KR20210020015A - 항체에 대한 친화성 물질 및 생체 직교성 관능기를 갖는 화합물 또는 이의 염 - Google Patents

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Abstract

본 발명은, 항체의 수식, 특히, 항체의 위치 선택적인 수식을 가능하게 하는 기술을 제공한다. 보다 구체적으로는, 본 발명은, 하기 화학식 I:
A-L-E-B (I)
〔식 중,
　A는 항체에 대한 친화성 물질이고,
　L은 이탈기를 포함하는 2가의 기이고,
　E는 (i) 상기 이탈기와 연결되어 있고, 또한 (ii) 상기 항체 중의 친핵기와 반응하는 능력을 갖는 친전자기를 포함하는 2가의 기이고,
　B는 생체 직교성 관능기이고,
　상기 이탈기는 상기 친핵기와 상기 친전자기 사이의 반응에 의해 E로부터 절단되어 이탈하는 능력을 갖는다.〕로 표시되는, 항체에 대한 친화성 물질 및 생체 직교성 관능기를 갖는 화합물 또는 이의 염 등을 제공한다.

Description

항체에 대한 친화성 물질 및 생체 직교성 관능기를 갖는 화합물 또는 이의 염
본 발명은 항체에 대한 친화성 물질 및 생체 직교성 관능기를 갖는 화합물 또는 이의 염 등에 관한 것이다.
최근, 항체 약물 복합체(Antibody-Drug Conjugate: ADC)의 연구 개발이 활발하게 행해지고 있다. ADC는 그 이름과 같이, 항체에 약물(예, 항암제)을 콘쥬게이션(conjugation)한 약제이며, 암세포 등에 대하여 직접적인 살세포 활성을 갖는다. 대표적인 ADC로서는, T-DM1(상품명: 캐싸일라(KADCYLA)(등록 상표))이 있다(비특허문헌 1 내지 3).
T-DM1을 비롯한 ADC는, 개발 당초부터 그 불균일성이 문제가 되고 있다. 즉, 항체 중에 70 내지 80정도 있는 Lys 잔기에 대하여, 저분자 약물을 랜덤으로 반응시키고 있기 때문에, 약물 항체비(Drug/Antibody Ratio: DAR)나 콘쥬게이션 위치가 일정하지 않다. 통상 이러한 랜덤 콘쥬게이션법이 되면 DAR이 0 내지 8의 범위가 되어, 약물의 결합수가 다른 복수의 약제가 생기는 것을 알 수 있다. 최근 ADC의 약물의 결합수 및 결합 위치를 변화시키면, 체내 동태나 약물의 방출 속도, 효과가 변화하는 것이 보고되고 있다. 이러한 점에서 차세대형 ADC에서는 콘쥬게이션하는 약물의 개수와 위치를 제어하는 것이 요구되고 있다. 개수 및 위치가 일정하면, 기대대로의 efficacy, 콘쥬게이션 약제의 베리에이션, 로트 차 이른바 레귤레이션의 문제가 해결될 것으로 생각되고 있다(비특허문헌 4).
항체의 위치 선택적 수식법은 세계적으로 연구되고 있지만, 그 대부분이 유전자 공학적 수법 또는 효소를 사용한 수식법이다. 유전자 공학적 수식법에 관해서는, 위치 선택성, 개수 선택성은 제어할 수 있지만, 항체 자체의 발현 효율이 저하(ADC를 조제할 때의 총 수율이 저하)하는 등의 문제가 지적되고 있다. 또한, 항체 발현계의 구축 등에 오랜 세월을 요한다는 것이 문제가 되고 있다(비특허문헌 5 내지 7).
또한, 소분자 프로브를 이용하여 세포 내와 같은 협잡(夾雜; 쓸데 없는 것이 뒤섞임)한 환경 하에서 단백질을 화학 수식하는 방법이 최근 보고되고 있다. 본 수법은, 이미징이나 저분자 약물의 리포지셔닝을 행하는데 있어서 수용체의 동정(同定) 등에 이용되고 있다. 또한, 케미컬 바이올로지 분야에 있어서, 합성 소분자 프로브를 사용한 유기 화학적인 단백질 수식법이 주목받고 있다(비특허문헌 8 내지 11).
최근, CCAP(Chemical Conjugation by Affinity Peptide)법이 개발되었다. 본 방법은, 친화성 펩타이드(Affinity Peptide)에 대하여 NHS 활성화 에스테르 및 약물이 연결된 펩타이드 시약을 항체와 반응시키는 방법(즉, 펩타이드 부분을 포함하는 링커를 개재한 ADC의 제작 방법)에 의해, 항체의 위치 선택적인 수식에 성공하고 있다. 이 방법은 세계에서 처음으로, 화학 합성적 수법에 의해, 약물로 항체 Fc 영역을 위치 선택적으로 수식하는 것에 성공한 것이며, 게다가 실용상에서도 양호한 결과〔반응 시간 30분, 수율 70%(DAR 1의 경우), 위치 선택성 100%〕가 확인되고 있다. 펩타이드 시약을 5등량 정도 추가함으로써, DAR을 2로 제어할 수 있는 것이 실증되어 있고, 수식 위치도 제어할 수 있는 점에서 획기적이다(특허문헌 1).
특허문헌 1: 국제공개 제2016/186206호
비특허문헌 1: Reichert JM et al., Nat Biotechnol 2005;23:1073-8 비특허문헌 2: Kubota T et al., Cancer Sci 2009;100:1566-72 비특허문헌 3: Wu AM et al., Nat Biotechnol 2005;23:1137-46 비특허문헌 4: Junutula JR et al., Nat Biotechnol 2008;26:925-32 비특허문헌 5: Shen BQ et al., Nat Biotechnol 2012;30:184-9 비특허문헌 6: Hoffer T et al., Biochemistry 2009;48:12047-57 비특허문헌 7: Liu W et al., Nat Methods 2007;4:239-44 비특허문헌 8: S. T. Laughlin et al., Science 2008;320, 664 비특허문헌 9: A. E. Speers et al., ChemBioChem 2004; 5, 41 비특허문헌 10: Y. Takaoka et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2013;52, 4088 비특허문헌 11: S. Fujishima et al., J. Am. Chem. Soc, 2012;134:3961-6
본 발명은 항체의 수식, 특히, 항체의 위치 선택적인 수식을 가능하게 하는 기술을 개발하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은, 예의 검토한 결과, A-L-E라는 구조 단위 (여기서, A는 항체에 대한 친화성 물질이고, L은, 소정의 이탈기를 포함하는 2가의 기이고, E는 (i) 상기 이탈기와 연결되어 있고, 또한 (ii) 상기 항체 중의 친핵기(求核基)와 반응하는 능력을 갖는 친전자기(求電子基)를 포함하는 2가의 기이다.)를 갖는 화합물 또는 이의 염이, 항체의 위치 특이적인 수식에 유용하다는 것을 발견했다. 예를 들어, 화학식 I로 나타나는, 항체에 대한 친화성 물질 및 생체 직교성 관능기를 갖는 소정의 화합물이, 항체의 위치 특이적인 수식에 유용하다는 것이 발견되었다(예, 도 1, 각종 실시예). 또한, 화학식 IV로 나타나는, 항체에 대한 친화성 물질 및 기능성 물질을 갖는 화합물 또는 이의 염이, 항체의 위치 특이적인 수식에 유용하다는 것이 발견되었다(예, 실시예 13, 14). 본 발명자들은 또한, 이러한 화합물을 사용함으로써, 펩타이드 부분을 링커로서 포함하지 않은, 기능성 물질(예, 약물)을 위치 선택적으로 갖는 항체(항체 약물 복합체(ADC))를 조제할 수 있는 것 등을 발견했다. 잠재적인 면역원성을 갖고, 또한 혈중에서 가수 분해되기 쉬운 펩타이드 부분을 포함하는 링커의 사용의 회피는, ADC의 임상 응용에 있어서 요망되는 것이다. 즉, 본 발명자들이 개발한 방법에 의하면, 화학 합성적 수법에 의해, 게다가 펩타이드 부분을 포함하는 링커를 사용하지 않고, 약물로 항체 Fc 영역을 위치 선택적으로 수식할 수 있다.
즉, 본 발명은, 이하와 같다.
〔1〕하기 화학식 I로 표시되는, 항체에 대한 친화성 물질 및 생체 직교성 관능기를 갖는 화합물 또는 이의 염:
[화학식 I]
A-L-E-B (I)
식 중,
A는 항체에 대한 친화성 물질이고,
L은 이탈기를 포함하는 2가의 기이고,
E는 (i) 상기 이탈기와 연결되어 있고, 또한 (ii) 상기 항체 중의 친핵기와 반응하는 능력을 갖는 친전자기를 포함하는 2가의 기이고,
B는 생체 직교성 관능기이고,
상기 이탈기는 상기 친핵기와 상기 친전자기 사이의 반응에 의해 E로부터 절단되어 이탈하는 능력을 갖는다.
〔2〕 상기 친화성 물질이 펩타이드인, 〔1〕의 화합물 또는 이의 염.
〔3〕 상기 펩타이드가 모노클로날 항체의 정상 영역에 대한 결합능을 갖는 펩타이드인, 〔2〕의 화합물 또는 이의 염.
〔4〕 상기 펩타이드가 모노클로날 항체의 Fc 영역에 대한 결합능을 갖는 펩타이드인, 〔2〕 또는 〔3〕의 화합물 또는 이의 염.
〔5〕 상기 펩타이드가 IgG의 Fc 영역에 대한 결합능을 갖는 펩타이드인, 〔4〕의 화합물 또는 이의 염.
〔6〕 상기 펩타이드가 10 내지 40의 아미노산 잔기를 갖는, 〔2〕 내지 〔5〕 중 어느 하나의 화합물 또는 이의 염.
〔7〕 상기 펩타이드가,
(a) (a-1-1) FNMQQQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDD (서열 번호 11)의 아미노산 서열, 또는
(a-1-2) FNMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDC (서열 번호 12)의 아미노산 서열에 있어서,
서열 중 어느 하나의 1개 내지 3개의 아미노산 잔기가 동일해도 상이해도 좋고, 라이신 잔기, 아스파라긴산 잔기 및 글루타민산 잔기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 각각 하나의 아미노산 잔기에 의해 치환되어 있거나,
(a-2-1) β-Ala-NMQQQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDD (서열 번호 13)의 아미노산 서열, 또는
(a-2-2) β-Ala-NMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDC (서열 번호 14)의 아미노산 서열에 있어서,
서열 중의 어느 하나의 1개 내지 3개의 아미노산 잔기가 동일해도 상이해도 좋고, 라이신 잔기, 아스파라긴산 잔기 및 글루타민산 잔기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 각각 하나의 아미노산 잔기에 의해 치환되어 있고, 또한
(b) 서열 번호 11 내지 14의 상기 아미노산 서열 각각에 대하여 85% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 〔2〕 내지 〔6〕 중 어느 하나의 화합물 또는 이의 염.
〔8〕 상기 펩타이드가,
식 1-1: (X0-3)a-C-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-I-I-W-C-(X0-3)b (서열 번호 15)
식 1-2: (X0-3)a-C-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-I-V-W-C-(X0-3)b (서열 번호 16)
식 1-3: (X0-3)a-C-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-V-V-W-C-(X0-3)b (서열 번호 17)
식 1-4: (X0-3)a-C-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-A-V-W-C-(X0-3)b (서열 번호 18)
식 1-5: (X0-3)a-C-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-L-L-W-C-(X0-3)b (서열 번호 19)
식 1-6 : (X0-3)a-C-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-L-I-W-C-(X0-3)b (서열 번호 20)
식 1-7: (X0-3)a-C-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-L-V-F-C-(X0-3)b (서열 번호 21)
식 1-8: (X0-3)a-C-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Q-V-W-C-(X0-3)b (서열 번호 22)
식 1-9: (X0-3)a-C-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-E-V-W-C-(X0-3)b (서열 번호 23)
〔식 중,
　(X0-3)a는 없음, 아르기닌 잔기-글리신 잔기-아스파라긴 잔기, 글리신 잔기-아스파라긴 잔기, 아스파라긴산 잔기, 또는 아스파라긴 잔기이고,
　(X0-3)b는 없음, 트레오닌 잔기-타이로신 잔기-히스티딘 잔기, 또는 트레오닌 잔기이고,
　Xaa1은 알라닌 잔기이고,
　Xaa2는 타이로신 잔기, 트립토판 잔기 또는 히스티딘 잔기이고,
　Xaa3는 히스티딘 잔기, 페닐알라닌 잔기, 타이로신 잔기, 트립토판 잔기, 아르기닌 잔기 또는 글리신 잔기이고,
　Xaa4는 라이신 잔기, 아스파라긴산 잔기 또는 글루타민산 잔기이고,
　Xaa5는 글리신 잔기, 세린 잔기, 아스파라긴 잔기, 글루타민 잔기, 아스파라긴산 잔기, 글루타민산 잔기, 페닐알라닌 잔기, 타이로신 잔기, 트립토판 잔기, 히스티딘 잔기, 트레오닌 잔기, 류신 잔기, 알라닌 잔기, 발린 잔기, 이소류신 잔기 또는 아르기닌 잔기이고,
　Xaa6는 글루타민 잔기, 글루타민산 잔기, 아스파라긴 잔기 또는 아스파라긴산 잔기이다.〕, 또는
식 2-1: (X0-3')a-C-(Xaa1')-(Xaa2')-(Xaa3')-(Xaa4')-(Xaa5')-(Xaa6')-L-V-W-C-(X0-3')b (서열 번호 24)
〔식 중,
　(X0-3')a 및 (X0-3')b는 각각 상기 (X0-3)a 및 (X0-3)b와 동일하고,
　Xaa1', Xaa2', Xaa3', Xaa4', Xaa5', Xaa6'는 각각 상기 Xaa1, Xaa2, Xaa3, Xaa4, Xaa5, Xaa6과 동일하다.〕 중의 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는, 〔2〕 내지 〔6〕 중 어느 하나의 화합물 또는 이의 염.
〔9〕 상기 이탈기가 (1) -O-, -S-, -Se-, -SO2-O-, -SO2-N(R)-, -SO2-, -C≡C-CH2-O-, -N(OR)-, -N(R)- 및 -O-N(R)-로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 기 (여기서, R은 수소 원자 또는 탄소 원자수 1 내지 6의 알킬이다.), 또는 (2) 헤테로아릴렌인, 〔1〕 내지 〔8〕 중 어느 하나의 화합물 또는 이의 염.
〔10〕 상기 친핵기가, 라이신 잔기의 측쇄에서의 NH2, 타이로신 잔기의 측쇄에서의 OH, 세린 잔기의 측쇄에서의 OH, 트레오닌 잔기의 측쇄에서의 OH, 및 시스테인 잔기의 측쇄에서의 SH로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 기인, 〔1〕 내지 〔9〕 중 어느 하나의 화합물 또는 이의 염.
〔11〕 상기 친전자기가 -C(=O)-, -SO2- 및 -CH2-로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 기인, 〔1〕 내지 〔10〕 중 어느 하나의 화합물 또는 이의 염.
〔12〕 상기 생체 직교성 관능기가 아지드 잔기, 알데하이드 잔기, 티올 잔기, 알킨 잔기, 알켄 잔기, 할로겐 잔기, 테트라진 잔기, 니트론 잔기, 하이드록실아민 잔기, 니트릴 잔기, 히드라진 잔기, 케톤 잔기, 보론산 잔기, 시아노벤조티아졸 잔기, 알릴 잔기, 포스핀 잔기, 말레이미드 잔기, 디설파이드 잔기, 티오에스테르 잔기, α-할로카보닐 잔기, 이소니트릴 잔기, 시드논 잔기 및 셀렌 잔기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 기인, 〔1〕 내지 〔11〕 중 어느 하나의 화합물 또는 이의 염.
〔13〕 상기 생체 직교성 관능기가 아지드 잔기, 티올 잔기, 알킨 잔기, 말레이미드 잔기 및 디설파이드 잔기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 기인, 〔1〕 내지 〔12〕 중 어느 하나의 화합물 또는 이의 염.
〔14〕 상기 화학식 I로 표시되는 화합물이 하기 화학식 I-1로 표시되는 화합물인, 〔1〕 내지 〔13〕 중 어느 하나의 화합물 또는 이의 염:
[화학식 I-1]
A-L1-L2-E1-E2-E3-B (I-1)
식 중,
A 및 B는 상기 화학식 I의 것과 동일하고,
L1은 결합 또는 2가의 기이고,
L2는 이탈기이고,
E1은 (i) 상기 이탈기와 연결되어 있고, 또한 (ii) 상기 항체 중의 친핵기와 반응하는 능력을 갖는 친전자기이고,
E2는 (a) -X-Y-〔여기서, E1과 결합하는 X는 C(R1)(R2) (여기서, R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소 원자 또는 탄소 원자수 1 내지 6의 알킬이다), N(R3) (여기서, R3는 수소 원자 또는 탄소 원자수 1 내지 6의 알킬이다.), O, S 또는 Se이고, E3와 결합하는 Y는 C(R4)(R5) (여기서, R4 및 R5는 각각 독립적으로 수소 원자 또는 탄소 원자수 1 내지 6의 알킬이다.)이다.〕 또는 (b) 하기 화학식 i:
[화학식 i]
Figure pct00001
(여기서, 환 Z는, E1과 결합하는 환 구성 원자 X' 및 이의 양 측면(兩隣)의 환 구성 원자 모두가 탄소 원자인 2가의 환기이거나, E1과 결합하는 환 구성 원자 X'가 질소 원자이며, 또한 질소 원자의 양 측면의 환 구성 원자가 탄소 원자인 2가의 복소환기이고, ·는 결합손이다.)로 표시되는 기이고,
E3는, E2가 -X-Y-인 경우에는 2가의 기이고, E2가 화학식 i로 표시되는 기인 경우에는 결합 또는 2가의 기이고,
상기 이탈기는 상기 친핵기와 상기 친전자기 사이의 반응에 의해 E1에서부터 절단되어 이탈하는 능력을 갖는다.
〔15〕 상기 L2가,
(a) 환 P-Q-〔여기서, 환 P가, 전자 흡인성 기로 치환되어 있어도 좋은 아릴렌, 전자 흡인성 기로 치환되어 있어도 좋은 헤테로아릴렌, 축환(縮環)하고 있어도 좋은 2,5-디케토피롤리딘, 축환하고 있어도 좋은 2,6-디케토피페리딘, 축환하고 있어도 좋은 2-케토피롤리딘, 축환하고 있어도 좋은 2-케토피페리딘, 2-피리돈으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 기이고, Q가 -O-, -S-, -Se-, -SO2-O-, -SO2-N(R)-, -SO2-, -C≡C-CH2-O-, -N(OR)-, -N(R)- 및 -O-N(R)-로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 기 (여기서, R은 수소 원자 또는 탄소 원자수 1 내지 6의 알킬이다.)이다.〕,
(b) 헤테로아릴렌, 또는
(c) -Q-〔여기서, Q가 -O-, -S-, -Se-, -SO2-O-, -SO2-N(R)-, -SO2-, -C≡C-CH2-O-, -N(OR)-, -N(R)- 및 -O-N(R)-로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 기 (여기서, R은 수소 원자 또는 탄소 원자수 1 내지 6의 알킬이다.)이다.〕, 〔14〕의 화합물 또는 이의 염.
〔16〕 상기 L2가 하기 구조식으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 기인, 〔14〕 또는 〔15〕의 화합물 또는 이의 염:
Figure pct00002
여기서, EWG는, 전자 흡인성 기이고,
m은 0 내지 4의 정수이고,
n은 0 내지 3의 정수이고,
R은 수소 원자, 또는 탄소 원자수 1 내지 6의 알킬이고,
○ (백색 원)은, L1에 대한 결합손이고, ● (흑색 원)은, E1에 대한 결합손이다.
〔17〕 A와 E를 연결하는 L 또는 L1-L2의 주쇄가, 20개 이하의 원자로 이루어진, 〔1〕 내지 〔16〕 중 어느 하나의 화합물 또는 이의 염.
〔18〕 상기 화학식 I-1로 표시되는 화합물이 하기 화학식 I-2로 표시되는 화합물인, 〔14〕 내지 〔17〕 중 어느 하나의 화합물 또는 이의 염:
[화학식 I-2]
A-L1-L2-E1-X-Y-E3-B (I-2)
식 중,
A, L1, X, Y 및 B는 상기 화학식 I-1의 것과 동일하고,
L2는,
(a) 환 P-Q-〔여기서, 환 P가, 전자 흡인성 기로 치환되어 있어도 좋은 아릴렌, 전자 흡인성 기로 치환되어 있어도 좋은 헤테로아릴렌, 축환하고 있어도 좋은 2,5-디케토피롤리딘, 축환하고 있어도 좋은 2,6-디케토피페리딘, 축환하고 있어도 좋은 2-케토피롤리딘, 축환하고 있어도 좋은 2-케토피페리딘, 2-피리돈으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 기이고, Q가 -O-, -S-, -Se-, -SO2-O-, -SO2-N(R)-, -SO2-, -C≡C-CH2-O-, -N(OR)-, -N(R)- 및 -O-N(R)-로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 기 (여기서, R은 수소 원자 또는 탄소 원자수 1 내지 6의 알킬이다.)이다.〕,
(b) 헤테로아릴렌, 또는
(c) -Q-〔여기서, Q가 -O-, -S-, -Se-, -SO2-O-, -SO2-N(R)-, -SO2-, -C≡C-CH2-O-, -N(OR)-, -N(R)- 및 -O-N(R)-로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 기 (여기서, R은 수소 원자 또는 탄소 원자수 1 내지 6의 알킬이다.)이다.〕이고,
E1은 -C(=O)-, -SO2- 및 -CH2-로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 기이고,
E3는 2가의 기이다.
〔19〕 상기 화학식 I-1로 표시되는 화합물이 하기 화학식 I-3으로 표시되는 화합물인, 〔14〕 내지 〔17〕 중 어느 하나의 화합물 또는 이의 염:
[화학식 I-3]
Figure pct00003
식 중,
A, L1, 환 Z 및 B는 상기 화학식 I-1의 것과 동일하고,
L2는,
(a) 환 P-Q-〔여기서, 환 P가, 전자 흡인성 기로 치환되어 있어도 좋은 아릴렌, 전자 흡인성 기로 치환되어 있어도 좋은 헤테로아릴렌, 축환하고 있어도 좋은 2,5-디케토피롤리딘, 축환하고 있어도 좋은 2,6-디케토피페리딘, 축환하고 있어도 좋은 2-케토피롤리딘, 축환하고 있어도 좋은 2-케토피페리딘, 2-피리돈으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 기이고, Q가 -O-, -S-, -Se-, -SO2-O-, -SO2-N(R)-, -SO2-, -C≡C-CH2-O-, -N(OR)-, -N(R)- 및 -O-N(R)-로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 기 (여기서, R은 수소 원자 또는 탄소 원자수 1 내지 6의 알킬이다.)이다.〕,
(b) 헤테로아릴렌, 또는
(c) -Q-〔여기서, Q가 -O-, -S-, -Se-, -SO2-O-, -SO2-N(R)-, -SO2-, -C≡C-CH2-O-, -N(OR)-, -N(R)- 및 -O-N(R)-로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 기 (여기서, R은 수소 원자 또는 탄소 원자수 1 내지 6 알킬이다.)이다.〕이고,
E1은 -C(=O)-, -SO2- 및 -CH2-로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 기이고,
E3는 결합 또는 2가의 기이다.
〔20〕하기 화학식 I로 표시되는, 항체에 대한 친화성 물질 및 생체 직교성 관능기를 갖는 화합물 또는 이의 염을 포함하는, 생체 직교성 관능기에 의한 항체의 위치 선택적 수식 시약:
[화학식 I]
A-L-E-B (I)
식 중,
A는 항체에 대한 친화성 물질이고,
L은 이탈기를 포함하는 2가의 기이고,
E는 (i) 상기 이탈기와 연결되어 있고, 또한 (ii) 상기 항체 중의 친핵기와 반응하는 능력을 갖는 친전자기를 포함하는 2가의 기이고,
B는 생체 직교성 관능기이고,
상기 이탈기는 상기 친핵기와 상기 친전자기 사이의 반응에 의해 E로부터 절단되어 이탈하는 능력을 갖는다.
〔21〕 생체 직교성 관능기를 갖는 항체 또는 이의 염의 제조 방법으로서,
　하기 화학식 I로 표시되는, 항체에 대한 친화성 물질 및 생체 직교성 관능기를 갖는 화합물 또는 이의 염을, 항체와 반응시켜, 하기 화학식 II로 표시되는, 생체 직교성 관능기를 갖는 항체 또는 이의 염을 생성하는 것을 포함하는, 방법:
[화학식 I]
A-L-E-B (I)
식 중,
A는 항체에 대한 친화성 물질이고,
L은 이탈기를 포함하는 2가의 기이고,
E는 (i) 상기 이탈기와 연결되어 있고, 또한 (ii) 상기 항체 중의 친핵기와 반응하는 능력을 갖는 친전자기를 포함하는 2가의 기이고,
B는 생체 직교성 관능기이고,
상기 이탈기는 상기 친핵기와 상기 친전자기 사이의 반응에 의해 E로부터 절단되어 이탈하는 능력을 갖는다.
[화학식 II]
Ab-E-B (II)
식 중,
E 및 B는 상기 화학식 I의 것과 동일하고,
Ab는 항체이다.
〔22〕 기능성 물질을 갖는 항체 또는 이의 염의 제조 방법으로서,
(1) 하기 화학식 I로 표시되는, 항체에 대한 친화성 물질 및 생체 직교성 관능기를 갖는 화합물 또는 이의 염을, 항체와 반응시켜, 　하기 화학식 II로 표시되는, 생체 직교성 관능기를 갖는 항체 또는 이의 염을 생성하는 것; 및
(2) 상기 화학식 II로 표시되는, 생체 직교성 관능기를 갖는 항체 또는 이의 염을, 생체 직교성 관능기를 통해서 기능성 물질과 반응시켜, 하기 화학식 III으로 표시되는, 기능성 물질을 갖는 항체 또는 이의 염을 생성하는 것을 포함하는, 방법:
[화학식 I]
A-L-E-B (I)
식 중,
A는 항체에 대한 친화성 물질이고,
L은 이탈기를 포함하는 2가의 기이고,
E는 (i) 상기 이탈기와 연결되어 있고, 또한 (ii) 상기 항체 중의 친핵기와 반응하는 능력을 갖는 친전자기를 포함하는 2가의 기이고,
B는 생체 직교성 관능기이고,
상기 이탈기는 상기 친핵기와 상기 친전자기 사이의 반응에 의해 E로부터 절단되어 이탈하는 능력을 갖는다.
[화학식 II]
Ab-E-B (II)
식 중,
E 및 B는 상기 화학식 I의 것과 동일하고,
Ab는 항체이다.
[화학식 III]
Ab-E-B'-F (III)
식 중,
Ab는 상기 화학식 II의 것과 동일하고,
E는 상기 화학식 I의 것과 동일하고,
B'는 기능성 물질과 생체 직교성 관능기 사이의 반응에 의해 생성하는 부분을 포함하는 2가의 기이고,
F는 기능성 물질이다.
〔23〕 하기 화학식 II-1로 표시되는, 생체 직교성 관능기를 위치 선택적으로 갖는 항체 또는 이의 염:
[화학식 II-1]
Ab-E1-E2-E3-B (II-1)
식 중,
Ab는 항체이고,
E1은 항체 중의 친핵기와 연결되어 있는 친전자기이고,
E2는 (a) -X-Y-〔여기서, E1과 결합하는 X는 C(R1)(R2) (여기서, R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소 원자 또는 탄소 원자수 1 내지 6의 알킬이다.), N(R3) (여기서, R3는 수소 원자 또는 탄소 원자수 1 내지 6의 알킬이다.), O, S 또는 Se이고, E3와 결합하는 Y는 C(R4)(R5) (여기서, R4 및 R5는 각각 독립적으로 수소 원자 또는 탄소 원자수 1 내지 6의 알킬이다.)이다.〕, 또는 (b) 하기 화학식 i:
[화학식 i]
Figure pct00004
(여기서, 환 Z는, E1과 결합하는 환 구성 원자 X' 및 이의 양 측면의 환 구성 원자의 전체가 탄소 원자인 2가의 환기이거나, E1과 결합하는 환 구성 원자 X'가 질소 원자이고, 또한 질소 원자의 양 측면의 환 구성 원자가 탄소 원자인 2가의 복소환기이고, ·는 결합손이다.)로 표시되는 기이고,
E3는, E2가 -X-Y-인 경우에는 2가의 기이고, E2가 화학식 i로 표시되는 기인 경우에는 결합 또는 2가의 기이고,
B는 생체 직교성 관능기이다.
〔24〕 상기 항체가 모노클로날 항체의 정상 영역에만 생체 직교성 관능기를 갖는 항체인, 〔23〕의 항체 또는 이의 염.
〔25〕 상기 항체가 모노클로날 항체의 Fc 영역에만 생체 직교성 관능기를 갖는 항체인, 〔23〕 또는 〔24〕의 항체 또는 이의 염.
〔26〕 상기 항체가, 인간 IgG Fc 영역에서의 246 내지 248 위치 또는 288 내지 290 위치의 아미노산 잔기로 이루어진 영역에 있어서, 생체 직교성 관능기를 위치 선택적으로 갖는 인간 IgG인, 〔23〕 내지 〔25〕 중 어느 하나의 항체 또는 이의 염.
〔27〕 상기 화학식 II-1로 표시되는 상기 항체가 하기 화학식 II-2로 표시되는, 생체 직교성 관능기를 위치 선택적으로 갖는 항체인, 〔23〕 내지 〔26〕 중 어느 하나의 항체 또는 이의 염:
[화학식 II-2]
Ab-E1-X-Y-E3-B (II-2)
식 중,
Ab, X, Y 및 B는 상기 화학식 II-1의 것과 동일하고,
E1은 -C(=O)-, -SO2- 및 -CH2-로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 기이고,
E3는 2가의 기이다.
〔28〕 상기 화학식 II-1로 표시되는 상기 항체가 하기 화학식 II-3로 표시되는, 생체 직교성 관능기를 위치 선택적으로 갖는 항체인, 〔23〕 내지 〔26〕 중 어느 하나의 항체 또는 이의 염:
[화학식 II-3]
Figure pct00005
식 중,
Ab, 환 구성 원자 X', 환 Z 및 B는 상기 화학식 II-1의 것과 동일하고,
E1은 -C(=O)-, -SO2- 및 -CH2-로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 기이고,
E3는 결합 또는 2가의 기이다.
〔29〕하기 화학식 III-1로 표시되는, 기능성 물질을 위치 선택적으로 갖는 항체 또는 이의 염:
[화학식 III-1]
Ab-E1-E2-E3-B'-F (III-1)
식 중,
Ab는 항체이고,
E1은 항체 중의 친핵기와 연결되어 있는 친전자기이고,
E2는 (a) -X-Y-〔여기서, E1과 결합하는 X는 C(R1)(R2) (여기서, R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소 원자 또는 탄소 원자수 1 내지 6의 알킬이다.), N(R3) (여기서, R3는 수소 원자 또는 탄소 원자수 1 내지 6의 알킬이다.), O, S 또는 Se이고, E3와 결합하는 Y는 C(R4)(R5) (여기서, R4 및 R5는 각각 독립적으로 수소 원자 또는 탄소 원자수 1 내지 6의 알킬이다.)이다.〕, 또는 (b) 하기 화학식 i:
[화학식 i]
Figure pct00006
(여기서, 환 Z는, E1과 결합하는 환 구성 원자 X' 및 이의 양 측면의 환 구성 원자의 전체가 탄소 원자인 2가의 환기이거나, E1과 결합하는 환 구성 원자 X'가 질소 원자이며, 또한 질소 원자의 양 측면의 환 구성 원자가 탄소 원자인 2가의 복소환기이고, ·은 결합손이다.)로 표시되는 기이고,
　E3는, E2가 -X-Y-인 경우에는 2가의 기이고, E2가 화학식 i로 표시되는 기인 경우에는 결합 또는 2가의 기이고,
　B'는 기능성 물질과 생체 직교성 관능기 사이의 반응에 의해 생성하는 부분을 포함하는 2가의 기이고,
　F는 기능성 물질이다.
〔30〕 상기 항체가 모노클로날 항체의 정상 영역에만 생체 직교성 관능기를 갖는 항체인, 〔29〕의 항체 또는 이의 염.
〔31〕 상기 항체가 모노클로날 항체의 Fc 영역에만 생체 직교성 관능기를 갖는 항체인, 〔29〕 또는 〔30〕의 항체 또는 이의 염.
〔32〕 상기 항체가, 인간 IgG Fc 영역에서의 246 내지 248 위치 또는 288 내지 290 위치의 아미노산 잔기로 이루어진 영역에 있어서, 기능성 물질을 위치 선택적으로 갖는 인간 IgG인, 〔29〕 내지 〔31〕 중 어느 하나의 항체 또는 이의 염.
〔33〕 상기 화학식 III-1로 표시되는 상기 항체가 하기 화학식 III-2로 표시되는, 기능성 물질을 위치 선택적으로 갖는 항체인, 〔29〕 내지 〔32〕 중 어느 하나의 항체 또는 이의 염:
[화학식 III-2]
Ab-E1-X-Y-E3-B'-F (III-2)
식 중,
Ab, X, Y, B' 및 F는 상기 화학식 III-1의 것과 동일하고,
E1은 -C(=O)-, -SO2- 및 -CH2-로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 기이고,
E3는 2가의 기이다.
〔34〕 상기 화학식 III-1로 표시되는 상기 항체가, 하기 화학식 III-3으로 표시되는, 기능성 물질을 위치 선택적으로 갖는 항체인, 〔29〕 내지 〔32〕 중 어느 하나의 항체 또는 이의 염:
[화학식 III-3]
Figure pct00007
식 중,
Ab, 환 구성 원자 X', 환 Z, B' 및 F는 상기 화학식 III-1의 것과 동일하고,
E1은 -C(=O)-, -SO2- 및 -CH2-로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 기이고,
E3는 결합 또는 2가의 기이다.
〔35〕하기 화학식 IV로 표시되는, 항체에 대한 친화성 물질 및 기능성 물질을 갖는 화합물 또는 이의 염:
[화학식 IV]
A-L-E-F (IV)
식 중,
A는 항체에 대한 친화성 물질이고,
L은 이탈기를 포함하는 2가의 기이고,
E는 (i) 상기 이탈기와 연결되어 있고, 또한 (ii) 상기 항체 중의 친핵기와 반응하는 능력을 갖는 친전자기를 포함하는 2가의 기이고,
F는 기능성 물질이고,
상기 이탈기는 상기 친핵기와 상기 친전자기 사이의 반응에 의해 E로부터 절단되어 이탈하는 능력을 갖는다.
〔36〕하기 화학식 IV로 표시되는, 항체에 대한 친화성 물질 및 기능성 물질을 갖는 화합물 또는 이의 염을 포함하는, 기능성 물질에 의한 항체의 위치 선택적 수식 시약:
[화학식 IV]
A-L-E-F (IV)
식 중,
A는 항체에 대한 친화성 물질이고,
L은 이탈기를 포함하는 2가의 기이고,
E는 (i) 상기 이탈기와 연결되어 있고, 또한 (ii) 상기 항체 중의 친핵기와 반응하는 능력을 갖는 친전자기를 포함하는 2가의 기이고,
F는 기능성 물질이고,
상기 이탈기는 상기 친핵기와 상기 친전자기 사이의 반응에 의해 E로부터 절단되어 이탈하는 능력을 갖는다.
〔37〕 기능성 물질을 갖는 항체 또는 이의 염의 제조 방법으로서,
하기 화학식 IV로 표시되는, 항체에 대한 친화성 물질 및 기능성 물질을 갖는 화합물 또는 이의 염을, 항체와 반응시켜, 하기 화학식 III으로 표시되는, 기능성 물질을 갖는 항체 또는 이의 염을 생성하는 것을 포함하는, 방법:
[화학식 III]
Ab-E-F (III)
식 중,
Ab는 항체이고,
E 및 F는 상기 화학식 IV의 것과 동일하다.
[화학식 IV]
A-L-E-F (IV)
식 중,
A는 항체에 대한 친화성 물질이고,
L은 이탈기를 포함하는 2가의 기이고,
E는 (i) 상기 이탈기와 연결되어 있고, 또한 (ii) 상기 항체 중의 친핵기와 반응하는 능력을 갖는 친전자기를 포함하는 2가의 기이고,
F는 기능성 물질이고,
상기 이탈기는 상기 친핵기와 상기 친전자기 사이의 반응에 의해 E로부터 절단되어 이탈하는 능력을 갖는다.
항체에 대한 친화성 물질 및 생체 직교성 관능기 또는 기능성 물질을 갖는 본 발명의 화합물 또는 이의 염은, 예를 들어, 항체의 위치 선택적인 수식에 유용하다.
생체 직교성 관능기를 위치 선택적으로 갖는 본 발명의 항체 또는 이의 염은, 예를 들면, 기능성 물질을 위치 선택적으로 갖는 항체 또는 이의 염의 조제에서의 중간체로서 유용하다.
기능성 물질을 위치 선택적으로 갖는 본 발명의 항체 또는 이의 염은, 예를 들어, 의약, 또는 시약(예, 진단약, 연구용 시약)으로서 유용하다.
[도 1] 도 1은, 본 발명의 개요를 나타내는 모식도이다.
[도 2] 도 2는, IgG 항체 트라스투주맙-펩타이드 복합체 합성에서의 SDS-PAGE에 의한 해석 결과를 나타내는 도면이다. 레인 1, 3, 6, 8: 분자량 마커; 레인 2: 미반응의 IgG 항체 트라스투주맙(컨트롤, 분자량 5만 부근의 밴드가 중쇄를 분자량 2만 5천 부근의 밴드가 경쇄를 나타냄); 레인 4: IgG 항체 트라스투주맙과 화합물 10에 의한 복합체(분자량 5만 부근의 위의 밴드가 트라스투주맙의 중쇄에 화합물 10이 콘쥬게이션한 것을 나타낸다. 분자량 5만 부근의 아래의 밴드가 미반응의 중쇄, 분자량 2만 5천 부근의 밴드가 미반응의 경쇄를 나타냄); 레인 5: IgG 항체 트라스투주맙과 화합물 11에 의한 복합체(분자량 5만 부근의 위의 밴드가 트라스투주맙의 중쇄에 화합물 11이 콘쥬게이션한 것을 나타낸다. 분자량 5만 부근의 아래의 밴드가 미반응의 중쇄, 분자량 2만 5천 부근의 밴드가 미반응의 경쇄를 나타냄); 레인 7: IgG 항체 트라스투주맙과 화합물 12에 의한 콘쥬게이션 후의 반응 혼합물(분자량 5만 부근의 밴드가 미반응의 중쇄, 분자량 2만 5천 부근의 밴드가 미반응의 경쇄를 나타낸다. 화합물 12가 콘쥬게이션한 밴드는 보이지 않는다).
[도 3] 도 3은, IgG 항체 트라스투주맙에 위치 특이적으로 말레이미드를 도입하고, 그 후에 티올을 갖는 펩타이드 시약과 콘쥬게이션시켜 합성한 트라스투주맙-펩타이드 복합체의 SDS-PAGE에 의한 해석 결과를 나타내는 도면이다. 레인 1, 9: 분자량 마커. 레인 2: IgG 항체 트라스투주맙을 화합물 22(항체에 대하여 10몰당량)로 처리하고, 위치 선택적으로 말레이미드를 도입한 후, 화합물 25를 콘쥬게이션시킨 복합체. 분자량 5만 부근의 위의 밴드가 트라스투주맙의 중쇄에 말레이미드가 도입되고, 화합물 25와 콘쥬게이션한 것을 나타낸다. 분자량 5만 부근의 아래의 밴드는 미반응의 중쇄, 분자량 2만5천 부근의 밴드가 미반응의 경쇄를 나타낸다. 레인 3: IgG 항체 트라스투주맙을 화합물 22(항체에 대하여 20몰당량)로 처리하고, 위치 선택적으로 말레이미드를 도입한 후, 화합물 25를 콘쥬게이션시킨 복합체. 분자량 5만 부근의 위의 밴드가 트라스투주맙의 중쇄에 말레이미드가 도입되고, 화합물 25와 콘쥬게이션한 것을 나타낸다. 분자량 5만 부근의 아래의 밴드는 미반응의 중쇄, 분자량 2만5천 부근의 밴드가 미반응의 경쇄를 나타낸다. 레인 4: IgG 항체 트라스투주맙을 화합물 22(항체에 대하여 40몰당량)로 처리하고, 위치 선택적으로 말레이미드를 도입한 후, 화합물 25를 콘쥬게이션시킨 복합체. 분자량 5만 부근의 위의 밴드가 트라스투주맙의 중쇄에 말레이미드가 도입되고, 화합물 25와 콘쥬게이션한 것을 나타낸다. 분자량 5만 부근의 아래의 밴드가 미반응의 중쇄, 분자량 2만5천 부근의 밴드는 미반응의 경쇄를 나타낸다. 레인 5: IgG 항체 트라스투주맙을 화합물 23(항체에 대하여 10몰당량)으로 처리하고, 위치 선택적으로 말레이미드를 도입한 후, 화합물 25를 콘쥬게이션시킨 복합체. 분자량 5만 부근의 위의 밴드가 트라스투주맙의 중쇄에 말레이미드가 도입되고, 화합물 25와 콘쥬게이션한 것을 나타낸다. 분자량 5만 부근의 아래의 밴드는 미반응의 중쇄, 분자량 2만5천 부근의 밴드가 미반응의 경쇄를 나타낸다. 레인 6: IgG 항체 트라스투주맙을 화합물 23(항체에 대하여 20몰당량)으로 처리하고, 위치 선택적으로 말레이미드를 도입한 후, 화합물 25를 콘쥬게이션시킨 복합체. 분자량 5만 부근의 위의 밴드가 트라스투주맙의 중쇄에 말레이미드가 도입되고, 화합물 25와 콘쥬게이션한 것을 나타낸다. 분자량 5만 부근의 아래의 밴드는 미반응의 중쇄, 분자량 2만5천 부근의 밴드가 미반응의 경쇄를 나타낸다. 레인 7: IgG 항체 트라스투주맙을 화합물 23(항체에 대하여 40몰당량)으로 처리하고, 위치 선택적으로 말레이미드를 도입한 후, 화합물 25를 콘쥬게이션시킨 복합체. 분자량 5만 부근의 위의 밴드가 트라스투주맙의 중쇄에 말레이미드가 도입되고, 화합물 25와 콘쥬게이션한 것을 나타낸다. 분자량 5만 부근의 아래의 밴드가 미반응의 중쇄, 분자량 2만5천 부근의 밴드는 미반응의 경쇄를 나타낸다. 레인 8, 10: 미반응의 IgG 항체 트라스투주맙(컨트롤, 분자량 5만 부근의 밴드가 중쇄를 분자량 2만5천 부근의 밴드가 경쇄를 나타냄) 레인 11: IgG 항체 트라스투주맙을 화합물 24(항체에 대하여 10몰당량)로 처리한 후, 화합물 25를 더한 반응 혼합물. 분자량 5만 부근의 밴드는 미반응의 중쇄, 분자량 2만5천 부근의 밴드가 미반응의 경쇄를 나타낸다. 레인 12: IgG 항체 트라스투주맙을 화합물 24(항체에 대하여 20몰당량)로 처리한 후, 화합물 25를 더한 반응 혼합물. 분자량 5만 부근의 밴드는 미반응의 중쇄, 분자량 2만5천 부근의 밴드가 미반응의 경쇄를 나타낸다. 레인 13: IgG 항체 트라스투주맙을 화합물 24(항체에 대하여 40몰당량)로 처리한 후, 화합물 25를 더한 반응 혼합물. 분자량 5만 부근의 밴드는 미반응의 중쇄, 분자량 2만5천 부근의 밴드가 미반응의 경쇄를 나타낸다.
[도 4] 도 4는, (4-5-1)에서 합성한 트라스투주맙-말레이미드 수식체의 환원 후 조건에서의 ESI-TOFMS를 나타내는 도면이다. 상단이 미반응의 트라스투주맙을 측정한 것, 하단이 수식체를 나타낸다.
[도 5] 도 5는, (6-1-1)에서 합성한 트라스투주맙-아지드 수식체(아지드 수식 항체 1)의 환원 후 조건에서의 ESI-TOFMS를 나타내는 도면이다. 하단이 미반응의 트라스투주맙을 측정한 것ㅇㅇ, 상단이 수식체를 나타낸다.
[도 6] 도 6은, (6-1-2)에서 합성한 트라스투주맙-아지드 수식체(아지드 수식 항체 3)의 환원 후 조건에서의 ESI-TOFMS를 나타내는 도면이다. 하단이 미반응의 트라스투주맙을 측정한 것, 상단이 수식체를 나타낸다.
[도 7] 도 7은, (6-1-3)에서 합성한 트라스투주맙-아지드 수식체(아지드 수식 항체 6)의 환원 후 조건에서의 ESI-TOFMS를 나타내는 도면이다. 상단이 미반응의 트라스투주맙을 측정한 것, 하단이 수식체를 나타낸다.
[도 8] 도 8은, (6-1-3)에서 합성한 트라스투주맙-아지드 수식체(아지드 수식 항체 8)의 환원 후 조건에서의 ESI-TOFMS를 나타내는 도면이다. 상단이 미반응의 트라스투주맙을 측정한 것, 하단이 수식체를 나타낸다.
[도 9] 도 9는, (6-1-3)에서 합성한 트라스투주맙-아지드 수식체(아지드 수식 항체 10)의 환원 후 조건에서의 ESI-TOFMS를 나타내는 도면이다. 상단이 미반응의 트라스투주맙을 측정한 것, 하단이 수식체를 나타낸다.
[도 10] 도 10은, (6-1-4)에서 합성한 아달리무맙-아지드 수식체(아지드 수식 항체 28)의 환원 후 조건에서의 ESI-TOFMS를 나타내는 도면이다. 상단이 미반응의 아달리무맙을 측정한 것, 하단이 수식체를 나타낸다.
[도 11] 도 11은, (6-1-4)에서 합성한 데노수맙-아지드 수식 항체(아지드 수식 항체 29)의 환원 후 조건에서의 ESI-TOFMS를 나타내는 도면이다. 상단이 미반응의 데노수맙을 측정한 것, 하단이 수식체를 나타낸다.
[도 12] 도 12는, (6-1-4)에서 합성한 두필루맙-아지드 수식 항체(아지드 수식 항체 30)의 환원 후 조건에서의 ESI-TOFMS를 나타내는 도면이다. 상단이 미반응의 두필루맙을 측정한 것, 하단이 수식체를 나타낸다.
[도 13] 도 13은, (6-1-4)에서 합성한 리툭시맙-아지드 수식 항체(아지드 수식 항체 31)의 환원 후 조건에서의 ESI-TOFMS를 나타내는 도면이다. 하단이 미반응의 리툭시맙을 측정한 것, 상단이 수식체를 나타낸다.
[도 14] 도 14는, (8-1-1)에서 합성한 트라스투주맙-보호 티올 수식체의 환원 후 조건에서의 ESI-TOFMS를 나타내는 도면이다. 상단이 미반응의 트라스투주맙을 측정한 것, 하단이 수식체를 나타낸다.
[도 15] 도 15는, (8-3-1)에서 탈보호한 트라스투주맙-티올 수식체의 환원 후 조건에서의 ESI-TOFMS를 나타내는 도면이다. 상단이 미반응의 트라스투주맙을 측정한 것, 하단이 수식체를 나타낸다.
[도 16] 도 16은, (9-1-1)에서 합성한 트라스투주맙-아지드 수식체의 환원 후 조건에서의 ESI-TOFMS를 나타내는 도면이다. 상단이 미반응의 트라스투주맙을 측정한 것, 하단이 수식체를 나타낸다.
[도 17] 도 17은, (9-1-5)에서 합성한 트라스투주맙-아지드 수식체의 환원 후 조건에서의 ESI-TOFMS를 나타내는 도면이다. 상단이 미반응의 트라스투주맙을 측정한 것, 하단이 수식체를 나타낸다.
[도 18] 도 18은, (9-2-2)에서 합성한 트라스투주맙-아지드 수식체의 환원 후 조건에서의 ESI-TOFMS를 나타내는 도면이다. 상단이 미반응의 트라스투주맙을 측정한 것, 하단이 수식체를 나타낸다.
[도 19] 도 19는, (10-1-1)에서 합성한 트라스투주맙-Cy3 복합체의 ESI-TOFMS를 나타내는 도면이다. 하단이 미반응의 트라스투주맙을 측정한 것, 중단(中段)이 (6-1-1)에서 합성한 트라스투주맙-아지드 수식체를 측정한 것, 상단이 트라스투주맙-Cy3 복합체를 나타낸다.
[도 20] 도 20은, (10-1-2)에서 처리한 트라스투주맙-Cy3 복합체의 환원 조건에서의 ESI-TOFMS를 나타내는 도면이다. 하단이 미반응의 트라스투주맙을 측정한 것, 중단이 (6-1-1)에서 합성한 트라스투주맙-아지드 수식체를 측정한 것, 상단이 트라스투주맙-Cy3 복합체를 나타낸다.
[도 21] 도 21은, (10-2-2)에서 합성한 트라스투주맙-펩타이드 복합체의 ESI-TOFMS를 나타내는 도면이다. 하단이 미반응의 트라스투주맙을 측정한 것, 중단이 (6-1-1)에서 합성한 트라스투주맙-아지드 수식체를 측정한 것, 상단이 트라스투주맙-Cy3 복합체를 나타낸다.
[도 22] 도 22는, (10-2-3)에서 처리한 트라스투주맙-Cy3 복합체의 환원 조건에서의 ESI-TOFMS를 나타내는 도면이다. 하단이 미반응의 트라스투주맙을 측정한 것, 중단이 (6-1-1)에서 합성한 트라스투주맙-아지드 수식체를 측정한 것, 상단이 트라스투주맙-펩타이드 복합체를 나타낸다.
[도 23] 도 23은, (10-3-1)에서 처리한 트라스투주맙-말레이미드 화합물 복합체의 환원 조건에서의 ESI-TOFMS를 나타내는 도면이다. 상단이 트라스투주맙의 티올 도입체를 측정한 것, 하단이 트라스투주맙-말레이미드 화합물 복합체를 나타낸다.
[도 24] 도 24는, (10-3-2)에서 처리한 반응 생성물의 환원 조건에서의 ESI-TOFMS를 나타내는 도면이다. 상단이 트라스투주맙의 티올 도입체를 측정한 것, 하단이 트라스투주맙-말레이미드 화합물 복합체를 나타낸다.
[도 25] 도 25는, (1) 트라스투주맙의 중쇄의 아미노산 서열(서열 번호 2), (2) 트라스투주맙의 경쇄의 아미노산 서열(서열 번호 4)을 나타내는 도면이다.
[도 26] 도 26은, (1) 데노수맙의 중쇄의 아미노산 서열(서열 번호 104), (2) 데노수맙의 경쇄의 아미노산 서열(서열 번호 105)을 나타내는 도면이다.
[도 27] 도 27은, (1) 두필루맙의 중쇄의 아미노산 서열(서열 번호 106), (2) 두필루맙의 경쇄의 아미노산 서열(서열 번호 107)을 나타내는 도면이다.
[도 28] 도 28은, 아지드 벤조산 수식 트라스투주맙의 트립신 소화에 의한 라이신 잔기로의 수식 부위를 포함하는, THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISR(서열 번호 11)의 펩타이드 프래그먼트의 MS 스펙트럼을 나타내는 도면이다.
[도 29] 도 29는, 아지드 벤조산 수식 트라스투주맙의 트립신 소화에 의한 라이신 잔기로의 수식 부위를 포함하는, THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISR(서열 번호 11)의 펩타이드 프래그먼트의 CID 스펙트럼을 나타내는 도면이다.
[도 30] 도 30은, 아지드 벤조산 수식 트라스투주맙의 트립신 소화에 의한 라이신 잔기로의 수식 부위를 포함하는, FNWYVDGVEVHNAKTKPR(서열 번호 12)의 펩타이드 프래그먼트의 MS 스펙트럼을 나타내는 도면이다.
[도 31] 도 31은, 아지드 벤조산 수식 트라스투주맙의 트립신 소화에 의한 라이신 잔기로의 수식 부위(아민 벤조산 도입체(+119.037Da))를 포함하는, FNWYVDGVEVHNAKTKPR(서열 번호 12)의 펩타이드 프래그먼트의 CID 스펙트럼을 나타내는 도면이다.
[도 32] 도 32는, 머캅토프로피온산 부가 말레이미드 수식 트라스투주맙의 트립신 소화에 의한 라이신 잔기로의 수식 부위를 포함하는, THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISR(서열 번호 11)의 펩타이드 프래그먼트의 MS 스펙트럼을 나타내는 도면이다.
[도 33] 도 33은, 말레이미드 MPA 수식 트라스투주맙의 트립신 소화에 의한 라이신 잔기로의 수식 부위를 포함하는, THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISR(서열 번호 11)의 펩타이드 프래그먼트의 CID 스펙트럼을 나타내는 도면이다.
[도 34] 도 34는, 알킬아지드 수식 트라스투주맙의 트립신 소화에 의한 라이신 잔기로의 수식 부위를 포함하는, THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISR(서열 번호 11)의 펩타이드 프래그먼트의 MS 스펙트럼을 나타내는 도면이다.
[도 35] 도 35는, 알킬아지드 수식 트라스투주맙의 트립신 소화에 의한 라이신 잔기로의 수식 부위를 포함하는, THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISR(서열 번호 11)의 펩타이드 프래그먼트의 CID 스펙트럼을 나타내는 도면이다.
[도 36] 도 36은, 아지드 벤조산 수식 트라스투주맙의 트립신 소화에 의한 라이신 잔기로의 수식 부위를 포함하는, VVSVLTVLHQDWLNGKEYK(서열 번호 101)의 펩타이드 프래그먼트의 MS 스펙트럼을 나타내는 도면이다.
[도 37] 도 37은, 아지드 벤조산 수식 트라스투주맙의 트립신 소화에 의한 라이신 잔기로의 수식 부위를 포함하는, VVSVLTVLHQDWLNGKEYK(서열 번호 101)의 펩타이드 프래그먼트의 CID 스펙트럼을 나타내는 도면이다.
[도 38] 도 38은, 아지드 벤조산 수식 트라스투주맙의 317 위치의 라이신 잔기가 고(高)선택적으로 수식되어 있다는 BioPharma Finder에 의한 해석 결과를 나타내는 도면이다.
[도 39] 도 39는, 아지드 벤조산 수식 트라스투주맙의 트립신 소화에 의한 라이신 잔기로의 수식 부위를 포함하는, FNWYVDGVEVHNAKTKPR(서열 번호 12)의 펩타이드 프래그먼트의 MS 스펙트럼을 나타내는 도면이다.
[도 40] 도 40은, 아지드 벤조산 수식 트라스투주맙의 트립신 소화에 의한 라이신 잔기로의 수식 부위를 포함하는, FNWYVDGVEVHNAKTKPR(서열 번호 12)의 펩타이드 프래그먼트의 CID 스펙트럼을 나타내는 도면이다.
[도 41] 도 41은, 아지드 벤조산 수식 트라스투주맙의 288 위치 또는 290 위치의 라이신 잔기가 고선택적으로 수식되어 있다는 BioPharma Finder에 의한 해석 결과를 나타내는 도면이다.
[도 42] 도 42는, 아지드 벤조산 수식 트라스투주맙의 트립신 소화에 의한 라이신 잔기로의 수식 부위를 포함하는, THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISR(서열 번호 11)의 펩타이드 프래그먼트의 MS 스펙트럼을 나타내는 도면이다.
[도 43] 도 43은, 아지드 벤조산 수식 트라스투주맙의 트립신 소화에 의한 라이신 잔기로의 수식 부위를 포함하는, THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISR(서열 번호 11)의 펩타이드 프래그먼트의 CID 스펙트럼을 나타내는 도면이다.
[도 44] 도 44는, 아지드 벤조산 수식 트라스투주맙의 246 위치 또는 248 위치의 라이신 잔기가 고선택적으로 수식되어 있다는 BioPharma Finder에 의한 해석 결과를 나타내는 도면이다.
[도 45] 도 45는, 아세틸티올 수식 트라스투주맙의 트립신 소화에 의한 라이신 잔기로의 수식 부위를 포함하는, THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISR(서열 번호 11)의 펩타이드 프래그먼트의 MS 스펙트럼을 나타내는 도면이다.
[도 46] 도 46은, 아세틸티올 수식 트라스투주맙의 트립신 소화에 의한 라이신 잔기로의 수식 부위를 포함하는, THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISR(서열 번호 11)의 펩타이드 프래그먼트의 CID 스펙트럼을 나타내는 도면이다.
[도 47] 도 47은, 아세틸티올 수식 트라스투주맙의 246 위치 또는 248 위치의 라이신 잔기가 고선택적으로 수식되어 있다는 BioPharma Finder에 의한 해석 결과를 나타내는 도면이다.
[도 48] 도 48은, 아지드 벤조산 수식 트라스투주맙의 트립신 소화에 의한 라이신 잔기로의 수식 부위를 포함하는, THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISR(서열 번호 11)의 펩타이드 프래그먼트의 MS 스펙트럼을 나타내는 도면이다.
[도 49] 도 49는, 아지드 벤조산 수식 트라스투주맙의 트립신 소화에 의한 라이신 잔기로의 수식 부위를 포함하는, THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISR(서열 번호 11)의 펩타이드 프래그먼트의 CID 스펙트럼을 나타내는 도면이다.
[도 50] 도 50은, 아지드 벤조산 수식 트라스투주맙의 트립신 소화에 의한 라이신 잔기로의 수식 부위를 포함하는, FNWYVDGVEVHNAKTKPR(서열 번호 12)의 펩타이드 프래그먼트의 MS 스펙트럼을 나타내는 도면이다.
[도 51] 도 51은, 아지드 벤조산 수식 트라스투주맙의 트립신 소화에 의한 라이신 잔기로의 수식 부위를 포함하는, FNWYVDGVEVHNAKTKPR(서열 번호 12)의 펩타이드 프래그먼트의 CID 스펙트럼을 나타내는 도면이다.
[도 52] 도 52는, 아세틸티올 및 아지드 벤조산 수식 트라스투주맙의 트립신 소화에 의한 라이신 잔기로의 수식 부위를 포함하는, THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISR(서열 번호 11)의 펩타이드 프래그먼트의 MS 스펙트럼을 나타내는 도면이다.
[도 53] 도 53은, 아세틸티올 및 아지드 벤조산 수식 트라스투주맙의 트립신 소화에 의한 라이신 잔기로의 수식 부위를 포함하는, THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISR(서열 번호 11)의 펩타이드 프래그먼트의 CID 스펙트럼을 나타내는 도면이다.
[도 54] 도 54는, 아세틸티올 및 아지드 벤조산 수식 트라스투주맙의 트립신 소화에 의한 라이신 잔기로의 수식 부위를 포함하는, FNWYVDGVEVHNAKTKPR(서열 번호 12)의 펩타이드 프래그먼트의 MS 스펙트럼을 나타내는 도면이다.
[도 55] 도 55는, 아세틸티올 및 아지드 벤조산 수식 트라스투주맙의 트립신 소화에 의한 라이신 잔기로의 수식 부위를 포함하는, FNWYVDGVEVHNAKTKPR(서열 번호 12)의 펩타이드 프래그먼트의 CID 스펙트럼을 나타내는 도면이다.
[도 56] 도 56은, 아세틸티올 및 아지드 벤조산 수식 트라스투주맙의 246 위치 또는 248 위치 및 288 위치 또는 290 위치의 라이신 잔기가 고선택적으로 수식되어 있다는 BioPharma Finder에 의한 해석 결과를 나타내는 도면이다.
[도 57] 도 57은, 벤조산 수식 데노수맙의 트립신 소화에 의한 라이신 잔기로의 수식 부위를 포함하는, CCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISR(서열 번호 102)의 펩타이드 프래그먼트의 MS 스펙트럼을 나타내는 도면이다.
[도 58] 도 58은, 벤조산 수식 데노수맙의 트립신 소화에 의한 라이신 잔기로의 수식 부위를 포함하는, CCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISR(서열 번호 102)의 펩타이드 프래그먼트의 CID 스펙트럼을 나타내는 도면이다.
[도 59] 도 59는, 벤조산 수식 데노수맙의 247 위치 또는 249 위치의 라이신 잔기가 고선택적으로 수식되어 있다는 BioPharma Finder에 의한 해석 결과를 나타내는 도면이다.
[도 60] 도 60은, 벤조산 수식 두필루맙의 트립신 소화에 의한 라이신 잔기로의 수식 부위를 포함하는, YGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISR(서열 번호 103)의 펩타이드 프래그먼트의 MS 스펙트럼을 나타내는 도면이다.
[도 61] 도 61은, 벤조산 수식 두필루맙의 트립신 소화에 의한 라이신 잔기로의 수식 부위를 포함하는, YGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISR(서열 번호 103)의 펩타이드 프래그먼트의 CID 스펙트럼을 나타내는 도면이다.
[도 62] 도 62는, 벤조산 수식 두필루맙의 251 위치 또는 253 위치의 라이신 잔기가 고선택적으로 수식되어 있다는 BioPharma Finder에 의한 해석 결과를 나타내는 도면이다.
[도 63] 도 63은, ESI-TOFMS(비환원 조건 하)에 의한, (12-1-1)에서 합성한 트라스투주맙-DM1 콘쥬게이트의 해석 결과를 나타내는 도면이다.
[도 64] 도 64는, ESI-TOFMS(환원 조건 하)에 의한, (12-1-1)에서 합성한 트라스투주맙-DM1 콘쥬게이트의 해석 결과를 나타내는 도면이다.
[도 65] 도 65는, ESI-TOFMS(비환원 조건 하)에 의한, (12-2-1)에서 합성한 트라스투주맙-MMAE 콘쥬게이트의 해석 결과를 나타내는 도면이다.
[도 66] 도 66은, ESI-TOFMS(환원 조건 하)에 의한, (12-2-1)에서 합성한 트라스투주맙-MMAE 콘쥬게이트의 해석 결과를 나타내는 도면이다.
[도 67] 도 67은, ESI-TOFMS(비환원 조건 하)에 의한, (12-3-1)에서 합성한 리툭시맙-DM1 콘쥬게이트의 해석 결과를 나타내는 도면이다.
[도 68] 도 68은, ESI-TOFMS(환원 조건 하)에 의한, (12-3-1)에서 합성한 리툭시맙-DM1 콘쥬게이트의 해석 결과를 나타내는 도면이다.
[도 69] 도 69는, ESI-TOFMS(비환원 조건 하)에 의한, (12-4-1)에서 합성한 리툭시맙-DM1 콘쥬게이트의 해석 결과를 나타내는 도면이다.
[도 70] 도 70은, ESI-TOFMS(환원 조건 하)에 의한, (12-4-1)에서 합성한 리툭시맙-DM1 콘쥬게이트의 해석 결과를 나타내는 도면이다.
[도 71] 도 71은, (1) 트라스투주맙의 중쇄 중의 Fc 영역, 및 IgG1 Fc 영역의 컨센서스 아미노산 서열(서열 번호 1), 및 (2) IgG1 Fc 영역의 아미노산 서열(서열 번호 3)을 나타내는 도면이다.
1. 항체에 대한 친화성 물질 및 생체 직교성 관능기를 갖는 화합물 또는 이의 염
1-1. 개요
본 발명은, 하기 화학식 I로 표시되는, 항체에 대한 친화성 물질 및 생체 직교성 관능기를 갖는 화합물 또는 이의 염을 제공한다:
[화학식 I]
A-L-E-B (I)
식 중,
A는 항체에 대한 친화성 물질이고,
L은 이탈기를 포함하는 2가의 기이고,
E는 (i) 상기 이탈기와 연결되어 있고, 또한 (ii) 상기 항체 중의 친핵기와 반응하는 능력을 갖는 친전자기를 포함하는 2가의 기이고,
B는 생체 직교성 관능기이고,
상기 이탈기는 상기 친핵기와 상기 친전자기 사이의 반응에 의해 E로부터 절단되어 이탈하는 능력을 갖는다.
본 발명에 관련하여 제시되는 화학식 I 및 다른 식 등의 표기에 있어서, -(하이픈)은, 그 양측에 존재하는 2개의 단위가 공유 결합하고 있는 것을 나타낸다. 따라서, 화학식 I에서는, A는, L과 공유 결합하고 있고, L은, A 및 E와 공유 결합하고 있고, E는, L 및 B와 공유 결합하고 있고, B는 E와 공유 결합하고 있다. 화학식 I로 표시되는, 항체에 대한 친화성 물질 및 생체 직교성 관능기를 갖는 화합물 또는 이의 염은, 항체에 대한 친화성 물질 (A)가, L-E-B를 갖는 구조 단위를, A와 L과의 공유 결합을 통해서 포함하는 것을 나타낸다. 따라서, 화학식 I에 있어서, 항체에 대한 친화성 물질 (A)는, L-E-B를 갖는 1개의 구조 단위, 또는 L-E-B를 갖는 복수(예를 들면 2 내지 5개, 바람직하게는 2 내지 4개, 보다 바람직하게는 2 또는 3개)의 구조 단위(동종 또는 이종)을 갖고 있어도 좋다.
다른 식에 있어서도, 항체에 대한 친화성 물질 (A) 또는 항체 (Ab)는, 식 중의 특정 구조 단위(A 또는 Ab를 제외하는 구조 단위)를, 공유 결합을 통해서 포함하는 것을 나타낸다. 따라서, 다른 식에 있어서도, 항체에 대한 친화성 물질 (A) 또는 항체 (Ab)는, 1개의 특정 구조 단위, 또는 복수(예를 들면 2 내지 5개, 바람직하게는 2 내지 4개, 보다 바람직하게는 2 또는 3개)의 특정 구조 단위(동종 또는 이종)을 갖고 있어도 좋다.
1-2. 항체에 대한 친화성 물질 (A)
화학식 I에 있어서, A는 항체에 대한 친화성 물질이다. 항체에 대한 친화성 물질이란, 항체에 대하여 비공유 결합에 의한 결합능을 갖는 물질이다.
본 발명에서 사용되는 친화성 물질은, 항체를 표적으로 한다. 항체는, 생체 분자(예, 당)로 수식된 항체라도, 생체 분자로 미수식의 항체라도 좋다. 항체로서는, 생물 유래 성분, 바이러스 유래 성분, 및 환경 중에 발견되는 성분 등의 임의의 성분에 대한 임의의 항체를 사용할 수 있지만, 생물 유래 성분 또는 바이러스 유래 성분에 대한 항체가 바람직하다. 생물 유래 성분으로서는, 예를 들어, 포유 동물, 조류(예, 닭) 등의 동물, 곤충, 미생물, 식물, 균류, 및 어류 유래의 성분(예, 단백질)을 들 수 있다. 바람직하게는, 생물 유래 성분은, 포유 동물 유래의 성분이다. 포유 동물로서는, 예를 들어, 영장류(예, 인간, 원숭이, 침팬지), 설치류(예, 생쥐, 쥐, 기니피그, 햄스터, 토끼), 애완 동물(예, 개, 고양이), 가축(예, 소, 돼지, 염소), 사역 동물(예, 말, 양)을 들 수 있다. 생물 유래 성분은, 보다 바람직하게는, 영장류 또는 설치류 유래의 성분(예, 단백질)이고, 보다 더욱 바람직하게는, 본 발명의 임상 응용의 관점에서, 인간 유래의 성분(예, 단백질)이다. 바이러스 유래 성분으로서는, 예를 들어, 인플루엔자 바이러스(예, 조류 인플루엔자 바이러스, 돼지 인플루엔자 바이러스), 에이즈 바이러스, 에볼라 바이러스, 파지 바이러스에 유래하는 성분(예, 단백질)을 들 수 있다.
항체는 또한, 폴리클로널 항체 또는 모노클로날 항체이고, 바람직하게는 모노클로날 항체이다. 모노클로날 항체로서는, 예를 들어, 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 소정의 당쇄가 부가된 항체(예, N형 당쇄 결합 컨센서스 서열 등의 당쇄 결합 컨센서스 서열을 갖도록 개변된 항체), 이중 특이성 항체, scFv 항체, Fab 항체, F(ab')2 항체, VHH 항체, Fc 영역 단백질, Fc 융합 단백질을 들 수 있다. 항체는 또한, 2가의 항체(예, IgG, IgD, IgE), 또는 4가 이상의 항체(예, IgA 항체, IgM 항체)라도 좋다.
친화성 물질의 표적인 항체는 또한, 임의의 아미노산 잔기로 구성되어 있어도 좋지만, 바람직하게는, 단백질을 통상 구성하는 천연의 20종의 L-α-아미노산 잔기로 구성된다. 이러한 아미노산 잔기로서는, 예를 들면, L-알라닌(A), L-아스파라긴(N), L-시스테인(C), L-글루타민(Q), L-이소류신(I), L-류신(L), L-메티오닌(M), L-페닐알라닌(F), L-프롤린(P), L-세린(S), L-트레오닌(T), L-트립토판(W), L-타이로신(Y), L-발린(V), L-아스파라긴산(D), L-글루타민산(E), L-아르기닌(R), L-히스티딘(H), 또는 L-라이신(K), 및 글리신(G)을 들 수 있다(이하, L의 표기를 생략). 항체는, 예를 들어 100개 이상, 바람직하게는 120개 이상, 보다 바람직하게는 150개 이상, 보다 더욱 바람직하게는 180개 이상, 특히 바람직하게는 200개 이상의 아미노산 잔기로 구성되어 있어도 좋다. 항체는 또한, 예를 들어 1000개 이하, 바람직하게는 900개 이하, 보다 바람직하게는 800개 이하, 보다 더욱 바람직하게는 700개 이하, 특히 바람직하게는 600개 이하라도 좋다. 보다 구체적으로는, 항체는, 예를 들면 100 내지 1000개, 바람직하게는 120 내지 900개, 보다 바람직하게는 150 내지 800개, 보다 더욱 바람직하게는 180 내지 700개 이상, 특히 바람직하게는 200 내지 600개의 아미노산 잔기로 구성되어 있어도 좋다. 항체가 항체(예, 상술한 바와 같은 모노클로날 항체)인 경우, 상기 개수의 아미노산 잔기는, 항체의 중쇄의 아미노산 잔기에 상당하는 것이라도 좋다.
친화성 물질의 표적인 항체는 또한, 후술하는 바와 같은 생체 직교성 관능기가 반응할 수 있는 측쇄 또는 말단(N 말단 및/또는 C 말단), 바람직하게는 측쇄를 갖는 특정의 아미노산 잔기를 하나의 위치 또는 복수의 위치(바람직하게는 복수의 위치)에서 포함하는 단백질이다. 이러한 특정의 아미노산 잔기로서는, 예를 들면, 후술하는 바와 같은 아미노산 잔기를 들 수 있지만, 바람직하게는, 라이신 잔기, 타이로신 잔기, 세린 잔기, 트레오닌 잔기, 및 시스테인 잔기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 잔기이다. 본 발명의 화합물이 항체를 위치 선택적으로 수식할 수 있는 것에 비추어보면, 이러한 특정의 아미노산 잔기를 복수의 위치에서 포함하는 항체가 바람직하다. 복수의 위치로서는, 2 이상의 위치인 한 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 3 이상의 위치, 바람직하게는 5 이상의 위치, 보다 바람직하게는 10 이상의 위치, 보다 더욱 바람직하게는 20 이상의 위치, 특히 바람직하게는 30 이상의 위치라도 좋다. 복수의 위치는 또한, 예를 들어 200 이하의 위치, 바람직하게는 180 이하의 위치, 보다 바람직하게는 150 이하의 위치, 보다 더욱 바람직하게는 120 이하의 위치, 특히 바람직하게는 100 이하의 위치라도 좋다. 보다 구체적으로는, 복수의 위치는, 예를 들어 3 내지 200의 위치, 바람직하게는 5 내지 180의 위치, 보다 바람직하게는 10 내지 150의 위치, 보다 더욱 바람직하게는 20 내지 120의 위치, 특히 바람직하게는 30 내지 100의 위치라도 좋다. 이러한 특정의 아미노산 잔기를 복수의 위치에서 포함하는 항체라도, 본 발명의 화합물은, 특정의 영역에 존재하는 1 또는 2개의 특정의 아미노산 잔기를 위치 선택적으로 수식할 수 있다. 예를 들어, 인간 IgG1의 라이신 잔기수는, 가변 영역 중의 아미노산 조성에도 따르지만, 일반적으로는 70 내지 90개 정도라고 말해지고 있다. 본 발명에서는, 이러한 인간 IgG1의 특정의 영역에 존재하는 1 또는 2개의 라이신 잔기를 위치 선택적으로 수식하는 것에 성공하고 있다.
보다 구체적으로는, 본 발명에서는, 항체의 기능을 유지하면서(즉, 항체를 변성시키지 않고 네이티브한 폴딩을 유지하면서), 항체 중의 특정의 표적 부위에 존재하는 아미노산 잔기를 수식하는 관점에서, 항체의 표면에 노출되어 있는 아미노산 잔기의 위치 선택적인 수식이 바람직하다. 예를 들어, 인간 IgG1 등의 인간 IgG에서는, 노출 라이신 잔기 및 노출 타이로신 잔기는, 이하의 위치에 존재한다(EU numbering에 의한; http://www.imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/Hu_IGHGnber.html을 참조).
(1) 노출 라이신 잔기
CH2 도메인(246 위치, 248 위치, 274 위치, 288 위치, 290 위치, 317 위치, 320 위치, 322 위치, 338 위치)
CH3 도메인(360 위치, 414 위치, 439 위치)
(2) 노출 타이로신 잔기
CH2 도메인(278 위치, 296 위치, 300 위치)
CH3 도메인(436 위치)
(3) 노출 세린 잔기
CH2 도메인(254 위치, 267 위치, 298 위치, 324 위치)
CH3 도메인(375 위치, 400 위치, 415 위치, 440 위치, 442 위치)
(4) 노출 트레오닌 잔기
CH2 도메인(256 위치, 289 위치, 307 위치)
CH3 도메인(335 위치, 359 위치, 393 위치, 437 위치)
따라서, 인간 IgG1 등의 인간 IgG가 라이신 잔기 또는 타이로신 잔기로 수식되는 경우, 상기 위치에서의 수식이 바람직하다.
바람직하게는, 인간 IgG1 등의 인간 IgG가 라이신 잔기, 타이로신 잔기, 세린 잔기 또는 트레오닌 잔기로 수식되는 경우, 상기 (1) 내지 (4)의 위치 중에서도, 표면으로의 노출성이 높은 이하의 위치에 존재하는 라이신 잔기, 타이로신 잔기, 세린 잔기 또는 트레오닌 잔기가 수식되어 있어도 좋다.
(1') 노출 라이신 잔기
CH2 도메인(246 위치, 248 위치, 274 위치, 288 위치, 290 위치, 317 위치, 320 위치, 322 위치)
CH3 도메인(360 위치, 414 위치, 439 위치)
(2') 노출 타이로신 잔기
CH2 도메인(278 위치, 296 위치, 300 위치)
CH3 도메인(436 위치)
(3') 노출 세린 잔기
CH2 도메인(254 위치, 267 위치, 298 위치)
CH3 도메인(400 위치, 415 위치, 440 위치)
(4') 노출 트레오닌 잔기
CH2 도메인(256 위치, 289 위치)
CH3 도메인(335 위치, 359 위치)
따라서, 인간 IgG1 등의 인간 IgG가 라이신 잔기, 타이로신 잔기, 세린 잔기 또는 트레오닌 잔기로 수식되는 경우, 상기 위치에서의 수식이 보다 바람직하다.
보다 바람직하게는, 인간 IgG1 등의 인간 IgG가 라이신 잔기로 수식되는 경우, 상기 (1)의 위치 중에서도, 본 발명에 있어서 효율적으로 수식할 수 있는 CH2 도메인 중의 소정의 위치(예, 246 위치, 248 위치, 288 위치, 290 위치, 317 위치)에 존재하는 라이신 잔기가 수식되어도 좋다.
특정의 실시형태에서는, 친화성 물질의 표적인 항체는, 상술한 바와 같이 특정의 아미노산 잔기를 복수의 위치에서 포함하는 경우, 연속하는 1 내지 50개의 아미노산 잔기로 이루어진 표적 영역 중에서 특정의 아미노산 잔기를 1개 이상 포함하고, 또한, 상기 표적 영역 이외의 비표적 영역 중에서 특정의 아미노산 잔기를 5개 이상 포함하는 것이라도 좋다. 표적 영역은, 바람직하게는 1 내지 30개, 보다 바람직하게는 1 내지 20개, 보다 더욱 바람직하게는 1 내지 10개, 1 내지 5개, 또는 1 내지 3개(즉, 1개, 2개, 또는 3개)의 아미노산 잔기로 이루어진 것이라도 좋다. 특히 바람직하게는, 표적 영역은, 특정의 위치에 존재하는 특정의 아미노산 잔기로 이루어진 영역이라도 좋다. 이러한 특정의 위치는, 표적 단백질 및 친화성 물질의 종류 등에 따라서도 변동하지만, 예를 들어, 항체의 정상 영역 중의 특정 영역(예, CH1, CH2, CH3) 중의 특정의 위치라도 좋고, 바람직하게는 항체의 CH2 중의 위치라도 좋다. 보다 구체적으로는, 표적 영역은, 인간 IgG Fc에서의 Eu numbering에 따른 하기 잔기라도 좋다:
(1) Lys248 잔기(이하, 본 명세서에서는 단순히 「Lys248」로도 표기하고, 인간 IgG CH2 영역(서열 번호 1)의 18번째의 잔기에 상당함) 또는 Lys246 잔기(이하, 본 명세서에서는 단순히 「Lys246」으로도 표기하고, 인간 IgG CH2 영역(서열 번호 1)의 16번째의 잔기에 상당함):
(2) Lys288 잔기(이하, 본 명세서에서는 단순히 「Lys288」로도 표기하고, 인간 IgG CH2 영역(서열 번호 1)의 58번째의 잔기에 상당함) 또는 Lys290 잔기(이하, 본 명세서에서는 단순히 「Lys290」으로도 표기하고, 인간 IgG CH2 영역(서열 번호 1)의 60번째의 잔기에 상당함);
(3) Lys317 잔기(이하, 본 명세서에서는 단순히 「Lys317」로도 표기하고, 인간 IgG CH2 영역(서열 번호 1)의 87번째의 잔기에 상당함).
본 발명에 의하면, 상기 표적 영역에서의 특정의 아미노산 잔기를 고도로 위치 선택으로 수식할 수 있다. 이러한 위치 선택성은, 예를 들어 30% 이상, 바람직하게는 40% 이상, 보다 바람직하게는 50% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 60% 이상, 특히 바람직하게는 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100%라도 좋다.
표적 영역은 또한, 특정의 위치에 존재하는 특정의 아미노산 잔기가, 당해 특정의 위치를 중심으로 하여 각각 N 말단측 및 C 말단측에 대하여 a개 (여기서, a는, 1 내지 10의 임의의 정수임)의 아미노산 잔기의 원격 위치까지의 영역에서, 당해 특정의 위치에 존재하는 특정의 아미노산 잔기 이외에, 특정의 아미노산 잔기와 동종의 아미노산 잔기를 포함하지 않는 것이라도 좋다. a는, 바람직하게는 1 내지 5의 정수이고, 보다 바람직하게는 1 내지 3의 정수이고, 보다 더욱 바람직하게는 1 또는 2이며, 특히 바람직하게는 1이다.
바람직한 실시형태에서는, 항체는, 모노클로날 항체이다. 모노클로날 항체 등의 항체의 아이소 타입으로서는, 예를 들어, IgG(예, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA, IgD, IgE, 및 IgY를 들 수 있다. 모노클로날 항체는, 전장(全長) 항체, 또는 항체 단편(예, F(ab')2, Fab', Fab, Fv, 단쇄 항체)이지만, 전장 항체가 바람직하다. 특히 바람직하게는, 항체는, 인간 IgG(예, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4)를 정상 영역에 갖는 인간 항체, 인간화 항체, 또는 키메라 항체이다.
항체는, 임의의 항원에 대한 항체이다. 예를 들어, 이러한 항원은, 상술한 바와 같은 생물 또는 바이러스에서 발견되는 성분이라도 좋다. 이러한 항원으로서는 또한, 예를 들어, 단백질〔올리고펩타이드, 폴리펩타이드를 포함한다. 당 등의 생체 분자로 수식된 단백질(예, 당단백질)이라도 좋다〕, 당쇄, 핵산, 저분자 화합물을 들 수 있다.
바람직하게는, 항체는, 단백질을 항원으로 하는 항체라도 좋다. 단백질로서는, 예를 들면, 세포막 수용체, 세포막 수용체 이외의 세포막 단백질(예, 세포외 기질 단백질), 리간드, 가용성 수용체를 들 수 있다.
보다 구체적으로는, 항체의 항원인 단백질은, 질환 표적 단백질이라도 좋다. 질환 표적 단백질로서는, 예를 들어, 이하를 들 수 있다.
(1) 암 영역
PD-L1, GD2, PDGFRα(혈소판 유래 성장 인자 수용체), CD22, HER2, 포스파티딜세린(PS), EpCAM, 피브로넥틴, PD-1, VEGFR-2, CD33, HGF, gpNMB, CD27, DEC-205, 엽산 수용체, CD37, CD19, Trop2, CEACAM5, S1P, HER3, IGF-1R, DLL4, TNT-1/B, CPAAs, PSMA, CD20, CD105(엔도글린), ICAM-1, CD30, CD16A, CD38, MUC1, EGFR, KIR2DL1,2,, NKG2A, tenascin-C, IGF(Insulin-like growth factor), CTLA-4, mesothelin, CD138, c-Met, Ang2, VEGF-A, CD79b, ENPD3, 엽산 수용체 α, TEM-1, GM2, 글리피칸 3, macrophage inhibitory factor, CD74, Notch1, Notch2, Notch3, CD37, TLR-2, CD3, CSF-1R, FGFR2b, HLA-DR, GM-CSF, EphA3, B7-H3, CD123, gpA33, Frizzled7 수용체, DLL4, VEGF, RSPO, LIV-1, SLITRK6, Nectin-4, CD70, CD40, CD19, SEMA4D(CD100), CD25, MET, Tissue Factor, IL-8, EGFR, cMet, KIR3DL2, Bst1(CD157), P-카데린, CEA, GITR, TAM(tumor associated macrophage), CEA, DLL4, Ang2, CD73, FGFR2, CXCR4, LAG-3, GITR, Fucosyl GM1, IGF-1, Angiopoietin 2, CSF-1R, FGFR3, OX40, BCMA, ErbB3, CD137(4-1BB), PTK7, EFNA4, FAP, DR5, CEA, Ly6E, CA6, CEACAM5, LAMP1, tissue factor, EPHA2, DR5, B7-H3, FGFR4, FGFR2, α2-PI, A33, GDF15, CAIX, CD166, ROR1, GITR, BCMA, TBA, LAG-3, EphA2, TIM-3, CD-200, EGFRvIII, CD16A, CD32B, PIGF, Axl, MICA/B, Thomsen-Friedenreich, CD39, CD37, CD73, CLEC12A, Lgr3, 트랜스페린 수용체, TGFβ, IL-17, 5T4, RTK, Immune Suppressor Protein, NaPi2b, 루이스 혈액형 B 항원, A34, Lysil-Oxidase, DLK-1, TROP-2, α9 인테그린, TAG-72(CA72-4), CD70
(2) 자기 면역 질환·염증성 질환
IL-17, IL-6R, IL-17R, INF-α, IL-5R, IL-13, IL-23, IL-6, ActRIIB, β7-Integrin, IL-4αR, HAS, Eotaxin-1, CD3, CD19, TNF-α, IL-15, CD3ε, Fibronectin, IL-1β, IL-1α, IL-17, TSLP(Thymic Stromal Lymphopoietin), LAMP(Alpha4 Beta 7 Integrin), IL-23, GM-CSFR, TSLP, CD28, CD40, TLR-3, BAFF-R, MAdCAM, IL-31R, IL-33, CD74, CD32B, CD79B, IgE(면역 글로불린E), IL-17A, IL-17F, C5, FcRn, CD28, TLR4, MCAM, B7RP1, CXCR1,2 Ligands, IL-21, Cadherin-11, CX3CL1, CCL20, IL-36R, IL-10R, CD86, TNF-α, IL-7R, Kv1.3, α9 인테그린, LIFHT
(3) 뇌신경 질환
CGRP, CD20, β아밀로이드, β아밀로이드 프로토 피브린, Calcitonin Gene-Related Peptide Receptor, LINGO(Ig Domain Containing1), α 시누클레인, 세포외 tau, CD52, 인슐린 수용체, tau 단백, TDP-43, SOD1, TauC3, JC 바이러스
(4) 감염증
Clostridium Difficile toxin B, 사이토메갈로바이러스, RS 바이러스, LPS, S.Aureus Alpha-toxin, M2e 단백, Psl, PcrV, S.Aureus toxin, 인플루엔자 A, Alginate, 황색포도구균, PD-L1, 인플루엔자 B, 아시네토박터, F-protein, Env, CD3, 병원성 대장균, 클렙시엘라, 폐렴구균
(5) 유전성·희소 질환
아밀로이드 AL, SEMA4D(CD100), 인슐린 수용체, ANGPTL3, IL4, IL13, FGF23, 부신피질 자극 호르몬, 트랜스타이레틴, 헌팅틴
(6) 안 질환
Factor D, IGF-1R, PGDFR, Ang2, VEGF-A, CD-105(Endoglin), IGF-1R, β 아밀로이드
(7) 뼈·정형외과 영역
Sclerostin, Myostatin, Dickkopf-1, GDF8, RNAKL, HAS, Siglec-15
(8) 혈액 질환
vWF, Factor IXa, Factor X, IFNγ, C5, BMP-6, Ferroportin, TFPI
(9) 기타 질환
BAFF(B cell activating factor), IL-1β, PCSK9, NGF, CD45, TLR-2, GLP-1, TNFR1, C5, CD40, LPA, 프로락틴 수용체, VEGFR-1, CB1, Endoglin, PTH1R, CXCL1, CXCL8, IL-1β, AT2-R, IAPP
보다 바람직한 실시형태에서는, 항체에 대한 친화성 물질은, 모노클로날 항체에 대한 친화성 물질이다. 모노클로날 항체의 아이소 타입은, 항체에 대하여 상술한 것과 동일하지만, IgG(예, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4)가 바람직하다. 바람직하게는, 모노클로날 항체는, 전장 모노클로날 항체이다.
보다 더욱 바람직한 실시형태에서는, 항체에 대한 친화성 물질은, 전장 모노클로날 항체인 키메라 항체, 인간화 항체, 또는 인간 항체(예, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 등의 IgG)에 대한 친화성 물질이다.
특히 바람직한 실시형태에서는, 항체에 대한 친화성 물질은, 하기 (A) 내지 (C)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 어느 하나의 Fc 영역 단백질을 포함하고, 또한 항원 결합능을 갖는 항체에 대한 친화성 물질이다:
(A) 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 Fc 영역 단백질;
(B) 서열 번호 1의 아미노산 서열에서, 1 또는 수개의 아미노산 잔기가 삽입, 부가, 결실 또는 치환된 아미노산 서열을 포함하는 Fc 영역 단백질; 또는
(C) 서열 번호 1의 아미노산 서열과 90% 이상의 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 Fc 영역 단백질.
서열 번호 1의 아미노산 서열은, Fc 영역 단백질이다. 이러한 Fc 영역 단백질은, 분비능을 갖는 것이 알려져 있다. 따라서, 상기 (A) 내지 (C)의 Fc 영역 단백질은, 분비능을 가질 수 있다. 또한, 이러한 Fc 영역 단백질을 포함하는 항체는, 항원 결합능을 가질 수 있다. 서열 번호 1에서의 18 위치의 아미노산 잔기는, 임의의 아미노산 잔기이지만, 바람직하게는 중성 아미노산 잔기이고, 보다 바람직하게는 후술하는 바와 같은 비극성 측쇄를 갖는 아미노산 잔기이고, 보다 더욱 바람직하게는 류신, 이소류신 또는 알라닌이며, 특히 바람직하게는 류신 또는 알라닌이다. 서열 번호 1에서의 19 위치의 아미노산 잔기는, 임의의 아미노산 잔기이지만, 바람직하게는 중성 아미노산 잔기 또는 산성 아미노산 잔기이고, 보다 바람직하게는 비극성 측쇄를 갖는 아미노산 잔기 또는 산성 아미노산 잔기이고, 보다 더욱 바람직하게는 류신 또는 글루타민산이다. 서열 번호 1에서의 21 위치의 아미노산 잔기는, 임의의 아미노산 잔기이지만, 바람직하게는 중성 아미노산 잔기이고, 보다 바람직하게는 비극성 측쇄를 갖는 아미노산 잔기이고, 보다 더욱 바람직하게는 글리신 또는 알라닌이다. 서열 번호 1에서의 140 위치의 아미노산 잔기는, 임의의 아미노산 잔기이지만, 바람직하게는 산성 아미노산 잔기이고, 보다 바람직하게는 글루타민산 또는 아스파라긴산이다. 서열 번호 1에서의 142 위치의 아미노산 잔기는, 임의의 아미노산 잔기이지만, 바람직하게는 중성 아미노산 잔기이고, 보다 바람직하게는 비극성 측쇄를 갖는 아미노산 잔기이고, 보다 더욱 바람직하게는 메티오닌, 류신 또는 이소류신이고, 특히 바람직하게는 메티오닌 또는 류신이다. 서열 번호 1에서의 177 위치의 아미노산 잔기는, 임의의 아미노산 잔기이지만, 바람직하게는 중성 아미노산 잔기이고, 보다 바람직하게는 후술하는 바와 같은 비하전성(非荷電性) 극성 측쇄를 갖는 아미노산 잔기 또는 비극성 측쇄를 갖는 아미노산 잔기이고, 보다 더욱 바람직하게는 트레오닌, 알라닌 또는 글리신이고, 특히 바람직하게는 트레오닌 또는 알라닌이다.
바람직한 실시형태에서는, 서열 번호 1의 아미노산 서열은, 서열 번호 2의 아미노산 서열에서의 220 내지 449 위치의 아미노산 잔기로 이루어진 아미노산 서열 이라도 좋다.
다른 바람직한 실시형태에서는, 서열 번호 1의 아미노산 서열은, 서열 번호 3의 아미노산 서열에서의 7 내지 236 위치의 아미노산 잔기로 이루어진 아미노산 서열 이라도 좋다.
특정의 실시형태에서는, 상술한 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 Fc 영역 단백질을 포함하는 항체는, 상술한 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 Fc 영역 단백질, 및 항체의 정상 영역을 포함하는 항체라도 좋다. 이러한 항체의 정상 영역으로서는, 키메라 항체, 인간화 항체, 또는 인간 항체(예, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 등의 IgG)의 고정 영역이라도 좋다.
Fc 영역 단백질 (B)에서는, 아미노산 잔기의 결실, 치환, 부가 및 삽입으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1, 2, 3 또는 4종의 변이에 의해, 1개 또는 수개의 아미노산 잔기가 개변될 수 있다. 아미노산 잔기의 변이는, 아미노산 서열 중의 하나의 영역에 도입되어도 좋지만, 복수의 다른 영역에 도입되어도 좋다. 용어 「1개 또는 수개」는, 단백질의 활성을 크게 해치지 않는 개수를 나타낸다. 용어 「1개 또는 수개」가 나타내는 수는, 예를 들어, 1 내지 100개, 바람직하게는 1 내지 80개, 보다 바람직하게는 1 내지 50개, 1 내지 30개, 1 내지 20개, 1 내지 10개 또는 1 내지 5개(예, 1개, 2개, 3개, 4개, 또는 5개)이다.
Fc 영역 단백질 (C)에서는, 서열 번호 1의 아미노산 서열과의 동일성%는, 70% 이상, 75% 이상 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상이라도 좋다. 본 발명에서는, 펩타이드 또는 폴리펩타이드(단백질)의 동일성%의 산출은, 알고리즘 blastp에 의해 행할 수 있다. 보다 구체적으로는, 폴리펩타이드의 동일성의 산정%는, National Center for Biotechnology Information(NCBI)에서 제공되고 있는 알고리즘 blastp에서, 디폴트 설정의 Scoring Parameters(Matrix:BLOSUM62;Gap Costs:Existence=11 Extension=1; Compositional Adjustments:Conditional compositional score matrix adjustment)를 사용하여 행할 수 있다. 또한, 폴리뉴클레오티드(유전자)의 동일성%의 산출은, 알고리즘 blastn에 의해 행할 수 있다. 보다 구체적으로는, 폴리뉴클레오티드의 동일성%의 산정은, NCBI에서 제공되고 있는 알고리즘 blastn에서, 디폴트 설정의 Scoring Parameters(Match/Mismatch Scores=1, -2; Gap Costs=Linear)를 사용하여 행할 수 있다.
분비능에서의 분비는, 분비 단백질의 분비(소위 가용성)와 동일한 의미이다. 따라서, 「분비능을 갖는다」란, 통상의 항체와 마찬가지로, 항체로서 기능하는 것을 의미한다.
상기 Fc 영역 단백질을 포함하는 항체는, 목적의 특성(예, 분비능, 항원 결합능)을 유지하는 한, 특정의 부위에, 변이가 도입되어 있어도 좋다. 목적의 특성을 유지할 수 있는, 변이가 도입되어도 좋은 아미노산 잔기의 위치는, 당업자에게 명백하다. 구체적으로는, 당업자는, 1) 동종의 특성을 갖는 복수의 단백질의 아미노산 서열을 비교하고, 2) 상대적으로 보존되어 있는 영역, 및 상대적으로 보존되어 있지 않은 영역을 명백하게 하고, 이어서, 3) 상대적으로 보존되어 있는 영역 및 상대적으로 보존되어 있지 않은 영역에서, 각각, 기능에 중요한 역할을 다할 수 있는 영역 및 기능에 중요한 역할을 다할 수 없는 영역을 예측할 수 있으므로, 구조·기능의 상관성을 인식할 수 있다. 따라서, 당업자는, 상기 Fc 영역 단백질을 포함하는 항체의 아미노산 서열에서 변이가 도입되어도 좋은 아미노산 잔기의 위치를 특정할 수 있다.
아미노산 잔기가 치환에 의해 변이되는 경우, 아미노산 잔기의 치환은, 보존적 치환이라도 좋다. 본 명세서 중에서 사용되는 경우, 용어 「보존적 치환」이란, 소정의 아미노산 잔기를, 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 치환하는 것을 말한다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는, 당해 분야에서 주지(周知)이다. 예를 들어, 이러한 패밀리로서는, 염기성 측쇄를 갖는 아미노산(예, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄를 갖는 아미노산(예, 아스파라긴산, 글루타민산), 비하전성 극성 측쇄를 갖는 아미노산(예, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 타이로신, 시스테인), 비극성 측쇄를 갖는 아미노산(예, 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), β위 분기 측쇄를 갖는 아미노산(예, 트레오닌, 발린, 이소류신), 방향족 측쇄를 갖는 아미노산(예, 타이로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘), 하이드록실기(예, 알코올성, 페놀성) 함유 측쇄를 갖는 아미노산(예, 세린, 트레오닌, 타이로신), 및 황 함유 측쇄를 갖는 아미노산(예, 시스테인, 메티오닌)을 들 수 있다. 바람직하게는, 아미노산의 보존적 치환은, 아스파라긴산과 글루타민산과의 사이에서의 치환, 아르기닌과 라이신과 히스티딘과의 사이에서의 치환, 트립토판과 페닐알라닌과의 사이에서의 치환, 페닐알라닌과 발린과의 사이에서의 치환, 류신과 이소류신과 알라닌과의 사이에서의 치환, 및 글리신과 알라닌과의 사이에서의 치환이라도 좋다.
본 발명에서 사용되는 항체, 또는 상기 (A) 내지 (C)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 어느 하나의 Fc 영역을 포함하는 항체로서는, 예를 들어, 키메라 항체(예, 리툭시맙, 바실릭시맙, 인플릭시맙, 세툭시맙, 실툭시맙, 디누툭시맙, 오르타톡사시맙(ortoxaximab)), 인간화 항체(예, 다클리주맙, 팔리비주맙, 트라스투주맙, 알렘투주맙, 오말리주맙, 에팔리주맙, 베바시주맙, 나탈리주맙(IgG4), 토실리주맙, 에쿨리주맙(IgG2), 모가물리주맙, 퍼투주맙, 오비누투주맙, 베돌리주맙, 펨브롤리주맙(IgG4), 메폴리주맙, 엘로투주맙, 다라투무맙, 익세키누맙(ixekizumab)(IgG4), 레슬리주맙(IgG4), 아테졸리주맙), 인간 항체(예, 아달리무맙, 파니투무맙, 골리무맙, 우스테키누맙, 카나키누맙, 오파투무맙, 데노수맙(IgG2), 이필리무맙, 벨리무맙, 락시바쿠맙, 라무시루맙, 니볼루맙(IgG4), 세쿠키누맙, 에볼로쿠맙(IgG2), 알리로쿠맙, 넥시투무맙, 브로달루맙(IgG2), 올랄라투맙, 두필루맙(IgG4))를 들 수 있다(IgG 서브 타입에 언급하고 있지 않은 경우, IgG1인 것을 나타낸다).
상술한 바와 같은 항체에 대한 친화성 물질로서는, 예를 들면, 펩타이드(올리고펩타이드, 폴리펩타이드, 및 단백질을 포함함), 저분자 화합물, 핵산, 핵산-펩타이드 복합체, 펩타이드-저분자 화합물 복합체, 핵산-저분자 복합체를 들 수 있다.
특정의 실시형태에서는, 상술한 바와 같은 항체에 대한 친화성 물질은, 펩타이드(올리고펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질을 포함한다. 당단백질이라도 좋음)라도 좋다. 이러한 펩타이드로서는, 예를 들면, 이하가 보고되고 있다:
(1) 인간 IgG 전반(즉, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4. 이하 동일)의 특정 영역(CH2 영역)에 친화성을 갖는 IgG 결합 펩타이드(예, 국제공개 제2016/186206호, 국제공개 제2013/027796호, 국제공개 제2008/054030호를 참조);
(2) 인간 IgG 전반의 특정 영역(CH2 영역)에 친화성을 갖는 ProteinA Mimetic(PAM) peptide(예, Fassina G et al., JOURNAL OF MOLECULAR RECOGNITION, 1996, VOL.6, 564-569를 참조);
(3) 인간 IgG 전반의 특정 영역(CH2 영역)에 친화성을 갖는 EPIHRSTLTALL(서열 번호 25)(예, Ehrlich G.K et al., J.Biochem. Biophys. Methods, 2001, VOL. 49, 443-454를 참조);
(4) 인간 IgG 전반의 특정 영역(Fc 영역)에 친화성을 갖는 (NH2-Cys1-X1-X2-X3-X4)2-Lys-Gly-OH(예, Ruvo M et al., ChemBioChem, 2005, VOL.6, 1242-1253을 참조);
(5) 인간 IgG 전반의 특정 영역(Fc 영역)에 친화성을 갖는 FARLVSSIRY(서열 번호 26), FGRLVSSIRY(서열 번호 27), 및 TWKTSRISIF(서열 번호 28)(예, Krook M et al., Journal of Immunological Methods, 1998, VOL. 221, 151-157을 참조);
(6) 인간 IgG 전반의 특정 영역에 친화성을 갖는 QSYP(서열 번호 29)(예, Jacobs J. M. et al., Bio. Techniques, 2003, VOL. 34, 132-141을 참조);
(7) 인간 IgG 전반의 특정 영역(Fc 영역)에 친화성을 갖는 HWRGWV(서열 번호 30), HYFKFD(서열 번호 31), 및 HFRRHL(서열 번호 32)(예, Carbonell R. G. et al., Journal of Chromatography A, 2009, VOL. 1216, 910-918을 참조);
(8) 인간 IgG 전반의 특정 영역(Fc 영역)에 친화성을 갖는 DAAG(서열 번호 33)(예, Lund L. N. et al., Journal of Chromatography A, 2012, VOL. 1225, 158-167을 참조);
(9) 인간 IgG 전반의 특정 영역(Fc 영역)에 친화성을 갖는 Fc-I, Fc-II, 및 Fc-III(예, Warren L. Delano et al., Science, 2000, VOL. 287, 1279-1283; 국제공개 2001/045746호 참조); 및
(10) 인간 IgG 전반의 특정 영역(Fc 영역)에 친화성을 갖는 NARKFYKG(서열 번호 34), 및 NKFRGKYK(서열 번호 35)(예, Biochemical Engineering Journal, 2013, VOL. 79, 33-40을 참조).
다른 특정의 실시형태에서는, 상술한 바와 같은 항체에 대한 친화성 물질은, 펩타이드 이외의 물질이라도 좋다. 이러한 물질로서는, 예를 들어, 인간 IgG(예, 인간 IgG1 내지 4)의 특정 영역(CH2 영역, 특히 Lys340의 측쇄)에 친화성을 갖는 앱타머〔예, GGUGCU 및 GGUGAU 등의 GGUG(C/A)(U/T) 모티프 함유 앱타머〕가 보고되어 있다(예, 국제공개 제2007/004748호; Nomura Y et al., Nucleic Acids Res., 2010 Nov; 38(21): 7822-9; Miyakawa S et al., RNA., 2008 Jun; 14(6): 1154-63을 참조).
상술한 바와 같은 항체에 대한 친화성 물질은, 당해 분야에서의 임의의 공지의 방법에 의해 얻을 수 있다. 예를 들어, 항체 전체, 또는 항체 중의 부분 펩타이드(예, 항체 표면 노출 영역이 판명되어 있는 경우, 당해 영역 중에 존재하는 부분 펩타이드)를 사용하여, 항체를 제작함으로써(예, 하이브리도마법), 또는 친화성 물질을 입수 가능한 라이브러리(예, 펩타이드 라이브러리, 항체 라이브러리, 항체 생산 세포 라이브러리, 앱타머 라이브러리, 파지 라이브러리, mRNA 라이브러리, cDNA 라이브러리)로부터 친화성 물질을 스크리닝함으로써(예, 파지 디스플레이법, SELEX법, mRNA 디스플레이법, 리보솜 디스플레이법, cDNA 디스플레이법, 효모 디스플레이법), 취득할 수 있다. 또한, 항체에 대한 친화성 물질이 항체의 Fc 영역(가용성 영역)에 대한 친화성 물질인 경우, 각종 항체(예, IgG, IgA, IgM, IgD, IgE)의 Fc 영역의 특정 영역(예, CH1, CH2, CH3) 중에 존재하는 부분 펩타이드를 사용함으로써, 항체의 Fc 영역 중의 임의의 부분에 대하여 선택적으로 결합할 수 있는 친화성 물질(예, 항체, 앱타머)을 효율적으로 취득할 수 있다. 이렇게 하여 취득되는 친화성 물질 중에는, 친화적 결합능이 상대적으로 강한 것 및 약한 것이 혼재한다. 그러나, 친화적 결합능이 약한 친화성 물질이라도, 과잉량으로 사용함으로써, 그 친화적 결합능을 보강할 수 있다.
바람직한 실시형태에서는, 항체에 대한 친화성 물질은, 펩타이드이다. 이러한 펩타이드로서는, 모노클로날 항체의 정상 영역에 대한 결합능을 갖는 펩타이드가 바람직하고, 모노클로날 항체의 Fc 영역에 대한 결합능을 갖는 펩타이드가 보다 바람직하고, IgG의 Fc 영역에 대한 결합능을 갖는 펩타이드가 보다 더욱 바람직하다. 펩타이드의 길이로서는, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, 10 내지 40(예, 10 내지 20, 20 내지 30, 및 30 내지 40)의 아미노산 잔기로 이루어진 펩타이드이다. 펩타이드를 구성하는 아미노산 잔기로서는, 천연 단백질을 구성하는 20종의 L-α-아미노산 잔기 및 입체이성체(예, D-아미노산), 그것들의 이성체(예, β-아미노산)를 들 수 있다.
특정의 실시형태에서는, 상술한 바와 같은 항체에 대한 친화성 물질은, 이하 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드라도 좋다.
(a-1-1) FNMQQQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDD(서열 번호 11)의 아미노산 서열(예, 화합물 22 내지 24, 29를 참조), 또는,
(a-1-2) FNMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDC(서열 번호 12)의 아미노산 서열(공지 서열 Z34C에서 두 K가 R로 치환되어 있는 아미노산 서열)에서, 서열 중 어느 하나의 1개 내지 3개의 아미노산 잔기가, 동일해도 상이해도 좋고, 라이신 잔기, 아스파라긴산 잔기, 및 글루타민산 잔기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 각각 하나의 아미노산 잔기에 의해 치환되어 있거나,
(a-2-1) β-Ala-NMQQQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDD(서열 번호 13)의 아미노산 서열(예, 화합물 26 내지 28을 참조), 또는,
(a-2-2) β-Ala-NMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDC(서열 번호 14)의 아미노산 서열(공지 서열 Z34C에서 두 K가 R로 치환되어 있고, 또한 N 말단의 F가 β-Ala로 치환되어 있는 아미노산 서열)에서, 서열 중 어느 하나의 1개 내지 3개의 아미노산 잔기가, 동일해도 상이해도 좋고, 라이신 잔기, 아스파라긴산 잔기, 및 글루타민산 잔기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 각각 하나의 아미노산 잔기에 의해 치환되어 있고, 또한
(b) 서열 번호 11 내지 14의 상기 아미노산 서열 각각에 대하여 85% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드.
이러한 펩타이드는, 모노클로날 항체의 Fc 영역에 대한 결합능을 갖는다.
서열 번호 12의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드는, 펩타이드 시약 합성상의 사정에 의해, Z34C로서 알려져 있는 친화성 펩타이드에서 N 말단으로부터 세어 26번째와 28번째 두 K(라이신)를 R(아르기닌)로 변경한 것이다. 상기 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 포함하는 본 발명의 화합물은, 인간 IgG Fc에서의 특정의 아미노산 잔기(예, Eu numbering에 따른 Lys248 잔기 또는 Lys246 잔기, Lys288 또는 Lys290, Lys317, 또는 그것들 잔기 이외의 다른 아미노산 잔기)의 위치 선택적인 수식에 유용하다. 또한, 상기 Z34C의 아미노산 서열은, FNMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNAKIKSIRDDC(서열 번호 36)이다(예, Starovasnik, M.A.et al., Structural mimicry of a native protein by a minimized binding domain., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 94, 10080-10085(1997)를 참조).
친화성 펩타이드는, 인간 IgG(예, 상술한 바와 같은 인간 IgG. 바람직하게는 인간 IgG1)에 대한 친화성을 가질 수 있다. 상기 친화성 펩타이드는, 두 시스테인 잔기(예, 5 위치 및 34 위치)를 포함하는 경우, 두 시스테인 잔기가 디설파이드 결합하여 환상 펩타이드를 형성하고 있어도 좋다.
라이신 잔기, 아스파라긴산 잔기, 또는 글루타민산 잔기(가교제에 의해서 수식이 용이한 아미노산 잔기)가 도입되는 위치로서는, 인간 IgG1 등의 인간 IgG에 대한 친화성을 갖는 한 임의의 위치를 이용할 수 있다. 이러한 위치에 대해서는, 당업자라면 용이하게 동정할 수 있다. 라이신 잔기, 아스파라긴산 잔기, 또는 글루타민산 잔기가 도입되는 위치는, 시스테인 잔기 이외의 아미노산 잔기라도 좋다. 보다 바람직하게는, 가교제에 의해서 용이하게 수식할 수 있는 아미노산 잔기가 도입되는 위치로서는, 예를 들어, 1 위치, 3 위치, 6 위치, 7 위치, 13 위치, 20 위치, 24 위치, 31 위치, 및 32 위치의 아미노산 잔기를 들 수 있다.
바람직하게는 (a) 및 (b)의 특성을 갖는 상기 아미노산 서열은, 라이신 잔기, 아스파라긴산 잔기, 및 글루타민산 잔기(가교제에 의해서 용이하게 수식할 수 있는 아미노산 잔기)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나의 특정의 아미노산 잔기(바람직하게는, 라이신 잔기)를 소정의 위치에 갖고, 또한, 천연 단백질을 구성하는 통상의 20종의 아미노산 잔기(바람직하게는, 라이신 잔기, 아스파라긴산 잔기, 및 글루타민산 잔기 이외의 17종의 아미노산 잔기이고, 보다 바람직하게는 라이신 잔기 이외의 19종의 아미노산 잔기)의 변이를 당해 소정의 위치 이외의 위치에 갖는 것도 또한 바람직하다. 이러한 소정의 위치는, 특별히 한정되지 않고, 예를 들어, 1 위치, 3 위치, 6 위치, 7 위치, 13 위치, 20 위치, 24 위치, 31 위치, 및 32 위치를 들 수 있다. (a) 및 (b)의 특성을 갖는 상기 아미노산 서열은, 두 시스테인 잔기가 유지되고 있고, 이러한 두 시스테인 잔기는 디설파이드 결합에 의해 결합하고 있어도 좋다. 서열 번호 11 내지 14의 상기 아미노산 서열에 대하여 85% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열은, 아미노산 잔기의 결실, 치환, 부가 및 삽입으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1, 2, 3 또는 4종의 변이(바람직하게는 치환)에 의해, 1 내지 3개(바람직하게는 1 또는 2개, 보다 바람직하게는 1개)의 아미노산 잔기가 개변된 것이라도 좋다. 아미노산 잔기의 변이는, 아미노산 서열 중의 하나의 영역에 도입되어도 좋지만, 복수의 다른 영역에 도입되어도 좋다.
보다 바람직하게는 (a) 및 (b)의 특성을 갖는 상기 아미노산 서열은, 이하 (c) 또는 (d)라도 좋다.
(c) 이하 (1) 내지 (16)의 아미노산 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열:
(1) FNMQQQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIKDD(서열 번호 5);
(2) FNMQQQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIKSIRDD(서열 번호 6);
(3) β-Ala-NMQQQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDD(서열 번호 7);
(4) FNMQQQRRFYEALHDPNLNEEQRNAKIKSIKDD(서열 번호 8);
(5) KNMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDC(서열 번호 37);
(6) FNMQCQKRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDC(서열 번호 38);
(7) FNMQCQRRFYEAKHDPNLNEEQRNARIRSIRDDC(서열 번호 39);
(8) FNMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRKARIRSIRDDC(서열 번호 40);
(9) FNMQCQRRFYEALHDPNLNKEQRNARIRSIRDDC(서열 번호 41);
(10) FNMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIKDDC(서열 번호 42);
(11) FNKQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDC(서열 번호 43);
(12) FNMQCKRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDC(서열 번호 44);
(13) FNMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRKDC(서열 번호 45);
(14) β-Ala-NMQQQRRFYEALHDPNLEEQRNARIRSI(서열 번호 97);
(15) FNMQQQRRFYEALHDPNLNKEQRNARIRSIRDD(서열 번호 98); 및
(16) β-Ala-NMQQQRRFYEALHDPNLEEQRNARIRSIKDD(서열 번호 100); 또는
(d) 상기 (1) 내지 (16) 중 어느 하나의 아미노산 서열에서, 하나의 라이신 잔기 및 두 시스테인 잔기 이외의 위치(예, 1 위치, 3 위치, 6 위치, 7 위치, 13 위치, 20 위치, 24 위치, 31 위치, 및 32 위치의 위치)에서, 라이신 잔기 이외의 19종의 아미노산 잔기의 변이를 갖는, 상기 (1) 내지 (16) 중 어느 하나의 아미노산 서열에 대하여 90% 이상의 동일성(상술한 바와 같은 개수의 아미노산 잔기의 수식이라도 좋음)을 갖는 아미노산 서열. 이러한 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드는, IgG의 Fc 영역에 대한 결합능을 갖는 것이 확인되고 있다. (d)의 상기 아미노산 서열을 갖는 친화성 펩타이드는, 모노클로날 항체의 정상 영역에 대한 결합능을 갖는 펩타이드가 바람직하고, 모노클로날 항체의 Fc 영역에 대한 결합능을 갖는 펩타이드가 보다 바람직하고, IgG의 Fc 영역에 대한 결합능을 갖는 펩타이드가 보다 더욱 바람직하다.
상기 친화성 펩타이드는, 서열 번호 11 내지 14의 상기 아미노산 서열 또는 상기 (1) 내지 (16)의 아미노산 서열에 대하여 85% 이상의 동일성을 갖는 한, 가교제에 의해서 수식이 용이한 하나의 아미노산 잔기의 도입 이외에도, 추가적인 아미노산 잔기의 변이를 갖고 있어도 좋다. 추가적인 아미노산의 변이를 도입할 수 있는 위치에 대해서는, 당업자라면 용이하게 동정할 수 있다. 예를 들어, 1 위치의 페닐알라닌 잔기, 6 위치의 아르기닌 잔기, 13 위치의 류신 잔기, 20 위치의 글루타민산 잔기, 24 위치의 아스파라긴 잔기, 또는 31 위치의 아르기닌 잔기(가교제에 의해서 용이하게 수식할 수 있는 아미노산 잔기가 이미 도입된 위치를 제외함)라도 이용할 수 있다. 추가적인 아미노산의 변이에 의해 도입할 수 있는 아미노산으로서는, 예를 들면, 알라닌(A), 아스파라긴(N), 시스테인(C), 글루타민(Q), 글리신(G), 이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 페닐알라닌(F), 프롤린(P), 세린(S), 트레오닌(T), 트립토판(W), 타이로신(Y), 발린(V), 아스파라긴산(D), 글루타민산(E), 아르기닌(R), 히스티딘(H), 및 라이신(L)을 들 수 있다. 바람직하게는, 라이신 이외의 이러한 19종의 아미노산이 이용되어도 좋다. 아미노산은 L체 또는 D체 중 어느 것이라도 좋지만, L체가 바람직하다(실시예에서는 펩타이드를 구성하는 아미노산 잔기는 모두 L체이다).
서열 번호 11 내지 14의 상기 아미노산 서열 또는 (1) 내지 (16)의 상기 아미노산 서열에 대한 동일성%의 정도는, 상술한 대로 결정할 수 있다. 동일성%의 정도는, 바람직하게는 90% 이상, 92% 이상, 보다 바람직하게는 94% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 95% 이상, 특히 바람직하게는 97% 이상(즉, 하나의 아미노산 잔기의 변이만을 갖는 것)이라도 좋다.
다른 특정의 실시형태에서는, 상술한 바와 같은 항체에 대한 친화성 물질은, 이하 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드이다.
식 1-1: (X0-3)a-C-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-I-I-W-C-(X0-3)b (서열 번호 15)
식 1-2: (X0-3)a-C-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-I-V-W-C-(X0-3)b (서열 번호 16)
식 1-3:(X0-3)a-C-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-V-V-W-C-(X0-3)b (서열 번호 17)
식 1-4: (X0-3)a-C-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-A-V-W-C-(X0-3)b (서열 번호 18)
식 1-5: (X0-3)a-C-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-L-L-W-C-(X0-3)b (서열 번호 19)
식 1-6: (X0-3)a-C-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-L-I-W-C-(X0-3)b (서열 번호 20)
식 1-7: (X0-3)a-C-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-L-V-F-C-(X0-3)b (서열 번호 21)
식 1-8: (X0-3)a-C-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Q-V-W-C-(X0-3)b (서열 번호 22)
식 1-9: (X0-3)a-C-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-E-V-W-C-(X0-3)b (서열 번호 23)
〔식 중,
　(X0-3)a는, 없음, 아르기닌 잔기-글리신 잔기-아스파라긴 잔기, 글리신 잔기-아스파라긴 잔기, 아스파라긴산 잔기, 또는 아스파라긴 잔기이고,
　(X0-3)B는 없음, 트레오닌 잔기-타이로신 잔기-히스티딘 잔기, 또는 트레오닌 잔기이고,
　Xaa1은, 알라닌 잔기이고,
　Xaa2는, 타이로신 잔기, 트립토판 잔기, 또는 히스티딘 잔기이고,
　Xaa3는, 히스티딘 잔기, 페닐알라닌 잔기, 타이로신 잔기, 트립토판 잔기, 아르기닌 잔기, 또는 글리신 잔기이고,
　Xaa4는, 라이신 잔기, 아스파라긴산 잔기, 또는 글루타민산 잔기이고,
　Xaa5는, 글리신 잔기, 세린 잔기, 아스파라긴 잔기, 글루타민 잔기, 아스파라긴산 잔기, 글루타민산 잔기, 페닐알라닌 잔기, 타이로신 잔기, 트립토판 잔기, 히스티딘 잔기, 트레오닌 잔기, 류신 잔기, 알라닌 잔기, 발린 잔기, 이소류신 잔기, 또는 아르기닌 잔기이고,
　Xaa6는, 글루타민 잔기, 글루타민산 잔기, 아스파라긴 잔기, 또는 아스파라긴산 잔기이다.〕, 또는
식 2-1: (X0-3')a-C-(Xaa1')-(Xaa2')-(Xaa3')-(Xaa4')-(Xaa5')-(Xaa6')-L-V-W-C-(X0-3')b (서열 번호 24)
〔식 중,
　(X0-3')a 및 (X0-3')b는 각각, 상기 (X0-3)a 및 (X0-3)b와 동일하고,
　Xaa1', Xaa2', Xaa3', Xaa4', Xaa5', Xaa6'는 각각, 상기 Xaa1, Xaa2, Xaa3, Xaa4, Xaa5, Xaa6과 동일하다.〕.
이러한 펩타이드는, 모노클로날 항체의 Fc 영역에 대한 결합능을 갖는다.
상기 식 1-1 내지 1-9, 및 식 2-1로 표시되는 아미노산 서열에서, (X0-3)a는,없음, 아르기닌 잔기-글리신 잔기-아스파라긴 잔기, 글리신 잔기-아스파라긴 잔기, 아스파라긴산 잔기, 또는 아스파라긴 잔기이고, 바람직하게는, 없음, 아르기닌 잔기-글리신 잔기-아스파라긴 잔기, 아스파라긴산 잔기, 또는 아스파라긴 잔기이다.
상기 식 1-1 내지 1-9, 및 식 2-1로 표시되는 아미노산 서열에서, Xaa2는, 타이로신 잔기, 트립토판 잔기, 또는 히스티딘 잔기이고, 바람직하게는, 타이로신 잔기, 또는 트립토판 잔기이다.
상기 식 1-1 내지 1-9, 및 식 2-1로 표시되는 아미노산 서열에서, Xaa3는, 히스티딘 잔기, 페닐알라닌 잔기, 타이로신 잔기, 트립토판 잔기, 아르기닌 잔기, 또는 글리신 잔기이고, 바람직하게는, 히스티딘 잔기이다.
상기 식 1-1 내지 1-9, 및 식 2-1로 표시되는 아미노산 서열에서, Xaa4는, 라이신 잔기, 아스파라긴산 잔기, 또는 글루타민산 잔기이고, 바람직하게는, 라이신 잔기이다 .
상기 식 1-1 내지 1-9, 및 식 2-1로 표시되는 아미노산 서열에서, Xaa5는, 글리신 잔기, 세린 잔기, 아스파라긴 잔기, 글루타민 잔기, 아스파라긴산 잔기, 글루타민산 잔기, 페닐알라닌 잔기, 타이로신 잔기, 트립토판 잔기, 히스티딘 잔기, 트레오닌 잔기, 류신 잔기, 알라닌 잔기, 발린 잔기, 이소류신 잔기, 또는 아르기닌 잔기이고, 바람직하게는, 글리신 잔기, 트레오닌 잔기, 류신 잔기이다.
상기 식 1-1 내지 1-9, 및 식 2-1로 표시되는 아미노산 서열에서, Xaa6는, 글루타민 잔기, 글루타민산 잔기, 아스파라긴 잔기, 또는 아스파라긴산 잔기이고,보다 바람직하게는, 글루타민 잔기이다.
바람직하게는, 상기 식 1-1 내지 1-9, 및 식 2-1로 표현되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드는, 하기 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드이다:
(1') RGNCAYHKGQIIWCTYH(서열 번호 46);
(2') RGNCAYHKGQIVWCTYH(서열 번호 47);
(3') RGNCAYHKGQVVWCTYH(서열 번호 48);
(4') RGNCAYHKGQAVWCTYH(서열 번호 49);
(5') RGNCAYHKGQLLWCTYH(서열 번호 50);
(6') RGNCAYHKGQLIWCTYH(서열 번호 51);
(7') DCAYHKGQIVWCT (서열 번호 52);
(8') DCAYHKGQVVWCT (서열 번호 53);
(9') DCAYHKGQAVWCT (서열 번호 54);
(10') RGNCAYHKSQIIWCTYH(서열 번호 55);
(11') RGNCAYHKNQIIWCTYH(서열 번호 56);
(12') RGNCAYHKDQIIWCTYH(서열 번호 57);
(13') RGNCAYHKQQIIWCTYH(서열 번호 58);
(14') RGNCAYHKEQIIWCTYH(서열 번호 59);
(15') RGNCAYHKFQIIWCTYH(서열 번호 60);
(16') RGNCAYHKYQIIWCTYH(서열 번호 61);
(17') RGNCAYHKWQIIWCTYH(서열 번호 62);
(18') RGNCAYHKHQIIWCTYH(서열 번호 63);
(19') RGNCAYHKTQIIWCTYH(서열 번호 64);
(20') RGNCAYHKLQIIWCTYH(서열 번호 65);
(21') CAYHKLQIVWC (서열 번호 66);
(22') CAYHKLQLIWC (서열 번호 67);
(23') CAYHKSQIVWC (서열 번호 68);
(24') RGNCAYHKGQLVFCTYH(서열 번호 69);
(25') RGNCAYHKGQQVWCTYH(서열 번호 70);
(26') RGNCAYHKGQEVWCTYH(서열 번호 71);
(27') CAYHKGQLVWC (서열 번호 72);
(28') RGNCAYHKAQLVWCTYH(서열 번호 73);
(29') RGNCAYHKVQLVWCTYH(서열 번호 74);
(30') RGNCAYHKLQLVWCTYH(서열 번호 75);
(31') RGNCAYHKIQLVWCTYH(서열 번호 76);
(32') RGNCAYHKSQLVWCTYH(서열 번호 77);
(33') RGNCAYHKTQLVWCTYH(서열 번호 78);
(34') RGNCAYHKNQLVWCTYH(서열 번호 79);
(35') RGNCAYHKDQLVWCTYH(서열 번호 80);
(36') RGNCAYHKQQLVWCTYH(서열 번호 81);
(37') RGNCAYHKEQLVWCTYH(서열 번호 82);
(38') RGNCAYHKFQLVWCTYH(서열 번호 83);
(39') RGNCAYHKRQLVWCTYH(서열 번호 84);
(40') RGNCAYHKHQLVWCTYH(서열 번호 85);
(41') RGNCAYHKWQLVWCTYH(서열 번호 86);
(42') RGNCAYHKYQLVWCTYH(서열 번호 87);
(43') RGNCAYFKGQLVWCTYH(서열 번호 88);
(44') RGNCAYYKGQLVWCTYH(서열 번호 89);
(45') RGNCAYWKGQLVWCTYH(서열 번호 90);
(46') RGNCAYRKGQLVWCTYH(서열 번호 91);
(47') RGNCAYGKGQLVWCTYH(서열 번호 92);
(48') DCAYHKGQLVWC (서열 번호 93);
(49') NCAYHKGQLVWC (서열 번호 94);
(50') CAYHKGQLVWCT (서열 번호 95);
(51') CAYHKSQLVWC (서열 번호 96);
(52') GNCAYHKGQIIWCTYH(서열 번호 99); 및
(53') RGNCAYHEGQIIWCTYH(서열 번호 108).
이러한 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드는, IgG의 Fc 영역에 대한 결합능을 갖는 것이 확인되고 있다.
상기 펩타이드의 각 아미노산 서열 중에 이간된 적어도 두 시스테인 잔기는, 디설파이드 결합에 의해 환상 펩타이드를 형성할 수 있다. 또는, 상기 펩타이드에서, 두 시스테인 잔기 중의 설파이드기는, 이하에 표시되는 카보닐기 함유 링커에 의해 연결되어 있어도 좋다.
Figure pct00008
상기에서 표시되는 카보닐기 함유 링커의 파선 부분은, 설파이드기와의 결합 부분을 의미한다. 당해 링커는, 통상의 디설파이드 결합보다도, 환원 반응 등에 대하여 안정적이다. 이러한 펩타이드는, 예를 들면, 국제공개 제2016/186206호에 기재된 방법에 의해, 조제할 수 있다.
상기 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 포함하는 본 발명의 화합물은, 인간 IgG Fc에서의 특정의 아미노산 잔기(예, Eu numbering에 따른 Lys248 잔기 또는 Lys246 잔기, Lys288 또는 Lys290, Lys317, 또는 그들 잔기 이외의 다른 아미노산 잔기)의 위치 선택적인 수식에 유용하다. 상기 펩타이드를 구성하는 아미노산은 L체 또는 D체 중 어느 것이라도 좋지만, L체가 바람직하다(실시예에서는 펩타이드를 구성하는 아미노산 잔기는 모두 L체이다).
상기 펩타이드는, 가교제에 의해 특정의 아미노산 잔기가 수식되어도 좋다. 이러한 특정의 아미노산 잔기로서는, 예를 들어, 라이신 잔기, 아스파라긴산 잔기, 및 글루타민산 잔기를 들 수 있지만, 바람직하게는, 라이신 잔기이다. 가교제로서는, 예를 들어, DSG(disuccinimidyl glutarate, 디숙신이미딜글루타레이트), DSS(disuccinimidyl suberate, 디숙신이미딜수베레이트) 등의 숙신이미딜기를 바람직하게는 2 이상 포함하는 가교제, DMA(dimethyl adipimidate·2HCl, 아디프이미드산디메틸2염산염), DMP(dimethyl pimelimidate·2HCl, 피멜이미드산디메틸2염산염), 및 DMS(dimethyl suberimidate·2HCl, 수베르이미드산디메틸2염산염) 등의 이미드산 부분을 바람직하게는 2 이상 포함하는 가교제, 및 DTBP(dimethyl 3,3'-dithiobispropionimidate·2HCl, 3,3'-디티오비스프로피온이미드산디메틸2염산염) 및 DSP(dithiobis(succinimidyl propionate), 디티오비스숙신이미딜프로피온산) 등의 SS 결합을 갖는 가교제를 들 수 있다(예, 국제공개 제2016/186206호).
항체에 대한 친화성 물질이 펩타이드인 경우, 펩타이드는, 말단에 있는 아미노기 및 카복시기가 보호되어 있어도 좋다. N-말단 아미노기의 보호기로서는, 예를 들면, 알킬카보닐기(아실기)(예, 아세틸기, 프로폭시기, tert-부톡시카보닐기 등의 부톡시카보닐기), 알킬옥시카보닐기(예, 플루오레닐메톡시카보닐기), 아릴옥시카보닐기, 아릴알킬(아랄킬)옥시카보닐기(예, 벤질옥시카보닐기)를 들 수 있다. N-말단 아미노기의 보호기로서는, 아세틸기가 바람직하다. C-말단 카복시기의 보호기로서는, 예를 들면, 에스테르 또는 아미드를 형성 가능한 기를 들 수 있다. 에스테르 또는 아미드를 형성 가능한 기로서는, 예를 들면, 알킬옥시기(예, 메틸옥시, 에틸옥시, 프로필옥시, 부틸옥시, 펜틸옥시, 헥실옥시), 아릴옥시기(예, 페닐옥시, 나프틸옥시), 아랄킬옥시기(예, 벤질옥시), 아미노기를 들 수 있다. C-말단 카복시기의 보호기로서는, 아미노기가 바람직하다.
1-3. 이탈기를 포함하는 2가의 기 (L)
화학식 I에서, L은 이탈기를 포함하는 2가의 기이다.
이탈기는, 항체 중의 친핵기와, 친전자기를 포함하는 2가의 기 (E)에 포함되는 친전자기 사이의 반응에 의해 E로부터 절단되어 이탈하는 능력을 갖는 기이다. 이러한 이탈기는, 당해 분야에서의 기술 상식이다(예, Fujishima,S.et al J.Am.Chem.Soc,2012, 134, 3961-3964.(전술); Chem.Sci.2015 3217-3224.; Nature Chemistry volume 8, pages 542-548(2016)). 이탈기로서는, 상기와 같은 반응에 의해 E로부터 절단되는 능력을 갖는 한 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, (1) -O-, -S-, -Se-, -SO2-O-, -SO2-N(R)-, -SO2-, -C≡C-CH2-O-, -N(OR)-, -N(R)- 및 -O-N(R)-로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 기 (여기서, R은 수소 원자 또는 탄소 원자수 1 내지 6의 알킬이다.), 및 (2) 헤테로아릴렌을 들 수 있다.
탄소 원자수 1 내지 6의 알킬로서는, 예를 들어, 메틸, 에틸, N-프로필, i-프로필, N-부틸, s-부틸, 이소부틸, t-부틸, 펜틸, 헥실을 들 수 있다. 탄소 원자수 1 내지 6의 알킬로서는, 탄소 원자수 1 내지 4의 알킬이 바람직하다.
이탈기의 예인, -O-, -S-, -Se-, -SO2O-, -SO2-N(R)-, -SO2-, -C≡C-CH2-O-, -N(OR)-, -N(R)- 및 -O-N(R)-로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 기는, 하기 (1) 또는 (2)이다:
(1) -O-, -S-, -Se-, -SO2-O-, -SO2-N(R)-, -SO2-, -C≡C-CH2-O-, -N(OR)-, -N(R)-, 또는 -O-N(R)-로 이루어진 기; 또는
(2) -O-, -S-, -Se-, -SO2-O-, -SO2-N(R)-, -SO2-, -C≡C-CH2-O-, -N(OR)-, -N(R)-, 또는 -O-N(R)- 및 그 이탈하는 능력을 높이는 기를 포함하는 기.
-O-, -S-, -Se-, -SO2-O-, -SO2-N(R)-, -SO2-, -C≡C-CH2-O-, -N(OR)-, -N(R)-, 또는 -O-N(R)-의 이탈하는 능력을 높이는 기는, 당해 기가 -O-, -S-, -Se-, -SO2-O-, -SO2-N(R)-, -SO2-, -C≡C-CH2-O-, -N(OR)-, -N(R)-, 또는 -O-N(R)-에 인접하여 존재하는 경우, 당해 기가 -O-, -S-, -Se-, -SO2-O-, -SO2-N(R)-, -SO2-, -C≡C-CH2-O-, -N(OR)-, -N(R)-, 또는 -O-N(R)-에 인접하여 존재하지 않는 경우에 비해, -O-, -S-, -Se-, -SO2-O-, -SO2-N(R)-, -SO2-, -C≡C-CH2-O-, -N(OR)-, -N(R)-, 또는 -O-N(R)-가 친전자기로부터 이탈하는 능력을 높이는 기이다. 환언하면, -O-, -S-, -Se-, -SO2-O-, -SO2-N(R)-, -SO2-, -C≡C-CH2-O-, -N(OR)-, -N(R)-, 또는 -O-N(R)-의 이탈하는 능력을 높이는 기는, 산소 원자, 황 원자, 셀렌 원자, 또는 질소 원자의 전자를 흡인하는 능력을 갖는 기이다.
-O-, -S-, -Se-, -SO2-O-, -SO2-N(R)-, -SO2-, -C≡C-CH2-O-, -N(OR)-, -N(R)-, 또는 -O-N(R)-의 이탈하는 능력을 높이는 기의 바람직한 예로서는, 전자 흡인성 기로 치환되어 있어도 좋은 아릴렌, 전자 흡인성 기로 치환되어 있어도 좋은 헤테로아릴렌, 축환하고 있어도 좋은 2,5-디케토피롤리딘, 축환하고 있어도 좋은 2,6-디케토피페리딘, 축환하고 있어도 좋은 2-케토피롤리딘, 축환하고 있어도 좋은 2-케토피페리딘, 및 2-피리돈을 들 수 있다. 아릴렌 및 헤테로아릴렌이 갖고 있어도 좋은 전자 흡인성 기의 수는, 1 이상(예를 들면 1 내지 3, 바람직하게는 1 또는 2)이다. 전자 흡인성 기로서는, 예를 들어, 할로겐 원자, 할로겐 원자로 치환된 알킬(예, 트리플루오로메틸), 보론산 잔기, 메실, 토실, 트리플레이트, 니트로, 시아 노, 페닐기, 케토기(예, 아실)를 들 수 있다.
「전자 흡인성 기로 치환되어 있어도 좋은 아릴렌」에서의 「아릴렌」으로서는, 탄소 원자수 6 내지 24의 아릴렌이 바람직하고, 탄소 원자수 6 내지 18의 아릴렌이 보다 바람직하고, 탄소 원자수 6 내지 14의 아릴렌이 보다 더욱 바람직하고, 탄소 원자수 6 내지 10의 아릴렌이 가장 바람직하다. 전자 흡인성 기로 치환되어 있어도 좋은 아릴렌은 또한, 전자 흡인성 기 이외의 치환기에 의해 치환되어 있어도, 치환되어 있지 않아도 좋다. 상기 탄소 원자수에 전자 흡인성 기 및 그 이외의 치환기의 탄소 원자수는 포함되지 않는다. 아릴렌으로서는, 예를 들면, 페닐렌, 나프틸렌, 안트라세닐렌을 들 수 있다.
「전자 흡인성 기로 치환되어 있어도 좋은 헤테로아릴렌」에서의 「헤테로아릴렌」으로서는, 탄소 원자수 1 내지 21의 헤테로아릴렌이 바람직하고, 탄소 원자수 1 내지 15의 헤테로아릴렌이 보다 바람직하고, 탄소 원자수 1 내지 9의 헤테로아릴렌이 보다 더욱 바람직하고, 탄소 원자수 1 내지 6의 헤테로아릴렌이 가장 바람직하다. 전자 흡인성 기로 치환되어 있어도 좋은 헤테로아릴렌은 또한, 전자 흡인성 기 이외의 치환기에 의해 치환되어 있어도, 치환되어 있지 않아도 좋다. 상기 탄소 원자수에 전자 흡인성 기 및 그 이외의 치환기의 탄소 원자수는 포함되지 않는다. 헤테로아릴렌은, 질소 원자, 산소 원자 및 황 원자로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1 이상(예를 들면 1 내지 5, 바람직하게는 1 내지 4, 보다 바람직하게는 1 내지 3)의 헤테로 원자를 환 구성 원자로서 포함한다. 헤테로아릴렌으로서는, 예를 들어, 피롤디일, 푸란디일, 티오펜디일, 피리딘디일, 피리다진디일, 피리미딘디일, 피라진디일, 트리아진디일, 피라졸디일, 이미다졸디일, 티아졸디일, 이소티아졸디일, 옥사졸디일, 이소옥사졸디일, 트리아졸디일, 테트라졸디일, 인돌디일, 퓨린디일, 안트라퀴논디일, 카바졸디일, 플루오렌디일, 퀴놀린디일, 이소퀴놀린디일, 퀴나졸린디일, 및 프탈라진디일을 들 수 있다.
축환하고 있어도 좋은 2,5-디케토피롤리딘, 축환하고 있어도 좋은 2,6-디케토피페리딘, 축환하고 있어도 좋은 2-케토피롤리딘, 축환하고 있어도 좋은 2-케토피페리딘, 및 2-피리돈은, 전자 흡인성 기 등의 치환기에 의해 치환되어 있어도, 치환되어 있지 않아도 좋다.
이탈기의 예인 헤테로아릴렌은, π 전자 밀도가 낮은(즉, 1 미만인) 헤테로아릴렌이다. 이탈기인 헤테로아릴렌으로서는, 질소 원자를 환 구성 원자로서 함유하는 헤테로아릴렌이 바람직하다. 질소 원자를 환 구성 원자로서 함유하는 헤테로아릴렌으로서는, 질소 원자를 환 구성 원자로서 함유하는 탄소 원자수 1 내지 21의 헤테로아릴렌이 바람직하고, 질소 원자를 환 구성 원자로서 함유하는 탄소 원자수 1 내지 15의 헤테로아릴렌이 보다 바람직하고, 질소 원자를 환 구성 원자로서 함유하는 탄소 원자수 1 내지 9의 헤테로아릴렌이 더욱 바람직하다. 이탈기인 헤테로아릴렌은, 전자 흡인성 기 등의 치환기에 의해 치환되어 있어도, 치환되어 있지 않아도 좋다. 상기 탄소 원자수에 치환기의 탄소 원자수는 포함되지 않는다. 질소 원자를 환 구성 원자로서 함유하는 이탈기인 헤테로아릴렌으로서는, 예를 들면, 이미다졸디일, 트리아졸디일, 테트라졸디일, 2-피리돈디일(즉, 2-하이드록시피리딘디일)을 들 수 있다.
-O-, -S-, -Se-, -SO2-O-, -SO2-N(R)-, -SO2-, -C≡C-CH2-O-, -N(OR)-, -N(R)-, 또는 -O-N(R)-의 이탈하는 능력을 높이는 기의 예인 「전자 흡인성 기로 치환되어 있어도 좋은 아릴렌」 등의 기, 및 이탈기의 예인 「헤테로아릴렌」은, 예를 들어 1 내지 5개, 바람직하게는 1 내지 3개, 보다 바람직하게는 1 또는 2개의 치환기를 갖고 있어도, 갖고 있지 않아도 좋다. 화학 구조가 간결한 화합물을 합성하는 관점에서는, 이러한 치환기를 갖지 않는 것이 바람직하다. 한편, 상기와 같은 기가 치환기를 갖는 경우, 이러한 치환기로서는, 예를 들어, 이하를 들 수 있다:
(i) 할로겐 원자;
(ii) 1가의 탄화수소기;
(iii) 아랄킬;
(iv) 1가의 복소환기;
(v) Ra-O-, Ra-C(=O)-, Ra-O-C(=O)-, 또는 Ra-C(=O)-O-(Ra는, 수소 원자, 또는 1가의 탄화수소기를 나타낸다.); 또는
(vi) NRbRc-, NRbRc-C(=O)-, NRbRc-C(=O)-O-, 또는 Rb-C(=O)-NRc-(Rb 및 Rc는, 동일 또는 상이하고, 수소 원자, 또는 1가의 탄화수소기를 나타낸다.);
(vii) 니트로기, 황산기, 설폰산기, 시아노기, 및 카복실기.
할로겐 원자로서는, 예를 들면, 불소 원자, 염소 원자, 브롬 원자, 요오드 원자를 들 수 있다.
1가의 탄화수소기로서는, 예를 들면, 1가의 쇄상 탄화수소기, 1가의 지환식 탄화수소기, 및 1가의 방향족 탄화수소기를 들 수 있다.
1가의 쇄상 탄화수소기란, 쇄상 구조만으로 구성된 탄화수소기를 의미하고, 주쇄에 환상 구조를 포함하지 않는다. 단, 쇄상 구조는 직쇄상이라도 분기상이라도 좋다. 1가의 쇄상 탄화수소기로서는, 예를 들면, 알킬, 알케닐, 알키닐을 들 수 있다. 알킬, 알케닐, 및 알키닐은, 직쇄상, 또는 분기상 중 어느 것이라도 좋다.
알킬로서는, 탄소 원자수 1 내지 12의 알킬이 바람직하고, 탄소 원자수 1 내지 6의 알킬이 보다 바람직하고, 탄소 원자수 1 내지 4의 알킬이 더욱 바람직하다. 상기 탄소 원자수에 치환기의 탄소 원자수는 포함되지 않는다. 탄소 원자수 1 내지 12의 알킬로서는, 예를 들어, 메틸, 에틸, N-프로필, i-프로필, N-부틸, s-부틸, 이소부틸, t-부틸, 펜틸, 헥실, 헵틸, 옥틸, 노닐, 데실, 도데실을 들 수 있다.
알케닐로서는, 탄소 원자수 2 내지 12의 알케닐이 바람직하고, 탄소 원자수 2 내지 6의 알케닐이 보다 바람직하고, 탄소 원자수 2 내지 4의 알케닐이 더욱 바람직하다. 상기 탄소 원자수에 치환기의 탄소 원자수는 포함되지 않는다. 탄소 원자수 2 내지 12의 알케닐로서는, 예를 들면, 비닐, 프로페닐, N-부테닐을 들 수 있다.
알키닐로서는, 탄소 원자수 2 내지 12의 알키닐이 바람직하고, 탄소 원자수 2 내지 6의 알키닐이 보다 바람직하고, 탄소 원자수 2 내지 4의 알키닐이 더욱 바람직하다. 상기 탄소 원자수에 치환기의 탄소 원자수는 포함되지 않는다. 탄소 원자수 2 내지 12의 알키닐로서는, 예를 들어, 에티닐, 프로피닐, N-부티닐을 들 수 있다.
1가의 쇄상 탄화수소기로서는, 알킬이 바람직하다.
1가의 지환식 탄화수소기란, 환 구조로서 지환식 탄화수소만을 포함하고, 방향족환을 포함하지 않는 탄화수소기를 의미하고, 지환식 탄화수소는 단환, 다환 중 어느 것이라도 좋다. 단, 지환식 탄화수소만으로 구성되어 있을 필요는 없고, 그 일부에 쇄상 구조를 포함하고 있어도 좋다. 1가의 지환식 탄화수소기로서는, 예를 들어, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 사이클로알키닐을 들 수 있고, 이들은, 단환, 다환 중 어느 것이라도 좋다.
사이클로알킬로서는, 탄소 원자수 3 내지 12의 사이클로알킬이 바람직하고, 탄소 원자수 3 내지 6의 사이클로알킬이 보다 바람직하고, 탄소 원자수 5 내지 6의 사이클로알킬이 더욱 바람직하다. 상기 탄소 원자수에 치환기의 탄소 원자수는 포함되지 않는다. 탄소 원자수 3 내지 12의 사이클로알킬로서는, 예를 들어, 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실을 들 수 있다.
사이클로알케닐로서는, 탄소 원자수 3 내지 12의 사이클로알케닐이 바람직하고, 탄소 원자수 3 내지 6의 사이클로알케닐이 보다 바람직하고, 탄소 원자수 5 내지 6의 사이클로알케닐이 더욱 바람직하다. 상기 탄소 원자수에 치환기의 탄소 원자수는 포함되지 않는다. 탄소 원자수 3 내지 12의 사이클로알케닐로서는, 예를 들어, 사이클로프로페닐, 사이클로부테닐, 사이클로펜테닐, 사이클로헥세닐을 들 수 있다.
사이클로알키닐로서는, 탄소 원자수 3 내지 12의 사이클로알키닐이 바람직하고, 탄소 원자수 3 내지 6의 사이클로알키닐이 보다 바람직하고, 탄소 원자수 5 내지 6의 사이클로알키닐이 더욱 바람직하다. 상기 탄소 원자수에 치환기의 탄소 원자수는 포함되지 않는다. 탄소 원자수 3 내지 12의 사이클로알키닐로서는, 예를 들면, 사이클로프로피닐, 사이클로부티닐, 사이클로펜티닐, 사이클로헥시닐을 들 수 있다.
1가의 지환식 탄화수소기로서는, 사이클로알킬이 바람직하다.
1가의 방향족 탄화수소기란, 방향족환 구조를 포함하는 탄화수소기를 의미한다. 단, 방향족환만으로 구성되어 있을 필요는 없고, 그 일부에 쇄상 구조나 지환식 탄화수소를 포함하고 있어도 좋고, 방향족환은 단환, 다환 중 어느 것이라도 좋다. 1가의 방향족 탄화수소기로서는, 탄소 원자수 6 내지 12의 아릴이 바람직하고, 탄소 원자수 6 내지 10의 아릴이 보다 바람직하고, 탄소 원자수 6의 아릴이 더욱 바람직하다. 상기 탄소 원자수에 치환기의 탄소 원자수는 포함되지 않는다. 탄소 원자수 6 내지 12의 아릴로서는, 예를 들면, 페닐, 나프틸을 들 수 있다.
1가의 방향족 탄화수소기로서는, 페닐이 바람직하다.
이 중에서도, 1가의 탄화수소기로서는, 알킬, 사이클로알킬, 아릴이 바람직하고, 알킬이 보다 바람직하다.
아랄킬이란, 아릴알킬을 말한다. 아릴알킬에서의 아릴 및 알킬의 정의, 예 및 바람직한 예는, 상술한 바와 같다. 아랄킬로서는, 탄소 원자수 3 내지 15의 아랄킬이 바람직하다. 이러한 아랄킬로서는, 예를 들면, 벤조일, 페네틸, 나프틸메틸, 나프틸에틸을 들 수 있다.
1가의 복소환기란, 복소환식 화합물의 복소환에서 수소 원자 1개를 제외한 기를 말한다. 1가의 복소환기는, 1가의 방향족 복소환기, 또는 1가의 비방향족 복소환기이다. 복소환기를 구성하는 헤테로 원자로서, 산소 원자, 황 원자, 질소 원자, 인 원자, 붕소 원자 및 규소 원자로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 이상을 포함하는 것이 바람직하고, 산소 원자, 황 원자 및 질소 원자로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 이상을 포함하는 것이 보다 바람직하다.
1가의 방향족 복소환기로서는, 탄소 원자수 1 내지 15의 방향족 복소환기가 바람직하고, 탄소 원자수 1 내지 9의 방향족 복소환기가 보다 바람직하고, 탄소 원자수 1 내지 6의 방향족 복소환기가 더욱 바람직하다. 상기 탄소 원자수에 치환기의 탄소 원자수는 포함되지 않는다. 1가의 방향족 복소환기로서는, 예를 들어, 피롤일, 푸라닐, 티오페닐, 피리디닐, 피리다지닐, 피리미디닐, 피라지닐, 트리아지닐, 피라졸릴, 이미다졸릴, 티아졸릴, 이소티아졸릴, 옥사졸릴, 이소옥사졸릴, 트리아졸릴, 테트라졸릴, 인돌릴, 푸리닐, 안트라퀴놀릴, 카바조닐(carbazonyl), 플루오레닐, 퀴놀리닐, 이소퀴놀리닐, 퀴나졸리닐, 및 프탈라지닐을 들 수 있다.
1가의 비방향족 복소환기로서는, 탄소 원자수 2 내지 15의 비방향족 복소환기가 바람직하고, 탄소 원자수 2 내지 9의 비방향족 복소환기가 보다 바람직하고, 탄소 원자수 2 내지 6의 비방향족 복소환기가 더욱 바람직하다. 상기 탄소 원자수에 치환기의 탄소 원자수는 포함되지 않는다. 1가의 비방향족 복소환기로서는, 예를 들어, 옥시라닐, 아지리디닐, 아제티디닐, 옥세타닐, 티에타닐, 피롤리디닐, 디하이드로푸라닐, 테트라하이드로푸라닐, 디옥솔라닐, 테트라하이드로티오페닐, 피롤리닐, 이미다졸리디닐, 옥사졸리디닐, 피페리디닐, 디하이드로피라닐, 테트라하이드로피라닐, 테트라하이드로티오피라닐, 모르폴리닐, 티오모르폴리닐, 피페라지닐, 디하이드로옥사지닐, 테트라하이드로옥사지닐, 디하이드로피리미디닐, 및 테트라하이드로피리미디닐을 들 수 있다.
이들 중에서도, 1가의 복소환기로서는, 5원 또는 6원의 복소환기가 바람직하다.
바람직하게는, 치환기는, 이하라도 좋다:
(i') 할로겐 원자;
(ii') 탄소 원자수 1 내지 12의 알킬, 페닐, 또는 나프틸;
(iii') 탄소 원자수 3 내지 15의 아랄킬;
(iv') 5원 또는 6원의 복소환;
(v') Ra-O-, Ra-C(=O)-, Ra-O-C(=O)-, 또는 Ra-C(=O)-O-(Ra는, 수소 원자, 또는 탄소 원자수 1 내지 12의 알킬을 나타낸다.); 또는
(vi') NRbRc-, NRbRc-C(=O)-, NRbRc-C(=O)-O-, 또는 Rb-C(=O)-NRc-(Rb 및 Rc는, 동일 또는 상이하고, 수소 원자, 또는 탄소 원자수 1 내지 12의 알킬을 나타낸다.);
(vii') 상기 (vii)에서 열거한 것과 동일한 기.
보다 바람직하게는, 치환기는, 이하라도 좋다:
(i'') 할로겐 원자;
(ii'') 탄소 원자수 1 내지 12의 알킬;
(iii'') Ra-O-, Ra-C(=O)-, Ra-O-C(=O)-, 또는 Ra-C(=O)-O-(Ra는, 수소 원자, 또는 탄소 원자수 1 내지 12의 알킬을 나타낸다.); 또는
(iv'') NRbRc-, NRbRc-C(=O)-, NRbRc-C(=O)-O-, 또는 Rb-C(=O)-NRc-(Rb 및 Rc는, 동일 또는 상이하고, 수소 원자, 또는 탄소 원자수 1 내지 12의 알킬을 나타낸다.);
(v'') 상기 (vii)에서 열거한 것과 동일한 기.
보다 더욱 바람직하게는, 치환기는, 이하라도 좋다:
(i''') 할로겐 원자;
(ii''') 탄소 원자수 1 내지 6의 알킬;
(iii''') Ra-O-, Ra-C(=O)-, Ra-O-C(=O)-, 또는 Ra-C(=O)-O-(Ra는, 수소 원자, 또는 탄소 원자수 1 내지 6 알킬을 나타낸다.); 또는
(iv''') NRbRc-, NRbRc-C(=O)-, NRbRc-C(=O)-O-, 또는 Rb-C(=O)-NRc-(Rb 및 Rc는, 동일 또는 상이하고, 수소 원자, 또는 탄소 원자수 1 내지 6의 알킬을 나타낸다.);
(v''') 상기 (vii)에서 열거한 것과 동일한 기.
특히 바람직하게는, 치환기는, 이하라도 좋다:
(i'''') 할로겐 원자;
(ii'''') 탄소 원자수 1 내지 4의 알킬;
(iii'''') Ra-O-, Ra-C(=O)-, Ra-O-C(=O)-, 또는 Ra-C(=O)-O-(Ra는, 수소 원자, 또는 탄소 원자수 1 내지 4의 알킬을 나타낸다.); 또는
(iv'''') NRbRc-, NRbRc-C(=O)-, NRbRc-C(=O)-O-, 또는 Rb-C(=O)-NRc-(Rb 및 Rc는, 동일 또는 상이하고, 수소 원자, 또는 탄소 원자수 1 내지 4의 알킬을 나타낸다.);
(v'''') 상기 (vii)에서 열거한 것과 동일한 기.
보다 구체적으로는, 이탈기로서는, 하기 (a) 내지 (c) 중 어느 하나를 들 수 있다.
(a) 환 P-Q-〔여기서, 환 P가, 전자 흡인성 기로 치환되어 있어도 좋은 아릴렌, 전자 흡인성 기로 치환되어 있어도 좋은 헤테로아릴렌, 축환하고 있어도 좋은 2,5-디케토피롤리딘, 축환하고 있어도 좋은 2,6-디케토피페리딘, 축환하고 있어도 좋은 2-케토피롤리딘, 축환하고 있어도 좋은 2-케토피페리딘, 2-피리돈으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 기이고, Q가 -O-, -S-, -Se-, -SO2-O-, -SO2-N(R)-, -SO2-, -C≡C-CH2-O-, -N(OR)-, -N(R)- 및 -O-N(R)-로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 기 (여기서, R은 수소 원자 또는 탄소 원자 1 내지 6의 알킬이다.)이다.〕,
(b) 헤테로아릴렌, 또는
(c) -Q-〔여기서, Q가 -O-, -S-, -Se-, -SO2-O-, -SO2-N(R)-, -SO2-, -C≡C-CH2-O-, -N(OR)-, -N(R)- 및 -O-N(R)-로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 기 (여기서, R은 수소 원자 또는 탄소 원자수 1 내지 6의 알킬이다.)이다.〕
이탈기로서는 (a), (b) 및 (c) 중 (a) 또는 (b)가 바람직하고 (a)가 특히 바람직하다. (a)에서의 환 P는, 전자 흡인성 기로 치환되어 있어도 좋은 아릴렌, 전자 흡인성 기로 치환되어 있어도 좋은 헤테로아릴렌, 축환하고 있어도 좋은 2,5-디케토피롤리딘, 축환하고 있어도 좋은 2,6-디케토피페리딘, 축환하고 있어도 좋은 2-케토피롤리딘, 축환하고 있어도 좋은 2-케토피페리딘, 2-피리돈 중 어느 하나이지만, 이 중, 전자 흡인성 기로 치환되어 있는 아릴렌, 전자 흡인성 기로 치환되어 있는 헤테로아릴렌, 2,5-디케토피롤리딘, 2,6-디케토피페리딘이 보다 바람직하고, 전자 흡인성 기로 치환되어 있는 아릴렌, 2,5-디케토피롤리딘, 2,6-디케토피페리딘이 보다 더욱 바람직하다.
(a)에서의 환 P는, 전자 흡인성 기로 치환되어 있어도 좋은 아릴렌, 전자 흡인성 기로 치환되어 있어도 좋은 헤테로아릴렌, 축환하고 있어도 좋은 2,5-디케토피롤리딘, 축환하고 있어도 좋은 2,6-디케토피페리딘, 축환하고 있어도 좋은 2-케토피롤리딘, 축환하고 있어도 좋은 2-케토피페리딘, 2-피리돈으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 기이다. 이러한 기의 상세는, -N(R)-, -N(OR)-, -O-, -S-, 또는 -Se-의 이탈하는 능력을 높이는 기의 바람직한 예로서 서술한 것과 동일하다.
(a)에서의 Q는, -O-, -S-, -Se-, -SO2-O-, -SO2-N(R)-, -SO2-, -C≡C-CH2-O-, -N(OR)-, -N(R)-, -O-N(R)-로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 기 (여기서, R은 수소 원자 또는 탄소 원자수 1 내지 6의 알킬이다.)이다.〕이지만, 이 중, -O-, -S-, -SO2-O-, 또는 -SO2-N(R)-가 바람직하고, -O- 또는 -S-가 보다 바람직하고, -O-가 보다 더욱 바람직하다.
(b)는 헤테로아릴렌이지만, 이미다졸디일, 트리아졸디일, 테트라졸디일, 또는 2-피리돈디일(=2-하이드록시피리딘디일)이 바람직하고, 이미다졸디일, 또는 2-피리돈디일이 보다 더욱 바람직하다.
(C)에서의 Q는, -O-, -S-, -Se-, -SO2-O-, -SO2-N(R)-, -SO2-, -C≡C-CH2-O-, -N(OR)-, -N(R)- 및 -O-N(R)-로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 기 (여기서, R은 수소 원자 또는 탄소 원자수 1 내지 6의 알킬이다.)이지만, -S-, -C≡C-CH2-O-, -N(OR)-, -N(R)-, 또는 -O-N(R)-가 바람직하고, S, -N(OR), 또는 -O-N(R)-가 보다 더욱 바람직하다.
보다 구체적으로는, 바람직한 이탈기는, 하기 구조식으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 기라도 좋다.
Figure pct00009
여기서, EWG는, 전자 흡인성 기이고,
m은 0 내지 4의 정수이고,
n은 0 내지 3의 정수이고,
R은 수소 원자, 또는 탄소 원자수 1 내지 6의 알킬이고,
○ (백색 원)는, L1에 대한 결합손이고, ● (흑색 원)는, E1에 대한 결합손이다.).
전자 흡인성 기, 및 탄소 원자수 1 내지 6의 알킬의 상세는, 상술한 바와 같다. m은 바람직하게는 1 내지 4의 정수이고, 보다 바람직하게는 1, 2 또는 3이다. n은 바람직하게는 1 내지 3의 정수이고, 보다 바람직하게는 1 또는 2이다.
L로 표시되는, 이탈기를 포함하는 2가의 기는, 상기 이탈기로 이루어진 2가의 기, 또는 상기 이탈기에 더하여 다른 2가의 기를 포함하는 2가의 기이다. 이러한 다른 2가의 기로서는, 예를 들면 2가의 탄화수소기, 2가의 복소환기, -C(=O)-, -NRL-(RL은 수소 원자, 또는 상술한 치환기를 나타냄), -O-, -S-, -C(=S)-, 및 이들의 2 이상(예를 들면 2 내지 8, 바람직하게는 2 내지 6, 보다 바람직하게는 2 내지 4)의 조합으로 이루어진 기를 들 수 있다. 2가의 탄화수소기, 및 2가의 복소환기는, 예를 들어 1 내지 5개, 바람직하게는 1 내지 3개, 보다 바람직하게는 1 또는 2개의 치환기를 갖고 있어도, 갖고 있지 않아도 좋다. 화학 구조가 간결한 화합물을 합성하는 관점에서는, 이러한 치환기를 갖지 않는 것이 바람직하다. 한편, 상기와 같은 기가 치환기를 갖는 경우, 이러한 치환기의 예 및 바람직한 예는, 상술의 것과 동일하다.
2가의 탄화수소기로서는, 직쇄, 분기쇄, 또는 환상의 2가의 탄화수소기이고, 바람직하게는 직쇄 또는 분기쇄의 2가의 탄화수소기이다. 2가의 탄화수소기로서는, 예를 들면, 알킬렌, 알케닐렌, 알키닐렌, 아릴렌을 들 수 있다.
알킬렌으로서는, 탄소 원자수 1 내지 12의 알킬렌이 바람직하고, 탄소 원자수 1 내지 6의 알킬렌이 보다 바람직하고, 탄소 원자수 1 내지 4의 알킬렌이 특히 바람직하다. 상기 탄소 원자수에 치환기의 탄소 원자수는 포함되지 않는다. 알킬렌은, 직쇄, 분기쇄, 또는 환상 중 어느 것이라도 좋지만, 직쇄의 알킬렌이 바람직하다. 이러한 알킬렌으로서는, 예를 들면, 메틸렌, 에틸렌, 프로필렌, 부틸렌, 펜틸렌, 헥실렌을 들 수 있다.
알케닐렌으로서는, 탄소 원자수 2 내지 12의 알케닐렌이 바람직하고, 탄소 원자수 2 내지 6의 알케닐렌이 보다 바람직하고, 탄소 원자수 2 내지 4의 알케닐렌이 특히 바람직하다. 상기 탄소 원자수에 치환기의 탄소 원자수는 포함되지 않는다. 알케닐렌은, 직쇄, 분기쇄, 또는 환상 중 어느 것이라도 좋지만, 직쇄의 알케닐렌이 바람직하다. 이러한 알케닐렌으로서는, 예를 들어, 에틸레닐렌(ethylenylene), 프로피닐렌, 부테닐렌, 펜테닐렌, 헥세닐렌을 들 수 있다.
알키닐렌으로서는, 탄소 원자수 2 내지 12의 알키닐렌이 바람직하고, 탄소 원자수 2 내지 6의 알키닐렌이 보다 바람직하고, 탄소 원자수 2 내지 4의 알키닐렌이 특히 바람직하다. 상기 탄소 원자수에 치환기의 탄소 원자수는 포함되지 않는다. 알키닐렌은, 직쇄, 분기쇄, 또는 환상 중 어느 것이라도 좋지만, 직쇄의 알키닐렌이 바람직하다. 이러한 알키닐렌으로서는, 예를 들어, 에티닐렌, 프로피닐렌, 부티닐렌, 펜티닐렌, 헥시닐렌을 들 수 있다.
아릴렌으로서는, 탄소 원자수 6 내지 24의 아릴렌이 바람직하고, 탄소 원자수 6 내지 18의 아릴렌이 보다 바람직하고, 탄소 원자수 6 내지 14의 아릴렌이 더욱 바람직하고, 탄소 원자수 6 내지 10의 아릴렌이 보다 더욱 바람직하다. 상기 탄소 원자수에 치환기의 탄소 원자수는 포함되지 않는다. 아릴렌으로서는, 예를 들면, 페닐렌, 나프틸렌, 안트라세닐렌을 들 수 있다.
2가의 복소환기는, 2가의 방향족 복소환기, 또는 2가의 비방향족 복소환기이다. 복소환을 구성하는 헤테로 원자로서, 산소 원자, 황 원자, 질소 원자, 인 원자, 붕소 원자 및 규소 원자 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 이상을 포함하는 것이 바람직하고, 산소 원자, 황 원자 및 질소 원자로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 이상을 포함하는 것이 보다 바람직하다.
2가의 방향족 복소환기로서는, 탄소 원자수 1 내지 21의 2가의 방향족 복소환기가 바람직하고, 탄소 원자수 1 내지 15의 2가의 방향족 복소환기가 보다 바람직하고, 탄소 원자수 1 내지 9의 2가의 방향족 복소환기가 더욱 바람직하고, 탄소 원자수 1 내지 6의 2가의 방향족 복소환기가 보다 더욱 바람직하다. 상기 탄소 원자수에 치환기의 탄소 원자수는 포함되지 않는다. 보다 구체적으로는, 2가의 방향족 복소환기로서는, 예를 들어, 피롤디일, 푸란디일, 티오펜디일, 피리딘디일, 피리다진디일, 피리미딘디일, 피라진디일, 트리아진디일, 피라졸디일, 이미다졸디일, 티아졸디일, 이소티아졸디일, 옥사졸디일, 이소옥사졸디일, 트리아졸디일, 테트라졸디일, 인돌디일, 퓨린디일, 안트라퀴논디일, 카바졸디일, 플루오렌디일, 퀴놀린디일, 이소퀴놀린디일, 퀴나졸린디일, 및 프탈라진디일을 들 수 있다.
2가의 비방향족 복소환기로서는, 탄소 원자수 2 내지 21의 비방향족 복소환기가 바람직하고, 탄소 원자수 2 내지 15의 비방향족 복소환기가 보다 바람직하고, 탄소 원자수 2 내지 9의 비방향족 복소환기가 더욱 바람직하고, 탄소 원자수 2 내지 6의 비방향족 복소환기가 보다 더욱 바람직하다. 상기 탄소 원자수에 치환기의 탄소 원자수는 포함되지 않는다. 보다 구체적으로는, 2가의 비방향족 복소환기로서는, 예를 들면, 피롤디온디일, 피롤린디온디일, 피롤린디일, 옥시란디일, 아지리딘디일, 아제티딘디일, 옥세탄디일, 티에탄디일, 피롤리딘디일, 디하이드로푸란디일, 테트라하이드로푸란디일, 디옥솔란디일, 테트라하이드로티오펜디일, 피롤린디일, 이미다졸리딘디일, 옥사졸리딘디일, 피페리딘디일, 디하이드로피란디일, 테트라하이드로피란디일, 테트라하이드로티오피란디일, 모르폴린디일, 티오모르폴린디일, 피페라진디일, 디하이드로옥사진디일, 테트라하이드로옥사진디일, 디하이드로피리미딘디일, 및 테트라하이드로피리미딘디일을 들 수 있다.
특정의 실시형태에서는, L은, L1-L2로서 표시될 수 있다.
L1은, 결합 또는 2가의 기이다. L1로 표시되는 2가의 기의 정의, 예 및 바람직한 예는, L로 표시되는 이탈기를 포함하는 2가의 기가 이탈기에 더하여 다른 2가의 기를 포함하는 2가의 기인 경우에서의 다른 2가의 기의 것과 동일하다.
L2는, 이탈기이다. L2로 표시되는 이탈기의 정의, 예 및 바람직한 예는, L에서의 이탈기의 것과 동일하다.
바람직하게는, L2로 표시되는 이탈기는 상기 (a) 내지 (c) 중 어느 하나이다. L2로 표시되는 이탈기의 예 및 바람직한 예도 또한, 상기 (a) 내지 (c)에서 언급 한 것과 동일하다.
A(친화성 물질)와 E(친전자기를 포함하는 2가의 기)를 연결하는 L(이탈기를 포함하는 2가의 기) 또는 L1(결합 또는 2가의 기)-L2(이탈기)의 주쇄의 길이는, 항체 및 친화성 물질의 종류, 및 항체에서의 친화성 물질의 표적 부위와, 위치 선택적으로 수식되어야 할 항체 중의 특정의 아미노산 잔기와의 관계 등의 다양한 인자에 따라, 적절하게 설계할 수 있다. L 또는 L1-L2의 주쇄란, A 및 E를 연결하는, 공유 결합으로 연결된 복수의 원자로 이루어진 쇄상 구조를 말하며, 수소 원자, 분기 구조 부분, 및 치환기는 제외된다. 화학식 I로 표시되는 화합물을 항체와 접촉시키면, 먼저, A가 항체에 회합한다. 이어서. 항체 회합 부위의 근방에 존재하는 항체 중의 수식되어야 할 특정의 아미노산 잔기의 측쇄 중의 친핵기(예, 라이신 잔기의 측쇄 중의 아미노기)가 E에서의 친전자기와 반응함으로써, 당해 친핵기가 당해 구전자와 결합하는 한편으로, L 또는 L1에 포함되는 이탈기가 E로부터 이탈할 수 있다. 이때, 항체 회합 부위와 수식되어야 할 특정의 아미노산 잔기 사이의 근방에서 당해 특정의 아미노산 잔기와 동종의 아미노산 잔기가 달리 존재하지 않는 경우, 주쇄의 길이를 엄밀하게 제어하지 않아도, E에서의 친전자기는, 항체 중의 수식되어야 할 특정의 아미노산 잔기의 측쇄 중의 친핵기에 대하여 위치 선택적으로 결합할 수 있다. 물론, 이러한 영역에서 당해 특정의 아미노산 잔기와 동종의 아미노산 잔기가 달리 존재하는 경우라도, 주쇄의 길이를 제어함으로써, E에서의 친전자기는, 당해 특정의 아미노산 잔기에 대하여 위치 선택적으로 결합할 수 있다.
A와 E를 연결하는 L 또는 L1-L2의 주쇄의 길이는, 항체 중의 특정의 아미노산 잔기를 위치 선택적으로 수식할 수 있는 한 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 인간 IgG Fc에서의 특정의 아미노산 잔기(예, Eu numbering에 따른 Lys248 잔기 또는 Lys246 잔기, Lys288 또는 Lys290, Lys317, 또는 그들 잔기 이외의 다른 아미노산 잔기)를 위치 선택적으로 수식하는 경우, 20개 이하의 원자로 이루어진 길이인 것이 바람직하다. L 또는 L1-L2의 주쇄의 길이는 또한, 바람직하게는 1 이상이고, 보다 바람직하게는 2 이상이며, 보다 더욱 바람직하게는 3 이상이며, 특히 바람직하게는 4 이상 또는 5 이상이라도 좋다. L 또는 L1-L2의 주쇄의 길이는 또한, 바람직하게는 50 이하이며, 보다 바람직하게는 30 이하이며, 보다 더욱 바람직하게는 20 이하이며, 특히 바람직하게는 15 이하 또는 10 이하라도 좋다. 보다 구체적으로는, L 또는 L1-L2의 주쇄의 길이는, 바람직하게는 1 내지 50이며, 보다 바람직하게는 1 내지 30이며, 보다 더욱 바람직하게는 1 내지 20이며, 특히 바람직하게는 1 내지 15 또는 1 내지 10이라도 좋다. 또는, L 또는 L1-L2의 주쇄의 길이는, 바람직하게는 2 내지 30이며, 보다 더욱 바람직하게는 3 내지 20이며, 특히 바람직하게는 4 내지 15 또는 5 내지 10이라도 좋다.
주쇄가 환 구조를 포함하지 않는 구조인 경우, 주쇄의 원자수는, 쇄상 구조 중의 원자수(수소 원자, 분기 구조 부분, 및 치환기 중의 원자수를 제외함)를 셈으로써 결정할 수 있다.
한편, 주쇄가 환 구조를 포함하는 구조인 경우, 주쇄의 길이를 규정하는 관점에서, 주쇄의 원자수를 편의적으로 셀 수 있다. 구체적으로는, 이러한 경우에서의 주쇄의 원자수는, 주쇄에서 2가의 환 구조를 포함하지 않는 쇄상 구조 중의 원자수(수소 원자, 분기 구조 부분, 및 치환기 중의 원자수 제외함)에 더하여, 환 구조 중의 두 결합손을 연락하는 최단 경로의 원자수를 셈으로써 결정할 수 있다(예를 들어, 이하 (a) 내지 (d)의 두꺼운 글자(太字) 경로를 참조).
Figure pct00010
·은 결합손이다.
(a)의 경우, 최단 경로는 두꺼운 글자 경로이기 때문에, 주쇄의 원자수로서 셀 수 있는 2가의 환 구조 중의 원자수는, 2이다.
(b)의 경우, 최단 경로는 두꺼운 글자 경로이기 때문에, 주쇄의 원자수로서 셀 수 있는 2가의 환 구조 중의 원자수는, 3이다.
(c)의 경우, 어느 경로도 최단 경로(등거리)이기 때문에, 주쇄의 원자수로서 셀 수 있는 2가의 환 구조 중의 원자수는, 4이다.
(d)의 경우, 축합 부위의 경로가 최단 경로이기 때문에, 주쇄의 원자수로서 셀 수 있는 2가의 환 구조 중의 원자수는, 4이다.
바람직하게는, L 또는 L1-L2의 주쇄는, L에서의 「다른 2가의 기」 또는 L1 에서의 「2가의 기」가 2가의 환 구조를 포함하지 않는 쇄상 구조라도 좋다. 따라서, L에서의 「다른 2가의 기」 또는 L1에서의 「2가의 기」는, 2가의 직쇄 또는 분기쇄의 탄화수소기, -C(=O)-, -NRL-(RL은 수소 원자, 또는 상술의 치환기를 나타냄), -O-, -S-, -C(=S)-, 및 이들의 2 이상(예를 들면 2 내지 8, 바람직하게는 2 내지 6, 보다 바람직하게는 2 내지 4)의 조합으로 이루어진 기라도 좋다. 2가의 직쇄 또는 분기쇄의 탄화수소기는, 예를 들어 1 내지 5개, 바람직하게는 1 내지 3개, 보다 바람직하게는 1 또는 2개의 치환기를 갖고 있어도, 갖고 있지 않아도 좋다. 화학 구조가 간결한 화합물을 합성하는 관점에서는, 이러한 치환기를 갖지 않는 것이 바람직하다. 한편, 상기와 같은 기가 치환기를 갖는 경우, 이러한 치환기의 예 및 바람직한 예는, 이탈기의 예인 헤테로아릴렌이 갖고 있어도 좋은 치환기와 동일하다.
1-4. 친전자기를 포함하는 2가의 기 (E)
화학식 I에서, L은, (i) 이탈기와 연결되어 있고, 또한 (ii) 항체 중의 친핵기와 반응하는 능력을 갖는 친전자기를 포함하는 2가의 기이다.
항체 중의 친핵기로서는, 예를 들어, 라이신 잔기의 측쇄에서의 NH2, 타이로신 잔기의 측쇄에서의 OH, 세린 잔기의 측쇄에서의 OH, 트레오닌 잔기의 측쇄에서의 OH, 및 시스테인 잔기의 측쇄에서의 SH를 들 수 있다. 항체 중의 친핵기로서는, 라이신 잔기의 측쇄에서의 NH2, 또는 타이로신 잔기의 측쇄에서의 OH가 바람직하고, 라이신 잔기의 측쇄에서의 NH2가 보다 바람직하다.
E에 포함되는 친전자기로서는, 이탈기와 연결할 수 있으며, 또한 상술한 바와 같은 항체 중의 친핵기와 반응하는 능력을 갖는 임의의 친전자기를 사용할 수 있지만, -C(=O)-, -SO2-, 및 -CH2-로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 기가 바람직하다. 친전자기로서는, 그 인접하는 기(예, 이탈기, L2, E2)와의 전자적인 밸런스에 의해 -CH2-도 이용할 수 있다. 예를 들어, 이탈기로서 토실기가 이용되는 경우, 친전자기로서 -CH2-를 적합하게 이용할 수 있다(Tsukiji et al., Nature Chemical Biology, Vol.5, No.5, May 2009). 친전자기로서는, -C(=O)- 또는 -SO2-가 보다 바람직하고, -C(=O)-가 보다 더욱 바람직하다.
E로 표시되는, 친전자기를 포함하는 2가의 기는, 상기 친전자기로 이루어진 2가의 기, 또는 상기 친전자기에 더하여 다른 2가의 기를 포함하는 2가의 기이다. 이러한 다른 2가의 기로서는, 예를 들면, 2가의 탄화수소기, 2가의 복소환기, -C(=O)-, -NRE-(RE는 수소 원자, 또는 상술한 치환기를 나타냄), -O-, -S-, -C(=S)-, 및 이들의 2 이상(예를 들면 2 내지 8, 바람직하게는 2 내지 6, 보다 바람직하게는 2 내지 4)의 조합으로 이루어진 기를 들 수 있다. 2가의 탄화수소기, 및 2가의 복소환기는, 예를 들어 1 내지 5개, 바람직하게는 1 내지 3개, 보다 바람직하게는 1 또는 2개의 치환기를 갖고 있어도, 갖고 있지 않아도 좋다. 화학 구조가 간결한 화합물을 합성하는 관점에서는, 이러한 치환기를 갖지 않는 것이 바람직하다. 한편, 상기와 같은 기가 치환기를 갖는 경우, 이러한 치환기의 예 및 바람직한 예는, 이탈기의 예인 헤테로아릴렌이 갖고 있어도 좋은 치환기와 동일하다. E(및 후술의 E1-E2-E3)는, 잠재적인 면역원성을 갖고, 또한 혈중에서 가수 분해되기 쉬운 문제를 안고 있는 펩타이드 부분을 포함하지 않도록 설계할 수 있다.
2가의 탄화수소기로서는, 직쇄, 분기쇄, 또는 환상의 2가의 탄화수소기이고, 바람직하게는 직쇄 또는 분기쇄의 2가의 탄화수소기이다. 2가의 탄화수소기로서는, 예를 들면, 알킬렌, 알케닐렌, 알키닐렌, 아릴렌을 들 수 있다.
알킬렌으로서는, 탄소 원자수 1 내지 12의 알킬렌이 바람직하고, 탄소 원자수 1 내지 6의 알킬렌이 보다 바람직하고, 탄소 원자수 1 내지 4의 알킬렌이 특히 바람직하다. 상기 탄소 원자수에 치환기의 탄소 원자수는 포함되지 않는다. 알킬렌은, 직쇄, 분기쇄, 또는 환상 중 어느 것이라도 좋지만, 직쇄의 알킬렌이 바람직하다. 이러한 알킬렌으로서는, 예를 들면, 메틸렌, 에틸렌, 프로필렌, 부틸렌, 펜틸렌, 헥실렌을 들 수 있다.
알케닐렌으로서는, 탄소 원자수 2 내지 12의 알케닐렌이 바람직하고, 탄소 원자수 2 내지 6의 알케닐렌이 보다 바람직하고, 탄소 원자수 2 내지 4의 알케닐렌이 특히 바람직하다. 상기 탄소 원자수에 치환기의 탄소 원자수는 포함되지 않는다. 알케닐렌은, 직쇄, 분기쇄, 또는 환상 중 어느 것이라도 좋지만, 직쇄의 알케닐렌이 바람직하다. 이러한 알케닐렌으로서는, 예를 들어, 에틸레닐렌, 프로피닐렌, 부테닐렌, 펜테닐렌, 헥세닐렌을 들 수 있다.
알키닐렌으로서는, 탄소 원자수 2 내지 12의 알키닐렌이 바람직하고, 탄소 원자수 2 내지 6의 알키닐렌이 보다 바람직하고, 탄소 원자수 2 내지 4의 알키닐렌이 특히 바람직하다. 상기 탄소 원자수에 치환기의 탄소 원자수는 포함되지 않는다. 알키닐렌은, 직쇄, 분기쇄, 또는 환상 중 어느 것이라도 좋지만, 직쇄의 알키닐렌이 바람직하다. 이러한 알키닐렌으로서는, 예를 들어, 에티닐렌, 프로피닐렌, 부티닐렌, 펜티닐렌, 헥시닐렌을 들 수 있다.
아릴렌으로서는, 탄소 원자수 6 내지 24의 아릴렌이 바람직하고, 탄소 원자수 6 내지 18의 아릴렌이 보다 바람직하고, 탄소 원자수 6 내지 14의 아릴렌이 더욱 바람직하고, 탄소 원자수 6 내지 10의 아릴렌이 보다 더욱 바람직하다. 상기 탄소 원자수에 치환기의 탄소 원자수는 포함되지 않는다. 아릴렌으로서는, 예를 들면, 페닐렌, 나프틸렌, 안트라세닐렌을 들 수 있다.
2가의 복소환기는, 2가의 방향족 복소환기, 또는 2가의 비방향족 복소환기이다. 복소환을 구성하는 헤테로 원자로서, 산소 원자, 황 원자, 질소 원자, 인 원자, 붕소 원자 및 규소 원자로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 이상을 포함하는 것이 바람직하며, 산소 원자, 황 원자 및 질소 원자로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 이상을 포함하는 것이 보다 바람직하다.
2가의 방향족 복소환기로서는, 탄소 원자수 1 내지 21의 2가의 방향족 복소환기가 바람직하고, 탄소 원자수 1 내지 15의 2가의 방향족 복소환기가 보다 바람직하고, 탄소 원자수 1 내지 9의 2가의 방향족 복소환기가 더욱 바람직하고, 탄소 원자수 1 내지 6의 2가의 방향족 복소환기가 보다 더욱 바람직하다. 상기 탄소 원자수에 치환기의 탄소 원자수는 포함되지 않는다. 보다 구체적으로는, 2가의 방향족 복소환기로서는, 예를 들어 피롤디일, 푸란디일, 티오펜디일, 피리딘디일, 피리다진디일, 피리미딘디일, 피라진디일, 트리아진디일, 피라졸디일, 이미다졸디일, 티아졸디일, 이소티아졸디일, 옥사졸디일, 이소옥사졸디일, 트리아졸디일, 테트라졸디일, 인돌디일, 퓨린디일, 안트라퀴논디일, 카바졸디일, 플루오렌디일, 퀴놀린디일, 이소퀴놀린디일, 퀴나졸린디일, 및 프탈라진디일을 들 수 있다.
2가의 비방향족 복소환기로서는, 탄소 원자수 2 내지 21의 비방향족 복소환기가 바람직하고, 탄소 원자수 2 내지 15의 비방향족 복소환기가 보다 바람직하고, 탄소 원자수 2 내지 9의 비방향족 복소환기가 더욱 바람직하고, 탄소 원자수 2 내지 6의 비방향족 복소환기가 보다 더욱 바람직하다. 상기 탄소 원자수에 치환기의 탄소 원자수는 포함되지 않는다. 보다 구체적으로는, 2가의 비방향족 복소환기로서는, 예를 들면, 피롤디온디일, 피롤린디온디일, 피롤린디일, 옥시란디일, 아지리딘디일, 아제티딘디일, 옥세탄디일, 티에탄디일, 피롤리딘디일, 디하이드로푸란디일, 테트라하이드로푸란디일, 디옥솔란디일, 테트라하이드로티오펜디일, 피롤린디일, 이미다졸리딘디일, 옥사졸리딘디일, 피페리딘디일, 디하이드로피란디일, 테트라하이드로피란디일, 테트라하이드로티오피란디일, 모르폴린디일, 티오모르폴린디일, 피페라진디일, 디하이드로옥사진디일, 테트라하이드로옥사진디일, 디하이드로 피리미딘디일, 및 테트라하이드로피리미딘디일을 들 수 있다.
특정의 실시형태에서는, E는, E1-E2-E3로서 표현될 수 있다.
E1은 (i) 상기 이탈기와 연결되어 있고, 또한 (ii) 상기 항체 중의 친핵기와 반응하는 능력을 갖는 친전자기이다. E1의 친전자기의 정의, 예 및 바람직한 예는, E에서의 친전자기와 동일하다.
E2는 하기 (a) 또는 (b)이다:
(a) -X-Y-〔여기서, E1과 결합하는 X는 C(R1)(R2) (여기서, R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소 원자 또는 탄소 원자수 1 내지 6의 알킬이다.), N(R3) (여기서, R3는, 수소 원자 또는 탄소 원자수 1 내지 6의 알킬이다.), O, S 또는 Se이고, E3와 결합하는 Y는 C(R4)(R5) (여기서, R4 및 R5는 각각 독립적으로 수소 원자 또는 탄소 원자수 1 내지 6의 알킬이다.)이다.〕; 또는
(b) 하기 화학식 i로 표시되는 기이다:
[화학식 i]
Figure pct00011
여기서, 환 Z는, E1과 결합하는 환 구성 원자 X' 및 이의 양 측면의 환 구성 원자 모두가 탄소 원자인 2가의 환기이거나, E1과 결합하는 환 구성 원자 X'가 질소 원자이며, 또한 질소 원자의 양 측면의 환 구성 원자가 탄소 원자인 2가의 복소환기이고, ·는 결합손이다.
E2가 상기 (a)인 경우, R1 내지 R5에서의 탄소 원자수 1 내지 6의 알킬은, 상술의 것과 동일하다.
E2가 상기 (a)인 경우, E1과 결합하는 X로서는, 본 발명의 화합물의 반응성 및 안정성의 향상의 관점에서, C(R1)(R2), N(R3), O, S 또는 Se가 바람직하고, C(R1)(R2), N(R3), O, 또는 S가 보다 바람직하고, C(R1)(R2), N(R3), 또는 O가 보다 더욱 바람직하고, C(R1)(R2), 또는 N(R3)가 보다 한층 바람직하고, C(R1)(R2)가 가장 바람직하다.
E2에서의 X는 또한, 이탈기(예, L, L2를 참조)와의 관계에서 규정할 수 있다. X가 N(R3), O, S 또는 Se 등의 원자 또는 기인 경우, 이탈기뿐만 아니라, X도 또한 친전자기로부터 이탈할 수 있다. 그러나, 화학식 I로 표시되는 소정량의 화합물을 항체와의 반응에 사용한 경우, 화학식 I로 표시되는 적어도 일부의 화합물에서의 X는, 친전자기로부터 이탈하지 않도록 반응을 제어할 수 있기 때문에, 본 발명에서는, X로서 상술한 바와 같은 원자 또는 기를 사용할 수 있다. 바람직하게는, 화학식 I로 표시되는 화합물과 항체와의 목적 반응의 효율의 향상, 나아가서는 생체 직교성 관능기를 갖는 항체의 수율의 향상의 관점에서, X로서, 이탈기보다도 이탈하기 어려운 원자 또는 기(즉, 당해 원자 또는 기의 pKa값이 이탈기의 pKa값보다 큰 것)를 사용할 수 있다. 따라서, 이탈기를 보다 선택적으로 이탈시키고, 또한 E2에서의 X의 이탈를 억제시킴으로써, 화학식 I로 표시되는 화합물과 항체와의 목적 반응의 효율을 향상시키고, 나아가서는 생체 직교성 관능기를 갖는 항체의 수율을 향상시키는 관점에서, E2에서의 X로서는, 이탈하는 능력이 이탈기 이하인 것이 바람직하다. 이러한 X로서는, 이탈기의 종류(예, -N(R)-, -N(OR)-, -O-, -S-, 또는 -Se-, 또는 헤테로아릴렌), 및 이탈기에 인접하여 존재하는 이탈기의 이탈하는 능력을 높이는 기를 포함하는 기의 유무 및 그 종류에 따라 변동될 수 있지만, 개설(槪說)하면, 이하와 같다.
(1) 이탈기가 -N(R)- 또는 -N(OR)-인 경우, X로서는, C(R1)(R2), 또는 N(R3)이 바람직하고, C(R1)(R2)가 보다 바람직하다.
(2) 이탈기가 -O-인 경우, X로서는, C(R1)(R2), N(R3), 또는 O가 바람직하고, C(R1)(R2), 또는 N(R3)이 보다 바람직하고, C(R1)(R2)가 보다 더욱 바람직하다.
(3) 이탈기가 -S-인 경우, X로서는, C(R1)(R2), N(R3), O, 또는 S가 바람직하고, C(R1)(R2), N(R3), 또는 O가 보다 바람직하고, C(R1)(R2), 또는 N(R3)이 보다 더욱 바람직하고, C(R1)(R2)가 보다 한층 바람직하다.
(4) 이탈기가 -Se-인 경우, X로서는, C(R1)(R2), N(R3), O, S 또는 Se가 바람직하고, C(R1)(R2), N(R3), O, 또는 S가 보다 바람직하고, C(R1)(R2), N(R3), 또는 O가 보다 더욱 바람직하고, C(R1)(R2), 또는 N(R3)이 보다 한층 바람직하고, C(R1)(R2)가 가장 바람직하다.
(5) 이탈기가 헤테로아릴렌인 경우, X로서는, C(R1)(R2), N(R3), O, S 또는 Se가 바람직하고, C(R1)(R2), N(R3), O, 또는 S가 보다 바람직하고, C(R1)(R2), N(R3), 또는 O가 보다 더욱 바람직하고, C(R1)(R2), 또는 N(R3)이 보다 한층 바람직하고, C(R1)(R2)가 가장 바람직하다.
E2가 상기 (b)인 경우, 환 Z에 포함되는, E1과 결합하는 환 구성 원자 X'는, 탄소 원자 또는 질소 원자이다.
E1과 결합하는 환 구성 원자 X'가 탄소 원자인 경우, 환 Z는, E1과 결합하는 환 구성 원자 X' 및 이의 양 측면의 환 구성 원자 모두가 탄소 원자인 2가의 환기이다. 2가의 환기는, 예를 들어 1 내지 5개, 바람직하게는 1 내지 3개, 보다 바람직하게는 1 또는 2개의 치환기를 갖고 있어도, 갖고 있지 않아도 좋다. 화학 구조가 간결한 화합물을 합성하는 관점에서는, 이러한 치환기를 갖지 않는 것이 바람직하다. 한편, 2가의 환기가 치환기를 갖는 경우, 이러한 치환기의 예 및 바람직한 예는, 이탈기의 예인 헤테로아릴렌이 갖고 있어도 좋은 치환기와 동일하다. 이와 같은 2가의 환기로서는, 예를 들면, 환상의 2가의 탄화수소기(예, 아릴렌, 환상의 알킬렌, 환상의 알케닐렌, 환상의 알키닐렌), 및 2가의 복소환기(예, 2가의 방향족 복소환기, 2가의 비방향족 복소환기)를 들 수 있다.
2가의 탄화수소기로서는, 환상의 2가의 탄화수소기이며, 2가의 탄화수소기로서는, 예를 들어, 환상의 알킬렌, 환상의 알케닐렌, 환상의 알키닐렌, 아릴렌을 들 수 있다.
환상의 알킬렌으로서는, 탄소 원자수 3 내지 12의 알킬렌이 바람직하고, 탄소 원자수 3 내지 10의 알킬렌이 보다 바람직하고, 탄소 원자수 5 내지 8의 알킬렌이 특히 바람직하다. 상기 탄소 원자수에 치환기의 탄소 원자수는 포함되지 않는다. 이러한 알킬렌으로서는, 예를 들면, 사이클로프로필렌, 사이클로부틸렌, 사이클로펜틸렌, 사이클로헥실렌, 사이클로헵틸렌, 사이클로옥틸렌, 사이클로노닐렌, 사이클로데킬렌을 들 수 있다.
환상의 알케닐렌으로서는, 탄소 원자수가 3 내지 12의 알케닐렌이 바람직하고, 탄소 원자수 3 내지 10의 알케닐렌이 보다 바람직하고, 탄소 원자수 5 내지 8의 알케닐렌이 특히 바람직하다. 상기 탄소 원자수에 치환기의 탄소 원자수는 포함되지 않는다. 이러한 알케닐렌으로서는, 예를 들면, 사이클로프로페닐렌, 사이클로부테닐렌, 사이클로펜테닐렌, 사이클로헥세닐렌, 사이클로헵테닐렌, 사이클로옥테닐렌, 사이클로노네닐렌, 사이클로데케닐렌을 들 수 있다.
환상의 알키닐렌으로서는, 탄소 원자수 6 내지 12의 알키닐렌이 바람직하고, 탄소 원자수 7 내지 12의 알키닐렌이 보다 바람직하고, 탄소 원자수 8 내지 12의 알키닐렌이 특히 바람직하다. 상기 탄소 원자수에 치환기의 탄소 원자수는 포함되지 않는다. 알키닐렌은, 직쇄, 분기쇄, 또는 환상 중 어느 것이라도 좋지만, 직쇄의 알키닐렌이 바람직하다. 이러한 알키닐렌으로서는, 예를 들면, 사이클로헥시닐렌, 사이클로헵티닐렌, 사이클로옥티닐렌, 사이클로노니닐렌, 사이클로데키닐렌, 사이클로운데키닐렌, 사이클로도데키닐렌을 들 수 있다.
아릴렌으로서는, 탄소 원자수 6 내지 24의 아릴렌이 바람직하고, 탄소 원자수 6 내지 18의 아릴렌이 보다 바람직하고, 탄소 원자수 6 내지 14의 아릴렌이 더욱 바람직하고, 탄소 원자수 6 내지 10의 아릴렌이 보다 더욱 바람직하다. 상기 탄소 원자수에 치환기의 탄소 원자수는 포함되지 않는다. 아릴렌으로서는, 예를 들면, 페닐렌, 나프틸렌, 안트라세닐렌을 들 수 있다.
2가의 복소환기는, 2가의 방향족 복소환기, 또는 2가의 비방향족 복소환기이다. 복소환을 구성하는 헤테로 원자로서, 산소 원자, 황 원자, 질소 원자, 인 원자, 붕소 원자 및 규소 원자로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 이상을 포함하는 것이 바람직하며, 산소 원자, 황 원자 및 질소 원자로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 이상을 포함하는 것이 보다 바람직하다.
2가의 방향족 복소환기로서는, 탄소 원자수 3 내지 21의 2가의 방향족 복소환기가 바람직하고, 탄소 원자수 3 내지 15의 2가의 방향족 복소환기가 보다 바람직하고, 탄소 원자수 3 내지 9의 2가의 방향족 복소환기가 더욱 바람직하고, 탄소 원자수 3 내지 6의 2가의 방향족 복소환기가 보다 더욱 바람직하다. 상기 탄소 원자수에 치환기의 탄소 원자수는 포함되지 않는다. 보다 구체적으로는, 2가의 방향족 복소환기로서는, 예를 들어 피롤디일, 푸란디일, 티오펜디일, 피리딘디일, 피리다진디일, 피리미딘디일, 피라졸디일, 이소티아졸디일, 이소옥사졸디일, 인돌디일, 안트라퀴논디일, 카바졸디일, 플루오렌디일, 퀴놀린디일, 이소퀴놀린디일, 퀴나졸린디일, 및 프탈라진디일을 들 수 있다.
2가의 비방향족 복소환기로서는, 탄소 원자수 3 내지 21의 비방향족 복소환기가 바람직하고, 탄소 원자수 3 내지 15의 비방향족 복소환기가 보다 바람직하고, 탄소 원자수 3 내지 9의 비방향족 복소환기가 더욱 바람직하고, 탄소 원자수 3 내지 6의 비방향족 복소환기가 보다 더욱 바람직하다. 상기 탄소 원자수에 치환기의 탄소 원자수는 포함되지 않는다. 보다 구체적으로는, 2가의 비방향족 복소환기로서는, 예를 들면, 피롤린디온디일, 피롤린디일, 아제티딘디일, 옥세탄디일, 티에탄디일, 피롤리딘디일, 디하이드로푸란디일, 테트라하이드로푸란디일, 테트라하이드로티오펜디일, 피롤린디일, 피페리딘디일, 디하이드로피란디일, 테트라하이드로피란디일, 테트라하이드로티오피란디일, 피페라진디일, 디하이드로옥사진디일, 테트라하이드로옥사진디일, 디하이드로피리미딘디일, 및 테트라하이드로피리미딘디일을 들 수 있다.
E1과 결합하는 환 구성 원자 X'가 질소 원자인 경우, 환 Z는, E1과 결합하는 환 구성 원자 X'가 질소 원자이며, 또한 질소 원자의 양 측면의 환 구성 원자가 탄소 원자인 2가의 복소환기이다. 이와 같은 2가의 복소환기는, 환 구성 원자로서 질소 원자를 포함하는 2가의 복소환기이다. 환 구성 원자로서 질소 원자를 포함하는 2가의 복소환기로서는, 탄소 원자수 3 내지 21의 2가의 복소환기가 바람직하고, 탄소 원자수 3 내지 15의 2가의 복소환기가 보다 바람직하고, 탄소 원자수 3 내지 9의 2가의 복소환기가 더욱 바람직하고, 탄소 원자수 3 내지 6의 2가 복소환기가 보다 더욱 바람직하다. 2가의 복소환기는, 예를 들어 1 내지 5개, 바람직하게는 1 내지 3개, 보다 바람직하게는 1 또는 2개의 치환기를 갖고 있어도, 갖고 있지 않아도 좋다. 화학 구조가 간결한 화합물을 합성하는 관점에서는, 이러한 치환기를 갖지 않는 것이 바람직하다. 한편, 2가의 복소환기가 치환기를 갖는 경우, 이러한 치환기의 예 및 바람직한 예는, 이탈기의 예인 헤테로아릴렌이 갖고 있어도 좋은 치환기와 동일하다. 상기 탄소 원자수에 치환기의 탄소 원자수는 포함되지 않는다. 환 구성 원자로서 질소 원자를 포함하는 2가의 복소환기로서는, 예를 들면, 환 구성 원자로서 질소 원자를 포함하는 2가의 방향족 복소환기, 환 구성 원자로서 질소 원자를 포함하는 2가의 비방향족 복소환기를 들 수 있다. 환 구성 원자로서 질소 원자를 포함하는 2가의 방향족 복소환기로서는, 예를 들어, 피롤디일, 이미다졸디일, 인돌디일, 푸린디일, 카바졸디일을 들 수 있다. 환 구성 원자로서 질소 원자를 포함하는 2가의 비방향족 복소환기로서는, 예를 들면, 피롤디온디일, 피롤린디온디일, 피롤린디일, 아지리딘디일, 아제티딘디일, 피롤리딘디일, 피롤린디일, 이미다졸리딘디일, 피페리딘디일, 모르폴린디일, 티오모르폴린디일, 피페라진디일, 디하이드로피리미딘디일, 및 테트라하이드로피리미딘디일을 들 수 있다.
바람직하게는, (b) 상기 화학식 i로 표시되는 기는 (b') 하기 화학식 i'로 표시되는 기이다:
[화학식 i']
Figure pct00012
여기서, 환 Z는, E1과 결합하는 환 구성 원자 및 이의 양 측면의 환 구성 원자 모두가 탄소 원자인 2가의 환기이고, ·는 결합손이다.
상기 화학식 i'로 표시되는 기에서의 환 Z에 대한 2가의 환기의 정의, 예 및 바람직한 예는, 상기 화학식 i로 표시되는 기에서의 환 Z에 대한 2가의 환기의 것과 동일하다.
E3는, E2가 -X-Y-인 경우에는 2가의 기이고, E2가 화학식 i로 표시되는 기인 경우에는 결합 또는 2가의 기이다. E3로 표시되는 2가의 기는, E로 표시되는 친전자기를 포함하는 2가의 기가 친전자기에 더하여 다른 2가의 기를 포함하는 2가의 기인 경우에서의 다른 2가의 기와 동일하다.
L(이탈기를 포함하는 2가의 기)과 B(생체 직교성 관능기)를 연결하는 E(친전자기를 포함하는 2가의 기) 또는 E1(친전자기)-E2(상기 (a) 또는 (b))-E3(결합 또는 2가의 기)의 주쇄의 길이는, 화학식 I로 표시되는 화합물과 항체 사이의 반응에서의, 항체 중의 특정의 아미노산 잔기의 위치 선택적인 수식으로 관여할 수 없고, 오히려, 당해 반응 후에 생성하는, 생체 직교성 관능기를 갖는 항체에서의 항체와 생체 직교성 관능기 사이의 거리에 관여할 수 있다. E 또는 E1-E2-E3의 주쇄란, L 및 B를 연결하는, 공유 결합으로 연결된 복수의 원자로 이루어진 쇄상 구조를 말하며, 수소 원자, 분기 구조 부분, 및 치환기는 제외된다. 따라서, E 또는 E1-E2-E3의 주쇄의 길이는, 당해 거리의 조절의 관점에서, 적절하게 설계할 수 있다.
L과 B를 연결하는 E 또는 E1-E2-E3의 주쇄의 길이는, 특별히 한정되지 않지만, 3개 이상의 원자 이루어진 길이라도 좋다.
주쇄가 환 구조를 포함하지 않는 구조인 경우, 주쇄의 원자수는, 쇄상 구조 중의 원자수(수소 원자, 분기 구조 부분, 및 치환기 중의 원자수를 제외함)를 셈으로써 결정할 수 있다.
한편, 주쇄가 환 구조를 포함하는 구조인 경우, 주쇄의 길이를 규정하는 관점에서, 주쇄의 원자수를 편의적으로 셀 수 있다. 구체적으로는, 이러한 경우에서의 주쇄의 원자수는, 상술한 바와 같이, 주쇄에서 2가의 환 구조를 포함하지 않는 쇄상 구조 중의 원자수(수소 원자, 분기 구조 부분, 및 치환기 중의 원자수를 제외함)에 더하여, 환 구조 중의 두 결합손을 연락하는 최단 경로의 원자수를 셈으로써 결정할 수 있다.
바람직하게는, E 또는 E1-E2-E3의 주쇄는, E에서의 「다른 2가의 기」 또는 E3에서의 「2가의 기」가 2가의 환 구조를 포함하지 않는 쇄상 구조라도 좋다. 따라서, E에서의 「다른 2가의 기」 또는 E3에서의 「2가의 기」는, 2가의 직쇄 또는 분기쇄의 탄화수소기, -C(=O)-, -NRE-(RE는 수소 원자, 또는 상술한 치환기를 나타냄), -O-, -S-, -C(=S)-, 및 이들의 2 이상(예를 들면 2 내지 8, 바람직하게는 2 내지 6, 보다 바람직 2 내지 4)의 조합으로 이루어진 기라도 좋다. 2가의 직쇄 또는 분기쇄의 탄화수소기는, 예를 들어 1 내지 5개, 바람직하게는 1 내지 3개, 보다 바람직하게는 1 또는 2개의 치환기를 갖고 있어도, 갖고 있지 않아도 좋다. 화학 구조가 간결한 화합물을 합성하는 관점에서는, 이러한 치환기를 갖지 않는 것이 바람직하다. 한편, 상기와 같은 기가 치환기를 갖는 경우, 이러한 치환기의 예 및 바람직한 예는, 이탈기의 예인 헤테로아릴렌이 갖고 있어도 좋은 치환기와 동일하다.
1-5. 생체 직교성 관능기 (B)
화학식 I에서, B는 생체 직교성 관능기이다.
생체 직교성 관능기란, 생체 구성 성분(예, 아미노산, 핵산, 지질, 당, 인산)과 반응하지 않거나, 또는 생체 구성 성분에 대한 반응의 속도가 느리지만, 생체 구성 성분 이외의 성분에 대하여 선택적으로 반응하는 기를 말한다. 생체 직교성 관능기는, 당해 기술 분야에서 주지이다(예, Sharpless K.B.et al., Angew.Chem.Int.Ed.40, 2004(2015); Bertozzi C.R.et al., Science 291, 2357(2001); Bertozzi C.R.et al., Nature Chemical Biology 1, 13(2005)을 참조).
친화성 물질의 표적이 항체(단백질)인 경우, 생체 직교성 관능기는, 단백질에 대한 생체 직교성 관능기이다. 단백질에 대한 생체 직교성 관능기란, 단백질을 구성하는 천연의 20종의 아미노산 잔기의 측쇄와 반응하지 않고, 소정의 관능기와 반응하는 기이다. 단백질을 구성하는 천연의 20종의 아미노산은, 알라닌(A), 아스파라긴(N), 시스테인(C), 글루타민(Q), 글리신(G), 이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 페닐알라닌(F), 프롤린(P), 세린(S), 트레오닌(T), 트립토판(W), 타이로신(Y), 발린(V), 아스파라긴산(D), 글루타민산(E), 아르기닌(R), 히스티딘(H), 및 라이신(L)이다. 이러한 천연의 20종의 아미노산 중, 측쇄가 없는(즉, 수소 원자인) 글리신, 및 측쇄가 탄화수소기인(즉, 황 원자, 질소 원자, 및 산소 원자로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 헤테로 원자를 측쇄에 포함하지 않는) 알라닌, 이소류신, 류신, 페닐알라닌, 및 발린은, 통상의 반응에 대하여 불활성이다. 따라서, 단백질에 대한 생체 직교성 관능기는, 통상의 반응에 대하여 불활성인 측쇄를 갖는 이러한 아미노산의 측쇄에 더하여, 아스파라긴, 글루타민, 메티오닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신, 아스파라긴산, 글루타민산, 아르기닌, 히스티딘, 및 라이신의 측쇄에 대해서도 반응할 수 없는 관능기이다.
단백질에 대하여 반응할 수 없는 이러한 생체 직교성 관능기로서는, 예를 들면, 아지드 잔기, 알데하이드 잔기, 티올 잔기, 알켄 잔기(환언하면, 탄소 원자간 이중 결합을 갖는 최소 단위인 비닐렌(에테닐렌) 부분을 갖고 있으면 좋다. 이하 동일), 알킨 잔기(환언하면, 탄소 원자간 삼중 결합을 갖는 최소 단위인 에티닐렌 부분을 갖고 있으면 좋다. 이하 동일), 할로겐 잔기, 테트라진 잔기, 니트론 잔기, 하이드록실아민 잔기, 니트릴 잔기, 히드라진 잔기, 케톤 잔기, 보론산 잔기, 시아노벤조티아졸 잔기, 알릴 잔기, 포스핀 잔기, 말레이미드 잔기, 디설파이드 잔기, 티오에스테르 잔기, α-할로카보닐 잔기(예, α위에 불소 원자, 염소 원자, 브롬 원자 또는 요오드 원자를 갖는 카보닐 잔기. 이하 동일), 이소니트릴 잔기, 시드논 잔기, 셀렌 잔기를 들 수 있다. 항체는, 유리의 티올을 포함할 수 없는 단백질일 수 있다. 유리의 티올을 포함할 수 없는 단백질에서는, 티올이 생체 직교성 관능기로서 기능한다. 따라서, 친화성 물질의 표적이 항체인 경우, 생체 직교성 관능기에는 티올이 포함된다. 티올 잔기는, 미보호의 티올 잔기(즉, -SH)라도, 보호된 티올 잔기라도 좋다. 보호된 티올 잔기에서의 티올 잔기의 보호기로서는, 예를 들면, 탄화수소기〔예, 알킬기, 알케닐기, 알키닐기, 사이클로알킬기, 아릴기(예, 페닐기, 나프틸기), 아릴알킬(아랄킬)기〕, 아실기(예, 아세틸기, 프로폭시기, tert-부톡시카보닐기 등의 부톡시카보닐기, 벤조일기), 아릴알킬옥시카보닐기(예, 플루오레닐메톡시카보닐기), 아릴옥시카보닐기, 아릴알킬(아랄킬)옥시카보닐기(예, 벤질옥시카보닐기), 알킬티올기(t-부틸티오기), 아릴티올기(예, 피리딜디티오기)를 들 수 있다. 또는, 보호된 티올 잔기는, 디설파이드 잔기라도 좋다. 아릴알킬(아랄킬)기, 및 아릴알킬(아랄킬)옥시카보닐기에서의 아릴알킬은, 1개 또는 복수개(예를 들면, 2개, 3개, 4개, 5개)의 아릴이 알킬에 결합한 것이다. 티올 잔기의 보호기의 탄소 원자수는, 예를 들면 1 내지 30개, 바람직하게는 1 내지 20개, 보다 바람직하게는 1 내지 15개, 보다 더욱 바람직하게는 1 내지 10개, 특히 바람직하게는 1 내지 6개이다. 본 발명에서는, 화학식 I로 표시되는 화합물에서, 1종 또는 2종 이상(예, 2종, 3종, 4종)의 생체 직교성 관능기가 포함되어 있어도 좋지만, 바람직하게는, 1종의 생체 직교성 관능기가 포함되어 있어도 좋다.
보다 구체적으로는, 생체 직교성 관능기는, 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 어느 하나의 화학 구조에 대응하고 있어도 좋다.
Figure pct00013
식 중,
R1f, 단일 또는 복수의 R1g 및 단일 또는 복수의 R1h는, 동일 또는 상이하고, (a) 내지 (g)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 원자 또는 기, 또는 전자 흡인기이고,
·는, 결합손이다.
(a) 내지 (g)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 원자 또는 기로서는, 하기를 들 수 있다:
(a) 수소 원자, 또는 할로겐 원자;
(b) 1가의 탄화수소기;
(c) 아랄킬;
(d) 1가의 복소환기;
(e) Ra-O-, Ra-C(=O)-, Ra-O-C(=O)-, 또는 Ra-C(=O)-O-(Ra는, 수소 원자, 또는 1가의 탄화수소기를 나타낸다.); 또는
(f) NRbRc-, NRbRc-C(=O)-, NRbRc-C(=O)-O-, 또는 Rb-C(=O)-NRc-(Rb 및 Rc는, 동일 또는 상이하고, 수소 원자, 또는 1가의 탄화수소기를 나타낸다.);
(g) 니트로기, 황산기, 설폰산기, 시아노기, 또는 카복실기
로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 기.
(a) 내지 (g)에서의 할로겐 원자, 1가의 탄화수소기, 아랄킬, 1가의 복소환기, 및 Ra 내지 Rc에서의 1가의 탄화수소기의 정의, 예 및 바람직한 예는, 상기 (i) 내지 (vii)에서의 것과 동일하다. 특히 바람직하게는 (a) 내지 (g)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 원자 또는 기는 (a) 또는 (b)의 원자 또는 기이다.
바람직하게는, 생체 직교성 관능기는, 반응 효율의 향상 등의 관점에서, 상술한 생체 직교성 관능기 중에서도, 아지드 잔기, 티올 잔기, 알킨 잔기, 말레이미드 잔기, 및 디설파이드 잔기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 기라도 좋다.
전자 흡인기로서는, 예를 들어, 상술한 것을 들 수 있지만, 할로겐 원자, 보론산 잔기, 메실, 토실, 트리플레이트가 바람직하다.
1-6. 화학식 I로 표시되는 화합물의 바람직한 구조
바람직한 실시형태에서는, 화학식 I로 표시되는 화합물은, 하기 화학식 I-1로 표시되는 화합물이라도 좋다:
[화학식 I-1]
A-L1-L2-E1-E2-E3-B (I-1)
식 중,
A 및 B는 화학식 I의 것과 동일하고,
L1은 결합 또는 2가의 기이고,
L2는 이탈기이고,
E1은 (i) 이탈기와 연결되어 있고, 또한 (ii) 항체 중의 친핵기와 반응하는 능력을 갖는 친전자기이고,
E2는 (a) -X-Y-〔여기서, E1과 결합하는 X는 C(R1)(R2) (여기서, R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소 원자 또는 탄소 원자수 1 내지 6의 알킬이다.), N(R3) (여기서, R3는 수소 원자 또는 탄소 원자수 1 내지 6의 알킬이다.), O, S 또는 Se이고, E3와 결합하는 Y는 C(R4)(R5) (여기서, R4 및 R5는 각각 독립적으로 수소 원자 또는 탄소 원자수 1 내지 6의 알킬이다.)이다.〕, 또는 (b) 하기 화학식 i:
[화학식 i]
Figure pct00014
(여기서, 환 Z는, E1과 결합하는 환 구성 원자 X' 및 이의 양 측면의 환 구성 원자 모두가 탄소 원자인 2가의 환기이거나, E1과 결합하는 환 구성 원자 X'가 질소 원자이며, 또한 질소 원자의 양 측면의 환 구성 원자가 탄소 원자인 2가의 복소환기이고, ·는 결합손이다.)로 표시되는 기이고,
E3는, E2가 -X-Y-인 경우에는 2가의 기이고, E2가 화학식 i로 표시되는 기인 경우에는 결합 또는 2가의 기이고,
이탈기는 상기 친핵기와 상기 친전자기 사이의 반응에 의해 E1에서부터 절단되어 이탈하는 능력을 갖는다.
화학식 I-1에서, L2로 표시되는 이탈기는, 바람직하게는, 상기 (a) 내지 (c) 중 어느 하나이다. L2로 표시되는 이탈기의 예 및 바람직한 예도 또한, 상기 (a) 내지 (c)에 언급한 것과 동일하다.
바람직한 특정의 실시형태에서는, 화학식 I-1로 표시되는 화합물은 하기 화학식 I-2로 표시되는 화합물이라도 좋다:
[화학식 I-2]
A-L1-L2-E1-X-Y-E3-B (i-2)
식 중,
A, L1, X, Y 및 B는 화학식 I-1의 것과 동일하고,
L2는,
(a) 환 P-Q-〔여기서, 환 P가, 전자 흡인성 기로 치환되어 있어도 좋은 아릴렌, 전자 흡인성 기로 치환되어 있어도 좋은 헤테로아릴렌, 축환하고 있어도 좋은 2,5-디케토피롤리딘, 축환하고도 좋은 2,6-디케토피페리딘, 축환하고 있어도 좋은 2-케토피롤리딘, 축환하고 있어도 좋은 2-케토피페리딘, 2-피리돈으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 기이고, Q가 -O-, -S-, -Se-, -SO2-O-, -SO2-N(R)-, -SO2-, -C≡C-CH2-O-, -N(OR)-, -N(R)- 및 -O-N(R)-로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 기 (여기서, R은 수소 원자 또는 탄소 원자수 1 내지 6의 알킬이다.)이다.〕,
(b) 헤테로아릴렌, 또는
(c) -Q-〔여기서, Q가 -O-, -S-, -Se-, -SO2-O-, -SO2-N(R)-, -SO2-, -C≡C-CH2-O-, -N(OR)-, -N(R)- 및 -O-N(R)-로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 기 (여기서, R은 수소 원자 또는 탄소 원자수 1 내지 6의 알킬이다.)이다.〕이며,
E1은 -C(=O)-, -SO2- 및 -CH2-로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 기이고,
E3는 2가의 기이다.
바람직한 다른 특정의 실시형태에서는, 화학식 I-1로 표시되는 화합물은, 하기 화학식 I-3으로 표시되는 화합물이라도 좋다:
[화학식 I-3]
Figure pct00015
식 중,
A, L1, 환 Z, 환 구성 원자 X' 및 B는 상기 화학식 I-1의 것과 동일하고,
L2는,
(a) 환 P-Q-〔여기서, 환 P가, 전자 흡인성 기로 치환되어 있어도 좋은 아릴렌, 전자 흡인성 기로 치환되어 있어도 좋은 헤테로아릴렌, 축환하고 있어도 좋은 2,5-디케토피롤리딘, 축환하고 있어도 좋은 2,6-디케토피페리딘, 축환하고 있어도 좋은 2-케토피롤리딘, 축환하고 있어도 좋은 2-케토피페리딘, 2-피리돈으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 기이고, Q가 -O-, -S-, -Se-, -SO2-O-, -SO2-N(R)-, -SO2-, -C≡C-CH2-O-, -N(OR)-, -N(R)- 및 -O-N(R)-로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 기 (여기서, R은 수소 원자 또는 탄소 원자수 1 내지 6의 알킬이다.)이다.〕,
(b) 헤테로아릴렌, 또는
(c) -Q-〔여기서, Q가 -O-, -S-, -Se-, -SO2-O-, -SO2-N(R)-, -SO2-, -C≡C-CH2-O-, -N(OR)-, -N(R)- 및 -O-N(R)-로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 기 (여기서, R은 수소 원자 또는 탄소 원자수 1 내지 6의 알킬이다.)이다.〕이며,
E1은 -C(=O)-, -SO2- 및 -CH2-로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 기이고,
E3는 결합 또는 2가의 기이다.
바람직하게는, 화학식 I-3으로 표시되는 화합물은, 하기 화학식 I-4로 표시되는 화합물이라도 좋다:
[화학식 I-4]
Figure pct00016
식 중,
A, L1, 및 B는 상기 화학식 I-1의 것과 동일하고,
L2는 (a) 환 P-Q-〔여기서, 환 P가, 전자 흡인성 기로 치환되어 있어도 좋은 아릴렌, 전자 흡인성 기로 치환되어 있어도 좋은 헤테로아릴렌, 축환하고 있어도 좋은 2,5-디케토피롤리딘, 축환하고 있어도 좋은 2,6-디케토피페리딘, 축환하고 있어도 좋은 2-케토피롤리딘, 축환하고도 좋은 2-케토피페리딘, 2-피리돈으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 기이고, Q가 -O-, -S-, -Se-, -SO2-O-, -SO2-N(R)-, -SO2-, -C≡C-CH2-O-, -N(OR)-, -N(R)- 및 -O-N(R)-로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 기 (여기서, R은 수소 원자 또는 탄소 원자수 1 내지 6의 알킬이다.)이다.〕,
(b) 헤테로아릴렌, 또는
(c) -Q-〔여기서, Q가 -O-, -S-, -Se-, -SO2-O-, -SO2-N(R)-, -SO2-, -C≡C-CH2-O-, -N(OR)-, -N(R)- 및 -O-N(R)-로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 기 (여기서, R은 수소 원자 또는 탄소 원자수 1 내지 6의 알킬이다.)이다.〕이며,
E1은 -C(=O)-, -SO2-, 및 -CH2-로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 기이고,
환 Z는, E1과 결합하는 환 구성 원자 및 이의 양 측면의 환 구성 원자 모두가 탄소 원자인 2가의 환기이다.)로 표시되는 기이며,
E3는 결합 또는 2가의 기이다.
상기 화학식 I-1 내지 I-4로 표시되는 화합물에서, A, L1, L2, E1, E2, E3, 및 B, 및 -X-Y-, R1 내지 R5에서의 탄소 원자수 1 내지 6의 알킬, 화학식 i로 표시되는 기(예, 2가의 환기, 2가의 복소환기)의 정의, 예 및 바람직한 예는, 상술한 것과 동일하다. 또한, L2인 (a) 내지 (c), 및 환 Z(예, E1과 결합하는 환 구성 원자 X' 및 이의 양 측면의 환 구성 원자 모두가 탄소 원자인 2가의 환기, 또는 E1과 결합하는 환 구성 원자 X'가 질소 원자이며, 또한 질소 원자의 양 측면의 환 구성 원자가 탄소 원자인 2가의 복소환기), 환 P, 및 Q(예, R에서의 탄소 원자수 1 내지 6의 알킬) 등의 기의 정의, 예 및 바람직한 예도 또한, 상술한 것과 동일하다.
1-7. 제조 방법
항체에 대한 친화성 물질 및 생체 직교성 관능기를 갖는 화합물 또는 이의 염은, 적절히 조제할 수 있다. 항체에 대한 친화성 물질 및 생체 직교성 관능기를 갖는 화합물 또는 이의 염은, 화학식 I, 바람직하게는 화학식 I-1, 보다 바람직하게는 화학식 I-2, I-3 또는 I-4로 표시된다.
항체에 대한 친화성 물질 (A)로서는, 임의의 관능기를 갖는 것을 적절히 선택할 수 있다. 따라서, 당해 관능기와 반응할 수 있는 반응성기를 이용함으로써, 친화성 물질을, L-E-B로 표시되는 구조 단위와 반응시켜, A-L-E-B로 표시되는 구조 단위를 조제할 수 있다. 예를 들어, 이러한 반응은, 적절한 반응계, 예를 들면 유기 용매계 또는 수용액계에서, 적온(適溫)(예, 약 15 내지 200℃)에서 행할 수 있다. 반응계는, 적절한 촉매를 포함하고 있어도 좋다. 반응 시간은, 예를 들어 1분 내지 20시간, 바람직하게는 10분 내지 15시간, 보다 바람직하게는 20분 내지 10시간, 보다 더욱 바람직하게는 30분 내지 8시간이다.
반응계에서, 친화성 물질 (X)에 대한, L-E-B로 표시되는 구조 단위 (Y)의 몰 비율(Y/X)은, 당해 구조 단위 및 친화성 물질의 종류, 당해 구조 단위에 의해 수식되어야 할 친화성 물질 중의 부위의 수 등에 따라 변동하기 때문에 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 0.1 내지 50이고, 바람직하게는 0.5 내지 40이며, 보다 바람직하게는 1 내지 35이며, 보다 더욱 바람직하게는 2 내지 25이며, 특히 바람직하게는 3 내지 15이다.
항체에 대한 친화성 물질 및 생체 직교성 관능기를 갖는 화합물 또는 이의 염의 생성의 확인은, 그 구체적인 원료 및 생성물의 분자량에도 따르지만, 예를 들어, 전기 영동법, 크로마토그래피(예, 겔 여과 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 역상 컬럼 크로마토그래피, HPLC), 또는 질량 분석에 의해, 바람직하게는, 질량 분석에 의해 행할 수 있다. 항체에 대한 친화성 물질 및 생체 직교성 관능기를 갖는 화합물 또는 이의 염은, 크로마토그래피(예, 상술한 크로마토그래피, 및 어피니티 크로마토그래피) 등의 임의의 방법에 의해 적절히 정제할 수 있다.
1-8. 기타
후술의 발명〔예, 화학식 II, III 및 그 하위 개념의 화학식, 및 부분 구조식으로 표시되는 발명〕에서는, 임의의 기호(예, A, L, E, B), 및 당해 기호에 관련하여 표시되는 용어의 상세(예를 들어, 정의, 예 및 바람직한 예)는, 상기 화학식 I 또는 그 하위 개념의 식으로 표시되는 화합물 또는 이의 염의 발명과 공통된다. 또한, 후술의 발명을 규정할 수 있는 특정의 기(예 생체 직교성 관능기, 2가의 기, 치환기), 및 특정의 수치 등의 임의의 기술 요소(예, 정의, 예 및 바람직한 예)에 대해서도, 상기에서 설명한 것과 공통으로 할 수 있다. 따라서, 이러한 사항은, 특별히 언급하지 않고, 후술의 발명에 있어서 적절하게 원용할 수 있다. 마찬가지로, 후술의 발명에서 언급한 특정의 발명의 기술 요소는, 본 발명 및 다른 발명의 기술 요소로서, 적절하게 원용할 수 있다.
2. 생체 직교성 관능기를 갖는 항체의 제조 방법
본 발명은, 이하를 포함하는, 생체 직교성 관능기를 갖는 항체 또는 이의 염의 제조 방법을 제공한다.
(1) 하기 화학식 I로 표시되는, 항체에 대한 친화성 물질 및 생체 직교성 관능기를 갖는 화합물 또는 이의 염을, 항체와 반응시켜, 하기 화학식 II로 표시되는, 생체 직교성 관능기를 갖는 항체 또는 이의 염을 생성하는 것:
[화학식 I]
A-L-E-B (I)
식 중,
A는 항체에 대한 친화성 물질이고,
L은 이탈기를 포함하는 2가의 기이고,
E는 (i) 이탈기와 연결되어 있고, 또한 (ii) 항체 중의 친핵기와 반응하는 능력을 갖는 친전자기를 포함하는 2가의 기이고,
B는 생체 직교성 관능기이며,
이탈기는 상기 친핵기와 상기 친전자기 사이의 반응에 의해 E로부터 절단되어 이탈하는 능력을 갖는다.
[화학식 II]
Ab-E-B (II)
식 중,
E 및 B는 화학식 I의 것과 동일하고,
Ab는 항체이다.
생체 직교성 관능기를 갖는 항체의 제조 방법에서 사용되는 항체는, 상술한 항체와 동일하다. 바람직하게는, 항체는, 모노클로날 항체이다. 모노클로날 항체의 아이소 타입으로서는, 예를 들어, IgG(예, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA, IgD, IgE, 및 IgY를 들 수 있다. 모노클로날 항체는, 전장 항체, 또는 항체 단편(예, F(ab')2, Fab', Fab, Fv, 단쇄 항체)이지만, 전장 항체가 바람직하다. 특히 바람직하게는, 항체는, 인간 IgG(예, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4)를 정상 영역에 갖는 인간 항체, 인간화 항체, 또는 키메라 항체이다.
화학식 II에서의 AB는 상술한 항체와 동일하고, E에서의 친전자기와 공유 결합하고 있다. E에서의 친전자기와의 공유 결합에 제공되는 항체 중의 친핵기로서는, 예를 들어, 라이신 잔기의 측쇄에서의 NH2, 타이로신 잔기의 측쇄에서의 OH, 세린 잔기의 측쇄에서의 OH, 트레오닌 잔기의 측쇄에서의 OH, 및 시스테인 잔기의 측쇄에서의 SH를 들 수 있다.
화학식 II에서의 E는 상기 화학식 I에서의 E와 동일하다. E는, E1-E2-E3로 표시될 수 있다. E1, E2, 및 E3는, 상술의 것과 동일하다. 상술한 바와 같이, E 및 E1-E2-E3는, 잠재적인 면역원성을 갖고, 또한 혈중에서 가수 분해되기 쉽다는 문제를 안고 있는 펩타이드 부분을 포함하지 않도록 설계할 수 있다. 이 경우, 화학식 II로 표시되는 생체 직교성 관능기를 갖는 항체는, 이러한 문제를 안지 않은, 기능성 물질을 갖는 항체의 조제에 사용할 수 있다.
E에서의 친전자기 및 E1의 친전자기는, 항체 중의 친핵기와 공유 결합하고 있다. 항체 중의 친핵기와 공유 결합하고 있는 친전자기로서는, 예를 들어, NH-C(=O)-, NH-SO2-, 및 NH-CH2-(E와의 공유 결합에 제공되는 항체 중의 친핵기가 라이신 잔기의 측쇄에서의 NH2인 경우), O-C(=O)-, O-SO2-, 및 O-CH2-(E와의 공유 결합에 제공되는 항체 중의 친핵기가, 타이로신 잔기, 세린 잔기, 또는 트레오닌 잔기의 측쇄에서의 OH인 경우), S-C(=O)-, 및 S-CH2-(E와의 공유 결합에 제공되는 항체 중의 친핵기가, 시스테인 잔기의 측쇄에서의 SH인 경우)를 들 수 있다. 항체 중의 친핵기와 공유 결합하고 있는 친전자기로서는, NH-C(=O)- 및 NH-SO2-(E와의 공유 결합에 제공되는 항체 중의 친핵기가 라이신 잔기의 측쇄에서의 NH2인 경우), O-C(=O)- 및 O-SO2-(E와의 공유 결합에 제공되는 항체 중의 친핵기가, 타이로신 잔기의 측쇄에서의 OH인 경우)가 바람직하고, NH-C(=O)- 및 NH-SO2-(E와의 공유 결합에 제공되는 항체 중의 친핵기가 라이신 잔기의 측쇄에서의 NH2인 경우)가 보다 바람직하고, NH-C(=O)-(E와의 공유 결합에 제공되는 항체 중의 친핵기가 라이신 잔기의 측쇄에서의 NH2인 경우)가 보다 더욱 바람직하다.
화학식 II에서의 B는 상기 화학식 I에서의 B와 동일하다.
바람직하게는, 본 발명의 제조 방법으로 제조되는 생체 직교성 관능기를 갖는 항체는, 생체 직교성 관능기를 위치 선택적으로 갖는 항체이다. 항체에 대한 친화성 물질 및 생체 직교성 관능기를 갖는 화합물 또는 이의 염이, 화학식 I로 표시되는 것인 경우, 화학식 II로 표시되는, 생체 직교성 관능기를 위치 선택적으로 갖는 항체를 제조할 수 있다. 생체 직교성 관능기를 위치 선택적으로 갖는 항체는, 바람직하게는, 정상 영역에만 생체 직교성 관능기를 갖는 항체이며, 보다 바람직하게는, Fc 영역에만 생체 직교성 관능기를 갖는 항체이다.
본 명세서에서, 「위치 선택적인」 또는 「위치 선택성」이란, 항체에서 특정의 아미노산 잔기가 특정의 영역에 편재하고 있지 않음에도 불구하고, 항체 중의 특정의 아미노산 잔기와 결합할 수 있는 소정의 구조 단위가, 항체 중의 특정의 영역에 편재하는 것을 말한다. 따라서, 「위치 선택적으로 갖는다」, 「위치 선택적인 결합」, 「위치 선택성에서의 결합」 등의 위치 선택성에 관련되는 표현은, 1개 이상의 특정의 아미노산 잔기를 포함하는 표적 영역에서의 소정의 구조 단위의 결합률 또는 보유율이, 표적 영역에서의 당해 특정의 아미노산 잔기와 동종인 복수개의 아미노산 잔기를 포함하는 비표적 영역에서의 당해 구조 단위의 보유율 또는 결합률보다도 훨씬 유의미한 레벨로 높은 것을 의미한다. 이러한 위치 선택적인 결합 또는 보유는, 항체 중의 특정의 아미노산 잔기에 대하여 소정의 구조 단위를 랜덤으로 반응시키는 것이 아니라, 항체에 대한 친화성 물질을 포함하는 화합물을 사용함으로써, 항체 중의 표적 영역에서의 특정의 아미노산 잔기에 대하여 소정의 구조 단위를 우선적으로 반응시킬 수 있는 본 발명에 의해 달성할 수 있다.
보다 구체적으로는, 항체 (Ab)가, 연속되는 1 내지 50개의 아미노산 잔기로 이루어진 표적 영역〔예, 인간 IgG Fc 영역에서의 246 내지 248 위치의 아미노산 잔기로 이루어진 영역, (b) 인간 IgG Fc 영역에서의 288 내지 290 위치의 아미노산 잔기로 이루어진 영역, 또는 (c) 인간 IgG Fc 영역에서의 317 위치의 아미노산 잔기로 이루어진 영역〕 중에서 특정의 아미노산 잔기(예, 라이신 잔기, 타이로신 잔기, 트레오닌 잔기, 세린 잔기, 시스테인 잔기)를 1개 이상 포함하고, 또한, 상기 표적 영역 이외의 비표적 영역 중에서 상기 특정의 아미노산 잔기를 5개 이상 포함하는 경우, 항체 이외의 부분 구조는, 당해 표적 영역 중에 포함되는 1개 이상의 특정의 아미노산 잔기에 대하여 30% 이상의 위치 선택성으로 결합시킬 수 있다. 위치 선택성은, 바람직하게는 40% 이상, 보다 바람직하게는 50% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 60% 이상, 특히 바람직하게는 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100%라도 좋다.
본 발명의 제조 방법으로 제조되는 생체 직교성 관능기를 갖는 항체는 또한, 중쇄의 수에 따라, 생체 직교성 관능기(즉, E-B로 표시되는 구조 단위)를 가질 수있다. 생체 직교성 관능기를 위치 선택적으로 갖는 항체는, 먼저, 화학식 I로 표시되는 화합물 (A-L-E-B)를, 항체에 대한 친화성 물질 (A)를 통해서 항체 중쇄의 정상 영역에 회합시키고, 이어서, E에서의 친전자기를, 회합 부위의 근방(상기 항체 중쇄와 동일 중쇄의 정상 영역)에서의 특정의 아미노산 잔기의 측쇄 중의 친핵기와 반응시킴으로써, 제조할 수 있다. 따라서, 항체 중쇄를 복수(예를 들면 1 내지 8개, 바람직하게는 1 내지 4개, 보다 바람직하게는 2개) 갖는 항체를 본 발명의 제조 방법에 있어서 사용함으로써, 복수의 항체 중쇄의 동일한 표적 영역에서 E-B로 나타나는 복수의 구조 단위(또는 그 하위 개념의 복수의 구조 단위)를 위치 선택적으로 갖는 항체를 제조할 수 있다. 예를 들어, 항체 중쇄를 둘 갖는 항체(예, IgG, IgD, IgE, F(ab')2 항체, Fc 영역 단백질, Fc 융합 단백질)를 본 발명의 제조 방법에 있어서 사용함으로써, 두 항체 중쇄의 동일한 표적 영역에서 E-B로 나타나는 두 구조 단위를 위치 선택적으로 갖는 항체를 제조할 수 있다. 즉, 생체 직교성 관능기를 갖는 항체에서, 생체 직교성 관능기에 의한 수식 양식을 복수(예, 둘)의 중쇄간에서 동일하게 할 수 있다.
생체 직교성 관능기를 갖는 항체는 또한, 하나의 항체 중쇄의 복수(예를 들면 2 내지 5개, 바람직하게는 2 내지 4개, 보다 바람직하게는 2 또는 3개)의 표적 영역에서, 동종 또는 이종의 생체 직교성 관능기(예를 들어, E-B로 표시되는 구조 단위)를 가질 수 있다. 이 경우, 생체 직교성 관능기를 갖는 항체에서, 생체 직교성 관능기에 의한 수식 양식을 복수(예, 둘)의 중쇄간에서 동일하게 할 수 있다.
본 발명의 제조 방법은 또한, 생성한 항체를, 특정의 처리에 부침으로써, 생체 직교성 관능기를 갖고, 또한 추가로 수식된 항체를 생성하는 것을 포함하고 있어도 좋다. 이러한 특정의 처리로서는, 예를 들어, 항체의 단편화 처리(예, 파파인, 펩신 등의 특정의 프로테아제에 의한 처리)를 들 수 있다.
본 발명의 제조 방법에 있어서 화학식 I로 표시되는 화합물 또는 이의 염을 사용하는 경우, 상기 화학식 II로 표시되는 생체 직교성 관능기를 갖는 항체를 제조할 수 있다.
바람직한 실시형태에서는, 본 발명의 제조 방법에 있어서 화학식 I로 표시되는 화합물로서 화학식 I-1로 표시되는 것을 사용하는 경우, 하기 화학식 II-1로 표시되는 생체 직교성 관능기를 갖는 항체를 제조할 수 있다:
[화학식 II-1]
Ab-E1-E2-E3-B (II-1)
식 중,
Ab는 항체이고,
E1은 항체 중의 친핵기와 연결되어 있는 친전자기이고,
E2는 (a) -X-Y-〔여기서, E1과 결합하는 X는 C(R1)(R2) (여기서, R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소 원자 또는 탄소 원자수 1 내지 6의 알킬이다.), N(R3) (여기서, R3는, 수소 원자 또는 탄소 원자수 1 내지 6의 알킬이다.), O, S 또는 Se이고, E3와 결합하는 Y는 C(R4)(R5) (여기서, R4 및 R5는 각각 독립적으로 수소 원자 또는 탄소 원자수 1 내지 6의 알킬이다.)이다.〕, 또는 (b) 하기 화학식 i:
[화학식 i]
Figure pct00017
(여기서, 환 Z는, E1과 결합하는 환 구성 원자 X' 및 이의 양 측면의 환 구성 원자 모두가 탄소 원자인 2가의 환기이거나, E1과 결합하는 환 구성 원자 X'가 질소 원자이며, 또한 질소 원자의 양 측면의 환 구성 원자가 탄소 원자인 2가의 복소환기이고, ·는 결합손이다.)로 표시되는 기이고,
E3는, E2가 -X-Y-인 경우에는 2가의 기이고, E2가 화학식 i로 표시되는 기인 경우에는 결합 또는 2가의 기이고,
B는 생체 직교성 관능기이다.
바람직한 특정의 실시형태에서는, 본 발명의 제조 방법에 있어서 화학식 I-1로 표시되는 화합물로서 화학식 I-2로 표시되는 것을 사용하는 경우, 하기 화학식 II-2로 표시되는 생체 직교성 관능기를 갖는 항체를 제조할 수 있다:
[화학식 II-2]
Ab-E1-X-Y-E3-B (II-2)
식 중,
Ab X, Y 및 B는 화학식 II-1의 것과 동일하고,
E1은 -C(=O)-, -SO2- 및 -CH2-로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 기이고,
E3는, 2가의 기이다.
바람직한 다른 특정의 실시형태에서는, 본 발명의 제조 방법에 있어서 화학식 I-1로 표시되는 화합물로서 화학식 I-3으로 표시되는 것을 사용하는 경우, 하기 화학식 II-3으로 표시되는 생체 직교성 관능기를 갖는 항체를 제조할 수 있다:
[화학식 II-3]
Figure pct00018
식 중,
Ab, 환 구성 원자 X', 환 Z 및 B는 화학식 II-1의 것과 동일하고,
E1은 -C(=O)-, -SO2- 및 -CH2-로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 기이고,
E3는 결합 또는 2가의 기이다.
바람직하게는, 본 발명의 제조 방법에 있어서 화학식 I-3으로 표시되는 화합물로서 화학식 I-4로 표시되는 것을 사용하는 경우, 하기 화학식 II-4로 표시되는 생체 직교성 관능기를 갖는 항체를 제조할 수 있다:
[화학식 II-4]
Figure pct00019
식 중,
Ab, 환 Z 및 B는 화학식 II-1의 것과 동일하고,
E1은 -C(=O)-, -SO2- 및 -CH2-로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 기이고,
E3는 결합 또는 2가의 기이다.
화학식 II, II-1, II-2, II-3 또는 II-4에서의 임의의 기호(예, E, E1, E2, E3, B), 및 당해 기호에 관련하여 표시되는 용어(예, 항체, 친전자기, 생체 직교성 관능기)의 상세(예를 들어, 정의, 예 및 바람직한 예)는, 상기 화학식 I 또는 그 하위 개념의 식의 것과 공통된다.
항체에 대한 친화성 물질 및 생체 직교성 관능기를 갖는 화합물 또는 이의 염은, E에서의 친전자기 또는 E1의 친전자기를 갖기 때문에, 항체와 반응할 수 있다. 이러한 반응은, 단백질의 변성·분해(예, 아미드 결합의 절단)를 일으킬 수 없는 조건(온화한 조건) 하에서 적절하게 행할 수 있다. 예를 들어, 이러한 반응은, 적절한 반응계, 예를 들어 완충액 중에서, 실온(예, 약 15 내지 30℃)에서 행할 수 있다. 완충액의 pH는, 예를 들어 5 내지 9이며, 바람직하게는 5.5 내지 8.5이며,보다 바람직하게는 6.0 내지 8.0이다. 완충액은, 적절한 촉매를 포함하고 있어도 좋다. 반응 시간은, 예를 들어 1분 내지 20시간, 바람직하게는 10분 내지 15시간,보다 바람직하게는 20분 내지 10시간, 보다 더욱 바람직하게는 30분 내지 8시간이다. 이러한 반응의 상세에 대해서는, 예를 들어, G.J.L.Bernardes et al., Chem.Rev., 115, 2174(2015); G.J.L.Bernardes et al., Chem.Asian.J., 4, 630(2009); B.G.Davies et al., Nat.Commun., 5, 4740(2014); A.Wagner et al., Bioconjugate.Chem., 25, 825(2014)를 참조할 것.
반응계에서, 항체(X)에 대한, 항체에 대한 친화성 물질 및 생체 직교성 관능기를 갖는 화합물 또는 이의 염(Y)의 몰 비율(Y/X)은, 항체에 대한 친화성 물질 및 생체 직교성 관능기를 갖는 화합물 또는 이의 염 및 항체의 종류, 항체에 대한 친화성 물질 및 생체 직교성 관능기를 갖는 화합물 또는 이의 염에 의해 수식되어야 할 항체 중의 부위의 수(예, DAR) 등에 따라 변동하기 때문에 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 0.1 내지 100이며, 바람직하게는 0.5 내지 80이며, 보다 바람직하게는 1 내지 70이며, 보다 더욱 바람직하게는 2 내지 50이며, 특히 바람직하게는 3 내지 30이다.
생체 직교성 관능기를 갖는 항체의 생성의 확인은, 그 구체적인 원료 및 생성물의 분자량에도 따르지만, 예를 들어, 전기 영동법, 크로마토그래피(예, 겔 여과 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 역상 컬럼 크로마토그래피, HPLC), 또는 질량 분석에 의해, 바람직하게는, 질량 분석에 의해 행할 수 있다. 위치 선택성의 확인은, 예를 들어, 펩타이드 매핑에 의해 행할 수 있다. 펩타이드 맵핑은, 예를 들어, 프로테아제(예, 트립신, 키모트립신,) 처리 및 질량 분석에 의해 행할 수 있다. 프로테아제로서는, 엔드 프로테아제가 바람직하다. 이러한 엔드 프로테아제로서는, 예를 들면, 트립신, 키모트립신, Glu-C, Lys-N, Lys-C, Asp-N을 들 수 있다. 생체 직교성 관능기를 갖는 항체가 보유하는, 생체 직교성 관능기의 개수의 확인은, 예를 들면, 전기 영동법, 크로마토그래피, 또는 질량 분석에 의해, 바람직하게는, 질량 분석에 의해 행할 수 있다. 생체 직교성 관능기를 갖는 항체는, 크로마토그래피(예, 상술한 크로마토그래피, 및 어피니티 크로마토그래피) 등의 임의의 방법에 의해 적절히 정제할 수 있다.
3. 항체에 대한 친화성 물질 및 생체 직교성 관능기를 갖는 화합물 또는 이의 염을 사용하는, 기능성 물질을 갖는 항체의 제조 방법
본 발명은, 이하를 포함하는, 기능성 물질을 갖는 항체 또는 이의 염의 제조 방법을 제공한다.
(1) 하기 화학식 I로 표시되는, 항체에 대한 친화성 물질 및 생체 직교성 관능기를 갖는 화합물 또는 이의 염을, 항체와 반응시켜, 하기 화학식 II로 표시되는, 생체 직교성 관능기를 갖는 항체 또는 이의 염을 생성하는 것; 및
(2) 상기 화학식 II로 표시되는, 생체 직교성 관능기를 갖는 항체 또는 이의 염을, 생체 직교성 관능기를 통해서 기능성 물질과 반응시켜, 하기 화학식 III으로 표시되는, 기능성 물질을 갖는 항체 또는 이의 염을 생성하는 것:
[화학식 I]
A-L-E-B (I)
식 중,
A는 항체에 대한 친화성 물질이고,
L은 이탈기를 포함하는 2가의 기이고,
E는 (i) 이탈기와 연결되어 있고, 또한 (ii) 항체 중의 친핵기와 반응하는 능력을 갖는 친전자기를 포함하는 2가의 기이고,
B는 생체 직교성 관능기이고,
이탈기는 상기 친핵기와 상기 친전자기 사이의 반응에 의해 E로부터 절단되어 이탈하는 능력을 갖는다.
[화학식 II]
Ab-E-B (II)
식 중,
E 및 B는 상기 화학식 I의 것과 동일하고,
Ab는 항체이다.
[화학식 III]
Ab-E-B'-F (III)
식 중,
AB는 화학식 II의 것과 동일하고,
E는 화학식 I의 것과 동일하고,
B'는 기능성 물질과 생체 직교성 관능기 사이의 반응에 의해 생성하는 부분을 포함하는 2가의 기이고,
F는 기능성 물질이다.
(1)의 공정은, 생체 직교성 관능기를 갖는 항체의 제조 방법과 동일하게 하여 행할 수 있다.
(2)의 공정에서 사용되는 기능성 물질 (F)는, 항체에 임의의 기능을 부여하는 물질인 한 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면, 약물, 표지 물질, 안정화제를 들 수 있지만, 바람직하게는 약물 또는 표지 물질이다. 기능성 물질은 또한, 단일의 기능성 물질이라도 좋고, 또는 2 이상의 기능성 물질이 연결된 물질이라도 좋다.
약물로서는, 임의의 질환에 대한 약물이라도 좋다. 이러한 질환으로서는, 예를 들어, 암(예, 폐암, 위암, 대장암, 췌장암, 신장암, 간장암, 갑상선암, 전립선암, 방광암, 난소암, 자궁암, 골암, 피부암, 뇌종양, 흑색종), 자기 면역 질환·염증성 질환(예, 알레르기 질환, 관절 류마티스, 전신성 에리테마토데스), 뇌신경 질환(예, 뇌경색, 알츠하이머병, 파킨슨병, 근위축성 측색 경화증), 감염증(예, 세균 감염증, 바이러스 감염증), 유전성·희소 질환(예, 유전성 구상 적혈구증, 비디스트로피 근긴장증), 안 질환(예, 가령 황반 변성증, 당뇨병 망막증, 망막 색소 변성증), 뼈·정형외과 영역의 질환(예, 변형성 관절염), 혈액 질환(예, 백혈병, 자반병), 기타 질환(예, 당뇨병, 고지혈증 등의 대사 이상증, 간장 질환, 신장 질환, 폐 질환, 순환기계 질환, 소화 기관계 질환)을 들 수 있다. 약물은, 소정의 질환을 치료 또는 예방하는 약물, 또는 소정의 질환의 표적 단백질에 대한 항체의 사용에 따른 부작용을 완화하는 약물이라도 좋다.
보다 구체적으로는, 약물은, 항암제이다. 항암제로서는, 예를 들면, 화학 요법제, 독소, 방사성 동위체 또는 그것을 포함하는 물질을 들 수 있다. 화학 요법제로서는, 예를 들면, DNA 손상제, 대사길항제, 효소 저해제, DNA 인터칼레이트제, DNA 절단제, 토포이소머라아제 저해제, DNA 결합 저해제, 튜불린 결합 저해제, 세포 상해성 뉴클레오시드, 백금 화합물을 들 수 있다. 독소로서는, 예를 들어, 세균 독소(예, 디프테리아 독소), 식물 독소(예, 리신)를 들 수 있다. 방사성 동위체로서는, 예를 들어, 수소 원자의 방사성 동위체(예, 3H), 탄소 원자의 방사성 동위체(예, 14C), 인 원자의 방사성 동위체(예, 32P), 황 원자의 방사성 동위체(예, 35S), 이트륨의 방사성 동위체(예, 90Y), 테크네튬의 방사성 동위체(예, 99mTc), 인듐의 방사성 동위체(예, 111In), 요오드 원자의 방사성 동위체(예, 123I, 125I, 129I, 131I), 사마륨의 방사성 동위체(예, 153Sm), 레늄의 방사성 동위체(예, 186Re), 아스타틴의 방사성 동위체(예, 211At), 비스무트의 방사성 동위체(예, 212Bi)를 들 수 있다.
표지 물질로서는, 예를 들어, 효소(예, 페록시다아제, 알칼리포스파타아제, 루시페라아제, β-갈락토시다아제), 친화성 물질(예, 스트렙타아비딘, 비오틴, 디곡시게닌, 앱타머), 형광 물질(예, 플루오레세인, 플루오레세인이소티오시아네이트, 로다민, 녹색 형광 단백질, 적색 형광 단백질), 발광 물질(예, 루시페린, 에쿠오린, 아크리디늄에스테르, 트리스(2,2'-비피리딜)루테늄, 루미놀), 방사성 동위체(예, 상술한 것) 또는 그것을 포함하는 물질을 들 수 있다.
기능성 물질은 또한, 고분자 화합물, 중분자 화합물, 또는 저분자 화합물이고, 바람직하게는, 저분자 화합물이다. 저분자 화합물이란, 분자량 1500 이하의 화합물을 말한다. 저분자 화합물은, 천연 화합물 또는 합성 화합물이다. 저분자 화합물의 분자량은, 1200 이하, 1000 이하, 900 이하, 800 이하, 700 이하, 600 이하, 500 이하, 400 이하, 또는 300 이하라도 좋다. 저분자 화합물의 분자량은 또한, 30 이상, 40 이상, 또는 50 이상이라도 좋다. 저분자 화합물은, 상술한 바와 같은 약물 또는 표지 물질이라도 좋다. 또한, 저분자 화합물로서는, 예를 들면, 아미노산, 올리고펩타이드, 비타민, 뉴클레오시드, 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 단당, 올리고당, 지질, 지방산, 및 그들의 염을 들 수 있다.
기능성 물질은, 그 구조에 따른 다양한 관능기를 갖는다. 기능성 물질이, 생체 직교성 관능기와 반응하기 쉬운 관능기를 갖는 경우, 기능성 물질의 당해 관능기와 생체 직교성 관능기를 적절하게 반응시킬 수 있다. 생체 직교성 관능기와 반응하기 쉬운 관능기는, 생체 직교성 관능기의 구체적인 종류에 따라서도 다를 수 있다. 당업자라면, 적절한 관능기를, 생체 직교성 관능기와 반응하기 쉬운 관능기로서 적절히 선택할 수 있다(예, Boutureira et al., Chem.Rev., 2015, 115, 2174-2195). 생체 직교성 관능기와 반응하기 쉬운 관능기로서는, 예를 들면, 생체 직교성 관능기가 알킨 잔기의 경우는 아지드 잔기를 들 수 있고, 생체 직교성 관능기가 알데하이드 잔기 또는 케톤 잔기의 경우는 히드라진 잔기를 들 수 있고, 생체 직교성 관능기가 티올 잔기의 경우는 말레이미드 잔기 및 디설파이드 잔기를 들 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 예를 들면, 생체 직교성 관능기가 알킨 잔기이고, 또한 생체 직교성 관능기와 반응하기 쉬운 관능기가 아지드 잔기인 경우(또는 그 반대인 경우), 기능성 물질과 생체 직교성 관능기 사이의 반응에 의해 생성하는 부분을 포함하는 2가의 기는, 트리아졸 잔기(다른 환과 축합하고 있어도 축합하고 있지 않아도 좋음)를 포함하는 2가의 기라도 좋다; 생체 직교성 관능기가 알데하이드 잔기 또는 케톤 잔기이며, 또한 생체 직교성 관능기와 반응하기 쉬운 관능기가 히드라진 잔기인 경우(또는 그 반대인 경우), 기능성 물질과 생체 직교성 관능기 사이의 반응에 의해 생성하는 부분을 포함하는 2가의 기는, 하이드라존 잔기를 포함하는 2가의 기라도 좋다; 생체 직교성 관능기가 티올 잔기이며, 또한 생체 직교성 관능기와 반응하기 쉬운 관능기가 말레이미드 잔기 또는 디설파이드 잔기인 경우(또는 그 반대인 경우), 기능성 물질과 생체 직교성 관능기 사이의 반응에 의해 생성하는 부분을 포함하는 2가의 기는, 티오숙신이미드 잔기를 포함하는 2가의 기, 또는 디설파이드 잔기를 포함하는 2가의 기라도 좋다(예, Boutureira et al., Chem. Rev., 2015, 115, 2174-2195). 트리아졸 잔기(다른 환과 축합하고 있어도 축합하고 있지 않아도 좋음)를 포함하는 2가의 기, 하이드라존 잔기를 포함하는 2가의 기, 티오숙신이미드 잔기를 포함하는 2가의 기, 또는 디설파이드 잔기를 포함하는 2가의 기는, 기능성 물질과 생체 직교성 관능기 사이의 반응에 의해 생성하는 부분을 포함하는 2가의 기의 바람직한 예이다.
한편, 기능성 물질이, 생체 직교성 관능기와 반응하기 쉬운 관능기를 갖지 않는 경우, 기능성 물질로서, 원하는 관능기를 갖도록 유도체화된 것을 사용할 수 있다. 예를 들면, 기능성 물질이 가용성 단백질인 경우, 가용성 단백질이 천연으로 갖지 않는 관능기를 갖도록 유도체화된 것을 사용할 수 있다.
유도체화는, 당해 분야에서의 기술 상식이다(예, 국제공개 제2004/010957호, 미국 특허 출원 공개 제2006/0074008호 명세서, 미국 특허 출원 공개 제2005/0238649호 명세서). 예를 들어, 유도체화는, 상술한 바와 같은 가교제를 사용하여 행해져도 좋다. 또는, 유도체화는, 원하는 관능기를 갖는 특정의 링커를 사용하여 행해져도 좋다. 예를 들어, 이러한 링커는, 적절한 환경(예, 세포 내 또는 세포 외)에서 기능성 물질과 항체를 링커의 절단에 의해 분리 가능한 것이라도 좋다. 이러한 링커로서는, 예를 들어, 특정의 프로테아제〔예, 세포 내 프로테아제(예, 리소좀, 또는 엔드솜 중에 존재하는 프로테아제), 세포 외 프로테아제(예, 분비성 프로테아제)〕로 분해되는 펩티딜 링커(즉, 미국 특허 제6,214,345호; Dubowchik et al., Pharm.Therapeutics 83:67-123(1999)), 생체 내에 존재하는 국소 산성 부위에서 절단될 수 있는 링커(예, 미국 특허 제5,622,929호, 동 제5,122,368호; 동 제5,824,805호)를 들 수 있다. 링커는, 자괴적(self-immolative)이라도 좋다(예, 국제공개 제02/083180호, 국제공개 제04/043493호, 국제공개 제05/112919호). 본 발명에서는, 유도체화된 기능성 물질도, 단순히 「기능성 물질」로 호칭할 수 있다.
화학식 III에서의 AB는 상술한 항체와 동일하고, E에서의 친전자기와 공유 결합하고 있다. E에서의 친전자기와의 공유 결합에 제공되는 항체 중의 친핵기로서는, 예를 들어, 라이신 잔기의 측쇄에서의 NH2, 타이로신 잔기의 측쇄에서의 OH, 세린 잔기의 측쇄에서의 OH, 트레오닌 잔기의 측쇄에서의 OH, 및 시스테인 잔기의 측쇄에서의 SH를 들 수 있다.
화학식 III에서의 E는 상기 화학식 I에서의 E와 동일하다. E는, E1-E2-E3로 표시될 수 있다. E1, E2, 및 E3는, 상술한 것과 동일하다. 상술한 바와 같이, E 및 E1-E2-E3는, 잠재적인 면역원성을 갖고, 또한 혈중에서 가수 분해되기 쉽다는 문제를 안고 있는 펩타이드 부분을 포함하지 않도록 설계할 수 있다. 이 경우, 화학식 III으로 표시되는 기능성 물질을 갖는 항체는, 의약으로서 적합하게 사용할 수 있다.
E에서의 친전자기 및 E1의 친전자기는, 항체 중의 친핵기와 공유 결합하고 있다. 항체 중의 친핵기와 공유 결합하고 있는 친전자기로서는, 예를 들어, NH-C(=O)-, NH-SO2-, 및 NH-CH2-(E와의 공유 결합에 제공되는 항체 중의 친핵기가 라이신 잔기의 측쇄에서의 NH2인 경우), O-C(=O)-, O-SO2-, 및 O-CH2-(E와의 공유 결합에 제공되는 항체 중의 친핵기가, 타이로신 잔기, 세린 잔기, 또는 트레오닌 잔기의 측쇄에서의 OH인 경우), S-C(=O)-, 및 S-CH2-(E와의 공유 결합에 제공되는 항체 중의 친핵기가, 시스테인 잔기의 측쇄에서의 SH인 경우)를 들 수 있다. 항체 중의 친핵기와 공유 결합하고 있는 친전자기로서는, NH-C(=O)- 및 NH-SO2-(E와의 공유 결합에 제공되는 항체 중의 친핵기가 라이신 잔기의 측쇄에서의 NH2인 경우), O-C(=O)- 및 O-SO2-(E와의 공유 결합에 제공되는 항체 중의 친핵기가, 타이로신 잔기의 측쇄에서의 OH인 경우)가 바람직하고, NH-C(=O)- 및 NH-SO2-(E와의 공유 결합에 제공되는 항체 중의 친핵기가 라이신 잔기의 측쇄에서의 NH2인 경우)가 보다 바람직하고, NH-C(=O)-(E와의 공유 결합에 제공되는 항체 중의 친핵기가 라이신 잔기의 측쇄에서의 NH2인 경우)가 보다 더욱 바람직하다.
특정의 실시형태에서는, 기능성 물질이, 생체 직교성 관능기와 반응하기 쉬운 관능기를 갖는 경우, 또는, 생체 직교성 관능기와 반응하기 쉬운 관능기를 갖도록 유도체화되어 있는 경우, 생체 직교성 관능기와 반응하기 쉬운 관능기는, 아지드 잔기, 알데하이드 잔기, 티올 잔기, 알킨 잔기, 알켄 잔기, 할로겐 잔기, 테트라진 잔기, 니트론 잔기, 하이드록실아민 잔기, 니트릴 잔기, 히드라진 잔기, 케톤 잔기, 보론산 잔기, 시아노벤조티아졸 잔기, 알릴 잔기, 포스핀 잔기, 말레이미드 잔기, 디설파이드 잔기, 티오에스테르 잔기, α-할로카보닐 잔기, 이소니트릴 잔기, 시드논 잔기, 셀렌 잔기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 기라도 좋다.
또한 특정의 실시형태에서는, 기능성 물질이, 생체 직교성 관능기와 반응하기 쉬운 관능기를 갖는 경우, 또는, 생체 직교성 관능기와 반응하기 쉬운 관능기를 갖도록 유도체화되어 있는 경우, 상기 생체 직교성 관능기와 반응하기 쉬운 관능기는, 하기에서 표시되는 기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 기라도 좋다.
Figure pct00020
식 중,
R1f, 단일 또는 복수의 R1g 및 단일 또는 복수의 R1h는, 동일 또는 상이하고, 상기 (i) 내지 (vii)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 원자 또는 기, 또는 전자 흡인기이고, ·는, 기능성 물질에 대한 결합손이다.
화학식 III에서의 B'로 표시되는, 기능성 물질과 생체 직교성 관능기 사이의 반응에 의해 생성하는 부분을 포함하는 2가의 기는, (1) 상술한 바람직한 예에서 언급한 잔기인, 트리아졸 잔기, 하이드라존 잔기, 또는 티오숙신이미드 잔기를 포함하는 2가의 기라도 좋고, 또는, (2) 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 디설파이드 잔기(이 잔기는, 상술한 바람직한 예에서 언급한 잔기이다), 아세탈 잔기, 케탈 잔기, 에스테르 잔기, 카르바모일 잔기, 알콕시알킬 잔기, 이민 잔기, 3급 알킬옥시카바메이트 잔기, 실란 잔기, 하이드라존 함유 잔기, 포스포르아미데이트 잔기, 아코니틸 잔기, 트리틸 잔기, 아조 잔기, 비시날 디올 잔기, 셀렌 잔기, 전자 흡인기를 갖는 방향족환 함유 잔기, 쿠마린 함유 잔기, 설폰 함유 잔기, 불포화 결합 함유쇄 잔기, 글리코실 잔기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 잔기를 포함하는 2가의 기라도 좋다.
기능성 물질과 생체 직교성 관능기 사이의 반응에 의해 생성하는 부분을 포함하는 2가의 기는 또한, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 어느 하나의 화학 구조에 대응하는 잔기를 포함하는 2가의 기라도 좋다:
Figure pct00021
여기서, 결합에 직교하는 파선은, 반응에 의해 생성하는 결합을 나타내고,
복수의 R2a, 복수의 R2b 및 복수의 R2c는 동일 또는 상이하고, 수소 원자 또는 상술한 치환기이고,
J는 -CH2- -O-, 또는 -S-이고,
R은 1 내지 4의 임의의 정수이며,
○ (백색 원)은 F측의 부분에 대한 결합을 나타내고, ● (흑색 원)은 B'측의 부분에 대한 결합을 나타낸다.
화학 구조가, 절단성 부분을 중심으로 하여 비대칭인 경우, ●이 B'측의 부분에 대한 결합을 나타내고, ○이 F측의 부분에 대한 결합을 나타내고 있어도 좋다.
바람직하게는, 본 발명의 제조 방법에서의 공정 (2)에서 제조되는 기능성 물질을 갖는 항체는, 기능성 물질을 위치 선택적으로 갖는 항체이다. 생체 직교성 관능기를 위치 선택적으로 갖는 항체가, 화학식 II로 표시되는 것인 경우, 화학식 III으로 표시되는, 기능성 물질을 위치 선택적으로 갖는 항체를 제조할 수 있다. 기능성 물질을 위치 선택적으로 갖는 항체는, 바람직하게는, 정상 영역에만 기능성 물질을 갖는 항체이며, 보다 바람직하게는, Fc 영역에만 기능성 물질을 갖는 항체이다.
항체 (Ab)가, 연속하는 1 내지 50개의 아미노산 잔기로 이루어진 표적 영역〔예, 인간 IgG Fc 영역에서의 246 내지 248 위치의 아미노산 잔기로 이루어진 영역, (b) 인간 IgG Fc 영역에서의 288 내지 290 위치의 아미노산 잔기로 이루어진 영역, 또는 (c) 인간 IgG Fc 영역에서의 317 위치의 아미노산 잔기로 이루어진 영역〕 중에서 특정의 아미노산 잔기(예, 라이신 잔기, 타이로신 잔기, 트레오닌 잔기, 세린 잔기, 시스테인 잔기)를 1개 이상 포함하고, 또한, 상기 표적 영역 이외의 비표적 영역 중에서 상기 특정의 아미노산 잔기를 5개 이상 포함하는 경우, 항체 이외의 부분 구조는, 당해 표적 영역 중에 포함되는 1개 이상의 특정의 아미노산 잔기에 대하여 30% 이상의 위치 선택성으로 결합시킬 수 있다. 위치 선택성은, 바람직하게는 40% 이상, 보다 바람직하게는 50% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 60% 이상, 특히 바람직하게는 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100%라도 좋다.
본 발명의 제조 방법으로 제조되는 기능성 물질을 갖는 항체는 또한, 중쇄의 수에 따라서, 기능성 물질(즉, E-B'-F로 나타나는 구조 단위)을 가질 수 있다. 이것은, 기능성 물질을 갖는 항체를, 중쇄의 수에 따라서 E-B로 나타나는 구조 단위를 가질 수 있는 생체 직교성 관능기를 갖는 항체로부터 제조할 수 있기 때문이다. 따라서, 항체 중쇄를 복수(예를 들면 1 내지 8개, 바람직하게는 1 내지 4개, 보다 바람직하게는 2개) 갖는 항체를 본 발명의 제조 방법에 있어서 사용함으로써, 복수의 항체 중쇄의 동일한 표적 영역에서 E-B'-F로 나타나는 복수의 구조 단위(또는 그 하위 개념의 복수의 구조 단위)를 위치 선택적으로 갖는 항체를 제조할 수 있다. 예를 들어, 항체 중쇄를 둘 갖는 항체(예, IgG, IgD, IgE, F(ab')2 항체, Fc 영역 단백질, Fc 융합 단백질)를 본 발명의 제조 방법에 있어서 사용함으로써, 두 항체 중쇄의 동일한 표적 영역에서 E-B'-F로 나타나는 두 구조 단위를 위치 선택적으로 갖는 항체를 제조할 수 있다. 즉, 기능성 물질을 갖는 항체에서, 기능성 물질에 의한 수식 양식을 복수(예, 둘)의 중쇄간에서 동일하게 할 수 있다.
기능성 물질을 갖는 항체는 또한, 하나의 항체 중쇄의 복수(예를 들면 2 내지 5개, 바람직하게는 2 내지 4개, 보다 바람직하게는 2 또는 3개)의 표적 영역에서, 동종 또는 이종의 기능성 물질(예를 들어, E-B'-F로 나타나는 구조 단위)을 가질 수 있다. 이 경우, 기능성 물질을 갖는 항체에서, 기능성 물질에 의한 수식 양식을 복수(예, 둘)의 중쇄간에서 동일하게 할 수 있다.
본 발명의 제조 방법은 또한, 생성한 항체를, 특정의 처리에 부침으로써, 기능성 물질을 갖고, 또한 추가로 수식된 항체를 생성하는 것을 포함하고 있어도 좋다. 이러한 특정의 처리로서는, 예를 들어, 항체의 단편화 처리(예, 파파인, 펩신 등의 특정의 프로테아제에 의한 처리)를 들 수 있다.
본 발명의 제조 방법에 있어서 화학식 I로 표시되는 화합물 또는 이의 염을 사용하는 경우, (1)의 공정에 있어서, 상기 화학식 II로 표시되는 생체 직교성 관능기를 갖는 항체를 제조할 수 있고, 이어서, (2)의 공정에 있어서, 상기 화학식 III으로 표시되는 기능성 물질기를 갖는 항체를 제조할 수 있다.
바람직한 실시형태에서는, 본 발명의 제조 방법에 있어서 화학식 I로 표시되는 화합물로서 화학식 I-1로 표시되는 것을 사용하는 경우, (1)의 공정에 있어서, 상기 화학식 II-1로 표시되는 생체 직교성 관능기를 갖는 항체를 제조할 수 있고, 이어서, (2)의 공정에서, 하기 화학식 III-1로 표시되는 기능성 물질기를 갖는 항체를 제조할 수 있다:
[화학식 III-1]
Ab-E1-E2-E3-B'-F (III-1)
식 중,
Ab는 항체이고,
E1은 항체 중의 친핵기와 연결되어 있는 친전자기이고,
E2는 (a) -X-Y-〔여기서, E1과 결합하는 X는 C(R1)(R2) (여기서, R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소 원자 또는 탄소 원자수 1 내지 6의 알킬이다.), N(R3) (여기서, R3는, 수소 원자 또는 탄소 원자수 1 내지 6의 알킬이다.), O, S 또는 Se이고, E3와 결합하는 Y는 C(R4)(R5) (여기서, R4 및 R5는 각각 독립적으로 수소 원자 또는 탄소 원자수 1 내지 6의 알킬이다.)이다.〕, 또는 (b) 하기 화학식 i:
[화학식 i]
Figure pct00022
(여기서, 환 Z는, E1과 결합하는 환 구성 원자 X' 및 이의 양 측면의 환 구성 원자 모두가 탄소 원자인 2가의 환기이거나, E1과 결합하는 환 구성 원자 X'가 질소 원자이며, 또한 질소 원자의 양 측면의 환 구성 원자가 탄소 원자인 2가의 복소환기이고, ·는 결합손이다.)로 표시되는 기이고,
E3는, E2가 -X-Y-인 경우에는 2가의 기이고, E2가 화학식 i로 표시되는 기인 경우에는 결합 또는 2가의 기이고,
B'는 기능성 물질과 생체 직교성 관능기 사이의 반응에 의해 생성하는 부분을 포함하는 2가의 기이고,
F는 기능성 물질이다.
바람직한 특정의 실시형태에서는, 본 발명의 제조 방법에 있어서 화학식 I-1로 표시되는 화합물로서 화학식 I-2로 표시되는 것을 사용하는 경우, (1)의 공정에 있어서, 상기 화학식 II-2로 표시되는 생체 직교성 관능기를 갖는 항체를 제조할 수 있으며, 이어서, (2)의 공정에서, 하기 화학식 III-2로 표시되는 기능성 물질기를 갖는 항체를 제조할 수 있다:
[화학식 III-2]
Ab-E1-X-Y-E3-B'-F (III-2)
식 중,
Ab X, Y, B' 및 F는 상기 화학식 III-1의 것과 동일하고,
E1은 -C(=O)-, -SO2- 및 -CH2-로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 기이고,
E3는 2가의 기이다.
바람직한 다른 특정의 실시형태에서는, 본 발명의 제조 방법에 있어서 화학식 I-1로 표시되는 화합물로서 화학식 I-3으로 표시되는 것을 사용하는 경우, (1)의 공정에 있어서, 상기 화학식 II-3으로 표시되는 생체 직교성 관능기를 갖는 항체를 제조할 수 있으며, 이어서, (2)의 공정에서, 하기 화학식 III-3으로 표시되는 기능성 물질기를 갖는 항체를 제조할 수 있다.
[화학식 III-3]
Figure pct00023
식 중,
Ab, 환 구성 원자 X', 환 Z, B' 및 F는 화학식 III-1의 것과 동일하고,
E1은 -C(=O)-, -SO2- 및 -CH2-로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 기이고,
E3는, 결합 또는 2가의 기이다.
바람직하게는, 본 발명의 제조 방법에 있어서 화학식 I-3으로 표시되는 화합물로서 화학식 I-4로 표시되는 것을 사용하는 경우, (1)의 공정에 있어서, 하기 화학식 II-4로 표시되는 생체 직교성 관능기를 갖는 항체를 제조할 수 있으며, 이어서, (2)의 공정에서, 하기 화학식 III-4로 표시되는 기능성 물질기를 갖는 항체를 제조할 수 있다.
[화학식 III-4]
Figure pct00024
식 중,
Ab, 환 Z, B' 및 F는 화학식 III-1의 것과 동일하고,
E1은 -C(=O)-, -SO2- 및 -CH2-로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 기이고,
E3는 결합 또는 2가의 기이다.
화학식 III, III-1, III-2, III-3 또는 III-4에서의 임의의 기호(예, E, E1, E2, E3, B), 및 당해 기호에 관련하여 표시되는 용어(예, 항체, 친전자기, 생체 직교성 관능기)의 상세(예를 들어, 정의, 예 및 바람직한 예)는, 상기 화학식 I 또는 그 하위 개념의 식의 것과 공통된다.
생체 직교성 관능기를 갖는 항체는, 생체 직행성 관능기를 통해서, 기능성 물질과 반응할 수 있다. 이러한 반응은, 상술한 바와 같은, 단백질의 변성·분해(예, 아미드 결합의 절단)를 일으키는 수 없는 조건(온화한 조건) 하에서 적절하게 행할 수 있다.
반응계에서, 생체 직행성 관능기를 갖는 항체 (Y)에 대한, 기능성 물질 (Z)의 몰 비율(Z/Y)은, 생체 직행성 관능기, 기능성 물질, 및 항체의 종류, 및 수식되어야 할 항체 중의 부위의 수(예, DAR) 등에 따라 변동하기 때문에 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 0.1 내지 100이며, 바람직하게는 0.5 내지 80이며, 보다 바람직하게는 1 내지 70이며, 보다 더욱 바람직하게는 2 내지 50이며, 특히 바람직하게는 3 내지 30이다.
기능성 물질을 갖는 항체의 생성의 확인은, 그 구체적인 원료 및 생성물의 분자량에도 따르지만, 예를 들어, 전기 영동법, 크로마토그래피(예, 겔 여과 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 역상 컬럼 크로마토그래피, HPLC), 또는 질량 분석에 의해, 바람직하게는, 질량 분석에 의해 행할 수 있다. 위치 선택성의 확인은, 예를 들어, 펩타이드 매핑에 의해 행할 수 있다. 펩타이드 맵핑은, 예를 들어, 프로테아제(예, 트립신, 키모트립신,) 처리 및 질량 분석에 의해 행할 수 있다. 프로테아제로서는, 엔드 프로테아제가 바람직하다. 이러한 엔드 프로테아제로서는, 예를 들면, 트립신, 키모트립신, Glu-C, Lys-N, Lys-C, Asp-N을 들 수 있다. 기능성 물질을 갖는 항체가 보유하는, 기능성 물질의 개수의 확인은, 예를 들면, 전기 영동법, 크로마토그래피, 또는 질량 분석에 의해, 바람직하게는, 질량 분석에 의해 행할 수 있다. 기능성 물질을 갖는 항체는, 크로마토그래피(예, 상술한 크로마토그래피, 및 어피니티 크로마토그래피) 등의 임의의 방법에 의해 적절히 정제할 수 있다.
4. 생체 직교성 관능기 또는 기능성 물질을 위치 선택적으로 갖는 항체 또는 이의 염
본 발명은, 생체 직교성 관능기 또는 기능성 물질을 위치 선택적으로 갖는 항체 또는 이의 염을 제공한다.
생체 직교성 관능기를 위치 선택적으로 갖는 항체 또는 이의 염은, 상기 화학식 II-1로 표시되는 생체 직교성 관능기를 위치 선택적으로 갖는 항체이다. 바람직하게는, 상기 화학식 II-1로 표시되는 생체 직교성 관능기를 위치 선택적으로 갖는 항체로서, 상기 화학식 II-2 또는 II-3으로 표시되는 생체 직교성 관능기를 위치 선택적으로 갖는 항체가 제공된다. 보다 바람직하게는, 상기 화학식 II-3으로 표시되는 생체 직교성 관능기를 위치 선택적으로 갖는 항체로서, 상기 화학식 II-4로 표시되는 생체 직교성 관능기를 위치 선택적으로 갖는 항체가 제공된다. 화학식 II, II-1, II-2, II-3 또는 II-4에서의 임의의 기호(예, E, E1, E2, E3, B), 및 당해 기호에 관련하여 표시되는 용어(예, 항체, 친전자기, 생체 직교성 관능기)의 상세(예를 들어, 정의, 예 및 바람직한 예)는, 상기 화학식 I 또는 그 하위 개념의 식의 것과 공통된다.
기능성 물질을 위치 선택적으로 갖는 항체 또는 이의 염은, 상기 화학식 III-1로 표시되는 기능성 물질을 위치 선택적으로 갖는 항체이다. 바람직하게는, 상기 화학식 III-1로 표시되는 기능성 물질을 위치 선택적으로 갖는 항체로서, 상기 화학식 III-2 또는 III-3으로 표시되는 기능성 물질을 위치 선택적으로 갖는 항체가 제공된다. 보다 바람직하게는, 상기 화학식 III-3으로 표시되는 기능성 물질을 위치 선택적으로 갖는 항체로서, 상기 화학식 III-4로 표시되는 기능성 물질을 위치 선택적으로 갖는 항체가 제공된다. 화학식 III, III-1, III-2, III-3 또는 III-4에서의 임의의 기호(예, E, E1, E2, E3, B), 및 당해 기호에 관련하여 표시되는 용어(예, 항체, 친전자기, 생체 직교성 관능기)의 상세(예를 들어, 정의, 예 및 바람직한 예)는, 상기 화학식 I 또는 그 하위 개념의 식의 것과 공통된다.
생체 직교성 관능기 또는 기능성 물질을 위치 선택적으로 갖는 항체는, 상술한 항체와 동일하다. 바람직하게는, 이러한 항체는, 모노클로날 항체이다. 모노클로날 항체의 아이소 타입으로서는, 예를 들어, IgG(예, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA, IgD, IgE, 및 IgY를 들 수 있다. 모노클로날 항체는, 전장 항체, 또는 항체 단편(예, F(ab')2, Fab', Fab, Fv, 단쇄 항체)이지만, 전장 항체가 바람직하다. 특히 바람직하게는, 이러한 항체는, 인간 IgG(예, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4)를 정상 영역에 갖는 인간 항체, 인간화 항체, 또는 키메라 항체이다.
생체 직교성 관능기 또는 기능성 물질을 위치 선택적으로 갖는 항체는, 바람직하게는, 항체의 정상 영역에만 생체 직교성 관능기 또는 기능성 물질을 갖는 항체이며, 보다 바람직하게는, 항체의 Fc 영역에만 생체 직교성 관능기 또는 기능성 물질을 갖는 항체이다.
생체 직교성 관능기 또는 기능성 물질을 위치 선택적으로 갖는 항체는, 연속하는 1 내지 50개의 아미노산 잔기로 이루어진 표적 영역〔예 (a) 인간 IgG Fc 영역에서의 246 내지 248 위치의 아미노산 잔기로 이루어진 영역, (b) 인간 IgG Fc 영역에서의 288 내지 290 위치의 아미노산 잔기로 이루어진 영역, 또는 (c) 인간 IgG Fc 영역에서의 317 위치의 아미노산 잔기로 이루어진 영역〕 중에서 특정의 아미노산 잔기(예, 라이신 잔기, 타이로신 잔기, 트레오닌 잔기, 세린 잔기, 시스테인 잔기)가 1개 이상 포함되어 있으며, 또한, 상기 표적 영역 이외의 비표적 영역 중에서 상기 특정의 아미노산 잔기가 5개 이상 포함되어 있는 경우, 생체 직교성 관능기 또는 기능성 물질을, 당해 표적 영역 중에 포함되는 1개 이상의 특정의 아미노산 잔기에서 30% 이상의 위치 선택성으로 가질 수 있다. 위치 선택성은, 바람직하게는 40% 이상, 보다 바람직하게는 50% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 60% 이상, 특히 바람직하게는 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100%라도 좋다.
생체 직교성 관능기 또는 기능성 물질을 위치 선택적으로 갖는 항체는 또한, 중쇄의 수에 따라, 생체 직교성 관능기(즉, E-B로 표시되는 구조 단위), 또는 기능성 물질(즉, E-B'-F로 표시되는 구조 단위)을 가질 수 있다. 생체 직교성 관능기 또는 기능성 물질을 위치 선택적으로 갖는 항체는, 항체 중쇄를 복수(예를 들면 1 내지 8개, 바람직하게는 1 내지 4개, 보다 바람직하게는 2개) 갖는 경우, 복수의 항체 중쇄의 동일한 표적 영역에서 생체 직교성 관능기 또는 기능성 물질을 위치 선택적으로 가질 수 있다. 즉, 생체 직교성 관능기 또는 기능성 물질을 위치 선택적으로 갖는 항체에서, 생체 직교성 관능기 또는 기능성 물질에 의한 수식 양식을 복수(예, 둘)의 중쇄간에서 동일하게 할 수 있다.
생체 직교성 관능기 또는 기능성 물질을 위치 선택적으로 갖는 항체는 또한, 하나의 항체 중쇄의 복수(예를 들면 2 내지 5개, 바람직하게는 2 내지 4개, 보다 바람직하게는 2 또는 3개)의 표적 영역에서, 동종 또는 이종의 생체 직교성 관능기(예를 들어, E-B로 표시되는 구조 단위), 또는 동종 또는 이종의 기능성 물질(예를 들어, E-B'-F로 나타나는 구조 단위)을 가질 수 있다. 이 경우, 생체 직교성 관능기 또는 기능성 물질을 위치 선택적으로 갖는 항체에서, 생체 직교성 관능기 또는 기능성 물질에 의한 수식 양식을 복수(예, 둘)의 중쇄간에서 동일하게 할 수 있다.
5. 항체에 대한 친화성 물질 및 기능성 물질을 갖는 화합물 또는 이의 염
본 발명은, 화학식 IV로 표시되는, 항체에 대한 친화성 물질 및 기능성 물질을 갖는 화합물 또는 이의 염을 제공한다:
[화학식 IV]
A-L-E-F (IV)
식 중,
A는 항체에 대한 친화성 물질이고,
L은 이탈기를 포함하는 2가의 기이고,
E는 (i) 상기 이탈기와 연결되어 있고, 또한 (ii) 상기 항체 중의 친핵기와 반응하는 능력을 갖는 친전자기를 포함하는 2가의 기이고,
F는 기능성 물질이고,
상기 이탈기는 상기 친핵기와 상기 친전자기 사이의 반응에 의해 E로부터 절단되어 이탈하는 능력을 갖는다.
항체에 대한 친화성 물질 및 기능성 물질을 갖는 화합물 또는 이의 염에서의, 항체에 대한 친화성 물질 (A), 이탈기를 포함하는 2가의 기 (L), 친전자기를 포함하는 2가의 기 (E), 및 기능성 물질 (F)의 정의, 예, 및 바람직한 예는, 상술한 것과 동일하다. 따라서, 항체에 대한 친화성 물질 및 기능성 물질을 갖는 화합물 또는 이의 염에서, A, L, 및 E는, 항체에 대한 친화성 물질 및 생체 직교성 관능기를 갖는 화합물 또는 이의 염(예를 들어, 화학식 I을 참조)에서의 A, L, 및 E와 마찬가지로 특정할 수 있다. 또한, 항체에 대한 친화성 물질 및 기능성 물질을 갖는 화합물 또는 이의 염에서, F는 기능성 물질을 갖는 항체 또는 이의 염(예를 들면, 화학식 III을 참조)에서의 F와 마찬가지로 특정할 수 있다.
바람직한 실시형태에서는, 화학식 IV로 표시되는 화합물은 하기 화학식 IV-1로 표시되는 화합물이라도 좋다:
[화학식 IV-1]
A-L1-L2-E1-E2-E3-F (IV-1)
식 중,
A 및 F는 화학식 IV의 것과 동일하고,
L1은 결합 또는 2가의 기이고,
L2는 이탈기이고,
E1은, (i) 이탈기와 연결되어 있고, 또한 (ii) 항체 중의 친핵기와 반응하는 능력을 갖는 친전자기이고,
E2는 (a) -X-Y-〔여기서, E1과 결합하는 X는 C(R1)(R2) (여기서, R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소 원자 또는 탄소 원자수 1 내지 6의 알킬이다.), N(R3) (여기서, R3는, 수소 원자 또는 탄소 원자수 1 내지 6의 알킬이다.), O, S 또는 Se이고, E3와 결합하는 Y는 C(R4)(R5) (여기서, R4 및 R5는 각각 독립적으로 수소 원자 또는 탄소 원자수 1 내지 6의 알킬이다.)이다.〕, 또는 (b) 하기 화학식 i:
[화학식 i]
Figure pct00025
(여기서, 환 Z는, E1과 결합하는 환 구성 원자 X' 및 이의 양 측면의 환 구성 원자 모두가 탄소 원자인 2가의 환기이거나, E1과 결합하는 환 구성 원자 X'가 질소 원자이며, 또한 질소 원자의 양 측면의 환 구성 원자가 탄소 원자인 2가의 복소환기이고, ·는 결합손이다.)로 표시되는 기이고,
E3는, E2가 -X-Y-인 경우에는 2가의 기이고, E2가 화학식 i로 표시되는 기인 경우에는 결합 또는 2가의 기이고,
이탈기는 상기 친핵기와 상기 친전자기 사이의 반응에 의해 E1에서부터 절단되어 이탈하는 능력을 갖는다.
화학식 IV-1에서, L2로 표시되는 이탈기의 정의, 예 및 바람직한 예는, 상기 「1-3. 이탈기를 포함하는 2가의 기 (L)」에서의 (a) 내지 (c)에 대하여 서술한 것과 동일하다.
바람직한 특정의 실시형태에서는, 화학식 IV-1로 표시되는 화합물은 하기 화학식 IV-2로 표시되는 화합물이라도 좋다:
[화학식 IV-2]
A-L1-L2-E1-X-Y-E3-F (IV-2)
식 중,
A, L1, X, Y 및 F는 화학식 IV-1의 것과 동일하고,
L2는,
(a) 환 P-Q-〔여기서, 환 P가, 전자 흡인성 기로 치환되어 있어도 좋은 아릴렌, 전자 흡인성 기로 치환되어 있어도 좋은 헤테로아릴렌, 축환하고 있어도 좋은 2,5-디케토피롤리딘, 축환하고 있어도 좋은 2,6-디케토피페리딘, 축환하고 있어도 좋은 2-케토피롤리딘, 축환하고 있어도 좋은 2-케토피페리딘, 2-피리돈으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 기이고, Q가 -O-, -S-, -Se-, -SO2-O-, -SO2-N(R)-, -SO2-, -C≡C-CH2-O-, -N(OR)-, -N(R)- 및 -O-N(R)-로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 기 (여기서, R은 수소 원자 또는 탄소 원자수 1 내지 6의 알킬이다.)이다.〕,
(b) 헤테로아릴렌, 또는
(c) -Q-〔여기서, Q가 -O-, -S-, -Se-, -SO2-O-, -SO2-N(R)-, -SO2-, -C≡C-CH2-O-, -N(OR)-, -N(R)- 및 -O-N(R)-로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 기 (여기서, R은 수소 원자 또는 탄소 원자수 1 내지 6의 알킬이다.)이다.〕이며,
E1은 -C(=O)-, -SO2- 및 -CH2-로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 기이고,
E3는 2가의 기이다.
바람직한 다른 특정의 실시형태에서는, 화학식 IV-1로 표시되는 화합물은, 하기 화학식 IV-3로 표시되는 화합물이라도 좋다:
[화학식 IV-3]
Figure pct00026
식 중,
A, L1, 환 Z, 환 구성 원자 X' 및 F는 상기 화학식 IV-1의 것과 동일하고,
L2는,
(a) 환 P-Q-〔여기서, 환 P가, 전자 흡인성 기로 치환되어 있어도 좋은 아릴렌, 전자 흡인성 기로 치환되어 있어도 좋은 헤테로아릴렌, 축환하고 있어도 좋은 2,5-디케토피롤리딘, 축환하고 있어도 좋은 2,6-디케토피페리딘, 축환하고 있어도 좋은 2-케토피롤리딘, 축환하고 있어도 좋은 2-케토피페리딘, 2-피리돈으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 기이고, Q가 -O-, -S-, -Se-, -SO2-O-, -SO2-N(R)-, -SO2-, -C≡C-CH2-O-, -N(OR)-, -N(R)- 및 -O-N(R)-로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 기 (여기서, R은 수소 원자 또는 탄소 원자수 1 내지 6의 알킬이다.)이다.〕,
(b) 헤테로아릴렌, 또는
(c) -Q-〔여기서, Q가 -O-, -S-, -Se-, -SO2-O-, -SO2-N(R)-, -SO2-, -C≡C-CH2-O-, -N(OR)-, -N(R)- 및 -O-N(R)-로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 기 (여기서, R은 수소 원자 또는 탄소 원자수 1 내지 6의 알킬이다.)이다.〕이며,
E1은 -C(=O)-, -SO2- 및 -CH2-로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 기이고,
E3는 결합 또는 2가의 기이다.
바람직하게는, 화학식 IV-3으로 표시되는 화합물은, 하기 화학식 IV-4로 표시되는 화합물이라도 좋다:
[화학식 IV-4]
Figure pct00027
식 중,
A, L1 및 F는 상기 화학식 IV-1의 것과 동일하고,
L2는 (a) 환 P-Q-〔여기서, 환 P가, 전자 흡인성 기로 치환되어 있어도 좋은 아릴렌, 전자 흡인성 기로 치환되어 있어도 좋은 헤테로아릴렌, 축환하고 있어도 좋은 2,5-디케토피롤리딘, 축환하고 있어도 좋은 2,6-디케토피페리딘, 축환하고 있어도 좋은 2-케토피롤리딘, 축환하고 있어도 좋은 2-케토피페리딘, 2-피리돈으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 기이고, Q가 -O-, -S-, -Se-, -SO2-O-, -SO2-N(R)-, -SO2-, -C≡C-CH2-O-, -N(OR)-, -N(R)- 및 -O-N(R)-로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 기 (여기서, R은 수소 원자 또는 탄소 원자수 1 내지 6의 알킬이다.)이다.〕,
(b) 헤테로아릴렌, 또는
(c) -Q-〔여기서, Q가 -O-, -S-, -Se-, -SO2-O-, -SO2-N(R)-, -SO2-, -C≡C-CH2-O-, -N(OR)-, -N(R)- 및 -O-N(R)-로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 기 (여기서, R은 수소 원자 또는 탄소 원자수 1 내지 6의 알킬이다.)이다.〕이며,
E1은, -C(=O)-, -SO2-, 및 -CH2-로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 기이고,
환 Z는, E1과 결합하는 환 구성 원자 및 이의 양 측면의 환 구성 원자 모두가 탄소 원자인 2가의 환기이다.)로 표시되는 기이며,
E3는 결합 또는 2가의 기이다.
상기 화학식 IV-1 내지 IV-4로 표시되는 화합물에서, A, L1, L2, E1, E2, E3 및 F, 및 -X-Y-, R1 내지 R5에서의 탄소 원자수 1 내지 6의 알킬, 화학식 i로 표시되는 기(예, 2가의 환기, 2가의 복소환기)의 정의, 예 및 바람직한 예는, 상술한 것과 동일하다. 또한, L2인 (a) 내지 (c), 및 환 Z(예, E1과 결합하는 환 구성 원자 X' 및 이의 양 측면의 환 구성 원자 모두가 탄소 원자인 2가의 환기, 또는 E1과 결합하는 환 구성 원자 X'가 질소 원자이며, 또한 질소 원자의 양 측면의 환 구성 원자가 탄소 원자인 2가의 복소환기), 환 P, 및 Q(예, R에서의 탄소 원자수 1 내지 6의 알킬) 등의 기의 정의, 예 및 바람직한 예도 또한, 상술한 것과 동일하다.
항체에 대한 친화성 물질 및 기능성 물질을 갖는 화합물 또는 이의 염은, 항체에 대한 친화성 물질 및 생체 직교성 관능기를 갖는 화합물 또는 이의 염을, 생체 직교성 관능기를 통해서, 상술한 바와 같은 기능성 물질과 반응시킴으로써, 적절하게 조제할 수 있다. 이러한 반응은, 적절한 반응계, 예를 들면 유기 용매계 또는 수용액계에서, 적온(예, 약 15 내지 200℃)에서 행할 수 있다. 반응계는, 적절한 촉매를 포함하고 있어도 좋다. 반응 시간은, 예를 들어 1분 내지 20시간, 바람직하게는 10분 내지 15시간, 보다 바람직하게는 20분 내지 10시간, 보다 더욱 바람직하게는 30분 내지 8시간이다.
반응계에서, 기능성 물질 (X)에 대한, 항체에 대한 친화성 물질 및 생체 직교성 관능기를 갖는 화합물 또는 이의 염의 몰 비율(Y/X)은, 당해 구조 단위 및 친화성 물질의 종류, 당해 구조 단위에 의해서 수식되어야 할 친화성 물질 중의 부위의 수 등에 따라 변동하기 때문에 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 0.01 내지 100이며, 바람직하게는 0.05 내지 20이며, 보다 바람직하게는 0.1 내지 10이다.
항체에 대한 친화성 물질 및 기능성 물질을 갖는 화합물 또는 이의 염의 생성의 확인은, 그 구체적인 원료 및 생성물의 분자량에도 따르지만, 예를 들어, 전기 영동법, 크로마토그래피(예, 겔 여과 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 역상 컬럼 크로마토그래피, HPLC), 또는 질량 분석에 의해, 바람직하게는, 질량 분석에 의해 행할 수 있다. 항체에 대한 친화성 물질 및 기능성 물질을 갖는 화합물 또는 이의 염은, 크로마토그래피(예, 상술한 크로마토그래피, 및 어피니티 크로마토그래피) 등의 임의의 방법에 의해 적절히 정제할 수 있다.
6. 항체에 대한 친화성 물질 및 기능성 물질을 갖는 화합물 또는 이의 염을 사용하는, 기능성 물질을 갖는 항체의 제조 방법
본 발명은, 이하를 포함하는, 기능성 물질을 갖는 항체 또는 이의 염의 제조 방법을 제공한다.
하기 화학식 IV로 표시되는, 항체에 대한 친화성 물질 및 기능성 물질을 갖는 화합물 또는 이의 염을, 항체와 반응시켜,
하기 화학식 V로 표시되는, 기능성 물질을 갖는 항체 또는 이의 염을 생성하는 것:
[화학식 IV]
A-L-E-F (IV)
식 중,
A는 항체에 대한 친화성 물질이고,
L은 이탈기를 포함하는 2가의 기이고,
E는 (i) 상기 이탈기와 연결되어 있고, 또한 (ii) 상기 항체 중의 친핵기와 반응하는 능력을 갖는 친전자기를 포함하는 2가의 기이고,
F는 기능성 물질이고,
상기 이탈기는 상기 친핵기와 상기 친전자기 사이의 반응에 의해 E로부터 절단되어 이탈하는 능력을 갖는다.
[화학식 V]
Ab-E-F (V)
식 중,
Ab는 항체이고,
E 및 F는 상기 화학식 IV의 것과 동일하다.
바람직하게는, 본 발명의 제조 방법으로 제조되는 기능성 물질을 갖는 항체는, 기능성 물질을 위치 선택적으로 갖는 항체이다. 이 경우, 화학식 V로 표시되는, 기능성 물질을 위치 선택적으로 갖는 항체를 제조할 수 있다. 기능성 물질을 위치 선택적으로 갖는 항체는, 바람직하게는, 정상 영역에만 기능성 물질을 갖는 항체이며, 보다 바람직하게는, Fc 영역에만 기능성 물질을 갖는 항체이다.
항체 (Ab)가, 연속하는 1 내지 50개의 아미노산 잔기로 이루어진 표적 영역〔예, 인간 IgG Fc 영역에서의 246 내지 248 위치의 아미노산 잔기로 이루어진 영역, (b) 인간 IgG Fc 영역에서의 288 내지 290 위치의 아미노산 잔기로 이루어진 영역, 또는 (c) 인간 IgG Fc 영역에서의 317 위치의 아미노산 잔기로 이루어진 영역〕 중에서 특정의 아미노산 잔기(예, 라이신 잔기, 타이로신 잔기, 트레오닌 잔기, 세린 잔기, 시스테인 잔기)를 1개 이상 포함하고, 또한, 상기 표적 영역 이외의 비표적 영역 중에서 상기 특정의 아미노산 잔기를 5개 이상 포함하는 경우, 항체 이외의 부분 구조는, 당해 표적 영역 중에 포함되는 1개 이상의 특정의 아미노산 잔기에 대하여 30% 이상의 위치 선택성으로 결합시킬 수 있다. 위치 선택성은, 바람직하게는 40% 이상, 보다 바람직하게는 50% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 60% 이상, 특히 바람직하게는 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100%라도 좋다.
본 발명의 제조 방법으로 제조되는 기능성 물질을 갖는 항체는 또한, 중쇄의 수에 따라, 기능성 물질(즉, E-F로 나타나는 구조 단위)을 가질 수 있다. 따라서, 항체 중쇄를 복수(예를 들면 1 내지 8개, 바람직하게는 1 내지 4개, 보다 바람직하게는 2개) 갖는 항체를 본 발명의 제조 방법에 있어서 사용함으로써, 복수의 항체 중쇄의 동일한 표적 영역에서 E-F로 나타나는 복수의 구조 단위(또는 그 하위 개념의 복수의 구조 단위)를 위치 선택적으로 갖는 항체를 제조할 수 있다. 예를 들어, 항체 중쇄를 둘 갖는 항체(예, IgG, IgD, IgE, F(ab')2 항체, Fc 영역 단백질, Fc 융합 단백질)를 본 발명의 제조 방법에 있어서 사용함으로써, 두 항체 중쇄의 동일한 표적 영역에서 E-F로 나타나는 두 구조 단위를 위치 선택적으로 갖는 항체를 제조할 수 있다. 즉, 기능성 물질을 갖는 항체에서, 기능성 물질에 의한 수식 양식을 복수(예, 둘)의 중쇄간에서 동일하게 할 수 있다.
기능성 물질을 갖는 항체는 또한, 하나의 항체 중쇄의 복수(예를 들면 2 내지 5개, 바람직하게는 2 내지 4개, 보다 바람직하게는 2 또는 3개)의 표적 영역에서, 동종 또는 이종의 기능성 물질(예를 들어, E-F로 나타나는 구조 단위)을 가질 수 있다. 이 경우, 기능성 물질을 갖는 항체는, 복수(예, 둘)의 중쇄간에서, 기능성 물질에 의한 수식 양식을 동일하게 할 수 있다.
본 발명의 제조 방법은 또한, 생성한 항체를, 특정의 처리에 부침으로써, 기능성 물질을 갖고, 또한 추가로 수식된 항체를 생성하는 것을 포함하고 있어도 좋다. 이러한 특정의 처리로서는, 예를 들어, 항체의 단편화 처리(예, 파파인, 펩신 등의 특정의 프로테아제에 의한 처리)를 들 수 있다.
본 발명의 제조 방법에 있어서 화학식 IV로 표시되는 화합물 또는 이의 염을 사용하는 경우, 상기 화학식 V로 표시되는 기능성 물질을 갖는 항체를 제조할 수 있다.
바람직한 실시형태에서는, 본 발명의 제조 방법에 있어서 화학식 IV로 표시되는 화합물로서 화학식 IV-1로 표시되는 것을 사용하는 경우, 하기 화학식 V-1로 표시되는 기능성 물질을 갖는 항체를 제조할 수 있다:
[화학식 V-1]
Ab-E1-E2-E3-F (V-1)
식 중,
Ab는 항체이고,
E1, E2, E3 및 F는 상기 화학식 IV-1의 것과 동일하다.
바람직한 특정의 실시형태에서는, 본 발명의 제조 방법에 있어서 화학식 IV-1로 표시되는 화합물로서 화학식 IV-2로 표시되는 것을 사용하는 경우, 하기 화학식 V-2로 표시되는 기능성 물질을 갖는 항체를 제조할 수 있다:
[화학식 V-2]
Ab-E1-X-Y-E3-F (V-2)
식 중,
Ab는 항체이고,
E1, X, Y, E3 및 F는 상기 화학식 IV-2의 것과 동일하다.
바람직한 다른 특정의 실시형태에서는, 본 발명의 제조 방법에 있어서 화학식 IV-1로 표시되는 화합물로서 화학식 IV-3으로 표시되는 것을 사용하는 경우, 하기 화학식 V-3으로 표시되는 기능성 물질을 갖는 항체를 제조할 수 있다:
[화학식 V-3]
Figure pct00028
식 중,
Ab는 항체이고,
E1, 환 Z, 환 구성 원자 X', E3 및 F는 상기 화학식 IV-3의 것과 동일하다.
바람직하게는, 본 발명의 제조 방법에 있어서 화학식 IV-3으로 표시되는 화합물로서 화학식 IV-4로 표시되는 것을 사용하는 경우, 하기 화학식 V-4로 표시되는 기능성 물질을 갖는 항체를 제조할 수 있다:
[화학식 V-4]
Figure pct00029
식 중,
Ab는 항체이고,
E1, 환 Z, E3 및 F는 상기 화학식 IV-4의 것과 동일하다.
항체에 대한 친화성 물질 및 기능성 물질을 갖는 화합물 또는 이의 염은, E에서의 친전자기 또는 E1의 친전자기를 갖기 때문에, 항체와 반응할 수 있다. 이러한 반응은, 단백질의 변성·분해(예, 아미드 결합의 절단)를 일으킬 수 없는 조건(온화한 조건) 하에서 적절하게 행할 수 있다. 예를 들어, 이러한 반응은, 적절한 반응계, 예를 들어 완충액 중에서, 실온(예, 약 15 내지 30℃)에서 행할 수 있다. 완충액의 pH는, 예를 들어 5 내지 9이며, 바람직하게는 5.5 내지 8.5이며, 보다 바람직하게는 6.0 내지 8.0이다. 완충액은, 적절한 촉매를 포함하고 있어도 좋다. 반응 시간은, 예를 들어 1분 내지 20시간, 바람직하게는 10분 내지 15시간, 보다 바람직하게는 20분 내지 10시간, 보다 더욱 바람직하게는 30분 내지 8시간이다. 이러한 반응의 상세에 대해서는, 예를 들어, G.J.L.Bernardes et al., Chem.Rev., 115, 2174(2015); G.J.L.Bernardes et al., Chem.Asian.J., 4, 630(2009); B.G.Davies et al., Nat.Commun., 5, 4740(2014); A.Wagner et al., Bioconjugate. Chem., 25, 825(2014)를 참조할 것.
반응계에서, 항체 (X)에 대한, 항체에 대한 친화성 물질 및 기능성 물질을 갖는 화합물 또는 이의 염 (Y)의 몰 비율(Y/X)은, 항체에 대한 친화성 물질, 및 기능성물기(機能性物基)를 갖는 화합물 또는 이의 염 및 항체의 종류, 항체에 대한 친화성 물질 및 생체 직교성 관능기를 갖는 화합물 또는 이의 염에 의해서 수식되어야 할 항체 중의 부위의 수(예, DAR) 등에 따라 변동하기 때문에 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 0.1 내지 100이며, 바람직하게는 0.5 내지 80이며, 보다 바람직하게는 1 내지 70이며, 보다 더욱 바람직하게는 2 내지 50이며, 특히 바람직하게는 3 내지 30이다.
기능성 물질을 갖는 항체의 생성의 확인은, 그 구체적인 원료 및 생성물의 분자량에도 따르지만, 예를 들어, 전기 영동법, 크로마토그래피(예, 겔 여과 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 역상 컬럼 크로마토그래피, HPLC), 또는 질량 분석에 의해, 바람직하게는, 질량 분석에 의해 행할 수 있다. 위치 선택성의 확인은, 예를 들어, 펩타이드 매핑에 의해 행할 수 있다. 펩타이드 맵핑은, 예를 들어, 프로테아제(예, 트립신, 키모트립신,) 처리 및 질량 분석에 의해 행할 수 있다. 프로테아제로서는, 엔드 프로테아제가 바람직하다. 이러한 엔드 프로테아제로서는, 예를 들면, 트립신, 키모트립신, Glu-C, Lys-N, Lys-C, Asp-N을 들 수 있다. 기능성물기를 갖는 항체가 보유하는, 기능성물기의 개수의 확인은, 예를 들면, 전기 영동법, 크로마토그래피, 또는 질량 분석에 의해, 바람직하게는, 질량 분석에 의해 행할 수 있다. 기능성물기를 갖는 항체는, 크로마토그래피(예, 상술한 크로마토그래피, 및 어피니티 크로마토그래피) 등의 임의의 방법에 의해 적절히 정제할 수 있다.
7. 염
본 발명에서, 염으로서는, 예를 들어, 무기산과의 염, 유기산과의 염, 무기 염기와의 염, 유기 염기와의 염, 및 아미노산과의 염을 들 수 있다. 무기산과의 염으로서는, 예를 들어, 염화수소, 브롬화수소, 인산, 황산, 질산과의 염을 들 수 있다. 유기산과의 염으로서는, 예를 들면, 포름산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 젖산, 주석산, 푸마르산, 옥살산, 말레산, 구연산, 호박산, 사과산, 벤젠설폰산, p-톨루엔설폰산과의 염을 들 수 있다. 무기 염기와의 염으로서는, 예를 들면, 알칼리 금속(예, 나트륨, 칼륨), 알칼리 토류 금속(예, 칼슘, 마그네슘), 및 아연, 알루미늄 등의 다른 금속, 및 암모늄과의 염을 들 수 있다. 유기 염기와의 염으로서는, 예를 들어, 트리메틸아민, 트리에틸아민, 프로필렌디아민, 에틸렌디아민, 피리딘, 에탄올아민, 모노알킬에탄올아민, 디알킬에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민과의 염을 들 수 있다. 아미노산과의 염으로서는, 예를 들어, 염기성 아미노산(예, 아르기닌, 히스티딘, 라이신, 오르니틴), 및 산성 아미노산(예, 아스파라긴산, 글루타민산)과의 염을 들 수 있다. 염은, 바람직하게는, 무기산(예, 염화수소)과의 염, 또는 유기산(예, 트리플루오로아세트산)과의 염이다.
8. 용도
항체에 대한 친화성 물질 및 생체 직교성 관능기를 갖는 본 발명의 화합물 또는 이의 염은, 예를 들면, 생체 직교성 관능기에 의한 항체의 위치 선택적인 수식에 유용하다. 따라서, 본 발명은, 항체에 대한 친화성 물질 및 생체 직교성 관능기를 갖는 화합물 또는 이의 염을 포함하는, 생체 직교성 관능기에 의한 항체의 위치 선택적 수식 시약을 제공한다. 생체 직교성 관능기에 의한 항체의 위치 선택적 수식 시약에 있어서, 항체에 대한 친화성 물질 및 생체 직교성 관능기를 갖는 화합물 또는 이의 염의 상세(예를 들어, 정의, 예 및 바람직한 예)는, 상술한 것과 동일하다.
항체에 대한 친화성 물질 및 기능성 물질을 갖는 본 발명의 화합물 또는 이의 염은, 예를 들면, 기능성 물질에 의한 항체의 위치 선택적인 수식에 유용하다. 따라서, 본 발명은, 항체에 대한 친화성 물질 및 기능성 물질을 갖는 화합물 또는 이의 염을 포함하는, 기능성 물질에 의한 항체의 위치 선택적 수식 시약을 제공한다. 기능성 물질에 의한 항체의 위치 선택적 수식 시약에 있어서, 항체에 대한 친화성 물질 및 기능성 물질을 갖는 화합물 또는 이의 염의 상세(예를 들어, 정의, 예 및 바람직한 예)는, 상술한 것과 동일하다.
본 발명의 위치 선택적 수식 시약에 있어서 수식되는 항체의 위치 선택적 수식의 상세(예를 들어, 정의, 예 및 바람직한 예)는, 상술한 것과 동일하다.
본 발명의 위치 선택적 수식 시약은, 다른 성분을 추가로 포함하는 조성물의 형태로 제공되어도 좋다. 이러한 다른 성분으로서는, 예를 들면, 용액, 안정화제(예, 산화 방지제, 보존제)를 들 수 있다. 용액으로서는, 수용액이 바람직하다. 수용액으로서는, 예를 들면, 물(예, 증류수, 멸균 증류수, 정제수, 생리식염수), 완충액(예, 인산 수용액, Tris-염산 완충액, 탄산-중탄산 완충액, 붕산 수용액, 글리신-수산화나트륨 완충액, 구연산 완충액)을 들 수 있지만, 완충액이 바람직하다. 용액의 pH는, 예를 들면 5.0 내지 9.0, 바람직하게는 5.5 내지 8.5이다. 본 발명의 위치 선택적 수식 시약은, 액상 또는 분말상(예, 동결 건조 분말)에서 제공할 수 있다.
생체 직교성 관능기를 위치 선택적으로 갖는 항체 또는 이의 염은, 예를 들면, 기능성 물질을 위치 선택적으로 갖는 항체 또는 이의 염의 조제에서의 중간체로서 유용하다.
기능성 물질을 위치 선택적으로 갖는 항체 또는 이의 염은, 예를 들어, 의약, 또는 시약(예, 진단약, 연구용 시약)으로서, 특히 의약으로서 유용하다. 항체 약물 복합체(ADC)의 약물의 결합수 및 결합 위치를 변화시키면, 체내 동태나 약물의 방출 속도, 효과가 변화하는 것이 보고되어 있다. 이러한 점에서 차세대형 ADC에서는 콘쥬게이션하는 약물의 개수와 위치를 제어하는 것이 요구되고 있다. 개수 및 위치가 일정하면, 기대와 같은 efficacy, 콘쥬게이션 약제의 베리에이션, 로트 차 이른바 레귤레이션의 문제가 해결될 것으로 생각되고 있다. 기능성 물질을 위치 선택적으로 갖는 본 발명의 항체 또는 이의 염은, 이러한 레귤레이션의 문제를 해결할 수 있다. 따라서, 기능성 물질을 위치 선택적으로 갖는 본 발명의 항체 또는 이의 염은, 의약 조성물의 형태에서 제공되어도 좋다. 이러한 의약 조성물은, 기능성 물질을 위치 선택적으로 갖는 항체 또는 이의 염에 더하여, 의약상 허용될 수 있는 담체를 포함하고 있어도 좋다. 의약상 허용될 수 있는 담체로서는, 예를 들어, 수크로오스, 전분, 만니트, 소르비트, 유당, 글루코오스, 셀룰로오스, 탤크, 인산칼슘, 탄산칼슘 등의 부형제, 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 하이드록시프로필셀룰로오스, 폴리프로필피롤리돈, 젤라틴, 아라비아 고무, 폴리에틸렌글리콜, 수크로오스, 전분 등의 결합제, 전분, 카복시메틸셀룰로오스, 하이드록시프로필스타치, 탄산수소나트륨, 인산칼슘, 구연산칼슘 등의 붕괴제, 스테아르산마그네슘, 에어로질, 탤크, 라 우릴황산나트륨 등의 활제, 구연산, 멘톨, 글리실리신·암모늄염, 글리신, 오렌지 분(粉) 등의 방향제, 벤조산나트륨, 아황산수소나트륨, 메틸파라벤, 프로필파라벤 등의 보존제, 구연산, 구연산나트륨, 아세트산 등의 안정제, 메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 스테아르산알루미늄 등의 현탁제, 계면 활성제 등의 분산제, 물, 생리식염수, 오렌지 주스 등의 희석제, 카카오 버터(脂), 폴리에틸렌글리콜, 백등유 등의 베이스 왁스 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 기능성 물질을 위치 선택적으로 갖는 본 발명의 항체 또는 이의 염은 또한, 안정성을 실현하는 임의의 수식(예, PEG화)을 갖고 있어도 좋다.
경구 투여에 적합한 제제는, 물, 생리식염수, 오렌지 주스와 같은 희석액에 유효량의 리간드를 용해시킨 액제, 유효량의 리간드를 고체나 과립으로서 포함하고 있는 캡슐제, 샤쉐(sachet)제 또는 정제(錠劑), 적당한 분산매 중에 유효량의 유효 성분을 현탁시킨 현탁액제, 유효량의 유효 성분을 용해시킨 용액을 적당한 분산매 중에 분산시켜 유화시킨 유제 등이다.
의학 조성물은, 비경구적인 투여(예, 정맥내 주사, 피하 주사, 근육 주사, 국소 주입, 복강 내 투여)에 적합하다. 이와 같은 비경구적인 투여에 적합한 의약 조성물로서는, 수성 및 비수성의 등장(等張)인 무균의 주사액제가 있으며, 이것에는 항산화제, 완충액, 제균제, 등장화제 등이 포함되어 있어도 좋다. 또한, 수성 및 비수성의 무균의 현탁액제를 들 수 있으며, 이것에는 현탁제, 가용화제, 증점제, 안정화제, 방부제 등이 포함되어 있어도 좋다.
의약 조성물의 투여량은, 유효 성분의 종류·활성, 병의 위중도, 투여 대상이 되는 동물종, 투여 대상의 약물 수용성, 체중, 연령 등에 따라 다르지만, 적절히 설정할 수 있다.
실시예
다음에 실시예를 나타내어 본 발명을 더욱 상세히 설명하지만, 본 발명은 이하의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1: IgG1 Fc 친화성 물질의 합성]
(1-1) 항체에 대한 친화성 펩타이드의 합성
항체에 대한 친화성 물질인 하기에 나타낸 펩타이드는, 모두 동일한 방법으로 조제했다. Fmoc법에 의한 Rink amide 수지를 사용한 펩타이드 고상 합성에 의해, N 말단을 아세틸기로 캐핑(capping)한 것(화합물 1, 2, 32 내지 53), N 말단을 3-(트리페닐메틸티오)프로피온산으로 캐핑한 것(화합물 3, 31, 54)을 조제하고, 트리플루오로아세트산:물:트리이소프로필실란:에탄디티올=94:2.5:1.0:2.5의 용액으로 3시간 교반함으로써 수지로부터의 잘라냄과 탈보호를 행했다. 수지를 필터레이션에 의해 제거하고, 디에틸에테르를 첨가하여 침전을 행하고, 디에틸에테르를 데칸테이션함으로써 제거하고, 펩타이드를 조결정(粗結晶)으로 해서 얻었다. 이를 분취 HPLC로 정제하여, 생성물인 친화성 펩타이드를 얻었다.
분자 내에 S-S 결합을 갖는 펩타이드(메티오닌을 함유하는 것을 제외함)인 화합물 35 내지 53에 대해서는, 전구체가 되는 직쇄의 펩타이드를 상기에 나타내는 방법으로 취득한 후, 다음에 나타내는 방법으로 합성했다. 얻어진 전구체 수십 mg을 DMSO 1mL에 용해하고, NH3/MeOH 100μL, H2O2 10μL를 첨가하고, 밤새 교반을 행했다. LCMS에 의해 반응이 종료되어 있는 것을 확인한 후, 분취 HPLC로 정제하여, 목적물인 친화성 펩타이드를 얻었다.
분자 내에 S-S 결합을 갖는 펩타이드(메티오닌을 함유하는 것)인 화합물 33, 34에 대해서는, 전구체가 되는 직쇄의 펩타이드를 상기에 나타내는 방법으로 취득한 후, 다음에 나타내는 방법으로 합성했다. 얻어진 전구체 수십 mg을 0.1M Tris-HCl Buffer(pH8.00) 20mL에 용해하고, 글루타티온 산화형 5.0eq를 첨가하고, 밤새 교반을 행했다. LCMS에 의해 반응이 종료되어 있는 것을 확인한 후, 분취 HPLC로 정제하여, 목적물인 친화성 펩타이드를 얻었다.
Figure pct00030
화합물 1
(펩타이드 부분의 아미노산 서열: 서열 번호 5)
MS (ESI)m/z:z=3 1392[M+3H]3+, z=4 1044[M+4H]4+
Figure pct00031
화합물 2
(펩타이드 부분의 아미노산 서열: 서열 번호 6)
MS (ESI)m/z:z=3 1392[M+3H]3+, z=4 1044[M+4H]4+
Figure pct00032
화합물 3
(펩타이드 부분의 아미노산 서열: 서열 번호 7)
MS (ESI)m/z:z=3 1478[M+3H]3+, z=4 1108[M+4H]4+
Figure pct00033
화합물 31
(펩타이드 부분의 아미노산 서열: 서열 번호 97)
MS (ESI)m/z:z=2 1892 [M+2H]2+, Z=3 1262 [M+3H]3+, Z=4 946 [M+4H]4+, z=5 757 [M+5H]5+
Figure pct00034
화합물 32
(펩타이드 부분의 아미노산 서열: 서열 번호 98)
MS (ESI)m/z:z=3 1401 [M+3H]3+, Z=4 1051 [M+4H]4+, z=5 841 [M+5H]5+
Figure pct00035
화합물 33
(펩타이드 부분의 아미노산 서열: 서열 번호 41)
MS (ESI)m/z:z=3 1426 [M+3H]3+, Z=4 1070 [M+4H]4+, z=5 859 [M+5H]5+
Figure pct00036
화합물 34
(펩타이드 부분의 아미노산 서열: 서열 번호 42)
MS (ESI)m/z:z=3 1417 [M+3H]3+, Z=4 1063 [M+4H]4+, z=5 851 [M+5H]5+
Figure pct00037
화합물 35
(펩타이드 부분의 아미노산 서열: 서열 번호 43)
MS (ESI)m/z:z=3 1425 [M+3H]3+, Z=4 1069 [M+4H]4+, z=5 855 [M+5H]5+
Figure pct00038
화합물 36
(펩타이드 부분의 아미노산 서열: 서열 번호 46)
MS (ESI)m/z:z=1 2090 [M+1H]+, Z=2 1045 [M+2H]2+, Z=3 697 [M+3H]3+
Figure pct00039
화합물 37
(펩타이드 부분의 아미노산 서열: 서열 번호 47)
MS (ESI)m/z:z=1 2074 [M+1H]+, Z=2 1037 [M+2H]2+, Z=3 692 [M+3H]3+
Figure pct00040
화합물 38
(펩타이드 부분의 아미노산 서열: 서열 번호 48)
MS (ESI)m/z:z=1 2061 [M+1H]+, Z=2 1031 [M+2H]2+, Z=3 687 [M+3H]3+
Figure pct00041
화합물 39
(펩타이드 부분의 아미노산 서열: 서열 번호 49)
MS (ESI)m/z:z=1 2032 [M+1H]+, Z=2 1016 [M+2H]2+, Z=3 678 [M+3H]3+
Figure pct00042
화합물 40
(펩타이드 부분의 아미노산 서열: 서열 번호 50)
MS (ESI)m/z:z=1 2089 [M+1H]+, Z=2 1044 [M+2H]2+, Z=3 696 [M+3H]3+
Figure pct00043
화합물 41
(펩타이드 부분의 아미노산 서열: 서열 번호 51)
MS (ESI)m/z:z=1 2088 [M+1H]+, Z=2 1044 [M+2H]2+, Z=3 696 [M+3H]3+
Figure pct00044
화합물 42
(펩타이드 부분의 아미노산 서열: 서열 번호 52)
MS (ESI)m/z:z=1 1561 [M+H]+, Z=2 781 [M+2H]2+
Figure pct00045
화합물 43
(펩타이드 부분의 아미노산 서열: 서열 번호 53)
MS (ESI)m/z:z=1 1548 [M+1H]+, Z=2 774 [M+2H]2+
Figure pct00046
화합물 44
(펩타이드 부분의 아미노산 서열: 서열 번호 55)
MS (ESI)m/z:z=2 1059 [M+2H]2+, Z=3 706 [M+3H]3+
Figure pct00047
화합물 45
(펩타이드 부분의 아미노산 서열: 서열 번호 57)
MS (ESI)m/z:z=2 1074 [M+2H]2+, Z=3 716 [M+3H]3+
Figure pct00048
화합물 46
(펩타이드 부분의 아미노산 서열: 서열 번호 59)
MS (ESI)m/z:z=2 1081 [M+2H]2+, Z=3 721 [M+3H]3+, Z=4 541 [M+4H]4+
Figure pct00049
화합물 47
(펩타이드 부분의 아미노산 서열: 서열 번호 63)
MS (ESI)m/z:z=2 1085 [M+2H]2+, Z=3 723 [M+3H]3+, Z=4 543 [M+4H]4+
Figure pct00050
화합물 48
(펩타이드 부분의 아미노산 서열: 서열 번호: 71)
MS (ESI)m/z:z=2 1045 [M+2H]2+, Z=3 697 [M+3H]3+
Figure pct00051
화합물 49
(펩타이드 부분의 아미노산 서열: 서열 번호 72)
MS (ESI)m/z:z=1 1345 [M+1H]+, Z=2 673 [M+2H]2+
Figure pct00052
화합물 50
(펩타이드 부분의 아미노산 서열: 서열 번호 77)
MS (ESI)m/z:z=2 1052 [M+2H]2+, Z=3 702 [M+3H]3+
Figure pct00053
화합물 51
(펩타이드 부분의 아미노산 서열: 서열 번호 81)
MS (ESI)m/z:z=2 1073 [M+2H]2+, Z=3 715 [M+3H]3+
Figure pct00054
화합물 52
(펩타이드 부분의 아미노산 서열: 서열 번호 82)
MS (ESI)m/z:z=2 1073 [M+2H]2+, Z=3 716 [M+3H]3+
Figure pct00055
화합물 53
(펩타이드 부분의 아미노산 서열: 서열 번호 99)
MS (ESI)m/z:z=2 966 [M+2H]2+, Z=3 644 [M+3H]3+
Figure pct00056
화합물 54
(펩타이드 부분의 아미노산 서열: 서열 번호 100)
MS (ESI)m/z:z=3 1381 [M+3H]3+, Z=4 1036 [M+4H]4+, z=5 829 [M+5H]5+
(1-2) 항체에 대한 친화성 펩타이드 아지드 부가체의 합성
하기에 나타낸 펩타이드-아지드 부가체(화합물 4, 5)는 이하와 같이 합성했다. 후에 관능기화하는 잔기의 Lys만 mtt기로 보호된 아미노산을 사용하여, Fmoc법에 의한 Rink amide 수지를 사용한 펩타이드 고상 합성에 의해, N 말단을 아세틸기로 캐핑한 것을 조제했다. 디클로로메탄:트리플루오로아세트산:트리이소프로필실란=90:5:5의 용액에서 1시간 교반시켜, mtt기만을 탈보호했다. 수지를 DMF로 세정한 후에, 트리에틸아민(50몰당량), 아지드아세틸산 NHS에스테르(10몰당량), DMF4mL)에 용해시켜 첨가하여, 16시간 교반했다. 용액을 제거한 후 트리플루오로아세트산:물:트리이소프로필실란=95:2.5:2.5의 용액에서 1시간 교반함으로써 수지로부터의 잘라냄과 탈보호를 행했다. 수지를 필터레이션에 의해 제거하고, 디에틸에테르를 첨가하여 침전을 행하고, 디에틸에테르를 데칸테이션함으로써 제거하여, 펩타이드를 조결정으로 해서 얻었다. 이를 분취 HPLC로 정제하여, 생성물인 친화성 펩타이드 아지드 부가체를 얻었다.
Figure pct00057
화합물 4
(펩타이드 부분의 아미노산 서열: 서열 번호 8)
MS (ESI)m/z:z=3 1401[M+3H]3+, z=4 1051[M+4H]4+
Figure pct00058
화합물 5
(펩타이드 부분의 아미노산 서열: 서열 번호 6)
MS (ESI) m/z:z=3 1420[M+3H]3+, z=4 1065[M+4H]4+
[실시예 2: 항체 수식 링커의 합성과 IgG1 Fc 친화성 펩타이드 아지드 부가체와의 연결]
(2-1) 이미다졸릴카보닐 화합물의 합성
(2-1-1) 이미다졸릴카보닐 화합물(화합물 6)의 합성
Figure pct00059
화합물 6
3-부틴-1-올(0.100g, 1.32mmol)과 카보닐디이미다졸(263mg, 1.62mmol)을 THF 용매에 용해시키고, 실온에서 1시간 교반했다. 반응액을 아세트산에틸로 희석하여, 물, 식염수로 세정 후, 황산나트륨을 첨가하여 5분 정치했다. 필터레이션에 의해 황산나트륨을 제거하고, 감압 하 농축함으로써 조(粗)생성물을 얻은 후, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제했다. 생성물이 포함되는 프렉션을 회수하고, 감압 하 농축함으로써, 화합물 6에 상당하는 1H-이미다졸-1-카복실산-3-부티닐에스테르(0.180g, 1.10mmol)를 얻었다.
1H NMR(400MHz, Chloroform-d) δ 2.08(t, J=2.7Hz, 1H), 2.73(td, J=6.6, 2.7Hz, 2H), 4.54(t, J=6.6Hz, 2H), 7.11(s, 1H), 7.43(s, 1H), 8.18(s, 1H).
MS(ESI) m/z:165[M+Na]+
(2-1-2) 이미다졸릴카보닐 화합물(화합물 7)의 합성
Figure pct00060
화합물 7
9-데신-1-올(0.100g, 0.745mmol)과 카보닐디이미다졸(148mg, 0.916mmol)을 THF 용매에 용해시키고, 실온에서 1시간 교반했다. 반응액을 아세트산에틸로 희석하여, 물, 식염수로 세정 후, 황산나트륨을 첨가하여 5분 정치했다. 필터레이션에 의해 황산나트륨을 제거하고, 감압 하 농축함으로써, 조생성물을 얻은 후, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제했다. 생성물이 포함되는 프렉션을 회수하고, 감압 하 농축함으로써, 화합물 7에 상당하는 1H-이미다졸-1-카복실산-9-부티닐에스테르(0.152g, 0.612mmol)를 얻었다.
1H NMR(400MHz, Chloroform-d) δ 1.33-1.50(m, 10H), 1.82(m, 2H), 1.96(t, J=2.6Hz, 1H)2.21(td, J=6.8, 2.6Hz, 2H), 4.43(t, J=6.8Hz, 2H)7.10(s, 1H), 7.45(brs, 1H), 8.16(s, 1H).
MS(ESI) m/z:271[M+Na]+
(2-1-3) 이미다졸릴카보닐 화합물(화합물 9)의 합성
Figure pct00061
화합물 8
N,N'-디사이클로헥실카르보디이미드(113mg, 0.546mmol), 1-하이드록시벤조트리아졸일수화물(78.1mg, 0.546mmol), 4-펜틴산(53.6mg, 0.546mmol)을 디클로로메탄 용매에 용해시키고, 실온에서 1시간 교반한 후, 12-아미노-도데칸올(0.100g, 0.497mmol)을 첨가하여, 실온에서 4시간 교반했다. 반응액을 아세트산에틸로 희석하여, 물, 식염수로 세정 후, 황산나트륨을 첨가하여 5분 정치했다. 필터레이션에 의해 황산나트륨을 제거하고, 감압 하 농축함으로써, 화합물 8에 상당하는 12-(펜티-4-인-1-옥소)아미노도데칸-1-올(0.102g, 0.363mmol)을 얻었다.
MS(ESI) m/z:281[M+H]+
Figure pct00062
화합물 9
12-(펜티-4-인아미드)도데칸-1-올(25.0mg, 0.089mmol)과 카보닐디이미다졸(29.1mg, 0.178mmol)을 THF 용매에 용해시키고, 실온에서 1시간 교반했다. 반응액을 아세트산에틸로 희석하여, 물, 식염수로 세정 후, 황산나트륨을 첨가하여 5분 정치했다. 필터레이션에 의해 황산나트륨을 제거하고, 감압 하 농축함으로써 조생성물을 얻은 후, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제했다. 생성물이 포함되는 프렉션을 회수하고, 감압 하 농축함으로써, 화합물 9에 상당하는 1H-이미다졸-1-카복실산-12-(펜티-4-인-1-옥소)아미노도데카닐에스테르(12.0mg, 0.032mmol)를 얻었다.
1H NMR(400MHz, Chloroform-d) δ 1.23-1.50(m, 20H), 1.81(t, J=2.6Hz, 1H), 2.36(m, 2H)2.53(td, J=6.8, 2.6Hz, 2H), 3.23(t, J=6.8Hz, 2H)4.41(t, J=6.8Hz, 2H), 5.64(brs, 1H), 7.07(s, 1H), 7.43(brs, 1H), 8.13(s, 1H).
MS(ESI) m/z:398[M+Na]+
(2-2) 이미다졸릴카보닐 화합물의 합성과 친화성 펩타이드 아지드체와의 연결
실시예 1에서 합성한 친화성 펩타이드 아지드체(화합물 4)와 실시예 2에서 합성한 이미다졸릴카보닐 화합물(화합물 6, 7, 9)은 모두 동일한 방법으로 연결시켰다. 펩타이드 아지드체를 100mM의 인산 완충액(pH7.0)에 용해시키고, 아미노구아니딘염산염(20몰당량), 아스코르브산나트륨(20몰당량), 100mg/mL의 이미다졸릴카보닐 화합물(3몰당량) 디메틸술폭시드 용액을 첨가했다. 이 반응 혼합물에 대하여, 별도 조제한 황산구리일수화물(4몰당량)과 트리스(3-하이드록시프로필트리아졸릴메틸)아민(20몰당량)의 수용액을 첨가하고, 교반했다. LC-MS로 반응 모니터링을 행하고, 원료의 소실을 확인한 후, 이를 한외 여과(Amicon Ultra, 3K MWCO))로 농축과 물 희석을 4회 반복하여, 얻어진 수용액을 동결 건조하여 하기에 나타내는 펩타이드-이미다졸릴카보닐 화합물(화합물 10, 11, 12)을 취득했다.
Figure pct00063
화합물 10
(펩타이드 부분의 아미노산 서열: 서열 번호 8)
MS (ESI)m/z:z=3 1455[M+3H]3+, z=4 1092[M+4H]4+
Figure pct00064
화합물 11
(펩타이드 부분의 아미노산 서열: 서열 번호 8)
MS (ESI)m/z:z=3 1483[M+3H]3+, z=4 1113[M+4H]4+
Figure pct00065
화합물 12
(펩타이드 부분의 아미노산 서열: 서열 번호 8)
MS (ESI)m/z:z=3 1525[M+3H]3+, z=4 1144[M+4H]4+
[참고예 1: 모델 실험에 의한 친화성 펩타이드로부터 항체 수식기(친전자기)까지의 원자수의 차이에 의한, 반응성의 차이의 검증]
(1-1) IgG 항체 트라스투주맙-펩타이드 복합체의 합성
항HER2 IgG 항체 트라스투주맙(츄가이 세이야쿠) 20μg을 100mM의 HEPES 완충액(pH7.2) 2.0μL에 용해시켜, 실시예 2의 (2-2)에서 합성한 펩타이드-이미다졸릴카보닐 화합물(화합물 10, 11, 12)을 각각 항체에 대하여 20몰당량 첨가하여, 37도에서 4시간 교반했다. 반응액을 한외 여과(Amicon Ultra, 3K MWCO))에 의해 물치환하여 펩타이드 시약을 제거함으로써 반응을 정지시키고, IgG 항체 트라스투주맙-펩타이드 복합체를 얻었다.
(1-2) IgG 항체 트라스투주맙-펩타이드 복합체의 SDS-PAGE에 의한 해석
3종의 펩타이드-이미다졸릴카보닐 화합물(화합물 10, 11, 12)을 사용하여 (1-1)에서 얻어진 IgG 항체 트라스투주맙-펩타이드 복합체의 3종을 SDS-PAGE(Mini-PROTEAN TGX gel, 4 내지 20%, Bio-RAD; 환원 조건 하; Coomasie Brilliant Blue G-250 Stain에 의해 염색)로 분석한 결과를, 도 2에 나타낸다. 이 결과로부터, 화합물 10, 11을 사용했을 때에는 항체의 수식 반응이 진행하고, 화합물 12를 사용한 때에는 진행하지 않는 것을 알았다.
[실시예 3: 말레이미드를 탑재한 항체 친화성 시약의 합성]
(3-1) 보호 티올 화합물의 합성
(3-1-1) 보호 티올 화합물(화합물 14)의 합성
Figure pct00066
화합물 13
3-(트리페닐메틸티오)프로피온산(100mg, 0.287mmol)을 THF에 용해시키고, 0℃에서 클로로탄산이소부틸(42.7μL, 0.316mmol), N-메틸모르폴린(69.4μL, 0.631mmol)을 첨가하고 30분 교반하여, 대응하는 혼합 산 무수물을 조제했다. 실온에서 5-아미노발레르산(33.6mg, 0.287mmol)을 1M 수산화나트륨 수용액에 용해시킨 후, 상술한 혼합 산 무수물의 THF 용액을 실온에서 적하했다. 실온에서 16시간 교반한 후, 반응액을 물과 아세트산에틸로 세정하고, 수상(水相)을 회수했다. 수상에 6M 염산 수용액을 첨가하고, 계 내의 pH를 3.0으로 조정한 후, 아세트산에틸에 의한 분액 추출을 행한 후, 유기상을 식염수로 세정 후, 무수 황산마그네슘을 첨가하여 5분 정치했다. 필터레이션에 의해 황산마그네슘을 제거하고, 감압 하 농축함으로써 조생성물을 얻은 후, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제했다. 생성물이 포함되는 프렉션을 회수하고, 감압 하 농축함으로써, 화합물 13에 상당하는 5-[3-(트리페닐메틸)설파닐-프로필-1-옥소]아미노-헥산산(110mg, 0.246mmol)을 얻었다.
1H NMR(400MHz, Chloroform-d) δ 1.66(m, 3H), 2.03(t, J=7.3Hz, 2H), 2.39(t, J=7.3Hz, 2H), 2.52(t, J=7.3Hz, 2H), 3.22(q, J=6.6Hz, 2H), 5.37(s, 1H), 7.19-7.36(m, 9H), 7.40-7.49(m, 6H).
MS(ESI) m/z:470[M+Na]+
Figure pct00067
화합물 14
5-(3-트리페닐메틸-프로필-1-옥소)아미노-헥산산(20.2mg, 0.045mmol)을 THF에 용해시키고, 0℃에서 클로로탄산이소부틸(6.70μL, 0.050mmol), N-메틸모르폴린(10.9μL, 0.0991mmol)을 첨가하고 30분 교반하여, 대응하는 혼합 산 무수물을 조제했다. 실온에서 프로파길아민(16.6μL, 0.226mmol)을 1M 수산화나트륨 수용액에 용해시킨 후, 전술의 혼합 산 무수물의 THF 용액을 실온에서 적하했다. 실온에서 16시간 교반한 후, 반응액을 물과 아세트산에틸로 세정하고, 수상을 회수했다. 수상에 6M 염산 수용액을 첨가하고, 계 내의 pH를 3.0으로 조정한 후, 아세트산에틸에 의한 분액 추출을 행한 후, 유기상을 식염수로 세정 후, 무수 황산마그네슘을 첨가하여 5분 정치했다. 필터레이션에 의해 황산마그네슘을 제거하고, 감압 하 농축함으로써, 조생성물을 얻은 후, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제했다. 생성물이 포함되는 프렉션을 회수하고, 감압 하 농축함으로써, 화합물 14에 상당하는 N-프로피닐-5-(3-트리페닐메틸설파닐-프로필-1-옥소)아미노-헥산아미드(20.0mg, 0.041mmol)를 얻었다.
1H NMR(400MHz, Chloroform-d) δ 1.52(dt, J=8.2, 6.5Hz, 2H), 1.59-1.72(m, 2H), 2.02-2.09(m, 2H), 2.17-2.28(m, 2H)2.52(t, J=7.2Hz, 2H), 3.21(brs, 2H), 4.01(dd, J=5.3, 2.6Hz, 2H), 6.04(s, 1H), 7.19-7.35(m, 9H), 7.40-7.49(m, 6H).
MS(ESI) m/z:507[M+H]+
(3-1-2) 보호 티올 화합물(화합물 15)의 합성
Figure pct00068
화합물 15
3-(트리페닐메틸티오)프로피온산(100mg, 0.287mmol)을 THF에 용해시키고, 0℃에서 클로로탄산이소부틸(42.7μL, 0.316mmol), N-메틸모르폴린(69.4μL, 0. 631mmol)을 첨가하고 30분 교반하여, 대응하는 혼합 산 무수물을 조제했다. 실온에서 프로파길아민(105μL, 1.43mmol)을 1M 수산화나트륨 수용액에 용해시킨 후, 전술의 혼합 산 무수물의 THF 용액을 실온에서 적하했다. 실온에서 16시간 교반한 후, 반응액을 물과 아세트산에틸로 세정하고, 수상을 회수했다. 수상에 6M 염산 수용액을 첨가하고, 계 내의 pH를 3.0으로 조정한 후, 아세트산에틸에 의한 분액 추출을 행한 후, 유기상을 식염수로 세정 후, 무수 황산마그네슘을 첨가하여 5분간 정치했다. 필터레이션에 의해 황산마그네슘을 제거하고, 감압 하 농축함으로써, 화합물 15에 상당하는 N-프로피닐-3-트리페닐메틸설파닐-프로판아미드(110mg, 0.286mmol)를 얻었다.
1H NMR(400MHz, Chloroform-d) δ 2.01(t, J=7.1Hz, 2H), 2.24(t, J=2.8Hz, 1H), 2.53(t, J=7.6Hz, 2H), 3.99(m, 2H), 5.40(brs, 1H), 7.19-7.35(m, 9H), 7.40-7.49(m, 6H).
MS(ESI) m/z:408[M+Na]+
(3-2) 친화성 펩타이드와 보호 티올 화합물의 연결
(3-2-1) 펩타이드-보호 티올 연결체(화합물 16)의 합성
Figure pct00069
화합물 16
(펩타이드 부분의 아미노산 서열: 서열 번호 6)
실시예 1에서 합성한 화합물 5를 N,N'-디메틸포름아미드에 용해하고, 3-(트리페닐메틸티오)프로피온산(5몰당량), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드염산염(15몰당량), 1-하이드록시벤조트리아졸(15몰당량)을 N,N'-디메틸포름아미드에 용해시키고, 계 중에 첨가했다. 실온에서 12시간 교반한 후, 분취 HPLC로 정제했다. 목적물을 포함하는 프렉션을 ESI-MS로 확인한 후, 동결 건조하여 생성물인 펩타이드-보호 티올 연결체(화합물 16)를 얻었다.
MS (ESI)m/z:z=3 1502[M+3H]3+, z=4 1125[M+4H]4+
(3-2-2) 펩타이드-보호 티올 연결체(화합물 17, 18)의 합성
실시예 1에서 합성한 친화성 펩타이드 아지드체(화합물 5)와 (4-1-1), (4-1-2)에서 합성한 보호 티올 화합물(화합물 17, 18)은 동일한 방법으로 연결시켰다. 펩타이드 아지드체를 100mM의 인산 완충액(pH7.0)에 용해시키고, 아미노구아니딘염산염(20몰당량), 아스코르브산나트륨(20몰당량), 100mg/mL의 보호 티올 화합물(3몰당량) 디메틸술폭시드 용액을 첨가했다. 이 반응 혼합물에 대하여, 별도 조제한 황산구리일수화물(4몰당량)과 트리스(3-하이드록시프로필트리아졸릴메틸)아민(20몰당량)의 수용액을 첨가하고, 교반했다. LC-MS로 반응 모니터링을 행하고, 원료의 소실을 확인한 후, 이를 한외 여과(Amicon Ultra-4, 3K MWCO)로 농축과 물 희석을 4회 반복하여, 얻어진 수용액을 동결 건조하여 펩타이드-보호 티올 연결체(화합물 17, 18)를 취득했다.
Figure pct00070
화합물 17
(펩타이드 부분의 아미노산 서열: 서열 번호 6)
MS(ESI) m/z:z=3 1548[M+3H]3+, z=4 1161[M+4H]4+
Figure pct00071
화합물 18
(펩타이드 부분의 아미노산 서열: 서열 번호 6)
MS(ESI) m/z:z=3 1581[M+3H]3+, z=4 1186[M+4H]4+
(3-3) 펩타이드-보호 티올 연결체(화합물 19, 20, 21)의 합성
(3-2)에서 합성한 친화성 펩타이드-보호 티올 연결체(화합물 16, 17, 18)를, 트리플루오로아세트산:디클로로메탄=1:1 용액에서 1시간 교반함으로써, 트리페닐메틸기를 제거했다. 반응 종결을 LC-MS로 확인한 후, 분취 HPLC로 정제했다. 목적물을 포함하는 프렉션을 ESI-MS로 확인한 후, 동결 건조하여 생성물인 티올-펩타이드 연결체(화합물 19, 20, 21)를 얻었다.
Figure pct00072
화합물 19
(펩타이드 부분의 아미노산 서열: 서열 번호 6)
MS(ESI) m/z:z=3 1454[M+3H]3+, z=4 1091[M+4H]4+
Figure pct00073
화합물 20
(펩타이드 부분의 아미노산 서열: 서열 번호 6)
MS(ESI) m/z:z=3 1468[M+3H]3+, z=4 1111[M+4H]4+
Figure pct00074
화합물 21
(펩타이드 부분의 아미노산 서열: 서열 번호 6)
m/z:z=3 1501[M+3H]3+, z=4 1126[M+4H]4+
(3-4) 말레이미드를 탑재한 항체 친화성 펩타이드 시약의 합성 (1)(화합물 22, 23, 24)
(3-3)에서 합성한 티올-펩타이드 연결체(화합물 19, 20, 21)를 디메틸술폭시드에 용해시켜, N-하이드록시말레이미드(20몰당량)의 디메틸술폭시드 용액을 첨가하여, 1시간 교반했다. 원료 소실을 LC-MS로 확인한 후, 트랜스-4-[(2,5-디하이드로-1H-피롤리-1-일)메틸)]사이클로헥산카복실산(40몰당량), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드염산염(30몰당량), 1-하이드록시벤조트리아졸(30몰당량)을 첨가하고, 4시간 교반했다. 반응 종결을 LC-MS로 확인한 후, 분취 HPLC로 정제했다. 목적물을 포함하는 프렉션을 ESI-MS로 확인한 후, 동결 건조하여 생성물인 말레이미드-친화성 펩타이드 시약(화합물 22, 23, 24)을 얻었다.
Figure pct00075
화합물 22
(펩타이드 부분의 아미노산 서열: 서열 번호 6)
MS(ESI) m/z:z=3 1532[M+3H]3+, z=4 1150[M+4H]4+
Figure pct00076
화합물 23
(펩타이드 부분의 아미노산 서열: 서열 번호 6)
MS(ESI) m/z:z=3 1578[M+3H]3+, z=4 1184[M+4H]4+
Figure pct00077
화합물 24
(펩타이드 부분의 아미노산 서열: 서열 번호 6)
MS(ESI) m/z:z=3 1611[M+3H]3+, z=4 1208[M+4H]4+
(3-5) 말레이미드를 탑재한 항체 친화성 펩타이드 시약의 합성 (2)(화합물 56, 58)
(3-5-1) N-하이드록시숙신이미드-펩타이드 연결체(화합물 55)의 합성
(1-1)에서 합성한 화합물 3을 디메틸술폭시드에 용해시키고, 트리에틸아민(1당량), N-하이드록시말레이미드(1.2당량)의 디메틸술폭시드 용액을 첨가하여 실온에서 1시간 교반했다. 반응 종결을 LC-MS로 확인한 후, 분취 HPLC로 정제했다. 목적물을 포함하는 프렉션을 ESI-MS로 확인한 후, 동결 건조하여 생성물인 N-하이드록시숙신이미드-펩타이드 연결체(화합물 55)를 얻었다.
Figure pct00078
화합물 55
(펩타이드 부분의 아미노산 서열: 서열 번호 7)
MS (ESI)m/z:z=3 1429 [M+3H]3+, Z=4 1072 [M+4H]4+, z=5 857 [M+5H]5+, z=6 715 [M+6H]6+
(3-5-2) 말레이미드를 탑재한 항체 친화성 펩타이드 시약의 합성(화합물 56)
(3-5-1)에서 얻어진 N-하이드록시숙신이미드-펩타이드 연결체, 4-(N-말레이미드메틸)사이클로헥산카복실산N-숙신이미딜(20당량)을 디메틸술폭시드에 용해시키고, 트리에틸아민(8당량)을 첨가했다. 실온에서 2시간 교반 후, LC-MS로 반응 진행을 확인했다. 분취 HPLC로 정제, 목적물을 포함하는 프렉션을 ESI-MS로 확인한 후, 동결 건조하여 목적물인 말레이미드를 탑재한 항체 친화성 펩타이드 시약(화합물 56)을 얻었다.
Figure pct00079
화합물 56
(펩타이드 부분의 아미노산 서열: 서열 번호 7)
MS (ESI)m/z:z=3 1502 [M+3H]3+, Z=4 1126 [M+4H]4+, z=5 901 [M+5H]5+, z=6 751 [M+6H]6+
(3-5-3) N-하이드록시숙신이미드-펩타이드 연결체(화합물 57)의 합성
실시예 1에서 합성한 항체 친화성 펩타이드(화합물 36)를 디메틸술폭시드에 용해시키고, 2-이미노티오란염산염(10몰당량), 디이소프로필에틸아민(15몰당량)을 첨가하고, 1시간 교반했다. 원료 소실을 LC-MS로 확인한 후, N-하이드록시말레이미드(20몰당량)의 디메틸술폭시드 용액을 첨가하여, 1시간 교반했다. 반응 진행을 LC-MS로 확인한 후, 분취 HPLC로 정제했다. 목적물을 포함하는 프렉션을 ESI-MS로 확인한 후, 동결 건조하여 생성물인 하이드록시말레이미드-친화성 펩타이드체(화합물 57)를 얻었다.
Figure pct00080
화합물 57
(펩타이드 부분의 아미노산 서열: 서열 번호 46)
MS (ESI) m/z:z=2 1152 [M+2H]2+, Z=3 769[M+3H]3+
(3-5-4) 말레이미드를 탑재한 항체 친화성 펩타이드 시약의 합성(화합물 58)
(3-5-2)에서 얻어진 N-하이드록시숙신이미드-펩타이드 연결체 (H1), 4-〔(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)메틸〕벤조산(20당량)를 디메틸술폭시드에 용해시키고, 트리에틸아민(8당량)을 첨가했다. 실온에서 2시간 교반 후, LC-MS로 반응 진행을 확인했다. 분취 HPLC로 정제, 목적물을 포함하는 프렉션을 ESI-MS로 확인한 후, 동결 건조하여 목적물인 말레이미드를 탑재한 항체 친화성 펩타이드 시약(화합물 58)을 얻었다.
Figure pct00081
화합물 58
(펩타이드 부분의 아미노산 서열: 서열 번호 46)
MS (ESI)m/z:z=2 1259 [M+2H]2+, Z=3 840[M+3H]3+
[실시예 4: 항HER2 IgG 항체 트라스투주맙으로의 위치 선택적 말레이미드 도입과 해석]
(4-1) 티올을 갖는 펩타이드 시약의 합성
하기의 화합물 25를 Fmoc법에 의한 2-클로로트리틸레진을 사용한 펩타이드 고상 합성에 의해 합성했다. 고상 합성 후, 트리플루오로아세트산:물:트리이소프로필실란=95:2.5:2.5의 용액에서 1시간 교반함으로써 수지로부터의 잘라냄과 탈보호를 행했다. 수지를 필터레이션에 의해 제거하고, 디에틸에테르를 첨가하여 침전울 행하고, 디에틸에테르를 데칸테이션함으로써 제거하여, 펩타이드를 조결정으로 하여 얻었다. 이를 분취 HPLC로 정제하여, 생성물인 하기 화합물 25를 얻었다. 화합물 25는, 친화성 펩타이드가 아니라, 생체 직교성 관능기인 말레이미드를 위치 선택적으로 갖는 항체에 대하여, 말레이미드기를 통해서 도입되어야 할, 약제의 대체 모델 펩타이드 화합물이다.
Figure pct00082
화합물 25
(펩타이드 부분의 아미노산 서열: 서열 번호 9)
MS (ESI) m/z:z=2 1482[M+2H]2+, z=3 988[M+3H]3+
(4-2) 말레이미드-친화성 펩타이드 시약에 의한 IgG 항체 트라스투주맙으로의 위치 특이적인 수식
실시예 4의 (4-4)에서 합성한 말레이미드-친화성 펩타이드 시약(화합물 22, 23, 24)을 N,N'-디메틸포름아미드에 용해하여 2.18mM로 했다. 항HER2 IgG 항체 트라스투주맙(츄가이 세이야쿠) 20.0μg을 50mM HEPES 완충액(pH7.2) 14.8μL에 용해시켜, 펩타이드 시약(10 내지 40몰당량)을 항체에 대하여 첨가하여, 37도에서 4시간 교반했다. 반응액을 한외 여과(Amicon Ultra, 10K MWCO))에 의해 20mM 아세트산 완충액(pH4.5)으로 용매 치환했다. 동 조작을 3회 반복함으로써 친화성 펩타이드 시약을 제거하고, IgG 항체 트라스투주맙-말레이미드 수식체를 얻었다.
(4-3) IgG 항체 트라스투주맙-말레이미드 수식체와 티올을 갖는 펩타이드 시약과의 콘쥬게이션
실시예 5의 (5-2)에서 합성한 IgG 항체 트라스투주맙-말레이미드 수식체를 한외 여과(Amicon Ultra, 10K MWCO)에 의해 50mM HEPES 완충액(pH7.2)으로 용매 치환함으로써, 계 내의 pH를 중성으로 되돌려, 10mg/mL로 조제한 화합물 25 수용액(항체에 대하여 80몰당량)을 첨가하고, 16시간 교반했다. 반응액을 한외 여과(Amicon Ultra, 10K MWCO)에 의해 물치환하고 펩타이드 시약을 제거함으로써 반응을 정지시키고, IgG 항체 트라스투주맙-펩타이드 복합체를 얻었다.
(4-4) IgG 항체 트라스투주맙-펩타이드 복합체의 SDS-PAGE에 의한 해석
(4-3)에서 얻어진 IgG 항체 트라스투주맙-펩타이드 복합체를 SDS-PAGE(Mini-PROTEAN TGX gel, 4 내지 20%, Bio-RAD; 환원 조건 하; Coomasie Brilliant Blue G-250 Stain에 의해 염색)로 분석한 결과를, 도 3에 나타낸다. 이 결과로부터, 말레이미드의 위치 선택적 도입 반응 (5-2)에서 화합물 22, 23을 사용했을 때에는 항체의 수식 반응이 진행하고, 화합물 24를 사용했을 때에는 진행하지 않는 것을 알 수 있었다.
(4-5) IgG 항체 트라스투주맙-말레이미드 수식체의 환원 조건에서의 ESI-TOFMS 해석에 의한 중쇄 선택성의 확인
(4-5-1) IgG 항체 트라스투주맙-말레이미드 수식체의 합성 (1)
실시예 3의 (3-5-2)에서 합성한 말레이미드를 탑재한 친화성 펩타이드 시약(화합물 56)을 N,N'-디메틸포름아미드에 용해하여 2.0mM로 했다. 항HER2 IgG 항체 트라스투주맙(츄가이 세이야쿠) 250μg을 50mM HEPES 완충액(pH7.2) 230μL에 용해시켜, 2.0mM의 펩타이드 시약을 항체에 대하여 20몰당량 첨가하여, 37도에서 16시간 교반했다. 한외 여과(Amicon Ultra, 10k MWCO)에 의해 농축함으로써 IgG 항체 트라스투주맙-말레이미드 수식체를 얻었다.
(4-5-2) 트라스투주맙-말레이미드 수식체의 환원 조건에서의 ESI-TOFMS 해석에 의한 중쇄 선택성의 확인 (1)
(4-5-1)에서 합성한 트라스투주맙-말레이미드 수식체에 대하여 7mM 트리스(2-카복시에틸)포스핀염산염 용액 2.0μL(항체에 대하여 100등량)를 첨가하여, 실온에서 20분 방치했다. ESI-TOFMS에 의해 질량을 측정한 결과, 컨트롤로서 사용한 원료의 트라스투주맙은 50596, 50757에 중쇄 피크, 23439에 경쇄 피크가 관측되었다. 반응 생성물은 중쇄에 트리스(2-카복시에틸)포스핀과 반응한 말레이미드가 도입된 51062, 51224, 및 원료와 동일한 23439에 경쇄 피크가 관측되었다. ESI-TOFMS 해석 결과를 도 4에 나타낸다.
(4-5-3) IgG 항체 트라스투주맙-말레이미드 수식체의 합성 (2)
(4-5-1)과 마찬가지로 실시예 3의 (3-5-4)에서 합성한 말레이미드를 탑재한 친화성 펩타이드 시약(화합물 58)을 사용하여, IgG 항체 트라스투주맙-아지드 수식체를 얻었다.
(4-5-4) 트라스투주맙-말레이미드 수식체의 환원 조건에서의 ESI-TOFMS 해석에 의한 중쇄 선택성의 확인 (2)
(4-5-2)와 마찬가지로 처리를 행하여, ESI-TOFMS에 의해 질량을 측정한 결과, 컨트롤로서 사용한 원료의 트라스투주맙은 50602, 50764에 중쇄 피크, 23443에 경쇄 피크가 관측되었다. 반응 생성물은 중쇄에 N-아세틸시스테인과 반응한 말레이미드가 도입된 50818, 50979, 및 원료와 동일한 23443에 경쇄 피크가 관측되었다.
[실시예 5: 아지드를 탑재한 항체 수식 시약의 합성]
(5-1) 항체 수식기(친전자기)의 β위에 헤테로 원자를 갖는 항체 수식 시약(비교예 화합물)의 합성
Figure pct00083
화합물 26
(펩타이드 부분의 아미노산 서열: 서열 번호 7)
실시예 1에서 합성한 항체 친화성 펩타이드(화합물 2)를 디메틸술폭시드에 용해시키고, N-하이드록시말레이미드(20몰당량)의 디메틸술폭시드 용액을 첨가하여, 1시간 교반했다. 원료 소실을 LC-MS로 확인한 후, 11-아지드-3,6,9-트리옥사운데칸산(40몰당량), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드염산염(32몰당량), 1-하이드록시벤조트리아졸(32몰당량)을 첨가하고, 2시간 교반했다. 반응 종결을 LC-MS로 확인한 후, 분취 HPLC로 정제했다. 목적물을 포함하는 프렉션을 ESI-MS로 확인한 후, 동결 건조하여 생성물인 아지드-PEG-친화성 펩타이드 시약(화합물 26)을 얻었다.
MS (ESI)m/z:z=3 1501[M+3H]3+, z=4 1125[M+4H]4+
(5-2) 항체 수식기(친전자기)의 β위에 탄소 원자 또는 헤테로 원자를 갖는 항체 수식 시약의 합성
(5-2-1) 아지드 시약과 친화성 펩타이드의 연결에 의한 항체 수식 시약(화합물 27, 59, 60)의 합성
Figure pct00084
화합물 27
(펩타이드 부분의 아미노산 서열: 서열 번호 7)
실시예 1에서 합성한 항체 친화성 펩타이드(화합물 3)를 디메틸술폭시드에 용해시키고, N-하이드록시말레이미드(20몰당량)의 디메틸술폭시드 용액을 첨가하여, 1시간 교반했다. 원료 소실을 LC-MS로 확인한 후, 6-아지드-헥산산(40몰당량), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드염산염(32몰당량), 1-하이드록시벤조트리아졸(32몰당량)을 첨가하고, 2시간 교반했다. 반응 종결을 LC-MS로 확인한 후, 분취 HPLC로 정제했다. 목적물을 포함하는 프렉션을 ESI-MS로 확인한 후, 동결 건조하여 생성물인 아지드-알킬-친화성 펩타이드 시약(화합물 27)을 얻었다.
MS (ESI)m/z:z=3 1475[M+3H]3+, z=4 1107[M+4H]4+
동일한 방법으로, 실시예 3에서 합성한 N-하이드록시숙신이미드-펩타이드 연결체(화합물 57)를 사용하여, 아지드-알킬-친화성 펩타이드 시약(화합물 59)을 얻었다.
Figure pct00085
화합물 59
(펩타이드 부분의 아미노산 서열: 서열 번호 46)
MS (ESI)m/z:z=2 1222 [M+2H]2+, Z=3 815[M+3H]3+
6-아지드-헥산산을 아지드 아세트산으로 변경하여 동일하게 합성을 행하여, 아지드-알킬-친화성 펩타이드 시약(화합물 60)을 얻었다. 또한, 화합물 60은, 항체 수식기(친전자기)의 β위에 헤테로 원자를 갖는 비교예 화합물이다.
Figure pct00086
화합물 60
(펩타이드 부분의 아미노산 서열: 서열 번호 46)
MS (ESI)m/z:z=2 1193 [M+2H]2+, Z=3 796 [M+3H]3+
(5-2-2) 아지드 시약과 친화성 펩타이드의 결합에 의한 항체 수식 시약(화합물 28, 61)의 합성
Figure pct00087
화합물 28
(펩타이드 부분의 아미노산 서열: 서열 번호 7)
실시예 1에서 합성한 항체 친화성 펩타이드(화합물 3)를 디메틸술폭시드에 용해시키고, N-하이드록시말레이미드(20몰당량)의 디메틸술폭시드 용액을 첨가하여, 1시간 교반했다. 원료 소실을 LC-MS로 확인한 후, 4-아지드 벤조산(40몰당량), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드염산염(32몰당량), 1-하이드록시벤조트리아졸(32몰당량)을 첨가하고, 2시간 교반했다. 반응 종결을 LC-MS로 확인한 후, 분취 HPLC로 정제했다. 목적물을 포함하는 프렉션을 ESI-MS로 확인한 후, 동결 건조하여 생성물인 아지드-페닐-친화성 펩타이드 시약(화합물 28)을 얻었다.
MS (ESI)m/z:z=3 1478[M+3H]3+, z=4 1108[M+4H]4+
동일한 방법으로, 실시예 1에서 합성한 항체 친화성 펩타이드(화합물 31)를 사용하여, 아지드-페닐-친화성 펩타이드 시약(화합물 61)을 얻었다.
Figure pct00088
화합물 61
(펩타이드 부분의 아미노산 서열: 서열 번호 97)
MS (ESI)m/z:z=3 1348 [M+3H]3+, Z=4 1011 [M+4H]4+
(5-2-3) 아지드 시약과 친화성 펩타이드의 연결에 의한 항체 수식 시약(화합물 29, 62 내지 83)의 합성
Figure pct00089
화합물 29
(펩타이드 부분의 아미노산 서열: 서열 번호 5)
실시예 1에서 합성한 항체 친화성 펩타이드(화합물 3)를 디메틸술폭시드에 용해시키고, 2-이미노티오란염산염(10몰당량), 디이소프로필에틸아민(15몰당량)을 첨가하여, 1시간 교반했다. 원료 소실을 LC-MS로 확인한 후, N-하이드록시말레이미드(20몰당량)의 디메틸술폭시드 용액을 첨가하여, 1시간 교반했다. 반응 진행을 LC-MS로 확인한 후, 4-아지드 벤조산(40몰당량), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드염산염(32몰당량), 1-하이드록시벤조트리아졸(32몰당량)을 첨가하고, 2시간 교반했다. 반응 종결을 LC-MS로 확인한 후, 분취 HPLC로 정제했다. 목적물을 포함하는 프렉션을 ESI-MS로 확인한 후, 동결 건조하여 생성물인 아지드-페닐-친화성 펩타이드 시약(화합물 29)을 얻었다.
MS (ESI)m/z:z=3 1512[M+3H]3+, z=4 1134[M+4H]4+
마찬가지의 수법으로, 실시예 1에서 합성한 항체 친화성 펩타이드(화합물 32 내지 53)를 사용하여, 하기에 나타내는 아지드 시약과 친화성 펩타이드의 연결에 의한 항체 수식 시약을 합성했다(화합물 62 내지 83).
실시예 1에서 합성한 항체 친화성 펩타이드(화합물 32)를 사용하여 합성된 항체 수식 시약은, 이하이다.
Figure pct00090
화합물 62
(펩타이드 부분의 아미노산 서열: 서열 번호 98)
MS (ESI)m/z:z=3 1521[M+3H]3+, z=4 1141[M+4H]4+
실시예 1에서 합성한 항체 친화성 펩타이드(화합물 33)를 사용하여 합성된 항체 수식 시약은, 이하이다.
Figure pct00091
화합물 63
(펩타이드 부분의 아미노산 서열: 서열 번호 41)
MS (ESI)m/z:z=3 1546 [M+3H]3+, Z=4 1159 [M+4H]4+
실시예 1에서 합성한 항체 친화성 펩타이드(화합물 34)를 사용하여 합성된 항체 수식 시약은, 이하이다.
Figure pct00092
화합물 64
(펩타이드 부분의 아미노산 서열: 서열 번호 42)
MS (ESI)m/z:z=3 1537 [M+3H]3+, Z=4 1153 [M+4H]4+
실시예 1에서 합성한 항체 친화성 펩타이드(화합물 35)를 사용하여 합성된 항체 수식 시약은, 이하이다.
Figure pct00093
화합물 65
(펩타이드 부분의 아미노산 서열: 서열 번호 43)
MS (ESI)m/z:z=3 1545 [M+3H]3+, Z=4 1159 [M+4H]4+
실시예 1에서 합성한 항체 친화성 펩타이드(화합물 36)를 사용하여 합성된 항체 수식 시약은, 이하이다.
Figure pct00094
화합물 66
(펩타이드 부분의 아미노산 서열: 서열 번호 46)
MS (ESI)m/z:z=2 1225[M+H]+, z=3 817[M+H]+
실시예 1에서 합성한 항체 친화성 펩타이드(화합물 37)를 사용하여 합성된 항체 수식 시약은, 이하이다.
Figure pct00095
화합물 67
(펩타이드 부분의 아미노산 서열: 서열 번호 47)
MS (ESI)m/z:z=2 1217 [M+2H]2+, z=3 812 [M+3H]3+
실시예 1에서 합성한 항체 친화성 펩타이드(화합물 38)를 사용하여 합성된 항체 수식 시약은, 이하이다.
Figure pct00096
화합물 68
(펩타이드 부분의 아미노산 서열: 서열 번호 48)
MS (ESI)m/z:z=2 1211 [M+2H]2+, z=3 807 [M+3H]3+
실시예 1에서 합성한 항체 친화성 펩타이드(화합물 39)를 사용하여 합성된 항체 수식 시약은, 이하이다.
Figure pct00097
화합물 69
(펩타이드 부분의 아미노산 서열: 서열 번호 49)
MS (ESI)m/z:z=2 1196 [M+2H]2+, z=3 798 [M+3H]3+
실시예 1에서 합성한 항체 친화성 펩타이드(화합물 40)를 사용하여 합성된 항체 수식 시약은, 이하이다.
Figure pct00098
화합물 70
(펩타이드 부분의 아미노산 서열: 서열 번호 50)
MS (ESI)m/z:z=2 1224 [M+2H]2+, z=3 817 [M+3H]3+
실시예 1에서 합성한 항체 친화성 펩타이드(화합물 41)를 사용하여 합성된 항체 수식 시약은, 이하이다.
Figure pct00099
화합물 71
(펩타이드 부분의 아미노산 서열: 서열 번호 51)
MS (ESI)m/z:z=2 1224 [M+2H]2+, z=3 817 [M+3H]3+
실시예 1에서 합성한 항체 친화성 펩타이드(화합물 42)를 사용하여 합성된 항체 수식 시약은, 이하이다.
Figure pct00100
화합물 72
(펩타이드 부분의 아미노산 서열: 서열 번호 52)
MS (ESI)m/z:z=2 961 [M+2H]2+
실시예 1에서 합성한 항체 친화성 펩타이드(화합물 43)를 사용하여 합성된 항체 수식 시약은, 이하이다.
Figure pct00101
화합물 73
(펩타이드 부분의 아미노산 서열: 서열 번호 53)
MS (ESI)m/z:z=1 1909[M+H]+, z=3 955[M+H]+
실시예 1에서 합성한 항체 친화성 펩타이드(화합물 44)를 사용하여 합성된 항체 수식 시약은, 이하이다.
Figure pct00102
화합물 74
(펩타이드 부분의 아미노산 서열: 서열 번호 55)
MS (ESI)m/z:z=2 1239 [M+2H]2+, z=3 827 [M+3H]3+
실시예 1에서 합성한 항체 친화성 펩타이드(화합물 45)를 사용하여 합성된 항체 수식 시약은, 이하이다.
Figure pct00103
화합물 75
(펩타이드 부분의 아미노산 서열: 서열 번호 57)
MS (ESI)m/z:z=2 1253 [M+2H]2+, z=3 836 [M+3H]3+
실시예 1에서 합성한 항체 친화성 펩타이드(화합물 46)를 사용하여 합성된 항체 수식 시약은, 이하이다.
Figure pct00104
화합물 76
(펩타이드 부분의 아미노산 서열: 서열 번호 59)
MS (ESI)m/z:z=2 1260 [M+2H]2+, z=3 841 [M+3H]3+
실시예 1에서 합성한 항체 친화성 펩타이드(화합물 47)를 사용하여 합성된 항체 수식 시약은, 이하이다.
Figure pct00105
화합물 77
(펩타이드 부분의 아미노산 서열: 서열 번호 63)
MS (ESI)m/z:z=2 1265[M+H]+, z=3 844[M+H]+
실시예 1에서 합성한 항체 친화성 펩타이드(화합물 48)를 사용하여 합성된 항체 수식 시약은, 이하이다.
Figure pct00106
화합물 78
(펩타이드 부분의 아미노산 서열: 서열 번호 71)
MS (ESI)m/z:z=2 1225 [M+2H]2+, z=3 817 [M+3H]3+
실시예 1에서 합성한 항체 친화성 펩타이드(화합물 49)를 사용하여 합성된 항체 수식 시약은, 이하이다.
Figure pct00107
화합물 79
(펩타이드 부분의 아미노산 서열: 서열 번호 72)
MS (ESI)m/z:z=2 853 [M+2H]2+
실시예 1에서 합성한 항체 친화성 펩타이드(화합물 50)를 사용하여 합성된 항체 수식 시약은, 이하이다.
Figure pct00108
화합물 80
(펩타이드 부분의 아미노산 서열: 서열 번호 77)
MS (ESI)m/z:z=2 1232 [M+2H]2+, z=3 822 [M+3H]3+
실시예 1에서 합성한 항체 친화성 펩타이드(화합물 51)를 사용하여 합성된 항체 수식 시약은, 이하이다.
Figure pct00109
화합물 81
(펩타이드 부분의 아미노산 서열: 서열 번호 81)
MS (ESI)m/z:z=2 1253 [M+2H]2+, z=3 836 [M+3H]3+
실시예 1에서 합성한 항체 친화성 펩타이드(화합물 52)를 사용하여 합성된 항체 수식 시약은, 이하이다.
Figure pct00110
화합물 82
(펩타이드 부분의 아미노산 서열: 서열 번호 82)
MS (ESI)m/z:z=2 1254 [M+2H]2+, z=3 836 [M+3H]3+
실시예 1에서 합성한 항체 친화성 펩타이드(화합물 53)를 사용하여 합성된 항체 수식 시약은, 이하이다.
Figure pct00111
화합물 83
(펩타이드 부분의 아미노산 서열: 서열 번호 99)
MS (ESI)m/z:z=2 1147 [M+2H]2+, z=3 764 [M+3H]3+
[실시예 6: IgG1 Fc 친화성 펩타이드 시약에 의한 IgG1 Fc의 위치 특이적 수식과 ESI-TOFMS에 의한 해석]
(6-1) 항체 수식기(친전자기)의 β위에 탄소 원자를 갖는 항체 수식 시약에서의 항체 수식 반응
(6-1-1) 친화성 펩타이드 시약(화합물 27, 화합물 59)을 사용한 항체 수식 반응(아지드 수식 항체 1, 2)
실시예 5에서 합성한 아지드를 탑재한 친화성 펩타이드 시약(화합물 27)을 N,N'-디메틸포름아미드에 용해하여 0.22mM로 했다. 항HER2 IgG 항체 트라스투주맙(츄가이 세이야쿠) 200μg을 50mM HEPES 완충액(pH7.2) 1200μL에 용해시켜, 0.22mM의 펩타이드 시약을 항체에 대하여 20몰당량 첨가하여, 37도에서 16시간 교반했다. 반응액에 10mg/mL의 Lys 수용액을 50μL 첨가하고, 30분 교반함으로써 반응을 정지시켰다. 반응 혼합물을 Protein A(Aspire Protein A Tips, Thermo)로 정제하고, 용출액을 9.57mM PBS 완충액(pH7.0)으로 치환하여 한외 여과(Amicon Ultra, 10K MWCO)에 의해 농축함으로써 IgG 항체 트라스투주맙-아지드 수식체(아지드 수식 항체 1)를 얻었다.
동일한 수법으로, 아지드를 탑재한 친화성 펩타이드 시약(화합물 59)을 사용하여 항체 수식 반응을 행하여 IgG 항체 트라스투주맙-아지드 수식체(아지드 수식 항체 2)를 얻었다.
(6-1-2) 친화성 펩타이드 시약(화합물 28, 화합물 61)을 사용한 항체 수식 반응(아지드 수식 항체 3, 4)
실시예 5에서 합성한 아지드를 탑재한 친화성 펩타이드 시약(화합물 28)을 N,N'-디메틸포름아미드에 용해하여 0.22mM로 했다. 항HER2 IgG 항체 트라스투주맙(츄가이 세이야쿠) 200μg을 50mM HEPES 완충액(pH7.2) 1200μL에 용해시키고, 0.22mM의 펩타이드 시약을 항체에 대하여 20몰당량 첨가하여, 37도에서 16시간 교반했다. 반응액에 10mg/mL의 Lys 수용액을 50μL 첨가하고, 30분 교반함으로써 반응을 정지시켰다. 반응 혼합물을 Protein A(Aspire Protein A Tips, Thermo)로 정제하고, 용출액을 9.57mM PBS 완충액(pH7.0)으로 치환하여 한외 여과(Amicon Ultra, 10K MWCO)에 의해 농축함으로써 IgG 항체 트라스투주맙-아지드 수식체(아지드 수식 항체 3)를 얻었다.
동일한 수법으로 아지드를 탑재한 친화성 펩타이드 시약(화합물 61)을 사용하여 항체 수식 반응을 행하여 IgG 항체 트라스투주맙-아지드 수식체(아지드 수식 항체 4)를 얻었다.
(6-1-3) 친화성 펩타이드 시약(화합물 29, 화합물 62 내지 83)을 사용한 항체 수식 반응(아지드 수식 항체 5 내지 27)
실시예 5에서 합성한 아지드를 탑재한 친화성 펩타이드 시약(화합물 29)을 N,N'-디메틸포름아미드에 용해하여 0.22mM로 했다. 항HER2 IgG 항체 트라스투주맙(츄가이 세이야쿠) 200μg을 50mM HEPES 완충액(pH7.2) 1200μL에 용해시키고, 0.22mM의 펩타이드 시약을 항체에 대하여 20몰당량 첨가하여, 37도에서 16시간 교반했다. 반응액에 10mg/mL의 Lys 수용액을 50μL 첨가하고, 30분 교반함으로써 반응을 정지시켰다. 반응 혼합물을 Protein A(Aspire Protein A Tips, Thermo)로 정제하고, 용출액을 9.57mM PBS 완충액(pH7.0)으로 치환하여 한외 여과(Amicon Ultra, 10K MWCO)에 의해 농축함으로써 IgG 항체 트라스투주맙-아지드 수식체를 얻었다(아지드 수식 항체 5).
동일한 수법으로 아지드를 탑재한 친화성 펩타이드 시약(화합물 62)을 사용하여 항체 수식 반응을 행하여 IgG 항체 트라스투주맙-아지드 수식체(아지드 수식 항체 6)를 얻었다.
동일한 수법으로 아지드를 탑재한 친화성 펩타이드 시약(화합물 63)을 사용하여 항체 수식 반응을 행하여 IgG 항체 트라스투주맙-아지드 수식체(아지드 수식 항체 7)를 얻었다.
동일한 수법으로 아지드를 탑재한 친화성 펩타이드 시약(화합물 64)을 사용하여 항체 수식 반응을 행하여 IgG 항체 트라스투주맙-아지드 수식체(아지드 수식 항체 8)를 얻었다.
동일한 수법으로 아지드를 탑재한 친화성 펩타이드 시약(화합물 65)을 사용하여 항체 수식 반응을 행하여 IgG 항체 트라스투주맙-아지드 수식체(아지드 수식 항체 9)를 얻었다.
동일한 수법으로 아지드를 탑재한 친화성 펩타이드 시약(화합물 66)을 사용하여 항체 수식 반응을 행하여 IgG 항체 트라스투주맙-아지드 수식체(아지드 수식 항체 10)를 얻었다.
동일한 수법으로 아지드를 탑재한 친화성 펩타이드 시약(화합물 67)을 사용하여 항체 수식 반응을 행하여 IgG 항체 트라스투주맙-아지드 수식체(아지드 수식 항체 11)를 얻었다.
동일한 수법으로 아지드를 탑재한 친화성 펩타이드 시약(화합물 68)을 사용하여 항체 수식 반응을 행하여 IgG 항체 트라스투주맙-아지드 수식체(아지드 수식 항체 12)를 얻었다.
동일한 수법으로 아지드를 탑재한 친화성 펩타이드 시약(화합물 69)을 사용하여 항체 수식 반응을 행하여 IgG 항체 트라스투주맙-아지드 수식체(아지드 수식 항체 13)를 얻었다.
동일한 수법으로 아지드를 탑재한 친화성 펩타이드 시약(화합물 70)을 사용하여 항체 수식 반응을 행하여 IgG 항체 트라스투주맙-아지드 수식체(아지드 수식 항체 14)를 얻었다.
동일한 수법으로 아지드를 탑재한 친화성 펩타이드 시약(화합물 71)을 사용하여 항체 수식 반응을 행하여 IgG 항체 트라스투주맙-아지드 수식체(아지드 수식 항체 15)를 얻었다.
동일한 수법으로 아지드를 탑재한 친화성 펩타이드 시약(화합물 72)을 사용하여 항체 수식 반응을 행하여 IgG 항체 트라스투주맙-아지드 수식체(아지드 수식 항체 16)를 얻었다.
동일한 수법으로 아지드를 탑재한 친화성 펩타이드 시약(화합물 73)을 사용하여 항체 수식 반응을 행하여 IgG 항체 트라스투주맙-아지드 수식체(아지드 수식 항체 17)를 얻었다.
동일한 수법으로 아지드를 탑재한 친화성 펩타이드 시약(화합물 74)을 사용하여 항체 수식 반응을 행하여 IgG 항체 트라스투주맙-아지드 수식체(아지드 수식 항체 18)를 얻었다.
동일한 수법으로 아지드를 탑재한 친화성 펩타이드 시약(화합물 75)을 사용하여 항체 수식 반응을 행하여 IgG 항체 트라스투주맙-아지드 수식체(아지드 수식 항체 19)를 얻었다.
동일한 수법으로 아지드를 탑재한 친화성 펩타이드 시약(화합물 76)을 사용하여 항체 수식 반응을 행하여 IgG 항체 트라스투주맙-아지드 수식체(아지드 수식 항체 20)를 얻었다.
동일한 수법으로 아지드를 탑재한 친화성 펩타이드 시약(화합물 77)을 사용하여 항체 수식 반응을 행하여 IgG 항체 트라스투주맙-아지드 수식체(아지드 수식 항체 21)를 얻었다.
동일한 수법으로 아지드를 탑재한 친화성 펩타이드 시약(화합물 78)을 사용하여 항체 수식 반응을 행하여 IgG 항체 트라스투주맙-아지드 수식체(아지드 수식 항체 22)를 얻었다.
동일한 수법으로 아지드를 탑재한 친화성 펩타이드 시약(화합물 79)을 사용하여 항체 수식 반응을 행하여 IgG 항체 트라스투주맙-아지드 수식체(아지드 수식 항체 23)를 얻었다.
동일한 수법으로 아지드를 탑재한 친화성 펩타이드 시약(화합물 80)을 사용하여 항체 수식 반응을 행하여 IgG 항체 트라스투주맙-아지드 수식체(아지드 수식 항체 24)를 얻었다.
동일한 수법으로 아지드를 탑재한 친화성 펩타이드 시약(화합물 F81)을 사용하여 항체 수식 반응을 행하여 IgG 항체 트라스투주맙-아지드 수식체(아지드 수식 항체 25)를 얻었다.
동일한 수법으로 아지드를 탑재한 친화성 펩타이드 시약(화합물 82)을 사용하여 항체 수식 반응을 행하여 IgG 항체 트라스투주맙-아지드 수식체(아지드 수식 항체 26)를 얻었다.
동일한 수법으로 아지드를 탑재한 친화성 펩타이드 시약(화합물 83)을 사용하여 항체 수식 반응을 행하여 IgG 항체 트라스투주맙-아지드 수식체(아지드 수식 항체 27)를 얻었다.
(6-1-4) 친화성 펩타이드 시약(화합물 66)을 사용한 트라스투주맙 이외의 항체 수식 반응(아지드 수식 항체 28 내지 31)
실시예 5에서 합성한 아지드를 탑재한 친화성 펩타이드 시약(화합물 66)을 N,N'-디메틸포름아미드에 용해하여 2.0mM로 했다. 항TNF-α IgG 항체 아달리무맙(에자이) 200μg을 50mM HEPES 완충액(pH7.2) 1200μL에 용해시키고, 2.0mM의 펩타이드 시약을 항체에 대하여 20몰당량 첨가하여, 25℃에서 16시간 교반했다. 반응액에 10mg/mL의 Lys 수용액을 50μL 첨가하고, 30분 교반함으로써 반응을 정지시켰다. 반응 혼합물을 Protein A(Aspire Protein A Tips, Thermo)로 정제하고, 용출액을 9.57mM PBS 완충액(pH7.0)으로 치환하여 한외 여과(Amicon Ultra, 10K MWCO)에 의해 농축함으로써 IgG 항체 아달리무맙-아지드 수식체를 얻었다(아지드 수식 항체 28)
상기와 동일한 수법으로, 항RANKL IgG 항체 데노수맙(다이이치산쿄)을 사용하여 항체 수식 반응을 행하여, IgG 항체 데노수맙-아지드 수식체(아지드 수식 항체 29)를 얻었다.
상기와 동일한 수법으로, 항IL-4/13 IgG 항체 두필루맙(사노피)을 사용하여 항체 수식 반응을 행하여, IgG 항체 두필루맙-아지드 수식체(아지드 수식 항체 30)를 얻었다.
상기와 동일한 수법으로, 항CD20 IgG 항체 리툭시맙(로슈사)을 사용하여 항체 수식 반응을 행하여, IgG 항체 리툭시맙-아지드 수식체(아지드 수식 항체 31)를 얻었다.
(6-2) IgG 항체 트라스투주맙-아지드 수식체의 환원 조건에서의 ESI-TOFMS 해석에 의한 중쇄 선택성의 확인
(6-2-1) 수식 반응에 화합물 27, 화합물 59를 사용했을 때의 트라스투주맙-아지드 수식체(아지드 수식 항체 1, 2)의 환원 조건에서의 ESI-TOFMS 해석에 의한 중쇄 선택성의 확인
실시예 6의 (6-1-1)에서 합성한 트라스투주맙-아지드 수식체(아지드 수식 항체 1)에 대하여 7mM 트리스(2-카복시에틸)포스핀염산염 용액 2.0μL(항체에 대하여 100등량)를 첨가하여, 실온에서 20분 방치했다. ESI-TOFMS에 의해 질량을 측정한 결과, 컨트롤로서 사용한 원료의 트라스투주맙은 50595, 50757에 중쇄 피크, 23440에 경쇄 피크가 관측되었다. 반응 생성물은 중쇄에 알킬아지드가 도입된 50733, 50895, 및 원료와 동일한 23440에 경쇄 피크가 관측되었다. ESI-TOFMS 해석 결과를 도 5에 나타낸다.
동일한 수법으로, 아지드 수식 항체 2에 대해서도 ESI-TOF MS 해석을 행했다. 컨트롤로서 사용한 원료의 트라스투주맙은 50602, 50764에 중쇄 피크, 23443에 경쇄 피크가 관측되었다. 반응 생성물은 중쇄에 알킬아지드가 도입된 50742, 50904, 및 원료와 동일한 23443에 경쇄 피크가 관측되었다.
(6-2-2) 수식 반응에 화합물 28, 화합물 61을 사용했을 때의 트라스투주맙-아지드 수식체(아지드 수식 항체 3, 4)의 환원 조건에서의 ESI-TOFMS 해석에 의한 중쇄 선택성의 확인
실시예 6의 (6-1-2)에서 합성한 트라스투주맙-아지드 수식체(아지드 수식 항체 3)에 대하여 7mM 트리스(2-카복시에틸)포스핀염산염 용액 2.0μL(항체에 대하여 100등량)을 첨가하여, 실온에서 20분 방치했다. ESI-TOFMS에 의해 질량을 측정한 결과, 컨트롤로서 사용한 원료의 트라스투주맙은 50595, 50757에 중쇄 피크, 23440에 경쇄 피크가 관측되었다. 반응 생성물은 중쇄에 아민 벤조산이 도입된 50714, 50876, 및 원료와 동일한 23440에 경쇄 피크가 관측되었다. 또한, 측정 전 처리의 7mM 트리스(2-카복시에틸)포스핀염의 환원 반응에 의해, 아지드 벤조산 도입체는 환원되어 아민 벤조산 도입체가 되어 있다. ESI-TOFMS 해석 결과를 도 6에 나타낸다.
동일한 수법으로, 아지드 수식 항체 4에 대해서도 ESI-TOF MS 해석을 행했다. 컨트롤로서 사용한 원료의 트라스투주맙은 50597, 50758에 중쇄 피크, 23441에 경쇄 피크가 관측되었다. 반응 생성물은 중쇄에 아민 벤조산이 도입된 50716, 50877, 및 원료와 동일한 23441에 경쇄 피크가 관측되었다.
(6-2-3) 수식 반응에 화합물 29, 화합물 62 내지 83을 사용했을 때의 트라스투주맙-아지드 수식체(아지드 수식 항체 5 내지 27)의 환원 조건에서의 ESI-TOFMS 해석에 의한 중쇄 선택성의 확인
실시예 6의 (6-1-3)에서 합성한 트라스투주맙-아지드 수식체(아지드 수식 항체 5)에 대하여 7mM 트리스(2-카복시에틸)포스핀염산염 용액 2.0μL(항체에 대하여 100등량)를 첨가하여, 실온에서 20분 방치했다. ESI-TOFMS에 의해 질량을 측정한 결과, 컨트롤로서 사용한 원료의 트라스투주맙은 50595, 50757에 중쇄 피크, 23440에 경쇄 피크가 관측되었다. 반응 생성물은 중쇄에 아민 벤조산이 도입된 50714, 50876, 및 원료와 동일한 23440에 경쇄 피크가 관측되었다. 또한, 측정 전 처리로 아지드 벤조산 도입체는 환원되어 아민 벤조산 도입체가 되어 있다.
동일한 수법으로, 아지드 수식 항체 6에 대해서도 ESI-TOF MS 해석을 행했다. 컨트롤로서 사용한 원료의 트라스투주맙은 50594, 5076에 중쇄 피크, 23439에 경쇄 피크가 관측되었다. 반응 생성물은 중쇄에 아민 벤조산이 도입된 50714, 50875, 및 원료와 동일한 23439에 경쇄 피크가 관측되었다. ESI-TOFMS 해석 결과를 도 7에 나타낸다.
동일한 수법으로, 아지드 수식 항체 7에 대해서도 ESI-TOF MS 해석을 행했다. 컨트롤로서 사용한 원료의 트라스투주맙은 50594, 5076에 중쇄 피크, 23439에 경쇄 피크가 관측되었다. 반응 생성물은 중쇄에 아민 벤조산이 도입된 50713, 50875, 및 원료와 동일한 23439에 경쇄 피크가 관측되었다.
동일한 수법으로, 아지드 수식 항체 8에 대해서도 ESI-TOF MS 해석을 행했다. 컨트롤로서 사용한 원료의 트라스투주맙은 50602, 50764에 중쇄 피크, 23443에 경쇄 피크가 관측되었다. 반응 생성물은 중쇄에 아민 벤조산이 도입된 50721, 50883, 및 원료와 동일한 23442에 경쇄 피크가 관측되었다. ESI-TOFMS 해석 결과를 도 8에 나타낸다.
동일한 수법으로, 아지드 수식 항체 9에 대해서도, ESI-TOF MS 해석을 행했다. 컨트롤로서 사용한 원료의 트라스투주맙은 50595, 50757에 중쇄 피크, 23440에 경쇄 피크가 관측되었다. 반응 생성물은 중쇄에 아민 벤조산이 도입된 50714, 50875, 및 원료와 동일한 23440에 경쇄 피크가 관측되었다.
동일한 수법으로, 아지드 수식 항체 10에 대해서도 ESI-TOF MS 해석을 행했다. 컨트롤로서 사용한 원료의 트라스투주맙은 50602, 50764에 중쇄 피크, 23443에 경쇄 피크가 관측되었다. 반응 생성물은 중쇄에 아민 벤조산이 도입된 50721, 50883, 및 원료와 동일한 23443에 경쇄 피크가 관측되었다. ESI-TOFMS 해석 결과를 도 9에 나타낸다.
동일한 수법으로, 아지드 수식 항체 11에 대해서도 ESI-TOF MS 해석을 행했다. 컨트롤로서 사용한 원료의 트라스투주맙은 50595, 50757에 중쇄 피크, 23440에 경쇄 피크가 관측되었다. 반응 생성물은 중쇄에 아민 벤조산이 도입된 50713, 50874, 및 원료와 동일한 23440에 경쇄 피크가 관측되었다.
동일한 수법으로, 아지드 수식 항체 12에 대해서도 ESI-TOF MS 해석을 행했다. 컨트롤로서 사용한 원료의 트라스투주맙은 50595, 50757에 중쇄 피크, 23440에 경쇄 피크가 관측되었다. 반응 생성물은 중쇄에 아민 벤조산이 도입된 50714, 50876, 및 원료와 동일한 23440에 경쇄 피크가 관측되었다.
동일한 수법으로, 아지드 수식 항체 13에 대해서도 ESI-TOF MS 해석을 행했다. 컨트롤로서 사용한 원료의 트라스투주맙은 50594, 50756에 중쇄 피크, 23440에 경쇄 피크가 관측되었다. 반응 생성물은 중쇄에 아민 벤조산이 도입된 50714, 50876, 및 원료와 동일한 23440에 경쇄 피크가 관측되었다.
동일한 수법으로, 아지드 수식 항체 14에 대해서도 ESI-TOF MS 해석을 행했다. 컨트롤로서 사용한 원료의 트라스투주맙은 50594, 50756에 중쇄 피크, 23440에 경쇄 피크가 관측되었다. 반응 생성물은 중쇄에 아민 벤조산이 도입된 50714, 50876, 및 원료와 동일한 23440에 경쇄 피크가 관측되었다.
동일한 수법으로, 아지드 수식 항체 15에 대해서도 ESI-TOF MS 해석을 행했다. 컨트롤로서 사용한 원료의 트라스투주맙은 50594, 50756에 중쇄 피크, 23440에 경쇄 피크가 관측되었다. 반응 생성물은 중쇄에 아민 벤조산이 도입된 50714, 50876, 및 원료와 동일한 23440에 경쇄 피크가 관측되었다.
동일한 수법으로, 아지드 수식 항체 16에 대해서도 ESI-TOF MS 해석을 행했다. 컨트롤로서 사용한 원료의 트라스투주맙은 50594, 50756에 중쇄 피크, 23440에 경쇄 피크가 관측되었다. 반응 생성물은 중쇄에 아민 벤조산이 도입된 50714, 50875, 및 원료와 동일한 23440에 경쇄 피크가 관측되었다.
동일한 수법으로, 아지드 수식 항체 17에 대해서도 ESI-TOF MS 해석을 행했다. 컨트롤로서 사용한 원료의 트라스투주맙은 50595, 50757에 중쇄 피크, 23440에 경쇄 피크가 관측되었다. 반응 생성물은 중쇄에 아민 벤조산이 도입된 50714, 50876, 및 원료와 동일한 23440에 경쇄 피크가 관측되었다.
동일한 수법으로, 아지드 수식 항체 18에 대해서도 ESI-TOF MS 해석을 행했다. 컨트롤로서 사용한 원료의 트라스투주맙은 50594, 50756에 중쇄 피크, 23439에 경쇄 피크가 관측되었다. 반응 생성물은 중쇄에 아민 벤조산이 도입된 50714, 50876, 및 원료와 동일한 23440에 경쇄 피크가 관측되었다.
동일한 수법으로, 아지드 수식 항체 19에 대해서도 ESI-TOF MS 해석을 행했다. 컨트롤로서 사용한 원료의 트라스투주맙은 50595, 50757에 중쇄 피크, 23440에 경쇄 피크가 관측되었다. 반응 생성물은 중쇄에 아민 벤조산이 도입된 50714, 50875, 및 원료와 동일한 23440에 경쇄 피크가 관측되었다.
동일한 수법으로, 아지드 수식 항체 20에 대해서도 ESI-TOF MS 해석을 행했다. 컨트롤로서 사용한 원료의 트라스투주맙은 50595, 50757에 중쇄 피크, 23440에 경쇄 피크가 관측되었다. 반응 생성물은 중쇄에 아민 벤조산이 도입된 50714, 50875, 및 원료와 동일한 23440에 경쇄 피크가 관측되었다.
동일한 수법으로, 아지드 수식 항체 21에 대해서도 ESI-TOF MS 해석을 행했다. 컨트롤로서 사용한 원료의 트라스투주맙은 50595, 50757에 중쇄 피크, 23440에 경쇄 피크가 관측되었다. 반응 생성물은 중쇄에 아민 벤조산이 도입된 50714, 50876, 및 원료와 동일한 23440에 경쇄 피크가 관측되었다.
동일한 수법으로, 아지드 수식 항체 22에 대해서도 ESI-TOF MS 해석을 행했다. 컨트롤로서 사용한 원료의 트라스투주맙은 50595, 50757에 중쇄 피크, 23440에 경쇄 피크가 관측되었다. 반응 생성물은 중쇄에 아민 벤조산이 도입된 50714, 50875, 및 원료와 동일한 23440에 경쇄 피크가 관측되었다.
동일한 수법으로, 아지드 수식 항체 23에 대해서도 ESI-TOF MS 해석을 행했다. 컨트롤로서 사용한 원료의 트라스투주맙은 50597, 50759에 중쇄 피크, 23440에 경쇄 피크가 관측되었다. 반응 생성물은 중쇄에 아민 벤조산이 도입된 50714, 50876, 및 원료와 동일한 23440에 경쇄 피크가 관측되었다.
동일한 수법으로, 아지드 수식 항체 24에 대해서도 ESI-TOF MS 해석을 행했다. 컨트롤로서 사용한 원료의 트라스투주맙은 50597, 50759에 중쇄 피크, 23440에 경쇄 피크가 관측되었다. 반응 생성물은 중쇄에 아민 벤조산이 도입된 50714, 50876, 및 원료와 동일한 23440에 경쇄 피크가 관측되었다.
동일한 수법으로, 아지드 수식 항체 25에 대해서도 ESI-TOF MS 해석을 행했다. 컨트롤로서 사용한 원료의 트라스투주맙은 50597, 50759에 중쇄 피크, 23440에 경쇄 피크가 관측되었다. 반응 생성물은 중쇄에 아민 벤조산이 도입된 50714, 50876, 및 원료와 동일한 23440에 경쇄 피크가 관측되었다.
동일한 수법으로, 아지드 수식 항체 26에 대해서도 ESI-TOF MS 해석을 행했다. 컨트롤로서 사용한 원료의 트라스투주맙은 50597, 50759에 중쇄 피크, 23440에 경쇄 피크가 관측되었다. 반응 생성물은 중쇄에 아민 벤조산이 도입된 50714, 50876, 및 원료와 동일한 23440에 경쇄 피크가 관측되었다.
동일한 수법으로, 아지드 수식 항체 27에 대해서도 ESI-TOF MS 해석을 행했다. 컨트롤로서 사용한 원료의 트라스투주맙은 50602, 50764에 중쇄 피크, 23443에 경쇄 피크가 관측되었다. 반응 생성물은 중쇄에 아민 벤조산이 도입된 50721, 50883, 및 원료와 동일한 23440에 경쇄 피크가 관측되었다.
(6-2-3) 수식 반응 화합물 5를 사용했을 때의 항체-아지드 수식체(아지드 수식 항체 28 내지 31)의 환원 조건에서의 ESI-TOFMS 해석에 의한 중쇄 선택성의 확인
실시예 6의 (6-1-4)에서 합성한 아달리무맙-아지드 수식체(아지드 수식 항체 28)에 대하여 7mM 트리스(2-카복시에틸)포스핀염산염 용액 2.0μL(항체에 대하여 100등량)를 첨가하여, 실온에서 20분 방치했다. ESI-TOFMS에 의해 질량을 측정한 결과, 컨트롤로서 사용한 원료의 아달리무맙은 50645, 50764에 중쇄 피크, 23412에 경쇄 피크가 관측되었다. 반응 생성물은 중쇄에 아민 벤조산이 도입된 50763, 50926, 및 원료와 동일한 23412에 경쇄 피크가 관측되었다. 또한, 측정 전 처리의 7mM 트리스(2-카복시에틸)포스핀염의 환원 반응에 의해, 아지드 벤조산 도입체는 환원되어 아민 벤조산 도입체가 되어 있다(이하 동일). ESI-TOFMS 해석 결과를 도 10에 나타낸다.
동일한 수법으로, 아지드 수식 항체 29(데노수맙-아지드 수식 항체)에 대해서도 ESI-TOF MS 해석을 행했다. 컨트롤로서 사용한 원료의 데노수맙은 50208, 50371에 중쇄 피크, 23487에 경쇄 피크가 관측되었다. 반응 생성물은 중쇄에 아민 벤조산이 도입된 50327, 50490, 및 원료와 동일한 23487에 경쇄 피크가 관측되었다. ESI-TOFMS 해석 결과를 도 11에 나타낸다.
동일한 수법으로, 아지드 수식 항체 30(두필루맙-아지드 수식 항체)에 대해서도 ESI-TOF MS 해석을 행했다. 컨트롤로서 사용한 원료의 두필루맙은 50889에 중쇄 피크, 24022에 경쇄 피크가 관측되었다. 반응 생성물은 중쇄에 아민 벤조산이 도입된 51009, 및 원료와 동일한 24022에 경쇄 피크가 관측되었다. ESI-TOFMS 해석 결과를 도 12에 나타낸다.
동일한 수법으로, 아지드 수식 항체 31(리툭시맙-아지드 수식 항체)에 대해서도 ESI-TOF MS 해석을 행했다. 컨트롤로서 사용한 원료의 리툭시맙은 50515, 50678에 중쇄 피크, 23040에 경쇄 피크가 관측되었다. 반응 생성물은 중쇄에 아민 벤조산이 도입된 50635, 50797, 및 원료와 동일한 23040에 경쇄 피크가 관측되었다(도 13).
[비교예 1: β위에 헤테로 원자를 갖는 펩타이드 시약에 의한 IgG1 Fc의 수식 반응과 ESI-TOFMS에 의한 해석]
실시예 5에서 합성한 β위에 헤테로 원자를 갖는 펩타이드 시약(화합물 26)을 N,N'-디메틸포름아미드에 용해하여 0.22mM로 했다. 항HER2 IgG 항체 트라스투주맙(츄가이 세이야쿠) 200μg을 50mM HEPES 완충액(pH7.2) 1200μL에 용해시켜, 0.22mM의 펩타이드 시약을 120μL(항체에 대하여 20몰당량) 첨가하여, 37도에서 16시간 교반했다. 반응액에 10mg/mL의 Lys 수용액을 50μL 첨가하고, 30분 교반함으로써 반응을 정지시켰다. 이를 한외 여과(Amicon Ultra, 10K MWCO)에 의해 PBS 용액으로 용매 치환한 후, 7mM 트리스(2-카복시에틸)포스핀염산염 용액 2.0μL(항체에 대하여 100등량)를 첨가하여, 실온에서 20분 방치했다. ESI-TOFMS에 의해 질량을 측정한 결과, 컨트롤로서 사용한 원료의 트라스투주맙은 50595, 50757에 중쇄 피크, 23440에 경쇄 피크가 관측되었다. 마찬가지로 반응 생성물도 50595, 50757에 중쇄 피크, 23440에 경쇄 피크가 관측되어, 항체 수식기(친전자기)의 β위에 헤테로 원자를 갖는 화합물 26에서의 항체 수식 반응은 진행되고 있지 않는 것을 확인할 수 있었다.
마찬가지로 β위에 헤테로 원자를 갖는 펩타이드 시약(화합물 60)을 사용하여, 항체 수식 반응을 행했다. ESI-TOFMS에 의해 질량을 측정한 결과, 컨트롤로서 사용한 원료의 트라스투주맙은 50602, 50764에 중쇄 피크, 23443에 경쇄 피크가 관측되었다. 마찬가지로 반응 생성물도 50602, 50764에 중쇄 피크, 23443에 경쇄 피크가 관측되어, β위에 헤테로 원자를 갖는 화합물 60에서의 항체 수식 반응은 진행되고 있지 않는 것을 확인할 수 있었다.
이 결과로부터, 아지드의 위치 선택적 도입 반응 (6-2)에서 화합물 27, 28, 29를 사용했을 때에는 항체의 수식 반응이 진행되고, 화합물 26을 사용했을 때에는 진행되지 않는 것을 알 수 있었다.
[실시예 7: 티올 보호체를 탑재한 항체 수식 시약의 합성]
(7-1) 보호 티올 시약과 친화성 펩타이드의 연결에 의한 항체 수식 시약(화합물 84)의 합성
(3-5-3)에서 합성한 하이드록시말레이미드-친화성 펩타이드체(화합물 57)를 디메틸술폭시드 용매에 녹이고, 3-(아세틸티오)프로피온산(40몰당량), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드염산염(32몰당량), 1-하이드록시벤조트리아졸(32몰당량)을 첨가하고, 2시간 교반했다. 반응 종결을 LC-MS로 확인한 후, 분취 HPLC로 정제했다. 목적물을 포함하는 프렉션을 ESI-MS로 확인한 후, 동결 건조하여 생성물인 아세틸티올-친화성 펩타이드 시약(화합물 84)을 얻었다.
Figure pct00112
화합물 84
(펩타이드 부분의 아미노산 서열: 서열 번호 46)
MS (ESI)m/z:z=2 1217 [M+2H]2+, z=3 812 [M+3H]3+
(7-2) 보호 티올 시약과 친화성 펩타이드의 연결에 의한 항체 수식 시약(화합물 85)의 합성
(3-5-3)에서 합성한 하이드록시말레이미드-친화성 펩타이드체(화합물 57)를 디메틸술폭시드 용매에 녹여, (S)-3-(벤조일티오)-2-메틸프로피온산(40몰당량), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드염산염(32몰당량), 1-하이드록시벤조트리아졸(32몰당량)을 첨가하고, 2시간 교반했다. 반응 종결을 LC-MS로 확인한 후, 분취 HPLC로 정제했다. 목적물을 포함하는 프렉션을 ESI-MS로 확인한 후, 동결 건조하여 생성물인 벤조일티올-친화성 펩타이드 시약(화합물 85)을 얻었다.
Figure pct00113
화합물 85
(펩타이드 부분의 아미노산 서열: 서열 번호 46)
MS (ESI)m/z:z=2 1255 [M+2H]2+, z=3 837 [M+3H]3+
[실시예 8: 티올 보호체 탑재 IgG1 Fc 친화성 펩타이드 시약에 의한 IgG1 Fc의 위치 특이적 수식과 ESI-TOFMS에 의한 해석]
(8-1) 티올 보호체 탑재 IgG1 Fc 친화성 펩타이드 시약에서의 항체 수식 반응
(8-1-1) 친화성 펩타이드 시약(화합물 84)을 사용한 항체 수식 반응
실시예 7에서 합성한 보호 티올을 탑재한 친화성 펩타이드 시약(화합물 84)을 N,N'-디메틸포름아미드에 용해하여 2.0mM로 했다. 항HER2 IgG 항체 트라스투주맙(츄가이 세이야쿠) 200μg을 50mM HEPES 완충액(pH7.2) 200μL에 용해시켜, 2.0mM의 펩타이드 시약을 항체에 대하여 20몰당량 첨가하여, 25도에서 3시간 교반했다. 반응액을 한외 여과(Amicon Ultra, 10k MWCO)에 의해 농축함으로써 IgG 항체 트라스투주맙-보호 티올 수식체를 얻었다.
(8-1-2) 친화성 펩타이드 시약(화합물 85)을 사용한 항체 수식 반응
실시예 7에서 합성한 보호 티올을 탑재한 친화성 펩타이드 시약(화합물 85)을 N,N'-디메틸포름아미드에 용해하여 2.0mM로 했다. 항HER2 IgG 항체 트라스투주맙(츄가이 세이야쿠) 200μg을 50mM HEPES 완충액(pH7.2) 200μL에 용해시켜, 2.0mM의 펩타이드 시약을 항체에 대하여 20몰당량 첨가하여, 25℃에서 3시간 교반했다. 반응액을 한외 여과(Amicon Ultra, 10k MWCO)에 의해 농축함으로써 IgG 항체 트라스투주맙-보호 티올 수식체를 얻었다.
(8-2) IgG 항체 트라스투주맙-보호 티올 수식체의 환원 조건에서의 ESI-TOFMS 해석에 의한 중쇄 선택성의 확인
(8-2-1) 수식 반응에 친화성 펩타이드 시약(화합물 84)을 사용했을 때의 트라스투주맙-아지드 수식체의 환원 조건에서의 ESI-TOFMS 해석에 의한 중쇄 선택성의 확인
(8-1-1)에서 합성한 트라스투주맙-보호 티올 수식체에 대하여 7mM 트리스(2-카복시에틸)포스핀염산염 용액 2.0μL(항체에 대하여 100등량)를 첨가하여, 실온에서 20분 방치했다. ESI-TOFMS에 의해 질량을 측정한 결과, 컨트롤로서 사용한 원료의 트라스투주맙은 50594, 50756에 중쇄 피크, 23439에 경쇄 피크가 관측되었다. 반응 생성물은 중쇄에 아세틸 보호 티올기가 도입된 50723, 50885, 및 원료와 동일한 23439에 경쇄 피크가 관측되었다. ESI-TOFMS 해석 결과를 도 14에 나타낸다.
(8-2-2) 수식 반응에 친화성 펩타이드 시약(화합물 3)을 사용했을 때의 트라스투주맙-보호 티올체의 환원 조건에서의 ESI-TOFMS 해석에 의한 중쇄 선택성의 확인
(8-1-2)에서 합성한 트라스투주맙-보호 티올 수식체에 대하여 7mM 트리스(2-카복시에틸)포스핀염산염 용액 2.0μL(항체에 대하여 100등량)를 첨가하여, 실온에서 20분 방치했다. ESI-TOFMS에 의해 질량을 측정한 결과, 컨트롤로서 사용한 원료의 트라스투주맙은 50594, 50756에 중쇄 피크, 23439에 경쇄 피크가 관측되었다. 반응 생성물은 중쇄에 벤조일 보호 티올기가 도입된 50800, 50962, 및 원료와 동일한 23439에 경쇄 피크가 관측되었다.
(8-3) IgG 항체 트라스투주맙-티올 수식체의 생성 확인
(8-3-1) IgG 항체 트라스투주맙-아세틸 보호 티올 수식체의 탈보호
(8-2-1)에서 얻은, IgG 항체 트라스투주맙-아세틸 보호 티올 수식체를 20mM 에틸렌디아민, 0.5M 하이드록실아민 수용액(pH6 조제품)으로 치환하여, 실온에서 1시간 정치했다. 반응액을 한외 여과(Amicon Ultra, 10k MWCO)에 의해 농축함으로써 IgG 항체 트라스투주맙-티올 수식체를 얻었다.
(8-3-2) ESI-TOFMS 해석에 의한 IgG 항체 트라스투주맙-티올 수식체의 생성 확인
(8-3-1)에서 탈보호한 트라스투주맙-티올 수식체에 대하여 7mM 트리스(2-카복시에틸)포스핀염산염 용액 2.0μL(항체에 대하여 100등량)를 첨가하여, 실온에서 20분 방치했다. ESI-TOFMS에 의해 질량을 측정한 결과, 반응 생성물은 중쇄에 아세틸기가 탈보호된 50681, 50844가 관측되고, 아세틸기가 빠져서 티올이 되어 있는 것을 확인할 수 있었다. ESI-TOFMS 해석 결과를 도 15에 나타낸다.
(8-3-3) IgG 항체 트라스투주맙-벤조일 보호 티올 수식체의 탈보호
(8-2-2)에서 얻은, IgG 항체 항체 트라스투주맙-벤조일 보호 티올 수식체를 20mM 에틸렌디아민, 0.5M 하이드록실아민 수용액(pH6 조제품)으로 치환하여, 실온에서 1시간 정치했다. 반응액을 한외 여과(Amicon Ultra, 10k MWCO)에 의해 농축함으로써 각각의 IgG 항체 트라스투주맙-티올 수식체를 얻었다.
(8-3-4) ESI-TOFMS 해석에 의한 IgG 항체 트라스투주맙-티올 수식체의 생성 확인
(8-3-3)에서 탈보호한 트라스투주맙-티올 수식체에 대하여 7mM 트리스(2-카복시에틸)포스핀염산염 용액 2.0μL(항체에 대하여 100등량)를 첨가하여, 실온에서 20분 방치했다. ESI-TOFMS에 의해 질량을 측정한 결과, 반응 생성물은 중쇄에 벤조일기가 탈보호된 50696, 50858이 관측되고 벤조일기가 빠져서 티올이 되어 있는 것을 확인할 수 있었다.
[실시예 9: IgG1 Fc 친화성 펩타이드 시약에 의한 IgG1 Fc의 다른 복수 표적 영역의 위치 선택적 수식과 ESI-TOFMS에 의한 해석]
(9-1) 2종류의 친화성 펩타이드 시약을 단계적으로 사용한 다른 복수 표적 영역의 위치 선택적 수식 ESI-TOFMS에 의한 해석
(9-1-1) 2종류의 친화성 펩타이드 시약(화합물 66, 화합물 64)을 단계적으로 사용한 복수 개소 위치 특이적 항체 수식 반응
실시예 5에서 합성한 아지드를 탑재한 친화성 펩타이드 시약(화합물 66)을 N,N'-디메틸포름아미드에 용해하여 2.04mM로 했다. 항HER2 IgG 항체 트라스투주맙(츄가이 세이야쿠) 300μg을 50mM 아세트산나트륨 완충액(pH4.7) 300μL에 용해시키고, 2.04mM의 펩타이드 시약을 항체에 대하여 20몰당량 첨가하여, 25도에서 3시간 교반했다. 한외 여과(Amicon Ultra, 10k MWCO)에 의해 펩타이드 시약 잔사를 제거하고, 얻어진 농축액을 50mM HEPES 완충액(pH7.2) 200μL로 희석했다. 여기에, 실시예 5에서 합성한 아지드를 탑재한 친화성 펩타이드 시약(화합물 64)의 2.0mM N,N'-디메틸포름아미드 용액을 항체에 대하여 20몰당량 첨가하여, 37도에서 16시간 교반했다. 반응액에 10mg/mL의 Lys 수용액을 50μL 첨가하고, 30분 교반함으로써 반응을 정지시켰다. 한외 여과(Amicon Ultra, 10k MWCO)에 의해 농축함으로써 IgG 항체 트라스투주맙-아지드 수식체를 얻었다.
(9-1-2) IgG 항체 트라스투주맙-아지드 수식체의 환원 조건에서의 ESI-TOFMS 해석에 의한 중쇄 선택성의 확인
실시예 9의 (9-1-1)에서 합성한 트라스투주맙-아지드 수식체에 대하여 7mM 트리스(2-카복시에틸)포스핀염산염 용액 2.0μL(항체에 대하여 100등량)를 첨가하여, 실온에서 20분 방치했다. ESI-TOFMS에 의해 질량을 측정한 결과, 컨트롤로서 사용한 원료의 트라스투주맙은 50602, 50764에 중쇄 피크, 23443에 경쇄 피크가 관측되었다. 반응 생성물은 중쇄에 두 아민 벤조산이 도입된 50841, 51002가 관측되었다. 경쇄 피크는 원료와 동일한 23443이 관측되었다. 또한, 측정 전 처리로 아지드 벤조산 도입체는 환원되어 아민 벤조산 도입체로 되어 있다. ESI-TOFMS 해석 결과를 도 16에 나타낸다.
(9-1-3) 2종류의 친화성 펩타이드 시약(화합물 64, 화합물 66)을 단계적으로 사용한 다른 복수 표적 영역의 위치 선택적 수식 반응
실시예 5에서 합성한 아지드를 탑재한 친화성 펩타이드 시약(화합물 64)을 N,N'-디메틸포름아미드에 용해하여 2.0mM로 했다. 항HER2 IgG 항체 트라스투주맙(츄가이 세이야쿠) 300μg을 50mM HEPES 완충액(pH7.2) 300μL에 용해시키고, 2.0mM의 펩타이드 시약을 항체에 대하여 20몰당량 첨가하여, 37도에서 16시간 교반했다. 한외 여과(Amicon Ultra, 10k MWCO)에 의해 펩타이드 시약 잔사를 제거하고, 얻어진 농축액을 50mM 아세트산나트륨 완충액(pH4.7) 200μL로 희석했다. 여기에, 실시예 5에서 합성한 아지드를 탑재한 친화성 펩타이드 시약(화합물 66)의 2.04mM N,N'-디메틸포름아미드 용액을 항체에 대하여 20몰당량 첨가하여, 37도에서 16시간 교반했다. 반응액에 10mg/mL의 Lys 수용액을 50μL 첨가하여, 30분 교반함으로써 반응을 정지시켰다. 한외 여과(Amicon Ultra, 10k MWCO)에 의해 농축함으로써 IgG 항체 트라스투주맙-아지드 수식체를 얻었다.
(9-1-4) IgG 항체 트라스투주맙-아지드 수식체의 환원 조건에서의 ESI-TOFMS 해석에 의한 중쇄 선택성의 확인
실시예 9의 (9-1-2)와 동일한 방법으로 ESI-TOFMS에 의해 질량을 측정했다. 컨트롤로서 사용한 원료의 트라스투주맙은 50602, 50764에 중쇄 피크, 23443에 경쇄 피크가 관측되었다. 반응 생성물은 중쇄에 두 아민 벤조산이 도입된 50840, 51002가 관측되었다. 경쇄 피크는 원료와 동일한 23443이 관측되었다. 또한, 측정 전 처리로 아지드 벤조산 도입체는 환원되어 아민 벤조산 도입체로 되어 있다.
(9-1-5) 2종류의 친화성 펩타이드 시약(화합물 84, 화합물 64)을 단계적으로 사용한 복수 개소 위치 특이적 항체 수식 반응
실시예 7에서 합성한 티올 보호체를 탑재한 친화성 펩타이드 시약(화합물 84)을 N,N'-디메틸포름아미드에 용해하여 2.04mM로 했다. 항HER2 IgG 항체 트라스투주맙(츄가이 세이야쿠) 300μg을 50mM 아세트산나트륨 완충액(pH4.7) 300μL에 용해시키고, 2.04mM의 펩타이드 시약을 항체에 대하여 20몰당량 첨가하여, 25도에서 3시간 교반했다. 한외 여과(Amicon Ultra, 10k MWCO)에 의해 펩타이드 시약 잔사를 제거하고, 얻어진 농축액을 50mM HEPES 완충액(pH7.2) 200μL로 희석했다. 여기에, 실시예 5에서 합성한 아지드를 탑재한 친화성 펩타이드 시약(화합물 64)의 2.0mM N,N'-디메틸포름아미드 용액을 항체에 대하여 20몰당량 첨가하여, 37도에서 16시간 교반했다. 반응액에 10mg/mL의 Lys 수용액을 50μL 첨가하고, 30분 교반함으로써 반응을 정지시켰다. 한외 여과(Amicon Ultra, 10k MWCO)에 의해 농축함으로써 IgG 항체 트라스투주맙-아지드 수식체를 얻었다.
(9-1-6) IgG 항체 트라스투주맙-아지드-티올 수식체의 환원 조건에서의 ESI-TOFMS 해석에 의한 중쇄 선택성의 확인
(9-1-5)에서 합성한 IgG 항체 트라스투주맙-아지드 수식체에 대하여, 실시예 9의 (9-1-2)와 동일한 방법으로 ESI-TOFMS에 의해 질량을 측정했다. 컨트롤로서 사용한 원료의 트라스투주맙은 50597, 50757에 중쇄 피크, 23439에 경쇄 피크가 관측되었다. 반응 생성물은 중쇄에 아민 벤조산과 아세틸 보호 티올기가 도입된 50843, 51005가 관측되었다. 경쇄 피크는 원료와 동일한 23443이 관측되었다. 또한, 측정 전 처리에서 아지드 벤조산 도입체는 환원되어 아민 벤조산 도입체로 되어 있다. ESI-TOFMS 해석 결과를 도 17에 나타낸다.
(9-2) 복수 유도화 부위를 갖는 친화성 펩타이드를 사용한 다른 복수 표적 영역의 위치 선택적 수식과 ESI-TOFMS에 의한 해석
(9-2-1) 복수 유도화 부위를 갖는 친화성 펩타이드(화합물 86)의 합성
실시예 1에서 합성한 항체 친화성 펩타이드(화합물 54)를 디메틸술폭시드에 용해시키고, 2-이미노티오란염산염(10몰당량), 디이소프로필에틸아민(15몰당량)을 첨가하고, 1시간 교반했다. 원료 소실을 LC-MS로 확인한 후, N-하이드록시말레이미드(20몰당량)의 디메틸술폭시드 용액을 첨가하여, 1시간 교반했다. 반응 진행을 LC-MS로 확인한 후, 4-아지드 벤조산(40몰당량), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드염산염(32몰당량), 1-하이드록시벤조트리아졸(32몰당량)을 첨가하고, 2시간 교반했다. 반응 종결을 LC-MS로 확인한 후, 분취 HPLC로 정제했다. 목적물을 포함하는 프렉션을 ESI-MS로 확인한 후, 동결 건조하여 생성물인 디(아지드-페닐)-친화성 펩타이드 시약(화합물 86)을 얻었다.
Figure pct00114
화합물 86
(펩타이드 부분의 아미노산 서열: 서열 번호 100)
MS (ESI)m/z:z=3 1587 [M+3H]3+, 3 1191 [M+4H]4+
(9-2-2) 복수 유도화 부위를 갖는 친화성 펩타이드를 사용한 복수 개소 위치 특이적 항체 수식 반응
실시예 9의 (9-2-1)에서 합성한 디(아지드-페닐)-친화성 펩타이드 시약(화합물 86)을 N,N'-디메틸포름아미드에 용해하여 2.0mM로 했다. 항HER2 IgG 항체 트라스투주맙(츄가이 세이야쿠) 250μg을 50mM HEPES 완충액(pH7.2) 250μL에 용해시켜, 2.0mM의 펩타이드 시약을 항체에 대하여 20몰당량 첨가하여, 25도에서 3시간 교반했다. 반응액을 한외 여과(Amicon Ultra, 10k MWCO)에 의해 농축함으로써 IgG 항체 트라스투주맙-아지드 수식체를 얻었다.
(9-2-3) IgG 항체 트라스투주맙-아지드 수식체의 환원 조건에서의 ESI-TOFMS 해석에 의한 중쇄 선택성의 확인
실시예 9의 (9-2-2)에서 합성한 트라스투주맙-아지드 수식체에 대하여 7mM 트리스(2-카복시에틸)포스핀염산염 용액 2.0μL(항체에 대하여 100등량)를 첨가하여, 실온에서 20분 방치했다. ESI-TOFMS에 의해 질량을 측정한 결과, 컨트롤로서 사용한 원료의 트라스투주맙은 50602, 50764에 중쇄 피크, 23443에 경쇄 피크가 관측되었다. 반응 생성물은 중쇄에 두 아민 벤조산이 도입된 50841, 51003이 관측되었다. 경쇄 피크는 원료와 동일한 23443이 관측되었다. 또한, 측정 전 처리에서 아지드 벤조산 도입체는 환원되어 아민 벤조산 도입체로 되어 있다. ESI-TOFMS 해석 결과를 도 18에 나타낸다.
[실시예 10: 트라스투주맙의 위치 특이적 아지드 도입체와 임의의 화합물과의 콘쥬게이션 및 생성물의 ESI-TOFMS 해석]
(10-1) 트라스투주맙의 위치 특이적 아지드 도입체와 Cy3-사이클로알킨과의 콘쥬게이션
(10-1-1) 트라스투주맙의 위치 특이적 아지드 도입체와 Cy3-DBCO와의 콘쥬게이션 및 ESI-TOFMS 해석
실시예 6의 (6-1-2)에서 합성한 트라스투주맙의 아지드 벤조산 도입체를 20mM PBS 완충액에 용해하여 0.3mM로 한 후, Sigma Aldrich 제조 Dibenzocyclooctyne-Cy3(0.94mM, 디메틸술폭시드에 용해)를 20μL 첨가하여, 실온에서 12시간 교반했다. 반응액을 한외 여과(Amicon Ultra, 10K MWCO)에 의해 물치환하여 반응을 정지했다. ESI-TOFMS에 의해 질량을 측정한 결과, 트라스투주맙은 148060에 피크가 관측되고, (6-1-2)에서 합성한 트라스투주맙의 아지드 도입체는 148489에 피크가 관측되고, 반응 생성물은 Cy3가 둘 도입된 150487에 피크가 관측되었다(도 19).
(10-1-2) 환원 조건에서의 ESI-TOFMS 해석
(10-1-1)에서 합성한 트라스투주맙-Cy3 복합체의 PBS 용액에 7mM 트리스(2-카복시에틸)포스핀염산염 용액 2μL(트라스투주맙-Cy3 복합체에 대하여 100등량)를 첨가하여, 실온에서 20분 교반했다. ESI-TOFMS에 의해 질량을 측정한 결과, 원료 인 실시예 6의 (6-1-1)에서 합성한 트라스투주맙의 아지드 도입체는 50714 및 50876에 중쇄 피크, 23440에 경쇄 피크가 관측되고, 트라스투주맙-Cy3 복합체는 중쇄에 Cy3가 도입된 51722 및 51885에 피크가 관측되고, 원료와 동일한 23440에 경쇄 피크가 관측되었다(도 20). 또한, 측정 전 처리의 7mM 트리스(2-카복시에틸)포스핀염의 환원 반응에 의해, 아지드 벤조산 도입체는 환원되어 아민 벤조산 도입체로 되어 있다.
(10-2) 트라스투주맙의 위치 특이적 아지드 도입체와 펩타이드-사이클로알킨과의 콘쥬게이션
(10-2-1) 펩타이드-사이클로알킨의 합성
하기의 화합물 30의 펩타이드 부분을 Fmoc법에 의한 2-클로로트리틸레진을 사용한 펩타이드 고상 합성에 의해서 합성했다. 고상 합성 후, 1-하이드록시벤조트리아졸(2몰당량), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드염산염(2몰당량), 트리에틸아민(2몰당량), 5-(5,6-디하이드로-11,12-디데하이드로디벤조[b, f][b, f]아조신-5(6H)-일)-옥소펜탄산(2.2몰당량)을 수시 첨가하여, 19시간 교반했다. 트리플루오로아세트산:물:트리이소프로필실란=95:2.5:2.5의 용액에서 1시간 교반함으로써 수지로부터의 잘라냄과 탈보호를 행하여, 잘라낸 후의 여과액에는 트리에틸아민을 첨가하여 중화했다. 수지를 필터레이션에 의해 제거하고, 디에틸에테르를 첨가하여 침전을 행하고, 디에틸에테르를 데칸테이션 함으로써 제거하고, 펩타이드를 조결정으로 해서 얻었다. 이를 분취 HPLC로 정제하여, 생성물인 하기 화합물 30을 얻었다.
Figure pct00115
화합물 30
(펩타이드 부분의 아미노산 서열: 서열 번호 50)
MS (ESI) m/z:1200[M+H]+
(10-2-2) 트라스투주맙의 위치 특이적 아지드 도입체와 펩타이드-사이클로알킨과의 콘쥬게이션 및 ESI-TOFMS 해석
실시예 6의 (6-1-2)에서 합성한 트라스투주맙의 아지드 벤조산 도입체를 20mM PBS 완충액에 용해하여 0.3mM로 한 후, 실시예 7의 (7-2-1)에서 합성한 펩타이드-사이클로알킨(화합물 29) 0.94mM 수용액을 20μL 첨가하여, 실온에서 12시간 교반했다. 반응액을 한외 여과(Amicon Ultra, 10K MWCO)에 의해 물치환하여 반응을 정지했다. ESI-TOFMS에 의해 질량을 측정한 결과, 트라스투주맙은 148060에 피크가 관측되고, (6-1-2)에서 합성한 트라스투주맙의 아지드 도입체는 148489에 피크가 관측되고, 반응 생성물은 펩타이드가 둘 도입된 150912에 피크가 관측되었다(도 21).
(10-2-3) 환원 조건에서의 ESI-TOFMS 해석
(10-2-2)에서 합성한 트라스투주맙-펩타이드 복합체의 PBS 용액에 7mM 트리스(2-카복시에틸)포스핀염산염 용액 2μL(트라스투주맙-펩타이드 복합체에 대하여 100등량)를 첨가하여, 실온에서 20분 교반했다. ESI-TOFMS에 의해 질량을 측정한 결과, 원료인 실시예 6의 (6-1-1)에서 합성한 트라스투주맙의 아지드 도입체는 50714 및 50876에 중쇄 피크, 23440에 경쇄 피크가 관측되고, 트라스투주맙-펩타이드 복합체는 중쇄에 펩타이드가 도입된 51941 및 52102에 피크가 관측되고, 원료와 동일한 23440에 경쇄 피크가 관측되었다(도 22). 또한, 측정 전 처리의 7mM 트리스(2-카복시에틸)포스핀염의 환원 반응에 의해, 아지드 벤조산 도입체는 환원되어 아민 벤조산 도입체로 되어 있다.
(10-3) 트라스투주맙의 위치 특이적 티올 도입체와 말레이미드 화합물과의 콘쥬게이션 및 ESI-TOFMS 해석
(10-3-1) 트라스투주맙의 위치 특이적 티올 도입체와 말레이미드 화합물과의 콘쥬게이션 및 ESI-TOFMS 해석
실시예 8의 (8-3-1)에서 합성한 트라스투주맙의 티올 도입체를 20mM PBS 완충액에 용해하여 0.3mM로 한 후, m-dPEG(등록 상표)24-MAL을 5몰당량 첨가하여, 실온에서 12시간 교반했다. 반응액을 한외 여과(Amicon Ultra, 10k MWCO)에 의해 처리했다. ESI-TOFMS에 의해 질량을 측정한 결과, 트라스투주맙은 14822에 피크가 관측되고, (8-3-3)에서 합성한 트라스투주맙의 티올 도입체는 148243에 피크가 관측되고, 반응 생성물은 m-dPEG(등록 상표)24-MAL이 둘 도입된 150880에 피크가 관측되었다(도 23).
(10-3-2) 환원 조건에서의 ESI-TOFMS 해석
(10-3-1)에서 합성한 트라스투주맙-페그 복합체의 PBS 용액에 7mM 트리스(2-카복시에틸)포스핀염산염 용액 2μL(트라스투주맙-페그 복합체에 대하여 100등량)를 첨가하여, 실온에서 20분 교반했다. ESI-TOFMS에 의해 질량을 측정한 결과, 원료인 실시예 8의 (8-3-3)에서 합성한 트라스투주맙의 티올 도입체는 50682 및 50844에 중쇄 피크, 23449에 경쇄 피크가 관측되고, 반응 생성물은 중쇄에 m-dPEG(등록 상표)24-MAL이 도입된 51922 및 52083에 피크가 관측되고, 원료와 동일한 23449에 경쇄 피크가 관측되었다(도 24).
[실시예 11: 트라스투주맙의 생체 직교성 관능기 도입체의 위치 특이적 수식의 확인]
(11-1) 트라스투주맙의 생체 직교성 관능기 도입체의 당쇄 절단
(11-1-1) 트라스투주맙의 아지드 벤조산 도입체의 당쇄 절단 (1)
실시예 6의 (6-1-2)에서 합성한 트라스투주맙의 아지드 벤조산 도입체(아지드 수식 항체 3)를 PNGase F(NEW ENGLAND BioLabs, 카탈로그 번호 P0704)를 사용하여, 제조자 프로토콜 및 특허(WO2017/191817)의 수법에 따라, 당쇄의 절단과 후처리를 행했다.
(11-1-2) 트라스투주맙의 아지드 벤조산 도입체의 당쇄 절단 (2)
실시예 6의 (6-1-3)에서 합성한 트라스투주맙의 아지드 벤조산 도입체(아지드 수식 항체 5)를 PNGase F(NEW ENGLAND BioLabs, 카탈로그 번호 P0704)를 사용하여, 제조자 프로토콜 및 특허(WO2017/191817)의 수법에 따라, 당쇄의 절단과 후처리를 행했다.
(11-1-3) 트라스투주맙의 말레이미드 도입체의 당쇄 절단 (3) (K246/248)
실시예 4의 (4-5-1)에서 합성한 트라스투주맙의 말레이미드 도입체를 3-머캅토프로피온산(20몰당량) 존재 하, PNGase F(NEW ENGLAND BioLabs, 카탈로그 번호 P0704)를 사용하여, 제조자 프로토콜 및 특허(WO2017/19181757)의 수법에 따라, 당쇄의 절단과 후처리를 행했다.
(11-1-4) 트라스투주맙의 알킬아지드 도입체의 당쇄 절단 (4) (K246/248)
실시예 6의 (6-1-1)에서 합성한 트라스투주맙의 알킬아지드 도입체(아지드 수식 항체 2)를 PNGase F(NEW ENGLAND BioLabs, 카탈로그 번호 P0704)를 사용하여, 제조자 프로토콜 및 특허(WO2017/19181757)의 수법에 따라, 당쇄의 절단과 후처리를 행했다.
(11-1-5) 트라스투주맙의 아지드 벤조산 도입체의 당쇄 절단 (5) (K317)
실시예 6의 (6-1-3)에서 합성한 트라스투주맙의 아지드 벤조산 도입체(아지드 수식 항체 6)를 PNGase F(NEW ENGLAND BioLabs, 카탈로그 번호 P0704)를 사용하여, 제조자 프로토콜 및 특허(WO2017/19181757)의 수법에 따라, 당쇄의 절단과 후처리를 행했다.
(11-1-6) 트라스투주맙의 아지드 벤조산 도입체의 당쇄 절단 (6) (K288/290)
실시예 6의 (6-1-3)에서 합성한 트라스투주맙의 아지드 벤조산 도입체(아지드 수식 항체 8)를 PNGase F(NEW ENGLAND BioLabs, 카탈로그 번호 P0704)를 사용하여, 제조자 프로토콜 및 특허(WO2017/19181757)의 수법에 따라, 당쇄의 절단과 후처리를 행했다.
(11-1-7) 트라스투주맙의 아지드 벤조산 도입체의 당쇄 절단 (7) (K246/248)
실시예 6의 (6-1-3)에서 합성한 트라스투주맙의 아지드 벤조산 도입체(아지드 수식 항체 10)를 PNGase F(NEW ENGLAND BioLabs, 카탈로그 번호 P0704)를 사용하여, 제조자 프로토콜 및 특허(WO2017/19181757)의 수법에 따라, 당쇄의 절단과 후처리를 행했다.
(11-1-8) 트라스투주맙의 아세틸 보호 티올 도입체의 당쇄 절단 (8) (K246/248)
실시예 8의 (8-1-3)에서 합성한 트라스투주맙의 아세틸 보호 티올 도입체를 PNGase F(NEW ENGLAND BioLabs, 카탈로그 번호 P0704)를 사용하여, 제조자 프로토콜 및 특허(WO2017/19181757)의 수법에 따라, 당쇄의 절단과 후처리를 행했다.
(11-1-9) 트라스투주맙의 아지드 벤조산 복수 표적 영역 도입체의 당쇄 절단 (9)
실시예 9의 (9-1-3)에서 합성한 트라스투주맙의 아지드 벤조산 복수 표적 영역 도입체를 PNGase F(NEW ENGLAND BioLabs, 카탈로그 번호 P0704)를 사용하여, 제조자 프로토콜 및 특허(WO2017/19181757)의 수법에 따라, 당쇄의 절단과 후처리를 행했다.
(11-1-10) 트라스투주맙의 아지드-티올 복수 표적 영역 도입체의 당쇄 절단 (10)
실시예 9의 (9-1-4)에서 합성한 트라스투주맙의 아지드-티올 복수 표적 영역 도입체를 PNGase F(NEW ENGLAND BioLabs, 카탈로그 번호 P0704)를 사용하여, 제조자 프로토콜 및 특허(WO2017/19181757)의 수법에 따라, 당쇄의 절단과 후처리를 행했다.
(11-1-11) 데노수맙의 아지드 벤조산 복수 표적 영역 도입체의 당쇄 절단 (11)
실시예 6의 (6-1-4)에서 합성한 데노수맙의 아지드 벤조산 도입체(아지드 수식 항체 29)를 PNGase F(NEW ENGLAND BioLabs, 카탈로그 번호 P0704)를 사용하여, 제조자 프로토콜 및 특허(WO2017/19181757)의 수법에 따라, 당쇄의 절단과 후처리를 행했다.
(11-1-12) 두필루맙의 아지드 벤조산 복수 표적 영역 도입체의 당쇄 절단 (12)
실시예 6의 (6-1-4)에서 합성한 두필루맙의 아지드 벤조산 도입체(아지드 수식 항체 30)를 PNGase F(NEW ENGLAND BioLabs, 카탈로그 번호 P0704)를 사용하여, 제조자 프로토콜 및 특허(WO2017/19181757)의 수법에 따라, 당쇄의 절단과 후처리를 행했다.
(11-2) 트라스투주맙의 아지드 벤조산 도입체의 트립신 처리
(11-2-1) 트라스투주맙의 아지드 벤조산 도입체의 당쇄 절단물의 트립신 처리 (1)
1.5mL 저흡착 마이크로 테스트 튜브에 (11-1-1)에서 얻은 트라스투주맙의 아지드 벤조산 도입체의 당쇄 절단물의 샘플 용액을 3.4μL, 50mM 탄산수소암모늄 완충액을 6.6μL 첨가하여 계(計) 10μL로 하고, 50mM 탄산수소암모늄 완충액, 20% 트리플루오로에탄올에 용해한 20mM의 디티오스레이톨 수용액 10μL를 첨가하여 65℃에서 1시간 가온 후, 50mM의 요오드아세트아미드 수용액 10μL를 첨가하고, 차광 하 실온에서 30분간 300rpm으로 진탕하여 반응시켰다. 반응 후, 50mM 탄산수소암모늄 완충액을 40μL 첨가하여 교반하고, 20ng/μL의 트립신 수용액을 10μL 첨가하여 37℃에서 18시간 효소 소화했다. 소화 후, 20% 트리플루오로아세트산 수용액을 2μL 첨가하여 반응을 멈췄다. 그 후, 50mM 탄산수소암모늄 완충액, 0.5% 트리플루오로아세트산을 사용하여 10배 희석하여, LC-MS/MS 측정에 사용했다.
(11-2-2) 트라스투주맙의 아지드 벤조산 도입체의 당쇄 절단물의 트립신 처리 (2)
1.5mL 저흡착 마이크로 테스트 튜브에 (11-1-2)에서 얻은 트라스투주맙의 아지드 벤조산 도입체의 당쇄 절단물의 샘플 용액을 10μL, 50mM 탄산수소암모늄 완충액, 20% 트리플루오로에탄올에 용해한 20mM의 디티오스레이톨 수용액 10μL를 첨가하여 65℃에서 1시간 가온 후, 50mM의 요오드아세트아미드 수용액 10μL를 첨가하고, 차광 하 실온에서 30분간 300rpm으로 진탕하여 반응시켰다. 반응 후, 50mM 탄산수소암모늄 완충액을 40μL 첨가하여 교반하고, 20ng/μL의 트립신 용액을 10μL 첨가하여 37℃에서 18시간 효소 소화했다. 소화 후, 20% 트리플루오로아세트산 수용액을 2μL 첨가하여 반응을 멈췄다. 그 후, 50mM 탄산수소암모늄 완충액, 0.5% 트리플루오로아세트산을 사용하여 10배 희석하여, LC-MS/MS 측정에 사용했다.
(11-2-3) 트라스투주맙의 말레이미드 도입체의 당쇄 절단물의 트립신 처리 (3)
1.5mL 저흡착 마이크로 테스트 튜브에 (11-1-3)에서 얻은 트라스투주맙의 말레이미드 도입체의 당쇄 절단물의 샘플 용액을 10μL 첨가하고, 11-2-1과 동일한 처리를 행하여 LC-MS/MS 측정용 샘플을 얻었다.
(11-2-4) 트라스투주맙의 알킬아지드 도입체의 당쇄 절단물의 트립신 처리 (4)
1.5mL 저흡착 마이크로 테스트 튜브에 (11-1-4)에서 얻은 트라스투주맙의 알킬아지드 도입체의 당쇄 절단물의 샘플 용액을 10μL 첨가하고, 11-2-1과 동일한 처리를 행하여 LC-MS/MS 측정용 샘플을 얻었다.
(11-2-5) 트라스투주맙의 아지드 벤조산 도입체의 당쇄 절단물의 트립신 처리 (5)
1.5mL 저흡착 마이크로 테스트 튜브에 (11-1-5)에서 얻은 트라스투주맙의 아지드 벤조산 도입체의 당쇄 절단물의 샘플 용액을 10μL 첨가하고, 11-2-1과 동일한 처리를 행하여 LC-MS/MS 측정용 샘플을 얻었다.
(11-2-6) 트라스투주맙의 아지드 벤조산 도입체의 당쇄 절단물의 트립신 처리 (6)
1.5mL 저흡착 마이크로 테스트 튜브에 (11-1-6)에서 얻은 트라스투주맙의 아지드 벤조산 도입체의 당쇄 절단물의 샘플 용액을 10μL 첨가하고, 11-2-1과 동일한 처리를 행하여 LC-MS/MS 측정용 샘플을 얻었다.
(11-2-7) 트라스투주맙의 아지드 벤조산 도입체의 당쇄 절단물의 트립신 처리 (7)
1.5mL 저흡착 마이크로 테스트 튜브에 (11-1-7)에서 얻은 트라스투주맙의 아지드 벤조산 도입체의 당쇄 절단물의 샘플 용액을 10μL 첨가하고, 11-2-1과 동일한 처리를 행하여 LC-MS/MS 측정용 샘플을 얻었다.
(11-2-8) 트라스투주맙의 아세틸티올 도입체의 당쇄 절단물의 트립신 처리 (8)
1.5mL 저흡착 마이크로 테스트 튜브에 (11-1-8)에서 얻은 트라스투주맙의 아세틸티올 도입체의 당쇄 절단물의 샘플 용액을 10μL 첨가하고, 11-2-1과 동일한 처리를 행하여 LC-MS/MS 측정용 샘플을 얻었다.
(11-2-9) 트라스투주맙의 아지드 벤조산 도입체의 당쇄 절단물의 트립신 처리 (9)
1.5mL 저흡착 마이크로 테스트 튜브에 (11-1-9)에서 얻은 트라스투주맙의 아지드 벤조산 도입체의 당쇄 절단물의 샘플 용액을 10μL 첨가하고, 11-2-1과 동일한 처리를 행하여 LC-MS/MS 측정용 샘플을 얻었다.
(11-2-10) 트라스투주맙의 아세틸티올 및 아지드 벤조산 도입체의 당쇄 절단물의 트립신 처리 (10)
1.5mL 저흡착 마이크로 테스트 튜브에 (11-1-8)에서 얻은 트라스투주맙의 아세틸티올 및 아지드 벤조산 도입체의 당쇄 절단물의 샘플 용액을 10μL 첨가하고, 11-2-1과 동일한 처리를 행하여 LC-MS/MS 측정용 샘플을 얻었다.
(11-2-11) 데노수맙의 아지드 벤조산 도입체의 당쇄 절단물의 트립신 처리 (11)
1.5mL 저흡착 마이크로 테스트 튜브에 (11-1-11)에서 얻은 데노수맙의 아지드 벤조산 도입체의 당쇄 절단물의 샘플 용액을 10μL 첨가하고, 11-2-1과 동일한 처리를 행하여 LC-MS/MS 측정용 샘플을 얻었다.
(11-2-12) 두필루맙의 아지드 벤조산 도입체의 당쇄 절단물의 트립신 처리 (12)
1.5mL 저흡착 마이크로 테스트 튜브에 (11-1-12)에서 얻은 두필루맙의 아지드 벤조산 도입체의 당쇄 절단물의 샘플 용액을 10μL 첨가하고, 11-2-1과 동일한 처리를 행하여 LC-MS/MS 측정용 샘플을 얻었다.
(11-3) 트라스투주맙의 LC-MS/MS 측정 조건
(분석 장치)
나노 HPLC: EASY-nLC 1000(써모 피셔 사이언티픽)
질량 분석계: 트리브리드 질량 분석계 Orbitrap Fusion(써모 피셔 사이언티픽)
(HPLC 분석 조건)
트랩 컬럼: Acclaim PepMap(등록 상표) 100, 75μmx2cm(써모 피셔 사이언티픽)
분석 컬럼: ESI-column(NTCC-360/75-3-125, 75μm×12.5cm, 3μm(닛쿄 테크노스))
이동상 A: 0.1% 포름산 수용액
이동상 B: 0.1% 포름산, 아세토니트릴 용액
로딩 용액: 0.1% 트리플루오로아세트산 수용액
유속: 300nL/min
샘플 주입량: 0.3-1μL
그레디언트 조건(B%): 2%(0.0-0.5분), 2%→30%(0.5-23.5분), 30%→75%(23.5-25.5분), 75%(25.5-35.0분)
(질량 분석계 분석 조건)
이온화법: ESI, Positive 모드
스캔 타입: Data Dependent Aquisition Activation Type:Collision Induced Dissociation(CID)
데이터의 취득은 부속 소프트웨어인 Xcalibur 3.0(써모 피셔 사이언티픽) 및 Thermo Orbitrap Fusion Tune Application 2.0(써모 피셔 사이언티픽)을 사용하여 행했다.
(11-4) 트라스투주맙, 데노수맙 및 두필루맙의 수식 부위의 해석 조건
LC-MS/MS 측정 결과에 대한 수식 부위 해석에 대해서는, BioPharma Finder 3.0(써모 피셔 사이언티픽)을 사용하여 행했다.
BioPharma Finder에서의 해석은, S/N Threshold를 1, MS Noise Level을 피크 톱의 강도의 0.01%가 되도록 설정하여 실시했다. 또한, 소화 효소를 Trypsin으로, Specificity를 High로 설정했다. 또한, 피크 검출시의 Mass Tolerance는 4ppm, 펩타이드 동정시의 Mass Accuracy는 5ppm으로 했다. Static Modification에는 요오드아세트아미드에 의한 시스테인 잔기의 수식으로서, Carbamidomethyl(+57.021Da)을 설정했다. Dynamic Modifications에 대해서는, 메티오닌의 산화(+15.995Da) 및 라이신 잔기로의 수식체(말레이미드 도입체(+219.090Da), 머캅토프로피온산 부가 말레이미드 도입체(+325.098Da), 알킬아지드 도입체(+139.075Da), 알킬아민 도입체(+113.084Da), 아지드 벤조산 도입체(+145.028Da), 아민 벤조산 도입체(+119.037Da), 아세틸티올 도입체(+130.009Da), 카바미도메틸화를 받은 아세틸티오 도입체(+145.020Da))를 설정했다. 또한, Confidence Score가 80 이상, MS/MS를 관측할 수 있는 것만이 되도록 필터를 설정했다.
또한, 소화시에 디티오스레이톨 및 요오드아세트아미드에 의한 환원 알킬화를 행하기 위해, 알킬아지드 도입체는 일부 환원되어 알킬아민 도입체로, 아지드 벤조산 도입체는 환원되어 아민 벤조산 도입체로 되고, 아세틸티올 도입체는 카바미도메틸화를 받는다.
또한, 수식 부위의 검색 대상의 아미노산 서열의 데이터로서, 트라스투주맙에 관해서는 도 25에 나타내어지는 (1) 내지 (2)를, 데노수맙에 관해서는 도 26에 나타내어지는 (1) 내지 (2)를, 두필루맙 관해서는 도 27에 나타내어지는 (1) 내지 (2)를 각각 사용했다.
(11-5) 소화물의 LC-MS/MS에 의한 수식 부위의 해석 결과
(11-5-1) 트립신 소화물의 LC-MS/MS에 의한 수식 부위의 해석 결과 (1)
LC-MS/MS를 사용한 해석의 결과, (11-2-1)에서 얻은 트라스투주맙 아지드 수식체의 트립신 소화에 의한 라이신 잔기로의 수식 부위(아민 벤조산 도입체(+119.037Da))를 포함하는 아미노산 33잔기로 이루어진 펩타이드, THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISR(서열 번호 11)의 펩타이드 프래그먼트의 MS 스펙트럼(실측값: m/z 945.73328, 이론값: 945.73350, 4가)이 관측되고(도 29), CID 스펙트럼에서 중쇄의 EU numbering에서의 246 위치 또는 248 위치의 라이신 잔기의 수식을 나타내는, 2가의 y19에 상당하는 m/z 1125.49(이론값: 1125.11)의 프로덕트 이온이 확인되었다(도 30).
(11-5-2) 트립신 소화물의 LC-MS/MS에 의한 수식 부위의 해석 결과 (2)
LC-MS/MS를 사용한 해석의 결과, (11-2-2)에서 얻은 트라스투주맙 아지드 수식체의 트립신 소화에 의한 라이신 잔기로의 수식 부위(아민 벤조산 도입체(+119.037Da))를 포함하는 아미노산 18잔기로 이루어진 펩타이드, FNWYVDGVEVHNAKTKPR(서열 번호 12)의 펩타이드 프래그먼트의 MS 스펙트럼(실측값: m/z 760.38287, 이론값: 760.38390, 3가)이 관측되고(도 31), CID 스펙트럼에서 중쇄의 EU numbering에서의 288 위치 또는 290 위치의 라이신 잔기의 수식을 나타내는, 2가의 y16에 상당하는 m/z 1009.83(이론값: 1009.52)의 프로덕트 이온이 확인되었다(도 32).
(11-5-3) 트립신 소화물의 LC-MS/MS에 의한 수식 부위의 해석 결과 (3)
LC-MS/MS를 사용한 해석의 결과, (11-2-3)에서 얻은 트라스투주맙 말레이미드 MPA 수식체의 트립신 소화에 의한 라이신 잔기로의 수식 부위(머캅토프로피온산 부가 말레이미드 도입체(+325.098Da))를 포함하는 아미노산 33잔기로 이루어진 펩타이드, THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISR(서열 번호 11)의 펩타이드 프래그먼트의 MS 스펙트럼(실측값: m/z 997.24986, 이론값: 997.24908, 4가)이 관측되고(도 33), CID 스펙트럼에서 중쇄의 EU numbering에서의 246 위치 또는 248 위치의 라이신 잔기의 수식을 나타내는, 2가의 y20에 상당하는 m/z 1256.96(이론값: 1256.65)의 프로덕트 이온이 확인되었다(도 34).
이 결과로부터, 상기 (11-2-3)에서는, 항체의 중쇄 상, EU numbering에서의 Lys246 및 Lys248에 위치 선택적으로 콘쥬게이션이 진행되고 있는 것을 알 수 있었다.
(11-5-4) 트립신 소화물의 LC-MS/MS에 의한 수식 부위의 해석 결과 (4)
LC-MS/MS를 사용한 해석의 결과, (11-2-4)에서 얻은 트라스투주맙 알킬아지드 수식체의 트립신 소화에 의한 라이신 잔기로의 수식 부위(알킬아지드 도입체(+139.075Da))를 포함하는 아미노산 33잔기로 이루어진 펩타이드, THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISR(서열 번호 11)의 펩타이드 프래그먼트의 MS 스펙트럼(실측값: m/z 950.74263, 이론값: 950.74313, 4가)이 관측되고(도 35), CID 스펙트럼에서 중쇄의 EU numbering에서의 246 위치 또는 248 위치의 라이신 잔기의 수식을 나타내는, 2가의 y20에 상당하는 m/z 1163.92(이론값: 1163.64)의 프로덕트 이온이 확인되었다(도 36).
이 결과로부터, 상기 (11-2-4)에서는, 항체의 중쇄 상, EU numbering에서의 Lys246 및 Lys248에 위치 선택적으로 콘쥬게이션이 진행되고 있는 것을 알 수 있었다.
(11-5-5) 트립신 소화물의 LC-MS/MS에 의한 수식 부위의 해석 결과 (5)
LC-MS/MS를 사용한 해석의 결과, (11-2-5)에서 얻은 트라스투주맙 아지드 벤조산 수식체의 트립신 소화에 의한 라이신 잔기로의 수식 부위(아민 벤조산 도입체(+119.037Da))를 포함하는 아미노산 19잔기로 이루어진 펩타이드, VVSVLTVLHQDWLNGKEYK(서열 번호 101)의 펩타이드 프래그먼트의 MS 스펙트럼(실측값: m/z 783.08731, 이론값: 783.08690, 3가)이 관측되고(도 37), CID 스펙트럼에서 중쇄의 EU numbering에서의 317 위치의 라이신 잔기의 수식을 나타내는, 2가의 y17에 상당하는 m/z 1075.31(이론값: 1075.06)의 프로덕트 이온이 확인되었다(도 38). 또한, BioPharma Finder에서의 해석에 의해, 317 위치의 라이신 잔기로의 수식이 고선택적으로 일어나고 있는 것이 나타나졌다(도 39).
이 결과로부터, 상기 (11-2-5)에서는, 항체의 중쇄 상, EU numbering에서의 Lys317에 위치 선택적으로 콘쥬게이션이 진행되고 있는 것을 알 수 있었다.
(11-5-6) 트립신 소화물의 LC-MS/MS에 의한 수식 부위의 해석 결과　(6)
LC-MS/MS를 사용한 해석의 결과, (11-2-6)에서 얻은 트라스투주맙 아지드 벤조산 수식체의 트립신 소화에 의한 라이신 잔기로의 수식 부위(아민 벤조산 도입체(+119.037Da))를 포함하는 아미노산 18잔기로 이루어진 펩타이드, FNWYVDGVEVHNAKTKPR(서열 번호 12)의 펩타이드 프래그먼트의 MS 스펙트럼(실측값: m/z 570.54026, 이론값: 570.53991, 4가)이 관측되고(도 40), CID 스펙트럼에서 중쇄의 EU numbering에서의 288 위치 또는 290 위치의 라이신 잔기의 수식을 나타내는, 3가의 y16에 상당하는 m/z 673.48(이론값: 673.35)의 프로덕트 이온이 확인되었다(도 41). 또한, BioPharma Finder에서의 해석에 의해, 288 위치 또는 290 위치의 라이신 잔기로의 수식이 고선택적으로 일어나고 있는 것이 나타나졌다(도 42).
이 결과로부터, 상기 (11-2-6)에서는, 항체의 중쇄 상, EU numbering에서의 Lys288 및 Lys290에 위치 선택적으로 콘쥬게이션이 진행되고 있는 것을 알 수 있었다.
(11-5-7) 트립신 소화물의 LC-MS/MS에 의한 수식 부위의 해석 결과 (7)
LC-MS/MS를 사용한 해석의 결과, (11-2-7)에서 얻은 트라스투주맙 아지드 벤조산 수식체의 트립신 소화에 의한 라이신 잔기로의 수식 부위(아민 벤조산 도입체(+119.037Da))를 포함하는 아미노산 33잔기로 이루어진 펩타이드, THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISR(서열 번호 11)의 펩타이드 프래그먼트의 MS 스펙트럼(실측값: m/z 945.73501, 이론값: 945.73376, 4가)이 관측되고(도 43), CID 스펙트럼에서 중쇄의 EU numbering에서의 246 위치 또는 248 위치의 라이신 잔기의 수식을 나타내는, 2가의 y20에 상당하는 m/z 1153.87(이론값: 1153.62)의 프로덕트 이온이 확인되었다(도 44). 또한, BioPharma Finder에서의 해석에 의해, 246 위치 또는 248 위치의 라이신 잔기로의 수식이 고선택적으로 일어나고 있는 것이 나타나졌다(도 45).
이 결과로부터, 상기 (11-2-7)에서는, 항체의 중쇄 상, EU numbering에서의 Lys246 및 Lys248에 위치 선택적으로 콘쥬게이션이 진행되고 있는 것을 알 수 있었다.
(11-5-8) 트립신 소화물의 LC-MS/MS에 의한 수식 부위의 해석 결과 (8)
LC-MS/MS를 사용한 해석의 결과, (11-2-8)에서 얻은 트라스투주맙 아세틸티올 수식체의 트립신 소화에 의한 라이신 잔기로의 수식 부위(카바미도메틸화를 받은 아세틸티올 도입체(+145.020Da))를 포함하는 아미노산 33잔기로 이루어진 펩타이드, THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISR(서열 번호 11)의 펩타이드 프래그먼트의 MS 스펙트럼(실측값: m/z 952.23368, 이론값: 952.22942, 4가)이 관측되고(도 46), CID 스펙트럼에서 중쇄의 EU numbering에서의 246 위치 또는 248 위치의 라이신 잔기의 수식을 나타내는, 2가의 y20에 상당하는 m/z 1166.95(이론값: 1166.61)의 프로덕트 이온이 확인되었다(도 47). 또한, BioPharma Finder에서의 해석에 의해, 246 위치 또는 248 위치의 라이신 잔기로의 수식이 고선택적으로 일어나고 있는 것이 나타나졌다(도 48).
이 결과로부터, 상기 (11-2-8)에서는, 항체의 중쇄 상, EU numbering에서의 Lys246 및 Lys248에 위치 선택적으로 콘쥬게이션이 진행되고 있는 것을 알 수 있었다.
(11-5-9) 트립신 소화물의 LC-MS/MS에 의한 수식 부위의 해석 결과 (9)
LC-MS/MS를 사용한 해석의 결과, (11-2-9)에서 얻은 트라스투주맙 아지드 벤조산 수식체의 트립신 소화에 의한 라이신 잔기로의 수식 부위(아민 벤조산 도입체(+119.037Da))를 포함하는 아미노산 33잔기로 이루어진 펩타이드, THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISR(서열 번호 11)의 펩타이드 프래그먼트의 MS 스펙트럼(실측값: m/z 945.74114, 이론값: 945.73376, 4가)이 관측되고(도 49), CID 스펙트럼에서 중쇄의 EU numbering에서의 246 위치 또는 248 위치의 라이신 잔기의 수식을 나타내는, 2가의 y20에 상당하는 m/z 1153.94(이론값: 1153.62)의 프로덕트 이온이 확인되었다(도 50). 또한, 라이신 잔기로의 수식 부위(아민 벤조산 도입체(+119.037Da))를 포함하는 아미노산 18잔기로 이루어진 펩타이드, FNWYVDGVEVHNAKTKPR(서열 번호 12)의 펩타이드 프래그먼트의 MS 스펙트럼(실측값: m/z 570.54470, 이론값: 570.53991, 4가)이 관측되고(도 51), CID 스펙트럼에서 중쇄의 EU numbering에서의 288 위치 또는 290 위치의 라이신 잔기의 수식을 나타내는, 3가의 y14에 상당하는 m/z 557.18(이론값: 556.97)의 프로덕트 이온이 확인되었다(도 52).
이 결과로부터, 상기 (11-2-9)에서는, 항체의 중쇄 상, EU numbering에서의 Lys246 또는 Lys248, 및, Lys288 또는 Lys290에 위치 선택적으로 콘쥬게이션이 진행되고 있는 것을 알 수 있었다.
(11-5-10) 트립신 소화물의 LC-MS/MS에 의한 수식 부위의 해석 결과 (10)
LC-MS/MS를 사용한 해석의 결과, (11-2-10)에서 얻은 트라스투주맙 아세틸티올 및 아지드 벤조산 수식체의 트립신 소화에 의한 라이신 잔기로의 수식 부위(카바미도메틸화를 받은 아세틸티올 도입체(+119.037Da))를 포함하는 아미노산 33잔기로 이루어진 펩타이드, THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISR(서열 번호 11)의 펩타이드 프래그먼트의 MS 스펙트럼(실측값: m/z 952.23028, 이론값: 952.22942, 4가)이 관측되고(도 53), CID 스펙트럼에서 중쇄의 EU numbering에서의 246 위치 또는 248 위치의 라이신 잔기의 수식을 나타내는, 2가의 y20에 상당하는 m/z 1166.90(이론값: 1166.61)의 프로덕트 이온이 확인되었다(도 54). 또한, 라이신 잔기로의 수식 부위(아민 벤조산 도입체(+119.037Da))를 포함하는 아미노산 18잔기로 이루어진 펩타이드, FNWYVDGVEVHNAKTKPR(서열 번호 12)의 펩타이드 프래그먼트의 MS 스펙트럼(실측값: m/z 570.54030, 이론값: 570.53991, 4가)이 관측되고(도 55), CID 스펙트럼에서 중쇄의 EU numbering에서의 288 위치 또는 290 위치의 라이신 잔기의 수식을 나타내는, 3가의 y16에 상당하는 m/z 673.52(이론값: 673.35)의 프로덕트 이온이 확인되었다(도 56). 또한, BioPharma Finder에서의 해석에 의해, 246 위치 또는 248 위치의 라이신 잔기로의 카바미도메틸화를 받은 아세틸티올 수식, 및, 288 위치 또는 290 위치의 라이신 잔기로의 아민 벤조산 수식이 고선택적으로 일어나고 있는 것이 나타나졌다(도 57).
이 결과로부터, 상기 (11-2-10)에서는, 항체의 중쇄 상, EU numbering에서의 Lys246 또는 Lys248, 및, Lys288 또는 Lys290에 위치 선택적으로 콘쥬게이션이 진행되고 있는 것을 알 수 있었다.
(11-5-11) 트립신 소화물의 LC-MS/MS에 의한 수식 부위의 해석 결과 (11)
LC-MS/MS를 사용한 해석의 결과, (11-2-11)에서 얻은 데노수맙 아지드 벤조산 수식체의 트립신 소화에 의한 라이신 잔기로의 수식 부위(아민 벤조산 도입체(+119.037Da))를 포함하는 아미노산 33잔기로 이루어진 펩타이드, CCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISR(서열 번호 102)의 펩타이드 프래그먼트의 MS 스펙트럼(실측값: m/z 961.72078, 이론값: 961.71980, 4가)이 관측되고(도 58), CID 스펙트럼에서 중쇄의 서열 중의 번호(즉, N말의 아미노산을 1번째로 한다. 이하 동일)에서의 247 위치 또는 249 위치의 라이신 잔기의 수식을 나타내는, 3가의 y23에 상당하는 m/z 872.08(이론값: 871.81)의 프로덕트 이온이 확인되었다(도 59). 또한, BioPharma Finder에서의 해석에 의해, 247 위치 또는 249 위치의 라이신 잔기로의 수식이 고선택적으로 일어나고 있는 것이 나타나졌다(도 60).
이 결과로부터, 상기 (11-2-11)에서는, 항체의 중쇄 상, 서열 중의 번호에서의 Lys247 또는 Lys249에 위치 선택적으로 콘쥬게이션이 진행되고 있는 것을 알 수 있었다.
(11-5-12) 트립신 소화물의 LC-MS/MS에 의한 수식 부위의 해석 결과 (12)
LC-MS/MS를 사용한 해석의 결과, (11-2-12)에서 얻은 두필루맙 아지드 벤조산 수식체의 트립신 소화에 의한 라이신 잔기로의 수식 부위(아민 벤조산 도입체(+119.037Da))를 포함하는 아미노산 34잔기로 이루어진 펩타이드, YGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISR(서열 번호 103)의 펩타이드 프래그먼트의 MS 스펙트럼(실측값: m/z 972.99064, 이론값: 972.98886, 4가)이 관측되고(도 61), CID 스펙트럼에서 중쇄의 서열 중의 번호에서의 251 위치 또는 253 위치의 라이신 잔기 수식을 나타내는, 3가의 y29에 상당하는 m/z 1105.98(이론값: 1105.58)의 프로덕트 이온이 확인되었다(도 62). 또한, BioPharma Finder에서의 해석에 의해, 251 위치 또는 253 위치의 라이신 잔기로의 수식이 고선택적으로 일어나고 있는 것이 나타나졌다(도 63).
이 결과로부터, 싱기 (11-2-12)에서는, 항체의 중쇄 상, 서열 중의 번호에서의 Lys251 또는 Lys253에 위치 선택적으로 콘쥬게이션이 진행되고 있는 것을 알 수 있었다.
[실시예 12: 4종의 항체 약물 복합체(ADC), 트라스투주맙-DM1 및 트라스투주맙-MMAE, 및 리툭시맙-DM1 및 리툭시맙-MMAE의 합성]
(12-1) 트라스투주맙의 위치 특이적 아지드 도입체와 DBCO-DM1과의 콘쥬게이션
(12-1-1) 위치 선택적 트라스투주맙-DM1 콘쥬게이트의 합성
실시예 6의 (6-1-2)에서 합성한 트라스투주맙의 아지드 벤조산 도입체(아지드 항체 3) 0.9mg을 473μL의 100mM PBS, 10mM EDTA 버퍼에 용해시킨 후, 51μL의 N,N'-디메틸아세트아미드와 DBCO-DM1(Abzena사 제조, 화합물 87)을 N,N'-디메틸아세트아미드에 용해하여 4mM로 한 것을 2μL 첨가하여 25℃에서 16시간 교반했다. 반응 후, NAP-5 컬럼에 의해 추출하고, DM1을 제거했다.
Figure pct00116
화합물 87
(12-1-2) ESI-TOFMS에 의한 평균 DAR의 산출
ESI-TOFMS는 애질런트사 제조의 Agilent 6550 coupled to Agilent 1290 UPLC with DAD detector, Autosampler cooling and Thermostatted column compartment를 사용했다. 소프트웨어는 MassHunter를 사용하여, DAR을 산출했다. 생성물은 DM1이 둘 도입된 150531 및 DM1이 하나 도입된 149827에 피크가 관측되고, 평균 DAR은 1.8로 산출되었다(도 64).
(12-1-3) 환원 조건에서의 ESI-TOFMS 해석
(12-1-1)에서 합성한 트라스투주맙-DM1 콘쥬게이트의 PBS 용액에 7mM 트리스 (2-카복시에틸)포스핀염산염 용액 2μL(트라스투주맙-DM1 콘쥬게이트에 대하여 100등량)를 첨가하여, 실온에서 20분 교반했다. ESI-TOFMS에 의해 질량을 측정한 결과, 원료인 실시예 6의 (6-1-1)에서 합성한 트라스투주맙의 아지드 도입체는 50715 및 50877에 중쇄 피크, 23440에 경쇄 피크가 관측되고, 트라스투주맙-DM1 콘쥬게이트는 중쇄에 DM1이 도입된 51748 및 519097에 피크가 관측되고, 원료와 동일한 23440에 경쇄 피크가 관측되었다(도 65). 또한, 측정 전처리의 7mM 트리스(2-카복시에틸)포스핀염의 환원 반응에 의해, 아지드 벤조산 도입체는 환원되어 아민 벤조산 도입체로 되어 있다.
(12-2) 트라스투주맙의 위치 특이적 아지드 도입체와 DBCO-MMAE와의 콘쥬게이션
(12-2-1) 위치 선택적 트라스투주맙-MMAE 콘쥬게이트의 합성
실시예 6의 (6-1-2)에서 합성한 트라스투주맙의 아지드 벤조산 도입체(아지드 항체 3)를 0.5mg을 실시예 12의 (12-1-1)과 동일한 수법으로, DBCO-MMAE(Abzena사 제조, 화합물 88)와 반응시켰다. 반응 후, NAP-5 컬럼에 의해 추출하고, DBCO-MMAE를 제거했다.
Figure pct00117
화합물 88
(12-2-2) ESI-TOFMS에 의한 평균 DAR의 산출
실시예 12의 (12-1-2)와 동일한 수법으로 DAR을 산출했다. 생성물은 MMAE가 둘 도입된 151336 및 MMAE가 하나 도입된 149972에 피크가 관측되고, 평균 DAR은 1.8로 산출되었다(도 66).
(12-2-3) 환원 조건에서의 ESI-TOFMS 해석
(12-2-1)에서 합성한 트라스투주맙-MMAE 콘쥬게이트의 PBS 용액에 7mM 트리스(2-카복시에틸)포스핀염산염 용액 2μL(트라스투주맙-DM1 콘쥬게이트에 대하여 100등량)를 첨가하여, 실온에서 20분 교반했다. ESI-TOFMS에 의해 질량을 측정한 결과, 원료인 실시예 6의 (6-1-1)에서 합성한 트라스투주맙의 아지드 도입체는 50715 및 50877에 중쇄 피크, 23440에 경쇄 피크가 관측되고, 트라스투주맙-MMAE 콘쥬게이트는 중쇄에 MMAE가 도입된 52154 및 52316에 피크가 관측되고, 원료와 동일한 23440에 경쇄 피크가 관측되었다(도 67). 또한, 측정 전처리의 7mM 트리스(2-카복시에틸)포스핀염의 환원 반응에 의해, 아지드 벤조산 도입체는 환원되어 아민 벤조산 도입체로 되어 있다.
(12-3) 리툭시맙의 위치 특이적 아지드 도입체와 DBCO-DM1과의 콘쥬게이션
(12-3-1) 위치 선택적 리툭시맙-DM1 콘쥬게이트의 합성
실시예 6의 (6-1-4)에서 합성한 리툭시맙의 아지드 벤조산 도입체(아지드 수식 항체 101)를 실시예 12의 (12-1-1)과 동일한 수법으로, DBCO-DM1(Abzena사 제조, 화합물 87)과 반응시켰다. 반응 후, NAP-5 컬럼에 의해 추출하고, DBCO-DM1을 제거했다.
(12-3-2) ESI-TOFMS에 의한 평균 DAR의 산출
실시예 12의 (12-1-2)와 동일한 수법으로 DAR을 산출했다. 생성물은 DM1이 둘 도입된 149549 및 DM1이 하나 도입된 148845 피크가 관측되고, 평균 DAR은 1.8로 산출되었다(도 68).
(12-3-3) 환원 조건에서의 ESI-TOFMS 해석
(12-3-1)에서 합성한 리툭시맙-DM1 콘쥬게이트의 PBS 용액에 7mM 트리스(2-카복시에틸)포스핀염산염 용액 2μL(트라스투주맙-DM1 콘쥬게이트에 대하여 100등량)를 첨가하여, 실온에서 20분 교반했다. ESI-TOFMS에 의해 질량을 측정한 결과, 원료인 실시예 6의 (6-1-4)에서 합성한 리툭시맙의 아지드 도입체는 50635 및 50797에 중쇄 피크, 23040에 경쇄 피크가 관측되고, 리툭시맙-DM1 콘쥬게이트는 중쇄에 DM1이 도입된 51668 및 51831에 피크가 관측되고, 원료와 동일한 23040에 경쇄 피크가 관측되었다(도 69). 또한, 측정 전처리의 7mM 트리스(2-카복시에틸)포스핀염의 환원 반응에 의해, 아지드 벤조산 도입체는 환원되어 아민 벤조산 도입체로 되어 있다.
(12-4) 리툭시맙의 위치 특이적 아지드 도입체와 DBCO-MMAE와의 콘쥬게이션
(12-4-1) 위치 선택적 리툭시맙-MMAE 콘쥬게이트의 합성
실시예 6의 (6-1-4)에서 합성한 리툭시맙의 아지드 벤조산 도입체(아지드 수식 항체 101)를 실시예 12의 (12-1-1)과 동일한 수법으로, DBCO-MMAE(Abzena사 제조, 화합물 88)와 반응시켰다. 반응 후, NAP-5 컬럼에 의해 추출하고, DBCO-MMAE를 제거했다.
(12-4-2) ESI-TOFMS에 의한 평균 DAR의 산출
실시예 12의 (12-2)와 동일한 수법으로 DAR을 산출했다. 생성물은 MMAE가 둘 도입된 150354 및 MMAE가 하나 도입된 148994에 피크가 관측되고, 평균 DAR은 1.6으로 산출되었다(도 70).
(12-4-3) 환원 조건에서의 ESI-TOFMS 해석
(12-4-1)에서 합성한 리툭시맙-MMAE 콘쥬게이트의 PBS 용액에 7mM 트리스(2-카복시에틸)포스핀염산염 용액 2μL(리툭시맙-MMAE 콘쥬게이트에 대하여 100등량)를 첨가하여, 실온에서 20분 교반했다. ESI-TOFMS에 의해 질량을 측정한 결과, 원료인 실시예 6의 (6-1-4)에서 합성한 리툭시맙의 아지드 도입체는 50635 및 50797에 중쇄 피크, 23040에 경쇄 피크가 관측되고, 리툭시맙-MMAE 콘쥬게이트는 중쇄에 MMAE가 도입된 52071 및 52233에 피크가 관측되고, 원료와 동일한 23040에 경쇄 피크가 관측되었다(도 71). 또한, 측정 전처리의 7mM 트리스(2-카복시에틸)포스핀염의 환원 반응에 의해, 아지드 벤조산 도입체는 환원되어 아민 벤조산 도입체로 되어 있다.
[실시예 13: 페이로드 모델 탑재 IgG1 Fc 친화성 펩타이드 시약에 의한 IgG1 Fc의 위치 특이적 페이로드 모델 도입과 ESI-TOFMS에 의한 해석]
(13-1) 페이로드 모델 탑재 IgG1 Fc 친화성 펩타이드 시약의 합성
(13-1-1) 페이로드 모델 탑재 IgG1 Fc 친화성 펩타이드 시약(화합물 89)의 합성
실시예 1에서 합성한 항체 친화성 펩타이드(화합물 36)를 디메틸술폭시드에 용해시키고, 2-이미노티오란염산염(10몰당량), 디이소프로필에틸아민(15몰당량)을 첨가하고, 1시간 교반했다. 원료 소실을 LC-MS로 확인한 후, N-하이드록시말레이미드(20몰당량)의 디메틸술폭시드 용액을 첨가하여, 1시간 교반했다. 반응 진행을 LC-MS로 확인한 후, Fmoc-N-아미드-dPEG12산(40몰당량), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드염산염(32몰당량), 1-하이드록시벤조트리아졸(32몰당량)을 첨가하고, 2시간 교반했다. 반응 종결을 LC-MS로 확인한 후, 분취 HPLC로 정제했다. 목적물을 포함하는 프렉션을 ESI-MS로 확인한 후, 동결 건조하여 생성물인 Fmoc-N-amido-dPEG12-친화성 펩타이드 시약(화합물 89))을 얻었다.
Figure pct00118
화합물 89
(펩타이드 부분의 아미노산 서열: 서열 번호 46)
MS (ESI)m/z:z=2 1563 [M+2H]2+, 3 1043 [M+3H]3+
(13-1-2) 페이로드 모델 탑재 IgG1 Fc 친화성 펩타이드 시약(화합물 90)의 합성
실시예 (13-1-1)과 동일하게 하여, 비오틴-친화성 펩타이드 시약(화합물 90)을 얻었다.
Figure pct00119
화합물 90
(펩타이드 부분의 아미노산 서열: 서열 번호 46)
MS (ESI)m/z:z=2 1563 [M+2H]2+, z=3 1043 [M+3H]3+
(13-2) 페이로드 모델 탑재 IgG1 Fc 친화성 펩타이드 시약에 의한 IgG1 Fc의 위치 특이적 페이로드 모델 도입 및 ESI-TOFMS 해석
(13-2-1) 페이로드 모델 dPEG12 탑재 IgG1 Fc 친화성 펩타이드 시약에 의한 IgG1 Fc의 위치 특이적 페이로드 모델 도입 및 ESI-TOFMS 해석
(13-1-1)에서 합성한 페이로드 모델 탑재한 친화성 펩타이드 시약(화합물 89)을 N,N'-디메틸포름아미드에 용해하여 2.0mM로 했다. 항HER2 IgG 항체 트라스투주맙(츄가이 세이야쿠) 200μg을 50mM HEPES 완충액(pH7.2) 200μL에 용해시켜, 2.0mM의 펩타이드 시약을 항체에 대하여 20몰당량 첨가하여, 25도에서 3시간 교반했다. 반응액을 한외 여과(Amicon Ultra, 10k MWCO)에 의해 농축함으로써 IgG 항체 페이로드 모델 dPEG12 도입체를 얻었다.
ESI-TOFMS에 의해 질량을 측정한 결과, 트라스투주맙은 148061에 피크가 관측되고, 반응 생성물은 Fmoc-dPEG12가 둘 도입된 149867에 피크가 관측되었다.
(13-2-2) 페이로드 모델 dPEG12 탑재 IgG1 Fc 친화성 펩타이드 시약에 의한 IgG1 Fc의 위치 특이적 페이로드 모델 도입 및 ESI-TOFMS 해석
(13-1-2)에서 합성한 페이로드 모델 탑재한 친화성 펩타이드 시약(화합물 90)을 사용하여, (13-2-1)과 동일한 검토를 행하여, IgG 항체 페이로드 모델 비오틴 도입체를 얻었다.
(13-3) 페이로드 모델 탑재 IgG1 Fc 친화성 펩타이드 시약에 의한 IgG1 Fc의 위치 특이적 페이로드 모델 도입의 환원 조건에서의 ESI-TOFMS에 의한 해석
(13-3-1) 페이로드 모델 dPEG12 탑재 IgG1 Fc 친화성 펩타이드 시약에 의한 IgG1 Fc의 위치 특이적 페이로드 모델 도입의 환원 조건에서의 ESI-TOFMS에 의한 해석
(13-2-1)에서 합성한 트라스투주맙-페이로드 모델에 대하여 7mM 트리스(2-카복시에틸)포스핀염산염 용액 2.0μL(항체에 대하여 100등량)를 첨가하여, 실온에서 20분 방치했다. ESI-TOFMS에 의해 질량을 측정한 결과, 컨트롤로서 사용한 원료의 트라스투주맙은 50602, 50764에 중쇄 피크, 23443에 경쇄 피크가 관측되었다. 반응 생성물은 중쇄에 Fmoc-dPEG12가 도입된 51425, 51584, 및 원료와 동일한 23443에 경쇄 피크가 관측되었다.
(13-3-2) 페이로드 모델 비오틴 탑재 IgG1 Fc 친화성 펩타이드 시약에 의한 IgG1 Fc의 위치 특이적 페이로드 모델 도입의 환원 조건에서의 ESI-TOFMS에 의한 해석
(13-2-2)에서 합성한 트라스투주맙-페이로드 모델에 대한 7mM 트리스(2-카복시에틸)포스핀염산염 용액 2.0μL(항체에 대하여 100등량)를 첨가하여, 실온에서 20분 방치했다. ESI-TOFMS에 의해 질량을 측정한 결과, 컨트롤로서 사용한 원료의 트라스투주맙은 50596, 50757에 중쇄 피크, 23439에 경쇄 피크가 관측되었다. 반응 생성물은 중쇄에 비오틴이 도입된 50820, 50982, 및 원료와 동일한 23439에 경쇄 피크가 관측되었다.
[실시예 14: 페이로드 탑재 IgG1 Fc 친화성 펩타이드 시약에 의한 IgG1 Fc의 위치 특이적 페이로드 도입과 ESI-TOFMS에 의한 해석]
(14-1) MMAE 탑재 IgG1 Fc 친화성 펩타이드 시약(화합물 91)의 합성
실시예 5에서 합성한 Fc 친화성 펩타이드 시약(화합물 66)을 N,N'-디메틸포름아미드에 용해하여 0.22mM로 했다. DBCO-MMAE(Abzena사 제조, 화합물 91)를 첨가하고, 25도에서 16시간 교반했다. 원료 소실을 LC-MS로 확인하고, 생성물인 MMAE 탑재 Fc 친화성 펩타이드 시약을 얻었다.
Figure pct00120
화합물 91
(펩타이드 부분의 아미노산 서열: 서열 번호 46)
MS (ESI)m/z:z=2 1930[M+2H]2+, z=3 1287[M+3H]3+
(14-2) MMAE 탑재 IgG1 Fc 친화성 펩타이드 시약에 의한 IgG1 Fc 위치 선택적 트라스투주맙-MMAE 콘쥬게이트의 합성 및 ESI-TOFMS 해석
항HER2 IgG 항체 트라스투주맙(츄가이 세이야쿠) 200μg을 사용하여, (14-1)에서 합성한 MMAE 탑재 Fc 친화성 펩타이드 시약(화합물 91)과 실시예 13의 (13-2)와 동일한 수법으로 반응시켰다. 반응액을 한외 여과(Amicon Ultra, 10k MWCO)에 의해 농축함으로써 위치 선택적 트라스투주맙-MMAE 콘쥬게이트를 얻었다.
그 결과, ESI-TOFMS에 의해 질량을 측정한 결과, MMAE가 둘 도입된 151336 및 MMAE가 하나 도입된 149972의 피크가 관측되었다.
[실시예 15: 글루타민산 잔기로부터의 링커를 갖는 IgG1 Fc 친화성 펩타이드 시약에 의한 IgG1 Fc의 위치 특이적 수식과 ESI-TOFMS에 의한 해석]
(15-1) 항체에 대한 친화성 펩타이드의 합성
(1-1)에 나타내는 방법으로, 화합물 92를 합성, 취득했다.
Figure pct00121
화합물 92
(펩타이드 부분의 아미노산 서열: 서열 번호 108)
MS (ESI)m/z:z=2 1046.4 [M+2H]2+, Z=3 698.3 [M+3H]3+
(15-2) 아지드 시약과 친화성 펩타이드 연결에 의한 항체 수식 시약의 합성
(15-1)에서 합성한 항체 친화성 펩타이드를 디메틸술폭시드에 용해시키고, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드염산염(40몰당량), 1-하이드록시벤조트리아졸(40몰당량)을 첨가하고, 교반했다. 거기에 2-아미노에탄올 용액(40몰당량)과 트리에틸아민(1몰당량)을 첨가하여, 실온에서 1시간 교반했다. LC-MS를 측정한 후, 역상 HPLC로 분리 정제를 행했다. 각 프렉션을 MS로 확인하고, 목적물이 포함되는 프렉션을 동결 건조했다. 얻어진 화합물을 디메틸술폭시드에 녹여, 트리에틸아민(1몰당량)과 N-하이드록시말레이미드(1.2몰당량)를 첨가하여 실온에서 1시간 교반하고, LC-MS 측정을 행하여 반응의 진행을 확인했다. 4-아지드 벤조산(40몰당량), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드염산염(32몰당량), 1-하이드록시벤조트리아졸(32몰당량)을 첨가하고, 2시간 교반했다. 반응 종결을 LC-MS로 확인한 후, 분취 HPLC로 정제했다. 목적물을 포함하는 프렉션을 ESI-MS로 확인한 후, 동결 건조하여 생성물인 아지드-페닐-친화성 펩타이드 시약(화합물 93)을 얻었다.
Figure pct00122
화합물 93
(펩타이드 부분의 아미노산 서열: 서열 번호 108)
MS (ESI)m/z:z=2 1204.3 [M+2H]2+, Z=3 803.3 [M+3H]3+
(15-3) 친화성 펩타이드 시약(화합물 93)을 사용한 항체 수식 반응
(15-2)에서 합성한 아지드를 탑재한 친화성 펩타이드(화합물 93)를 사용하여, (6-1-3)에 나타내는 방법으로 반응을 행하여, IgG 항체 트라스투주맙-아지드 수식 항체를 얻었다.
(15-4) IgG 항체 트라스투주맙-아지드 수식 항체의 환원 조건에서의 ESI-TOFMS 해석에 의한 중쇄 선택성의 확인
(15-3)에서 얻어진 트라스투주맙-아지드 수식체를, 실시예 6의 (6-2-3)에 나타내는 방법으로 환원, ESI-TOFMS 해석을 행했다. 컨트롤로서 사용한 원료의 트라스투주맙은 50602, 50764에 중쇄 피크, 23443에 경쇄 피크가 관측되었다. 반응 생성물은 중쇄에 아민 벤조산이 도입된 50725, 50885, 및 23446에 경쇄 피크가 관측되었다.
[실시예 16: 티오글리콜산에스테르를 이탈기로 하는 IgG1 Fc 친화성 펩타이드 시약에 의한 IgG1 Fc의 위치 특이적 수식과 ESI-TOFMS에 의한 해석]
(16-1) 티오글리콜산에스테르 이탈기로 하는 링커(화합물 95)의 합성
디티오디글리콜산을 디클로로메탄에 용해하고, 글리신 t-부틸에스테르(2.2몰당량), N,N-디이소프로필아민(4.8몰당량), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드염산염(2.4몰당량)을 추가하여 1시간 교반했다. 반응액을 물로 분액 세정 후, 얻어진 유기층을 감압 하 농축했다. 얻어진 잔사를 N,N-디메틸포름아미드/물(1:1)로 용해하고, 트리스(2-카복시에틸)포스핀염산염(1.3몰당량)을 첨가하여, 실온에서 1시간 교반했다. 아세트산에틸로 추출 후, 감압 농축하여, 아세트산에틸/헥산으로 실리카겔 컬럼 처리를 행하여, 화합물 94를 얻었다.
Figure pct00123
화합물 94
MS (ESI) [2M+H]+=411, [M-H]-=204
화합물 94를 디클로로메탄에 용해하고, 4-아지드 벤조산(1몰당량), 1H-벤조트리아졸-1-일옥시트리피롤리디노포스포늄헥사플루오로포스페이트(1.2몰당량), N,N-디이소프로필에틸아민(1.5몰당량)을 첨가하여, 실온에서 30분 교반했다. 반응액을 실리카겔 컬럼으로 정제 후, 얻어진 백색 결정을 디클로로메탄/트리플루오로아세트산(1:1)에 용해하여, 실온에서 1시간 교반했다. 반응액을 동결 건조하여, 티오글리콜산에스테르 이탈기로 하는 링커(화합물 95)를 얻었다.
Figure pct00124
화합물 95
MS (ESI)m/z:z=1 295 [M+H]1+
(16-2) 아지드 시약과 친화성 펩타이드 연결에 의한 항체 수식 시약의 합성
(1-1)에서 합성한 항체 친화성 펩타이드(화합물 36)에, (16-1)에서 합성한 링커(화합물 95)(40몰당량), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드염산염(32몰당량), 1-하이드록시벤조트리아졸(32몰당량)을 첨가하고, 2시간 교반했다. 반응 종결을 LC-MS로 확인한 후, 분취 HPLC로 정제했다. 목적물을 포함하는 프렉션을 ESI-MS로 확인한 후, 동결 건조하여 생성물인 아지드-페닐-친화성 펩타이드 시약(화합물 96)을 얻었다.
Figure pct00125
화합물 96
(펩타이드 부분의 아미노산 서열: 서열 번호 46)
MS (ESI)m/z:z=2 1183.3 [M+2H]2+, Z=3 789.2 [M+3H]3+
(16-3) 친화성 펩타이드 시약(화합물 96)을 사용한 항체 수식 반응
(16-2)에서 합성한 아지드를 탑재한 친화성 펩타이드(화합물 96)를 사용하여, (6-1-3)에 나타내는 방법으로 반응을 행하여, IgG 항체 트라스투주맙-아지드 수식 항체를 얻었다.
(16-4) IgG 항체 트라스투주맙-아지드 수식 항체의 환원 조건에서의 ESI-TOFMS 해석에 의한 중쇄 선택성의 확인
(16-3)에서 얻어진 트라스투주맙-아지드 수식체를, 실시예 6의 (6-2-3)에 나타내는 방법으로 환원, ESI-TOFMS 해석을 행했다. 컨트롤로서 사용한 원료의 트라스투주맙은 50602, 50764에 중쇄 피크, 23443에 경쇄 피크가 관측되었다. 반응 생성물은 중쇄에 아민 벤조산이 도입된 50720, 50882, 및 원료와 동일한 23443에 경쇄 피크가 관측되었다.
(정리)
이상의 결과를 정리하면, 실시예에서 사용한 친화성 펩타이드의 아미노산 서열, 및 실시예에서 제조한 화합물을 사용하여 제조할 수 있는, 생체 직교성 관능기를 갖는 항체의 개요는, 이하와 같다.
Figure pct00126
또한, 항체에 대하여, 하기 아미노산 잔기를 비롯한 특정의 아미노산 잔기의 위치 선택적인 수식이 가능하다는 것이 나타나졌다:
(1) 246 위치 및/또는 248 위치의 라이신 잔기
예를 들어, 트라스투주맙의 246 위치 및/또는 248 위치의 라이신 잔기의 수식에 관한 실시예 11(11-5-1), (11-5-3), (11-5-4), (11-5-7), (11-5-8), (11-5-9), 및 (11-5-10), 데노수맙의 247 위치 및/또는 249 위치의 라이신 잔기(EU numbering에서의 인간 IgG의 246 위치 및/또는 248 위치의 라이신 잔기에 상당)의 수식에 관한 실시예 11(11-5-11), 및 두필루맙의 251 위치 및/또는 253 위치의 라이신 잔기(EU numbering에서의 인간 IgG의 246 위치 및/또는 248 위치의 라이신 잔기에 상당)의 수식에 관한 실시예 11(11-5-12)를 참조;
(2) 288 위치 및/또는 290 위치의 라이신 잔기
예를 들어, 실시예 11(11-5-2), (11-5-6), (11-5-9), 및 (11-5-10)을 참조;
(3) 317 위치의 라이신 잔기
예를 들어, 실시예 11(11-5-5)를 참조.
또한, 하기 화학식 I로 표시되는, 항체에 대한 친화성 물질 및 생체 직교성 관능기를 갖는 화합물에 대하여, 실시예의 일부를 예로 들어 설명하면 이하의 표 2 및 표 3과 같다.
A-L-E-B (I)
〔식 중,
　A는 항체에 대한 친화성 물질이고,
　L은 이탈기를 포함하는 2가의 기이고,
　E는 (i) 상기 이탈기와 연결되어 있고, 또한 (ii) 상기 항체 중의 친핵기와 반응하는 능력을 갖는 친전자기를 포함하는 2가의 기이고,
　B는 생체 직교성 관능기이고,
　상기 이탈기는 상기 친핵기와 상기 친전자기 사이의 반응에 의해 E로부터 절단되어 이탈하는 능력을 갖는다.〕
Figure pct00127
Figure pct00128
Figure pct00129
Figure pct00130
Figure pct00131
이상으로, 항체에 대한 친화성 물질, 절단성 부분 및 반응성기를 갖는 화합물에서, 친화성 물질의 종류, 친화성 물질과 반응성기 사이의 링커의 길이, 및 링커가 도입되는 친화성 물질 중의 위치 등의 인자를 적절히 조절함으로써, 항체를 위치 선택적으로 수식할 수 있는 것이 나타나졌다.
[산업상 사용가능성]
본 발명은, 예를 들어, 위치 선택적으로 수식된 항체의 제조에 유용하다.
<110> Ajinomoto Co., Inc. <120> Compounds and salts thereof comprising an affinity substance to an antibody, and a bioorthogonal group <130> PAMA-20541 <150> JP2018-113962 <151> 2018-06-14 <160> 108 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 230 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc region of human IgG1 <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (140)..(140) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (142)..(142) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (177)..(177) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 1 Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 1 5 10 15 Glu Xaa Xaa Gly Xaa Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 20 25 30 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 35 40 45 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 50 55 60 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 65 70 75 80 Asp Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 85 90 95 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 100 105 110 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 115 120 125 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Xaa Glu Xaa Thr Lys 130 135 140 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 145 150 155 160 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 165 170 175 Xaa Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 180 185 190 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 195 200 205 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 210 215 220 Leu Ser Leu Ser Pro Gly 225 230 <210> 2 <211> 449 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain of Trastuzumab (humanized IgG1 monoclonal antibody) <400> 2 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asp Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly <210> 3 <211> 237 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc region of human IgG1 antibody <400> 3 Ile Glu Gly Arg Met Asp Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys 1 5 10 15 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu 20 25 30 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 35 40 45 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 50 55 60 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 65 70 75 80 Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asp Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 85 90 95 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 100 105 110 Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 115 120 125 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 130 135 140 Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 145 150 155 160 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 165 170 175 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Ala Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 180 185 190 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 195 200 205 Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 210 215 220 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 225 230 235 <210> 4 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain of Trastuzumab (humanized IgG1 monoclonal antibody) <400> 4 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 5 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide having an affinity to Fc region of human IgG. The amino acid residue at N-terminus may be acetylated, and the amino acid residue at C-terminus may be aminated. <400> 5 Phe Asn Met Gln Gln Gln Arg Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp Pro 1 5 10 15 Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Arg Ile Arg Ser Ile Lys Asp 20 25 30 Asp <210> 6 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide having an affinity to Fc region of human IgG. The amino acid residue at N-terminus may be acetylated, and the amino acid residue at C-terminus may be aminated. <400> 6 Phe Asn Met Gln Gln Gln Arg Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp Pro 1 5 10 15 Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Arg Ile Lys Ser Ile Arg Asp 20 25 30 Asp <210> 7 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide having an affinity to Fc region of human IgG. The amino acid residue at N-terminus may be acetylated, and the amino acid residue at C-terminus may be aminated. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> beta-alanine <400> 7 Xaa Asn Met Gln Gln Gln Arg Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp Pro 1 5 10 15 Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Arg Ile Arg Ser Ile Arg Asp 20 25 30 Asp <210> 8 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide having an affinity to Fc region of human IgG. The amino acid residue at N-terminus may be acetylated, and the amino acid residue at C-terminus may be aminated. <400> 8 Phe Asn Met Gln Gln Gln Arg Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp Pro 1 5 10 15 Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Lys Ile Lys Ser Ile Lys Asp 20 25 30 Asp <210> 9 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide having an affinity to Fc region of human IgG. The amino acid residue at N-terminus may be acetylated, and the amino acid residue at C-terminus may be aminated. <400> 9 Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Glu Glu 1 5 10 15 Gln Arg Gly Gly Gly Gly Ser Cys Gly 20 25 <210> 10 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Model for peptide drug <400> 10 His His His His His His Gly 1 5 <210> 11 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide having an affinity to Fc region of human IgG. The amino acid residue at N-terminus may be acetylated, and the amino acid residue at C-terminus may be aminated. <400> 11 Phe Asn Met Gln Gln Gln Arg Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp Pro 1 5 10 15 Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Arg Ile Arg Ser Ile Arg Asp 20 25 30 Asp <210> 12 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide having an affinity to Fc region of human IgG. The amino acid residue at N-terminus may be acetylated, and the amino acid residue at C-terminus may be aminated. <400> 12 Phe Asn Met Gln Cys Gln Arg Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp Pro 1 5 10 15 Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Arg Ile Arg Ser Ile Arg Asp 20 25 30 Asp Cys <210> 13 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide having an affinity to Fc region of human IgG. The amino acid residue at N-terminus may be acetylated, and the amino acid residue at C-terminus may be aminated. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> beta-alanine <400> 13 Xaa Asn Met Gln Gln Gln Arg Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp Pro 1 5 10 15 Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Arg Ile Arg Ser Ile Arg Asp 20 25 30 Asp <210> 14 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide having an affinity to Fc region of human IgG. The amino acid residue at N-terminus may be acetylated, and the amino acid residue at C-terminus may be aminated. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> beta-alanine <400> 14 Xaa Asn Met Gln Cys Gln Arg Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp Pro 1 5 10 15 Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Arg Ile Arg Ser Ile Arg Asp 20 25 30 Asp Cys <210> 15 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide having an affinity to Fc region of human IgG. The amino acid residue at N-terminus may be acetylated, the amino acid residue at C-terminus may be aminated and two cysteine residues may be linked by disulfide bridge. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> absent, or arginine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> absent, or glycine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> absent, aspartic acid, or asparagine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> alanine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> tyrosine, tryptophan, or histidine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> histidine, phenylalanine, tyrosine, tryptophan, arginine, or glycine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> lysine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> glycine, serine, asparagine, glutamine, aspartic acid, glutamic acide, phenylalanine, tyrosine, tryptophan, histidine, threonine, leucine, alanine, valine, isoleucine, or arginine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> glutamine, glutamic acid, asparagine, or aspartic acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> absent, or threonine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> absent, or tyrosine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> absent, or histidine <400> 15 Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ile Ile Trp Cys Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa <210> 16 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide having an affinity to Fc region of human IgG. The amino acid residue at N-terminus may be acetylated, the amino acid residue at C-terminus may be aminated and two cysteine residues may be linked by disulfide bridge. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> absent, or arginine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> absent, or glycine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> absent, aspartic acid, or asparagine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> alanine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> tyrosine, tryptophan, or histidine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> histidine, phenylalanine, tyrosine, tryptophan, arginine, or glycine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> lysine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> glycine, serine, asparagine, glutamine, aspartic acid, glutamic acide, phenylalanine, tyrosine, tryptophan, histidine, threonine, leucine, alanine, valine, isoleucine, or arginine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> glutamine, glutamic acid, asparagine, or aspartic acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> absent, or threonine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> absent, or tyrosine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> absent, or histidine <400> 16 Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ile Val Trp Cys Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa <210> 17 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide having an affinity to Fc region of human IgG. The amino acid residue at N-terminus may be acetylated, the amino acid residue at C-terminus may be aminated and two cysteine residues may be linked by disulfide bridge. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> absent, or arginine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> absent, or glycine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> absent, aspartic acid, or asparagine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> alanine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> tyrosine, tryptophan, or histidine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> histidine, phenylalanine, tyrosine, tryptophan, arginine, or glycine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> lysine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> glycine, serine, asparagine, glutamine, aspartic acid, glutamic acide, phenylalanine, tyrosine, tryptophan, histidine, threonine, leucine, alanine, valine, isoleucine, or arginine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> glutamine, glutamic acid, asparagine, or aspartic acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> absent, or threonine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> absent, or tyrosine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> absent, or histidine <400> 17 Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Val Val Trp Cys Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa <210> 18 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide having an affinity to Fc region of human IgG. The amino acid residue at N-terminus may be acetylated, the amino acid residue at C-terminus may be aminated and two cysteine residues may be linked by disulfide bridge. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> absent, or arginine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> absent, or glycine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> absent, aspartic acid, or asparagine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> alanine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> tyrosine, tryptophan, or histidine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> histidine, phenylalanine, tyrosine, tryptophan, arginine, or glycine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> lysine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> glycine, serine, asparagine, glutamine, aspartic acid, glutamic acide, phenylalanine, tyrosine, tryptophan, histidine, threonine, leucine, alanine, valine, isoleucine, or arginine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> glutamine, glutamic acid, asparagine, or aspartic acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> absent, or threonine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> absent, or tyrosine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> absent, or histidine <400> 18 Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Val Trp Cys Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa <210> 19 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide having an affinity to Fc region of human IgG. The amino acid residue at N-terminus may be acetylated, the amino acid residue at C-terminus may be aminated and two cysteine residues may be linked by disulfide bridge. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> absent, or arginine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> absent, or glycine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> absent, aspartic acid, or asparagine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> alanine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> tyrosine, tryptophan, or histidine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> histidine, phenylalanine, tyrosine, tryptophan, arginine, or glycine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> lysine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> glycine, serine, asparagine, glutamine, aspartic acid, glutamic acide, phenylalanine, tyrosine, tryptophan, histidine, threonine, leucine, alanine, valine, isoleucine, or arginine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> glutamine, glutamic acid, asparagine, or aspartic acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> absent, or threonine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> absent, or tyrosine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> absent, or histidine <400> 19 Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Leu Trp Cys Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa <210> 20 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide having an affinity to Fc region of human IgG. The amino acid residue at N-terminus may be acetylated, the amino acid residue at C-terminus may be aminated and two cysteine residues may be linked by disulfide bridge. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> absent, or arginine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> absent, or glycine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> absent, aspartic acid, or asparagine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> alanine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> tyrosine, tryptophan, or histidine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> histidine, phenylalanine, tyrosine, tryptophan, arginine, or glycine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> lysine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> glycine, serine, asparagine, glutamine, aspartic acid, glutamic acide, phenylalanine, tyrosine, tryptophan, histidine, threonine, leucine, alanine, valine, isoleucine, or arginine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> glutamine, glutamic acid, asparagine, or aspartic acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> absent, or threonine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> absent, or tyrosine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> absent, or histidine <400> 20 Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Ile Trp Cys Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa <210> 21 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide having an affinity to Fc region of human IgG. The amino acid residue at N-terminus may be acetylated, the amino acid residue at C-terminus may be aminated and two cysteine residues may be linked by disulfide bridge. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> absent, or arginine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> absent, or glycine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> absent, aspartic acid, or asparagine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> alanine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> tyrosine, tryptophan, or histidine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> histidine, phenylalanine, tyrosine, tryptophan, arginine, or glycine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> lysine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> glycine, serine, asparagine, glutamine, aspartic acid, glutamic acide, phenylalanine, tyrosine, tryptophan, histidine, threonine, leucine, alanine, valine, isoleucine, or arginine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> glutamine, glutamic acid, asparagine, or aspartic acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> absent, or threonine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> absent, or tyrosine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> absent, or histidine <400> 21 Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Val Phe Cys Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa <210> 22 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide having an affinity to Fc region of human IgG. The amino acid residue at N-terminus may be acetylated, the amino acid residue at C-terminus may be aminated and two cysteine residues may be linked by disulfide bridge. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> absent, or arginine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> absent, or glycine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> absent, aspartic acid, or asparagine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> alanine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> tyrosine, tryptophan, or histidine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> histidine, phenylalanine, tyrosine, tryptophan, arginine, or glycine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> lysine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> glycine, serine, asparagine, glutamine, aspartic acid, glutamic acide, phenylalanine, tyrosine, tryptophan, histidine, threonine, leucine, alanine, valine, isoleucine, or arginine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> glutamine, glutamic acid, asparagine, or aspartic acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> absent, or threonine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> absent, or tyrosine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> absent, or histidine <400> 22 Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gln Val Trp Cys Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa <210> 23 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide having an affinity to Fc region of human IgG. The amino acid residue at N-terminus may be acetylated, the amino acid residue at C-terminus may be aminated and two cysteine residues may be linked by disulfide bridge. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> absent, or arginine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> absent, or glycine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> absent, aspartic acid, or asparagine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> alanine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> tyrosine, tryptophan, or histidine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> histidine, phenylalanine, tyrosine, tryptophan, arginine, or glycine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> lysine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> glycine, serine, asparagine, glutamine, aspartic acid, glutamic acide, phenylalanine, tyrosine, tryptophan, histidine, threonine, leucine, alanine, valine, isoleucine, or arginine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> glutamine, glutamic acid, asparagine, or aspartic acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> absent, or threonine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> absent, or tyrosine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> absent, or histidine <400> 23 Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Val Trp Cys Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa <210> 24 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide having an affinity to Fc region of human IgG. The amino acid residue at N-terminus may be acetylated, the amino acid residue at C-terminus may be aminated and two cysteine residues may be linked by disulfide bridge. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> absent, or arginine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> absent, or glycine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> absent, aspartic acid, or asparagine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> alanine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> tyrosine, tryptophan, or histidine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> histidine, phenylalanine, tyrosine, tryptophan, arginine, or glycine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> lysine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> glycine, serine, asparagine, glutamine, aspartic acid, glutamic acide, phenylalanine, tyrosine, tryptophan, histidine, threonine, leucine, alanine, valine, isoleucine, or arginine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> glutamine, glutamic acid, asparagine, or aspartic acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> absent, or threonine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> absent, or tyrosine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> absent, or histidine <400> 24 Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Val Trp Cys Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa <210> 25 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide having an affinity to CH2 region of human IgG <400> 25 Glu Pro Ile His Arg Ser Thr Leu Thr Ala Leu Leu 1 5 10 <210> 26 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide having an affinity to Fc region of human IgG <400> 26 Phe Ala Arg Leu Val Ser Ser Ile Arg Tyr 1 5 10 <210> 27 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide having an affinity to Fc region of human IgG <400> 27 Phe Gly Arg Leu Val Ser Ser Ile Arg Tyr 1 5 10 <210> 28 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide having an affinity to Fc region of human IgG <400> 28 Thr Trp Lys Thr Ser Arg Ile Ser Ile Phe 1 5 10 <210> 29 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide having an affinity to specific region of human IgG <400> 29 Gln Ser Tyr Pro 1 <210> 30 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide having an affinity to Fc region of human IgG <400> 30 His Trp Arg Gly Trp Val 1 5 <210> 31 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide having an affinity to Fc region of human IgG <400> 31 His Tyr Phe Lys Phe Asp 1 5 <210> 32 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide having an affinity to Fc region of human IgG <400> 32 His Phe Arg Arg His Leu 1 5 <210> 33 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide having an affinity to Fc region of human IgG <400> 33 Asp Ala Ala Gly 1 <210> 34 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide having an affinity to Fc region of human IgG <400> 34 Asn Ala Arg Lys Phe Tyr Lys Gly 1 5 <210> 35 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide having an affinity to Fc region of human IgG <400> 35 Asn Lys Phe Arg Gly Lys Tyr Lys 1 5 <210> 36 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Phenylalanine residue at N-terminus may be acetylated and two cysteine residues may be linked by disulfide bridge <400> 36 Phe Asn Met Gln Cys Gln Arg Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp Pro 1 5 10 15 Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Lys Ile Lys Ser Ile Arg Asp 20 25 30 Asp Cys <210> 37 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Lysine residue at N-terminus may be acetylated and two cysteine residues may be linked by disulfide bridge <400> 37 Lys Asn Met Gln Cys Gln Arg Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp Pro 1 5 10 15 Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Arg Ile Arg Ser Ile Arg Asp 20 25 30 Asp Cys <210> 38 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Phenylalanine residue at N-terminus may be acetylated and two cysteine residues may be linked by disulfide bridge <400> 38 Phe Asn Met Gln Cys Gln Lys Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp Pro 1 5 10 15 Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Arg Ile Arg Ser Ile Arg Asp 20 25 30 Asp Cys <210> 39 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Phenylalanine residue at N-terminus may be acetylated and two cysteine residues may be linked by disulfide bridge <400> 39 Phe Asn Met Gln Cys Gln Arg Arg Phe Tyr Glu Ala Lys His Asp Pro 1 5 10 15 Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Arg Ile Arg Ser Ile Arg Asp 20 25 30 Asp Cys <210> 40 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Phenylalanine residue at N-terminus may be acetylated and two cysteine residues may be linked by disulfide bridge <400> 40 Phe Asn Met Gln Cys Gln Arg Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp Pro 1 5 10 15 Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Lys Ala Arg Ile Arg Ser Ile Arg Asp 20 25 30 Asp Cys <210> 41 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Phenylalanine residue at N-terminus may be acetylated and two cysteine residues may be linked by disulfide bridge <400> 41 Phe Asn Met Gln Cys Gln Arg Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp Pro 1 5 10 15 Asn Leu Asn Lys Glu Gln Arg Asn Ala Arg Ile Arg Ser Ile Arg Asp 20 25 30 Asp Cys <210> 42 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Phenylalanine residue at N-terminus may be acetylated and two cysteine residues may be linked by disulfide bridge <400> 42 Phe Asn Met Gln Cys Gln Arg Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp Pro 1 5 10 15 Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Arg Ile Arg Ser Ile Lys Asp 20 25 30 Asp Cys <210> 43 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Phenylalanine residue at N-terminus may be acetylated and two cysteine residues may be linked by disulfide bridge <400> 43 Phe Asn Lys Gln Cys Gln Arg Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp Pro 1 5 10 15 Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Arg Ile Arg Ser Ile Arg Asp 20 25 30 Asp Cys <210> 44 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Phenylalanine residue at N-terminus may be acetylated and two cysteine residues may be linked by disulfide bridge <400> 44 Phe Asn Met Gln Cys Lys Arg Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp Pro 1 5 10 15 Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Arg Ile Arg Ser Ile Arg Asp 20 25 30 Asp Cys <210> 45 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Phenylalanine residue at N-terminus may be acetylated and two cysteine residues may be linked by disulfide bridge <400> 45 Phe Asn Met Gln Cys Gln Arg Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp Pro 1 5 10 15 Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Arg Ile Arg Ser Ile Arg Lys 20 25 30 Asp Cys <210> 46 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide having an affinity to Fc region of human IgG. The amino acid residue at N-terminus may be acetylated, the amino acid residue at C-terminus may be aminated and two cysteine residues may be linked by disulfide bridge. <400> 46 Arg Gly Asn Cys Ala Tyr His Lys Gly Gln Ile Ile Trp Cys Thr Tyr 1 5 10 15 His <210> 47 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide having an affinity to Fc region of human IgG. The amino acid residue at N-terminus may be acetylated, the amino acid residue at C-terminus may be aminated and two cysteine residues may be linked by disulfide bridge. <400> 47 Arg Gly Asn Cys Ala Tyr His Lys Gly Gln Ile Val Trp Cys Thr Tyr 1 5 10 15 His <210> 48 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide having an affinity to Fc region of human IgG. The amino acid residue at N-terminus may be acetylated, the amino acid residue at C-terminus may be aminated and two cysteine residues may be linked by disulfide bridge. <400> 48 Arg Gly Asn Cys Ala Tyr His Lys Gly Gln Val Val Trp Cys Thr Tyr 1 5 10 15 His <210> 49 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide having an affinity to Fc region of human IgG. The amino acid residue at N-terminus may be acetylated, the amino acid residue at C-terminus may be aminated and two cysteine residues may be linked by disulfide bridge. <400> 49 Arg Gly Asn Cys Ala Tyr His Lys Gly Gln Ala Val Trp Cys Thr Tyr 1 5 10 15 His <210> 50 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide having an affinity to Fc region of human IgG. The amino acid residue at N-terminus may be acetylated, the amino acid residue at C-terminus may be aminated and two cysteine residues may be linked by disulfide bridge. <400> 50 Arg Gly Asn Cys Ala Tyr His Lys Gly Gln Leu Leu Trp Cys Thr Tyr 1 5 10 15 His <210> 51 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide having an affinity to Fc region of human IgG. The amino acid residue at N-terminus may be acetylated, the amino acid residue at C-terminus may be aminated and two cysteine residues may be linked by disulfide bridge. <400> 51 Arg Gly Asn Cys Ala Tyr His Lys Gly Gln Leu Ile Trp Cys Thr Tyr 1 5 10 15 His <210> 52 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide having an affinity to Fc region of human IgG. The amino acid residue at N-terminus may be acetylated, the amino acid residue at C-terminus may be aminated and two cysteine residues may be linked by disulfide bridge. <400> 52 Asp Cys Ala Tyr His Lys Gly Gln Ile Val Trp Cys Thr 1 5 10 <210> 53 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide having an affinity to Fc region of human IgG. The amino acid residue at N-terminus may be acetylated, the amino acid residue at C-terminus may be aminated and two cysteine residues may be linked by disulfide bridge. <400> 53 Asp Cys Ala Tyr His Lys Gly Gln Val Val Trp Cys Thr 1 5 10 <210> 54 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide having an affinity to Fc region of human IgG. The amino acid residue at N-terminus may be acetylated, the amino acid residue at C-terminus may be aminated and two cysteine residues may be linked by disulfide bridge. <400> 54 Asp Cys Ala Tyr His Lys Gly Gln Ala Val Trp Cys Thr 1 5 10 <210> 55 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> eptide having an affinity to Fc region of human IgG. The amino acid residue at N-terminus may be acetylated, the amino acid residue at C-terminus may be aminated and two cysteine residues may be linked by disulfide bridge. <400> 55 Arg Gly Asn Cys Ala Tyr His Lys Ser Gln Ile Ile Trp Cys Thr Tyr 1 5 10 15 His <210> 56 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide having an affinity to Fc region of human IgG. The amino acid residue at N-terminus may be acetylated, the amino acid residue at C-terminus may be aminated and two cysteine residues may be linked by disulfide bridge. <400> 56 Arg Gly Asn Cys Ala Tyr His Lys Asn Gln Ile Ile Trp Cys Thr Tyr 1 5 10 15 His <210> 57 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide having an affinity to Fc region of human IgG. The amino acid residue at N-terminus may be acetylated, the amino acid residue at C-terminus may be aminated and two cysteine residues may be linked by disulfide bridge. <400> 57 Arg Gly Asn Cys Ala Tyr His Lys Asp Gln Ile Ile Trp Cys Thr Tyr 1 5 10 15 His <210> 58 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide having an affinity to Fc region of human IgG. The amino acid residue at N-terminus may be acetylated, the amino acid residue at C-terminus may be aminated and two cysteine residues may be linked by disulfide bridge. <400> 58 Arg Gly Asn Cys Ala Tyr His Lys Gln Gln Ile Ile Trp Cys Thr Tyr 1 5 10 15 His <210> 59 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide having an affinity to Fc region of human IgG. The amino acid residue at N-terminus may be acetylated, the amino acid residue at C-terminus may be aminated and two cysteine residues may be linked by disulfide bridge. <400> 59 Arg Gly Asn Cys Ala Tyr His Lys Glu Gln Ile Ile Trp Cys Thr Tyr 1 5 10 15 His <210> 60 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide having an affinity to Fc region of human IgG. The amino acid residue at N-terminus may be acetylated, the amino acid residue at C-terminus may be aminated and two cysteine residues may be linked by disulfide bridge. <400> 60 Arg Gly Asn Cys Ala Tyr His Lys Phe Gln Ile Ile Trp Cys Thr Tyr 1 5 10 15 His <210> 61 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide having an affinity to Fc region of human IgG. The amino acid residue at N-terminus may be acetylated, the amino acid residue at C-terminus may be aminated and two cysteine residues may be linked by disulfide bridge. <400> 61 Arg Gly Asn Cys Ala Tyr His Lys Tyr Gln Ile Ile Trp Cys Thr Tyr 1 5 10 15 His <210> 62 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide having an affinity to Fc region of human IgG. The amino acid residue at N-terminus may be acetylated, the amino acid residue at C-terminus may be aminated and two cysteine residues may be linked by disulfide bridge. <400> 62 Arg Gly Asn Cys Ala Tyr His Lys Trp Gln Ile Ile Trp Cys Thr Tyr 1 5 10 15 His <210> 63 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide having an affinity to Fc region of human IgG. The amino acid residue at N-terminus may be acetylated, the amino acid residue at C-terminus may be aminated and two cysteine residues may be linked by disulfide bridge. <400> 63 Arg Gly Asn Cys Ala Tyr His Lys His Gln Ile Ile Trp Cys Thr Tyr 1 5 10 15 His <210> 64 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide having an affinity to Fc region of human IgG. The amino acid residue at N-terminus may be acetylated, the amino acid residue at C-terminus may be aminated and two cysteine residues may be linked by disulfide bridge. <400> 64 Arg Gly Asn Cys Ala Tyr His Lys Thr Gln Ile Ile Trp Cys Thr Tyr 1 5 10 15 His <210> 65 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide having an affinity to Fc region of human IgG. The amino acid residue at N-terminus may be acetylated, the amino acid residue at C-terminus may be aminated and two cysteine residues may be linked by disulfide bridge. <400> 65 Arg Gly Asn Cys Ala Tyr His Lys Leu Gln Ile Ile Trp Cys Thr Tyr 1 5 10 15 His <210> 66 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide having an affinity to Fc region of human IgG. The amino acid residue at N-terminus may be acetylated, the amino acid residue at C-terminus may be aminated and two cysteine residues may be linked by disulfide bridge. <400> 66 Cys Ala Tyr His Lys Leu Gln Ile Val Trp Cys 1 5 10 <210> 67 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide having an affinity to Fc region of human IgG. The amino acid residue at N-terminus may be acetylated, the amino acid residue at C-terminus may be aminated and two cysteine residues may be linked by disulfide bridge. <400> 67 Cys Ala Tyr His Lys Leu Gln Leu Ile Trp Cys 1 5 10 <210> 68 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide having an affinity to Fc region of human IgG. The amino acid residue at N-terminus may be acetylated, the amino acid residue at C-terminus may be aminated and two cysteine residues may be linked by disulfide bridge. <400> 68 Cys Ala Tyr His Lys Ser Gln Ile Val Trp Cys 1 5 10 <210> 69 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide having an affinity to Fc region of human IgG. The amino acid residue at N-terminus may be acetylated, the amino acid residue at C-terminus may be aminated and two cysteine residues may be linked by disulfide bridge. <400> 69 Arg Gly Asn Cys Ala Tyr His Lys Gly Gln Leu Val Phe Cys Thr Tyr 1 5 10 15 His <210> 70 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide having an affinity to Fc region of human IgG. The amino acid residue at N-terminus may be acetylated, the amino acid residue at C-terminus may be aminated and two cysteine residues may be linked by disulfide bridge. <400> 70 Arg Gly Asn Cys Ala Tyr His Lys Gly Gln Gln Val Trp Cys Thr Tyr 1 5 10 15 His <210> 71 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide having an affinity to Fc region of human IgG. The amino acid residue at N-terminus may be acetylated, the amino acid residue at C-terminus may be aminated and two cysteine residues may be linked by disulfide bridge. <400> 71 Arg Gly Asn Cys Ala Tyr His Lys Gly Gln Glu Val Trp Cys Thr Tyr 1 5 10 15 His <210> 72 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide having an affinity to Fc region of human IgG. The amino acid residue at N-terminus may be acetylated, the amino acid residue at C-terminus may be aminated and two cysteine residues may be linked by disulfide bridge. <400> 72 Cys Ala Tyr His Lys Gly Gln Leu Val Trp Cys 1 5 10 <210> 73 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide having an affinity to Fc region of human IgG. The amino acid residue at N-terminus may be acetylated, the amino acid residue at C-terminus may be aminated and two cysteine residues may be linked by disulfide bridge. <400> 73 Arg Gly Asn Cys Ala Tyr His Lys Ala Gln Leu Val Trp Cys Thr Tyr 1 5 10 15 His <210> 74 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide having an affinity to Fc region of human IgG. The amino acid residue at N-terminus may be acetylated, the amino acid residue at C-terminus may be aminated and two cysteine residues may be linked by disulfide bridge. <400> 74 Arg Gly Asn Cys Ala Tyr His Lys Val Gln Leu Val Trp Cys Thr Tyr 1 5 10 15 His <210> 75 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide having an affinity to Fc region of human IgG. The amino acid residue at N-terminus may be acetylated, the amino acid residue at C-terminus may be aminated and two cysteine residues may be linked by disulfide bridge. <400> 75 Arg Gly Asn Cys Ala Tyr His Lys Leu Gln Leu Val Trp Cys Thr Tyr 1 5 10 15 His <210> 76 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide having an affinity to Fc region of human IgG. The amino acid residue at N-terminus may be acetylated, the amino acid residue at C-terminus may be aminated and two cysteine residues may be linked by disulfide bridge. <400> 76 Arg Gly Asn Cys Ala Tyr His Lys Ile Gln Leu Val Trp Cys Thr Tyr 1 5 10 15 His <210> 77 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide having an affinity to Fc region of human IgG. The amino acid residue at N-terminus may be acetylated, the amino acid residue at C-terminus may be aminated and two cysteine residues may be linked by disulfide bridge. <400> 77 Arg Gly Asn Cys Ala Tyr His Lys Ser Gln Leu Val Trp Cys Thr Tyr 1 5 10 15 His <210> 78 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide having an affinity to Fc region of human IgG. The amino acid residue at N-terminus may be acetylated, the amino acid residue at C-terminus may be aminated and two cysteine residues may be linked by disulfide bridge. <400> 78 Arg Gly Asn Cys Ala Tyr His Lys Thr Gln Leu Val Trp Cys Thr Tyr 1 5 10 15 His <210> 79 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide having an affinity to Fc region of human IgG. The amino acid residue at N-terminus may be acetylated, the amino acid residue at C-terminus may be aminated and two cysteine residues may be linked by disulfide bridge. <400> 79 Arg Gly Asn Cys Ala Tyr His Lys Asn Gln Leu Val Trp Cys Thr Tyr 1 5 10 15 His <210> 80 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide having an affinity to Fc region of human IgG. The amino acid residue at N-terminus may be acetylated, the amino acid residue at C-terminus may be aminated and two cysteine residues may be linked by disulfide bridge. <400> 80 Arg Gly Asn Cys Ala Tyr His Lys Asp Gln Leu Val Trp Cys Thr Tyr 1 5 10 15 His <210> 81 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide having an affinity to Fc region of human IgG. The amino acid residue at N-terminus may be acetylated, the amino acid residue at C-terminus may be aminated and two cysteine residues may be linked by disulfide bridge. <400> 81 Arg Gly Asn Cys Ala Tyr His Lys Gln Gln Leu Val Trp Cys Thr Tyr 1 5 10 15 His <210> 82 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide having an affinity to Fc region of human IgG. The amino acid residue at N-terminus may be acetylated, the amino acid residue at C-terminus may be aminated and two cysteine residues may be linked by disulfide bridge. <400> 82 Arg Gly Asn Cys Ala Tyr His Lys Glu Gln Leu Val Trp Cys Thr Tyr 1 5 10 15 His <210> 83 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide having an affinity to Fc region of human IgG. The amino acid residue at N-terminus may be acetylated, the amino acid residue at C-terminus may be aminated and two cysteine residues may be linked by disulfide bridge. <400> 83 Arg Gly Asn Cys Ala Tyr His Lys Phe Gln Leu Val Trp Cys Thr Tyr 1 5 10 15 His <210> 84 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide having an affinity to Fc region of human IgG. The amino acid residue at N-terminus may be acetylated, the amino acid residue at C-terminus may be aminated and two cysteine residues may be linked by disulfide bridge. <400> 84 Arg Gly Asn Cys Ala Tyr His Lys Arg Gln Leu Val Trp Cys Thr Tyr 1 5 10 15 His <210> 85 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide having an affinity to Fc region of human IgG. The amino acid residue at N-terminus may be acetylated, the amino acid residue at C-terminus may be aminated and two cysteine residues may be linked by disulfide bridge. <400> 85 Arg Gly Asn Cys Ala Tyr His Lys His Gln Leu Val Trp Cys Thr Tyr 1 5 10 15 His <210> 86 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide having an affinity to Fc region of human IgG. The amino acid residue at N-terminus may be acetylated, the amino acid residue at C-terminus may be aminated and two cysteine residues may be linked by disulfide bridge. <400> 86 Arg Gly Asn Cys Ala Tyr His Lys Trp Gln Leu Val Trp Cys Thr Tyr 1 5 10 15 His <210> 87 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide having an affinity to Fc region of human IgG. The amino acid residue at N-terminus may be acetylated, the amino acid residue at C-terminus may be aminated and two cysteine residues may be linked by disulfide bridge. <400> 87 Arg Gly Asn Cys Ala Tyr His Lys Tyr Gln Leu Val Trp Cys Thr Tyr 1 5 10 15 His <210> 88 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide having an affinity to Fc region of human IgG. The amino acid residue at N-terminus may be acetylated, the amino acid residue at C-terminus may be aminated and two cysteine residues may be linked by disulfide bridge. <400> 88 Arg Gly Asn Cys Ala Tyr Phe Lys Gly Gln Leu Val Trp Cys Thr Tyr 1 5 10 15 His <210> 89 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide having an affinity to Fc region of human IgG. The amino acid residue at N-terminus may be acetylated, the amino acid residue at C-terminus may be aminated and two cysteine residues may be linked by disulfide bridge. <400> 89 Arg Gly Asn Cys Ala Tyr Tyr Lys Gly Gln Leu Val Trp Cys Thr Tyr 1 5 10 15 His <210> 90 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide having an affinity to Fc region of human IgG. The amino acid residue at N-terminus may be acetylated, the amino acid residue at C-terminus may be aminated and two cysteine residues may be linked by disulfide bridge. <400> 90 Arg Gly Asn Cys Ala Tyr Trp Lys Gly Gln Leu Val Trp Cys Thr Tyr 1 5 10 15 His <210> 91 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide having an affinity to Fc region of human IgG. The amino acid residue at N-terminus may be acetylated, the amino acid residue at C-terminus may be aminated and two cysteine residues may be linked by disulfide bridge. <400> 91 Arg Gly Asn Cys Ala Tyr Arg Lys Gly Gln Leu Val Trp Cys Thr Tyr 1 5 10 15 His <210> 92 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide having an affinity to Fc region of human IgG. The amino acid residue at N-terminus may be acetylated, the amino acid residue at C-terminus may be aminated and two cysteine residues may be linked by disulfide bridge. <400> 92 Arg Gly Asn Cys Ala Tyr Gly Lys Gly Gln Leu Val Trp Cys Thr Tyr 1 5 10 15 His <210> 93 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide having an affinity to Fc region of human IgG. The amino acid residue at N-terminus may be acetylated, the amino acid residue at C-terminus may be aminated and two cysteine residues may be linked by disulfide bridge. <400> 93 Asp Cys Ala Tyr His Lys Gly Gln Leu Val Trp Cys 1 5 10 <210> 94 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide having an affinity to Fc region of human IgG. The amino acid residue at N-terminus may be acetylated, the amino acid residue at C-terminus may be aminated and two cysteine residues may be linked by disulfide bridge. <400> 94 Asn Cys Ala Tyr His Lys Gly Gln Leu Val Trp Cys 1 5 10 <210> 95 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide having an affinity to Fc region of human IgG. The amino acid residue at N-terminus may be acetylated, the amino acid residue at C-terminus may be aminated and two cysteine residues may be linked by disulfide bridge. <400> 95 Cys Ala Tyr His Lys Gly Gln Leu Val Trp Cys Thr 1 5 10 <210> 96 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide having an affinity to Fc region of human IgG. The amino acid residue at N-terminus may be acetylated, the amino acid residue at C-terminus may be aminated and two cysteine residues may be linked by disulfide bridge. <400> 96 Cys Ala Tyr His Lys Ser Gln Leu Val Trp Cys 1 5 10 <210> 97 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide having an affinity to Fc region of human IgG. The amino acid residue at N-terminus may be acetylated, and the amino acid residue at C-terminus may be aminated. <400> 97 Asn Met Gln Gln Gln Arg Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp Pro Asn 1 5 10 15 Leu Glu Glu Gln Arg Asn Ala Arg Ile Arg Ser Ile 20 25 <210> 98 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide having an affinity to Fc region of human IgG. The amino acid residue at N-terminus may be acetylated, and the amino acid residue at C-terminus may be aminated. <400> 98 Phe Asn Met Gln Gln Gln Arg Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp Pro 1 5 10 15 Asn Leu Asn Lys Glu Gln Arg Asn Ala Arg Ile Arg Ser Ile Arg Asp 20 25 30 Asp <210> 99 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide having an affinity to Fc region of human IgG. The amino acid residue at N-terminus may be acetylated, the amino acid residue at C-terminus may be aminated and two cysteine residues may be linked by disulfide bridge. <400> 99 Gly Asn Cys Ala Tyr His Lys Gly Gln Ile Ile Trp Cys Thr Tyr His 1 5 10 15 <210> 100 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide having an affinity to Fc region of human IgG. The amino acid residue at N-terminus may be acetylated, and the amino acid residue at C-terminus may be aminated. <400> 100 Asn Met Gln Gln Gln Arg Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp Pro Asn 1 5 10 15 Leu Glu Glu Gln Arg Asn Ala Arg Ile Arg Ser Ile Lys Asp Asp 20 25 30 <210> 101 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptice fragment containing lysin residue at position 317 in human IgG <400> 101 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 1 5 10 15 Glu Tyr Lys <210> 102 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptice fragment containing lysin residue at position 247or 249 in denosumab <400> 102 Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro 1 5 10 15 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 20 25 30 Arg <210> 103 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptice fragment containing lysin residue at position 251or 253 in dupixent <400> 103 Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly 1 5 10 15 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 20 25 30 Ser Arg <210> 104 <211> 447 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of heavy chain of denosumab <400> 104 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Thr Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Pro Gly Thr Thr Val Ile Met Ser Trp Phe Asp Pro Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 115 120 125 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr 130 135 140 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 165 170 175 Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 180 185 190 Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp 195 200 205 His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys 210 215 220 Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 <210> 105 <211> 215 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of light chain of denosumab <400> 105 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Arg Gly Arg 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Phe Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95 Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala 100 105 110 Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser 115 120 125 Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 130 135 140 Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser 145 150 155 160 Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 165 170 175 Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val 180 185 190 Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys 195 200 205 Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 106 <211> 452 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of heavy chain of dupixent <400> 106 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Glu Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asp Tyr 20 25 30 Ala Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Arg Leu Ser Ile Thr Ile Arg Pro Arg Tyr Tyr Gly Leu 100 105 110 Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 115 120 125 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser 130 135 140 Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 145 150 155 160 Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 165 170 175 Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 180 185 190 Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys 195 200 205 Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu 210 215 220 Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu 225 230 235 240 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 245 250 255 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 260 265 270 Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 275 280 285 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr 290 295 300 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 305 310 315 320 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser 325 330 335 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 340 345 350 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 355 360 365 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 370 375 380 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 385 390 395 400 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr 405 410 415 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 420 425 430 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 435 440 445 Ser Leu Gly Lys 450 <210> 107 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of light chain of dupixent <400> 107 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30 Ile Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Ser Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Phe Tyr Tyr Cys Met Gln Ala 85 90 95 Leu Gln Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 195 200 205 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 108 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide having an affinity to Fc region of human IgG. The amino acid residue at N-terminus may be acetylated, the amino acid residue at C-terminus may be aminated and two cysteine residues may be linked by disulfide bridge. <400> 108 Arg Gly Asn Cys Ala Tyr His Glu Gly Gln Ile Ile Trp Cys Thr Tyr 1 5 10 15 His

Claims (37)

  1. 하기 화학식 I로 표시되는, 항체에 대한 친화성 물질 및 생체 직교성 관능기를 갖는 화합물 또는 이의 염:
    [화학식 I]
    A-L-E-B (I)
    식 중,
    A는 항체에 대한 친화성 물질이고,
    L은 이탈기를 포함하는 2가의 기이고,
    E는 (i) 상기 이탈기와 연결되어 있고, 또한 (ii) 상기 항체 중의 친핵기와 반응하는 능력을 갖는 친전자기를 포함하는 2가의 기이고,
    B는 생체 직교성 관능기이고,
    상기 이탈기는 상기 친핵기와 상기 친전자기 사이의 반응에 의해 E로부터 절단되어 이탈하는 능력을 갖는다.
  2. 제1항에 있어서,　상기 친화성 물질이 펩타이드인, 화합물 또는 이의 염.
  3. 제2항에 있어서, 상기 펩타이드가 모노클로날 항체의 정상 영역에 대한 결합능을 갖는 펩타이드인, 화합물 또는 이의 염.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 펩타이드가 모노클로날 항체의 Fc 영역에 대한 결합능을 갖는 펩타이드인, 화합물 또는 이의 염.
  5. 제4항에 있어서, 상기 펩타이드가 IgG의 Fc 영역에 대한 결합능을 갖는 펩타이드인, 화합물 또는 이의 염.
  6. 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드가 10 내지 40의 아미노산 잔기를 갖는, 화합물 또는 이의 염.
  7. 제2항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드가,
    (a) (a-1-1) FNMQQQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDD (서열 번호 11)의 아미노산 서열, 또는
    (a-1-2) FNMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDC (서열 번호 12)의 아미노산 서열에서,
    서열 중의 어느 하나의 1개 내지 3개의 아미노산 잔기가 동일해도 상이해도 좋고, 라이신 잔기, 아스파라긴산 잔기 및 글루타민산 잔기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 각각 하나의 아미노산 잔기에 의해 치환되어 있거나,
    (a-2-1) β-Ala-NMQQQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDD (서열 번호 13)의 아미노산 서열, 또는
    (a-2-2) β-Ala-NMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDC (서열 번호 14)의 아미노산 서열에서,
    서열 중 어느 하나의 1개 내지 3개의 아미노산 잔기가 동일해도 상이해도 좋고, 라이신 잔기, 아스파라긴산 잔기 및 글루타민산 잔기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 각각 하나의 아미노산 잔기에 의해 치환되어 있고, 또한
    (b) 서열 번호 11 내지 14의 상기 아미노산 서열 각각에 대하여 85% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 화합물 또는 이의 염.
  8. 제2항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드가,
    식 1-1: (X0-3)a-C-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-I-I-W-C-(X0-3)b (서열 번호 15)
    식 1-2: (X0-3)a-C-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-I-V-W-C-(X0-3)b (서열 번호 16)
    식 1-3: (X0-3)a-C-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-V-V-W-C-(X0-3)b (서열 번호 17)
    식 1-4: (X0-3)a-C-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-A-V-W-C-(X0-3)b (서열 번호 18)
    식 1-5: (X0-3)a-C-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-L-L-W-C-(X0-3)b (서열 번호 19)
    식 1-6: (X0-3)a-C-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-L-I-W-C-(X0-3)b (서열 번호 20)
    식 1-7: (X0-3)a-C-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-L-V-F-C-(X0-3)b (서열 번호 21)
    식 1-8: (X0-3)a-C-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Q-V-W-C-(X0-3)b (서열 번호 22)
    식 1-9: (X0-3)a-C-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-E-V-W-C-(X0-3)b (서열 번호 23)
    〔식 중,
    　(X0-3)a는 없음, 아르기닌 잔기-글리신 잔기-아스파라긴 잔기, 아스파라긴산 잔기, 글리신 잔기-아스파라긴 잔기, 또는 아스파라긴 잔기이고,
    　(X0-3)b는 없음, 트레오닌 잔기-타이로신 잔기-히스티딘 잔기, 또는 트레오닌 잔기이고,
    　Xaa1은 알라닌 잔기이고,
    　Xaa2는 타이로신 잔기, 트립토판 잔기 또는 히스티딘 잔기이고,
    　Xaa3는 히스티딘 잔기, 페닐알라닌 잔기, 타이로신 잔기, 트립토판 잔기, 아르기닌 잔기 또는 글리신 잔기이고,
    　Xaa4는 라이신 잔기, 아스파라긴산 잔기 또는 글루타민산 잔기이고,
    　Xaa5는 글리신 잔기, 세린 잔기, 아스파라긴 잔기, 글루타민 잔기, 아스파라긴산 잔기, 글루타민산 잔기, 페닐알라닌 잔기, 타이로신 잔기, 트립토판 잔기, 히스티딘 잔기, 트레오닌 잔기, 류신 잔기, 알라닌 잔기, 발린 잔기, 이소류신 잔기 또는 아르기닌 잔기이고,
    　Xaa6는 글루타민 잔기, 글루타민산 잔기, 아스파라긴 잔기 또는 아스파라긴산 잔기이다.〕 또는
    식 2-1: (X0-3')a-C-(Xaa1')-(Xaa2')-(Xaa3')-(Xaa4')-(Xaa5')-(Xaa6')-L-V-W-C-(X0-3')b (서열 번호 24)
    〔식 중,
    　(X0-3')a 및 (X0-3')b는 각각 상기 (X0-3)a 및 (X0-3)b와 동일하고,
    　Xaa1', Xaa2', Xaa3', Xaa4', Xaa5', Xaa6'는 각각 상기 Xaa1, Xaa2, Xaa3, Xaa4, Xaa5, Xaa6과 동일하다.〕 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는, 화합물 또는 이의 염.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이탈기가, (1) -O-, -S-, -Se-, -SO2-O-, -SO2-N(R)-, -SO2-, -C≡C-CH2-O-, -N(OR)-, -N(R)- 및 -O-N(R)-로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 기 (여기서, R은 수소 원자 또는 탄소 원자수 1 내지 6의 알킬이다.) 또는 (2) 헤테로아릴렌인, 화합물 또는 이의 염.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 친핵기가 라이신 잔기의 측쇄에서의 NH2, 타이로신 잔기의 측쇄에서의 OH, 세린 잔기의 측쇄에서의 OH, 트레오닌 잔기의 측쇄에서의 OH, 및 시스테인 잔기의 측쇄에서의 SH로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 기인, 화합물 또는 이의 염.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 친전자기가 -C(=O)-, -SO2- 및 -CH2-로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 기인, 화합물 또는 이의 염.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생체 직교성 관능기가 아지드 잔기, 알데하이드 잔기, 티올 잔기, 알킨 잔기, 알켄 잔기, 할로겐 잔기, 테트라진 잔기, 니트론 잔기, 하이드록실아민 잔기, 니트릴 잔기, 히드라진 잔기, 케톤 잔기, 보론산 잔기, 시아노벤조티아졸 잔기, 알릴 잔기, 포스핀 잔기, 말레이미드 잔기, 디설파이드 잔기, 티오에스테르 잔기, α-할로카보닐 잔기, 이소니트릴 잔기, 시드논 잔기 및 셀렌 잔기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 기인, 화합물 또는 이의 염.
  13. 제1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생체 직교성 관능기가 아지드 잔기, 티올 잔기, 알킨 잔기, 말레이미드 잔기 및 디설파이드 잔기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 기인, 화합물 또는 이의 염.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 화학식 I로 표시되는 화합물이 하기 화학식 I-1로 표시되는 화합물인, 화합물 또는 이의 염:
    [화학식 I-1]
    A-L1-L2-E1-E2-E3-B (I-1)
    식 중,
    A 및 B는 상기 화학식 I의 것과 동일하고,
    L1은 결합 또는 2가의 기이고,
    L2는 이탈기이고,
    E1은 (i) 상기 이탈기와 연결되어 있고, 또한 (ii) 상기 항체 중의 친핵기와 반응하는 능력을 갖는 친전자기이고,
    E2는 (a) -X-Y-〔여기서, E1과 결합하는 X는 C(R1)(R2) (여기서, R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소 원자 또는 탄소 원자수 1 내지 6의 알킬이다.), N(R3) (여기서, R3는 수소 원자 또는 탄소 원자수 1 내지 6의 알킬이다.), O, S 또는 Se이고, E3와 결합하는 Y는 C(R4)(R5) (여기서, R4 및 R5는 각각 독립적으로 수소 원자 또는 탄소 원자수 1 내지 6의 알킬이다.)이다〕 또는 (b) 하기 화학식 i:
    [화학식 i]
    Figure pct00132

    (여기서, 환 Z는, E1과 결합하는 환 구성 원자 X' 및 이의 양 측면의 환 구성 원자 모두가 탄소 원자인 2가의 환기이거나, E1과 결합하는 환 구성 원자 X'가 질소 원자이며, 또한 질소 원자의 양 측면의 환 구성 원자가 탄소 원자인 2가의 복소환기이고, ·는 결합손이다.)로 표시되는 기이고,
    E3는, E2가 -X-Y-인 경우에는 2가의 기이고, E2가 화학식 i로 표시되는 기인 경우에는 결합 또는 2가의 기이고,
    상기 이탈기는 상기 친핵기와 상기 친전자기 사이의 반응에 의해 E1로부터 절단되어 이탈하는 능력을 갖는다.
  15. 제14항에 있어서, 상기 L2가,
    (a) 환 P-Q-〔여기서, 환 P가, 전자 흡인성 기로 치환되어 있어도 좋은 아릴렌, 전자 흡인성 기로 치환되어 있어도 좋은 헤테로아릴렌, 축환하고 있어도 좋은 2,5-디케토피롤리딘, 축환하고 있어도 좋은 2,6-디케토피페리딘, 축환하고 있어도 좋은 2-케토피롤리딘, 축환하고 있어도 좋은 2-케토피페리딘, 2-피리돈으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 기이고, Q가 -O-, -S-, -Se-, -SO2-O-, -SO2-N(R)-, -SO2-, -C≡C-CH2-O-, -N(OR)-, -N(R)- 및 -O-N(R)-로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 기 (여기서, R은 수소 원자 또는 탄소 원자수 1 내지 6의 알킬이다.)이다.〕,
    (b) 헤테로아릴렌, 또는
    (c) -Q-〔여기서, Q가 -O-, -S-, -Se-, -SO2-O-, -SO2-N(R)-, -SO2-, -C≡C-CH2-O-, -N(OR)-, -N(R)- 및 -O-N(R)-로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 기 (여기서, R은 수소 원자 또는 탄소 원자수 1 내지 6의 알킬이다.)이다.〕인, 화합물 또는 이의 염.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 상기 L2가 하기 구조식으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 기인, 화합물 또는 이의 염:
    Figure pct00133

    여기서, EWG는 전자 흡인성 기이고,
    m은 0 내지 4의 정수이고,
    n은 0 내지 3의 정수이고,
    R은 수소 원자 또는 탄소 원자수 1 내지 6의 알킬이고,
    ○ (백색 원)은 L1에 대한 결합손이고, ● (흑색 원)은 E1에 대한 결합손이다.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, A와 E를 연결하는 L 또는 L1-L2의 주쇄가, 20개 이하의 원자로 이루어진, 화합물 또는 이의 염.
  18. 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학식 I-1로 표시되는 화합물이 하기 화학식 I-2로 표시되는 화합물인, 화합물 또는 이의 염:
    [화학식 I-2]
    A-L1-L2-E1-X-Y-E3-B (I-2)
    식 중,
    A, L1, X, Y, 및 B는 상기 화학식 I-1의 것과 동일하고,
    L2는,
    (a) 환 P-Q-〔여기서, 환 P가 전자 흡인성 기로 치환되어 있어도 좋은 아릴렌, 전자 흡인성 기로 치환되어 있어도 좋은 헤테로아릴렌, 축환하고 있어도 좋은 2,5-디케토피롤리딘, 축환하고 있어도 좋은 2,6-디케토피페리딘, 축환하고 있어도 좋은 2-케토피롤리딘, 축환하고 있어도 좋은 2-케토피페리딘, 2-피리돈으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 기이며, Q가 -O-, -S-, -Se-, -SO2-O-, -SO2-N(R)-, -SO2-, -C≡C-CH2-O-, -N(OR)-, -N(R)- 및 -O-N(R)-로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 기 (여기서, R은 수소 원자 또는 탄소 원자수 1 내지 6의 알킬이다.)이다.〕,
    (b) 헤테로아릴렌, 또는
    (c) -Q-〔여기서, Q가 -O-, -S-, -Se-, -SO2-O-, -SO2-N(R)-, -SO2-, -C≡C-CH2-O-, -N(OR)-, -N(R)- 및 -O-N(R)-로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 기 (여기서, R은 수소 원자 또는 탄소 원자수 1 내지 6의 알킬이다.)이다.〕이고,
    E1은 -C(=O)-, -SO2- 및 -CH2-로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 기이고,
    E3는 2가의 기이다.
  19. 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학식 I-1로 표시되는 화합물이, 하기 화학식 I-3으로 표시되는 화합물인, 화합물 또는 이의 염:
    [화학식 I-3]
    Figure pct00134

    식 중,
    A, L1, 환 Z 및 B는 상기 화학식 I-1의 것과 동일하고,
    L2는,
    (a) 환 P-Q-〔여기서, 환 P가, 전자 흡인성 기로 치환되어 있어도 좋은 아릴렌, 전자 흡인성 기로 치환되어 있어도 좋은 헤테로아릴렌, 축환하고 있어도 좋은 2,5-디케토피롤리딘, 축환하고 있어도 좋은 2,6-디케토피페리딘, 축환하고 있어도 좋은 2-케토피롤리딘, 축환하고 있어도 좋은 2-케토피페리딘, 2-피리돈으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 기이고, Q가 -O-, -S-, -Se-, -SO2-O-, -SO2-N(R)-, -SO2-, -C≡C-CH2-O-, -N(OR)-, -N(R)- 및 -O-N(R)-로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 기 (여기서, R은 수소 원자 또는 탄소 원자수 1 내지 6의 알킬이다.)이다.〕,
    (b) 헤테로아릴렌, 또는
    (c) -Q-〔여기서, Q가 -O-, -S-, -Se-, -SO2-O-, -SO2-N(R)-, -SO2-, -C≡C-CH2-O-, -N(OR)-, -N(R)- 및 -O-N(R)-로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 기 (여기서, R은 수소 원자 또는 탄소 원자수 1 내지 6의 알킬이다.)이다〕이고,
    E1은 -C(=O)-, -SO2- 및 -CH2-로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 기이고,
    E3는 결합 또는 2가의 기이다.
  20. 하기 화학식 I로 표시되는, 항체에 대한 친화성 물질 및 생체 직교성 관능기를 갖는 화합물 또는 이의 염을 포함하는, 생체 직교성 관능기에 의한 항체의 위치 선택적 수식 시약:
    [화학식 I]
    A-L-E-B (I)
    식 중,
    A는 항체에 대한 친화성 물질이고,
    L은 이탈기를 포함하는 2가의 기이고,
    E는 (i) 상기 이탈기와 연결되어 있고, 또한 (ii) 상기 항체 중의 친핵기와 반응하는 능력을 갖는 친전자기를 포함하는 2가의 기이고,
    B는 생체 직교성 관능기이고,
    상기 이탈기는 상기 친핵기와 상기 친전자기 사이의 반응에 의해 E로부터 절단되어 이탈하는 능력을 갖는다.
  21. 생체 직교성 관능기를 갖는 항체 또는 이의 염의 제조 방법으로서,
    하기 화학식 I로 표시되는, 항체에 대한 친화성 물질 및 생체 직교성 관능기를 갖는 화합물 또는 이의 염을, 항체와 반응시켜, 하기 화학식 II로 표시되는, 생체 직교성 관능기를 갖는 항체 또는 이의 염을 생성하는 것을 포함하는, 방법:
    [화학식 I]
    A-L-E-B (I)
    식 중,
    A는 항체에 대한 친화성 물질이고,
    L은 이탈기를 포함하는 2가의 기이고,
    E는 (i) 상기 이탈기와 연결되어 있고, 또한 (ii) 상기 항체 중의 친핵기와 반응하는 능력을 갖는 친전자기를 포함하는 2가의 기이고,
    B는 생체 직교성 관능기이고,
    상기 이탈기는 상기 친핵기와 상기 친전자기 사이의 반응에 의해 E로부터 절단되어 이탈하는 능력을 갖는다.
    [화학식 II]
    Ab-E-B (II)
    식 중,
    E 및 B는 상기 화학식 I의 것과 동일하고,
    Ab는 항체이다.
  22. 기능성 물질을 갖는 항체 또는 이의 염의 제조 방법으로서,
    (1) 하기 화학식 I로 표시되는, 항체에 대한 친화성 물질 및 생체 직교성 관능기를 갖는 화합물 또는 이의 염을, 항체와 반응시켜, 하기 화학식 II로 표시되는, 생체 직교성 관능기를 갖는 항체 또는 이의 염을 생성하는 것; 및
    (2) 상기 화학식 II로 표시되는, 생체 직교성 관능기를 갖는 항체 또는 이의 염을, 생체 직교성 관능기를 통해서 기능성 물질과 반응시켜, 하기 화학식 III으로 표시되는, 기능성 물질을 갖는 항체 또는 이의 염을 생성하는 것을 포함하는, 방법:
    [화학식 I]
    A-L-E-B (I)
    식 중,
    A는 항체에 대한 친화성 물질이고,
    L은 이탈기를 포함하는 2가의 기이고,
    E는 (i) 상기 이탈기와 연결되어 있고, 또한 (ii) 상기 항체 중의 친핵기와 반응하는 능력을 갖는 친전자기를 포함하는 2가의 기이고,
    B는 생체 직교성 관능기이고,
    상기 이탈기는 상기 친핵기와 상기 친전자기 사이의 반응에 의해 E로부터 절단되어 이탈하는 능력을 갖는다.
    [화학식 II]
    Ab-E-B (II)
    식 중,
    E 및 B는 상기 화학식 I의 것과 동일하고,
    Ab는 항체이다.
    [화학식 III]
    Ab-E-B'-F (III)
    식 중,
    Ab는 상기 화학식 II의 것과 동일하고,
    E는 상기 화학식 I의 것과 동일하고,
    B'는 기능성 물질과 생체 직교성 관능기 사이의 반응에 의해 생성하는 부분을 포함하는 2가의 기이고,
    F는 기능성 물질이다.
  23. 하기 화학식 II-1로 표시되는, 생체 직교성 관능기를 위치 선택적으로 갖는 항체 또는 이의 염:
    [화학식 II-1]
    Ab-E1-E2-E3-B (II-1)
    식 중,
    Ab는 항체이고,
    E1은 항체 중의 친핵기와 연결되어 있는 친전자기이고,
    E2는 (a) -X-Y-〔여기서, E1과 결합하는 X는 C(R1)(R2) (여기서, R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소 원자 또는 탄소 원자수 1 내지 6의 알킬이다.), N(R3) (여기서, R3는 수소 원자 또는 탄소 원자수 1 내지 6의 알킬이다.), O, S 또는 Se이고, E3와 결합하는 Y는 C(R4)(R5) (여기서, R4 및 R5는 각각 독립적으로 수소 원자 또는 탄소 원자수 1 내지 6의 알킬이다.)이다〕 또는 (b) 하기 화학식 i:
    [화학식 i]
    Figure pct00135

    (여기서, 환 Z는, E1과 결합하는 환 구성 원자 X' 및 이의 양 측면의 환 구성 원자 모두가 탄소 원자인 2가의 환기이거나, E1과 결합하는 환 구성 원자 X'가 질소 원자이며, 또한 질소 원자의 양 측면의 환 구성 원자가 탄소 원자인 2가의 복소환기이고, ·는 결합손이다.)로 표시되는 기이고,
    E3는 E2가 -X-Y-인 경우에는 2가의 기이고, E2가 화학식 i로 표시되는 기인 경우에는 결합 또는 2가의 기이고,
    B는 생체 직교성 관능기이다.
  24. 제23항에 있어서, 상기 항체가 모노클로날 항체의 정상 영역에만 생체 직교성 관능기를 갖는 항체인, 항체 또는 이의 염.
  25. 제23항 또는 제24항에 있어서, 상기 항체가 모노클로날 항체의 Fc 영역에만 생체 직교성 관능기를 갖는 항체인, 항체 또는 이의 염.
  26. 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가, 인간 IgG Fc 영역에서의 246 내지 248 위치 또는 288 내지 290 위치의 아미노산 잔기로 이루어진 영역에서, 생체 직교성 관능기를 위치 선택적으로 갖는 인간 IgG인, 항체 또는 이의 염.
  27. 제23항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학식 II-1로 표시되는 상기 항체가 하기 화학식 II-2로 표시되는, 생체 직교성 관능기를 위치 선택적으로 갖는 항체인, 항체 또는 이의 염:
    [화학식 II-2]
    Ab-E1-X-Y-E3-B (II-2)
    식 중,
    Ab, X, Y 및 B는 상기 화학식 II-1의 것과 동일하고,
    E1은 -C(=O)-, -SO2- 및 -CH2-로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 기이고,
    E3는 2가의 기이다.
  28. 제23항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학식 II-1로 표시되는 상기 항체가 하기 화학식 II-3으로 표시되는, 생체 직교성 관능기를 위치 선택적으로 갖는 항체인, 항체 또는 이의 염:
    [화학식 II-3]
    Figure pct00136

    식 중,
    Ab, 환 구성 원자 X', 환 Z 및 B는 상기 화학식 II-1의 것과 동일하고,
    E1은 -C(=O)-, -SO2- 및 -CH2-로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 기이고,
    E3는 결합 또는 2가의 기이다.
  29. 하기 화학식 III-1로 표시되는, 기능성 물질을 위치 선택적으로 갖는 항체 또는 이의 염:
    [화학식 III-1]
    Ab-E1-E2-E3-B'-F (III-1)
    식 중,
    Ab는 항체이고,
    E1은 항체 중의 친핵기와 연결되어 있는 친전자기이고,
    E2는 (a) -X-Y-〔여기서, E1과 결합하는 X는 C(R1)(R2) (여기서, R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소 원자 또는 탄소 원자수 1 내지 6의 알킬이다.), N(R3) (여기서, R3는 수소 원자 또는 탄소 원자수 1 내지 6의 알킬이다.), O, S 또는 Se이고, E3와 결합하는 Y는 C(R4)(R5) (여기서, R4 및 R5는 각각 독립적으로 수소 원자 또는 탄소 원자수 1 내지 6의 알킬이다.)이다〕 또는 (b) 하기 화학식 i:
    [화학식 i]
    Figure pct00137

    (여기서, 환 Z는, E1과 결합하는 환 구성 원자 X' 및 이의 양 측면의 환 구성 원자 모두가 탄소 원자인 2가의 환기이거나, E1과 결합하는 환 구성 원자 X'가 질소 원자이며, 또한 질소 원자의 양 측면의 환 구성 원자가 탄소 원자인 2가의 복소환기이고, ·는 결합손이다.)로 표시되는 기이고,
    E3는, E2가 -X-Y-인 경우에는 2가의 기이고, E2가 화학식 i로 표시되는 기인 경우에는 결합 또는 2가의 기이고,
    B'는 기능성 물질과 생체 직교성 관능기 사이의 반응에 의해 생성하는 부분을 포함하는 2가의 기이고,
    F는 기능성 물질이다.
  30. 제29항에 있어서, 상기 항체가 모노클로날 항체의 정상 영역에만 생체 직교성 관능기를 갖는 항체인, 항체 또는 이의 염.
  31. 제29항 또는 제30항에 있어서, 상기 항체가 모노클로날 항체의 Fc 영역에만 생체 직교성 관능기를 갖는 항체인, 항체 또는 이의 염.
  32. 제29항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가, 인간 IgG Fc 영역에서의 246 내지 248 위치 또는 288 내지 290 위치의 아미노산 잔기로 이루어진 영역에서, 기능성 물질을 위치 선택적으로 갖는 인간 IgG인, 항체 또는 이의 염.
  33. 제29항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학식 III-1로 표시되는 상기 항체가 하기 화학식 III-2로 표시되는, 기능성 물질을 위치 선택적으로 갖는 항체인, 항체 또는 이의 염:
    [화학식 III-2]
    Ab-E1-X-Y-E3-B'-F (III-2)
    식 중,
    Ab, X, Y, B' 및 F는 상기 화학식 III-1의 것과 동일하고,
    E1은 -C(=O)-, -SO2- 및 -CH2-로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 기이고,
    E3는 2가의 기이다.
  34. 제29항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학식 III-1로 표시되는 상기 항체가 하기 화학식 III-3으로 표시되는, 기능성 물질을 위치 선택적으로 갖는 항체인, 항체 또는 이의 염:
    [화학식 III-3]
    Figure pct00138

    식 중,
    Ab, 환 구성 원자 X', 환 Z, B' 및 F는 상기 화학식 III-1의 것과 동일하고,
    E1은 -C(=O)-, -SO2- 및 -CH2-로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 기이고,
    E3는 결합 또는 2가의 기이다.
  35. 하기 화학식 IV로 표시되는, 항체에 대한 친화성 물질 및 기능성 물질을 갖는 화합물 또는 이의 염:
    [화학식 IV]
    A-L-E-F (IV)
    식 중,
    A는 항체에 대한 친화성 물질이고,
    L은 이탈기를 포함하는 2가의 기이고,
    E는 (i) 상기 이탈기와 연결되어 있고, 또한 (ii) 상기 항체 중의 친핵기와 반응하는 능력을 갖는 친전자기를 포함하는 2가의 기이고,
    F는 기능성 물질이고,
    상기 이탈기는 상기 친핵기와 상기 친전자기 사이의 반응에 의해 E로부터 절단되어 이탈하는 능력을 갖는다.
  36. 하기 화학식 IV로 표시되는, 항체에 대한 친화성 물질 및 기능성 물질을 갖는 화합물 또는 이의 염을 포함하는, 기능성 물질에 의한 항체의 위치 선택적 수식 시약:
    [화학식 IV]
    A-L-E-F (IV)
    식 중,
    A는 항체에 대한 친화성 물질이고,
    L은 이탈기를 포함하는 2가의 기이고,
    E는 (i) 상기 이탈기와 연결되어 있고, 또한 (ii) 상기 항체 중의 친핵기와 반응하는 능력을 갖는 친전자기를 포함하는 2가의 기이고,
    F는 기능성 물질이고,
    상기 이탈기는 상기 친핵기와 상기 친전자기 사이의 반응에 의해 E로부터 절단되어 이탈하는 능력을 갖는다.
  37. 기능성 물질을 갖는 항체 또는 이의 염의 제조 방법으로서,
    하기 화학식 IV로 표시되는, 항체에 대한 친화성 물질 및 기능성 물질을 갖는 화합물 또는 이의 염을, 항체와 반응시켜, 하기 화학식 III으로 표시되는, 기능성 물질을 갖는 항체 또는 이의 염을 생성하는 것을 포함하는, 방법:
    [화학식 III]
    Ab-E-F (III)
    식 중,
    Ab는 항체이고,
    E 및 F는 상기 화학식 IV의 것과 동일하다.
    [화학식 IV]
    A-L-E-F (IV)
    식 중,
    A는 항체에 대한 친화성 물질이고,
    L은 이탈기를 포함하는 2가의 기이고,
    E는 (i) 상기 이탈기와 연결되어 있고, 또한 (ii) 상기 항체 중의 친핵기와 반응하는 능력을 갖는 친전자기를 포함하는 2가의 기이고,
    F는 기능성 물질이고,
    상기 이탈기는 상기 친핵기와 상기 친전자기 사이의 반응에 의해 E로부터 절단되어 이탈하는 능력을 갖는다.
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