CN103890174B - IgG结合性肽及利用其检测和纯化IgG的方法 - Google Patents

IgG结合性肽及利用其检测和纯化IgG的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种对人IgG特异性或选择性地具有结合性的肽。所述肽的特征在于，含有式I所示的由13～17个氨基酸残基构成的氨基酸序列，且可与人IgG结合：(X1-3)-C-(X2)-H-R-G-(Xaa1)-L-V-W-C-(X1-3)，式中，X分别为独立的半胱氨酸以外的任意氨基酸残基，C为半胱氨酸残基，H为组氨酸残基，R为精氨酸残基，G为甘氨酸残基，Xaa1为谷氨酸残基或天冬酰胺残基，L为亮氨酸残基，V为缬氨酸残基，且W为色氨酸残基。

Description

IgG结合性肽及利用其检测和纯化IgG的方法
技术领域
本发明涉及一种由随机肽文库得到的人IgG结合性肽及利用该肽的IgG的检测及纯化方法。
背景技术
目前，抗体药物作为可靠性最高的分子靶向药物备受关注，迅速地扩大新的药品领域。目前开发中或正在使用的抗体药物大部分使用属于免疫球蛋白G(以下记为“IgG”)类的抗体。
一直以来，IgG抗体的纯化中使用源自金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）的蛋白A或蛋白G(非专利文献1、2)。这些蛋白由于也与小鼠、兔子的IgG结合，因此，多用于研究试剂水平下的IgG纯化，但近年来以人IgG1为中心的抗体药物开始利用于药物领域，工业、制药的利用中的重要性日益提高。特别是蛋白A柱在抗体药物的纯化中也起到中心性的作用，许多抗体药物的制造厂商引进以该柱为中心的纯化系统。
然而，蛋白A柱被指出有若干的问题点。其中之一在于在纯化抗体中混入蛋白A的问题。蛋白A为源自细菌的蛋白，人体给药后的免疫原性高，另外担心内毒素的混入。作为用于这样的药品纯化的亲和配体，为了不会引起不合适的物质的混入，对作为配体的蛋白A要求较高的纯化度，这成为提高用于药品纯化的蛋白A柱的成本的主要原因。
为了解决这样的问题，进行有新的IgG抗体的纯化系统的开发。例如报告有基于蛋白A模拟肽(非专利文献3、4)、或以蛋白A和IgG抗体的Fc的Ｘ射线结晶结构为基础而设计的非肽性的亲和配体(非专利文献5)，但从它们的结合能力及特异性的问题方面考虑，在利用上存在限制。
另外，进行有许多使用噬菌体文库或合成肽文库等探索新的IgG结合性肽的研究(专利文献1-3)。
如上所述，虽然进行有利用新的肽、低分子的IgG抗体纯化的研究，但不存在可代替蛋白A、G柱的能够以工业规模应用的新的纯化系统，在该领域中依然寻求一种用于纯化IgG抗体的新的方法。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：WO01/045746
专利文献2：WO02/086070
专利文献3：WO02/38592
非专利文献
非专利文献1：Ey,P.L.,Prowse,S.J.,andJenkin,C.R.(1978)Immunochemistry15(7),429-436
非专利文献2：Akerstrom,B.,Brodin,T.,Reis,K.,andBjorck,L.(1985)JImmunol135(4),2589-2592
非专利文献3：Fassina,G.,Verdoliva,A.,Odierna,M.R.,Ruvo,M.,andCassini,G.(1996)JMolRecognit9(5-6),564-569
非专利文献4：Fassina,G.,Palombo,G.,Verdoliva,A.,andRuvo,M.(2002)AffinityPurificationofImmunoglobulinsUsingProteinAMimetic(PAM)In:Walker,J.M.(ed).TheProteinProtocolsHandbook,SecondEdition,HumanaPressInc.,Totowa,NJ
非专利文献5：Li,R.,Dowd,V.,Stewart,D.J.,Burton,S.J.,andLowe,C.R.(1998)Naturebiotechnology16(2),190-195
发明内容
发明所要解决的课题
本发明的目的在于，提供一种对人IgG特异性或选择性地具有结合性的肽。
另外，本发明的另一目的在于，提供一种使用该肽来纯化或分析(检测或定量)人IgG的方法。
用于解决课题的方法
人IgG主要存在于血液中，通过排除外来的异物及抗体依赖性细胞毒作用，在生物体防御及体内稳态维持方面发挥重要的作用。特别是由于这样的特性，IgG近年来作为抗体药物被用作以癌及自身免疫性疾病例如风湿病为中心的治疗药。本发明以如上作为药品占有重要的地位的IgG抗体的状况为基础，提供一种可与人IgG(特别是IgG1)特异性或选择性地结合的肽，由此，认为对于解决如背景技术中所记载的现有问题，可用作药物的IgG的纯化及分析法的确立是有用的。
对本发明进行归纳，则具有以下的特征。
[1]一种肽，其特征在于，含有下述的式I所示的由13～17个氨基酸残基构成的氨基酸序列，且可与人IgG结合：
(X1-3)-C-(X2)-H-R-G-(Xaa1)-L-V-W-C-(X1-3)(I)
式中，X分别为独立的半胱氨酸以外的任意氨基酸残基，
C为半胱氨酸残基，
H为组氨酸残基，
R为精氨酸残基，
G为甘氨酸残基，
Xaa1为谷氨酸残基或天冬酰胺残基，
L为亮氨酸残基，
V为缬氨酸残基，
且W为色氨酸残基。
[2]如[1]的肽，其特征在于，含有下述的式II所示的由13～17个氨基酸残基构成的氨基酸序列，且可与人IgG结合：
(X1-3)-C-(Xaa2)-(Xaa3)-H-R-G-(Xaa1)-L-V-W-C-(X1-3)(II)
式中，X分别为独立的半胱氨酸以外的任意氨基酸残基，
C为半胱氨酸残基，
H为组氨酸残基，
R为精氨酸残基，
G为甘氨酸残基，
Xaa1为谷氨酸残基或天冬酰胺残基，
L为亮氨酸残基，
V为缬氨酸残基，
W为色氨酸残基，
Xaa2为丙氨酸残基、丝氨酸残基或苏氨酸残基，且
Xaa3为酪氨酸残基或色氨酸残基。
[3]如[1]或[2]的肽，其特征在于，含有下述的式III所示的由13～17个氨基酸残基构成的氨基酸序列，且可与人IgG结合：
(X1-3)-C-A-Y-H-R-G-E-L-V-W-C-(X1-3)(III)
式中，X分别为独立的半胱氨酸以外的任意氨基酸残基，
C为半胱氨酸残基，
A为丙氨酸残基，
Y为酪氨酸残基，
H为组氨酸残基，
R为精氨酸残基，
G为甘氨酸残基，
E为谷氨酸残基，
L为亮氨酸残基，
V为缬氨酸残基，
且W为色氨酸残基。
[4]如[1]～[3]中任一项的肽，其中，设为17个氨基酸残基时，从N末端起第1～3、15～17个的各氨基酸残基为：
第1个氨基酸残基=S、G、F或无；
第2个氨基酸残基=D、G、A、S、P或无；
第3位的氨基酸残基=S、D、T、N、E或R；
第15位的氨基酸残基=S、T或D；
第16位的氨基酸残基=H、G、Y、T、N、D、F或无；
第17位的氨基酸残基=Y、F、H、M或无。
[5]如[4]的肽，所述肽由以下的1)～12)中的任一氨基酸序列构成。
1)DCAYHRGELVWCT(SEQIDNO：55)
2)GPDCAYHRGELVWCTFH(SEQIDNO：56)
3)RCAYHRGELVWCS(SEQIDNO：57)
4)GPRCAYHRGELVWCSFH(SEQIDNO：58)
5)SPDCAYHRGELVWCTFH(SEQIDNO：100)
6)GDDCAYHRGELVWCTFH(SEQIDNO：101)
7)GPSCAYHRGELVWCTFH(SEQIDNO：102)
8)GPDCAYHRGELVWCSFH(SEQIDNO：103)
9)GPDCAYHRGELVWCTHH(SEQIDNO：104)
10)GPDCAYHRGELVWCTFY(SEQIDNO：105)
11)SPDCAYHRGELVWCTFY(SEQIDNO：106)
12)SDDCAYHRGELVWCTFY(SEQIDNO：107)
[6]如[1]或[2]的肽，其特征在于，含有下述的式IV所示的由13个氨基酸残基构成的氨基酸序列，且可与人IgG结合：
D-C-(Xaa2)-(Xaa3)-H-R-G-(Xaa1)-L-V-W-C-T(IV)
式中，
D为天冬氨酸残基，
C为半胱氨酸残基，
H为组氨酸残基，
R为精氨酸残基，
G为甘氨酸残基，
Xaa1为谷氨酸残基或天冬酰胺残基，
L为亮氨酸残基，
V为缬氨酸残基，
W为色氨酸残基，
T为苏氨酸残基，
Xaa2为丙氨酸残基或苏氨酸残基，
且Xaa3为酪氨酸残基或色氨酸残基。
[7]如[6]的肽，所述肽由以下1)～4)中的任一氨基酸序列构成。
1)DCTYHRGNLVWCT(SEQIDNO：47)
2)DCAYHRGNLVWCT(SEQIDNO：48)
3)DCTYHRGELVWCT(SEQIDNO：50)
4)DCAWHRGELVWCT(SEQIDNO：53)。
[8]一种肽，其特征在于，含有下述的式V所示的由13个氨基酸残基构成的氨基酸序列，且可与人IgG结合：
D-C-(Xaa1)-(Xaa2)-(Xaa3)-(Xaa4)-G-(Xaa5)-L-(Xaa6)-W-C-T(V)
式中，
D为天冬氨酸残基，
C为半胱氨酸残基，
G为甘氨酸残基，
L为亮氨酸残基，
W为色氨酸残基，
T为苏氨酸残基，
Xaa1为丙氨酸残基、丝氨酸残基或苏氨酸残基，
Xaa2为色氨酸残基或酪氨酸残基，
Xaa3为组氨酸残基、精氨酸残基、丝氨酸残基或苏氨酸残基，
Xaa4为天冬酰胺残基或精氨酸残基，
Xaa5为谷氨酸残基、天冬酰胺残基、精氨酸残基、或天冬氨酸残基，且
Xaa6为异亮氨酸残基或缬氨酸残基。
[9]如[8]的肽，所述肽由以下的1)～12)中的任一氨基酸序列构成。
1)DCTYTNGNLVWCT(SEQIDNO：29)
2)DCAYTNGNLVWCT(SEQIDNO：31)
3)DCSYTNGNLVWCT(SEQIDNO：32)
4)DCTWTNGNLVWCT(SEQIDNO：34)
5)DCTYHNGNLVWCT(SEQIDNO：35)
6)DCTYRNGNLVWCT(SEQIDNO：36)
7)DCTYSNGNLVWCT(SEQIDNO：37)
8)DCTYTRGNLVWCT(SEQIDNO：39)
9)DCTYTNGELVWCT(SEQIDNO：40)
10)DCTYTNGRLVWCT(SEQIDNO：41)
11)DCTYTNGDLVWCT(SEQIDNO：42)
12)DCTYTNGNLIWCT(SEQIDNO：45)
[10]如[1]～[9]中任一项的肽，其中，肽在2个半胱氨酸(C)残基间形成二硫键。
[11]如[1]～[10]中的任一肽，其中，所述肽与标记连接。
[12]一种融合蛋白，其由[1]～[11]中任一项的肽和所连接的蛋白构成。
[13]一种固定化肽，由[1]～[11]中任一项的肽与固相结合而成。
[14]一种核酸，编码[1]～[11]中任一项的肽。
[15]一种IgG的纯化方法，所述纯化方法包括使[1]～[11]中任一项的肽或[13]的固定化肽与IgG结合、以及使结合的IgG释放而回收IgG。
[16]一种IgG的检测方法，所述检测方法包括使样品中的IgG与[1]～[11]中任一项的肽或[13]的固定化肽结合而检测结合的IgG。
[17]一种用于人IgG的分析或纯化的试剂盒，所述试剂盒含有[1]～[11]中任一项的肽或[13]的固定化肽中的至少1种。
[18]一种IgG分离用柱，含有[13]的固定化肽。
[19]如[1]的肽，其特征在于，含有下述的式I'所示的由13～17个氨基酸残基构成的氨基酸序列，且可与人IgG结合：
(X1-3)-C-(X1)-Y-H-R-G-N-L-V-W-C-(X1-3)(I')
式中，X分别为独立的半胱氨酸以外的任意氨基酸残基，
C为半胱氨酸残基，
Y为酪氨酸残基，
H为组氨酸残基，
R为精氨酸残基，
G为甘氨酸残基，
N为天冬酰胺残基，
L为亮氨酸残基，
V为缬氨酸残基，
且W为色氨酸残基。
[20]如[1]的肽，其特征在于，含有下述的式I''所示的由13～17个氨基酸残基构成的氨基酸序列，且可与人IgG结合：
(X1-3)-C-A-(X1)-H-R-G-E-L-V-W-C-(X1-3)(I'')
式中，X分别为独立的半胱氨酸以外的任意氨基酸残基，
C为半胱氨酸残基，
A为丙氨酸残基，
H为组氨酸残基，
R为精氨酸残基，
G为甘氨酸残基，
E为谷氨酸残基，
L为亮氨酸残基，
V为缬氨酸残基，
且W为色氨酸残基。
本说明书包含作为本申请的优先权基础的日本专利申请2011-182539号的说明书和/或附图中所记载的内容。
发明效果
本发明的人IgG结合性肽具有下述优点：与IgA、IgM及IgE相比，对IgG具有更高的选择性，可与人IgG结合。这意味着可以从例如人血清等中选择性地分离IgG。
附图说明
图1表示利用ELISA的人IgG结合噬菌体克隆的结合特异性；
图2表示Lib-A的序列(A)和由该序列得到的肽的序列(B)；
图3表示Lib-B的序列；
图4表示Lib-C的序列；
图5表示利用表面等离子的GFc-C35-3/15(T5A、T7H、N8R、N10E)肽(A)及GFc-C35-3/15(T5A、Y6W、T7H、N8R、N10E)肽(B)对人IgG(左侧)及人IgA(右侧)的结合分析的结果；
图6表示Lib-D的序列；
图7表示以由Lib-D得到的肽序列为基础在各位点所看到的氨基酸的出现频率；
图8表示利用固定化了IgG结合性肽的柱从人血清中纯化IgG的结果；
图9表示利用固定化了IgG结合性肽的柱从人血清中纯化的洗脱级分D的SDS-PAGE的结果。各泳道(レーン)分别表示以下的样品。1：标记物，2：IgG，3：HAS、4：血清、5：洗脱级分D。
具体实施方式
此次，本发明人等发现的对人IgG具有特异性或选择性的结合性的肽是参考通过T7噬菌体展示系统所构建的分子内含有1个二硫键的随机肽文库(Sakamoto,K.,Ito,Y.,Hatanaka,T.,Soni,P.B.,Mori,T.,andSugimura,K.(2009)TheJournalofbiologicalchemistry284(15),9986-9993)，利用生物淘选法从新设计、构建的文库中分离而得到的，此时所得到的2种特异性克隆可观察到彼此共有序列的同源性，基于该序列进行各种置换或缺失而制备的合成肽显示对于IgG的特异性。对这些肽的IgG结合所必需的残基进行鉴定，使得将该肽应用于亲和性增强方法、以及从人血清中纯化IgG成为可能。本发明的IgG结合性肽为最小型的肽，小到13个残基，由此，可期待以低成本的肽为基础来构建IgG的纯化系统。
下面，对本发明进一步详细地进行说明。
具体而言，对本发明的IgG结合性肽、利用该肽的IgG的纯化法及分析法、用于这样的IgG纯化或检测的试剂盒进行说明。
IgG结合性肽
本发明的肽是从含有大量随机肽的噬菌体文库中作为对人IgG特异性或选择性地具有结合性的肽而筛选出的。
本说明书中使用的人IgG是指IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。
即，本发明的肽，作为广义的一次结构，其特征在于，含有下述的式I所示的由13～17个氨基酸残基构成的氨基酸序列，且可与人IgG结合：
(X1-3)-C-(X2)-H-R-G-(Xaa1)-L-V-W-C-(X1-3)(I)
式中，X各自独立地为半胱氨酸以外的任意氨基酸残基，
C为半胱氨酸残基，
H为组氨酸残基，
R为精氨酸残基，
G为甘氨酸残基，
Xaa1为谷氨酸残基或天冬酰胺残基，
L为亮氨酸残基，
V为缬氨酸残基，且
W为色氨酸残基。
上述式中，N末端或C末端的X1-3的符号是指连续1～3个半胱氨酸(C或Cys)以外的独立的任意氨基酸残基X，构成其的氨基酸残基为相同或不同的残基，但优选由3个均不同的残基的序列构成。相同地，X2也是指连续2个半胱氨酸(C或Cys)以外的独立的任意氨基酸残基X，构成其的氨基酸残基为相同或不同的残基，但优选由该2个连续的氨基酸残基不同的残基的序列构成。
式I的2个半胱氨酸残基可以形成二硫键从而形成环状肽。通常，式I的肽形成二硫键。
在式I的肽的氨基酸序列中，进一步指定了氨基酸残基X的式I'及式I''所示的肽示于以下。
即，式I'所示的肽的特征在于，含有下述的式I'所示的由13～17个氨基酸残基构成的氨基酸序列，且可与人IgG结合：
(X1-3)-C-(X1)-Y-H-R-G-N-L-V-W-C-(X1-3)(I')
式中，X各自独立地为半胱氨酸以外的任意氨基酸残基，
C为半胱氨酸残基，
Y为酪氨酸残基，
H为组氨酸残基，
R为精氨酸残基，
G为甘氨酸残基，
N为天冬酰胺残基，
L为亮氨酸残基，
V为缬氨酸残基，且，
W为色氨酸残基。
式I''所示的肽的特征在于，含有下述的式I''所示的由13～17个氨基酸残基构成的氨基酸序列，且可与人IgG结合：
(X1-3)-C-A-(X1)-H-R-G-E-L-V-W-C-(X1-3)(I'')
式中，X各自独立地为半胱氨酸以外的任意氨基酸残基，
C为半胱氨酸残基，
A为丙氨酸残基，
H为组氨酸残基，
R为精氨酸残基，
G为甘氨酸残基，
E为谷氨酸残基，
L为亮氨酸残基，
V为缬氨酸残基，且
W为色氨酸残基。
另外，在式I的肽的氨基酸序列中，进一步指定了氨基酸残基X的式II所示的肽示于以下。
即，式II所示的肽的特征在于，含有下述的式II所示的由13～17个氨基酸残基构成的氨基酸序列，且可与人IgG结合：
(X1-3)-C-(Xaa2)-(Xaa3)-H-R-G-(Xaa1)-L-V-W-C-(X1-3)(II)
式中，X各自独立地为半胱氨酸以外的任意氨基酸残基，
C为半胱氨酸残基，
H为组氨酸残基，
R为精氨酸残基，
G为甘氨酸残基，
Xaa1为谷氨酸残基或天冬酰胺残基，
L为亮氨酸残基，
V为缬氨酸残基，
W为色氨酸残基，
Xaa2为丙氨酸残基、丝氨酸残基或苏氨酸残基，且
Xaa3为酪氨酸残基或色氨酸残基。
在上述的式I'、式I''及式II的肽的氨基酸序列中，设为17个氨基酸残基时，从N末端起第1个及第2个以及第16个及第17个的氨基酸残基X可以缺失，这样的肽由13个氨基酸长度构成。
本说明书中使用的“设为17个氨基酸残基时”是在将肽的氨基酸残基按氨基酸编号命名时，为了从作为最长的氨基酸长度的17个残基的N末端起依次对第1个～第17个进行编号，而方便地表达的术语。
进而，在式I的肽的氨基酸序列中，进一步指定了氨基酸残基X的式III所示的肽示于以下。
式III所示的肽的特征在于，含有下述的式III所示的由13～17氨个基酸残基构成的氨基酸序列，且可与人IgG结合：
(X1-3)-C-A-Y-H-R-G-E-L-V-W-C-(X1-3)(III)
式中，X各自独立地为半胱氨酸以外的任意氨基酸残基，
C为半胱氨酸残基，
A为丙氨酸残基，
Y为酪氨酸残基，
H为组氨酸残基，
R为精氨酸残基，
G为甘氨酸残基，
E为谷氨酸残基，
L为亮氨酸残基，
V为缬氨酸残基，且
W为色氨酸残基。
在上述的式III的肽的氨基酸序列中，设为17个氨基酸残基时，从N末端起第1个及第2个以及第16个及第17个的氨基酸残基X可以缺失，这样的肽由13个氨基酸长度构成。
进而，上述的各式的肽的氨基酸序列的半胱氨酸(C)以外的氨基酸残基即设为17个氨基酸残基时，从N末端起第1～3、5、6、15～17个的各氨基酸残基优选选自以下残基。其中，各大写字母为氨基酸的单字母符号：
第1个氨基酸残基=S、G、F或无；
第2个氨基酸残基=D、G、A、S、P或无；
第3个氨基酸残基=S、D、T、N、E或R；
第5个氨基酸残基=A或T；
第6个氨基酸残基=Y或W；
第15个氨基酸残基=S、T或D；
第16个氨基酸残基=H、G、Y、T、N、D、F或无；
第17个氨基酸残基=Y、F、H、M或无。
第5个氨基酸残基=A或T；
第6个氨基酸残基=Y或W；
在式I的肽的氨基酸序列中，进一步指定了氨基酸残基X的式IV所示的肽示于以下。
式IV所示的肽的特征在于，含有下述的式IV所示的由13个氨基酸残基构成的氨基酸序列，且可与人IgG结合。
D-C-(Xaa2)-(Xaa3)-H-R-G-(Xaa1)-L-V-W-C-T(IV)
(D为天冬氨酸残基，
C为半胱氨酸残基，
H为组氨酸残基，
R为精氨酸残基，
G为甘氨酸残基，
Xaa1为谷氨酸残基或天冬酰胺残基，
L为亮氨酸残基，
V为缬氨酸残基，
W为色氨酸残基，
T为苏氨酸残基，
Xaa2为丙氨酸残基、或苏氨酸残基，且
Xaa3为酪氨酸残基或色氨酸残基。)
以下的1)～17)中例举若干式I的肽的具体例，但并不受其限定。这样的肽对于人IgA，与其它种类的免疫球蛋白相比，均具有特别高的结合特异性或结合选择性：
1)DCTYHRGNLVWCT(SEQIDNO：47)
2)DCAYHRGNLVWCT(SEQIDNO：48)
3)DCTYHRGELVWCT(SEQIDNO：50)
4)DCAYHRGELVWCT(SEQIDNO：52)
5)DCAWHRGELVWCT(SEQIDNO：53)
6)DCAYHRGELVWCT(SEQIDNO：55)
7)GPDCAYHRGELVWCTFH(SEQIDNO：56)
8)RCAYHRGELVWCS(SEQIDNO：57)
9)GPRCAYHRGELVWCSFH(SEQIDNO：58)
10)SPDCAYHRGELVWCTFH(SEQIDNO：100)
11)GDDCAYHRGELVWCTFH(SEQIDNO：101)
12)GPSCAYHRGELVWCTFH(SEQIDNO：102)
13)GPDCAYHRGELVWCSFH(SEQIDNO：103)
14)GPDCAYHRGELVWCTHH(SEQIDNO：104)
15)GPDCAYHRGELVWCTFY(SEQIDNO：105)
16)SPDCAYHRGELVWCTFY(SEQIDNO：106)
17)SDDCAYHRGELVWCTFY(SEQIDNO：107)。
另外，本发明的肽，作为广义的一次结构，其特征在于，含有下述的式V所示的由13个氨基酸残基构成的氨基酸序列，且可与人IgG结合：
D-C-(Xaa1)-(Xaa2)-(Xaa3)-(Xaa4)-G-(Xaa5)-L-(Xaa6)-W-C-T(V)
式中，
D为天冬氨酸残基，
C为半胱氨酸残基，
G为甘氨酸残基，
L为亮氨酸残基，
W为色氨酸残基，
T为苏氨酸残基，
Xaa1为丙氨酸残基、丝氨酸残基或苏氨酸残基，
Xaa2为色氨酸残基或酪氨酸残基，
Xaa3为组氨酸残基、精氨酸残基、丝氨酸残基或苏氨酸残基，
Xaa4为天冬酰胺残基或精氨酸残基，
Xaa5为谷氨酸残基、天冬酰胺残基、精氨酸残基、或天冬氨酸残基，
且Xaa6为异亮氨酸残基或缬氨酸残基。
式V的2个半胱氨酸残基可以形成二硫键从而形成环状肽。通常，式V的肽形成有二硫键。
以下的10)～21)中例举若干式V的肽的具体例，但并不受其限定。这样的肽对于IgA，与其它种类的免疫球蛋白相比，均具有特别高的结合特异性或结合选择性：
10)DCTYTNGNLVWCT(SEQIDNO：29)
11)DCAYTNGNLVWCT(SEQIDNO：31)
12)DCSYTNGNLVWCT(SEQIDNO：32)
13)DCTWTNGNLVWCT(SEQIDNO：34)
14)DCTYHNGNLVWCT(SEQIDNO：35)
15)DCTYRNGNLVWCT(SEQIDNO：36)
16)DCTYSNGNLVWCT(SEQIDNO：37)
17)DCTYTRGNLVWCT(SEQIDNO：39)
18)DCTYTNGELVWCT(SEQIDNO：40)
19)DCTYTNGRLVWCT(SEQIDNO：41)
20)DCTYTNGDLVWCT(SEQIDNO：42)
21)DCTYTNGNLIWCT(SEQIDNO：45)。
如上所述，本发明涉及的上述式的肽的特征在于，各氨基酸序列中具有隔开的2个半胱氨酸(C)残基，且以能够在该半胱氨酸残基间形成二硫键的方式配置半胱氨酸残基，优选的肽是2个半胱氨酸残基形成二硫键从而形成环状肽，在各半胱氨酸残基的N末端侧及C末端侧可以具有1或2个半胱氨酸以外的任意氨基酸残基。在各半胱氨酸残基的N末端侧及C末端侧具有1或2个氨基酸残基的情况下，设为17个氨基酸残基，从N末端起第1～2、16～17个的各氨基酸残基为上述例示的残基。
本发明的肽与人IgG的结合亲和性，与其它的人免疫球蛋白(IgA、IgE、IgM)相比高约10倍以上，优选高约50倍以上，更优选高约200倍以上。关于本发明的肽与人IgG的结合的解离常数(Kd)，可通过表面等离子共振谱分析(例如使用BIACORE系统)来确定，例如为1×10-1M～低于1×10-3M，优选低于1×10-4M，更优选低于1×10-5M。
本发明的肽可以通过惯用的液相合成法、固相合成法等肽合成法、利用自动肽合成机的肽合成等来制造(Kelley等,GeneticsEngineeringPrinciplesandMethods,Setlow,J.K.eds.,PlenumPressNY.(1990)Vol.12,p.1-19；Stewart等,Solid-PhasePeptideSynthesis(1989)W.H.FreemanCo.;Houghten,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)82:p.5132；《新生物化学实验讲座1蛋白质IV》(1992)日本生物化学会编，东京化学同人)。或者，也可以通过使用编码本发明的肽的核酸的基因重组法或噬菌体展示法等来制造肽。例如可以将编码本发明的肽的氨基酸序列的DNA导入表达载体中，导入宿主细胞中培养，由此制造目标肽。制造的肽可以通过常规方法例如凝胶过滤色谱法、离子交换柱色谱法、亲和色谱法、反相柱色谱法、HPLC等色谱法、硫酸铵分级、超滤、免疫吸附法等进行回收或纯化。
肽合成是准备保护了各氨基酸的除要结合的α-氨基和α-羧基以外的官能团的氨基酸类，在各氨基酸的α-氨基和α-羧基之间进行肽键形成反应。通常，将位于肽的C末端的氨基酸残基的羧基通过适当的间隔体或接头与固相结合。将以上得到的二肽的氨基末端的保护基选择性地除去，在与下一氨基酸的α-羧基之间形成肽键。连续进行这样的操作而制造侧基被保护的肽，最后，除去全部的保护基，从固相中分离。保护基的种类及保护方法、肽键法的详细内容详细地记载于上述的文献中。
基因重组法包括将编码本发明的肽的DNA插入适当的表达载体中，将载体导入至适当的宿主细胞中，培养细胞，从细胞内或细胞外液中回收目标肽。载体没有限定，例如为质粒、噬菌体、粘粒、噬菌粒、病毒等载体。质粒载体没有限定，可以举出：源自大肠杆菌的质粒(例如pET22b(+)、pBR322、pBR325、pUC118、pUC119、pUC18、pUC19、pBluescript等)、源自枯草杆菌的质粒(例如pUB110、pTP5等)、源自酵母的质粒(例如YEp13、YCp50等)等。噬菌体载体没有限定，可以举出：T7噬菌体展示载体(T7Select10-3b、T7Select1-1b、T7Select1-2a、T7Select1-2b、T7Select1-2c等(Novagen))、λ噬菌体载体(Charon4A、Charon21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11、λZAP、λZAPII等)。病毒载体没有限定，例如可以举出：反转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、牛痘病毒、仙台病毒等动物病毒；杆状病毒等昆虫病毒等。粘粒载体没有限定，可以举出：Lorist6、Charomid9-20、Charomid9-42等。噬菌粒载体没有限定，例如已知有pSKAN、pBluescript、pBK、pComb3H等。载体中可以包含可表达目标DNA的调节序列或用于淘选含有目标DNA的载体的选择标记物、用于插入目标DNA的多克隆位点等。这样的调节序列中含有启动子、增强子、终止子、S-D序列或核糖体结合位点、复制起始区、多A位点等。另外，选择标记物可以使用例如氨苄西林抗性基因、新霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、二氢叶酸还原酶基因等。用于导入载体的宿主细胞为大肠杆菌及枯草杆菌等细胞、酵母细胞、昆虫细胞、动物细胞(例如哺乳动物细胞)、植物细胞等，对这些细胞的转化或转染，例如包括磷酸钙法、电穿孔法、脂质体转染法、粒子枪法、PEG法等。培养转化细胞的方法可依据宿主生物的培养中所使用的通常的方法来进行。例如，在大肠杆菌及酵母细胞等微生物的培养中，含有宿主微生物可进行同化的碳源、氮源、无机盐类等。为了容易地回收本发明的肽，优选使通过表达生成的肽分泌至细胞外。因此，将编码可使肽从该细胞分泌的肽序列的DNA结合于编码目标肽的DNA的5'末端侧。转移至细胞膜的融合肽被信号肽酶切断，从而使目标肽分泌释放至培养基中。或者，也可以回收蓄积于细胞内的目标肽。此时，将细胞物理性或化学性地破坏，使用蛋白纯化技术来回收目标肽。
因此，本发明进一步还涉及一种编码本发明的肽的核酸。在此，核酸包括DNA或RNA(例如mRNA)。
为了可以检测IgG，本发明的肽也可以标记。标记没有限定，例如包括荧光色素、化学发光色素、酶、放射性同位素、荧光蛋白、生物素等。优选的标记的例子为荧光素、FITC等荧光素衍生物，若丹明、四甲基若丹明等若丹明衍生物，德克萨斯红等荧光色素。
本发明的肽可以与任意的蛋白融合。蛋白只要为GFP(绿色荧光蛋白)之类的荧光蛋白、过氧化物酶等酶等，则可将该蛋白用作标记。此时，可以根据需要经由适当的接头，通过基因重组法将本发明的肽及该蛋白制作为融合蛋白。此时，本发明的肽应该以不会损伤与人IgG的结合性的方式制作融合蛋白。
本发明的肽还可以进一步以能够用于人IgG的分离纯化、分析等的方式固定化在能够填充于亲和柱的固相上。
作为适用于将肽固定化的固相没有限定，例如可以举出：聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚酯、聚丙烯腈、苯乙烯-丁二烯共聚物、(甲基)丙烯酸酯聚合物、氟树脂、硅胶、交联葡聚糖、多糖、琼脂糖等多糖类、玻璃、金属、磁性物质及它们的组合等。这样的固相的形状例如可以为盘、球、纤维、粒子、棒、平板、容器、盒、微板、试管、膜(膜或薄膜)、凝胶、片等任意的形状。具体而言，例如可以举出：磁性珠、玻璃珠、聚苯乙烯珠、琼脂糖珠、硅胶珠、多糖类珠、聚苯乙烯板、玻璃板、聚苯乙烯管等。本发明的肽固定化于这些固相可以使用本领域技术人员公知的方法来进行，例如可通过物理吸附法、共价键法、离子键法等进行。固定优选通过共价键来进行，使固相表面具有化学官能团(例如羟基、氨基、N-羟基琥珀酰亚胺基等)，优选具有含有作为间隔体的碳原子数约4～20的亚烷基链的化学官能团，使其与肽的羧基末端进行化学反应而形成酯键或酰胺键等。固定化了本发明的肽的固相填充于亲和色谱柱、HPLC柱等柱，可以用于检测、纯化或分离人IgG。
IgG的纯化法
本发明进一步提供一种IgG的纯化方法，其包含使上述本发明的肽或固定化肽与IgG结合以及使结合的IgG释放并回收IgG。
将固定化了本发明的肽的固相填充于亲和色谱柱、HPLC柱等柱中，用适当的缓冲液平衡，在室温～0℃、优选约10℃～0℃、进一步优选约4℃的低温下应用含有人IgG的液体，使人IgG与固相上的肽结合。例如在分离血清中的IgG的情况下，可以使用中性范围的pH、例如pH6.0～7.5的缓冲液，上柱，进行结合操作。洗脱可以通过将酸性范围的pH、例如pH2～4的缓冲液(例如含有0.3M的NaCl的pH3.5～2.5的0.2M甘氨酸-HCl缓冲液)在柱中流动来进行。
IgG是否已被回收可通过例如电泳、之后使用抗人IgG抗体的蛋白印迹法来测定。电泳条件如下：可以进行使用5～20%丙烯酰胺梯度凝胶的SDS-PAGE，另外，蛋白印迹条件如下：可以将电泳后的蛋白转印至PVDF膜上，用脱脂乳封闭后，利用抗人IgGα链山羊抗体与HRP标记抗山羊IgG小鼠抗体进行检测。
本发明的方法可用于由各种方法生成的含IgG的产物中纯化IgG的工序中得到富集IgG的级分。因此，优选在亲和色谱法、HPLC等柱色谱法中使用本发明的方法。在纯化IgG时，除这样的色谱法以外，还可以适宜组合蛋白的惯用纯化技术，例如凝胶过滤色谱法、离子交换柱色谱法、反相柱色谱法等色谱法、硫酸铵分级、超滤等。
IgG的分析法
本发明进一步提供一种IgG的检测方法，其包含使样品中的IgG与上述的本发明的肽或固定化肽结合而检测结合的IgG。在此，检测包含定性或定量中的任一种分析。
IgG的检测可以如下进行：使用适于操作的缓冲液，同时使样品与薄膜或聚苯乙烯孔板等结合，使其与本发明的标记肽接触，根据需要清洗后，对标记的水平进行定性或定量。
或者，在使用如上所述的固定化了本发明的肽的HPLC柱的情况下，向该柱注入含有人IgG的样品，通入结合缓冲液，使人IgG与肽结合，记录在例如吸光度280nm、或者280nm的激发光所致的350nm的荧光下检测的蛋白，用洗脱缓冲液(例如在含有0.15M的NaCl的0.1M甘氨酸盐酸缓冲液pH2.5中的梯度洗脱)从柱中洗脱，通过出现的峰及峰面积，可以进行IgG的定性及定量。
试剂盒及柱
本发明进一步提供一种用于人IgG的分析(定性、定量等)或纯化的试剂盒，其含有上述本发明的肽或固定化肽中的至少1种。
本发明的试剂盒中所含的各种肽或固定化肽容纳在单独的容器中。另外，根据需要，试剂盒中还可以具备记载了人IgG的分析步骤及纯化步骤的使用说明书。进而，试剂盒中还可以含有分析所需的试剂及缓冲液、固定化肽填充柱等。
本发明进一步提供一种IgG分离用柱，其含有上述的本发明的固定化肽。
上述IgG分离用柱为用于分离IgG的柱，具体而言，包含用于IgG的分析或纯化/分离的色谱柱、高效液相色谱(HPLC)柱等柱。柱的尺寸没有特别限制，可以根据分析用、纯化/分离用等用途、应用(装载)或注入的量等进行改变。另外，柱的材质可以为金属、塑料、玻璃等通常用作柱的材质。
上述的柱可通过将根据上述方法制作的本发明的固定化肽(干燥或湿润状态)紧密地填充于柱中来制造。
实施例
下面，举出实施例对本发明进一步具体地进行说明，但本发明的范围并不受这些实施例限制。
为了从通过T7噬菌体展示法构建的具有由2个Cys形成的环状结构的随机肽文库中分离人IgG特异性的噬菌体，使用以下的生物淘选的方法。
即，将含有0.5%BSA和0.1μM的II型IgG结合肽K6R(J.Biol.Chem.284,9986,2009)的PBS中的5×1010pfu的T7噬菌体文库(X3CX8CX3、X3CX9CX3X3CX10CX3的等量混合物)溶液加入到涂布了人IgG-Fc(来自人血浆，AthensResearch&Technology,Athens,GA,USA)(1μg/100μl/孔)并用0.5%BSA封闭的96孔微板(Nunc,Maxisorp)的孔中，使其反应1小时。除去上清液的噬菌体溶液后，用含有0.1%吐温的PBS将孔清洗10次。加入大肠杆菌BLT5615(Novagen)的培养液(300μl)使其感染，与3ml的大肠杆菌培养液一同在37℃下培养直至增殖、溶菌。根据常规方法通过利用聚乙二醇的噬菌体沉淀法从溶菌后的培养液中回收噬菌体。使得到的噬菌体溶解于PBS中，通过0.45μm的过滤器后，用于以下的淘选。通过进行包含上述轮次的4轮淘选，由此浓缩IgG特异性的噬菌体。
通过ELISA调查4轮淘选后得到的噬菌体对各种IgG的结合特异性，结果如图1所示，不仅与人IgG结合，而且也发现与兔子、山羊、小鼠的IgG的结合活性。
因此，进行得到的噬菌体展示的肽模体的分析，确定氨基酸序列(表1)。
[表1]
由随机肽文库得到的IgG结合性的噬菌体展示的肽序列的比较
1******8-9*******17
GFc-A2 SFTCAYDRDGNLVWCTHS SEQ ID NO：1 1/30
Fx-B17 SSDCTYQR-GELVWCTHL SEQ ID NO：2 1/30
GFc-C3 PGECTKHM-GELVWCVSK SEQ ID NO：3 1/80
GFc-C35 GPDGTYTN-GNLVWCTFH SEQ ID NO：4 2/80
GFc-C65 KPRCSYLR-CQLVWCLHS SEQ ID NO：5 2/80
***C*****G*LVWC***
其中，肽的氨基酸的编号是基于X3CX9CX3的肽文库的长度从N末端起编号为1-17。
对结合活性较强的GFc-C35进行肽合成，进行利用表面等离子共振(SPR)分析的亲和性评价，结果可知，Kd值为14μM，亲和性较低，对于用作亲和性配体，需要增强亲和性。
因此，首先以2个Cys所夹持的区域为对象，固定GFc-C35中完全保守的Gly9、Leu11、Val12及Trp13、以及Thr15，通过用NNK混合核苷酸使其它的部位随机化构建文库(文库A：Lib-A，图2(A))，由通过生物淘选得到的肽的序列评价优先结合的氨基酸的特性(其中，从文库中得到的肽的氨基酸序列的1位几乎未发现共同的特征，因此，从该文库中除去)。使用该文库A进行对于人抗体的生物淘选后，将得到的噬菌体的肽的序列和各氨基酸部位所发现的氨基酸示于图2(B)。5位中仅发现侧链较小的Thr、Ser、Ala，另外，6位中Trp最多，此外，被具有芳香环的侧链的Tyr、Phe所占。7位中His最多，发现一部分Ser和Trp。另外，8位中发现大量Arg、Leu、Met。进而，10位被亲水性的氨基酸所占，其中，Arg最多(图2)。
由以上的结果明确了将Gly9、Leu11、Val12、Trp13及Thr15固定化时IgG结合中重要的各部位的侧链的特征，但为了进行保守残基的重要性的确认和具有更强的结合力的肽的筛选，再次设计文库B:Lib-B。
即，如图3所示，在保持Lib-A中得到的克隆的肽序列的特性的同时，通过经由导入具有类似的侧链的氨基酸也对表1中完全保守的氨基酸(Leu11、Val12、Trp13及Thr15)引入突变，进行文库构建。其中，认为Gly9对肽的立体结构的维持很重要，因此进行固定，另外，将2个Cys更外侧的氨基酸残基从文库构建中除去，仅附加原本的GFc-C35的肽的序列(Asp3和Thr15)。使用构建的文库，在严格的清洗条件下进行生物淘选，通过ELISA的筛选分析显示较强的结合活性的克隆的肽序列。
将得到的序列示于表2。
[表2]
39
1-T3331 DC SYRF CELVW CT SEQ ID NO：6
2-T3338 DC SYHF GELVW CT SEQ ID NO：7
3-T33313 DC AFHL GHLVW CT SEQ ID NO：8
4-T33314 DC AFHR CDLVW CT SEQ ID NO：9
5-T33315 DC AFHF GDLVW CT SEQ ID NO：10
6-T33320 DC TYHF GKLVW CT SEQ ID NO：11
1-T33324 DC AFHL CELVR CT SEQ ID NO：12
8-T333317 DC TWKF GDLIW CT SEQ ID NO：13
9-T33339 DC AYHL GQLVR CT SEQ ID NO：14
10-T33341 DC SFHL GDLVW CT SEQ ID NO：15
11-T32213 DCSYHL GDYVW CT SEQ ID NO：16
12-T32222 DC SWHM GQLIW CT SEQ ID NO：17
AYHF DLVW
SF L E
TW
结果：关于5位，Ala最多，但与Ser及Thr相比未发现显著的优先性。关于6位，Tyr和Phe优先，代替了Lib-A中显著的Trp。关于7位，尽管在文库中导入了各种氨基酸，但His压倒性地多。对8位而言，代替Lib-A中的Arg和Leu，Phe和Leu占有大量。在10位中，酸性的氨基酸Asp和Glu占有大量，但也发现少数具有正电荷的Lys、His及Gln。另一方面，如由最初分离的克隆的序列所预料那样，Leu11、Val12、Trp13是大致保守的，但极微少地发现在11位置换为Tyr、在12位置换为Ile、在13位置换为Arg。
认为这些以高频率出现的氨基酸反映出各氨基酸的侧链对IgG结合的贡献。在从原本的文库(库O：Lib-O)、文库A,B(Lib-A,B)中得到的克隆的肽序列中，将在每个位点以高频率发现的氨基酸汇总并示于表3。
[表3]
在通过淘选从各文库中得到的噬菌体的肽序列中以高频率出现的氨基酸
5 6 7 8 9 10 11 12 13 15 16
Lib0 Y R G L V W T H
Lib A SAT WFY HSW RLM - REN - - - -
Lib B AST YEW H FL - DE L V W -
Lib C SA WFY H L(R) - Q ML V(I) W TS
表中，-表示固定化的氨基酸，分别表示Gly9，Leu11，Va112，Trp13，Thr15。
基于该信息，进一步在两侧的Cys的外侧添加序列，构建随机化的文库(Lib-C，图4)。在该文库中，Cys内部的序列含有Lib-A、B中以高频率出现的氨基酸，而以含有利用NNK的混合核苷酸的完全的无规序列或者与Lib-O或Lib-A中发现的类似的氨基酸类似的氨基酸的方式对Cys的两外侧的残基进行随机化。关于文库的构成，原本应该在6位放入Thr，但若在核苷酸混合中放入Thr，则氨基酸数变得非常多，因此，放入疏水和/或芳香族氨基酸代替Thr。另外，原本应该在7位放入Ser、Arg、Trp等，但His压倒性地多，由此加入His，作为其对照加入Tyr、Gln。
使用该文库，通过淘选，再次选出结合性高的克隆，将分析序列的结果示于表4。
[表4]
GFc-C35 GPDC TYTNC NlVWC TFH SEQ ID NO：4
T6-1 RGC SYHLG QLVWC TAV SEQ ID NO：18
T6-2 VKC SWHLG QMVWC TSN SEQ ID NO：19
T6-7 ANC SWHLG DMVWC STI SEQ ID NO：20
T6-15 VKC SWHLG QMVWC SNS SEQ ID NO：21
T6-16 VKC SWHLG QMVWC SNS SEQ ID NO：22
T6-20 LNC AFHRC RLVWC TDL SEQ ID NO：23
T6-26 SKC SFHLG QLIWC S SEQ ID NO：24
T6-33 TRC SYHLG EMVWC APS SEQ ID NO：25
T6-41 LNC AFHRG RLVWC TDL SEQ ID NO：26
T6-43 VGC AWLG NMVWC TSF SEQ ID NO：27
K SW L QM T
AY R L S
F
结果：在N末侧Cys的外侧的2、3位中未发现特征性的氨基酸的出现，但在C末侧Cys的外侧的15位发现Thr或Ser多次出现。但是，在16、17位未看到特征性的氨基酸。关于内部序列，大致得到不与由Lib-O,A,B获得的序列的结果(表3)矛盾的序列。
接着，使用合成肽对在认为有助于增强结合的各位点以较高的频率发现的氨基酸的导入效果进行评价、验证。
为了缩小用于验证的氨基酸的区域，合成从GFc-C35的序列中的两端各删去1个(GFc-C35-2/16)或2个的肽(GFc-C35-3/15)。其中，以GFc-C35-3/15的合成肽为基准，评价对氨基酸突变导入引起的亲和性的影响。即，合成置换为从噬菌体文库中得到的以高频率或者一部分中观察到的氨基酸的肽，进行其结合分析，由此评价各氨基酸置换对亲和性的贡献。将结果示于表5。
[表5]
合成肤中的氨基酸置换引起的亲和性评价的研究
肽 序列 Kd(μM)
GFc-C35 GPDCTYTNGNLVWCTFH SEQ ID NO：4 14
GFc-C35-2/16 PDCTYTNGNLVWCTF SEQ ID NO：28 25
GFc-C35-3/15 DCTYTNGNLVWCT SEQ ID NO：29 130
GFc-C35-3/15(D3R) RCTYTNGNLVWCT SEQ ID NO：30 69
GFc-C35-3/15(T5A) DCAYTNGNLVWCT SEQ ID NO：31 61
GFc-C35-3/15(T5S) DCSYTNGNLVWCT SEQ ID NO：32 120
GFc-C35-3/15(Y6F) DCTFTNGNLVWCT SEQ ID NO：33 2100
GFc-C35-3/15(Y6W) DCTWTNGNLVWCT SEQ ID NO：34 50
GFc-C35-3/15(T7H) DCTYHNGNLVWCT SEQ ID NO：35 3
GFc-C35-3/15(T7R) DCTYRNGNLVWCT SEQ ID NO：36 83
GFc-C35-3/15(T7S) DCTYSNGNLVWCT SEQ ID NO：37 26
GFc-C35-3/15(N8L) DCTYTLGNLVWCT SEQ ID NO：38 260
CFc-C35-3/15(N8R) DCTYTRGNLVWCT SEQ ID NO：39 8
GFc-C35-3/15(N10E) DCTYTNGELVWCT SEQ ID NO：40 26
GFc-C35-3/15(N10R) DCTYTNGRLVWCT SEQ ID NO：41 42
GFc-C35-3/15(N10D) DCTYTNGDLVIYCT SEQ ID NO：42 80
GFc-C35-3/15(N10Q) DCTYTNGQLWVCT SEQ ID NO：43 160
GFc-C35-3/15(L11M) DCTYTNGNMWCT SEQ ID NO：44 280
GFc-C35-3/15(Vl2I) DCTYTNGNLIWCT SEQ ID NO：45 12
CFc-C35-3/15(T15S) DCTYTNGNLVWCS SEQ ID NO：46 34
进行从两端各删去1个(GFc-C35-2/16)或2个的肽(GFc-C35-3/15)的亲和性分析，结果，各自的Kd值与GFc-C35的14μM相比为25μM及130μM，增大，亲和性降低。由该结果明确两端的残基(1、2、16、17位)有助于结合。
关于Asp3，发现Arg在Lib-0及Lib-C中是共同的(表1及4)。比较置换的肽(GFc-C35-3/15(D3R))和原本的肽(GFc-C35-3/15)的亲和性，结果，发现亲和性的上升。
关于Thr5，在Lib-A中几乎仅发现Ala、Thr、Ser，另外，在之后的Lib-B,C中，未发现在3个氨基酸中的优先性(表3)。比较置换的2种肽(GFc-C35-3/15(T5A)、GFc-C35-3/15(T5S))和原本的肽(GFc-C35-3/15)的亲和性，结果由Ala置换的肽显示最高的亲和性。
关于Tyr6，从Lib-A,B中大致均等地发现Trp、Tyr、Phe，但是，制作导入了各自的置换体并进行评价，结果，发现GFc-C35-3/15(Y6F)的亲和性大幅降低，在置换为Trp时(GFc-C35-3/15(Y6W))，发现亲和性的上升。
关于Thr7，制作分别导入了从Lib-A中得到的His、Ser的置换体并进行评价。在任一情况下，亲和性均大幅提高，但特别是置换为His使亲和性显著增加(约50倍)。
关于Asn8，进行用Lib-O及Lib-A、B中大量发现的Leu和Arg的置换。在置换为Arg时(GFc-C35-3/15(N8R))，发现约18倍的Kd值的降低，亲和性大幅增大。另一方面，置换为Leu(GFc-C35-3/15(N8L))大幅降低亲和性。
关于Asn10，从Lib-A中发现大量电荷正相反的Arg和Glu。在导入了该氨基酸的肽(GFc-C35-3/15(N10R)及GFc-C35-3/15(N10E))中，亲和性均比原本的肽(GFc-C35-3/15)提高。该结果显示带电的残基可增加结合活性。该结果也在由不具有电荷的Gln置换Asn10时(GFc-C35-3/15(N10Q))，与原本的肽具有大致同等的亲和性且没有亲和性的增强的效果支持。另一方面，在用Asp置换Asn10的情况下(GFc-C35-3/15(N10D))，也确认到若干亲和性的提高，但在用具有较长的侧链的Glu置换的肽(GFc-C35-3/15(N10E))的情况下，亲和性未提高。因此，显示为了提高亲和性，导入的氨基酸残基具有某种程度长度的侧链。
关于Leu11，在Lib-O及Lib-B中，11位的位点的Leu压倒性地多，看作对结合重要的残基，但在Lib-C中，也发现Met的出现。因此，用Met置换Leu11(GFc-C35-3/15(L11M))时，发现亲和性的降低(以Kd值计约2倍)。
关于Val12，置换为Lib-C中发现的Ile时，与原本的肽相比，Kd值为1/10左右，亲和性提高。
关于Thr15，置换为Lib-C中以高频率出现的Ser时，与原本的肽相比，发现亲和性的上升(以Kd值计约1/4左右)。
基于上述的研究，合成组合预测有助于亲和性的提高的氨基酸置换而成的肽(表6)。
[表6]
氨基酸置换的组合引起的呢G结合肤的亲和性的提高
肽 序列 Kd(μM)
CFc-C35-3/15(T7H，N8R) DCTYHRGNLVWCT SEQ ID NO：47 1.1
GFc-C35-3/15(T7h，N8R，T5A) DCAYHRGNLVWCT SEQ ID NO：48 0.25
GFc-C35-3/15(T7H，N8R，Y6W) DCTWHRGNLVWCT SEQ ID NO：49 2.0
CFc-C35-3/15(T7H，N8R,N10E) DCTYHRGELVWCT SEQ ID NO：50 0.27
GFc-C35-3/15(T7H，U8R，V12I) DCTYHRGNLIWCT SEQ ID NO:51 4.8
GFc-C35-3/15(T5A，T7H，N8R，N10E） DCAYHRGELVWCT SEQ ID NO：52 0.054
CFc-C35-3/15(T5A，Y6W，T7H，N8R，N10E) DCAWHRGELVWCT SEQ ID NO：53 0.26
GFc-C35-3/15(D3R，T5A，T7H，N8R，N10E，T15S) RCAYHRGELVWCS SEQ ID NO：54 0.0147
首先，导入效果最大的Thr7His和Asn8Arg的置换(GFc-C35-3/15(T7H,N8R))时，Kd值降低为1.1μM，发现亲和性增强的效果。
进而，在该肽(GFc-C35-3/15(T7H、N8R))中导入表5中有效的T5A、Y6W、N10E、V12I各1个时，在导入了T5A或N10E的肽(GFc-C35-3/15(T7H、N8R、T5A)或GFc-C35-3/15(T7H、N8R、N10E))中，未发现亲和性增强的效果，但在导入了Y6W或V12I的肽(GFc-C35-3/15(T7H、N8R、Y6W)或GFc-C35-3/15(T7H、N8R、V12I))中，亲和性降低。这显示即使积累各个优势变化，由于相互的效果的补偿及干涉作用，可加性未必成立。
接着，进行亲和性增强效果大的肽GFc-C35-3/15(T5A、T7H、N8R、N10E)及GFc-C35-3/15(T5A、Y6W、T7H、N8R、N10E)的表面等离子共振(SPR)分析。
将结果示于图5。
根据传感图的分析，GFc-C35-3/15(T5A、T7H、N8R、N10E)的亲和性(Kd值)为54nM，与原本的GFc-C35-3/15肽相比，Kd值为约24分之1。另外，结合速率常数为ka=4.6×105M-1S-1，极快，另外，解离速率常数为kd=2.5×10-2S-1。
GFc-C35-3/15(T5A、Y6W、T7H、N8R、N10E)的亲和性(Kd值)为257nM，与原本的GFc-C35-3/15肽相比，上升。解离反应速率常数kd值为1.4×10-2S-1，降低至GFc-C35-3/15(T5A、T7H、N8R、N10E)的一半，有助于亲和性的增加，另一方面，结合速率常数ka为5.4×104M-1S-1(8分之1以下)，大幅降低，因此，GFc-C35-3/15(T5A、Y6W、T7H、N8R、N10E)整体亲和性降低。如上所述，显示Y6W的置换为大幅影响ka值和kd值两者的氨基酸置换。
GFc-C35-3/15(D3R、T5A、T7H、N8R、N10E、T15S)的亲和性为147nM，与原本的GFc-C35-3/15肽相比，上升。然而，若与GFc-C35-3/15(T5A、T7H、N8R、N10E)相比，则亲和性降低。
通过上述研究，得到具有原本的肽的GFc-C35-3/15约2400倍的亲和性的GFc-C35-3/15(T5A、T7H、N8R、N10E)。以下将该显示最高的亲和性的肽称为C35A-3/15。
由表5的结果，GFc-C35的序列中的从两端各删去1个(GFc-C35-2/15)或2个的肽(GFc-C35-3/15)的Kd值与GFc-C35相比，其亲和性降低，说明两端的残基(1、2、16、17位)有助于结合。因此，评价两端的2个残基对亲和性的贡献。对于显示最高的亲和性的C35A-3/15，合成在1位加入Gly、在2位加入Pro、在16位加入Phe、在17位加入His的肽(C35A)，进行亲和性分析。
为了确认这4个残基的氨基酸添加所致的效果，合成对C35A-3/15(D3R、T15S)也在1位加入Gly、在2位加入Pro、在16位加入Phe、在17位加入His的肽(C35A(D3R、T15S))，进行亲和性分析。另外，C35A-3/15(D3R、T15S)为与表6中的GFc-C35-3/15(D3R、T5A、T7H、N8R、N10E、T15S)同样的序列。
将结果示于表7。
[表7]
肽 序列 Kd(μM)
C35A-3/15 DCAYHRGELVWCT SEQ ID NO：55 0.054
C35A GPDCAYHRGELVWCTFH SEQ ID NO：56 0.009
C35A-3/15(D3R，T15S) RCAYHRGELVWCS SEQ ID NO；57 0.147
C35A(D3R，T15S) GPRCAYHRGELVWCSFH SEQ ID NO：58 0.042
在C35A-3/15的序列的两端导入了Gly、Pro、Phe、His的肽(C35A)中，与原本的序列相比，发现亲和性的提高(Kd值约5分之1)。另外，即使在C35A-3/15(D3R、T15S)的序列的两端导入了同样的氨基酸的肽(C35A(D3R、T15S))中，与原本的序列相比，亲和性也提高(以Kd值计约3分之1)。
显示在2种肽中，通过两端的2个残基(1、2、16、17位)的导入确认到亲和性的提高，因此，Cys残基的外部序列也有助于对于人IgG的亲和性。即，显示通过Cys残基的外部序列的优化，可得到具有更高的亲和性的序列。因此，构建将2个Cys残基间的内侧的序列固定且通过XYZ的混合核苷酸对Cys残基外侧的氨基酸进行随机化的文库(Lib-D，图6)，由通过生物淘选得到的肽的序列评价优先结合的氨基酸的特性。
即，将5×1011pfu的T7噬菌体文库(X3CAYHRGELVWCX3)溶液加入到涂布了RNA酶(源自牛胰腺的RNA酶，SIGMA)(4μg/400μl/孔)并用0.5%BSA封闭的96孔微板(Nunc,Maxisorp)的孔中，使其反应1小时(吸附步骤1)。接着，将其上清液加入到涂布了HSA(人血清白蛋白，SIGMA)(4μg/400μl/孔)并用0.5%BSA封闭的96孔微板(Nunc,Maxisorp)的孔中，使其反应1小时(吸附步骤2)。然后，将其上清液转移至涂布了人IgG1(单克隆，中外制药株式会社)(1μg/200μl/孔)且用0.5%BSA封闭的孔中，进行反应1小时(结合步骤)。除去上清液的噬菌体溶液后，用含有0.1%吐温的PBS将孔清洗3次(清洗步骤)。加入大肠杆菌BLT5403(Novagen)的培养液(200μl)使其感染，与10ml的大肠杆菌培养液一同在37℃下培养，直至增殖、溶菌(增殖步骤)。依据常规方法通过利用聚乙二醇的噬菌体沉淀法从溶菌后的培养液中回收噬菌体。使得到的噬菌体溶解于PBS中，用于以下的淘选。通过进行包含上述轮次的7轮淘选，浓缩IgG特异性的噬菌体。其中，在第2～7轮淘选中，逐步增加清洗次数最大进行30次。另外，在第6～7轮淘选中未进行吸附步骤。在第7次淘选后对噬菌体进行单克隆化，通过ELISA评价对于人IgG的结合特异性。对评价的噬菌体内对于人IgG显示高结合活性的克隆分析所展示的肽序列。将其结果示于表8。[表8]
克隆名 序列
1-14 NDTCAYHRGELVECTYS SEQ ID NO：59
1-15 SDSCAYHRGELVWCDGY SEQ ID NO：60
1-16 VDSCAYHRGELVWCSNY SEQ ID NO：61
1-23 SAECAYHRGELVWCSVF SEQ ID NO：62
1-27 FNDCAYHRGELVWCSGY SEQ ID NO：63
1-36 HETCAYHRGELVWCDHH SEQ ID NO：64
1-38 SYECAYHRGELVWCSTY SEQ ID NO：65
1-55 SGNCAYHRCELVWCNFL SEQ ID NO：66
2-1 SGDCAYHRGELVWCSYH SEQ ID NO：67
2-17 LSSCAYHRGELVWCSHF SEQ ID NO:68
2-18 FSDCAYHRGELVWCGHF SEQ ID NO：69
2-25 GDPCAYHRGELVWCSNF SEQ ID NO：7
2-33 DVYCAYHRGELVWCNGD SEQ ID NO：71
2-36 GHSCAYHRGELVWCSHM SEQ ID NO：72
2-38 RGQCAYHRGELVWCSHY SEQ ID NO：73
2-71 EFNCAYHRGELVWCTDY SEQ ID NO：74
2-72 GRSCAYHRGELVWCSTF SEQ ID NO：75
2-80 TARCAYHRGELVWCEDM SEQ ID NO：76
基于得到的肽序列，将各位点中发现的氨基酸的出现频率示于图7。
在N末侧的1位中，Ser占优势，原本的序列(C35A)的Gly的出现频率第二高。在2位中，Asp、Gly优势出现。在3位中，Ser残基的出现为优势的，原本的序列中发现的Asp的出现频率第二高。在C末侧的15位中，Ser的出现频率显著提高。在16位中，His、Gly的出现频率提高。在17位中，Tyr优势出现，具有芳香环的Tyr、Phe的出现为优势的。这些结果显示通过在2个Cys残基的外部序列导入这些氨基酸，可设计对于人IgG具有更高的亲和性的肽。
基于上述的研究，使用合成肽对各位点中以高频率发现的氨基酸的导入的效果进行评价、验证。
以C35A的合成肽为基准，通过氨基酸突变导入，合成置换为上述噬菌体文库中以高频率观察到的氨基酸的肽，与上述同样地通过表面等离子共振(SPR)分析进行对于人IgG的结合分析，评价各氨基酸置换对亲和性的贡献。将结果示于以下的表9。
[表9]
克隆名 序列 Kd(μM)
C35A(G1S) SPDCAYHRGELVWCTFH SEQ ID NO：100 0.0093
C35A(P2D) GDDCAYHRCELVWCTFH SEQ ID NO：101 0.0133
C35A(D3S) GPSCAYHRGELVWCTFH SEQ ID NO：102 0.0285
C35A(T15S) GPDCAYHRGELVWCSFH SEQ ID NO：103 0.0144
C35A(F16H) GPDCAYHKGELVWCTHH SEQ ID NO：104 0.0114
C35A(H17Y) GPDCAYHRGELVWCTFY SEQ ID NO：105 0.012
C35A(C1S，H17Y) SPDCAYHKGELVWCTFY SEQ ID NO：106 0.011
C35A(P2D，H17Y) SDDCAYHRGELVWCTFY SEQ ID NO：107 0.013
为了确认得到的IgG结合性肽的有用性，使用固定了IgG结合性肽的柱进行IgG从人血清的纯化。固定了IgG结合性肽的柱通过以下的方法制作。
在用1mMHCl(5mL)平衡的HiTrapNHS-activatedHP柱(1ml,GEHealthcare)中加入溶解肽溶液(将4.0mg的N末端PEG化而成的C35A-3/15(NH2-PEG4-DCAYHRGELVWCT-NH2)4mg溶解于0.05M碳酸缓冲液(pH8.3)1.1mL中而成的溶液(浓度1.5mM))1mL，在室温下固定30分钟。然后，用1MTris(1mL)清洗，加入1MTris(2mL)，在室温下封闭30分钟。用PBS(6mL)清洗3次，接着用PBS(1mL)清洗1次。通过上述操作制作固定化量1.2μmol的肽固定柱。
在Profinia蛋白纯化系统(BIORAD)中使用得到的肽固定柱(1.2μmol)，将人血清(1mL)稀释5倍，将得到的PBS溶液(5mL)应用于肽固定柱。用PBS清洗柱后，用0.1M甘氨酸盐酸(pH2.5)进行逐步洗脱。蛋白从柱的洗脱用280nm的吸光度追踪。
将结果示于图8。
由洗脱级分的溶液(级分D，5mL)的吸光度的测定结果确认了蛋白的回收量为10.4mg。
关于图8所示的洗脱级分，依据现有公知的方法在SDS-PAGE(还原处理)中进行IgG的确认。即，利用2-巯基乙醇对洗脱级分D进行还原处理后，在4～20%聚丙烯酰胺梯度凝胶(Mini-PROTEANTGX凝胶；BioRad)上进行电泳，用GelcodeBlueRegent使其染色。结果，确认到显示IgG的轻链(L链)及重链(H链)的25kDa附近及50kDa附近的清晰的条带(图9的带5)。其中，泳道1、2、3、4表示分子量标记物、人IgG制品、HAS、人血清的样品。
由此明确，固定化了IgG结合性肽的柱可用作人IgG纯化用的亲和柱。
工业上的可利用性
本发明提供一种可与人IgG特异性或选择性地结合的肽，由此，在工业上可以用于作为抗体药物的IgG的制造中的IgG的纯化以及IgG的分析。
本说明书中引用的全部出版物、专利及专利申请作为参考全部引入本说明书中。

Claims (11)

1.一种肽，其特征在于，由下述的式I所示的由13至17个氨基酸残基构成的氨基酸序列构成，且所述肽能够与人IgG结合：
X1-X2-X3-C-A-Y-H-R-G-E-L-V-W-C-X15-X16-X17(I)
其中，X各自独立地为半胱氨酸以外的任意氨基酸残基，
C为半胱氨酸残基，
A为丙氨酸残基，
Y为酪氨酸残基，
H为组氨酸残基，
R为精氨酸残基，
G为甘氨酸残基，
E为谷氨酸残基，
L为亮氨酸残基，
V为缬氨酸残基，且
W为色氨酸残基
其中：
X1＝S、G、F或不存在，
X2＝D、G、A、S、P或不存在，
X3＝S、D、T、N、E或R，
X15＝S、T或D，
X16＝H、G、Y、T、N、D、F或不存在，且
X17＝Y、F、H、M或不存在。
2.如权利要求1所述的肽，所述肽由以下1)至12)中的任一氨基酸序列构成：
1)DCAYHRGELVWCT(SEQIDNO：55)
2)GPDCAYHRGELVWCTFH(SEQIDNO：56)
3)RCAYHRGELVWCS(SEQIDNO：57)
4)GPRCAYHRGELVWCSFH(SEQIDNO：58)
5)SPDCAYHRGELVWCTFH(SEQIDNO：100)
6)GDDCAYHRGELVWCTFH(SEQIDNO：101)
7)GPSCAYHRGELVWCTFH(SEQIDNO：102)
8)GPDCAYHRGELVWCSFH(SEQIDNO：103)
9)GPDCAYHRGELVWCTHH(SEQIDNO：104)
10)GPDCAYHRGELVWCTFY(SEQIDNO：105)
11)SPDCAYHRGELVWCTFY(SEQIDNO：106)，和
12)SDDCAYHRGELVWCTFY(SEQIDNO：107)。
3.如权利要求1所述的肽，其中，所述肽在2个半胱氨酸(C)残基间形成二硫键。
4.如权利要求1所述的肽，其中，所述肽与标记连接。
5.一种融合蛋白，由权利要求1至4中任一项所述的肽和与所述肽连接的蛋白构成。
6.一种固定化肽，其中所述固定化肽由权利要求1至4中任一项所述的肽与固相结合而成。
7.一种核酸，编码权利要求1至4中任一项所述的肽。
8.一种IgG的纯化方法，所述纯化方法包括使权利要求1至4中任一项所述的肽或由权利要求1至4中任一项所述的肽与固相结合而成的固定化肽与IgG结合、以及通过使结合的IgG释放而回收IgG。
9.一种IgG的检测方法，所述检测方法包括使样品中的IgG与权利要求1至4中任一项所述的肽或由权利要求1至4中任一项所述的肽与固相结合而成的固定化肽结合并检测结合的IgG，所述方法用于非诊断目的。
10.一种用于人IgG的分析或纯化的试剂盒，所述试剂盒含有权利要求1至4中任一项所述的肽或由权利要求1至4中任一项所述的肽与固相结合而成的固定化肽中的至少1种。
11.一种IgG分离用柱，含有权利要求6所述的固定化肽。
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