JPWO2019240288A1 - 抗体に対する親和性物質、および生体直交性官能基を有する化合物またはその塩 - Google Patents

抗体に対する親和性物質、および生体直交性官能基を有する化合物またはその塩 Download PDF

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Abstract

本発明は、抗体の修飾、特に、抗体の位置選択的な修飾を可能にする技術を提供する。より具体的には、本発明は、下記式（Ｉ）：Ａ−Ｌ−Ｅ−Ｂ （Ｉ）〔式中、Ａは、抗体に対する親和性物質であり、Ｌは、脱離基を含む２価の基であり、Ｅは、（ｉ）前記脱離基と連結しており、かつ（ｉｉ）前記抗体中の求核基と反応する能力を有する求電子基を含む２価の基であり、Ｂは、生体直交性官能基であり、前記脱離基は、前記求核基と前記求電子基との間の反応によりＥから切断されて脱離する能力を有する。〕で表される、抗体に対する親和性物質、および生体直交性官能基を有する化合物またはその塩などを提供する。

Description

本発明は、抗体に対する親和性物質、および生体直交性官能基を有する化合物またはその塩などに関する。
近年、抗体薬物複合体（Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ：ＡＤＣ）の研究開発が盛んに行われている。ＡＤＣはその名の通り、抗体に薬物（例、抗がん剤）をコンジュゲーションした薬剤であり、がん細胞などに対して直接的な殺細胞活性を有する。代表的なＡＤＣとしては、Ｔ−ＤＭ１（商品名：カドサイラ（登録商標））がある（非特許文献１〜３）。
Ｔ−ＤＭ１を始めとするＡＤＣは、開発当初からその不均一性が問題となっている。すなわち、抗体中に７０〜８０程度あるＬｙｓ残基に対して、低分子薬物をランダムに反応させているため、薬物抗体比（Ｄｒｕｇ／Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｒａｔｉｏ：ＤＡＲ）やコンジュゲーション位置が一定ではない。通常このようなランダムコンジュゲーション法になるとＤＡＲが０〜８の範囲となり、薬物の結合数が異なる複数の薬剤が生じることが分かっている。近年ＡＤＣの薬物の結合数および結合位置を変化させると、体内動態や薬物の放出速度、効果が変化することが報告されている。これらのことから次世代型ＡＤＣではコンジュゲーションする薬物の個数と位置を制御することが求められている。個数および位置が一定であると、期待通りのｅｆｆｉｃａｃｙ、コンジュゲーション薬剤のバリエーション、ロット差いわゆるレギュレーションの問題が解決すると考えられている（非特許文献４）。
抗体の位置選択的修飾法は世界中で研究されているが、そのほとんどが遺伝子工学的手法もしくは酵素を用いた修飾法である。遺伝子工学的修飾法に関しては、位置選択性、個数選択性は制御できるものの、抗体自体の発現効率が低下（ＡＤＣを調製する際の総収率が低下）するなどの問題が指摘されている。また、抗体発現系の構築などに長い年月を要することが問題となっている（非特許文献５〜７）。
また、小分子プローブを利用して細胞内のような夾雑な環境下でタンパク質を化学修飾する方法が近年報告されている。本手法は、イメージングや低分子薬物のリポジショニングを行う上で受容体の同定などに利用されている。また、ケミカルバイオロジー分野において、合成小分子プローブを用いた有機化学的なタンパク質修飾法が注目されている（非特許文献８〜１１）。
最近、ＣＣＡＰ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｂｙ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｐｅｐｔｉｄｅ）法が開発された。本方法は、親和性ペプチド（Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｐｅｐｔｉｄｅ）に対してＮＨＳ活性化エステルおよび薬物が連結されたペプチド試薬を抗体と反応させる方法（すなわち、ペプチド部分を含むリンカーを介したＡＤＣの作製方法）により、抗体の位置選択的な修飾に成功している。本方法は世界で初めて、化学合成的手法により、薬物で抗体Ｆｃ領域を位置選択的に修飾することに成功したものであり、しかも実用上も良好な結果〔反応時間３０分、収率７０％（ＤＡＲ １の場合）、位置選択性１００％〕が確認されている。ペプチド試薬を５等量程度加えることで、ＤＡＲを２で制御できることが実証されており、修飾位置も制御できる点で画期的である（特許文献１）。
国際公開第２０１６／１８６２０６号
Ｒｅｉｃｈｅｒｔ ＪＭ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２００５；２３：１０７３−８ Ｋｕｂｏｔａ Ｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ ２００９；１００：１５６６−７２ Ｗｕ ＡＭ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２００５；２３：１１３７−４６ Ｊｕｎｕｔｕｌａ ＪＲ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２００８；２６：９２５−３２ Ｓｈｅｎ ＢＱ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２０１２；３０：１８４−９ Ｈｏｆｅｒ Ｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００９；４８：１２０４７−５７ Ｌｉｕ Ｗ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２００７；４：２３９−４４ Ｓ．Ｔ．Ｌａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００８；３２０，６６４ Ａ．Ｅ．Ｓｐｅｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ ２００４；５，４１ Ｙ．Ｔａｋａｏｋａ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ． ２０１３；５２，４０８８ Ｓ．Ｆｕｊｉｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，２０１２；１３４：３９６１−６４
本発明は、抗体の修飾、特に、抗体の位置選択的な修飾を可能にする技術を開発することを目的とする。
本発明者らは、鋭意検討した結果、Ａ−Ｌ−Ｅという構造単位（ここで、Ａは、抗体に対する親和性物質であり、Ｌは、所定の脱離基を含む２価の基であり、Ｅは、（ｉ）前記脱離基と連結しており、かつ（ｉｉ）前記抗体中の求核基と反応する能力を有する求電子基を含む２価の基である。）を有する化合物またはその塩が、抗体の位置特異的な修飾に有用であることを見出した。例えば、式（Ｉ）で表われる、抗体に対する親和性物質、および生体直交性官能基を有する所定の化合物が、抗体の位置特異的な修飾に有用であることが見出された（例、図１、各種実施例）。また、式（ＩＶ）で表われる、抗体に対する親和性物質、および機能性物質を有する化合物またはその塩が、抗体の位置特異的な修飾に有用であることが見出された（例、実施例１３、１４）。本発明者らはさらに、このような化合物を用いることにより、ペプチド部分をリンカーとして含まない、機能性物質（例、薬物）を位置選択的に有する抗体（抗体薬物複合体（ＡＤＣ））を調製できることなどを見出した。潜在的な免疫原性を有し、また血中で加水分解され易いペプチド部分を含むリンカーの使用の回避は、ＡＤＣの臨床応用において望ましいものである。すなわち、本発明者らの開発した方法によれば、化学合成的手法により、しかもペプチド部分を含むリンカーを使用することなく、薬物で抗体Ｆｃ領域を位置選択的に修飾することができる。
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕下記式（Ｉ）：
Ａ−Ｌ−Ｅ−Ｂ （Ｉ）
〔式中、
Ａは、抗体に対する親和性物質であり、
Ｌは、脱離基を含む２価の基であり、
Ｅは、（ｉ）前記脱離基と連結しており、かつ（ｉｉ）前記抗体中の求核基と反応する能力を有する求電子基を含む２価の基であり、
Ｂは、生体直交性官能基であり、
前記脱離基は、前記求核基と前記求電子基との間の反応によりＥから切断されて脱離する能力を有する。〕で表される、抗体に対する親和性物質、および生体直交性官能基を有する化合物またはその塩。
〔２〕前記親和性物質がペプチドである、〔１〕の化合物またはその塩。
〔３〕前記ペプチドが、モノクローナル抗体の定常領域に対する結合能を有するペプチドである、〔２〕の化合物またはその塩。
〔４〕前記ペプチドが、モノクローナル抗体のＦｃ領域に対する結合能を有するペプチドである、〔２〕または〔３〕の化合物またはその塩。
〔５〕前記ペプチドが、ＩｇＧのＦｃ領域に対する結合能を有するペプチドである、〔４〕の化合物またはその塩。
〔６〕前記ペプチドが、１０〜４０のアミノ酸残基を有する、〔２〕〜〔５〕のいずれかの化合物またはその塩。
〔７〕前記ペプチドが、
（ａ）（ａ−１−１）ＦＮＭＱＱＱＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＲＩＲＳＩＲＤＤ（配列番号１１）のアミノ酸配列、または、
（ａ−１−２）ＦＮＭＱＣＱＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＲＩＲＳＩＲＤＤＣ（配列番号１２）のアミノ酸配列において、
配列中のいずれかの１〜３つのアミノ酸残基が、同一でも異なってもよく、リジン残基、アスパラギン酸残基、およびグルタミン酸残基からなる群より選ばれる各々１つのアミノ酸残基により置換されているか、
（ａ−２−１）β−Ａｌａ−ＮＭＱＱＱＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＲＩＲＳＩＲＤＤ（配列番号１３）のアミノ酸配列、または、
（ａ−２−２）β−Ａｌａ−ＮＭＱＣＱＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＲＩＲＳＩＲＤＤＣ（配列番号１４）のアミノ酸配列において、
配列中のいずれかの１〜３つのアミノ酸残基が、同一でも異なってもよく、リジン残基、アスパラギン酸残基、およびグルタミン酸残基からなる群より選ばれる各々１つのアミノ酸残基により置換されており、かつ
（ｂ）配列番号１１〜１４の前記アミノ酸配列各々に対して８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む、〔２〕〜〔６〕のいずれかの化合物またはその塩。
〔８〕前記ペプチドが、
式１−１：（Ｘ０−３）ａ−Ｃ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｉ−Ｉ−Ｗ−Ｃ−（Ｘ０−３）ｂ（配列番号１５）
式１−２：（Ｘ０−３）ａ−Ｃ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｉ−Ｖ−Ｗ−Ｃ−（Ｘ０−３）ｂ（配列番号１６）
式１−３：（Ｘ０−３）ａ−Ｃ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｖ−Ｖ−Ｗ−Ｃ−（Ｘ０−３）ｂ（配列番号１７）
式１−４：（Ｘ０−３）ａ−Ｃ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ａ−Ｖ−Ｗ−Ｃ−（Ｘ０−３）ｂ（配列番号１８）
式１−５：（Ｘ０−３）ａ−Ｃ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｌ−Ｌ−Ｗ−Ｃ−（Ｘ０−３）ｂ（配列番号１９）
式１−６：（Ｘ０−３）ａ−Ｃ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｌ−Ｉ−Ｗ−Ｃ−（Ｘ０−３）ｂ（配列番号２０）
式１−７：（Ｘ０−３）ａ−Ｃ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｃ−（Ｘ０−３）ｂ（配列番号２１）
式１−８：（Ｘ０−３）ａ−Ｃ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｑ−Ｖ−Ｗ−Ｃ−（Ｘ０−３）ｂ（配列番号２２）
式１−９：（Ｘ０−３）ａ−Ｃ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｅ−Ｖ−Ｗ−Ｃ−（Ｘ０−３）ｂ（配列番号２３）
〔式中、
（Ｘ０−３）ａは、なし、アルギニン残基−グリシン残基−アスパラギン残基、グリシン残基−アスパラギン残基、アスパラギン酸残基、またはアスパラギン残基であり、
（Ｘ０−３）ｂは、なし、スレオニン残基−チロシン残基−ヒスチジン残基、またはスレオニン残基であり、
Ｘａａ１は、アラニン残基であり、
Ｘａａ２は、チロシン残基、トリプトファン残基、またはヒスチジン残基であり、
Ｘａａ３は、ヒスチジン残基、フェニルアラニン残基、チロシン残基、トリプトファン残基、アルギニン残基、またはグリシン残基であり、
Ｘａａ４は、リジン残基、アスパラギン酸残基、またはグルタミン酸残基であり、
Ｘａａ５は、グリシン残基、セリン残基、アスパラギン残基、グルタミン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、フェニルアラニン残基、チロシン残基、トリプトファン残基、ヒスチジン残基、スレオニン残基、ロイシン残基、アラニン残基、バリン残基、イソロイシン残基、またはアルギニン残基であり、
Ｘａａ６は、グルタミン残基、グルタミン酸残基、アスパラギン残基、またはアスパラギン酸残基である。〕、あるいは
式２−１：（Ｘ０−３’）ａ−Ｃ−（Ｘａａ１’）−（Ｘａａ２’）−（Ｘａａ３’）−（Ｘａａ４’）−（Ｘａａ５’）−（Ｘａａ６’）−Ｌ−Ｖ−Ｗ−Ｃ−（Ｘ０−３’）ｂ（配列番号２４）
〔式中、
（Ｘ０−３’）ａおよび（Ｘ０−３’）ｂはそれぞれ、前記（Ｘ０−３）ａおよび（Ｘ０−３）ｂと同じであり、
Ｘａａ１’、Ｘａａ２’、Ｘａａ３’、Ｘａａ４’、Ｘａａ５’、Ｘａａ６’はそれぞれ、前記Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ４、Ｘａａ５、Ｘａａ６と同じである。〕のいずれかのアミノ酸配列を含む、〔２〕〜〔６〕のいずれかの化合物またはその塩。
〔９〕前記脱離基が、（１）−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓｅ−、−ＳＯ２−Ｏ−、−ＳＯ２−Ｎ（Ｒ）−、−ＳＯ２−、−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｎ（ＯＲ）−、−Ｎ（Ｒ）−、および−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−からなる群より選ばれる基（ここで、Ｒは、水素原子または炭素原子数１〜６のアルキルである。）、または（２）ヘテロアリーレンである、〔１〕〜〔８〕のいずれかの化合物またはその塩。
〔１０〕前記求核基が、リジン残基の側鎖におけるＮＨ２、チロシン残基の側鎖におけるＯＨ、セリン残基の側鎖におけるＯＨ、スレオニン残基の側鎖におけるＯＨ、およびシステイン残基の側鎖におけるＳＨからなる群より選ばれる基である、〔１〕〜〔９〕のいずれかの化合物またはその塩。
〔１１〕前記求電子基が、−Ｃ（＝Ｏ）−、−ＳＯ２−、および−ＣＨ２−からなる群より選ばれる基である、〔１〕〜〔１０〕のいずれかの化合物またはその塩。
〔１２〕前記生体直交性官能基が、アジド残基、アルデヒド残基、チオール残基、アルキン残基、アルケン残基、ハロゲン残基、テトラジン残基、ニトロン残基、ヒドロキシルアミン残基、ニトリル残基、ヒドラジン残基、ケトン残基、ボロン酸残基、シアノベンゾチアゾール残基、アリル残基、ホスフィン残基、マレイミド残基、ジスルフィド残基、チオエステル残基、α―ハロカルボニル残基、イソニトリル残基、シドノン残基、およびセレン残基からなる群より選ばれる基である、〔１〕〜〔１１〕のいずれかの化合物またはその塩。
〔１３〕前記生体直交性官能基が、アジド残基、チオール残基、アルキン残基、マレイミド残基、およびジスルフィド残基からなる群より選ばれる基である、〔１〕〜〔１２〕のいずれかの化合物またはその塩。
〔１４〕前記式（Ｉ）で表される化合物が、下記式（Ｉ−１）：
Ａ−Ｌ１−Ｌ２−Ｅ１−Ｅ２−Ｅ３−Ｂ （Ｉ−１）
〔式中、
ＡおよびＢは、前記式（Ｉ）のものと同じであり、
Ｌ１は、結合または２価の基であり、
Ｌ２は、脱離基であり、
Ｅ１は、（ｉ）前記脱離基と連結しており、かつ（ｉｉ）前記抗体中の求核基と反応する能力を有する求電子基であり、
Ｅ２は、（ａ）−Ｘ−Ｙ−〔ここで、Ｅ１と結合するＸは、Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）（ここで、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して、水素原子または炭素原子数１〜６のアルキルである。）、Ｎ（Ｒ３）（ここで、Ｒ３は、水素原子または炭素原子数１〜６のアルキルである。）、Ｏ、Ｓ、またはＳｅであり、Ｅ３と結合するＹは、Ｃ（Ｒ４）（Ｒ５）（ここで、Ｒ４およびＲ５はそれぞれ独立して、水素原子または炭素原子数１〜６のアルキルである。）である。〕、あるいは（ｂ）下記式（ｉ）：
Figure 2019240288
 （ここで、環Ｚは、Ｅ１と結合する環構成原子Ｘ’およびその両隣の環構成原子の全てが炭素原子である２価の環基であるか、またはＥ１と結合する環構成原子Ｘ’が窒素原子であり、かつ窒素原子の両隣の環構成原子が炭素原子である２価の複素環基である。・は結合手である。）で表される基であり、
Ｅ３は、Ｅ２が−Ｘ−Ｙ−の場合には２価の基であり、Ｅ２が式（ｉ）で表される基の場合には結合または２価の基であり、
前記脱離基は、前記求核基と前記求電子基との間の反応によりＥ１から切断されて脱離する能力を有する。〕で表される化合物である、〔１〕〜〔１３〕のいずれかの化合物またはその塩。
〔１５〕前記Ｌ２が、
（ａ）環Ｐ−Ｑ−〔ここで、環Ｐが、電子吸引性基で置換されていてもよいアリーレン、電子吸引性基で置換されていてもよいヘテロアリーレン、縮環していてもよい２，５-ジケトピロリジン、縮環していてもよい２，６−ジケトピペリジン、縮環していてもよい２-ケトピロリジン、縮環していてもよい２−ケトピペリジン、２−ピリドンからなる群より選ばれる基であり、Ｑが、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓｅ−、−ＳＯ２−Ｏ−、−ＳＯ２−Ｎ（Ｒ）−、−ＳＯ２−、−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｎ（ＯＲ）−、−Ｎ（Ｒ）−、および−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−からなる群より選ばれる基（ここで、Ｒは、水素原子または炭素原子数１〜６のアルキルである。）である。〕、
（ｂ）ヘテロアリーレン、あるいは
（ｃ）−Ｑ−〔ここで、Ｑが、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓｅ−、−ＳＯ２−Ｏ−、−ＳＯ２−Ｎ（Ｒ）−、−ＳＯ２−、−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｎ（ＯＲ）−、−Ｎ（Ｒ）−、および−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−からなる群より選ばれる基（ここで、Ｒは、水素原子または炭素原子数１〜６のアルキルである。）である。〕、〔１４〕の化合物またはその塩。
〔１６〕前記Ｌ２が、下記構造式からなる群より選ばれる基である、〔１４〕または〔１５〕の化合物またはその塩：
Figure 2019240288
 （ここで、ＥＷＧは、電子吸引性基であり、
ｍは、０〜４の整数であり、
ｎは、０〜３の整数であり、
Ｒは、水素原子、または炭素原子数１〜６のアルキルであり、
○（白丸）は、Ｌ１に対する結合手であり、●（黒丸）は、Ｅ１に対する結合手である。）。
〔１７〕ＡとＥとを連結するＬまたはＬ１−Ｌ２の主鎖が２０個以下の原子からなる、〔１〕〜〔１６〕のいずれかの化合物またはその塩。
〔１８〕前記式（Ｉ−１）で表される化合物が、下記式（Ｉ−２）：
Ａ−Ｌ１−Ｌ２−Ｅ１−Ｘ−Ｙ−Ｅ３−Ｂ （Ｉ−２）
〔式中、
Ａ、Ｌ１、Ｘ、Ｙ、およびＢは、前記式（Ｉ−１）のものと同じであり、
Ｌ２は、
（ａ）環Ｐ−Ｑ−〔ここで、環Ｐが、電子吸引性基で置換されていてもよいアリーレン、電子吸引性基で置換されていてもよいヘテロアリーレン、縮環していてもよい２，５-ジケトピロリジン、縮環していてもよい２，６−ジケトピペリジン、縮環していてもよい２-ケトピロリジン、縮環していてもよい２−ケトピペリジン、２−ピリドンからなる群より選ばれる基であり、Ｑが、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓｅ−、−ＳＯ２−Ｏ−、−ＳＯ２−Ｎ（Ｒ）−、−ＳＯ２−、−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｎ（ＯＲ）−、−Ｎ（Ｒ）−、および−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−からなる群より選ばれる基（ここで、Ｒは、水素原子または炭素原子数１〜６のアルキルである。）である。〕、
（ｂ）ヘテロアリーレン、あるいは
（ｃ）−Ｑ−〔ここで、Ｑが、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓｅ−、−ＳＯ２−Ｏ−、−ＳＯ２−Ｎ（Ｒ）−、−ＳＯ２−、−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｎ（ＯＲ）−、−Ｎ（Ｒ）−、および−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−からなる群より選ばれる基（ここで、Ｒは、水素原子または炭素原子数１〜６のアルキルである。）である。〕であり、
Ｅ１は、−Ｃ（＝Ｏ）−、−ＳＯ２−、および−ＣＨ２−からなる群より選ばれる基であり、
Ｅ３は、２価の基である。〕で表される化合物である、〔１４〕〜〔１７〕のいずれかの化合物またはその塩。
〔１９〕前記式（Ｉ−１）で表される化合物が、下記式（Ｉ−３）：
Figure 2019240288
 〔式中、
Ａ、Ｌ１、環Ｚ、およびＢは、前記式（Ｉ−１）のものと同じであり、
Ｌ２は、
（ａ）環Ｐ−Ｑ−〔ここで、環Ｐが、電子吸引性基で置換されていてもよいアリーレン、電子吸引性基で置換されていてもよいヘテロアリーレン、縮環していてもよい２，５-ジケトピロリジン、縮環していてもよい２，６−ジケトピペリジン、縮環していてもよい２-ケトピロリジン、縮環していてもよい２−ケトピペリジン、２−ピリドンからなる群より選ばれる基であり、Ｑが、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓｅ−、−ＳＯ２−Ｏ−、−ＳＯ２−Ｎ（Ｒ）−、−ＳＯ２−、−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｎ（ＯＲ）−、−Ｎ（Ｒ）−、および−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−からなる群より選ばれる基（ここで、Ｒは、水素原子または炭素原子数１〜６のアルキルである。）である。〕、
（ｂ）ヘテロアリーレン、あるいは
（ｃ）−Ｑ−〔ここで、Ｑが、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓｅ−、−ＳＯ２−Ｏ−、−ＳＯ２−Ｎ（Ｒ）−、−ＳＯ２−、−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｎ（ＯＲ）−、−Ｎ（Ｒ）−、および−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−からなる群より選ばれる基（ここで、Ｒは、水素原子または炭素原子数１〜６のアルキルである。）である。〕であり、
Ｅ１は、−Ｃ（＝Ｏ）−、−ＳＯ２−、および−ＣＨ２−からなる群より選ばれる基であり、
Ｅ３は、結合または２価の基である。〕で表される化合物である、〔１４〕〜〔１７〕のいずれかの化合物またはその塩。
〔２０〕下記式（Ｉ）：
Ａ−Ｌ−Ｅ−Ｂ （Ｉ）
〔式中、
Ａは、抗体に対する親和性物質であり、
Ｌは、脱離基を含む２価の基であり、
Ｅは、（ｉ）前記脱離基と連結しており、かつ（ｉｉ）前記抗体中の求核基と反応する能力を有する求電子基を含む２価の基であり、
Ｂは、生体直交性官能基であり、
前記脱離基は、前記求核基と前記求電子基との間の反応によりＥから切断されて脱離する能力を有する。〕で表される、抗体に対する親和性物質、および生体直交性官能基を有する化合物またはその塩を含む、生体直交性官能基による抗体の位置選択的修飾試薬。
〔２１〕生体直交性官能基を有する抗体またはその塩の製造方法であって、
下記式（Ｉ）：
Ａ−Ｌ−Ｅ−Ｂ （Ｉ）
〔式中、
Ａは、抗体に対する親和性物質であり、
Ｌは、脱離基を含む２価の基であり、
Ｅは、（ｉ）前記脱離基と連結しており、かつ（ｉｉ）前記抗体中の求核基と反応する能力を有する求電子基を含む２価の基であり、
Ｂは、生体直交性官能基であり、
前記脱離基は、前記求核基と前記求電子基との間の反応によりＥから切断されて脱離する能力を有する。〕で表される、抗体に対する親和性物質、および生体直交性官能基を有する化合物またはその塩を、抗体と反応させて、
下記式（ＩＩ）：
Ａｂ−Ｅ−Ｂ （ＩＩ）
〔式中、
ＥおよびＢは、前記式（Ｉ）のものと同じであり、
Ａｂは、抗体である。〕で表される、生体直交性官能基を有する抗体またはその塩を生成することを含む、方法。
〔２２〕機能性物質を有する抗体またはその塩の製造方法であって、
（１）下記式（Ｉ）：
Ａ−Ｌ−Ｅ−Ｂ （Ｉ）
〔式中、
Ａは、抗体に対する親和性物質であり、
Ｌは、脱離基を含む２価の基であり、
Ｅは、（ｉ）前記脱離基と連結しており、かつ（ｉｉ）前記抗体中の求核基と反応する能力を有する求電子基を含む２価の基であり、
Ｂは、生体直交性官能基であり、
前記脱離基は、前記求核基と前記求電子基との間の反応によりＥから切断されて脱離する能力を有する。〕で表される、抗体に対する親和性物質、および生体直交性官能基を有する化合物またはその塩を、抗体と反応させて、
下記式（ＩＩ）：
Ａｂ−Ｅ−Ｂ （ＩＩ）
〔式中、
ＥおよびＢは、前記式（Ｉ）のものと同じであり、
Ａｂは、抗体である。〕で表される、生体直交性官能基を有する抗体またはその塩を生成すること；ならびに
（２）前記式（ＩＩ）で表される、生体直交性官能基を有する抗体またはその塩を、生体直交性官能基を介して機能性物質と反応させて、
下記式（ＩＩＩ）：
Ａｂ−Ｅ−Ｂ’−Ｆ （ＩＩＩ）
〔式中、
Ａｂは、前記式（ＩＩ）のものと同じであり、
Ｅは、前記式（Ｉ）のものと同じであり、
Ｂ’は、機能性物質と生体直交性官能基との間の反応により生成する部分を含む２価の基であり、
Ｆは、機能性物質である。〕で表される、機能性物質を有する抗体またはその塩を生成することを含む、方法。
〔２３〕下記式（ＩＩ−１）：
Ａｂ−Ｅ１−Ｅ２−Ｅ３−Ｂ （ＩＩ−１）
〔式中、
Ａｂは、抗体であり、
Ｅ１は、抗体中の求核基と連結している求電子基であり、
Ｅ２は、（ａ）−Ｘ−Ｙ−〔ここで、Ｅ１と結合するＸは、Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）（ここで、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して、水素原子または炭素原子数１〜６のアルキルである。）、Ｎ（Ｒ３）（ここで、Ｒ３は、水素原子または炭素原子数１〜６のアルキルである。）、Ｏ、Ｓ、またはＳｅであり、Ｅ３と結合するＹは、Ｃ（Ｒ４）（Ｒ５）（ここで、Ｒ４およびＲ５はそれぞれ独立して、水素原子または炭素原子数１〜６のアルキルである。）である。〕、あるいは（ｂ）下記式（ｉ）：
Figure 2019240288
 （ここで、環Ｚは、Ｅ１と結合する環構成原子Ｘ’およびその両隣の環構成原子の全てが炭素原子である２価の環基であるか、またはＥ１と結合する環構成原子Ｘ’が窒素原子であり、かつ窒素原子の両隣の環構成原子が炭素原子である２価の複素環基である。・は結合手である。）で表される基であり、
Ｅ３は、Ｅ２が−Ｘ−Ｙ−の場合には２価の基であり、Ｅ２が式（ｉ）で表される基の場合には結合または２価の基であり、
Ｂは、生体直交性官能基である。〕で表される、生体直交性官能基を位置選択的に有する抗体またはその塩。
〔２４〕前記抗体が、モノクローナル抗体の定常領域のみに生体直交性官能基を有する抗体である、〔２３〕の抗体またはその塩。
〔２５〕前記抗体が、モノクローナル抗体のＦｃ領域のみに生体直交性官能基を有する抗体である、〔２３〕または〔２４〕の抗体またはその塩。
〔２６〕前記抗体が、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域における２４６〜２４８位または２８８〜２９０位のアミノ酸残基からなる領域において、生体直交性官能基を位置選択的に有するヒトＩｇＧである、〔２３〕〜〔２５〕のいずれかの抗体またはその塩。
〔２７〕前記式（ＩＩ−１）で表される前記抗体が、下記式（ＩＩ−２）：
Ａｂ−Ｅ１−Ｘ−Ｙ−Ｅ３−Ｂ （ＩＩ−２）
〔式中、
Ａｂ、Ｘ、Ｙ、およびＢは、前記式（ＩＩ−１）のものと同じであり、
Ｅ１は、−Ｃ（＝Ｏ）−、−ＳＯ２−、および−ＣＨ２−からなる群より選ばれる基であり、
Ｅ３は、２価の基である。〕で表される、生体直交性官能基を位置選択的に有する抗体である、〔２３〕〜〔２６〕のいずれかの抗体またはその塩。
〔２８〕前記式（ＩＩ−１）で表される前記抗体が、下記式（ＩＩ−３）：
Figure 2019240288
 〔式中、
Ａｂ、環構成原子Ｘ’、環Ｚ、およびＢは、前記式（ＩＩ−１）のものと同じであり、
Ｅ１は、−Ｃ（＝Ｏ）−、−ＳＯ２−、および−ＣＨ２−からなる群より選ばれる基であり、
Ｅ３は、結合または２価の基である。〕で表される、生体直交性官能基を位置選択的に有する抗体である、〔２３〕〜〔２６〕のいずれかの抗体またはその塩。
〔２９〕下記式（ＩＩＩ−１）：
Ａｂ−Ｅ１−Ｅ２−Ｅ３−Ｂ’−Ｆ （ＩＩＩ−１）
〔式中、
Ａｂは、抗体であり、
Ｅ１は、抗体中の求核基と連結している求電子基であり、
Ｅ２は、（ａ）−Ｘ−Ｙ−〔ここで、Ｅ１と結合するＸは、Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）（ここで、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して、水素原子または炭素原子数１〜６のアルキルである。）、Ｎ（Ｒ３）（ここで、Ｒ３は、水素原子または炭素原子数１〜６のアルキルである。）、Ｏ、Ｓ、またはＳｅであり、Ｅ３と結合するＹは、Ｃ（Ｒ４）（Ｒ５）（ここで、Ｒ４およびＲ５はそれぞれ独立して、水素原子または炭素原子数１〜６のアルキルである。）である。〕、あるいは（ｂ）下記式（ｉ）：
Figure 2019240288
 （ここで、環Ｚは、Ｅ１と結合する環構成原子Ｘ’およびその両隣の環構成原子の全てが炭素原子である２価の環基であるか、またはＥ１と結合する環構成原子Ｘ’が窒素原子であり、かつ窒素原子の両隣の環構成原子が炭素原子である２価の複素環基である。・は結合手である。）で表される基であり、
Ｅ３は、Ｅ２が−Ｘ−Ｙ−の場合には２価の基であり、Ｅ２が式（ｉ）で表される基の場合には結合または２価の基であり、
Ｂ’は、機能性物質と生体直交性官能基との間の反応により生成する部分を含む２価の基であり、
Ｆは、機能性物質である。〕で表される、機能性物質を位置選択的に有する抗体またはその塩。
〔３０〕前記抗体が、モノクローナル抗体の定常領域のみに生体直交性官能基を有する抗体である、〔２９〕の抗体またはその塩。
〔３１〕前記抗体が、モノクローナル抗体のＦｃ領域のみに生体直交性官能基を有する抗体である、〔２９〕または〔３０〕の抗体またはその塩。
〔３２〕前記抗体が、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域における２４６〜２４８位または２８８〜２９０位のアミノ酸残基からなる領域において、機能性物質を位置選択的に有するヒトＩｇＧである、〔２９〕〜〔３１〕のいずれかの抗体またはその塩。
〔３３〕前記式（ＩＩＩ−１）で表される前記抗体が、下記式（ＩＩＩ−２）：
Ａｂ−Ｅ１−Ｘ−Ｙ−Ｅ３−Ｂ’−Ｆ （ＩＩＩ−２）
〔式中、
Ａｂ、Ｘ、Ｙ、Ｂ’およびＦは、前記式（ＩＩＩ−１）のものと同じであり、
Ｅ１は、−Ｃ（＝Ｏ）−、−ＳＯ２−、および−ＣＨ２−からなる群より選ばれる基であり、
Ｅ３は、２価の基である〕で表される、機能性物質を位置選択的に有する抗体である、〔２９〕〜〔３２〕のいずれかの抗体またはその塩。
〔３４〕前記式（ＩＩＩ−１）で表される前記抗体が、下記式（ＩＩＩ−３）：
Figure 2019240288
 〔式中、
Ａｂ、環構成原子Ｘ’、環Ｚ、Ｂ’およびＦは、前記式（ＩＩＩ−１）のものと同じであり、
Ｅ１は、−Ｃ（＝Ｏ）−、−ＳＯ２−、および−ＣＨ２−からなる群より選ばれる基であり、
Ｅ３は、結合または２価の基である。〕で表される、機能性物質を位置選択的に有する抗体である、〔２９〕〜〔３２〕のいずれかの抗体またはその塩。
〔３５〕下記式（ＩＶ）：
Ａ−Ｌ−Ｅ−Ｆ （ＩＶ）
〔式中、
Ａは、抗体に対する親和性物質であり、
Ｌは、脱離基を含む２価の基であり、
Ｅは、（ｉ）前記脱離基と連結しており、かつ（ｉｉ）前記抗体中の求核基と反応する能力を有する求電子基を含む２価の基であり、
Ｆは、機能性物質であり、
前記脱離基は、前記求核基と前記求電子基との間の反応によりＥから切断されて脱離する能力を有する。〕で表される、抗体に対する親和性物質、および機能性物質を有する化合物またはその塩。
〔３６〕下記式（ＩＶ）：
Ａ−Ｌ−Ｅ−Ｆ （ＩＶ）
〔式中、
Ａは、抗体に対する親和性物質であり、
Ｌは、脱離基を含む２価の基であり、
Ｅは、（ｉ）前記脱離基と連結しており、かつ（ｉｉ）前記抗体中の求核基と反応する能力を有する求電子基を含む２価の基であり、
Ｆは、機能性物質であり、
前記脱離基は、前記求核基と前記求電子基との間の反応によりＥから切断されて脱離する能力を有する。〕で表される、抗体に対する親和性物質、および機能性物質を有する化合物またはその塩を含む、機能性物質による抗体の位置選択的修飾試薬。
〔３７〕機能性物質を有する抗体またはその塩の製造方法であって、
下記式（ＩＶ）：
Ａ−Ｌ−Ｅ−Ｆ （ＩＶ）
〔式中、
Ａは、抗体に対する親和性物質であり、
Ｌは、脱離基を含む２価の基であり、
Ｅは、（ｉ）前記脱離基と連結しており、かつ（ｉｉ）前記抗体中の求核基と反応する能力を有する求電子基を含む２価の基であり、
Ｆは、機能性物質であり、
前記脱離基は、前記求核基と前記求電子基との間の反応によりＥから切断されて脱離する能力を有する。〕で表される、抗体に対する親和性物質、および機能性物質を有する化合物またはその塩を、抗体と反応させて、
下記式（ＩＩＩ）：
Ａｂ−Ｅ−Ｆ （ＩＩＩ）
〔式中、
Ａｂは、抗体であり、
ＥおよびＦは、前記式（ＩＶ）のものと同じである。〕で表される、機能性物質を有する抗体またはその塩を生成することを含む、方法。
抗体に対する親和性物質、および生体直交性官能基または機能性物質を有する本発明の化合物またはその塩は、例えば、抗体の位置選択的な修飾に有用である。
生体直交性官能基を位置選択的に有する本発明の抗体またはその塩は、例えば、機能性物質を位置選択的に有する抗体またはその塩の調製における中間体として有用である。
機能性物質を位置選択的に有する本発明の抗体またはその塩は、例えば、医薬、または試薬（例、診断薬、研究用試薬）として有用である。
図１は、本発明の概要を示す模式図である。 図２は、ＩｇＧ抗体トラスツズマブ−ペプチド複合体合成におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析結果を示す図である。レーン１，３，６，８：分子量マーカー；レーン２：未反応のＩｇＧ抗体トラスツズマブ（コントロール、分子量５万付近のバンドが重鎖を分子量２万５千付近のバンドが軽鎖を示す）；レーン４：ＩｇＧ抗体トラスツズマブと化合物１０による複合体（分子量５万付近の上のバンドがトラスツズマブの重鎖に化合物１０がコンジュゲーションしたことを示す。分子量５万付近の下のバンドが未反応の重鎖、分子量２万５千付近のバンドが未反応の軽鎖を示す）；レーン５：ＩｇＧ抗体トラスツズマブと化合物１１による複合体（分子量５万付近の上のバンドがトラスツズマブの重鎖に化合物１１がコンジュゲーションしたことを示す。分子量５万付近の下のバンドが未反応の重鎖、分子量２万５千付近のバンドが未反応の軽鎖を示す）；レーン７：ＩｇＧ抗体トラスツズマブと化合物１２によるコンジュゲーション後の反応混合物（分子量５万付近のバンドが未反応の重鎖、分子量２万５千付近のバンドが未反応の軽鎖を示す。化合物１２がコンジュゲーションしたバンドは見られない）。 図３は、ＩｇＧ抗体トラスツズマブに位置特異的にマレイミドを導入し、その後にチオールを有するペプチド試薬とコンジュゲーションさせ合成したトラスツズマブ−ペプチド複合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析結果を示す図である。レーン１，９：分子量マーカー。レーン２：ＩｇＧ抗体トラスツズマブを化合物２２（抗体に対して１０モル当量）で処理し、位置選択的にマレイミドを導入した後、化合物２５をコンジュゲーションさせた複合体。分子量５万付近の上のバンドがトラスツズマブの重鎖にマレイミドが導入され、化合物２５とコンジュゲーションしたことを示す。分子量５万付近の下のバンドは未反応の重鎖、分子量２万５千付近のバンドが未反応の軽鎖を示す。レーン３：ＩｇＧ抗体トラスツズマブを化合物２２（抗体に対して２０モル当量）で処理し、位置選択的にマレイミドを導入した後、化合物２５をコンジュゲーションさせた複合体。分子量５万付近の上のバンドがトラスツズマブの重鎖にマレイミドが導入され、化合物２５とコンジュゲーションしたことを示す。分子量５万付近の下のバンドは未反応の重鎖、分子量２万５千付近のバンドが未反応の軽鎖を示す。レーン４：ＩｇＧ抗体トラスツズマブを化合物２２（抗体に対して４０モル当量）で処理し、位置選択的にマレイミドを導入した後、化合物２５をコンジュゲーションさせた複合体。分子量５万付近の上のバンドがトラスツズマブの重鎖にマレイミドが導入され、化合物２５とコンジュゲーションしたことを示す。分子量５万付近の下のバンドが未反応の重鎖、分子量２万５千付近のバンドは未反応の軽鎖を示す。レーン５：ＩｇＧ抗体トラスツズマブを化合物２３（抗体に対して１０モル当量）で処理し、位置選択的にマレイミドを導入した後、化合物２５をコンジュゲーションさせた複合体。分子量５万付近の上のバンドがトラスツズマブの重鎖にマレイミドが導入され、化合物２５とコンジュゲーションしたことを示す。分子量５万付近の下のバンドは未反応の重鎖、分子量２万５千付近のバンドが未反応の軽鎖を示す。レーン６：ＩｇＧ抗体トラスツズマブを化合物２３（抗体に対して２０モル当量）で処理し、位置選択的にマレイミドを導入した後、化合物２５をコンジュゲーションさせた複合体。分子量５万付近の上のバンドがトラスツズマブの重鎖にマレイミドが導入され、化合物２５とコンジュゲーションしたことを示す。分子量５万付近の下のバンドは未反応の重鎖、分子量２万５千付近のバンドが未反応の軽鎖を示す。レーン７：ＩｇＧ抗体トラスツズマブを化合物２３（抗体に対して４０モル当量）で処理し、位置選択的にマレイミドを導入した後、化合物２５をコンジュゲーションさせた複合体。分子量５万付近の上のバンドがトラスツズマブの重鎖にマレイミドが導入され、化合物２５とコンジュゲーションしたことを示す。分子量５万付近の下のバンドが未反応の重鎖、分子量２万５千付近のバンドは未反応の軽鎖を示す。レーン８、１０：未反応のＩｇＧ抗体トラスツズマブ（コントロール、分子量５万付近のバンドが重鎖を分子量２万５千付近のバンドが軽鎖を示す）レーン１１：ＩｇＧ抗体トラスツズマブを化合物２４（抗体に対して１０モル当量）で処理した後、化合物２５を加えた反応混合物。分子量５万付近のバンドは未反応の重鎖、分子量２万５千付近のバンドが未反応の軽鎖を示す。レーン１２：ＩｇＧ抗体トラスツズマブを化合物２４（抗体に対して２０モル当量）で処理した後、化合物２５を加えた反応混合物。分子量５万付近のバンドは未反応の重鎖、分子量２万５千付近のバンドが未反応の軽鎖を示す。レーン１３：ＩｇＧ抗体トラスツズマブを化合物２４（抗体に対して４０モル当量）で処理した後、化合物２５を加えた反応混合物。分子量５万付近のバンドは未反応の重鎖、分子量２万５千付近のバンドが未反応の軽鎖を示す。 図４は、（４−５−１）で合成したトラスツズマブ−マレイミド修飾体の還元後条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳを示す図である。上段が未反応のトラスツズマブを測定したもの、下段が修飾体を示す。 図５は、（６−１−１）で合成したトラスツズマブ−アジド修飾体（アジド修飾抗体１）の還元後条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳを示す図である。下段が未反応のトラスツズマブを測定したもの、上段が修飾体を示す。 図６は、（６−１−２）で合成したトラスツズマブ−アジド修飾体（アジド修飾抗体３）の還元後条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳを示す図である。下段が未反応のトラスツズマブを測定したもの、上段が修飾体を示す。 図７は、（６−１−３）で合成したトラスツズマブ−アジド修飾体（アジド修飾抗体６）の還元後条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳを示す図である。上段が未反応のトラスツズマブを測定したもの、下段が修飾体を示す。 図８は、（６−１−３）で合成したトラスツズマブ−アジド修飾体（アジド修飾抗体８）の還元後条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳを示す図である。上段が未反応のトラスツズマブを測定したもの、下段が修飾体を示す。 図９は、（６−１−３）で合成したトラスツズマブ−アジド修飾体（アジド修飾抗体１０）の還元後条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳを示す図である。上段が未反応のトラスツズマブを測定したもの、下段が修飾体を示す。 図１０は、（６−１−４）で合成したアダリムマブ−アジド修飾体（アジド修飾抗体２８）の還元後条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳを示す図である。上段が未反応のアダリムマブを測定したもの、下段が修飾体を示す。 図１１は、（６−１−４）で合成したデノスマブ―アジド修飾抗体（アジド修飾抗体２９）の還元後条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳを示す図である。上段が未反応のデノスマブを測定したもの、下段が修飾体を示す。 図１２は、（６−１−４）で合成したデュピルマブ―アジド修飾抗体（アジド修飾抗体３０）の還元後条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳを示す図である。上段が未反応のデュピルマブを測定したもの、下段が修飾体を示す。 図１３は、（６−１−４）で合成したリツキシマブ―アジド修飾抗体（アジド修飾抗体３１）の還元後条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳを示す図である。下段が未反応のリツキシマブを測定したもの、上段が修飾体を示す。 図１４は、（８−１−１）で合成したトラスツズマブ−保護チオール修飾体の還元後条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳを示す図である。上段が未反応のトラスツズマブを測定したもの、下段が修飾体を示す。 図１５は、（８−３−１）で脱保護したトラスツズマブ−チオール修飾体の還元後条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳを示す図である。上段が未反応のトラスツズマブを測定したもの、下段が修飾体を示す。 図１６は、（９−１−１）で合成したトラスツズマブ−アジド修飾体の還元後条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳを示す図である。上段が未反応のトラスツズマブを測定したもの、下段が修飾体を示す。 図１７は、（９−１−５）で合成したトラスツズマブ−アジド修飾体の還元後条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳを示す図である。上段が未反応のトラスツズマブを測定したもの、下段が修飾体を示す。 図１８は、（９−２−２）で合成したトラスツズマブ−アジド修飾体の還元後条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳを示す図である。上段が未反応のトラスツズマブを測定したもの、下段が修飾体を示す。 図１９は、（１０−１−１）で合成したトラスツズマブ−Ｃｙ３複合体のＥＳＩ−ＴＯＦＭＳを示す図である。下段が未反応のトラスツズマブを測定したもの、中段が（６−１−１）で合成したトラスツズマブ−アジド修飾体を測定したもの、上段がトラスツズマブ−Ｃｙ３複合体を示す。 図２０は、（１０−１−２）で処理したトラスツズマブ−Ｃｙ３複合体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳを示す図である。下段が未反応のトラスツズマブを測定したもの、中段が（６−１−１）で合成したトラスツズマブ−アジド修飾体を測定したもの、上段がトラスツズマブ−Ｃｙ３複合体を示す。 図２１は、（１０−２−２）で合成したトラスツズマブ−ペプチド複合体のＥＳＩ−ＴＯＦＭＳを示す図である。下段が未反応のトラスツズマブを測定したもの、中段が（６−１−１）で合成したトラスツズマブ−アジド修飾体を測定したもの、上段がトラスツズマブ−Ｃｙ３複合体を示す。 図２２は、（１０−２−３）で処理したトラスツズマブ−Ｃｙ３複合体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳを示す図である。下段が未反応のトラスツズマブを測定したもの、中段が（６−１−１）で合成したトラスツズマブ−アジド修飾体を測定したもの、上段がトラスツズマブ−ペプチド複合体を示す。 図２３は、（１０−３−１）で処理したトラスツズマブ−マレイミド化合物複合体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳを示す図である。上段がトラスツズマブのチオール導入体を測定したもの、下段がトラスツズマブ−マレイミド化合物複合体を示す。 図２４は、（１０−３−２）で処理した反応生成物の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳを示す図である。上段がトラスツズマブのチオール導入体を測定したもの、下段がトラスツズマブ−マレイミド化合物複合体を示す。 図２５は、（１）トラスツズマブの重鎖のアミノ酸配列（配列番号２）、（２）トラスツズマブの軽鎖のアミノ酸配列（配列番号４）を示す図である。 図２６は、（１）デノスマブの重鎖のアミノ酸配列（配列番号１０４）、（２）デノスマブの軽鎖のアミノ酸配列（配列番号１０５）を示す図である。 図２７は、（１）デュピルマブの重鎖のアミノ酸配列（配列番号１０６）、（２）デュピルマブの軽鎖のアミノ酸配列（配列番号１０７）を示す図である。 図２８は、アジド安息香酸修飾トラスツズマブのトリプシン消化によるリジン残基への修飾部位を含む、ＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号１１）のペプチドフラグメントのＭＳスペクトルを示す図である。 図２９は、アジド安息香酸修飾トラスツズマブのトリプシン消化によるリジン残基への修飾部位を含む、ＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号１１）のペプチドフラグメントのＣＩＤスペクトルを示す図である。 図３０は、アジド安息香酸修飾トラスツズマブのトリプシン消化によるリジン残基への修飾部位を含む、ＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲ（配列番号１２）のペプチドフラグメントのＭＳスペクトルを示す図である。 図３１は、アジド安息香酸修飾トラスツズマブのトリプシン消化によるリジン残基への修飾部位（アミン安息香酸導入体（＋１１９．０３７Ｄａ））を含む、ＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲ（配列番号１２）のペプチドフラグメントのＣＩＤスペクトルを示す図である。 図３２は、メルカプトプロピオン酸付加マレイミド修飾トラスツズマブのトリプシン消化によるリジン残基への修飾部位を含む、ＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号１１）のペプチドフラグメントのＭＳスペクトルを示す図である。 図３３は、マレイミドＭＰＡ修飾トラスツズマブのトリプシン消化によるリジン残基への修飾部位を含む、ＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号１１）のペプチドフラグメントのＣＩＤスペクトルを示す図である。 図３４は、アルキルアジド修飾トラスツズマブのトリプシン消化によるリジン残基への修飾部位を含む、ＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号１１）のペプチドフラグメントのＭＳスペクトルを示す図である。 図３５は、アルキルアジド修飾トラスツズマブのトリプシン消化によるリジン残基への修飾部位を含む、ＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号１１）のペプチドフラグメントのＣＩＤスペクトルを示す図である。 図３６は、アジド安息香酸修飾トラスツズマブのトリプシン消化によるリジン残基への修飾部位を含む、ＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫ（配列番号１０１）のペプチドフラグメントのＭＳスペクトルを示す図である。 図３７は、アジド安息香酸修飾トラスツズマブのトリプシン消化によるリジン残基への修飾部位を含む、ＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫ（配列番号１０１）のペプチドフラグメントのＣＩＤスペクトルを示す図である。 図３８は、アジド安息香酸修飾トラスツズマブの３１７位のリジン残基が高選択的に修飾されているというＢｉｏＰｈａｒｍａ Ｆｉｎｄｅｒによる解析結果を示す図である。 図３９は、アジド安息香酸修飾トラスツズマブのトリプシン消化によるリジン残基への修飾部位を含む、ＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲ（配列番号１２）のペプチドフラグメントのＭＳスペクトルを示す図である。 図４０は、アジド安息香酸修飾トラスツズマブのトリプシン消化によるリジン残基への修飾部位を含む、ＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲ（配列番号１２）のペプチドフラグメントのＣＩＤスペクトルを示す図である。 図４１は、アジド安息香酸修飾トラスツズマブの２８８位もしくは２９０位のリジン残基が高選択的に修飾されているというＢｉｏＰｈａｒｍａ Ｆｉｎｄｅｒによる解析結果を示す図である。 図４２は、アジド安息香酸修飾トラスツズマブのトリプシン消化によるリジン残基への修飾部位を含む、ＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号１１）のペプチドフラグメントのＭＳスペクトルを示す図である。 図４３は、アジド安息香酸修飾トラスツズマブのトリプシン消化によるリジン残基への修飾部位を含む、ＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号１１）のペプチドフラグメントのＣＩＤスペクトルを示す図である。 図４４は、アジド安息香酸修飾トラスツズマブの２４６位もしくは２４８位のリジン残基が高選択的に修飾されているというＢｉｏＰｈａｒｍａ Ｆｉｎｄｅｒによる解析結果を示す図である。 図４５は、アセチルチオール修飾トラスツズマブのトリプシン消化によるリジン残基への修飾部位を含む、ＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号１１）のペプチドフラグメントのＭＳスペクトルを示す図である。 図４６は、アセチルチオール修飾トラスツズマブのトリプシン消化によるリジン残基への修飾部位を含む、ＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号１１）のペプチドフラグメントのＣＩＤスペクトルを示す図である。 図４７は、アセチルチオール修飾トラスツズマブの２４６位もしくは２４８位のリジン残基が高選択的に修飾されているというＢｉｏＰｈａｒｍａ Ｆｉｎｄｅｒによる解析結果を示す図である。 図４８は、アジド安息香酸修飾トラスツズマブのトリプシン消化によるリジン残基への修飾部位を含む、ＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号１１）のペプチドフラグメントのＭＳスペクトルを示す図である。 図４９は、アジド安息香酸修飾トラスツズマブのトリプシン消化によるリジン残基への修飾部位を含む、ＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号１１）のペプチドフラグメントのＣＩＤスペクトルを示す図である。 図５０は、アジド安息香酸修飾トラスツズマブのトリプシン消化によるリジン残基への修飾部位を含む、ＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲ（配列番号１２）のペプチドフラグメントのＭＳスペクトルを示す図である。 図５１は、アジド安息香酸修飾トラスツズマブのトリプシン消化によるリジン残基への修飾部位を含む、ＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲ（配列番号１２）のペプチドフラグメントのＣＩＤスペクトルを示す図である。 図５２は、アセチルチオールおよびアジド安息香酸修飾トラスツズマブのトリプシン消化によるリジン残基への修飾部位を含む、ＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号１１）のペプチドフラグメントのＭＳスペクトルを示す図である。 図５３は、アセチルチオールおよびアジド安息香酸修飾トラスツズマブのトリプシン消化によるリジン残基への修飾部位を含む、ＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号１１）のペプチドフラグメントのＣＩＤスペクトルを示す図である。 図５４は、アセチルチオールおよびアジド安息香酸修飾トラスツズマブのトリプシン消化によるリジン残基への修飾部位を含む、ＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲ（配列番号１２）のペプチドフラグメントのＭＳスペクトルを示す図である。 図５５は、アセチルチオールおよびアジド安息香酸修飾トラスツズマブのトリプシン消化によるリジン残基への修飾部位を含む、ＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲ（配列番号１２）のペプチドフラグメントのＣＩＤスペクトルを示す図である。 図５６は、アセチルチオールおよびアジド安息香酸修飾トラスツズマブの２４６位もしくは２４８位および２８８位もしくは２９０位のリジン残基が高選択的に修飾されているというＢｉｏＰｈａｒｍａ Ｆｉｎｄｅｒによる解析結果を示す図である。 図５７は、安息香酸修飾デノスマブのトリプシン消化によるリジン残基への修飾部位を含む、ＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号１０２）のペプチドフラグメントのＭＳスペクトルを示す図である。 図５８は、安息香酸修飾デノスマブのトリプシン消化によるリジン残基への修飾部位を含む、ＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号１０２）のペプチドフラグメントのＣＩＤスペクトルを示す図である。 図５９は、安息香酸修飾デノスマブの２４７位もしくは２４９位のリジン残基が高選択的に修飾されているというＢｉｏＰｈａｒｍａ Ｆｉｎｄｅｒによる解析結果を示す図である。 図６０は、安息香酸修飾デュピルマブのトリプシン消化によるリジン残基への修飾部位を含む、ＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号１０３）のペプチドフラグメントのＭＳスペクトルを示す図である。 図６１は、安息香酸修飾デュピルマブのトリプシン消化によるリジン残基への修飾部位を含む、ＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号１０３）のペプチドフラグメントのＣＩＤスペクトルを示す図である。 図６２は、安息香酸修飾デュピルマブの２５１位もしくは２５３位のリジン残基が高選択的に修飾されているというＢｉｏＰｈａｒｍａ Ｆｉｎｄｅｒによる解析結果を示す図である。 図６３は、ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ（非還元条件下）による、（１２−１−１）で合成したトラスツズマブ−ＤＭ１コンジュゲートの解析結果を示す図である。 図６４は、ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ（還元条件下）による、（１２−１−１）で合成したトラスツズマブ−ＤＭ１コンジュゲートの解析結果を示す図である。 図６５は、ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ（非還元条件下）による、（１２−２−１）で合成したトラスツズマブ−ＭＭＡＥコンジュゲートの解析結果を示す図である。 図６６は、ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ（還元条件下）による、（１２−２−１）で合成したトラスツズマブ−ＭＭＡＥコンジュゲートの解析結果を示す図である。 図６７は、ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ（非還元条件下）による、（１２−３−１）で合成したリツキシマブ−ＤＭ１コンジュゲートの解析結果を示す図である。 図６８は、ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ（還元条件下）による、（１２−３−１）で合成したリツキシマブ−ＤＭ１コンジュゲートの解析結果を示す図である。 図６９は、ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ（非還元条件下）による、（１２−４−１）で合成したリツキシマブ−ＤＭ１コンジュゲートの解析結果を示す図である。 図７０は、ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ（還元条件下）による、（１２−４−１）で合成したリツキシマブ−ＤＭ１コンジュゲートの解析結果を示す図である。 図７１は、（１）トラスツズマブの重鎖中のＦｃ領域、およびＩｇＧ１ Ｆｃ領域のコンセンサスアミノ酸配列（配列番号１）、ならびに（２）ＩｇＧ１ Ｆｃ領域のアミノ酸配列（配列番号３）を示す図である。
１．抗体に対する親和性物質、および生体直交性官能基を有する化合物またはその塩
１−１．概要
本発明は、式（Ｉ）で表される、抗体に対する親和性物質、および生体直交性官能基を有する化合物またはその塩を提供する。
Ａ−Ｌ−Ｅ−Ｂ （Ｉ）
〔式中、
Ａは、抗体に対する親和性物質であり、
Ｌは、脱離基を含む２価の基であり、
Ｅは、（ｉ）前記脱離基と連結しており、かつ（ｉｉ）前記抗体中の求核基と反応する能力を有する求電子基を含む２価の基であり、
Ｂは、生体直交性官能基であり、
前記脱離基は、前記求核基と前記求電子基との間の反応によりＥから切断されて脱離する能力を有する。〕
本発明に関連して提示される式（Ｉ）および他の式などの表記において、−（ハイフン）は、その両側に存在する２つの単位が共有結合していることを示す。したがって、式（Ｉ）では、Ａは、Ｌと共有結合しており、Ｌは、ＡおよびＥと共有結合しており、Ｅは、ＬおよびＢと共有結合しており、Ｂは、Ｅと共有結合している。式（Ｉ）で表される、抗体に対する親和性物質、および生体直交性官能基を有する化合物またはその塩は、抗体に対する親和性物質（Ａ）が、Ｌ−Ｅ−Ｂを有する構造単位を、ＡとＬとの共有結合を介して含むことを示す。したがって、式（Ｉ）において、抗体に対する親和性物質（Ａ）は、Ｌ−Ｅ−Ｂを有する１個の構造単位、またはＬ−Ｅ−Ｂを有する複数（例えば２〜５個、好ましくは２〜４個、より好ましくは２または３個）の構造単位（同種または異種）を有していてもよい。
他の式においても、抗体に対する親和性物質（Ａ）または抗体（Ａｂ）は、式中の特定構造単位（ＡまたはＡｂを除く構造単位）を、共有結合を介して含むことを示す。したがって、他の式においても、抗体に対する親和性物質（Ａ）または抗体（Ａｂ）は、１個の特定構造単位、または複数（例えば２〜５個、好ましくは２〜４個、より好ましくは２または３個）の特定構造単位（同種または異種）を有していてもよい。
１−２．抗体に対する親和性物質（Ａ）
式（Ｉ）において、Ａは、抗体に対する親和性物質である。抗体に対する親和性物質とは、抗体に対して非共有結合による結合能を有する物質である。
本発明で用いられる親和性物質は、抗体を標的とする。抗体は、生体分子（例、糖）で修飾された抗体であっても、生体分子で未修飾の抗体であってもよい。抗体としては、生物由来成分、ウイルス由来成分、および環境中に見出される成分等の任意の成分に対する任意の抗体を用いることができるが、生物由来成分またはウイルス由来成分に対する抗体が好ましい。生物由来成分としては、例えば、哺乳動物、鳥類（例、ニワトリ）等の動物、昆虫、微生物、植物、菌類、および魚類由来の成分（例、タンパク質）が挙げられる。好ましくは、生物由来成分は、哺乳動物由来の成分である。哺乳動物としては、例えば、霊長類（例、ヒト、サル、チンパンジー）、齧歯類（例、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ）、愛玩動物（例、イヌ、ネコ）、家畜（例、ウシ、ブタ、ヤギ）、使役動物（例、ウマ、ヒツジ）が挙げられる。生物由来成分は、より好ましくは、霊長類または齧歯類由来の成分（例、タンパク質）であり、さらにより好ましくは、本発明の臨床応用の観点から、ヒト由来の成分（例、タンパク質）である。ウイルス由来成分としては、例えば、インフルエンザウイルス（例、トリインフルエンザウイルス、ブタインフルエンザウイルス）、エイズウイルス、エボラウイルス、ファージウイルスに由来する成分（例、タンパク質）が挙げられる。
抗体はまた、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり、好ましくはモノクローナル抗体である。モノクローナル抗体としては、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、所定の糖鎖が付加された抗体（例、Ｎ型糖鎖結合コンセンサス配列等の糖鎖結合コンセンサス配列を有するように改変された抗体）、二重特異性抗体、ｓｃＦｖ抗体、Ｆａｂ抗体、Ｆ（ａｂ‘）２抗体、ＶＨＨ抗体、Ｆｃ領域タンパク質、Ｆｃ融合タンパク質が挙げられる。抗体はまた、２価の抗体（例、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥ）、または４価以上の抗体（例、ＩｇＡ抗体、ＩｇＭ抗体）であってもよい。
親和性物質の標的である抗体はまた、任意のアミノ酸残基から構成されていてもよいが、好ましくは、タンパク質を通常構成する天然の２０種のＬ−α−アミノ酸残基から構成される。このようなアミノ酸残基としては、例えば、Ｌ−アラニン（Ａ）、Ｌ−アスパラギン（Ｎ）、Ｌ−システイン（Ｃ）、Ｌ−グルタミン（Ｑ）、Ｌ−イソロイシン（Ｉ）、Ｌ−ロイシン（Ｌ）、Ｌ−メチオニン（Ｍ）、Ｌ−フェニルアラニン（Ｆ）、Ｌ−プロリン（Ｐ）、Ｌ−セリン（Ｓ）、Ｌ−スレオニン（Ｔ）、Ｌ−トリプトファン（Ｗ）、Ｌ−チロシン（Ｙ）、Ｌ−バリン（Ｖ）、Ｌ−アスパラギン酸（Ｄ）、Ｌ−グルタミン酸（Ｅ）、Ｌ−アルギニン（Ｒ）、Ｌ−ヒスチジン（Ｈ）、またはＬ−リジン（Ｋ）、及びグリシン（Ｇ）が挙げられる（以下、Ｌの表記を省略）。抗体は、例えば１００個以上、好ましくは１２０個以上、より好ましくは１５０個以上、さらにより好ましくは１８０個以上、特に好ましくは２００個以上のアミノ酸残基から構成されていてもよい。抗体はまた、例えば１０００個以下、好ましくは９００個以下、より好ましくは８００個以下、さらにより好ましくは７００個以下、特に好ましくは６００個以下であってもよい。より具体的には、抗体は、例えば１００〜１０００個、好ましくは１２０〜９００個、より好ましくは１５０〜８００個、さらにより好ましくは１８０〜７００個以上、特に好ましくは２００〜６００個のアミノ酸残基から構成されていてもよい。抗体が抗体（例、上述したようなモノクローナル抗体）である場合、上記個数のアミノ酸残基は、抗体の重鎖のアミノ酸残基に相当するものであってもよい。
親和性物質の標的である抗体はさらに、後述するような生体直交性官能基が反応できる側鎖または末端（Ｎ末端および/またはＣ末端）、好ましくは側鎖を有する特定のアミノ酸残基を１つの位置または複数の位置（好ましくは複数の位置）で含むタンパク質である。このような特定のアミノ酸残基としては、例えば、後述するようなアミノ酸残基が挙げられるが、好ましくは、リジン残基、チロシン残基、セリン残基、スレオニン残基、およびシステイン残基からなる群より選ばれるアミノ酸残基である。本発明の化合物が抗体を位置選択的に修飾できることに鑑みると、このような特定のアミノ酸残基を複数の位置で含む抗体が好ましい。複数の位置としては、２以上の位置である限り特に限定されないが、例えば３以上の位置、好ましくは５以上の位置、より好ましくは１０以上の位置、さらにより好ましくは２０以上の位置、特に好ましくは３０以上の位置であってもよい。複数の位置はまた、例えば２００以下の位置、好ましくは１８０以下の位置、より好ましくは１５０以下の位置、さらにより好ましくは１２０以下の位置、特に好ましくは１００以下の位置であってもよい。より具体的には、複数の位置は、例えば３〜２００の位置、好ましくは５〜１８０の位置、より好ましくは１０〜１５０の位置、さらにより好ましくは２０〜１２０の位置、特に好ましくは３０〜１００の位置であってもよい。このような特定のアミノ酸残基を複数の位置で含む抗体であっても、本発明の化合物は、特定の領域に存在する１または２個の特定のアミノ酸残基を位置選択的に修飾することができる。例えば、ヒトＩｇＧ１のリジン残基数は、可変領域中のアミノ酸組成にもよるが、一般的には７０〜９０個程度と言われている。本発明では、このようなヒトＩｇＧ１の特定の領域に存在する１または２個のリジン残基を位置選択的に修飾することに成功している。
より具体的には、本発明では、抗体の機能を維持しつつ（すなわち、抗体を変性させずにネイティブなフォールディングを維持しつつ）、抗体中の特定の標的部位に存在するアミノ酸残基を修飾する観点から、抗体の表面に露出しているアミノ酸残基の位置選択的な修飾が好ましい。例えば、ヒトＩｇＧ１等のヒトＩｇＧでは、露出リジン残基および露出チロシン残基は、以下の位置に存在する（ＥＵ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇによる；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ＩＭＧＴＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＣｈａｒｔ／Ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ／Ｈｕ＿ＩＧＨＧｎｂｅｒ．ｈｔｍｌを参照）。
（１）露出リジン残基
ＣＨ２ドメイン（２４６位、２４８位、２７４位、２８８位、２９０位、３１７位、３２０位、３２２位、３３８位）
ＣＨ３ドメイン（３６０位、４１４位、４３９位）
（２）露出チロシン残基
ＣＨ２ドメイン（２７８位、２９６位、３００位）
ＣＨ３ドメイン（４３６位）
（３）露出セリン残基
ＣＨ２ドメイン（２５４位、２６７位、２９８位、３２４位）
ＣＨ３ドメイン（３７５位、４００位、４１５位、４４０位、４４２位）
（４）露出スレオニン残基
ＣＨ２ドメイン（２５６位、２８９位、３０７位）
ＣＨ３ドメイン（３３５位、３５９位、３９３位、４３７位）
したがって、ヒトＩｇＧ１等のヒトＩｇＧがリジン残基またはチロシン残基で修飾される場合、上記位置での修飾が好ましい。
好ましくは、ヒトＩｇＧ１等のヒトＩｇＧがリジン残基、チロシン残基、セリン残基またはスレオニン残基で修飾される場合、上記（１）〜（４）の位置のなかでも、表面への露出性が高い以下の位置に存在するリジン残基、チロシン残基、セリン残基またはスレオニン残基が修飾されてもよい。
（１’）露出リジン残基
ＣＨ２ドメイン（２４６位、２４８位、２７４位、２８８位、２９０位、３１７位、３２０位、３２２位）
ＣＨ３ドメイン（３６０位、４１４位、４３９位）
（２’）露出チロシン残基
ＣＨ２ドメイン（２７８位、２９６位、３００位）
ＣＨ３ドメイン（４３６位）
（３’）露出セリン残基
ＣＨ２ドメイン（２５４位、２６７位、２９８位）
ＣＨ３ドメイン（４００位、４１５位、４４０位）
（４’）露出スレオニン残基
ＣＨ２ドメイン（２５６位、２８９位）
ＣＨ３ドメイン（３３５位、３５９位）
したがって、ヒトＩｇＧ１等のヒトＩｇＧがリジン残基、チロシン残基、セリン残基またはスレオニン残基で修飾される場合、上記位置での修飾がより好ましい。
より好ましくは、ヒトＩｇＧ１等のヒトＩｇＧがリジン残基で修飾される場合、上記（１）の位置のなかでも、本発明において効率的に修飾することができるＣＨ２ドメイン中の所定の位置（例、２４６位、２４８位、２８８位、２９０位、３１７位）に存在するリジン残基が修飾されてもよい。
特定の実施形態では、親和性物質の標的である抗体は、上述したように特定のアミノ酸残基を複数の位置で含む場合、連続する１〜５０個のアミノ酸残基からなる標的領域中において特定のアミノ酸残基を１個以上含み、かつ、前記標的領域以外の非標的領域中において特定のアミノ酸残基を５個以上含むものであってもよい。標的領域は、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜２０個、さらにより好ましくは１〜１０個、１〜５個、または１〜３個（すなわち、１個、２個、もしくは３個）のアミノ酸残基からなるものであってもよい。特に好ましくは、標的領域は、特定の位置に存在する特定のアミノ酸残基からなる領域であってもよい。このような特定の位置は、標的タンパク質および親和性物質の種類などによっても変動するが、例えば、抗体の定常領域中の特定領域（例、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）中の特定の位置であってもよく、好ましくは抗体のＣＨ２中の位置であってもよい。より具体的には、標的領域は、ヒトＩｇＧ ＦｃにおけるＥｕ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇに従う下記残基であってもよい：
（１）Ｌｙｓ２４８残基（以下、本明細書では単に「Ｌｙｓ２４８」とも表記し、ヒトＩｇＧ ＣＨ２領域（配列番号１）の１８番目の残基に相当する）またはＬｙｓ２４６残基（以下、本明細書では単に「Ｌｙｓ２４６」とも表記し、ヒトＩｇＧ ＣＨ２領域（配列番号１）の１６番目の残基に相当する）：
（２）Ｌｙｓ２８８残基（以下、本明細書では単に「Ｌｙｓ２８８」とも表記し、ヒトＩｇＧ ＣＨ２領域（配列番号１）の５８番目の残基に相当する）またはＬｙｓ２９０残基（以下、本明細書では単に「Ｌｙｓ２９０」とも表記し、ヒトＩｇＧ ＣＨ２領域（配列番号１）の６０番目の残基に相当する）；
（３）Ｌｙｓ３１７残基（以下、本明細書では単に「Ｌｙｓ３１７」とも表記し、ヒトＩｇＧ ＣＨ２領域（配列番号１）の８７番目の残基に相当する）。
本発明によれば、上記標的領域における特定のアミノ酸残基を高度に位置選択的に修飾することができる。このような位置選択性は、例えば３０％以上、好ましくは４０％以上、より好ましくは５０％以上、さらにより好ましくは６０％以上、特に好ましくは７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％であってもよい。
標的領域はまた、特定の位置に存在する特定のアミノ酸残基が、当該特定の位置を中心としてそれぞれＮ末端側およびＣ末端側に対してａ個（ここで、ａは、１〜１０の任意の整数である）のアミノ酸残基の遠隔位置までの領域において、当該特定の位置に存在する特定のアミノ酸残基以外に、特定のアミノ酸残基と同種のアミノ酸残基を含まないものであってもよい。ａは、好ましくは１〜５の整数であり、より好ましくは１〜３の整数であり、さらにより好ましくは１または２であり、特に好ましくは１である。
好ましい実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体である。モノクローナル抗体等の抗体のアイソタイプとしては、例えば、ＩｇＧ（例、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、およびＩｇＹが挙げられる。モノクローナル抗体は、全長抗体、または抗体断片（例、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、単鎖抗体）であるが、全長抗体が好ましい。特に好ましくは、抗体は、ヒトＩｇＧ（例、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）を定常領域に有するヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体である。
抗体は、任意の抗原に対する抗体である。例えば、このような抗原は、上述したような生物またはウイルスにおいて見出される成分であってもよい。このような抗原としてはまた、例えば、タンパク質〔オリゴペプチド、ポリペプチドを含む。糖等の生体分子で修飾されたタンパク質（例、糖タンパク質）であってもよい〕、糖鎖、核酸、低分子化合物が挙げられる。
好ましくは、抗体は、タンパク質を抗原とする抗体であってもよい。タンパク質としては、例えば、細胞膜受容体、細胞膜受容体以外の細胞膜タンパク質（例、細胞外基質タンパク質）、リガンド、可溶性受容体が挙げられる。
より具体的には、抗体の抗原であるタンパク質は、疾患標的タンパク質であってもよい。疾患標的タンパク質としては、例えば、以下が挙げられる。
（１）がん領域
ＰＤ−Ｌ１、ＧＤ２、ＰＤＧＦＲα（血小板由来成長因子受容体）、ＣＤ２２、ＨＥＲ２、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ＥｐＣＡＭ、フィブロネクチン、ＰＤ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＣＤ３３、ＨＧＦ、ｇｐＮＭＢ、ＣＤ２７、ＤＥＣ−２０５、葉酸受容体、ＣＤ３７、ＣＤ１９、Ｔｒｏｐ２、ＣＥＡＣＡＭ５、Ｓ１Ｐ、ＨＥＲ３、ＩＧＦ−１Ｒ、ＤＬＬ４、ＴＮＴ−１／Ｂ、ＣＰＡＡｓ、ＰＳＭＡ、ＣＤ２０、ＣＤ１０５（エンドグリン）、ＩＣＡＭ−１、ＣＤ３０、ＣＤ１６Ａ、ＣＤ３８、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲ、ＫＩＲ２ＤＬ１，２，、ＮＫＧ２Ａ、ｔｅｎａｓｃｉｎ−Ｃ、ＩＧＦ（Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、ＣＴＬＡ−４、ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ、ＣＤ１３８、ｃ−Ｍｅｔ、Ａｎｇ２、ＶＥＧＦ−Ａ、ＣＤ７９ｂ、ＥＮＰＤ３、葉酸受容体α、ＴＥＭ−１、ＧＭ２、グリピカン３、ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ、ＣＤ７４、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、ＣＤ３７、ＴＬＲ−２、ＣＤ３、ＣＳＦ−１Ｒ、ＦＧＦＲ２ｂ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＥｐｈＡ３、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ１２３、ｇｐＡ３３、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ７受容体、ＤＬＬ４、ＶＥＧＦ、ＲＳＰＯ、ＬＩＶ−１、ＳＬＩＴＲＫ６、Ｎｅｃｔｉｎ−４、ＣＤ７０、ＣＤ４０、ＣＤ１９、ＳＥＭＡ４Ｄ（ＣＤ１００）、ＣＤ２５、ＭＥＴ、Ｔｉｓｓｕｅ Ｆａｃｔｏｒ、ＩＬ−８、ＥＧＦＲ、ｃＭｅｔ、ＫＩＲ３ＤＬ２、Ｂｓｔ１（ＣＤ１５７）、Ｐ−カドヘリン、ＣＥＡ、ＧＩＴＲ、ＴＡＭ（ｔｕｍｏｒ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）、ＣＥＡ、ＤＬＬ４、Ａｎｇ２、ＣＤ７３、ＦＧＦＲ２、ＣＸＣＲ４、ＬＡＧ−３、ＧＩＴＲ、Ｆｕｃｏｓｙｌ ＧＭ１、ＩＧＦ−１、Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ ２、ＣＳＦ−１Ｒ、ＦＧＦＲ３、ＯＸ４０、ＢＣＭＡ、ＥｒｂＢ３、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＰＴＫ７、ＥＦＮＡ４、ＦＡＰ、ＤＲ５、ＣＥＡ、Ｌｙ６Ｅ、ＣＡ６、ＣＥＡＣＡＭ５、ＬＡＭＰ１、ｔｉｓｓｕｅ ｆａｃｔｏｒ、ＥＰＨＡ２、ＤＲ５、Ｂ７−Ｈ３、ＦＧＦＲ４、ＦＧＦＲ２、α２−ＰＩ、Ａ３３、ＧＤＦ１５、ＣＡＩＸ、ＣＤ１６６、ＲＯＲ１、ＧＩＴＲ、ＢＣＭＡ、ＴＢＡ、ＬＡＧ−３、ＥｐｈＡ２、ＴＩＭ−３、ＣＤ−２００、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＤ１６Ａ、ＣＤ３２Ｂ、ＰＩＧＦ、Ａｘｌ、ＭＩＣＡ／Ｂ、Ｔｈｏｍｓｅｎ−Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ、ＣＤ３９、ＣＤ３７、ＣＤ７３、ＣＬＥＣ１２Ａ、Ｌｇｒ３、トランスフェリン受容体、ＴＧＦβ、ＩＬ−１７、５Ｔ４、ＲＴＫ、Ｉｍｍｕｎｅ Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ、ＮａＰｉ２ｂ、ルイス血液型Ｂ抗原、Ａ３４、Ｌｙｓｉｌ−Ｏｘｉｄａｓｅ、ＤＬＫ−１、ＴＲＯＰ−２、α９インテグリン、ＴＡＧ−７２（ＣＡ７２−４）、ＣＤ７０
（２）自己免疫疾患・炎症性疾患
ＩＬ−１７、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−１７Ｒ、ＩＮＦ−α、ＩＬ−５Ｒ、ＩＬ−１３、ＩＬ−２３、ＩＬ−６、ＡｃｔＲＩＩＢ、β７−Ｉｎｔｅｇｒｉｎ、ＩＬ−４αＲ、ＨＡＳ、Ｅｏｔａｘｉｎ−１、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１５、ＣＤ３ε、Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ、ＩＬ−１β、ＩＬ−１α、ＩＬ−１７、ＴＳＬＰ（Ｔｈｙｍｉｃ Ｓｔｒｏｍａｌ Ｌｙｍｐｈｏｐｏｉｅｔｉｎ）、ＬＡＭＰ（Ａｌｐｈａ４ Ｂｅｔａ ７ Ｉｎｔｅｇｒｉｎ）、ＩＬ−２３、ＧＭ−ＣＳＦＲ、ＴＳＬＰ、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＴＬＲ−３、ＢＡＦＦ−Ｒ、ＭＡｄＣＡＭ、ＩＬ−３１Ｒ、ＩＬ−３３、ＣＤ７４、ＣＤ３２Ｂ、ＣＤ７９Ｂ、ＩｇＥ（免疫グロブリンＥ）、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｆ、Ｃ５、ＦｃＲｎ、ＣＤ２８、ＴＬＲ４、ＭＣＡＭ、Ｂ７ＲＰ１、ＣＸＣＲ１，２ Ｌｉｇａｎｄｓ、ＩＬ−２１、Ｃａｄｈｅｒｉｎ−１１、ＣＸ３ＣＬ１、ＣＣＬ２０、ＩＬ−３６Ｒ、ＩＬ−１０Ｒ、ＣＤ８６、ＴＮＦ−α、ＩＬ−７Ｒ、Ｋｖ１．３、α９インテグリン、ＬＩＦＨＴ
（３）脳神経疾患
ＣＧＲＰ、ＣＤ２０、βアミロイド、βアミロイドプロトフィブリン、Ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ Ｇｅｎｅ−Ｒｅｌａｔｅｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＬＩＮＧＯ（Ｉｇ Ｄｏｍａｉｎ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ１）、αシヌクレイン、細胞外ｔａｕ、ＣＤ５２、インスリン受容体、ｔａｕタンパク、ＴＤＰ−４３、ＳＯＤ１、ＴａｕＣ３、ＪＣウイルス
（４）感染症
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ Ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ｔｏｘｉｎ Ｂ、サイトメガロウイルス、ＲＳウイルス、ＬＰＳ、Ｓ．Ａｕｒｅｕｓ Ａｌｐｈａ−ｔｏｘｉｎ、Ｍ２ｅタンパク、Ｐｓｌ、ＰｃｒＶ、Ｓ．Ａｕｒｅｕｓ ｔｏｘｉｎ、インフルエンザＡ、Ａｌｇｉｎａｔｅ、黄色ブドウ球菌、ＰＤ−Ｌ１、インフルエンザＢ、アシネトバクター、Ｆ−ｐｒｏｔｅｉｎ、Ｅｎｖ、ＣＤ３、病原性大腸菌、クレブシエラ、肺炎球菌
（５）遺伝性・希少疾患
アミロイドＡＬ、ＳＥＭＡ４Ｄ（ＣＤ１００）、インスリン受容体、ＡＮＧＰＴＬ３、ＩＬ４、ＩＬ１３、ＦＧＦ２３、副腎皮質刺激ホルモン、トランスサイレチン、ハンチンチン
（６）眼疾患
Ｆａｃｔｏｒ Ｄ、ＩＧＦ−１Ｒ、ＰＧＤＦＲ、Ａｎｇ２、ＶＥＧＦ−Ａ、ＣＤ−１０５（Ｅｎｄｏｇｌｉｎ）、ＩＧＦ−１Ｒ、βアミロイド
（７）骨・整形外科領域
Ｓｃｌｅｒｏｓｔｉｎ、Ｍｙｏｓｔａｔｉｎ、Ｄｉｃｋｋｏｐｆ−１、ＧＤＦ８、ＲＮＡＫＬ、ＨＡＳ、Ｓｉｇｌｅｃ−１５
（８）血液疾患
ｖＷＦ、Ｆａｃｔｏｒ ＩＸａ、Ｆａｃｔｏｒ Ｘ、ＩＦＮγ、Ｃ５、ＢＭＰ−６、Ｆｅｒｒｏｐｏｒｔｉｎ、ＴＦＰＩ
（９）その他の疾患
ＢＡＦＦ（Ｂ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）、ＩＬ−１β、ＰＣＳＫ９、ＮＧＦ、ＣＤ４５、ＴＬＲ−２、ＧＬＰ−１、ＴＮＦＲ１、Ｃ５、ＣＤ４０、ＬＰＡ、プロラクチン受容体、ＶＥＧＦＲ−１、ＣＢ１、Ｅｎｄｏｇｌｉｎ、ＰＴＨ１Ｒ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ８、ＩＬ−１β、ＡＴ２−Ｒ、ＩＡＰＰ
より好ましい実施形態では、抗体に対する親和性物質は、モノクローナル抗体に対する親和性物質である。モノクローナル抗体のアイソタイプは、抗体について上述したものと同様であるが、ＩｇＧ（例、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）が好ましい。好ましくは、モノクローナル抗体は、全長モノクローナル抗体である。
さらにより好ましい実施形態では、抗体に対する親和性物質は、全長モノクローナル抗体であるキメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体（例、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４等のＩｇＧ）に対する親和性物質である。
特に好ましい実施形態では、抗体に対する親和性物質は、下記（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選ばれるいずれか一つのＦｃ領域タンパク質を含み、かつ抗原結合能を有する抗体に対する親和性物質である：
（Ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＦｃ領域タンパク質；
（Ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基が挿入、付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列を含むＦｃ領域タンパク質；または
（Ｃ）配列番号１のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含むＦｃ領域タンパク質。
配列番号１のアミノ酸配列は、Ｆｃ領域タンパク質である。このようなＦｃ領域タンパク質は、分泌能を有することが知られている。したがって、上記（Ａ）〜（Ｃ）のＦｃ領域タンパク質は、分泌能を有することができる。また、このようなＦｃ領域タンパク質を含む抗体は、抗原結合能を有することができる。配列番号１における１８位のアミノ酸残基は、任意のアミノ酸残基であるが、好ましくは中性アミノ酸残基であり、より好ましくは後述するような非極性側鎖を有するアミノ酸残基であり、さらにより好ましくはロイシン、イソロイシンまたはアラニンであり、特に好ましくはロイシンまたはアラニンである。配列番号１における１９位のアミノ酸残基は、任意のアミノ酸残基であるが、好ましくは中性アミノ酸残基または酸性アミノ酸残基であり、より好ましくは非極性側鎖を有するアミノ酸残基または酸性アミノ酸残基であり、さらにより好ましくはロイシンまたはグルタミン酸である。配列番号１における２１位のアミノ酸残基は、任意のアミノ酸残基であるが、好ましくは中性アミノ酸残基であり、より好ましくは非極性側鎖を有するアミノ酸残基であり、さらにより好ましくはグリシンまたはアラニンである。配列番号１における１４０位のアミノ酸残基は、任意のアミノ酸残基であるが、好ましくは酸性アミノ酸残基であり、より好ましくはグルタミン酸またはアスパラギン酸である。配列番号１における１４２位のアミノ酸残基は、任意のアミノ酸残基であるが、好ましくは中性アミノ酸残基であり、より好ましくは非極性側鎖を有するアミノ酸残基であり、さらにより好ましくはメチオニン、ロイシンまたはイソロイシンであり、特に好ましくはメチオニンまたはロイシンである。配列番号１における１７７位のアミノ酸残基は、任意のアミノ酸残基であるが、好ましくは中性アミノ酸残基であり、より好ましくは後述するような非荷電性極性側鎖を有するアミノ酸残基または非極性側鎖を有するアミノ酸残基であり、さらにより好ましくはスレオニン、アラニンまたはグリシンであり、特に好ましくはスレオニンまたはアラニンである。
好ましい実施形態では、配列番号１のアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸配列における２２０〜４４９位のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列であってもよい。
別の好ましい実施形態では、配列番号１のアミノ酸配列は、配列番号３のアミノ酸配列における７〜２３６位のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列であってもよい。
特定の実施形態では、上述したようなアミノ酸配列を含むＦｃ領域タンパク質を含む抗体は、上述したようなアミノ酸配列を含むＦｃ領域タンパク質、および抗体の定常領域を含む抗体であってもよい。このような抗体の定常領域としては、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体（例、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４等のＩｇＧ）の定常領域であってもよい。
Ｆｃ領域タンパク質（Ｂ）では、アミノ酸残基の欠失、置換、付加および挿入からなる群より選ばれる１、２、３または４種の変異により、１個または数個のアミノ酸残基が改変され得る。アミノ酸残基の変異は、アミノ酸配列中の１つの領域に導入されてもよいが、複数の異なる領域に導入されてもよい。用語「１個または数個」は、タンパク質の活性を大きく損なわない個数を示す。用語「１個または数個」が示す数は、例えば、１〜１００個、好ましくは１〜８０個、より好ましくは１〜５０個、１〜３０個、１〜２０個、１〜１０個または１〜５個（例、１個、２個、３個、４個、または５個）である。
Ｆｃ領域タンパク質（Ｃ）では、配列番号１のアミノ酸配列との同一性％は、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上であってもよい。本発明では、ペプチドまたはポリペプチド（タンパク質）の同一性％の算出は、アルゴリズムｂｌａｓｔｐにより行うことができる。より具体的には、ポリペプチドの同一性の算定％は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）において提供されているアルゴリズムｂｌａｓｔｐにおいて、デフォルト設定のＳｃｏｒｉｎｇ Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ（Ｍａｔｒｉｘ：ＢＬＯＳＵＭ６２；Ｇａｐ Ｃｏｓｔｓ：Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ＝１１ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ＝１；Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ Ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔｓ：Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ ｓｃｏｒｅ ｍａｔｒｉｘ ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔ）を用いて行うことができる。また、ポリヌクレオチド（遺伝子）の同一性％の算出は、アルゴリズムｂｌａｓｔｎにより行うことができる。より具体的には、ポリヌクレオチドの同一性％の算定は、ＮＣＢＩにおいて提供されているアルゴリズムｂｌａｓｔｎにおいて、デフォルト設定のＳｃｏｒｉｎｇ Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ（Ｍａｔｃｈ／Ｍｉｓｍａｔｃｈ Ｓｃｏｒｅｓ＝１，−２；Ｇａｐ Ｃｏｓｔｓ＝Ｌｉｎｅａｒ）を用いて行うことができる。
分泌能における分泌は、分泌タンパク質の分泌（いわゆる可溶性）と同じ意味である。したがって、「分泌能を有する」とは、通常の抗体と同様に、抗体として機能することを意味する。
上記Ｆｃ領域タンパク質を含む抗体は、目的の特性（例、分泌能、抗原結合能）を保持する限り、特定の部位に、変異が導入されていてもよい。目的の特性を保持し得る、変異が導入されてもよいアミノ酸残基の位置は、当業者に明らかである。具体的には、当業者は、１）同種の特性を有する複数のタンパク質のアミノ酸配列を比較し、２）相対的に保存されている領域、および相対的に保存されていない領域を明らかにし、次いで、３）相対的に保存されている領域および相対的に保存されていない領域から、それぞれ、機能に重要な役割を果たし得る領域および機能に重要な役割を果たし得ない領域を予測できるので、構造・機能の相関性を認識することができる。したがって、当業者は、上記Ｆｃ領域タンパク質を含む抗体のアミノ酸配列において変異が導入されてもよいアミノ酸残基の位置を特定できる。
アミノ酸残基が置換により変異される場合、アミノ酸残基の置換は、保存的置換であってもよい。本明細書中で用いられる場合、用語「保存的置換」とは、所定のアミノ酸残基を、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換することをいう。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野で周知である。例えば、このようなファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電性極性側鎖を有するアミノ酸（例、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β位分岐側鎖を有するアミノ酸（例、スレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族側鎖を有するアミノ酸（例、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）、ヒドロキシル基（例、アルコール性、フェノール性）含有側鎖を有するアミノ酸（例、セリン、スレオニン、チロシン）、および硫黄含有側鎖を有するアミノ酸（例、システイン、メチオニン）が挙げられる。好ましくは、アミノ酸の保存的置換は、アスパラギン酸とグルタミン酸との間での置換、アルギニンとリジンとヒスチジンとの間での置換、トリプトファンとフェニルアラニンとの間での置換、フェニルアラニンとバリンとの間での置換、ロイシンとイソロイシンとアラニンとの間での置換、およびグリシンとアラニンとの間での置換であってもよい。
本発明で用いられる抗体、または上記（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選ばれるいずれか一つのＦｃ領域を含む抗体としては、例えば、キメラ抗体（例、リツキシマブ、バシリキシマブ、インフリキシマブ、セツキシマブ、シルツキシマブ、ディヌツキシマブ、オルタトキサシマブ）、ヒト化抗体（例、ダクリヅマブ、パリビズマブ、トラスツズマブ、アレンツズマブ、オマリヅマブ、エファリヅマブ、ベバシヅマブ、ナタリヅマブ（ＩｇＧ４）、トシリヅマブ、エクリヅマブ（ＩｇＧ２）、モガムリヅマブ、ペルツヅマブ、オビヌツヅマブ、ベドリヅマブ、ペンプロリヅマブ（ＩｇＧ４）、メポリヅマブ、エロツヅマブ、ダラツムマブ、イケセキヅマブ（ＩｇＧ４）、レスリヅマブ（ＩｇＧ４）、アテゾリヅマブ）、ヒト抗体（例、アダリムマブ、パニツムマブ、ゴリムマブ、ウステキヌマブ、カナキヌマブ、オファツムマブ、デノスマブ（ＩｇＧ２）、イピリムマブ、ベリムマブ、ラキシバクマブ、ラムシルマブ、ニボルマブ（ＩｇＧ４）、セクキヌマブ、エボロクマブ（ＩｇＧ２）、アリロクマブ、ネシツムマブ、ブロダルマブ（ＩｇＧ２）、オララツマブ、デュピルマブ（ＩｇＧ４））が挙げられる（ＩｇＧサブタイプに言及していない場合、ＩｇＧ１であることを示す）。
上述したような抗体に対する親和性物質としては、例えば、ペプチド（オリゴペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質を含む）、低分子化合物、核酸、核酸-ペプチド複合体、ペプチド−低分子化合物複合体、核酸―低分子複合体挙げられる。
特定の実施形態では、上述したような抗体に対する親和性物質は、ペプチド（オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質を含む。糖タンパク質であってもよい）であってもよい。このようなペプチドとしては、例えば、以下が報告されている：
（１）ヒトＩｇＧ全般（すなわち、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４。以下同様）の特定領域（ＣＨ２領域）に親和性を有するＩｇＧ結合ペプチド（例、国際公開第２０１６／１８６２０６号、国際公開２０１３／０２７７９６号、国際公開第２００８／０５４０３０号を参照）；
（２）ヒトＩｇＧ全般の特定領域（ＣＨ２領域）に親和性を有するＰｒｏｔｅｉｎＡ Ｍｉｍｅｔｉｃ（ＰＡＭ） ｐｅｐｔｉｄｅ（例、Ｆａｓｓｉｎａ Ｇ ｅｔ ａｌ．，ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＲＥＣＯＧＮＩＴＩＯＮ，１９９６，ＶＯＬ．６，５６４−５６９を参照）；
（３）ヒトＩｇＧ全般の特定領域（ＣＨ２領域）に親和性を有するＥＰＩＨＲＳＴＬＴＡＬＬ（配列番号２５）（例、Ｅｈｒｌｉｃｈ Ｇ．Ｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００１，ＶＯＬ．４９，４４３−４５４を参照）；
（４）ヒトＩｇＧ全般の特定領域（Ｆｃ領域）に親和性を有する（ＮＨ２−Ｃｙｓ１−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４）２−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−ＯＨ（例、Ｒｕｖｏ Ｍ ｅｔ ａｌ．，ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ，２００５，ＶＯＬ．６，１２４２−１２５３を参照）；
（５）ヒトＩｇＧ全般の特定領域（Ｆｃ領域）に親和性を有するＦＡＲＬＶＳＳＩＲＹ（配列番号２６）、ＦＧＲＬＶＳＳＩＲＹ（配列番号２７）、およびＴＷＫＴＳＲＩＳＩＦ（配列番号２８）（例、Ｋｒｏｏｋ Ｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９９８，ＶＯＬ．２２１，１５１−１５７を参照）；
（６）ヒトＩｇＧ全般の特定領域に親和性を有するＱＳＹＰ（配列番号２９）（例、Ｊａｃｏｂｓ Ｊ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ．Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２００３，ＶＯＬ．３４，１３２−１４１を参照）；
（７）ヒトＩｇＧ全般の特定領域（Ｆｃ領域）に親和性を有するＨＷＲＧＷＶ（配列番号３０）、ＨＹＦＫＦＤ（配列番号３１）、およびＨＦＲＲＨＬ（配列番号３２）（例、Ｃａｒｂｏｎｅｌｌ Ｒ．Ｇ． ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ，２００９，ＶＯＬ．１２１６，９１０−９１８を参照）；
（８）ヒトＩｇＧ全般の特定領域（Ｆｃ領域）に親和性を有するＤＡＡＧ（配列番号３３）（例、Ｌｕｎｄ Ｌ．Ｎ． ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ，２０１２，ＶＯＬ．１２２５，１５８−１６７を参照）；
（９）ヒトＩｇＧ全般の特定領域（Ｆｃ領域）に親和性を有するＦｃ−Ｉ、Ｆｃ−ＩＩ、およびＦｃ−ＩＩＩ（例、Ｗａｒｒｅｎ Ｌ．Ｄｅｌａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０００，ＶＯＬ．２８７，１２７９−１２８３；国際公開２００１／０４５７４６号を参照）；ならびに
（１０）ヒトＩｇＧ全般の特定領域（Ｆｃ領域）に親和性を有するＮＡＲＫＦＹＫＧ（配列番号３４）、およびＮＫＦＲＧＫＹＫ（配列番号３５）（例、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｊｏｕｒｎａｌ，２０１３，ＶＯＬ．７９，３３−４０を参照）。
別の特定の実施形態では、上述したような抗体に対する親和性物質は、ペプチド以外の物質であってもよい。このような物質としては、例えば、ヒトＩｇＧ（例、ヒトＩｇＧ１〜４）の特定領域（ＣＨ２領域、特にＬｙｓ３４０の側鎖）に親和性を有するアプタマー〔例、ＧＧＵＧＣＵおよびＧＧＵＧＡＵ等のＧＧＵＧ（Ｃ／Ａ）（Ｕ／Ｔ）モチーフ含有アプタマー〕が報告されている（例、国際公開第２００７／００４７４８号公報；Ｎｏｍｕｒａ Ｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０１０ Ｎｏｖ；３８（２１）：７８２２−９；Ｍｉｙａｋａｗａ Ｓ ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ．，２００８ Ｊｕｎ；１４（６）：１１５４−６３を参照）。
上述したような抗体に対する親和性物質は、当該分野における任意の公知の方法により得ることができる。例えば、抗体全体、または抗体中の部分ペプチド（例、抗体表面露出領域が判明している場合、当該領域中に存在する部分ペプチド）を用いて、抗体を作製することにより（例、ハイブリドーマ法）、または親和性物質を入手可能なライブラリ（例、ペプチドライブラリ、抗体ライブラリ、抗体産生細胞ライブラリ、アプタマーライブラリ、ファージライブラリ、ｍＲＮＡライブラリ、ｃＤＮＡライブラリ）から親和性物質をスクリーニングすることにより（例、ファージディスプレイ法、ＳＥＬＥＸ法、ｍＲＮＡディスプレイ法、リボソームディスプレイ法、ｃＤＮＡディスプレイ法、酵母ディスプレイ法）、取得することができる。また、抗体に対する親和性物質が抗体のＦｃ領域（可溶性領域）に対する親和性物質である場合、各種抗体（例、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ）のＦｃ領域の特定領域（例、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）中に存在する部分ペプチドを用いることにより、抗体のＦｃ領域中の任意の部分に対して選択的に結合することができる親和性物質（例、抗体、アプタマー）を効率的に取得することができる。このようにして取得される親和性物質のなかには、親和的結合能が相対的に強いものおよび弱いものが混在する。しかし、親和的結合能が弱い親和性物質であっても、過剰量で用いることにより、その親和的結合能を補強することができる。
好ましい実施形態では、抗体に対する親和性物質は、ペプチドである。このようなペプチドとしては、モノクローナル抗体の定常領域に対する結合能を有するペプチドが好ましく、モノクローナル抗体のＦｃ領域に対する結合能を有するペプチドがより好ましく、ＩｇＧのＦｃ領域に対する結合能を有するペプチドがさらにより好ましい。ペプチドの長さとしては、特に限定されないが、例えば、１０〜４０（例、１０〜２０、２０〜３０、および３０〜４０）のアミノ酸残基からなるペプチドである。ペプチドを構成するアミノ酸残基としては、天然タンパク質を構成する２０種のＬ−α−アミノ酸残基およびその立体異性体（例、Ｄ−アミノ酸）、それらの異性体（例、β−アミノ酸）が挙げられる。
特定の実施形態では、上述したような抗体に対する親和性物質は、以下のいずれかのアミノ酸配列を含むペプチドであってもよい。
（ａ−１−１）ＦＮＭＱＱＱＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＲＩＲＳＩＲＤＤ（配列番号１１）のアミノ酸配列（例、化合物２２〜２４、２９を参照）、または、
（ａ−１−２）ＦＮＭＱＣＱＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＲＩＲＳＩＲＤＤＣ（配列番号１２）のアミノ酸配列（公知配列Ｚ３４Ｃにおいて２つのＫがＲで置換されているアミノ酸配列）において、配列中のいずれかの１〜３つのアミノ酸残基が、同一でも異なってもよく、リジン残基、アスパラギン酸残基、およびグルタミン酸残基からなる群より選ばれる各々１つのアミノ酸残基により置換されているか、
（ａ−２−１）β−Ａｌａ−ＮＭＱＱＱＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＲＩＲＳＩＲＤＤ（配列番号１３）のアミノ酸配列（例、化合物２６〜２８を参照）、または、
（ａ−２−２）β−Ａｌａ−ＮＭＱＣＱＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＲＩＲＳＩＲＤＤＣ（配列番号１４）のアミノ酸配列（公知配列Ｚ３４Ｃにおいて２つのＫがＲで置換されており、かつＮ末端のＦがβ−Ａｌａで置換されているアミノ酸配列）において、配列中のいずれかの１〜３つのアミノ酸残基が、同一でも異なってもよく、リジン残基、アスパラギン酸残基、およびグルタミン酸残基からなる群より選ばれる各々１つのアミノ酸残基により置換されており、かつ
（ｂ）配列番号１１〜１４の前記アミノ酸配列各々に対して８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチド。
このようなペプチドは、モノクローナル抗体のＦｃ領域に対する結合能を有する。
配列番号１２のアミノ酸配列からなるペプチドは、ペプチド試薬合成上の都合により、Ｚ３４Ｃとして知られている親和性ペプチドにおいてＮ末端から数えて２６番目と２８番目の２つのＫ（リジン）をＲ（アルギニン）に変更したものである。上記アミノ酸配列を含むペプチドを含む本発明の化合物は、ヒトＩｇＧ Ｆｃにおける特定のアミノ酸残基（例、Ｅｕ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇに従うＬｙｓ２４８残基またはＬｙｓ２４６残基、Ｌｙｓ２８８またはＬｙｓ２９０、Ｌｙｓ３１７、あるいはそれら残基以外の他のアミノ酸残基）の位置選択的な修飾に有用である。なお、上記Ｚ３４Ｃのアミノ酸配列は、ＦＮＭＱＣＱＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＫＩＫＳＩＲＤＤＣ（配列番号３６）である（例、Ｓｔａｒｏｖａｓｎｉｋ， Ｍ． Ａ． ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｍｉｍｉｃｒｙ ｏｆ ａ ｎａｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｙ ａ ｍｉｎｉｍｉｚｅｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９４，１００８０−１００８５（１９９７）を参照）。
親和性ペプチドは、ヒトＩｇＧ（例、上述したようなヒトＩｇＧ。好ましくはヒトＩｇＧ１）に対する親和性を有することができる。上記親和性ペプチドは、２つのシステイン残基（例、５位および３４位）を含む場合、２つのシステイン残基がジスルフィド結合して環状ペプチドを形成していてもよい。
リジン残基、アスパラギン酸残基、またはグルタミン酸残基（架橋剤によって修飾が容易であるアミノ酸残基）が導入される位置としては、ヒトＩｇＧ１等のヒトＩｇＧに対する親和性を有する限り任意の位置を利用することができる。このような位置については、当業者であれば容易に同定することができる。リジン残基、アスパラギン酸残基、またはグルタミン酸残基が導入される位置は、システイン残基以外のアミノ酸残基であってもよい。より好ましくは、架橋剤によって容易に修飾できるアミノ酸残基が導入される位置としては、例えば、１位、３位、６位、７位、１３位、２０位、２４位、３１位、および３２位のアミノ酸残基が挙げられる。
好ましくは、（ａ）および（ｂ）の特性を有する上記アミノ酸配列は、リジン残基、アスパラギン酸残基、およびグルタミン酸残基（架橋剤によって容易に修飾できるアミノ酸残基）からなる群より選ばれる１つの特定のアミノ酸残基（好ましくは、リジン残基）を所定の位置に有し、かつ、天然タンパク質を構成する通常の２０種のアミノ酸残基（好ましくは、リジン残基、アスパラギン酸残基、およびグルタミン酸残基以外の１７種のアミノ酸残基であり、より好ましくはリジン残基以外の１９種のアミノ酸残基）の変異を当該所定の位置以外の位置に有することもまた好ましい。このような所定の位置は、特に限定されず、例えば、１位、３位、６位、７位、１３位、２０位、２４位、３１位、および３２位が挙げられる。（ａ）および（ｂ）の特性を有する上記アミノ酸配列は、２つのシステイン残基が維持されており、これらの２つのシステイン残基はジスルフィド結合により結合していてもよい。配列番号１１〜１４の前記アミノ酸配列に対して８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列は、アミノ酸残基の欠失、置換、付加および挿入からなる群より選ばれる１、２、３または４種の変異（好ましくは置換）により、１〜３個（好ましくは１または２個、より好ましくは１個）のアミノ酸残基が改変されたものであってもよい。アミノ酸残基の変異は、アミノ酸配列中の１つの領域に導入されてもよいが、複数の異なる領域に導入されてもよい。
より好ましくは、（ａ）および（ｂ）の特性を有する上記アミノ酸配列は、以下（ｃ）または（ｄ）であってもよい。
（ｃ）以下（１）〜（１６）のアミノ酸配列からなる群より選ばれるアミノ酸配列：
（１）ＦＮＭＱＱＱＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＲＩＲＳＩＫＤＤ（配列番号５）；
（２）ＦＮＭＱＱＱＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＲＩＫＳＩＲＤＤ（配列番号６）；
（３）β−Ａｌａ−ＮＭＱＱＱＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＲＩＲＳＩＲＤＤ（配列番号７）；
（４）FＮＭＱＱＱＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＫＩＫＳＩＫＤＤ（配列番号８）；
（５）ＫＮＭＱＣＱＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＲＩＲＳＩＲＤＤＣ（配列番号３７）；
（６）ＦＮＭＱＣＱＫＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＲＩＲＳＩＲＤＤＣ（配列番号３８）；
（７）ＦＮＭＱＣＱＲＲＦＹＥＡＫＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＲＩＲＳＩＲＤＤＣ（配列番号３９）；
（８）ＦＮＭＱＣＱＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＫＡＲＩＲＳＩＲＤＤＣ（配列番号４０）；
（９）ＦＮＭＱＣＱＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＫＥＱＲＮＡＲＩＲＳＩＲＤＤＣ（配列番号４１）；
（１０）ＦＮＭＱＣＱＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＲＩＲＳＩＫＤＤＣ（配列番号４２）；
（１１）ＦＮＫＱＣＱＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＲＩＲＳＩＲＤＤＣ（配列番号４３）；
（１２）ＦＮＭＱＣＫＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＲＩＲＳＩＲＤＤＣ（配列番号４４）；
（１３）ＦＮＭＱＣＱＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＲＩＲＳＩＲＫＤＣ（配列番号４５）；
（１４）β−Ａｌａ−ＮＭＱＱＱＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＥＥＱＲＮＡＲＩＲＳＩ（配列番号９７）；
（１５）ＦＮＭＱＱＱＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＫＥＱＲＮＡＲＩＲＳＩＲＤＤ（配列番号９８）；および
（１６）β−Ａｌａ−ＮＭＱＱＱＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＥＥＱＲＮＡＲＩＲＳＩＫＤＤ（配列番号１００）；あるいは
（ｄ）上記（１）〜（１６）のいずれかのアミノ酸配列において、１つのリジン残基および２つのシステイン残基以外の位置（例、１位、３位、６位、７位、１３位、２０位、２４位、３１位、および３２位の位置）において、リジン残基以外の１９種のアミノ酸残基の変異を有する、上記（１）〜（１６）のいずれかのアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性（上述したような個数のアミノ酸残基の修飾であってもよい）を有するアミノ酸配列。
このようなアミノ酸配列を含むペプチドは、ＩｇＧのＦｃ領域に対する結合能を有することが確認されている。（ｄ）の上記アミノ酸配列を有する親和性ペプチドは、モノクローナル抗体の定常領域に対する結合能を有するペプチドが好ましく、モノクローナル抗体のＦｃ領域に対する結合能を有するペプチドがより好ましく、ＩｇＧのＦｃ領域に対する結合能を有するペプチドがさらにより好ましい。
上記親和性ペプチドは、配列番号１１〜１４の前記アミノ酸配列または上記（１）〜（１６）のアミノ酸配列に対して８５％以上の同一性を有する限り、架橋剤によって修飾が容易である１つのアミノ酸残基の導入以外にも、さらなるアミノ酸残基の変異を有していてもよい。さらなるアミノ酸の変異を導入できる位置については、当業者であれば容易に同定することができる。例えば、１位のフェニルアラニン残基、６位のアルギニン残基、１３位のロイシン残基、２０位のグルタミン酸残基、２４位のアスパラギン残基、または３１位のアルギニン残基（架橋剤によって容易に修飾できるアミノ酸残基が既に導入された位置を除く）であっても利用することができる。さらなるアミノ酸の変異により導入できるアミノ酸としては、例えば、アラニン（Ａ）、アスパラギン（Ｎ）、システイン（Ｃ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、プロリン（Ｐ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、バリン（Ｖ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）、およびリジン（Ｌ）が挙げられる。好ましくは、リジン以外のこれらの１９種のアミノ酸が利用されてもよい。アミノ酸はＬ体またはＤ体のいずれであってもよいが、Ｌ体が好ましい（実施例ではペプチドを構成するアミノ酸残基は全てＬ体である）。
配列番号１１〜１４の前記アミノ酸配列または（１）〜（１６）の前記アミノ酸配列に対する同一性％の程度は、上述したとおりに決定することができる。同一性％の程度は、好ましくは９０％以上、９２％以上、より好ましくは９４％以上、さらにより好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上（すなわち、１つのアミノ酸残基の変異のみを有するもの）であってもよい。
別の特定の実施形態では、上述したような抗体に対する親和性物質は、以下のいずれかのアミノ酸配列を含むペプチドである。
式１−１：（Ｘ０−３）ａ−Ｃ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｉ−Ｉ−Ｗ−Ｃ−（Ｘ０−３）ｂ（配列番号１５）
式１−２：（Ｘ０−３）ａ−Ｃ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｉ−Ｖ−Ｗ−Ｃ−（Ｘ０−３）ｂ（配列番号１６）
式１−３：（Ｘ０−３）ａ−Ｃ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｖ−Ｖ−Ｗ−Ｃ−（Ｘ０−３）ｂ（配列番号１７）
式１−４：（Ｘ０−３）ａ−Ｃ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ａ−Ｖ−Ｗ−Ｃ−（Ｘ０−３）ｂ（配列番号１８）
式１−５：（Ｘ０−３）ａ−Ｃ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｌ−Ｌ−Ｗ−Ｃ−（Ｘ０−３）ｂ（配列番号１９）
式１−６：（Ｘ０−３）ａ−Ｃ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｌ−Ｉ−Ｗ−Ｃ−（Ｘ０−３）ｂ（配列番号２０）
式１−７：（Ｘ０−３）ａ−Ｃ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｃ−（Ｘ０−３）ｂ（配列番号２１）
式１−８：（Ｘ０−３）ａ−Ｃ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｑ−Ｖ−Ｗ−Ｃ−（Ｘ０−３）ｂ（配列番号２２）
式１−９：（Ｘ０−３）ａ−Ｃ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｅ−Ｖ−Ｗ−Ｃ−（Ｘ０−３）ｂ（配列番号２３）
〔式中、
（Ｘ０−３）ａは、なし、アルギニン残基−グリシン残基−アスパラギン残基、グリシン残基−アスパラギン残基、アスパラギン酸残基、またはアスパラギン残基であり、
（Ｘ０−３）ｂは、なし、スレオニン残基−チロシン残基−ヒスチジン残基、またはスレオニン残基であり、
Ｘａａ１は、アラニン残基であり、
Ｘａａ２は、チロシン残基、トリプトファン残基、またはヒスチジン残基であり、
Ｘａａ３は、ヒスチジン残基、フェニルアラニン残基、チロシン残基、トリプトファン残基、アルギニン残基、またはグリシン残基であり、
Ｘａａ４は、リジン残基、アスパラギン酸残基、またはグルタミン酸残基であり、
Ｘａａ５は、グリシン残基、セリン残基、アスパラギン残基、グルタミン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、フェニルアラニン残基、チロシン残基、トリプトファン残基、ヒスチジン残基、スレオニン残基、ロイシン残基、アラニン残基、バリン残基、イソロイシン残基、またはアルギニン残基であり、
Ｘａａ６は、グルタミン残基、グルタミン酸残基、アスパラギン残基、またはアスパラギン酸残基である。〕、あるいは
式２−１：（Ｘ０−３’）ａ−Ｃ−（Ｘａａ１’）−（Ｘａａ２’）−（Ｘａａ３’）−（Ｘａａ４’）−（Ｘａａ５’）−（Ｘａａ６’）−Ｌ−Ｖ−Ｗ−Ｃ−（Ｘ０−３’）ｂ（配列番号２４）
〔式中、
（Ｘ０−３’）ａおよび（Ｘ０−３’）ｂはそれぞれ、前記（Ｘ０−３）ａおよび（Ｘ０−３）ｂと同じであり、
Ｘａａ１’、Ｘａａ２’、Ｘａａ３’、Ｘａａ４’、Ｘａａ５’、Ｘａａ６’はそれぞれ、前記Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ４、Ｘａａ５、Ｘａａ６と同じである。
〕。
このようなペプチドは、モノクローナル抗体のＦｃ領域に対する結合能を有する。
上記式１−１〜１−９、および式２−１で表されるアミノ酸配列において、（Ｘ０−３）ａは、なし、アルギニン残基−グリシン残基−アスパラギン残基、グリシン残基−アスパラギン残基、アスパラギン酸残基、またはアスパラギン残基であり、好ましくは、なし、アルギニン残基−グリシン残基−アスパラギン残基、アスパラギン酸残基、またはアスパラギン残基である。
上記式１−１〜１−９、および式２−１で表されるアミノ酸配列において、Ｘａａ２は、チロシン残基、トリプトファン残基、またはヒスチジン残基であり、好ましくは、チロシン残基、またはトリプトファン残基である。
上記式１−１〜１−９、および式２−１で表されるアミノ酸配列において、Ｘａａ３は、ヒスチジン残基、フェニルアラニン残基、チロシン残基、トリプトファン残基、アルギニン残基、またはグリシン残基であり、好ましくは、ヒスチジン残基である。
上記式１−１〜１−９、および式２−１で表されるアミノ酸配列において、Ｘａａ４は、リジン残基、アスパラギン酸残基、またはグルタミン酸残基であり、好ましくは、リジン残基である。
上記式１−１〜１−９、および式２−１で表されるアミノ酸配列において、Ｘａａ５は、グリシン残基、セリン残基、アスパラギン残基、グルタミン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、フェニルアラニン残基、チロシン残基、トリプトファン残基、ヒスチジン残基、スレオニン残基、ロイシン残基、アラニン残基、バリン残基、イソロイシン残基、またはアルギニン残基であり、好ましくは、グリシン残基、スレオニン残基、ロイシン残基である。
上記式１−１〜１−９、および式２−１で表されるアミノ酸配列において、Ｘａａ６は、グルタミン残基、グルタミン酸残基、アスパラギン残基、またはアスパラギン酸残基であり、より好ましくは、グルタミン残基である。
好ましくは、上記式１−１〜１−９、および式２−１で表されるいずれかのアミノ酸配列を含むペプチドは、下記からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含むペプチドである：
（１’） ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＱＩＩＷＣＴＹＨ（配列番号４６）；
（２’） ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＱＩＶＷＣＴＹＨ（配列番号４７）；
（３’） ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＱＶＶＷＣＴＹＨ（配列番号４８）；
（４’） ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＱＡＶＷＣＴＹＨ（配列番号４９）；
（５’） ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＱＬＬＷＣＴＹＨ（配列番号５０）；
（６’） ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＱＬＩＷＣＴＹＨ（配列番号５１）；
（７’） ＤＣＡＹＨＫＧＱＩＶＷＣＴ （配列番号５２）；
（８’） ＤＣＡＹＨＫＧＱＶＶＷＣＴ （配列番号５３）；
（９’） ＤＣＡＹＨＫＧＱＡＶＷＣＴ （配列番号５４）；
（１０’）ＲＧＮＣＡＹＨＫＳＱＩＩＷＣＴＹＨ（配列番号５５）；
（１１’）ＲＧＮＣＡＹＨＫＮＱＩＩＷＣＴＹＨ（配列番号５６）；
（１２’）ＲＧＮＣＡＹＨＫＤＱＩＩＷＣＴＹＨ（配列番号５７）；
（１３’）ＲＧＮＣＡＹＨＫＱＱＩＩＷＣＴＹＨ（配列番号５８）；
（１４’）ＲＧＮＣＡＹＨＫＥＱＩＩＷＣＴＹＨ（配列番号５９）；
（１５’）ＲＧＮＣＡＹＨＫＦＱＩＩＷＣＴＹＨ（配列番号６０）；
（１６’）ＲＧＮＣＡＹＨＫＹＱＩＩＷＣＴＹＨ（配列番号６１）；
（１７’）ＲＧＮＣＡＹＨＫＷＱＩＩＷＣＴＹＨ（配列番号６２）；
（１８’）ＲＧＮＣＡＹＨＫＨＱＩＩＷＣＴＹＨ（配列番号６３）；
（１９’）ＲＧＮＣＡＹＨＫＴＱＩＩＷＣＴＹＨ（配列番号６４）；
（２０’）ＲＧＮＣＡＹＨＫＬＱＩＩＷＣＴＹＨ（配列番号６５）；
（２１’） ＣＡＹＨＫＬＱＩＶＷＣ （配列番号６６）；
（２２’） ＣＡＹＨＫＬＱＬＩＷＣ （配列番号６７）；
（２３’） ＣＡＹＨＫＳＱＩＶＷＣ （配列番号６８）；
（２４’）ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＱＬＶＦＣＴＹＨ（配列番号６９）；
（２５’）ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＱＱＶＷＣＴＹＨ（配列番号７０）；
（２６’）ＲＧＮＣＡＹＨＫＧＱＥＶＷＣＴＹＨ（配列番号７１）；
（２７’） ＣＡＹＨＫＧＱＬＶＷＣ （配列番号７２）；
（２８’）ＲＧＮＣＡＹＨＫＡＱＬＶＷＣＴＹＨ（配列番号７３）；
（２９’）ＲＧＮＣＡＹＨＫＶＱＬＶＷＣＴＹＨ（配列番号７４）；
（３０’）ＲＧＮＣＡＹＨＫＬＱＬＶＷＣＴＹＨ（配列番号７５）；
（３１’）ＲＧＮＣＡＹＨＫＩＱＬＶＷＣＴＹＨ（配列番号７６）；
（３２’）ＲＧＮＣＡＹＨＫＳＱＬＶＷＣＴＹＨ（配列番号７７）；
（３３’）ＲＧＮＣＡＹＨＫＴＱＬＶＷＣＴＹＨ（配列番号７８）；
（３４’）ＲＧＮＣＡＹＨＫＮＱＬＶＷＣＴＹＨ（配列番号７９）；
（３５’）ＲＧＮＣＡＹＨＫＤＱＬＶＷＣＴＹＨ（配列番号８０）；
（３６’）ＲＧＮＣＡＹＨＫＱＱＬＶＷＣＴＹＨ（配列番号８１）；
（３７’）ＲＧＮＣＡＹＨＫＥＱＬＶＷＣＴＹＨ（配列番号８２）；
（３８’）ＲＧＮＣＡＹＨＫＦＱＬＶＷＣＴＹＨ（配列番号８３）；
（３９’）ＲＧＮＣＡＹＨＫＲＱＬＶＷＣＴＹＨ（配列番号８４）；
（４０’）ＲＧＮＣＡＹＨＫＨＱＬＶＷＣＴＹＨ（配列番号８５）；
（４１’）ＲＧＮＣＡＹＨＫＷＱＬＶＷＣＴＹＨ（配列番号８６）；
（４２’）ＲＧＮＣＡＹＨＫＹＱＬＶＷＣＴＹＨ（配列番号８７）；
（４３’）ＲＧＮＣＡＹＦＫＧＱＬＶＷＣＴＹＨ（配列番号８８）；
（４４’）ＲＧＮＣＡＹＹＫＧＱＬＶＷＣＴＹＨ（配列番号８９）；
（４５’）ＲＧＮＣＡＹＷＫＧＱＬＶＷＣＴＹＨ（配列番号９０）；
（４６’）ＲＧＮＣＡＹＲＫＧＱＬＶＷＣＴＹＨ（配列番号９１）；
（４７’）ＲＧＮＣＡＹＧＫＧＱＬＶＷＣＴＹＨ（配列番号９２）；
（４８’） ＤＣＡＹＨＫＧＱＬＶＷＣ （配列番号９３）；
（４９’） ＮＣＡＹＨＫＧＱＬＶＷＣ （配列番号９４）；
（５０’） ＣＡＹＨＫＧＱＬＶＷＣＴ （配列番号９５）；
（５１’） ＣＡＹＨＫＳＱＬＶＷＣ （配列番号９６）；
（５２’） ＧＮＣＡＹＨＫＧＱＩＩＷＣＴＹＨ（配列番号９９）；および
（５３’）ＲＧＮＣＡＹＨＥＧＱＩＩＷＣＴＹＨ（配列番号１０８）。
このようなアミノ酸配列を含むペプチドは、ＩｇＧのＦｃ領域に対する結合能を有することが確認されている。
上記ペプチドの各アミノ酸配列の中に離間した少なくとも２つのシステイン残基は、ジスルフィド結合により環状ペプチドを形成することができる。あるいは、上記ペプチドにおいて、２つのシステイン残基中のスルフィド基は、以下で表されるカルボニル基含有リンカーにより連結されていてもよい。
Figure 2019240288
上記で表されるカルボニル基含有リンカーの破線部分は、スルフィド基との結合部分を意味する。当該リンカーは、通常のジスルフィド結合よりも、還元反応等に対して安定である。このようなペプチドは、例えば、国際公開第２０１６／１８６２０６号に記載される方法により、調製することができる。
上記アミノ酸配列を含むペプチドを含む本発明の化合物は、ヒトＩｇＧ Ｆｃにおける特定のアミノ酸残基（例、Ｅｕ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇに従うＬｙｓ２４８残基またはＬｙｓ２４６残基、Ｌｙｓ２８８またはＬｙｓ２９０、Ｌｙｓ３１７、あるいはそれら残基以外の他のアミノ酸残基）の位置選択的な修飾に有用である。上記ペプチドを構成するアミノ酸はＬ体またはＤ体のいずれであってもよいが、Ｌ体が好ましい（実施例ではペプチドを構成するアミノ酸残基は全てＬ体である）。
上記ペプチドは、架橋剤により特定のアミノ酸残基が修飾されてもよい。このような特定のアミノ酸残基としては、例えば、リジン残基、アスパラギン酸残基、およびグルタミン酸残基が挙げられるが、好ましくは、リジン残基である。架橋剤としては、例えば、ＤＳＧ（ｄｉｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｇｌｕｔａｒａｔｅ、ジスクシンイミジルグルタレート）、ＤＳＳ（ｄｉｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｓｕｂｅｒａｔｅ、ジスクシンイミジルスベレート）等のスクシンイミジル基を好ましくは２以上含む架橋剤、ＤＭＡ（ｄｉｍｅｔｈｙｌ ａｄｉｐｉｍｉｄａｔｅ・２ＨＣｌ、アジプイミド酸ジメチル二塩酸塩）、ＤＭＰ（ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｐｉｍｅｌｉｍｉｄａｔｅ・２ ＨＣｌ、ピメルイミド酸ジメチル二塩酸塩）、及びＤＭＳ（ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｂｅｒｉｍｉｄａｔｅ・２ ＨＣｌ、スベルイミド酸ジメチル二塩酸塩）等のイミド酸部分を好ましくは２以上含む架橋剤、並びにＤＴＢＰ（ｄｉｍｅｔｈｙｌ ３，３’−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓｐｒｏｐｉｏｎｉｍｉｄａｔｅ・２ＨＣｌ、３，３’−ジチオビスプロピオンイミド酸ジメチル二塩酸塩）及びＤＳＰ（ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）、ジチオビススクシンイミジルプロピオン酸）等のＳＳ結合を有する架橋剤が挙げられる（例、国際公開第２０１６／１８６２０６号）。
抗体に対する親和性物質がペプチドである場合、ペプチドは、末端にあるアミノ基およびカルボキシ基が保護されていてもよい。Ｎ−末端アミノ基の保護基としては、例えば、アルキルカルボニル基（アシル基）（例、アセチル基、プロポキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基等のブトキシカルボニル基）、アルキルオキシカルボニル基（例、フルオレニルメトキシカルボニル基）、アリールオキシカルボニル基、アリールアルキル（アラルキル）オキシカルボニル基（例、ベンジルオキシカルボニル基）が挙げられる。Ｎ−末端アミノ基の保護基としては、アセチル基が好ましい。Ｃ−末端カルボキシ基の保護基としては、例えば、エステルまたはアミドを形成可能な基が挙げられる。エステルまたはアミドを形成可能な基としては、例えば、アルキルオキシ基（例、メチルオキシ、エチルオキシ、プロピルオキシ、ブチルオキシ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシ）、アリールオキシ基（例、フェニルオキシ、ナフチルオキシ）、アラルキルオキシ基（例、ベンジルオキシ）、アミノ基が挙げられる。Ｃ−末端カルボキシ基の保護基としては、アミノ基が好ましい。
１−３．脱離基を含む２価の基（Ｌ）
式（Ｉ）において、Ｌは、脱離基を含む２価の基である。
脱離基は、抗体中の求核基と、求電子基を含む２価の基（Ｅ）に含まれる求電子基との間の反応によりＥから切断されて脱離する能力を有する基である。このような脱離基は、当該分野における技術常識である（例、Ｆｕｊｉｓｈｉｍａ，Ｓ．ｅｔ ａｌ Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，２０１２，１３４，３９６１−３９６４．（前述）；Ｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２０１５ ３２１７−３２２４．；Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｖｏｌｕｍｅ ８， ｐａｇｅｓ ５４２−５４８ （２０１６））。脱離基としては、上記のような反応によりＥから切断される能力を有する限り特に限定されないが、例えば、（１）−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓｅ−、−ＳＯ２−Ｏ−、−ＳＯ２−Ｎ（Ｒ）−、−ＳＯ２−、−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｎ（ＯＲ）−、−Ｎ（Ｒ）−、および−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−からなる群より選ばれる基（ここで、Ｒは、水素原子または炭素原子数１〜６のアルキルである。）、および（２）ヘテロアリーレンが挙げられる。
炭素原子数１〜６のアルキルとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシルが挙げられる。炭素原子数１〜６のアルキルとしては、炭素原子数１〜４のアルキルが好ましい。
脱離基の例である、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓｅ−、−ＳＯ２−Ｏ−、−ＳＯ２−Ｎ（Ｒ）−、−ＳＯ２−、−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｎ（ＯＲ）−、−Ｎ（Ｒ）−、および−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−からなる群より選ばれる基は、下記（１）あるいは（２）である：
（１）−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓｅ−、−ＳＯ２−Ｏ−、−ＳＯ２−Ｎ（Ｒ）−、−ＳＯ２−、−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｎ（ＯＲ）−、−Ｎ（Ｒ）−、または−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−からなる基；あるいは
（２）−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓｅ−、−ＳＯ２−Ｏ−、−ＳＯ２−Ｎ（Ｒ）−、−ＳＯ２−、−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｎ（ＯＲ）−、−Ｎ（Ｒ）−、または−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−およびその脱離する能力を高める基を含む基。
−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓｅ−、−ＳＯ２−Ｏ−、−ＳＯ２−Ｎ（Ｒ）−、−ＳＯ２−、−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｎ（ＯＲ）−、−Ｎ（Ｒ）−、または−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−の脱離する能力を高める基は、当該基が−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓｅ−、−ＳＯ２−Ｏ−、−ＳＯ２−Ｎ（Ｒ）−、−ＳＯ２−、−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｎ（ＯＲ）−、−Ｎ（Ｒ）−、または−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−に隣接して存在する場合、当該基が−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓｅ−、−ＳＯ２−Ｏ−、−ＳＯ２−Ｎ（Ｒ）−、−ＳＯ２−、−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｎ（ＯＲ）−、−Ｎ（Ｒ）−、または−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−に隣接して存在しない場合に比し、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓｅ−、−ＳＯ２−Ｏ−、−ＳＯ２−Ｎ（Ｒ）−、−ＳＯ２−、−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｎ（ＯＲ）−、−Ｎ（Ｒ）−、または−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−が求電子基から脱離する能力を高める基である。換言すれば、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓｅ−、−ＳＯ２−Ｏ−、−ＳＯ２−Ｎ（Ｒ）−、−ＳＯ２−、−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｎ（ＯＲ）−、−Ｎ（Ｒ）−、または−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−の脱離する能力を高める基は、酸素原子、硫黄原子、セレン原子、または窒素原子の電子を吸引する能力を有する基である。
−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓｅ−、−ＳＯ２−Ｏ−、−ＳＯ２−Ｎ（Ｒ）−、−ＳＯ２−、−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｎ（ＯＲ）−、−Ｎ（Ｒ）−、または−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−の脱離する能力を高める基の好ましい例としては、電子吸引性基で置換されていてもよいアリーレン、電子吸引性基で置換されていてもよいヘテロアリーレン、縮環していてもよい２，５-ジケトピロリジン、縮環していてもよい２，６−ジケトピペリジン、縮環していてもよい２-ケトピロリジン、縮環していてもよい２−ケトピペリジン、および２−ピリドンが挙げられる。アリーレンおよびヘテロアリーレンが有していてもよい電子吸引性基の数は、１以上（例えば１〜３、好ましくは１または２）である。電子吸引性基としては、例えば、ハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されたアルキル（例、トリフルオロメチル）、ボロン酸残基、メシル、トシル、トリフレート、ニトロ、シアノ、フェニル基、ケト基（例、アシル）が挙げられる。
「電子吸引性基で置換されていてもよいアリーレン」における「アリーレン」としては、炭素原子数６〜２４のアリーレンが好ましく、炭素原子数６〜１８のアリーレンがより好ましく、炭素原子数６〜１４のアリーレンがさらにより好ましく、炭素原子数６〜１０のアリーレンが最も好ましい。電子吸引性基で置換されていてもよいアリーレンはさらに、電子吸引性基以外の置換基により置換されていても、置換されていなくてもよい。上記炭素原子数に電子吸引性基およびそれ以外の置換基の炭素原子数は含まれない。アリーレンとしては、例えば、フェニレン、ナフチレン、アントラセニレンが挙げられる。
「電子吸引性基で置換されていてもよいヘテロアリーレン」における「ヘテロアリーレン」としては、炭素原子数１〜２１のヘテロアリーレンが好ましく、炭素原子数１〜１５のヘテロアリーレンがより好ましく、炭素原子数１〜９のヘテロアリーレンがさらにより好ましく、炭素原子数１〜６のヘテロアリーレンが最も好ましい。電子吸引性基で置換されていてもよいヘテロアリーレンはさらに、電子吸引性基以外の置換基により置換されていても、置換されていなくてもよい。上記炭素原子数に電子吸引性基およびそれ以外の置換基の炭素原子数は含まれない。ヘテロアリーレンは、窒素原子、酸素原子および硫黄原子からなる群より選ばれる１以上（例えば１〜５、好ましくは１〜４、より好ましくは１〜３）のヘテロ原子を環構成原子として含む。ヘテロアリーレンとしては、例えば、ピロールジイル、フランジイル、チオフェンジイル、ピリジンジイル、ピリダジンジイル、ピリミジンジイル、ピラジンジイル、トリアジンジイル、ピラゾールジイル、イミダゾールジイル、チアゾールジイル、イソチアゾールジイル、オキサゾールジイル、イソオキサゾールジイル、トリアゾールジイル、テトラゾールジイル、インドールジイル、プリンジイル、アントラキノンジイル、カルバゾールジイル、フルオレンジイル、キノリンジイル、イソキノリンジイル、キナゾリンジイル、およびフタラジンジイルが挙げられる。
縮環していてもよい２，５-ジケトピロリジン、縮環していてもよい２，６−ジケトピペリジン、縮環していてもよい２-ケトピロリジン、縮環していてもよい２−ケトピペリジン、および２−ピリドンは、電子吸引性基等の置換基により置換されていても、置換されていなくてもよい。
脱離基の例であるヘテロアリーレンは、π電子密度が低い（すなわち、１未満である）ヘテロアリーレンである。脱離基であるヘテロアリーレンとしては、窒素原子を環構成原子として含有するヘテロアリーレンが好ましい。窒素原子を環構成原子として含有するヘテロアリーレンとしては、窒素原子を環構成原子として含有する炭素原子数１〜２１のヘテロアリーレンが好ましく、窒素原子を環構成原子として含有する炭素原子数１〜１５のヘテロアリーレンがより好ましく、窒素原子を環構成原子として含有する炭素原子数１〜９のヘテロアリーレンがさらに好ましい。脱離基であるヘテロアリーレンは、電子吸引性基等の置換基により置換されていても、置換されていなくてもよい。上記炭素原子数に置換基の炭素原子数は含まれない。窒素原子を環構成原子として含有する脱離基であるヘテロアリーレンとしては、例えば、イミダゾールジイル、トリアゾールジイル、テトラゾールジイル、２−ピリドンジイル（すなわち、２−ヒドロキシピリジンジイル）が挙げられる。
−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓｅ−、−ＳＯ２−Ｏ−、−ＳＯ２−Ｎ（Ｒ）−、−ＳＯ２−、−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｎ（ＯＲ）−、−Ｎ（Ｒ）−、または−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−の脱離する能力を高める基の例である「電子吸引性基で置換されていてもよいアリーレン」等の基、ならびに脱離基の例である「ヘテロアリーレン」は、例えば１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１もしくは２個の置換基を有していても、有していなくてもよい。化学構造が簡潔な化合物を合成する観点からは、このような置換基を有しないことが好ましい。一方、上記のような基が置換基を有する場合、このような置換基としては、例えば、以下が挙げられる：
（ｉ）ハロゲン原子；
（ｉｉ）１価の炭化水素基；
（ｉｉｉ）アラルキル；
（ｉｖ）１価の複素環基；
（ｖ）Ｒａ−Ｏ−、Ｒａ−Ｃ（＝Ｏ）−、Ｒａ−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−、もしくはＲａ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−（Ｒａは、水素原子、もしくは１価の炭化水素基を示す。）；または
（ｖｉ）ＮＲｂＲｃ−、ＮＲｂＲｃ−Ｃ（＝Ｏ）−、ＮＲｂＲｃ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−、もしくはＲｂ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲｃ−（ＲｂおよびＲｃは、同一もしくは異なって、水素原子、もしくは１価の炭化水素基を示す。）；
（ｖｉｉ）ニトロ基、硫酸基、スルホン酸基、シアノ基、およびカルボキシル基。
ハロゲン原子としては、例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子が挙げられる。
１価の炭化水素基としては、例えば、１価の鎖状炭化水素基、１価の脂環式炭化水素基、および１価の芳香族炭化水素基が挙げられる。
１価の鎖状炭化水素基とは、鎖状構造のみで構成された炭化水素基を意味し、主鎖に環状構造を含まない。ただし、鎖状構造は直鎖状であっても分岐状であってもよい。１価の鎖状炭化水素基としては、例えば、アルキル、アルケニル、アルキニルが挙げられる。アルキル、アルケニル、およびアルキニルは、直鎖状、または分岐状のいずれであってもよい。
アルキルとしては、炭素原子数１〜１２のアルキルが好ましく、炭素原子数１〜６のアルキルがより好ましく、炭素原子数１〜４のアルキルがさらに好ましい。上記炭素原子数に置換基の炭素原子数は含まれない。炭素原子数１〜１２のアルキルとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ドデシルが挙げられる。
アルケニルとしては、炭素原子数２〜１２のアルケニルが好ましく、炭素原子数２〜６のアルケニルがより好ましく、炭素原子数２〜４のアルケニルがさらに好ましい。上記炭素原子数に置換基の炭素原子数は含まれない。炭素原子数２〜１２のアルケニルとしては、例えば、ビニル、プロペニル、ｎ−ブテニルが挙げられる。
アルキニルとしては、炭素原子数２〜１２のアルキニルが好ましく、炭素原子数２〜６のアルキニルがより好ましく、炭素原子数２〜４のアルキニルがさらに好ましい。上記炭素原子数に置換基の炭素原子数は含まれない。炭素原子数２〜１２のアルキニルとしては、例えば、エチニル、プロピニル、ｎ−ブチニルが挙げられる。
１価の鎖状炭化水素基としては、アルキルが好ましい。
１価の脂環式炭化水素基とは、環構造として脂環式炭化水素のみを含み、芳香族環を含まない炭化水素基を意味し、脂環式炭化水素は単環、多環のいずれであってもよい。ただし、脂環式炭化水素のみで構成されている必要はなく、その一部に鎖状構造を含んでいてもよい。１価の脂環式炭化水素基としては、例えば、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニルが挙げられ、これらは、単環、多環のいずれであってもよい。
シクロアルキルとしては、炭素原子数３〜１２のシクロアルキルが好ましく、炭素原子数３〜６のシクロアルキルがより好ましく、炭素原子数５〜６のシクロアルキルがさらに好ましい。上記炭素原子数に置換基の炭素原子数は含まれない。炭素原子数３〜１２のシクロアルキルとしては、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルが挙げられる。
シクロアルケニルとしては、炭素原子数３〜１２のシクロアルケニルが好ましく、炭素原子数３〜６のシクロアルケニルがより好ましく、炭素原子数５〜６のシクロアルケニルがさらに好ましい。上記炭素原子数に置換基の炭素原子数は含まれない。炭素原子数３〜１２のシクロアルケニルとしては、例えば、シクロプロペニル、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニルが挙げられる。
シクロアルキニルとしては、炭素原子数３〜１２のシクロアルキニルが好ましく、炭素原子数３〜６のシクロアルキニルがより好ましく、炭素原子数５〜６のシクロアルキニルがさらに好ましい。上記炭素原子数に置換基の炭素原子数は含まれない。炭素原子数３〜１２のシクロアルキニルとしては、例えば、シクロプロピニル、シクロブチニル、シクロペンチニル、シクロヘキシニルが挙げられる。
１価の脂環式炭化水素基としては、シクロアルキルが好ましい。
１価の芳香族炭化水素基とは、芳香族環構造を含む炭化水素基を意味する。ただし、芳香族環のみで構成されている必要はなく、その一部に鎖状構造や脂環式炭化水素を含んでいてもよく、芳香族環は単環、多環のいずれであってもよい。１価の芳香族炭化水素基としては、炭素原子数６〜１２のアリールが好ましく、炭素原子数６〜１０のアリールがより好ましく、炭素原子数６のアリールがさらに好ましい。上記炭素原子数に置換基の炭素原子数は含まれない。炭素原子数６〜１２のアリールとしては、例えば、フェニル、ナフチルが挙げられる。
１価の芳香族炭化水素基としては、フェニルが好ましい。
これらの中でも、１価の炭化水素基としては、アルキル、シクロアルキル、アリールが好ましく、アルキルがより好ましい。
アラルキルとは、アリールアルキルをいう。アリールアルキルにおけるアリールおよびアルキルの定義、例および好ましい例は、上述したとおりである。アラルキルとしては、炭素原子数３〜１５のアラルキルが好ましい。このようなアラルキルとしては、例えば、ベンゾイル、フェネチル、ナフチルメチル、ナフチルエチルが挙げられる。
１価の複素環基とは、複素環式化合物の複素環から水素原子１個を除いた基をいう。１価の複素環基は、１価の芳香族複素環基、または１価の非芳香族複素環基である。複素環基を構成するヘテロ原子として、酸素原子、硫黄原子、窒素原子、リン原子、ホウ素原子及びケイ素原子からなる群から選択される１種以上を含むことが好ましく、酸素原子、硫黄原子及び窒素原子からなる群から選択される１種以上を含むことがより好ましい。
１価の芳香族複素環基としては、炭素原子数１〜１５の芳香族複素環基が好ましく、炭素原子数１〜９の芳香族複素環基がより好ましく、炭素原子数１〜６の芳香族複素環基がさらに好ましい。上記炭素原子数に置換基の炭素原子数は含まれない。１価の芳香族複素環基としては、例えば、ピロリル、フラニル、チオフェニル、ピリジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、トリアジニル、ピラゾリル、イミダゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、インドリル、プリニル、アントラキノリル、カルバゾニル、フルオレニル、キノリニル、イソキノリニル、キナゾリニル、及びフタラジニルが挙げられる。
１価の非芳香族複素環基としては、炭素原子数２〜１５の非芳香族複素環基が好ましく、炭素原子数２〜９の非芳香族複素環基がより好ましく、炭素原子数２〜６の非芳香族複素環基がさらに好ましい。上記炭素原子数に置換基の炭素原子数は含まれない。１価の非芳香族複素環基としては、例えば、オキシラニル、アジリジニル、アゼチジニル、オキセタニル、チエタニル、ピロリジニル、ジヒドロフラニル、テトラヒドロフラニル、ジオキソラニル、テトラヒドロチオフェニル、ピロリニル、イミダゾリジニル、オキサゾリジニル、ピペリジニル、ジヒドロピラニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、モルホリニル、チオモルホリニル、ピペラジニル、ジヒドロオキサジニル、テトラヒドロオキサジニル、ジヒドロピリミジニル、及びテトラヒドロピリミジニルが挙げられる。
これらの中でも、１価の複素環基としては、５員または６員の複素環基が好ましい。
好ましくは、置換基は、以下であってもよい：
（ｉ’）ハロゲン原子；
（ｉｉ’）炭素原子数１〜１２のアルキル、フェニル、もしくはナフチル；
（ｉｉｉ’）炭素原子数３〜１５のアラルキル；
（ｉｖ’）５員または６員の複素環；
（ｖ’）Ｒａ−Ｏ−、Ｒａ−Ｃ（＝Ｏ）−、Ｒａ−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−、もしくはＲａ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−（Ｒａは、水素原子、もしくは炭素原子数１〜１２のアルキルを示す。）；または
（ｖｉ’）ＮＲｂＲｃ−、ＮＲｂＲｃ−Ｃ（＝Ｏ）−、ＮＲｂＲｃ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−、もしくはＲｂ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲｃ−（ＲｂおよびＲｃは、同一もしくは異なって、水素原子、もしくは炭素原子数１〜１２のアルキルを示す。）；
（ｖｉｉ’）上記（ｖｉｉ）で列挙したものと同じ基。
より好ましくは、置換基は、以下であってもよい：
（ｉ’’）ハロゲン原子；
（ｉｉ’’）炭素原子数１〜１２のアルキル；
（ｉｉｉ’’）Ｒａ−Ｏ−、Ｒａ−Ｃ（＝Ｏ）−、Ｒａ−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−、もしくはＲａ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−（Ｒａは、水素原子、もしくは炭素原子数１〜１２のアルキルを示す。）；または
（ｉｖ’’）ＮＲｂＲｃ−、ＮＲｂＲｃ−Ｃ（＝Ｏ）−、ＮＲｂＲｃ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−、もしくはＲｂ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲｃ−（ＲｂおよびＲｃは、同一もしくは異なって、水素原子、もしくは炭素原子数１〜１２のアルキルを示す。）；
（ｖ’’）上記（ｖｉｉ）で列挙したものと同じ基。
さらにより好ましくは、置換基は、以下であってもよい：
（ｉ’’’）ハロゲン原子；
（ｉｉ’’’）炭素原子数１〜６のアルキル；
（ｉｉｉ’’’）Ｒａ−Ｏ−、Ｒａ−Ｃ（＝Ｏ）−、Ｒａ−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−、もしくはＲａ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−（Ｒａは、水素原子、もしくは炭素原子数１〜６のアルキルを示す。）；または
（ｉｖ’’’）ＮＲｂＲｃ−、ＮＲｂＲｃ−Ｃ（＝Ｏ）−、ＮＲｂＲｃ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−、もしくはＲｂ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲｃ−（ＲｂおよびＲｃは、同一もしくは異なって、水素原子、もしくは炭素原子数１〜６のアルキルを示す。）；
（ｖ’’’）上記（ｖｉｉ）で列挙したものと同じ基。
特に好ましくは、置換基は、以下であってもよい：
（ｉ’’’’）ハロゲン原子；
（ｉｉ’’’’）炭素原子数１〜４のアルキル；
（ｉｉｉ’’’’）Ｒａ−Ｏ−、Ｒａ−Ｃ（＝Ｏ）−、Ｒａ−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−、もしくはＲａ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−（Ｒａは、水素原子、もしくは炭素原子数１〜４のアルキルを示す。）；または
（ｉｖ’’’’）ＮＲｂＲｃ−、ＮＲｂＲｃ−Ｃ（＝Ｏ）−、ＮＲｂＲｃ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−、もしくはＲｂ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲｃ−（ＲｂおよびＲｃは、同一もしくは異なって、水素原子、もしくは炭素原子数１〜４のアルキルを示す。）；
（ｖ’’’’）上記（ｖｉｉ）で列挙したものと同じ基。
より具体的には、脱離基としては、下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかが挙げられる。
（ａ）環Ｐ−Ｑ−〔ここで、環Ｐが、電子吸引性基で置換されていてもよいアリーレン、電子吸引性基で置換されていてもよいヘテロアリーレン、縮環していてもよい２，５-ジケトピロリジン、縮環していてもよい２，６−ジケトピペリジン、縮環していてもよい２-ケトピロリジン、縮環していてもよい２−ケトピペリジン、２−ピリドンからなる群より選ばれる基であり、Ｑが、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓｅ−、−ＳＯ２−Ｏ−、−ＳＯ２−Ｎ（Ｒ）−、−ＳＯ２−、−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｎ（ＯＲ）−、−Ｎ（Ｒ）−、および−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−からなる群より選ばれる基（ここで、Ｒは、水素原子または炭素原子数１〜６のアルキルである。）である。〕、
（ｂ）ヘテロアリーレン、あるいは
（ｃ）−Ｑ−〔ここで、Ｑが、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓｅ−、−ＳＯ２−Ｏ−、−ＳＯ２−Ｎ（Ｒ）−、−ＳＯ２−、−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｎ（ＯＲ）−、−Ｎ（Ｒ）−、および−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−からなる群より選ばれる基（ここで、Ｒは、水素原子または炭素原子数１〜６のアルキルである。）である。〕
脱離基としては、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のうち、（ａ）または（ｂ）が好ましく、（ａ）が特に好ましい。（ａ）における環Ｐは、電子吸引性基で置換されていてもよいアリーレン、電子吸引性基で置換されていてもよいヘテロアリーレン、縮環していてもよい２，５−ジケトピロリジン、縮環していてもよい２，６−ジケトピペリジン、縮環していてもよい２−ケトピロリジン、縮環していてもよい２−ケトピペリジン、２−ピリドンのいずれかであるが、このうち、電子吸引性基で置換されているアリーレン、電子吸引性基で置換されているヘテロアリーレン、２，５−ジケトピロリジン、２，６−ジケトピペリジンがより好ましく、電子吸引性基で置換されているアリーレン、２，５−ジケトピロリジン、２，６−ジケトピペリジンがさらにより好ましい。
（ａ）における環Ｐは、電子吸引性基で置換されていてもよいアリーレン、電子吸引性基で置換されていてもよいヘテロアリーレン、縮環していてもよい２，５-ジケトピロリジン、縮環していてもよい２，６−ジケトピペリジン、縮環していてもよい２-ケトピロリジン、縮環していてもよい２−ケトピペリジン、２−ピリドンからなる群より選ばれる基である。これらの基の詳細は、−Ｎ（Ｒ）−、−Ｎ（ＯＲ）−、−Ｏ−、−Ｓ−、または−Ｓｅ−の脱離する能力を高める基の好ましい例として述べたものと同じである。
（ａ）におけるＱは、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓｅ−、−ＳＯ２−Ｏ−、−ＳＯ２−Ｎ（Ｒ）−、−ＳＯ２−、−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｎ（ＯＲ）−、−Ｎ（Ｒ）−、−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−からなる群より選ばれる基（ここで、Ｒは、水素原子または炭素原子数１〜６のアルキルである。）である。〕であるが、このうち、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＳＯ２−Ｏ−、または−ＳＯ２−Ｎ（Ｒ）−が好ましく、−Ｏ−または−Ｓ−がより好ましく、−Ｏ−がさらにより好ましい。
（ｂ）はヘテロアリーレンであるが、イミダゾールジイル、トリアゾールジイル、テトラゾールジイル、または２−ピリドンジイル（＝２−ヒドロキシピリジンジイル）が好ましく、イミダゾールジイル、または２−ピリドンジイルがさらにより好ましい。
（Ｃ）におけるＱは、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓｅ−、−ＳＯ２−Ｏ−、−ＳＯ２−Ｎ（Ｒ）−、−ＳＯ２−、−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｎ（ＯＲ）−、−Ｎ（Ｒ）−、および−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−からなる群より選ばれる基（ここで、Ｒは、水素原子または炭素原子数１〜６のアルキルである。）であるが、−Ｓ−、−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｎ（ＯＲ）−、−Ｎ（Ｒ）−、または−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−が好ましく、Ｓ、−Ｎ（ＯＲ）、または−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−がさらにより好ましい。
より具体的には、好ましい脱離基は、下記構造式からなる群より選ばれる基であってもよい。
Figure 2019240288
 （ここで、ＥＷＧは、電子吸引性基であり、
ｍは、０〜４の整数であり、
ｎは、０〜３の整数であり、
Ｒは、水素原子、または炭素原子数１〜６のアルキルであり、
○（白丸）は、Ｌ１に対する結合手であり、●（黒丸）は、Ｅ１に対する結合手である。）。
電子吸引性基、および炭素原子数１〜６のアルキルの詳細は、上述のとおりである。ｍは、好ましくは１〜４の整数であり、より好ましくは１、２または３である。ｎは、好ましくは１〜３の整数であり、より好ましくは１または２である。
Ｌで表される、脱離基を含む２価の基は、上記脱離基からなる２価の基、または上記脱離基に加えて他の２価の基を含む２価の基である。このような他の２価の基としては、例えば、２価の炭化水素基、２価の複素環基、−Ｃ（＝Ｏ）−、−ＮＲＬ−（ＲＬは水素原子、または上述の置換基を示す）、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｃ（＝Ｓ）−、およびこれらの２以上（例えば２〜８、好ましくは２〜６、より好ましくは２〜４）の組み合わせからなる基が挙げられる。２価の炭化水素基、および２価の複素環基は、例えば１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１もしくは２個の置換基を有していても、有していなくてもよい。化学構造が簡潔な化合物を合成する観点からは、このような置換基を有しないことが好ましい。一方、上記のような基が置換基を有する場合、このような置換基の例および好ましい例は、上述のものと同じである。
２価の炭化水素基としては、直鎖、分岐鎖、または環状の２価の炭化水素基であり、好ましくは直鎖または分岐鎖の２価の炭化水素基である。２価の炭化水素基としては、例えば、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、アリーレンが挙げられる。
アルキレンとしては、炭素原子数１〜１２のアルキレンが好ましく、炭素原子数１〜６のアルキレンがより好ましく、炭素原子数１〜４のアルキレンが特に好ましい。上記炭素原子数に置換基の炭素原子数は含まれない。アルキレンは、直鎖、分岐鎖、または環状のいずれであってもよいが、直鎖のアルキレンが好ましい。このようなアルキレンとしては、例えば、メチレン、エチレン、プロピレン、ブチレン、ペンチレン、へキシレンが挙げられる。
アルケニレンとしては、炭素原子数２〜１２のアルケニレンが好ましく、炭素原子数２〜６のアルケニレンがより好ましく、炭素原子数２〜４のアルケニレンが特に好ましい。上記炭素原子数に置換基の炭素原子数は含まれない。アルケニレンは、直鎖、分岐鎖、または環状のいずれであってもよいが、直鎖のアルケニレンが好ましい。このようなアルケニレンとしては、例えば、エチレニレン、プロピニレン、ブテニレン、ペンテニレン、へキセニレンが挙げられる。
アルキニレンとしては、炭素原子数２〜１２のアルキニレンが好ましく、炭素原子数２〜６のアルキニレンがより好ましく、炭素原子数２〜４のアルキニレンが特に好ましい。上記炭素原子数に置換基の炭素原子数は含まれない。アルキニレンは、直鎖、分岐鎖、または環状のいずれであってもよいが、直鎖のアルキニレンが好ましい。このようなアルキニレンとしては、例えば、エチニレン、プロピニレン、ブチニレン、ペンチニレン、へキシニレンが挙げられる。
アリーレンとしては、炭素原子数６〜２４のアリーレンが好ましく、炭素原子数６〜１８のアリーレンがより好ましく、炭素原子数６〜１４のアリーレンがさらに好ましく、炭素原子数６〜１０のアリーレンがさらにより好ましい。上記炭素原子数に置換基の炭素原子数は含まれない。アリーレンとしては、例えば、フェニレン、ナフチレン、アントラセニレンが挙げられる。
２価の複素環基は、２価の芳香族複素環基、または２価の非芳香族複素環基である。複素環を構成するヘテロ原子として、酸素原子、硫黄原子、窒素原子、リン原子、ホウ素原子およびケイ素原子からなる群から選択される１種以上を含むことが好ましく、酸素原子、硫黄原子および窒素原子からなる群から選択される１種以上を含むことがより好ましい。
２価の芳香族複素環基としては、炭素原子数１〜２１の２価の芳香族複素環基が好ましく、炭素原子数１〜１５の２価の芳香族複素環基がより好ましく、炭素原子数１〜９の２価の芳香族複素環基がさらに好ましく、炭素原子数１〜６の２価の芳香族複素環基がさらにより好ましい。上記炭素原子数に置換基の炭素原子数は含まれない。より具体的には、２価の芳香族複素環基としては、例えば、ピロールジイル、フランジイル、チオフェンジイル、ピリジンジイル、ピリダジンジイル、ピリミジンジイル、ピラジンジイル、トリアジンジイル、ピラゾールジイル、イミダゾールジイル、チアゾールジイル、イソチアゾールジイル、オキサゾールジイル、イソオキサゾールジイル、トリアゾールジイル、テトラゾールジイル、インドールジイル、プリンジイル、アントラキノンジイル、カルバゾールジイル、フルオレンジイル、キノリンジイル、イソキノリンジイル、キナゾリンジイル、およびフタラジンジイルが挙げられる。
２価の非芳香族複素環基としては、炭素原子数２〜２１の非芳香族複素環基が好ましく、炭素原子数２〜１５の非芳香族複素環基がより好ましく、炭素原子数２〜９の非芳香族複素環基がさらに好ましく、炭素原子数２〜６の非芳香族複素環基がさらにより好ましい。上記炭素原子数に置換基の炭素原子数は含まれない。より具体的には、２価の非芳香族複素環基としては、例えば、ピロールジオンジイル、ピロリンジオンジイル、ピロリンジイル、オキシランジイル、アジリジンジイル、アゼチジンジイル、オキセタンジイル、チエタンジイル、ピロリジンジイル、ジヒドロフランジイル、テトラヒドロフランジイル、ジオキソランジイル、テトラヒドロチオフェンジイル、ピロリンジイル、イミダゾリジンジイル、オキサゾリジンジイル、ピペリジンジイル、ジヒドロピランジイル、テトラヒドロピランジイル、テトラヒドロチオピランジイル、モルホリンジイル、チオモルホリンジイル、ピペラジンジイル、ジヒドロオキサジンジイル、テトラヒドロオキサジンジイル、ジヒドロピリミジンジイル、およびテトラヒドロピリミジンジイルが挙げられる。
特定の実施形態では、Ｌは、Ｌ１−Ｌ２として表わされることができる。
Ｌ１は、結合または２価の基である。Ｌ１で表される２価の基の定義、例および好ましい例は、Ｌで表される脱離基を含む２価の基が脱離基に加えて他の２価の基を含む２価の基である場合における他の２価の基のものと同じである。
Ｌ２は、脱離基である。Ｌ２で表される脱離基の定義、例および好ましい例は、Ｌにおける脱離基のものと同じである。
好ましくは、Ｌ２で表される脱離基は、上記（ａ）〜（ｃ）のいずれかである。Ｌ２で表される脱離基の例および好ましい例もまた、上記（ａ）〜（ｃ）で述べたものと同じである。
Ａ（親和性物質）とＥ（求電子基を含む２価の基）とを連結するＬ（脱離基を含む２価の基）またはＬ１（結合または２価の基）−Ｌ２（脱離基）の主鎖の長さは、抗体および親和性物質の種類、ならびに抗体における親和性物質の標的部位と、位置選択的に修飾されるべき抗体中の特定のアミノ酸残基との関係などの種々の因子に応じて、適宜設計することができる。ＬまたはＬ１−Ｌ２の主鎖とは、ＡおよびＥを連結する、共有結合で連結された複数の原子からなる鎖状構造をいい、水素原子、分岐構造部分、および置換基は除かれる。式（Ｉ）で表される化合物を抗体と接触させると、先ず、Ａが抗体に会合する。次いで、抗体会合部位の近傍に存在する抗体中の修飾されるべき特定のアミノ酸残基の側鎖中の求核基（例、リジン残基の側鎖中のアミノ基）がＥにおける求電子基と反応することにより、当該求核基が当該求電子と結合する一方で、ＬまたはＬ１に含まれる脱離基がＥから脱離することができる。このとき、抗体会合部位と修飾されるべき特定のアミノ酸残基との間の近傍において当該特定のアミノ酸残基と同種のアミノ酸残基が他に存在しない場合、主鎖の長さを厳密に制御せずとも、Ｅにおける求電子基は、抗体中の修飾されるべき特定のアミノ酸残基の側鎖中の求核基に対して位置選択的に結合することができる。勿論、このような領域において当該特定のアミノ酸残基と同種のアミノ酸残基が他に存在する場合であっても、主鎖の長さを制御することにより、Ｅにおける求電子基は、当該特定のアミノ酸残基に対して位置選択的に結合することができる。
ＡとＥとを連結するＬまたはＬ１−Ｌ２の主鎖の長さは、抗体中の特定のアミノ酸残基を位置選択的に修飾できる限り特に限定されないが、例えば、ヒトＩｇＧ Ｆｃにおける特定のアミノ酸残基（例、Ｅｕ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇに従うＬｙｓ２４８残基またはＬｙｓ２４６残基、Ｌｙｓ２８８またはＬｙｓ２９０、Ｌｙｓ３１７、あるいはそれら残基以外の他のアミノ酸残基）を位置選択的に修飾する場合、２０個以下の原子からなる長さであることが好ましい。ＬまたはＬ１−Ｌ２の主鎖の長さはまた、好ましくは１以上であり、より好ましくは２以上であり、さらにより好ましくは３以上であり、特に好ましくは４以上または５以上であってもよい。ＬまたはＬ１−Ｌ２の主鎖の長さはまた、好ましくは５０以下であり、より好ましくは３０以下であり、さらにより好ましくは２０以下であり、特に好ましくは１５以下または１０以下であってもよい。より具体的には、ＬまたはＬ１−Ｌ２の主鎖の長さは、好ましくは１〜５０であり、より好ましくは１〜３０であり、さらにより好ましくは１〜２０であり、特に好ましくは１〜１５または１〜１０であってもよい。あるいは、ＬまたはＬ１−Ｌ２の主鎖の長さは、好ましくは２〜３０であり、さらにより好ましくは３〜２０であり、特に好ましくは４〜１５または５〜１０であってもよい。
主鎖が環構造を含まない構造である場合、主鎖の原子数は、鎖状構造中の原子数（水素原子、分岐構造部分、および置換基中の原子数を除く）を数えることにより決定することができる。
一方、主鎖が環構造を含む構造である場合、主鎖の長さを規定する観点から、主鎖の原子数を便宜的に数えることができる。具体的には、このような場合における主鎖の原子数は、主鎖において２価の環構造を含まない鎖状構造中の原子数（水素原子、分岐構造部分、および置換基中の原子数を除く）に加えて、環構造中の２つの結合手を連絡する最短経路の原子数を数えることにより決定することができる（例えば、以下（ａ）〜（ｄ）の太字経路を参照）。
Figure 2019240288
 ・は、結合手である。
（ａ）の場合、最短経路は太字経路であるため、主鎖の原子数として数えられる２価の環構造中の原子数は、２である。
（ｂ）の場合、最短経路は太字経路であるため、主鎖の原子数として数えられる２価の環構造中の原子数は、３である。
（ｃ）の場合、いずれの経路も最短経路（等距離）であるため、主鎖の原子数として数えられる２価の環構造中の原子数は、４である。
（ｄ）の場合、縮合部位の経路が最短経路であるため、主鎖の原子数として数えられる２価の環構造中の原子数は、４である。
好ましくは、ＬまたはＬ１−Ｌ２の主鎖は、Ｌにおける「他の２価の基」またはＬ１における「２価の基」が２価の環構造を含まない鎖状構造であってもよい。したがって、Ｌにおける「他の２価の基」またはＬ１における「２価の基」は、２価の直鎖または分岐鎖の炭化水素基、−Ｃ（＝Ｏ）−、−ＮＲＬ−（ＲＬは水素原子、または上述の置換基を示す）、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｃ（＝Ｓ）−、およびこれらの２以上（例えば２〜８、好ましくは２〜６、より好ましくは２〜４）の組み合わせからなる基であってもよい。２価の直鎖または分岐鎖の炭化水素基は、例えば１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１もしくは２個の置換基を有していても、有していなくてもよい。化学構造が簡潔な化合物を合成する観点からは、このような置換基を有しないことが好ましい。一方、上記のような基が置換基を有する場合、このような置換基の例および好ましい例は、脱離基の例であるヘテロアリーレンが有していてもよい置換基と同じである。
１−４．求電子基を含む２価の基（Ｅ）
式（Ｉ）において、Ｌは、（ｉ）脱離基と連結しており、かつ（ｉｉ）抗体中の求核基と反応する能力を有する求電子基を含む２価の基である。
抗体中の求核基としては、例えば、リジン残基の側鎖におけるＮＨ２、チロシン残基の側鎖におけるＯＨ、セリン残基の側鎖におけるＯＨ、スレオニン残基の側鎖におけるＯＨ、およびシステイン残基の側鎖におけるＳＨが挙げられる。抗体中の求核基としては、リジン残基の側鎖におけるＮＨ２、またはチロシン残基の側鎖におけるＯＨが好ましく、リジン残基の側鎖におけるＮＨ２がより好ましい。
Ｅに含まれる求電子基としては、脱離基と連結することができ、かつ、上述のような抗体中の求核基と反応する能力を有する任意の求電子基を用いることができるが、−Ｃ（＝Ｏ）−、−ＳＯ２−、および−ＣＨ２−からなる群より選ばれる基が好ましい。求電子基としては、その隣接する基（例、脱離基、Ｌ２、Ｅ２）との電子的なバランスによって−ＣＨ２−も利用することができる。例えば、脱離基としてトシル基が利用される場合、求電子基として−ＣＨ２−を好適に利用することができる（Ｔｓｕｋｉｊｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．５，Ｎｏ．５，Ｍａｙ ２００９）。求電子基としては、−Ｃ（＝Ｏ）−または−ＳＯ２−がより好ましく、−Ｃ（＝Ｏ）−がさらにより好ましい。
Ｅで表される、求電子基を含む２価の基は、上記求電子基からなる２価の基、または上記求電子基に加えて他の２価の基を含む２価の基である。このような他の２価の基としては、例えば、２価の炭化水素基、２価の複素環基、−Ｃ（＝Ｏ）−、−ＮＲＥ−（ＲＥは水素原子、または上述の置換基を示す）、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｃ（＝Ｓ）−、およびこれらの２以上（例えば２〜８、好ましくは２〜６、より好ましくは２〜４）の組み合わせからなる基が挙げられる。２価の炭化水素基、および２価の複素環基は、例えば１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１もしくは２個の置換基を有していても、有していなくてもよい。化学構造が簡潔な化合物を合成する観点からは、このような置換基を有しないことが好ましい。一方、上記のような基が置換基を有する場合、このような置換基の例および好ましい例は、脱離基の例であるヘテロアリーレンが有していてもよい置換基と同じである。Ｅ（および後述のＥ１−Ｅ２−Ｅ３）は、潜在的な免疫原性を有し、また血中で加水分解され易いという問題を抱えるペプチド部分を含まないように設計できる。
２価の炭化水素基としては、直鎖、分岐鎖、または環状の２価の炭化水素基であり、好ましくは直鎖または分岐鎖の２価の炭化水素基である。２価の炭化水素基としては、例えば、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、アリーレンが挙げられる。
アルキレンとしては、炭素原子数１〜１２のアルキレンが好ましく、炭素原子数１〜６のアルキレンがより好ましく、炭素原子数１〜４のアルキレンが特に好ましい。上記炭素原子数に置換基の炭素原子数は含まれない。アルキレンは、直鎖、分岐鎖、または環状のいずれであってもよいが、直鎖のアルキレンが好ましい。このようなアルキレンとしては、例えば、メチレン、エチレン、プロピレン、ブチレン、ペンチレン、へキシレンが挙げられる。
アルケニレンとしては、炭素原子数２〜１２のアルケニレンが好ましく、炭素原子数２〜６のアルケニレンがより好ましく、炭素原子数２〜４のアルケニレンが特に好ましい。上記炭素原子数に置換基の炭素原子数は含まれない。アルケニレンは、直鎖、分岐鎖、または環状のいずれであってもよいが、直鎖のアルケニレンが好ましい。このようなアルケニレンとしては、例えば、エチレニレン、プロピニレン、ブテニレン、ペンテニレン、へキセニレンが挙げられる。
アルキニレンとしては、炭素原子数２〜１２のアルキニレンが好ましく、炭素原子数２〜６のアルキニレンがより好ましく、炭素原子数２〜４のアルキニレンが特に好ましい。上記炭素原子数に置換基の炭素原子数は含まれない。アルキニレンは、直鎖、分岐鎖、または環状のいずれであってもよいが、直鎖のアルキニレンが好ましい。このようなアルキニレンとしては、例えば、エチニレン、プロピニレン、ブチニレン、ペンチニレン、へキシニレンが挙げられる。
アリーレンとしては、炭素原子数６〜２４のアリーレンが好ましく、炭素原子数６〜１８のアリーレンがより好ましく、炭素原子数６〜１４のアリーレンがさらに好ましく、炭素原子数６〜１０のアリーレンがさらにより好ましい。上記炭素原子数に置換基の炭素原子数は含まれない。アリーレンとしては、例えば、フェニレン、ナフチレン、アントラセニレンが挙げられる。
２価の複素環基は、２価の芳香族複素環基、または２価の非芳香族複素環基である。複素環を構成するヘテロ原子として、酸素原子、硫黄原子、窒素原子、リン原子、ホウ素原子およびケイ素原子からなる群から選択される１種以上を含むことが好ましく、酸素原子、硫黄原子および窒素原子からなる群から選択される１種以上を含むことがより好ましい。
２価の芳香族複素環基としては、炭素原子数１〜２１の２価の芳香族複素環基が好ましく、炭素原子数１〜１５の２価の芳香族複素環基がより好ましく、炭素原子数１〜９の２価の芳香族複素環基がさらに好ましく、炭素原子数１〜６の２価の芳香族複素環基がさらにより好ましい。上記炭素原子数に置換基の炭素原子数は含まれない。より具体的には、２価の芳香族複素環基としては、例えば、ピロールジイル、フランジイル、チオフェンジイル、ピリジンジイル、ピリダジンジイル、ピリミジンジイル、ピラジンジイル、トリアジンジイル、ピラゾールジイル、イミダゾールジイル、チアゾールジイル、イソチアゾールジイル、オキサゾールジイル、イソオキサゾールジイル、トリアゾールジイル、テトラゾールジイル、インドールジイル、プリンジイル、アントラキノンジイル、カルバゾールジイル、フルオレンジイル、キノリンジイル、イソキノリンジイル、キナゾリンジイル、およびフタラジンジイルが挙げられる。
２価の非芳香族複素環基としては、炭素原子数２〜２１の非芳香族複素環基が好ましく、炭素原子数２〜１５の非芳香族複素環基がより好ましく、炭素原子数２〜９の非芳香族複素環基がさらに好ましく、炭素原子数２〜６の非芳香族複素環基がさらにより好ましい。上記炭素原子数に置換基の炭素原子数は含まれない。より具体的には、２価の非芳香族複素環基としては、例えば、ピロールジオンジイル、ピロリンジオンジイル、ピロリンジイル、オキシランジイル、アジリジンジイル、アゼチジンジイル、オキセタンジイル、チエタンジイル、ピロリジンジイル、ジヒドロフランジイル、テトラヒドロフランジイル、ジオキソランジイル、テトラヒドロチオフェンジイル、ピロリンジイル、イミダゾリジンジイル、オキサゾリジンジイル、ピペリジンジイル、ジヒドロピランジイル、テトラヒドロピランジイル、テトラヒドロチオピランジイル、モルホリンジイル、チオモルホリンジイル、ピペラジンジイル、ジヒドロオキサジンジイル、テトラヒドロオキサジンジイル、ジヒドロピリミジンジイル、およびテトラヒドロピリミジンジイルが挙げられる。
特定の実施形態では、Ｅは、Ｅ１−Ｅ２−Ｅ３として表わされることができる。
Ｅ１は、（ｉ）前記脱離基と連結しており、かつ（ｉｉ）前記抗体中の求核基と反応する能力を有する求電子基である。Ｅ１の求電子基の定義、例および好ましい例は、Ｅにおける求電子基と同じである。
Ｅ２は、下記（ａ）あるいは（ｂ）である：
（ａ）−Ｘ−Ｙ−〔ここで、Ｅ１と結合するＸは、Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）（ここで、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して、水素原子または炭素原子数１〜６のアルキルである。）、Ｎ（Ｒ３）（ここで、Ｒ３は、水素原子または炭素原子数１〜６のアルキルである。）、Ｏ、Ｓ、またはＳｅであり、Ｅ３と結合するＹは、Ｃ（Ｒ４）（Ｒ５）（ここで、Ｒ４およびＲ５はそれぞれ独立して、水素原子または炭素原子数１〜６のアルキルである。）である。〕；あるいは
（ｂ）下記式（ｉ）：
Figure 2019240288
 （ここで、環Ｚは、Ｅ１と結合する環構成原子Ｘ’およびその両隣の環構成原子の全てが炭素原子である２価の環基であるか、またはＥ１と結合する環構成原子Ｘ’が窒素原子であり、かつ窒素原子の両隣の環構成原子が炭素原子である２価の複素環基である。・は結合手である。）で表される基である。
Ｅ２が上記（ａ）である場合、Ｒ１〜Ｒ５における炭素原子数１〜６のアルキルは、上述のものと同じである。
Ｅ２が上記（ａ）である場合、Ｅ１と結合するＸとしては、本発明の化合物の反応性および安定性の向上の観点より、Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）、Ｎ（Ｒ３）、Ｏ、Ｓ、またはＳｅが好ましく、Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）、Ｎ（Ｒ３）、Ｏ、またはＳがより好ましく、Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）、Ｎ（Ｒ３）、またはＯがさらにより好ましく、Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）、またはＮ（Ｒ３）がなおさらにより好ましく、Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）が最も好ましい。
Ｅ２におけるＸはまた、脱離基（例、Ｌ、Ｌ２を参照）との関係において規定することができる。ＸがＮ（Ｒ３）、Ｏ、Ｓ、またはＳｅ等の原子または基である場合、脱離基のみならず、Ｘもまた求電子基から脱離し得る。しかし、式（Ｉ）で表される所定量の化合物を抗体との反応に使用した場合、式（Ｉ）で表される少なくとも一部の化合物におけるＸは、求電子基から脱離しないように反応を制御することができるので、本発明では、Ｘとして上述したような原子または基を用いることができる。好ましくは、式（Ｉ）で表される化合物と抗体との目的反応の効率の向上、ひいては生体直交性官能基を有する抗体の収率の向上の観点から、Ｘとして、脱離基よりも脱離し難い原子または基（すなわち、当該原子または基のｐＫａ値が脱離基のｐＫａ値よりも大きいもの）を用いることができる。したがって、脱離基をより選択的に脱離させ、かつＥ２におけるＸの脱離を抑制させることにより、式（Ｉ）で表される化合物と抗体との目的反応の効率を向上させ、ひいては生体直交性官能基を有する抗体の収率を向上させる観点から、Ｅ２におけるＸとしては、脱離する能力が脱離基以下であるものが好ましい。このようなＸとしては、脱離基の種類（例、−Ｎ（Ｒ）−、−Ｎ（ＯＲ）−、−Ｏ−、−Ｓ−、または−Ｓｅ−、あるいはヘテロアリーレン）、ならびに脱離基に隣接して存在する脱離基の脱離する能力を高める基を含む基の有無およびその種類によって変動し得るが、概説すると、以下のとおりである。
（１）脱離基が−Ｎ（Ｒ）−または−Ｎ（ＯＲ）−である場合、Ｘとしては、Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）、またはＮ（Ｒ３）が好ましく、Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）がより好ましい。
（２）脱離基が−Ｏ−である場合、Ｘとしては、Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）、Ｎ（Ｒ３）、またはＯが好ましく、Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）、またはＮ（Ｒ３）がより好ましく、Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）がさらにより好ましい。
（３）脱離基が−Ｓ−である場合、Ｘとしては、Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）、Ｎ（Ｒ３）、Ｏ、またはＳが好ましく、Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）、Ｎ（Ｒ３）、またはＯがより好ましく、Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）、またはＮ（Ｒ３）がさらにより好ましく、Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）がなおさらにより好ましい。
（４）脱離基が−Ｓｅ−である場合、Ｘとしては、Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）、Ｎ（Ｒ３）、Ｏ、Ｓ、またはＳｅが好ましく、Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）、Ｎ（Ｒ３）、Ｏ、またはＳがより好ましく、Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）、Ｎ（Ｒ３）、またはＯがさらにより好ましく、Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）、またはＮ（Ｒ３）がなおさらにより好ましく、Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）が最も好ましい。
（５）脱離基がヘテロアリーレンである場合、Ｘとしては、Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）、Ｎ（Ｒ３）、Ｏ、Ｓ、またはＳｅが好ましく、Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）、Ｎ（Ｒ３）、Ｏ、またはＳがより好ましく、Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）、Ｎ（Ｒ３）、またはＯがさらにより好ましく、Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）、またはＮ（Ｒ３）がなおさらにより好ましく、Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）が最も好ましい。
Ｅ２が上記（ｂ）である場合、環Ｚに含まれる、Ｅ１と結合する環構成原子Ｘ’は、炭素原子または窒素原子である。
Ｅ１と結合する環構成原子Ｘ’が炭素原子である場合、環Ｚは、Ｅ１と結合する環構成原子Ｘ’およびその両隣の環構成原子の全てが炭素原子である２価の環基である。２価の環基は、例えば１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１もしくは２個の置換基を有していても、有していなくてもよい。化学構造が簡潔な化合物を合成する観点からは、このような置換基を有しないことが好ましい。一方、２価の環基が置換基を有する場合、このような置換基の例および好ましい例は、脱離基の例であるヘテロアリーレンが有していてもよい置換基と同じである。このような２価の環基としては、例えば、環状の２価の炭化水素基（例、アリーレン、環状のアルキレン、環状のアルケニレン、環状のアルキニレン）、および２価の複素環基（例、２価の芳香族複素環基、２価の非芳香族複素環基）が挙げられる。
２価の炭化水素基としては、環状の２価の炭化水素基であり、２価の炭化水素基としては、例えば、環状のアルキレン、環状のアルケニレン、環状のアルキニレン、アリーレンが挙げられる。
環状のアルキレンとしては、炭素原子数３〜１２のアルキレンが好ましく、炭素原子数３〜１０のアルキレンがより好ましく、炭素原子数５〜８のアルキレンが特に好ましい。上記炭素原子数に置換基の炭素原子数は含まれない。このようなアルキレンとしては、例えば、シクロプロピレン、シクロブチレン、シクロペンチレン、シクロへキシレン、シクロヘプチレン、シクロオクチレン、シクロノニレン、シクロデキレンが挙げられる。
環状のアルケニレンとしては、炭素原子数３〜１２のアルケニレンが好ましく、炭素原子数３〜１０のアルケニレンがより好ましく、炭素原子数５〜８のアルケニレンが特に好ましい。上記炭素原子数に置換基の炭素原子数は含まれない。このようなアルケニレンとしては、例えば、シクロプロペニレン、シクロブテニレン、シクロペンテニレン、シクロへキセニレン、シクロヘプテニレン、シクロオクテニレン、シクロノネニレン、シクロデケニレンが挙げられる。
環状のアルキニレンとしては、炭素原子数６〜１２のアルキニレンが好ましく、炭素原子数７〜１２のアルキニレンがより好ましく、炭素原子数８〜１２のアルキニレンが特に好ましい。上記炭素原子数に置換基の炭素原子数は含まれない。アルキニレンは、直鎖、分岐鎖、または環状のいずれであってもよいが、直鎖のアルキニレンが好ましい。このようなアルキニレンとしては、例えば、シクロへキシニレン、シクロヘプチニレン、シクロオクチニレン、シクロノニニレン、シクロデキニレン、シクロウンデキニレン、シクロドデキニレンが挙げられる。
アリーレンとしては、炭素原子数６〜２４のアリーレンが好ましく、炭素原子数６〜１８のアリーレンがより好ましく、炭素原子数６〜１４のアリーレンがさらに好ましく、炭素原子数６〜１０のアリーレンがさらにより好ましい。上記炭素原子数に置換基の炭素原子数は含まれない。アリーレンとしては、例えば、フェニレン、ナフチレン、アントラセニレンが挙げられる。
２価の複素環基は、２価の芳香族複素環基、または２価の非芳香族複素環基である。複素環を構成するヘテロ原子として、酸素原子、硫黄原子、窒素原子、リン原子、ホウ素原子およびケイ素原子からなる群から選択される１種以上を含むことが好ましく、酸素原子、硫黄原子および窒素原子からなる群から選択される１種以上を含むことがより好ましい。
２価の芳香族複素環基としては、炭素原子数３〜２１の２価の芳香族複素環基が好ましく、炭素原子数３〜１５の２価の芳香族複素環基がより好ましく、炭素原子数３〜９の２価の芳香族複素環基がさらに好ましく、炭素原子数３〜６の２価の芳香族複素環基がさらにより好ましい。上記炭素原子数に置換基の炭素原子数は含まれない。より具体的には、２価の芳香族複素環基としては、例えば、ピロールジイル、フランジイル、チオフェンジイル、ピリジンジイル、ピリダジンジイル、ピリミジンジイル、ピラゾールジイル、イソチアゾールジイル、イソオキサゾールジイル、インドールジイル、アントラキノンジイル、カルバゾールジイル、フルオレンジイル、キノリンジイル、イソキノリンジイル、キナゾリンジイル、およびフタラジンジイルが挙げられる。
２価の非芳香族複素環基としては、炭素原子数３〜２１の非芳香族複素環基が好ましく、炭素原子数３〜１５の非芳香族複素環基がより好ましく、炭素原子数３〜９の非芳香族複素環基がさらに好ましく、炭素原子数３〜６の非芳香族複素環基がさらにより好ましい。上記炭素原子数に置換基の炭素原子数は含まれない。より具体的には、２価の非芳香族複素環基としては、例えば、ピロリンジオンジイル、ピロリンジイル、アゼチジンジイル、オキセタンジイル、チエタンジイル、ピロリジンジイル、ジヒドロフランジイル、テトラヒドロフランジイル、テトラヒドロチオフェンジイル、ピロリンジイル、ピペリジンジイル、ジヒドロピランジイル、テトラヒドロピランジイル、テトラヒドロチオピランジイル、ピペラジンジイル、ジヒドロオキサジンジイル、テトラヒドロオキサジンジイル、ジヒドロピリミジンジイル、およびテトラヒドロピリミジンジイルが挙げられる。
Ｅ１と結合する環構成原子Ｘ’が窒素原子である場合、環Ｚは、Ｅ１と結合する環構成原子Ｘ’が窒素原子であり、かつ窒素原子の両隣の環構成原子が炭素原子である２価の複素環基である。このような２価の複素環基は、環構成原子として窒素原子を含む２価の複素環基である。環構成原子として窒素原子を含む２価の複素環基としては、炭素原子数３〜２１の２価の複素環基が好ましく、炭素原子数３〜１５の２価の複素環基がより好ましく、炭素原子数３〜９の２価の複素環基がさらに好ましく、炭素原子数３〜６の２価の複素環基がさらにより好ましい。２価の複素環基は、例えば１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１もしくは２個の置換基を有していても、有していなくてもよい。化学構造が簡潔な化合物を合成する観点からは、このような置換基を有しないことが好ましい。一方、２価の複素環基が置換基を有する場合、このような置換基の例および好ましい例は、脱離基の例であるヘテロアリーレンが有していてもよい置換基と同じである。上記炭素原子数に置換基の炭素原子数は含まれない。環構成原子として窒素原子を含む２価の複素環基としては、例えば、環構成原子として窒素原子を含む２価の芳香族複素環基、環構成原子として窒素原子を含む２価の非芳香族複素環基が挙げられる。環構成原子として窒素原子を含む２価の芳香族複素環基としては、例えば、ピロールジイル、イミダゾールジイル、インドールジイル、プリンジイル、カルバゾールジイルが挙げられる。環構成原子として窒素原子を含む２価の非芳香族複素環基としては、例えば、ピロールジオンジイル、ピロリンジオンジイル、ピロリンジイル、アジリジンジイル、アゼチジンジイル、ピロリジンジイル、ピロリンジイル、イミダゾリジンジイル、ピペリジンジイル、モルホリンジイル、チオモルホリンジイル、ピペラジンジイル、ジヒドロピリミジンジイル、およびテトラヒドロピリミジンジイルが挙げられる。
好ましくは、（ｂ）上記式（ｉ）で表される基は、（ｂ’）下記式（ｉ’）：
Figure 2019240288
 （ここで、環Ｚは、Ｅ１と結合する環構成原子およびその両隣の環構成原子の全てが炭素原子である２価の環基である。・は結合手である。）で表される基である。上記式（ｉ’）で表される基における環Ｚについての２価の環基の定義、例および好ましい例は、上記式（ｉ）で表される基における環Ｚについての２価の環基のものと同じである。
Ｅ３は、Ｅ２が−Ｘ−Ｙ−の場合には２価の基であり、Ｅ２が式（ｉ）で表される基の場合には結合または２価の基である。Ｅ３で表される２価の基は、Ｅで表される求電子基を含む２価の基が求電子基に加えて他の２価の基を含む２価の基である場合における他の２価の基と同じである。
Ｌ（脱離基を含む２価の基）とＢ（生体直交性官能基）とを連結するＥ（求電子基を含む２価の基）またはＥ１（求電子基）−Ｅ２（上記（ａ）または（ｂ））−Ｅ３（結合または２価の基）の主鎖の長さは、式（Ｉ）で表される化合物と抗体との間の反応における、抗体中の特定のアミノ酸残基の位置選択的な修飾に関与し得ず、むしろ、当該反応後に生成する、生体直交性官能基を有する抗体における抗体と生体直交性官能基との間の距離に関与し得る。ＥまたはＥ１−Ｅ２−Ｅ３の主鎖とは、ＬおよびＢを連結する、共有結合で連結された複数の原子からなる鎖状構造をいい、水素原子、分岐構造部分、および置換基は除かれる。したがって、ＥまたはＥ１−Ｅ２−Ｅ３の主鎖の長さは、当該距離の調節の観点から、適宜設計することができる。
ＬとＢとを連結するＥまたはＥ１−Ｅ２−Ｅ３の主鎖の長さは、特に限定されないが、３個以上の原子からなる長さであってもよい。
主鎖が環構造を含まない構造である場合、主鎖の原子数は、鎖状構造中の原子数（水素原子、分岐構造部分、および置換基中の原子数を除く）を数えることにより決定することができる。
一方、主鎖が環構造を含む構造である場合、主鎖の長さを規定する観点から、主鎖の原子数を便宜的に数えることができる。具体的には、このような場合における主鎖の原子数は、上述のとおり、主鎖において２価の環構造を含まない鎖状構造中の原子数（水素原子、分岐構造部分、および置換基中の原子数を除く）に加えて、環構造中の２つの結合手を連絡する最短経路の原子数を数えることにより決定することができる。
好ましくは、ＥまたはＥ１−Ｅ２−Ｅ３の主鎖は、Ｅにおける「他の２価の基」またはＥ３における「２価の基」が２価の環構造を含まない鎖状構造であってもよい。したがって、Ｅにおける「他の２価の基」またはＥ３における「２価の基」は、２価の直鎖または分岐鎖の炭化水素基、−Ｃ（＝Ｏ）−、−ＮＲＥ−（ＲＥは水素原子、または上述の置換基を示す）、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｃ（＝Ｓ）−、およびこれらの２以上（例えば２〜８、好ましくは２〜６、より好ましくは２〜４）の組み合わせからなる基であってもよい。２価の直鎖または分岐鎖の炭化水素基は、例えば１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１もしくは２個の置換基を有していても、有していなくてもよい。化学構造が簡潔な化合物を合成する観点からは、このような置換基を有しないことが好ましい。一方、上記のような基が置換基を有する場合、このような置換基の例および好ましい例は、脱離基の例であるヘテロアリーレンが有していてもよい置換基と同じである。
１−５．生体直交性官能基（Ｂ）
式（Ｉ）において、Ｂは、生体直交性官能基である。
生体直交性官能基とは、生体構成成分（例、アミノ酸、核酸、脂質、糖、リン酸）とは反応しない、もしくは生体構成成分に対する反応の速度が遅いが、生体構成成分以外の成分に対して選択的に反応する基をいう。生体直交性官能基は、当該技術分野において周知である（例、Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ Ｋ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４０，２００４（２０１５）；Ｂｅｒｔｏｚｚｉ Ｃ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９１，２３５７（２００１）；Ｂｅｒｔｏｚｚｉ Ｃ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １，１３（２００５）を参照）。
親和性物質の標的が抗体（タンパク質）である場合、生体直交性官能基は、タンパク質に対する生体直交性官能基である。タンパク質に対する生体直交性官能基とは、タンパク質を構成する天然の２０種のアミノ酸残基の側鎖と反応せずに、所定の官能基と反応する基である。タンパク質を構成する天然の２０種のアミノ酸は、アラニン（Ａ）、アスパラギン（Ｎ）、システイン（Ｃ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、プロリン（Ｐ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、バリン（Ｖ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）、およびリジン（Ｌ）である。これらの天然の２０種のアミノ酸のうち、側鎖がない（すなわち、水素原子である）グリシン、ならびに側鎖が炭化水素基である（すなわち、硫黄原子、窒素原子、および酸素原子からなる群より選ばれるヘテロ原子を側鎖に含まない）アラニン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、およびバリンは、通常の反応に対して不活性である。したがって、タンパク質に対する生体直交性官能基は、通常の反応に対して不活性である側鎖を有するこれらのアミノ酸の側鎖に加えて、アスパラギン、グルタミン、メチオニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、ヒスチジン、およびリジンの側鎖に対しても反応できない官能基である。
タンパク質に対して反応できないこのような生体直交性官能基としては、例えば、アジド残基、アルデヒド残基、チオール残基、アルケン残基（換言すれば、炭素原子間二重結合を有する最小単位であるビニレン（エテニレン）部分を有していればよい。以下同様）、アルキン残基（換言すれば、炭素原子間三重結合を有する最小単位であるエチニレン部分を有していればよい。以下同様）、ハロゲン残基、テトラジン残基、ニトロン残基、ヒドロキシルアミン残基、ニトリル残基、ヒドラジン残基、ケトン残基、ボロン酸残基、シアノベンゾチアゾール残基、アリル残基、ホスフィン残基、マレイミド残基、ジスルフィド残基、チオエステル残基、α―ハロカルボニル残基（例、α位にフッ素原子、塩素原子、臭素原子またはヨウ素原子を有するカルボニル残基。以下同様）、イソニトリル残基、シドノン残基、セレン残基が挙げられる。抗体は、遊離のチオールを含み得ないタンパク質であり得る。遊離のチオールを含み得ないタンパク質においては、チオールが生体直交性官能基として機能する。したがって、親和性物質の標的が抗体である場合、生体直交性官能基にはチオールが含まれる。チオール残基は、未保護のチオール残基（すなわち、−ＳＨ）であっても、保護されたチオール残基であってもよい。保護されたチオール残基におけるチオール残基の保護基としては、例えば、炭化水素基〔例、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、アリール基（例、フェニル基、ナフチル基）、アリールアルキル（アラルキル）基〕、アシル基（例、アセチル基、プロポキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基等のブトキシカルボニル基、ベンゾイル基）、アリールアルキルオキシカルボニル基（例、フルオレニルメトキシカルボニル基）、アリールオキシカルボニル基、アリールアルキル（アラルキル）オキシカルボニル基（例、ベンジルオキシカルボニル基）、アルキルチオール基（ｔ−ブチルチオ基)、アリールチオール基（例、ピリジルジチオ基）が挙げられる。あるいは、保護されたチオール残基は、ジスルフィド残基であってもよい。アリールアルキル（アラルキル）基、およびアリールアルキル（アラルキル）オキシカルボニル基におけるアリールアルキルは、１個または複数個（例えば、２個、３個、４個、５個）のアリールがアルキルに結合したものである。チオール残基の保護基の炭素原子数は、例えば１〜３０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１５個、さらにより好ましくは１〜１０個、特に好ましくは１〜６個である。本発明では、式（Ｉ）で表される化合物において、１種または２種以上（例、２種、３種、４種）の生体直交性官能基が含まれていてもよいが、好ましくは、１種の生体直交性官能基が含まれていてもよい。
より具体的には、生体直交性官能基は、下記からなる群より選ばれるいずれか一つの化学構造に対応していてもよい。
Figure 2019240288
 〔式中、
Ｒ１ｆ、単一もしくは複数のＲ１ｇおよび単一もしくは複数のＲ１ｈは、同一もしくは異なって、（ａ）〜（ｇ）からなる群より選ばれる原子もしくは基、または電子吸引基であり、
・は、結合手である。）
（ａ）〜（ｇ）からなる群より選ばれる原子もしくは基としては、下記が挙げられる：
（ａ）水素原子、またはハロゲン原子；
（ｂ）１価の炭化水素基；
（ｃ）アラルキル；
（ｄ）１価の複素環基；
（ｅ）Ｒａ−Ｏ−、Ｒａ−Ｃ（＝Ｏ）−、Ｒａ−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−、もしくはＲａ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−（Ｒａは、水素原子、もしくは１価の炭化水素基を示す。）；または
（ｆ）ＮＲｂＲｃ−、ＮＲｂＲｃ−Ｃ（＝Ｏ）−、ＮＲｂＲｃ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−、もしくはＲｂ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲｃ−（ＲｂおよびＲｃは、同一もしくは異なって、水素原子、もしくは１価の炭化水素基を示す。）；
（ｇ）ニトロ基、硫酸基、スルホン酸基、シアノ基、もしくはカルボキシル基
からなる群より選ばれる基。
（ａ）〜（ｇ）におけるハロゲン原子、１価の炭化水素基、アラルキル、１価の複素環基、およびＲａ〜Ｒｃにおける１価の炭化水素基の定義、例および好ましい例は、上記（ｉ）〜（ｖｉｉ）におけるものと同じである。特に好ましくは、（ａ）〜（ｇ）からなる群より選ばれる原子もしくは基は、（ａ）または（ｂ）の原子もしくは基である。
好ましくは、生体直交性官能基は、反応効率の向上等の観点より、上述の生体直交性官能基のなかでも、アジド残基、チオール残基、アルキン残基、マレイミド残基、およびジスルフィド残基からなる群より選ばれる基であってもよい。
電子吸引基としては、例えば、上述したものが挙げられるが、ハロゲン原子、ボロン酸残基、メシル、トシル、トリフレートが好ましい。
１−６．式（Ｉ）で表される化合物の好ましい構造
好ましい実施形態では、式（Ｉ）で表される化合物は、下記式（Ｉ−１）：
Ａ−Ｌ１−Ｌ２−Ｅ１−Ｅ２−Ｅ３−Ｂ （Ｉ−１）
〔式中、
ＡおよびＢは、式（Ｉ）のものと同じであり、
Ｌ１は、結合または２価の基であり、
Ｌ２は、脱離基であり、
Ｅ１は、（ｉ）脱離基と連結しており、かつ（ｉｉ）抗体中の求核基と反応する能力を有する求電子基であり、
Ｅ２は、（ａ）−Ｘ−Ｙ−〔ここで、Ｅ１と結合するＸは、Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）（ここで、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して、水素原子または炭素原子数１〜６のアルキルである。）、Ｎ（Ｒ３）（ここで、Ｒ３は、水素原子または炭素原子数１〜６のアルキルである。）、Ｏ、Ｓ、またはＳｅであり、Ｅ３と結合するＹは、Ｃ（Ｒ４）（Ｒ５）（ここで、Ｒ４およびＲ５はそれぞれ独立して、水素原子または炭素原子数１〜６のアルキルである。）である。〕、あるいは（ｂ）下記式（ｉ）：
Figure 2019240288
 （ここで、環Ｚは、Ｅ１と結合する環構成原子Ｘ’およびその両隣の環構成原子の全てが炭素原子である２価の環基であるか、またはＥ１と結合する環構成原子Ｘ’が窒素原子であり、かつ窒素原子の両隣の環構成原子が炭素原子である２価の複素環基である。・は結合手である。）で表される基であり、
Ｅ３は、Ｅ２が−Ｘ−Ｙ−の場合には２価の基であり、Ｅ２が式（ｉ）で表される基の場合には結合または２価の基であり、
脱離基は、上記求核基と上記求電子基との間の反応によりＥ１から切断されて脱離する能力を有する。〕で表される化合物であってもよい。
式（Ｉ−１）において、Ｌ２で表される脱離基は、好ましくは、上記（ａ）〜（ｃ）のいずれかである。Ｌ２で表される脱離基の例および好ましい例もまた、上記（ａ）〜（ｃ）で述べたものと同じである。
好ましい特定の実施形態では、式（Ｉ−１）で表される化合物は、下記式（Ｉ−２）：
Ａ−Ｌ１−Ｌ２−Ｅ１−Ｘ−Ｙ−Ｅ３−Ｂ （Ｉ−２）
〔式中、
Ａ、Ｌ１、Ｘ、Ｙ、およびＢは、式（Ｉ−１）のものと同じであり、
Ｌ２は、
（ａ）環Ｐ−Ｑ−〔ここで、環Ｐが、電子吸引性基で置換されていてもよいアリーレン、電子吸引性基で置換されていてもよいヘテロアリーレン、縮環していてもよい２，５-ジケトピロリジン、縮環していてもよい２，６−ジケトピペリジン、縮環していてもよい２-ケトピロリジン、縮環していてもよい２−ケトピペリジン、２−ピリドンからなる群より選ばれる基であり、Ｑが、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓｅ−、−ＳＯ２−Ｏ−、−ＳＯ２−Ｎ（Ｒ）−、−ＳＯ２−、−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｎ（ＯＲ）−、−Ｎ（Ｒ）−、および−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−からなる群より選ばれる基（ここで、Ｒは、水素原子または炭素原子数１〜６のアルキルである。）である。〕、
（ｂ）ヘテロアリーレン、あるいは
（ｃ）−Ｑ−〔ここで、Ｑが、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓｅ−、−ＳＯ２−Ｏ−、−ＳＯ２−Ｎ（Ｒ）−、−ＳＯ２−、−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｎ（ＯＲ）−、−Ｎ（Ｒ）−、および−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−からなる群より選ばれる基（ここで、Ｒは、水素原子または炭素原子数１〜６のアルキルである。）である。〕であり、
Ｅ１は、−Ｃ（＝Ｏ）−、−ＳＯ２−、および−ＣＨ２−からなる群より選ばれる基であり、
Ｅ３は、２価の基である。〕で表される化合物であってもよい。
好ましい別の特定の実施形態では、式（Ｉ−１）で表される化合物は、下記式（Ｉ−３）：
Figure 2019240288
 〔式中、
Ａ、Ｌ１、環Ｚ、環構成原子Ｘ’、およびＢは、前記式（Ｉ−１）のものと同じであり、
Ｌ２は、
（ａ）環Ｐ−Ｑ−〔ここで、環Ｐが、電子吸引性基で置換されていてもよいアリーレン、電子吸引性基で置換されていてもよいヘテロアリーレン、縮環していてもよい２，５-ジケトピロリジン、縮環していてもよい２，６−ジケトピペリジン、縮環していてもよい２-ケトピロリジン、縮環していてもよい２−ケトピペリジン、２−ピリドンからなる群より選ばれる基であり、Ｑが、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓｅ−、−ＳＯ２−Ｏ−、−ＳＯ２−Ｎ（Ｒ）−、−ＳＯ２−、−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｎ（ＯＲ）−、−Ｎ（Ｒ）−、および−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−からなる群より選ばれる基（ここで、Ｒは、水素原子または炭素原子数１〜６のアルキルである。）である。〕、
（ｂ）ヘテロアリーレン、あるいは
（ｃ）−Ｑ−〔ここで、Ｑが、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓｅ−、−ＳＯ２−Ｏ−、−ＳＯ２−Ｎ（Ｒ）−、−ＳＯ２−、−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｎ（ＯＲ）−、−Ｎ（Ｒ）−、および−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−からなる群より選ばれる基（ここで、Ｒは、水素原子または炭素原子数１〜６のアルキルである。）である。〕であり、
Ｅ１は、−Ｃ（＝Ｏ）−、−ＳＯ２−、および−ＣＨ２−からなる群より選ばれる基であり、
Ｅ３は、結合または２価の基である。〕で表される化合物であってもよい。
好ましくは、式（Ｉ−３）で表される化合物は、下記式（Ｉ−４）：
Figure 2019240288
 〔式中、
Ａ、Ｌ１、およびＢは、前記式（Ｉ−１）のものと同じであり、
Ｌ２は、（ａ）環Ｐ−Ｑ−〔ここで、環Ｐが、電子吸引性基で置換されていてもよいアリーレン、電子吸引性基で置換されていてもよいヘテロアリーレン、縮環していてもよい２，５-ジケトピロリジン、縮環していてもよい２，６−ジケトピペリジン、縮環していてもよい２-ケトピロリジン、縮環していてもよい２−ケトピペリジン、２−ピリドンからなる群より選ばれる基であり、Ｑが、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓｅ−、−ＳＯ２−Ｏ−、−ＳＯ２−Ｎ（Ｒ）−、−ＳＯ２−、−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｎ（ＯＲ）−、−Ｎ（Ｒ）−、および−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−からなる群より選ばれる基（ここで、Ｒは、水素原子または炭素原子数１〜６のアルキルである。）である。〕、
（ｂ）ヘテロアリーレン、あるいは
（ｃ）−Ｑ−〔ここで、Ｑが、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓｅ−、−ＳＯ２−Ｏ−、−ＳＯ２−Ｎ（Ｒ）−、−ＳＯ２−、−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｎ（ＯＲ）−、−Ｎ（Ｒ）−、および−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−からなる群より選ばれる基（ここで、Ｒは、水素原子または炭素原子数１〜６のアルキルである。）である。〕であり、
Ｅ１は、−Ｃ（＝Ｏ）−、−ＳＯ２−、および−ＣＨ２−からなる群より選ばれる基であり、
環Ｚは、Ｅ１と結合する環構成原子およびその両隣の環構成原子の全てが炭素原子である２価の環基である。）で表される基であり、
Ｅ３は、結合または２価の基である。〕で表される化合物であってもよい。
上記式（Ｉ−１）〜（Ｉ−４）で表される化合物において、Ａ、Ｌ１、Ｌ２、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、およびＢ、ならびに−Ｘ−Ｙ−、Ｒ１〜Ｒ５における炭素原子数１〜６のアルキル、式（ｉ）で表される基（例、２価の環基、２価の複素環基）の定義、例および好ましい例は、上述したものと同じである。また、Ｌ２である（ａ）〜（ｃ）、ならびに環Ｚ（例、Ｅ１と結合する環構成原子Ｘ’およびその両隣の環構成原子の全てが炭素原子である２価の環基、またはＥ１と結合する環構成原子Ｘ’が窒素原子であり、かつ窒素原子の両隣の環構成原子が炭素原子である２価の複素環基）、環Ｐ、およびＱ（例、Ｒにおける炭素原子数１〜６のアルキル）などの基の定義、例および好ましい例もまた、上述したものと同じである。
１−７．製造方法
抗体に対する親和性物質、および生体直交性官能基を有する化合物またはその塩は、適宜調製することができる。抗体に対する親和性物質、および生体直交性官能基を有する化合物またはその塩は、式（Ｉ）、好ましくは式（Ｉ−１）、より好ましくは式（Ｉ−２）、（Ｉ−３）または（Ｉ−４）で表される。
抗体に対する親和性物質（Ａ）としては、任意の官能基を有するものを適宜選択することができる。したがって、当該官能基と反応することができる反応性基を利用することにより、親和性物質を、Ｌ−Ｅ−Ｂで表される構造単位と反応させて、Ａ−Ｌ−Ｅ−Ｂで表される構造単位を調製することができる。例えば、このような反応は、適切な反応系、例えば有機溶媒系または水溶液系において、適温（例、約１５〜２００℃）で行うことができる。反応系は、適切な触媒を含んでいてもよい。反応時間は、例えば１分〜２０時間、好ましくは１０分〜１５時間、より好ましくは２０分〜１０時間、さらにより好ましくは３０分〜８時間である。
反応系において、親和性物質（Ｘ）に対する、Ｌ−Ｅ−Ｂで表される構造単位（Ｙ）のモル比率（Ｙ／Ｘ）は、当該構造単位および親和性物質の種類、当該構造単位によって修飾されるべき親和性物質中の部位の数等に応じて変動することから特に限定されないが、例えば０．１〜５０であり、好ましくは０．５〜４０であり、より好ましくは１〜３５であり、さらにより好ましくは２〜２５であり、特に好ましくは３〜１５である。
抗体に対する親和性物質、および生体直交性官能基を有する化合物またはその塩の生成の確認は、その具体的な原料および生成物の分子量にもよるが、例えば、電気泳動法、クロマトグラフィー（例、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相カラムクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ）、または質量分析により、好ましくは、質量分析により行うことができる。抗体に対する親和性物質、および生体直交性官能基を有する化合物またはその塩は、クロマトグラフィー（例、上述したクロマトグラフィー、およびアフィニティークロマトグラフィー）等の任意の方法により適宜精製することができる。
１−８．その他
後述の発明〔例、式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）およびその下位概念の式、ならびに部分構造式で表される発明〕では、任意の記号（例、Ａ、Ｌ、Ｅ、Ｂ）、および当該記号に関連して表される用語の詳細（例えば、定義、例および好ましい例）は、上記式（Ｉ）またはその下位概念の式で表される化合物またはその塩の発明と共通する。また、後述の発明を規定することができる特定の基（例、生体直交性官能基、２価の基、置換基）、および特定の数値等の任意の技術要素（例、定義、例および好ましい例）についても、上記で説明したものと共通にすることができる。したがって、これらの事項は、特に言及することなく、後述の発明において適宜援用することができる。同様に、後述の発明で述べた特定の発明の技術要素は、本発明および他の発明の技術要素として、適宜援用することができる。
２．生体直交性官能基を有する抗体の製造方法
本発明は、以下を含む、生体直交性官能基を有する抗体またはその塩の製造方法を提供する。
（１）下記式（Ｉ）：
Ａ−Ｌ−Ｅ−Ｂ （Ｉ）
〔式中、
Ａは、抗体に対する親和性物質であり、
Ｌは、脱離基を含む２価の基であり、
Ｅは、（ｉ）脱離基と連結しており、かつ（ｉｉ）抗体中の求核基と反応する能力を有する求電子基を含む２価の基であり、
Ｂは、生体直交性官能基であり、
脱離基は、上記求核基と上記求電子基との間の反応によりＥから切断されて脱離する能力を有する。〕で表される、抗体に対する親和性物質、および生体直交性官能基を有する化合物またはその塩を、抗体と反応させて、
下記式（ＩＩ）：
Ａｂ−Ｅ−Ｂ （ＩＩ）
〔式中、
ＥおよびＢは、式（Ｉ）のものと同じであり、
Ａｂは、抗体である。〕で表される、生体直交性官能基を有する抗体またはその塩を生成すること。
生体直交性官能基を有する抗体の製造方法で用いられる抗体は、上述の抗体と同じである。好ましくは、抗体は、モノクローナル抗体である。モノクローナル抗体のアイソタイプとしては、例えば、ＩｇＧ（例、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、およびＩｇＹが挙げられる。モノクローナル抗体は、全長抗体、または抗体断片（例、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、単鎖抗体）であるが、全長抗体が好ましい。特に好ましくは、抗体は、ヒトＩｇＧ（例、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）を定常領域に有するヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体である。
式（ＩＩ）におけるＡｂは、上述の抗体と同じであり、Ｅにおける求電子基と共有結合している。Ｅにおける求電子基との共有結合に供される抗体中の求核基としては、例えば、リジン残基の側鎖におけるＮＨ２、チロシン残基の側鎖におけるＯＨ、セリン残基の側鎖におけるＯＨ、スレオニン残基の側鎖におけるＯＨ、およびシステイン残基の側鎖におけるＳＨが挙げられる。
式（ＩＩ）におけるＥは、上記式（Ｉ）におけるＥと同じである。Ｅは、Ｅ１−Ｅ２−Ｅ３で表されることができる。Ｅ１、Ｅ２、およびＥ３は、上述のものと同じである。上述のとおり、ＥおよびＥ１−Ｅ２−Ｅ３は、潜在的な免疫原性を有し、また血中で加水分解され易いという問題を抱えるペプチド部分を含まないように設計できる。この場合、式（ＩＩ）で表される生体直交性官能基を有する抗体は、かかる問題を抱えない、機能性物質を有する抗体の調製に使用することができる。
Ｅにおける求電子基およびＥ１の求電子基は、抗体中の求核基と共有結合している。抗体中の求核基と共有結合している求電子基としては、例えば、ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−、ＮＨ−ＳＯ２−、およびＮＨ−ＣＨ２−（Ｅとの共有結合に供される抗体中の求核基がリジン残基の側鎖におけるＮＨ２である場合）、Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−、Ｏ−ＳＯ２−、およびＯ−ＣＨ２−（Ｅとの共有結合に供される抗体中の求核基が、チロシン残基、セリン残基、またはスレオニン残基の側鎖におけるＯＨである場合）、Ｓ−Ｃ（＝Ｏ）−、およびＳ−ＣＨ２−（Ｅとの共有結合に供される抗体中の求核基が、システイン残基の側鎖におけるＳＨである場合）が挙げられる。抗体中の求核基と共有結合している求電子基としては、ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−およびＮＨ−ＳＯ２−（Ｅとの共有結合に供される抗体中の求核基がリジン残基の側鎖におけるＮＨ２である場合）、Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−およびＯ−ＳＯ２−（Ｅとの共有結合に供される抗体中の求核基が、チロシン残基の側鎖におけるＯＨである場合）が好ましく、ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−およびＮＨ−ＳＯ２−（Ｅとの共有結合に供される抗体中の求核基がリジン残基の側鎖におけるＮＨ２である場合）がより好ましく、ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−（Ｅとの共有結合に供される抗体中の求核基がリジン残基の側鎖におけるＮＨ２である場合）がさらにより好ましい。
式（ＩＩ）におけるＢは、上記式（Ｉ）におけるＢと同じである。
好ましくは、本発明の製造方法で製造される生体直交性官能基を有する抗体は、生体直交性官能基を位置選択的に有する抗体である。抗体に対する親和性物質、および生体直交性官能基を有する化合物またはその塩が、式（Ｉ）で表されるものである場合、式（ＩＩ）で表される、生体直交性官能基を位置選択的に有する抗体を製造することができる。生体直交性官能基を位置選択的に有する抗体は、好ましくは、定常領域のみに生体直交性官能基を有する抗体であり、より好ましくは、Ｆｃ領域のみに生体直交性官能基を有する抗体である。
本明細書において、「位置選択的」または「位置選択性」とは、抗体において特定のアミノ酸残基が特定の領域に偏在していないにもかかわらず、抗体中の特定のアミノ酸残基と結合できる所定の構造単位が、抗体中の特定の領域に偏在することをいう。したがって、「位置選択的に有する」、「位置選択的な結合」、「位置選択性での結合」等の位置選択性に関連する表現は、１個以上の特定のアミノ酸残基を含む標的領域における所定の構造単位の結合率または保有率が、標的領域における当該特定のアミノ酸残基と同種である複数個のアミノ酸残基を含む非標的領域における当該構造単位の保有率または結合率よりも有意なレベルで高いことを意味する。このような位置選択的な結合または保有は、抗体中の特定のアミノ酸残基に対して所定の構造単位をランダムに反応させるのではなく、抗体に対する親和性物質を含む化合物を用いることにより、抗体中の標的領域における特定のアミノ酸残基に対して所定の構造単位を優先的に反応させることができる本発明により達成することができる。
より具体的には、抗体（Ａｂ）が、連続する１〜５０個のアミノ酸残基からなる標的領域〔例、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域における２４６〜２４８位のアミノ酸残基からなる領域、（ｂ）ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域における２８８〜２９０位のアミノ酸残基からなる領域、または（ｃ）ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域における３１７位のアミノ酸残基からなる領域〕中において特定のアミノ酸残基（例、リジン残基、チロシン残基、スレオニン残基、セリン残基、システイン残基）を１個以上含み、かつ、前記標的領域以外の非標的領域中において前記特定のアミノ酸残基を５個以上含む場合、抗体以外の部分構造は、当該標的領域中に含まれる１個以上の特定のアミノ酸残基に対して３０％以上の位置選択性で結合させることができる。位置選択性は、好ましくは４０％以上、より好ましくは５０％以上、さらにより好ましくは６０％以上、特に好ましくは７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％であってもよい。
本発明の製造方法で製造される生体直交性官能基を有する抗体はまた、重鎖の数に応じて、生体直交性官能基（すなわち、Ｅ−Ｂで表わされる構造単位）を有することができる。生体直交性官能基を位置選択的に有する抗体は、先ず、式（Ｉ）で表される化合物（Ａ−Ｌ−Ｅ−Ｂ）を、抗体に対する親和性物質（Ａ）を介して抗体重鎖の定常領域に会合させ、次いで、Ｅにおける求電子基を、会合部位の近傍（上記抗体重鎖と同一重鎖の定常領域）における特定のアミノ酸残基の側鎖中の求核基と反応させることにより、製造することができる。したがって、抗体重鎖を複数（例えば１〜８個、好ましくは１〜４個、より好ましくは２個）有する抗体を本発明の製造方法において用いることで、複数の抗体重鎖の同じ標的領域においてＥ−Ｂで表われる複数の構造単位（またはその下位概念の複数の構造単位）を位置選択的に有する抗体を製造することができる。例えば、抗体重鎖を２つ有する抗体（例、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、Ｆ（ａｂ‘）２抗体、Ｆｃ領域タンパク質、Ｆｃ融合タンパク質）を本発明の製造方法において用いることで、２つの抗体重鎖の同じ標的領域においてＥ−Ｂで表われる２つの構造単位を位置選択的に有する抗体を製造することができる。すなわち、生体直交性官能基を有する抗体において、生体直交性官能基による修飾様式を複数（例、２つ）の重鎖間で同一にすることができる。
生体直交性官能基を有する抗体はまた、１つの抗体重鎖の複数（例えば２〜５個、好ましくは２〜４個、より好ましくは２または３個）の標的領域において、同種または異種の生体直交性官能基（例えば、Ｅ−Ｂで表わされる構造単位）を有することができる。この場合、生体直交性官能基を有する抗体において、生体直交性官能基による修飾様式を複数（例、２つ）の重鎖間で同一にすることができる。
本発明の製造方法はまた、生成した抗体を、特定の処理に付すことにより、生体直交性官能基を有し、かつさらに修飾された抗体を生成することを含んでいてもよい。このような特定の処理としては、例えば、抗体の断片化処理（例、パパイン、ペプシン等の特定のプロテアーゼによる処理）が挙げられる。
本発明の製造方法において式（Ｉ）で表される化合物またはその塩を用いる場合、上記式（ＩＩ）で表される生体直交性官能基を有する抗体を製造することができる。
好ましい実施形態では、本発明の製造方法において式（Ｉ）で表される化合物として式（Ｉ−１）で表されるものを用いる場合、下記式（ＩＩ−１）で表される生体直交性官能基を有する抗体を製造することができる。
Ａｂ−Ｅ１−Ｅ２−Ｅ３−Ｂ （ＩＩ−１）
〔式中、
Ａｂは、抗体であり、
Ｅ１は、抗体中の求核基と連結している求電子基であり、
Ｅ２は、（ａ）−Ｘ−Ｙ−〔ここで、Ｅ１と結合するＸは、Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）（ここで、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して、水素原子または炭素原子数１〜６のアルキルである。）、Ｎ（Ｒ３）（ここで、Ｒ３は、水素原子または炭素原子数１〜６のアルキルである。）、Ｏ、Ｓ、またはＳｅであり、Ｅ３と結合するＹは、Ｃ（Ｒ４）（Ｒ５）（ここで、Ｒ４およびＲ５はそれぞれ独立して、水素原子または炭素原子数１〜６のアルキルである。）である。〕、あるいは（ｂ）下記式（ｉ）：
Figure 2019240288
 （ここで、環Ｚは、Ｅ１と結合する環構成原子Ｘ’およびその両隣の環構成原子の全てが炭素原子である２価の環基であるか、またはＥ１と結合する環構成原子Ｘ’が窒素原子であり、かつ窒素原子の両隣の環構成原子が炭素原子である２価の複素環基である。・は結合手である。）で表される基であり、
Ｅ３は、Ｅ２が−Ｘ−Ｙ−の場合には２価の基であり、Ｅ２が式（ｉ）で表される基の場合には結合または２価の基であり、
Ｂは、生体直交性官能基である。〕
好ましい特定の実施形態では、本発明の製造方法において式（Ｉ−１）で表される化合物として式（Ｉ−２）で表されるものを用いる場合、下記式（ＩＩ−２）で表される生体直交性官能基を有する抗体を製造することができる。
Ａｂ−Ｅ１−Ｘ−Ｙ−Ｅ３−Ｂ （ＩＩ−２）
〔式中、
Ａｂ、Ｘ、Ｙ、およびＢは、式（ＩＩ−１）のものと同じであり、
Ｅ１は、−Ｃ（＝Ｏ）−、−ＳＯ２−、および−ＣＨ２−からなる群より選ばれる基であり、
Ｅ３は、２価の基である。〕
好ましい別の特定の実施形態では、本発明の製造方法において式（Ｉ−１）で表される化合物として式（Ｉ−３）で表されるものを用いる場合、下記式（ＩＩ−３）で表される生体直交性官能基を有する抗体を製造することができる。
Figure 2019240288
 〔式中、
Ａｂ、環構成原子Ｘ’、環Ｚ、およびＢは、式（ＩＩ−１）のものと同じであり、
Ｅ１は、−Ｃ（＝Ｏ）−、−ＳＯ２−、および−ＣＨ２−からなる群より選ばれる基であり、
Ｅ３は、結合または２価の基である。〕
好ましくは、本発明の製造方法において式（Ｉ−３）で表される化合物として式（Ｉ−４）で表されるものを用いる場合、下記式（ＩＩ−４）で表される生体直交性官能基を有する抗体を製造することができる。
Figure 2019240288
 〔式中、
Ａｂ、環Ｚ、およびＢは、式（ＩＩ−１）のものと同じであり、
Ｅ１は、−Ｃ（＝Ｏ）−、−ＳＯ２−、および−ＣＨ２−からなる群より選ばれる基であり、
Ｅ３は、結合または２価の基である。〕
式（ＩＩ）、（ＩＩ−１）、（ＩＩ−２）、（ＩＩ−３）または（ＩＩ−４）における任意の記号（例、Ｅ、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｂ）、および当該記号に関連して表される用語（例、抗体、求電子基、生体直交性官能基）の詳細（例えば、定義、例および好ましい例）は、上記式（Ｉ）またはその下位概念の式のものと共通する。
抗体に対する親和性物質、および生体直交性官能基を有する化合物またはその塩は、Ｅにおける求電子基またはＥ１の求電子基を有するため、抗体と反応することができる。このような反応は、タンパク質の変性・分解（例、アミド結合の切断）を引き起こし得ない条件（温和な条件）下で適宜行うことができる。例えば、このような反応は、適切な反応系、例えば緩衝液中において、室温（例、約１５〜３０℃）で行うことができる。緩衝液のｐＨは、例えば５〜９であり、好ましくは５．５〜８．５であり、より好ましくは６．０〜８．０である。緩衝液は、適切な触媒を含んでいてもよい。反応時間は、例えば１分〜２０時間、好ましくは１０分〜１５時間、より好ましくは２０分〜１０時間、さらにより好ましくは３０分〜８時間である。このような反応の詳細については、例えば、Ｇ．Ｊ．Ｌ．Ｂｅｒｎａｒｄｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．，１１５，２１７４（２０１５）；Ｇ．Ｊ．Ｌ．Ｂｅｒｎａｒｄｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ａｓｉａｎ．Ｊ．，４，６３０（２００９）；Ｂ．Ｇ．Ｄａｖｉｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．，５，４７４０（２０１４）；Ａ．Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ．Ｃｈｅｍ．，２５，８２５（２０１４）を参照のこと。
反応系において、抗体（Ｘ）に対する、抗体に対する親和性物質、および生体直交性官能基を有する化合物またはその塩（Ｙ）のモル比率（Ｙ／Ｘ）は、抗体に対する親和性物質、および生体直交性官能基を有する化合物またはその塩および抗体の種類、抗体に対する親和性物質、および生体直交性官能基を有する化合物またはその塩によって修飾されるべき抗体中の部位の数（例、ＤＡＲ）等に応じて変動することから特に限定されないが、例えば０．１〜１００であり、好ましくは０．５〜８０であり、より好ましくは１〜７０であり、さらにより好ましくは２〜５０であり、特に好ましくは３〜３０である。
生体直交性官能基を有する抗体の生成の確認は、その具体的な原料および生成物の分子量にもよるが、例えば、電気泳動法、クロマトグラフィー（例、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相カラムクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ）、または質量分析により、好ましくは、質量分析により行うことができる。位置選択性の確認は、例えば、ペプチドマッピングにより行うことができる。ペプチドマッピングは、例えば、プロテアーゼ（例、トリプシン、キモトリプシン、）処理および質量分析により行うことができる。プロテアーゼとしては、エンドプロテアーゼが好ましい。このようなエンドプロテアーゼとしては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、Ｇｌｕ−Ｃ、Ｌｙｓ−Ｎ、Ｌｙｓ−Ｃ、Ａｓｐ−Ｎが挙げられる。生体直交性官能基を有する抗体が保有する、生体直交性官能基の個数の確認は、例えば、電気泳動法、クロマトグラフィー、または質量分析により、好ましくは、質量分析により行うことができる。生体直交性官能基を有する抗体は、クロマトグラフィー（例、上述したクロマトグラフィー、およびアフィニティークロマトグラフィー）等の任意の方法により適宜精製することができる。
３．抗体に対する親和性物質、および生体直交性官能基を有する化合物またはその塩を用いる、機能性物質を有する抗体の製造方法
本発明は、以下を含む、機能性物質を有する抗体またはその塩の製造方法を提供する。
（１）下記式（Ｉ）：
Ａ−Ｌ−Ｅ−Ｂ （Ｉ）
〔式中、
Ａは、抗体に対する親和性物質であり、
Ｌは、脱離基を含む２価の基であり、
Ｅは、（ｉ）脱離基と連結しており、かつ（ｉｉ）抗体中の求核基と反応する能力を有する求電子基を含む２価の基であり、
Ｂは、生体直交性官能基であり、
脱離基は、上記求核基と上記求電子基との間の反応によりＥから切断されて脱離する能力を有する。〕で表される、抗体に対する親和性物質、および生体直交性官能基を有する化合物またはその塩を、抗体と反応させて、
下記式（ＩＩ）：
Ａｂ−Ｅ−Ｂ （ＩＩ）
〔式中、
ＥおよびＢは、前記式（Ｉ）のものと同じであり、
Ａｂは、抗体である。〕で表される、生体直交性官能基を有する抗体またはその塩を生成すること；ならびに
（２）前記式（ＩＩ）で表される、生体直交性官能基を有する抗体またはその塩を、生体直交性官能基を介して機能性物質と反応させて、
下記式（ＩＩＩ）：
Ａｂ−Ｅ−Ｂ’−Ｆ （ＩＩＩ）
〔式中、
Ａｂは、式（ＩＩ）のものと同じであり、
Ｅは、式（Ｉ）のものと同じであり、
Ｂ’は、機能性物質と生体直交性官能基との間の反応により生成する部分を含む２価の基であり、
Ｆは、機能性物質である。〕で表される、機能性物質を有する抗体またはその塩を生成すること。
（１）の工程は、生体直交性官能基を有する抗体の製造方法と同様にして行うことができる。
（２）の工程で用いられる機能性物質（Ｆ）は、抗体に任意の機能を付与する物質である限り特に限定されず、例えば、薬物、標識物質、安定化剤が挙げられるが、好ましくは薬物または標識物質である。機能性物質はまた、単一の機能性物質であってもよく、または２以上の機能性物質が連結された物質であってもよい。
薬物としては、任意の疾患に対する薬物であってもよい。このような疾患としては、例えば、癌（例、肺癌、胃癌、大腸癌、膵臓癌、腎臓癌、肝臓癌、甲状腺癌、前立腺癌、膀胱癌、卵巣癌、子宮癌、骨癌、皮膚癌、脳腫瘍、黒色腫）、自己免疫疾患・炎症性疾患（例、アレルギー疾患、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス）、脳神経疾患（例、脳梗塞、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症）、感染症（例、細菌感染症、ウイルス感染症）、遺伝性・希少疾患（例、遺伝性球状赤血球症、非ジストロフィー筋緊張症）、眼疾患（例、加齢黄斑変性症、糖尿病網膜症、網膜色素変性症）、骨・整形外科領域の疾患（例、変形性関節症）、血液疾患（例、白血病、紫斑病）、その他の疾患（例、糖尿病、高脂血症等の代謝異常症、肝臓疾患、腎疾患、肺疾患、循環器系疾患、消化器官系疾患）が挙げられる。薬物は、所定の疾患を治療または予防する薬物、または所定の疾患の標的タンパク質に対する抗体の使用に伴う副作用を緩和する薬物であってもよい。
より具体的には、薬物は、抗癌剤である。抗癌剤としては、例えば、化学療法剤、毒素、放射性同位体またはそれを含む物質が挙げられる。化学療法剤としては、例えば、ＤＮＡ損傷剤、代謝拮抗薬、酵素阻害剤、ＤＮＡインターカレート剤、ＤＮＡ切断剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ＤＮＡ結合阻害剤、チューブリン結合阻害剤、細胞傷害性ヌクレオシド、白金化合物が挙げられる。毒素としては、例えば、細菌毒素（例、ジフテリア毒素）、植物毒素（例、リシン）が挙げられる。放射性同位体としては、例えば、水素原子の放射性同位体（例、３Ｈ）、炭素原子の放射性同位体（例、１４Ｃ）、リン原子の放射性同位体（例、３２Ｐ）、硫黄原子の放射性同位体（例、３５Ｓ）、イットリウムの放射性同位体（例、９０Ｙ）、テクネチウムの放射性同位体（例、９９ｍＴｃ）、インジウムの放射性同位体（例、１１１Ｉｎ）、ヨウ素原子の放射性同位体（例、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１２９Ｉ、１３１Ｉ)、サマリウムの放射性同位体（例、１５３Ｓｍ）、レニウムの放射性同位体（例、１８６Ｒｅ）、アスタチンの放射性同位体（例、２１１Ａｔ）、ビスマスの放射性同位体（例、２１２Ｂｉ）が挙げられる。
標識物質としては、例えば、酵素（例、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、βガラクトシダーゼ）、親和性物質（例、ストレプトアビジン、ビオチン、ジゴキシゲニン、アプタマー）、蛍光物質（例、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質）、発光物質（例、ルシフェリン、エクオリン、アクリジニウムエステル、トリス（２，２’−ビピリジル）ルテニウム、ルミノール）、放射性同位体（例、上述したもの）またはそれを含む物質が挙げられる。
機能性物質はまた、高分子化合物、中分子化合物、または低分子化合物であり、好ましくは、低分子化合物である。低分子化合物とは、分子量１５００以下の化合物をいう。低分子化合物は、天然化合物または合成化合物である。低分子化合物の分子量は、１２００以下、１０００以下、９００以下、８００以下、７００以下、６００以下、５００以下、４００以下、または３００以下であってもよい。低分子化合物の分子量はまた、３０以上、４０以上、または５０以上であってもよい。低分子化合物は、上述したような薬物または標識物質であってもよい。また、低分子化合物としては、例えば、アミノ酸、オリゴペプチド、ビタミン、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、単糖、オリゴ糖、脂質、脂肪酸、およびそれらの塩が挙げられる。
機能性物質は、その構造に応じた種々の官能基を有する。機能性物質が、生体直交性官能基と反応し易い官能基を有する場合、機能性物質の当該官能基と生体直交性官能基とを適宜反応させることができる。生体直交性官能基と反応し易い官能基は、生体直交性官能基の具体的な種類によっても異なり得る。当業者であれば、適切な官能基を、生体直交性官能基と反応し易い官能基として適宜選択することができる（例、Ｂｏｕｔｕｒｅｉｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｍ． Ｒｅｖ．，２０１５，１１５，２１７４−２１９５）。生体直交性官能基と反応し易い官能基としては、例えば、生体直交性官能基がアルキン残基の場合はアジド残基が挙げられ、生体直交性官能基がアルデヒド残基またはケトン残基の場合はヒドラジン残基が挙げられ、生体直交性官能基がチオール残基の場合はマレイミド残基およびジスルフィド残基が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、生体直交性官能基がアルキン残基であり、かつ生体直交性官能基と反応し易い官能基がアジド残基である場合（またはその逆である場合）、機能性物質と生体直交性官能基との間の反応により生成する部分を含む２価の基は、トリアゾール残基（他の環と縮合していても縮合していなくてもよい）を含む２価の基であってもよい；生体直交性官能基がアルデヒド残基またはケトン残基であり、かつ生体直交性官能基と反応し易い官能基がヒドラジン残基である場合（またはその逆である場合）、機能性物質と生体直交性官能基との間の反応により生成する部分を含む２価の基は、ヒドラゾン残基を含む２価の基であってもよい；生体直交性官能基がチオール残基であり、かつ生体直交性官能基と反応し易い官能基がマレイミド残基またはジスルフィド残基である場合（またはその逆である場合）、機能性物質と生体直交性官能基との間の反応により生成する部分を含む２価の基は、チオスクシンイミド残基を含む２価の基、またはジスルフィド残基を含む２価の基であってもよい（例、Ｂｏｕｔｕｒｅｉｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｍ． Ｒｅｖ．，２０１５，１１５，２１７４−２１９５）。トリアゾール残基（他の環と縮合していても縮合していなくてもよい）を含む２価の基、ヒドラゾン残基を含む２価の基、チオスクシンイミド残基を含む２価の基、またはジスルフィド残基を含む２価の基は、機能性物質と生体直交性官能基との間の反応により生成する部分を含む２価の基の好ましい例である。
一方、機能性物質が、生体直交性官能基と反応し易い官能基を有しない場合、機能性物質として、所望の官能基を有するように誘導体化されたものを使用することができる。例えば、機能性物質が可溶性タンパク質である場合、可溶性タンパク質が天然に有しない官能基を有するように誘導体化されたものを使用することができる。
誘導体化は、当該分野における技術常識である（例、国際公開第２００４／０１０９５７号、米国特許出願公開第２００６／００７４００８号明細書、米国特許出願公開第２００５／０２３８６４９号明細書）。例えば、誘導体化は、上述したような架橋剤を用いて行われてもよい。あるいは、誘導体化は、所望の官能基を有する特定のリンカーを用いて行われてもよい。例えば、このようなリンカーは、適切な環境（例、細胞内または細胞外）において機能性物質と抗体とをリンカーの切断により分離可能なものであってもよい。このようなリンカーとしては、例えば、特定のプロテアーゼ〔例、細胞内プロテアーゼ（例、リソソーム、またはエンドソーム中に存在するプロテアーゼ）、細胞外プロテアーゼ（例、分泌性プロテアーゼ）〕で分解されるペプチジルリンカー（例、米国特許第６，２１４，３４５号；Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ８３：６７−１２３（１９９９））、生体内に存在する局所酸性部位で切断され得るリンカー（例、米国特許第５，６２２，９２９号、同第５，１２２，３６８号；同第５，８２４，８０５号）が挙げられる。リンカーは、自壊的（ｓｅｌｆ−ｉｍｍｏｌａｔｉｖｅ）であってもよい（例、国際公開第０２／０８３１８０号、国際公開第０４／０４３４９３号、国際公開第０５／１１２９１９号）。本発明では、誘導体化された機能性物質も、単に「機能性物質」と呼称することができる。
式（ＩＩＩ）におけるＡｂは、上述の抗体と同じであり、Ｅにおける求電子基と共有結合している。Ｅにおける求電子基との共有結合に供される抗体中の求核基としては、例えば、リジン残基の側鎖におけるＮＨ２、チロシン残基の側鎖におけるＯＨ、セリン残基の側鎖におけるＯＨ、スレオニン残基の側鎖におけるＯＨ、およびシステイン残基の側鎖におけるＳＨが挙げられる。
式（ＩＩＩ）におけるＥは、上記式（Ｉ）におけるＥと同じである。Ｅは、Ｅ１−Ｅ２−Ｅ３で表されることができる。Ｅ１、Ｅ２、およびＥ３は、上述のものと同じである。上述のとおり、ＥおよびＥ１−Ｅ２−Ｅ３は、潜在的な免疫原性を有し、また血中で加水分解され易いという問題を抱えるペプチド部分を含まないように設計できる。この場合、式（ＩＩＩ）で表される機能性物質を有する抗体は、医薬として好適に使用することができる。
Ｅにおける求電子基およびＥ１の求電子基は、抗体中の求核基と共有結合している。抗体中の求核基と共有結合している求電子基としては、例えば、ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−、ＮＨ−ＳＯ２−、およびＮＨ−ＣＨ２−（Ｅとの共有結合に供される抗体中の求核基がリジン残基の側鎖におけるＮＨ２である場合）、Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−、Ｏ−ＳＯ２−、およびＯ−ＣＨ２−（Ｅとの共有結合に供される抗体中の求核基が、チロシン残基、セリン残基、またはスレオニン残基の側鎖におけるＯＨである場合）、Ｓ−Ｃ（＝Ｏ）−、およびＳ−ＣＨ２−（Ｅとの共有結合に供される抗体中の求核基が、システイン残基の側鎖におけるＳＨである場合）が挙げられる。抗体中の求核基と共有結合している求電子基としては、ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−およびＮＨ−ＳＯ２−（Ｅとの共有結合に供される抗体中の求核基がリジン残基の側鎖におけるＮＨ２である場合）、Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−およびＯ−ＳＯ２−（Ｅとの共有結合に供される抗体中の求核基が、チロシン残基の側鎖におけるＯＨである場合）が好ましく、ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−およびＮＨ−ＳＯ２−（Ｅとの共有結合に供される抗体中の求核基がリジン残基の側鎖におけるＮＨ２である場合）がより好ましく、ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−（Ｅとの共有結合に供される抗体中の求核基がリジン残基の側鎖におけるＮＨ２である場合）がさらにより好ましい。
特定の実施形態では、機能性物質が、生体直交性官能基と反応し易い官能基を有する場合、または、生体直交性官能基と反応し易い官能基を有するように誘導体化されている場合、生体直交性官能基と反応し易い官能基は、アジド残基、アルデヒド残基、チオール残基、アルキン残基、アルケン残基、ハロゲン残基、テトラジン残基、ニトロン残基、ヒドロキシルアミン残基、ニトリル残基、ヒドラジン残基、ケトン残基、ボロン酸残基、シアノベンゾチアゾール残基、アリル残基、ホスフィン残基、マレイミド残基、ジスルフィド残基、チオエステル残基、α―ハロカルボニル残基、イソニトリル残基、シドノン残基、セレン残基からなる群より選ばれる基であってもよい。
さらに特定の実施形態では、機能性物質が、生体直交性官能基と反応し易い官能基を有する場合、または、生体直交性官能基と反応し易い官能基を有するように誘導体化されている場合、前記生体直交性官能基と反応し易い官能基は、下記で表される基からなる群より選ばれる基であってもよい。
Figure 2019240288
 〔式中、
Ｒ１ｆ、単一もしくは複数のＲ１ｇおよび単一もしくは複数のＲ１ｈは、同一もしくは異なって、前記（ｉ）〜（ｖｉｉ）からなる群より選ばれる原子もしくは基、または電子吸引基であり、・は、機能性物質に対する結合手である。）
式（ＩＩＩ）におけるＢ’で表される、機能性物質と生体直交性官能基との間の反応により生成する部分を含む２価の基は、（１）上述の好ましい例において言及した残基である、トリアゾール残基、ヒドラゾン残基、またはチオスクシンイミド残基を含む２価の基であってもよく、あるいは、（２）特に限定されるわけではないが、例えば、ジスルフィド残基（この残基は、上述の好ましい例において言及した残基である）、アセタール残基、ケタール残基、エステル残基、カルバモイル残基、アルコキシアルキル残基、イミン残基、三級アルキルオキシカルバメート残基、シラン残基、ヒドラゾン含有残基、フォスフォルアミデート残基、アコニチル残基、トリチル残基、アゾ残基、ビシナルジオール残基、セレン残基、電子吸引基を有する芳香族環含有残基、クマリン含有残基、スルホン含有残基、不飽和結合含有鎖残基、グリコシル残基からなる群より選ばれる残基を含む２価の基であってもよい。
機能性物質と生体直交性官能基との間の反応により生成する部分を含む２価の基はまた、特に限定されるわけではないが、例えば、下記：
Figure 2019240288
 〔ここで、結合に直交する波線は、反応により生成する結合を示し、
複数のＲ２ａ、複数のＲ２ｂ、および複数のＲ２ｃは、同一または異なって、水素原子または上述の置換基であり、
Ｊは、−ＣＨ２−、−Ｏ−、または−Ｓ−であり、
ｒは、１〜４の任意の整数であり、
○（白丸）はＦ側の部分に対する結合を示し、●（黒丸）はＢ’側の部分に対する結合を示す。
化学構造が、切断性部分を中心にして非対称である場合、●がＢ’側の部分に対する結合を示し、○がＦ側の部分に対する結合を示していてもよい。〕からなる群より選ばれるいずれか一つの化学構造に対応する残基を含む２価の基であってもよい。
好ましくは、本発明の製造方法における工程（２）で製造される機能性物質を有する抗体は、機能性物質を位置選択的に有する抗体である。生体直交性官能基を位置選択的に有する抗体が、式（ＩＩ）で表されるものである場合、式（ＩＩＩ）で表される、機能性物質を位置選択的に有する抗体を製造することができる。機能性物質を位置選択的に有する抗体は、好ましくは、定常領域のみに機能性物質を有する抗体であり、より好ましくは、Ｆｃ領域のみに機能性物質を有する抗体である。
抗体（Ａｂ）が、連続する１〜５０個のアミノ酸残基からなる標的領域〔例、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域における２４６〜２４８位のアミノ酸残基からなる領域、（ｂ）ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域における２８８〜２９０位のアミノ酸残基からなる領域、または（ｃ）ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域における３１７位のアミノ酸残基からなる領域〕中において特定のアミノ酸残基（例、リジン残基、チロシン残基、スレオニン残基、セリン残基、システイン残基）を１個以上含み、かつ、前記標的領域以外の非標的領域中において前記特定のアミノ酸残基を５個以上含む場合、抗体以外の部分構造は、当該標的領域中に含まれる１個以上の特定のアミノ酸残基に対して３０％以上の位置選択性で結合させることができる。位置選択性は、好ましくは４０％以上、より好ましくは５０％以上、さらにより好ましくは６０％以上、特に好ましくは７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％であってもよい。
本発明の製造方法で製造される機能性物質を有する抗体はまた、重鎖の数に応じて、機能性物質（すなわち、Ｅ−Ｂ’−Ｆで表われる構造単位）を有することができる。これは、機能性物質を有する抗体を、重鎖の数に応じてＥ−Ｂで表われる構造単位を有することができる生体直交性官能基を有する抗体から製造することができるためである。したがって、抗体重鎖を複数（例えば１〜８個、好ましくは１〜４個、より好ましくは２個）有する抗体を本発明の製造方法において用いることで、複数の抗体重鎖の同じ標的領域においてＥ−Ｂ’−Ｆで表われる複数の構造単位（またはその下位概念の複数の構造単位）を位置選択的に有する抗体を製造することができる。例えば、抗体重鎖を２つ有する抗体（例、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、Ｆ（ａｂ‘）２抗体、Ｆｃ領域タンパク質、Ｆｃ融合タンパク質）を本発明の製造方法において用いることで、２つの抗体重鎖の同じ標的領域においてＥ−Ｂ’−Ｆで表われる２つの構造単位を位置選択的に有する抗体を製造することができる。すなわち、機能性物質を有する抗体において、機能性物質による修飾様式を複数（例、２つ）の重鎖間で同一にすることができる。
機能性物質を有する抗体はまた、１つの抗体重鎖の複数（例えば２〜５個、好ましくは２〜４個、より好ましくは２または３個）の標的領域において、同種または異種の機能性物質（例えば、Ｅ−Ｂ’−Ｆで表われる構造単位）を有することができる。この場合、機能性物質を有する抗体において、機能性物質による修飾様式を複数（例、２つ）の重鎖間で同一にすることができる。
本発明の製造方法はまた、生成した抗体を、特定の処理に付すことにより、機能性物質を有し、かつさらに修飾された抗体を生成することを含んでいてもよい。このような特定の処理としては、例えば、抗体の断片化処理（例、パパイン、ペプシン等の特定のプロテアーゼによる処理）が挙げられる。
本発明の製造方法において式（Ｉ）で表される化合物またはその塩を用いる場合、（１）の工程において、上記式（ＩＩ）で表される生体直交性官能基を有する抗体を製造することができ、次いで、（２）の工程において、上記式（ＩＩＩ）で表される機能性物質基を有する抗体を製造することができる。
好ましい実施形態では、本発明の製造方法において式（Ｉ）で表される化合物として式（Ｉ−１）で表されるものを用いる場合、（１）の工程において、上記式（ＩＩ−１）で表される生体直交性官能基を有する抗体を製造することができ、次いで、（２）の工程において、下記式（ＩＩＩ−１）で表される機能性物質基を有する抗体を製造することができる。
Ａｂ−Ｅ１−Ｅ２−Ｅ３−Ｂ’−Ｆ （ＩＩＩ−１）
〔式中、
Ａｂは、抗体であり、
Ｅ１は、抗体中の求核基と連結している求電子基であり、
Ｅ２は、（ａ）−Ｘ−Ｙ−〔ここで、Ｅ１と結合するＸは、Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）（ここで、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して、水素原子または炭素原子数１〜６のアルキルである。）、Ｎ（Ｒ３）（ここで、Ｒ３は、水素原子または炭素原子数１〜６のアルキルである。）、Ｏ、Ｓ、またはＳｅであり、Ｅ３と結合するＹは、Ｃ（Ｒ４）（Ｒ５）（ここで、Ｒ４およびＲ５はそれぞれ独立して、水素原子または炭素原子数１〜６のアルキルである。）である。〕、あるいは（ｂ）下記式（ｉ）：
Figure 2019240288
 （ここで、環Ｚは、Ｅ１と結合する環構成原子Ｘ’およびその両隣の環構成原子の全てが炭素原子である２価の環基であるか、またはＥ１と結合する環構成原子Ｘ’が窒素原子であり、かつ窒素原子の両隣の環構成原子が炭素原子である２価の複素環基である。・は結合手である。）で表される基であり、
Ｅ３は、Ｅ２が−Ｘ−Ｙ−の場合には２価の基であり、Ｅ２が式（ｉ）で表される基の場合には結合または２価の基であり、
Ｂ’は、機能性物質と生体直交性官能基との間の反応により生成する部分を含む２価の基であり、
Ｆは、機能性物質である。〕
好ましい特定の実施形態では、本発明の製造方法において式（Ｉ−１）で表される化合物として式（Ｉ−２）で表されるものを用いる場合、（１）の工程において、上記式（ＩＩ−２）で表される生体直交性官能基を有する抗体を製造することができ、次いで、（２）の工程において、下記式（ＩＩＩ−２）で表される機能性物質基を有する抗体を製造することができる。
Ａｂ−Ｅ１−Ｘ−Ｙ−Ｅ３−Ｂ’−Ｆ （ＩＩＩ−２）
〔式中、
Ａｂ、Ｘ、Ｙ、Ｂ’およびＦは、前記式（ＩＩＩ−１）のものと同じであり、
Ｅ１は、−Ｃ（＝Ｏ）−、−ＳＯ２−、および−ＣＨ２−からなる群より選ばれる基であり、
Ｅ３は、２価の基である。〕
好ましい別の特定の実施形態では、本発明の製造方法において式（Ｉ−１）で表される化合物として式（Ｉ−３）で表されるものを用いる場合、（１）の工程において、上記式（ＩＩ−３）で表される生体直交性官能基を有する抗体を製造することができ、次いで、（２）の工程において、下記式（ＩＩＩ−３）で表される機能性物質基を有する抗体を製造することができる。
Figure 2019240288
 〔式中、
Ａｂ、環構成原子Ｘ’、環Ｚ、Ｂ’およびＦは、式（ＩＩＩ−１）のものと同じであり、
Ｅ１は、−Ｃ（＝Ｏ）−、−ＳＯ２−、および−ＣＨ２−からなる群より選ばれる基であり、
Ｅ３は、結合または２価の基である。〕
好ましくは、本発明の製造方法において式（Ｉ−３）で表される化合物として式（Ｉ−４）で表されるものを用いる場合、（１）の工程において、下記式（ＩＩ−４）で表される生体直交性官能基を有する抗体を製造することができ、次いで、（２）の工程において、下記式（ＩＩＩ−４）で表される機能性物質基を有する抗体を製造することができる。
Figure 2019240288
 〔式中、
Ａｂ、環Ｚ、Ｂ’およびＦは、式（ＩＩＩ−１）のものと同じであり、
Ｅ１は、−Ｃ（＝Ｏ）−、−ＳＯ２−、および−ＣＨ２−からなる群より選ばれる基であり、
Ｅ３は、結合または２価の基である。〕
式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩ−１）、（ＩＩＩ−２）、（ＩＩＩ−３）または（ＩＩＩ−４）における任意の記号（例、Ｅ、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｂ）、および当該記号に関連して表される用語（例、抗体、求電子基、生体直交性官能基）の詳細（例えば、定義、例および好ましい例）は、上記式（Ｉ）またはその下位概念の式のものと共通する。
生体直交性官能基を有する抗体は、生体直行性官能基を介して、機能性物質と反応することができる。このような反応は、上述したような、タンパク質の変性・分解（例、アミド結合の切断）を引き起こし得ない条件（温和な条件）下で適宜行うことができる。
反応系において、生体直行性官能基を有する抗体（Ｙ）に対する、機能性物質（Ｚ）のモル比率（Ｚ／Ｙ）は、生体直行性官能基、機能性物質、および抗体の種類、ならびに修飾されるべき抗体中の部位の数（例、ＤＡＲ）等に応じて変動することから特に限定されないが、例えば０．１〜１００であり、好ましくは０．５〜８０であり、より好ましくは１〜７０であり、さらにより好ましくは２〜５０であり、特に好ましくは３〜３０である。
機能性物質を有する抗体の生成の確認は、その具体的な原料および生成物の分子量にもよるが、例えば、電気泳動法、クロマトグラフィー（例、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相カラムクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ）、または質量分析により、好ましくは、質量分析により行うことができる。位置選択性の確認は、例えば、ペプチドマッピングにより行うことができる。ペプチドマッピングは、例えば、プロテアーゼ（例、トリプシン、キモトリプシン、）処理および質量分析により行うことができる。プロテアーゼとしては、エンドプロテアーゼが好ましい。このようなエンドプロテアーゼとしては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、Ｇｌｕ−Ｃ、Ｌｙｓ−Ｎ、Ｌｙｓ−Ｃ、Ａｓｐ−Ｎが挙げられる。機能性物質を有する抗体が保有する、機能性物質の個数の確認は、例えば、電気泳動法、クロマトグラフィー、または質量分析により、好ましくは、質量分析により行うことができる。機能性物質を有する抗体は、クロマトグラフィー（例、上述したクロマトグラフィー、およびアフィニティークロマトグラフィー）等の任意の方法により適宜精製することができる。
４．生体直交性官能基または機能性物質を位置選択的に有する抗体またはその塩
本発明は、生体直交性官能基または機能性物質を位置選択的に有する抗体またはその塩を提供する。
生体直交性官能基を位置選択的に有する抗体またはその塩は、上記式（ＩＩ−１）で表される生体直交性官能基を位置選択的に有する抗体である。好ましくは、上記式（ＩＩ−１）で表される生体直交性官能基を位置選択的に有する抗体として、上記式（ＩＩ−２）または（ＩＩ−３）で表される生体直交性官能基を位置選択的に有する抗体が提供される。より好ましくは、上記式（ＩＩ−３）で表される生体直交性官能基を位置選択的に有する抗体として、上記式（ＩＩ−４）で表される生体直交性官能基を位置選択的に有する抗体が提供される。式（ＩＩ）、（ＩＩ−１）、（ＩＩ−２）、（ＩＩ−３）または（ＩＩ−４）における任意の記号（例、Ｅ、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｂ）、および当該記号に関連して表される用語（例、抗体、求電子基、生体直交性官能基）の詳細（例えば、定義、例および好ましい例）は、上記式（Ｉ）またはその下位概念の式のものと共通する。
機能性物質を位置選択的に有する抗体またはその塩は、上記式（ＩＩＩ−１）で表される機能性物質を位置選択的に有する抗体である。好ましくは、上記式（ＩＩＩ−１）で表される機能性物質を位置選択的に有する抗体として、上記式（ＩＩＩ−２）または（ＩＩＩ−３）で表される機能性物質を位置選択的に有する抗体が提供される。より好ましくは、上記式（ＩＩＩ−３）で表される機能性物質を位置選択的に有する抗体として、上記式（ＩＩＩ−４）で表される機能性物質を位置選択的に有する抗体が提供される。式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩ−１）、（ＩＩＩ−２）、（ＩＩＩ−３）または（ＩＩＩ−４）における任意の記号（例、Ｅ、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｂ）、および当該記号に関連して表される用語（例、抗体、求電子基、生体直交性官能基）の詳細（例えば、定義、例および好ましい例）は、上記式（Ｉ）またはその下位概念の式のものと共通する。
生体直交性官能基または機能性物質を位置選択的に有する抗体は、上述の抗体と同じである。好ましくは、このような抗体は、モノクローナル抗体である。モノクローナル抗体のアイソタイプとしては、例えば、ＩｇＧ（例、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、およびＩｇＹが挙げられる。モノクローナル抗体は、全長抗体、または抗体断片（例、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、単鎖抗体）であるが、全長抗体が好ましい。特に好ましくは、このような抗体は、ヒトＩｇＧ（例、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）を定常領域に有するヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体である。
生体直交性官能基または機能性物質を位置選択的に有する抗体は、好ましくは、抗体の定常領域のみに生体直交性官能基または機能性物質を有する抗体であり、より好ましくは、抗体のＦｃ領域のみに生体直交性官能基または機能性物質を有する抗体である。
生体直交性官能基または機能性物質を位置選択的に有する抗体は、連続する１〜５０個のアミノ酸残基からなる標的領域〔例、（ａ）ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域における２４６〜２４８位のアミノ酸残基からなる領域、（ｂ）ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域における２８８〜２９０位のアミノ酸残基からなる領域、または（ｃ）ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域における３１７位のアミノ酸残基からなる領域〕中において特定のアミノ酸残基（例、リジン残基、チロシン残基、スレオニン残基、セリン残基、システイン残基）が１個以上含まれており、かつ、前記標的領域以外の非標的領域中において前記特定のアミノ酸残基が５個以上含まれている場合、生体直交性官能基または機能性物質を、当該標的領域中に含まれる１個以上の特定のアミノ酸残基において３０％以上の位置選択性で有することができる。位置選択性は、好ましくは４０％以上、より好ましくは５０％以上、さらにより好ましくは６０％以上、特に好ましくは７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％であってもよい。
生体直交性官能基または機能性物質を位置選択的に有する抗体はまた、重鎖の数に応じて、生体直交性官能基（すなわち、Ｅ−Ｂで表わされる構造単位）、または機能性物質（すなわち、Ｅ−Ｂ’−Ｆで表われる構造単位）を有することができる。生体直交性官能基または機能性物質を位置選択的に有する抗体は、抗体重鎖を複数（例えば１〜８個、好ましくは１〜４個、より好ましくは２個）有する場合、複数の抗体重鎖の同じ標的領域において生体直交性官能基または機能性物質を位置選択的に有することができる。すなわち、生体直交性官能基または機能性物質を位置選択的に有する抗体において、生体直交性官能基または機能性物質による修飾様式を複数（例、２つ）の重鎖間で同一にすることができる。
生体直交性官能基または機能性物質を位置選択的に有する抗体はまた、１つの抗体重鎖の複数（例えば２〜５個、好ましくは２〜４個、より好ましくは２または３個）の標的領域において、同種または異種の生体直交性官能基（例えば、Ｅ−Ｂで表わされる構造単位）、または同種または異種の機能性物質（例えば、Ｅ−Ｂ’−Ｆで表われる構造単位）を有することができる。この場合、生体直交性官能基または機能性物質を位置選択的に有する抗体において、生体直交性官能基または機能性物質による修飾様式を複数（例、２つ）の重鎖間で同一にすることができる。
５．抗体に対する親和性物質、および機能性物質を有する化合物またはその塩
本発明は、式（ＩＶ）で表される、抗体に対する親和性物質、および機能性物質を有する化合物またはその塩を提供する。
Ａ−Ｌ−Ｅ−Ｆ （ＩＶ）
〔式中、
Ａは、抗体に対する親和性物質であり、
Ｌは、脱離基を含む２価の基であり、
Ｅは、（ｉ）前記脱離基と連結しており、かつ（ｉｉ）前記抗体中の求核基と反応する能力を有する求電子基を含む２価の基であり、
Ｆは、機能性物質であり、
前記脱離基は、前記求核基と前記求電子基との間の反応によりＥから切断されて脱離する能力を有する。〕
抗体に対する親和性物質、および機能性物質を有する化合物またはその塩における、抗体に対する親和性物質（Ａ）、脱離基を含む２価の基（Ｌ）、求電子基を含む２価の基（Ｅ）、および機能性物質（Ｆ）の定義、例、および好ましい例は、上述したものと同じである。したがって、抗体に対する親和性物質、および機能性物質を有する化合物またはその塩において、Ａ、Ｌ、およびＥは、抗体に対する親和性物質、および生体直交性官能基を有する化合物またはその塩（例えば、式（Ｉ）を参照）におけるＡ、Ｌ、およびＥと同様に特定することができる。また、抗体に対する親和性物質、および機能性物質を有する化合物またはその塩において、Ｆは、機能性物質を有する抗体またはその塩（例えば、式（ＩＩＩ）を参照）におけるＦと同様に特定することができる。
好ましい実施形態では、式（ＩＶ）で表される化合物は、下記式（ＩＶ−１）：
Ａ−Ｌ１−Ｌ２−Ｅ１−Ｅ２−Ｅ３−Ｆ （ＩＶ−１）
〔式中、
ＡおよびＦは、式（ＩＶ）のものと同じであり、
Ｌ１は、結合または２価の基であり、
Ｌ２は、脱離基であり、
Ｅ１は、（ｉ）脱離基と連結しており、かつ（ｉｉ）抗体中の求核基と反応する能力を有する求電子基であり、
Ｅ２は、（ａ）−Ｘ−Ｙ−〔ここで、Ｅ１と結合するＸは、Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）（ここで、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して、水素原子または炭素原子数１〜６のアルキルである。）、Ｎ（Ｒ３）（ここで、Ｒ３は、水素原子または炭素原子数１〜６のアルキルである。）、Ｏ、Ｓ、またはＳｅであり、Ｅ３と結合するＹは、Ｃ（Ｒ４）（Ｒ５）（ここで、Ｒ４およびＲ５はそれぞれ独立して、水素原子または炭素原子数１〜６のアルキルである。）である。〕、あるいは（ｂ）下記式（ｉ）：
Figure 2019240288
 （ここで、環Ｚは、Ｅ１と結合する環構成原子Ｘ’およびその両隣の環構成原子の全てが炭素原子である２価の環基であるか、またはＥ１と結合する環構成原子Ｘ’が窒素原子であり、かつ窒素原子の両隣の環構成原子が炭素原子である２価の複素環基である。・は結合手である。）で表される基であり、
Ｅ３は、Ｅ２が−Ｘ−Ｙ−の場合には２価の基であり、Ｅ２が式（ｉ）で表される基の場合には結合または２価の基であり、
脱離基は、上記求核基と上記求電子基との間の反応によりＥ１から切断されて脱離する能力を有する。〕で表される化合物であってもよい。
式（ＩＶ−１）において、Ｌ２で表される脱離基の定義、例および好ましい例は、上記「１−３．脱離基を含む２価の基（Ｌ）」における（ａ）〜（ｃ）について述べたものと同じである。
好ましい特定の実施形態では、式（ＩＶ−１）で表される化合物は、下記式（ＩＶ−２）：
Ａ−Ｌ１−Ｌ２−Ｅ１−Ｘ−Ｙ−Ｅ３−Ｆ （ＩＶ−２）
〔式中、
Ａ、Ｌ１、Ｘ、ＹおよびＦは、式（ＩＶ−１）のものと同じであり、
Ｌ２は、
（ａ）環Ｐ−Ｑ−〔ここで、環Ｐが、電子吸引性基で置換されていてもよいアリーレン、電子吸引性基で置換されていてもよいヘテロアリーレン、縮環していてもよい２，５-ジケトピロリジン、縮環していてもよい２，６−ジケトピペリジン、縮環していてもよい２-ケトピロリジン、縮環していてもよい２−ケトピペリジン、２−ピリドンからなる群より選ばれる基であり、Ｑが、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓｅ−、−ＳＯ２−Ｏ−、−ＳＯ２−Ｎ（Ｒ）−、−ＳＯ２−、−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｎ（ＯＲ）−、−Ｎ（Ｒ）−、および−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−からなる群より選ばれる基（ここで、Ｒは、水素原子または炭素原子数１〜６のアルキルである。）である。〕、
（ｂ）ヘテロアリーレン、あるいは
（ｃ）−Ｑ−〔ここで、Ｑが、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓｅ−、−ＳＯ２−Ｏ−、−ＳＯ２−Ｎ（Ｒ）−、−ＳＯ２−、−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｎ（ＯＲ）−、−Ｎ（Ｒ）−、および−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−からなる群より選ばれる基（ここで、Ｒは、水素原子または炭素原子数１〜６のアルキルである。）である。〕であり、
Ｅ１は、−Ｃ（＝Ｏ）−、−ＳＯ２−、および−ＣＨ２−からなる群より選ばれる基であり、
Ｅ３は、２価の基である。〕で表される化合物であってもよい。
好ましい別の特定の実施形態では、式（ＩＶ−１）で表される化合物は、下記式（ＩＶ−３）：
Figure 2019240288
 〔式中、
Ａ、Ｌ１、環Ｚ、環構成原子Ｘ’およびＦは、前記式（ＩＶ−１）のものと同じであり、
Ｌ２は、
（ａ）環Ｐ−Ｑ−〔ここで、環Ｐが、電子吸引性基で置換されていてもよいアリーレン、電子吸引性基で置換されていてもよいヘテロアリーレン、縮環していてもよい２，５-ジケトピロリジン、縮環していてもよい２，６−ジケトピペリジン、縮環していてもよい２-ケトピロリジン、縮環していてもよい２−ケトピペリジン、２−ピリドンからなる群より選ばれる基であり、Ｑが、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓｅ−、−ＳＯ２−Ｏ−、−ＳＯ２−Ｎ（Ｒ）−、−ＳＯ２−、−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｎ（ＯＲ）−、−Ｎ（Ｒ）−、および−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−からなる群より選ばれる基（ここで、Ｒは、水素原子または炭素原子数１〜６のアルキルである。）である。〕、
（ｂ）ヘテロアリーレン、あるいは
（ｃ）−Ｑ−〔ここで、Ｑが、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓｅ−、−ＳＯ２−Ｏ−、−ＳＯ２−Ｎ（Ｒ）−、−ＳＯ２−、−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｎ（ＯＲ）−、−Ｎ（Ｒ）−、および−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−からなる群より選ばれる基（ここで、Ｒは、水素原子または炭素原子数１〜６のアルキルである。）である。〕であり、
Ｅ１は、−Ｃ（＝Ｏ）−、−ＳＯ２−、および−ＣＨ２−からなる群より選ばれる基であり、
Ｅ３は、結合または２価の基である。〕で表される化合物であってもよい。
好ましくは、式（ＩＶ−３）で表される化合物は、下記式（ＩＶ−４）：
Figure 2019240288
 〔式中、
Ａ、Ｌ１およびＦは、前記式（ＩＶ−１）のものと同じであり、
Ｌ２は、（ａ）環Ｐ−Ｑ−〔ここで、環Ｐが、電子吸引性基で置換されていてもよいアリーレン、電子吸引性基で置換されていてもよいヘテロアリーレン、縮環していてもよい２，５-ジケトピロリジン、縮環していてもよい２，６−ジケトピペリジン、縮環していてもよい２-ケトピロリジン、縮環していてもよい２−ケトピペリジン、２−ピリドンからなる群より選ばれる基であり、Ｑが、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓｅ−、−ＳＯ２−Ｏ−、−ＳＯ２−Ｎ（Ｒ）−、−ＳＯ２−、−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｎ（ＯＲ）−、−Ｎ（Ｒ）−、および−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−からなる群より選ばれる基（ここで、Ｒは、水素原子または炭素原子数１〜６のアルキルである。）である。〕、
（ｂ）ヘテロアリーレン、あるいは
（ｃ）−Ｑ−〔ここで、Ｑが、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓｅ−、−ＳＯ２−Ｏ−、−ＳＯ２−Ｎ（Ｒ）−、−ＳＯ２−、−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｎ（ＯＲ）−、−Ｎ（Ｒ）−、および−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−からなる群より選ばれる基（ここで、Ｒは、水素原子または炭素原子数１〜６のアルキルである。）である。〕であり、
Ｅ１は、−Ｃ（＝Ｏ）−、−ＳＯ２−、および−ＣＨ２−からなる群より選ばれる基であり、
環Ｚは、Ｅ１と結合する環構成原子およびその両隣の環構成原子の全てが炭素原子である２価の環基である。）で表される基であり、
Ｅ３は、結合または２価の基である。〕で表される化合物であってもよい。
上記式（ＩＶ−１）〜（ＩＶ−４）で表される化合物において、Ａ、Ｌ１、Ｌ２、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３およびＦ、ならびに−Ｘ−Ｙ−、Ｒ１〜Ｒ５における炭素原子数１〜６のアルキル、式（ｉ）で表される基（例、２価の環基、２価の複素環基）の定義、例および好ましい例は、上述したものと同じである。また、Ｌ２である（ａ）〜（ｃ）、ならびに環Ｚ（例、Ｅ１と結合する環構成原子Ｘ’およびその両隣の環構成原子の全てが炭素原子である２価の環基、またはＥ１と結合する環構成原子Ｘ’が窒素原子であり、かつ窒素原子の両隣の環構成原子が炭素原子である２価の複素環基）、環Ｐ、およびＱ（例、Ｒにおける炭素原子数１〜６のアルキル）などの基の定義、例および好ましい例もまた、上述したものと同じである。
抗体に対する親和性物質、および機能性物質を有する化合物またはその塩は、抗体に対する親和性物質、および生体直交性官能基を有する化合物またはその塩を、生体直交性官能基を介して、上述したような機能性物質と反応させることにより、適宜調製することができる。このような反応は、適切な反応系、例えば有機溶媒系または水溶液系において、適温（例、約１５〜２００℃）で行うことができる。反応系は、適切な触媒を含んでいてもよい。反応時間は、例えば１分〜２０時間、好ましくは１０分〜１５時間、より好ましくは２０分〜１０時間、さらにより好ましくは３０分〜８時間である。
反応系において、機能性物質（Ｘ）に対する、抗体に対する親和性物質、および生体直交性官能基を有する化合物またはその塩のモル比率（Ｙ／Ｘ）は、当該構造単位および親和性物質の種類、当該構造単位によって修飾されるべき親和性物質中の部位の数等に応じて変動することから特に限定されないが、例えば０．０１〜１００であり、好ましくは０．０５〜２０であり、より好ましくは０．１〜１０である。
抗体に対する親和性物質、および機能性物質を有する化合物またはその塩の生成の確認は、その具体的な原料および生成物の分子量にもよるが、例えば、電気泳動法、クロマトグラフィー（例、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相カラムクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ）、または質量分析により、好ましくは、質量分析により行うことができる。抗体に対する親和性物質、および機能性物質を有する化合物またはその塩は、クロマトグラフィー（例、上述したクロマトグラフィー、およびアフィニティークロマトグラフィー）等の任意の方法により適宜精製することができる。
６．抗体に対する親和性物質、および機能性物質を有する化合物またはその塩を用いる、機能性物質を有する抗体の製造方法
本発明は、以下を含む、機能性物質を有する抗体またはその塩の製造方法を提供する。
下記式（ＩＶ）：
Ａ−Ｌ−Ｅ−Ｆ （ＩＶ）
〔式中、
Ａは、抗体に対する親和性物質であり、
Ｌは、脱離基を含む２価の基であり、
Ｅは、（ｉ）前記脱離基と連結しており、かつ（ｉｉ）前記抗体中の求核基と反応する能力を有する求電子基を含む２価の基であり、
Ｆは、機能性物質であり、
前記脱離基は、前記求核基と前記求電子基との間の反応によりＥから切断されて脱離する能力を有する。〕で表される、抗体に対する親和性物質、および機能性物質を有する化合物またはその塩を、抗体と反応させて、
下記式（Ｖ）：
Ａｂ−Ｅ−Ｆ （Ｖ）
〔式中、
Ａｂは、抗体であり、
ＥおよびＦは、前記式（ＩＶ）のものと同じである。〕で表される、機能性物質を有する抗体またはその塩を生成すること。
好ましくは、本発明の製造方法で製造される機能性物質を有する抗体は、機能性物質を位置選択的に有する抗体である。この場合、式（Ｖ）で表される、機能性物質を位置選択的に有する抗体を製造することができる。機能性物質を位置選択的に有する抗体は、好ましくは、定常領域のみに機能性物質を有する抗体であり、より好ましくは、Ｆｃ領域のみに機能性物質を有する抗体である。
抗体（Ａｂ）が、連続する１〜５０個のアミノ酸残基からなる標的領域〔例、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域における２４６〜２４８位のアミノ酸残基からなる領域、（ｂ）ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域における２８８〜２９０位のアミノ酸残基からなる領域、または（ｃ）ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域における３１７位のアミノ酸残基からなる領域〕中において特定のアミノ酸残基（例、リジン残基、チロシン残基、スレオニン残基、セリン残基、システイン残基）を１個以上含み、かつ、前記標的領域以外の非標的領域中において前記特定のアミノ酸残基を５個以上含む場合、抗体以外の部分構造は、当該標的領域中に含まれる１個以上の特定のアミノ酸残基に対して３０％以上の位置選択性で結合させることができる。位置選択性は、好ましくは４０％以上、より好ましくは５０％以上、さらにより好ましくは６０％以上、特に好ましくは７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％であってもよい。
本発明の製造方法で製造される機能性物質を有する抗体はまた、重鎖の数に応じて、機能性物質（すなわち、Ｅ−Ｆで表われる構造単位）を有することができる。したがって、抗体重鎖を複数（例えば１〜８個、好ましくは１〜４個、より好ましくは２個）有する抗体を本発明の製造方法において用いることで、複数の抗体重鎖の同じ標的領域においてＥ−Ｆで表われる複数の構造単位（またはその下位概念の複数の構造単位）を位置選択的に有する抗体を製造することができる。例えば、抗体重鎖を２つ有する抗体（例、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、Ｆ（ａｂ‘）２抗体、Ｆｃ領域タンパク質、Ｆｃ融合タンパク質）を本発明の製造方法において用いることで、２つの抗体重鎖の同じ標的領域においてＥ−Ｆで表われる２つの構造単位を位置選択的に有する抗体を製造することができる。すなわち、機能性物質を有する抗体において、機能性物質による修飾様式を複数（例、２つ）の重鎖間で同一にすることができる。
機能性物質を有する抗体はまた、１つの抗体重鎖の複数（例えば２〜５個、好ましくは２〜４個、より好ましくは２または３個）の標的領域において、同種または異種の機能性物質（例えば、Ｅ−Ｆで表われる構造単位）を有することができる。この場合、機能性物質を有する抗体は、複数（例、２つ）の重鎖間で、機能性物質による修飾様式を同一にすることができる。
本発明の製造方法はまた、生成した抗体を、特定の処理に付すことにより、機能性物質を有し、かつさらに修飾された抗体を生成することを含んでいてもよい。このような特定の処理としては、例えば、抗体の断片化処理（例、パパイン、ペプシン等の特定のプロテアーゼによる処理）が挙げられる。
本発明の製造方法において式（ＩＶ）で表される化合物またはその塩を用いる場合、上記式（Ｖ）で表される機能性物質を有する抗体を製造することができる。
好ましい実施形態では、本発明の製造方法において式（ＩＶ）で表される化合物として式（ＩＶ−１）で表されるものを用いる場合、下記式（Ｖ−１）で表される機能性物質を有する抗体を製造することができる。
Ａｂ−Ｅ１−Ｅ２−Ｅ３−Ｆ （Ｖ−１）
〔式中、
Ａｂは、抗体であり、
Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３およびＦは、上記式（ＩＶ−１）のものと同じである。〕
好ましい特定の実施形態では、本発明の製造方法において式（ＩＶ−１）で表される化合物として式（ＩＶ−２）で表されるものを用いる場合、下記式（Ｖ−２）で表される機能性物質を有する抗体を製造することができる。
Ａｂ−Ｅ１−Ｘ−Ｙ−Ｅ３−Ｆ （Ｖ−２）
〔式中、
Ａｂは、抗体であり、
Ｅ１、Ｘ、Ｙ、Ｅ３およびＦは、上記式（ＩＶ−２）のものと同じである。〕
好ましい別の特定の実施形態では、本発明の製造方法において式（ＩＶ−１）で表される化合物として式（ＩＶ−３）で表されるものを用いる場合、下記式（Ｖ−３）で表される機能性物質を有する抗体を製造することができる。
Figure 2019240288
 〔式中、
Ａｂは、抗体であり、
Ｅ１、環Ｚ、環構成原子Ｘ’、Ｅ３およびＦは、上記式（ＩＶ−３）のものと同じである。〕
好ましくは、本発明の製造方法において式（ＩＶ−３）で表される化合物として式（ＩＶ−４）で表されるものを用いる場合、下記式（Ｖ−４）で表される機能性物質を有する抗体を製造することができる。
Figure 2019240288
 〔式中、
Ａｂは、抗体であり、
Ｅ１、環Ｚ、Ｅ３およびＦは、上記式（ＩＶ−４）のものと同じである。〕
抗体に対する親和性物質、および機能性物質を有する化合物またはその塩は、Ｅにおける求電子基またはＥ１の求電子基を有するため、抗体と反応することができる。このような反応は、タンパク質の変性・分解（例、アミド結合の切断）を引き起こし得ない条件（温和な条件）下で適宜行うことができる。例えば、このような反応は、適切な反応系、例えば緩衝液中において、室温（例、約１５〜３０℃）で行うことができる。緩衝液のｐＨは、例えば５〜９であり、好ましくは５．５〜８．５であり、より好ましくは６．０〜８．０である。緩衝液は、適切な触媒を含んでいてもよい。反応時間は、例えば１分〜２０時間、好ましくは１０分〜１５時間、より好ましくは２０分〜１０時間、さらにより好ましくは３０分〜８時間である。このような反応の詳細については、例えば、Ｇ．Ｊ．Ｌ．Ｂｅｒｎａｒｄｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．，１１５，２１７４（２０１５）；Ｇ．Ｊ．Ｌ．Ｂｅｒｎａｒｄｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ａｓｉａｎ．Ｊ．，４，６３０（２００９）；Ｂ．Ｇ．Ｄａｖｉｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．，５，４７４０（２０１４）；Ａ．Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ．Ｃｈｅｍ．，２５，８２５（２０１４）を参照のこと。
反応系において、抗体（Ｘ）に対する、抗体に対する親和性物質、および機能性物質を有する化合物またはその塩（Ｙ）のモル比率（Ｙ／Ｘ）は、抗体に対する親和性物質、および機能性物基を有する化合物またはその塩および抗体の種類、抗体に対する親和性物質、および生体直交性官能基を有する化合物またはその塩によって修飾されるべき抗体中の部位の数（例、ＤＡＲ）等に応じて変動することから特に限定されないが、例えば０．１〜１００であり、好ましくは０．５〜８０であり、より好ましくは１〜７０であり、さらにより好ましくは２〜５０であり、特に好ましくは３〜３０である。
機能性物質を有する抗体の生成の確認は、その具体的な原料および生成物の分子量にもよるが、例えば、電気泳動法、クロマトグラフィー（例、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相カラムクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ）、または質量分析により、好ましくは、質量分析により行うことができる。位置選択性の確認は、例えば、ペプチドマッピングにより行うことができる。ペプチドマッピングは、例えば、プロテアーゼ（例、トリプシン、キモトリプシン、）処理および質量分析により行うことができる。プロテアーゼとしては、エンドプロテアーゼが好ましい。このようなエンドプロテアーゼとしては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、Ｇｌｕ−Ｃ、Ｌｙｓ−Ｎ、Ｌｙｓ−Ｃ、Ａｓｐ−Ｎが挙げられる。機能性物基を有する抗体が保有する、機能性物基の個数の確認は、例えば、電気泳動法、クロマトグラフィー、または質量分析により、好ましくは、質量分析により行うことができる。機能性物基を有する抗体は、クロマトグラフィー（例、上述したクロマトグラフィー、およびアフィニティークロマトグラフィー）等の任意の方法により適宜精製することができる。
７．塩
本発明において、塩としては、例えば、無機酸との塩、有機酸との塩、無機塩基との塩、有機塩基との塩、およびアミノ酸との塩が挙げられる。無機酸との塩としては、例えば、塩化水素、臭化水素、リン酸、硫酸、硝酸との塩が挙げられる。有機酸との塩としては、例えば、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、乳酸、酒石酸、フマル酸、シュウ酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸との塩が挙げられる。無機塩基との塩としては、例えば、アルカリ金属（例、ナトリウム、カリウム）、アルカリ土類金属（例、カルシウム、マグネシウム）、および亜鉛、アルミニウム等の他の金属、ならびにアンモニウムとの塩が挙げられる。有機塩基との塩としては、例えば、トリメチルアミン、トリエチルアミン、プロピレンジアミン、エチレンジアミン、ピリジン、エタノールアミン、モノアルキルエタノールアミン、ジアルキルエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミンとの塩が挙げられる。アミノ酸との塩としては、例えば、塩基性アミノ酸（例、アルギニン、ヒスチジン、リジン、オルニチン）、および酸性アミノ酸（例、アスパラギン酸、グルタミン酸）との塩が挙げられる。塩は、好ましくは、無機酸（例、塩化水素）との塩、または有機酸（例、トリフルオロ酢酸）との塩である。
８．用途
抗体に対する親和性物質、および生体直交性官能基を有する本発明の化合物またはその塩は、例えば、生体直交性官能基による抗体の位置選択的な修飾に有用である。したがって、本発明は、抗体に対する親和性物質、および生体直交性官能基を有する化合物またはその塩を含む、生体直交性官能基による抗体の位置選択的修飾試薬を提供する。生体直交性官能基による抗体の位置選択的修飾試薬において、抗体に対する親和性物質、および生体直交性官能基を有する化合物またはその塩の詳細（例えば、定義、例および好ましい例）は、上述したものと同じである。
抗体に対する親和性物質、および機能性物質を有する本発明の化合物またはその塩は、例えば、機能性物質による抗体の位置選択的な修飾に有用である。したがって、本発明は、抗体に対する親和性物質、および機能性物質を有する化合物またはその塩を含む、機能性物質による抗体の位置選択的修飾試薬を提供する。機能性物質による抗体の位置選択的修飾試薬において、抗体に対する親和性物質、および機能性物質を有する化合物またはその塩の詳細（例えば、定義、例および好ましい例）は、上述したものと同じである。
本発明の位置選択的修飾試薬において修飾される抗体の位置選択的修飾の詳細（例えば、定義、例および好ましい例）は、上述したものと同じである。
本発明の位置選択的修飾試薬は、他の成分をさらに含む組成物の形態で提供されてもよい。このような他の成分としては、例えば、溶液、安定化剤（例、酸化防止剤、保存剤）が挙げられる。溶液としては、水溶液が好ましい。水溶液としては、例えば、水（例、蒸留水、滅菌蒸留水、精製水、生理食塩水）、緩衝液（例、リン酸水溶液、Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液、炭酸−重炭酸緩衝液、ホウ酸水溶液、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液、クエン酸緩衝液）が挙げられるが、緩衝液が好ましい。溶液のｐＨは、例えば５．０〜９．０、好ましくは５．５〜８．５である。本発明の位置選択的修飾試薬は、液状または粉末状（例、凍結乾燥粉末）において提供することができる。
生体直交性官能基を位置選択的に有する抗体またはその塩は、例えば、機能性物質を位置選択的に有する抗体またはその塩の調製における中間体として有用である。
機能性物質を位置選択的に有する抗体またはその塩は、例えば、医薬、または試薬（例、診断薬、研究用試薬）として、特に医薬として有用である。抗体薬物複合体（ＡＤＣ）の薬物の結合数および結合位置を変化させると、体内動態や薬物の放出速度、効果が変化することが報告されている。これらのことから次世代型ＡＤＣではコンジュゲーションする薬物の個数と位置を制御することが求められている。個数および位置が一定であると、期待通りのｅｆｆｉｃａｃｙ、コンジュゲーション薬剤のバリエーション、ロット差いわゆるレギュレーションの問題が解決すると考えられている。機能性物質を位置選択的に有する本発明の抗体またはその塩は、このようなレギュレーションの問題を解決することができる。したがって、機能性物質を位置選択的に有する本発明の抗体またはその塩は、医薬組成物の形態において提供されてもよい。このような医薬組成物は、機能性物質を位置選択的に有する抗体またはその塩に加えて、医薬上許容され得る担体を含んでいてもよい。医薬上許容され得る担体としては、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑剤、クエン酸、メントール、グリシルリシン・アンモニウム塩、グリシン、オレンジ粉等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水、オレンジジュース等の希釈剤、カカオ脂、ポリエチレングリコール、白灯油等のベースワックスなどが挙げられるが、それらに限定されるものではない。機能性物質を位置選択的に有する本発明の抗体またはその塩はまた、安定性を実現する任意の修飾（例、ＰＥＧ化）を有していてもよい。
経口投与に好適な製剤は、水、生理食塩水、オレンジジュースのような希釈液に有効量のリガンドを溶解させた液剤、有効量のリガンドを固体や顆粒として含んでいるカプセル剤、サッシェ剤または錠剤、適当な分散媒中に有効量の有効成分を懸濁させた懸濁液剤、有効量の有効成分を溶解させた溶液を適当な分散媒中に分散させ乳化させた乳剤等である。
医薬組成物は、非経口的な投与（例、静脈内注射、皮下注射、筋肉注射、局所注入、腹腔内投与）に好適である。このような非経口的な投与に好適な医薬組成物としては、水性および非水性の等張な無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性および非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。
医薬組成物の投与量は、有効成分の種類・活性、病気の重篤度、投与対象となる動物種、投与対象の薬物受容性、体重、年齢等によって異なるが、適宜設定することができる。
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［実施例１：ＩｇＧ１ Ｆｃ親和性物質の合成］
（１−１）抗体に対する親和性ペプチドの合成
抗体に対する親和性物質である下記に示したペプチドは、全て同様の方法にて調製した。Ｆｍｏｃ法によるＲｉｎｋ ａｍｉｄｅ樹脂をもちいたペプチド固相合成によって、Ｎ末端をアセチル基でキャッピングしたもの（化合物１，２，３２〜５３）、Ｎ末端を３−（トリフェニルメチルチオ）プロピオン酸でキャッピングしたもの（化合物３，３１，５４）を調製し、トリフルオロ酢酸：水：トリイソプロピルシラン：エタンジチオール＝９４：２．５：１．０：２．５の溶液にて３時間攪拌することで樹脂からの切り出しと脱保護を行った。樹脂をフィルトレーションにより除去し、ジエチルエーテルを加え沈殿を行い、ジエチルエーテルをデカンテーションすることで除去し、ペプチドを粗結晶として得た。これを分取ＨＰＬＣにて精製し、生成物である親和性ペプチドを得た。
分子内にＳ−Ｓ結合を有するペプチド（メチオニンを含有するものを除く）である化合物３５〜５３については、前駆体となる直鎖のペプチドを上記に示す方法にて取得したのち、次に示す方法にて合成した。得られた前駆体数十ｍｇをＤＭＳＯ １ｍＬに溶解し、ＮＨ３／ＭｅＯＨ １００μＬ、Ｈ２Ｏ２ １０μＬを加え、終夜攪拌を行った。ＬＣＭＳにより反応が終了していることを確認したのち、分取ＨＰＬＣにて精製し、目的物である親和性ペプチドを得た。
分子内にＳ−Ｓ結合を有するペプチド（メチオニンを含有するもの）である化合物３３，３４については、前駆体となる直鎖のペプチドを上記に示す方法にて取得したのち、次に示す方法にて合成した。得られた前駆体数十ｍｇを０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．００） ２０ｍＬに溶解し、グルタチオン酸化型 ５．０ｅｑを加え、終夜攪拌を行った。ＬＣＭＳにより反応が終了していることを確認したのち、分取ＨＰＬＣにて精製し、目的物である親和性ペプチドを得た。
Figure 2019240288
ＭＳ （ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝３ １３９２［Ｍ＋３Ｈ］３＋，ｚ＝４ １０４４［Ｍ＋４Ｈ］４＋
Figure 2019240288
ＭＳ （ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝３ １３９２［Ｍ＋３Ｈ］３＋，ｚ＝４ １０４４［Ｍ＋４Ｈ］４＋
Figure 2019240288
ＭＳ （ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝３ １４７８［Ｍ＋３Ｈ］３＋，ｚ＝４ １１０８［Ｍ＋４Ｈ］４＋
Figure 2019240288
ＭＳ （ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝２ １８９２ ［Ｍ＋２Ｈ］２＋， Ｚ＝３ １２６２ ［Ｍ＋３Ｈ］３＋， Ｚ＝４ ９４６ ［Ｍ＋４Ｈ］４＋， ｚ＝５ ７５７ ［Ｍ＋５Ｈ］５＋
Figure 2019240288
ＭＳ （ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝３ １４０１ ［Ｍ＋３Ｈ］３＋， Ｚ＝４ １０５１ ［Ｍ＋４Ｈ］４＋， ｚ＝５ ８４１ ［Ｍ＋５Ｈ］５＋
Figure 2019240288
ＭＳ （ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝３ １４２６ ［Ｍ＋３Ｈ］３＋， Ｚ＝４ １０７０ ［Ｍ＋４Ｈ］４＋， ｚ＝５ ８５９ ［Ｍ＋５Ｈ］５＋
Figure 2019240288
ＭＳ （ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝３ １４１７ ［Ｍ＋３Ｈ］３＋， Ｚ＝４ １０６３ ［Ｍ＋４Ｈ］４＋， ｚ＝５ ８５１ ［Ｍ＋５Ｈ］５＋
Figure 2019240288
ＭＳ （ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝３ １４２５ ［Ｍ＋３Ｈ］３＋， Ｚ＝４ １０６９ ［Ｍ＋４Ｈ］４＋， ｚ＝５ ８５５ ［Ｍ＋５Ｈ］５＋
Figure 2019240288
ＭＳ （ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝１ ２０９０ ［Ｍ＋１Ｈ］＋， Ｚ＝２ １０４５ ［Ｍ＋２Ｈ］２＋， Ｚ＝３ ６９７ ［Ｍ＋３Ｈ］３＋
Figure 2019240288
ＭＳ （ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝１ ２０７４ ［Ｍ＋１Ｈ］＋， Ｚ＝２ １０３７ ［Ｍ＋２Ｈ］２＋， Ｚ＝３ ６９２ ［Ｍ＋３Ｈ］３＋
Figure 2019240288
ＭＳ （ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝１ ２０６１ ［Ｍ＋１Ｈ］＋， Ｚ＝２ １０３１ ［Ｍ＋２Ｈ］２＋， Ｚ＝３ ６８７ ［Ｍ＋３Ｈ］３＋
Figure 2019240288
ＭＳ （ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝１ ２０３２ ［Ｍ＋１Ｈ］＋， Ｚ＝２ １０１６ ［Ｍ＋２Ｈ］２＋， Ｚ＝３ ６７８ ［Ｍ＋３Ｈ］３＋
Figure 2019240288
ＭＳ （ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝１ ２０８９ ［Ｍ＋１Ｈ］＋， Ｚ＝２ １０４４ ［Ｍ＋２Ｈ］２＋， Ｚ＝３ ６９６ ［Ｍ＋３Ｈ］３＋
Figure 2019240288
ＭＳ （ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝１ ２０８８ ［Ｍ＋１Ｈ］＋， Ｚ＝２ １０４４ ［Ｍ＋２Ｈ］２＋， Ｚ＝３ ６９６ ［Ｍ＋３Ｈ］３＋
Figure 2019240288
ＭＳ （ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝１ １５６１ ［Ｍ＋Ｈ］＋， Ｚ＝２ ７８１ ［Ｍ＋２Ｈ］２＋
Figure 2019240288
ＭＳ （ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝１ １５４８ ［Ｍ＋１Ｈ］＋， Ｚ＝２ ７７４ ［Ｍ＋２Ｈ］２＋
Figure 2019240288
ＭＳ （ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝２ １０５９ ［Ｍ＋２Ｈ］２＋， Ｚ＝３ ７０６ ［Ｍ＋３Ｈ］３＋
Figure 2019240288
ＭＳ （ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝２ １０７４ ［Ｍ＋２Ｈ］２＋， Ｚ＝３ ７１６ ［Ｍ＋３Ｈ］３＋
Figure 2019240288
ＭＳ （ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝２ １０８１ ［Ｍ＋２Ｈ］２＋， Ｚ＝３ ７２１ ［Ｍ＋３Ｈ］３＋， Ｚ＝４ ５４１ ［Ｍ＋４Ｈ］４＋
Figure 2019240288
ＭＳ （ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝２ １０８５ ［Ｍ＋２Ｈ］２＋， Ｚ＝３ ７２３ ［Ｍ＋３Ｈ］３＋， Ｚ＝４ ５４３ ［Ｍ＋４Ｈ］４＋
Figure 2019240288
ＭＳ （ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝２ １０４５ ［Ｍ＋２Ｈ］２＋， Ｚ＝３ ６９７ ［Ｍ＋３Ｈ］３＋
Figure 2019240288
ＭＳ （ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝１ １３４５ ［Ｍ＋１Ｈ］＋， Ｚ＝２ ６７３ ［Ｍ＋２Ｈ］２＋
Figure 2019240288
ＭＳ （ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝２ １０５２ ［Ｍ＋２Ｈ］２＋， Ｚ＝３ ７０２ ［Ｍ＋３Ｈ］３＋
Figure 2019240288
ＭＳ （ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝２ １０７３ ［Ｍ＋２Ｈ］２＋， Ｚ＝３ ７１５ ［Ｍ＋３Ｈ］３＋
Figure 2019240288
ＭＳ （ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝２ １０７３ ［Ｍ＋２Ｈ］２＋， Ｚ＝３ ７１６ ［Ｍ＋３Ｈ］３＋
Figure 2019240288
ＭＳ （ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝２ ９６６ ［Ｍ＋２Ｈ］２＋， Ｚ＝３ ６４４ ［Ｍ＋３Ｈ］３＋
Figure 2019240288
ＭＳ （ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝３ １３８１ ［Ｍ＋３Ｈ］３＋， Ｚ＝４ １０３６ ［Ｍ＋４Ｈ］４＋， ｚ＝５ ８２９ ［Ｍ＋５Ｈ］５＋
（１−２）抗体に対する親和性ペプチドアジド付加体の合成
下記に示したペプチド−アジド付加体（化合物４，５）は以下の通り合成した。後に官能基化する残基のＬｙｓのみｍｔｔ基で保護されたアミノ酸を用い、Ｆｍｏｃ法によるＲｉｎｋ ａｍｉｄｅ樹脂を持ちいたペプチド固相合成によって、Ｎ末端をアセチル基でキャッピングしたものを調製した。ジクロロメタン：トリフルオロ酢酸：トリイソプロピルシラン＝９０：５：５の溶液にて１時間攪拌させ、ｍｔｔ基のみを脱保護した。樹脂をＤＭＦで洗浄した後に、トリエチルアミン（５０モル当量）、アジドアセチル酸ＮＨＳエステル（１０モル当量），ＤＭＦ４ｍＬ）に溶解させて添加し、１６時間攪拌した。溶液を除去した後トリフルオロ酢酸：水：トリイソプロピルシラン＝９５：２．５：２．５の溶液にて１時間攪拌することで樹脂からの切り出しと脱保護を行った。樹脂をフィルトレーションにより除去し、ジエチルエーテルを加え沈殿を行い、ジエチルエーテルをデカンテーションすることで除去し、ペプチドを粗結晶として得た。これを分取ＨＰＬＣにて精製し、生成物である親和性ペプチドアジド付加体を得た。
Figure 2019240288
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝３ １４０１［Ｍ＋３Ｈ］３＋，ｚ＝４ １０５１［Ｍ＋４Ｈ］４＋
Figure 2019240288
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝３ １４２０［Ｍ＋３Ｈ］３＋，ｚ＝４ １０６５［Ｍ＋４Ｈ］４＋
［実施例２：抗体修飾リンカーの合成とＩｇＧ１ Ｆｃ親和性ペプチドアジド付加体との連結］
（２−１）イミダゾリルカルボニル化合物の合成
（２−１−１）イミダゾリルカルボニル化合物（化合物６）の合成
Figure 2019240288
３−ブチン−１−オール（０．１００ｇ，１．３２ｍｍｏｌ）とカルボニルジイミダゾール（２６３ｍｇ，１．６２ｍｍｏｌ）をＴＨＦ溶媒に溶解させ、室温で１時間攪拌した。反応液を酢酸エチルで希釈し、水、食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムを加え５分静置した。フィルトレーションにより硫酸ナトリウムを取り除き、減圧下濃縮することにより粗生成物を得たのち、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することにより、化合物６に相当する１Ｈ−イミダゾール−１−カルボン酸−３−ブチニルエステル（０．１８０ｇ，１．１０ｍｍｏｌ）を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ−ｄ） δ ２．０８（ｔ，Ｊ＝２．７Ｈｚ，１Ｈ），２．７３（ｔｄ，Ｊ＝６．６，２．７Ｈｚ，２Ｈ），４．５４（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ），７．１１（ｓ，１Ｈ），７．４３（ｓ，１Ｈ），８．１８（ｓ，１Ｈ）．
ＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ：１６５［Ｍ＋Ｎａ］＋
（２−１−２）イミダゾリルカルボニル化合物（化合物７）の合成
Figure 2019240288
９−デシン−１−オール（０．１００ｇ，０．７４５ｍｍｏｌ）とカルボニルジイミダゾール（１４８ｍｇ，０．９１６ｍｍｏｌ）をＴＨＦ溶媒に溶解させ、室温で１時間攪拌した。反応液を酢酸エチルで希釈し、水、食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムを加え５分静置した。フィルトレーションにより硫酸ナトリウムを取り除き、減圧下濃縮することにより、粗生成物を得たのち、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することにより、化合物７に相当する１Ｈ−イミダゾール−１−カルボン酸−９−ブチニルエステル（０．１５２ｇ，０．６１２ｍｍｏｌ）を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ−ｄ） δ １．３３−１．５０（ｍ，１０Ｈ），１．８２（ｍ，２Ｈ），１．９６（ｔ，Ｊ＝２．６Ｈｚ，１Ｈ）２．２１（ｔｄ，Ｊ＝６．８，２．６Ｈｚ，２Ｈ），４．４３（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ）７．１０（ｓ，１Ｈ），７．４５（ｂｒｓ，１Ｈ），８．１６（ｓ，１Ｈ）．
ＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ：２７１［Ｍ＋Ｎａ］＋
（２−１−３）イミダゾリルカルボニル化合物（化合物９）の合成
Figure 2019240288
Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（１１３ｍｇ，０．５４６ｍｍｏｌ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物（７８．１ｍｇ，０．５４６ｍｍｏｌ）、４−ペンチン酸（５３．６ｍｇ，０．５４６ｍｍｏｌ）をジクロロメタン溶媒に溶解させ、室温で１時間攪拌した後、１２−アミノ−ドデカノール（０．１００ｇ，０．４９７ｍｍｏｌ）を加え、室温で４時間攪拌した。反応液を酢酸エチルで希釈し、水、食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムを加え５分静置した。フィルトレーションにより硫酸ナトリウムを取り除き、減圧下濃縮することにより、化合物８に相当する１２−（ペンチ−４−イン−１−オキソ）アミノドデカン−１−オール（０．１０２ｇ，０．３６３ｍｍｏｌ）を得た。
ＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ：２８１［Ｍ＋Ｈ］＋
Figure 2019240288
１２−（ペンチ−４−インアミド）ドデカン−１−オール（２５．０ｍｇ，０．０８９ｍｍｏｌ）とカルボニルジイミダゾール（２９．１ｍｇ，０．１７８ｍｍｏｌ）をＴＨＦ溶媒に溶解させ、室温で１時間攪拌した。反応液を酢酸エチルで希釈し、水、食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムを加え５分静置した。フィルトレーションにより硫酸ナトリウムを取り除き、減圧下濃縮することにより粗生成物を得たのち、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することにより、化合物９に相当する１Ｈ−イミダゾール−１−カルボン酸−１２−（ペンチ−４−イン−１−オキソ）アミノドデカニルエステル（１２．０ｍｇ，０．０３２ｍｍｏｌ）を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ−ｄ） δ １．２３−１．５０（ｍ，２０Ｈ），１．８１（ｔ，Ｊ＝２．６Ｈｚ，１Ｈ），２．３６（ｍ，２Ｈ）２．５３（ｔｄ，Ｊ＝６．８，２．６Ｈｚ，２Ｈ），３．２３（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ）４．４１（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），５．６４（ｂｒｓ，１Ｈ），７．０７（ｓ，１Ｈ），７．４３（ｂｒｓ，１Ｈ），８．１３（ｓ，１Ｈ）．
ＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ：３９８［Ｍ＋Ｎａ］＋
（２−２）イミダゾリルカルボニル化合物の合成と親和性ペプチドアジド体との連結
実施例１で合成した親和性ペプチドアジド体（化合物４）と実施例２で合成したイミダゾリルカルボニル化合物（化合物６，７，９）は全て同様の方法で連結させた。ペプチドアジド体を１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解させ、アミノグアニジン塩酸塩（２０モル当量）、アスコルビン酸ナトリウム（２０モル当量）、１００ｍｇ／ｍＬのイミダゾリルカルボニル化合物（３モル当量）ジメチルスルホキシド溶液を加えた。この反応混合物に対して、別途調製した硫酸銅一水和物（４モル当量）とトリス（３−ヒドロキシプロピルトリアゾリルメチル）アミン （２０モル当量）の水溶液を添加し、攪拌した。ＬＣ−ＭＳで反応モニタリングを行い、原料の消失を確認した後、これを限外濾過（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ， ３Ｋ ＭＷＣＯ））にて濃縮と水希釈を４回繰り返し、得られた水溶液を凍結乾燥して下記に示すぺプチド−イミダゾリルカルボニル化合物（化合物１０，１１，１２）を取得した。
Figure 2019240288
ＭＳ （ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝３ １４５５［Ｍ＋３Ｈ］３＋，ｚ＝４ １０９２［Ｍ＋４Ｈ］４＋
Figure 2019240288
ＭＳ （ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝３ １４８３［Ｍ＋３Ｈ］３＋，ｚ＝４ １１１３［Ｍ＋４Ｈ］４＋
Figure 2019240288
ＭＳ （ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝３ １５２５［Ｍ＋３Ｈ］３＋，ｚ＝４ １１４４［Ｍ＋４Ｈ］４＋
［参考例１：モデル実験による親和性ペプチドから抗体修飾基（求電子基）までの原子数の違いによる、反応性の違いの検証］
（１−１）ＩｇＧ抗体トラスツズマブ−ペプチド複合体の合成
抗ＨＥＲ２ ＩｇＧ抗体トラスツズマブ（中外製薬）２０μｇを１００ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ ７．２）２．０μＬに溶解させ、実施例２の（２−２）で合成したぺプチド−イミダゾリルカルボニル化合物（化合物１０，１１，１２）をそれぞれ抗体に対して２０モル当量加えて、３７度で４時間攪拌した。反応液を限外濾過（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ， ３Ｋ ＭＷＣＯ））により水置換しペプチド試薬を取り除くことで反応を停止させ、ＩｇＧ抗体トラスツズマブ−ペプチド複合体を得た。
（１−２）ＩｇＧ抗体トラスツズマブ−ペプチド複合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析
３種のぺプチド−イミダゾリルカルボニル化合物（化合物１０，１１，１２）を用いて（１−１）で得られたＩｇＧ抗体トラスツズマブ−ペプチド複合体の３種ををＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｍｉｎｉ−ＰＲＯＴＥＡＮ ＴＧＸ ｇｅｌ，４〜２０％，Ｂｉｏ−ＲＡＤ；還元条件下；Ｃｏｏｍａｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ Ｇ−２５０ Ｓｔａｉｎにより染色）にて分析した結果を、図２に示す。この結果から、化合物１０，１１を用いたときには抗体の修飾反応が進行し、化合物１２を用いた際には進行しないことが分かった。
［実施例３：マレイミドを搭載した抗体親和性試薬の合成］
（３−１）保護チオール化合物の合成
（３−１−１）保護チオール化合物（化合物１４）の合成
Figure 2019240288
３−（トリフェニルメチルチオ）プロピオン酸（１００ｍｇ，０．２８７ｍｍｏｌ）をＴＨＦに溶解させ、０℃にてクロロ炭酸イソブチル（ ４２．７μＬ，０．３１６ｍｍｏｌ）、Ｎ−メチルモルホリン（６９．４μＬ，０．６３１ｍｍｏｌ）を加え３０分攪拌し、対応する混合酸無水物を調製した。室温にて５−アミノ吉草酸（３３．６ｍｇ、０．２８７ｍｍｏｌ）を１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液に溶解させたのち、前述の混合酸無水物のＴＨＦ溶液を室温にて滴下した。室温にて１６時間攪拌した後、反応液を水と酢酸エチルで洗浄し、水相を回収した。水相に６Ｍ塩酸水溶液を加え、系内のｐＨを３．０に調整した後、酢酸エチルによる分液抽出を行った後、有機相を食塩水で洗浄後、無水硫酸マグネシウムを加え５分静置した。フィルトレーションにより硫酸マグネシウムを取り除き、減圧下濃縮することにより粗生成物を得たのち、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することにより、化合物１３に相当する５−［３−（トリフェニルメチル）スルファニル−プロピル−１−オキソ］アミノ−ヘキサン酸（１１０ｍｇ，０．２４６ｍｍｏｌ）を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ−ｄ） δ １．６６（ｍ，３Ｈ），２．０３（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ），２．３９（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ），２．５２（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ），３．２２（ｑ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ），５．３７（ｓ，１Ｈ），７．１９−７．３６（ｍ，９Ｈ），７．４０−７．４９（ｍ，６Ｈ）．
ＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ：４７０［Ｍ＋Ｎａ］＋
Figure 2019240288
５−（３−トリフェニルメチル−プロピル−１−オキソ）アミノ−ヘキサン酸（２０．２ｍｇ，０．０４５ｍｍｏｌ）をＴＨＦに溶解させ、０℃にてクロロ炭酸イソブチル（ ６．７０μＬ，０．０５０ｍｍｏｌ）、Ｎ−メチルモルホリン（１０．９μＬ，０．０９９１ｍｍｏｌ）を加え３０分攪拌し、対応する混合酸無水物を調製した。室温にてプロパルギルアミン（１６．６μＬ、０．２２６ｍｍｏｌ）を１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液に溶解させたのち、前述の混合酸無水物のＴＨＦ溶液を室温にて滴下した。室温にて１６時間攪拌した後、反応液を水と酢酸エチルで洗浄し、水相を回収した。水相に６Ｍ塩酸水溶液を加え、系内のｐＨを３．０に調整した後、酢酸エチルによる分液抽出を行った後、有機相を食塩水で洗浄後、無水硫酸マグネシウムを加え５分静置した。フィルトレーションにより硫酸マグネシウムを取り除き、減圧下濃縮することにより、粗生成物を得たのち、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することにより、化合物１４に相当するＮ−プロピニル−５−（３−トリフェニルメチルスルファニル−プロピル−１−オキソ）アミノ−ヘキサンアミド（２０．０ｍｇ，０．０４１ｍｍｏｌ）を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ−ｄ） δ １．５２（ｄｔ，Ｊ＝８．２，６．５Ｈｚ，２Ｈ），１．５９−１．７２（ｍ，２Ｈ），２．０２−２．０９（ｍ，２Ｈ），２．１７−２．２８（ｍ，２Ｈ）２．５２（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），３．２１（ｂｒｓ，２Ｈ），４．０１（ｄｄ，Ｊ＝５．３，２．６Ｈｚ，２Ｈ），６．０４（ｓ，１Ｈ），７．１９−７．３５（ｍ，９Ｈ），７．４０−７．４９（ｍ，６Ｈ）．
ＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ：５０７［Ｍ＋Ｈ］＋
（３−１−２）保護チオール化合物（化合物１５）の合成
Figure 2019240288
３−（トリフェニルメチルチオ）プロピオン酸（１００ｍｇ，０．２８７ｍｍｏｌ）をＴＨＦに溶解させ、０℃にてクロロ炭酸イソブチル（４２．７μＬ，０．３１６ｍｍｏｌ）、Ｎ−メチルモルホリン（６９．４μＬ，０．６３１ｍｍｏｌ）を加え３０分攪拌し、対応する混合酸無水物を調製した。室温にてプロパルギルアミン（１０５μＬ、１．４３ｍｍｏｌ）を１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液に溶解させたのち、前述の混合酸無水物のＴＨＦ溶液を室温にて滴下した。室温にて１６時間攪拌した後、反応液を水と酢酸エチルで洗浄し、水相を回収した。水相に６Ｍ塩酸水溶液を加え、系内のｐＨを３．０に調整した後、酢酸エチルによる分液抽出を行った後、有機相を食塩水で洗浄後、無水硫酸マグネシウムを加え５分静置した。フィルトレーションにより硫酸マグネシウムを取り除き、減圧下濃縮することにより、化合物１５に相当するＮ−プロピニル−３−トリフェニルメチルスルファニル−プロパンアミド（１１０ｍｇ，０．２８６ｍｍｏｌ）を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ−ｄ） δ ２．０１（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ），２．２４（ｔ，Ｊ＝２．８Ｈｚ，１Ｈ），２．５３（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），３．９９（ｍ，２Ｈ），５．４０（ｂｒｓ，１Ｈ），７．１９−７．３５（ｍ，９Ｈ），７．４０−７．４９（ｍ，６Ｈ）．
ＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ：４０８［Ｍ＋Ｎａ］＋
（３−２）親和性ペプチドと保護チオール化合物の連結
（３−２−１）ぺプチド−保護チオール連結体（化合物１６）
の合成
Figure 2019240288
実施例１で合成した化合物５をＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドに溶解し、３−（トリフェニルメチルチオ）プロピオン酸（５モル当量）、１−エチル―３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（１５モル当量）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（１５モル当量）をＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドに溶解させ、系中に加えた。室温で１２時間攪拌した後、分取ＨＰＬＣにて精製した。目的物を含むフラクションをＥＳＩ−ＭＳで確認した後、凍結乾燥し生成物であるぺプチド−保護チオール連結体（化合物１６）を得た。
ＭＳ （ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝３ １５０２［Ｍ＋３Ｈ］３＋，ｚ＝４ １１２５［Ｍ＋４Ｈ］４＋
（３−２−２）ぺプチド−保護チオール連結体（化合物１７，１８）の合成
実施例１で合成した親和性ペプチドアジド体（化合物５）と（４−１−１）、（４−１−２）で合成した保護チオール化合物（化合物１７，１８）は同様の方法で連結させた。ペプチドアジド体を１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解させ、アミノグアニジン塩酸塩（２０モル当量）、アスコルビン酸ナトリウム（２０モル当量）、１００ｍｇ／ｍＬの保護チオール化合物（３モル当量）ジメチルスルホキシド溶液を加えた。この反応混合物に対して、別途調製した硫酸銅一水和物（４モル当量）とトリス（３−ヒドロキシプロピルトリアゾリルメチル）アミン（２０モル当量）の水溶液を添加し、攪拌した。ＬＣ−ＭＳで反応モニタリングを行い、原料の消失を確認した後、これを限外濾過（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−４， ３Ｋ ＭＷＣＯ）にて濃縮と水希釈を４回繰り返し、得られた水溶液を凍結乾燥してぺプチド−保護チオール連結体（化合物１７，１８）を取得した。
Figure 2019240288
ＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ：ｚ＝３ １５４８［Ｍ＋３Ｈ］３＋，ｚ＝４ １１６１［Ｍ＋４Ｈ］４＋
Figure 2019240288
ＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ：ｚ＝３ １５８１［Ｍ＋３Ｈ］３＋，ｚ＝４ １１８６［Ｍ＋４Ｈ］４＋
（３−３）ぺプチド−保護チオール連結体（化合物１９，２０，２１）の合成
（３−２）で合成した親和性ペプチド−保護チオール連結体（化合物１６，１７，１８）を、トリフルオロ酢酸：ジクロロメタン＝１：１溶液で１時間攪拌することにより、トリフェニルメチル基を除去した。反応終結をＬＣ−ＭＳで確認した後、分取ＨＰＬＣにて精製した。目的物を含むフラクションをＥＳＩ−ＭＳで確認した後、凍結乾燥し生成物であるチオール−ペプチド連結体（化合物１９，２０，２１）を得た。
Figure 2019240288
ＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ：ｚ＝３ １４５４［Ｍ＋３Ｈ］３＋，ｚ＝４ １０９１［Ｍ＋４Ｈ］４＋
Figure 2019240288
ＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ：ｚ＝３ １４６８［Ｍ＋３Ｈ］３＋，ｚ＝４ １１１１［Ｍ＋４Ｈ］４＋
Figure 2019240288
ｍ／ｚ：ｚ＝３ １５０１［Ｍ＋３Ｈ］３＋，ｚ＝４ １１２６［Ｍ＋４Ｈ］４＋
（３−４）マレイミドを搭載した抗体親和性ペプチド試薬の合成（１）（化合物２２、２３、２４）
（３−３）で合成したチオール−ペプチド連結体（化合物１９，２０，２１）をジメチルスルホキシドに溶解させ、Ｎ−ヒドロキシマレイミド（２０モル当量）のジメチルスルホキシド溶液を加え、１時間攪拌した。原料消失をＬＣ−ＭＳで確認した後、トランス−４−［（２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロリ−１−イル）メチル）］シクロヘキサンカルボン酸（４０モル当量）、１−エチル―３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（３０モル当量）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（３０モル当量）を加え、４時間攪拌した。反応終結をＬＣ−ＭＳで確認した後、分取ＨＰＬＣにて精製した。目的物を含むフラクションをＥＳＩ−ＭＳで確認した後、凍結乾燥し生成物であるマレイミド−親和性ペプチド試薬（化合物２２，２３，２４）を得た。
Figure 2019240288
ＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ：ｚ＝３ １５３２［Ｍ＋３Ｈ］３＋，ｚ＝４ １１５０［Ｍ＋４Ｈ］４＋
Figure 2019240288
ＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ：ｚ＝３ １５７８［Ｍ＋３Ｈ］３＋，ｚ＝４ １１８４［Ｍ＋４Ｈ］４＋
Figure 2019240288
ＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ：ｚ＝３ １６１１［Ｍ＋３Ｈ］３＋，ｚ＝４ １２０８［Ｍ＋４Ｈ］４＋
（３−５）マレイミドを搭載した抗体親和性ペプチド試薬の合成（２）（化合物５６、５８）
（３−５−１）Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド―ペプチド連結体（化合物５５）の合成
（１−１）で合成した化合物３をジメチルスルホキシドに溶解させ、トリエチルアミン（１当量）、Ｎ−ヒドロキシマレイミド（１．２当量）のジメチルスルホキシド溶液を加えて室温で１時間撹拌した。反応終結をＬＣ−ＭＳで確認した後、分取ＨＰＬＣにて精製した。目的物を含むフラクションをＥＳＩ−ＭＳで確認した後、凍結乾燥し生成物であるＮ−ヒドロキシスクシンイミド―ペプチド連結体（化合物５５）を得た。
Figure 2019240288
ＭＳ （ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝３ １４２９ ［Ｍ＋３Ｈ］３＋， Ｚ＝４ １０７２ ［Ｍ＋４Ｈ］４＋， ｚ＝５ ８５７ ［Ｍ＋５Ｈ］５＋， ｚ＝６ ７１５ ［Ｍ＋６Ｈ］６＋
（３−５−２）マレイミドを搭載した抗体親和性ペプチド試薬の合成（化合物５６）
（３−５−１）で得られたＮ−ヒドロキシスクシンイミド―ペプチド連結体、４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボン酸Ｎ−スクシンイミジル（２０当量）をジメチルスルホキシドに溶解させ、トリエチルアミン（８当量）を加えた。室温で２時間撹拌後、ＬＣ−ＭＳにて反応進行を確認した。分取ＨＰＬＣにて精製、目的物を含むフラクションをＥＳＩ−ＭＳで確認した後、凍結乾燥し目的物であるマレイミドを搭載した抗体親和性ペプチド試薬（化合物５６）を得た。
Figure 2019240288
ＭＳ （ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝３ １５０２ ［Ｍ＋３Ｈ］３＋， Ｚ＝４ １１２６ ［Ｍ＋４Ｈ］４＋， ｚ＝５ ９０１ ［Ｍ＋５Ｈ］５＋， ｚ＝６ ７５１ ［Ｍ＋６Ｈ］６＋
（３−５−３）Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド―ペプチド連結体（化合物５７）の合成
実施例１で合成した抗体親和性ペプチド（化合物３６）をジメチルスルホキシドに溶解させ、２−イミノチオラン塩酸塩（１０モル当量）、ジイソプロピルエチルアミン（１５モル当量）を加え、１時間攪拌した。原料消失をＬＣ−ＭＳで確認した後、Ｎ−ヒドロキシマレイミド（２０モル当量）のジメチルスルホキシド溶液を加え、１時間攪拌した。反応進行をＬＣ−ＭＳで確認した後、分取ＨＰＬＣにて精製した。目的物を含むフラクションをＥＳＩ−ＭＳで確認した後、凍結乾燥し生成物であるヒドロキシマレイミド−親和性ペプチド体（化合物５７）を得た。
Figure 2019240288
ＭＳ （ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝２ １１５２ ［Ｍ＋２Ｈ］２＋， Ｚ＝３ ７６９ ［Ｍ＋３Ｈ］３＋
（３−５−４）マレイミドを搭載した抗体親和性ペプチド試薬の合成 （化合物５８）
（３−５−２）で得られたＮ−ヒドロキシスクシンイミド−ペプチド連結体（Ｈ１）、４−〔（２，５−ジオキソー２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）メチル〕ベイゾイックアシッド（２０当量）をジメチルスルホキシドに溶解させ、トリエチルアミン（８当量）を加えた。室温で２時間撹拌後、ＬＣ−ＭＳにて反応進行を確認した。分取ＨＰＬＣにて精製、目的物を含むフラクションをＥＳＩ−ＭＳで確認した後、凍結乾燥し目的物であるマレイミドを搭載した抗体親和性ペプチド試薬（化合物５８）を得た。
Figure 2019240288
ＭＳ （ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝２ １２５９ ［Ｍ＋２Ｈ］２＋， Ｚ＝３ ８４０ ［Ｍ＋３Ｈ］３＋
［実施例４：抗ＨＥＲ２ ＩｇＧ抗体トラスツズマブへの位置選択的マレイミド導入と解析］
（４−１）チオールを有するペプチド試薬の合成
下記の化合物２５をＦｍｏｃ法による２−クロロトリチルレジンを用いたペプチド固相合成によって合成した。固相合成後、トリフルオロ酢酸：水：トリイソプロピルシラン＝９５：２．５：２．５の溶液にて１時間攪拌することで樹脂からの切り出しと脱保護を行った。樹脂をフィルトレーションにより除去し、ジエチルエーテルを加え沈殿を行い、ジエチルエーテルをデカンテーションすることで除去し、ペプチドを粗結晶として得た。これを分取ＨＰＬＣにて精製し、生成物である下記化合物２５を得た。化合物２５は、親和性ペプチドではなく、生体直交性官能基であるマレイミドを位置選択的に有する抗体に対して、マレイミド基を介して導入されるべき、薬剤の代わりのモデルペプチド化合物である。
Figure 2019240288
ＭＳ （ＥＳＩ） ｍ／ｚ：ｚ＝２ １４８２［Ｍ＋２Ｈ］２＋，ｚ＝３ ９８８［Ｍ＋３Ｈ］３＋
（４−２）マレイミド−親和性ペプチド試薬によるＩｇＧ抗体トラスツズマブへの位置特異的な修飾
実施例４の（４−４）で合成したマレイミド−親和性ペプチド試薬（化合物２２，２３，２４）をＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドに溶解し２．１８ｍＭとした。抗ＨＥＲ２ ＩｇＧ抗体トラスツズマブ（中外製薬）２０．０μｇを５０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ ７．２）１４．８μＬに溶解させ、ペプチド試薬（１０〜４０モル当量）を抗体に対して加えて、３７度で４時間攪拌した。反応液を限外濾過（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ， １０Ｋ ＭＷＣＯ））により２０ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）へと溶媒置換した。同操作を３回繰り返すことで親和性ペプチド試薬を取り除き、ＩｇＧ抗体トラスツズマブ−マレイミド修飾体を得た。
（４−３）ＩｇＧ抗体トラスツズマブ−マレイミド修飾体とチオールを有するペプチド試薬とのコンジュゲーション
実施例５の（５−２）で合成したＩｇＧ抗体トラスツズマブ−マレイミド修飾体を限外濾過（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ， １０Ｋ ＭＷＣＯ）により５０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ ７．２）へ溶媒置換することで、系内のｐＨを中性に戻し、１０ｍｇ／ｍＬに調製した化合物２５水溶液（抗体に対して８０モル当量）を加え、１６時間攪拌した。反応液を限外濾過（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ， １０Ｋ ＭＷＣＯ）により水置換しペプチド試薬を取り除くことで反応を停止させ、ＩｇＧ抗体トラスツズマブ−ペプチド複合体を得た。
（４−４）ＩｇＧ抗体トラスツズマブ−ペプチド複合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析
（４−３）で得られたＩｇＧ抗体トラスツズマブ−ペプチド複合体のをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｍｉｎｉ−ＰＲＯＴＥＡＮ ＴＧＸ ｇｅｌ，４〜２０％，Ｂｉｏ−ＲＡＤ；還元条件下；Ｃｏｏｍａｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ Ｇ−２５０ Ｓｔａｉｎにより染色）にて分析した結果を、図３に示す。この結果から、マレイミドの位置選択的導入反応（５−２）において化合物２２，２３を用いたときには抗体の修飾反応が進行し、化合物２４を用いた際には進行しないことが分かった。
（４−５）ＩｇＧ抗体トラスツズマブ−マレイミド修飾体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
（４−５−１）ＩｇＧ抗体トラスツズマブ−マレイミド修飾体の合成（１）
実施例３の（３−５−２）で合成したマレイミドを搭載した親和性ペプチド試薬（化合物５６）をＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドに溶解し２．０ｍＭとした。抗ＨＥＲ２ ＩｇＧ抗体トラスツズマブ（中外製薬）２５０μｇを５０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ ７．２）２３０μＬに溶解させ、２．０ｍＭのペプチド試薬を抗体に対して２０モル当量加えて、３７度で１６時間攪拌した。限外濾過（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ， １０ｋ ＭＷＣＯ）により濃縮することでＩｇＧ抗体トラスツズマブ−マレイミド修飾体を得た。
（４−５−２）トラスツズマブ−マレイミド修飾体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認（１）
（４−５−１）で合成したトラスツズマブ−マレイミド修飾体に対して７ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩溶液２．０μＬ（抗体に対して１００等量）を加えて、室温で２０分放置した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、コントロールとして用いた原料のトラスツズマブは５０５９６，５０７５７に重鎖ピーク、２３４３９に軽鎖ピークが観測された。反応生成物は重鎖にトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンと反応したマレイミドが導入された５１０６２，５１２２４、および原料と同じ２３４３９に軽鎖ピークが観測された。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析結果を図４に示す。
（４−５−３）ＩｇＧ抗体トラスツズマブ−マレイミド修飾体の合成（２）
（４−５−１）と同様に実施例３の（３−５−４）で合成したマレイミドを搭載した親和性ペプチド試薬（化合物５８）を用いて、ＩｇＧ抗体トラスツズマブ−アジド修飾体を得た。
（４−５−４）トラスツズマブ−マレイミド修飾体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認（２）
（４−５−２）と同様に処理を行い、ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、コントロールとして用いた原料のトラスツズマブは５０６０２，５０７６４に重鎖ピーク、２３４４３に軽鎖ピークが観測された。反応生成物は重鎖にＮ−アセチルシステインと反応したマレイミドが導入された５０８１８，５０９７９、および原料と同じ２３４４３に軽鎖ピークが観測された。
［実施例５：アジドを搭載した抗体修飾試薬の合成］
（５−１）抗体修飾基（求電子基）のβ位にヘテロ原子を有する抗体修飾試薬（比較例化合物）の合成
Figure 2019240288
実施例１で合成した抗体親和性ペプチド（化合物２）をジメチルスルホキシドに溶解させ、Ｎ−ヒドロキシマレイミド（２０モル当量）のジメチルスルホキシド溶液を加え、１時間攪拌した。原料消失をＬＣ−ＭＳで確認した後、１１−アジド−３，６，９−トリオキサウンデカン酸（４０モル当量）、１−エチル―３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（３２モル当量）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（３２モル当量）を加え、２時間攪拌した。反応終結をＬＣ−ＭＳで確認した後、分取ＨＰＬＣにて精製した。目的物を含むフラクションをＥＳＩ−ＭＳで確認した後、凍結乾燥し生成物であるアジド−ＰＥＧ−親和性ペプチド試薬（化合物２６）を得た。
ＭＳ （ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝３ １５０１［Ｍ＋３Ｈ］３＋，ｚ＝４ １１２５［Ｍ＋４Ｈ］４＋
（５−２）抗体修飾基（求電子基）のβ位に炭素原子またはヘテロ原子を有する抗体修飾試薬の合成
（５−２−１）アジド試薬と親和性ペプチドの連結による抗体修飾試薬（化合物２７，５９、６０）の合成
Figure 2019240288
実施例１で合成した抗体親和性ペプチド（化合物３）をジメチルスルホキシドに溶解させ、Ｎ−ヒドロキシマレイミド（２０モル当量）のジメチルスルホキシド溶液を加え、１時間攪拌した。原料消失をＬＣ−ＭＳで確認した後、６−アジド−ヘキサン酸（４０モル当量）、１−エチル―３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（３２モル当量）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（３２モル当量）を加え、２時間攪拌した。反応終結をＬＣ−ＭＳで確認した後、分取ＨＰＬＣにて精製した。目的物を含むフラクションをＥＳＩ−ＭＳで確認した後、凍結乾燥し生成物であるアジド−アルキル−親和性ペプチド試薬（化合物２７）を得た。
ＭＳ （ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝３ １４７５［Ｍ＋３Ｈ］３＋，ｚ＝４ １１０７［Ｍ＋４Ｈ］４＋
同様の方法にて、実施例３で合成したＮ−ヒドロキシスクシンイミド―ペプチド連結体（化合物５７）を用い、アジド−アルキル−親和性ペプチド試薬（化合物５９）を得た。
Figure 2019240288
ＭＳ （ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝２ １２２２ ［Ｍ＋２Ｈ］２＋， Ｚ＝３ ８１５ ［Ｍ＋３Ｈ］３＋
６−アジド−ヘキサン酸をアジド酢酸に変えて同様に合成を行い、アジド−アルキル−親和性ペプチド試薬（化合物６０）を得た。なお、化合物６０は、抗体修飾基（求電子基）のβ位にヘテロ原子を有する比較例化合物である。
Figure 2019240288
ＭＳ （ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝２ １１９３ ［Ｍ＋２Ｈ］２＋， Ｚ＝３ ７９６ ［Ｍ＋３Ｈ］３＋
（５−２−２）アジド試薬と親和性ペプチドの連結による抗体修飾試薬（化合物２８，６１）の合成
Figure 2019240288
実施例１で合成した抗体親和性ペプチド（化合物３）をジメチルスルホキシドに溶解させ、Ｎ−ヒドロキシマレイミド（２０モル当量）のジメチルスルホキシド溶液を加え、１時間攪拌した。原料消失をＬＣ−ＭＳで確認した後、４−アジド安息香酸（４０モル当量）、１−エチル―３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（３２モル当量）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（３２モル当量）を加え、２時間攪拌した。反応終結をＬＣ−ＭＳで確認した後、分取ＨＰＬＣにて精製した。目的物を含むフラクションをＥＳＩ−ＭＳで確認した後、凍結乾燥し生成物であるアジド−フェニル−親和性ペプチド試薬（化合物２８）を得た。
ＭＳ （ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝３ １４７８［Ｍ＋３Ｈ］３＋，ｚ＝４ １１０８［Ｍ＋４Ｈ］４＋
同様の方法にて、実施例１で合成した抗体親和性ペプチド（化合物３１）を用い、アジド−フェニル−親和性ペプチド試薬（化合物６１）を得た。
Figure 2019240288
ＭＳ （ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝３ １３４８ ［Ｍ＋３Ｈ］３＋， Ｚ＝４ １０１１ ［Ｍ＋４Ｈ］４＋
（５−２−３）アジド試薬と親和性ペプチドの連結による抗体修飾試薬（化合物２９，６２〜８３）の合成
Figure 2019240288
実施例１で合成した抗体親和性ペプチド（化合物３）をジメチルスルホキシドに溶解させ、２−イミノチオラン塩酸塩（１０モル当量）、ジイソプロピルエチルアミン（１５モル当量）を加え、１時間攪拌した。原料消失をＬＣ−ＭＳで確認した後、Ｎ−ヒドロキシマレイミド（２０モル当量）のジメチルスルホキシド溶液を加え、１時間攪拌した。反応進行をＬＣ−ＭＳで確認した後、４−アジド安息香酸（４０モル当量）、１−エチル―３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（３２モル当量）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（３２モル当量）を加え、２時間攪拌した。反応終結をＬＣ−ＭＳで確認した後、分取ＨＰＬＣにて精製した。目的物を含むフラクションをＥＳＩ−ＭＳで確認した後、凍結乾燥し生成物であるアジド−フェニル−親和性ペプチド試薬（化合物２９）を得た。
ＭＳ （ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝３ １５１２［Ｍ＋３Ｈ］３＋，ｚ＝４ １１３４［Ｍ＋４Ｈ］４＋
同様の手法にて、実施例１で合成した抗体親和性ペプチド（化合物３２〜５３）を用い、下記に示すアジド試薬と親和性ペプチドの連結による抗体修飾試薬を合成した（化合物６２〜８３）。
実施例１で合成した抗体親和性ペプチド（化合物３２）を用いて合成された抗体修飾試薬は、以下である。
Figure 2019240288
ＭＳ （ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝３ １５２１［Ｍ＋３Ｈ］３＋，ｚ＝４ １１４１［Ｍ＋４Ｈ］４＋
実施例１で合成した抗体親和性ペプチド（化合物３３）を用いて合成された抗体修飾試薬は、以下である。
Figure 2019240288
ＭＳ （ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝３ １５４６ ［Ｍ＋３Ｈ］３＋， Ｚ＝４ １１５９ ［Ｍ＋４Ｈ］４＋
実施例１で合成した抗体親和性ペプチド（化合物３４）を用いて合成された抗体修飾試薬は、以下である。
Figure 2019240288
ＭＳ （ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝３ １５３７ ［Ｍ＋３Ｈ］３＋， Ｚ＝４ １１５３ ［Ｍ＋４Ｈ］４＋
実施例１で合成した抗体親和性ペプチド（化合物３５）を用いて合成された抗体修飾試薬は、以下である。
Figure 2019240288
ＭＳ （ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝３ １５４５ ［Ｍ＋３Ｈ］３＋， Ｚ＝４ １１５９ ［Ｍ＋４Ｈ］４＋
実施例１で合成した抗体親和性ペプチド（化合物３６）を用いて合成された抗体修飾試薬は、以下である。
Figure 2019240288
ＭＳ （ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝２ １２２５［Ｍ＋Ｈ］＋，ｚ＝３ ８１７［Ｍ＋Ｈ］＋
実施例１で合成した抗体親和性ペプチド（化合物３７）を用いて合成された抗体修飾試薬は、以下である。
Figure 2019240288
ＭＳ （ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝２ １２１７ ［Ｍ＋２Ｈ］２＋，ｚ＝３ ８１２ ［Ｍ＋３Ｈ］３＋
実施例１で合成した抗体親和性ペプチド（化合物３８）を用いて合成された抗体修飾試薬は、以下である。
Figure 2019240288
ＭＳ （ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝２ １２１１ ［Ｍ＋２Ｈ］２＋，ｚ＝３ ８０７ ［Ｍ＋３Ｈ］３＋
実施例１で合成した抗体親和性ペプチド（化合物３９）を用いて合成された抗体修飾試薬は、以下である。
Figure 2019240288
ＭＳ （ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝２ １１９６ ［Ｍ＋２Ｈ］２＋，ｚ＝３ ７９８ ［Ｍ＋３Ｈ］３＋
実施例１で合成した抗体親和性ペプチド（化合物４０）を用いて合成された抗体修飾試薬は、以下である。
Figure 2019240288
ＭＳ （ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝２ １２２４ ［Ｍ＋２Ｈ］２＋，ｚ＝３ ８１７ ［Ｍ＋３Ｈ］３＋
実施例１で合成した抗体親和性ペプチド（化合物４１）を用いて合成された抗体修飾試薬は、以下である。
Figure 2019240288
ＭＳ （ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝２ １２２４ ［Ｍ＋２Ｈ］２＋，ｚ＝３ ８１７ ［Ｍ＋３Ｈ］３＋
実施例１で合成した抗体親和性ペプチド（化合物４２）を用いて合成された抗体修飾試薬は、以下である。
Figure 2019240288
ＭＳ （ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝２ ９６１ ［Ｍ＋２Ｈ］２＋
実施例１で合成した抗体親和性ペプチド（化合物４３）を用いて合成された抗体修飾試薬は、以下である。
Figure 2019240288
ＭＳ （ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝１ １９０９［Ｍ＋Ｈ］＋，ｚ＝３ ９５５［Ｍ＋Ｈ］＋
実施例１で合成した抗体親和性ペプチド（化合物４４）を用いて合成された抗体修飾試薬は、以下である。
Figure 2019240288
ＭＳ （ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝２ １２３９ ［Ｍ＋２Ｈ］２＋，ｚ＝３ ８２７ ［Ｍ＋３Ｈ］３＋
実施例１で合成した抗体親和性ペプチド（化合物４５）を用いて合成された抗体修飾試薬は、以下である。
Figure 2019240288
ＭＳ （ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝２ １２５３ ［Ｍ＋２Ｈ］２＋，ｚ＝３ ８３６ ［Ｍ＋３Ｈ］３＋
実施例１で合成した抗体親和性ペプチド（化合物４６）を用いて合成された抗体修飾試薬は、以下である。
Figure 2019240288
ＭＳ （ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝２ １２６０ ［Ｍ＋２Ｈ］２＋，ｚ＝３ ８４１ ［Ｍ＋３Ｈ］３＋
実施例１で合成した抗体親和性ペプチド（化合物４７）を用いて合成された抗体修飾試薬は、以下である。
Figure 2019240288
ＭＳ （ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝２ １２６５［Ｍ＋Ｈ］＋，ｚ＝３ ８４４［Ｍ＋Ｈ］＋
実施例１で合成した抗体親和性ペプチド（化合物４８）を用いて合成された抗体修飾試薬は、以下である。
Figure 2019240288
ＭＳ （ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝２ １２２５ ［Ｍ＋２Ｈ］２＋，ｚ＝３ ８１７ ［Ｍ＋３Ｈ］３＋
実施例１で合成した抗体親和性ペプチド（化合物４９）を用いて合成された抗体修飾試薬は、以下である。
Figure 2019240288
ＭＳ （ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝２ ８５３ ［Ｍ＋２Ｈ］２＋
実施例１で合成した抗体親和性ペプチド（化合物５０）を用いて合成された抗体修飾試薬は、以下である。
Figure 2019240288
ＭＳ （ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝２ １２３２ ［Ｍ＋２Ｈ］２＋，ｚ＝３ ８２２ ［Ｍ＋３Ｈ］３＋
実施例１で合成した抗体親和性ペプチド（化合物５１）を用いて合成された抗体修飾試薬は、以下である。
Figure 2019240288
ＭＳ （ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝２ １２５３ ［Ｍ＋２Ｈ］２＋，ｚ＝３ ８３６ ［Ｍ＋３Ｈ］３＋
実施例１で合成した抗体親和性ペプチド（化合物５２）を用いて合成された抗体修飾試薬は、以下である。
Figure 2019240288
ＭＳ （ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝２ １２５４ ［Ｍ＋２Ｈ］２＋，ｚ＝３ ８３６ ［Ｍ＋３Ｈ］３＋
実施例１で合成した抗体親和性ペプチド（化合物５３）を用いて合成された抗体修飾試薬は、以下である。
Figure 2019240288
ＭＳ （ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝２ １１４７ ［Ｍ＋２Ｈ］２＋，ｚ＝３ ７６４ ［Ｍ＋３Ｈ］３＋
［実施例６：ＩｇＧ１ Ｆｃ親和性ペプチド試薬によるＩｇＧ１ Ｆｃの位置特異的修飾とＥＳＩ−ＴＯＦＭＳによる解析］
（６−１）抗体修飾基（求電子基）のβ位に炭素原子を有する抗体修飾試薬での抗体修飾反応
（６−１−１）親和性ペプチド試薬（化合物２７、化合物５９）を用いた抗体修飾反応（アジド修飾抗体１，２）
実施例５で合成したアジドを搭載した親和性ペプチド試薬（化合物２７）をＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドに溶解し０．２２ｍＭとした。抗ＨＥＲ２ ＩｇＧ抗体トラスツズマブ（中外製薬）２００μｇを５０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ ７．２）１２００μＬに溶解させ、０．２２ｍＭのペプチド試薬を抗体に対して２０モル当量加えて、３７度で１６時間攪拌した。反応液に１０ｍｇ／ｍＬのＬｙｓ水溶液を５０μＬ加え、３０分攪拌することで反応を停止させた。反応混合物をＰｒｏｔｅｉｎ Ａ（Ａｓｐｉｒｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｔｉｐｓ，Ｔｈｅｒｍｏ）にて精製し、溶出液を ９．５７ｍＭ ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．０）へと置換し限外濾過（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ， １０Ｋ ＭＷＣＯ）により濃縮することでＩｇＧ抗体トラスツズマブ−アジド修飾体（アジド修飾抗体１）を得た。
同様の手法にて、アジドを搭載した親和性ペプチド試薬（化合物５９）を用いて抗体修飾反応を行いＩｇＧ抗体トラスツズマブ−アジド修飾体（アジド修飾抗体２）を得た。
（６−１−２）親和性ペプチド試薬（化合物２８、化合物６１）を用いた抗体修飾反応（アジド修飾抗体３、４）
実施例５で合成したアジドを搭載した親和性ペプチド試薬（化合物２８）をＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドに溶解し０．２２ｍＭとした。抗ＨＥＲ２ ＩｇＧ抗体トラスツズマブ（中外製薬）２００μｇを５０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ ７．２）１２００μＬに溶解させ、０．２２ｍＭのペプチド試薬を抗体に対して２０モル当量加えて、３７度で１６時間攪拌した。反応液に１０ｍｇ／ｍＬのＬｙｓ水溶液を５０μＬ加え、３０分攪拌することで反応を停止させた。反応混合物をＰｒｏｔｅｉｎ Ａ（Ａｓｐｉｒｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｔｉｐｓ，Ｔｈｅｒｍｏ）にて精製し、溶出液を ９．５７ｍＭ ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．０）へと置換し限外濾過（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ， １０Ｋ ＭＷＣＯ）により濃縮することでＩｇＧ抗体トラスツズマブ−アジド修飾体（アジド修飾抗体３）を得た。
同様の手法にてアジドを搭載した親和性ペプチド試薬（化合物６１）を用いて抗体修飾反応を行いＩｇＧ抗体トラスツズマブ−アジド修飾体（アジド修飾抗体４）を得た。
（６−１−３）親和性ペプチド試薬（化合物２９、化合物６２〜８３）を用いた抗体修飾反応（アジド修飾抗体５〜２７）
実施例５で合成したアジドを搭載した親和性ペプチド試薬（化合物２９）をＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドに溶解し０．２２ｍＭとした。抗ＨＥＲ２ ＩｇＧ抗体トラスツズマブ（中外製薬）２００μｇを５０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ ７．２）１２００μＬに溶解させ、０．２２ｍＭのペプチド試薬を抗体に対して２０モル当量加えて、３７度で１６時間攪拌した。反応液に１０ｍｇ／ｍＬのＬｙｓ水溶液を５０μＬ加え、３０分攪拌することで反応を停止させた。反応混合物をＰｒｏｔｅｉｎ Ａ（Ａｓｐｉｒｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｔｉｐｓ，Ｔｈｅｒｍｏ）にて精製し、溶出液を ９．５７ｍＭ ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．０）へと置換し限外濾過（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ， １０Ｋ ＭＷＣＯ）により濃縮することでＩｇＧ抗体トラスツズマブ−アジド修飾体を得た（アジド修飾抗体５）。
同様の手法にてアジドを搭載した親和性ペプチド試薬（化合物６２）を用いて抗体修飾反応を行いＩｇＧ抗体トラスツズマブ−アジド修飾体（アジド修飾抗体６）を得た。
同様の手法にてアジドを搭載した親和性ペプチド試薬（化合物６３）を用いて抗体修飾反応を行いＩｇＧ抗体トラスツズマブ−アジド修飾体（アジド修飾抗体７）を得た。
同様の手法にてアジドを搭載した親和性ペプチド試薬（化合物６４）を用いて抗体修飾反応を行いＩｇＧ抗体トラスツズマブ−アジド修飾体（アジド修飾抗体８）を得た。
同様の手法にてアジドを搭載した親和性ペプチド試薬（化合物６５）を用いて抗体修飾反応を行いＩｇＧ抗体トラスツズマブ−アジド修飾体（アジド修飾抗体９）を得た。
同様の手法にてアジドを搭載した親和性ペプチド試薬（化合物６６）を用いて抗体修飾反応を行いＩｇＧ抗体トラスツズマブ−アジド修飾体（アジド修飾抗体１０）を得た。
同様の手法にてアジドを搭載した親和性ペプチド試薬（化合物６７）を用いて抗体修飾反応を行いＩｇＧ抗体トラスツズマブ−アジド修飾体（アジド修飾抗体１１）を得た。
同様の手法にてアジドを搭載した親和性ペプチド試薬（化合物６８）を用いて抗体修飾反応を行いＩｇＧ抗体トラスツズマブ−アジド修飾体（アジド修飾抗体１２）を得た。
同様の手法にてアジドを搭載した親和性ペプチド試薬（化合物６９）を用いて抗体修飾反応を行いＩｇＧ抗体トラスツズマブ−アジド修飾体（アジド修飾抗体１３）を得た。
同様の手法にてアジドを搭載した親和性ペプチド試薬（化合物７０）を用いて抗体修飾反応を行いＩｇＧ抗体トラスツズマブ−アジド修飾体（アジド修飾抗体１４）を得た。
同様の手法にてアジドを搭載した親和性ペプチド試薬（化合物７１）を用いて抗体修飾反応を行いＩｇＧ抗体トラスツズマブ−アジド修飾体（アジド修飾抗体１５）を得た。
同様の手法にてアジドを搭載した親和性ペプチド試薬（化合物７２）を用いて抗体修飾反応を行いＩｇＧ抗体トラスツズマブ−アジド修飾体（アジド修飾抗体１６）を得た。
同様の手法にてアジドを搭載した親和性ペプチド試薬（化合物７３）を用いて抗体修飾反応を行いＩｇＧ抗体トラスツズマブ−アジド修飾体（アジド修飾抗体１７）を得た。
同様の手法にてアジドを搭載した親和性ペプチド試薬（化合物７４）を用いて抗体修飾反応を行いＩｇＧ抗体トラスツズマブ−アジド修飾体（アジド修飾抗体１８）を得た。
同様の手法にてアジドを搭載した親和性ペプチド試薬（化合物７５）を用いて抗体修飾反応を行いＩｇＧ抗体トラスツズマブ−アジド修飾体（アジド修飾抗体１９）を得た。
同様の手法にてアジドを搭載した親和性ペプチド試薬（化合物７６）を用いて抗体修飾反応を行いＩｇＧ抗体トラスツズマブ−アジド修飾体（アジド修飾抗体２０）を得た。
同様の手法にてアジドを搭載した親和性ペプチド試薬（化合物７７）を用いて抗体修飾反応を行いＩｇＧ抗体トラスツズマブ−アジド修飾体（アジド修飾抗体２１）を得た。
同様の手法にてアジドを搭載した親和性ペプチド試薬（化合物７８）を用いて抗体修飾反応を行いＩｇＧ抗体トラスツズマブ−アジド修飾体（アジド修飾抗体２２）を得た。
同様の手法にてアジドを搭載した親和性ペプチド試薬（化合物７９）を用いて抗体修飾反応を行いＩｇＧ抗体トラスツズマブ−アジド修飾体（アジド修飾抗体２３）を得た。
同様の手法にてアジドを搭載した親和性ペプチド試薬（化合物８０）を用いて抗体修飾反応を行いＩｇＧ抗体トラスツズマブ−アジド修飾体（アジド修飾抗体２４）を得た。
同様の手法にてアジドを搭載した親和性ペプチド試薬（化合物Ｆ８１）を用いて抗体修飾反応を行いＩｇＧ抗体トラスツズマブ−アジド修飾体（アジド修飾抗体２５）を得た。
同様の手法にてアジドを搭載した親和性ペプチド試薬（化合物８２）を用いて抗体修飾反応を行いＩｇＧ抗体トラスツズマブ−アジド修飾体（アジド修飾抗体２６）を得た。
同様の手法にてアジドを搭載した親和性ペプチド試薬（化合物８３）を用いて抗体修飾反応を行いＩｇＧ抗体トラスツズマブ−アジド修飾体（アジド修飾抗体２７）を得た。
（６−１−４）親和性ペプチド試薬（化合物６６）を用いたトラスツマブ以外の抗体修飾反応（アジド修飾抗体２８〜３１）
実施例５で合成したアジドを搭載した親和性ペプチド試薬（化合物６６）をＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドに溶解し２．０ｍＭとした。抗ＴＮＦ−α ＩｇＧ抗体アダリムマブ（エーザイ）２００μｇを５０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ ７．２）１２００μＬに溶解させ、２．０ｍＭのペプチド試薬を抗体に対して２０モル当量加えて、２５度で１６時間攪拌した。反応液に１０ｍｇ／ｍＬのＬｙｓ水溶液を５０μＬ加え、３０分攪拌することで反応を停止させた。反応混合物をＰｒｏｔｅｉｎ Ａ（Ａｓｐｉｒｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｔｉｐｓ，Ｔｈｅｒｍｏ）にて精製し、溶出液を ９．５７ｍＭ ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．０）へと置換し限外濾過（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ， １０Ｋ ＭＷＣＯ）により濃縮することでＩｇＧ抗体アダリムマブ−アジド修飾体を得た（アジド修飾抗体２８）。
上記と同様の手法にて、抗ＲＡＮＫＬ ＩｇＧ抗体デノスマブ（第一三共）を用いて抗体修飾反応を行い、ＩｇＧ抗体デノスマブマブ−アジド修飾体（アジド修飾抗体２９）を得た。
上記と同様の手法にて、抗ＩＬ−４／１３ ＩｇＧ抗体デュピルマブ（サノフィ）を用いて抗体修飾反応を行い、ＩｇＧ抗体デュピルマブ−アジド修飾体（アジド修飾抗体３０）を得た。
上記と同様の手法にて、抗ＣＤ２０ ＩｇＧ抗体リツキシマブ（ロッシュ社）を用いて抗体修飾反応を行い、ＩｇＧ抗体リツキシマブ−アジド修飾体（アジド修飾抗体３１）を得た。
（６−２）ＩｇＧ抗体トラスツズマブ−アジド修飾体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
（６−２−１）修飾反応に化合物２７、化合物５９を用いた際のトラスツズマブ−アジド修飾体（アジド修飾抗体１，２）の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
実施例６の（６−１−１）で合成したトラスツズマブ−アジド修飾体（アジド修飾抗体１）に対して７ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩溶液２．０μＬ（抗体に対して１００等量）を加えて、室温で２０分放置した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、コントロールとして用いた原料のトラスツズマブは５０５９５，５０７５７に重鎖ピーク、２３４４０に軽鎖ピークが観測された。反応生成物は重鎖にアルキルアジドが導入された５０７３３，５０８９５、および原料と同じ２３４４０に軽鎖ピークが観測された。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析結果を図５に示す。
同様の手法にて、アジド修飾抗体２についてもＥＳＩ−ＴＯＦ ＭＳ解析を行った。コントロールとして用いた原料のトラスツズマブは５０６０２，５０７６４に重鎖ピーク、２３４４３に軽鎖ピークが観測された。反応生成物は重鎖にアルキルアジドが導入された５０７４２，５０９０４、および原料と同じ２３４４３に軽鎖ピークが観測された。
（６−２−２）修飾反応に化合物２８、化合物６１を用いた際のトラスツズマブ−アジド修飾体（アジド修飾抗体３、４）の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
実施例６の（６−１−２）で合成したトラスツズマブ−アジド修飾体（アジド修飾抗体３）に対して７ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩溶液２．０μＬ（抗体に対して１００等量）を加えて、室温で２０分放置した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、コントロールとして用いた原料のトラスツズマブは５０５９５，５０７５７に重鎖ピーク、２３４４０に軽鎖ピークが観測された。反応生成物は重鎖にアミン安息香酸が導入された５０７１４，５０８７６、および原料と同じ２３４４０に軽鎖ピークが観測された。なお、測定前処理の７ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩の還元反応により、アジド安息香酸導入体は還元されアミン安息香酸導入体となっている。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析結果を図６に示す。
同様の手法にて、アジド修飾抗体４についてもＥＳＩ−ＴＯＦ ＭＳ解析を行った。コントロールとして用いた原料のトラスツズマブは５０５９７，５０７５８に重鎖ピーク、２３４４１に軽鎖ピークが観測された。反応生成物は重鎖にアミン安息香酸が導入された５０７１６，５０８７７、および原料と同じ２３４４１に軽鎖ピークが観測された。
（６−２−３）修飾反応に化合物２９、化合物６２〜８３を用いた際のトラスツズマブ−アジド修飾体（アジド修飾抗体５〜２７）の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
実施例６の（６−１−３）で合成したトラスツズマブ−アジド修飾体（アジド修飾抗体５）に対して７ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩溶液２．０μＬ（抗体に対して１００等量）を加えて、室温で２０分放置した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、コントロールとして用いた原料のトラスツズマブは５０５９５，５０７５７に重鎖ピーク、２３４４０に軽鎖ピークが観測された。反応生成物は重鎖にアミン安息香酸が導入された５０７１４，５０８７６、および原料と同じ２３４４０に軽鎖ピークが観測された。なお、測定前処理でアジド安息香酸導入体は還元されアミン安息香酸導入体となっている。
同様の手法にて、アジド修飾抗体６についてもＥＳＩ−ＴＯＦ ＭＳ解析を行った。コントロールとして用いた原料のトラスツズマブは５０５９４，５０７６に重鎖ピーク、２３４３９に軽鎖ピークが観測された。反応生成物は重鎖にアミン安息香酸が導入された５０７１４，５０８７５、および原料と同じ２３４３９に軽鎖ピークが観測された。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析結果を図７に示す。
同様の手法にて、アジド修飾抗体７についてもＥＳＩ−ＴＯＦ ＭＳ解析を行った。コントロールとして用いた原料のトラスツズマブは５０５９４，５０７６に重鎖ピーク、２３４３９に軽鎖ピークが観測された。反応生成物は重鎖にアミン安息香酸が導入された５０７１３，５０８７５、および原料と同じ２３４３９に軽鎖ピークが観測された。
同様の手法にて、アジド修飾抗体８についてもＥＳＩ−ＴＯＦ ＭＳ解析を行った。コントロールとして用いた原料のトラスツズマブは５０６０２，５０７６４に重鎖ピーク、２３４４３に軽鎖ピークが観測された。反応生成物は重鎖にアミン安息香酸が導入された５０７２１，５０８８３、および原料と同じ２３４４２に軽鎖ピークが観測された。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析結果を図８に示す。
同様の手法にて、アジド修飾抗体９についてもＥＳＩ−ＴＯＦ ＭＳ解析を行った。コントロールとして用いた原料のトラスツズマブは５０５９５，５０７５７に重鎖ピーク、２３４４０に軽鎖ピークが観測された。反応生成物は重鎖にアミン安息香酸が導入された５０７１４，５０８７５、および原料と同じ２３４４０に軽鎖ピークが観測された。
同様の手法にて、アジド修飾抗体１０についてもＥＳＩ−ＴＯＦ ＭＳ解析を行った。コントロールとして用いた原料のトラスツズマブは５０６０２，５０７６４に重鎖ピーク、２３４４３に軽鎖ピークが観測された。反応生成物は重鎖にアミン安息香酸が導入された５０７２１，５０８８３、および原料と同じ２３４４３に軽鎖ピークが観測された。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析結果を図９に示す。
同様の手法にて、アジド修飾抗体１１についてもＥＳＩ−ＴＯＦ ＭＳ解析を行った。コントロールとして用いた原料のトラスツズマブは５０５９５，５０７５７に重鎖ピーク、２３４４０に軽鎖ピークが観測された。反応生成物は重鎖にアミン安息香酸が導入された５０７１３，５０８７４、および原料と同じ２３４４０に軽鎖ピークが観測された。
同様の手法にて、アジド修飾抗体１２についてもＥＳＩ−ＴＯＦ ＭＳ解析を行った。コントロールとして用いた原料のトラスツズマブは５０５９５，５０７５７に重鎖ピーク、２３４４０に軽鎖ピークが観測された。反応生成物は重鎖にアミン安息香酸が導入された５０７１４，５０８７６、および原料と同じ２３４４０に軽鎖ピークが観測された。
同様の手法にて、アジド修飾抗体１３についてもＥＳＩ−ＴＯＦ ＭＳ解析を行った。コントロールとして用いた原料のトラスツズマブは５０５９４，５０７５６に重鎖ピーク、２３４４０に軽鎖ピークが観測された。反応生成物は重鎖にアミン安息香酸が導入された５０７１４，５０８７６、および原料と同じ２３４４０に軽鎖ピークが観測された。
同様の手法にて、アジド修飾抗体１４についてもＥＳＩ−ＴＯＦ ＭＳ解析を行った。コントロールとして用いた原料のトラスツズマブは５０５９４，５０７５６に重鎖ピーク、２３４４０に軽鎖ピークが観測された。反応生成物は重鎖にアミン安息香酸が導入された５０７１４，５０８７６、および原料と同じ２３４４０に軽鎖ピークが観測された。
同様の手法にて、アジド修飾抗体１５についてもＥＳＩ−ＴＯＦ ＭＳ解析を行った。コントロールとして用いた原料のトラスツズマブは５０５９４，５０７５６に重鎖ピーク、２３４４０に軽鎖ピークが観測された。反応生成物は重鎖にアミン安息香酸が導入された５０７１４，５０８７６、および原料と同じ２３４４０に軽鎖ピークが観測された。
同様の手法にて、アジド修飾抗体１６についてもＥＳＩ−ＴＯＦ ＭＳ解析を行った。コントロールとして用いた原料のトラスツズマブは５０５９４，５０７５６に重鎖ピーク、２３４４０に軽鎖ピークが観測された。反応生成物は重鎖にアミン安息香酸が導入された５０７１４，５０８７５、および原料と同じ２３４４０に軽鎖ピークが観測された。
同様の手法にて、アジド修飾抗体１７についてもＥＳＩ−ＴＯＦ ＭＳ解析を行った。コントロールとして用いた原料のトラスツズマブは５０５９５，５０７５７に重鎖ピーク、２３４４０に軽鎖ピークが観測された。反応生成物は重鎖にアミン安息香酸が導入された５０７１４，５０８７６、および原料と同じ２３４４０に軽鎖ピークが観測された。
同様の手法にて、アジド修飾抗体１８についてもＥＳＩ−ＴＯＦ ＭＳ解析を行った。コントロールとして用いた原料のトラスツズマブは５０５９４，５０７５６に重鎖ピーク、２３４３９に軽鎖ピークが観測された。反応生成物は重鎖にアミン安息香酸が導入された５０７１４，５０８７６、および原料と同じ２３４４０に軽鎖ピークが観測された。
同様の手法にて、アジド修飾抗体１９についてもＥＳＩ−ＴＯＦ ＭＳ解析を行った。コントロールとして用いた原料のトラスツズマブは５０５９５，５０７５７に重鎖ピーク、２３４４０に軽鎖ピークが観測された。反応生成物は重鎖にアミン安息香酸が導入された５０７１４，５０８７５、および原料と同じ２３４４０に軽鎖ピークが観測された。
同様の手法にて、アジド修飾抗体２０についてもＥＳＩ−ＴＯＦ ＭＳ解析を行った。コントロールとして用いた原料のトラスツズマブは５０５９５，５０７５７に重鎖ピーク、２３４４０に軽鎖ピークが観測された。反応生成物は重鎖にアミン安息香酸が導入された５０７１４，５０８７５、および原料と同じ２３４４０に軽鎖ピークが観測された。
同様の手法にて、アジド修飾抗体２１についてもＥＳＩ−ＴＯＦ ＭＳ解析を行った。コントロールとして用いた原料のトラスツズマブは５０５９５，５０７５７に重鎖ピーク、２３４４０に軽鎖ピークが観測された。反応生成物は重鎖にアミン安息香酸が導入された５０７１４，５０８７６、および原料と同じ２３４４０に軽鎖ピークが観測された。
同様の手法にて、アジド修飾抗体２２についてもＥＳＩ−ＴＯＦ ＭＳ解析を行った。コントロールとして用いた原料のトラスツズマブは５０５９５，５０７５７に重鎖ピーク、２３４４０に軽鎖ピークが観測された。反応生成物は重鎖にアミン安息香酸が導入された５０７１４，５０８７５、および原料と同じ２３４４０に軽鎖ピークが観測された。
同様の手法にて、アジド修飾抗体２３についてもＥＳＩ−ＴＯＦ ＭＳ解析を行った。コントロールとして用いた原料のトラスツズマブは５０５９７，５０７５９に重鎖ピーク、２３４４０に軽鎖ピークが観測された。反応生成物は重鎖にアミン安息香酸が導入された５０７１４，５０８７６、および原料と同じ２３４４０に軽鎖ピークが観測された。
同様の手法にて、アジド修飾抗体２４についてもＥＳＩ−ＴＯＦ ＭＳ解析を行った。コントロールとして用いた原料のトラスツズマブは５０５９７，５０７５９に重鎖ピーク、２３４４０に軽鎖ピークが観測された。反応生成物は重鎖にアミン安息香酸が導入された５０７１４，５０８７６、および原料と同じ２３４４０に軽鎖ピークが観測された。
同様の手法にて、アジド修飾抗体２５についてもＥＳＩ−ＴＯＦ ＭＳ解析を行った。コントロールとして用いた原料のトラスツズマブは５０５９７，５０７５９に重鎖ピーク、２３４４０に軽鎖ピークが観測された。反応生成物は重鎖にアミン安息香酸が導入された５０７１４，５０８７６、および原料と同じ２３４４０に軽鎖ピークが観測された。
同様の手法にて、アジド修飾抗体２６についてもＥＳＩ−ＴＯＦ ＭＳ解析を行った。コントロールとして用いた原料のトラスツズマブは５０５９７，５０７５９に重鎖ピーク、２３４４０に軽鎖ピークが観測された。反応生成物は重鎖にアミン安息香酸が導入された５０７１４，５０８７６、および原料と同じ２３４４０に軽鎖ピークが観測された。
同様の手法にて、アジド修飾抗体２７についてもＥＳＩ−ＴＯＦ ＭＳ解析を行った。コントロールとして用いた原料のトラスツズマブは５０６０２，５０７６４に重鎖ピーク、２３４４３に軽鎖ピークが観測された。反応生成物は重鎖にアミン安息香酸が導入された５０７２１，５０８８３、および原料と同じ２３４４０に軽鎖ピークが観測された。
（６−２−３）修飾反応に化合物５を用いた際の抗体−アジド修飾体（アジド修飾抗体２８〜３１）の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
実施例６の（６−１−４）で合成したアダリムマブ−アジド修飾体（アジド修飾抗体２８）に対して７ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩溶液２．０μＬ（抗体に対して１００等量）を加えて、室温で２０分放置した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、コントロールとして用いた原料のアダリムマブは５０６４５，５０７６４に重鎖ピーク、２３４１２に軽鎖ピークが観測された。反応生成物は重鎖にアミン安息香酸が導入された５０７６３，５０９２６、および原料と同じ２３４１２に軽鎖ピークが観測された。なお、測定前処理の７ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩の還元反応により、アジド安息香酸導入体は還元されアミン安息香酸導入体となっている（以下同様）。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析結果を図１０に示す。
同様の手法にて、アジド修飾抗体２９（デノスマブ―アジド修飾抗体）についてもＥＳＩ−ＴＯＦ ＭＳ解析を行った。コントロールとして用いた原料のデノスマブは５０２０８，５０３７１に重鎖ピーク、２３４８７に軽鎖ピークが観測された。反応生成物は重鎖にアミン安息香酸が導入された５０３２７，５０４９０、および原料と同じ２３４８７に軽鎖ピークが観測された。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析結果を図１１に示す。
同様の手法にて、アジド修飾抗体３０（デュピルマブ―アジド修飾抗体）についてもＥＳＩ−ＴＯＦ ＭＳ解析を行った。コントロールとして用いた原料のデュピルマブは５０８８９に重鎖ピーク、２４０２２に軽鎖ピークが観測された。反応生成物は重鎖にアミン安息香酸が導入された５１００９、および原料と同じ２４０２２に軽鎖ピークが観測された。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析結果を図１２に示す。
同様の手法にて、アジド修飾抗体３１（リツキシマブ―アジド修飾抗体）についてもＥＳＩ−ＴＯＦ ＭＳ解析を行った。コントロールとして用いた原料のリツキシマブは５０５１５，５０６７８に重鎖ピーク、２３０４０に軽鎖ピークが観測された。反応生成物は重鎖にアミン安息香酸が導入された５０６３５，５０７９７、および原料と同じ２３０４０に軽鎖ピークが観測された（図１３）。
［比較例１：β位にヘテロ原子を有するペプチド試薬によるＩｇＧ１ Ｆｃの修飾反応とＥＳＩ−ＴＯＦＭＳによる解析］
実施例５で合成したβ位にヘテロ原子を有するペプチド試薬（化合物２６）をＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドに溶解し０．２２ｍＭとした。抗ＨＥＲ２ ＩｇＧ抗体トラスツズマブ（中外製薬）２００μｇを５０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ ７．２）１２００μＬに溶解させ、０．２２ｍＭのペプチド試薬を１２０μＬ（抗体に対して２０モル当量）加えて、３７度で１６時間攪拌した。反応液に１０ｍｇ／ｍＬのＬｙｓ水溶液を５０μＬ加え、３０分攪拌することで反応を停止させた。これを限外濾過（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ， １０Ｋ ＭＷＣＯ）によりＰＢＳ溶液へと溶媒置換した後、７ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩溶液２．０μＬ（抗体に対して１００等量）を加えて、室温で２０分放置した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、コントロールとして用いた原料のトラスツズマブは５０５９５，５０７５７に重鎖ピーク、２３４４０に軽鎖ピークが観測された。同様に反応生成物も５０５９５，５０７５７に重鎖ピーク、２３４４０に軽鎖ピークが観測され、抗体修飾基（求電子基）のβ位にヘテロ原子を有する化合物２６での抗体修飾反応は進行していないことが確認できた。
同様にβ位にヘテロ原紙を有するペプチド試薬（化合物６０）を用いて、抗体修飾反応を行った。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、コントロールとして用いた原料のトラスツズマブは５０６０２，５０７６４に重鎖ピーク、２３４４３に軽鎖ピークが観測された。同様に反応生成物も５０６０２，５０７６４に重鎖ピーク、２３４４３に軽鎖ピークが観測され、β位にヘテロ原子を有する化合物６０での抗体修飾反応は進行していないことが確認できた。
この結果から、アジドの位置選択的導入反応（６−２）において化合物２７、２８、２９を用いたときには抗体の修飾反応が進行し、化合物２６を用いた際には進行しないことが分かった。
［実施例７：チオール保護体を搭載した抗体修飾試薬の合成］
（７−１）保護チオール試薬と親和性ペプチドの連結による抗体修飾試薬（化合物８４）の合成
（３−５−３）で合成したヒドロキシマレイミド−親和性ペプチド体（化合物５７）をジメチルスルホキシド溶媒に溶かし、３−（アセチルチオ）プロピオン酸（４０モル当量）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（３２モル当量）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（３２モル当量）を加え、２時間攪拌した。反応終結をＬＣ−ＭＳで確認した後、分取ＨＰＬＣにて精製した。目的物を含むフラクションをＥＳＩ−ＭＳで確認した後、凍結乾燥し生成物であるアセチルチオール−親和性ペプチド試薬（化合物８４）を得た。
Figure 2019240288
ＭＳ （ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝２ １２１７ ［Ｍ＋２Ｈ］２＋，ｚ＝３ ８１２ ［Ｍ＋３Ｈ］３＋
（７−２）保護チオール試薬と親和性ペプチドの連結による抗体修飾試薬（化合物８５）の合成
（３−５−３）で合成したヒドロキシマレイミド−親和性ペプチド体（化合物５７）をジメチルスルホキシド溶媒に溶かし、（Ｓ）−３−（ベンゾイルチオ）−２−メチルプロピオン酸（４０モル当量）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（３２モル当量）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（３２モル当量）を加え、２時間攪拌した。反応終結をＬＣ−ＭＳで確認した後、分取ＨＰＬＣにて精製した。目的物を含むフラクションをＥＳＩ−ＭＳで確認した後、凍結乾燥し生成物であるベンゾイルチオール−親和性ペプチド試薬（化合物８５）を得た。
Figure 2019240288
ＭＳ （ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝２ １２５５ ［Ｍ＋２Ｈ］２＋，ｚ＝３ ８３７ ［Ｍ＋３Ｈ］３＋
［実施例８：チオール保護体搭載ＩｇＧ１ Ｆｃ親和性ペプチド試薬によるＩｇＧ１ Ｆｃの位置特異的修飾とＥＳＩ−ＴＯＦＭＳによる解析］
（８−１）チオール保護体搭載ＩｇＧ１ Ｆｃ親和性ペプチド試薬での抗体修飾反応
（８−１−１）親和性ペプチド試薬（化合物８４）を用いた抗体修飾反応
実施例７で合成した保護チオールを搭載した親和性ペプチド試薬（化合物８４）をＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドに溶解し２．０ｍＭとした。抗ＨＥＲ２ ＩｇＧ抗体トラスツズマブ（中外製薬）２００μｇを５０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ ７．２）２００μＬに溶解させ、２．０ｍＭのペプチド試薬を抗体に対して２０モル当量加えて、２５度で３時間攪拌した。反応液を限外濾過（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ， １０ｋ ＭＷＣＯ）により濃縮することでＩｇＧ抗体トラスツズマブ−保護チオール修飾体を得た。
（８−１−２）親和性ペプチド試薬（化合物８５）を用いた抗体修飾反応
実施例７で合成した保護チオールを搭載した親和性ペプチド試薬（化合物８５）をＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドに溶解し２．０ｍＭとした。抗ＨＥＲ２ ＩｇＧ抗体トラスツズマブ（中外製薬）２００μｇを５０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ ７．２）２００μＬに溶解させ、２．０ｍＭのペプチド試薬を抗体に対して２０モル当量加えて、２５度で３時間攪拌した。反応液を限外濾過（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ， １０ｋ ＭＷＣＯ）により濃縮することでＩｇＧ抗体トラスツズマブ−保護チオール修飾体を得た。
（８−２）ＩｇＧ抗体トラスツズマブ−保護チオール修飾体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
（８−２−１）修飾反応に親和性ペプチド試薬（化合物８４）を用いた際のトラスツズマブ−アジド修飾体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
（８−１−１）で合成したトラスツズマブ−保護チオール修飾体に対して７ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩溶液２．０μＬ（抗体に対して１００等量）を加えて、室温で２０分放置した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、コントロールとして用いた原料のトラスツズマブは５０５９４，５０７５６に重鎖ピーク、２３４３９に軽鎖ピークが観測された。反応生成物は重鎖にアセチル保護チオール基が導入された５０７２３，５０８８５、および原料と同じ２３４３９に軽鎖ピークが観測された。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析結果を図１４に示す。
（８−２−２）修飾反応に親和性ペプチド試薬（化合物３）を用いた際のトラスツズマブ−保護チオール体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
（８−１−２）で合成したトラスツズマブ−保護チオール修飾体に対して７ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩溶液２．０μＬ（抗体に対して１００等量）を加えて、室温で２０分放置した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、コントロールとして用いた原料のトラスツズマブは５０５９４，５０７５６に重鎖ピーク、２３４３９に軽鎖ピークが観測された。反応生成物は重鎖にベンゾイル保護チオール基が導入された５０８００，５０９６２、および原料と同じ２３４３９に軽鎖ピークが観測された。
（８−３）ＩｇＧ抗体トラスツズマブ−チオール修飾体の生成確認
（８−３−１）ＩｇＧ抗体トラスツズマブ−アセチル保護チオール修飾体の脱保護
（８−２−１）で得た、ＩｇＧ抗体抗体トラスツズマブ−アセチル保護チオール修飾体を２０ｍＭエチレンジアミン、０．５Ｍヒドロキシルアミン水溶液（ｐＨ６調製品）に置換し、室温で１時間静置した。反応液を限外濾過（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ， １０ｋ ＭＷＣＯ）により濃縮することでＩｇＧ抗体トラスツズマブ−チオール修飾体を得た。
（８−３−２）ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析によるＩｇＧ抗体トラスツズマブ−チオール修飾体の生成確認
（８−３−１）で脱保護したトラスツズマブ−チオール修飾体に対して７ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩溶液２．０μＬ（抗体に対して１００等量）を加えて、室温で２０分放置した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、反応生成物は重鎖にアセチル基が脱保護された５０６８１，５０８４４が観測され、アセチル基が外れてチオールとなっていることを確認できた。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析結果を図１５に示す。
（８−３−３）ＩｇＧ抗体トラスツズマブ−ベンゾイル保護チオール修飾体の脱保護
（８−２−２）で得た、ＩｇＧ抗体抗体トラスツズマブ−ベンゾイル保護チオール修飾体を２０ｍＭエチレンジアミン、０．５Ｍヒドロキシルアミン水溶液（ｐＨ６調製品）に置換し、室温で１時間静置した。反応液を限外濾過（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ， １０ｋ ＭＷＣＯ）により濃縮することでそれぞれのＩｇＧ抗体トラスツズマブ−チオール修飾体を得た。
（８−３−４）ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析によるＩｇＧ抗体トラスツズマブ−チオール修飾体の生成確認
（８−３−３）で脱保護したトラスツズマブ−チオール修飾体に対して７ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩溶液２．０μＬ（抗体に対して１００等量）を加えて、室温で２０分放置した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、反応生成物は重鎖にベンゾイル基が脱保護された５０６９６，５０８５８が観測されベンゾイル基が外れてチオールとなっていることを確認できた。
［実施例９：ＩｇＧ１ Ｆｃ親和性ペプチド試薬によるＩｇＧ１ Ｆｃの異なる複数標的領域の位置選択的修飾とＥＳＩ−ＴＯＦＭＳによる解析］
（９−１）２種類の親和性ペプチド試薬を段階的に用いた異なる複数標的領域の位置選択的修飾ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳによる解析
（９−１−１）２種類の親和性ペプチド試薬（化合物６６、化合物６４）を段階的に用いた複数個所位置特異的抗体修飾反応
実施例５で合成したアジドを搭載した親和性ペプチド試薬（化合物６６）をＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドに溶解し２．０４ｍＭとした。抗ＨＥＲ２ ＩｇＧ抗体トラスツズマブ（中外製薬）３００μｇを５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ４．７）３００μＬに溶解させ、２．０４ｍＭのペプチド試薬を抗体に対して２０モル当量加えて、２５度で３時間攪拌した。限外濾過（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ， １０ｋ ＭＷＣＯ）によりペプチド試薬残渣を除去し、得られた濃縮液を５０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ ７．２）２００μＬにて希釈した。ここに、実施例５で合成したアジドを搭載した親和性ペプチド試薬（化合物６４）の２．０ｍＭＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド溶液を抗体に対して２０モル当量加えて、３７度で１６時間攪拌した。反応液に１０ｍｇ／ｍＬのＬｙｓ水溶液を５０μＬ加え、３０分攪拌することで反応を停止させた。限外濾過（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ， １０ｋ ＭＷＣＯ）により濃縮することでＩｇＧ抗体トラスツズマブ−アジド修飾体を得た。
（９−１−２）ＩｇＧ抗体トラスツズマブ−アジド修飾体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
実施例９の（９−１−１）で合成したトラスツズマブ−アジド修飾体に対して７ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩溶液２．０μＬ（抗体に対して１００等量）を加えて、室温で２０分放置した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、コントロールとして用いた原料のトラスツズマブは５０６０２，５０７６４に重鎖ピーク、２３４４３に軽鎖ピークが観測された。反応生成物は重鎖に二つアミン安息香酸が導入された５０８４１，５１００２が観測された。軽鎖ピークは原料と同じ２３４４３が観測された。なお、測定前処理でアジド安息香酸導入体は還元されアミン安息香酸導入体となっている。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析結果を図１６に示す。
（９−１−３）２種類の親和性ペプチド試薬（化合物６４、化合物６６）を段階的に用いた異なる複数標的領域の位置選択的修飾反応
実施例５で合成したアジドを搭載した親和性ペプチド試薬（化合物６４）をＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドに溶解し２．０ｍＭとした。抗ＨＥＲ２ ＩｇＧ抗体トラスツズマブ（中外製薬）３００μｇを５０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ ７．２）３００μＬに溶解させ、２．０ｍＭのペプチド試薬を抗体に対して２０モル当量加えて、３７度で１６時間攪拌した。限外濾過（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ， １０ｋ ＭＷＣＯ）によりペプチド試薬残渣を除去し、得られた濃縮液を５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ４．７）２００μＬにて希釈した。ここに、実施例５で合成したアジドを搭載した親和性ペプチド試薬（化合物６６）の２．０４ｍＭＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド溶液を抗体に対して２０モル当量加えて、３７度で１６時間攪拌した。反応液に１０ｍｇ／ｍＬのＬｙｓ水溶液を５０μＬ加え、３０分攪拌することで反応を停止させた。限外濾過（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ， １０ｋ ＭＷＣＯ）により濃縮することでＩｇＧ抗体トラスツズマブ−アジド修飾体を得た。
（９−１−４）ＩｇＧ抗体トラスツズマブ−アジド修飾体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
実施例９の（９−１−２）と同様の方法にてＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定した。コントロールとして用いた原料のトラスツズマブは５０６０２，５０７６４に重鎖ピーク、２３４４３に軽鎖ピークが観測された。反応生成物は重鎖に二つアミン安息香酸が導入された５０８４０，５１００２が観測された。軽鎖ピークは原料と同じ２３４４３が観測された。なお、測定前処理でアジド安息香酸導入体は還元されアミン安息香酸導入体となっている。
（９−１−５）２種類の親和性ペプチド試薬（化合物８４，化合物６４）を段階的に用いた複数個所位置特異的抗体修飾反応
実施例７で合成したチオール保護体を搭載した親和性ペプチド試薬（化合物８４）をＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドに溶解し２．０４ｍＭとした。抗ＨＥＲ２ ＩｇＧ抗体トラスツズマブ（中外製薬）３００μｇを５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ４．７）３００μＬに溶解させ、２．０４ｍＭのペプチド試薬を抗体に対して２０モル当量加えて、２５度で３時間攪拌した。限外濾過（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ， １０ｋ ＭＷＣＯ）によりペプチド試薬残渣を除去し、得られた濃縮液を５０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ ７．２）２００μＬにて希釈した。ここに、実施例５で合成したアジドを搭載した親和性ペプチド試薬（化合物６４）の２．０ｍＭＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド溶液を抗体に対して２０モル当量加えて、３７度で１６時間攪拌した。反応液に１０ｍｇ／ｍＬのＬｙｓ水溶液を５０μＬ加え、３０分攪拌することで反応を停止させた。限外濾過（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ， １０ｋ ＭＷＣＯ）により濃縮することでＩｇＧ抗体トラスツズマブ−アジド修飾体を得た。
（９−１−６）ＩｇＧ抗体トラスツズマブ−アジドーチオール修飾体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
（９−１−５）で合成したＩｇＧ抗体トラスツズマブ−アジド修飾体について、実施例９の（９−１−２）と同様の方法にてＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定した。コントロールとして用いた原料のトラスツズマブは５０５９７，５０７５７に重鎖ピーク、２３４３９に軽鎖ピークが観測された。反応生成物は重鎖にアミン安息香酸とアセチル保護チオール基が導入された５０８４３，５１００５が観測された。軽鎖ピークは原料と同じ２３４４３が観測された。なお、測定前処理でアジド安息香酸導入体は還元されアミン安息香酸導入体となっている。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析結果を図１７に示す。
（９−２）複数誘導化部位を持つ親和性ペプチドを用いた異なる複数標的領域の位置選択的修飾とＥＳＩ−ＴＯＦＭＳによる解析
（９−２−１）複数誘導化部位を持つ親和性ペプチド（化合物８６）の合成
実施例１で合成した抗体親和性ペプチド（化合物５４）をジメチルスルホキシドに溶解させ、２−イミノチオラン塩酸塩（１０モル当量）、ジイソプロピルエチルアミン（１５モル当量）を加え、１時間攪拌した。原料消失をＬＣ−ＭＳで確認した後、Ｎ−ヒドロキシマレイミド（２０モル当量）のジメチルスルホキシド溶液を加え、１時間攪拌した。反応進行をＬＣ−ＭＳで確認した後、４−アジド安息香酸（４０モル当量）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（３２モル当量）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（３２モル当量）を加え、２時間攪拌した。反応終結をＬＣ−ＭＳで確認した後、分取ＨＰＬＣにて精製した。目的物を含むフラクションをＥＳＩ−ＭＳで確認した後、凍結乾燥し生成物であるジ（アジド−フェニル）−親和性ペプチド試薬（化合物８６）を得た。
Figure 2019240288
ＭＳ （ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝３ １５８７ ［Ｍ＋３Ｈ］３＋， ３ １１９１ ［Ｍ＋４Ｈ］４＋
（９−２−２）複数誘導化部位を持つ親和性ペプチドを用いた複数個所位置特異的抗体修飾反応
実施例９の（９−２−１）で合成したジ（アジド−フェニル）−親和性ペプチド試薬（化合物８６）をＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドに溶解し２．０ｍＭとした。抗ＨＥＲ２ ＩｇＧ抗体トラスツズマブ（中外製薬）２５０μｇを５０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ ７．２）２５０μＬに溶解させ、２．０ｍＭのペプチド試薬を抗体に対して２０モル当量加えて、２５度で３時間攪拌した。反応液を限外濾過（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ， １０ｋ ＭＷＣＯ）により濃縮することでＩｇＧ抗体トラスツズマブ−アジド修飾体を得た。
（９−２−３）ＩｇＧ抗体トラスツズマブ−アジド修飾体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
実施例９の（９−２−２）で合成したトラスツズマブ−アジド修飾体に対して７ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩溶液２．０μＬ（抗体に対して１００等量）を加えて、室温で２０分放置した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、コントロールとして用いた原料のトラスツズマブは５０６０２，５０７６４に重鎖ピーク、２３４４３に軽鎖ピークが観測された。反応生成物は重鎖に二つアミン安息香酸が導入された５０８４１，５１００３が観測された。軽鎖ピークは原料と同じ２３４４３が観測された。なお、測定前処理でアジド安息香酸導入体は還元されアミン安息香酸導入体となっている。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析結果を図１８に示す。
［実施例１０：トラスツズマブの位置特異的アジド導入体と任意の化合物とのコンジュゲーションおよび生成物のＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析］
（１０−１）トラスツズマブの位置特異的アジド導入体とＣｙ３−シクロアルキンとのコンジュゲーション
（１０−１−１）トラスツズマブの位置特異的アジド導入体とＣｙ３−ＤＢＣＯとのコンジュゲーションおよびＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析
実施例６の（６−１−２）で合成したトラスツズマブのアジド安息香酸導入体を２０ｍＭ ＰＢＳ緩衝液に溶解し０．３ｍＭとした後、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ製 Ｄｉｂｅｎｚｏｃｙｃｌｏｏｃｔｙｎｅ−Ｃｙ３（０．９４ｍＭ、ジメチルスルホキシドに溶解）を２０μＬ添加し、室温で１２時間攪拌した。反応液を限外濾過（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ， １０Ｋ ＭＷＣＯ）により水置換し反応を停止した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、トラスツズマブは１４８０６０にピークが観測され、（６−１−２）で合成したトラスツズマブのアジド導入体は１４８４８９にピークが観測され、反応生成物はＣｙ３が２つ導入された１５０４８７にピークが観測された（図１９）。
（１０−１−２）還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析
（１０−１−１）で合成したトラスツズマブ−Ｃｙ３複合体のＰＢＳ溶液に７ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩溶液２μＬ（トラスツズマブ−Ｃｙ３複合体に対して１００等量）を加えて、室温で２０分攪拌した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料である実施例６の（６−１−１）で合成したトラスツズマブのアジド導入体は５０７１４および５０８７６に重鎖ピーク、２３４４０に軽鎖ピークが観測され、トラスツズマブ−Ｃｙ３複合体は重鎖にＣｙ３が導入された５１７２２および５１８８５にピークが観察され、原料と同じ２３４４０に軽鎖ピークが観測された（図２０）。なお、測定前処理の７ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩の還元反応により、アジド安息香酸導入体は還元されアミン安息香酸導入体となっている。
（１０−２）トラスツズマブの位置特異的アジド導入体とペプチド−シクロアルキンとのコンジュゲーション
（１０−２−１）ペプチド−シクロアルキンの合成
下記の化合物３０のペプチド部分をＦｍｏｃ法による２−クロロトリチルレジンを用いたペプチド固相合成によって合成した。固相合成後、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（２モル当量）、１−エチル―３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩 （２モル当量）、トリエチルアミン（２モル当量）、５−（５，６−ジヒドロ−１１，１２−ジデヒドロジベンゾ［ｂ，ｆ］［ｂ，ｆ］アゾシン−５（６Ｈ）−イル）−オキソペンタン酸（２．２モル当量）を随時添加し、１９時間攪拌した。トリフルオロ酢酸：水：トリイソプロピルシラン＝９５：２．５：２．５の溶液にて１時間攪拌することで樹脂からの切り出しと脱保護を行い、切り出し後のろ液にはトリエチルアミンを加え中和した。樹脂をフィルトレーションにより除去し、ジエチルエーテルを加え沈殿を行い、ジエチルエーテルをデカンテーションすることで除去し、ペプチドを粗結晶として得た。これを分取ＨＰＬＣにて精製し、生成物である下記化合物３０を得た。
Figure 2019240288
ＭＳ （ＥＳＩ） ｍ／ｚ：１２００［Ｍ＋Ｈ］＋
（１０−２−２）トラスツズマブの位置特異的アジド導入体とペプチド−シクロアルキンとのコンジュゲーションおよびＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析
実施例６の（６−１−２）で合成したトラスツズマブのアジド安息香酸導入体を２０ｍＭ ＰＢＳ緩衝液に溶解し０．３ｍＭとした後、実施例７の（７−２−１）で合成したペプチド−シクロアルキン（化合物２９）０．９４ｍＭ水溶液を２０μＬ添加し、室温で１２時間攪拌した。反応液を限外濾過（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ， １０Ｋ ＭＷＣＯ）により水置換し反応を停止した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、トラスツズマブは１４８０６０にピークが観測され、（６−１−２）で合成したトラスツズマブのアジド導入体は１４８４８９にピークが観測され、反応生成物はペプチドが２つ導入された１５０９１２にピークが観測された（図２１）。
（１０−２−３）還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析
（１０−２−２）で合成したトラスツズマブ−ペプチド複合体のＰＢＳ溶液に７ｍＭトリス （２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩溶液２μＬ（トラスツズマブ−ペプチド複合体に対して１００等量）を加えて、室温で２０分攪拌した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料である実施例６の（６−１−１）で合成したトラスツズマブのアジド導入体は５０７１４および５０８７６に重鎖ピーク、２３４４０に軽鎖ピークが観測され、トラスツズマブ−ペプチド複合体は重鎖にペプチドが導入された５１９４１および５２１０２にピークが観察され、原料と同じ２３４４０に軽鎖ピークが観測された（図２２）。なお、測定前処理の７ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩の還元反応により、アジド安息香酸導入体は還元されアミン安息香酸導入体となっている。
（１０−３）トラスツズマブの位置特異的チオール導入体とマレイミド化合物とのコンジュゲーションおよびＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析
（１０−３−１）トラスツズマブの位置特異的チオール導入体とマレイミド化合物とのコンジュゲーションおよびＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析
実施例８の（８−３−１）で合成したトラスツズマブのチオール導入体を２０ｍＭ ＰＢＳ緩衝液に溶解し０．３ｍＭとした後、ｍ−ｄＰＥＧ（登録商標）２４−ＭＡＬを５モル当量添加し、室温で１２時間攪拌した。反応液を限外濾過（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ， １０ｋ ＭＷＣＯ）により処理した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、トラスツズマブは１４８２２にピークが観測され、（８−３−３）で合成したトラスツズマブのチオール導入体は１４８２４３にピークが観測され、反応生成物はｍ−ｄＰＥＧ（登録商標）２４−ＭＡＬが二つ導入された１５０８８０にピークが観測された（図２３）。
（１０−３−２）還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析
（１０−３−１）で合成したトラスツズマブ−ペグ複合体のＰＢＳ溶液に７ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩溶液２μＬ（トラスツズマブ−ペグ複合体に対して１００等量）を加えて、室温で２０分攪拌した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料である実施例８の（８−３−３）で合成したトラスツズマブのチオール導入体は５０６８２および５０８４４に重鎖ピーク、２３４４９に軽鎖ピークが観測され、反応生成物は重鎖にｍ−ｄＰＥＧ（登録商標）２４−ＭＡＬが導入された５１９２２および５２０８３にピークが観察され、原料と同じ２３４４９に軽鎖ピークが観測された（図２４）。
［実施例１１：トラスツズマブの生体直交性官能基導入体の位置特異的修飾の確認］
（１１−１）トラスツズマブの生体直交性官能基導入体の糖鎖切断
（１１−１−１）トラスツズマブのアジド安息香酸導入体の糖鎖切断（１）
実施例６の（６−１−２）で合成したトラスツズマブのアジド安息香酸導入体（アジド修飾抗体３）をＰＮＧａｓｅ Ｆ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢｉｏＬａｂｓ，カタログ番号Ｐ０７０４）を用い、製造者プロトコルおよび特許（ＷＯ２０１７／１９１８１７の手法に従い、糖鎖の切断と後処理を行った。
（１１−１−２）トラスツズマブのアジド安息香酸導入体の糖鎖切断（２）
実施例６の（６−１−３）で合成したトラスツズマブのアジド安息香酸導入体（アジド修飾抗体５）をＰＮＧａｓｅ Ｆ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢｉｏＬａｂｓ，カタログ番号Ｐ０７０４）を用い、製造者プロトコルおよび特許（ＷＯ２０１７／１９１８１７）の手法に従い、糖鎖の切断と後処理を行った。
（１１−１−３）トラスツズマブのマレイミド導入体の糖鎖切断（３）（Ｋ２４６／２４８）
実施例４の（４−５−１）で合成したトラスツズマブのマレイミド導入体を３−メルカプトプロピオン酸（２０モル当量）存在下、ＰＮＧａｓｅ Ｆ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢｉｏＬａｂｓ，カタログ番号Ｐ０７０４）を用い、製造者プロトコルおよび特許（ＷＯ２０１７／１９１８１７５７）の手法に従い、糖鎖の切断と後処理を行った。
（１１−１−４）トラスツズマブのアルキルアジド導入体の糖鎖切断（４）（Ｋ２４６／２４８）
実施例６の（６−１−１）で合成したトラスツズマブのアルキルアジド導入体（アジド修飾抗体２）をＰＮＧａｓｅ Ｆ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢｉｏＬａｂｓ，カタログ番号Ｐ０７０４）を用い、製造者プロトコルおよび特許（ＷＯ２０１７／１９１８１７５７）の手法に従い、糖鎖の切断と後処理を行った。
（１１−１−５）トラスツズマブのアジド安息香酸導入体の糖鎖切断（５）（Ｋ３１７）
実施例６の（６−１−３）で合成したトラスツズマブのアジド安息香酸導入体（アジド修飾抗体６）をＰＮＧａｓｅ Ｆ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢｉｏＬａｂｓ，カタログ番号Ｐ０７０４）を用い、製造者プロトコルおよび特許（ＷＯ２０１７／１９１８１７５７）の手法に従い、糖鎖の切断と後処理を行った。
（１１−１−６）トラスツズマブのアジド安息香酸導入体の糖鎖切断（６）（Ｋ２８８／２９０）
実施例６の（６−１−３）で合成したトラスツズマブのアジド安息香酸導入体（アジド修飾抗体８）をＰＮＧａｓｅ Ｆ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢｉｏＬａｂｓ，カタログ番号Ｐ０７０４）を用い、製造者プロトコルおよび特許（ＷＯ２０１７／１９１８１７５７）の手法に従い、糖鎖の切断と後処理を行った。
（１１−１−７）トラスツズマブのアジド安息香酸導入体の糖鎖切断（７）（Ｋ２４６／２４８）
実施例６の（６−１−３）で合成したトラスツズマブのアジド安息香酸導入体（アジド修飾抗体１０）をＰＮＧａｓｅ Ｆ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢｉｏＬａｂｓ，カタログ番号Ｐ０７０４）を用い、製造者プロトコルおよび特許（ＷＯ２０１７／１９１８１７５７）の手法に従い、糖鎖の切断と後処理を行った。
（１１−１−８）トラスツズマブのアセチル保護チオール導入体の糖鎖切断（８）（Ｋ２４６／２４８）
実施例８の（８−１−３）で合成したトラスツズマブのアセチル保護チオール導入体をＰＮＧａｓｅ Ｆ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢｉｏＬａｂｓ，カタログ番号Ｐ０７０４）を用い、製造者プロトコルおよび特許（ＷＯ２０１７／１９１８１７５７）の手法に従い、糖鎖の切断と後処理を行った。
（１１−１−９）トラスツズマブのアジド安息香酸複数標的領域導入体の糖鎖切断（９）
実施例９の（９−１−３）で合成したトラスツズマブのアジド安息香酸複数標的領域導入体をＰＮＧａｓｅ Ｆ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢｉｏＬａｂｓ，カタログ番号Ｐ０７０４）を用い、製造者プロトコルおよび特許（ＷＯ２０１７／１９１８１７５７）の手法に従い、糖鎖の切断と後処理を行った。
（１１−１−１０）トラスツズマブのアジドーチオール複数標的領域導入体の糖鎖切断（１０）
実施例９の（９−１−４）で合成したトラスツズマブのアジドーチオール複数標的領域導入体をＰＮＧａｓｅ Ｆ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢｉｏＬａｂｓ，カタログ番号Ｐ０７０４）を用い、製造者プロトコルおよび特許（ＷＯ２０１７／１９１８１７５７）の手法に従い、糖鎖の切断と後処理を行った。
（１１−１−１１）デノスマブのアジド安息香酸複数標的領域導入体の糖鎖切断（１１）
実施例６の（６−１−４）で合成したデノスマブのアジド安息香酸導入体（アジド修飾抗体２９）をＰＮＧａｓｅ Ｆ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢｉｏＬａｂｓ，カタログ番号Ｐ０７０４）を用い、製造者プロトコルおよび特許（ＷＯ２０１７／１９１８１７５７）の手法に従い、糖鎖の切断と後処理を行った。
（１１−１−１２）デュピルマブのアジド安息香酸複数標的領域導入体の糖鎖切断（１２）
実施例６の（６−１−４）で合成したデュピルマブのアジド安息香酸導入体（アジド修飾抗体３０）をＰＮＧａｓｅ Ｆ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢｉｏＬａｂｓ，カタログ番号Ｐ０７０４）を用い、製造者プロトコルおよび特許（ＷＯ２０１７／１９１８１７５７）の手法に従い、糖鎖の切断と後処理を行った。
（１１−２）トラスツズマブのアジド安息香酸導入体のトリプシン処理
（１１−２−１）トラスツズマブのアジド安息香酸導入体の糖鎖切断物のトリプシン処理（１）
１．５ｍＬ低吸着マイクロテストチューブに（１１−１−１）で得たトラスツズマブのアジド安息香酸導入体の糖鎖切断物のサンプル溶液を３．４μＬ、５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム緩衝液を６．６μＬ添加して計１０μＬとし、５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム緩衝液、２０％トリフルオロエタノールに溶解した２０ｍＭのジチオスレイトール水溶液１０μＬを加えて６５℃で１時間加温後、５０ｍＭのヨードアセトアミド水溶液１０μＬを添加し、遮光下室温にて３０分間３００ｒｐｍで振盪し反応させた。反応後、５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム緩衝液を４０μＬ加えて撹拌し、２０ｎｇ／μＬのトリプシン水溶液を１０μＬ添加して３７℃で１８時間酵素消化した。消化後、２０％トリフルオロ酢酸水溶液を２μＬ添加し反応を止めた。その後、５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム緩衝液、０．５％トリフルオロ酢酸を用いて１０倍希釈し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ測定に使用した。
（１１−２−２）トラスツズマブのアジド安息香酸導入体の糖鎖切断物のトリプシン処理（２）
１．５ｍＬ低吸着マイクロテストチューブに（１１−１−２）で得たトラスツズマブのアジド安息香酸導入体の糖鎖切断物のサンプル溶液を１０μＬ、５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム緩衝液、２０％トリフルオロエタノールに溶解した２０ｍＭのジチオスレイトール水溶液１０μＬを加えて６５℃で１時間加温後、５０ｍＭのヨードアセトアミド水溶液１０μＬを添加し、遮光下室温で３０分間３００ｒｐｍで振盪し反応させた。反応後、５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム緩衝液を４０μＬ加えて撹拌し、２０ｎｇ／μＬのトリプシン水溶液を１０μＬ添加して３７℃で１８時間酵素消化した。消化後、２０％トリフルオロ酢酸水溶液を２μＬ添加し反応を止めた。その後、５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム緩衝液、０．５％トリフルオロ酢酸を用いて１０倍希釈し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ測定に使用した。
（１１−２−３）トラスツズマブのマレイミド導入体の糖鎖切断物のトリプシン処理（３）
１．５ｍＬ低吸着マイクロテストチューブに（１１−１−３）で得たトラスツズマブのマレイミド導入体の糖鎖切断物のサンプル溶液を１０μＬ加え、１１−２−１と同様の処理を行いＬＣ−ＭＳ／ＭＳ測定用サンプルを得た。
（１１−２−４）トラスツズマブのアルキルアジド導入体の糖鎖切断物のトリプシン処理（４）
１．５ｍＬ低吸着マイクロテストチューブに（１１−１−４）で得たトラスツズマブのアルキルアジド導入体の糖鎖切断物のサンプル溶液を１０μＬ加え、１１−２−１と同様の処理を行いＬＣ−ＭＳ／ＭＳ測定用サンプルを得た。
（１１−２−５）トラスツズマブのアジド安息香酸導入体の糖鎖切断物のトリプシン処理（５）
１．５ｍＬ低吸着マイクロテストチューブに（１１−１−５）で得たトラスツズマブのアジド安息香酸導入体の糖鎖切断物のサンプル溶液を１０μＬ加え、１１−２−１と同様の処理を行いＬＣ−ＭＳ／ＭＳ測定用サンプルを得た。
（１１−２−６）トラスツズマブのアジド安息香酸導入体の糖鎖切断物のトリプシン処理（６）
１．５ｍＬ低吸着マイクロテストチューブに（１１−１−６）で得たトラスツズマブのアジド安息香酸導入体の糖鎖切断物のサンプル溶液を１０μＬ加え、１１−２−１と同様の処理を行いＬＣ−ＭＳ／ＭＳ測定用サンプルを得た。
（１１−２−７）トラスツズマブのアジド安息香酸導入体の糖鎖切断物のトリプシン処理（７）
１．５ｍＬ低吸着マイクロテストチューブに（１１−１−７）で得たトラスツズマブのアジド安息香酸導入体の糖鎖切断物のサンプル溶液を１０μＬ加え、１１−２−１と同様の処理を行いＬＣ−ＭＳ／ＭＳ測定用サンプルを得た。
（１１−２−８）トラスツズマブのアセチルチオール導入体の糖鎖切断物のトリプシン処理（８）
１．５ｍＬ低吸着マイクロテストチューブに（１１−１−８）で得たトラスツズマブのアセチルチオール導入体の糖鎖切断物のサンプル溶液を１０μＬ加え、１１−２−１と同様の処理を行いＬＣ−ＭＳ／ＭＳ測定用サンプルを得た。
（１１−２−９）トラスツズマブのアジド安息香酸導入体の糖鎖切断物のトリプシン処理（９）
１．５ｍＬ低吸着マイクロテストチューブに（１１−１−９）で得たトラスツズマブのアジド安息香酸導入体の糖鎖切断物のサンプル溶液を１０μＬ加え、１１−２−１と同様の処理を行いＬＣ−ＭＳ／ＭＳ測定用サンプルを得た。
（１１−２−１０）トラスツズマブのアセチルチオールおよびアジド安息香酸導入体の糖鎖切断物のトリプシン処理（１０）
１．５ｍＬ低吸着マイクロテストチューブに（１１−１−８）で得たトラスツズマブのアセチルチオールおよびアジド安息香酸導入体の糖鎖切断物のサンプル溶液を１０μＬ加え、１１−２−１と同様の処理を行いＬＣ−ＭＳ／ＭＳ測定用サンプルを得た。
（１１−２−１１）デノスマブのアジド安息香酸導入体の糖鎖切断物のトリプシン処理（１１）
１．５ｍＬ低吸着マイクロテストチューブに（１１−１−１１）で得たデノスマブのアジド安息香酸導入体の糖鎖切断物のサンプル溶液を１０μＬ加え、１１−２−１と同様の処理を行いＬＣ−ＭＳ／ＭＳ測定用サンプルを得た。
（１１−２−１２）デュピルマブのアジド安息香酸導入体の糖鎖切断物のトリプシン処理（１２）
１．５ｍＬ低吸着マイクロテストチューブに（１１−１−１２）で得たデュピルマブのアジド安息香酸導入体の糖鎖切断物のサンプル溶液を１０μＬ加え、１１−２−１と同様の処理を行いＬＣ−ＭＳ／ＭＳ測定用サンプルを得た。
（１１−３）トラスツズマブのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ測定条件
（分析装置）
ナノＨＰＬＣ：ＥＡＳＹ−ｎＬＣ １０００（サーモフィッシャーサイエンティフィック）
質量分析計：トライブリッド質量分析計Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）
（ＨＰＬＣ分析条件）
トラップカラム：Ａｃｃｌａｉｍ ＰｅｐＭａｐ（登録商標） １００，７５μｍｘ２ｃｍ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）
分析カラム：ＥＳＩ−ｃｏｌｕｍｎ（ＮＴＣＣ−３６０／７５−３−１２５，７５μｍ×１２．５ｃｍ，３μｍ（日京テクノス））
移動相Ａ：０．１％ギ酸水溶液
移動相Ｂ：０．１％ギ酸、アセトニトリル溶液
ローディング溶液：０．１％トリフルオロ酢酸水溶液
流速：３００ｎＬ／ｍｉｎ
サンプル注入量：０．３−１μＬ
グラジエント条件（Ｂ％）：２％（０．０−０．５分）、２％→３０％（０．５−２３．５分）、３０％→７５％（２３．５−２５．５分）、７５％（２５．５−３５．０分）
（質量分析計分析条件）
イオン化法：ＥＳＩ， Ｐｏｓｉｔｉｖｅモード
スキャンタイプ：Ｄａｔａ Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ａｑｕｉｓｉｔｉｏｎ
Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｔｙｐｅ：Ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（ＣＩＤ）
データの取得は付属ソフトであるＸｃａｌｉｂｕｒ ３．０（サーモフィッシャーサイエンティフィック）およびＴｈｅｒｍｏ Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ Ｔｕｎｅ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ２．０（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を用いて行った。
（１１−４）トラスツズマブ、デノスマブおよびデュピルマブの修飾部位の解析条件
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ測定結果に対する修飾部位解析については、ＢｉｏＰｈａｒｍａ Ｆｉｎｄｅｒ ３．０（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を用いて行った。
ＢｉｏＰｈａｒｍａ Ｆｉｎｄｅｒでの解析は、Ｓ／Ｎ Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄを１、ＭＳ Ｎｏｉｓｅ Ｌｅｖｅｌをピークトップの強度の０．０１％となるように設定して実施した。また、消化酵素をＴｒｙｐｓｉｎに、ＳｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙをＨｉｇｈに設定した。さらに、ピーク検出時のＭａｓｓ Ｔｏｌｅｒａｎｃｅは４ｐｐｍ、ペプチド同定時のＭａｓｓ Ａｃｃｕｒａｃｙは５ｐｐｍとした。Ｓｔａｔｉｃ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎにはヨードアセトアミドによるシステイン残基の修飾として、Ｃａｒｂａｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ（＋５７．０２１Ｄａ）を設定した。Ｄｙｎａｍｉｃ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓについては、メチオニンの酸化（＋１５．９９５Ｄａ）およびリジン残基への修飾体（マレイミド導入体（＋２１９．０９０Ｄａ）、メルカプトプロピオン酸付加マレイミド導入体（＋３２５．０９８Ｄａ）、アルキルアジド導入体（＋１３９．０７５Ｄａ）、アルキルアミン導入体（＋１１３．０８４Ｄａ）、アジド安息香酸導入体（＋１４５．０２８Ｄａ）、アミン安息香酸導入体（＋１１９．０３７Ｄａ）、アセチルチオール導入体（＋１３０．００９Ｄａ）、カルバミドメチル化を受けたアセチルチオール導入体（＋１４５．０２０Ｄａ））を設定した。また、Ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ Ｓｃｏｒｅが８０以上、ＭＳ／ＭＳが観測できているもののみとなるようフィルターを設定した。
なお、消化の際にジチオスレイトールおよびヨードアセトアミドによる還元アルキル化を行うため、アルキルアジド導入体は一部還元されアルキルアミン導入体に、アジド安息香酸導入体は還元されアミン安息香酸導入体になり、アセチルチオール導入体はカルバミドメチル化を受ける。
また、修飾部位の検索対象のアミノ酸配列のデータとして、トラスツズマブに関しては図２５に示される（１）〜（２）を、デノスマブに関しては図２６に示される（１）〜（２）を、デュピルマブに関しては図２７に示される（１）〜（２）をそれぞれ用いた。
（１１−５）消化物のＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる修飾部位の解析結果
（１１−５−１）トリプシン消化物のＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる修飾部位の解析結果（１）
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いた解析の結果、（１１−２−１）で得たトラスツズマブアジド修飾体のトリプシン消化によるリジン残基への修飾部位（アミン安息香酸導入体（＋１１９．０３７Ｄａ））を含むアミノ酸３３残基からなるペプチド、ＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号１１）のペプチドフラグメントのＭＳスペクトル（実測値：ｍ／ｚ ９４５．７３３２８、理論値：９４５．７３３５０、４価）が観測され（図２９）、ＣＩＤスペクトルより重鎖のＥＵ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおける２４６位もしくは２４８位のリジン残基の修飾を示す、２価のｙ１９に相当するｍ／ｚ １１２５．４９（理論値：１１２５．１１）のプロダクトイオンが確認された（図３０）。
（１１−５−２）トリプシン消化物のＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる修飾部位の解析結果（２）
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いた解析の結果、（１１−２−２）で得たトラスツズマブアジド修飾体のトリプシン消化によるリジン残基への修飾部位（アミン安息香酸導入体（＋１１９．０３７Ｄａ））を含むアミノ酸１８残基からなるペプチド、ＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲ（配列番号１２）のペプチドフラグメントのＭＳスペクトル（実測値：ｍ／ｚ ７６０．３８２８７、理論値：７６０．３８３９０、３価）が観測され（図３１）、ＣＩＤスペクトルより重鎖のＥＵ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおける２８８位もしくは２９０位のリジン残基の修飾を示す、２価のｙ１６に相当するｍ／ｚ １００９．８３（理論値：１００９．５２）のプロダクトイオンが確認された（図３２）。
（１１−５−３）トリプシン消化物のＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる修飾部位の解析結果（３）
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いた解析の結果、（１１−２−３）で得たトラスツズマブマレイミドＭＰＡ修飾体のトリプシン消化によるリジン残基への修飾部位（メルカプトプロピオン酸付加マレイミド導入体（＋３２５．０９８Ｄａ））を含むアミノ酸３３残基からなるペプチド、ＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号１１）のペプチドフラグメントのＭＳスペクトル（実測値：ｍ／ｚ ９９７．２４９８６、理論値：９９７．２４９０８、４価）が観測され（図３３）、ＣＩＤスペクトルより重鎖のＥＵ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおける２４６位もしくは２４８位のリジン残基の修飾を示す、２価のｙ２０に相当するｍ／ｚ １２５６．９６（理論値：１２５６．６５）のプロダクトイオンが確認された（図３４）。
この結果より、上記（１１−２−３）では、抗体の重鎖上、ＥＵ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおけるＬｙｓ２４６およびＬｙｓ２４８に位置選択的にコンジュゲーションが進行していることが分かった。
（１１−５−４）トリプシン消化物のＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる修飾部位の解析結果（４）
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いた解析の結果、（１１−２−４）で得たトラスツズマブアルキルアジド修飾体のトリプシン消化によるリジン残基への修飾部位（アルキルアジド導入体（＋１３９．０７５Ｄａ））を含むアミノ酸３３残基からなるペプチド、ＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号１１）のペプチドフラグメントのＭＳスペクトル（実測値：ｍ／ｚ ９５０．７４２６３、理論値：９５０．７４３１３、４価）が観測され（図３５）、ＣＩＤスペクトルより重鎖のＥＵ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおける２４６位もしくは２４８位のリジン残基の修飾を示す、２価のｙ２０に相当するｍ／ｚ １１６３．９２（理論値：１１６３．６４）のプロダクトイオンが確認された（図３６）。
この結果より、上記（１１−２−４）では、抗体の重鎖上、ＥＵ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおけるＬｙｓ２４６およびＬｙｓ２４８に位置選択的にコンジュゲーションが進行していることが分かった。
（１１−５−５）トリプシン消化物のＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる修飾部位の解析結果（５）
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いた解析の結果、（１１−２−５）で得たトラスツズマブアジド安息香酸修飾体のトリプシン消化によるリジン残基への修飾部位（アミン安息香酸導入体（＋１１９．０３７Ｄａ））を含むアミノ酸１９残基からなるペプチド、ＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫ（配列番号１０１）のペプチドフラグメントのＭＳスペクトル（実測値：ｍ／ｚ ７８３．０８７３１、理論値：７８３．０８６９０、３価）が観測され（図３７）、ＣＩＤスペクトルより重鎖のＥＵ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおける３１７位のリジン残基の修飾を示す、２価のｙ１７に相当するｍ／ｚ １０７５．３１（理論値：１０７５．０６）のプロダクトイオンが確認された（図３８）。また、ＢｉｏＰｈａｒｍａ Ｆｉｎｄｅｒでの解析により、３１７位のリジン残基への修飾が高選択的に起こっていることが示された（図３９）。
この結果より、上記（１１−２−５）では、抗体の重鎖上、ＥＵ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおけるＬｙｓ３１７に位置選択的にコンジュゲーションが進行していることが分かった。
（１１−５−６）トリプシン消化物のＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる修飾部位の解析結果（６）
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いた解析の結果、（１１−２−６）で得たトラスツズマブアジド安息香酸修飾体のトリプシン消化によるリジン残基への修飾部位（アミン安息香酸導入体（＋１１９．０３７Ｄａ））を含むアミノ酸１８残基からなるペプチド、ＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲ（配列番号１２）のペプチドフラグメントのＭＳスペクトル（実測値：ｍ／ｚ ５７０．５４０２６、理論値：５７０．５３９９１、４価）が観測され（図４０）、ＣＩＤスペクトルより重鎖のＥＵ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおける２８８位もしくは２９０位のリジン残基の修飾を示す、３価のｙ１６に相当するｍ／ｚ ６７３．４８（理論値：６７３．３５）のプロダクトイオンが確認された（図４１）。また、ＢｉｏＰｈａｒｍａ Ｆｉｎｄｅｒでの解析により、２８８位もしくは２９０位のリジン残基への修飾が高選択的に起こっていることが示された（図４２）。
この結果より、上記（１１−２−６）では、抗体の重鎖上、ＥＵ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおけるＬｙｓ２８８およびＬｙｓ２９０に位置選択的にコンジュゲーションが進行していることが分かった。
（１１−５−７）トリプシン消化物のＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる修飾部位の解析結果（７）
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いた解析の結果、（１１−２−７）で得たトラスツズマブアジド安息香酸修飾体のトリプシン消化によるリジン残基への修飾部位（アミン安息香酸導入体（＋１１９．０３７Ｄａ））を含むアミノ酸３３残基からなるペプチド、ＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号１１）のペプチドフラグメントのＭＳスペクトル（実測値：ｍ／ｚ ９４５．７３５０１、理論値：９４５．７３３７６、４価）が観測され（図４３）、ＣＩＤスペクトルより重鎖のＥＵ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおける２４６位もしくは２４８位のリジン残基の修飾を示す、２価のｙ２０に相当するｍ／ｚ １１５３．８７（理論値：１１５３．６２）のプロダクトイオンが確認された（図４４）。また、ＢｉｏＰｈａｒｍａ Ｆｉｎｄｅｒでの解析により、２４６位もしくは２４８位のリジン残基への修飾が高選択的に起こっていることが示された（図４５）。
この結果より、上記（１１−２−７）では、抗体の重鎖上、ＥＵ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおけるＬｙｓ２４６およびＬｙｓ２４８に位置選択的にコンジュゲーションが進行していることが分かった。
（１１−５−８）トリプシン消化物のＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる修飾部位の解析結果（８）
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いた解析の結果、（１１−２−８）で得たトラスツズマブアセチルチオール修飾体のトリプシン消化によるリジン残基への修飾部位（カルバミドメチル化を受けたアセチルチオール導入体（＋１４５．０２０Ｄａ））を含むアミノ酸３３残基からなるペプチド、ＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号１１）のペプチドフラグメントのＭＳスペクトル（実測値：ｍ／ｚ ９５２．２３３６８、理論値：９５２．２２９４２、４価）が観測され（図４６）、ＣＩＤスペクトルより重鎖のＥＵ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおける２４６位もしくは２４８位のリジン残基の修飾を示す、２価のｙ２０に相当するｍ／ｚ １１６６．９５（理論値：１１６６．６１）のプロダクトイオンが確認された（図４７）。また、ＢｉｏＰｈａｒｍａ Ｆｉｎｄｅｒでの解析により、２４６位もしくは２４８位のリジン残基への修飾が高選択的に起こっていることが示された（図４８）。
この結果より、上記（１１−２−８）では、抗体の重鎖上、ＥＵ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおけるＬｙｓ２４６およびＬｙｓ２４８に位置選択的にコンジュゲーションが進行していることが分かった。
（１１−５−９）トリプシン消化物のＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる修飾部位の解析結果（９）
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いた解析の結果、（１１−２−９）で得たトラスツズマブアジド安息香酸修飾体のトリプシン消化によるリジン残基への修飾部位（アミン安息香酸導入体（＋１１９．０３７Ｄａ））を含むアミノ酸３３残基からなるペプチド、ＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号１１）のペプチドフラグメントのＭＳスペクトル（実測値：ｍ／ｚ ９４５．７４１１４、理論値：９４５．７３３７６、４価）が観測され（図４９）、ＣＩＤスペクトルより重鎖のＥＵ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおける２４６位もしくは２４８位のリジン残基の修飾を示す、２価のｙ２０に相当するｍ／ｚ １１５３．９４（理論値：１１５３．６２）のプロダクトイオンが確認された（図５０）。また、リジン残基への修飾部位（アミン安息香酸導入体（＋１１９．０３７Ｄａ））を含むアミノ酸１８残基からなるペプチド、ＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲ（配列番号１２）のペプチドフラグメントのＭＳスペクトル（実測値：ｍ／ｚ ５７０．５４４７０、理論値：５７０．５３９９１、４価）が観測され（図５１）、ＣＩＤスペクトルより重鎖のＥＵ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおける２８８位もしくは２９０位のリジン残基の修飾を示す、３価のｙ１４に相当するｍ／ｚ ５５７．１８（理論値：５５６．９７）のプロダクトイオンが確認された（図５２）。
この結果より、上記（１１−２−９）では、抗体の重鎖上、ＥＵ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおけるＬｙｓ２４６もしくはＬｙｓ２４８、および、Ｌｙｓ２８８もしくはＬｙｓ２９０に位置選択的にコンジュゲーションが進行していることが分かった。
（１１−５−１０）トリプシン消化物のＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる修飾部位の解析結果（１０）
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いた解析の結果、（１１−２−１０）で得たトラスツズマブアセチルチオールおよびアジド安息香酸修飾体のトリプシン消化によるリジン残基への修飾部位（カルバミドメチル化を受けたアセチルチオール導入体（＋１１９．０３７Ｄａ））を含むアミノ酸３３残基からなるペプチド、ＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号１１）のペプチドフラグメントのＭＳスペクトル（実測値：ｍ／ｚ ９５２．２３０２８、理論値：９５２．２２９４２、４価）が観測され（図５３）、ＣＩＤスペクトルより重鎖のＥＵ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおける２４６位もしくは２４８位のリジン残基の修飾を示す、２価のｙ２０に相当するｍ／ｚ １１６６．９０（理論値：１１６６．６１）のプロダクトイオンが確認された（図５４）。また、リジン残基への修飾部位（アミン安息香酸導入体（＋１１９．０３７Ｄａ））を含むアミノ酸１８残基からなるペプチド、ＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲ（配列番号１２）のペプチドフラグメントのＭＳスペクトル（実測値：ｍ／ｚ ５７０．５４０３０、理論値：５７０．５３９９１、４価）が観測され（図５５）、ＣＩＤスペクトルより重鎖のＥＵ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおける２８８位もしくは２９０位のリジン残基の修飾を示す、３価のｙ１６に相当するｍ／ｚ ６７３．５２（理論値：６７３．３５）のプロダクトイオンが確認された（図５６）。さらに、ＢｉｏＰｈａｒｍａ Ｆｉｎｄｅｒでの解析により、２４６位もしくは２４８位のリジン残基へのカルバミドメチル化を受けたアセチルチオール修飾、および、２８８位もしくは２９０位のリジン残基へのアミン安息香酸修飾が高選択的に起こっていることが示された（図５７）。
この結果より、上記（１１−２−１０）では、抗体の重鎖上、ＥＵ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおけるＬｙｓ２４６もしくはＬｙｓ２４８、および、Ｌｙｓ２８８もしくはＬｙｓ２９０に位置選択的にコンジュゲーションが進行していることが分かった。
（１１−５−１１）トリプシン消化物のＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる修飾部位の解析結果（１１）
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いた解析の結果、（１１−２−１１）で得たデノスマブアジド安息香酸修飾体のトリプシン消化によるリジン残基への修飾部位（アミン安息香酸導入体（＋１１９．０３７Ｄａ））を含むアミノ酸３３残基からなるペプチド、ＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号１０２）のペプチドフラグメントのＭＳスペクトル（実測値：ｍ／ｚ ９６１．７２０７８、理論値：９６１．７１９８０、４価）が観測され（図５８）、ＣＩＤスペクトルより重鎖の配列中の番号（すなわち、Ｎ末のアミノ酸を１番目とする。以下同様）における２４７位もしくは２４９位のリジン残基の修飾を示す、３価のｙ２３に相当するｍ／ｚ ８７２．０８（理論値：８７１．８１）のプロダクトイオンが確認された（図５９）。また、ＢｉｏＰｈａｒｍａ Ｆｉｎｄｅｒでの解析により、２４７位もしくは２４９位のリジン残基への修飾が高選択的に起こっていることが示された（図６０）。
この結果より、上記（１１−２−１１）では、抗体の重鎖上、配列中の番号におけるＬｙｓ２４７もしくはＬｙｓ２４９に位置選択的にコンジュゲーションが進行していることが分かった。
（１１−５−１２）トリプシン消化物のＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる修飾部位の解析結果（１２）
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いた解析の結果、（１１−２−１２）で得たデュピルマブアジド安息香酸修飾体のトリプシン消化によるリジン残基への修飾部位（アミン安息香酸導入体（＋１１９．０３７Ｄａ））を含むアミノ酸３４残基からなるペプチド、ＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号１０３）のペプチドフラグメントのＭＳスペクトル（実測値：ｍ／ｚ ９７２．９９０６４、理論値：９７２．９８８８６、４価）が観測され（図６１）、ＣＩＤスペクトルより重鎖の配列中の番号における２５１位もしくは２５３位のリジン残基の修飾を示す、３価のｙ２９に相当するｍ／ｚ １１０５．９８（理論値：１１０５．５８）のプロダクトイオンが確認された（図６２）。また、ＢｉｏＰｈａｒｍａ Ｆｉｎｄｅｒでの解析により、２５１位もしくは２５３位のリジン残基への修飾が高選択的に起こっていることが示された（図６３）。
この結果より、上記（１１−２−１２）では、抗体の重鎖上、配列中の番号におけるＬｙｓ２５１もしくはＬｙｓ２５３に位置選択的にコンジュゲーションが進行していることが分かった。
［実施例１２：４種の抗体薬物複合体（ＡＤＣ）、トラスツズマブ−ＤＭ１およびトラスツズマブ−ＭＭＡＥ、ならびにリツキシマブ−ＤＭ１およびリツキシマブ−ＭＭＡＥの合成］
（１２−１）トラスツズマブの位置特異的アジド導入体とＤＢＣＯ−ＤＭ１とのコンジュゲーション
（１２−１−１）位置選択的トラスツズマブ−ＤＭ１コンジュゲートの合成
実施例６の（６−１−２）で合成したトラスツズマブのアジド安息香酸導入体（アジド抗体３）０．９ｍｇを４７３μＬの１００ｍＭ ＰＢＳ、１０ｍＭ ＥＤＴＡバッファーに溶解させたのち、５１μＬのＮ，Ｎ’−ジメチルアセトアミドとＤＢＣＯ−ＤＭ１（Ａｂｚｅｎａ社製、化合物８７）をＮ，Ｎ’−ジメチルアセトアミドに溶解し４ｍＭとしたものを２μＬ添加し２５℃で１６時間攪拌した。反応後、ＮＡＰ−５カラムにより抽出し、ＤＭ１を取り除いた。
Figure 2019240288
（１２−１−２） ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳによる平均ＤＡＲの算出
ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳはアジレント社製のＡｇｉｌｅｎｔ ６５５０ ｃｏｕｐｌｅｄ ｔｏ Ａｇｉｌｅｎｔ １２９０ ＵＰＬＣ ｗｉｔｈ ＤＡＤ ｄｅｔｅｃｔｏｒ， Ａｕｔｏｓａｍｐｌｅｒ ｃｏｏｌｉｎｇ ａｎｄ Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｔｔｅｄ ｃｏｌｕｍｎ ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔを使用した。ソフトウェアはＭａｓｓＨｕｎｔｅｒを使用し、ＤＡＲを算出した。生成物はＤＭ１が２つ導入された１５０５３１およびＤＭ１が１つ導入された１４９８２７にピークが観測され、平均ＤＡＲは１．８と算出された（図６４）。
（１２−１−３）還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析
（１２−１−１）で合成したトラスツズマブ−ＤＭ１コンジュゲートのＰＢＳ溶液に７ｍＭトリス （２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩溶液２μＬ（トラスツズマブ−ＤＭ１コンジュゲートに対して１００等量）を加えて、室温で２０分攪拌した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料である実施例６の（６−１−１）で合成したトラスツズマブのアジド導入体は５０７１５および５０８７７に重鎖ピーク、２３４４０に軽鎖ピークが観測され、トラスツズマブ−ＤＭ１コンジュゲートは重鎖にＤＭ１が導入された５１７４８および５１９０９７にピークが観察され、原料と同じ２３４４０に軽鎖ピークが観測された（図６５）。なお、測定前処理の７ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩の還元反応により、アジド安息香酸導入体は還元されアミン安息香酸導入体となっている。
（１２−２）トラスツズマブの位置特異的アジド導入体とＤＢＣＯ−ＭＭＡＥとのコンジュゲーション
（１２−２−１）位置選択的トラスツズマブ−ＭＭＡＥコンジュゲートの合成
実施例６の（６−１−２）で合成したトラスツズマブのアジド安息香酸導入体（アジド抗体３）を０．５ｍｇを実施例１２の（１２−１−１）と同様の手法にて、ＤＢＣＯ−ＭＭＡＥ（Ａｂｚｅｎａ社製、化合物８８）と反応させた。反応後、ＮＡＰ−５カラムにより抽出し、ＤＢＣＯ−ＭＭＡＥを取り除いた。
Figure 2019240288
（１２−２−２） ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳによる平均ＤＡＲの算出
実施例１２の（１２−１−２）と同様の手法にてＤＡＲを算出した。生成物はＭＭＡＥが２つ導入された１５１３３６およびＭＭＡＥが１つ導入された１４９９７２にピークが観測され、平均ＤＡＲは１．８と算出された（図６６）。
（１２−２−３）還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析
（１２−２−１）で合成したトラスツズマブ−ＭＭＡＥコンジュゲートのＰＢＳ溶液に７ｍＭトリス （２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩溶液２μＬ（トラスツズマブ−ＤＭ１コンジュゲートに対して１００等量）を加えて、室温で２０分攪拌した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料である実施例６の（６−１−１）で合成したトラスツズマブのアジド導入体は５０７１５および５０８７７に重鎖ピーク、２３４４０に軽鎖ピークが観測され、トラスツズマブ−ＭＭＡＥコンジュゲートは重鎖にＭＭＡＥが導入された５２１５４および５２３１６にピークが観察され、原料と同じ２３４４０に軽鎖ピークが観測された（図６７）。なお、 測定前処理の７ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩の還元反応により、アジド安息香酸導入体は還元されアミン安息香酸導入体となっている。
（１２−３）リツキシマブの位置特異的アジド導入体とＤＢＣＯ−ＤＭ１とのコンジュゲーション
（１２−３−１）位置選択的リツキシマブ−ＤＭ１コンジュゲートの合成
実施例６の（６−１−４）で合成したリツキシマブのアジド安息香酸導入体（アジド修飾抗体１０１）を実施例１２の（１２−１−１）と同様の手法にて、ＤＢＣＯ−ＤＭ１（Ａｂｚｅｎａ社製、化合物８７）と反応させた。反応後、ＮＡＰ−５カラムにより抽出し、ＤＢＣＯ−ＤＭ１を取り除いた。
（１２−３−２） ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳによる平均ＤＡＲの算出
実施例１２の（１２−１−２）と同様の手法にてＤＡＲを算出した。生成物はＤＭ１が２つ導入された１４９５４９およびＤＭ１が１つ導入された１４８８４５にピークが観測され、平均ＤＡＲは１．８と算出された（図６８）。
（１２−３−３）還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析
（１２−３−１）で合成したリツキシマブ−ＤＭ１コンジュゲートのＰＢＳ溶液に７ｍＭトリス （２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩溶液２μＬ（トラスツズマブ−ＤＭ１コンジュゲートに対して１００等量）を加えて、室温で２０分攪拌した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料である実施例６の（６−１−４）で合成したリツキシマブのアジド導入体は５０６３５および５０７９７に重鎖ピーク、２３０４０に軽鎖ピークが観測され、リツキシマブ−ＤＭ１コンジュゲートは重鎖にＤＭ１が導入された５１６６８および５１８３１にピークが観察され、原料と同じ２３０４０に軽鎖ピークが観測された（図６９）。なお、 測定前処理の７ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩の還元反応により、アジド安息香酸導入体は還元されアミン安息香酸導入体となっている。
（１２−４）リツキシマブの位置特異的アジド導入体とＤＢＣＯ−ＭＭＡＥとのコンジュゲーション
（１２−４−１）位置選択的リツキシマブ−ＭＭＡＥコンジュゲートの合成
実施例６の（６−１−４）で合成したリツキシマブのアジド安息香酸導入体（アジド修飾抗体１０１）を実施例１２の（１２−１−１）と同様の手法にて、ＤＢＣＯ−ＭＭＡＥ（Ａｂｚｅｎａ社製、化合物８８）と反応させた。反応後、ＮＡＰ−５カラムにより抽出し、ＤＢＣＯ−ＭＭＡＥを取り除いた。
（１２−４−２） ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳによる平均ＤＡＲの算出
実施例１２の（１２−２）と同様の手法にてＤＡＲを算出した。生成物はＭＭＡＥが２つ導入された１５０３５４およびＭＭＡＥが１つ導入された１４８９９４にピークが観測され、平均ＤＡＲは１．６と算出された（図７０）。
（１２−４−３）還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析
（１２−４−１）で合成したリツキシマブ−ＭＭＡＥコンジュゲートのＰＢＳ溶液に７ｍＭトリス （２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩溶液２μＬ（リツキシマブ−ＭＭＡＥコンジュゲートに対して１００等量）を加えて、室温で２０分攪拌した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、原料である実施例６の（６−１−４）で合成したリツキシマブのアジド導入体は５０６３５および５０７９７に重鎖ピーク、２３０４０に軽鎖ピークが観測され、リツキシマブ−ＭＭＡＥコンジュゲートは重鎖にＭＭＡＥが導入された５２０７１および５２２３３にピークが観察され、原料と同じ２３０４０に軽鎖ピークが観測された（図７１）。なお、測定前処理の７ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩の還元反応により、アジド安息香酸導入体は還元されアミン安息香酸導入体となっている。
［実施例１３：ペイロードモデル搭載ＩｇＧ１ Ｆｃ親和性ペプチド試薬によるＩｇＧ１ Ｆｃの位置特異的ペイロードモデル導入とＥＳＩ−ＴＯＦＭＳによる解析］
（１３−１）ペイロードモデル搭載ＩｇＧ１ Ｆｃ親和性ペプチド試薬の合成
（１３−１−１）ペイロードモデル搭載ＩｇＧ１ Ｆｃ親和性ペプチド試薬（化合物８９）の合成
実施例１で合成した抗体親和性ペプチド（化合物３６）をジメチルスルホキシドに溶解させ、２−イミノチオラン塩酸塩（１０モル当量）、ジイソプロピルエチルアミン（１５モル当量）を加え、１時間攪拌した。原料消失をＬＣ−ＭＳで確認した後、Ｎ−ヒドロキシマレイミド（２０モル当量）のジメチルスルホキシド溶液を加え、１時間攪拌した。反応進行をＬＣ−ＭＳで確認した後、Ｆｍｏｃ−Ｎ−アミド−ｄＰＥＧ１２酸（４０モル当量）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（３２モル当量）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（３２モル当量）を加え、２時間攪拌した。反応終結をＬＣ−ＭＳで確認した後、分取ＨＰＬＣにて精製した。目的物を含むフラクションをＥＳＩ−ＭＳで確認した後、凍結乾燥し生成物であるＦｍｏｃ−Ｎ−ａｍｉｄｏ−ｄＰＥＧ１２−親和性ペプチド試薬（化合物８９））を得た。
Figure 2019240288
ＭＳ （ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝２ １５６３ ［Ｍ＋２Ｈ］２＋， ３ １０４３ ［Ｍ＋３Ｈ］３＋
（１３−１−２）ペイロードモデル搭載ＩｇＧ１ Ｆｃ親和性ペプチド試薬（化合物９０）の合成
実施例（１３−１−１）と同様にして、ビオチン−親和性ペプチド試薬（化合物９０）を得た。
Figure 2019240288
ＭＳ （ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝２ １５６３ ［Ｍ＋２Ｈ］２＋，ｚ＝３ １０４３ ［Ｍ＋３Ｈ］３＋
（１３−２）ペイロードモデル搭載ＩｇＧ１ Ｆｃ親和性ペプチド試薬によるＩｇＧ１ Ｆｃの位置特異的ペイロードモデル導入およびＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析
（１３−２−１）ペイロードモデルｄＰＥＧ１２搭載ＩｇＧ１ Ｆｃ親和性ペプチド試薬によるＩｇＧ１ Ｆｃの位置特異的ペイロードモデル導入およびＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析
（１３−１−１）で合成したペイロードモデル搭載した親和性ペプチド試薬（化合物８９）をＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドに溶解し２．０ｍＭとした。抗ＨＥＲ２ ＩｇＧ抗体トラスツズマブ（中外製薬）２００μｇを５０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ ７．２）２００μＬに溶解させ、２．０ｍＭのペプチド試薬を抗体に対して２０モル当量加えて、２５度で３時間攪拌した。反応液を限外濾過（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ， １０ｋ ＭＷＣＯ）により濃縮することでＩｇＧ抗体ペイロードモデルｄＰＥＧ１２導入体を得た。
ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、トラスツズマブは１４８０６１にピークが観測され、反応生成物はＦｍｏｃ−ｄＰＥＧ１２が二つ導入された１４９８６７にピークが観測された。
（１３−２−２）ペイロードモデルｄＰＥＧ１２搭載ＩｇＧ１ Ｆｃ親和性ペプチド試薬によるＩｇＧ１ Ｆｃの位置特異的ペイロードモデル導入およびＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析
（１３−１−２）で合成したペイロードモデル搭載した親和性ペプチド試薬（化合物９０）を用い、（１３−２−１）と同様の検討を行い、ＩｇＧ抗体ペイロードモデルビオチン導入体を得た。
（１３−３）ペイロードモデル搭載ＩｇＧ１ Ｆｃ親和性ペプチド試薬によるＩｇＧ１ Ｆｃの位置特異的ペイロードモデル導入の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳによる解析
（１３−３−１）ペイロードモデルｄＰＥＧ１２搭載ＩｇＧ１ Ｆｃ親和性ペプチド試薬によるＩｇＧ１ Ｆｃの位置特異的ペイロードモデル導入の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳによる解析
（１３−２−１）で合成したトラスツズマブ−ペイロードモデルに対して７ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩溶液２．０μＬ（抗体に対して１００等量）を加えて、室温で２０分放置した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、コントロールとして用いた原料のトラスツズマブは５０６０２，５０７６４に重鎖ピーク、２３４４３に軽鎖ピークが観測された。反応生成物は重鎖にＦｍｏｃ−ｄＰＥＧ１２が導入された５１４２５，５１５８４、および原料と同じ２３４４３に軽鎖ピークが観測された。
（１３−３−２）ペイロードモデルビオチン搭載ＩｇＧ１ Ｆｃ親和性ペプチド試薬によるＩｇＧ１ Ｆｃの位置特異的ペイロードモデル導入の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳによる解析
（１３−２−２）で合成したトラスツズマブ−ペイロードモデルに対して７ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩溶液２．０μＬ（抗体に対して１００等量）を加えて、室温で２０分放置した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、コントロールとして用いた原料のトラスツズマブは５０５９６，５０７５７に重鎖ピーク、２３４３９に軽鎖ピークが観測された。反応生成物は重鎖にビオチンが導入された５０８２０，５０９８２、および原料と同じ２３４３９に軽鎖ピークが観測された。
［実施例１４：ペイロード搭載ＩｇＧ１ Ｆｃ親和性ペプチド試薬によるＩｇＧ１ Ｆｃの位置特異的ペイロード導入とＥＳＩ−ＴＯＦＭＳによる解析］
（１４−１）ＭＭＡＥ搭載ＩｇＧ１ Ｆｃ親和性ペプチド試薬（化合物９１）の合成
実施例５で合成したＦｃ親和性ペプチド試薬（化合物６６）をＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドに溶解し０．２２ｍＭとした。ＤＢＣＯ−ＭＭＡＥ（Ａｂｚｅｎａ社製、化合物９１）を加え、２５度で１６時間攪拌した。原料消失をＬＣ−ＭＳで確認し、生成物であるＭＭＡＥ搭載Ｆｃ親和性ペプチド試薬を得た。
Figure 2019240288
ＭＳ （ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝２ １９３０［Ｍ＋２Ｈ］２＋，ｚ＝３ １２８７［Ｍ＋３Ｈ］３＋
（１４−２）ＭＭＡＥ搭載ＩｇＧ１ Ｆｃ親和性ペプチド試薬によるＩｇＧ１ Ｆｃ位置選択的トラスツズマブ−ＭＭＡＥコンジュゲートの合成およびＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析
抗ＨＥＲ２ ＩｇＧ抗体トラスツズマブ（中外製薬）２００μｇを用い、（１４−１）で合成したＭＭＡＥ搭載Ｆｃ親和性ペプチド試薬（化合物９１）と実施例１３の（１３−２）と同様の手法にて反応させた。反応液を限外濾過（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ， １０ｋ ＭＷＣＯ）により濃縮することで位置選択的トラスツズマブ−ＭＭＡＥコンジュゲートを得た。
その結果、ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、ＭＭＡＥが２つ導入された１５１３３６およびＭＭＡＥが１つ導入された１４９９７２のピークが観測された。
［実施例１５：グルタミン酸残基からのリンカーを有するＩｇＧ１ Ｆｃ親和性ペプチド試薬によるＩｇＧ１ Ｆｃの位置特異的修飾とＥＳＩ−ＴＯＦＭＳによる解析］
（１５−１）抗体に対する親和性ペプチドの合成
（１−１）に示す方法で、化合物９２を合成、取得した。
Figure 2019240288
ＭＳ （ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝２ １０４６．４ ［Ｍ＋２Ｈ］２＋， Ｚ＝３ ６９８．３ ［Ｍ＋３Ｈ］３＋
（１５−２）アジド試薬と親和性ペプチド連結による抗体修飾試薬の合成
（１５−１）で合成した抗体親和性ペプチドをジメチルスルホキシドに溶解させ、１−エチル―３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（４０モル当量）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（４０モル当量）を加え、攪拌した。そこへ２−アミノエタノール溶液（４０モル当量）とトリエチルアミン（１モル当量）を加え、室温で１時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳを測定し後、逆相ＨＰＬＣで分離精製を行った。各フラクションをＭＳにて確認し、目的物が含まれるフラクションを凍結乾燥した。得られた化合物をジメチルスルホキシドに溶かし、トリエチルアミン（１モル当量）とＮ−ヒドロキシマレイミド（１．２モル当量）を加えて室温で１時間撹拌し、ＬＣ−ＭＳ測定を行い反応の進行を確認した。４−アジド安息香酸（４０モル当量）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（３２モル当量）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（３２モル当量）を加え、２時間攪拌した。反応終結をＬＣ−ＭＳで確認した後、分取ＨＰＬＣにて精製した。目的物を含むフラクションをＥＳＩ−ＭＳで確認した後、凍結乾燥し生成物であるアジド−フェニル−親和性ペプチド試薬（化合物９３）を得た。
Figure 2019240288
ＭＳ （ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝２ １２０４．３ ［Ｍ＋２Ｈ］２＋， Ｚ＝３ ８０３．３ ［Ｍ＋３Ｈ］３＋
（１５−３）親和性ペプチド試薬（化合物９３）を用いた抗体修飾反応
（１５−２）で合成したアジドを搭載した親和性ペプチド（化合物９３）を用い、（６−１−３）に示す方法で反応を行い、ＩｇＧ抗体トラスツズマブ−アジド修飾抗体を得た。
（１５−４）ＩｇＧ抗体トラスツズマブ−アジド修飾抗体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
（１５−３）で得られたトラスツズマブ−アジド修飾体を、実施例６の（６−２−３）に示す方法で還元、ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析を行った。コントロールとして用いた原料のトラスツズマブは５０６０２，５０７６４に重鎖ピーク、２３４４３に軽鎖ピークが観測された。反応生成物は重鎖にアミン安息香酸が導入された５０７２５，５０８８５、および２３４４６に軽鎖ピークが観測された。
［実施例１６：チオグリコール酸エステルを脱離基とするＩｇＧ１ Ｆｃ親和性ペプチド試薬によるＩｇＧ１ Ｆｃの位置特異的修飾とＥＳＩ−ＴＯＦＭＳによる解析］
（１６−１）チオグリコール酸エステル脱離基とするリンカー（化合物９５）の合成
ジチオジグリコール酸をジクロロメタンに溶解し、グリシン ｔ−ブチルエステル（２．２モル当量）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミン（４．８モル当量）、１−エチル―３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（２．４モル当量）を加え１時間撹拌した。反応液を水で分液洗浄後、得られた有機層を減圧下濃縮した。得られた残渣をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド／水（１：１）で溶解し、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（１．３モル当量）を加え、室温で１時間撹拌した。酢酸エチルにて抽出後、減圧濃縮し、酢酸エチル／ヘキサンでシリカゲルカラム処理を行い、化合物９４を得た。
Figure 2019240288
ＭＳ （ＥＳＩ） ［２Ｍ＋Ｈ］＋ ＝４１１， ［Ｍ−Ｈ］−＝２０４
化合物９４をジクロロメタンに溶解し、４−アジド安息香酸（１モル当量）、１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスファート（１．２モル当量）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１．５モル当量）を加え、室温で３０分撹拌した。反応液をシリカゲルカラムにて精製後、得られた白色結晶をジクロロメタン／トリフルオロ酢酸（１：１）に溶解し、室温で１時間撹拌した。反応液を凍結乾燥し、チオグリコール酸エステル脱離基とするリンカー（化合物９５）を得た。
Figure 2019240288
ＭＳ （ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝１ ２９５ ［Ｍ＋Ｈ］１＋
（１６−２）アジド試薬と親和性ペプチド連結による抗体修飾試薬の合成
（１−１）で合成した抗体親和性ペプチド（化合物３６）に、（１６−１）で合成したリンカー（化合物９５）（４０モル当量）、１−エチル―３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（３２モル当量）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（３２モル当量）を加え、２時間攪拌した。反応終結をＬＣ−ＭＳで確認した後、分取ＨＰＬＣにて精製した。目的物を含むフラクションをＥＳＩ−ＭＳで確認した後、凍結乾燥し生成物であるアジド−フェニル−親和性ペプチド試薬（化合物９６）を得た。
Figure 2019240288
ＭＳ （ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝２ １１８３．３ ［Ｍ＋２Ｈ］２＋， Ｚ＝３ ７８９．２ ［Ｍ＋３Ｈ］３＋
（１６−３）親和性ペプチド試薬（化合物９６）を用いた抗体修飾反応
（１６−２）で合成したアジドを搭載した親和性ペプチド（化合物９６）を用い、（６−１−３）に示す方法で反応を行い、ＩｇＧ抗体トラスツズマブ−アジド修飾抗体を得た。
（１６−４）ＩｇＧ抗体トラスツズマブ−アジド修飾抗体の還元条件でのＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析による重鎖選択性の確認
（１６−３）で得られたトラスツズマブ−アジド修飾体を、実施例６の（６−２−３）に示す方法で還元、ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析を行った。コントロールとして用いた原料のトラスツズマブは５０６０２，５０７６４に重鎖ピーク、２３４４３に軽鎖ピークが観測された。反応生成物は重鎖にアミン安息香酸が導入された５０７２０，５０８８２、および原料と同じ２３４４３に軽鎖ピークが観測された。
（まとめ）
以上の結果をまとめると、実施例で使用した親和性ペプチドのアミノ酸配列、および実施例で製造した化合物を用いて製造することができる、生体直交性官能基を有する抗体の概要は、以下のとおりである。
Figure 2019240288
また、抗体について、下記アミノ酸残基を始めとする特定のアミノ酸残基の位置選択的な修飾が可能であることが示された：
（１）２４６位及び／又は２４８位のリジン残基
例えば、トラスツズマブの２４６位及び／又は２４８位のリジン残基の修飾に関する実施例１１（１１−５−１）、（１１−５−３）、（１１−５−４）、（１１−５−７）、（１１−５−８）、（１１−５−９）、および（１１−５−１０）、デノスマブの２４７位及び／又は２４９位のリジン残基（ＥＵ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおけるヒトＩｇＧの２４６位及び／又は２４８位のリジン残基に相当）の修飾に関する実施例１１（１１−５−１１）、ならびにデュピルマブの２５１位及び／又は２５３位のリジン残基（ＥＵ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおけるヒトＩｇＧの２４６位及び／又は２４８位のリジン残基に相当）の修飾に関する実施例１１（１１−５−１２）を参照；
（２）２８８位及び／又は２９０位のリジン残基
例えば、実施例１１（１１−５−２）、（１１−５−６）、（１１−５−９）、および（１１−５−１０）を参照；
（３）３１７位のリジン残基
例えば、実施例１１（１１−５−５）を参照。
さらに、下記式（Ｉ）で表される、抗体に対する親和性物質、および生体直交性官能基を有する化合物について、実施例の一部を例に挙げて説明すると以下の表２および表３のとおりである。
Ａ−Ｌ−Ｅ−Ｂ （Ｉ）
〔式中、
Ａは、抗体に対する親和性物質であり、
Ｌは、脱離基を含む２価の基であり、
Ｅは、（ｉ）前記脱離基と連結しており、かつ（ｉｉ）前記抗体中の求核基と反応する能力を有する求電子基を含む２価の基であり、
Ｂは、生体直交性官能基であり、
前記脱離基は、前記求核基と前記求電子基との間の反応によりＥから切断されて脱離する能力を有する。〕
Figure 2019240288
Figure 2019240288
Figure 2019240288
Figure 2019240288
Figure 2019240288
以上より、抗体に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物において、親和性物質の種類、親和性物質と反応性基との間のリンカーの長さ、およびリンカーが導入される親和性物質中の位置等の因子を適宜調節することにより、抗体を位置選択的に修飾できることが示された。
本発明は、例えば、位置選択的に修飾された抗体の製造に有用である。
Figure 2019240288
Figure 2019240288
Figure 2019240288
６−アジド−ヘキサン酸をアジド酢酸に変えて同様に合成を行い、アジド−アルキル−親和性ペプチド試薬（化合物６０）を得た。なお、化合物６０は、抗体修飾基（求電子基）のβ位にヘテロ原子を有する比較例化合物である。
Figure 2019240288
実施例１で合成した抗体親和性ペプチド（化合物３２）を用いて合成された抗体修飾試薬は、以下である。
Figure 2019240288
実施例１で合成した抗体親和性ペプチド（化合物３３）を用いて合成された抗体修飾試薬は、以下である。
Figure 2019240288
実施例１で合成した抗体親和性ペプチド（化合物３４）を用いて合成された抗体修飾試薬は、以下である。
Figure 2019240288
実施例１で合成した抗体親和性ペプチド（化合物３５）を用いて合成された抗体修飾試薬は、以下である。
Figure 2019240288
実施例１で合成した抗体親和性ペプチド（化合物３６）を用いて合成された抗体修飾試薬は、以下である。
Figure 2019240288
実施例１で合成した抗体親和性ペプチド（化合物３７）を用いて合成された抗体修飾試薬は、以下である。
Figure 2019240288
実施例１で合成した抗体親和性ペプチド（化合物３８）を用いて合成された抗体修飾試薬は、以下である。
Figure 2019240288
実施例１で合成した抗体親和性ペプチド（化合物３９）を用いて合成された抗体修飾試薬は、以下である。
Figure 2019240288
実施例１で合成した抗体親和性ペプチド（化合物４０）を用いて合成された抗体修飾試薬は、以下である。
Figure 2019240288
実施例１で合成した抗体親和性ペプチド（化合物４１）を用いて合成された抗体修飾試薬は、以下である。
Figure 2019240288
実施例１で合成した抗体親和性ペプチド（化合物４２）を用いて合成された抗体修飾試薬は、以下である。
Figure 2019240288
実施例１で合成した抗体親和性ペプチド（化合物４３）を用いて合成された抗体修飾試薬は、以下である。
Figure 2019240288
実施例１で合成した抗体親和性ペプチド（化合物４４）を用いて合成された抗体修飾試薬は、以下である。
Figure 2019240288
実施例１で合成した抗体親和性ペプチド（化合物４５）を用いて合成された抗体修飾試薬は、以下である。
Figure 2019240288
実施例１で合成した抗体親和性ペプチド（化合物４６）を用いて合成された抗体修飾試薬は、以下である。
Figure 2019240288
実施例１で合成した抗体親和性ペプチド（化合物４７）を用いて合成された抗体修飾試薬は、以下である。
Figure 2019240288
実施例１で合成した抗体親和性ペプチド（化合物４８）を用いて合成された抗体修飾試薬は、以下である。
Figure 2019240288
実施例１で合成した抗体親和性ペプチド（化合物４９）を用いて合成された抗体修飾試薬は、以下である。
Figure 2019240288
実施例１で合成した抗体親和性ペプチド（化合物５０）を用いて合成された抗体修飾試薬は、以下である。
Figure 2019240288
実施例１で合成した抗体親和性ペプチド（化合物５１）を用いて合成された抗体修飾試薬は、以下である。
Figure 2019240288
実施例１で合成した抗体親和性ペプチド（化合物５２）を用いて合成された抗体修飾試薬は、以下である。
Figure 2019240288
実施例１で合成した抗体親和性ペプチド（化合物５３）を用いて合成された抗体修飾試薬は、以下である。
Figure 2019240288
Figure 2019240288
Figure 2019240288
Figure 2019240288
Figure 2019240288
Figure 2019240288
Figure 2019240288

Claims (37)

  1. 下記式（Ｉ）：
    Ａ−Ｌ−Ｅ−Ｂ （Ｉ）
    〔式中、
    Ａは、抗体に対する親和性物質であり、
    Ｌは、脱離基を含む２価の基であり、
    Ｅは、（ｉ）前記脱離基と連結しており、かつ（ｉｉ）前記抗体中の求核基と反応する能力を有する求電子基を含む２価の基であり、
    Ｂは、生体直交性官能基であり、
    前記脱離基は、前記求核基と前記求電子基との間の反応によりＥから切断されて脱離する能力を有する。〕で表される、抗体に対する親和性物質、および生体直交性官能基を有する化合物またはその塩。
  2. 前記親和性物質がペプチドである、請求項１記載の化合物またはその塩。
  3. 前記ペプチドが、モノクローナル抗体の定常領域に対する結合能を有するペプチドである、請求項２記載の化合物またはその塩。
  4. 前記ペプチドが、モノクローナル抗体のＦｃ領域に対する結合能を有するペプチドである、請求項２または３記載の化合物またはその塩。
  5. 前記ペプチドが、ＩｇＧのＦｃ領域に対する結合能を有するペプチドである、請求項４記載の化合物またはその塩。
  6. 前記ペプチドが、１０〜４０のアミノ酸残基を有する、請求項２〜５記載のいずれか一項記載の化合物またはその塩。
  7. 前記ペプチドが、
    （ａ）（ａ−１−１）ＦＮＭＱＱＱＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＲＩＲＳＩＲＤＤ（配列番号１１）のアミノ酸配列、または、
    （ａ−１−２）ＦＮＭＱＣＱＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＲＩＲＳＩＲＤＤＣ（配列番号１２）のアミノ酸配列において、
    配列中のいずれかの１〜３つのアミノ酸残基が、同一でも異なってもよく、リジン残基、アスパラギン酸残基、およびグルタミン酸残基からなる群より選ばれる各々１つのアミノ酸残基により置換されているか、
    （ａ−２−１）β−Ａｌａ−ＮＭＱＱＱＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＲＩＲＳＩＲＤＤ（配列番号１３）のアミノ酸配列、または、
    （ａ−２−２）β−Ａｌａ−ＮＭＱＣＱＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＲＩＲＳＩＲＤＤＣ（配列番号１４）のアミノ酸配列において、
    配列中のいずれかの１〜３つのアミノ酸残基が、同一でも異なってもよく、リジン残基、アスパラギン酸残基、およびグルタミン酸残基からなる群より選ばれる各々１つのアミノ酸残基により置換されており、かつ
    （ｂ）配列番号１１〜１４の前記アミノ酸配列各々に対して８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２〜６のいずれか一項記載の化合物またはその塩。
  8. 前記ペプチドが、
    式１−１：（Ｘ０−３）ａ−Ｃ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｉ−Ｉ−Ｗ−Ｃ−（Ｘ０−３）ｂ（配列番号１５）
    式１−２：（Ｘ０−３）ａ−Ｃ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｉ−Ｖ−Ｗ−Ｃ−（Ｘ０−３）ｂ（配列番号１６）
    式１−３：（Ｘ０−３）ａ−Ｃ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｖ−Ｖ−Ｗ−Ｃ−（Ｘ０−３）ｂ（配列番号１７）
    式１−４：（Ｘ０−３）ａ−Ｃ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ａ−Ｖ−Ｗ−Ｃ−（Ｘ０−３）ｂ（配列番号１８）
    式１−５：（Ｘ０−３）ａ−Ｃ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｌ−Ｌ−Ｗ−Ｃ−（Ｘ０−３）ｂ（配列番号１９）
    式１−６：（Ｘ０−３）ａ−Ｃ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｌ−Ｉ−Ｗ−Ｃ−（Ｘ０−３）ｂ（配列番号２０）
    式１−７：（Ｘ０−３）ａ−Ｃ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｃ−（Ｘ０−３）ｂ（配列番号２１）
    式１−８：（Ｘ０−３）ａ−Ｃ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｑ−Ｖ−Ｗ−Ｃ−（Ｘ０−３）ｂ（配列番号２２）
    式１−９：（Ｘ０−３）ａ−Ｃ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｅ−Ｖ−Ｗ−Ｃ−（Ｘ０−３）ｂ（配列番号２３）
    〔式中、
    （Ｘ０−３）ａは、なし、アルギニン残基−グリシン残基−アスパラギン残基、アスパラギン酸残基、グリシン残基−アスパラギン残基、またはアスパラギン残基であり、
    （Ｘ０−３）ｂは、なし、スレオニン残基−チロシン残基−ヒスチジン残基、またはスレオニン残基であり、
    Ｘａａ１は、アラニン残基であり、
    Ｘａａ２は、チロシン残基、トリプトファン残基、またはヒスチジン残基であり、
    Ｘａａ３は、ヒスチジン残基、フェニルアラニン残基、チロシン残基、トリプトファン残基、アルギニン残基、またはグリシン残基であり、
    Ｘａａ４は、リジン残基、アスパラギン酸残基、またはグルタミン酸残基であり、
    Ｘａａ５は、グリシン残基、セリン残基、アスパラギン残基、グルタミン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、フェニルアラニン残基、チロシン残基、トリプトファン残基、ヒスチジン残基、スレオニン残基、ロイシン残基、アラニン残基、バリン残基、イソロイシン残基、またはアルギニン残基であり、
    Ｘａａ６は、グルタミン残基、グルタミン酸残基、アスパラギン残基、またはアスパラギン酸残基である。〕、あるいは
    式２−１：（Ｘ０−３’）ａ−Ｃ−（Ｘａａ１’）−（Ｘａａ２’）−（Ｘａａ３’）−（Ｘａａ４’）−（Ｘａａ５’）−（Ｘａａ６’）−Ｌ−Ｖ−Ｗ−Ｃ−（Ｘ０−３’）ｂ（配列番号２４）
    〔式中、
    （Ｘ０−３’）ａおよび（Ｘ０−３’）ｂはそれぞれ、前記（Ｘ０−３）ａおよび（Ｘ０−３）ｂと同じであり、
    Ｘａａ１’、Ｘａａ２’、Ｘａａ３’、Ｘａａ４’、Ｘａａ５’、Ｘａａ６’はそれぞれ、前記Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ４、Ｘａａ５、Ｘａａ６と同じである。〕のいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項２〜６のいずれか一項記載の化合物またはその塩。
  9. 前記脱離基が、（１）−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓｅ−、−ＳＯ２−Ｏ−、−ＳＯ２−Ｎ（Ｒ）−、−ＳＯ２−、−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｎ（ＯＲ）−、−Ｎ（Ｒ）−、および−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−からなる群より選ばれる基（ここで、Ｒは、水素原子または炭素原子数１〜６のアルキルである。）、または（２）ヘテロアリーレンである、請求項１〜８のいずれか一項記載の化合物またはその塩。
  10. 前記求核基が、リジン残基の側鎖におけるＮＨ２、チロシン残基の側鎖におけるＯＨ、セリン残基の側鎖におけるＯＨ、スレオニン残基の側鎖におけるＯＨ、およびシステイン残基の側鎖におけるＳＨからなる群より選ばれる基である、請求項１〜９のいずれか一項記載の化合物またはその塩。
  11. 前記求電子基が、−Ｃ（＝Ｏ）−、−ＳＯ２−、および−ＣＨ２−からなる群より選ばれる基である、請求項１〜１０のいずれか一項記載の化合物またはその塩。
  12. 前記生体直交性官能基が、アジド残基、アルデヒド残基、チオール残基、アルキン残基、アルケン残基、ハロゲン残基、テトラジン残基、ニトロン残基、ヒドロキシルアミン残基、ニトリル残基、ヒドラジン残基、ケトン残基、ボロン酸残基、シアノベンゾチアゾール残基、アリル残基、ホスフィン残基、マレイミド残基、ジスルフィド残基、チオエステル残基、α―ハロカルボニル残基、イソニトリル残基、シドノン残基、およびセレン残基からなる群より選ばれる基である、請求項１〜１１のいずれか一項記載の化合物またはその塩。
  13. 前記生体直交性官能基が、アジド残基、チオール残基、アルキン残基、マレイミド残基、およびジスルフィド残基からなる群より選ばれる基である、請求項１〜１２のいずれか一項記載の化合物またはその塩。
  14. 前記式（Ｉ）で表される化合物が、下記式（Ｉ−１）：
    Ａ−Ｌ１−Ｌ２−Ｅ１−Ｅ２−Ｅ３−Ｂ （Ｉ−１）
    〔式中、
    ＡおよびＢは、前記式（Ｉ）のものと同じであり、
    Ｌ１は、結合または２価の基であり、
    Ｌ２は、脱離基であり、
    Ｅ１は、（ｉ）前記脱離基と連結しており、かつ（ｉｉ）前記抗体中の求核基と反応する能力を有する求電子基であり、
    Ｅ２は、（ａ）−Ｘ−Ｙ−〔ここで、Ｅ１と結合するＸは、Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）（ここで、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して、水素原子または炭素原子数１〜６のアルキルである。）、Ｎ（Ｒ３）（ここで、Ｒ３は、水素原子または炭素原子数１〜６のアルキルである。）、Ｏ、Ｓ、またはＳｅであり、Ｅ３と結合するＹは、Ｃ（Ｒ４）（Ｒ５）（ここで、Ｒ４およびＲ５はそれぞれ独立して、水素原子または炭素原子数１〜６のアルキルである。）である。〕、あるいは（ｂ）下記式（ｉ）：
    Figure 2019240288
     （ここで、環Ｚは、Ｅ１と結合する環構成原子Ｘ’およびその両隣の環構成原子の全てが炭素原子である２価の環基であるか、またはＥ１と結合する環構成原子Ｘ’が窒素原子であり、かつ窒素原子の両隣の環構成原子が炭素原子である２価の複素環基である。・は結合手である。）で表される基であり、
    Ｅ３は、Ｅ２が−Ｘ−Ｙ−の場合には２価の基であり、Ｅ２が式（ｉ）で表される基の場合には結合または２価の基であり、
    前記脱離基は、前記求核基と前記求電子基との間の反応によりＥ１から切断されて脱離する能力を有する。〕で表される化合物である、請求項１〜１３のいずれか一項記載の化合物またはその塩。
  15. 前記Ｌ２が、
    （ａ）環Ｐ−Ｑ−〔ここで、環Ｐが、電子吸引性基で置換されていてもよいアリーレン、電子吸引性基で置換されていてもよいヘテロアリーレン、縮環していてもよい２，５-ジケトピロリジン、縮環していてもよい２，６−ジケトピペリジン、縮環していてもよい２-ケトピロリジン、縮環していてもよい２−ケトピペリジン、２−ピリドンからなる群より選ばれる基であり、Ｑが、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓｅ−、−ＳＯ２−Ｏ−、−ＳＯ２−Ｎ（Ｒ）−、−ＳＯ２−、−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｎ（ＯＲ）−、−Ｎ（Ｒ）−、および−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−からなる群より選ばれる基（ここで、Ｒは、水素原子または炭素原子数１〜６のアルキルである。）である。〕、
    （ｂ）ヘテロアリーレン、あるいは
    （ｃ）−Ｑ−〔ここで、Ｑが、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓｅ−、−ＳＯ２−Ｏ−、−ＳＯ２−Ｎ（Ｒ）−、−ＳＯ２−、−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｎ（ＯＲ）−、−Ｎ（Ｒ）−、および−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−からなる群より選ばれる基（ここで、Ｒは、水素原子または炭素原子数１〜６のアルキルである。）である。〕である、請求項１４記載の化合物またはその塩。
  16. 前記Ｌ２が、下記構造式からなる群より選ばれる基である、請求項１４または１５記載の化合物またはその塩：
    Figure 2019240288
     （ここで、ＥＷＧは、電子吸引性基であり、
    ｍは、０〜４の整数であり、
    ｎは、０〜３の整数であり、
    Ｒは、水素原子、または炭素原子数１〜６のアルキルであり、
    ○（白丸）は、Ｌ１に対する結合手であり、●（黒丸）は、Ｅ１に対する結合手である。）。
  17. ＡとＥとを連結するＬまたはＬ１−Ｌ２の主鎖が２０個以下の原子からなる、請求項１〜１６のいずれか一項記載の化合物またはその塩。
  18. 前記式（Ｉ−１）で表される化合物が、下記式（Ｉ−２）：
    Ａ−Ｌ１−Ｌ２−Ｅ１−Ｘ−Ｙ−Ｅ３−Ｂ （Ｉ−２）
    〔式中、
    Ａ、Ｌ１、Ｘ、Ｙ、およびＢは、前記式（Ｉ−１）のものと同じであり、
    Ｌ２は、
    （ａ）環Ｐ−Ｑ−〔ここで、環Ｐが、電子吸引性基で置換されていてもよいアリーレン、電子吸引性基で置換されていてもよいヘテロアリーレン、縮環していてもよい２，５-ジケトピロリジン、縮環していてもよい２，６−ジケトピペリジン、縮環していてもよい２-ケトピロリジン、縮環していてもよい２−ケトピペリジン、２−ピリドンからなる群より選ばれる基であり、Ｑが、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓｅ−、−ＳＯ２−Ｏ−、−ＳＯ２−Ｎ（Ｒ）−、−ＳＯ２−、−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｎ（ＯＲ）−、−Ｎ（Ｒ）−、および−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−からなる群より選ばれる基（ここで、Ｒは、水素原子または炭素原子数１〜６のアルキルである。）である。〕、
    （ｂ）ヘテロアリーレン、あるいは
    （ｃ）−Ｑ−〔ここで、Ｑが、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓｅ−、−ＳＯ２−Ｏ−、−ＳＯ２−Ｎ（Ｒ）−、−ＳＯ２−、−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｎ（ＯＲ）−、−Ｎ（Ｒ）−、および−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−からなる群より選ばれる基（ここで、Ｒは、水素原子または炭素原子数１〜６のアルキルである。）である。〕であり、
    Ｅ１は、−Ｃ（＝Ｏ）−、−ＳＯ２−、および−ＣＨ２−からなる群より選ばれる基であり、
    Ｅ３は、２価の基である。〕で表される化合物である、請求項１４〜１７のいずれか一項記載の化合物またはその塩。
  19. 前記式（Ｉ−１）で表される化合物が、下記式（Ｉ−３）：
    Figure 2019240288
     〔式中、
    Ａ、Ｌ１、環Ｚ、およびＢは、前記式（Ｉ−１）のものと同じであり、
    Ｌ２は、
    （ａ）環Ｐ−Ｑ−〔ここで、環Ｐが、電子吸引性基で置換されていてもよいアリーレン、電子吸引性基で置換されていてもよいヘテロアリーレン、縮環していてもよい２，５-ジケトピロリジン、縮環していてもよい２，６−ジケトピペリジン、縮環していてもよい２-ケトピロリジン、縮環していてもよい２−ケトピペリジン、２−ピリドンからなる群より選ばれる基であり、Ｑが、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓｅ−、−ＳＯ２−Ｏ−、−ＳＯ２−Ｎ（Ｒ）−、−ＳＯ２−、−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｎ（ＯＲ）−、−Ｎ（Ｒ）−、および−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−からなる群より選ばれる基（ここで、Ｒは、水素原子または炭素原子数１〜６のアルキルである。）である。〕、
    （ｂ）ヘテロアリーレン、あるいは
    （ｃ）−Ｑ−〔ここで、Ｑが、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓｅ−、−ＳＯ２−Ｏ−、−ＳＯ２−Ｎ（Ｒ）−、−ＳＯ２−、−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｎ（ＯＲ）−、−Ｎ（Ｒ）−、および−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−からなる群より選ばれる基（ここで、Ｒは、水素原子または炭素原子数１〜６のアルキルである。）である。〕であり、
    Ｅ１は、−Ｃ（＝Ｏ）−、−ＳＯ２−、および−ＣＨ２−からなる群より選ばれる基であり、
    Ｅ３は、結合または２価の基である。〕で表される化合物である、請求項１４〜１７のいずれか一項記載の化合物またはその塩。
  20. 下記式（Ｉ）：
    Ａ−Ｌ−Ｅ−Ｂ （Ｉ）
    〔式中、
    Ａは、抗体に対する親和性物質であり、
    Ｌは、脱離基を含む２価の基であり、
    Ｅは、（ｉ）前記脱離基と連結しており、かつ（ｉｉ）前記抗体中の求核基と反応する能力を有する求電子基を含む２価の基であり、
    Ｂは、生体直交性官能基であり、
    前記脱離基は、前記求核基と前記求電子基との間の反応によりＥから切断されて脱離する能力を有する。〕で表される、抗体に対する親和性物質、および生体直交性官能基を有する化合物またはその塩を含む、生体直交性官能基による抗体の位置選択的修飾試薬。
  21. 生体直交性官能基を有する抗体またはその塩の製造方法であって、
    下記式（Ｉ）：
    Ａ−Ｌ−Ｅ−Ｂ （Ｉ）
    〔式中、
    Ａは、抗体に対する親和性物質であり、
    Ｌは、脱離基を含む２価の基であり、
    Ｅは、（ｉ）前記脱離基と連結しており、かつ（ｉｉ）前記抗体中の求核基と反応する能力を有する求電子基を含む２価の基であり、
    Ｂは、生体直交性官能基であり、
    前記脱離基は、前記求核基と前記求電子基との間の反応によりＥから切断されて脱離する能力を有する。〕で表される、抗体に対する親和性物質、および生体直交性官能基を有する化合物またはその塩を、抗体と反応させて、
    下記式（ＩＩ）：
    Ａｂ−Ｅ−Ｂ （ＩＩ）
    〔式中、
    ＥおよびＢは、前記式（Ｉ）のものと同じであり、
    Ａｂは、抗体である。〕で表される、生体直交性官能基を有する抗体またはその塩を生成することを含む、方法。
  22. 機能性物質を有する抗体またはその塩の製造方法であって、
    （１）下記式（Ｉ）：
    Ａ−Ｌ−Ｅ−Ｂ （Ｉ）
    〔式中、
    Ａは、抗体に対する親和性物質であり、
    Ｌは、脱離基を含む２価の基であり、
    Ｅは、（ｉ）前記脱離基と連結しており、かつ（ｉｉ）前記抗体中の求核基と反応する能力を有する求電子基を含む２価の基であり、
    Ｂは、生体直交性官能基であり、
    前記脱離基は、前記求核基と前記求電子基との間の反応によりＥから切断されて脱離する能力を有する。〕で表される、抗体に対する親和性物質、および生体直交性官能基を有する化合物またはその塩を、抗体と反応させて、
    下記式（ＩＩ）：
    Ａｂ−Ｅ−Ｂ （ＩＩ）
    〔式中、
    ＥおよびＢは、前記式（Ｉ）のものと同じであり、
    Ａｂは、抗体である。〕で表される、生体直交性官能基を有する抗体またはその塩を生成すること；ならびに
    （２）前記式（ＩＩ）で表される、生体直交性官能基を有する抗体またはその塩を、生体直交性官能基を介して機能性物質と反応させて、
    下記式（ＩＩＩ）：
    Ａｂ−Ｅ−Ｂ’−Ｆ （ＩＩＩ）
    〔式中、
    Ａｂは、前記式（ＩＩ）のものと同じであり、
    Ｅは、前記式（Ｉ）のものと同じであり、
    Ｂ’は、機能性物質と生体直交性官能基との間の反応により生成する部分を含む２価の基であり、
    Ｆは、機能性物質である。〕で表される、機能性物質を有する抗体またはその塩を生成することを含む、方法。
  23. 下記式（ＩＩ−１）：
    Ａｂ−Ｅ１−Ｅ２−Ｅ３−Ｂ （ＩＩ−１）
    〔式中、
    Ａｂは、抗体であり、
    Ｅ１は、抗体中の求核基と連結している求電子基であり、
    Ｅ２は、（ａ）−Ｘ−Ｙ−〔ここで、Ｅ１と結合するＸは、Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）（ここで、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して、水素原子または炭素原子数１〜６のアルキルである。）、Ｎ（Ｒ３）（ここで、Ｒ３は、水素原子または炭素原子数１〜６のアルキルである。）、Ｏ、Ｓ、またはＳｅであり、Ｅ３と結合するＹは、Ｃ（Ｒ４）（Ｒ５）（ここで、Ｒ４およびＲ５はそれぞれ独立して、水素原子または炭素原子数１〜６のアルキルである。）である。〕、あるいは（ｂ）下記式（ｉ）：
    Figure 2019240288
     （ここで、環Ｚは、Ｅ１と結合する環構成原子Ｘ’およびその両隣の環構成原子の全てが炭素原子である２価の環基であるか、またはＥ１と結合する環構成原子Ｘ’が窒素原子であり、かつ窒素原子の両隣の環構成原子が炭素原子である２価の複素環基である。・は結合手である。）で表される基であり、
    Ｅ３は、Ｅ２が−Ｘ−Ｙ−の場合には２価の基であり、Ｅ２が式（ｉ）で表される基の場合には結合または２価の基であり、
    Ｂは、生体直交性官能基である。〕で表される、生体直交性官能基を位置選択的に有する抗体またはその塩。
  24. 前記抗体が、モノクローナル抗体の定常領域のみに生体直交性官能基を有する抗体である、請求項２３記載の抗体またはその塩。
  25. 前記抗体が、モノクローナル抗体のＦｃ領域のみに生体直交性官能基を有する抗体である、請求項２３または請求項２４記載の抗体またはその塩。
  26. 前記抗体が、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域における２４６〜２４８位または２８８〜２９０位のアミノ酸残基からなる領域において、生体直交性官能基を位置選択的に有するヒトＩｇＧである、請求項２３〜２５のいずれか一項記載の抗体またはその塩。
  27. 前記式（ＩＩ−１）で表される前記抗体が、下記式（ＩＩ−２）：
    Ａｂ−Ｅ１−Ｘ−Ｙ−Ｅ３−Ｂ （ＩＩ−２）
    〔式中、
    Ａｂ、Ｘ、Ｙ、およびＢは、前記式（ＩＩ−１）のものと同じであり、
    Ｅ１は、−Ｃ（＝Ｏ）−、−ＳＯ２−、および−ＣＨ２−からなる群より選ばれる基であり、
    Ｅ３は、２価の基である。〕で表される、生体直交性官能基を位置選択的に有する抗体である、請求項２３〜２６のいずれか一項記載の抗体またはその塩。
  28. 前記式（ＩＩ−１）で表される前記抗体が、下記式（ＩＩ−３）：
    Figure 2019240288
     〔式中、
    Ａｂ、環構成原子Ｘ’、環Ｚ、およびＢは、前記式（ＩＩ−１）のものと同じであり、
    Ｅ１は、−Ｃ（＝Ｏ）−、−ＳＯ２−、および−ＣＨ２−からなる群より選ばれる基であり、
    Ｅ３は、結合または２価の基である。〕で表される、生体直交性官能基を位置選択的に有する抗体である、請求項２３〜２６のいずれか一項記載の抗体またはその塩。
  29. 下記式（ＩＩＩ−１）：
    Ａｂ−Ｅ１−Ｅ２−Ｅ３−Ｂ’−Ｆ （ＩＩＩ−１）
    〔式中、
    Ａｂは、抗体であり、
    Ｅ１は、抗体中の求核基と連結している求電子基であり、
    Ｅ２は、（ａ）−Ｘ−Ｙ−〔ここで、Ｅ１と結合するＸは、Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）（ここで、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して、水素原子または炭素原子数１〜６のアルキルである。）、Ｎ（Ｒ３）（ここで、Ｒ３は、水素原子または炭素原子数１〜６のアルキルである。）、Ｏ、Ｓ、またはＳｅであり、Ｅ３と結合するＹは、Ｃ（Ｒ４）（Ｒ５）（ここで、Ｒ４およびＲ５はそれぞれ独立して、水素原子または炭素原子数１〜６のアルキルである。）である。〕、あるいは（ｂ）下記式（ｉ）：
    Figure 2019240288
     （ここで、環Ｚは、Ｅ１と結合する環構成原子Ｘ’およびその両隣の環構成原子の全てが炭素原子である２価の環基であるか、またはＥ１と結合する環構成原子Ｘ’が窒素原子であり、かつ窒素原子の両隣の環構成原子が炭素原子である２価の複素環基である。・は結合手である。）で表される基であり、
    Ｅ３は、Ｅ２が−Ｘ−Ｙ−の場合には２価の基であり、Ｅ２が式（ｉ）で表される基の場合には結合または２価の基であり、
    Ｂ’は、機能性物質と生体直交性官能基との間の反応により生成する部分を含む２価の基であり、
    Ｆは、機能性物質である。〕で表される、機能性物質を位置選択的に有する抗体またはその塩。
  30. 前記抗体が、モノクローナル抗体の定常領域のみに生体直交性官能基を有する抗体である、請求項２９記載の抗体またはその塩。
  31. 前記抗体が、モノクローナル抗体のＦｃ領域のみに生体直交性官能基を有する抗体である、請求項２９または請求項３０記載の抗体またはその塩。
  32. 前記抗体が、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域における２４６〜２４８位または２８８〜２９０位のアミノ酸残基からなる領域において、機能性物質を位置選択的に有するヒトＩｇＧである、請求項２９〜３１のいずれか一項記載の抗体またはその塩。
  33. 前記式（ＩＩＩ−１）で表される前記抗体が、下記式（ＩＩＩ−２）：
    Ａｂ−Ｅ１−Ｘ−Ｙ−Ｅ３−Ｂ’−Ｆ （ＩＩＩ−２）
    〔式中、
    Ａｂ、Ｘ、Ｙ、Ｂ’およびＦは、前記式（ＩＩＩ−１）のものと同じであり、
    Ｅ１は、−Ｃ（＝Ｏ）−、−ＳＯ２−、および−ＣＨ２−からなる群より選ばれる基であり、
    Ｅ３は、２価の基である〕で表される、機能性物質を位置選択的に有する抗体である、請求項２９〜３２のいずれか一項記載の抗体またはその塩。
  34. 前記式（ＩＩＩ−１）で表される前記抗体が、下記式（ＩＩＩ−３）：
    Figure 2019240288
     〔式中、
    Ａｂ、環構成原子Ｘ’、環Ｚ、Ｂ’およびＦは、前記式（ＩＩＩ−１）のものと同じであり、
    Ｅ１は、−Ｃ（＝Ｏ）−、−ＳＯ２−、および−ＣＨ２−からなる群より選ばれる基であり、
    Ｅ３は、結合または２価の基である。〕で表される、機能性物質を位置選択的に有する抗体である、請求項２９〜３２のいずれか一項記載の抗体またはその塩。
  35. 下記式（ＩＶ）：
    Ａ−Ｌ−Ｅ−Ｆ （ＩＶ）
    〔式中、
    Ａは、抗体に対する親和性物質であり、
    Ｌは、脱離基を含む２価の基であり、
    Ｅは、（ｉ）前記脱離基と連結しており、かつ（ｉｉ）前記抗体中の求核基と反応する能力を有する求電子基を含む２価の基であり、
    Ｆは、機能性物質であり、
    前記脱離基は、前記求核基と前記求電子基との間の反応によりＥから切断されて脱離する能力を有する。〕で表される、抗体に対する親和性物質、および機能性物質を有する化合物またはその塩。
  36. 下記式（ＩＶ）：
    Ａ−Ｌ−Ｅ−Ｆ （ＩＶ）
    〔式中、
    Ａは、抗体に対する親和性物質であり、
    Ｌは、脱離基を含む２価の基であり、
    Ｅは、（ｉ）前記脱離基と連結しており、かつ（ｉｉ）前記抗体中の求核基と反応する能力を有する求電子基を含む２価の基であり、
    Ｆは、機能性物質であり、
    前記脱離基は、前記求核基と前記求電子基との間の反応によりＥから切断されて脱離する能力を有する。〕で表される、抗体に対する親和性物質、および機能性物質を有する化合物またはその塩を含む、機能性物質による抗体の位置選択的修飾試薬。
  37. 機能性物質を有する抗体またはその塩の製造方法であって、
    下記式（ＩＶ）：
    Ａ−Ｌ−Ｅ−Ｆ （ＩＶ）
    〔式中、
    Ａは、抗体に対する親和性物質であり、
    Ｌは、脱離基を含む２価の基であり、
    Ｅは、（ｉ）前記脱離基と連結しており、かつ（ｉｉ）前記抗体中の求核基と反応する能力を有する求電子基を含む２価の基であり、
    Ｆは、機能性物質であり、
    前記脱離基は、前記求核基と前記求電子基との間の反応によりＥから切断されて脱離する能力を有する。〕で表される、抗体に対する親和性物質、および機能性物質を有する化合物またはその塩を、抗体と反応させて、
    下記式（ＩＩＩ）：
    Ａｂ−Ｅ−Ｆ （ＩＩＩ）
    〔式中、
    Ａｂは、抗体であり、
    ＥおよびＦは、前記式（ＩＶ）のものと同じである。〕で表される、機能性物質を有する抗体またはその塩を生成することを含む、方法。
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