる。
具体的な実施形態では、抗体は、ヒト抗体でありうる。他の具体的な実施形態では、抗体は、非ヒト動物抗体でありうる。具体的な実施形態では、抗体は、免疫グロブリンG(IgG)でありうる。具体的な実施形態では、抗体は、完全な抗体でありうる。他の具体的な実施形態では、抗体は、抗体の断片でありうる。
具体的な実施形態では、抗体は、2つのそのFcドメインの1つのみにおいて式10-1のアミノ酸配列を含みうる。他の具体的な実施形態では、抗体は、2つのそのFcドメインの両方において式10-1のアミノ酸配列を含みうる。
本発明は、以下の式10-2:
[式10-2]
G-P-S-V-F-L-F-P-P-K-P-(K)"-D-T-L-M-I(配列番号24)
[式中、Gは、グリシンであり、Pは、プロリンであり、Sは、セリンであり、Vは、バリンであり、Fは、フェニルアラニンであり、Lは、ロイシンであり、Kは、リジンであり、Dは、アスパラギン酸であり、Tは、スレオニンであり、Mは、メチオニンであり、Iは、イソロイシンであり、
(K)"は、
Figure 0007393810000063
(式中、Cmは、カーゴ部分であり、
Bは、第1のクリック反応性官能基と第2のクリック反応性官能基との間のクリック化学反応により形成される構造であり、
D1は、任意のアルキレン、アルケニレン、又はアルキニレンである)である]
のアミノ酸配列を含む抗体又はその断片を提供する。抗体又はその断片は、そのFcドメインのリジン246にコンジュゲートするカーゴ部分、又はリジン246に相当する部位を有する。
カーゴ部分の内容は、節「6.ペイロード」に開示される内容を適用する。
具体的な実施形態では、Bは、アルキン、アジド、歪んだアルキン、ジエン、ジエノフィル、アルケン、チオール、及びテトラジンから選択される任意の1つと、そのパートナー「クリック反応性官能基」との間のクリック化学反応により形成される構造でありうる。その上、Bは、
Figure 0007393810000064
(式中、A1及びA2の両方は、A1及びA2が同じ部分に接続しないように、カーゴ部分又はD1と接続し、Rxは、H、ハロゲン、及びC1～3アルキルから選択されうる)
から選択される任意の1つでありうる。更に、Bは、
Figure 0007393810000065
でありうる。加えて、Bは、
Figure 0007393810000066
でありうる。
具体的な実施形態では、D1は、共有結合、C1～4アルキレン、C2～4アルケニレン、C2～4アルキニレン、及びC3～8シクロアルキレンから選択される任意の1つを含みうる。その上、D1は、-CH2OCH2-でありうる。加えて、D1は、共有結合でありうる。
具体的な実施形態では、抗体は、ヒト抗体でありうる。他の具体的な実施形態では、抗体は、非ヒト動物抗体でありうる。具体的な実施形態では、抗体は、免疫グロブリンG(IgG)でありうる。具体的な実施形態では、抗体は、完全な抗体でありうる。他の具体的な実施形態では、抗体は、抗体の断片でありうる。
具体的な実施形態では、抗体は、2つのそのFcドメインの1つのみにおいて式10-2のアミノ酸配列を含みうる。他の具体的な実施形態では、抗体は、2つのそのFcドメインの両方において式10-2のアミノ酸配列を含みうる。
本発明は、以下の式10-3:
[式10-3]
G-P-S-V-F-L-F-P-P-(K)"-P-(K)"-D-T-L-M-I(配列番号25)
[式中、Gは、グリシンであり、Pは、プロリンであり、Sは、セリンであり、Vは、バリンであり、Fは、フェニルアラニンであり、Lは、ロイシンであり、Kは、リジンであり、Dは、アスパラギン酸であり、Tは、スレオニンであり、Mは、メチオニンであり、Iは、イソロイシンであり、
(K)"は、各々独立して、
Figure 0007393810000067
(式中、Cmは、カーゴ部分であり、
Bは、第1のクリック反応性官能基と第2のクリック反応性官能基との間のクリック化学反応により形成される構造であり、
D1は、任意のアルキレン、アルケニレン、又はアルキニレンである)である]
のアミノ酸配列を含む抗体又はその断片を提供する。抗体又はその断片は、そのFcドメインのリジン246にコンジュゲートするカーゴ部分、又はリジン246に相当する部位を有する。
カーゴ部分の内容は、節「6.ペイロード」に開示される内容を適用する。
具体的な実施形態では、Bは、アルキン、アジド、歪んだアルキン、ジエン、ジエノフィル、アルケン、チオール、及びテトラジンから選択される任意の1つと、そのパートナー「クリック反応性官能基」との間のクリック化学反応により形成される構造でありうる。その上、Bは、
Figure 0007393810000068
(式中、A1及びA2の両方は、A1及びA2が同じ部分に接続しないように、カーゴ部分又はD1と接続し、Rxは、H、ハロゲン、及びC1～3アルキルから選択されうる)
から選択される任意の1つでありうる。更に、Bは、
Figure 0007393810000069
でありうる。加えて、Bは、
Figure 0007393810000070
でありうる。
具体的な実施形態では、D1は、共有結合、C1～4アルキレン、C2～4アルケニレン、C2～4アルキニレン、及びC3～8シクロアルキレンから選択される任意の1つを含みうる。その上、D1は、-CH2OCH2-でありうる。加えて、D1は、共有結合でありうる。
具体的な実施形態では、抗体は、ヒト抗体でありうる。他の具体的な実施形態では、抗体は、非ヒト動物抗体でありうる。具体的な実施形態では、抗体は、免疫グロブリンG(IgG)でありうる。具体的な実施形態では、抗体は、完全な抗体でありうる。他の具体的な実施形態では、抗体は、抗体の断片でありうる。
具体的な実施形態では、抗体は、2つのそのFcドメインの1つのみにおいて式10-3のアミノ酸配列を含みうる。他の具体的な実施形態では、抗体は、2つのそのFcドメインの両方において式10-3のアミノ酸配列を含みうる。
本発明は、式10-1、10-2、及び10-3から選択される1つ又は複数のアミノ酸配列を含む抗体又はその断片を提供する。この場合、式10-1～10-3の内容は、上述した通りである。
具体的な実施形態では、D1は、共有結合でありうる。
具体的な実施形態では、抗体又はその断片は、式10-1のアミノ酸配列のみを含み、式10-2及び10-3のアミノ酸配列を含まない。その上、抗体又はその断片は、2つのそのFcドメインの1つのみにおいて式10-1のアミノ酸配列を含みうる。加えて、抗体は、2つのそのFcドメインの両方において式10-1のアミノ酸配列を含みうる。
他の具体的な実施形態では、抗体又はその断片は、式10-2のアミノ酸配列のみを含み、式10-1及び10-3のアミノ酸配列を含まない。その上、抗体又はその断片は、2つのそのFcドメインの1つのみにおいて式10-2のアミノ酸配列を含みうる。加えて、抗体は、2つのそのFcドメインの両方において式10-2のアミノ酸配列を含みうる。
具体的な実施形態では、抗体又はその断片は、式10-3のアミノ酸配列のみを含み、式10-1及び10-2のアミノ酸配列を含まない。その上、抗体又はその断片は、2つのそのFcドメインの1つのみにおいて式10-3のアミノ酸配列を含みうる。加えて、抗体は、2つのそのFcドメインの両方において式10-3のアミノ酸配列を含みうる。
7.1. 抗体薬物コンジュゲート(ADC)
本発明によると、新規の抗体薬物コンジュゲート(ADC)が開示される。本発明によるADCとは、抗体ペイロードコンジュゲートでのペイロードが薬物部分を含むことを意味する。
本発明は、カーゴ部分が薬物部分を含む、本発明によるCm-Abを提供する。
具体的な実施形態では、カーゴ部分は、2つ以上の薬物部分を含みうる。
具体的な実施形態ではが、薬物部分は、抗がん薬でありうる。その上、抗がん薬は、DM1、DM3、DM4、アブリン、リシンA、シュードモナス外毒素、コレラ毒素、ジフテリア毒素、腫瘍壊死因子、α-インターフェロン、β-インターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子、組織プラスミノゲン活性化因子、サイトカイン、アポトーシス誘導剤、抗血管新生剤、リンホカイン、タキサン、DNA-アルキル化剤、アントラサイクリン、ツブリシン類似体、デュオカルマイシン類似体、アウリスタチンE、アウリスタチンF、メイタンシノイド、反応性ポリエチレングリコール残基を含む細胞毒性剤、タクソン、サイトカラシンB、グラミシジンD、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、T.コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンD、1-ジヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシン、メソトレキセート、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、シタラビン、5-フルオロウラシルデカルバジン、メクロレタミン、チオテパ、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン、ロムスチン、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンC、シスプラチン、ダクチノマイシン、ブレオマイシン、アントラマイシン、カリケアミシン、アビラテロン、ベンダムスチン、ボルテゾミブ、カルボプラチン、カバジタキセル、ダサチニブ、ドセタキセル、エピルビシン、エルロチニブ、エベロリムス、ゲムシタビン、ゲフィチニブ、イダルビシン、イマチニブ、ヒドロキシ尿素、ラパチニブ、リュープロレリン、メルファラン、ネダプラチン、ニロチニブ、オキサリプラチン、パゾパニブ、ペメトレキセド、ピコプラチン、ロミデプシン、サトラプラチン、ソラフェニブ、ベムラフェニブ、スニチニブ、テニポシド、トリプラチン、及びビノレルビンから選択される1つ又は複数を含みうる。
具体的な実施形態では、カーゴ部分は、VCリンカーを含みうる。
7.2. 抗体-ペイロードコンジュゲートを調製する方法
本発明によると、抗体-ペイロードコンジュゲートを調製する方法が開示される。
本発明の抗体-ペイロードコンジュゲートは、Cm-H2がH1-Abと反応させることを可能にすることにより調製することができる。この場合、H1-Abの内容は、第5.1節に開示される内容を適用し、第6節に開示される内容は、Cm-H2に対して適用する。H1-Abの第1のクリック反応性官能基及びCm-H2の第2のクリック反応性官能基が、互いに相補的である場合、即ち、H1-Abの第1のクリック反応性官能基及びCm-H2の第2のクリック反応性官能基が、パートナークリック反応性官能基として機能する場合、クリック化学反応が生じて、本発明による抗体-ペイロードコンジュゲートが調製されうる。クリック化学反応の内容は、上節「定義」で十分に説明した。クリック化学反応は、生体直交性反応であり、反応が非常に迅速な反応速度で起こり、強い結合構造を形成するのに使用されるという利点を有する。従って、クリック化学反応は、以下の第7.3節及び第7.4節と同じ利点を有する。
本発明は、抗体-ペイロードコンジュゲートを調製する方法であって、本発明による第1のクリック反応性官能基を含有する抗体を、本発明によるペイロードと反応させる工程を含み、ペイロードのH2が、第1のクリック反応性官能基に相補的な第2のクリック反応性官能基であることを特徴とする方法を提供する。
この場合、第5.1節で提供される抗体は、第1のクリック反応性官能基を含有する抗体に適用し、第6節で提供されるペイロードは、ペイロードに適用する。リジン246及び/又はリジン248の第1のクリック反応性官能基を含有する全ての抗体が、第5.1節に開示されるので、カーゴ部分がリジン246及び/又はリジン248にコンジュゲートする抗体-ペイロードコンジュゲートは、完全に再現可能な程度に開示されることが望ましい(第7節の式10、及び10-1～10-3を参照)。
本発明は、抗体-ペイロードコンジュゲートを調製するためのキットであって、本発明による第1のクリック反応性官能基を含有する抗体;及び、本発明によるペイロードを含み、ペイロードのH2が、第1のクリック反応性官能基に相補的な第2のクリック反応性官能基であることを特徴とするキットを提供する。
この場合、第5.1節で提供される抗体は、第1のクリック反応性官能基を含有する抗体に適用し、第6節で提供されるペイロードは、ペイロードに適用する。
任意で、本発明は、抗体-ペイロードコンジュゲートを調製するためのキットであって、
抗体;
第1のクリック反応性官能基を本発明による抗体に転移させるための薬剤;及び
本発明によるペイロード
を含むキットを提供する。
具体的な実施形態では、第1のクリック反応性官能基を抗体に転移させるための薬剤は、第1のクリック反応性官能基を本発明による抗体のFcドメインのリジン246又は248に特異的に転移させるためのH1-L2-SSFIでありうる。他の具体的な実施形態では、第1のクリック反応性官能基を抗体に転移させるための薬剤は、第1のクリック反応性官能基を本発明による抗体のFcドメインのリジン246に特異的に転移させるためのH1-L2-SSFIでありうる。更に別の具体的な実施形態では、第1のクリック反応性官能基を抗体に転移させるための薬剤は、第1のクリック反応性官能基を本発明による抗体のFcドメインのリジン248に特異的に転移させるためのH1-L2-SSFIでありうる。
任意で、本発明は、抗体-ペイロードコンジュゲートを調製するためのキットであって、
抗体;
本発明によるリンカー;
本発明による部位特異的抗体インタラクトーム;及び
本発明によるペイロード
を含むキットを提供する。
具体的な実施形態では、リンカーのD2は、Cyアルキレン、Cyアルケニレン、又はCyアルキニレンであり、部位特異的抗体インタラクトームのD3は、Cxアルキレンであり、yは、1以上の整数でありうる。その上、x及びyの合計は、1≦x+y≦5でありうる。加えて、x及びyの合計は、6≦x+y≦8でありうる。更に、x及びyの合計は、9≦x+y≦12でありうる。
7.3. 本発明による抗体-ペイロードコンジュゲートは、生体直交性反応を使用して、安定な結合を形成する。
本発明による抗体-ペイロードコンジュゲートは、クリック化学反応を通して形成される。クリック化学反応は、in vivoで天然に存在する生化学的現象に影響を及ぼさない生体直交性反応である。その上、生体直交性反応により形成される結合は、in vivoでのリアーゼに認識されない。従って、本発明による抗体-ペイロードコンジュゲートは、抗体及びカーゴ部分が、in vivoで非常に安定な結合を形成するという利点を有する。
7.4. 本発明に従って調製される抗体-ペイロードコンジュゲートは、高い均一性及び収率を有する。
第5.6節に上述した通り、本発明による第1のクリック反応性官能基を含有する抗体は、高い均一性及び収率を有する。従って、本発明による抗体から調製される抗体-ペイロードコンジュゲートは、これも高い均一性及び収率を有するという利点を有する。Cm-Abの均一性は、抗体コンジュゲートが均一な性能を有するために高い必要がある。
出願番号US 2018/0141976 A1及びWO 2018/199337 A1に開示される先行技術により調製される抗体コンジュゲートの場合、抗体コンジュゲートが、第5.6節に上述した通り、収率及び均一性が不十分であるので、性能の均一性に悪影響が存在しうる。
7.5. 本発明による抗体-ペイロードコンジュゲートが、そのFcRn結合部位が遮断されていないので、抗体の機能は低下しない。
本発明によるCm-Abは、第5.7節及び第5.8節の記載と同じ利点を有する。特に、in vivoで使用するADCの薬物動態学的(PK)特性は、ADCが延長した半減期を有するので、大幅に改善することができる。
出願番号US 2018/0141976 A1に開示される先行技術により調製されるADCのFcRn結合部位は、SSFIが最終的な抗体標識化生成物に含まれるので遮断される。従って、本発明によるADCは、対応する先行技術によるADCと比較して、優れたPK特性を有する。
7.6. 抗体-薬物コンジュゲートが、高い生体反応性の化学官能基を含有しないので、本発明による抗体-薬物コンジュゲートは安定である。
本発明によるCm-Abは、第5.9節の記載と同じ利点を有する。特に、in vivoで使用するADCの薬力学的(PD)特性は、ADCが円滑な抗体-薬物作用を可能にするので、大幅に改善することができる。
出願番号WO 2018/199337 A1に開示される先行技術により調製されるADCの場合、チオール、ヒドロキシ、カルボン酸、リン酸、アミン等のような追加の化学官能基は、最終的な抗体標識化生成物に含まれる。従って、本発明によるADCは、対応する先行技術によるADCと比較して、優れたPD特性を有する。
8. 組成物
本発明によると、抗体を含む組成物が開示される。この場合、抗体は、本発明による第1の化学官能基を含有する抗体でありうる。或いは、抗体は、本発明による抗体-ペイロードコンジュゲートでありうる。その上、抗体は、本発明による抗体-薬物コンジュゲートでありうる。
本発明による組成物は、組成物に含まれる抗体の機能に依存して様々な用途に使用することができる。例えば、第1の化学官能基又はカーゴ部分が、放射性部分を含む場合、対応する組成物は、放射性造影剤等として使用することができる。或いは、第1の化学官能基又はカーゴ部分が、蛍光部分を含む場合、対応する組成物は、酵素結合性免疫吸着アッセイ(ELISA)等で使用される標識として使用することができる。或いは、第1の化学官能基又はカーゴ部分が、薬物部分を含む場合、対応する組成物は、医薬組成物として使用することができる。この場合、関連技術分野において一般に使用される組成物の成分は、本発明の範囲内にある。その上、関連技術において一般に使用される対応する組成物の組成比もまた、本発明の範囲内にある。
本発明は、本発明による第1の化学官能基を含有する抗体を含む、組成物を提供する。具体的な実施形態では、第1の化学官能基を含有する抗体は、式7、7-1～7-3、8、及び8-1～8-3から選択される少なくとも1つでありうる。
その上、本発明は、本発明による第1のクリック反応性官能基を含有する抗体を含む、組成物を提供する。具体的な実施形態では、第1のクリック反応性官能基を含有する抗体は、式8、及び8-1～8-3から選択される少なくとも1つでありうる。
加えて、本発明は、本発明による抗体-ペイロードコンジュゲートを含む、組成物を提供する。この場合、第7節に記載の内容は、抗体-ペイロードコンジュゲートの内容に適用する。
任意で、本発明は、本発明による抗体-薬物コンジュゲートを含む、組成物を提供する。この場合、第7.1節に記載の内容は、抗体-薬物コンジュゲートの内容に適用する。
医薬組成物
以下の内容は、組成物が、診断、予防、及び/又は治療目的で使用される医薬組成物であることに関する。ここの内容「医薬組成物」のみにおいて、本発明による全てのR1'-Ab、H1-Ab、Cm-Ab、及びADCは、用語「抗体又はその断片」と互換的に使用される。
本発明は、本発明による抗体又はその断片を含む医薬組成物を提供する。その上、医薬組成物は、がんを処置するための組成物でありうる。更に、がんは、膀胱がん、骨がん、脳がん、乳がん、心臓がん、子宮頚部がん、結腸がん、直腸がん、食道がん、線維肉腫、胃(gastric)がん、胃(stomach)がん、頭頚部がん、カポジ肉腫、腎がん、白血病、肝がん、肺がん、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、卵巣がん、膵がん、陰茎がん、前立腺がん、精巣生殖細胞がん、胸腺腫、及び胸腺癌から選択される任意の1つを含みうる。更に、がんは、乳がんでありうる。
本発明は、本発明による抗体又はその断片を含む医薬組成物を対象に投与する工程を含む、治療方法を提供する。その上、治療方法は、がんを処置する方法でありうる。更に、がんは、膀胱がん、骨がん、脳がん、乳がん、心臓がん、子宮頚部がん、結腸がん、直腸がん、食道がん、線維肉腫、胃(gastric)がん、胃(stomach)がん、頭頚部がん、カポジ肉腫、腎がん、白血病、肝がん、肺がん、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、卵巣がん、膵がん、陰茎がん、前立腺がん、精巣生殖細胞がん、胸腺腫、及び胸腺癌から選択される任意の1つを含みうる。更に、がんは、乳がんでありうる。
抗体又はその断片を含む、医薬組成物又は滅菌組成物を調製するために、本発明による抗体又はその断片は、薬学的に許容される担体又は添加剤と混合することができる。組成物は、がん(例えば、乳がん、結腸直腸がん、肺がん、多発性骨髄腫、卵巣がん、肝がん、胃がん、膵がん、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、骨肉腫、扁平上皮細胞癌、末梢神経鞘腫瘍、シュワン細胞腫、頭頚部がん、膀胱がん、食道がん、バレット食道がん、神経膠芽細胞腫、軟組織の明細胞肉腫、悪性中皮腫、神経線維腫症、腎がん、黒色腫、前立腺がん、良性前立腺肥大症(BPH)、女性化乳房、横紋筋肉腫、及び子宮内膜症)を処置又は予防するのに好適な1つ又は複数の他の治療剤を更に含みうる。
治療剤及び診断剤の製剤化は、例えば、凍結乾燥散剤、スラリー、水溶液、ローション剤、又は懸濁剤の形態において、生理学的に許容される担体、添加剤、又は安定化剤と混合することにより調製することができる(例えば、Hardman等、Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics、McGraw-Hill社、New York、N.Y.、2001年; Gennaro、Remington: The Science and Practice of Pharmacy、Lippincott, Williams, and Wilkins社、New York、N.Y.、2000年; Avis等(編)、Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications、Marcel Dekker社、NY、1993年; Lieberman等(編)、Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets、Marcel Dekker社、NY、1990年; Lieberman等(編) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems、Marcel Dekker社、NY、1990年; Weiner及びKotkoskie、Excipient Toxicity and Safety、Marcel Dekker, Inc.社、New York、N.Y.、2000年を参照)。
具体的な実施形態では、本発明による抗体-薬物コンジュゲートの臨床供給形態(CSF)は、ADC、コハク酸ナトリウム、及びポリソルベート20を含有するバイアル中に存在する凍結乾燥物である。凍結乾燥物は、注射用の水で再構成することができ、溶液は、およそpH5.0で、ADC、コハク酸ナトリウム、スクロース、及びポリソルベート20を含む。逐次静脈内投与のために、得られた溶液は、通常、担体溶液に更に希釈させる。
治療投与レジメンの選択は、物質の血清又は組織の置換え速度、症状のレベル、物質の免疫原性、及び生物学的マトリックスでの標的細胞のアクセシビリティを含む、様々な因子に依存する。具体的な実施形態では、投与レジメンは、患者に送達する治療剤の量を、許容されるレベルの副作用を満たすように最大にする。従って、投与される生物学的薬剤の量は、ある特定の物質、及び処置される状態の重症度に部分的に依存する。ガイダンスは、抗体、サイトカイン、及び小分子の適切な用量の選択に利用可能である(例えば、Wawrzynczak、Antibody Therapy、Bios Scientific Pub. Ltd社、Oxfordshire、UK、1996年; Kresina(編)、Monoclonal Antibodies、Cytokines and Arthritis、Marcel Dekker社、New York、N.Y.、1991年; Bach(編)、Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases、Marcel Dekker社、New York、N.Y.、1993年; Baert等、New Engl. J. Med. 348:601～608頁、2003年; Milgrom等、New Engl. J. Med. 341:1966～1973頁、1999年; Slamon等、New Engl. J. Med. 344:783～792頁、2001年; Beniaminovitz等、New Engl. J. Med. 342:613～619頁、2000年; Ghosh等、New Engl. J. Med. 348:24～32頁、2003年; Lipsky等、New Engl. J. Med. 343:1594～1602頁、2000年を参照)。
適切な用量は、例えば、関連技術分野で公知の、若しくは処置に影響を及ぼすと思われるパラメーター若しくは因子を使用して、又は処置に影響を及ぼすと予期されるパラメーター若しくは因子を使用して、臨床医が決定する。一般に、用量は、適量よりいくらか少ない量で開始した後、任意の副作用に対して、望ましい又は適切な効果に達するまで少しずつ増やした。重要な診断測定は、例えば、炎症の症状、又は生成された炎症性サイトカインのレベルを含む。
本発明による医薬組成物の活性成分の実際の用量レベルは、患者にいかなる毒性も起こさずに、ある特定の患者、組成物、及び投与様式において所望の治療応答を実現する活性成分の有効量に達するように変化しうる。選んだ用量レベルは、使用する本発明のある特定の組成物、又はそのエステル、塩、若しくはアミドの活性、投与の経路、投与時間、使用するある特定の化合物の分泌速度、処置の期間、使用するある特定の化合物と組み合わせて使用する他の薬物、化合物、及び/又は物質、処置される患者の年齢、性別、体重、状態、全身の健康、及び過去の病歴、並びに、医薬分野で公知の他の因子を含む、様々な薬物動態学的因子に依存して決定することができる。
本発明による抗体又はその断片を含む組成物は、例えば、毎日、毎週、1週に1～7回、隔週、3週毎に1回、4週毎に1回、5週毎に1回、6週毎に1回、7週毎に1回、又は8週毎に1回、持続注入により与える、又は単一用量で与えることができる。用量は、静脈内で、皮下で、局所で、経口で、鼻腔内で、直腸内で、筋肉内で、脳内で、又は吸入により与えることができる。ある特定の投与プロトコルは、著しく望まない副作用を避ける最大用量又は投与頻度を含む。
本発明による抗体又はその断片に対して、患者に投与される用量は、0.0001mg/kg～100mg/kg(患者の体重)の範囲でありうる。用量は、0.0001mg/kg～20mg/kg、0.0001mg/kg～10mg/kg、0.0001mg/kg～5mg/kg、0.0001～2mg/kg、0.0001～1mg/kg、0.0001mg/kg～0.75mg/kg、0.0001mg/kg～0.5mg/kg、0.0001mg/kg～0.25mg/kg、0.0001～0.15mg/kg、0.0001～0.10mg/kg、0.001～0.5mg/kg、0.01～0.25mg/kg、又は0.01～0.10mg/kg(患者の体重)の範囲でありうる。本発明による抗体又はその断片の用量は、患者の質量(キログラム(kg))に、投与される用量(mg/kg)を乗算することにより計算することができる。
本発明による抗体又はその断片は、繰返し投与することができ、投与は、少なくとも1日、2日、3日、5日、10日、15日、30日、45日、2か月、75日、3か月、又は少なくとも6か月の間隔で実施することができる。具体的な実施形態では、本発明による抗体又はその断片は、3週間毎に繰返し投与することができる。
ある特定の患者に投与される有効量は、処置される状態、患者の全身の健康、投与の様式、経路、及び投与量、並びに副作用の重症度のような因子に依存して変化しうる(例えば、Maynard等、A Handbook of SOPs for Good Clinical Practice、Interpharm Press社、Boca Raton、Fla.、1996年; Dent、Good Laboratory and Good Clinical Practice、Urch Publ.社、London、UK、2001年を参照)。
投与の経路は、例えば、局所若しくは皮膚塗布による、静脈内、腹腔内、脳内、筋肉内、眼内、動脈内、髄内、病変内注射若しくは注入による、又は、持続放出システム若しくは移植によるものでありうる(例えば、Sidman等、Biopolymers 22:547～556頁、1983年; Langer等、J. Biomed. Mater. Res. 15:167～277頁、1981年; Langer、Chem. Tech. 12:98～105頁、1982年; Epstein等、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688～3692頁、1985年; Hwang等、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030～4034頁、1980年; 米国特許第6,350,466号、及び米国特許第6,316,024号を参照)。必要な場合、組成物はまた、可溶化剤、及び注射の部位の疼痛緩和のために局所麻酔薬(例えばリドカイン)を含みうる。例えば、組成物はまた、吸入器若しくはネブライザーを使用して製剤化されうる、又はエアゾール化剤を使用する製剤により肺内投与用に使用することができる。例えば、米国特許第6,019,968号、米国特許第5,985,320号、米国特許第5,985,309号、米国特許第5,934,272号、米国特許第5,874,064号、米国特許第5,855,913号、米国特許第5,290,540号、及び米国特許第4,880,078号; 並びに、PCT出願番号WO 92/19244、WO 97/32572、WO 97/44013、WO 98/31346、及びWO 99/66903を参照し、これらの全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
その上、本発明の組成物は、関連技術分野で公知の1つ又は複数の様々な方法を使用する投与の1つ又は複数の経路を通して投与することができる。当業者に認識される通り、投与の経路及び/又は様式は、所望の結果に依存する。本発明による抗体又はその断片に対して選択される投与の経路は、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、髄腔内、又は投与の他の非経口経路、例えば、注射又は注入による投与の経路を含む。非経口投与は、一般に、経腸及び局所投与以外の注射による投与の様式を表し、静脈内、筋肉内、動脈内、鞘内、包内、眼窩内、心内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、髄腔内、硬膜外、及び胸骨内注射及び注入を含むが、本発明では、これらに限定されない。或いは、本発明の組成物は、投与の非経口経路、例えば、投与の局所、表皮内、又は粘膜内経路を通して投与することができ、例えば、鼻腔内、経口、経膣、直腸内、舌下、又は局所で投与することができる。具体的な一実施形態では、本発明による抗体又はその断片は、注入により投与することができる。別の具体的な実施形態では、本発明による抗体又はその断片は、皮下投与することができる。
本発明による抗体又はその断片が、制御又は遅延放出システムを使用して投与される場合、ポンプを使用して、制御又は遅延放出を達成することができる(Langer、上記; Sefton、CRC Crit. Ref Biomed. Eng. 14:20、1987年; Buchwald等、Surgery 88:507、1980年; Saudek等、N. Engl. J. Med. 321:574, 1989年を参照)。ポリマー物質を使用して、本発明の療法において制御又は遅延放出を達成することができる(例えば、Medical Applications of Controlled Release、Langer及びWise(編)、CRC Pres.社、Boca Raton、Fla.、1974年; Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance、Smolen及びBall(編)、Wiley社、New York、1984年; Ranger及びPeppas、J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61、1983年を参照;その上、Levy等、Science 228:190、1985年; During等、Ann. Neurol. 25:351、1989年; Howard等、J. Neurosurg. 7 1:105、1989年; 米国特許第5,679,377号; 米国特許第5,916,597号; 米国特許第5,912,015号; 米国特許第5,989,463号; 米国特許第5,128,326号; PCT出願番号WO 99/15154; 及びPCT出願番号WO 99/20253を参照)。持続放出製剤で使用されるポリマーの例として、ポリ(2-ヒドロキシエチルメタクリレート)、ポリ(メチルメタクリレート)、ポリ(アクリル酸)、ポリ(エチレン-コ-ビニルアセテート)、ポリ(メタクリル酸)、ポリグリコリド(PLG)、ポリアンハイドライド、ポリ(N-ビニルピロリドン)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリアクリルアミド、ポリ(エチレングリコール)、ポリラクチド(PLA)、ポリ(ラクチド-コ-グリコリド)(PLGA)、及びポリオルトエステルが挙げられるが、本発明では、これらに限定されない。具体的な一実施形態では、持続放出製剤で使用されるポリマーは、不活性であり、ろ過性不純物を有さず、保管性、滅菌性、及び生分解性で安定である。制御又は遅延放出システムは、予防又は治療標的に隣接して位置することができるので、全身用量の一部を必要とする(例えば、Goodson、Medical Applications of Controlled Release、上記、第2巻、115～138頁、1984年を参照)。
制御放出システムは、論文「Langer、Science 249:1527～1533頁、1990年」の総論で議論されている。当業者に公知の任意の先行技術を使用して、本発明による1つ又は複数の抗体又はその断片を含む、持続放出製剤を生成することができる。例えば、米国特許第4,526,938号、PCT出願番号WO 91/05548、PCT出願番号WO 96/20698、Ning等、Radiotherapy & Oncology 39:179～189頁、1996年; Song等、PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372～397頁、1995年; Cleek等、Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853～854頁、1997年; 及び、Lam等、Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759～760頁、1997年を参照し、これらの全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
本発明による抗体又はその断片が、局所投与される場合、抗体又はその断片は、軟膏剤、クリーム剤、経皮貼付剤、ローション剤、ゲル剤、シャンプー剤、スプレー剤、エアゾール剤、溶液剤、若しくは乳剤の形態、又は、当業者に周知の他の形態で製剤化することができる。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences and Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms、第19版、Mack Pub. Co.社、Easton、Pa.(1995)を参照のこと。非スプレー型局所剤形は、局所適用に好適な担体又は1つ又は複数の添加剤を含む。いくつかの場合、水より高い動粘度を有する粘性、半固体状、又は固体状の形態が、一般に、局所剤形として使用することができる。好適な調製物として、溶液剤、懸濁剤、乳剤、クリーム剤、軟膏剤、散剤、リニメント剤、軟膏剤等が挙げられ、これら全ては、滅菌する、又は、必要な場合、例えば浸透圧のような様々な特性に影響を及ぼす補助剤(例えば、保存剤、安定化剤、湿潤化剤、緩衝剤、若しくは塩)と混合するが、本発明では、これらに限定されない。いくつかの場合、他の好適な局所剤形は、活性成分を固体状又は液状の不活性担体と合わせた後、圧縮した揮発性物質の混合物(例えば、フレオンのような気体状噴射剤)、又はスクイーズボトルに装填したスプレー型エアゾール製剤を含む。必要な場合、保湿剤又は保水剤もまた、医薬組成物及び剤形に添加することができる。このような追加成分の例は、関連技術分野で知られている。
抗体又はその断片を含む組成物が、鼻腔内投与される場合、組成物は、エアゾール剤、スプレー剤、ミスト剤、又は滴剤の形態で製剤化することができる。特に、本発明で使用される予防又は治療剤は、好適な噴霧剤(例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、又は他の好適な気体)を使用する加圧型パック又は噴霧器から、エアゾールスプレー剤形で都合よく送達することができる。加圧型エアゾールの場合、投与量単位は、計量した量を送達する弁を設けることにより決定することができる。吸入器又は注入器を使用するための(例えばゼラチンからなる)カプセル剤及びカートリッジは、化合物の粉末混合物、及び好適な粉末基剤、例えばラクトース又はデンプンを含んで製剤化することができる。
第2の治療剤、例えばサイトカイン、ステロイド、化学療法剤、抗生物質、又は放射線での共投与又は処置の方法は、関連技術分野で知られている(例えば、Hardman等(編)(2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics、第10版、McGraw-Hill社、New York、N.Y.; Poole及びPeterson(編)(2001) Pharmacotherapeutics for Advanced Practice:A Practical Approach、Lippincott, Williams & Wilkins社、Phila.、Pa.; Chabner及びLongo(編)(2001) Cancer Chemotherapy and Biotherapy、Lippincott, Williams & Wilkins社、Phila.、Pa.を参照)。有効量の治療剤は、少なくとも10%;少なくとも20%;少なくともおよそ30%;少なくとも40%、又は少なくとも50%、症状を低減することができる。
本発明による抗体又はその断片と組み合わせて投与することができる追加療法(例えば、予防又は治療剤)は、5分間未満の間隔、30分間未満の間隔、1時間の間隔、およそ1時間の間隔、およそ1時間～およそ2時間の間隔、およそ2時間～およそ3時間の間隔、およそ3時間～およそ4時間の間隔、およそ4時間～およそ5時間の間隔、およそ5時間～およそ6時間の間隔、およそ6時間～およそ7時間の間隔、およそ7時間～およそ8時間の間隔、およそ8時間～およそ9時間の間隔、およそ9時間～およそ10時間の間隔、およそ10時間～およそ11時間の間隔、およそ11時間～およそ12時間の間隔、およそ12時間～18時間の間隔、18時間～24時間の間隔、24時間～36時間の間隔、36時間～48時間の間隔、48時間～52時間の間隔、52時間～60時間の間隔、60時間～72時間の間隔、72時間～84時間の間隔、84時間～96時間の間隔、又は96時間～120時間の間隔で、本発明による抗体又はその断片と共に投与することができる。2種以上の治療剤は、患者による同じ訪問時に投与することができる。
具体的な実施形態では、本発明による抗体又はその断片は、in vivoでの適切な分布を確実にするように製剤化することができる。例えば、血液脳関門(BBB)は、いくつかの高親水性化合物を排除する。本発明の治療化合物がBBBを通るのを確実にするために(必要な場合)、これらは、例えば、リポソームにおいて製剤化することができる。リポソームを調製する方法に対しては、例えば、米国特許第4,522,811号;米国特許第5,374,548号;及び、米国特許第5,399,331号を参照のこと。リポソームは、特定の細胞又は臓器に選択的に輸送される1つ又は複数の部分を含みうるので、標的化した薬物送達を向上させる(例えば、Ranade、(1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685頁を参照)。例示的な標的化部分は、葉酸又はビオチン(例えば、米国特許第5,416,016号(Low等に対する)を参照);マンノシド(Umezawa等(1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038頁を参照);抗体(Bloeman等(1995) FEBS Lett. 357:140頁; Owais等(1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180頁を参照);界面活性タンパク質A受容体(Briscoe等(1995) Am. J. Physiol. 1233:134頁を参照);p120(Schreier等(1994) J. Biol. Chem. 269:9090頁を参照)等を含む。その上、K. Keinanen; M. L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123頁; J. J. Killion; I. J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273頁を参照のこと。
本発明は、本発明による抗体又はその断片を含む、医薬組成物を、それを必要とする対象に、単独で、又は他の療法と組み合わせて投与するためのプロトコルを提供する。本発明の併用療法用の治療剤(例えば、予防又は治療剤)は、対象に同時又は逐次投与することができる。本発明の併用療法用の治療剤(例えば、予防又は治療剤)はまた、周期的に投与することができる。周期的な療法は、所定の時間の間、第1の治療剤(例えば、第1の予防又は治療剤)を投与する工程、所定の時間の間、第2の治療剤(例えば、第2の予防又は治療剤)を投与する工程、次いで、投与の工程を逐次繰り返す工程、即ち、治療剤(例えば、アゴニスト)の1つに対する抵抗の発生を低減するための、及び/又は、治療剤(例えば、アゴニスト)の1つの副作用を予防若しくは低減するための、及び/又は、治療剤の有効性を改善するための所定のサイクルを含む。
本発明の併用療法用の治療剤(例えば、予防又は治療剤)は、対象に同時投与することができる。
用語「同時に」とは、療法(例えば、予防又は治療剤)が、限定することなく正確に同時に投与する必要はないが、むしろ本発明による抗体又はその断片を含む医薬組成物を逐次的に対象に投与し、本発明の抗体が他の療法と異なる時間で投与される場合と比較して、より高い利益をもたらす役目を果たしうる時間間隔で投与されることを意味する。例えば、それぞれの治療剤は、任意の順番で同時に又は異なる時間点で対象に逐次投与することができるが、これらを同時に投与しない場合、所望の治療又は予防効果をもたらすのに十分なほど短い時間間隔で投与すべきである。それぞれの治療剤は、任意の好適な投与の経路を通して、任意の適切な形態で対象に投与することができる。様々な具体的な実施形態では、治療剤(例えば、予防又は治療剤)は、15分間未満の間隔、30分間未満の間隔、1時間未満の間隔、およそ1時間の間隔、およそ1時間～およそ2時間の間隔、およそ2時間～およそ3時間の間隔、およそ3時間～およそ4時間の間隔、およそ4時間～およそ5時間の間隔、およそ5時間～およそ6時間の間隔、およそ6時間～およそ7時間の間隔、およそ7時間～およそ8時間の間隔、およそ8時間～およそ9時間の間隔、およそ9時間～およそ10時間の間隔、およそ10時間～およそ11時間の間隔、およそ11時間～およそ12時間の間隔、24時間、48時間、72時間の間隔、又は1週間の間隔で、対象に投与することができる。他の具体的な実施形態では、2種以上の治療剤(例えば、予防又は治療剤)は、患者による同じ訪問時に投与することができる。
同じ医薬組成物では、併用療法用の予防又は治療剤は、対象に投与することができる。或いは、個々の医薬組成物では、併用療法用の予防又は治療剤は、対象に同時投与することができる。予防又は治療剤は、投与の同じ又は異なる経路を通して、対象に投与することができる。
1. 部位特異的な第1のクリック反応性官能基を抗体に転移させるための薬剤を調製するための化合物の調製例
1.1. リンカー(H1-L1)の合成、及び構造の確認
1.1.1.:化合物I(SO1リンカー:NHS及びノルボルネン)
Figure 0007393810000071
化合物Iの合成(スキーム6、図15)
化合物1の合成
2g(10.98mmol、1.0当量)の2-(ビシクロ[2.2.1]ヘプタ-5-エン-2-イルメトキシ)酢酸を、50mLのDCMに溶解した後、0.085mL(1.098mmol、0.1当量)のDMF及び、1.91mL(21.96mmol、2.0当量)の塩化オキサリルを、室温で撹拌しながら滴下した。反応溶液を、3時間撹拌した後、減圧下で濃縮して、1.97gの標的化合物を得た(収率:90%)。
化合物2の合成
1.97g(9.88mmol、1.0当量)の化合物1を、20mLのアセトニトリル(ACN) に溶解した後、0.68mL(9.88mmol、1.0当量)のチオグリコール酸、及び2.06mL(14.82mmol、1.5当量)のトリエチルアミンを、室温で撹拌しながら滴下した。反応溶液を、18時間撹拌した後、減圧下で濃縮した。続いて、水を反応溶液に添加し、反応溶液を、酢酸エチル(EA)で3回抽出した。有機層を、硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧下で濃縮した後、カラムクロマトグラフィー(DCM:MeOH=10:1)で精製して、2.05g(収率:79%)の標的化合物を得た。
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.15 - 6.01 (m, 2H), 4.20 (t, J = 5.0 Hz, 1H), 3.77 - 3.71 (m, 2H), 3.68 - 3.57 (m, 1H), 3.56 - 3.45 (m, 1H), 2.84 (s, 2H), 1.81 - 1.69 (m, 2H), 1.30 (ddd, J = 19.8, 14.5, 8.6 Hz, 4H), 1.15 (ddd, J = 16.0, 7.6, 3.3 Hz, 1H).
化合物Iの合成
2.05g(7.81mmol、1.0当量)の化合物2を、50mLのACNに溶解した後、2.76g(14.44mmol、1.8当量)の1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDCi)、及び2.21g(19.25mmol、2.46当量)のN-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)を、室温で撹拌しながら添加した。反応溶液を、18時間撹拌した後、減圧下で濃縮した。続いて、水を反応溶液に添加し、反応溶液を、EAで3回抽出した。有機層を回収し、硫酸マグネシウムで乾燥した後、減圧下で濃縮した。次いで、残渣を、クロマトグラフィー(EA:Hex=2:1)を使用したシリカゲルカラムで精製して、2.7g(収率:98%)の標的化合物を得た。
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.15 - 6.03 (m, 2H), 4.45 (s, 1H), 4.21 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 3.97 (s, 1H), 3.65 (dd, J = 12.0, 7.3 Hz, 1H), 3.52 (t, J = 8.9 Hz, 1H), 2.83 (dd, J = 24.4, 11.8 Hz, 6H), 1.81 - 1.67 (m, 1H), 1.30 (dq, J = 27.0, 9.5 Hz, 4H), 1.16 (ddd, J = 15.3, 7.4, 3.8 Hz, 1H).
化合物Iの構造の確認
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.15 - 6.03 (m, 2H), 4.45 (s, 1H), 4.21 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 3.97 (s, 1H), 3.65 (dd, J = 12.0, 7.3 Hz, 1H), 3.52 (t, J = 8.9 Hz, 1H), 2.83 (dd, J = 24.4, 11.8 Hz, 6H), 1.81 - 1.67 (m, 1H), 1.30 (dq, J = 27.0, 9.5 Hz, 4H), 1.16 (ddd, J = 15.3, 7.4, 3.8 Hz, 1H).
LRMS (ESI): m/z 371.2 [M+ NH4 +]
化合物Iの構造を、質量分析で確認した。結果は、図16に示す。
1.1.2. 化合物II(SO2リンカー:NHS及びノルボルネン)
Figure 0007393810000072
化合物IIの合成(スキーム7、図17)
化合物3の合成
0.55g(2.33mmol、1.0当量)の化合物1を、5mLのアセトニトリル(ACN)に溶解した後、0.2mL(2.33mmol、1.0当量)の3-メルカプトプロピオン酸、及び0.49mL(3.49mmol、1.5当量)のトリエチルアミンを、室温で撹拌しながら滴下した。反応溶液を、11時間撹拌した後、減圧下で濃縮した。続いて、水を反応溶液に添加し、反応溶液を、酢酸エチル(EA)で3回抽出した。有機層を、硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧下で濃縮した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(DCM:MeOH=10:1)で精製して、0.56g(収率:89%)の標的化合物を得た。
化合物IIの合成
0.56g(2.07mmol、1.0当量)の化合物3を、10mLのアセトニトリル(ACN)に溶解し、0.81g(4.21mmol、2.0当量)の1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDCi)、及び0.65g(5.61mmol、2.7当量)のN-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)を、室温で撹拌しながら添加した。反応溶液を、12時間撹拌した後、減圧下で濃縮した。続いて、水を反応溶液に添加し、反応溶液を、EAで3回抽出した。有機層を、硫酸マグネシウムで乾燥した後、減圧下で濃縮した。次いで、残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(EA:Hex=2:1)で精製して、0.63g(収率:83%)の標的化合物を得た。
化合物IIの構造の確認
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.16-6.14 (m, 2H), 4.45 (s, 1H), 4.21 - 4.08 (m, 1H), 3.69 - 3.58 (m, 1H), 3.51 (dt, J = 14.5, 8.9 Hz, 1H), 3.22 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 2.96 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 2.79-2.83 (m, 6H), 1.81 - 1.67 (m, 1H), 1.37 - 1.21 (m, 4H), 1.13-1.18 (m, 1H).
LRMS (ESI): m/z 385.1 [M+ NH4 +]
化合物IIの構造を、質量分析で確認した。結果は、図18に示す。
1.1.3. 化合物III(SO3リンカー:NHS及びノルボルネン)
Figure 0007393810000073
化合物IIIの合成(スキーム8、図19)
化合物4の合成
0.5g(3.62mmol、1.0当量)のエキソ-5-ノルボルネンカルボン酸を、20mLのDCMに溶解した後、0.028mL(0.37mmol、0.94当量)のDMF、及び0.63mL(7.24mmol、2.0当量)の塩化オキサリルを、室温で撹拌しながら滴下した。反応溶液を、3時間撹拌した後、減圧下で濃縮して、0.47g(収率:83%)の標的化合物を得た。
化合物5の合成
0.47g(3.0mmol、1.0当量)の化合物4を、15mLのアセトニトリル(ACN)に溶解した後、0.21mL(3.0mmol、1.0当量)のチオグリコール酸、及び0.63mL(4.5mmol、1.5当量)のトリエチルアミンを、室温で撹拌しながら滴下した。反応溶液を、18時間撹拌した後、減圧下で濃縮した。続いて、水を反応溶液に添加し、反応溶液を、酢酸エチル(EA)で3回抽出した。有機層を、硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧下で濃縮した後、カラムクロマトグラフィー(DCM:MeOH=10:1)で精製して、0.3g(収率:47%)の標的化合物を得た。
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 9.82 (brs, 1H), 6.24 - 6.07 (m, 2H), 3.76 (s, 2H), 3.12 (s, 1H), 2.97 (s, 1H), 2.54 (dd, J = 9.0, 4.7 Hz, 1H), 2.04 - 1.87 (m, 1H), 1.57 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 1.48 - 1.35 (m, 2H).
化合物IIIの合成
0.26g(1.22mmol、1.0当量)の化合物5を、15mLのアセトニトリル(ACN)に溶解し、0.35g(1.83mmol、1.5当量)の1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDCi)、及び0.28g(2.44mmol、2.0当量)のN-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)を、室温で撹拌しながら添加した。反応溶液を、3時間撹拌した後、減圧下で濃縮した。続いて、水を反応溶液に添加し、反応溶液を、EAで3回抽出した。有機層を回収し、硫酸マグネシウムで乾燥した後、減圧下で濃縮した。次いで、残渣を、クロマトグラフィー(EA:Hex=2:1)を使用したシリカゲルカラムで精製して、0.32g(収率:85%)の標的化合物を得た。
化合物IIIの構造の確認
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.21 (dd, J = 5.5, 3.0 Hz, 1H), 6.15 (dd, J = 5.5, 3.1 Hz, 1H), 4.01 (s, 2H), 3.15 (s, 1H), 2.98 (s, 1H), 2.86 (s, 4H), 2.54 (dd, J = 9.2, 4.6 Hz, 1H), 2.02 (dt, J = 11.9, 4.0 Hz, 1H), 1.59 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 1.46 - 1.36 (m, 2H).
LCMS (ESI): m/z 332.16 [M+Na+]
化合物IIIの構造を、質量分析で確認した。結果は、図20に示す。
1.1.4. 化合物IV(SO4リンカー:NHS及びアジド)
Figure 0007393810000074
化合物IVの合成(スキーム9、図21及び図22)
化合物6の合成
2-(2-クロロエトキシ)エタノール(2mL、18.94mmol)を、蒸留水(12mL)に溶解し、NaN3(3.08g、47.35mmol、2.5当量)を、それに添加した。得られた混合物を、80℃で16時間撹拌した。反応混合物を、室温まで冷却し、5%のNaOH(水溶液)(20mL)に注いだ後、およそ10分間撹拌した。反応混合物を、ジエチルエーテルで3回抽出し、有機層を、硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過した。ろ液を、減圧下で濃縮して、2.47g(収率:99%)の標的化合物を得た。
化合物7の合成
2.47g(18.84mmol)の化合物6を、アセトン(50mL)に溶解した後、1MのJone's試薬(75.36mL、75.36mmol、4当量)を、0℃でゆっくり添加した。反応混合物を、0℃で3時間撹拌し、室温まで加温した後、およそ10分間撹拌した。反応混合物を、酢酸エチル(EA)で3回抽出し、有機層を、硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過した。ろ液を、減圧下で濃縮して、2.69g(収率:98%)の標的化合物を得た。
化合物8の合成
2.69g(18.57mmol、1.0当量)の化合物7を、50mLのDCMに溶解した後、0.1mL(1.29mmol、0.07当量)のDMF、及び2.43mL(27.86mmol、1.5当量)の塩化オキサリルを、室温で撹拌しながら滴下した。反応溶液を、3時間撹拌した後、減圧下で濃縮して、2.42g(収率:80%)の標的化合物を得た。
化合物9の合成
0.88g(5.40mmol、1.0当量)の化合物8を、30mLのDCMに溶解した後、0.8g(5.40mmol、1.0当量)のtert-ブチル2-メルカプトアセテート、及び1.41mL(8.10mmol、1.5当量)のN,N-ジイソプロピルエチルアミンを、室温で撹拌しながら滴下した。反応溶液を、2時間撹拌した後、減圧下で濃縮した。続いて、水を反応溶液に添加し、反応溶液を、ジクロロメタン(DCM)で3回抽出した。有機層を、硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧下で濃縮した後、カラムクロマトグラフィー(Hex:EA=5:1)で精製して、0.73g(収率:49%)の標的化合物を得た。
化合物10の合成
0.73g(2.66mmol、1当量)の化合物9を、10mLのDCMに溶解した後、10mL(129.8mmol、48当量)のトリフルオロ酢酸を、室温で撹拌しながら滴下した。反応溶液を、8時間撹拌した後、減圧下で濃縮して、0.40g(収率:70%)の標的化合物を得た。
化合物IVの合成
1.97g(9.0mmol、1.0当量)の化合物10を、25mLのアセトニトリル(ACN)に溶解し、2.58g(13.5mmol、1.5当量)の1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDCi)、及び2.07g(18.0mmol、2.0当量)のN-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)を、室温で撹拌しながら添加した。反応溶液を、3時間撹拌した後、減圧下で濃縮した。続いて、水を反応溶液に添加し、反応溶液を、EAで3回抽出した。有機層を回収し、硫酸マグネシウムで乾燥した後、減圧下で濃縮した。次いで、残渣を、クロマトグラフィー(EA:Hex=2:1)を使用したシリカゲルカラムで精製して、1.03g(収率:36%)の標的化合物を得た。
化合物IVの構造の確認
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 4.30 (s, 2H), 4.00 (s, 2H), 3.87 - 3.75 (m, 2H), 3.55 - 3.47 (m, 2H), 2.86 (s, 4H).
LRMS (ESI): m/z 334.0 [M+ NH4 +]
化合物IVの構造を、質量分析で確認した。結果は、図23に示す。
1.2. 部位特異的Fcインタラクトーム(SSFI)の合成、及び構造の確認
1.2.1. SSFIの合成、及び構造の確認(Xa1はリンカーである)
SSFI(6Lys)の合成
Figure 0007393810000075
使用したFmocアミノ酸のリスト及び導入の順番
Fmoc-L-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-L-Trp(Boc)-OH、Fmoc-L-Val-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-L-His(Trt)-OH、Fmoc-L-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Asp(tBu)-OH。
調製方法
(a)アミノ酸の導入
以下のプロセスで使用される試薬の量は、0.25ミリモルに基づいた。0.5g(0.48ミリモル/g)の透明なアミド樹脂(Peptide International Inc.社、USA)を、合成反応器に入れ、1ミリモルの各Fmoc-アミノ酸ブロックを、計量して、上記の順でC末端からN末端までペプチドアミノ酸配列を調製した。
Fmoc-アミノ酸を活性化して、活性化した残基を透明なアミド樹脂に結合させるための反応を、C末端アミノ酸から逐次実施した。
Fmocの除去を、20%のピペリジン含有DMFで実施し、調製して配列に対応させたアミノ酸を、2mLの0.5M HOBt含有DMF溶液、2mLの0.5M HBTU含有DMF溶液、及び174μLのDIPEAと5分間混合すること、並びに、樹脂を含有する反応器で2時間、得られた混合物を混合することにより、残基の活性化及び導入を実施した。
導入反応の確認は、Kaiser試験法を使用して実行した。導入反応が不完全であると確認した場合、導入反応をもう1回繰り返した、又は、キャッピングを、20%のAc2O含有DMF溶液を使用して実施した。導入反応及びFmoc除去の各々では、樹脂を、次の工程に行く前に、DMF及びDCMで十分に洗浄した。このプロセスを、標的ペプチド配列が完了するまで、繰返し実施した。
(b)H-PEG8-OHの導入
アミノ酸の導入が完了した後に配列のN端末にH-PEG8-OHを導入するために、1mLの0.5M Fmoc-N-アミド-dPEG8-酸のDMF中溶液、1mLの0.5M HBTU含有DMF溶液、1mLの0.5M HOBt含有DMF溶液、及び87μLのDIPEAを、5分間混合し、得られた混合物を、反応性樹脂を含有する反応器で2時間混合した。
反応の進行は、Kaiser試験法でモニタリングした。未反応のアミンが残留することを見出した場合、反応時間を、更に1～3時間延長した、又は、反応溶液を廃棄し、前述の反応プロセスを再び繰り返した。N端末のFmoc保護基の除去を、20%のピペリジン含有DMFを使用して実施した後、ペプチドが結合する樹脂を、乾燥し、計量した。
(c)工程(b)で調製したペプチドが結合する樹脂250mgを、TFA、TIS、水及びEDTの2mLの混合溶液(94:1.0:2.5:2.5)と共に室温で120分間撹拌して、樹脂からペプチドを切断した。切断した混合物をろ過し、ろ液を、窒素ガスを使用して約半分の体積まで濃縮した。その後、エーテルを混合物に注いで、ペプチドを沈殿させた。沈殿したペプチドを、エーテルで3回洗浄し、窒素ガス下で乾燥した。乾燥した沈殿物を、0.1%のTFA-30%のACN含有水に溶解し、6時間撹拌した後、濃縮した。
濃縮物を、5%のDMSO-20%のACN含有の0.01M 酢酸アンモニウム緩衝剤(pH6.5)の溶液において0.1mg/mLの濃度で溶解した後、空気に曝露しながら3日間撹拌した。ジスルフィド結合形成反応の進行は、HPLCでモニタリングした。反応がこれ以上進行しないことが見出された場合、反応溶液を凍結乾燥して、ペプチド沈殿物を得た。
(d)精製
工程(c)での乾燥凍結により得られたペプチド沈殿物を、以下のTable 4(表4)に列挙した分取LC一次精製条件下で分離し、更に以下のTable 5(表5)に列挙した分取LC二次精製条件下で精製した後、凍結乾燥した。得られたペプチドは、分析HPLCにより90%以上の純度を有することが確認され、合成したペプチドの分子量は、LC/MS質量分析を使用して確認した。
H-PEG8-Asp-Cys*-Ala-Trp-His-Lys-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys*-Thr-NH2 (Cys*:ジスルフィド結合部位)
Figure 0007393810000076
Figure 0007393810000077
SSFI(6Lys)の構造の確認
SSFI(6Lys)の合成は、マトリックス支援レーザー脱離/イオン化(MALDI)質量分析による分子量測定で確認した。
測定機器:Ultraflextreme(Bruker社)
測定マトリックス:CHCA(α-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸)及びDHB(2,5-ジヒドロキシ安息香酸)
計算した分子量:2010.29g/mol
測定した分子量(M+H)+:2011.89g/mol
SSFI(6Lys)の質量分析結果は、図24に示す。
1.2.2. SSFIの合成、及び構造の確認(Xa1はオルニチンである)
Figure 0007393810000078
SSFI(6Orn)の合成
使用したFmocアミノ酸のリスト及び導入の順番
Fmoc-L-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-L-Trp(Boc)-OH、Fmoc-L-Val-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Orn(Boc)-OH、Fmoc-L-His(Trt)-OH、Fmoc-L-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Asp(tBu)-OH。
調製方法
(a)アミノ酸の導入
以下のプロセスで使用される試薬の量は、0.25ミリモルに基づいた。0.5g(0.48ミリモル/g)の透明なアミド樹脂(Peptide International Inc.社、USA)を、合成反応器に入れ、1ミリモルの各Fmoc-アミノ酸ブロックを、計量して、上記のC末端からN末端までのペプチドアミノ酸配列を調製した。
Fmoc-アミノ酸を活性化して、活性化した残基を透明なアミド樹脂に結合させるための反応を、C末端アミノ酸から逐次実施した。
Fmocの除去を、20%のピペリジン含有DMFで実施し、調製して配列に対応させたアミノ酸を、2mLの0.5M HOBt含有DMF溶液、2mLの0.5M HBTU含有DMF溶液、及び174μLのDIPEAと5分間混合すること、並びに、樹脂を含有する反応器で2時間、得られた混合物を混合することにより、残基の活性化及び導入を実施した。
導入反応の確認は、Kaiser試験法を使用して実行した。導入反応が不完全であると確認した場合、導入反応をもう1回繰り返した、又は、キャッピングを、20%のAc2O含有DMF溶液を使用して実施した。導入反応及びFmoc除去の各々では、樹脂を、次の工程に行く前に、DMF及びDCMで十分に洗浄した。このプロセスを、標的ペプチド配列が完了するまで、繰返し実施した。
(b)H-PEG8-OHの導入
アミノ酸の導入が完了した後に配列のN端末にH-PEG8-OHを導入するために、1mLの0.5M Fmoc-N-アミド-dPEG8-酸のDMF中溶液、1mLの0.5M HBTU含有DMF溶液、1mLの0.5M HOBt含有DMF溶液、及び87μLのDIPEAを、5分間混合し、得られた混合物を、反応性樹脂を含有する反応器で2時間混合した。
反応の進行は、Kaiser試験法でモニタリングした。未反応のアミンが残留することを見出した場合、反応時間を、更に1～3時間延長した、又は、反応溶液を廃棄し、前述の反応プロセスを再び繰り返した。N端末のFmoc保護基の除去を、20%のピペリジン含有DMFを使用して実施した後、ペプチドが結合する樹脂を、乾燥し、計量した。
(c)工程(b)で調製したペプチドが結合する樹脂250mgを、TFA、TIS、水及びEDTの2mLの混合溶液(94:1.0:2.5:2.5)と共に室温で120分間撹拌して、樹脂からペプチドを切断した。切断した混合物をろ過し、ろ液を、窒素ガスを使用して約半分の体積まで濃縮した。その後、エーテルを混合物に注いで、ペプチドを沈殿させた。沈殿したペプチドを、エーテルで3回洗浄し、窒素ガス下で乾燥した。乾燥した沈殿物を、0.1%のTFA-30%のACN含有水に溶解し、6時間撹拌した後、濃縮した。
濃縮物を、5%のDMSO-20%のACN含有の0.01M 酢酸アンモニウム緩衝剤(pH6.5)の溶液において0.1mg/mLの濃度で溶解した後、空気に曝露しながら3日間撹拌した。ジスルフィド結合形成反応の進行は、HPLCでモニタリングした。反応がこれ以上進行しないことが見出された場合、反応溶液を凍結乾燥して、ペプチド沈殿物を得た。
(d)精製
工程(c)での乾燥凍結により得られたペプチド沈殿物を、以下のTable 6(表6)に列挙した分取LC一次精製条件下で分離し、更に以下のTable 7(表7)に列挙した分取LC二次精製条件下で精製した後、凍結乾燥した。得られたペプチドは、分析HPLCにより90%以上の純度を有することが確認され、合成したペプチドの分子量は、LC/MS質量分析を使用して確認した。
H-PEG8-Asp-Cys*-Ala-Trp-His-Orn-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys*-Thr-NH2 (Cys*:ジスルフィド結合部位)
Figure 0007393810000079
Figure 0007393810000080
SSFI(6Orn)の構造の確認
SSFI(6オルニチン)の合成は、マトリックス支援レーザー脱離/イオン化(MALDI)質量分析による分子量測定で確認した。
測定機器:Ultraflextreme(Bruker社)
測定マトリックス:CHCA(α-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸)及びDHB(2,5-ジヒドロキシ安息香酸)
計算した分子量:1996.26g/mol
測定した分子量(M+2H)2+:999.13g/mol
SSFI(6Orn)の質量分析結果は、図25に示す。
1.2.3. SSFIの合成、及び構造の確認(Xa1はジアミノ酪酸(Dab)である)
Figure 0007393810000081
SSFI(6Dab)の合成
使用したFmocアミノ酸のリスト及び導入の順番
Fmoc-L-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-L-Trp(Boc)-OH、Fmoc-L-Val-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Dab(Boc)-OH、Fmoc-L-His(Trt)-OH、Fmoc-L-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Asp(tBu)-OH。
調製方法
(a)アミノ酸の導入
以下のプロセスで使用される試薬の量は、0.25ミリモルに基づいた。0.5g(0.48ミリモル/g)の透明なアミド樹脂(Peptide International Inc.社、USA)を、合成反応器に入れ、1ミリモルの各Fmoc-アミノ酸ブロックを、計量して、上記の順でC末端からN末端までペプチドアミノ酸配列を調製した。
Fmoc-アミノ酸を活性化して、活性化した残基を透明なアミド樹脂に結合させるための反応を、C末端アミノ酸から逐次実施した。
Fmocの除去を、20%のピペリジン含有DMFで実施し、調製して配列に対応させたアミノ酸を、2mLの0.5M HOBt含有DMF溶液、2mLの0.5M HBTU含有DMF溶液、及び174μLのDIPEAと5分間混合すること、並びに、樹脂を含有する反応器で2時間、得られた混合物を混合することにより、残基の活性化及び導入を実施した。
導入反応の確認は、Kaiser試験法を使用して実行した。導入反応が不完全であると確認した場合、導入反応をもう1回繰り返した、又は、キャッピングを、20%のAc2O含有DMF溶液を使用して実施した。導入反応及びFmoc除去の各々では、樹脂を、次の工程に行く前に、DMF及びDCMで十分に洗浄した。このプロセスを、標的ペプチド配列が完了するまで、繰返し実施した。
(b)H-PEG8-OHの導入
アミノ酸の導入が完了した後に配列のN端末にH-PEG8-OHを導入するために、1mLの0.5M Fmoc-N-アミド-dPEG8-酸のDMF中溶液、1mLの0.5M HBTU含有DMF溶液、1mLの0.5M HOBt含有DMF溶液、及び87μLのDIPEAを、5分間混合し、得られた混合物を、反応性樹脂を含有する反応器で2時間混合した。
反応の進行は、Kaiser試験法でモニタリングした。未反応のアミンが残留することを見出した場合、反応時間を、更に1～3時間延長した、又は、反応溶液を廃棄し、前述の反応プロセスを再び繰り返した。N端末のFmoc保護基の除去を、20%のピペリジン含有DMFを使用して実施した後、ペプチドが結合する樹脂を、乾燥し、計量した。
(c)工程(b)で調製したペプチドが結合する樹脂250mgを、TFA、TIS、水及びEDTの2mLの混合溶液(94:1.0:2.5:2.5)と共に室温で120分間撹拌して、樹脂からペプチドを切断した。切断した混合物をろ過し、ろ液を、窒素ガスを使用して約半分の体積まで濃縮した。その後、エーテルを混合物に注いで、ペプチドを沈殿させた。沈殿したペプチドを、エーテルで3回洗浄し、窒素ガス下で乾燥した。乾燥した沈殿物を、0.1%のTFA-30%のACN含有水に溶解し、6時間撹拌した後、濃縮した。
濃縮物を、5%のDMSO-20%のACN含有の0.01M 酢酸アンモニウム緩衝剤(pH6.5)の溶液において0.1mg/mLの濃度で溶解した後、空気に曝露しながら3日間撹拌した。ジスルフィド結合形成反応の進行は、HPLCでモニタリングした。反応がこれ以上進行しないことが見出された場合、反応溶液を凍結乾燥して、ペプチド沈殿物を得た。
(d)精製
工程(c)での乾燥凍結により得られたペプチド沈殿物を、以下のTable 8(表8)に列挙した分取LC一次精製条件下で分離し、更に以下のTable 9(表9)に列挙した分取LC二次精製条件下で精製した後、凍結乾燥した。得られたペプチドは、分析HPLCにより90%以上の純度を有することが確認され、合成したペプチドの分子量は、LC/MS質量分析を使用して確認した。
H-PEG8-Asp-Cys*-Ala-Trp-His-Dab-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys*-Thr-NH2 (Cys*:ジスルフィド結合部位)
Figure 0007393810000082
Figure 0007393810000083
SSFI(6Dab)の構造の確認
SSFI(6Dab)の合成は、マトリックス支援レーザー脱離/イオン化(MALDI)質量分析による分子量測定で確認した。
測定機器:Ultraflextreme(Bruker社)
測定マトリックス:CHCA(α-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸)及びDHB(2,5-ジヒドロキシ安息香酸)
計算した分子量:1982.24g/mol
測定した分子量(M+2H)2+:992.33g/mol
SSFI(6Dab)の質量分析結果は、図26に示す。
1.2.4. SSFIの合成、及び構造の確認(Xa1はジアミノプロピオン酸(Dab)である)
Figure 0007393810000084
SSFI(6Dap)の合成
配列:Nor.-PEG8-DCAWHA(βアミノアラニン、Dap)GELVWCT-CONH2
使用したFmocアミノ酸のリスト及び導入の順番
Fmoc-L-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-L-Trp(Boc)-OH、Fmoc-L-Val-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Dap(Boc)-OH、Fmoc-L-His(Trt)-OH、Fmoc-L-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Asp(tBu)-OH。
調製方法
(a)アミノ酸の導入
以下のプロセスで使用される試薬の量は、0.25ミリモルに基づいた。0.5g(0.48ミリモル/g)の透明なアミド樹脂(Peptide International Inc.社、USA)を、合成反応器に入れ、1ミリモルの各Fmoc-アミノ酸ブロックを、計量して、上記の順でC末端からN末端までペプチドアミノ酸配列を調製した。
Fmoc-アミノ酸を活性化して、活性化した残基を透明なアミド樹脂に結合させるための反応を、C末端アミノ酸から逐次実施した。
Fmocの除去を、20%のピペリジン含有DMFで実施し、調製して配列に対応させたアミノ酸を、2mLの0.5M HOBt含有DMF溶液、2mLの0.5M HBTU含有DMF溶液、及び174μLのDIPEAと5分間混合すること、並びに、樹脂を含有する反応器で2時間、得られた混合物を混合することにより、残基の活性化及び導入を実施した。
導入反応の確認は、Kaiser試験法を使用して実行した。導入反応が不完全であると確認した場合、導入反応をもう1回繰り返した、又は、キャッピングを、20%のAc2O含有DMF溶液を使用して実施した。導入反応及びFmoc除去の各々では、樹脂を、次の工程に行く前に、DMF及びDCMで十分に洗浄した。このプロセスを、標的ペプチド配列が完了するまで、繰返し実施した。
(b)H-PEG8-OHの導入
アミノ酸の導入が完了した後に配列のN端末にH-PEG8-OHを導入するために、1mLの0.5M Fmoc-N-アミド-dPEG8-酸のDMF中溶液、1mLの0.5M HBTU含有DMF溶液、1mLの0.5M HOBt含有DMF溶液、及び87μLのDIPEAを、5分間混合し、得られた混合物を、反応性樹脂を含有する反応器で2時間混合した。
反応の進行は、Kaiser試験法でモニタリングした。未反応のアミンが残留することを見出した場合、反応時間を、更に1～3時間延長した、又は、反応溶液を廃棄し、前述の反応プロセスを再び繰り返した。N端末のFmoc保護基の除去を、20%のピペリジン含有DMFを使用して実施した後、ペプチドが結合する樹脂を、乾燥し、計量した。
(c)工程(b)で調製したペプチドが結合する樹脂250mgを、TFA、TIS、水及びEDTの2mLの混合溶液(94:1.0:2.5:2.5)と共に室温で120分間撹拌して、樹脂からペプチドを切断した。切断した混合物をろ過し、ろ液を、窒素ガスを使用して約半分の体積まで濃縮した。その後、エーテルを混合物に注いで、ペプチドを沈殿させた。沈殿したペプチドを、エーテルで3回洗浄し、窒素ガス下で乾燥した。乾燥した沈殿物を、0.1%のTFA-30%のACN含有水に溶解し、6時間撹拌した後、濃縮した。
濃縮物を、5%のDMSO-20%のACN含有の0.01M 酢酸アンモニウム緩衝剤(pH6.5)の溶液において0.1mg/mLの濃度で溶解した後、空気に曝露しながら3日間撹拌した。ジスルフィド結合形成反応の進行は、HPLCでモニタリングした。反応がこれ以上進行しないことが見出された場合、反応溶液を凍結乾燥して、ペプチド沈殿物を得た。
(d)精製
工程(c)での乾燥凍結により得られたペプチド沈殿物を、以下のTable 10(表10)に列挙した分取LC一次精製条件下で分離し、更に以下のTable 11(表11)に列挙した分取LC二次精製条件下で精製した後、凍結乾燥した。得られたペプチドは、分析HPLCにより90%以上の純度を有することが確認され、合成したペプチドの分子量は、LC/MS質量分析を使用して確認した。
H-PEG8-Asp-Cys*-Ala-Trp-His-Dap-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys*-Thr-NH2 (Cys*:ジスルフィド結合部位)
Figure 0007393810000085
Figure 0007393810000086
SSFI(6Dap)の構造の確認
測定機器:Quattro Premier Xe(Waters社)
計算した分子量:1968.21g/mol
測定した分子量(M+2H)2+:984.71g/mol
SSFI(6Dap)の質量分析結果は、図27に示す。
1.3. VCリンカーの合成、及び構造の確認
1.3.1. VCリンカー(DD2)の合成、及び構造の確認
Figure 0007393810000087
VCリンカー(DD2)の合成
化合物11の合成
5g(14.7mmol、1.0当量)のFmoc-Val-OH及び1.7g(14.7mmol、1.0当量)のN-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)を、140mLのジメトキシエタン(DME)に溶解し、撹拌した。2.5mL(16.2mmol、1.1当量)のN,N'-ジイソプロピルカルボジイミド(DIC)を、0℃で滴下し、16時間撹拌した。反応溶液を、減圧下でろ過して浮遊物を除去し、ろ液を減圧下で濃縮した。残渣をアセトンに溶解し、冷蔵庫において低温で4時間保管した。その後、得られた溶液を、減圧下でろ過して再形成した浮遊物を除去し、いかなる精製もせずに次の反応で使用した(粗収率:5.5g、86%)。TLC(EA:Hex=1:1);Rf=0.5。
化合物12の合成
2.0g(11.5mmol、1.0当量)のL-シトルリンを、テトラヒドロフラン(THF)及び水の1:1混合溶液100mLに溶解し、撹拌した。988mgの炭酸水素ナトリウムを、それに添加し、撹拌した。その後、5.0g(11.5mmol、1.0当量)の化合物8を、80mLのアセトンに溶解し、反応溶液に滴下した後、撹拌した。得られた混合物を、21時間撹拌した後、減圧下で濃縮して、有機溶媒を除去した。水性層を、酢酸エチル(EA)で洗浄した後、2N HClをゆっくり滴下することでpH3に滴定した。EAをそれに添加し、有機層の沈殿物を抽出した。次いで、有機層を、飽和食塩水及び硫酸ナトリウムで乾燥し、いかなる精製もせずに次の反応で使用した(粗収率:5.6g、98%)。TLC(DCM:MeOH=10:1、1滴のギ酸);Rf=0.1。
化合物13の合成
N,N-ジメチルホルムアミド(DMF)中の10%のピペリジン 50mLを、2.84g(5.72mmol、1.0当量)の化合物12に滴下し、撹拌した。4時間後、得られた混合物を、減圧下で濃縮して反応溶液を除去し、残渣を水に溶解し、減圧下でろ過して形成した浮遊物を除去した。水性層を濃縮して、標的化合物を得たが、これをいかなる精製もせずに次の反応で使用した。TLC(DCM:MeOH=10:1);Rf=0.01。
化合物14の合成
54mg(0.22mmol、1.0当量)の化合物10を、2mLのDMFに溶解し、0.05mL(0.264mmol、1.2当量)のN,N-ジイソプロピルエチルアミン(DIPEA)を、それに滴下した。化合物13を、2mLの水に添加することで完全に溶解し、0.05mL(0.528mmol、2.4当量)の無水酢酸を、室温でそれに滴下した。3時間後、得られた混合物を、減圧下で濃縮して反応溶液を除去し、濃縮物を逆相カラムクロマトグラフィーで精製して、標的化合物を得た。TLC(DCM:MeOH=10:1);Rf=0.05。
化合物15の合成
1g(3.16mmol、1.0当量)の化合物14を、DCM及びメタノールの2:1混合溶液30mLに溶解し、868mg(3.48mmol、1.1当量)のN-エトキシカルボニル-2-エトキシ-1,2-ジヒドロキノリン(EEDQ)を、それに添加し、撹拌した。451mg(3.66mmol、1.16当量)の4-アミノベンジルアルコールを、それに添加し、5時間撹拌した。得られた混合物を、減圧下で濃縮して反応溶液を除去し、濃縮物をカラムクロマトグラフィー(DCM中の10%のMeOH)で精製して、419mgの標的化合物を得た(収率:32%)。TLC(DCM:MeOH=10:1);Rf=0.1。
化合物DD2の合成
109mg(0.3mmol、1.2当量)のフェノール活性化SN38及び0.06mL(0.33mmol、1.3当量)のDIPEAを、10mLのDMF中の105mg(0.25mmol、1.0当量)の化合物15を溶解することで得られた溶液に滴下した。得られた混合物を、20時間撹拌した後、減圧下で濃縮して、反応溶液を除去した。濃縮物を、カラムクロマトグラフィー(DCM中の10%のMeOH)で精製して、標的化合物を得た。TLC(DCM:MeOH=10:1);Rf=0.2。
VCリンカー(DD2)の構造の確認
LRMS (ESI): m/z 840.4 [M+H+]
結果は、図28に示す。
1.3.2. VCリンカー(DD3)の合成、及び構造の確認
Figure 0007393810000088
Figure 0007393810000089
VCリンカー(DD3)の合成
化合物16の合成
5g(14.7mmol、1.0当量)のFmoc-Val-OH及び1.7g(14.7mmol、1.0当量)のN-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)を、140mLのジメトキシエタン(DME)に溶解し、撹拌した。2.5mL(16.2mmol、1.1当量)のN,N'-ジイソプロピルカルボジイミド(DIC)を、0℃で滴下し、16時間撹拌した。反応溶液を、減圧下でろ過して浮遊物を除去し、ろ液を減圧下で濃縮した。残渣をアセトンに溶解し、冷蔵庫において低温で4時間保管した。その後、得られた溶液を、減圧下でろ過して再形成した浮遊物を除去し、いかなる精製もせずに次の反応で使用した(粗収率:5.5g、86%)。TLC(EA:Hex=1:1);Rf=0.5。
化合物17の合成
2.0g(11.5mmol、1.0当量)のL-シトルリンを、テトラヒドロフラン(THF)及び水の1:1混合溶液100mLに溶解し、撹拌した。988mgの炭酸水素ナトリウムを、それに添加し、撹拌した。その後、5.0g(11.5mmol、1.0当量)の化合物16を、80mLのアセトンに溶解し、反応溶液に滴下した後、撹拌した。得られた混合物を、21時間撹拌した後、減圧下で濃縮して、有機溶媒を除去した。水性層を、酢酸エチル(EA)で洗浄した後、2N HClを滴下することでpH3に滴定した。EAをそれに添加し、有機層の沈殿物を抽出した。次いで、有機層を、飽和食塩水及び硫酸ナトリウムで乾燥し、いかなる精製もせずに次の反応で使用した(粗収率:5.6g、98%)。TLC(DCM:MeOH=10:1、1滴のギ酸);Rf=0.1。
化合物18の合成
N,N-ジメチルホルムアミド(DMF)中の50mLの10%のピペリジンを、2.84g(5.72mmol、1.0当量)の化合物17に滴下し、撹拌した。4時間後、得られた混合物を、減圧下で濃縮して反応溶液を除去し、残渣を水に溶解し、減圧下でろ過して形成した浮遊物を除去した。水性層を濃縮して、標的化合物を得たが、これをいかなる精製もせずに次の反応で使用した。TLC(DCM:MeOH=10:1);Rf=0.01。
化合物19の合成
54mg(0.22mmol、1.0当量)の化合物18を、2mLのDMFに溶解し、0.05mL(0.264mmol、1.2当量)のN,N-ジイソプロピルエチルアミン(DIPEA)を、それに滴下した。化合物15を、2mLの水に添加することで完全に溶解し、0.05mL(0.528mmol、2.4当量)の無水酢酸を、室温でそれに滴下した。3時間後、得られた混合物を、減圧下で濃縮して反応溶液を除去し、濃縮物を逆相カラムクロマトグラフィーで精製して、標的化合物を得た。TLC(DCM:MeOH=10:1);Rf=0.05。
化合物20の合成
1g(3.16mmol、1.0当量)の化合物19を、DCM及びメタノールの2:1混合溶液30mLに溶解し、868mg(3.48mmol、1.1当量)のN-エトキシカルボニル-2-エトキシ-1,2-ジヒドロキノリン(EEDQ)を、それに添加し、撹拌した。451mg(3.66mmol、1.16当量)の4-アミノベンジルアルコールを、それに添加し、5時間撹拌した。得られた混合物を、減圧下で濃縮して反応溶液を除去し、濃縮物をカラムクロマトグラフィー(DCM中の10%のMeOH)で精製して、419mgの標的化合物を得た(収率:32%)。TLC(DCM:MeOH=10:1);Rf=0.1。
化合物21の合成
240mg(0.55mmol、1.0当量)の化合物20を、10mLのDMFに溶解し、0.3mL(1.65mmol、3.0当量)のDIPEAを、それに滴下し、撹拌した。その後、反応を、509mg(1.65mmol、3.0当量)のビス-(4-アミノフェニル)カーボネートを添加することにより実行した。3時間後、得られた混合物を、減圧下で濃縮して反応溶液を除去し、ジエチルエーテルをそれに添加して標的化合物を沈殿させ、これを減圧下でろ過した。得られた標的化合物を、いかなる精製もせずに次の反応で使用した。
化合物22の合成
33mg(0.06mmol、1.0当量)の化合物21を、5mLのDMFに溶解し、16mg(0.08mmol、1.3当量)の1-[(tert-ブトキシカルボニル)アミノ]-2-アミノエタン、及び0.02mL(0.08mmol、1.3当量)のDIPEAを、それに滴下し、撹拌した。得られた混合物を、7時間撹拌した後、減圧下で濃縮して反応溶液を除去し、ジエチルエーテルをそれに添加して標的化合物を沈殿させ、これを減圧下でろ過した。得られた標的化合物を、いかなる精製もせずに次の反応で使用した。TLC(DCM:MeOH=10:1);Rf=0.1。
化合物23の合成
17mg(0.03mmol、1.0当量)の化合物22を、1mLのDCMに溶解した後、1mLのトリフルオロ酢酸(TFA)を、0℃でそれに滴下した。得られた混合物を0℃で30分間撹拌した後、室温で30分間撹拌することにより、反応を実行した。その後、混合物を、減圧下で濃縮してDCMのような反応溶液を除去した後、この濃縮を3回繰り返した。濃縮した物質を、高真空下で乾燥し、逆相カラムクロマトグラフィーで精製して、13mgの標的化合物を得た。TLC(DCM:MeOH=10:1);Rf=0.01。
化合物DD3の合成
0.01mL(0.04mmol、1.5当量)のDIPEAを、3mLのDMF中に13mg(0.03mmol、1.0当量)の化合物23を溶解することにより得られた溶液に滴下し、22mg(0.04mmol、1.5当量)のフェノール活性化SN38を、それに添加した。得られた混合物を、1時間撹拌した後、減圧下で濃縮して、反応溶液を除去した。濃縮物を、カラムクロマトグラフィー(DCM中の10%のMeOH)で精製して、標的化合物を得た。TLC(DCM:MeOH=10:1);Rf=0.2。
VCリンカー(DD3)の構造の確認
LRMS (ESI): m/z 926.4 [M+H+]
結果は、図29に示す。
1.3.3. VCリンカー(DD4)の合成、及び構造の確認
Figure 0007393810000090
VCリンカー(DD4)の合成
化合物24の合成
5g(14.7mmol、1.0当量)のFmoc-Val-OH及び1.7g(14.7mmol、1.0当量)のN-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)を、140mLのジメトキシエタン(DME)に溶解し、撹拌した。2.5mL(16.2mmol、1.1当量)のN,N'-ジイソプロピルカルボジイミド(DIC)を、0℃で滴下し、16時間撹拌した。反応溶液を、減圧下でろ過して浮遊物を除去し、ろ液を減圧下で濃縮した。残渣をアセトンに溶解し、冷蔵庫において低温で4時間保管した。その後、得られた溶液を、減圧下でろ過して再形成した浮遊物を除去し、いかなる精製もせずに次の反応で使用した(粗収率:5.5g、86%)。TLC(EA:Hex=1:1);Rf=0.5。
化合物25の合成
2.0g(11.5mmol、1.0当量)のL-シトルリンを、テトラヒドロフラン(THF)及び水の1:1混合溶液100mLに溶解し、撹拌した。988mgの炭酸水素ナトリウムを、それに添加し、撹拌した。その後、5.0g(11.5mmol、1.0当量)の化合物21を、80mLのアセトンに溶解し、反応溶液に滴下した後、撹拌した。得られた混合物を、21時間撹拌した後、減圧下で濃縮して、有機溶媒を除去した。水性層を、酢酸エチル(EA)で洗浄した後、2N HClをゆっくり滴下することでpH3に滴定した。EAをそれに添加し、有機層の沈殿物を抽出した。次いで、有機層を、飽和食塩水及び硫酸ナトリウムで乾燥し、いかなる精製もせずに次の反応で使用した(粗収率:5.6g、98%)。TLC(DCM:MeOH=10:1、1滴のギ酸);Rf=0.1。
化合物26の合成
N,N-ジメチルホルムアミド(DMF)中の50mLの10%のピペリジンを、2.84g(5.72mmol、1.0当量)の化合物25に滴下し、撹拌した。4時間後、得られた混合物を、減圧下で濃縮して反応溶液を除去し、残渣を水に溶解し、減圧下でろ過して形成した浮遊物を除去した。水性層を濃縮して、標的化合物を得たが、これをいかなる精製もせずに次の反応で使用した。TLC(DCM:MeOH=10:1);Rf=0.01。
化合物27の合成
54mg(0.22mmol、1.0当量)の化合物26を、2mLのDMFに溶解し、0.05mL(0.264mmol、1.2当量)のN,N-ジイソプロピルエチルアミン(DIPEA)を、それに滴下した。化合物23を、2mLの水に添加することで完全に溶解し、0.05mL(0.528mmol、2.4当量)の無水酢酸を、室温でそれに滴下した。3時間後、得られた混合物を、減圧下で濃縮して反応溶液を除去し、濃縮物を逆相カラムクロマトグラフィーで精製して、標的化合物を得た。TLC(DCM:MeOH=10:1);Rf=0.05。
化合物28の合成
300mg(0.95mmol、1.0当量)の化合物27を、6mLのDMFに溶解した後、550mg(1.43mmol、1.5当量)の1-[ビス(ジメチルアミノ)メチレン]-1H-1,2,3-トリアゾロ[4,5-b]ピリジニウム3-オキシドヘキサフルオロホスフェート(HATU)を、それに添加した。その後、0.25mL(1.43mmol、1.5当量)のDIPEAを滴下し、230mg(1.43mmol、1.5当量)の1-[(tert-ブトキシカルボニル)アミノ]-2-アミノエタンを、3.5mLのDMFに溶解し、室温で滴下した。7時間後、反応溶液を、酢酸エチル(EA)で希釈し、有機層を、飽和炭酸水素ナトリウム溶液で洗浄した。次いで、有機層を、飽和食塩水及び硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過して、標的化合物を得た。得られた標的化合物を、いかなる精製もせずに次の反応で使用した。TLC(DCM:MeOH=10:1);Rf=0.5。
化合物29の合成
化合物28を、DCM及びTFAの2:1混合溶液に溶解した後、反応を0℃で実行した。その後、反応混合物を、減圧下で濃縮してDCMのような反応溶液を除去した後、この濃縮を3回繰り返した。残渣を、高真空下で乾燥し、逆相カラムクロマトグラフィーで精製して、370mgの標的化合物を得た。TLC(DCM:MeOH=10:1);Rf=0.01。
化合物DD4の合成
0.03mL(0.17mmol、1.2当量)のDIPEAを、3mLのDMF中に50mg(0.14mmol、1.0当量)の化合物26を溶解することにより得られた溶液に滴下し、107mg(0.21mmol、1.5当量)のフェノール活性化SN38を、それに添加した。得られた混合物を、1時間撹拌した後、減圧下で濃縮して、反応溶液を除去した。濃縮物を、カラムクロマトグラフィー(DCM中の10%のMeOH)で精製して、標的化合物を得た。TLC(DCM:MeOH=10:1);Rf=0.1。
VCリンカー(DD4)の構造の確認
LRMS (ESI): m/z 777.3 [M+H+]
結果は、図30に示す。
1.3.4. VCリンカー(DD5)の合成、及び構造の確認
Figure 0007393810000091
Figure 0007393810000092
VCリンカー(DD5)の合成
化合物30の合成
5g(14.7mmol、1.0当量)のFmoc-Val-OH及び1.7g(14.7mmol、1.0当量)のN-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)を、140mLのジメトキシエタン(DME)に溶解し、撹拌した。2.5mL(16.2mmol、1.1当量)のN,N'-ジイソプロピルカルボジイミド(DIC)を、0℃で滴下し、16時間撹拌した。反応溶液を、減圧下でろ過して浮遊物を除去し、ろ液を減圧下で濃縮した。残渣をアセトンに溶解し、冷蔵庫において低温で4時間保管した。その後、得られた溶液を、減圧下でろ過して再形成した浮遊物を除去し、いかなる精製もせずに次の反応で使用した(粗収率:5.5g、86%)。TLC(EA:Hex=1:1);Rf=0.5。
化合物31の合成
2.0g(11.5mmol、1.0当量)のL-シトルリンを、テトラヒドロフラン(THF)及び水の1:1混合溶液100mLに溶解し、撹拌した。988mgの炭酸水素ナトリウムを、それに添加し、撹拌した。その後、5.0g(11.5mmol、1.0当量)の化合物30を、80mLのアセトンに溶解し、反応溶液に滴下した後、撹拌した。得られた混合物を、21時間撹拌した後、減圧下で濃縮して、有機溶媒を除去した。水性層を、酢酸エチル(EA)で洗浄した後、2N HClをゆっくり滴下することでpH3に滴定した。EAをそれに添加し、有機層の沈殿物を抽出した。次いで、有機層を、飽和食塩水及び硫酸ナトリウムで乾燥し、いかなる精製もせずに次の反応で使用した(粗収率:5.6g、98%)。TLC(DCM:MeOH=10:1、1滴のギ酸);Rf=0.1。
化合物32の合成
N,N-ジメチルホルムアミド(DMF)中の50mLの10%のピペリジンを、2.84g(5.72mmol、1.0当量)の化合物31に滴下し、撹拌した。4時間後、得られた混合物を、減圧下で濃縮して反応溶液を除去し、残渣を水に溶解し、減圧下でろ過して形成した浮遊物を除去した。水性層を濃縮して、標的化合物を得たが、これをいかなる精製もせずに次の反応で使用した。TLC(DCM:MeOH=10:1);Rf=0.01。
化合物33の合成
54mg(0.22mmol、1.0当量)の化合物29を、2mLのDMFに溶解し、0.05mL(0.264mmol、1.2当量)のN,N-ジイソプロピルエチルアミン(DIPEA)を、それに滴下した。化合物32を、2mLの水に添加することで完全に溶解し、0.05mL(0.528mmol、2.4当量)の無水酢酸を、室温でそれに滴下した。3時間後、得られた混合物を、減圧下で濃縮して反応溶液を除去し、濃縮物を逆相カラムクロマトグラフィーで精製して、標的化合物を得た。TLC(DCM:MeOH=10:1);Rf=0.05。
化合物34の合成
1g(3.16mmol、1.0当量)の化合物33を、DCM及びメタノールの2:1混合溶液30mLに溶解し、868mg(3.48mmol、1.1当量)のN-エトキシカルボニル-2-エトキシ-1,2-ジヒドロキノリン(EEDQ)を、それに添加し、撹拌した。451mg(3.66mmol、1.16当量)の4-アミノベンジルアルコールを、それに添加し、5時間撹拌した。得られた混合物を、減圧下で濃縮して反応溶液を除去し、濃縮物をカラムクロマトグラフィー(DCM中の10%のMeOH)で精製して、419mgの標的化合物を得た(収率:32%)。TLC(DCM:MeOH=10:1);Rf=0.1。
化合物35の合成
240mg(0.55mmol、1.0当量)の化合物34を、10mLのDMFに溶解し、0.3mL(1.65mmol、3.0当量)のDIPEAを、それに滴下し、撹拌した。その後、反応を、509mg(1.65mmol、3.0当量)のビス-(4-アミノフェニル)カーボネートを添加することにより実行した。3時間後、得られた混合物を、減圧下で濃縮して反応溶液を除去し、ジエチルエーテルをそれに添加して標的化合物を沈殿させ、これを減圧下でろ過した。得られた標的化合物を、いかなる精製もせずに次の反応で使用した。
化合物36の合成
33mg(0.06mmol、1.0当量)の化合物35を、5mLのDMFに溶解し、16mg(0.08mmol、1.3当量)のN-[(tert-ブトキシ)カルボニル]-N,N'-ジメチルエチレンジアミン、及び0.02mL(0.08mmol、1.3当量)のDIPEAを、それに滴下し、撹拌した。得られた混合物を、7時間撹拌した後、減圧下で濃縮して反応溶液を除去し、ジエチルエーテルをそれに添加して標的化合物を沈殿させ、これを減圧下でろ過した。得られた標的化合物を、いかなる精製もせずに次の反応で使用した。TLC(DCM:MeOH=10:1);Rf=0.1。
化合物37の合成
17mg(0.03mmol、1.0当量)の化合物36を、1mLのDCMに溶解した後、1mLのトリフルオロ酢酸(TFA)を、0℃でそれに滴下した。得られた混合物を0℃で30分間撹拌した後、室温で30分間撹拌することにより、反応を実行した。その後、混合物を、減圧下で濃縮してDCMのような反応溶液を除去した後、この濃縮を3回繰り返した。濃縮した物質を、高真空下で乾燥し、逆相カラムクロマトグラフィーで精製して、13mgの標的化合物を得た。TLC(DCM:MeOH=10:1);Rf=0.01。
化合物DD5の合成
0.01mL(0.04mmol、1.5当量)のDIPEAを、3mLのDMF中に13mg(0.03mmol、1.0当量)の化合物37を溶解することにより得られた溶液に滴下し、22mg(0.04mmol、1.5当量)のフェノール活性化SN38を、それに添加した。得られた混合物を、1時間撹拌した後、減圧下で濃縮して、反応溶液を除去した。濃縮物を、カラムクロマトグラフィー(DCM中の10%のMeOH)で精製して、標的化合物を得た。TLC(DCM:MeOH=10:1);Rf=0.2。
3-4-2:VCリンカー(DD5)の構造の確認
LRMS (ESI): m/z 954.4 [M+H+]
結果は、図31に示す。
1.3.5. VCリンカー(DD6)の合成、及び構造の確認
Figure 0007393810000093
VCリンカー(DD6)の合成
化合物38の合成
5g(14.7mmol、1.0当量)のFmoc-Val-OH及び1.7g(14.7mmol、1.0当量)のN-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)を、140mLのジメトキシエタン(DME)に溶解し、撹拌した。2.5mL(16.2mmol、1.1当量)のN,N'-ジイソプロピルカルボジイミド(DIC)を、0℃で滴下し、16時間撹拌した。反応溶液を、減圧下でろ過して浮遊物を除去し、ろ液を減圧下で濃縮した。残渣をアセトンに溶解し、冷蔵庫において低温で4時間保管した。その後、得られた溶液を、減圧下でろ過して再形成した浮遊物を除去し、いかなる精製もせずに次の反応で使用した(粗収率:5.5g、86%)。TLC(EA:Hex=1:1);Rf=0.5。
化合物39の合成
2.0g(11.5mmol、1.0当量)のL-シトルリンを、テトラヒドロフラン(THF)及び水の1:1混合溶液100mLに溶解し、撹拌した。988mgの炭酸水素ナトリウムを、それに添加し、撹拌した。その後、5.0g(11.5mmol、1.0当量)の化合物38を、80mLのアセトンに溶解し、反応溶液に滴下した後、撹拌した。得られた混合物を、21時間撹拌した後、減圧下で濃縮して、有機溶媒を除去した。水性層を、酢酸エチル(EA)で洗浄した後、2N HClをゆっくり滴下することでpH3に滴定した。EAをそれに添加し、有機層の沈殿物を抽出した。次いで、有機層を、飽和食塩水及び硫酸ナトリウムで乾燥し、いかなる精製もせずに次の反応で使用した(粗収率:5.6g、98%)。TLC(DCM:MeOH=10:1、1滴のギ酸);Rf=0.1。
化合物40の合成
N,N-ジメチルホルムアミド(DMF)中の50mLの10%のピペリジンを、2.84g(5.72mmol、1.0当量)の化合物39に滴下し、撹拌した。4時間後、得られた混合物を、減圧下で濃縮して反応溶液を除去し、残渣を水に溶解し、減圧下でろ過して形成した浮遊物を除去した。水性層を濃縮して、標的化合物を得たが、これをいかなる精製もせずに次の反応で使用した。TLC(DCM:MeOH=10:1);Rf=0.01。
化合物41の合成
54mg(0.22mmol、1.0当量)の化合物40を、2mLのDMFに溶解し、0.05mL(0.264mmol、1.2当量)のN,N-ジイソプロピルエチルアミン(DIPEA)を、それに滴下した。化合物37を、2mLの水に添加することで完全に溶解し、0.05mL(0.528mmol、2.4当量)の無水酢酸を、室温でそれに滴下した。3時間後、得られた混合物を、減圧下で濃縮して反応溶液を除去し、濃縮物を逆相カラムクロマトグラフィーで精製して、標的化合物を得た。TLC(DCM:MeOH=10:1);Rf=0.05。
化合物42の合成
300mg(0.95mmol、1.0当量)の化合物41を、6mLのDMFに溶解した後、550mg(1.43mmol、1.5当量)の1-[ビス(ジメチルアミノ)メチレン]-1H-1,2,3-トリアゾロ[4,5-b]ピリジニウム3-オキシドヘキサフルオロホスフェート(HATU)を、それに添加した。その後、0.25mL(1.43mmol、1.5当量)のDIPEAを滴下し、230mg(1.43mmol、1.5当量)のN-[(tert-ブトキシ)カルボニル]-N,N'-ジメチルエチレンジアミンを、3.5mLのDMFに溶解し、室温で滴下した。7時間後、反応溶液を、酢酸エチル(EA)で希釈し、有機層を、飽和炭酸水素ナトリウム溶液で洗浄した。次いで、有機層を、飽和食塩水及び硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過して、標的化合物を得た。得られた標的化合物を、いかなる精製もせずに次の反応で使用した。TLC(DCM:MeOH=10:1);Rf=0.5。
化合物43の合成
化合物42を、DCM及びTFAの2:1混合溶液に溶解した後、反応を0℃で実行した。その後、反応混合物を、減圧下で濃縮してDCMのような反応溶液を除去した後、この濃縮を3回繰り返した。残渣を、高真空下で乾燥し、逆相カラムクロマトグラフィーで精製して、370mgの標的化合物を得た。TLC(DCM:MeOH=10:1);Rf=0.01。
化合物DD6の合成
0.03mL(0.17mmol、1.2当量)のDIPEAを、3mLのDMF中に50mg(0.14mmol、1.0当量)の化合物43を溶解することにより得られた溶液に滴下し、107mg(0.21mmol、1.5当量)のフェノール活性化SN38を、それに添加した。得られた混合物を、1時間撹拌した後、減圧下で濃縮して、反応溶液を除去した。濃縮物を、カラムクロマトグラフィー(DCM中の10%のMeOH)で精製して、標的化合物を得た。TLC(DCM:MeOH=10:1);Rf=0.1。
VCリンカー(DD6)の構造の確認
LRMS (ESI): m/z 805.5 [M+H+]
結果は、図32に示す。
2. 部位特異的な第1のクリック反応性官能基を抗体に転移させるための薬剤(H1-L2-SSFI)の調製
2.1. 化合物I-SSFIの合成、及び構造の確認(Xa1はリジンである)
Figure 0007393810000094
化合物I-SSFI(Lys)の合成方法
化合物I-SSFIの合成を、DMF中で実行し、3当量のDIPEA及び8.4μmolの化合物Iを、7.3μmolのSSFIに溶解し、撹拌して、化合物IをSSFIに導入した。
反応の完了を確認した後、反応溶液を濃縮し、分取HPLCによる化合物I-SSFIの精製を試みた。精製後、化合物I-SSFIを凍結乾燥して、標的化合物を得たが、その量は、12mg(純度:95%超(HPLC)、及び収率:71%)であることが確認された。
化合物I-SSFIの構造の確認
測定機器:Waters Quattro Premier Xe
計算した分子量:2246.99g/mol
測定した分子量(M/2+H)2+:1124.90g/mol
結果は、図33に示す。
2.2. 化合物II-SSFIの合成、及び構造の確認(Xa1はリジンである)
Figure 0007393810000095
化合物II-SSFI(Lys)の合成方法
化合物II-SSFIの合成を、DMF中で実行し、3当量のDIPEA及び8.4μmolの化合物IIを、7.3μmolのSSFIに溶解し、撹拌して、化合物IIをSSFIに導入した。
反応の完了を確認した後、反応溶液を濃縮し、分取HPLCによる化合物II-SSFIの精製を試みた。精製後、化合物II-SSFIを凍結乾燥して、標的化合物を得たが、その量は、13mg(純度:95%超(HPLC)、及び収率:78%)であることが確認された。
化合物II-SSFI(Lys)の構造の確認
測定機器:Ultraflextreme(Bruker社)
測定マトリックス:CHCA(α-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸)及びDHB(2,5-ジヒドロキシ安息香酸)
計算した分子量:2261.01g/mol
測定した分子量(M/2+H)2+:2263.26g/mol
結果は、図34に示す。
2.3.化合物III-SSFIの合成、及び構造の確認(Xa1はリジンである)
Figure 0007393810000096
化合物III-SSFI(Lys)の合成方法
化合物III-SSFIの合成を、DMF中で実行し、3当量のDIPEA及び8.4μmolの化合物IIIを、7.3μmolのSSFIに溶解し、撹拌して、化合物IIIをSSFIに導入した。
反応の完了を確認した後、反応溶液を濃縮し、分取HPLCによる化合物III-SSFIの精製を試みた。精製後、化合物III-SSFIを凍結乾燥して、標的化合物を得たが、その量は、12mg(純度:95%超(HPLC)、及び収率:75%)であることが確認された。
化合物III-SSFI(Lys)の構造の確認
測定機器:Waters Quattro Premier Xe
計算した分子量:2202.97g/mol
測定した分子量(M/2+H)2+:1103.64g/mol
結果は、図35に示す。
2.4. 化合物III-SSFIの合成、及び構造の確認(Xa1はオルニチンである)
Figure 0007393810000097
化合物III-SSFI(Orn)の合成方法
化合物III-SSFIの合成を、DMF中で実行し、3当量のDIPEA及び8.4μmolの化合物IIIを、7.3μmolのSSFIに溶解し、撹拌して、化合物IIIをSSFIに導入した。
反応の完了を確認した後、反応溶液を濃縮し、分取HPLCによる化合物III-SSFIの精製を試みた。精製後、化合物III-SSFIを凍結乾燥して、標的化合物を得たが、その量は、14mg(純度:95%超(HPLC)、及び収率:87%)であることが確認された。
化合物III-SSFI(Orn)の構造の確認
測定機器:Waters Quattro Premier Xe
計算した分子量:2188.97g/mol
測定した分子量(M/2+H)2+:1096.64g/mol
結果は、図36に示す。
2.5. 化合物III-SSFIの合成、及び構造の確認(Xa1は2,4-ジアミノブタン酸(Dab)である)
Figure 0007393810000098
化合物III-SSFI(Dab)の合成方法
化合物III-SSFIの合成を、DMF中で実行し、3当量のDIPEA及び8.4μmolの化合物IIIを、7.3μmolのSSFIに溶解し、撹拌して、化合物IIIをSSFIに導入した。
反応の完了を確認した後、反応溶液を濃縮し、分取HPLCによる化合物III-SSFIの精製を試みた。精製後、化合物III-SSFIを凍結乾燥して、標的化合物を得たが、その量は、12mg(純度:95%超(HPLC)、及び収率:75%)であることが確認された。
化合物III-SSFI(Dab)の構造の確認
測定機器:Waters Quattro Premier Xe
計算した分子量:2174.94g/mol
測定した分子量(M/2+H)2+:1089.94g/mol
結果は、図37に示す。
2.6. 化合物III-SSFIの合成、及び構造の確認(Xa1は2,3-ジアミノプロピオン酸(Dap)である)
Figure 0007393810000099
化合物III-SSFI(Dap)の合成方法
化合物III-SSFIの合成を、DMF中で実行し、3当量のDIPEA及び8.4μmolの化合物IIIを、7.3μmolのSSFIに溶解し、撹拌して、化合物IIIをSSFIに導入した。
反応の完了を確認した後、反応溶液を濃縮し、分取HPLCによる化合物III-SSFIの精製を試みた。精製後、化合物III-SSFIを凍結乾燥して、標的化合物を得たが、その量は、12mg(純度:95%超(HPLC)、及び収率:75%)であることが確認された。
化合物III-SSFI(Dap)の構造の確認
測定機器:Waters Quattro Premier Xe
計算した分子量:2160.92g/mol
測定した分子量(M/2+H)2+:1082.34g/mol
結果は、図38に示す。
2.7. 化合物IV-SSFIの合成、及び構造の確認(Xa1はDapである)
Figure 0007393810000100
化合物IV-SSFI(Dap)の合成方法
化合物IV-SSFIの合成を、DMF中で実行し、3当量のDIPEA及び8.4μmolの化合物IVを、7.3μmolのSSFIに溶解し、撹拌して、化合物IVをSSFIに導入した。
反応の完了を確認した後、反応溶液を濃縮し、分取HPLCによる化合物IV-SSFIの精製を試みた。精製後、化合物IV-SSFIを凍結乾燥して、標的化合物を得たが、その量は、12mg(純度:95%超(HPLC)、及び収率:76%)であることが確認された。
化合物IV-SSFI(Dap)の構造の確認
測定機器:Waters Quattro Premier Xe
計算した分子量:2167.90g/mol
測定した分子量(M/2+H)2+:1085.60g/mol
結果は、図39に示す。
3. 部位特異的手法における第1のクリック反応性官能基を含有する抗体の合成及び構造の確認
3.1. 抗体-ノルボルネンの合成
トラスツズマブ-ノルボルネンの合成方法(1)
化合物I-SSFI(Lys)を使用する導入反応
Ab(246/248 Lys)-ノルボルネンの合成を、化合物I-SSFI(Lys)を使用して緩衝剤中で実行した。1×PBS緩衝剤(0.01%のTween 20、pH7.4)を、反応緩衝剤として使用した。抗体(トラスツマブ、4mg/mL)のある特定の部位にノルボルネンを導入するために、8当量の化合物I-SSFI(Lys)を、1つの抗体毎に添加し、室温で72時間反応させ、反応のモニタリング及び完了を、HIC-HPLCで確認した。ノルボルネンの抗体への結合が進行すると、クロマトグラムのピークは、4分から4.5分及び5分にシフトすることが観察され、これにより、反応の進行の度合いを確認した。Ab-ノルボルネンコンジュゲートを、1×PBS緩衝剤(pH7.4)を使用して3回透析し、サイズ排除クロマトグラフィー技術を使用して精製した。
反応時間によるトラスツズマブと化合物I-SSFI(Lys)との間の結合反応の観察は、図40に示す。
トラスツズマブ-ノルボルネンの合成方法(2)
化合物II-SSFI(Lys)を使用する導入反応
Ab(246/248 Lys)-ノルボルネンの合成を、化合物II-SSFI(Lys)を使用して緩衝剤中で実行した。1×PBS緩衝剤(0.01%のTween 20、pH7.4)を、反応緩衝剤として使用した。抗体(トラスツマブ、4mg/mL)のある特定の部位にノルボルネンを導入するために、8当量の化合物II-SSFI(Lys)を、1つの抗体毎に添加し、室温で72時間反応させ、反応のモニタリング及び完了を、HIC-HPLCで確認した。ノルボルネンの抗体への結合が進行すると、クロマトグラムのピークは、4分から4.5分にシフトすることが観察され、これにより、反応の進行の度合いを確認した。Ab-ノルボルネンコンジュゲートを、1×PBS緩衝剤(pH7.4)を使用して3回透析し、サイズ排除クロマトグラフィー技術を使用して精製した。
反応時間によるトラスツズマブと化合物II-SSFI(Lys)との間の結合反応の観察は、図41に示す。
トラスツズマブ-ノルボルネンの合成方法(3)
化合物III-SSFI(Dap、Dab、Orn、又はLys)を使用する導入反応
Ab(246/248 Lys)-ノルボルネンの合成を、化合物III-SSFI(Lys)を使用して緩衝剤中で実行した。1×PBS緩衝剤(0.01%のTween 20、pH7.4)を、反応緩衝剤として使用した。抗体(ハーセプチン又はトラスツマブ、4mg/mL)のある特定の部位にノルボルネンを導入するために、10当量の化合物III-SSFI(Dap、Dab、Orn、又はLys)を、1つの抗体毎に添加し、室温で28時間反応させ、反応のモニタリング及び完了を、HIC-HPLCで確認した。ノルボルネンの抗体への結合が進行すると、クロマトグラムのピークは、6.2分から6.4分～6.7分にシフトすることが観察され、これにより、反応の進行の度合いを確認した。Ab-ノルボルネンコンジュゲートを、1×PBS緩衝剤(pH7.4)を使用して透析し、サイズ排除クロマトグラフィー技術を使用して精製した。
化合物III-SSFI(Dap、Dab、Orn、又はLys)と抗体との間の反応は、図42に示し、最終生成物(即ち、Ab(246/248)-ノルボルネン)の構造は、図43に示す。
反応時間によるトラスツズマブと化合物III-SSFI(Dap)との間の結合反応の観察は、図44に示す。
反応時間によるトラスツズマブと化合物III-SSFI(Dab)との間の結合反応の観察は、図45に示す。
反応時間によるトラスツズマブと化合物III-SSFI(Orn)との間の結合反応の観察は、図46に示す。
反応時間によるトラスツズマブと化合物III-SSFI(Lys)との間の結合反応の観察は、図47に示す。
3.2.抗体-アジドの合成
トラスツズマブ-アジドの合成方法(4)
化合物IV-SSFI(Dap)を使用する導入反応
Ab(246/248 Lys)-アジドの合成を、化合物IV-SSFI(Dap)を使用して緩衝剤中で実行した。1×PBS緩衝剤(0.01%のTween 20、pH7.4)を、反応緩衝剤として使用した。抗体(トラスツマブ、4mg/mL)のある特定の部位にアジドを導入するために、10当量の化合物IV-SSFI(Dap)を、1つの抗体毎に添加し、室温で24時間反応させ、反応のモニタリング及び完了を、HIC-HPLCで確認した。ノルボルネンの抗体への結合が進行すると、クロマトグラムのピークは、6分から6.3分にシフトすることが観察され、これにより、反応の進行の度合いを確認した。Ab-ノルボルネンコンジュゲートを、1×PBS緩衝剤(pH7.4)を使用して3回透析し、サイズ排除クロマトグラフィー技術を使用して精製した。
反応時間によるトラスツズマブと化合物IV-SSFI(Dap)との間の結合反応の観察は、図48に示す。
3.3.トラスツズマブ-ノルボルネンコンジュゲートの構造及び部位特異的結合の確認
ノルボルネンリンカーが、化合物III-SSFI(Dap)を介して抗体と結合した、抗体-ノルボルネン複合体を、質量分析で確認した。抗体-ノルボルネン複合体をIdeS酵素で処置した後、抗体のいずれの部位にノルボルネンがF(ab')2及びFc/2を介して結合したかを決定した。Ides Fc/2-ノルボルネン複合体が、N-グリカンの質量値、1つのリジン残基の喪失の値、及びノルボルネン1分子の値の合成値を考慮して正確に一致する値である、2991.68の「Obs-Theo」値を有することを見出し、これが、120Daの分子量に相当したことを確認した(-0.10の値は、高質量の分子量解析でのシステムエラーであるとみなした)。Ides_F(ab')2の観察された質量スペクトルは検出されたが、1つの電荷の質量値は、それぞれの質量スペクトルの複雑さによりシフトせず、それにより対応する質量値を得ることは不可能となった。
抗体-ノルボルネン結合により増加した分子量を有する複合体のスペクトルは、図49及び図50に示し、ノルボルネンコンジュゲーションによる分子量の変化は、Table 12(表12)に列挙する。
Figure 0007393810000101
その上、抗体-ノルボルネン複合体のノルボルネン結合部位を、トラスツズマブとのMS/MSスペクトルの比較を通して確認した。結果として、ノルボルネン分子が、配列LFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFのK248部位に結合したことを確認した。MS/MSクロマトグラムは、図51～図54に示し、MS/MSスペクトルに基づく配列マッチング結果は、図55に示す。
分析の条件は、以下の通りである。
UPLC条件
測定機器:Acquity UPLC I-Class system
1. カラム:Thermo MAbPac(商標)RP(2.1mm×5mm)
2. カラム温度:60℃
3. 移動相
A. 水中の0.1%のギ酸
B. アセトニトリル中の0.1%のギ酸
質量分析条件
測定機器:LTQ Elite(Thermo社)
源タイプ:HESI
キャピラリー温度:320℃
源ヒーター温度:300℃
シースガス流:40.00
Auxガス流:20.00
スイープガス流:5.00
電源電圧(KV):4.00
FTMS分解能:120,000
FTMS質量範囲:400～4,000
3.4. トラスツズマブ-アジドの構造の確認
アジドリンカーが、化合物IV-SSFI(Dap)を介して抗体と結合した、抗体-アジド複合体を、質量分析を使用して確認した。アジド化合物の2分子がトラスツズマブと結合した場合、249Daの分子量の増加を確認した。トラスツズマブの測定した質量スペクトルは、図56に示し、2つのアジド分子が結合する抗体-アジド複合体の質量スペクトルは、図57に示す。
測定機器:Ultraflex III(TOF/TOF)
解析モード:線形モード
極性:正
検出:m/z 2,000～300,000
レーザー繰返し率:100Hz
ショット数:1,000ショット
偏向:オン、5,000Da
電圧:イオン源kV、イオン源II 23.00kV、レンズ9.00kV
計算した分子量:148,271g/mol
測定した分子量:148,262g/mol
4. 抗体-ペイロードコンジュゲートの合成、及び構造の確認
4.1. ペイロードの合成方法、及び構造の確認
Figure 0007393810000102
テトラジン-DM1の合成方法
化合物41の合成
0.53g(0.8mmol、1.0当量)のFmoc-PEG8-OHを、7mLのDMFに溶解した後、撹拌した。その後、0.38g(1.0mmol、1.25当量)のHATU及び0.3mL(1.7mmol、2.1当量)のDIPEAを、それに滴下した。0.205g(0.86mmol、1.1当量)のメチルテトラジン-アミンHClを滴下し、0.3mL(1.7mmol、2.1当量)のDIPEAを、それに滴下した。得られた混合物を、4時間撹拌した後、減圧下で濃縮して、溶媒を除去した。混合物を、カラムクロマトグラフィー(DCM中の5%のMeOH)で精製して、標的化合物を得た。TLC(DCM:MeOH=20:1);Rf=0.3。
化合物42の合成
0.527g(0.62mmol、1.0当量)の化合物41を、6mLのDMFに溶解し、0.3mLのジエチルアミンを、それに滴下した。得られた混合物を、2.5時間撹拌した後、減圧下で濃縮して、溶媒を除去した。混合物を、カラムクロマトグラフィー(DCM:MeOH:NH4OH=80:25:2.5)で精製して、標的化合物を得たが、その量は、0.273g(収率:70%)であることが確認された。TLC(DCM:MeOH:NH4OH=80:25:2.5);Rf=0.1。
テトラジン-DM1の合成
0.355g(0.57mmol、1.5当量)の化合物42を、25mLのDMFに溶解した後、撹拌した。0.405g(0.38mmol、1.0当量)のDM1-SMCC-NHSを、それに添加し、混合物のpHがpH9.0に達するまで、DIPEAを滴下した。その後、混合物を、2時間撹拌した。反応溶液を減圧下で濃縮した後、カラムクロマトグラフィー(DCM中の10%のMeOH)で精製して、標的化合物を得たが、その量は、0.434g(収率:73%)であることが確認された。TLC(DCM:MeOH=10:1);Rf=0.5。
テトラジン-DM1の構造の確認
LRMS (ESI): m/z 782.6 [M+2H+]
結果は、図58に示す。
4.2. 抗体-ペイロードコンジュゲートの合成、及び構造の確認
4.2.1. 抗体-ノルボルネン-テトラジン-DM1
トラスツズマブ-ノルボルネン-テトラジン-DM1の合成方法(1)
化合物III-SSFI(Dap)を使用するテトラジン-DM1のトラスツズマブ-ノルボルネンへの導入反応
抗体-ペイロードコンジュゲートは、2つのノルボルネン分子を化合物III-SSFI(Dap)を介して導入した、トラスツズマブを使用して構築した。反応を、4.5mg/mLの濃度で25mLの抗体-ペイロードコンジュゲートを使用して実行し、テトラジン-PEG8-DM1薬のコンジュゲーションは、抗体にコンジュゲートしたノルボルネンと生体直交性反応(即ち、生体直交性化学)に対して試みた。40当量の薬物を、1つの抗体毎に使用し、コンジュゲーション反応を、20mM ヒスチジンアセテート溶液(pH5.5)中で、室温で24時間実施した。コンジュゲーション反応を、HIC-HPLCでモニタリングし、ノルボルネン分子のみがトラスツズマブと結合した7.7分後に現れるピークが、テトラジン-PEG8-DM1薬が抗体-ノルボルネンリンカーと反応したので、8.7分(DAR1)及び10.5分(DAR2)にシフトしたことを観察した。結果として、抗体-ペイロードコンジュゲートの形成を観察した。
生成物「抗体-ペイロードコンジュゲート」の構造は、図59に示し、HIC-HPLCでモニタリングした反応は、図60(Table 13(表13))に示す。
Figure 0007393810000103
トラスツズマブ-ノルボルネン-テトラジン-DM1構造の確認(2)
テトラジン-DM1がトラスツズマブ-ノルボルネンに結合した抗体-薬物コンジュゲートを、質量分析で確認した。抗体-薬物コンジュゲートをIdeS酵素で処置した後、抗体のいずれの部位にテトラジン-DM1がF(ab')2及びFc/2を介して結合したかを決定した。薬物が1つのテトラジン-DM1分子の合成値を考慮してコンジュゲートに結合したことを示す、1673.5の「Obs-Theo」値を、Ides Fc/2-DM1複合体が有することを見出し、これが、1,688.80Daの分子量に相当したことを確認した(脱水反応は、DM1系の薬物の分子量分析で観察された)。Ides_F(ab')2の観察された質量スペクトルは検出されたが、1つの電荷の質量値は、それぞれの質量スペクトルの複雑さによりシフトせず、それにより対応する質量値を得ることは不可能となった。
トラスツズマブ-ノルボルネン-テトラジン-DM1結合により増加した分子量を有する複合体のスペクトルは、図61及び図62に示す。
UPLC条件
測定機器:Acquity UPLC I-Class system
1. カラム:Thermo MAbPac(商標)RP(2.1mm×5mm)
2. カラム温度:60℃
3. 移動相
A. 水中の0.1%のギ酸
B. アセトニトリル中の0.1%のギ酸
質量分析条件
測定機器:LTQ Elite(Thermo社)
源タイプ:HESI
キャピラリー温度:320℃
源ヒーター温度:300℃
シースガス流:40.00
Auxガス流:20.00
スイープガス流:5.00
電源電圧(KV):4.00
FTMS分解能:120,000
FTMS質量範囲:400～4,000
5.抗体-薬物コンジュゲートのFcRn結合解析
本特許で構築した抗体-薬物コンジュゲートは、「AbClick(登録商標)Pro」と命名した。
抗体-薬物コンジュゲート(図59を参照;AbClick(登録商標)Pro(NC、DM1))が、抗体リサイクリング機能を有するか否かをチェックするために、in vivoでの抗体リサイクリングに密接に関連する新生児Fc受容体(FcRn)に対するコンジュゲートの結合親和性を解析した。生体分子相互作用システムの1つとして、Octet(モデル:Octet QK384)を使用して、構築したADCに対するFcRnの反応親和性を決定した。センサーの表面に付着した分子とサンプル中の分子との間の反応の度合いに従って起こる表面変化に起因する光の反射の差が、標識をされない(free of a label)こととして認識されたので、動態解析を実施した。トラスツズマブ、Kadcyla、及びAbClick(登録商標)Pro(NC、DM1)を、サンプルとして使用して、pH6.0の条件下でFcRnの結合親和性を測定した。結果として、測定したKD値が、それぞれ1.12×10-7M、1.12×10-7M、及び8.84×10-8Mであり、AbClick(登録商標)Proが、Kadcylaと比較して類似の又は優れた結合親和性を有することを示すことを確認した(Table 14(表14))。
Figure 0007393810000104
6. 抗体-薬物コンジュゲートの抗原結合解析
Her2タンパク質が抗体-薬物コンジュゲートに結合するか否かを酵素結合性免疫吸着アッセイ(ELISA)解析を通して決定した。トラスツズマブ及び化合物III-SSFI(Dap)を使用して構築した抗体-ノルボルネン複合体を、抗原結合親和性の測定のための抗体-薬物コンジュゲートとして使用した。抗体-ノルボルネン複合体に結合する3つの薬物の構造は、図63に示す。
ハーセプチン(トラスツズマブ)、Kadcyla、AbClick(登録商標)Pro(NC、DM1)、AbClick(登録商標)Pro(VC、DM1)、及び抗原由来のAbClick(登録商標)Pro(VC、MMAE)の解離定数(Kd)は、それぞれ、およそ98.6pM、およそ94.8pM、およそ121.4pM、およそ137.0pM、及びおよそ117.3pMであることが確認された。結果に基づいて、薬物の結合部位が、抗原に対する構築したADCの結合親和性に影響を及ぼさないことを確認した。
抗体-薬物コンジュゲートの抗原結合親和性を測定したグラフは、図64に示す(Table 15(表15))。
Figure 0007393810000105
7. 抗体-薬物コンジュゲートの血清安定性の確認
抗体-薬物コンジュゲートが血清で安定であるか否かを酵素結合性免疫吸着アッセイ(ELISA)解析を通して決定した。ラット、ウサギ、及びヒトの血清での抗体-薬物コンジュゲートの安定性を、室温で試験した。経時的な自己構築ADC「AbClick(登録商標)Pro(NC、DM1)」のインタクトなADC(即ち、薬物結合ADC)残留レベルのパターンが、Kadcyla(登録商標)群のものと一致することを確認した。
抗体-薬物コンジュゲートの血清安定性解析の結果は、図65～図67に示す。
8.細胞レベルでの抗体-薬物コンジュゲート(AbClick(登録商標)Pro)の薬効の評価(in vitro細胞傷害性試験)
トラスツズマブを使用する3つの抗体-薬物コンジュゲート(ADC、AbClick(登録商標)Proシリーズ)の薬効を、がん細胞での標的マーカーのレベルに従って評価し、細胞傷害性試験を、それぞれ、標的抗原(Her2)「細胞株」を発現する陽性細胞株、及びBT474を発現する陰性細胞株として、NCI-N87及びMDA-MB-468を使用して実施した。Her2過剰発現細胞NCI-N87において、構築した3つの抗体-薬物コンジュゲート(AbClick(登録商標)Pro(NC、DM1)、AbClick(登録商標)Pro(VC、DM1)、及びAbClick(登録商標)Pro(VC、MMAE))を、細胞を異なる濃度の抗体-薬物コンジュゲートで処理した後に観察した。結果として、抗体-薬物コンジュゲートが、207.7ng/mL、93.9ng/mL、及び57.7ng/mLのIC50値を有し、抗体-薬物コンジュゲートが、優れた抗がん作用を有することを示すことを確認した。別のHer2過剰発現細胞株BT474において、構築した3つの抗体-薬物コンジュゲート(AbClick(登録商標)Pro(NC、DM1)、AbClick(登録商標)Pro(VC、DM1)、及びAbClick(登録商標)Pro(VC、MMAE))を、細胞を異なる濃度の抗体-薬物コンジュゲートで処理した後に観察した。結果として、抗体-薬物コンジュゲートが、47.7ng/mL、44.6ng/mL、及び1.09ng/mLのIC50値を有し、抗体-薬物コンジュゲートが、優れた抗がん作用を有することを示すことを確認した。AbClick(登録商標)Pro(VC、MMAE)が、市販のハーセプチンADCとしてのKadcylaと比較して、等しいか又は優れたアポトーシス効果を有すると観察されたので、新規のADCとしてのAbClick(登録商標)Pro(VC、MMAE)の利用性を確認した。
試験結果は、図68～図70に示す。
9. 動物レベルでの抗体-薬物コンジュゲート(AbClick(登録商標)Pro)の薬効の評価(in vitro細胞傷害性試験)
標的の抗原過剰発現NCI-N87胃がん細胞株を、マウスに皮下移植して異種移植片モデルを確立し、マウスを4群に分けて、投与した物質での抗がん有効性試験を実施した。本試験で使用したBALB/cヌードマウスはT細胞を欠損していたので、がん細胞を、BALB/cヌードマウスに容易に移植した。従って、BALB/cヌードマウスを、齧歯類を使用する抗がん有効性試験に適したモデルとして使用した。
(a)細胞株の調製
1バイアルのヒト腫瘍細胞株(NCI-N87細胞株)を、熱不活性の10%のウシ胎児血清(FBS;Gibco、10082-742)を補充した、RPMI1640培地(Gibco、22400-089)を含有する細胞培養フラスコに置き、5%のCO2インキュベーターで、37℃で培養した。細胞培養培地を、PBSで洗浄し、2.5%のトリプシン-EDTA(Gibco、15090)で10倍に希釈した。その後、希釈した細胞株培地を添加して細胞を分離し、細胞を遠心分離(1,000rpmで5分間)して、上清を廃棄した。新鮮な培地を、細胞ペレットに添加して、細胞懸濁液を得た。細胞の生存率を、顕微鏡を使用して確認し、細胞を、1:1の混合比で培地及びマトリゲルを混合することにより得られた溶液で1.25×107細胞/mLの濃度に希釈して、細胞株を調製した。
(b)細胞株の移植
細胞株を、節「4.3)(4)細胞株の調製」に記載の方法を使用して調製した。細胞を、再懸濁及びホモジナイズして細胞株を調製し、調製した細胞株を、動物に直ちに投与した。細胞株の移植のために、動物の背部を、70%のアルコールで滅菌し、背部の皮膚を親指と人差し指で引き上げて、皮膚と筋肉との間に空間を形成した。その後、26ゲージ針の注射器を、親指と人差し指との間の皮下ポケットに刺した後、細胞株を、動物の前部から、2.5×106細胞/0.2mL/匹の用量で皮下投与した。順応期間の間、健康な動物を選択し、細胞株を接種した。細胞株移植部位での腫瘍のサイズが、およそ100～150mm3に達した場合、マウスを、ランク付けした腫瘍のサイズに従って分け、各群の腫瘍サイズを、可能な限り均一に分布させた。
(c)実験群の構成、並びに用量及び投与方法の決定
細胞株=NCI-N87
マウス型=BALB/cヌード(CAnN.Cg-Foxn1nu/CrljOri)
群当たりの個数=5
投与方法=静脈内注射(26ゲージ針の注射器を使用)
用量=5mg/kg
投与の回数=1回/3日、3回投与した
観察期間=5週間
群1:PBS;群2:ハーセプチン(トラスツズマブ);群3:Kadcyla;群4:AbClick(登録商標)Pro(NC、DM1);群5:AbClick(登録商標)Pro(VC、DM1);及び、群6:AbClick(登録商標)Pro(VC、MMAE)
(d)観察及び検査項目
全身症状
投与及び観察期間の間、全身症状の種類(死亡を含む)、症状発症日、及び症状の重症度を、1日1回観察し、各個体に対して記録した。全身症状が悪化した個体は隔離した。
体重
体重を、グループ分けした日又は試験物質の投与の開始日に測定した後、1週間に2回測定した。
腫瘍サイズの測定
腫瘍サイズを、試験物質の投与の開始日から5週間、1週間に2回測定した。腫瘍の長軸長さ及び短軸長さを、ノギスを使用して測定し、腫瘍サイズを、以下の等式に従って計算した。
腫瘍サイズ=ab2/2(a:長軸長さ;及び、b:短軸長さ)
(e)結果
リン酸緩衝食塩水(PBS)及びハーセプチン(トラスツズマブ)を注射した群のマウスは、5週間の観察期間で、腫瘍の成長を抑制する傾向は示さなかった。本発明に従って構築したAbClick(登録商標)Proシリーズの抗体-薬物コンジュゲートが、ハーセプチンと比較して優れた腫瘍の成長を抑制する能力を有し、本発明による抗体-薬物コンジュゲートが、ADCとして良好に機能することを示すことを確認した。
関連する結果は、図71及び図72に示す。
10. 抗体-薬物コンジュゲートの薬物動態学(PK)試験
AbClick(登録商標)Proを使用して製造した抗体-薬物コンジュゲート(ADC)の薬物動態的特性を解析するために、酵素結合性免疫吸着アッセイ(ELISA)を実施して、抗体-薬物コンジュゲートの薬物動態を確認した。製造したADCは、図59で示すAbClick(登録商標)Pro(NC、DM1)構造を有し、Kadcylaでの比較検証を行った。ラット(n=3)を、動物モデルに使用した。この場合、ラットは、5mg/kgのADCを静脈内注射した後、経時的にモニタリングした。投与したAbClick(登録商標)Pro(NC、DM1)のインタクトなADC形態(薬物が結合したインタクトなADC)が、経時的に減少したことを確認した。インタクトなADCが、Kadcylaと比較して、類似の又は向上した薬物特性を有すると判断した。
結果は、図73に示す。

Claims (18)

  1. 式2:
    (式中、
    H1は、第1の化学官能基であり、第1の化学官能基はジエン、ノルボルネン、テトラジン、アジド、trans-シクロオクテン、ジベンゾシクロオクチン-アミン、ジベンゾシクロオクチン、アルケン、及びチオールから選択され、
    D1は、共有結合、非置換C1～4アルキレン、非置換C2～4アルケニレン、非置換C2～4アルキンレン、及び非置換C3～8シクロアルキレンから選択され、
    X1は、Sであり、
    D2は、非置換C1～7アルキレン、非置換C2～7アルケニレン、非置換C2～7アルキニレン、及び非置換C3～8シクロアルキンレンから選択され、
    X2は、Oであり、
    R2'は、N-スクシンイミド、又はp-ニトロフェニルである)
    の化合物。
  2. H1が、ノルボルネン、テトラジン、アジド及びジベンゾシクロオクチン-アミンから選択される、
    請求項1に記載の化合物。
  3. R2'が、N-スクシンイミドである、
    請求項1又は2に記載の化合物。
  4. D 1 が、1つ又は複数のヘテロ原子を含む、
    請求項1から3のいずれか一項に記載の化合物。
  5. D 1 が、-[CH 2 ] a -O-[CH 2 ] b -であり、
    a及びbのそれぞれは、独立して、0～3から選択され、a及びbのそれぞれは、整数であり、
    a及びbの合計は、0以上且つ3以下である、
    請求項1から4のいずれか一項に記載の化合物。
  6. D 1 が、-CH 2 CH 2 OCH 2 -又は-CH 2 OCH 2 -である、
    請求項1から5のいずれか一項に記載の化合物。
  7. D 1 が、共有結合である、
    請求項1から3のいずれか一項に記載の化合物。
  8. 式2の化合物が、式2-1、2-2、又は2-3の化合物:
    である、
    請求項1から3のいずれか一項に記載の化合物。
  9. 化学官能基を抗体に転移するための式6-2:
    [式6-2]
    (Xaa)1-3-C-(Xaa)2-H-(Xa1)'-G-Xa2-L-V-Xa3-C-(Xaa)1-3
    [式中、
    各Xaaは、独立して、システイン残基ではない任意のアミノ酸残基であり、
    Cは、システイン残基であり、Hは、ヒスチジン残基であり、Gは、グリシン残基であり、Xa2は、グルタミン酸残基又はアスパラギン残基であり、Lは、ロイシン残基であり、Vは、バリン残基であり、Xa3は、トリプトファン残基、ナフチルアラニン残基、及びフェニルアラニン残基から選択され、
    (Xa1)'は、
    (式中、
    H1は、第1の化学官能基であり、第1の化学官能基はジエン、ノルボルネン、テトラジン、アジド、trans-シクロオクテン、ジベンゾシクロオクチン-アミン、ジベンゾシクロオクチン、アルケン、及びチオールから選択され、
    D1は、共有結合、非置換C1～4アルキレン、非置換C2～4アルケニレン、非置換C2～4アルキニレン、及び非置換C3～8シクロアルキンレンから選択され、
    X1は、Sであり、
    D2は、非置換C1～7アルキレン、非置換C2～7アルケニレン、非置換C2～7アルキニレン、及び非置換C3～8シクロアルキンレンから選択され、
    D3は、共有結合又は非置換C1～3アルキレンであり、
    X3は、NHである)
    である]
    のペプチド-化合物コンジュゲートであって、
    ペプチドが、13～17個のアミノ酸残基からなり、
    ペプチドが、ヒト免疫グロブリンG(IgG)に対する結合活性を呈し、
    式6-2のN末端から2～4個のアミノ酸にあるシステイン残基、及び式6-2のC末端から2～4個のアミノ酸にあるシステイン残基が、任意で連結しており、
    抗体との反応において、第一の化学官能基が抗体に転移する間、X1を含む基がペプチド-化合物コンジュゲートから除去される脱離基として作用する、
    ペプチド-化合物コンジュゲート。
  10. D2が、非置換Cyアルキレン、非置換Cyアルケニレン、又は非置換Cyアルキニレンであり、
    D3が、非置換Cxアルキレンであり、
    yが、1以上の整数で、1≦x+y≦5である、
    請求項9に記載のペプチド-化合物コンジュゲート。
  11. D2が、非置換Cyアルキレン、非置換Cyアルケニレン、又は非置換Cyアルキニレンであり、
    D3が、非置換Cxアルキレンであり、
    yが、1以上の整数で、9≦x+y≦12である、
    請求項9に記載のペプチド-化合物コンジュゲート。
  12. D2が、非置換Cyアルキレン、非置換Cyアルケニレン、又は非置換Cyアルキニレンであり、
    D3が、非置換Cxアルキレンであり、
    yが、1以上の整数で、6≦x+y≦8である、
    請求項9に記載のペプチド-化合物コンジュゲート。
  13. 式6-2のペプチド-化合物コンジュゲートが、式6-3のペプチド-化合物コンジュゲート:
    [式6-3]
    D-C-A-W-H-(Xa1)'-G-E-L-V-W-C-T
    (式中、
    Dは、アスパラギン酸残基であり、Aは、アラニン残基であり、Eは、グルタミン酸残基であり、Wは、トリプトファン残基であり、Tは、スレオニン残基である)
    である、
    請求項9から12のいずれか一項に記載のペプチド-化合物コンジュゲート。
  14. D 1 が、1つ又は複数のヘテロ原子を含む、
    請求項9から13のいずれか一項に記載のペプチド-化合物コンジュゲート。
  15. D 1 が、-[CH 2 ] a -O-[CH 2 ] b -であり、
    a及びbのそれぞれは、独立して、0～3から選択され、a及びbのそれぞれは、整数であり、
    a及びbの合計は、0以上且つ3以下である、
    請求項9から14のいずれか一項に記載のペプチド-化合物コンジュゲート。
  16. D 1 が、-CH 2 CH 2 OCH 2 -又は-CH 2 OCH 2 -である、
    請求項9から15のいずれか一項に記載のペプチド-化合物コンジュゲート。
  17. D1が、共有結合であり、D2が、メチレンである、
    請求項9に記載のペプチド-化合物コンジュゲート。
  18. 化学官能基を抗体に転移するためのペプチド-化合物コンジュゲートを調製するためのキットであって、
    式2:
    (式中、
    H1は、第1の化学官能基であり、第1の化学官能基はジエン、ノルボルネン、テトラジン、アジド、trans-シクロオクテン、ジベンゾシクロオクチン-アミン、ジベンゾシクロオクチン、アルケン、及びチオールから選択され、
    D1は、共有結合、非置換C1～4アルキレン、非置換C2～4アルケニレン、非置換C2～4アルキニレン、及び非置換C3～8シクロアルキンレンから選択され、
    X1は、Sであり、
    D2は、非置換C1～7アルキレン、非置換C2～7アルケニレン、非置換C2～7アルキニレン、及び非置換C3～8シクロアルキンレンから選択され、
    X2は、Oであり、
    R2'は、N-スクシンイミド、又はp-ニトロフェニルである)
    の化合物;並びに、
    式4-2:
    [式4-2]
    (Xaa)1-3-C-(Xaa)2-H-Xa1-G-Xa2-L-V-Xa3-C-(Xaa)1-3
    [式中、
    各Xaaは、独立して、システイン残基ではない任意のアミノ酸残基であり、
    Cは、システイン残基であり、Hは、ヒスチジン残基であり、Gは、グリシン残基であり、Xa2は、グルタミン酸残基又はアスパラギン残基であり、Lは、ロイシン残基であり、Vは、バリン残基であり、Xa3は、トリプトファン残基、ナフチルアラニン残基、及びフェニルアラニン残基から選択され、
    Xa1は、
    (式中、D3は、共有結合又は非置換C1～3アルキレンであり、X3は、NH2である)
    であり、
    ペプチドが、13～17個のアミノ酸残基からなり、
    ペプチドが、ヒト免疫グロブリンG(IgG)に対する結合活性を呈し、
    式4-2のN末端から2～4個のアミノ酸にあるシステイン残基、及び式4-2のC末端から2～4個のアミノ酸にあるシステイン残基が、任意で連結している]
    のペプチド
    を含む、キット。
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