KR20230107276A - 펩타이드 가교제 및 상기 가교제를 이용하여 가교된 가교 펩타이드 - Google Patents

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Abstract

단백질 또는 펩타이드의 가교제는 하기 화학식 (I)로 표시된다. 이 화학식에서 A는 수소 원자, 선택적으로 페닐기 또는 할로겐 원자로 치환된 C1 내지 6 알킬기, 또는 페닐기이다.
Figure pct00097

Description

펩타이드 가교제 및 상기 가교제를 이용하여 가교된 가교 펩타이드
본 발명은 가교 펩타이드(crosslinked peptide) 의 제조 방법 등에 관한 것이다.
현재 가장 주목받고 있는 바이오의약품 중 하나는 단백질 의약품과 펩타이드 의약품이다. 특히, 항체의약품, 주로 IgG 항체 및 펩타이드 의약품은 최근 제약 분야에서 활용되고 있으며, 산업 및 제약 분야에서 점점 더 중요해지고 있다.
본 발명자는 항체 의약품의 정제에 사용되는 단백질 A 컬럼에 대한 대체 시스템을 구성하기 위해, 지금까지 17개의 잔기로 구성되고 이황화 결합에 의해 고리화되고 특정 서열을 포함하는 IgG 펩타이드를 포함하는 펩타이드 리간드가 고정화된 컬럼에 의해 IgG의 정제 능력을 보고하였다(특허문헌 1). 그러나 이러한 IgG 펩타이드 컬럼은 펩타이드에 존재하는 이황화 결합의 알칼리성 저항성이 낮아 반복적으로 사용할 수 없는 문제점이 있다. 본 발명자는 펩타이드 또는 단백질의 이황화 결합이 알칼리 세척에 화학적으로 약해지는 문제를 해결하기 위해 알칼리 저항성을 증가시키는 해결책을 반복적으로 연구한 결과, 1,3-디클로로아세톤을 사용하여 펩타이드 또는 단백질 내 시스테인 잔기의 티올기 간 가교를 통해 알칼리 세척에 대한 저항성을 획기적으로 증가시킨 IgG 결합 펩타이드를 발견하였다(특허문헌 2). 그러나 이러한 가교는 강한 내알칼리성을 부여하지만 IgG와의 친화성(Kd = 4.9 μM)이 낮고 기능성이 상실되는 새로운 문제를 가지고 있다. 그 후 디클로로아세톤에 의한 가교와 달리 기능성이 크게 저하되지 않으면서도 내알칼리성을 유지할 수 있도록 가교 구조를 재설계하여 개선하고자 노력한 결과, 이황화물의 티올 하나를 메틸기로 바꾸어 내알칼리성을 유지할 수 있는 가교 구조를 얻게 되었다. 이황화물의 티올 하나를 메틸기로 변경하여 SS 결합을 CH3-S 결합으로 전환함으로써 실용적인 가교 구조에 가까운 가교 구조를 얻을 수 있었으며, 이 가교 구조는 여전히 친화도는 다소 낮지만 340 nM의 Kd 값을 가지며 알칼리 저항성을 갖는 것으로 밝혀졌다(특허문헌 3). 그러나 이러한 방법은 펩타이드의 호모세린을 한 번 염소 처리한 다음 그 결과물을 시스테인의 티올기와 반응시켜야 하므로 생산 수율이 낮다는 문제점이 있다.
특허 문헌 1: 국제 공개 번호 WO 2013/027796 특허 문헌 2: 국제 공개 번호 WO 2018/092867 특허 문헌 3: 국제 공개 번호 WO 2020/075670
본 발명의 목적은 가교 구조의 재설계를 통해, 내알칼리성이 높고 친화성이 현저히 저하되지 않으면서 기능성이 유지되는 가교 구조를 높은 수율로 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명자는 가교제의 구조 개선에 대한 연구를 거듭한 결과, 일반적으로 반응성이 높아 수용액에서는 사용되지 않는 1,1-디클로로아세톤 및 그 유도체를 가교제로 사용하여 내알칼리성및 IgG와의 높은 친화도(Kd = 45 nM)를 갖는 IgG 결합 펩타이드를 제조하는데 성공하였다. 본 발명은 의약품에 실질적으로 사용될 수 있고, 수율이 높으며, 알칼리 저항성을 나타내면서 단백질이나 펩타이드의 기능을 유지할 수 있는 가교 기술을 제공하는 데 성공하였다.
본 발명의 제1 측면에 따른 단백질 또는 펩타이드에 대한 가교제는 하기 화학식 (I)로 표시된다.
Figure pct00001
상기 화학식에서, A는 수소 원자, 선택적으로 페닐기 또는 할로겐 원자로 치환된 C1 내지 6 알킬기, 또는 페닐기이다.
본 발명의 제2 측면에 따른 가교 단백질 또는 펩타이드의 제조 방법은, 단일 또는 분리된 단백질 또는 펩타이드 내의 적어도 두 티올기가 하기 화학식으로 표시되는 바와 같이 결합된 가교 단백질 또는 펩타이드의 제조 방법이다:
Figure pct00002
[상기 A는 수소 원자, 선택적으로 페닐기 또는 할로겐 원자, 페닐기 또는 C1 내지 6 알킬기로 치환된 C1 내지 6 알킬기이고, 단백질/펩타이드는 단백질 또는 펩타이드를 나타내며, 단백질/펩타이드 A 그리고 단백질/펩타이드 B는 선택적으로 동일하거나 상이하다]
단백질 또는 펩타이드를 본 발명의 제1 측면에 따른 가교제와 반응시켜, 하기의 그룹을 통해 2개의 티올기를 결합시키는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
Figure pct00003
[상기 A는 수소 원자, 선택적으로 페닐기 또는 할로겐 원자로 치환된 C1 내지 6 알킬기, 페닐기, 또는 C1 내지 6 알킬기].
상기 단백질 또는 펩타이드는 적어도 2개의 티올기의 전부 또는 일부가 이황화 결합을 형성하는 단백질 또는 펩타이드일 수 있으며, 상기 방법은 상기 이황화 결합을 환원시켜 2개의 티올기를 생성하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 제3 측면에 따른 단백질 또는 펩타이드의 내알칼리성 향상 방법은 본 발명의 제2 측면에 따른 방법에 의해 단백질 또는 펩타이드 내에 티올기를 결합시켜 가교 단백질 또는 펩타이드를 얻는 단계를 포함한다.
본 발명의 제4 측면에 따른 단백질 또는 펩타이드의 제조 방법은 하기 화학식으로 표시되는 반응성 작용기에 결합된 단백질 또는 펩타이드를 제조하는 방법이다:
Figure pct00004
[상기 A는 수소 원자, 선택적으로 페닐기 또는 할로겐 원자, 페닐기 또는 C1 내지 6 알킬기로 치환된 C1 내지 6 알킬기이고, 단백질/펩타이드는 단백질 또는 펩타이드를 나타내며, 단백질/펩타이드 A그리고 단백질/펩타이드 B는 선택적으로 동일하거나 상이하고, L은 링커를 나타내고 Z는 상기 반응성 작용기를 나타낸다]
본 발명의 제2 측면에 따른 방법에 의해 상기 가교 단백질 또는 펩타이드를 얻는 단계; 및
얻어진 가교 단백질 또는 펩타이드를 NH2-L-Z(L은 링커를 나타내고 Z는 상기 반응성 작용기를 나타냄)와 반응시켜, 상기 가교 단백질 또는 펩타이드의 가교된 부분에 반응성 작용기를 도입하는 단계를 포함하는 방법.
본 발명의 제5 측면에 따른 단백질 또는 펩타이드의 제조 방법은 하기 화학식으로 표시되는 반응성 작용기에 결합된 단백질 또는 펩타이드의 제조 방법이다:
Figure pct00005
[상기 A는 수소 원자, 선택적으로 페닐기 또는 할로겐 원자, 페닐기 또는 C1 내지 6 알킬기로 치환된 C1 내지 6 알킬기이고, 단백질/펩타이드는 단백질 또는 펩타이드를 나타내며, 단백질/펩타이드 A그리고 단백질/펩타이드 B는 선택적으로 동일하거나 상이하고, L은 링커를 나타내고 Z는 상기 반응성 작용기를 나타낸다]
하기 화학식으로 표시되는 가교 단백질(들) 또는 펩타이드(들)를 반응시키는 단계:
Figure pct00006
[상기 A는 수소 원자, 선택적으로 페닐기 또는 할로겐 원자, 페닐기 또는 C1 내지 6 알킬기로 치환된 C1 내지 6 알킬기이고, 단백질/펩타이드는 단백질 또는 펩타이드를 나타내며, 단백질/펩타이드 A그리고 단백질/펩타이드 B는 선택적으로 동일하거나 상이하다]
그리고 NH2-L-Z(L은 링커를 나타내고 Z는 상기 반응성 작용기를 나타냄)를 반응시켜 가교 단백질(들) 또는 펩타이드(들)의 가교된 부분에 상기 반응성 작용기를 도입하는 것을 포함하는 방법.
본 발명의 제6 측면에 따른 단백질 또는 펩타이드와 약물의 복합체를 제조하는 방법은 단백질 또는 펩타이드와 하기 화학식으로 표시되는 약물의 복합체를 제조하는 방법이다:
Figure pct00007
[상기 A는 수소 원자, 선택적으로 페닐기 또는 할로겐 원자, 페닐기 또는 C1 내지 6 알킬기로 치환된 C1 내지 6 알킬기이고, 단백질/펩타이드는 단백질 또는 펩타이드를 나타내며, 단백질/펩타이드 A그리고 단백질/펩타이드 B는 선택적으로 동일하거나 상이하고, L은 링커를 나타내고 D 는 상기 약물을 나타낸다]
본 발명의 제4 또는 제5 측면에 따른 방법에 의해 반응성 작용기에 결합된 단백질(들) 또는 펩타이드(들)를 얻는 단계; 및
반응성 작용기에 결합하여 얻어진 단백질(들) 또는 펩타이드(들) 그리고 반응성 작용기와 반응하는 다른 작용기를 갖는 약물을 반응시켜, 약물을 상기 가교 단백질(들) 또는 펩타이드(들)의 가교된 부분에 상기 약물을 결합시키는 단계를 포함하는 방법.
본 발명의 제7 측면에 따른 단백질 또는 펩타이드와 약물의 복합체를 제조하는 방법은 하기 화학식으로 표시되는 단백질 또는 펩타이드 및 약물의 복합체를 제조하는 방법이다:
Figure pct00008
[상기 A는 수소 원자, 선택적으로 페닐기 또는 할로겐 원자, 페닐기 또는 C1 내지 6 알킬기로 치환된 C1 내지 6 알킬기이고, 단백질/펩타이드는 단백질 또는 펩타이드를 나타내며, 단백질/펩타이드 A그리고 단백질/펩타이드 B는 선택적으로 동일하거나 상이하고, L은 링커를 나타내고 D 는 상기 약물을 나타낸다]
하기 화학식으로 표시되는 반응성 작용기에 결합된 단백질(들) 또는 펩타이드(들)를 반응시키는 단계:
Figure pct00009
[상기 A는 수소 원자, 선택적으로 페닐기 또는 할로겐 원자, 페닐기 또는 C1 내지 6 알킬기로 치환된 C1 내지 6 알킬기이고, 단백질/펩타이드는 단백질 또는 펩타이드를 나타내며, 단백질/펩타이드 A그리고 단백질/펩타이드 B는 선택적으로 동일하거나 상이하고, L은 링커를 나타내고 Z는 상기 반응성 작용기를 나타낸다]
그리고 반응성 작용기와 반응하는 다른 작용기를 갖는 약물을 반응시켜 상기 가교 단백질(들) 또는 펩타이드(들)의 가교된 부분에 상기 약물을 결합시키는 단계를 포함하는 방법.
본 발명의 제4 내지 제7 측면에 따른 방법에 있어서, 상기 링커는 단백질 분해 효소에 의해 절단 가능한 부위(moiety)를 함유할 수 있다.
본 발명의 제2 내지 제7 측면에 따른 방법에 있어서, 상기 단백질 또는 펩타이드는 5 내지 50개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드일 수 있다.
본 발명의 제2 내지 제7 측면에 따른 방법에 있어서, 상기 가교용 티올기는 단일 단백질 또는 펩타이드에 존재할 수 있다.
본 발명의 제2 내지 제7 측면에 따른 방법에 있어서, 상기 단백질 또는 펩타이드는 Fc-결합 펩타이드일 수 있다.
본 발명의 제2 내지 제7 측면에 따른 방법에 있어서, 상기 가교용 티올기는 분리된 단백질 또는 펩타이드에 존재할 수 있다.
본 발명의 제8 측면에 따른 가교 단백질(들) 또는 펩타이드(들)는 하기 화학식으로 표시된다.
Figure pct00010
[상기 A는 수소 원자, 선택적으로 페닐기 또는 할로겐 원자, 페닐기 또는 C1 내지 6 알킬기로 치환된 C1 내지 6 알킬기이고, 단백질/펩타이드는 단백질 또는 펩타이드를 나타내며, 단백질/펩타이드 A 그리고 단백질/펩타이드 B는 선택적으로 동일하거나 상이함].
본 발명의 제9 측면에 따른 반응성 작용기에 결합된 단백질(들) 또는 펩타이드(들)는 하기 화학식으로 표시된다:
Figure pct00011
[상기 A는 수소 원자, 선택적으로 페닐기 또는 할로겐 원자, 페닐기 또는 C1 내지 6 알킬기로 치환된 C1 내지 6 알킬기이고, 단백질/펩타이드는 단백질 또는 펩타이드를 나타내며, 단백질/펩타이드 A그리고 단백질/펩타이드 B는 선택적으로 동일하거나 상이하고, L은 링커를 나타내고 Z는 상기 반응성 작용기를 나타낸다]
본 발명의 제10 측면에 따른 단백질(들) 또는 펩타이드(들) 및 약물의 복합체는 하기 화학식으로표시된다:
Figure pct00012
[상기 A는 수소 원자, 선택적으로 페닐기 또는 할로겐 원자, 페닐기 또는 C1 내지 6 알킬기로 치환된 C1 내지 6 알킬기이고, 단백질/펩타이드는 단백질 또는 펩타이드를 나타내며, 단백질/펩타이드 A그리고 단백질/펩타이드 B는 선택적으로 동일하거나 상이하고, L은 링커를 나타내고 D 는 상기 약물을 나타낸다]
본 발명의 제8 측면 및 제9 측면에 따른 단백질(들) 또는 펩타이드(들) 및 본 발명의 제10 측면에 따른 복합체에 있어서, 상기 링커는 단백질 분해 효소에 의해 절단 가능한 모이어티를 포함할 수 있다.
본 발명의 제8 측면 및 제9 측면에 따른 단백질 또는 펩타이드, 및 본 발명의 제10 측면에 따른 복합체에 있어서, 상기 단백질 또는 펩타이드는 5 내지 50개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드일 수 있다.
본 발명의 제8 측면 및 제9 측면에 따른 단백질 또는 펩타이드 및 본 발명의 제10 측면에 따른 복합체에 있어서, 가교용 티올기는 단일 단백질 또는 펩타이드에 존재할 수 있다.
본 발명의 제8 측면 및 제9 측면에 따른 단백질 또는 펩타이드, 및 본 발명의 제10 측면에 따른 복합체에 있어서, 상기 단백질 또는 펩타이드는 Fc-결합 펩타이드일 수 있다.
라이신 잔기, 시스테인 잔기, 아스파라긴산 잔기, 글루탐산 잔기, 2-아미노수베릭산, 디아미노프로피온산, 아르기닌 잔기 또는 Fc-결합 펩타이드의 1-위치에 있는 아미노산의 아미노기는 DSG(disuccinimidyl glutarate), DSS(disuccinimidyl suberate), DMA(dimethyl adipimidate dihydrochloride), DMP(dimethyl pimelimidate dihydrochloride), DMS(dimethyl suberimidate dihydrochloride), DTBP (dimethyl 3,3'-dithiobispropionimidate dihydrochloride), 또는 DSP(dithiobis(succinimidyl propionic acid))로 변형될 수 있다.
본 발명의 제8 측면 및 제9 측면에 따른 단백질 또는 펩타이드 및 본 발명의 제10 측면에 따른 복합체에 있어서, 상기 가교용 티올기는 분리된 단백질 또는 펩타이드에 존재할 수 있다.
본 발명의 제11 측면에 따른 가교 Fc-결합 펩타이드(들)에 결합된 IgG-Fc 영역 함유 분자의 제조 방법은, 본 발명의 제8 또는 제9 측면에 따른 단백질 또는 펩타이드 또는 본 발명의 제10측면에 따른 복합체와 IgG-Fc 영역 함유 분자를 접촉시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 제12 측면에 따른 가교 Fc-결합 펩타이드(들)에 결합된 IgG-Fc 영역 함유 분자를 제조하는 방법으로서, 본 발명의 제1 측면에 따른 가교제와 IgG-Fc 영역 함유 분자에 결합된 Fc-결합 펩타이드를 반응시켜, 다음 기(group)를 통해 상기 Fc-결합 펩타이드의 두 티올 기를 결합시키는 단계:를 포함한다.
Figure pct00013
[상기 A는 수소 원자, 선택적으로 페닐기 또는 할로겐 원자로 치환된 C1 내지 6 알킬기, 페닐기, 또는 C1 내지 6 알킬기]
본 발명의 제13 측면에 따르면, 반응성 작용기 Z를 갖는 Fc-결합 펩타이드에 결합된 IgG-Fc 영역 함유 분자의 제조방법은 하기 화학식으로 표시된다.
Figure pct00014
[상기 A는 수소 원자, 선택적으로 페닐기 또는 할로겐 원자, 페닐기 또는 C1 내지 6 알킬기로 치환된 C1 내지 6 알킬기이고, L은 링커를 나타내고 Z는 상기 반응성 작용기를 나타낸다]
하기 화학식으로 표시되는 가교 Fc-결합 펩타이드에 결합한 IgG-Fc 영역 함유 분자를 반응시키는 단계:
Figure pct00015
[상기 A는 수소 원자, 선택적으로 페닐기 또는 할로겐 원자, 페닐기 또는 C1 내지 6 알킬기로 치환된 C1 내지 6 알킬기]
그리고 NH2-L-Z(L은 링커를 나타내고 Z는 상기 반응성 작용기를 나타냄)를 반응시켜 가교 Fc-결합 펩타이드에 가교된 부분에 상기 반응성 작용기를 도입하는 것을 포함하는 방법.
본 발명의 제14 측면에 따르면, 상기 Fc-결합 펩타이드는 하기 화학식으로 표시되는, 약물 D를 갖는 Fc-결합 펩타이드에 결합된 IgG-Fc 영역 함유 분자의 제조 방법,
Figure pct00016
반응성 작용기 Z를 갖는 Fc-결합 펩타이드(들)에 결합된 IgG-Fc 영역 함유 분자를 반응시키는 단계를 포함하며, 여기서 Fc-결합 펩타이드는 하기 화학식으로 표시된다:
Figure pct00017
[상기 A는 수소 원자, 선택적으로 페닐기 또는 할로겐 원자, 페닐기 또는 C1 내지 6 알킬기로 치환된 C1 내지 6 알킬기이고, L은 링커를 나타내고 Z는 상기 반응성 작용기를 나타낸다]
그리고 반응성 작용기Z와 반응하는 다른 작용기를 갖는 약물을 반응시켜 가교 단백질 또는 펩타이드의 가교된 부분에 상기 약물을 결합시키는 단계를 포함하는 방법.
본 발명의 제11 내지 제14 측면에 따른 방법은 각각 Fc-결합 펩타이드 및 IgG-Fc 영역 함유 분자를 공유결합시키는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 제15 측면에 따른 IgG-Fc 영역 함유 분자는 본 발명의 제8 측면 및 제9 측면에 따른 단백질 또는 펩타이드 또는 본 발명의 제10 측면에 따른 복합체가 결합된 것이다.
본 발명의 제15 측면에 따른 분자에 있어서, 상기 Fc-결합 펩타이드 및 IgG-Fc 영역 함유 분자는 공유결합할 수 있다.
본 발명의 제16 측면에 따른 운반체는 본 발명의 제8 측면 또는 제9 측면에 따른 펩타이드가 결합된 것이다.
본 발명의 제17 측면에 따른 IgG-Fc 영역 함유 분자의 정제 방법은 본 발명의 제16 측면에 따른 운반체와 IgG-Fc 영역 함유 분자를 포함하는 액체를 접촉시키는 단계,
세척을 통해 운반체에 결합되지 않는 구성 요소를 제거하는 단계, 및
IgG-Fc 영역 함유 분자를 회수하기 위해 운반체에 결합된 구성 요소를 용출시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 제18 측면에 따른 가교 단백질 또는 펩타이드의 제조 방법은 적어도 2개의 티올기가 결합된 가교 단백질 또는 펩타이드의 제조 방법이며, 여기서 상기 가교 단백질 또는 펩타이드는 하기 화학식으로 표시된다:
Figure pct00018
[상기 A는 수소 원자, 선택적으로 페닐기 또는 할로겐 원자, 페닐기 또는 C1 내지 6 알킬기로 치환된 C1 내지 6 알킬기이고, 단백질/펩타이드는 단백질 또는 펩타이드를 나타낸다]
Fmoc 방법에 의한 상기 단백질 또는 펩타이드를 합성하는 단계; 및
상기 합성에서 적어도 하나의 시스테인 잔기 대신에 하기 화학식으로 표시되는 화합물을 사용하는 단계를 포함하는 방법.
Figure pct00019
본 발명의 제19 측면에 따른 단백질 또는 펩타이드의 제조 방법은 하기 화학식으로 표시되는 반응성 작용기 또는 약물이 결합된 단백질 또는 펩타이드의 제조 방법이다:
Figure pct00020
[상기 A는 수소 원자, 선택적으로 페닐기 또는 할로겐 원자, 페닐기, 또는 C1 내지 6 알킬기로 치환된 C1 내지 6 알킬기이고, 단백질/펩타이드는 단백질 또는 펩타이드를 나타내며, L은 링커를 나타내고, Z는 상기 반응성 작용기를 나타내고 D는 약물을 나타낸다]
Fmoc 방법에 의한 상기 단백질 또는 펩타이드를 합성하는 단계; 및
상기 합성에서 적어도 하나의 시스테인 잔기 대신에 하기 화학식으로 표시되는 화합물을 사용하는 단계를 포함하는 방법.
Figure pct00021
본 발명의 방법에 의해 얻어진 아미노산 내의 SH-SH 결합은 높은 수율로 가교 구조를 형성할 수 있다. 상기 결합은 내알칼리성이 우수하여 알칼리 조건에서 노출되어도 분해되지 않는다. 이에, 내알칼리성이 강한 단백질 및 펩타이드를 제공할 수 있으며, 이들은 알칼리 조건에서 사용 또는 세척이 가능한 단백질 및 펩타이드로 사용될 수 있다. 또한, 이러한 단백질 및 펩타이드는 가교 구조에 의해 본래 내부에 보유된 구조를 유지하고 기능에 손상을 주지 않으므로 다양한 펩타이드 및 단백질의 안정화에 사용될 수 있다.
도 1은 분자 내 SS 결합을 개략적으로 도시한 도면이고; A는 천연 단백질 또는 펩타이드의 SS 결합, B는 종래 기술에서의 가교 결합, C는 본 발명에서의 가교 결합을 도시한 도면이다;
도 2는 1,1- 디클로로아세톤 가교 펩타이드 유도체 고정화 컬럼으로 DBC를 평가한 결과를 나타낸 그래프이다. 세로축은 280 nm에서의 흡광도, 가로축은 유지 시간, 파선은 10%에서의 돌파 지점, 실선은 알칼리 세척 1~5회(어두운 선은 더 많은 세척 횟수를 나타냄), 점선은 알칼리 세척 횟수가 10~30회(어두운 선은 더 많은 세척 횟수를 나타냄)임을 나타낸다;
도 3은 알칼리세척에 의한 펩타이드 고정화 컬럼의 DBC 변화를 나타낸 그래프이며, 세로축은 변화량(%), 가로축은 세척 횟수를 나타낸다;
도 4는 본 발명의 가교 펩타이드를 개략적으로 도시하고 있다;
도 5는 실시예 11에서 옥시토신(oxytocin)의 가교 반응 전과 가교 반응 후 액체크로마토그래피-질량분석기(LC-MS)로 분석한 결과를 나타내는 도면; 및 A와 B는 각각 가교 반응 전의 옥시토신 SS 산화 형태와 가교 반응 후의 반응 생성물의 용출 크로마토그램을 나타내는 도면을 포함한다;
도 6에는 실시예 12에서 바소프레신(vasopressin)의 가교 반응 전과 가교 반응 후 LC-MS로 분석한 결과를 나타내는 도면; 및 A와 B는 각각 가교 반응 전의 바소프레신 SS 산화 형태와 가교 반응 후의 반응 생성물의 용출 크로마토그램을 나타내는 도면을 포함한다;
도 7은 실시예 13에서 α-키모트립신에 노출된 옥시토신 SS 산화 형태의 분석 결과를 역상 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)로 나타낸 도면을 포함한다;
도 8은 실시예 13에서 α-키모트립신에 노출된 옥시토신 SH 환원 형태의 분석 결과를 역상 HPLC로 나타낸 도면을 포함한다;
도 9는 실시예 13에서 α-키모트립신에 노출된 2,2-디클로로아세토페논 가교 형태의 반응 생성물을 역상 HPLC로 분석한 결과를 나타내는 도면을 포함한다; 그리고
도 10은 실시예 13에서 α-키모트립신을 첨가한 후 분자 종류별 변화량을 나타낸 도면이다;
(가교제)
일 측면에서 단백질 또는 펩타이드를 가교시키기 위한 가교제는 하기 화학식 (I)로 표시된다.
Figure pct00022
상기 화학식에서, Hal은 할로겐 원자를 나타내고, 2개의 할로겐 원자는 선택적으로 동일하거나 상이하며,　A는 수소 원자, 선택적으로 페닐기 또는 할로겐 원자로 치환된 C1 내지 6 알킬기, 또는 페닐기이다.
여기서 "알킬기"는 직쇄, 분지형 또는 고리형 포화 탄화수소기를 의미한다. 여기서, C는 탄소 원자의 수를 나타내고, "C1 내지 6 알킬기"는 탄소 원자수가 1 내지 6인 알킬기를 나타낸다. 상기 알킬기는 메틸기, 에틸기, n-프로필기, i-프로필기, n-부틸기, sec-부틸기, t-부틸기, 이소부틸기, 펜틸기, 이소펜틸기, 2, 3-디메틸프로필기, 헥실기 및 사이클로헥실기를 포함한다.
상기 A군의 C1 내지 6 알킬기의 치환기 수는 1 내지 10, 1 내지 8, 1 내지 6, 1 내지 5, 1 내지 4, 1 내지 3, 3, 2 및/또는 1일 수 있으며, 예를 들어, 트리플루오로메탄(trifluoromethane)을 들 수 있다.
상기 "할로겐 원자"는 불소 원자, 염소 원자, 브롬 원자 및 요오드 원자를 의미하며, 바람직하게는 불소 원자, 염소 원자 및 브롬 원자, 더욱 바람직하게는 불소 원자 또는 염소 원자를 의미한다.
바람직하게는 2개의 Hal은 동일한 할로겐 원자이며, 둘 다 예를 들어 불소 원자, 염소 원자 또는 브롬 원자일 수 있다.
상기 가교제의 예로는 1,1- 디클로로아세톤, 1,1- 디클로로피나콜린, 그리고 2,2- 디클로로아세토페논 등을 들 수 있다.
Figure pct00023
(가교제 합성방법)
A가 알킬 사슬인 경우, Gallucci 등의 문헌(Gallucci, R. R. and Going, R., Journal of Organic Chemistry, 1981, vol. 46, #12, p. 2532-2538)에 따라 합성에 의해 이염화(dichlorination)가 이루어질 수 있다. 반면에, A가 페닐인 경우에는, Zhang 등의 문헌(Shao-Lin Zhang, Zheng Yang, Xiaohui Hu, Kin Yip Tam, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, vol. 28, Issue 21, 15 November 2018, p. 3441-3445)에 따라 합성에 의해 이염화가 이루어질 수 있다.
(가교단백질 또는 펩타이드의 제조방법)
하나의 측면에서, 가교 단백질 또는 펩타이드의 제조 방법은 단일 또는 분리된 단백질 또는 펩타이드에서 적어도 2개의 티올기가 결합되어 있고, 가교 단백질 또는 펩타이드는 하기 화학식으로 표시되는 가교 단백질 또는 펩타이드의 제조 방법:
Figure pct00024
여기서, A는 수소 원자, 선택적으로 페닐기 또는 할로겐 원자로 치환된 C1 내지 6 알킬기, 페닐기, 또는 C1 내지 6 알킬기이고, 단백질/펩타이드는 단백질 또는 펩타이드를 나타내며, 단백질/펩타이드 A 및 단백질/펩타이드 B는 선택적으로 동일하거나 상이하다
다음을 포함하는 방법:
단백질 또는 펩타이드를 본 실시예에 따른 가교제와 반응시켜, 하기 그룹을 통해 2개의 티올기를 결합시키는 것을 특징으로 하는 가교제:
Figure pct00025
여기서, A는 수소 원자, 선택적으로 페닐기 또는 할로겐 원자로 치환된 C1 내지 6 알킬기, 페닐기 또는 C1 내지 6 알킬기이다.
가교 단백질을 제조하는 방법은, 예를 들어, 하기 반응식으로 나타낼 수 있다.
Figure pct00026
상기 가교제와 티올기의 가교반응은 필요에 따라 TCEP-HCl의 첨가로 이황화 결합의 분열에 의해 SH기가 생성되는 단백질 또는 펩타이드 용액에 아세토니트릴(acetonitrile)에 용해된 가교제를 첨가함으로써 수행될 수 있으며, 필요에 따라 PBS와 같은 완충액에 녹이고 상온에서 30분 내지 하루 동안 교반하면서 환원한 다음, 혼합물을 실온에서 30분 내지 하루 동안 교반한다. 상기 반응 용액은 필요에 따라 HPLC 등으로 정제될 수 있다. 원료가 되는 단백질 또는 펩타이드는 필요에 따라 Fmoc로 보호될 수 있으며, 이 경우, 반응 후에 단백질 또는 펩타이드 내의 Fmoc 보호기를 보호 해제하기 위해 피페리딘(piperidine)과 같은 염기가 첨가된다. 반응액은 필요에 따라 HPLC(C18 역상 컬럼)로 더 정제할 수 있다. 가교 단백질 또는 펩타이드의 생성 여부는 예를 들어 LC-MS 분석을 통해 분자량을 확인함으로써 확인할 수 있다.
본 실시예에 따른 가교제는 분리된 2개의 단백질 또는 펩타이드에 존재하는 SH기의 가교를 부여할 수 있으며, 이때 이러한 2개의 단백질 또는 펩타이드는 가교제와 반응하여 결합(A)된다. 이러한 두 분자는 선택적으로 동일하거나 다른 종류의 분자이다. 또는, 본 가교 방법은 하나의 분자 내에 존재하는 2개의 SH기를 가교시키는 것을 포함할 수 있으며, 이때 하나의 단백질 또는 펩타이드를 가교제와 반응시켜 가교(C)를 수행한다.
본 명세서에서 가교제는 2개의 티올기의 가교를 부여한다. "티올기" 또는 "SH기"는 일반적으로 단백질 또는 펩타이드를 구성하는 시스테인 잔기로부터 유래되며, 예를 들어 인공 아미노산을 사용하여 인위적으로 도입된 기일 수 있다. 자연 상태 또는 가교 전 상태인 2개의 티올기는 이황화 결합을 형성할 수도 있고 형성하지 않을 수도 있다.
자연 상태 또는 가교 전 상태인 두 티올기가 이황화 결합을 형성하는 경우, 상기 가교 방법 이전에 이황화 결합을 환원하여 티올기를 생성하는 단계를 포함할 수 있다(B 및 D). 예를 들어, 이황화 결합은, 시판되는 단백질 이황화 환원제, 예컨대 tris(2-carboethoxy)phosphine(TCEP), 그의 염산염, dithioethanol (DTT), 2- mercaptoethanol, 및 cysteine hydrochloride (Cys-HCl) 과 같은 단백질 이황화에 대한 환원제를 사용함으로써 환원될 수 있다. 2개의 티올기는 단일 단백질 또는 펩타이드에 포함된 시스테인 잔기에 존재하는 티올기일 수 있고, 분리된 단백질 또는 펩타이드(단백질, 펩타이드 및 단백질과 펩타이드의 조합을 포함)의 티올기일 수 있다. 단일 단백질 또는 펩타이드에서 이황화 결합을 형성하는 티올기가 가교된 경우, 가교 후의 구조는 이황화 결합에서와 동일한 입체 구조를 제공하는 것이 바람직하다.
가교하고자 하는 단백질 또는 펩타이드는 각각 분자 내 가교의 경우 2개 이상의 SH기를 가지며, 분자 간 가교의 경우 1개 이상의 SH기를 갖는다. 상기 단백질 또는 펩타이드는, 예를 들어, 분자 내 또는 분자 간에 하나 이상(예를 들어, 1 내지 10, 2 내지 8, 4 내지 6, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6)의 이황화 결합을 가질 수 있다. 예를 들어, 상기 단백질은 500 Da 이상, 1000 Da 이상, 2000 Da 이상 및/또는 500,000 Da 이하, 200,000 Da 이하, 또는 100,000 Da 이하의 단백질일 수 있다. 예를 들어, 상기 단백질은 효소, 당단백질(에리트로포이에틴 등), 사이토카인, 독소, 보조제, 구조단백질, 항체, Fc 융합단백질, 항체 단편(F(ab')2, Fab', Fab, Fab3, single-stranded Fv(scFv), (tandem) bispecific single-stranded Fv(sc(Fv)2), a single-stranded triplebody, a nanobody, a divalent VHH, a pentavalent VHH, a minibody, a (double-stranded) diabody, a tandem diabody, a bispecific tribody, a bispecific bibody, a dual affinity retargeting molecule (DART), a triabody (or tribody), a tetrabody (or [sc(Fv)2]2), or (scFv-SA)4) disulfide bond Fv, compact IgG, a heavy chain antibody, 또는 이들의 중합체)일 수 있다. 상기 펩타이드는 예를 들어, 아미노산 5 내지 5000개, 아미노산 5 내지 1000개, 아미노산 5 내지 500개, 아미노산 5 내지 100개, 아미노산 5 내지 50개 또는 아미노산 10 내지 40개로 이루어진 펩타이드일 수 있다. 펩타이드는 고리형 또는 선형일 수 있다. 상기 펩타이드의 예로는 백신, 마이크로 항체 및 항균 펩타이드를 들 수 있다. 여기서, 항체 Fc 영역을 포함하는 단백질 및 펩타이드는 각각 "항체 등"으로 지칭된다.
상기 가교 방법은 단일 또는 동일한 가교 구조를 형성할 수도 있고, 복수의 가교 구조를 형성할 수도 있다. 복수의 단백질 또는 펩타이드가 가교되어 동일하거나 상이한 3개 이상의 단백질 및/또는 펩타이드가 가교될 수 있다. 이러한 가교는 분자내 가교와 분자간 가교의 조합에 의해 이루어질 수 있으며, 예를 들어, 후술하는 Fc-결합 펩타이드에서의 분자내 가교와 펩타이드와 항체 Fc 영역 사이의 분자간 가교의 두 종류의 가교에 의해 이루어질 수 있다.
(펩타이드 합성에 의한 가교단백질 또는 펩타이드의 제조방법)
대안적으로, 또 다른 측면에 따른 가교 방법은 단백질 또는 펩타이드에서 적어도 2개의 티올 그룹이 결합된 가교된 단백질 또는 펩타이드를 제조하는 방법이며, 가교된 단백질 또는 펩타이드는 하기 화학식으로 표시된다:
Figure pct00027
여기서, A는 수소 원자, 선택적으로 페닐기 또는 할로겐 원자로 치환된 C1 내지 6 알킬기, 페닐기 또는 C1 내지 6 알킬기이고, 단백질/펩타이드는 단백질 또는 펩타이드를 나타낸다;
다음을 포함하는 방법:
Fmoc 방법에 의한 단백질 또는 펩타이드 합성하는 단계; 그리고
상기 합성에서 적어도 하나의 시스테인 잔기 대신 하기 화학식으로 표시되는 화합물을 사용하여 합성한다.
Figure pct00028
보다 구체적으로, 본 발명의 방법은 Fmoc 방법에 따라 펩타이드 합성 수지와 같은 담체 상에 C-말단으로부터 가교될 2개의 Cyse를 포함하는 펩타이드를 합성하는 것을 포함한다. 첫 번째 Cys는 공통 Cys(필요한 경우 SH기가 선택적으로 보호됨)를 사용하여 결합되며, 일반적인 Fmoc 방법에 따라 나머지 다른 Cys의 이전 아미노산까지 합성된다.
만약 합성되는 펩타이드에 포함된 Cys가 보호되면, 이러한 보호기를 탈보호(deprotected)한 다음 Fmoc-cysteine(예: Fmoc-chloroacetophenoyl cysteine) 여기서 1,1-디클로로아세톤 유도체(예: 1,1- 디클로로아세톤, 1, 1- 디클로로피나콜린, 또는 2,2- 디클로로아세토페논)가 SH기에 결합되어 부가되고 연결된다(반응식 B의 단계 d). Fmoc는 탈보호되고(반응식 B의 단계 e), 생성된 펩타이드의 N-말단에 있는 α-아미노기와 acetophenoyl cysteine side의 α-카르복실기가 결합되고(반응식 B의 단계 f), 따라서 1,1- 디클로로아세톤 유도체가 SH기에 결합된 시스테인은 펩타이드 사슬에 결합된다. 나머지 아미노산은 Fmoc 방법에 따라 연결하여 합성함으로써(반응식 B의 g 단계) 펩타이드 사슬 가교가 완성된다.
Figure pct00029
(반응성 작용기 도입 방법)
상기 방법에 의해 얻어진 가교제에는 반응성 작용기가 더 도입될 수 있다. 따라서, 일 측면에서 단백질 또는 펩타이드를 제조하는 방법은 반응성 작용기가 결합된 단백질 또는 펩타이드를 제조하는 방법이며, 상기 단백질 또는 펩타이드는 하기 화학식으로 표시된다:
Figure pct00030
여기서, A는 수소 원자, 선택적으로 페닐기 또는 할로겐 원자로 치환된 C1 내지 6 알킬기 페닐기, 또는 C1 내지 6 알킬기이고, 단백질/펩타이드는 단백질 또는 펩타이드를 나타내며, 단백질/펩타이드 A 및 단백질/펩타이드 B는 선택적으로 동일하거나 상이하다, L은 링커를 나타내고 Z는 반응성 작용기를 나타낸다;
다음을 포함하는 방법:
상기 방법에 의해 가교 단백질 또는 펩타이드 얻는 단계; 그리고
얻어진 가교 단백질 또는 펩타이드를 NH2-L-Z(L은 링커를 나타내고 Z는 반응성 작용기를 나타낸다)와 반응시켜 가교 단백질 또는 펩타이드의 가교 부분에 반응성 작용기를 도입한다.
Figure pct00031
대안적으로, 다른 측면에서, 반응성 작용기가 결합된 단백질 또는 펩타이드의 제조 방법은 가교 물질을 사용하여 수행될 수 있다. 따라서, 다른 측면에서, 상기 방법은 반응성 작용기가 결합된 단백질 또는 펩타이드를 제조하는 방법일 수 있다:
Figure pct00032
여기서, A는 수소 원자, 선택적으로 페닐기 또는 할로겐 원자로 치환된 C1 내지 6 알킬기, 페닐기, 또는 C1 내지 6 알킬기이고, 단백질/펩타이드는 단백질 또는 펩타이드를 나타내며, 단백질/펩타이드 A 및 단백질/펩타이드 B는 선택적으로 동일하거나 상이하며, L은 링커를 나타내고 Z는 반응성 작용기를 나타낸다;
다음을 포함하는 방법:
하기 화학식으로 표시되는 가교 단백질 또는 펩타이드를 반응시키는 단계:
Figure pct00033
여기서, A는 수소 원자, 선택적으로 페닐기 또는 할로겐 원자로 치환된 C1 내지 6 알킬기, 페닐기, 또는 C1 내지 6 알킬기이고, 단백질/펩타이드는 단백질 또는 펩타이드를 나타내며, 단백질/펩타이드 A 및 단백질/펩타이드 B는 선택적으로 동일하거나 상이하다;
그리고 NH2-L-Z(L은 링커를 나타내고 Z는 반응성 작용기 나타냄), 이에 따라 가교 단백질 또는 펩타이드의 가교된 부분에 반응성 작용기를 도입한다.
Figure pct00034
다른 측면의 단백질 또는 펩타이드를 제조하는 방법은 반응성 작용기가 결합된 단백질 또는 펩타이드를 제조하는 방법이며, 상기 단백질 또는 펩타이드는 하기 화학식으로 표시되는 것인, 단백질 또는 펩타이드의 제조 방법:
Figure pct00035
여기서, A는 수소 원자, 선택적으로 페닐기 또는 할로겐 원자로 치환된 C1 내지 6 알킬기, 페닐기, 또는 C1 내지 6 알킬기이고, 단백질/펩타이드는 단백질 또는 펩타이드를 나타내며, L은 링커를, Z는 반응성 작용기를, D는 약물을 나타낸다;
다음을 포함하는 방법:
Fmoc 방법에 의해 단백질 또는 펩타이드를 합성하는 단계; 및
상기 합성에서 적어도 하나의 시스테인 잔기 대신 하기 화학식으로 표시되는 화합물을 사용한다.
Figure pct00036
본 방법은 사용된 시스테인 잔기가 상기 화합물인 것을 제외하고는 상기와 동일한 방법(펩타이드 합성에 의한 가교 단백질 또는 펩타이드의 제조 방법)으로 수행될 수 있다.
(반응성 작용기)
구체적으로, 반응성 작용기는 본 실시예에 따른 가교제에 의해 가교된 단백질 또는 펩타이드와 반응성 작용기를 갖는 아미노 화합물(NH2-L-Z)을 반응시켜 옥심(oxime)을 형성함으로써 도입될 수 있다(옥심 방법). 여기서 사용되는 반응성 작용기를 갖는 아미노 화합물은 NH2-X-L'-Z(여기서 X는 O, NH 또는 N(C1 내지 4 알킬))일 수 있다.
(링커)
여기서, L 및 L'은 각각 링커를 나타낸다. 여기서, "링커"는 반응성 작용기 또는 약물이 링커 및 가교 단백질 또는 펩타이드에 결합할 수 있는 길이를 가지며, 가교 반응에 영향을 미치지 않는 구조를 갖는 한 특별히 제한되지 않으며, 부재 할 수 있다(결합을 나타낼 수 있음). 하나의 예에서, 상기 링커는 알킬렌(alkylenes), 알케닐렌(alkenylenes) 및 알키닐렌(alkynylenes)을 하나 이상 포함할 수 있다. 이러한 알킬렌, 알케닐렌 및 알키닐렌은 각각 직쇄, 분지형 또는 고리형일 수 있다. 상기 알킬렌 내 탄소 원자수는 1 내지 20, 1 내지 10, 1 내지 6, 1 내지 4, 1 내지 3, 1 내지 2, 2, 또는 1일 수 있고, 상기 알케닐렌 및 알킬렌 내 탄소수는 각각 2 내지 20, 2 내지 10, 2 내지 6, 2 내지 4, 2 내지 3, 또는 2일 수 있다. 상기 링커는 -O-, -S-, -S-S-, -NH-, -N((C1 내지 C6)알킬), -NH-C(O)-NH-, -C(O)-NH-, -NH-C(O), 페닐렌(phenylenes), 헤테로아릴렌(heteroarylenes) 및/또는 헤테로시클렌 (heterocyclenes)을 하나 이상 포함할 수 있다. 또, 상기 링커는 하나 이상의 아미노산 부분을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 1 내지 100, 1 내지 50, 1 내지 25, 1 내지 20, 1 내지 15, 1 내지 10, 1 내지 5, 1 내지 4, 1 내지 3, 1 내지 2, 2, 또는 1개의 아미노산 모이어티를 포함할 수 있다. 상기 링커를 구성하는 그룹에서 탄소 원자에 결합된 수소 원자는 할로겐 원자로 대체될 수 있다. 목적이 최종적으로 현재의 가교제를 약물에 결합시킨 후 특정 조건에서 약물을 방출하는 것인 경우 (예를 들어, 현재의 가교제는 표적이 풍부한 지역에서 약물을 방출하기 위해 특정 표적으로 향하는 펩타이드 또는 단백질(예를 들어, Fc영역 함유 분자)에 결합(예를 들어, 항체-약물 복합체(ADC))되도록 의도된다), 링커는 바람직하게는 생체 내에서 특정 조건, 바람직하게는 국소의 특성을 갖는 조건에서 분해 가능한 모이어티를 포함한다. 이러한 조건의 예로는 효소의 존재, pH 등이 있다. 예를 들어, 링커는 프로테아제(protease) 또는 에스터레이즈(esterase)에 의해 분해될 펩타이드 결합(예를 들어, 리소좀 효소에 의해 분해될 GGFG, Marcin Poreba, The FEBS Journal (2020) 287: 1936-1969 참조) 또는 에스테르(ester)를 포함할 수 있다. 이 경우, 링커는 프로테아제에 의해 절단되는 펩타이드 결합 이외의 아미노산 모이어티를 포함할 수 있다.
여기서, "알킬렌(alkylene)"은 알킬기에서 수소 원자 하나를 제거한 2가기를 나타낸다. 상기 알킬렌기로는 C1 내지 20 직쇄 또는 분지형 알킬렌 및 C3 내지 7 사이클로알킬렌을 들 수 있으며, 메틸렌기, 에틸렌기, 프로필렌기, 부틸렌기, 펜틸렌기, 헥실렌기, 사이클로헥실렌기 등을 들 수 있다. 상기 알킬렌은 필요에 따라 선택적으로 하이드록시기, 할로겐 원자 및 아미노기로 치환되며, 이때, 상기 알킬렌 내 치환기의 수는 1 내지 10, 1 내지 8, 1 내지 6, 1 내지 5, 1 내지 4, 1 내지 3, 3, 2 및/또는 1일 수 있다.
상기 "알케닐렌(alkenylene)"은 하나 이상의 탄소-탄소 이중결합을 갖는 직쇄, 분지형 또는 고리형 불포화 탄화수소의 어느 하나의 탄소 원자로부터 2개의 수소 원자를 제거한 2가 기(divalent group)를 의미한다. 상기 알케닐렌의 예로는 C2 내지 20 알케닐렌을 들 수 있으며, 비닐렌(vinylene), 프로페닐렌(propenylene), 이소프로페닐렌(isopropenylene), 부틸렌(butenylene), 펜테닐렌(pentenylene), 헥세닐렌(hexenylene), 헵테닐렌(heptenylene), 옥테닐렌(octenylene), 노네닐렌(nonenylene), 데케닐렌(decenylene) 등이 있다.
상기 "알키닐렌(alkynylene)"은 하나 이상의 탄소-탄소 삼중결합을 갖는 직쇄 또는 분지형 불포화 탄화수소의 탄소 원자 중 어느 하나에서 2개의 수소 원자를 제거한 2가 기를 의미한다. 상기 알키닐렌의 예로는 C2 내지 20알키닐렌을 들 수 있으며, 예를 들면 에티닐렌(ethynylene), 프로피닐렌(propynylene), 부티닐렌(butynylene), 펜티닐렌(pentynylene), 헥시닐렌(hexynylene), 페닐에티닐렌(phenyl ethynylene) 등이 있다.
상기 "헤테로아릴렌(heteroarylene)" 및 "헤테로시클렌(heterocyclene)"은 각각 질소 원자, 산소 원자 및 황 원자 중에서 선택된 적어도 하나 이상의 헤테로 원자를 각각 포함하는 방향족 및 비방향족 5- 내지 14-원자 2가 단고리 또는 융합된 헤테로고리기를 의미한다. 상기 5 내지 14원자 헤테로고리기에 포함되는 헤테로원자의 수는, 예를 들어, 1 내지 5, 1 내지 4, 1 내지 3, 1 내지 2, 2, 또는 1일 수 있다. 단고리 헤테로고리기는 5 내지 6원자 고리인 것이 바람직하다. 융합된 헤테로고리기는 8- 내지 10-원자 고리인 것이 바람직하다. 상기 헤테로아릴렌 및 헤테로시클렌의 예로는 피페리딜렌(piperidylene), 피페라질렌(piperazylene), 모르폴리렌(morpholylene), 퀴누클릴렌(quinuclidylene), 피롤리딘(pyrrolidylene), 아제티딜렌(azetidylene), 옥세틸렌(oxetylene), 아지리디닐렌(aziridinylene), 트로파닐렌(tropanylene), 퓨릴렌(furylene), 테트라하이드로퓨릴렌(tetrahydrofurylene), 티에닐렌(thienylene), 피롤릴렌(pyrrolylene), 피롤리닐렌(pyrrolynylene), 피롤리디닐렌(pyrrolidinylene), 디옥솔라닐렌(dioxolanylene), 옥사졸릴렌(oxazolylene), 옥사졸리닐렌(oxazolinylene), 이소옥사졸릴렌(isoxazolylene), 티아졸릴렌(thiazolylene), 티아졸리닐렌(thiazolinylene) 이소티아졸릴렌(isothiazolylene), 이미다졸릴렌(imidazolylene), 이미다졸리디닐렌(imidazolinylene), 이미다졸리디닐렌(imidazolidinylene), 옥사졸리디닐렌(oxazolidinylene), 티아졸리디닐렌(thiazolidinylene) 피라졸리렌(pyrazolylene), 피라졸리닐렌(pyrazolinylene), 피라졸리디닐렌(pyrazolidinylene), 옥사디아졸릴렌 (oxadiazolylene), 푸라자닐렌 (furazanylene), 티아디아졸릴렌 (thiadiazolylene), 트리아졸릴렌 (triazolylene), 테트라졸릴렌 (tetrazolylene), 피라닐렌 (pyranylene), 피리딜렌 (pyridylene), 피페리디닐렌 (piperidinylene), 피리다지닐렌 (pyridazinylene), 피리미디닐렌 (pyrimidinylene), 피라지닐렌 (pyrazinylene), 피페라지닐렌 (piperazinylene), 디옥사닐렌 (dioxanylene), 옥사지닐렌 (oxazinylene), 모르폴리닐렌 (morpholinylene), 티아디닐렌 (thiadinylene), 트리아지닐렌 (triazinylene), 벤조푸라닐렌 (benzofuranylene), 이소벤조푸라닐렌 (isobenzofuranylene), 디하이드로벤조푸라닐렌 (dihydrobenzofuranylene), 디하이드로이소벤조푸라닐렌 (dihydroisobenzofuranylene), 벤조티에닐렌 (benzothienylene), 이소벤조티에닐렌 (isobenzothienylene), 디하이드로벤조티에닐렌 (dihydrobenzothienylene), 디하이드로이소벤조티에닐렌 (dihydroisobenzothienylene), 테트라하이드로벤조티에닐렌 (tetrahydrobenzothienylene), 퀴놀릴렌 (quinolylene), 이소퀴놀릴렌 (isoquinolylene), 퀴나졸리닐렌 (quinazolinylene), 프탈라지닐렌 (phthalazinylene), 프테리디닐렌 (pteridinylene), 쿠마릴렌 (cumarylene), 크로모닐렌 (chromonylene), 인돌릴렌 (indolylene), 이소인돌릴렌 (isoindolylene), 벤지미다조일렌 (benzimidazoylene), 벤조푸릴렌 (benzofurylene), 푸리닐렌 (purinylene), 아크리디닐렌 (acridinylene), 페녹사지닐렌 (phenoxazinylene), 페노티아지닐렌 (phenothiazinylene), 벤조옥사졸릴렌 (benzoxazolylene), 벤조티아졸릴렌 (benzothiazolylene), 인다졸릴렌 (indazolylene), 벤지미다졸릴렌 (benzimidazolylene), 벤조다이옥졸라닐렌 (benzodioxolanylene), 벤조다이옥사닐 (benzodioxanyl) 크로메닐렌 (chromenylene), 크로마닐렌 (chromanylene), 이소크로마닐렌 (isochromanylene), 크로마노닐렌 (chromanonylene), 신놀리닐렌 (cinnolinylene), 퀴녹살리닐렌 (quinoxalinylene), 인돌리지닐렌 (indolizinylene), 퀴놀디닐렌 (quinolidinylene), 이미다조피리딜렌 (imidazopyridylene), 나프틸리디닐렌 (naphthylidinylene), 디하이드로벤족사지닐렌 (dihydrobenzoxazinylene), 디하이드로벤족사졸리노닐렌 (dihydrobenzoxazolinonylene), 디하이드로벤족사지노닐렌 (dihydrobenzoxazinonylene) 및 벤조티옥사닐렌 (benzothioxanylene).
본 명세서에서 "포함(including)"이라는 용어는 "구성된/구성된(composed of/consisting of)"의 경우를 포함하는 것을 의미하며, "구성된/구성된(composed of/consisting of)"으로 읽을 수 있다.
여기서, "반응성 작용기(reactive functional group)" 또는 "Z"로 표시되는 기는 비교적 온화한 조건에서 펩타이드, 단백질, 핵산 또는 저분자 의약품 등과 반응 및 결합이 가능한 기를 의미한다. 반응성 작용기의 예로는 말레이미드(maleimide), 티올(thiol) 또는 프로텍티드 티올(protected thiol), 알코올(alcohol), 아크릴레이트(acrylate), 아크릴아마이드(acrylamide) 아민(amine) 또는 프로텍티드 아민(protected amine), 카르복실산(carboxylic acid) 또는 프로텍티드 카르복실산(protected carboxylic acid), 아지드(azide), 시클로알킨(cycloalkyne)을 포함하는 알킨(alkyne), 시클로펜타디엔(cyclopentadiene) 및 퓨란(furan)을 포함하는 1,3-디엔(1,3-diene), 알파-할로카르보닐(alpha-halocarbonyl), N-히드록시숙신이미딜(N-hydroxysuccinimidyl), N-하이드록시술포숙신이미딜(N-hydroxysulfosuccinimidyl), 니트로페닐에스테르(nitrophenyl ester), 카보네이트(carbonate), 디벤조사이클로이틴(dibenzocyclooctyne (DBCO)), 테트라진(tetrazine), 메틸테트라진(methyltetrazine (MTZ)), 트랜스사이클로옥텐(trans-cyclooctene (TCO)), 아지드(azide), 카르복시(carboxy), 토실(tosyl), 아미노(amino), 에폭시(epoxy), 아실(acyl), 이소티오시아네이트(isothiocyanate), 이소시아네이트(isocyanate), 아실 아지드(acyl azide), NHS에스테르산(NHS ester), 산 염화물(acid chloride), 알데히드(aldehyde), 글리옥살(glyoxal), 에폭시(epoxide), 옥시란(oxirane), 탄산염(carbonate), 아릴화제(arylating agent), 이미드 에스테르(imide ester), 카르보디이미드(carbodiimide), 산 무수물(acid anhydride), 할로아세틸(haloacetyl), 알킬 할라이드(alkyl halide), 말레미드(maleimide), 아지리딘(aziridine), 아크릴로일 유도체(acryloyl derivative), 디아조알칸(diazoalkane) 디아조아세틸 화합물(diazoacetyl compound), 카르보닐(carbonyl), 케톤(ketone), 카르보디이미드(carbodiimide), 에폭사이드(epoxide), 옥시란(oxirane), 카르보닐디이미다졸(carbonyldiimidazole), N,N'-디수시니미딜 카보네이트(N,N'-disuccinimidyl carbonate), N-하이드록시숙신이미딜 클로로포메이트(N-hydroxysuccinimidyl chloroformate), 이소시아네이트(isocyanate), 히드라진(hydrazine), 쉬프 염기(Schiff base), 환원성 아미노화 생성물(reductive amination product), 만니히 축합 생성물(Mannich condensation product), 디아조늄 유도체(diazonium derivative), 오드화 반응 생성물(iodination reaction product), 아릴라자이드(arylazide), 아릴라자이드 할라이드(arylazide halide), 벤조페논(benzophenone), 디아조 화합물(diazo compound) 및 디아지리딘 유도체(diaziridine derivative)를 포함할 수 있다.
상기 반응성 작용기는 약물과 결합된 형태로 아미드 결합(amide bond), 이황화 결합(disulfide bond), 티오에테르 결합(thioether bond), 티오에스테르 결합(thioester bond), 히드라존 결합(hydrazone bond), 에스테르 결합(ester bond), 에테르 결합(ether bond) 또는 우레탄 결합(urethane bond)에 의해 공유 결합을 부여하는 그룹일 수 있다. 예를 들어, 1차 아민(amine)과의 반응에 적합한 반응성 작용기는 N-숙신이미딜 에스테르(N-succinimidyl ester) 또는 N-술포석신이미딜 에스테르(N-sulfosuccinimidyl ester)이고, 아미노기(amino group)와의 반응에 적합한 반응성 작용기는 p-니트로페닐 에스테르(p-nitrophenyl ester), 디니트로페닐 에스테르(dinitrophenyl ester) 또는 펜타플루오로페닐 에스테르(pentafluorophenyl ester)이고, 메르캅토기(mercapto group)와의 반응에 적합한 반응성 작용기는 말레이미드기(maleimide group), 카르복실산 클로라이드(carboxylic acid chloride), 피리딜디티오기(pyridyldithio group), 니트로피리딜디티오기(nitropyridyldithio group), 할로알킬기(haloalkyl group) 및 할로아세틸기(haloacetyl group)이고, 히드록시기(hydroxy group)와의 반응에 적합한 반응성 작용기는 이소시아네이트기(isocyanate group) (이소시아네이트(isocyanate))이다 (Greg t. Hermanson, Bioconjugate Techiniques Second Edition, p 234-345).
반응성 작용기는 또한 알콕시아민(alkoxyamine)과의 반응에 의해 옥심 결합을 형성하는 반응, Cu(I) 촉매에 의한 알킨 또는 아지드와의 반응인 하우젠의 1,3-이극성 고리화 첨가 반응(Huisgen's 1,3- dipolar cyclization addition reaction)("클릭" 반응), 역전자 수요 디엘스-알더 반응(inverse-electron-demand Diels-Alder reaction), 마이클 반응(Michael reaction), 메타테시스 반응(metathesis reaction), 전이 금속 촉매에 의한 교차 결합 반응, 라디칼 중합 반응, 산화 결합 반응, 트랜스아실화 반응 또는 광클릭 반응에 관여(할 수 있는) 반응성 작용기를 더 포함한다(Kim CH et al, Curr Opin Chem Biol. 2013 Jun; 17(3):412-9).
하나의 예로, 반응성 작용기 도입은 가교제를 통해 결합된 단백질 또는 펩타이드 또는 이의 융합물, 및 하이드록시아민 유도체의 반응으로 인한 알킨기와 같은 반응성 작용기를 4°C에서 상온까지 30분에서 하룻밤 사이의 환경에서 PBS(pH7.4)와 같은 완충제에 도입함으로써 수행될 수 있다.
Figure pct00037
(약물 결합 방법)
본 실시예에 따른 가교제는 단백질 또는 펩타이드 또는 이의 융합 생성물에 약물(페이로드)을 도입하는 데 활용될 수 있다. 구체적으로, 상기 반응성 작용기가 도입된 단백질 또는 펩타이드 또는 이의 융합 생성물의 반응성 작용기 및 약물(payload)이 반응하여 상기 단백질 또는 펩타이드 또는 이의 융합 생성물에 상기 약물(payload)을 도입하도록 결합될 수 있다.
따라서, 일 측면에서, 단백질 또는 펩타이드와 약물의 복합체를 제조하는 방법은 단백질 또는 펩타이드와 약물의 복합체를 제조하는 방법이며, 상기 복합체는 하기 화학식으로 표시된다:
Figure pct00038
여기서, A는 수소원자, 선택적으로 페닐기 또는 할로겐 원자로 치환된 C1 내지 6 알킬기, 페닐기, 또는 C1 내지 6 알킬기, 단백질/펩타이드는 단백질 또는 펩타이드를 나타내고, 단백질/펩타이드 A 및 단백질/펩타이드 B는 선택적으로 동일하거나 상이하며, L은 링커를 나타내고 D는 약물을 나타낸다;
다음을 포함하는 방법:
상기 방법에 의해 반응성 작용기가 결합된 단백질 또는 펩타이드를 얻는 단계; 및
얻은 단백질 또는 펩타이드와 반응성 작용기가 결합된 반응성 작용기를 갖는 약물을 반응시켜, 상기 약물을 상기 가교된 단백질 또는 펩타이드의 가교된 부분에 결합시킨다.
또는, 단백질 또는 펩타이드 및 약물의 복합체를 제조하는 방법은 반응성 작용기가 도입된 단백질 및/또는 펩타이드를 사용하여 실시될 수 있다. 따라서, 단백질 또는 펩타이드와 약물의 복합체를 다른 측면에서 제조하는 방법은 단백질 또는 펩타이드와 약물의 복합체를 제조하는 방법이며, 복합체는 하기 화학식으로 표시된다:
Figure pct00039
여기서, A는 수소원자, 선택적으로 페닐기 또는 할로겐 원자로 치환된 C1 내지 6 알킬기, 페닐기, 또는 C1 내지 6 알킬기, 단백질/펩타이드는 단백질 또는 펩타이드를 나타내고, 단백질/펩타이드 A 및 단백질/펩타이드 B는 선택적으로 동일하거나 상이하며, L은 링커를 나타내고 D는 약물을 나타낸다;
다음을 포함하는 방법:
반응성 작용기가 결합된 단백질 또는 펩타이드를 반응시키는 단계, 상기 단백질 또는 펩타이드는 하기 화학식으로 표시된다:
Figure pct00040
여기서, A는 수소원자, 선택적으로 페닐기 또는 할로겐 원자로 치환된 C1 내지 6 알킬기, 페닐기, 또는 C1 내지 6 알킬기, 단백질/펩타이드는 단백질 또는 펩타이드를 나타내고, 단백질/펩타이드 A 및 단백질/펩타이드 B는 선택적으로 동일하거나 상이하며, L은 링커를 나타내고 Z는 반응성 작용기를 나타낸다 및 상기 가교된 단백질 또는 펩타이드의 가교된 부분에 상기 약물을 결합시키기 위해 상기 반응성 작용기와 반응성 작용기를 갖는 약물.
Figure pct00041
여기서 "약물"은 단백질 또는 펩타이드에 투입하여 사용하는 약이면 특별히 제한되지 않으며, 그 예로는 치료제(therapeutic agent), 예방제(prophylactic agent), 표적화제(targeting agent), 표지제(labeling agent) 또는 진단제(diagnostic agent)를 들 수 있다. 상기 치료제 또는 예방제의 예로는 모노메틸아우리스타틴(monomethyl auristatin), 오리스타틴(auristatin), 마이탄신(maytansine), 엠탄신(emtansine), 독소루비신(doxorubicin), 블레오마이신(bleomycin), 오조가마이신(ozogamicin), 베도틴(vedotin), 파수도톡신(pasudotox), 데룩스테칸(deruxtecan), 메이탄시놀 (maytansinol), 칼리케아미신(calicheamicin), 엑사테칸(exatecan), 피롤로벤조디아제핀 이량체(pyrrolobenzodiazepine dimer), 듀오카르마이신(duocarmycin), 에리불린(eribulin), SN-38, PN-682, PNU-159682, 엠탄신(emtansine (DM1)), 메르탄신(mertansine) 또는 그 유도체; 90Y와 같은 방사성 동위원소; 혈액-뇌 장벽의 수용체에 결합할 수 있는 약물 및 암세포에 결합한 후 항체를 세포로 전달할 수 있는 약물과 같은 표적 약물; 그리고 방사성 라벨, 효소, 형광 라벨, 생물 발광 라벨, 화학 발광 라벨 금속이 있다.
하나의 예로서, 단백질 또는 펩타이드 또는 이들의 융합 생성물에 반응성 작용기인 말레미드기(maleimide group)를 미리 옥심 반응(oxime reaction)에 의해 도입한 후, 항암제인 메르탄신(mertansine)의 SH기에 아지드기(azide group)를 도입하여 얻은 것을 약물로서 4°C에서 상온의 환경에서 30분 내지 하룻밤 동안 PBS(pH 7.4)와 같은 완충액에서 반응시켜 얻을 수 있다.
Figure pct00042
(가교단백질 또는 펩타이드)
하나의 측면은 가교제에 의해 가교된 단백질 및/또는 펩타이드를 제공한다. 또 다른 측면은 분리된 단백질 및/또는 펩타이드에 존재하는 2개의 티올기가 가교제를 통해 서로 결합하는, 하기와 같은 구조를 갖는 융합 단백질 또는 융합 펩타이드를 제공한다. 이하, 단백질/펩타이드 A와 단백질/펩타이드 B는 선택적으로 동일한 물질이거나 서로 다른 물질이다.
Figure pct00043
화학식에서, A는 화학식(I)로 정의된다.
또 다른 측면은 본 발명의 가교제를 통해 단일 단백질 또는 펩타이드에 존재하는 2개의 티올기가 서로 결합하는 구조를 갖는 단백질 또는 펩타이드를 제공한다.
Figure pct00044
화학식에서, A는 화학식(I)로 정의된다.
본 실시예에 따른 가교제는 반응성 작용기 또는 약물과 결합하여 원하는 단백질, 펩타이드 또는 이들의 복합체에 작용기 또는 약물을 도입할 수 있다. 따라서, 상기 가교 단백질 및 펩타이드는 상기 가교제를 통해 반응성 작용기가 결합되어 있는 단백질 또는 펩타이드일 수 있고, 상기 가교제를 통해 약물이 결합되어 있는 단백질 또는 펩타이드일 수 있으며, 하기의 분자를 나타낸다.
Figure pct00045
화학식에서, L은 링커를 나타내고, Z는 반응성 작용기를 나타내고, D는 약물을 나타낸다.
여기서, 상기 링커는 복수의 작용기(Z) 또는 약물(D)과 결합하도록 분지형 구조를 가질 수 있다. 본 실시예에 따른 가교제에 결합하는 작용기(Z) 또는 약물(D)의 수는 1 내지 20, 1 내지 10, 1 내지 8, 1 내지 7, 1 내지 6, 1 내지 5, 1 내지 4, 1 내지 3, 1 내지 2, 또는 1일 수 있다. 예를 들어, 작용기 Z 또는 약물 D의 수가 2일 때, 다음과 같은 구조를 채택할 수 있다(L1과 L2는 각각 링커를 나타낸다; 링커는 위에서 설명한 바와 같이 정의된다).
Figure pct00046
본 실시예에 따른 가교제는 원하는 단백질, 펩타이드 또는 이들의 복합체의 결합 안정성을 높이기 위한 목적으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 가교된 단백질 또는 펩타이드에서, 그룹 A는 수소 원자일 수 있고, 하기에 표시된 분자가 포함되어 있다.
Figure pct00047
상기 링커 L, 반응성 작용기 Z 및 약물 D는 전술한 바와 같다. 가교된 분자는 이황화 결합에 비해 내알칼리성이 향상되고 안정화된 분자이다. 가교제를 통한 이러한 결합 부위의 수는 하나 또는 둘 이상일 수 있다. 이러한 가교 부위가 둘 이상 존재하는 경우, 단일 단백질 또는 펩타이드에 가교가 이루어질 수 있고, 분리된 단백질 및/또는 펩타이드에 가교가 이루어질 수 있으며, 단일 단백질 또는 펩타이드에 가교 및 분리된 단백질 및/또는 펩타이드에 가교가 결합될 수 있다. 분리된 단백질 또는 펩타이드 내에 이러한 가교 부위가 2개 이상 존재하는 경우, 동일한 2개의 단백질 및/또는 펩타이드 간의 가교가 이루어질 수도 있고, 복수의 단백질 및/또는 펩타이드 간의 가교에 의해 3개 이상의 단백질 및/또는 펩타이드 간의 가교에 의해 결합될 수도 있다.
(가교된 Fc-결합 펩타이드)
여기서 가교되는 펩타이드는 Fc-결합 펩타이드일 수 있다. 이에, 또 다른 측면은 하기 화학식(여기서, A, L, Z 및 D는 전술한 바와 같이 정의됨)으로 표시되고 상기 가교제를 통해 가교된 Fc-결합 펩타이드 또는 이의 제조방법을 제공한다.
Figure pct00048
Figure pct00049
Figure pct00050
여기서 "Fc-결합 펩타이드"는 IgG의 Fc 영역에 특이적으로 결합되는 펩타이드를 의미한다. 여기서 "IgG의 Fc 영역"은 전형적으로 단백질 분해 효소인 파파인(papain)으로 IgG를 처리하여 형성된 생성물로 얻은 C-말단의 단편을 의미한다. 상기 Fc-결합 펩타이드는 바람직하게는 Eu 번호에 따라 Fc의 Lys248, Lys246, Lys338, Lys288, Lys290, Lys360, Lys414 및/또는 이들의 인접 영역, 및/또는 이들의 인접 영역 중에서 선택되는 부위에 결합하거나, 또는 단백질 A의 결합 영역에 결합하는 펩타이드이다. 상기 Fc-결합 펩타이드는 예를 들어 Fc-결합 능력을 갖는 단백질 A의 부분 펩타이드 또는 이의 돌연변이일 수 있다. 이러한 펩타이드의 구체적인 예는 국제 공개 번호WO 2008/054030, 국제 공개 번호WO 2013/027796, 국제 공개 번호 WO 2016/186206, 국제 공개 번호WO 2018/230257 및 Kyohei Muguruma et al., ACS Omega (2019); 4(11): 14390-14397에 기재되어 있으며, 이러한 펩타이드는 본 명세서에 기재된 방법에 따라 적절하게 준비될 수 있다. Fc-결합 펩타이드에서, 바람직하게는, 두 개의 시스테인 잔기, 즉 C-말단에 가장 가까운 시스테인 및 N-말단에 가장 가까운 시스테인이 본 발명의 가교제를 통해 가교되는 것이 바람직하다.
본 명세서에서, "IgG"는 포유류, 예를 들어 인간, 침팬지 등의 영장류, 쥐, 생쥐, 토끼 등의 실험동물, 돼지, 소, 말, 양, 염소 등의 가축동물, 개, 고양이 등의 반려동물로부터 유래한 IgG일 수 있으며, 인간 IgG(IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4)인 것이 바람직하다. 여기서, 상기 IgG는 바람직하게는 인간 IgG1, IgG2, 또는 IgG4, 또는 토끼 IgG이며, 특히 바람직하게는 인간 IgG1, IgG2, 또는 IgG4인 것이 바람직하다.
구체적으로, 상기 Fc-결합 펩타이드는 하기 (i) 내지 (iv) 중에서 선택되는 펩타이드일 수 있다:
(i) 하기 화학식 (I)로 표시되는 펩타이드:
NH2-(링커)-(X1 1-3)-C-(X2)-(X3)-(X4)-(X5)-G-(X6)-L-(X7)-W-C-(X8 1-3))...(I)
여기서, (링커)는 링커를 나타내고, 1 내지 3개의 X1s, X2s, X3s, X4s, X5s, X6s, and X7s, 그리고 1 내지 3개의 X8s는 각각 독립적으로 동일하거나 다른 아미노산 잔기를 나타내며,
각각의 X1, X2 및 X3 및 각 X8은 독립적으로 동일하거나 상이한 C 이외의 아미노산 잔기를 나타내며,
X4는 H, R, S 또는 D,
X5는 K, C, D, E, R, V, F, L, 2- 아미노수베릭산, Dpr, Orn, AcOrn, AcDab, Dab, Nle, Nva, Tle, Ala(t-Bu) 및 Cha 중에서 선택된 하나의 아미노산 잔기,
X6는 E, N, R 또는 D, 및
X7은 I 또는 V;
(ii) 하기 화학식 (II)로 표시되는 펩타이드 또는 (II)의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드, 여기서 하나 이상의 아미노산이 X9 내지 X13이 아닌 위치에서 첨가, 삭제 및/또는 치환된 펩타이드:
X9 1-2 NMQCQRRFYEALHDPNLNEQRNAX11IX12SIRDDC-(링커2)-CONH2(SEQ ID NO:2)...(II)
여기서, (링커 2)는 링커를 나타내며, X9 1-2는 GF, AF, VF, LF, IF, MF, PF, FF, WF, KF, Orn-F, CF, DF, EF, βAla-F, 2-아미노수베릭산-F, Dpr-F, 및 NH2-(PEG)n-CO(n=1 내지 50)-F, F, K, Orn, C, D, E, 2-아미노수베릭산 잔기, 및 Dpr로 이루어진 군에서 선택되고, 그리고
X11 및 X12는 각각 독립적으로 R, H, D, E, S, T, N, Q, Y 및 C;로 이루어진 군에서 선택된다;
(iii) 하기 화학식 (I') 또는 (I'')로 표시되는 펩타이드:
Z-[(링커3)-(X1 1-3)-C-(X2)-(X3)-(X4)-(X5)-G-(X6)-L-(X7)-W-C-(X8 1-3)] ... (I')
[(X1 1-3)-C-(X2)-(X3)-(X4)-(X5)-G-(X6)-L-(X7)-W-C-(X8 1-3)-(링커3)]-Z ... (I'')
여기서Z는 반응성 작용기를 나타내고,
(링커3)는 링커를 나타내고,
1 내지 3개의 X1s, X2s, X3s, X4s, X5s, X6s, 및 X7s, 그리고 1 내지 3개의 X8s는 각각 독립적으로 동일하거나 상이한 아미노산 잔기를 나타내고,
각각의 X1, X2 및 X3 및 각 X8은 독립적으로 동일하거나 상이한 C 이외의 아미노산 잔기를 나타내고,
X4는 H, R, S 또는 D,
X5는 K, C, D, E, R, V, F, L, 2-아미노수베릭산, Dpr, Orn, AcOrn, AcDab, Dab, Nle, Nva, Tle, Ala(t-Bu) 및 Cha 중에서 선택된 하나의 아미노산 잔기,
X6은 E, N, R 또는 D, 그리고
X7은 I 또는 V;
(iv) 하기 화학식 (II')로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 또는 (II')의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드, 여기서 하나 이상의 아미노산이 X9 내지 X14 이외의 위치에 추가, 삭제 및/또는 치환된 펩타이드:
X9 1-2 NMQCQX14RFYEALHDPNLNEQRNAX11IX12SIRDDC-(링커2)-NH2(SEQ ID NO: 3)...(II')
여기서, (링커 2)는 링커를 나타내며, X9 1-2는 GF, AF, VF, LF, IF, MF, PF, FF, WF, KF, Orn-F, CF, DF, EF, βAla-F, 2-아미노수베릭산-F, Dpr-F, 및 NH2-(PEG)n-CO(n=1 내지 50)-F, F, K, Orn, C, D, E, 2- 아미노수베릭산 잔기, Dpr, 및 Acetyl-K로 이루어진 군에서 선택되고,
X11 및 X12는 각각 독립적으로 R, H, D, E, S, T, N, Q, Y, C 및 K(Z)로 이루어진 군으로부터 선택되고,
X14는 R, C, K(Z), 그리고
Z는 반응성 작용기이다.
여기서, Xm(m은 정수)은 아미노산을 나타낸다. "Xmn"은 n개의 아미노산 Xm의 결합을 나타내고, n이 지정되지 않은 "Xm"은 하나의 아미노산 Xm의 존재를 나타낸다. n이 2개 이상인 경우, 복수의 Xm은 각각 독립적으로 동일하거나 다른 아미노산일 수 있다. n이 "p-q"인 경우는 아미노산 Xm이 p에서 q까지 존재함을 나타낸다. 본 명세서에 기술된 아미노산 서열에서, A는 알라닌 잔기, R은 아르기닌 잔기, N은 아스파라긴 잔기, D는 아스파르트산 잔기, C는 시스테인 잔기, Q는 글루타민 잔기, E는 글루탐산 잔기, G는 글리신 잔기, H는 히스티딘 잔기입니다, I는 이소류신 잔기, L은 류신 잔기, K는 라이신 잔기, M은 메티오닌 잔기, F는 페닐알라닌 잔기, P는 프롤린 잔기, S는 세린 잔기, T는 트레오닌 잔기, W는 트립토판 잔기, Y는 티로신 잔기, V는 발린 잔기이다. Hcy는 호모시스테인, Dpr은 디아미노프로피온산, Orn은 오르니틴 잔기, βAla는 β-알라닌 잔기, Dab은 2,4-디아미노부티르산 잔기, Nle는 노르로이신 잔기, Nva는 노르발린 잔기, Tle는 테르트-류신 잔기, Ala(t-Bu)는 테르트-부틸알라닌 잔기, Cha는 사이클로헥실알라닌 잔기이다. 곁가지(side chain)에 아미노기를 포함하는 잔기(라이신 잔기, 오르니틴 잔기, 2,4-디아미노부티르산 잔기)에서, 필요한 경우, 아미노기는 아세틸화될 수 있다. 여기서, 천연 아미노산 및 인공 아미노산의 아세틸화 형태는 각각 해당 아미노산의 명칭에 접두사 Ac를 붙여 지정할 수 있으며, 이러한 아미노산은 특별히 해석에 모순이 없는 한 Ac로 지정되지 않더라도 해당 아세틸화 형태를 포괄할 수 있는 것으로 해석된다. 여기서, K(Z)는 작용기 결합 라이신 잔기를 의미하며, K(Z)는 바람직하게는 K(아지드)다. K(아지드)는 아지드 결합 라이신 잔기를 나타낸다.
여기서, 상기 Fc-결합 펩타이드는 운반체와 결합하여 항체 및 운반체를 결합하기 위한 운반체 결합용 펩타이드일 수 있고, 상기 펩타이드를 통해 약물과 항체를 결합하기 위한 약물 결합용 펩타이드일 수 있다. 운반체-결합용 펩타이드의 경우, (i) 또는 (ii) 펩타이드가 바람직하다.
화학식 (I)에서, 링커는 (GSGGS)1-3, (SGSGS)1-3, (GGGGS)1-3, 또는 (PEG)2-10(바람직하게는 (PEG)4), 또는 없을 수 있다. 운반체와의 결합을 위해, 화학식 (I)의 C-말단에서 아미노기가 카르복실 말단(-COOH)에 결합하여(-C(=O)NH2)를 제공하거나, (상술한 바와 같이 정의된) 링커를 카르복실 말단과 아미노기 사이에 임의로 삽입할 수 있다. 링커가 C-말단에 있을 때 N-말단 측에는 링커가 없을 수 있다. 즉, (X1 1-3)-C-(X2)-(X3)-(X4)-(X5)-G-(X6)-L-(X7)-W-C-(X8 1-3)-(링커)-NH2 도 형성될 수 있다. 화학식 (I)의 N-말단의 아미노기는 아세틸화될 수 있다(이 경우, N-말단 측의 링커에서 N-말단 부근의 적절한 위치에 Lys 잔기가 도입됨).
화학식 (I)로 표시되는 펩타이드의 예는 바람직하게는 다음의 펩타이드를 포함한다.
[1] X1 1-3은 (S, G, F, 또는 없음)-(D, G, A, S, P, Hcy, 또는 없음)-(S, D, T, N, E, 또는 R)로 표시되는 아미노산 서열이다.
[2] X1 1-3 은 D, GPD, R, GPR, SPD, GDD, GPS, SDD, RGN, G-Hcy-D, RGP, 또는 GPD이다.
[3] X1 1-3 는 D 또는 GPD이다.
[4] X2 는 A, S, 또는 T이다.
[5] X2 는 A 또는 T이다.
[6] X2 는 A이다.
[7] X3 는 Y 또는 W이다.
[8] X3 는 Y이다.
[9] X4 는 H이다.
[10] X5 는 A, R, K, C, D, E, L, 2-아미노수베릭산, Dpr, R, F, 2-아미노수베릭산, Dpr, AcOrn, AcDab, Dab, Nle, Nva, Ala(t-Bu), 및 Cha 중에서 선택된 하나의 아미노산 잔기다.
[11] X5 는 K, R, 또는 AcOrn이다.
[12] X5 는 V, Dab, F, R, L, Nva, Nle, Ala(t-Bu), 및 Cha 중에서 선택된 하나의 아미노산 잔기다.
[13] X5 는 F, R, L, Nva, Nle, Ala(t-Bu), 및 Cha 중에서 선택된 하나의 아미노산 잔기다.
[14] X5 는 L, Ala(t-Bu), 및 Cha 중에서 선택된 하나의 아미노산 잔기다.
[15] X6 는 E 또는 N이다.
[16] X6 는 E이다.
[17] X7 는 V이다.
[18] X8 1-3 는 (S, T, 또는 D)-(H, G, Y, T, N, D, F, Hcy, 또는 없음)-(Y, F, H, M, 또는 없음).
[19] X8 1-3 는 T, TFH, S, SFH, THH, TFY, TYH, 또는 T-Hcy-H이다.
[20] X8 1-3 는 T 또는 TFH이다.
상기 화학식 (I)로 표시되는 펩타이드는 상기 조건 중 어느 하나 또는 둘 이상의 조건을 만족하는 펩타이드일 수도 있고, 예를 들어, 다음 조건을 만족하는 펩타이드일 수도 있다: [8] 및 [9]; [8] 및 [17]; [9] 및 [17]; [8] 및 [9] 및 [17]; 또는 [10] 내지 [14] 중 어느 하나에 대한 이들의 조합.
보다 구체적으로, 그 예로는 다음의 펩타이드(이하, X5는 전술한 바와 동일하며, NH2-(링커)-기가 N-말단에 존재할 수 있고, -NH2기 또는 NH2-(링커)-기가 C-말단에 존재할 수 있다)를 들 수 있다:
1) DCAYHX5GELVWCT (SEQ ID NO: 4)
2) GPDCAYHX5GELVWCTFH (SEQ ID NO: 5)
3) RCAYHX5GELVWCS (SEQ ID NO: 6)
4) GPRCAYHX5GELVWCSFH (SEQ ID NO: 7)
5) SPDCAYHX5GELVWCTFH (SEQ ID NO: 8)
6) GDDCAYHX5GELVWCTFH (SEQ ID NO: 9)
7) GPSCAYHX5GELVWCTFH (SEQ ID NO: 10)
8) GPDCAYHX5GELVWCSFH (SEQ ID NO: 11)
9) GPDCAYHX5GELVWCTHH (SEQ ID NO: 12)
10) GPDCAYHX5GELVWCTFY (SEQ ID NO: 13)
11) SPDCAYHX5GELVWCTFY (SEQ ID NO: 14)
12) SDDCAYHX5GELVWCTFY (SEQ ID NO: 15)
13) RGNCAYHX5GQLVWCTYH (SEQ ID NO: 16)
14) G-Hcy-DCAYHX5GELVWCT-Hcy-H (SEQ ID NO: 17)
15) RRGPDCAYHX5GELVWCTFH (SEQ ID NO: 18)
16) DCTYHX5GNLVWCT (SEQ ID NO: 19)
17) DCAYHX5GNLVWCT (SEQ ID NO: 20)
18) DCTYHX5GELVWCT (SEQ ID NO: 21)
19) DCAWHX5GELVWCT (SEQ ID NO: 22)
20) DCTYTX5GNLVWCT (SEQ ID NO: 23)
21) DCAYTX5GNLVWCT (SEQ ID NO: 24)
22) DCSYTX5GNLVWCT (SEQ ID NO: 25)
23) DCTWTX5GNLVWCT (SEQ ID NO: 26)
24) DCTYHX5GNLVWCT (SEQ ID NO: 27)
25) DCTYRX5GNLVWCT (SEQ ID NO: 28)
26) DCTYSX5GNLVWCT (SEQ ID NO: 29)
27) DCTYTX5GNLVWCT (SEQ ID NO: 30)
28) DCTYTX5GELVWCT (SEQ ID NO: 31)
29) DCTYTX5GRLVWCT (SEQ ID NO: 32)
30) DCTYTX5GDLVWCT (SEQ ID NO: 33)
31) DCTYTX5GNLIWCT (SEQ ID NO: 34)
32) DCAYHRGELVWCT (SEQ ID NO: 35)
33) GPDCAYHRGELVWCTFH (SEQ ID NO: 36)
34) RCAYHRGELVWCS (SEQ ID NO: 37)
35) GPRCAYHRGELVWCSFH (SEQ ID NO: 38)
36) SPDCAYHRGELVWCTFH (SEQ ID NO: 39)
37) GDDCAYHRGELVWCTFH (SEQ ID NO: 40)
38) GPSCAYHRGELVWCTFH (SEQ ID NO: 41)
39) GPDCAYHRGELVWCSFH (SEQ ID NO: 42)
40) GPDCAYHRGELVWCTHH (SEQ ID NO: 43)
41) GPDCAYHRGELVWCTFY (SEQ ID NO: 44)
42) SPDCAYHRGELVWCTFY (SEQ ID NO: 45)
43) SDDCAYHRGELVWCTFY (SEQ ID NO: 46)
44) DCTYHRGNLVWCT (SEQ ID NO: 47)
45) DCAYHRGNLVWCT (SEQ ID NO: 48)
46) DCTYHRGELVWCT (SEQ ID NO: 49)
47) DCAWHRGELVWCT (SEQ ID NO: 50)
48) DCTYTNGNLVWCT (SEQ ID NO: 51)
49) DCAYTNGNLVWCT (SEQ ID NO: 52)
50) DCSYTNGNLVWCT (SEQ ID NO: 53)
51) DCTWTNGNLVWCT (SEQ ID NO: 54)
52) DCTYHNGNLVWCT (SEQ ID NO: 55)
53) DCTYRNGNLVWCT (SEQ ID NO: 56)
54) DCTYSNGNLVWCT (SEQ ID NO: 57)
55) DCTYTRGNLVWCT (SEQ ID NO: 58)
56) DCTYTNGELVWCT (SEQ ID NO: 59)
57) DCTYTNGRLVWCT (SEQ ID NO: 60)
58) DCTYTNGDLVWCT (SEQ ID NO: 61)
59) DCTYTNGNLIWCT (SEQ ID NO: 62)
하나의 예로서, 운반체 결합에는 하기와 같은 구조의 펩타이드가 사용될 수 있다.
GSGGS-GPDCAYHRGELVWCTFH-NH2
(PEG)4-GPDCAYHRGELVWCTFH-NH2
GSGGS-DCAYHRGELVWCT-NH2
(PEG)4-DCAYHRGELVWCT-NH2
화학식 (II)에서, 링커2는 (GSGGS)1-3, (SGSGS)1-3, (GGGGS)1-3 또는 (PEG)2-10-Lys(바람직하게는 (PEG)4-Lys), 또는 없을 수 있다. 상기 화학식(II)의 N-말단 아미노산의 말단(-NH2)은 아세틸화되어, (CH3-C(=O)-NH-)기의 형태일 수 있다. 링커 2는 아미노 말단에 결합될 수 있으며(이 경우, Lys 잔기는 N-말단 측 링커의 N-말단 측의 적절한 위치로 도입된다), 이 경우, C-말단의 링커 2는 존재하거나 없을 수 있다.
화학식 (II)로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드의 예로는 하기의 펩타이드를 들 수 있다.
[21] X9는 GF, AF, βAlaF, NH2-(PEG)n-CO(n = 2 내지 10)-F, F, K, Orn, C 및 Dpr로 이루어진 군에서 선택된다.
[22] X9는 GF, F 및 K로 이루어진 군에서 선택된다.
[23] X11 및 X12는 각각 독립적으로 R, H 및 E로 이루어진 군에서 선택된다.
[24] X11 및 X12는 각각 R이다.
화학식 (II)로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드의 구체적인 예는 다음과 같은 펩타이드를 포함할 수 있다:
60) FNMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDC (SEQ ID NO: 63),
61) GFNMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDC (SEQ ID NO: 64),
62) KNMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDC (SEQ ID NO: 65),
63) GFNMQCQKRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDC (SEQ ID NO: 66),
64) KNMQCQKRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDC (SEQ ID NO: 67), 또는
65) GKNMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDC (SEQ ID NO: 68).
예를 들어, 운반체 결합용 펩타이드로는 하기와 같은 구조의 펩타이드를 사용할 수 있다.
Acetyl-FNMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDC-SGSGSK-NH2
Acetyl-FNMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDC-(PEG)4-Lys-NH2
운반체 결합용 펩타이드는 운반체와의 공유 결합에 대해 적어도 하나의 아미노기(-NH2)를 갖는다. 이러한 아미노기는 바람직하게는 N-말단에 있는 아미노기이며, 운반체와 결합이 가능한 한 N-말단 또는 C-말단 부근(예를 들어 링커에 위치)에 있는 라이신 잔기, 시스테인 잔기, 아스파르트산 잔기, 글루탐산 잔기, 2-아미노수베릭산, Dpr 및 아르기닌 잔기의 임의의 측쇄 아미노기가 될 수 있다.
약물 결합용 펩타이드의 경우, 펩타이드 (iii) 또는 (iv)가 바람직하다.
화학식 (I')로 표시되는 펩타이드는 N-말단의 작용기 대신 C-말단에 작용기를 포함할 수 있다. 즉, 화학식 (I')로 표시되는 펩타이드는 하기 화학식 (I')로 표시되는 펩타이드일 수 있다:
[(X1 1-3)-C-(X2)-(X3)-(X4)-(X5)-G-(X6)-L-(X7)-W-C-(X8 1-3)-(링커3)]-Z ... (I’’)
여기서, Z는 작용기를 나타내고, [(X1 1-3)-C-(X2)-(X3)-(X4)-(X5)-G-(X6)-L-(X7)-W-C-(X8 1-3)-(링커3)]로 표시되는 구조의 임의의 모이어티에 결합되어 있으며, (링커3)은 링커를 나타내고, 1 내지 3개의 X1s, X2s, X3s, X4s, X5s, X6s, 및 X7s, 그리고 1내지 3개의 X8s는 각각 동일하거나 다른 아미노산 잔기를 독립적으로 나타내고,
각 X1, X2, 및 X3, 및 각 X8은 동일하거나 다른 C 이외의 아미노산 잔기를 독립적으로 나타낸다.
X4는 H, R, S 또는 T이고,
X5는 K, C, D, E, R, V, F, L, 2-아미노수베릭산, Dpr, Orn, AcOrn, AcDab, Dab, Nle, Nva, Tle, Ala(t-Bu) 및 Cha 중에서 선택된 하나의 아미노산 잔기이고,
X6은 E, N, R 또는 D, 그리고
X7은 I 또는 V이다.
화학식 (I') 및 화학식 (I'')에서, 링커 3은 RRRGS, EEGGS 또는 (PEG)1-8(바람직하게는, (PEG)4), 또는 없을 수 있다. 아미노기는 화학식 (I')의 C-말단 아미노산의 말단(-COOH)에 결합하여 (-C(=O)NH2) 기의 형태로 결합될 수 있다. 아세틸기는 화학식 (I'')의 N-말단 아미노산의 말단(-NH2)에 결합하여 (CH3-C(=O)-NH-)기의 형태로 결합할 수 있다.
화학식 (I') 및 화학식 (I'')로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드는 각각 Z-(링커3)-(X1 1-3)-C-(X2)-(X3)-(X4)-(X5)-G-(X6)-L-(X7)-W-C-(X8 1-3) 또는 (X1 1-3)-C-(X2)-(X3)-(X4)-(X5)-G-(X6)-L-(X7)-W-C-(X8 1-3)-(링커3)-Z이다. 바람직한 아미노산 서열은 화학식 (I)로 표시된 펩타이드의 바람직한 아미노산 서열과 동일하다.
약물 결합용 펩타이드의 예로는 다음과 같은 펩타이드가 포함될 수 있다.
Acetyl-K(Z)-RRRGS-GPDCAYHKGELVWCTFH-NH2
Acetyl-K(Z)-EEGGS-GPDCAYHKGELVWCTFH-NH2
Acetyl-K(Z)-(PEG)4-GPDCAYHKGELVWCTFH-NH2
Maleimide-RRRGS-GPDCAYHKGELVWCTFH-NH2
Maleimide-EEGGS-GPDCAYHKGELVWCTFH-NH2
Maleimide-(PEG)4-GPDCAYHKGELVWCTFH-NH2
DBCO-RRRGS-GPDCAYHKGELVWCTFH-NH2
DBCO-EEGGS-GPDCAYHKGELVWCTFH-NH2
DBCO-(PEG)4-GPDCAYHKGELVWCTFH-NH2
Tetrazine-RRRGS-GPDCAYHKGELVWCTFH-NH2
Tetrazine-EEGGS-GPDCAYHKGELVWCTFH-NH2
Tetrazine-(PEG)4-GPDCAYHKGELVWCTFH-NH2
TCO-RRRGS-GPDCAYHKGELVWCTFH-NH2
TCO-EEGGS-GPDCAYHKGELVWCTFH-NH2
TCO-(PEG)4-GPDCAYHKGELVWCTFH-NH2
Acetyl-K(Z)RRRGS-DCAYHKGELVWCT-NH2
Acetyl-K(Z)EEGGS-DCAYHKGELVWCT-NH2
Acetyl-K(Z)-(PEG)4-DCAYHKGELVWCT-NH2
Maleimide-RRRGS-DCAYHKGELVWCT-NH2
Maleimide-EEGGS-DCAYHKGELVWCT-NH2
Maleimide-(PEG)4-DCAYHKGELVWCT-NH2
DBCO-RRRGS-DCAYHKGELVWCT-NH2
DBCO-EEGGS-DCAYHKGELVWCT-NH2
DBCO-(PEG)4-DCAYHKGELVWCT-NH2
Tetrazine-RRRGS-DCAYHKGELVWCT-NH2
Tetrazine-EEGGS-DCAYHKGELVWCT-NH2
Tetrazine-(PEG)4-DCAYHKGELVWCT-NH2
TCO-RRRGS-DCAYHKGELVWCT-NH2
TCO-EEGGS-DCAYHKGELVWCT-NH2
TCO-(PEG)4-DCAYHKGELVWCT-NH2
화학식 (II')에서, 링커2는 SGSGSK, SRRCR, SRRK(Z)R, SRRCRRCRRC, SRRK(Z)RRK(Z)RRK(Z), or (PEG)1-8-Lys (바람직하게는, (PEG)4-Lys), 또는 없을 수 있다. 화학식 (II')의 N-말단 아미노산의 말단(-NH2)은 아세틸화되어 (CH3-C(=O)-NH-)기의 형태일 수 있다. 필요한 경우 다른 기능성 분자가 말레이미드기를 통해 링커에 포함된 Cys 잔기(C)에 결합될 수도 있다.
화학식 (II')로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드의 예로는 하기의 펩타이드를 들 수 있다.
[a] X9는 GF, AF, βAlaF, NH2-(PEG)n-CO(n = 1 내지 50)-F, F, K, Orn, C, Dpr 및 아세틸-K로 이루어진 군에서 선택된다.
[b] X9는 GF, F 및 아세틸-K로 이루어진 군에서 선택된다.
[c] X11 및 X12는 각각 독립적으로 R, H 및 E로 이루어진 군에서 선택된다.
[d] X11은 R이다.
[e] X12는 R 또는 K(Z)(바람직하게는, Z는 아지드)이다.
화학식 (II')로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드의 예는 보다 구체적으로 60) 내지 66)에 기재된 펩타이드를 포함할 수 있다(필요한 경우, 작용기가 포함된 라이신 잔기에 결합될 수 있다):
FNMQQQCRFYEALHDPNLNEEQRNARICSIRDDP-SRRCRRCRRC-NH2
ACetyl-KNMQQQCRFYEALHDPNLNEEQRNARICSIRDDP-SRRCRRCRRC-NH2
GFNMQQQCRFYEALHDPNLNEEQRNARICSIRDDP-SRRCRRCRRC-NH2
FNMQCQZRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDC-NH2
ACetyl-KNMQCQZRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDC-NH2
GFNMQCQK(Z)RFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDC-SRRK(Z)R-NH2
FNMQCQK(Z)RFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDC-NH2
ACetyl-KNMQCQK(Z)RFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDC-SRRK(Z)R-NH2
GFNMQCQK(Z)RFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDC-SRRK(Z)RRK(Z)RRK(Z)-NH2
ACetyl-KNMQCQK(Z)RFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDC-SRRK(Z)RRK(Z)RRK(Z)-NH2
GFNMQCQK(Z)RFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDC-SRRK(Z)RRK(Z)RRK(Z)-NH2
Fc-결합 펩타이드의 다른 예로는 다음과 같은 펩타이드를 들 수 있다(도 4).
1) CAWHLGELVWC (SEQ ID NO: 70)
2) DCAWHLGELVWCT (SEQ ID NO: 71)
3) DCAWHLGELVFCT (SEQ ID NO: 72)
4) DCAWHLGELVXCT (SEQ ID NO: 73)
X = 1-naphtoyl, 2-naphtoyl, benzyl, or benzothiophene
5) CDCAWHLGELVWCTC (SEQ ID NO: 74)
6) CAYHLGELVWC (SEQ ID NO: 75)
7) DCAYHLGELVWCTF(2-Pya) (SEQ ID NO: 76)
예를 들어, 반응성 작용기(바람직하게는 아지드기)는, 필요한 경우, 링커를 통해, 본 명세서에서 약물 결합을 위해 펩타이드의 N-말단 또는 C-말단(바람직하게는, N-말단)에 결합될 수 있다. 예를 들어, 반응성 작용기(예를 들어, 아지드기)가 펩타이드의 말단에 포함되며, 여기서 1 내지 3(바람직하게는 2) 글루탐산이 N-말단 및/또는 C-말단에 추가로 결합된다. 아지드기를 갖는 펩타이드는 디벤질시클록틴(DBCO), 알킨, 및 TCO를 갖는 다른 작용 분자와 클릭 반응(click reaction)을 일으켜 이러한 다른 작용 분자를 펩타이드에 연결할 수 있다. 펩타이드와 이러한 다른 기능성 물질의 결합은 당업자에게 알려진 다른 방법, 예를 들어 말레이미드 그룹과 설프하이드릴 그룹의 반응에 의해 수행될 수도 있다.
다른 기능성 분자는 또한 본 발명의 펩타이드에 결합될 수 있다. 예를 들어, 이러한 다른 분자는 반응성 작용기(예를 들어, 아미노 말단 또는 이와 유사한)를 통해 결합될 수 있고, 펩타이드 내의 아미노산(예를 들어, 라이신 잔기)이 반응성 작용기를 갖는 경우 반응성 작용기(예를 들어, 라이신 잔기의 치환체로서 아지드기)에 결합될 수 있고, 말레이미드기를 통해 펩타이드 내의 Cys 잔기(예를 들어 링커 2의 Cys 잔기)에 결합될 수 있다.
본 발명의 펩타이드에 결합할 수 있는 다른 기능성 분자는 각각 펩타이드, 단백질, 핵산 또는 저분자 의약품을 포함하는 표지 물질 또는 의료용 약물을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 항원 특이성 및 Fc 분자의 기타 특성이 적용될 수 있는 모든 분자는 그러한 다른 분자로 결합될 수 있다. 이러한 물질의 예로는 항암제, 저분자 의약품, 방사선 표지, 형광 표지, 핵산 의약품, 유전자 치료 의약품, 펩타이드 의약품, IgA 또는 VHH와 같은 항체 등이 있다.
운반체 결합용 펩타이드는 항체와의 공유 결합을 위해 적어도 하나의 아미노기(-NH2)를 갖는다. 이러한 아미노기는 바람직하게는 아미노 말단에 있는 아미노기이며, 라이신 잔기, 시스테인 잔기, 아스파르트산 잔기, 글루탐산 잔기, 2-아미노수베릭산, 디아미노프로피온산 및 아르기닌 잔기의 임의의 측쇄 아미노기일 수 있다.
가교제에 의한 가교는 알칼리에 대한 내성이 강하므로, 본 실시예에 따른 가교 방법은 2개 이상의 SH기를 갖는 단백질 또는 펩타이드 또는 그 융합 생성물의 알칼리 저항성을 개선하는 방법일 수 있다. 본 실시예에 따른 가교 방법은 예를 들어, 이황화 결합의 내알칼리성을 향상시키는 방법, 분자 내에 이황화 결합을 갖는 단백질 또는 펩타이드의 내알칼리성을 향상시키는 방법, 또는 안정성을 향상시키는 방법일 수 있다. 구체적으로는, 단백질 또는 펩타이드의 알칼리 저항성을 개선하는 방법, 상기 방법에 의해 단백질 또는 펩타이드에 두 개의 티올기를 결합시키는 것을 포함하는 단백질 또는 펩타이드의 알칼리 저항성을 개선하는 방법이 제공된다.
(가교된 Fc-결합 펩타이드가 결합된 IgG-Fc 영역 함유 분자)
Fc-결합 펩타이드는 IgG-Fc 영역-함유 분자와 결합될 수 있다. 따라서, 다른 실시예에 따른 복합체는 가교제에 의해 분자 내 가교된 Fc-결합 펩타이드와 IgG-Fc 영역 함유 분자의 복합체이다. 상기 복합체는 약물을 포함하는 가교제에 의해 가교된 Fc-결합 펩타이드가 IgG-Fc 영역-함유 분자에 결합된 복합체; 및 반응성 작용기를 포함하는 가교제에 의해 가교된 Fc-결합 펩타이드가 IgG-Fc 영역-함유 분자에 결합된 복합체를 포함한다.
본 실시예에 따른 가교제는 Fc-결합 펩타이드와 IgG-Fc 영역-함유 분자 사이의 가교를 제공할 수 있다. 구체적으로, Fc-결합 펩타이드는 가교제를 통해 항체 등에 포함된 시스테인 잔기의 SH 그룹과 결합될 수 있다. 이러한 항체 또는 유사한-Fc-결합 펩타이드 가교물에서 Fc-결합 펩타이드는 분자 내에서 더 가교될 수 있으며, 예를 들어, 반응성 작용기/약물은 분자 내 가교에 의해 Fc-결합 펩타이드에 결합할 수 있고, Fc-결합 펩타이드는 항체의 Fc 영역을 포함하는 분자 등과 더 가교될 수 있다. 따라서, 다른 실시예에 따른 복합체는 Fc-결합 펩타이드 및 IgG-Fc 영역 함유 분자의 복합체로서, 가교제에 의해 가교된다. 복합체는 IgG-Fc 영역 함유 분자와 Fc-결합 펩타이드가 약물을 포함하는 가교제에 의해 가교된 복합체; 및 IgG-Fc 영역 함유 분자와 Fc-결합 펩타이드가 반응성 작용기를 포함하는 가교제에 의해 가교된 복합체를 포함한다.
Figure pct00051
본 명세서에서, "IgG-Fc 영역 함유 분자"는 IgG의 Fc 영역을 포함하는 펩타이드, 단백질 또는 기타 복합체를 의미하며, 야생형(wild-type) 또는 인공 IgG 및 이의 돌연변이체 외에 Fc 융합 단백질로 대표되는 IgG의 Fc 영역과 기타 물질(활성 성분, 약물, 단백질, 저분자 화합물, 중분자 화합물, 고분자 화합물, 매트릭스, 지질, 리포솜, 나노 입자, DDS용 매개체, 핵산 및/또는 펩타이드) 의 융합 산물 및 Fc영역만으로 구성된 분자를 포함한다. 예를 들어, Fc 분자가 Fc 융합 단백질인 경우, Fc와 융합되는 단백질 또는 펩타이드의 예로는 수용체, 사이토카인, 인터루킨, 인자 VIII, CTLA4, 인간 락토페린, TNF 수용체 또는 LFA-3 또는 이의 일부(바람직하게는 표적 결합 부분)가 포함된다.
복합체는 가교제에 의해 가교된 Fc-결합 펩타이드와 IgG-Fc 영역 함유 분자를 접촉시킴으로써 생성될 수 있다. 따라서, 약물이 융합된 IgG-Fc 영역 함유 분자를 제조하는 방법은 가교제에 의해 가교된 Fc-결합 펩타이드와 IgG-Fc 영역 함유 분자를 접촉시키는 것을 포함한다. 또는, 복합체는 Fc-결합 펩타이드를 IgG-Fc 영역 함유 분자에 결합시킨 후, 가교제에 의해 분자 내 및/또는 분자 간 가교를 수행함으로써 제조될 수 있다.
따라서, IgG-Fc 영역 함유 분자의 제조 방법은 다음을 포함하는 가교 Fc-결합 펩타이드가 결합된 IgG-Fc 영역 함유 분자의 제조 방법:
IgG-Fc 영역 함유 분자에 결합된 Fc-결합 펩타이드를 가교제와 반응시켜 하기 기를 통해 Fc-결합 펩타이드의 두 티올 그룹을 결합시키는 단계:
Figure pct00052
여기서, A는 수소 원자, 선택적으로 페닐기 또는 할로겐 원자로 치환된 C1 내지 6 알킬기, 페닐기 또는 C1 내지 6 알킬기이다.
상기 IgG-Fc 영역 함유 분자의 제조 방법은 반응성 작용기 Z가 결합된 Fc-결합 펩타이드, 상기 Fc-결합 펩타이드가 하기 화학식으로 표시되는 IgG-Fc 영역 함유 분자의 제조 방법:
Figure pct00053
여기서 A는 수소 원자, 선택적으로 페닐기 또는 할로겐 원자로 치환된 C1 내지 6 알킬기, 또는 페닐기, 또는 C1 내지 6 알킬기, L은 링커를 나타내고 Z는 반응성 작용기를 나타낸다;
결합되어 있는,
다음을 포함하는 방법:
하기 화학식으로 표시되는 가교된 Fc-결합 펩타이드가 결합된 IgG-Fc 영역 함유 분자를 반응시키는 단계:
Figure pct00054
여기서 A는 수소 원자, 선택적으로 페닐기 또는 할로겐 원자로 치환된 C1 내지 6 알킬기, 페닐기, 또는 C1 내지 6 알킬기;
및 NH2-L-Z(L은 링커를 나타내고, Z는 반응성 작용기를 나타낸다)를 가교된 Fc-결합 펩타이드 내의 가교 부분에 도입한다.
상기Fc-결합 펩타이드와 항체 등을 결합하는 방법은 국제 공개 번호 WO 2013/027796, 국제 공개 번호 WO 2018/092867, 국제 공개 번호 WO 2020/075670 등을 참조하여 수행할 수 있다.
라이신 잔기, 시스테인 잔기, 아스파르트산 잔기, 글루탐산 잔기, 2-아미노수베릭산, 디아미노프로피온산, 아르기닌 잔기(바람직하게는, 라이신 잔기) 또는 Fc-결합 펩타이드의 제1 위치의 아미노산은 선택적으로 항체와 공유결합을 위한 부분으로 변형될 수 있으며, 펩타이드가 항체 등과 결합될 때 부분에 항체 등과 공유결합될 수 있다. 본 명세서에서는, 모이어티에 의해 변형된 Fc-결합 펩타이드를 "CCAP 시약"으로 지칭하기도 한다. 여기서, "항체와의 공유결합용 모이어티"는 Fc-결합 펩타이드와 IgG-Fc 영역 함유 분자를 공유결합으로 연결하기 위한 화학구조를 의미하며, 원하는 아미노산(예를 들어, 라이신 잔기, 시스테인 잔기, 아스파르트산 잔기, 글루탐산 잔기, 2-아미노수베릭산, 디아미노프로피온산 또는 아르기닌 잔기)과 결합할 수 있는 적어도 하나의 부위를 갖는 화학 구조일 수 있다. 항체와 공유 결합을 위한 모이어티를 부여하는 화합물의 예로는 DSG (disuccinimidyl glutarate), DSS (disuccinimidyl suberate), DMA (dimethyl adipimidate dihydrochloride), DMP (dimethyl pimelimidate dihydrochloride), DMS (dimethyl suberimidate dihydrochloride), DTBP (dimethyl 3,3’-dithiobispropionimidate dihydrochloride), and DSP (dithiobis(succinimidyl propionic acid)), 및 DSG, DSS, 또는 DSP 가 바람직하다. 예를 들어, DSS 또는 DSG와 같은 석시니미딜기는 라이신 잔기의 측쇄 및 폴리펩타이드의 N-말단에 존재하는 일차 아민과 반응하므로, Fc-결합 펩타이드의 N-말단을 차단한 후 DSS 또는 DSG와의 반응을 수행함으로써 IgBP의 라이신 잔기의 측쇄만을 DSS 또는 DSG로 특이적으로 변형시킬 수 있다. Fc-결합 펩타이드와 IgG 사이의 가교는 예를 들어, Fc-결합 펩타이드의 X5, X9, X11, X12 또는 X14의 아미노산 잔기와 IgG의 Fc 영역에서 Lys248 또는 Lys246, 바람직하게는 Lys248 사이에서 부위 특이적으로 발생할 수 있다.
CCAP 시약으로서의 Fc-결합 펩타이드와 항체 등의 결합은 가교 반응이 일어날 수 있는 조건 하에서 결합이 수행되는 한 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어 실온(예를 들어, 약 15°C 내지 30°C)에서 적절한 완충액에 혼합하여 Fc-결합 펩타이드와 항체 등을 반응시킴으로써 이루어질 수 있다. 혼합 단계는 필요한 경우 가교 반응을 촉진하는 적절한 양의 촉매를 첨가하여 수행될 수 있다. 혼합 단계에서의 Fc-결합 펩타이드와 항체 등의 혼합 비율은, 예를 들어, Fc-결합 펩타이드: 항체 등의 몰비 측면에서, 1:1 내지 20:1, 바람직하게는 2:1 내지 20:1 또는 5:1 내지 10:1이 될 수 있다. 혼합 단계에서의 혼합 시간(반응 시간)은 예를 들어, 1분 내지 5시간, 바람직하게는 10분 내지 2시간, 또는 15분 내지 1시간일 수 있다. 결과적으로 결합된 생성물은, 필요한 경우, 추가로 정제될 수 있다.
IgG 등의 Fc 영역은 일반적으로 두 개의 대칭 쌍인 중쇄 불변 영역(heavy-chain constant region)을 형성하며, 따라서 Fc-결합 펩타이드가 결합될 두 개의 부위가 존재할 수 있다. 따라서, 1 내지 2개의 펩타이드, 바람직하게는 Fc-결합 펩타이드의 1개의 펩타이드가 IgG-Fc 영역 함유 분자의 1개의 분자에 결합할 수 있다.
(가교 Fc-결합 펩타이드 결합 운반체)
상기 Fc-결합 펩타이드는 컬럼 등의 운반체에 결합되어 항체의 정제 등에 사용될 수 있다. 본 발명에서의 가교 방법은 알칼리에 대한 내성을 향상시키는 결과를 가져오므로, 본 발명의 가교제에 의해 가교된 Fc-결합 펩타이드를 사용하여 알칼리로 1회 또는 수회 세척하여 운반체를 재사용할 수 있다. 따라서, 일 측면은 상기 가교제에 의해 분자 내 가교된 Fc-결합 펩타이드가 결합된 운반체를 제공한다. 상기 펩타이드의 운반체에 대한 결합은, 예를 들어, 아미노기와 반응성이 있는 작용기를 갖는 운반체와 펩타이드의 반응에 의해 수행될 수 있다. 상기 반응은 양쪽 모두의 충분한 결합을 부여하는 조건에서 수행되며, 예를 들어 상온에서 1 내지 5시간(바람직하게는 2.5 내지 3.5시간) 동안 완충액 중에서 접촉시킴으로써 수행될 수 있다.
운반체의 예로는 겔의 형태(예를 들면, 컬럼용 겔), 입자, 비드, 나노입자, 미립자, 매크로비드, 막, 마이크로플레이트, 어레이 등이 있으며, 이들의 물질의 예로는 자성체, 라텍스, 아가로스, 유리, 셀룰로스, 세파로스, 니트로셀룰로스, 폴리스티렌, 기타 고분자 물질 등이 있다. 운반체는 컬럼(컬럼 크로마토그래피)용 겔인 것이 바람직하다. 여기서 사용되는 운반체는 예를 들어, HiTrap NHS 활성화 HP(GE Healthcare)일 수 있다.
운반체를 이용하여 IgG-Fc 영역 함유 분자를 정제하는 방법이 또한 제공된다. 일 측면에서 항체 등을 정제하는 방법은 항체 등의 함유액을 운반체에 접촉시켜 운반체에 항체 등을 결합시켜 운반체에 결합되지 않은 성분을 세척 및 제거하고, 운반체에 결합된 성분을 용출하여 회수하는 단계를 포함한다.
항체 등 함유액과 운반체의 접촉은 둘 다 충분히 접촉할 수 있는 조건에서 이루어진다. 상기 접촉은, 예를 들어, 운반체가 컬럼인 경우, 컬럼에 항체 등의 함유액을 주입하여 이루어진다. 운반체에 결합되지 않은 성분의 제거는 통상적인 방법으로 수행될 수 있으며, 예를 들어 항체에 결합된 운반체를 완충제(pH 약 7.0)로 세척함으로써 수행될 수 있다. 운반체에 결합된 항체 등의 회수는 2.5 이상의 pH에서 수행될 수 있으며, 산도는 항체 등의 변성을 방지하기 위해 약하고 pH는 3.6 이상인 것이 바람직하며, 예를 들어 3.6 내지 4.3일 수 있다. 또는, 운반체에 비드를 사용하는 경우에는, 항체 등을 운반체에 접촉시킨 후, 원심분리 등에 의해 비드를 회수하여 용출액에 재부유(re-suspending)함으로써 항체 등을 회수할 수 있다.
(의료용 조성물)
다른 측면은 본 발명의 가교제에 의해 가교된 Fc-결합 펩타이드가 결합된 IgG-Fc 영역 함유 분자 또는 상기 가교제에 의해 가교된 펩타이드 및/또는 단백질을 유효성분으로 포함하는 의료용 조성물, 특히 치료제, 예방제, 또는 진단용 제품을 제공한다. 치료 또는 예방 효과가 있는 약물이 결합된 가교제에 의해 가교된 펩타이드 또는 단백질은 의료용(치료 또는 예방) 조성물에 사용될 수 있다.
상기 펩타이드 및/또는 단백질, 또는 가교제를 통해 결합된 약물 D가 각각 치료제, 예방제 또는 백신으로 사용되는 약물인 경우, 펩타이드 및/또는 단백질 가교제 또는 펩타이드 및/또는 단백질 가교제가 결합된 항체 등은 치료 또는 예방에 사용될 수 있다.
상기 펩타이드 및/또는 단백질, 또는 가교제를 통해 결합된 약물 D가 각각 라벨 역할을 하는 약물인 경우, 펩타이드 및/또는 단백질 가교제가 결합된 항체 등을 진단 또는 검출에 사용할 수 있다.
상기 조성물이 치료용 또는 예방용 조성물인 경우 해당 약물은 치료제 또는 예방제이며, 상기 조성물이 진단용 제품인 경우 해당 약물은 라벨 물질이다. 의료용 조성물의 표적 질환은 사용하고자 하는 펩타이드, 단백질 또는 항체 등과 결합하고자 하는 약물을 선택하여 적절히 설정할 수 있으며, 그 예로는 암, 염증성 질환, 감염, 신경 퇴행성 질환 등이 있다.
상기 의료용 조성물은 예를 들어 주사 제제로서 사용될 수 있으며, 정맥 주사 제제, 피하 주사 제제, 피내 주사 제제, 근육 주사 제제 및 점적 주사 제제와 같은 제형을 포함한다. 이러한 주사 제제는 예를 들어, 공지된 방법에 따라 주사 제제에 일반적으로 사용되는 멸균 수성 또는 유성 액체에 활성 성분을 용해, 현탁 또는 유화하여 제조할 수 있다. 준비된 주사액은 일반적으로 적절한 앰플, 바이알 또는 주사기에 포장된다. 상기 주사 용액은 또한 활성 성분에 적절한 첨가제를 첨가하여 동결 건조 제형을 제조하고 사용하기 전에 주사 용매, 생리 식염수 등에 제형을 용해하여 얻을 수 있다. 항체와 같은 단백질은 일반적으로 소화계에 의한 분해로 인해 경구투여가 어려운 반면, 이러한 경구투여는 항체 단편 및 변형된 항체 단편 및 제형의 독창성(originality) 및 독창성(ingenuity)으로 이루어질 수도 있다. 경구 투여 제제의 예는 캡슐, 정제, 시럽 및 과립을 포함할 수 있다.
의료용 조성물은 투여되는 활성 성분의 양에 적합한 투여 단위의 투여 형태로 적합하게 제조된다. 투여 단위의 제형은 예를 들어, 주사 제제(앰플, 바이알 또는 프리필드 주사기)이며, 일반적으로 투여 단위의 제형당 5 내지 500 mg, 5 내지 100 mg, 10 내지 250 mg의 활성 성분 또는 약물을 함유할 수 있다.
의료용 조성물의 투여 경로는 국소적 또는 전신적일 수 있다. 투여 방법은 특별히 제한되지 않으며, 상술한 바와 같이 비경구 또는 경구 투여이다. 비경구 투여 경로의 예로는 피하 투여, 복강 내 투여, 혈액 내 투여(정맥 내 또는 동맥 내), 또는 척수액 내 주사 또는 점적 투여가 포함되며, 혈액 내 투여가 바람직하다. 의료 또는 진단용 조성물은 일시적으로 투여될 수도 있고, 지속적 또는 간헐적으로 투여될 수도 있다. 예를 들어, 투여는 1 분 내지 2 주 동안 연속 투여될 수도 있다. 약학 조성물의 투여 요법은 원하는 치료 효과 또는 예방 효과를 부여할 수 있도록 투여 용량 및 투여 시간을 설정하는 한 특별히 제한되지 않으며, 증상, 성별, 연령 등에 따라 적절하게 결정될 수 있다. 예를 들어, 활성 성분의 단일 용량은 일반적으로 약 0.01 내지 20 mg/kg 체중, 바람직하게는 약 0.1 내지 10 mg/kg 체중, 더 바람직하게는 약 0.1 내지 5 mg/kg 체중의 정맥 주사를 질병의 임상 증상 발생 전후에 1일 1회 내지 10회, 바람직하게는 1일 1회 내지 5 회 투여하는 것이 바람직하다. 또한, 다른 비경구 투여 및 경구 투여의 경우, 이와 유사한 용량으로 투여할 수 있다.
이하, 본 발명은 실시예들을 참조하여 보다 구체적으로 설명되지만, 본 발명은 이러한 실시예들에 의해 제한되지 않는다. 본 명세서 전체에 인용된 문서 전체가 본 명세서에 참조로 통합되어 있다.
1,1-디클로로아세톤-가교된 고리형 펩타이드의 제조
원료 펩타이드 [서열: Fmoc-HN-GSGGS-GPDCAYHRGELVWCTFH (SEQ ID NO: 1): IgGBP-longGS 또는 IgGBP-LGS]는 고상(solid-phase) 펩타이드 합성법(Fmoc 방법)에 의해 의뢰(Eurofins)로 합성되었다. 원료 펩타이드 5mg(1.95μmol)을 DMF 1500μL에 녹인 후, 미리 2ml의 PBS(pH 7.4)에 용해시킨 TCEP-HCl(1.12mg, 3.9μmol, 2 ?韜?몰)을 첨가하여 상온에서 30분간 교반하면서 환원 반응을 실시하였다. 그 후, 120 μL의 아세토니트릴에 용해된 1,1-디클로로-2-프로파논(0.495 mg, 3.9 μmol, 2 당량몰)을 첨가하여 상온에서 교반하였다. 1시간 후, LC-MS 분석(SIMADZU CORPORATION제조 LC-MS8030)으로 반응 종료를 확인하고, 반응 용액을 HPLC(C18 역상 컬럼)로 정제하여 Fmoc-고리형 펩타이드(2 mg, 0.76 μmol, 40% 수율)를 얻었다. 그 후, Fmoc 보호기의 탈보호를 위해 2%의 피페리딘을 첨가하고, 10분 후에 LC-MS 분석(SIMADZU CORPORATION 제조 LC-MS8030)으로 반응 종료를 확인한 후, HPLC(C18 역상 컬럼)로 직접 정제하여 고리형 펩타이드(1 mg, 38 μmol, 20% 수율)를 얻었다. 최종 정제된 펩타이드는 LC-MS 분석(SIMADZU CORPORATION 제조 LC-MS8030)으로 분자량을 확인한 후 동결 건조하였다.
1,1-디클로로피나콜린-가교 고리형 펩타이드의 제조
원료 펩타이드 [서열: Fmoc-HN-GSGGS-GPDCAYHRGELVWCTFH (SEQ ID NO: 1]는 고상 펩타이드 합성법(Fmoc 방법)에 의해 의뢰(Eurofins)로 합성되었다. DMF 1500 μL에 원료 펩타이드 10 mg(3.9 μmol)을 용해하고, 여기에 미리 PBS(pH 7.4) 2 ml에 TCEP-HCl(2.24 mg, 7.8 μmol, 2 당량몰)을 첨가하고, 상온 교반하에서 30분간 환원 반응을 실시하였다. 그 후 아세토니트릴 120 μL에 용해된 1,1-디클로로피나콜린(1.32 mg, 7.8 μmol, 2 당량몰)을 첨가하여 상온에서 교반하였다. 1시간 후에는 LC-MS 분석(SIMADZU CORPORATION제조 LC-MS8030)으로 반응 종료를 확인하고, 반응 용액을 HPLC(C18 역상 컬럼)로 정제하여 Fmoc-고리형 펩타이드(7 mg, 2.7 μmol)를 얻었다. 그 후, Fmoc 보호기의 탈보호를 위해 2%의 피페리딘을 첨가하고, LC-MS 분석(SIMADZU CORPORATION제조 LC-MS8030)으로 10분 후에 반응 종료를 확인한 후, 반응 용액을 HPLC(C18 역상 컬럼)로 직접 정제하여 고리형 펩타이드(5mg, 2.04 μmol, 50% 수율)를 얻었다. 최종 정제된 펩타이드는 LC-MS 분석(SIMADZU CORPORATION 제조 LC-MS8030)으로 분자량을 확인한 후 동결 건조하였다.
2,2-디클로로아세토페논 가교 고리형 펩타이드의 제조
원료 펩타이드[sequence: Fmoc-HN-GSGGS-GPDCAYHRGELVWCTFH(SEQ ID NO: 1)]는 고상 펩타이드 합성법(Fmoc법)에 의해 의뢰로 합성되었다. DMF 1500 μL에 원료 펩타이드 2.5 mg(1.00 μmol), PBS(pH 7.4) 2 ml에 미리 용해된 TCEP-HCl(0.506 mg, 2.0 μmol, 2 당량몰)을 넣고 상온 교반하에서 30분간 환원 반응을 실시하였다. 그 후 아세토니트릴 120 μL에 용해된 2,2-디클로로아세토페논(0.38 mg, 2.0 μmol, 2 당량몰)을 첨가하여 상온에서 교반하였다. 1시간 후 LC-MS 분석(SIMADZU CORPORATION제조 LC-MS8030)으로 반응 종료를 확인하고, 반응 용액을 HPLC(C18 역상 컬럼)로 정제하여 약 2 mg의 Fmoc-고리형 펩타이드를 얻었다. 그 후, Fmoc 보호기의 탈보호를 위해 2%의 피페리딘을 첨가하고, LC-MS 분석(SIMADZU CORPORATION 제조 LC-MS8030)으로 10분 후에 반응 종료를 확인하고, 반응 용액을 HPLC(C18 역상 컬럼)로 직접 정제하여 고리형 펩타이드(1.2mg, 0.49 μmol, 49% 수율)를 얻었다. 최종 정제된 펩타이드는 LC-MS 분석(SIMADZU CORPORATION 제조 LC-MS8030)으로 분자량을 확인한 후 동결 건조하였다.
가교 고리형 펩타이드의 결합 친화성 측정
친화도 분석은 다음과 같은 방법으로 수행되었다. 먼저 BIAcore T200(GE healthcare)에 CM5 센서칩을 설치하고, 센서칩에 0.4 M 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디미드(EDC)와 등가량이 혼합된 0.1 M의 설포-N-히드록시수키니미드(sulfo-NHS) 용액을 10 μl/ml의 유량으로 주입하여 센서칩을 활성화시켰다. 그 후, IgG는 pH 5.5(10 mM Na 아세테이트) 조건으로 센서 칩 상에 고정화되었다. 측정은 HBS-EP 버퍼(10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0.005% Tween 20, 3 mM EDTA, pH 7.4)를 사용하였으며, 각각 15.625, 31.2, 62.5, 125, 250, 500 nM의 펩타이드를 50 μl/ml의 유량으로 180초 동안 주입하여 결합 반응을 모니터링하였다. 해리 반응을 측정하였을 때, 완충액만 600초 동안 주입하였다. 상호 작용 매개변수(interaction parameter)는 BIAevaluation T100 소프트웨어로 분석하였다.
비교 평가된 IgG 결합 펩타이드 유도체는 도 1에 도시되어 있다. 인간 IgG1에 대한 이러한 펩타이드의 친화성 평가 결과는 표 1과 같다. 이황화 결합을 갖는 원래 IgG 결합 펩타이드의 친화력 Kd 값은 8.2nM이었고, 1,3-디클로로아세톤-가교 고리형 펩타이드의 친화력 Kd 값은 4.9μM으로 친화력이 약 500배 감소하였다. 이와 관련하여, 1,1-디클로로아세톤-가교환 펩타이드의 Kd 값은 45.6nM으로 원래 펩타이드에 비해 약 5배 감소하였으며, 1,1-디클로로피나콜린-가교 고리형 펩타이드의 Kd 값은 112nM으로 원래 펩타이드에 비해 약 14배 감소하였고, 2,2-디클로로아세토페논-가교 고리형 펩타이드의 Kd 값은 6.4nM로 원래 펩타이드의 Kd 값과 비슷했다.
Figure pct00055
펩타이드 고정 컬럼의 제조 및 IgG의 정제
1 mL의 염산 5 mL을 부피가 1 mL인 NHS 활성 프리패킹 컬럼에 보내고 컬럼 내의 이소프로판올 용액을 제거하였다. 다음으로 10.0 mg/mL 펩타이드 용액(DMSO 100 μL에 용해됨)을 커플링 용액(20 mM 탄산 완충액, 50 mM 염화 나트륨, pH 8.3)으로 10배 희석하고 희석액 1 mL를 흘려준 후 상온에서 4시간 동안 고정화하였다. 그 후, 미반응 NHS를 상온에서 1 M Tris(pH 8.0) 5 mL로 1시간 동안 차단하였다. 이후 0.1N NaOH 수용액 5 mL로 세척하였다. 마지막으로 PBS 용액 10 mL(20 mM 인산 완충액, 150 mM 염화 나트륨, pH 7.4)를 흘려보내 크로마토그래피 평가에 사용하였다.
제조된 IgG 결합 펩타이드-이동 컬럼을 BioLogic LP(Bio-Rad Laboratory Inc. 제조) 액체 크로마토그래피 시스템에 연결하고 PBS와 평형을 이루었다. 다음으로 PBS에 용해된 1 mg/mL 인간 혈청 유래 IgG(Sigma-Aldrich Co. LLC 제조)를 1 mL/min의 유속으로 1분간 보냈다. 또한 컬럼을 PBS로 세척하고 용출액(100 mM 글리신 버퍼, pH 2.8)을 보내 흡착 성분으로 IgG를 용출하였다. 컬럼에서 IgG의 용출은 280 nm에서의 흡광도에 의해 검출되었다.
펩타이드 고정 컬럼의 동적 결합력(DBC) 측정 및 알칼리 저항성 평가 1
상기와 같은 방법으로 펩타이드의 고정화량이 1 mg인 컬럼을 제조하였다. 제조된 컬럼은 PBS와 평형을 이루어 PBS에 용해된 1 mg/mL 인간 혈청 유래 IgG(Sigma-Aldrich Co. LLC 제조)를 1 mL/min(유지시간 1분)의 유속으로 보냈다. DBC는 첨가된 샘플의 280 nm에서의 흡광도 10%가 누출된 시점에서 첨가된 단백질의 양으로부터 결정된 것으로 표시되었다.
다음으로, 0.1 N 수산화나트륨 수용액 5mL를 펩타이드 1mg이 고정된 1mL 컬럼으로 보냈다. 그 후, PBS로 세척하였다. 이 사이클은 1,1-디클로로아세톤-가교 고리형 펩타이드의 경우 30회 반복되었고, 1,1-디클로로피나콜린-가교 고리형 펩타이드의 경우 10회 반복되었다. 1,1-디클로로아세톤-가교 고리형 펩타이드에 대해 1~5회 및 10회째에 1mL/min의 유속으로 DBC 측정을 수행하고, 20회 및 30회째에 추가로 수행하여 알칼리 저항성을 평가했다. 컬럼 생산 직후의 DBC가 100%라는 가정 하에 측정 결과를 바탕으로 표 2에 따라 DBC의 변화를 확인했다.
Figure pct00056
이와 관련하여, 원래 펩타이드의 경우 각 펩타이드 컬럼의 DBC 초기값이 17.24 mg/mL-column이었고, 1,3-디클로로아세톤 가교 펩타이드의 경우 2.3 mg/mL-column이었던 반면, 1,1-디클로로아세톤 가교 펩타이드의 경우 DBC 값이 12.8 mg/mL-column이었고, 16.70 mg/mL-column 1,1-디클로로피나콜린 가교 펩타이드의 경우. 이로 인해, IgG 흡착 성능이 기존의 가교 고리형 펩타이드에 비해 높은 것으로 나타났다.
펩타이드 고정 컬럼의 동적 결합력(DBC) 측정 및 알칼리 저항성 평가 2
제조된 1 mL column에 0.1 M 수산화나트륨 용액 5 mL를 흘려주어 펩타이드의 고정화량이 1 mg이 되도록 한 후, 5 mL의 PBS로 세척하였다. 이러한 작업은 1사이클로 정의하고 NaOH 수용액으로 세척/PBS로 세척 처리를 1~30회 실시한 후, 의도한 횟수(1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30회)로 1 mL/min의 유속으로 DBC 측정을 실시하였다.
결과는 도 2에 도시되어 있다. 이황화 결합을 갖는 원래의 IgG 결합 펩타이드의 경우 알칼리 세척에 의해 항체의 컬럼 결합량이 감소한 반면(그림에 없음), 1,1-디클로로아세톤-가교 펩타이드와 1,1-디클로로피나콜린-가교 펩타이드의 경우 항체의 컬럼 결합량 감소가 극히 미미한 것으로 나타났다.
도 3은 DBC의 10% 값에서 항체의 양 변화율을 비교한 결과를 나타낸 것이다. 이황화 결합을 갖는 기존 IgG 결합 펩타이드 고정 컬럼의 DBC는 5회 알칼리 세척에서 50% 이하로 감소한 반면, 1,1-디클로로아세톤 가교 펩타이드는 30회 세척에서 90% 이상, 1,1-디클로로피나콜린 가교 펩타이드는 10회 세척에서 85% 이상 유지되었다(도 3). 따라서 1,1-디클로로아세톤-가교 펩타이드와 1,1-디클로로피나콜린-가교 펩타이드는 분명히 높은 알칼리 저항성을 획득한 것으로 밝혀졌다. 이와 관련하여 이황화 결합을 갖는 원래 IgG 결합 펩타이드 고정화 컬럼의 DBC 값은 17.24 mg/ml 인 반면, 1,1- 디클로로아세톤-가교 펩타이드 컬럼의 값은 12.8 mg/ml로 약 74 %에 해당하고 1,1- 디클로로피나콜린-가교 펩타이드 컬럼의 값은 16.70 mg/ml로 약 96 %에 해당한다. 일반적으로 고정된 리간드(펩타이드)의 양과 유속에 따라서도 DBC는 상당히 달라지기 때문에 1,1-디클로로아세톤-가교 펩타이드와 1,1-디클로로피나콜린-가교 펩타이드를 이용한 컬럼도 각각 최적의 조건을 찾아 실용화에 적합한 컬럼으로 완성할 수 있을 것이다.
반응성 작용기 도입
Figure pct00057
400 μl의 DMF에 제조된 1,1-디클로로아세톤-가교 고리형 펩타이드 0.201 μ몰을 용해시키고, 미리 0.2 M NaHCO3 완충액(pH 8.3) 1.0 ml에 용해시켜 얻은 O-2-프로피닐하이드록실아민 염산염(20.1 μ몰)의 100배 부피를 여기에 첨가하였다. 반응 액을 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 반응 종료는 LC-MS 분석 (SHIMADZU CORPORATION 제조 LC-MS8030)으로 확인되었으며, 반응 용액을 HPLC (C18 역상 컬럼)로 직접 정제하여 알킨 작용기가 도입되고 가교 고리형 펩타이드 (0.10 μmol, 50 % 수율)를 얻었다. 최종적으로 정제된 펩타이드는 LC-MS 분석(SHIMADZU CORPORATION 제조 LC-MS8030)을 통해 분자량을 확인한 후 동결 건조시켰다. 생성된 화합물을 실시예 4(가교된 고리형 펩타이드의 결합 친화도 측정)와 동일한 친화도 측정을 실시한 후, 그 결과 Kd값이 334 nM으로 원래의 펩타이드에 비해 약 42배 감소된 것을 확인하였다.
VHH 항체와 1,1-디클로로아세톤의 가교
요소 용액을 950 μg/ml 항-CD89 VHH 항체(IgARC25)의 PBS 용액(pH 7.4) 100 μl(95 μg, 56 × 10-10 mol)에 첨가하여 최종 농도가 5 M이 되도록 하고, 혼합물을 실온에서 1시간 동안 그대로 두었다. 그 후, TCEPTCEP-HCl(11.2 nmol, 2 당량몰)을 첨가하고 실온에서 30분 동안 교반하면서 환원 반응을 실시하였다. 그 후, 120 μL의 아세토니트릴에 용해된 1,1-디클로로아세톤(11DCA, 11.2 nmol, 2 당량몰)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 교반하였다. 1시간 후 LC-MS 분석(Waters Corporation 제조 Bio-Accord SYSTEM)을 통해 반응 종료를 확인하였다. 그 결과, 가교 전 IgARC25의 분자량은 14,028 Da였으며, 11DCA 처리 후 14,085 Da로 57 Da가 증가한 것으로 나타나 11DCA에 의한 가교가 확인되었다.
펩타이드 합성에 의한 가교 구조를 갖는 펩타이드의 제조
다음 식으로 표현되는 1,1-디클로로아세톤 유도체 화합물(1,1-디클로로아세톤, 1,1-디클로로피나콜린, 2,2-디클로로아세토페논)에 의한 이황화 결합의 가교 반응에서, 펩타이드는 다음 식에 의해 생성된다,
Figure pct00058
N-말단에서 각각 Fmoc에 의해 변형된 두 개의 Cys를 갖는 펩타이드(또는 N-말단에서 Fmoc에 의해 변형되고 이황화 결합을 갖는 펩타이드의 환원에 의해 얻어진 펩타이드) 및 1.0 내지 2.0 등가물의 1,1- 디클로로아세톤 유도체 화합물을 PBS에서 반응시켜 가교를 수행하고 (반응식 A의 단계 a), 최종적으로 N- 말단의 Fmoc을 제거 및 탈 보호하여 (반응식 A의 단계 b) 다음 화학식과 같이 제조한다. 한편, 이 방법에 따르지 않는 방법으로는, 화학식 B에 도시된 바와 같이, am Fmoc 방법에 의한 펩타이드 합성에서 가교반응을 수행하여, 가교될 두 개의 Cys 중 하나를 포함하는 펩타이드를 펩타이드 합성 수지 상에서 C-말단에서 다른 Cys의 이전 말단까지 Fmoc 방법에 의해 합성하는 방법을 고안하였다. 펩타이드에서 Cys의 보호 그룹을 탈보호 한 다음 (반응식 B의 단계 c) Fmoc-클로로아세토페노일 시스테인을 첨가하고 연결했다 (반응식 B의 단계 d). Fmoc이 비보호되고(반응식 B의 단계 e), 생성된 펩타이드의 N-말단에 있는 α-아미노기와 아세토페노일 시스테인 측에 있는 α-카복실기가 결합되었다(반응식 B의 단계 f). 나머지 아미노산은 Fmoc 방법으로 연결 및 합성을 거쳤으며 (반응식 B의 단계 g), 마지막으로 수지로부터의 절단 및 Fmoc의 탈보호를 통해 객관적인 펩타이드를 얻었다.
Figure pct00059
(Fmoc-알릴화된 클로로아세토페노일 시스테인의 합성)
본 방법에 사용된 Fmoc-클로로아세토페노일 시스테인(이하, 화합물 5)은 다음과 같은 방법으로 합성되었다. 다음에서, Fmoc-클로로아세토페노일 시스테인의 α-카르복실기는 알릴기에 의해 보호되었다.
Figure pct00060
아르곤 스트림 하에서 N,N-디이소프로필에틸아민(1.60 mL, 9.38 mmol, 1.1 당량)을 화합물 1(5.00 g, 8.53 mmol)과 알릴브로마이드(1.44 mL, 17.1 mmol, 2 당량)의 아세토니트릴 용액(85 mL)에 넣고 상온에서 16시간 동안 교반하였다. 물 첨가에 의한 반응 종료 후, 반응액을 농축한 후, 에틸아세테이트로 추출하고, 유기층을 포화수소나트륨 수용액, 2N 염산 수용액 및 포화염수로 세척한 후, 황산나트륨으로 건조시켰다. 결과물을 농축하고 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(헥산:아세테이트 에틸 = 4:1)로 정제하여 화합물 2(5.03g, 94%)를 얻었다.
Figure pct00061
트리플루오로아세트산과 디클로로메탄 용액에 화합물 2(5.03 g, 8.03 mmol)와 트리이소프로필실란(5.45 mL, 26.5 mmol, 3.3 당량)을 1:1(30 mL)로 넣고 상온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응이 끝난 후 톨루엔과 함께 제오트로피(zeotropy)를 사용하여 농도로 얻어진 잔기를 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(헥산:아세테이트 에틸 = 4:1)로 정제하여 화합물 3(1.94g, 63%)을 얻었다.
Figure pct00062
아르곤 스트림 하에서 화합물 3(1.00g, 2.63 mmol)과 페나실 클로라이드(814 mg, 5.27 mmol, 2 당량)의 디클로로메탄 용액(26 mL)에 트리에틸아민(0.401 mL, 2.90 mmol, 1.1 당량)을 첨가하고 상온에서 30분간 교반하였다. 물을 첨가하여 반응을 종료한 후 디클로로메탄으로 추출하고, 유기층을 포화 식염수로 세척한 후 황산나트륨으로 건조시켰다. 결과물을 농축하고 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(헥산:에틸 아세테이트 = 2:1)로 정제하여 화합물 4(1.17g, 89%)를 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3, ppm): δ7.96 (d, J = 7.8 Hz, 2H),7.76 (d, J = 7.3 Hz, 2H),7.64-7.57 (m, 3H),7.47 (dd, J = 7.6,8.0 Hz, 2H),7.40 (dd, J = 7.3,7.8 Hz, 2H),7.31 (ddd, J = 1.4,7.3,7.3 Hz, 2H),5.94-5.84 (m, 2H),5.33 (d, J = 16.9 Hz, 1H),5.24 (dd, J = 1.4,10.1 Hz, 1H),4.71-4.64 (m, 3H),4.40-4.38 (m, 2H),4.23 (dd, J = 6.9,6.9 Hz, 1H), 3.90 (s, 2H), 3.16-3.03 (m, 2H)
HRMS (FAB-TOF) m/z: [(M+H)+] calcd for C29H28N1O5S1 502.1688; found502.1690.
Figure pct00063
아르곤 스트림 하에 사염화탄소와 디클로로메탄을 1:1(4 mL), 화합물 4(204 mg, 0.401 mmol) 및 N-클로로숙시니미드(59.6 mg, 0.447 mmol, 1.1 당량)의 용액을 넣고 상온에서 1시간 동안 교반하였다. 물을 첨가하여 반응을 종료한 후, 디클로로메탄으로 추출하고, 유기층을 포화 식염수로 세척한 후, 황산나트륨으로 건조시켰다. 결과물을 농축하고 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(디클로로메탄만)로 정제하여 화합물 5(210 mg, 97%)를 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3, ppm): δ7.99 (d, J = 7.8 Hz, 2H), 7.76 (d, J = 7.3 Hz, 2H), 7.63-7.57 (m, 3H), 7.48 (dd, J = 7.8,7.8 Hz, 2H), 7.39 (dd, J = 7.3,7.8 Hz, 2H), 7.30 (ddd, J = 1.0,7.3,7.3 Hz, 2H), 6.37 (d, J = 25.6 Hz, 1H), 5.95-5.84 (m, 1H), 5.63-5.58 (m, 1H), 5.38-5.24 (m, 2H), 4.76-4.60 (m, 3H), 4.39 (d, J = 6.9 Hz, 2H), 4.21 (dd, J = 6.9,6.9 Hz, 1H), 3.51-3.14 (m, 2H)
HRMS (FAB-TOF) m/z: [(M+H)+] calcd for C29H27N1O5S2Cl1S1 536.1296; found 536.1298.
(Fmoc-알릴화된 클로로아세토페노일 시스테인과 Cys의 반응성)
합성된 Fmoc-알릴화된 클로로아세토페노일 시스테인(화합물 5)이 Cys의 티올과 반응성을 갖는지 여부는 다음과 같은 반응에 의해 시험하였다.
Figure pct00064
아르곤 스트림 하에서 화합물 5(59.0 mg, 0.110 mmol)와 Fmoc-Cys-OAlyl(0.046 mg, 0.121 mmol, 1.1 당량)의 디클로로메탄 용액(1.1 mL)에 트리에틸아민(0.017 mL, 0.121 mmol, 1.1 당량)을 첨가하고 상온에서 10분간 교반하였다. 물을 첨가하여 반응을 종료한 후, 디클로로메탄으로 추출하고, 유기층을 포화 식염수로 세척한 후, 황산나트륨으로 건조시켰다. 결과물을 농축하고 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(헥산:아세테이트 에틸 = 3:1)로 정제하여 화합물 6(93.8 mg, 97%)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3, ppm): δ7.96 (d, J = 7.8 Hz, 2H), 7.75 (dd, J = 2.7,7.8 Hz, 4H), 7.59-7.53 (m, 5H), 7.41 (dd, J = 7.8,7.8 Hz, 2H), 7.39-7.35 (m, 4H), 7.30-7.26 (m, 4H), 5.91-5.80 (m, 2H), 5.70 (dd, J = 7.8,22.0 Hz, 2H), 5.61 (s, 1H), 5.31 (d, J = 17.4 Hz, 2H), 5.22 (d, J = 11.6 Hz, 2H), 4.69-4.59 (m, 6H), 4.41-4.29 (m, 4H), 4.19 (dd, J = 7.3,7.3 Hz, 2H), 3.33-2.97 (m, 4H),
HRMS (FAB-TOF) m/z: [(M+Na)+] calcd for C50H46N2O9S2Na 905.2542; found 905.2542.
위의 결과로부터 Fmoc-알릴화된 클로로아세토페노일 시스테인(화합물 5)이 Cys의 티올과 반응성을 가짐을 알 수 있었으며, 반응의 진행은 반응식 B의 d단계에 나타낸 바와 같이 진행됨을 알 수 있었다. 이상의 결과로부터 화학식 B에서 새로운 가교 펩타이드의 합성이 가능함을 확인했다.
옥시토신의 가교
옥시토신(Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2(SEQ ID NO: 77), 분자 내 SS 결합, 분자량: 1007.19)의 가교는 1.1-디클로로아세톤으로 수행되었다. 하기 화학식 A로 표시되는 옥시토신 SS 산화형(옥시토신-OX)의 아세테이트(Toronto Research Chemicals 제조) 10mg(9.92μmol)을 0.1M HEPES-HCl 완충액(pH 8.0) 3mL에 용해시키고, 환원제로 TCEP 염산염(Tris(2-carboxyethyl)phosphine Hydrochloride) 1 mg(200 μmol)이 용해된 0.1M HEPES-HCl 완충액(pH 8.0) 10.2mL를 혼합하고 1시간 동안 교반하였다.
Figure pct00065
얻어진 반응 생성물을 LC-MS로 다음과 같이 분석하였다. 반응 생성물을 0.1 % 포름산으로 5 배 희석 한 후, 그 중 20 μL를 분석 하였다 (유속: 0.2mL/min, 용출: 0.1% 포름산을 함유한 4% CH3CN에서 70% CH3CN까지 선형 구배, 컬럼 온도: 25°C)를 펩타이드 BEH-C18 컬럼(130Å, 1.7μm, 2.1 × 100mm, Waters Corporation 제조)과 결합된 Acquity UPLC/SQ 검출기 시스템(Waters Corporation 제조)을 사용하여 분석하였다.
염산염을 첨가하기 전의 옥시토신-OX와 LC-MS로 분석된 반응 생성물의 각각의 결과는 도 5A 및 도 5B에 도시되어 있다. 옥시토신-OX에 할당된 피크의 질량 측정값은 1006.3으로, 옥시토신-OX에 대한 이론적 값인 1007.19와 거의 동일했다. 반면, 1.1-디클로로아세톤의 가교 반응에서 반응 생성물에 할당된 피크는 원래 피크 뒤에 용출되었고, 피크의 질량은 1060.4였다. 이 질량은 Fomula A1에 표시된 옥시토신-디클로로아세톤 가교 형태(옥시토신-DA)에 대한 이론적 값인 1063.26과 거의 동일하여 객관적인 구조를 갖는 가교 생성물을 얻을 수 있는 것으로 확인되었다.
Figure pct00066
바소프레신의 가교
바소프레신의 가교(Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Arg-Gly-NH2(SEQ ID NO: 78), 분자 내 SS 결합, 분자량: 1084.24)는 1.1-디클로로아세톤으로 수행되었다. 0.1 M 인산 완충제(pH 8.0) 1.65 mL에 바소프레신 SS 산화형(바소프레신-OX)의 아세테이트 5.5 mg(5.07 μmol)을 용해하였으며, 여기서 염산염 24.6 mg(0.86)이 혼합된 0.1 M 인산 완충제(PH 8.0) 4.4 mL를 Formula B로 표시하였다, 그리고 혼합물을 1시간 동안 저었다. 아세토니트릴 0.371 mL에 용해된 1,1-디클로로아세톤 1.42 mg(11.2 μmol)(바소프레신에 대한 몰비: 2.2)을 첨가하고 1시간 동안 교반하였다.
Figure pct00067
얻어진 반응 생성물을 실시예 11에서와 동일한 방식으로 LC-MS로 분석하였다. 염산염을 첨가하기 전의 바소프레신-OX와 LC-MS로 분석된 반응 생성물의 각각의 결과는 도 6A 및 도 6B에 도시되어 있다. 바소프레신-OX에 할당된 피크의 질량 측정값은 1083.7로, 바소프레신-OX에 대한 이론적 값인 1084.24와 거의 동일했다. 반면, 1.1-디클로로아세톤의 가교 반응에서 반응 생성물에 할당된 피크는 원래 피크 뒤에서 용출되었으며, 피크의 질량은 1139.0 및 1121.6이었다. 질량 1139.0은 다음 Formula B1에 표시된 바소프레신-디클로로아세톤 가교 형태(바소프레신-DA)에 대한 이론적 값인 1140.30과 거의 동일하여 객관적인 구조를 갖는 가교 생성물이 포함된 것으로 확인되었다. 한편, 1121.6의 질량은 1139.0보다 17.4만큼 작았고, 그 이유는 다음과 같이 추정된다: Formula B1에 표시된 바소프레신-DA는 TCEP와 환원 반응을 거쳤기 때문에 하기 Formula B2로 표시되는 바소프레신-디클로로아세톤-가교된 형태의 환원 생성물(바소프레신-DA-R)로 형성되었고, 탈수 반응을 거쳤으므로 Formula B3로 표시되는 바소프레신-디클로로아세톤-가교형의 환원/탈수형(바소프레신-DA-RDH, 질량의 이론값: 1124.3)으로 형성되었다.
Figure pct00068
Figure pct00069
Figure pct00070
옥시토신의 가교반응에 의한 프로테아제에 대한 내성 획득
가교반응에 의한 펩타이드의 안정성 평가를 위해, α-키모트립신(소 췌장 유래, MP Biomedicals 제조)의 프로테아제 분해에 대한 저항성을 2,2-디클로로아세토페논에 의해 가교된 옥시토신으로 평가하였다. 2,2-디클로로아세토페논에 의한 옥시토신의 가교는 실시예 11의 1.1-디클로로아세톤을 2,2-디클로로아세토페논으로 대체하는 것과 동일한 방식으로 수행되었고, 역상 HPLC로 객관적인 생성물을 채취하였다. 구체적으로, 옥시토신 아세테이트 10 mg (10 μmol)을 0.1 M HEPES 염산 완충액 (pH 8.0) 3 mL에 용해시키고, 용액을 57.4 mg (200 μmol) TCEP-HCl을 포함하는 0.1 M HEPES 염산 완충액 (pH 8.0) 2 mL와 혼합하고 혼합물을 1 시간 동안 교반하였다. 다음으로, 아세토니트릴 0.44mL에 용해된 2,2-디클로로아세토페논 8.3mg(44μmol)을 첨가하여 혼합하고, 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 결과 샘플을 LC-Forte(YMC 제조)에 연결된 InertSustain C18 컬럼(5μm, 14 × 250mm, GL Sciences 제조)에 적용하였다(유속 5mL/min). 용출은 4%에서 70%(0.1% 포름산 함유)의 선형 구배에서 수행되었다. 객관적인 생성물을 채취하고 음압에서 아세토니트릴을 제거한 후 동결 건조하였다.
옥시토신의 2,2-디클로로아세토페논 가교형태(옥시토신-DP)의 구조는 하기 Fomula A2로 표시된다.
Figure pct00071
옥시토신-OX와 하기 Fomula A3에 나타낸 옥시토신 SH 환원 형태(옥시토신-RD)를 비교 대상으로 하여 평가를 실시하였다. 즉, 옥시토신 용액을 0.1 M 인산 완충액(pH 7.0)에 0.5mg/mL로 용해하여 얻은 옥시토신 용액을 옥시토신-OX로, 0.5mg/mL의 TCEP를 함유한 0.1 M 인산 완충액(pH 7.0)에 용해하여 얻은 옥시토신 용액을 0.5mg/mL로 첨가하여 30분 경과 후 얻은 물질을 옥시토신-RD로 채택했다. 각 용액 200μL에 1mg/mL α-키모트립신 10μL(옥시토신에 대한 중량비 1/10)를 넣고 37°C에서 배양한 후 역상 HPLC로 분석했다. 블랭크의 경우 α-키모트립신 대신 인산 완충액을 첨가하였다.
0.5 mg/mL TCEP가 함유된 0.1 M 인산 완충액(pH 7.0)에 정제된 0.5 mg/mL 옥시토신-DP를 용해시킨 후 30분 경과 후에 얻은 물질을 시료로 채택하고, 유사한 α-키모트립신을 첨가하여 역상 HPLC로 분석하였다.
Figure pct00072
옥시토신-OX의 경우 15분 내지 2시간 경과 후에도 어떠한 피크의 변화도 관찰되지 않았으나, 도 7에 도시된 바와 같이, 옥시토신-RD의 경우에는 10분 후에 어떠한 피크도 사라졌으며, 도 8에 도시된 바와 같이 약 15분 정도 용출된 넓은 피크는 α-키모트립신에 할당된 피크로 간주되었다.
도 9는 역상 HPLC에 의해 옥시토신-DP로부터 제조된 시료의 용출 크로마토그램을 나타낸다. 여기서, 두 개의 피크, 피크 A 및 B가 나타났다. 질량 분석으로 질량을 분석한 결과, 피크 A의 질량은 1126.7이고 피크 B의 질량은 1106.5였다. 이는 하기 Fomula A4에 표시된 옥시토신-디클로로아세톤페논 가교 형태(옥시토신-DP)의 질량 이론 값인 1125.34와 거의 동일했으며, 환원 생성물(옥시토신-DP-R, 하기 Fomula A5)을 탈수하여 얻은 옥시토신-DP-RDH(하기 Fomula A6)의 질량 이론 값인 1109.33과도 일치하였다. 따라서 샘플은 옥시토신-DP와 옥시토신-DP-RDH의 혼합물이라는 것이 밝혀졌다. 이 시료에 α- 키모트립신을 1/10의 중량비에 해당하는 양으로 첨가하여 반응을 수행한 결과, α- 키모트립신을 첨가한 후에도 옥시토신-RD의 경우와 달리 옥시토신-OX의 경우와 같이 두 피크에서 감소가 관찰되지 않았다.
도 10은 α-키모트립신 첨가 후 각 분자의 종류에 따른 변화량을 관찰하기 위해 시간에 대한 블랭크의 피크 면적에 대한 상대값(%)을 플롯한 결과를 나타낸 도면이다. 옥시토신-RD는 α-키모트립신 첨가 직후 피크가 빠르게 사라져 프로테아제에 대한 내성이 매우 낮은 것으로 판단되는 반면, 옥시토신-OX는 이의 SS 가교 생성물로서 α-키모트립신 첨가에도 분해되지 않고 높은 프로테아제 내성을 가지고 있어 SS 결합에 의한 가교가 내성에 크게 기여하는 것으로 확인되었다. 한편, 디클로로아세톤페논 가교 형태(옥시토신-DP 및 옥시토신-DP-RDH)도 환원제 TCEP의 존재 하에서 α-키모트립신 소화에 대한 높은 저항성을 갖는 것으로 관찰되었다. 이는 본 가교 방법이 펩타이드의 안정성, 특히 프로테아제에 대한 내성(안정성)에 크게 기여할 수 있음을 나타낸다.
Figure pct00073
Figure pct00074
Figure pct00075
전술한 것은 설명의 목적을 위해 몇 가지 예시적인 실시예들을 설명한 것이다. 전술한 논의에서 구체적인 실시예들이 제시되었지만, 당업자는 본 발명의 광범위한 정신 및 범위를 벗어나지 않으면서도 형태 및 세부 사항에 변경이 이루어질 수 있음을 인식할 것이다. 따라서, 명세서 및 도면은 제한적인 의미보다는 예시적인 의미로 간주되어야 한다. 따라서, 본 상세한 설명은 제한적인 의미로 받아들여져서는 안 되며, 본 발명의 범위는 포함된 청구범위에 의해서만 정의되며, 그러한 청구범위에 기재된 균등범위 전체에 의해서만 정의된다.
본 출원은 2020년 11월 9일에 출원된 일본 특허출원 제2020-186833호 및 2021년 5월 14일에 출원된 일본 특허출원 제2021-82739호의 이익을 주장하며, 그 전체의 개시 내용은 여기에 참조로 통합되어 있다.
산업 적용성
본 발명은 펩타이드와 단백질의 가교에 유용하다.
<110> Kagoshima University <120> Peptide crosslinking agent and paptide crosslinked by the agent <130> 21F129-PCT <150> JP 2020-186833 <151> 2020-11-09 <150> JP 2021-082739 <151> 2021-05-14 <160> 78 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc binding peptide <400> 1 Gly Ser Gly Gly Ser Gly Pro Asp Cys Ala Tyr His Arg Gly Glu Leu 1 5 10 15 Val Trp Cys Thr Phe His 20 <210> 2 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc binding peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1) <223> X is G, A, V, L, I, M, P, F, W, K, Orn, C, D, E, Dpr, or 2-Aminooctanedioic acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2) <223> X is F,K,Orn,C,D,E,2-Aminooctanedioic acid, or Dpr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (27) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29) <223> X is R,H,D,E,S,T,N,Q,Y, or C <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31) <223> X is R,H,D,E,S,T,N,Q,Y, or C <400> 2 Xaa Xaa Asn Met Gln Cys Gln Arg Arg Phe Tyr 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<400> 7 Gly Pro Arg Cys Ala Tyr His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Ser Phe 1 5 10 15 His <210> 8 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG-BP <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8) <223> X is K, C, D, E, R, V, F, L, 2-Aminosuberic acid, Dpr, Orn, AcOrn, AcDab, Dab, Nle, Nva, Tle, Ala(t-Bu), or Cha <400> 8 Ser Pro Asp Cys Ala Tyr His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe 1 5 10 15 His <210> 9 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG-BP <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8) <223> X is K,C,D,E, R, 2-Aminosuberic acid, or Diaminopropionic acid <400> 9 Gly Asp Asp Cys Ala Tyr His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe 1 5 10 15 His <210> 10 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG-BP <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8) <223> X is K, C, D, E, R, V, F, L, 2-Aminosuberic acid, Dpr, Orn, AcOrn, AcDab, Dab, Nle, Nva, Tle, Ala(t-Bu), or Cha <400> 10 Gly Pro Ser Cys Ala Tyr His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe 1 5 10 15 His <210> 11 <211> 17 <212> PRT 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MISC_FEATURE <222> (8) <223> X is K, C, D, E, R, V, F, L, 2-Aminosuberic acid, Dpr, Orn, AcOrn, AcDab, Dab, Nle, Nva, Tle, Ala(t-Bu), or Cha <400> 14 Ser Pro Asp Cys Ala Tyr His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe 1 5 10 15 Tyr <210> 15 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG-BP <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8) <223> X is K, C, D, E, R, V, F, L, 2-Aminosuberic acid, Dpr, Orn, AcOrn, AcDab, Dab, Nle, Nva, Tle, Ala(t-Bu), or Cha <400> 15 Ser Asp Asp Cys Ala Tyr His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe 1 5 10 15 Tyr <210> 16 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG-BP <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8) <223> X is K, C, D, E, R, V, F, L, 2-Aminosuberic acid, Dpr, Orn, AcOrn, AcDab, Dab, Nle, Nva, Tle, Ala(t-Bu), or Cha <400> 16 Arg Gly Asn Cys Ala Tyr His Xaa Gly Gln Leu Val Trp Cys Thr Tyr 1 5 10 15 His <210> 17 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG-BP <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2) <223> X is homocysteine <220> <221> 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E, R, V, F, L, 2-Aminosuberic acid, Dpr, Orn, AcOrn, AcDab, Dab, Nle, Nva, Tle, Ala(t-Bu), or Cha <400> 23 Asp Cys Thr Tyr Thr Xaa Gly Asn Leu Val Trp Cys Thr 1 5 10 <210> 24 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG-BP <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6) <223> X is K, C, D, E, R, V, F, L, 2-Aminosuberic acid, Dpr, Orn, AcOrn, AcDab, Dab, Nle, Nva, Tle, Ala(t-Bu), or Cha <400> 24 Asp Cys Ala Tyr Thr Xaa Gly Asn Leu Val Trp Cys Thr 1 5 10 <210> 25 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG-BP <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6) <223> X is K, C, D, E, R, V, F, L, 2-Aminosuberic acid, Dpr, Orn, AcOrn, AcDab, Dab, Nle, Nva, Tle, Ala(t-Bu), or Cha <400> 25 Asp Cys Ser Tyr Thr Xaa Gly Asn Leu Val Trp Cys Thr 1 5 10 <210> 26 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG-BP <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6) <223> X is K, C, D, E, R, V, F, L, 2-Aminosuberic acid, Dpr, Orn, AcOrn, AcDab, Dab, Nle, Nva, Tle, Ala(t-Bu), or Cha <400> 26 Asp Cys Thr Trp Thr Xaa Gly Asn Leu Val Trp Cys Thr 1 5 10 <210> 27 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG-BP <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6) <223> X is K, C, D, E, R, V, F, L, 2-Aminosuberic acid, Dpr, Orn, AcOrn, AcDab, Dab, Nle, Nva, Tle, Ala(t-Bu), or Cha <400> 27 Asp Cys Thr Tyr His Xaa Gly Asn Leu Val Trp Cys Thr 1 5 10 <210> 28 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG-BP <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6) <223> X is K, C, D, E, R, V, F, L, 2-Aminosuberic acid, Dpr, Orn, AcOrn, AcDab, Dab, Nle, Nva, Tle, Ala(t-Bu), or Cha <400> 28 Asp Cys Thr Tyr Arg Xaa Gly Asn Leu Val Trp Cys Thr 1 5 10 <210> 29 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG-BP <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6) <223> X is K, C, D, E, R, V, F, L, 2-Aminosuberic acid, Dpr, Orn, AcOrn, AcDab, Dab, Nle, Nva, Tle, Ala(t-Bu), or Cha <400> 29 Asp Cys Thr Tyr Ser Xaa Gly Asn Leu Val Trp Cys Thr 1 5 10 <210> 30 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG-BP <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6) <223> X is K, C, D, E, R, V, F, L, 2-Aminosuberic acid, Dpr, Orn, AcOrn, AcDab, Dab, Nle, Nva, Tle, Ala(t-Bu), or Cha <400> 30 Asp Cys Thr Tyr Thr Xaa Gly Asn Leu Val Trp Cys Thr 1 5 10 <210> 31 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG-BP <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6) <223> X is K, C, D, E, R, V, F, L, 2-Aminosuberic acid, Dpr, Orn, AcOrn, AcDab, Dab, Nle, Nva, Tle, Ala(t-Bu), or Cha <400> 31 Asp Cys Thr Tyr Thr Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr 1 5 10 <210> 32 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG-BP <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6) <223> X is K, C, D, E, R, V, F, L, 2-Aminosuberic acid, Dpr, Orn, AcOrn, AcDab, Dab, Nle, Nva, Tle, Ala(t-Bu), or Cha <400> 32 Asp Cys Thr Tyr Thr Xaa Gly Arg Leu Val Trp Cys Thr 1 5 10 <210> 33 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG-BP <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6) <223> X is K, C, D, E, R, V, F, L, 2-Aminosuberic acid, Dpr, Orn, AcOrn, AcDab, Dab, Nle, Nva, Tle, Ala(t-Bu), or Cha <400> 33 Asp Cys Thr Tyr Thr Xaa Gly Asp Leu Val Trp Cys Thr 1 5 10 <210> 34 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG-BP <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6) <223> X is K, C, D, E, R, V, F, L, 2-Aminosuberic acid, Dpr, Orn, AcOrn, AcDab, Dab, Nle, Nva, Tle, Ala(t-Bu), or Cha <400> 34 Asp Cys Thr Tyr Thr Xaa Gly Asn Leu Ile Trp Cys Thr 1 5 10 <210> 35 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG-BP <400> 35 Asp Cys Ala Tyr His Arg Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr 1 5 10 <210> 36 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG-BP <400> 36 Gly Pro Asp Cys Ala Tyr His Arg Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe 1 5 10 15 His <210> 37 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG-BP <400> 37 Arg Cys Ala Tyr His Arg Gly Glu Leu Val Trp Cys Ser 1 5 10 <210> 38 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG-BP <400> 38 Gly Pro Arg Cys Ala Tyr His Arg Gly Glu Leu Val Trp Cys Ser Phe 1 5 10 15 His <210> 39 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG-BP <400> 39 Ser Pro Asp Cys Ala Tyr His Arg Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe 1 5 10 15 His <210> 40 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG-BP <400> 40 Gly Asp Asp Cys Ala Tyr His Arg Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe 1 5 10 15 His <210> 41 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG-BP <400> 41 Gly Pro Ser Cys Ala Tyr His Arg Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe 1 5 10 15 His <210> 42 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG-BP <400> 42 Gly Pro Asp Cys Ala Tyr His Arg Gly Glu Leu Val Trp Cys Ser Phe 1 5 10 15 His <210> 43 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG-BP <400> 43 Gly Pro Asp Cys Ala Tyr His Arg Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr His 1 5 10 15 His <210> 44 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG-BP <400> 44 Gly Pro Asp Cys Ala Tyr His Arg Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe 1 5 10 15 Tyr <210> 45 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG-BP <400> 45 Ser Pro Asp Cys Ala Tyr His Arg Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe 1 5 10 15 Tyr <210> 46 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG-BP <400> 46 Ser Asp Asp Cys Ala Tyr His Arg Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe 1 5 10 15 Tyr <210> 47 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG-BP <400> 47 Asp Cys Thr Tyr His Arg Gly Asn Leu Val Trp Cys Thr 1 5 10 <210> 48 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG-BP <400> 48 Asp Cys Ala Tyr His Arg Gly Asn Leu Val Trp Cys Thr 1 5 10 <210> 49 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG-BP <400> 49 Asp Cys Thr Tyr His Arg Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr 1 5 10 <210> 50 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG-BP <400> 50 Asp Cys Ala Trp His Arg Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr 1 5 10 <210> 51 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG-BP <400> 51 Asp Cys Thr Tyr Thr Asn Gly Asn Leu Val Trp Cys Thr 1 5 10 <210> 52 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG-BP <400> 52 Asp Cys Ala Tyr Thr Asn Gly Asn Leu Val Trp Cys Thr 1 5 10 <210> 53 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG-BP <400> 53 Asp Cys Ser Tyr Thr Asn Gly Asn Leu Val Trp Cys Thr 1 5 10 <210> 54 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG-BP <400> 54 Asp Cys Thr Trp Thr Asn Gly Asn Leu Val Trp Cys Thr 1 5 10 <210> 55 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG-BP <400> 55 Asp Cys Thr Tyr His Asn Gly Asn Leu Val Trp Cys Thr 1 5 10 <210> 56 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG-BP <400> 56 Asp Cys Thr Tyr Arg Asn Gly Asn Leu Val Trp Cys Thr 1 5 10 <210> 57 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG-BP <400> 57 Asp Cys Thr Tyr Ser Asn Gly Asn Leu Val Trp Cys Thr 1 5 10 <210> 58 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG-BP <400> 58 Asp Cys Thr Tyr Thr Arg Gly Asn Leu Val Trp Cys Thr 1 5 10 <210> 59 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG-BP <400> 59 Asp Cys Thr Tyr Thr Asn Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr 1 5 10 <210> 60 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG-BP <400> 60 Asp Cys Thr Tyr Thr Asn Gly Arg Leu Val Trp Cys Thr 1 5 10 <210> 61 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG-BP <400> 61 Asp Cys Thr Tyr Thr Asn Gly Asp Leu Val Trp Cys Thr 1 5 10 <210> 62 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG-BP <400> 62 Asp Cys Thr Tyr Thr Asn Gly Asn Leu Ile Trp Cys Thr 1 5 10 <210> 63 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG-BP <400> 63 Phe Asn Met Gln Cys Gln Arg Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp Pro 1 5 10 15 Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Arg Ile Arg Ser Ile Arg Asp 20 25 30 Asp Cys <210> 64 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG-BP <400> 64 Gly Phe Asn Met Gln Cys Gln Arg Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp 1 5 10 15 Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Arg Ile Arg Ser Ile Arg 20 25 30 Asp Asp Cys 35 <210> 65 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG-BP <400> 65 Lys Asn Met Gln Cys Gln Arg Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp Pro 1 5 10 15 Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Arg Ile Arg Ser Ile Arg Asp 20 25 30 Asp Cys <210> 66 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG-BP <400> 66 Gly Phe Asn Met Gln Cys Gln Lys Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp 1 5 10 15 Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Arg Ile Arg Ser Ile Arg 20 25 30 Asp Asp Cys 35 <210> 67 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG-BP <400> 67 Lys Asn Met Gln Cys Gln Lys Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp Pro 1 5 10 15 Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Arg Ile Arg Ser Ile Arg Asp 20 25 30 Asp Cys <210> 68 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG-BP <400> 68 Phe Asn Met Gln Gln Gln Arg Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp Pro 1 5 10 15 Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Arg Ile Arg Ser Ile Arg Asp 20 25 30 Asp <210> 69 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG-BP <400> 69 Gly Lys Asn Met Gln Cys Gln Arg Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp 1 5 10 15 Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Arg Ile Arg Ser Ile Arg 20 25 30 Asp Asp Cys 35 <210> 70 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc binding peptide <400> 70 Cys Ala Trp His Leu Gly Glu Leu Val Trp Cys 1 5 10 <210> 71 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc binding peptide <400> 71 Asp Cys Ala Trp His Leu Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr 1 5 10 <210> 72 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc binding peptide <400> 72 Asp Cys Ala Trp His Leu Gly Glu Leu Val Phe Cys Thr 1 5 10 <210> 73 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc binding peptide <400> 73 Asp Cys Ala Trp His Leu Gly Glu Leu Val 1 5 10 <210> 74 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc binding peptide <400> 74 Cys Asp Cys Ala Trp His Leu Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Cys 1 5 10 15 <210> 75 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc binding peptide <400> 75 Cys Ala Tyr His Leu Gly Glu Leu Val Trp Cys 1 5 10 <210> 76 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc binding peptide <400> 76 Asp Cys Ala Tyr His Leu Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe 1 5 10 <210> 77 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 77 Cys Tyr Ile Gln Asn Cys Pro Leu Gly 1 5 <210> 78 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 78 Cys Tyr Phe Gln Asn Cys Pro Arg Gly 1 5

Claims (33)

  1. 하기 화학식 (I)로 표시되는 단백질 또는 펩타이드용 가교제로서,
    [화학식 1]
    Figure pct00076

    상기 A는 수소 원자, 선택적으로 페닐기 또는 할로겐 원자로 치환된 C1 내지 6 알킬기, 또는 페닐기인 것을 특징으로 하는 단백질 또는 펩타이드용 가교제
  2. 단일 또는 분리된 단백질(들) 또는 펩타이드(들) 내에서 적어도 2개의 티올기가 하기 화학식으로 표시된 대로 결합된 가교 단백질 또는 펩타이드를 제조하는 방법으로,
    [화학식 2]
    Figure pct00077

    [상기 A는 수소 원자, 선택적으로 페닐기 또는 할로겐 원자, 페닐기 또는 C1 내지 6 알킬기로 치환된 C1 내지 6 알킬기이고, 단백질/펩타이드는 단백질 또는 펩타이드를 나타내며, 단백질/펩타이드 A 그리고 단백질/펩타이드 B는 선택적으로 동일하거나 상이하다]
    제1항에 따른 가교제와 상기 단백질 또는 상기 펩타이드를 반응시켜, 하기 그룹을 통해 두 티올기를 결합시키는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 가교 단백질 또는 펩타이드의 제조 방법.
    [화학식 3]
    Figure pct00078

    [상기 A는 수소 원자, 선택적으로 페닐기 또는 할로겐 원자로 치환된 C1 내지 6 알킬기, 페닐기, 또는 C1 내지 6 알킬기]
  3. 제2항에 있어서, 상기 단백질 또는 상기 펩타이드는 적어도 2개의 티올기의 전부 또는 일부가 이황화 결합을 형성하는 단백질 또는 펩타이드이고, 상기 이황화 결합을 환원시켜 2개의 티올기를 생성하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제2항 또는 제3항의 방법으로 상기 단백질 또는 상기 펩타이드 내의 티올기를 결합시켜 가교 단백질 또는 펩타이드를 얻는 것을 포함하는, 단백질 또는 펩타이드의 내알칼리성을 향상시키는 방법.
  5. 하기 화학식으로 표시되는 반응성 작용기에 결합된 단백질 또는 펩타이드 제조 방법으로,
    [화학식 4]
    Figure pct00079

    [상기 A는 수소 원자, 선택적으로 페닐기 또는 할로겐 원자, 페닐기 또는 C1 내지 6 알킬기로 치환된 C1 내지 6 알킬기이고, 단백질/펩타이드는 단백질 또는 펩타이드를 나타내며, 단백질/펩타이드 A그리고 단백질/펩타이드 B는 선택적으로 동일하거나 상이하고, L은 링커를 나타내고 Z는 상기 반응성 작용기를 나타낸다]
    제2항 또는 제3항에 따른 방법에 의해 상기 가교 단백질 또는 펩타이드를 얻는 단계; 및
    얻어진 가교 단백질 또는 펩타이드를 NH2-L-Z(L은 링커를 나타내고, Z는 상기 반응성 작용기를 나타낸다)와 반응시켜, 상기 가교 단백질 또는 펩타이드의 가교된 부분에 반응성 작용기를 도입하는 단계를 포함하는 방법.
  6. 하기 화학식으로 표시되는 반응성 작용기에 결합된 단백질(들) 또는 펩타이드(들)의 제조 방법으로,
    [화학식 5]
    Figure pct00080

    [상기 A는 수소 원자, 선택적으로 페닐기 또는 할로겐 원자, 페닐기 또는 C1 내지 6 알킬기로 치환된 C1 내지 6 알킬기이고, 단백질/펩타이드는 단백질 또는 펩타이드를 나타내며, 단백질/펩타이드 A그리고 단백질/펩타이드 B는 선택적으로 동일하거나 상이함, L은 링커를 나타내고 Z는 상기 반응성 작용기를 나타낸다]
    하기 화학식으로 표시되는 가교 단백질(들) 또는 펩타이드(들)를 반응시키는 단계; 및
    [화학식 6]
    Figure pct00081

    [상기 A는 수소 원자, 선택적으로 페닐기 또는 할로겐 원자, 페닐기 또는 C1 내지 6 알킬기로 치환된 C1 내지 6 알킬기이고, 단백질/펩타이드는 단백질 또는 펩타이드를 나타내며, 단백질/펩타이드 A그리고 단백질/펩타이드 B는 선택적으로 동일하거나 상이하다]
    NH2-L-Z(L은 링커를 나타내고, Z는 상기 반응성 작용기를 나타낸다)를 반응시켜 가교 단백질(들) 또는 펩타이드(들)의 가교된 부분에 상기 반응성 작용기를 도입하는 것을 포함하는 방법.
  7. 하기 화학식으로 표시되는 단백질(들) 또는 펩타이드(들)와 약물의 복합체를 제조하는 방법으로,
    [화학식 7]
    Figure pct00082

    [상기 A는 수소 원자, 선택적으로 페닐기 또는 할로겐 원자, 페닐기 또는 C1 내지 6 알킬기로 치환된 C1 내지 6 알킬기이고, 단백질/펩타이드는 단백질 또는 펩타이드를 나타내며, 단백질/펩타이드 A그리고 단백질/펩타이드 B는 선택적으로 동일하거나 상이하고, L은 링커를 나타내고 D 는 상기 약물을 나타낸다]
    제5항 또는 제6항에 따른 방법에 의해 반응성 작용기에 결합된 단백질(들) 또는 펩타이드(들)를 얻는 단계; 및
    반응성 작용기에 결합하여 얻어진 단백질(들) 또는 펩타이드(들) 그리고 반응성 작용기와 반응하는 다른 작용기를 갖는 약물을 반응시켜, 약물을 상기 가교 단백질(들) 또는 펩타이드(들)의 가교된 부분에 상기 약물을 결합시키는 단계를 포함하는 방법.
  8. 하기 화학식으로 표시되는 단백질(들) 또는 펩타이드(들)와 약물의 복합체를 제조하는 방법으로,
    [화학식 8]
    Figure pct00083

    [상기 A는 수소 원자, 선택적으로 페닐기 또는 할로겐 원자, 페닐기 또는 C1 내지 6 알킬기로 치환된 C1 내지 6 알킬기이고, 단백질/펩타이드는 단백질 또는 펩타이드를 나타내며, 단백질/펩타이드 A그리고 단백질/펩타이드 B는 선택적으로 동일하거나 상이하고, L은 링커를 나타내고 D 는 상기 약물을 나타낸다]
    하기 화학식으로 표시되는 반응성 작용기에 결합된 단백질(들) 또는 펩타이드(들)를 반응시키는 단계; 및
    [화학식 9]
    Figure pct00084

    [상기 A는 수소 원자, 선택적으로 페닐기 또는 할로겐 원자, 페닐기 또는 C1 내지 6 알킬기로 치환된 C1 내지 6 알킬기이고, 단백질/펩타이드는 단백질 또는 펩타이드를 나타내며, 단백질/펩타이드 A그리고 단백질/펩타이드 B는 선택적으로 동일하거나 상이함, L은 링커를 나타내고 Z는 상기 반응성 작용기를 나타낸다]
    반응성 작용기와 반응하는 다른 작용기를 갖는 약물을 반응시켜 상기 가교 단백질(들) 또는 펩타이드(들)의 가교된 부분에 상기 약물을 결합시키는 단계를 포함하는 방법.
  9. 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 링커는 단백질 분해 효소에 의해 절단 가능한 부분을 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제2항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질 또는 상기 펩타이드는 5 내지 50개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드인 방법.
  11. 제2항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가교용 티올기는 단일 단백질 또는 펩타이드에 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 단백질 또는 펩타이드는 Fc-결합 펩타이드인 방법.
  13. 제2항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가교용 티올기는 분리된 단백질 또는 펩타이드에 존재하는 방법.
  14. 하기 화학식으로 표시되는 가교 단백질(들) 또는 펩타이드(들).
    [화학식 10]
    Figure pct00085

    [상기 A는 수소 원자, 선택적으로 페닐기 또는 할로겐 원자, 페닐기 또는 C1 내지 6 알킬기로 치환된 C1 내지 6 알킬기이고, 단백질/펩타이드는 단백질 또는 펩타이드를 나타내며, 단백질/펩타이드 A 그리고 단백질/펩타이드 B는 선택적으로 동일하거나 상이하다]
  15. 하기 화학식으로 표시되는 반응성 작용기에 결합한 단백질(들) 또는 펩타이드(들).
    [화학식 11]
    Figure pct00086

    [상기 A는 수소 원자, 선택적으로 페닐기 또는 할로겐 원자, 페닐기 또는 C1 내지 6 알킬기로 치환된 C1 내지 6 알킬기이고, 단백질/펩타이드는 단백질 또는 펩타이드를 나타내며, 단백질/펩타이드 A 그리고 단백질/펩타이드 B는 선택적으로 동일하거나 상이하고, L은 링커를 나타내고 Z는 상기 반응성 작용기를 나타낸다]
  16. 하기 화학식으로 표시되는 단백질(들) 또는 펩타이드(들)와 약물의 복합체.
    [화학식 12]
    Figure pct00087

    [상기 A는 수소 원자, 선택적으로 페닐기 또는 할로겐 원자, 페닐기 또는 C1 내지 6 알킬기로 치환된 C1 내지 6 알킬기이고, 단백질/펩타이드는 단백질 또는 펩타이드를 나타내며, 단백질/펩타이드 A그리고 단백질/펩타이드 B는 선택적으로 동일하거나 상이하고, L은 링커를 나타내고, D 는 상기 약물을 나타낸다]
  17. 제14항에 따른 상기 단백질(들) 또는 상기 펩타이드(들), 제15항에 따른 상기 단백질(들) 또는 펩타이드(들), 또는 제16항에 따른 상기 복합체에 있어서, 상기 링커는 단백질 분해 효소에 의해 절단될 수 있는 부분을 포함하는 링커.
  18. 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질 또는 상기 펩타이드는 5 내지 50 아미노산으로 이루어진 펩타이드인 것을 특징으로 하는 상기 단백질, 상기 펩타이드 또는 상기 복합체.
  19. 제14항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가교용 티올기가 단일 단백질 또는 펩타이드에 존재하는 것인 상기 단백질, 상기 펩타이드 또는 상기 복합체.
  20. 제19항에 있어서, 상기 단백질 또는 상기 펩타이드가 Fc-결합 펩타이드인 상기 단백질, 상기 펩타이드 또는 상기 복합체.
  21. 제20항에 있어서, 라이신 잔기, 시스테인 잔기, 아스파라긴산 잔기, 글루탐산 잔기, 2-아미노수베르산, 디아미노프로피온산, 아르기닌 잔기 또는 Fc-결합 펩타이드의 1-위치에 있는 아미노산의 아미노기는 DSG(disuccinimidyl glutarate), DSS(disuccinimidyl suberate), DMA(dimethyl adipimidate dihydrochloride), DMP(dimethyl pimelimidate dihydrochloride), DMS(dimethyl suberimidate dihydrochloride), DTBP (dimethyl 3,3'-dithiobispropionimidate dihydrochloride), 또는 DSP(dithiobis(succinimidyl propionic acid))로 변형되는 상기 단백질, 상기 펩타이드 또는 상기 복합체.
  22. 제14항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가교용 티올기는 분리된 단백질 또는 펩타이드에 존재하는 상기 단백질, 상기 펩타이드 또는 상기 복합체.
  23. 제20항 또는 제21항에 따른 IgG-Fc 영역 함유 분자와 상기 단백질, 상기 펩타이드 또는 상기 복합체를 접촉시키는 단계를 포함하는, 가교 Fc-결합 펩타이드(들)에 결합한 IgG-Fc 영역 함유 분자의 제조 방법.
  24. 가교 Fc-결합 펩타이드(들)에 결합한 IgG-Fc 영역 함유 분자를 제조하는 방법으로,
    제 1 항에 따른 가교제와 IgG-Fc 영역 함유 분자에 결합된 Fc-결합 펩타이드를 반응시켜, 하기의 기(group)를 통해 상기 Fc-결합 펩타이드의 두 티올 기를 결합시키는 단계를 포함하는 방법.
    [화학식 13]
    Figure pct00088

    [상기 A는 수소 원자, 선택적으로 페닐기 또는 할로겐 원자로 치환된 C1 내지 6 알킬기, 페닐기, 또는 C1 내지 6 알킬기]
  25. 반응성 작용기 Z를 갖는 Fc-결합 펩타이드에 결합한 IgG-Fc 영역 함유 분자 제조 방법으로,
    상기 Fc-결합 펩타이드는 하기 화학식으로 표시되고,
    [화학식 14]
    Figure pct00089

    [상기 A는 수소 원자, 선택적으로 페닐기 또는 할로겐 원자, 페닐기 또는 C1 내지 6 알킬기로 치환된 C1 내지 6 알킬기이고, L은 링커를 나타내고 Z는 상기 반응성 작용기를 나타낸다]
    하기 화학식으로 표시되는 가교 Fc-결합 펩타이드에 결합한 IgG-Fc 영역 함유 분자를 반응시키는 단계; 및
    [화학식 15]
    Figure pct00090

    [상기 A는 수소 원자, 선택적으로 페닐기 또는 할로겐 원자, 페닐기 또는 C1 내지 6 알킬기로 치환된 C1 내지 6 알킬기]
    NH2-L-Z(L은 링커를 나타내고, Z는 상기 반응성 작용기를 나타낸다)를 반응시켜 가교 Fc-결합 펩타이드에 가교된 부분에 상기 반응성 작용기를 도입하는 것을 포함하는 방법.
  26. 하기 화학식으로 표시되는 약물 D를 갖는 Fc-결합 펩타이드에 결합한 IgG-Fc 영역 함유 분자 제조 방법으로,
    [화학식 16]
    Figure pct00091

    하기 화학식으로 표시되는 반응성 작용기 Z를 갖는 Fc-결합 펩타이드(들)에 결합한 IgG-Fc 영역 함유 분자를 반응시키는 단계; 및
    [화학식 17]
    Figure pct00092

    [상기 A는 수소 원자, 선택적으로 페닐기 또는 할로겐 원자, 페닐기 또는 C1 내지 6 알킬기로 치환된 C1 내지 6 알킬기이고, L은 링커를 나타내고 Z는 상기 반응성 작용기를 나타낸다]
    반응성 작용기Z와 반응하는 다른 작용기를 갖는 약물을 반응시켜 가교 단백질 또는 펩타이드의 가교된 부분에 상기 약물을 결합시키는 단계를 포함하는 방법.
  27. 제23항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Fc-결합 펩타이드 및 상기 IgG-Fc 영역 함유 분자를 공유 결합시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  28. 제20항 또는 제21항에 따른 상기 단백질, 상기 펩타이드 또는 상기 복합체가 결합된 IgG-Fc 영역 함유 분자.
  29. 제28항에 있어서, 상기 Fc-결합 펩타이드 및 상기 IgG-Fc 영역 함유 분자는 공유 결합된 분자.
  30. 제20항 또는 제21항에 따른 상기 펩타이드가 결합된 운반체.
  31. 제 30항에 따른 운반체와 IgG-Fc 영역 함유 분자를 포함하는 액체를 접촉시키는 단계;
    세척을 통해 운반체에 결합되지 않는 구성 요소를 제거하는 단계; 및
    IgG-Fc 영역 함유 분자를 회수하기 위해 운반체에 결합된 구성 요소를 용출시키는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 IgG-Fc 영역 함유 분자의 정제 방법.
  32. 하기 화학식으로 표시되는 단백질 또는 펩타이드가 적어도 두 티올기가 결합된 가교 단백질 또는 펩타이드의 제조 방법으로,
    [화학식 18]
    Figure pct00093

    [상기 A는 수소 원자, 선택적으로 페닐기 또는 할로겐 원자, 페닐기 또는 C1 내지 6 알킬기로 치환된 C1 내지 6 알킬기이고, 단백질/펩타이드는 단백질 또는 펩타이드를 나타낸다]
    Fmoc 방법에 의한 상기 단백질 또는 펩타이드를 합성하는 단계; 및
    상기 합성에서 적어도 하나의 시스테인 잔기 대신에 하기 화학식으로 표시되는 화합물을 사용하는 단계를 포함하는 방법.
    [화학식 19]
    Figure pct00094
  33. 하기 화학식으로 표시되는 반응성 작용기에 결합한 단백질 또는 펩타이드의 제조 방법으로,
    [화학식 20]
    Figure pct00095

    [상기 A는 수소 원자, 선택적으로 페닐기 또는 할로겐 원자, 페닐기, 또는 C1 내지 6 알킬기로 치환된 C1 내지 6 알킬기이고, 단백질/펩타이드는 단백질 또는 펩타이드를 나타내며, L은 링커를 나타내고, Z는 상기 반응성 작용기를 나타내고 D는 약물을 나타낸다]
    Fmoc 방법에 의한 상기 단백질 또는 펩타이드를 합성하는 단계; 및
    상기 합성에서 적어도 하나의 시스테인 잔기 대신에 하기 화학식으로 표시되는 화합물을 사용하는 단계를 포함하는 단백질 또는 펩타이드의 제조 방법.
    [화학식 21]
    Figure pct00096

KR1020237018809A 2020-11-09 2021-10-22 펩타이드 가교제 및 상기 가교제를 이용하여 가교된 가교 펩타이드 KR20230107276A (ko)

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