KR102468989B1 - IgG 결합 펩타이드를 포함하는 고상 담체 및 IgG의 분리 방법 - Google Patents

IgG 결합 펩타이드를 포함하는 고상 담체 및 IgG의 분리 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 IgG 정제를 위해 이용할 수 있고, 또한 안정성, 예를 들어 알칼리 안정성이 우수한 IgG 결합 펩타이드를 제공하는 것 등을 과제로 한다. 또한, 본 발명은 상기 IgG 결합 펩타이드를 이용하여 IgG를 정제하는 방법 등을 제공하는 것을 과제로 한다. 구체적으로는, 본 발명은 IgG 결합 펩타이드를 포함하는 고상 담체, 당해 고상 담체를 포함하는 IgG 분리용 컬럼, 당해 고상 담체 또는 컬럼을 포함하는 키트, 및 당해 고상 담체 또는 컬럼을 이용하는 IgG의 정제 방법 등에 관한 것이다.

Description

IgG 결합 펩타이드를 포함하는 고상 담체 및 IgG의 분리 방법
본 발명은 IgG 결합 펩타이드를 포함하는 고상 담체, 당해 고상 담체를 포함하는 IgG 분리용 컬럼, 당해 고상 담체 또는 컬럼을 포함하는 키트, 및 당해 고상 담체 또는 컬럼을 이용하는 IgG의 정제 방법 등에 관한 것이다.
IgG 항체는 현재 가장 주목받고 있는 바이오 의약품의 하나이다. 최근 IgG 항체를 중심으로 한 항체 의약이 의약 분야에 이용되도록 되어, 공업적, 제약적(製藥的)인 이용에서의 중요성이 점차 높아지고 있다. 항체의 정제에는 프로테인 A 컬럼이 중심적인 역할을 담당하고 있으며, 많은 항체 의약의 제조 메이커는 이 컬럼을 중심으로 한 정제 시스템을 도입하고 있다.
그러나 이 프로테인 A 컬럼은 몇 가지 문제점이 지적되고 있다. 하나로는 정제 항체 속으로의 프로테인 A의 혼입 문제이다. 프로테인 A는 박테리아 유래의 단백질이며, 인체 투여 후의 면역원성(免疫原性, immunogenecity)이 높고, 또한 엔도톡신의 혼입이 우려된다. IgG와 같은 의약품의 정제에 이용하는 친화성 리간드(affinity ligand)로서는, 적합하지 않은 물질의 혼입이 발생하지 않도록 리간드로서의 프로테인 A에는 높은 정제도가 요구되고 있으며, 이것이 의약품 정제에 이용하는 프로테인 A 컬럼의 비용을 상승시키는 요인이 되고 있다. 이 때문에, 프로테인 A를 대체할 새로운 친화성 컬럼의 개발이 기대되고 있다.
본 발명자들은 지금까지 디설파이드 결합으로 환화(環化)된 특정 서열을 포함하는 펩타이드 리간드에 의해 IgG를 정제할 수 있다는 것을 보고하고 있지만(특허문헌 1), 본 펩타이드 리간드는 알칼리 용액 세정의 반복에 의해 친화성이 저하한다는 문제를 안고 있었다.
특허문헌 1: WO2013/027796
본 발명은 IgG 정제를 위해 이용할 수 있고, 또한 안정성, 예를 들어 알칼리 안정성이 우수한 IgG 결합 펩타이드를 제공하는 것 등을 과제로 한다. 또한, 본 발명은 상기 IgG 결합 펩타이드를 이용하여 IgG를 정제하는 방법 등을 제공하는 것을 과제로 한다.
본 발명자는 펩타이드 중의 시스테인 잔기에서의 설파이드기를, 특정 구조를 갖는 링커에 의해 가교함으로써, 펩타이드의 안정성이 현저하게 개선되는 것을 찾아내어 본원 발명을 완성시켰다.
따라서 본 발명은 이하의 태양을 포함한다.
(1) 인간 IgG와 결합 가능한 것을 특징으로 하는 펩타이드를 고정화한 고상 담체로서,
상기 펩타이드가 하기 식 I:
(X1-3)-C-(X2)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-(X1-3) (I)
(식 중, X의 각각은 독립적으로 시스테인 이외의 임의의 아미노산 잔기이고,
C는 시스테인 잔기이고,
H는 히스티딘 잔기이고,
Xaa1은 아르기닌 잔기, 라이신 잔기, 류신 잔기 또는 아스파라긴 잔기, 또는 그들의 유도체이고,
G는 글리신 잔기이고,
Xaa2는 글루탐산 잔기 또는 아스파라긴 잔기이고,
L은 류신 잔기이고,
V는 발린 잔기이고, 또한
W는 트립토판 잔기이다.)
에 의해 표시되는, 13∼17 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 상기 펩타이드의 외측의 2개의 시스테인 잔기 중의 설파이드기가 이하의 식:
Figure 112019049486713-pct00001
로 표시되는 링커로 이루어지는 군으로부터 선택되는 링커에 의해 연결되어 있으며, 여기서 R은 치환된 또는 치환되지 않은 C1~C6 알킬인, 고상 담체.
(2) 상기 펩타이드가 하기 식 II:
(X1-3)-C-(Xaa3)-(Xaa4)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-(X1-3) (II)
(식 중, X의 각각은 독립적으로 시스테인 이외의 임의의 아미노산 잔기이고,
C는 시스테인 잔기이고,
H는 히스티딘 잔기이고,
Xaa1은 아르기닌 잔기, 라이신 잔기, 류신 잔기 또는 아스파라긴 잔기, 또는 그들의 유도체이고,
G는 글리신 잔기이고,
Xaa2는 글루탐산 잔기 또는 아스파라긴 잔기이고,
L은 류신 잔기이고,
V는 발린 잔기이고,
W는 트립토판 잔기이고,
Xaa3은 알라닌 잔기, 세린 잔기 또는 트레오닌 잔기이고, 또한
Xaa4는 티로신 잔기 또는 트립토판 잔기이다.)
에 의해 표시되는, 13~17 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열을 포함하는, (1)에 기재한 고상 담체.
(3) 상기 펩타이드가 하기 식 III:
(X1-3)-C-A-Y-H-(Xaa1)-G-E-L-V-W-C-(X1-3) (III)
(식 중, X의 각각은 독립적으로 시스테인 이외의 임의의 아미노산 잔기이고,
C는 시스테인 잔기이고,
A는 알라닌 잔기이고,
Y는 티로신 잔기이고,
H는 히스티딘 잔기이고,
Xaa1은 아르기닌 잔기, 라이신 잔기, 류신 잔기 또는 아스파라긴 잔기, 또는 그들의 유도체이고,
G는 글리신 잔기이고,
E는 글루탐산 잔기이고,
L은 류신 잔기이고,
V는 발린 잔기이고, 또한
W는 트립토판 잔기이다.)
에 의해 표시되는, 13~17 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열을 포함하는, (1) 또는 (2)에 기재한 고상 담체.
(4) 17 아미노산 잔기로 한 경우의, 상기 펩타이드의 N 말단으로부터 1~3, 15~17번째의 각 아미노산 잔기가
1번째 아미노산 잔기=S, G, F 또는 없음,
2번째 아미노산 잔기=D, G, A, S, P, 호모시스테인 또는 없음,
3번째 아미노산 잔기=S, D, T, N, E 또는 R,
15번째 아미노산 잔기=S, T 또는 D,
16번째 아미노산 잔기=H, G, Y, T, N, D, F, 호모시스테인 또는 없음,
17번째 아미노산 잔기=Y, F, H, M 또는 없음
인, (1)~(3) 중 어느 하나에 기재한 고상 담체.
(5) 상기 펩타이드가 이하의 1)~14) 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어지는, 단 Xaa1은 아르기닌 잔기, 라이신 잔기, 류신 잔기 또는 아스파라긴 잔기, 또는 그들의 유도체이고, Xaa2는 호모시스테인인, (4)에 기재한 고상 담체:
1) DCAYH(Xaa1)GELVWCT(서열 번호 1)
2) GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(서열 번호 2)
3) RCAYH(Xaa1)GELVWCS(서열 번호 3)
4) GPRCAYH(Xaa1)GELVWCSFH(서열 번호 4)
5) SPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(서열 번호 5)
6) GDDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(서열 번호 6)
7) GPSCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(서열 번호 7)
8) GPDCAYH(Xaa1)GELVWCSFH(서열 번호 8)
9) GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTHH(서열 번호 9)
10) GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY(서열 번호 10)
11) SPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY(서열 번호 11)
12) SDDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY(서열 번호 12)
13) RGNCAYH(Xaa1)GQLVWCTYH(서열 번호 13)
14) G(Xaa2)DCAYH(Xaa1)GELVWCT(Xaa2)H(서열 번호 14).
(6) 상기 펩타이드가 하기 식 IV:
D-C-(Xaa3)-(Xaa4)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-T (IV)
(식 중,
D는 아스파라긴산 잔기이고,
C는 시스테인 잔기이고,
H는 히스티딘 잔기이고,
Xaa1은 아르기닌 잔기, 라이신 잔기, 류신 잔기 또는 아스파라긴 잔기, 또는 그들의 유도체이고,
G는 글리신 잔기이고,
Xaa2는 글루탐산 잔기 또는 아스파라긴 잔기이고,
L은 류신 잔기이고,
V는 발린 잔기이고,
W는 트립토판 잔기이고,
T는 트레오닌 잔기이고,
Xaa3은 알라닌 잔기 또는 트레오닌 잔기이고, 또한
Xaa4는 티로신 잔기 또는 트립토판 잔기이다.)에 의해 표시되는, 13 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열을 포함하는, (1) 또는 (2)에 기재한 고상 담체.
(7) 상기 펩타이드가 이하의 1)~4) 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어지는, 단 Xaa1은 아르기닌 잔기, 라이신 잔기, 류신 잔기 또는 아스파라긴 잔기, 또는 그들의 유도체인, (6)에 기재한 고상 담체:
1) DCTYH(Xaa1)GNLVWCT(서열 번호 15)
2) DCAYH(Xaa1)GNLVWCT(서열 번호 16)
3) DCTYH(Xaa1)GELVWCT(서열 번호 17)
4) DCAWH(Xaa1)GELVWCT(서열 번호 18).
(8) 인간 IgG와 결합 가능한 것을 특징으로 하는 펩타이드를 고정화한 고상 담체로서,
상기 펩타이드가 하기 식 V:
D-C-(Xaa2)-(Xaa3)-(Xaa4)-(Xaa1)-G-(Xaa5)-L-(Xaa6)-W-C-T (V)
(식 중,
D는 아스파라긴산 잔기이고,
C는 시스테인 잔기이고,
G는 글리신 잔기이고,
L은 류신 잔기이고,
W는 트립토판 잔기이고,
T는 트레오닌 잔기이고,
Xaa1은 아르기닌 잔기, 라이신 잔기, 류신 잔기 또는 아스파라긴 잔기, 또는 그들의 유도체이고,
Xaa2는 알라닌 잔기, 세린 잔기 또는 트레오닌 잔기이고,
Xaa3은 트립토판 잔기 또는 티로신 잔기이고,
Xaa4는 히스티딘 잔기, 아르기닌 잔기, 세린 잔기 또는 트레오닌 잔기이고,
Xaa5는 글루탐산 잔기, 아스파라긴 잔기, 아르기닌 잔기 또는 아스파라긴산 잔기이고, 또한
Xaa6은 이소류신 잔기 또는 발린 잔기이다)에 의해 표시되는, 13 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 상기 펩타이드의 외측의 2개의 시스테인 잔기 중의 설파이드기가 이하의 식:
Figure 112019049486713-pct00002
로 표시되는 링커로 이루어지는 군으로부터 선택되는 링커에 의해 연결되어 있으며, 여기서 R은 치환된 또는 치환되지 않은 C1~C6 알킬인, 고상 담체.
(9) Xaa1이 아르기닌 잔기, 라이신 잔기 또는 그의 아실화 유도체, 또는 류신 잔기인, (1)~(8) 중 어느 하나에 기재한 고상 담체.
(10) 상기 펩타이드가 이하의 아미노산 서열로 이루어지는, (1)에 기재한 고상 담체:
GPDCAYHRGELVWCTFH(서열 번호 31).
(11) 상기 링커가 이하의 식:
Figure 112019049486713-pct00003
로 표시되는 링커인, (1)~(10) 중 어느 하나에 기재한 고상 담체.
(12) 상기 펩타이드의 N 말단이 PEG화되어 있는, (1)~(11) 중 어느 하나에 기재한 고상 담체.
(13) 상기 펩타이드의 C 말단이 아미드화되어 있는, (1)~(12) 중 어느 하나에 기재한 고상 담체.
(14) 상기 펩타이드가 다량체화되어 있는, (1)~(13) 중 어느 하나에 기재한 고상 담체.
(15) 상기 펩타이드의 다량체가 당해 펩타이드 사이에 스페이서를 갖는, (14)에 기재한 고상 담체.
(16) 상기 펩타이드와 고상(固相) 사이에 스페이서를 갖는, (1)~(15) 중 어느 하나에 기재한 고상 담체.
(17) (1)~(16) 중 어느 하나에 기재한 고상 담체를 포함하는, IgG 분리용 컬럼.
(18) (1)~(16) 중 어느 하나에 기재한 고상 담체, 또는 (17)에 기재한 IgG 분리용 컬럼을 포함하는, IgG의 정제를 위한 키트.
(19) (1)~(16) 중 어느 하나에 기재한 고상 담체, 또는 (17)에 기재한 IgG 분리용 컬럼에 IgG를 결합시키는 공정, 및
결합한 IgG를 용출시켜 IgG를 회수하는 공정을 포함하는, IgG의 정제 방법.
본 명세서는 본원의 우선권의 기초가 되는 일본국 특허 출원 번호 2016-225483호의 개시 내용을 포함한다.
본 발명의 고상 담체에 포함되는 펩타이드는 시스테인 잔기에서의 설파이드기를, 특정 구조를 갖는 링커에 의해 가교함으로써, 안정성이 개선되고 있다. 따라서 본 발명의 고상 담체는 알칼리 세정 공정 등에 의해 IgG 결합능이 저감되기 어렵기 때문에, 효율적인 IgG 정제에 이용할 수 있다.
도 1은 실시예 3에서 제작한 펩타이드 고정화 컬럼에 인간 혈청 유래 γ-글로불린(와코(Wako))을 흡착시키고, 산성 용출 용액(20 mM 구연산, pH 2.5)을 이용하여 용출한 경우의 결과를 나타낸다. 횡축은 용출액의 체적을, 종축은 280 nm의 흡광도에 의해 측정되는 단백질 농도를 나타낸다.
도 2는 실시예 3에서 제작한 펩타이드 고정화 컬럼으로부터 구연산 또는 IgG 결합 펩타이드에 의해 단백질을 용출시키고, 0.5 mL 분획한 각 프랙션의 SDS-PAGE의 결과를 나타낸다. 단백질의 검출은 CBB 염색으로 수행했다.
도 3은 펩타이드 고정화 양이 상이한 3종(1 mg, 4 mg, 10 mg)의 컬럼을 흡착 용액으로 평형화한 후, 흡착 용액에 용해한 1 mg/mL 인간 혈청 유래 γ-글로불린을 1 mL/min(체류 시간 1 min)의 유속으로 송액(送液)했을 때의 DBC의 측정 결과를 나타낸다. DBC는, 280 nm 흡광도에 있어서, 비흡착 성분을 제외한 값이 샘플 전체의 흡광도의 10%에 도달할 때까지 송액된 샘플 양으로부터 구했다.
도 4는 실시예 2에서 조제한 링커에 의해 가교된 IgG 결합 펩타이드, 및 비교예 1에서 조제한 디설파이드에 의해 가교된 IgG 결합 펩타이드의 수산화나트륨 처리 시의 DBC의 측정 결과를 나타낸다.
<IgG 결합 펩타이드를 포함하는 고상 담체>
일 태양에 있어서, 본 발명은 IgG 결합 펩타이드를 포함하는 고상 담체에 관한 것이다. 본 명세서에서의 「고상 담체」로서는, 한정하는 것은 아니지만, 글라스 비즈, 실리카 겔 등의 무기 담체, 가교 폴리비닐 알코올, 가교 폴리아크릴레이트, 가교 폴리아크릴아미드, 가교 폴리스티렌 등의 합성 고분자나 결정성 셀룰로오스, 가교 셀룰로오스, 가교 아가로오스, 가교 덱스트란 등의 다당류로 이루어지는 유기 담체, 나아가서는 이들의 조합에 의해 얻어지는 유기-유기, 유기-무기 등의 복합 담체 등을 들 수 있지만, 그 중에서도 친수성 담체는 비특이 흡착이 비교적 적고, IgG 결합 펩타이드의 선택성이 양호하기 때문에 바람직하다. 여기서 말하는 친수성 담체란, 담체를 구성하는 화합물을 평판상으로 했을 때의 물과의 접촉각이 60도 이하인 담체를 나타낸다. 이러한 담체로서는 셀룰로오스, 키토산, 덱스트란 등의 다당류, 폴리비닐 알코올, 에틸렌-아세트산 비닐 공중합체 비누화물, 폴리아크릴아미드, 폴리아크릴산, 폴리메타크릴산, 폴리메타크릴산 메틸, 폴리아크릴산 그라프트화 폴리에틸렌, 폴리아크릴아미드 그라프트화 폴리에틸렌, 유리 등으로 이루어지는 담체를 대표 예로서 들 수 있다.
고상 담체의 형태로서는 비즈상, 선유상(線維狀, filamentous), 입자상, 막상(중공사(中空絲)도 포함한다), 겔상 등 모두 가능하며, 임의의 형태를 선택할 수 있다. 특정한 배제 한계 분자량을 갖는 담체 제작의 용이함에서 비즈상이 특히 바람직하게 이용된다. 비즈상의 평균 입경은 10~2500 μm인 것이 사용하기 쉬우며, 특히 IgG 결합 펩타이드 고정화 반응의 용이함의 점에서 25 μm 내지 800 μm의 범위가 바람직하다. 고상 담체로서는 구체적으로는, 예를 들어 자성 비즈, 글라스 비즈, 폴리스티렌 비즈, 실리카 겔 비즈 및 다당류 비즈 등을 들 수 있다.
게다가 고상 담체 표면에는, IgG 결합 펩타이드의 고정화 반응에 이용할 수 있는 관능기가 존재하고 있으면 IgG 결합 펩타이드의 고정화에 적합하다. 이들 관능기의 대표 예로서는 수산기, 아미노기, 알데히드기, 카복실기, 티올기, 실라놀기, 에폭시기, 석신이미드기, N-하이드록시석신이미드기 등, 산 무수물기, 요오도아세틸기 등을 들 수 있다.
고상 담체로서는 시판품을 이용할 수도 있다. 시판품으로서는 다공질 셀룰로오스 겔인 GCL2000, GC700, 알릴 덱스트란과 메틸렌비스아크릴아미드를 공유 결합으로 가교한 세파크릴(Sephacryl) S-1000, 아크릴레이트계 담체인 토요펄(Toyopearl), 아가로오스계 가교 담체인 세파로오스(Sepharose) CL4B, 에폭시기로 활성화된 폴리메타크릴아미드인 오이파깃트(Eupergit) C250L, NHS기로 활성화된 세파로오스 담체를 포함하는 NHS 활성화 프리팩 컬럼(prepack column) 등을 예시할 수 있다. 단, 본 실시 태양에 있어서는 이들 담체, 활성화 담체만으로 한정되는 것은 아니다.
상술한 고상 담체는 각각 단독으로 이용할 수도 있고, 임의의 2종류 이상을 혼합할 수도 있다. 또한, 고상 담체로서는 그 사용 목적 및 방법에서 보아, 표면적이 큰 것이 바람직하며, 적당한 크기의 세공을 다수 갖는, 즉 다공질인 것이 바람직하다.
상기 고상 담체에는, 본 명세서에 기재한 IgG 결합 펩타이드가 고정화되어 있는 것이 바람직하며, 펩타이드의 고정화는 당업자에게 주지의 방법을 이용하여 수행할 수 있으며, 예를 들어 물리적 흡착법, 공유 결합법, 이온 결합법 등에 의해 수행할 수 있다. 고정화는, 예를 들어 IgG 결합 펩타이드의 N 말단의 아미노기를 직접 또는 스페이서를 통해 고상 담체에 공유 결합시킴으로써 수행하는 것이 바람직하다. IgG 결합 펩타이드의 입체 장애를 작게 함으로써 분리 효율을 향상시키고, 또한 비특이적인 결합을 억제하기 위해 친수성 스페이서를 통해 고정화하는 것이 보다 바람직하다. 친수성 스페이서는 특별히 한정하지 않지만, 예를 들어 양 말단을 카복실기, 아미노기, 알데히드기, 에폭시기 등으로 치환한 폴리알킬렌 옥사이드의 유도체를 이용하는 것이 바람직하다.
상기 고상 담체에 도입되는 IgG 결합 펩타이드 및 스페이서로서 이용되는 유기 화합물의 고정화 방법 및 조건은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 일반적으로 단백질이나 펩타이드를 담체에 고정화하는 경우에 채용되는 방법을 예시한다. 예를 들어, 담체를 아미노기를 포함하는 화합물, N-하이드록시석신이미딜기를 포함하는 화합물, 브롬화 시안, 에피클로로하이드린, 디글리시딜 에테르, 토실 클로라이드, 트레실 클로라이드, 하이드라진 등과 반응시켜 활성화하여(담체가 원래 갖고 있는 관능기로부터 IgG 결합 펩타이드가 반응하기 쉬운 관능기로 바꾸어), IgG 결합 펩타이드와 반응, 고정화하는 방법, 또한 담체와 IgG 결합 펩타이드가 존재하는 계에 카보디이미드와 같은 축합 시약, 또는 글루타르알데히드처럼 분자 중에 복수의 관능기를 갖는 시약을 가하여 축합, 가교하는 것에 의한 고정화 방법을 들 수 있지만, 고상 담체의 멸균 시 또는 이용 시에 IgG 결합 펩타이드가 고상 담체로부터 용이하게 이탈하지 않는 고정화 방법을 적용하는 것이 보다 바람직하다.
본 명세서에 기재한 IgG 결합 펩타이드를 포함하는 고상 담체는 크로마토그래피 컬럼 등에 충전하여, 인간 IgG를 정제 또는 분리하기 위해 이용할 수 있다.
본 발명의 고상 담체에 포함될 수 있는 IgG 결합 펩타이드에 대하여, 이하 상세히 설명한다.
본 명세서 중에서 사용하는 「IgG」는 포유 동물, 예를 들어 인간 및 침팬지 등의 영장류, 랫트, 마우스 및 토끼 등의 실험 동물, 돼지, 소, 말, 양 및 염소 등의 가축 동물, 및 개 및 고양이 등의 애완 동물의 IgG, 바람직하게는 인간의 IgG(IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4)를 가리키는 것으로 한다. 본 명세서에서의 IgG는 더욱더 바람직하게는 인간 IgG1, IgG2 또는 IgG4, 또는 토끼 IgG이며, 특히 바람직하게는 인간 IgG1, IgG2 또는 IgG4이다.
일 태양에 있어서, 본 발명의 고상 담체에 포함될 수 있는 IgG 결합 펩타이드는 하기 식 I:
(X1-3)-C-(X2)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-(X1-3) (I)
(식 중, X의 각각은 독립적으로 시스테인 이외의 임의의 아미노산 잔기이고,
C는 시스테인 잔기이고,
H는 히스티딘 잔기이고,
Xaa1은 아르기닌 잔기, 라이신 잔기, 류신 잔기 또는 아스파라긴 잔기, 또는 그들의 유도체이고,
G는 글리신 잔기이고,
Xaa2는 글루탐산 잔기 또는 아스파라긴 잔기이고,
L은 류신 잔기이고,
V는 발린 잔기이고, 또한
W는 트립토판 잔기이다.)
에 의해 표시되는, 13~17 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 상기 펩타이드의 외측의 2개의 시스테인 잔기 중의 설파이드기가 이하의 식:
Figure 112019049486713-pct00004
로 표시되는 링커로 이루어지는 군으로부터 선택되는 링커에 의해 연결되어 있다.
상기 식에서, N 말단 또는 C 말단의 X1-3이라는 표기는 시스테인(C 또는 Cys) 이외의 독립적으로 임의의 아미노산 잔기 X가 1~3개 연속하고 있는 것을 의미하며, 그것을 구성하는 아미노산 잔기는 동일하거나 상이한 잔기이지만, 바람직하게는 3개 모두가 동일한 잔기가 아닌 서열로 이루어진다. 마찬가지로, X2도 시스테인(C 또는 Cys) 이외의 독립적으로 임의의 아미노산 잔기 X가 2개 연속하고 있는 것을 의미하며, 그것을 구성하는 아미노산 잔기는 동일하거나 상이한 잔기이지만, 바람직하게는 당해 2개 연속하고 있는 아미노산 잔기는 동일한 잔기가 아닌 서열로 이루어진다.
식 I의 펩타이드의 아미노산 서열에 있어서 아미노산 잔기 X를 더욱더 특정한 식 I' 및 식 I''로 표시되는 펩타이드를 이하에 나타낸다.
즉, 식 I'으로 표시되는 펩타이드는,
(X1-3)-C-(X1)-Y-H-(Xaa1)-G-N-L-V-W-C-(X1-3) (I')
(식 중, X의 각각은 독립적으로 시스테인 이외의 임의의 아미노산 잔기이고,
C는 시스테인 잔기이고,
Y는 티로신 잔기이고,
H는 히스티딘 잔기이고,
Xaa1은 아르기닌 잔기, 라이신 잔기, 류신 잔기 또는 아스파라긴 잔기, 또는 그들의 유도체이고,
G는 글리신 잔기이고,
N은 아스파라긴 잔기이고,
L은 류신 잔기이고,
V는 발린 잔기이고, 또한
W는 트립토판 잔기이다.)
에 의해 표시되는, 13~17 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열을 포함한다.
식 I''으로 표시되는 펩타이드는,
(X1-3)-C-A-(X1)-H-(Xaa1)-G-E-L-V-W-C-(X1-3) (I'')
(식 중, X의 각각은 독립적으로 시스테인 이외의 임의의 아미노산 잔기이고,
C는 시스테인 잔기이고,
A는 알라닌 잔기이고,
H는 히스티딘 잔기이고,
Xaa1은 아르기닌 잔기, 라이신 잔기, 류신 잔기 또는 아스파라긴 잔기, 또는 그들의 유도체이고,
G는 글리신 잔기이고,
E는 글루탐산 잔기이고,
L은 류신 잔기이고,
V는 발린 잔기이고, 또한
W는 트립토판 잔기이다.)
에 의해 표시되는, 13~17 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열을 포함한다.
또한, 식 I의 펩타이드의 아미노산 서열에 있어서 아미노산 잔기 X를 더욱더 특정한 식 II로 표시되는 펩타이드를 이하에 나타낸다.
즉, 식 II로 표시되는 펩타이드는,
(X1-3)-C-(Xaa3)-(Xaa4)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-(X1-3) (II)
(식 중, X의 각각은 독립적으로 시스테인 이외의 임의의 아미노산 잔기이고,
C는 시스테인 잔기이고,
H는 히스티딘 잔기이고,
Xaa1은 아르기닌 잔기, 라이신 잔기, 류신 잔기 또는 아스파라긴 잔기, 또는 그들의 유도체이고,
G는 글리신 잔기이고,
Xaa2는 글루탐산 잔기 또는 아스파라긴 잔기이고,
L은 류신 잔기이고,
V는 발린 잔기이고,
W는 트립토판 잔기이고,
Xaa3은 알라닌 잔기, 세린 잔기 또는 트레오닌 잔기이고, 또한
Xaa4는 티로신 잔기 또는 트립토판 잔기이다.)
에 의해 표시되는, 13~17 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열을 포함한다.
상기 식 I', 식 I'' 및 식 II의 펩타이드의 아미노산 서열에 있어서, 17 아미노산 잔기로 한 경우의, N 말단으로부터 1번째 및 2번째, 및 16번째 및 17번째 아미노산 잔기 X는 결실되어 있을 수도 있으며, 그러한 펩타이드는 13 아미노산 길이로 이루어진다.
본 명세서에서 사용하는 「17 아미노산 잔기로 한 경우의」란, 펩타이드의 아미노산 잔기를 아미노산 번호로 부를 때, 식 I의 펩타이드에 대해 최장의 아미노산 길이인 17 잔기의 N 말단으로부터 순서대로 1번째부터 17번째까지 번호를 부여하기 위해 편의적으로 표현한 용어이다.
또한, 식 I의 펩타이드의 아미노산 서열에 있어서 아미노산 잔기 X를 더욱더 특정한 식 III으로 표시되는 펩타이드를 이하에 나타낸다.
즉, 식 III으로 표시되는 펩타이드는,
(X1-3)-C-A-Y-H-(Xaa1)-G-E-L-V-W-C-(X1-3) (III)
(식 중, X의 각각은 독립적으로 시스테인 이외의 임의의 아미노산 잔기이고,
C는 시스테인 잔기이고,
A는 알라닌 잔기이고,
Y는 티로신 잔기이고,
H는 히스티딘 잔기이고,
Xaa1은 아르기닌 잔기, 라이신 잔기, 류신 잔기 또는 아스파라긴 잔기, 또는 그들의 유도체이고,
G는 글리신 잔기이고,
E는 글루탐산 잔기이고,
L은 류신 잔기이고,
V는 발린 잔기이고, 또한
W는 트립토판 잔기이다.)
에 의해 표시되는, 13~17 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열을 포함한다.
상기 식 III의 펩타이드의 아미노산 서열에 있어서, 17 아미노산 잔기로 한 경우의, N 말단으로부터 1번째 및 2번째, 및 16번째 및 17번째 아미노산 잔기 X는 결실되어 있을 수도 있으며, 그러한 펩타이드는 13 아미노산 길이로 이루어질 수 있다.
또한, 상기의 각 식의 펩타이드의 아미노산 서열의 시스테인(C) 이외의 아미노산 잔기, 즉 17 아미노산 잔기로 한 경우의 N 말단으로부터 1~3, 5, 6, 15~17번째의 각 아미노산 잔기는 이하의 것으로부터 선택되는 것이 바람직하다. 여기서, 각 대문자의 알파벳은 아미노산의 일문자 표기(一文字表記)이다:
1번째 아미노산 잔기=S, G, F 또는 없음,
2번째 아미노산 잔기=D, G, A, S, P, 호모시스테인 또는 없음,
3번째 아미노산 잔기=S, D, T, N, E 또는 R,
15번째 아미노산 잔기=S, T 또는 D,
16번째 아미노산 잔기=H, G, Y, T, N, D, F, 호모시스테인 또는 없음,
17번째 아미노산 잔기=Y, F, H, M 또는 없음,
5번째 아미노산 잔기=A 또는 T,
6번째 아미노산 잔기=Y 또는 W.
또한, 식 I의 펩타이드의 아미노산 서열에 있어서 아미노산 잔기 X를 더욱더 특정한 식 IV로 표시되는 펩타이드를 이하에 나타낸다.
즉, 식 IV로 표시되는 펩타이드는,
D-C-(Xaa3)-(Xaa4)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-T (IV)
(식 중,
D는 아스파라긴산 잔기이고,
C는 시스테인 잔기이고,
H는 히스티딘 잔기이고,
Xaa1은 아르기닌 잔기, 라이신 잔기, 류신 잔기 또는 아스파라긴 잔기, 또는 그들의 유도체이고,
G는 글리신 잔기이고,
Xaa2는 글루탐산 잔기 또는 아스파라긴 잔기이고,
L은 류신 잔기이고,
V는 발린 잔기이고,
W는 트립토판 잔기이고,
T는 트레오닌 잔기이고,
Xaa3은 알라닌 잔기 또는 트레오닌 잔기이고, 또한
Xaa4는 티로신 잔기 또는 트립토판 잔기이다.)에 의해 표시되는, 13 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열을 포함한다.
식 I의 펩타이드의 구체 예 중 몇 가지를 이하의 1)~18)에 열거하지만, 이들로 제한되지 않는 것은 말할 필요도 없다:
1) DCAYH(Xaa1)GELVWCT(서열 번호 1),
2) GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(서열 번호 2),
3) RCAYH(Xaa1)GELVWCS(서열 번호 3),
4) GPRCAYH(Xaa1)GELVWCSFH(서열 번호 4),
5) SPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(서열 번호 5),
6) GDDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(서열 번호 6),
7) GPSCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(서열 번호 7),
8) GPDCAYH(Xaa1)GELVWCSFH(서열 번호 8),
9) GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTHH(서열 번호 9),
10) GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY(서열 번호 10),
11) SPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY(서열 번호 11),
12) SDDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY(서열 번호 12),
13) RGNCAYH(Xaa1)GQLVWCTYH(서열 번호 13),
14) G(Xaa2)DCAYH(Xaa1)GELVWCT(Xaa2)H(서열 번호 14),
15) DCTYH(Xaa1)GNLVWCT(서열 번호 15),
16) DCAYH(Xaa1)GNLVWCT(서열 번호 16),
17) DCTYH(Xaa1)GELVWCT(서열 번호 17), 및
18) DCAWH(Xaa1)GELVWCT(서열 번호 18)
(식 중, Xaa1은 아르기닌 잔기, 라이신 잔기, 류신 잔기 또는 아스파라긴 잔기, 또는 그들의 유도체이고, Xaa2는 호모시스테인이며, 바람직하게는 호모시스테인끼리는 서로 디설파이드 결합을 형성하고 있다).
식 I의 펩타이드의 바람직한 구체 예로서,
1) DCAYH(Xaa1)GELVWCT(서열 번호 1, 단 Xaa1은 R임),
2) GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(서열 번호 2, 단 Xaa1은 R, L, K 또는 아세틸화 라이신임), 및
4) GPRCAYH(Xaa1)GELVWCSFH(서열 번호 4, 단 Xaa1은 R임)
를 들 수 있으며, 특히 바람직한 예로서 GPDCAYHRGELVWCTFH(서열 번호 31)를 들 수 있다.
또한, 일 태양에 있어서, 본 명세서에 기재한 IgG 결합 펩타이드는 광의(廣義)의 일차 구조로서, 하기 식 V:
D-C-(Xaa2)-(Xaa3)-(Xaa4)-(Xaa1)-G-(Xaa5)-L-(Xaa6)-W-C-T (V)
(식 중,
D는 아스파라긴산 잔기이고,
C는 시스테인 잔기이고,
G는 글리신 잔기이고,
L은 류신 잔기이고,
W는 트립토판 잔기이고,
T는 트레오닌 잔기이고,
Xaa1은 아르기닌 잔기, 라이신 잔기, 류신 잔기 또는 아스파라긴 잔기, 또는 그들의 유도체이고,
Xaa2는 알라닌 잔기, 세린 잔기 또는 트레오닌 잔기이고,
Xaa3은 트립토판 잔기 또는 티로신 잔기이고,
Xaa4는 히스티딘 잔기, 아르기닌 잔기, 세린 잔기 또는 트레오닌 잔기이고,
Xaa5는 글루탐산 잔기, 아스파라긴 잔기, 아르기닌 잔기 또는 아스파라긴산 잔기이고, 또한
Xaa6은 이소류신 잔기 또는 발린 잔기이다)에 의해 표시되는, 13 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 상기 펩타이드의 외측의 2개의 시스테인 잔기 중의 설파이드기가 이하의 식:
Figure 112019049486713-pct00005
로 표시되는 링커로 이루어지는 군으로부터 선택되는 링커에 의해 연결되어 있다.
식 V의 펩타이드의 구체 예 중 몇 가지를 이하의 19)~30)에 열거하지만, 이들로 제한되지 않는 것은 말할 필요도 없다:
19) DCTYT(Xaa1)GNLVWCT(서열 번호 19),
20) DCAYT(Xaa1)GNLVWCT(서열 번호 20),
21) DCSYT(Xaa1)GNLVWCT(서열 번호 21),
22) DCTWT(Xaa1)GNLVWCT(서열 번호 22),
23) DCTYH(Xaa1)GNLVWCT(서열 번호 23),
24) DCTYR(Xaa1)GNLVWCT(서열 번호 24),
25) DCTYS(Xaa1)GNLVWCT(서열 번호 25),
26) DCTYT(Xaa1)GNLVWCT(서열 번호 26),
27) DCTYT(Xaa1)GELVWCT(서열 번호 27),
28) DCTYT(Xaa1)GRLVWCT(서열 번호 28),
29) DCTYT(Xaa1)GDLVWCT(서열 번호 29), 및
30) DCTYT(Xaa1)GNLIWCT(서열 번호 30)
(식 중, Xaa1은 아르기닌 잔기, 라이신 잔기, 류신 잔기 또는 아스파라긴 잔기, 또는 그들의 유도체이다).
상기와 같이, 본 명세서에 기재한 IgG 결합 펩타이드에 있어서, Xaa1은 아르기닌 잔기, 라이신 잔기, 류신 잔기 또는 아스파라긴 잔기, 또는 그들의 유도체, 바람직하게는 아르기닌 잔기, 라이신 잔기 또는 그의 유도체, 류신 잔기 또는 아스파라긴 잔기, 더욱더 바람직하게는 아르기닌 잔기, 라이신 잔기 또는 그의 유도체, 또는 류신 잔기이다. 본 명세서에 있어서, 유도체의 종류는 특별히 한정하지 않지만, 아세틸기 또는 프로피닐기 등의 아실화 유도체(아실화 유도체는 일반식: R-CO-로 표시되며, 식 중 R은 탄화수소, 바람직하게는 탄소수 1~6의 알킬기이다)를 들 수 있다. 유도체의 예로서, 예를 들어 라이신 잔기의 ε아미노기가 아실화, 예를 들어 아세틸화된 유도체를 들 수 있다.
상술한 바와 같이, 본 명세서에 기재한 IgG 결합 펩타이드는 각 아미노산 서열 중에 이간(離間)된 적어도 2개의 시스테인(C) 잔기를 가지며, 당해 시스테인 잔기의 설파이드기가 이하의 식:
Figure 112019049486713-pct00006
로 표시되는 링커로 이루어지는 군으로부터 선택되는 링커에 의해 연결되어 있는 것을 특징으로 하고 있다.
상기 IgG 결합 펩타이드에서의 링커는 바람직하게는
Figure 112019049486713-pct00007
로 표시되는 링커, 더욱더 바람직하게는
Figure 112019049486713-pct00008
로 표시되는 링커이다.
상기 IgG 결합 펩타이드에서의 링커 중의 R은 치환된 또는 치환되지 않은 알킬, 바람직하게는 치환된 또는 치환되지 않은 C1~C6 알킬, 즉 메틸기, 에틸기, 프로필기, 부틸기, 펜틸기 또는 헥실기이다. R의 치환기는 특별히 한정하지 않지만, 예를 들어 하이드록시기, (모노 또는 폴리)에틸렌 옥사이드기, 카복실기, 알콕시기, 아실기, 알킬기, 아미드기, 에스테르기, 할로겐기(F, Cl, Br 또는 I), 또는 이들의 조합일 수 있다. 또한, 파선 부분은 설파이드기와의 결합 부분을 의미한다. 당해 링커는 통상의 디설파이드 결합보다도 안정성, 예를 들어 알칼리 내성 또는 환원 반응 등 내성, 바람직하게는 알칼리 내성이 우수하다.
상기 링커를 갖는 펩타이드를 조제하는 방법은 특별히 한정하지 않는다. 예를 들어, 이하의 식:
Figure 112019049486713-pct00009
로 표시되는 링커를 갖는 펩타이드는, 예를 들어 이하의 방법:
시스테인 잔기를 2개 포함하는 펩타이드와, 상기 링커의 파선 부분에 가교 반응에 관여하는 반응성 관능기(예를 들어, 할로겐기, 이미다졸기 등)를 갖는 화합물을, 예를 들어 산성 조건하에서 혼합하는 공정을 포함하는 방법에 의해 얻을 수 있다.
또한, 상기 카보닐기를 갖는 펩타이드를 1급 아민(RNH2)과 반응시킴으로써,
Figure 112019049486713-pct00010
로 표시되는 링커에 의해 연결된 펩타이드를 얻을 수 있다(R은 상기와 동일한 의미이다).
상기 화합물에 있어서, 할로겐기는 바람직하게는 F, Cl, Br 및 I, 더욱더 바람직하게는 Cl, Br 및 I로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 할로겐기는 바람직하게는 동일하며, 더욱더 바람직하게는 할로겐기는 모두 Cl이다.
본 방법에서의 혼합 공정의 조건은 펩타이드의 시스테인 잔기 사이에서 연결 반응이 발생하는 조건이라면 특별히 한정하지 않는다. 예를 들어, 펩타이드와 상기 화합물을 적당한 버퍼 중에서 실온(예를 들어, 약 15℃~30℃) 또는 저온에서 혼합함으로써 반응을 수행할 수 있다. 당해 혼합 공정은 연결 반응을 촉진하는 염기(또는 알칼리), 예를 들어 약염기성의 무기 또는 유기(예를 들어, 염화구아니듐, 중탄산나트륨 및 디에틸아민 등)를 적정량 가하여 수행할 수도 있다.
본 방법의 혼합 공정에서의 펩타이드와 화합물의 혼합 비율은 특별히 한정하지 않는다. 펩타이드와 화합물의 몰 비율은, 예를 들어 1:0.2~1:10, 바람직하게는 1:0.5~1:5 또는 1:1~1:2로 할 수 있다.
당해 혼합 공정에서의 혼합 시간(반응 시간)은 펩타이드의 시스테인 잔기 사이에서 연결 반응이 발생하는 한 한정하는 것은 아니지만, 예를 들어 1분~5시간, 바람직하게는 10분~2시간 또는 15분~1시간으로 할 수 있다.
본 방법은, 필요에 따라, 상기 공정을 수행한 후의 혼합물로부터 불순물, 예를 들어 미반응 펩타이드 및 화합물 등을 분리하고, 시스테인 잔기가 연결된 펩타이드를 정제하는 공정을 추가로 포함할 수 있다. 당해 공정은 본 분야에 공지된 방법, 예를 들어 겔 여과 크로마토그래피, 이온 교환 컬럼 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 역상 컬럼 크로마토그래피, 및 HPLC 등의 크로마토그래피 등에 의해 수행할 수 있다.
또한, 본 명세서에 기재한 IgG 결합 펩타이드는 그 안정성의 향상 등을 위해, 예를 들어 N 말단의 PEG화(폴리에틸렌 글리콜 부가), 및 C 말단의 아미드화 등에 의해 수식(修飾)되어 있을 수도 있다. PEG화를 수행하는 경우의 PEG의 분자수는 특별히 한정되지 않으며, 예를 들어 1~50분자, 1~20분자, 2~10분자, 2~6분자 또는 4분자의 PEG를 부가할 수 있다.
또한, 본 명세서에 기재한 IgG 결합 펩타이드는 다량체화되어 있을 수도 있다. 본 명세서에 있어서, IgG 결합 펩타이드의 「다량체화」란, 공유 결합을 통해 2분자 이상의 상기 IgG 결합 펩타이드가 연결되어 있는 것을 가리키며, IgG 결합 펩타이드의 다량체는, 예를 들어 2~6량체, 2~5량체, 2~4량체, 2~3량체, 바람직하게는 2량체일 수 있다.
상기 펩타이드의 다량체는 당해 펩타이드 사이에 스페이서를 가지고 있을 수도 있다. 다량체화는 당업자에게 공지된 방법에 의해 수행할 수 있으며, 예를 들어 상기 IgG 결합 펩타이드의 N 말단의 아미노기를 스페이서를 통해 2분자 이상 연결함으로써 수행할 수 있다. 스페이서의 종류는 특별히 한정하지 않지만, 예를 들어 양 말단에 카복실기를 갖는 아스파라긴산 및 글루탐산 등의 아미노산, 및 양 말단을 카복실기, 알데히드기, 에폭시기, N-하이드록시석신이미딜기 등의 관능기로 치환한 폴리알킬렌 옥사이드의 유도체를 들 수 있다.
본 명세서에 기재한 IgG 결합 펩타이드는 인간 IgG와의 결합 친화성이 다른 인간 면역 글로불린(IgA, IgE, IgM)과 비교하여 약 10배 이상, 바람직하게는 약 50배 이상, 보다 바람직하게는 약 200배 이상 높은 것일 수 있다. 본 명세서에 기재한 펩타이드와 인간 IgG와의 결합에 관한 해리 정수(Kd)는 표면 플라즈몬 공명 스펙트럼 해석(예를 들어, 비아코어(BIACORE) 시스템 사용)에 의해 결정 가능하며, 예를 들어 1×10-1 M 미만, 1×10-3 M 미만, 바람직하게는 1×10-4 M 미만, 보다 바람직하게는 1×10-5 M 미만이다. 본 명세서에 기재한 IgG 결합 펩타이드는 IgG의 Fc 도메인에 결합할 수 있다.
본 명세서에 기재한 펩타이드는 관용의 액상 합성법, 고상 합성법 등의 펩타이드 합성법, 자동 펩타이드 합성기에 의한 펩타이드 합성 등(Kelley et al., Genetics Engineering Principles and Methods, Setlow, J.K. eds., Plenum Press NY.(1990) Vol.12, p.1-19; Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis(1989) W.H. Freeman Co.; Houghten, Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1985) 82: p.5132; 「신생화학 실험 강좌 1 단백질 IV」(1992) 일본 생화학회 편찬, 도쿄카가쿠도진(東京化學同人; Tokyo Chemistry Coterie Co., Ltd.))에 의해 제조할 수 있다. 혹은, 본 명세서에 기재한 펩타이드를 코딩하는 핵산을 이용한 유전자 재조합법이나 파지 디스플레이법 등에 의해 펩타이드를 제조할 수도 있다. 예를 들어, 본 명세서에 기재한 펩타이드의 아미노산 서열을 코딩하는 DNA를 발현 벡터 중에 삽입하고, 숙주 세포 중에 도입하여 배양함으로써, 목적의 펩타이드를 제조할 수 있다. 제조된 펩타이드는 통상적인 방법에 의해, 예를 들어 겔 여과 크로마토그래피, 이온 교환 컬럼 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 역상 컬럼 크로마토그래피, HPLC 등의 크로마토그래피, 황산암모늄 분획, 한외 여과 및 면역 흡착법 등에 의해 회수 또는 정제할 수 있다.
펩타이드 합성에서는, 예를 들어 각 아미노산(천연인지 비천연인지를 불문함)의, 결합하고자 하는 α-아미노기와 α-카복실기 이외의 관능기를 보호한 아미노산류를 준비하고, 각각의 아미노산의 α-아미노기와 α-카복실기와의 사이에서 펩타이드 결합 형성 반응을 수행한다. 통상, 펩타이드의 C 말단에 위치하는 아미노산 잔기의 카복실기를 적당한 스페이서 또는 링커를 통해 고상에 결합시켜 둔다. 이렇게 하여 얻어진 디펩타이드의 아미노 말단의 보호기를 선택적으로 제거하고, 다음 아미노산의 α-카복실기와의 사이에서 펩타이드 결합을 형성한다. 이러한 조작을 연속하여 수행하여 측기(側基)가 보호된 펩타이드를 제조하고, 마지막으로 모든 보호기를 제거하고, 고상으로부터 분리한다. 보호기의 종류나 보호 방법, 펩타이드 결합법의 상세는 상기 문헌에 자세히 기재되어 있다.
유전자 재조합법에 의한 제조는, 예를 들어 본 명세서에 기재한 펩타이드를 코딩하는 DNA를 적당한 발현 벡터 중에 삽입하고, 적당한 숙주 세포에 벡터를 도입하고, 세포를 배양하고, 세포 내로부터 또는 세포 외액으로부터 목적의 펩타이드를 회수하는 것을 포함하는 방법에 의해 이루어질 수 있다. 벡터는 한정되지 않지만, 예를 들어 플라스미드, 파지, 코스미드, 파지미드 및 바이러스 등의 벡터이다. 플라스미드 벡터로서는, 한정하는 것은 아니지만, 대장균 유래의 플라스미드(예를 들어, pET22b(+), pBR322, pBR325, pUC118, pUC119, pUC18, pUC19, pBluescript 등), 고초균 유래의 플라스미드(예를 들어, pUB110, pTP5 등), 및 효모 유래의 플라스미드(예를 들어, YEp13, YCp50 등) 등을 들 수 있다. 파지 벡터로서는, 한정하는 것은 아니지만, T7 파지 디스플레이 벡터(T7Select10-3b, T7Select1-1b, T7Select1-2a, T7Select1-2b, T7Select1-2c 등(노바겐(Novagen))), 및 λ 파지 벡터(Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4, λgt10, λgt11, λZAP, λZAPII 등)를 들 수 있다. 바이러스 벡터로서는, 한정하는 것은 아니지만, 예를 들어 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노 수반 바이러스, 백시니아바이러스 및 센다이바이러스 등의 동물 바이러스, 및 바큘로바이러스 등의 곤충 바이러스 등을 들 수 있다. 코스미드 벡터로서는, 한정하는 것은 아니지만, Lorist 6, Charomid9-20, 및 Charomid9-42 등을 들 수 있다. 파지미드 벡터로서는, 한정하는 것은 아니지만, 예를 들어 pSKAN, pBluescript, pBK, 및 pComb3H 등이 알려져 있다. 벡터에는, 목적의 DNA가 발현 가능하도록 조절 서열이나, 목적 DNA를 포함하는 벡터를 선별하기 위한 선택 마커, 목적 DNA를 삽입하기 위한 멀티클로닝 사이트 등이 포함될 수 있다. 그러한 조절 서열에는, 프로모터, 인핸서, 터미네이터, S-D 서열 또는 리보솜 결합 부위, 복제 개시점 및 폴리 A 사이트 등이 포함된다. 또한, 선택 마커에는, 예를 들어 암피실린 내성 유전자, 네오마이신 내성 유전자, 카나마이신 내성 유전자 및 디하이드로엽산 환원효소 유전자 등이 이용될 수 있다. 벡터를 도입하기 위한 숙주 세포는 대장균이나 고초균 등의 세균, 효모 세포, 곤충 세포, 동물 세포(예를 들어, 포유동물 세포) 및 식물 세포 등이며, 이들 세포로의 형질 전환 또는 트랜스펙션은, 예를 들어 인산칼슘법, 일렉트로포레이션법, 리포펙션법, 입자총법(particle gun method) 및 PEG법 등을 포함한다. 형질전환 세포의 배양은 숙주 생물의 배양에 이용되는 통상의 방법에 따라 수행된다. 예를 들어, 대장균이나 효모 세포 등의 미생물의 배양액은 숙주 미생물이 자화(資化)할 수 있는 탄소원, 질소원 및 무기 염류 등을 함유한다. 본 명세서에 기재한 펩타이드의 회수를 용이하게 하기 위해, 발현에 의해 생성한 펩타이드를 세포 외로 분비시키는 것이 바람직하다. 이는, 그 세포로부터의 펩타이드의 분비를 가능하게 하는 펩타이드 서열을 코딩하는 DNA를, 목적 펩타이드를 코딩하는 DNA의 5' 말단 측에 결합함으로써 수행할 수 있다. 세포막으로 이행한 융합 펩타이드가 시그널 펩티다아제에 의해 절단되어, 목적의 펩타이드가 배지에 분비 방출된다. 혹은, 세포 내에 축적된 목적 펩타이드를 회수할 수도 있다. 이 경우, 세포를 물리적 또는 화학적으로 파괴하고, 단백질 정제 기술을 사용하여 목적 펩타이드를 회수한다.
<IgG 분리용 컬럼 또는 IgG의 정제를 위한 키트>
일 태양에 있어서, 본 발명은 상기의 IgG 결합 펩타이드를 포함하는 고상 담체를 포함하는, IgG, 바람직하게는 인간 IgG 분리용 컬럼에 관한 것이다.
상기 IgG 분리용 컬럼은 IgG의 정제 또는 분리를 위한 크로마토그래피 컬럼, 고속 액체 크로마토그래피(HPLC) 컬럼 등의 컬럼을 포함한다. 컬럼의 사이즈는 특별히 제한되지 않는 것으로 하며, 분석용, 정제용, 분취용 등의 용도, 어플라이(탑재) 또는 주입하는 양, 컬럼의 길이 또는 내경 등에 따라 변화시킬 수 있다. 또한, 컬럼의 재질은 금속, 플라스틱, 유리 등의 컬럼으로서 통상 사용되는 것과 같은 것일 수 있다.
상기 컬럼은 상기의 본 발명의 고상 담체(건조 또는 습윤 상태 중 어느 것이어도 됨)를 컬럼에 치밀하게 충전함으로써 제조할 수 있다.
또한, 일 태양에 있어서, 본 발명은 상기의 IgG 결합 펩타이드를 포함하는 고상 담체를 포함하는, IgG, 바람직하게는 인간 IgG의 정제를 위한 키트에 관한 것이다.
본 발명의 키트는 인간 IgG의 분석 절차나 정제 절차를 기재한 사용 설명서, 정제에 필요한 시약이나 버퍼, 고상 담체의 충전용 컬럼 중 적어도 하나를 포함할 수 있다.
<IgG의 정제 방법>
일 태양에 있어서, 본 발명은 상기 고상 담체 또는 상기 IgG 분리용 컬럼에 IgG를 결합시키는 공정 및 결합한 IgG를 용출시켜 IgG를 회수하는 공정을 포함하는, IgG, 바람직하게는 인간 IgG의 정제 방법에 관한 것이다.
결합 공정은 당업자에게 공지된 방법에 의해 수행할 수 있다. 예를 들어, 상기 고상 담체 또는 IgG 분리용 컬럼을 적당한 버퍼로 평형화하고, 0℃~실온, 바람직하게는 0℃~약 10℃, 더욱더 바람직하게는 약 4℃의 저온에서 IgG를 함유하는 액을 어플라이하고, 고상 담체 위의 펩타이드에 IgG를 결합시킨다. 예를 들어, 혈청 중의 IgG를 분리하는 경우에는, 중성 영역의 pH, 예를 들어 pH 6.0~7.5의 버퍼를 사용하여 컬럼에 어플라이하고, 결합 공정을 수행할 수 있다.
용출 공정도 당업자에게 공지된 방법에 의해 수행할 수 있다. 예를 들어, 산성 영역의 pH, 예를 들어 pH 2~4의 버퍼(예를 들어, 0.3 M의 NaCl을 함유하는 pH 3.5 내지 pH 2.5의 0.2 M 글리신-HCl 버퍼 또는 20 mM 구연산 버퍼)를 컬럼에 흘려 수행할 수도 있으며, 상기 IgG 결합 펩타이드를 이용하여 경합 용출에 의해 용출시킬 수도 있다. 특히, 비용의 점에서 산에 의해 용출을 수행하는 것이 바람직하다. 이 경우, 고상 담체 또는 컬럼을 수산화나트륨 용액, 수산화칼륨 용액 및 수산화칼륨 용액 등의 알칼리성 용액(예를 들어, 0.1 M 수산화나트륨 용액)으로 세정함으로써 고상 담체 또는 컬럼을 재생하여 재차 결합 공정에 이용할 수 있다. 용액의 알칼리성의 정도는 당업자라면 용이하게 결정할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 임의로 알칼리성 용액에 의해 세정함으로써 고상 담체 또는 컬럼을 재생하는 공정을 포함할 수 있다.
IgG가 회수되었는지 어떤지는, 예를 들어 전기 영동에 의한 분자량의 확인, 및 임의로 그 후의 항IgG 항체를 사용하는 웨스턴 블롯법에 의해 판정할 수 있다. 예를 들어, 전기 영동은 5~20% 아크릴아미드 구배 겔(acrylamide gradient gel)을 이용한 SDS-PAGE에 의해 수행할 수 있으며, 또한 웨스턴 블롯은 영동 후의 단백질을 PVDF 막에 전사하고, 스킴 밀크(skim milk)로 블로킹 후, 항IgG α쇄 염소 항체와 HRP 표지 항염소 IgG 마우스 항체로 검출을 수행할 수 있다.
본 발명의 방법은, 다양한 방법으로 생산된 IgG 함유 생산물로부터 IgG를 정제하는 공정에 있어서, IgG가 풍부한 분획을 얻는 경우에 유용하다. 그러므로 친화성 크로마토그래피, HPLC 등의 컬럼 크로마토그래피에 있어서 본 발명의 방법을 사용하는 것이 바람직하다. IgG의 정제 시에는, 이러한 크로마토그래피법 이외에 단백질의 관용적인 정제 기술, 예를 들어 겔 여과 크로마토그래피, 이온 교환 컬럼 크로마토그래피, 역상 컬럼 크로마토그래피 등의 크로마토그래피, 황산암모늄 분획, 한외 여과 등을 적절히 조합할 수 있다.
본 발명을 이하의 실시예에 의해 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 범위는 이들 실시예에 의해 제한되지 않는 것으로 한다.
실시예
[실시예 1: IgG 결합 펩타이드의 조제 및 결합 친화성의 측정]
N 말단을 비오틴화 PEG4로 블록킹한 이하의 6개의 IgG 결합 펩타이드를 Fmoc 고상 합성법에 의해 통상적인 방법에 따라 합성했다:
DCAYH(Xaa1)GELVWCT(서열 번호 1, 단 Xaa1은 아르기닌이고, C 말단은 아미드화됨);
GPRCAYH(Xaa1)GELVWCSFH(서열 번호 4, 단 Xaa1은 아르기닌이고, C 말단은 아미드화됨);
GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(서열 번호 2, 단 Xaa1은 아르기닌이고, C 말단은 아미드화됨);
GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(서열 번호 2, 단 Xaa1은 류신이고, C 말단은 아미드화됨); GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(서열 번호 2, 단 Xaa1은 라이신이고, C 말단은 아미드화됨);
GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(서열 번호 2, 단 Xaa1은 아세틸화 라이신이고, C 말단은 아미드화됨).
보호기를 제거한 후, pH 8.5의 수용액 중 산화 조건하에서 분자 내 S-S 결합을 형성시키고, 역상 HPLC를 이용하여 유속 1.0 ml/min, 0.1%의 TFA를 포함하는 10%부터 60%의 아세토니트릴의 구배 용출(gradient elution)에 의해 분자 내 S-S 결합을 갖는 펩타이드를 정제했다.
정제한 IgG 결합 펩타이드의 친화성 해석은 이하의 방법으로 수행했다. 비아코어 T200(지이 헬스케어(GE healthcare))에 세팅한 CM5 센서 칩 위로 0.4 M EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드)와 0.1 M 설포-NHS(sulfo-N-hydroxysuccinimide, 설포-N-하이드록시석신이미드)를 등량 혼합 후, 10 μl/ml의 유속으로 센서 칩에 7분간 인젝팅함으로써 센서 칩을 활성화하고, pH 4.0(10 mM 아세트산 Na)의 조건하에서 고정화 양이 RU 값으로 4000~5000이 되도록 IgG를 고정화했다. HBS-EP 완충액(0.01 M HEPES, 0.15 M NaCl, 0.005% Tween 20, 3 mM EDTA, pH 7.0)을 이용하면서, 유속 50 μl/ml로 10 nM 내지 2 μM의 농도의 펩타이드를 180초간 인젝팅함으로써 결합 반응을 모니터하고, 그 후, 완충액에 의해 600 sec 세정함으로써 해리 반응을 측정했다. 결합 파라미터의 해석은 비아이밸루에이션(BIAevaluation) T100 소프트웨어를 이용하여 수행했다.
친화성 측정의 결과를 이하의 표 1에 나타낸다. 표 1의 결과는, 모든 펩타이드가 IgG와 결합성을 가져서 항체의 정제에 이용할 수 있는 것을 나타내고 있다.
Figure 112019049486713-pct00011
각종 펩타이드의 친화성(모두 펩타이드의 N 말단을 비오틴화 PEG4로 블록킹한 것을 이용했다). 최하단의 K(아세틸)은 아세틸화된 라이신 잔기를 의미한다.
[실시예 2: 링커에 의해 가교된 IgG 결합 펩타이드의 조제]
NH2-PEG4화 합성 펩타이드 GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(서열 번호 2, Xaa1은 아르기닌이고, C 말단은 아미드화됨)는 펩타이드 합성 비즈(링크-아미드-켐매트릭스 수지, 바이오타지(Biotage)) 위에서 Fmoc 고상 합성법에 의해 통상적인 방법에 따라 합성했다.
수지로부터의 펩타이드의 절단, 탈보호를 수행한 후, 펩타이드를 얻었다. 얻어진 펩타이드 65 mg(15.6 μmol)을, 6 M 염화구아니듐(Gn·HCl)을 포함하는 인산 완충액(pH=7.3) 5 mL에 용해하고, 이것에 아세토니트릴 120 μL에 용해한 1,3-디클로로-2-프로판온(2.9 mg, 23.4 μmol, 1.5 등량 몰)을 가하여 실온에서 교반했다. 1시간 후, HPLC 분석에 의해 반응의 종료를 확인하고, 반응 용액을 직접 HPLC로 정제함으로써, 환화 펩타이드(33 mg, 7.8 μmol, 수율 50%)를 얻었다.
이상의 절차에 의해, GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(서열 번호 2, Xaa1은 아르기닌이고, C 말단은 아미드화됨)로 표시되는 아미노산 서열을 포함하며, 외측의 2개의 시스테인 잔기 중의 설파이드기가 이하의 식:
Figure 112019049486713-pct00012
로 표시되는 링커에 의해 연결되어 있는 N 말단 PEG4화 및 C 말단 아미드화 펩타이드 a를 얻었다.
또한, 상기와 동일한 방법으로 조제한 펩타이드(Fmoc-HN-PEG4-GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(서열 번호 2, Xaa1은 아르기닌이고, C 말단은 아미드화됨)) 1.1 mg을 220 μL의 DMF에 용해하고(2 mM), 이것에 아세토니트릴에 용해한 10 mM의 티오카보닐 디이미다졸 22 μL(0.5 등량 몰)를 가하여, 얼음 위에서 2.5시간 교반했다. HPLC 분석에 의해 반응 종료를 확인하고, 반응 용액을 직접 HPLC로 정제함으로써, 2개의 시스테인 잔기 중의 설파이드기가 이하의 식:
Figure 112019049486713-pct00013
로 표시되는 링커에 의해 연결되어 있는 환화 펩타이드 b를 얻었다(0.3 mg, 수율 27%). 본 펩타이드에 대해, 실시예 1과 동일하게 IgG와의 친화성을 측정한 바, Kd는 1 μM였다.
[실시예 3: 인간 혈청 유래 γ-글로불린의 분리]
디클로로아세톤 가교 펩타이드가 인간 항체 정제 친화성 리간드로서 이용 가능한지, NHS 활성화 프리팩 컬럼(지이 헬스케어)에 고정화하여 각종 평가를 실시했다.
펩타이드 고정화 컬럼은 이하의 방법으로 제작했다. 아울러, 용액의 송액에는 시린지를 이용했다.
1 mL 용량의 NHS 활성화 프리팩 컬럼에 1 mM 염산 5 mL를 송액하여, 컬럼 내의 이소프로판올 용액을 제거했다. 그 다음, 1.0 mg/mL 펩타이드 용액(DMSO에 용해한 100 mg/mL의 실시예 2에서 조제한 펩타이드 a의 용액을 커플링 용액(20 mM 탄산 완충액, 50 mM 염화나트륨, pH 8.3)으로 100배로 희석) 1 mL를 송액하고, 실온에서 1시간 고정화했다. 그 후, 1 M Tris(pH 8.0) 5 mL로 미반응 NHS를 실온에서 1시간 블로킹했다. 마지막으로, 흡착 용액(20 mM 인산 완충액, 150 mM 염화나트륨, pH 7.4) 5 mL를 송액하고, 크로마토그래피 평가에 이용했다.
제작한 펩타이드 고정화 컬럼을 액체 크로마토그래피 장치 악타익스플로러(AKTAexplorer)(지이 헬스케어)에 접속하여, 흡착 용액으로 평형화했다. 그 다음, 흡착 용액에 용해한 1 mg/mL 인간 혈청 유래 γ-글로불린(와코)을 1 mL/min의 유속으로 1 min 송액했다. 추가로, 컬럼을 흡착 용액으로 세정하고, 산성 용출 용액(20 mM 구연산, pH 2.5)을 송액함으로써 흡착 성분을 용출했다. 컬럼으로부터의 단백질의 용출은 280 nm의 흡광도에서 검출했다. 실험 결과를 도 1에 나타낸다.
도 1에 나타내는 바와 같이, pH의 저하에 의해, 컬럼에 흡착한 인간 혈청 유래 γ-글로불린의 용출이 확인된 것으로부터, 실시예 2에서 조제한 펩타이드가 친화성 컬럼의 리간드로서 이용할 수 있는 것이 밝혀졌다.
[실시예 4: 펩타이드에 의한 경합 용출]
실시예 3과 동일한 방법으로 제작한 컬럼에 대해, 1 mg의 인간 혈청 유래 γ-글로불린을 송액하고, 흡착시켰다. 컬럼을 흡착 용액으로 세정 후, 흡착 용액에 용해한 0.4 mg/mL의 실시예 2에서 조제한 펩타이드 a의 용액을 2.5 mL 송액했다. 0.5 mL 분획한 각 프랙션을 정법(定法)에 따라 환원 조건하에서의 SDS-PAGE에 제공했다. 단백질의 검출은 CBB 염색으로 수행했다. 비교를 위해, 구연산 용출에서도 동일한 조작을 수행했다.
도 2에 나타내는 바와 같이, 경쇄(L쇄) 및 중쇄(H쇄)를 나타내는 25 kDa 부근 및 50 kDa 부근의 밴드가 확인된 것으로부터, 용출 방법으로서 펩타이드 용액을 이용하는 것이 가능하다는 것이 밝혀졌다.
[실시예 5: 동적 결합 용량(DBC) 측정]
실시예 3과 동일한 방법으로 펩타이드 고정화 양이 상이한 3종(1 mg, 4 mg, 10 mg)의 컬럼을 제작했다. 단, 펩타이드 용액은 4 mg/mL, 10 mg/mL를 준비하여 고정화에 이용했다.
각 컬럼을 흡착 용액으로 평형화한 후, 흡착 용액에 용해한 1 mg/mL 인간 혈청 유래 γ-글로불린(와코)을 1 mL/min, 0.4 mL/min, 0.2 mL/min(체류 시간 1 min, 2.5 min, 5 min)의 유속으로 송액했다. DBC는, 280 nm 흡광도에 있어서, 비흡착 성분을 제외한 값이 샘플 전체의 흡광도의 10%에 도달할 때까지 송액된 샘플 양으로부터 구했다. 1 mL/min 유속에서의 크로마토그램을 도 3에 나타내고, DBC를 표 2에 정리했다. 아울러, 비교를 위해, 시판 프로테인 A 담체 맙셀렉트(MabSelect)(지이 헬스케어)에 대해서도 동일한 측정을 수행했다.
Figure 112019049486713-pct00014
도 3 및 표 2에 나타내는 바와 같이, 펩타이드 고정화 양을 증가시킴으로써 DBC가 높아지는 것이 밝혀졌다. 10 mg 펩타이드 고정화 컬럼의 DBC는 체류 시간 5 min의 저유속에서는 맙셀렉트보다 낮았지만, 체류 시간 1 min의 고유속에서는 유의하게 높아, 고유속에서의 정제에 적합하다는 것이 시사되었다(표 2).
[실시예 6: 알칼리 내성의 평가]
실시예 3과 동일한 방법으로 제작한 1 mg 펩타이드 고정화 1 mL 컬럼에 0.1 M 수산화나트륨 용액을 5 mL 송액했다. 그 후, 흡착 용액으로 세정을 수행하고, 실시예 5와 동일하게 유속 1 mL/min에서의 DBC 측정을 수행했다. 계속해서, 수산화나트륨 용액 처리/DBC 측정을 5회 반복 수행함으로써 알칼리 내성을 평가했다. 수산화나트륨 처리를 수행하기 전의 DBC를 100%로 하여, DBC 변동률을 구했다.
[비교예 1]
비교예 1로서, 디설파이드 결합으로 가교된 펩타이드를 1 mg 고정화한 컬럼을 제작하고, 실시예 5와 동일하게 알칼리 내성 평가를 실시했다.
실시예 5 및 비교예 1의 결과를 도 4에 나타내고, 실측값을 표 3에 정리했다.
Figure 112019049486713-pct00015
도 4 및 표 3에 나타내는 바와 같이, 디설파이드 결합으로 가교된 펩타이드에서는 5회의 수산화나트륨 처리에 의해 DBC가 86.4%까지 저하되었다(비교예 1). 한편, 디클로로아세톤 가교 펩타이드에서는 DBC의 저하가 확인되지 않아, 높은 알칼리 내성을 갖는 것이 밝혀졌다.
본 발명의 고상 담체에 포함되는 펩타이드는 시스테인 잔기에서의 설파이드기를, 특정 구조를 갖는 링커에 의해 가교함으로써, 안정성이 개선되고 있다. 따라서 본 발명의 고상 담체는 알칼리 세정 공정 등에 의해 IgG 결합능이 저감되기 어렵기 때문에, 효율적인 IgG 정제에 이용할 수 있으며, 의약품으로서도 이용되는 IgG의 효율적인 생산에 이용할 수 있다.
본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 그대로 인용에 의해 본 명세서에 편입되는 것으로 한다.
SEQUENCE LISTING <110> Kagoshima University Daicel Corporation <120> A solid carrier comprising IgG binding peptide and a method for separating IgG <130> PH-7113-PCT <150> JP 2016-225483 <151> 2016-11-18 <160> 31 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa is arginine, lysine, leucine, asparagine, or derivative thereof <400> 1 Asp Cys Ala Tyr His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr 1 5 10 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa is arginine, lysine, leucine, asparagine, or derivative thereof <400> 2 Gly Pro Asp Cys Ala Tyr His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe 1 5 10 15 His <210> 3 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa is arginine, lysine, leucine, asparagine, or derivative thereof <400> 3 Arg Cys Ala Tyr His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Ser 1 5 10 <210> 4 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa is arginine, lysine, leucine, asparagine, or derivative thereof <400> 4 Gly Pro Arg Cys Ala Tyr His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Ser Phe 1 5 10 15 His <210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa is arginine, lysine, leucine, asparagine, or derivative thereof <400> 5 Ser Pro Asp Cys Ala Tyr His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe 1 5 10 15 His <210> 6 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa is arginine, lysine, leucine, asparagine, or derivative thereof <400> 6 Gly Asp Asp Cys Ala Tyr His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe 1 5 10 15 His <210> 7 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa is arginine, lysine, leucine, asparagine, or derivative thereof <400> 7 Gly Pro Ser Cys Ala Tyr His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe 1 5 10 15 His <210> 8 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa is arginine, lysine, leucine, asparagine, or derivative thereof <400> 8 Gly Pro Asp Cys Ala Tyr His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Ser Phe 1 5 10 15 His <210> 9 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa is arginine, lysine, leucine, asparagine, or derivative thereof <400> 9 Gly Pro Asp Cys Ala Tyr His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr His 1 5 10 15 His <210> 10 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa is arginine, lysine, leucine, asparagine, or derivative thereof <400> 10 Gly Pro Asp Cys Ala Tyr His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe 1 5 10 15 Tyr <210> 11 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa is arginine, lysine, leucine, asparagine, or derivative thereof <400> 11 Ser Pro Asp Cys Ala Tyr His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe 1 5 10 15 Tyr <210> 12 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa is arginine, lysine, leucine, asparagine, or derivative thereof <400> 12 Ser Asp Asp Cys Ala Tyr His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe 1 5 10 15 Tyr <210> 13 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa is arginine, lysine, leucine, asparagine, or derivative thereof <400> 13 Arg Gly Asn Cys Ala Tyr His Xaa Gly Gln Leu Val Trp Cys Thr Tyr 1 5 10 15 His <210> 14 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa is homoserine <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa is arginine, lysine, leucine, asparagine, or derivative thereof <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> Xaa is homoserine <400> 14 Gly Xaa Asp Cys Ala Tyr His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Xaa 1 5 10 15 His <210> 15 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa is arginine, lysine, leucine, asparagine, or derivative thereof <400> 15 Asp Cys Thr Tyr His Xaa Gly Asn Leu Val Trp Cys Thr 1 5 10 <210> 16 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa is arginine, lysine, leucine, asparagine, or derivative thereof <400> 16 Asp Cys Ala Tyr His Xaa Gly Asn Leu Val Trp Cys Thr 1 5 10 <210> 17 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa is arginine, lysine, leucine, asparagine, or derivative thereof <400> 17 Asp Cys Thr Tyr His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr 1 5 10 <210> 18 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa is arginine, lysine, leucine, asparagine, or derivative thereof <400> 18 Asp Cys Ala Trp His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr 1 5 10 <210> 19 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa is arginine, lysine, leucine, asparagine, or derivative thereof <400> 19 Asp Cys Thr Tyr Thr Xaa Gly Asn Leu Val Trp Cys Thr 1 5 10 <210> 20 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa is arginine, lysine, leucine, asparagine, or derivative thereof <400> 20 Asp Cys Ala Tyr Thr Xaa Gly Asn Leu Val Trp Cys Thr 1 5 10 <210> 21 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa is arginine, lysine, leucine, asparagine, or derivative thereof <400> 21 Asp Cys Ser Tyr Thr Xaa Gly Asn Leu Val Trp Cys Thr 1 5 10 <210> 22 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa is arginine, lysine, leucine, asparagine, or derivative thereof <400> 22 Asp Cys Thr Trp Thr Xaa Gly Asn Leu Val Trp Cys Thr 1 5 10 <210> 23 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa is arginine, lysine, leucine, asparagine, or derivative thereof <400> 23 Asp Cys Thr Tyr His Xaa Gly Asn Leu Val Trp Cys Thr 1 5 10 <210> 24 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa is arginine, lysine, leucine, asparagine, or derivative thereof <400> 24 Asp Cys Thr Tyr Arg Xaa Gly Asn Leu Val Trp Cys Thr 1 5 10 <210> 25 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa is arginine, lysine, leucine, asparagine, or derivative thereof <400> 25 Asp Cys Thr Tyr Ser Xaa Gly Asn Leu Val Trp Cys Thr 1 5 10 <210> 26 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa is arginine, lysine, leucine, asparagine, or derivative thereof <400> 26 Asp Cys Thr Tyr Thr Xaa Gly Asn Leu Val Trp Cys Thr 1 5 10 <210> 27 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa is arginine, lysine, leucine, asparagine, or derivative thereof <400> 27 Asp Cys Thr Tyr Thr Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr 1 5 10 <210> 28 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa is arginine, lysine, leucine, asparagine, or derivative thereof <400> 28 Asp Cys Thr Tyr Thr Xaa Gly Arg Leu Val Trp Cys Thr 1 5 10 <210> 29 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa is arginine, lysine, leucine, asparagine, or derivative thereof <400> 29 Asp Cys Thr Tyr Thr Xaa Gly Asp Leu Val Trp Cys Thr 1 5 10 <210> 30 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa is arginine, lysine, leucine, asparagine, or derivative thereof <400> 30 Asp Cys Thr Tyr Thr Xaa Gly Asn Leu Ile Trp Cys Thr 1 5 10 <210> 31 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <400> 31 Gly Pro Asp Cys Ala Tyr His Arg Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Phe 1 5 10 15 His

Claims (19)

  1. 인간 IgG와 결합 가능한 것을 특징으로 하는 펩타이드를 고정화한 고상 담체로서,
    상기 펩타이드가 하기 식 I:
    (X1-3)-C-(X2)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-(X1-3) (I)
    (식 중, X의 각각은 독립적으로 시스테인 이외의 임의의 아미노산 잔기이고,
    C는 시스테인 잔기이고,
    H는 히스티딘 잔기이고,
    Xaa1은 아르기닌 잔기, 라이신 잔기, 류신 잔기 또는 아스파라긴 잔기이고,
    G는 글리신 잔기이고,
    Xaa2는 글루탐산 잔기 또는 아스파라긴 잔기이고,
    L은 류신 잔기이고,
    V는 발린 잔기이고, 또한
    W는 트립토판 잔기이다.)
    에 의해 표시되는, 13∼17 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 상기 펩타이드의 외측의 2개의 시스테인 잔기 중의 설파이드기가 이하의 식:
    Figure 112022063319651-pct00016

    로 표시되는 링커로 이루어지는 군으로부터 선택되는 링커에 의해 연결되어 있으며, 여기서 R은 치환되지 않은 C1~C6 알킬인, 고상 담체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 펩타이드가 하기 식 II:
    (X1-3)-C-(Xaa3)-(Xaa4)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-(X1-3) (II)
    (식 중, X의 각각은 독립적으로 시스테인 이외의 임의의 아미노산 잔기이고,
    C는 시스테인 잔기이고,
    H는 히스티딘 잔기이고,
    Xaa1은 아르기닌 잔기, 라이신 잔기, 류신 잔기 또는 아스파라긴 잔기이고,
    G는 글리신 잔기이고,
    Xaa2는 글루탐산 잔기 또는 아스파라긴 잔기이고,
    L은 류신 잔기이고,
    V는 발린 잔기이고,
    W는 트립토판 잔기이고,
    Xaa3은 알라닌 잔기, 세린 잔기 또는 트레오닌 잔기이고, 또한
    Xaa4는 티로신 잔기 또는 트립토판 잔기이다.)
    에 의해 표시되는, 13~17 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열을 포함하는, 고상 담체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 펩타이드가 하기 식 III:
    (X1-3)-C-A-Y-H-(Xaa1)-G-E-L-V-W-C-(X1-3) (III)
    (식 중, X의 각각은 독립적으로 시스테인 이외의 임의의 아미노산 잔기이고,
    C는 시스테인 잔기이고,
    A는 알라닌 잔기이고,
    Y는 티로신 잔기이고,
    H는 히스티딘 잔기이고,
    Xaa1은 아르기닌 잔기, 라이신 잔기, 류신 잔기 또는 아스파라긴 잔기이고,
    G는 글리신 잔기이고,
    E는 글루탐산 잔기이고,
    L은 류신 잔기이고,
    V는 발린 잔기이고, 또한
    W는 트립토판 잔기이다.)
    에 의해 표시되는, 13~17 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열을 포함하는, 고상 담체.
  4. 제1항에 있어서, 17 아미노산 잔기로 한 경우의, 상기 펩타이드의 N 말단으로부터 1~3, 15~17번째의 각 아미노산 잔기가
    1번째 아미노산 잔기=S, G, F 또는 없음,
    2번째 아미노산 잔기=D, G, A, S, P, 호모시스테인 또는 없음,
    3번째 아미노산 잔기=S, D, T, N, E 또는 R,
    15번째 아미노산 잔기=S, T 또는 D,
    16번째 아미노산 잔기=H, G, Y, T, N, D, F, 호모시스테인 또는 없음,
    17번째 아미노산 잔기=Y, F, H, M 또는 없음
    인, 고상 담체.
  5. 제4항에 있어서, 상기 펩타이드가 이하의 1)~14) 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어지는, 단 Xaa1은 아르기닌 잔기, 라이신 잔기, 류신 잔기 또는 아스파라긴 잔기이고, Xaa2는 호모시스테인인, 고상 담체:
    1) DCAYH(Xaa1)GELVWCT(서열 번호 1)
    2) GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(서열 번호 2)
    3) RCAYH(Xaa1)GELVWCS(서열 번호 3)
    4) GPRCAYH(Xaa1)GELVWCSFH(서열 번호 4)
    5) SPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(서열 번호 5)
    6) GDDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(서열 번호 6)
    7) GPSCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(서열 번호 7)
    8) GPDCAYH(Xaa1)GELVWCSFH(서열 번호 8)
    9) GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTHH(서열 번호 9)
    10) GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY(서열 번호 10)
    11) SPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY(서열 번호 11)
    12) SDDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY(서열 번호 12)
    13) RGNCAYH(Xaa1)GQLVWCTYH(서열 번호 13)
    14) G(Xaa2)DCAYH(Xaa1)GELVWCT(Xaa2)H(서열 번호 14).
  6. 제1항에 있어서, 상기 펩타이드가 하기 식 IV:
    D-C-(Xaa3)-(Xaa4)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-T (IV)
    (식 중,
    D는 아스파라긴산 잔기이고,
    C는 시스테인 잔기이고,
    H는 히스티딘 잔기이고,
    Xaa1은 아르기닌 잔기, 라이신 잔기, 류신 잔기 또는 아스파라긴 잔기이고,
    G는 글리신 잔기이고,
    Xaa2는 글루탐산 잔기 또는 아스파라긴 잔기이고,
    L은 류신 잔기이고,
    V는 발린 잔기이고,
    W는 트립토판 잔기이고,
    T는 트레오닌 잔기이고,
    Xaa3은 알라닌 잔기 또는 트레오닌 잔기이고, 또한
    Xaa4는 티로신 잔기 또는 트립토판 잔기이다.)에 의해 표시되는, 13 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열을 포함하는, 고상 담체.
  7. 제6항에 있어서, 상기 펩타이드가 이하의 1)~4) 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어지는, 단 Xaa1은 아르기닌 잔기, 라이신 잔기, 류신 잔기 또는 아스파라긴 잔기인, 고상 담체:
    1) DCTYH(Xaa1)GNLVWCT(서열 번호 15)
    2) DCAYH(Xaa1)GNLVWCT(서열 번호 16)
    3) DCTYH(Xaa1)GELVWCT(서열 번호 17)
    4) DCAWH(Xaa1)GELVWCT(서열 번호 18).
  8. 인간 IgG와 결합 가능한 것을 특징으로 하는 펩타이드를 고정화한 고상 담체로서,
    상기 펩타이드가 하기 식 V:
    D-C-(Xaa2)-(Xaa3)-(Xaa4)-(Xaa1)-G-(Xaa5)-L-(Xaa6)-W-C-T (V)
    (식 중,
    D는 아스파라긴산 잔기이고,
    C는 시스테인 잔기이고,
    G는 글리신 잔기이고,
    L은 류신 잔기이고,
    W는 트립토판 잔기이고,
    T는 트레오닌 잔기이고,
    Xaa1은 아르기닌 잔기, 라이신 잔기, 류신 잔기 또는 아스파라긴 잔기이고,
    Xaa2는 알라닌 잔기, 세린 잔기 또는 트레오닌 잔기이고,
    Xaa3은 트립토판 잔기 또는 티로신 잔기이고,
    Xaa4는 히스티딘 잔기, 아르기닌 잔기, 세린 잔기 또는 트레오닌 잔기이고,
    Xaa5는 글루탐산 잔기, 아스파라긴 잔기, 아르기닌 잔기 또는 아스파라긴산 잔기이고, 또한
    Xaa6은 이소류신 잔기 또는 발린 잔기이다)에 의해 표시되는, 13 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 상기 펩타이드의 외측의 2개의 시스테인 잔기 중의 설파이드기가 이하의 식:
    Figure 112022063319651-pct00017

    로 표시되는 링커로 이루어지는 군으로부터 선택되는 링커에 의해 연결되어 있으며, 여기서 R은 치환되지 않은 C1~C6 알킬인, 고상 담체.
  9. 제1항에 있어서, Xaa1이 아르기닌 잔기, 라이신 잔기 또는 류신 잔기인, 고상 담체.
  10. 제1항에 있어서, 상기 펩타이드가 이하의 아미노산 서열로 이루어지는, 고상 담체:
    GPDCAYHRGELVWCTFH(서열 번호 31).
  11. 제1항에 있어서, 상기 링커가
    Figure 112020093166269-pct00018

    로 표시되는 링커인, 고상 담체.
  12. 제1항에 있어서, 상기 펩타이드의 N 말단이 PEG화되어 있는, 고상 담체.
  13. 제1항에 있어서, 상기 펩타이드의 C 말단이 아미드화되어 있는, 고상 담체.
  14. 제1항에 있어서, 상기 펩타이드가 다량체화되어 있는, 고상 담체.
  15. 제14항에 있어서, 상기 펩타이드의 다량체가 당해 펩타이드 사이에 스페이서를 갖는, 고상 담체.
  16. 제1항에 있어서, 상기 펩타이드와 고상 사이에 스페이서를 갖는, 고상 담체.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 기재한 고상 담체를 포함하는, IgG 분리용 컬럼.
  18. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 기재한 고상 담체 또는 상기 고상 담체를 포함하는 IgG 분리용 컬럼을 포함하는, IgG의 정제를 위한 키트.
  19. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 기재한 고상 담체 또는 상기 고상 담체를 포함하는 IgG 분리용 컬럼에 IgG를 결합시키는 공정, 및
    결합한 IgG를 용출시켜 IgG를 회수하는 공정을 포함하는, IgG의 정제 방법.
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