JP6024101B2 - 血液凝固因子又は細胞接着因子に対する吸着剤及び精製方法 - Google Patents
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Description
また、タンパク質をリガンドとするアフィニティークロマトグラフィーでは、そのリガンド材料に動物由来材料が混入する場合があり、その安全性の問題もある。すなわち、近年狂牛病等の人畜共通感染症への懸念から、例えばウシ由来のゼラチンをリガンドとして用いることは避けたいという需要があり、動物由来材料に替わるリガンド材料が求められている。
さらに、タンパク質をリガンドとするアフィニティークロマトグラフィーでは、リガンドと対象物質との高い親和性ゆえに、対象物質の回収条件が必ずしも温和なものとならない場合がある。例えば、前述のプロテインA固定化ゲルから免疫グロブリンを溶出させる場合に酸性条件(例えばpH3)を要したり、ゼラチン固定化ゲルからフィブロネクチンを溶出させる場合に8M 尿素、1M NaBr又はアルギニン等を使用したりすることがある(非特許文献1)。このような厳しい溶出条件のもとでは、対象物質のタンパク質が変性するおそれや、溶出に使用する尿素やアルギニン等の試薬が高濃度でコストがかかる点や、溶出工程後に中和等の処理を要しそのコストや煩雑さが問題となる。
このように、タンパク質の精製においては、対象物質との高い親和性と劣化しにくさを有しつつ、温和な条件で、簡便な手順で、かつ安価で安全に、タンパク質を精製できるアフィニティーリガンドが求められている。
天然コラーゲンは種々の生体分子と結合したり、血小板凝集能を有したりすることが知られている。これまでに天然コラーゲン中の特定のアミノ酸配列に対して特定のタンパク
質等の分子が結合したりすることが分かっている(非特許文献3)。このような知見を利用して特定の対象分子に結合するコラーゲン様ペプチドを創出する研究も行われており、例えばフォン・ウィルブランド因子等のコラーゲン結合分子と結合する特定のアミノ酸配列を有するコラーゲン様ペプチドが開示されている(非特許文献2)。
また、コラーゲン様ペプチドとして創出されたものとしてPro−X−Gly(XはPro又はHyp)の配列の繰り返し構造を有するポリペプチドがある。このポリペプチドは血小板凝集能を有することが分かっており(非特許文献4)、これを含む血小板凝集惹起物質が開示されている(特許文献1)。しかしながら、上記配列の繰り返し構造を有するポリペプチドフラグメントが、フィブロネクチンやフォン・ウィルブランド因子等と高い親和性で結合することは知られていなかった。
すなわち、本発明は以下の通りである。
[1]式(1)で示されるペプチドフラグメントを有するポリペプチドを含有することを特徴とする、血液凝固因子又は細胞接着因子に対する吸着剤(以降、本発明の吸着剤と記す)。
―(Pro−Hyp−Gly)n― (1)
(式(1)中、nは2〜9000の整数である。)
[2]前記血液凝固因子又は細胞接着因子が、フォン・ウィルブランド因子、フィブロネクチン、グリコプロテインVI(GPVI)、インテグリン、ヒートショックプロテイン47、およびビトロネクチンから選択される、[1]に記載の吸着剤。
[3]前記ポリペプチドの重量平均分子量が570〜700万である、[1]又は[2]に記載の吸着剤。
[4][1]〜[3]のいずれかに記載の吸着剤を固定化した固相担体。
[5]試料溶液中の血液凝固因子又は細胞接着因子を精製する方法であって、
[1]〜[3]のいずれかに記載の吸着剤又は[4]に記載の固相担体に、前記試料溶液を接触させて前記血液凝固因子又は細胞接着因子を前記吸着剤に吸着させる吸着工程を含む方法(以降、本発明の精製方法と記す)。
[6]さらに前記吸着工程後の吸着剤又は固相担体に溶出剤を含む溶出液を接触させて前記血液凝固因子又は細胞接着因子を溶出させる溶出工程を含む、[5]に記載の方法。
[7]前記血液凝固因子又は細胞接着因子が、フォン・ウィルブランド因子、フィブロネクチン、グリコプロテインVI(GPVI)、インテグリン、ヒートショックプロテイン47、およびビトロネクチンから選択される、[5]又は[6]に記載の方法。
[8]前記試料が血漿である、[5]〜[7]のいずれかに記載の方法。
[9]前記溶出剤が、NaCl、KCl、MgCl2、CaCl2、Na2SO4、NaBr、KBr、酢酸ナトリウム、トリス塩酸塩、リン酸塩、グアニジン塩、アルギニンおよびその塩、並びに尿素から選ばれる、[6]〜[8]のいずれかに記載の方法。
したがって、本発明によれば、対象物質との高い親和性と劣化しにくさを有しつつ、温和な条件で、簡便な手順で、かつ安価で安全に、血液凝固因子や細胞接着因子を精製する方法が提供される。
Ala:L−アラニン残基
Arg:L−アルギニン残基
Asn:L−アスパラギン残基
Asp:L−アスパラギン酸残基
Cys:L−システイン残基
Gln:L−グルタミン残基
Glu:L−グルタミン酸残基
Gly:グリシン残基
His:L−ヒスチジン残基
Hyp:L−ヒドロキシプロリン残基
Ile:L−イソロイシン残基
Leu:L−ロイシン残基
Lys:L−リジン残基
Met:L−メチオニン残基
Phe:L−フェニルアラニン残基
Pro:L−プロリン残基
Sar:サルコシン残基
Ser:L−セリン残基
Thr:L−トレオニン残基
Trp:L−トリプトファン残基
Tyr:L−チロシン残基
Val:L−バリン残基
なお、本明細書におけるペプチド鎖のアミノ酸配列は、定法に従い、N末端のアミノ酸残基を左側に、C末端のアミノ酸残基を右側に位置させて記載する。
本発明の吸着剤に含有されるポリペプチドは、次式(1)で示されるペプチドフラグメ
ント(以降、ポリPHGと記す)を有する。
―(Pro−Hyp−Gly)n― (1)
ここでHypは、例えば4Hypであり、trans−4−ヒドロキシ−L−プロリンが好ましい。
なお、ポリペプチドが3重らせん構造をとっているか否かは、ポリペプチド溶液について円二色性スペクトルを測定することにより確認することができる。具体的には、波長220〜230nmに正のコットン効果、および波長195〜205nmに負のコットン効果を示す場合、そのポリペプチドは3重らせん構造をとっていると考えられる。
また、本発明の吸着剤に含有されるポリペプチド鎖どうしは、互いに架橋されていてもよい。
ここで、ポリペプチドの重量平均分子量は、例えば特開2003-321500号公報に記載されている、カラム:Superdex 200 HR 10/30(GEヘルスケア・ジャパン株式会社製)、流速:0.5mL/min、溶離液:150mMのNaClを含む10mMリン酸塩緩衝液(pH7.4))分子量標準としてGelFiltration LMW Calibration Kit及びGel Filtration HMW Calibration Kit(GEヘルスケア・ジャパン株式会社製)を使用したゲルパーミエーションクロマトグラフィーによる方法、あるいは、カラム:Superdex peptide PE 7.5/300(GEヘルスケア・ジャパン株式会社製)、流速:0.25mL/min、溶離液:150mMのNaClを含む10mMリン酸塩緩衝液(pH7.4))、分子量標準としてGel Filtration LMW Calibration Kit(GEヘルスケア・ジャパン株式会社製)とヒトインシュリン、グリシンを用いたゲルパーミエーションクロマトグラフィーによる方法により測定することができる。別の方法として、カラム:TSK-GEL6000PW XL-CP 8.0 x 300mm(東ソー製)、移動相20mM KH2PO4・H3PO4(pH3.0):MeOH=8:2、カラム温度40℃、流速0.5mL/min、検出はUVモニターによる215nm及び示差屈折系、分子量標準として分子量50000から1600000のプルラン(昭和電工製)および分子量11900000のデキストラン(Polymer Standards Service GmbH)によるHPLCゲルパーミエーションクロマトグラフィーにより測定できる。また、このHPLCゲルパーミエーションクロマトグラフィーの検出器にWyatt Technology社のDAWN HELEOS、Optolab rEXを用いる事で、ゲル浸透クロマトグラフ/多角度レーザー光散乱検出器 (GPC-MALS)法としても測定する事ができる。本明細書においてポリペプチドの重量平均分子量は、これらの方法によって測定された値である。
よいが、3重らせん構造の安定性を損なわず、また本発明の効果を損なわない範囲において、ポリPHGの他にアミノ酸残基もしくはペプチドフラグメントまたはアルキレンを含んでもよい。
アミノ酸残基としては、Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Hyp、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Sar、Ser、Thr、Trp、Tyr、Valから選択された少なくとも1種が挙げられる。ペプチドフラグメントとしては、前記アミノ酸残基の1種以上が複数個結合したペプチドが挙げられる。アルキレンとしては、直鎖状、分岐状のいずれでもよく、特に限定されるものではないが、具体的には炭素数1〜18のアルキレンが挙げられ、実用的には炭素数2〜12のアルキレンが好ましい。
本発明の吸着剤に含有されるポリペプチドは、ポリPHGとポリPHGの他のアミノ酸残基もしくはペプチドフラグメントまたはアルキレンを、重量比においてポリPHG:他のアミノ酸残基もしくはペプチドフラグメントまたはアルキレン他のペプチドフラグメント=1:99〜100:0、好ましくは10:90〜100:0の範囲で有する。
例えば、既知の固相合成法または液相合成法により取得したポリPHGを構成するアミノ酸からなるペプチドオリゴマーを用いて、縮合反応を行う方法により好ましく取得できる。
、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)−カルボジイミド塩酸塩(WSCI・HCl)、ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)等)、フルオロホスフェート系縮合剤(O−(7−アザベンゾトリアゾール−1−イル)−1,1,3,3−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート、O−ベンゾトリアゾール−1−イル−N,N,N′,N′−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート、ベンゾトリアゾール−1−イル−オキシ−トリス−ピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート、ベンゾトリアゾール−1−イル−トリス(ジメチルアミノ)ホスホニウムヘキサフルオロリン化物塩(BOP))等)、ジフェニルホスホリルアジド(DPPA)が例示できる。
これらの脱水縮合剤は単独で又は二種以上組み合わせて混合物として使用できる。好ましい脱水縮合剤は、カルボジイミド系縮合剤(例えば、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)−カルボジイミド、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)−カルボジイミド塩酸塩)である。
これらの縮合助剤も単独で又は二種以上組み合わせて使用できる。好ましい縮合助剤は、N−ヒドロキシジカルボン酸イミド類(HONSu等)、N−ヒドロキシベンゾトリアゾール又はN−ヒドロキシベンゾトリアジン類(HOBt等)である。
また、縮合反応に関与しない塩基を反応溶液に添加してもよい。縮合反応に関与しない塩基としては、第三級アミン類、例えば、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミンなどのトリアルキルアミン類、N−メチルモルホリン、ピリジンなどの複素環式第三級アミン類などが例示できる。このような塩基の使用量は、通常、本ペプチドオリゴマーの総モル数の1〜2倍程度の範囲から選択できる。
は本発明の吸着剤の血液凝固因子又は細胞接着因子に対する吸着能に影響するため、除去することが好ましい。残存している試薬の除去は、透析法、カラム法、限外ろ過法等の既知の手法を用いることができる。
保存溶媒としては、得られた有効成分ポリペプチドの物理的性質等の変化を抑えられるものであれば特に限定されない。例えば、水、生理食塩水、弱酸から弱アルカリに緩衝能を有するバッファーを挙げることができる。ただし、血液凝固因子や細胞接着因子に影響を与える物質を含有しないことが好ましい。
本発明の吸着剤は、血液等のタンパク質の混合物から血液凝固因子や細胞接着因子を精製あるいは除去したり、菌体や酵母等で製造した組換えタンパク質を精製したりできるため、目的とする血液凝固因子や細胞接着因子の精製や製造に好適に使用できる。
固定化は、固相担体に対して本発明の吸着剤を共有結合で固定することが、操作中の吸着剤の脱離を防ぐ観点から好ましい。共有結合による固定化は、例えば、上記固相担体の表面にエステル基、アルデヒド基、エポキシ基等の反応性基を導入し、本発明の吸着剤に含有されるポリペプチドのアミノ基や水酸基とのカップリング反応を固相担体表面で行う一般的な公知の方法により行うことができる。なお、表面に反応性基が導入された固相担体は市販のものが種々存在するので、これらを好適に利用できる。固相担体へのポリペプチドの固定化量は、本発明の効果を妨げない限りにおいて任意に設定することができる。
このような固定化固相担体は、例えばタンパク質精製キット等に含めて、後述する血液凝固因子又は細胞接着因子の精製方法に好適に用いることができる。
本発明の精製方法は、本発明の吸着剤又は本発明の吸着剤を固定化した固相担体に、前記試料溶液を接触させて前記血液凝固因子又は細胞接着因子を前記吸着剤に吸着させる吸着工程を含む。また、さらなる態様では、さらに前記吸着工程後の吸着剤又は固相担体に溶出剤を含む溶出液を接触させて前記血液凝固因子又は細胞接着因子を溶出させる溶出工程を含む。
本発明の精製方法では、試料溶液中の血液凝固因子又は細胞接着因子を精製することができる。特に、前記血液凝固因子又は細胞接着因子のうち、vWF、FN、GPVI、インテグリン、ヒートショックプロテイン47、ビトロネクチンを好ましく精製対象とすることができる。
また、前記試料としては、特に限定されないが、全血、血漿、細胞等の培養液、細胞抽出液、血清、体液、組み替え細胞の生産物等が挙げられ、特に血漿が好ましい。全血や血漿等の生体由来の試料の場合は、いずれの動物のものでも構わないが、ヒトのものに好ましく適用できる。
本発明の精製方法は、血液等のタンパク質の混合物からの血液凝固因子や細胞接着因子の精製あるいは除去や、菌体や酵母等で製造した組換えタンパク質の精製に適用できるため、目的とする血液凝固因子や細胞接着因子の精製や製造に好適に使用できる。
以下に、本発明の精製方法の各工程について説明する。
吸着工程においては、試料溶液を本発明の吸着剤に接触させることにより、血液凝固因子又は細胞接着因子を吸着剤に吸着させるが、これは本発明の吸着剤を固定化した固相担体を用いれば、操作を容易に行うことができる。例えば、そのような固定化担体を充填したカラムに試料溶液を通過させてもよく、その場合は吸着が十分に行われるように、試料溶液の通過速度や通過回数を適宜調整することができる。また、固定化担体を入れた容器(容器自体が固定化担体であってもよい)に試料溶液を入れ、吸着に十分な時間おいた後(溶液の攪拌はあってもなくてもよい)、試料溶液の除去等により固定化担体を回収してもよい。
吸着工程後は、必要に応じて、洗浄液、例えば濃度0.01〜0.5Mの塩又は尿素を含む緩衝液等で洗浄して、吸着剤に非特異吸着した分子や未吸着の分子を取り除いてもよい。
また、吸着工程は、特に限定されないが、2〜37℃の温度において行うことが好ましく、吸着剤やタンパク質の変性を防ぐ観点から4〜25℃がより好ましい。
本発明の精製方法においては、吸着工程で用いた溶液よりも溶出液の塩又は尿素の濃度を上昇させるという簡便な手段で、吸着剤に吸着している血液凝固因子又は細胞接着因子を溶出・回収することができる。これは、従来のアフィニティークロマトグラフィーに比べて、各段に温和な条件での精製を可能とするものであり、血液凝固因子又は細胞接着因子やリガンドとなるポリPHGを有するポリペプチドを劣化させるおそれがない。また、高価な試薬を大量に使用することもないため、非常に効率が良い。
溶出工程も前記吸着工程同様に、固定化した固相担体を用いれば、操作を容易に行うことができる。すなわち、吸着工程後の固定化担体を充填したカラムに溶出液を通過させてもよく、その場合溶出が十分に行われるように、溶出液の通過速度や通過回数を適宜調整することができる。また、吸着工程後の固定化担体を入れた容器(容器自体が固定化担体であってもよい)に溶出液を入れ、溶出に十分な時間おいた後(溶液の攪拌はあってもなくてもよい)、溶出液を回収してもよい。
また、溶出工程は、特に限定されないが、4〜25℃の温度において行うことが好ましい。
本発明の吸着剤であるポリPHG含有ポリペプチド又は比較のためのコラーゲンを、アフィニティーリガンドとしてゲル担体に公知の方法で固定化した。
<実施例1>
セルファインホルミル(JNC(株)製)を50mM炭酸ナトリウムで洗浄し、吸引ろ過して得られた洗浄ゲル4.3gを200mLの三角フラスコに入れ、さらに0.5重量%のポリPHG含有ポリペプチド水溶液を16g、50mM炭酸ナトリウムを6.4mL、水9.6mLを加えて、よく混合したのち、40℃で2時間振盪した。水素化ホウ素ナトリウム50mg/mL水溶液0.7mLを加えて、更に40℃で2時間振盪した。反応終了後、反応スラリーを吸引ろ過してゲルを回収した。ゲルに残存する未反応物などを除くために、50mM炭酸ナトリウム、塩酸水溶液(pH3)、純水で洗浄、吸引ろ過してポリPHG固定化ゲルを得た。
洗浄液中の残存ポリPHG含有ポリペプチド量を定量し、反応に用いたポリPHG含有ポリペプチドとの差から、固定化されたポリPHG含有ポリペプチドの量を算出した。洗浄液中のポリPHG含有ポリペプチド量は、210nmの吸光度から濃度を測定して算出した。
ここで用いたポリPHG含有ポリペプチドは、式(1)で示されるペプチドフラグメントのみで構成された重量平均分子量が約500万のポリペプチドであり、以降の実施例・比較例においても同様である。
セルファインホルミル(JNC(株)製)を50mM炭酸ナトリウムで洗浄し、吸引ろ過して得られた洗浄ゲル4.3gを200mLの三角フラスコに入れ、さらブタ皮膚精製コラーゲン溶液1%(日本ハム(株)製)を8g、50mM炭酸ナトリウム24mLを加えて、よく混合したのち、40℃で2時間振盪した。水素化ホウ素ナトリウム50mg/mL水溶液0.7mLを加えて、更に40℃で2時間振盪した。反応終了後、反応スラリーを吸引ろ過してゲルを回収した。ゲルに残存する未反応物などを除くために、50mM炭酸ナトリウム、塩酸水溶液(pH3)、純水で洗浄、吸引ろ過してコラーゲン固定化ゲルを得た。
洗浄液中の残存コラーゲン量を定量し、反応に用いたコラーゲンとの差から、固定化されたコラーゲンの量を算出した。洗浄液中のコラーゲン量は、210nmの吸光度から濃度を測定して算出した。
Shodex BIOACT gel EPOシリーズ(昭和電工(株)製)を乾燥重量で2.7gを量り、30mLの0.25重量%のポリPHG含有ポリペプチド、50mM炭酸ナトリウム溶液に加え、40℃で一夜振盪し反応させた。反応終了後、反応スラリーを吸引ろ過してゲルを回収した。ゲルに残存する未反応物などを除くために、50mM炭酸ナトリウム、塩酸水溶液(pH3)、純水で洗浄、吸引ろ過してポリPHG固定化ゲルを得た。
洗浄液中の残存ポリPHG含有ポリペプチド量を定量し、反応に用いたポリPHG含有ポリペプチドとの差から、固定化されたポリPHG含有ポリペプチドの量を算出した。洗浄液中のポリPHG含有ポリペプチド量は、210nmの吸光度から濃度を測定して算出
した。
反応温度を40℃から4℃に変えた以外は、実施例2と同様にした。
Shodex BIOACT gel EPOシリーズ(昭和電工(株)製)を乾燥重量で2.7gを量り、30mLの0.25重量%に希釈したブタ皮膚精製コラーゲン溶液(日本ハム(株)製)、50mM炭酸ナトリウム溶液に加え、40℃で一夜振盪し反応させた。反応終了後、反応スラリーを吸引ろ過してゲルを回収した。ゲルに残存する未反応物などを除くために、50mM炭酸ナトリウム、塩酸水溶液(pH3)、純水で洗浄、吸引ろ過してコラーゲン固定化ゲルを得た。
洗浄液中の残存コラーゲン量を定量し、反応に用いたコラーゲンとの差から、固定化されたコラーゲンの量を算出した。洗浄液中のコラーゲン量は、210nmの吸光度から濃度を測定して算出した。
反応温度を40℃から4℃に変えた以外は、比較例2と同様にした。
実施例1及び比較例1の固定化ゲル担体並びにゲル担体の原料である6重量%セルロース粒子(JNC(株)製)各1mLを、ポリプロピレン製のカラムに充填した。100mMのTris−HCl、pH7.5(TB)を5mL以上通液して平衡化した後、TBで10倍に希釈したPlasma,human(Sigma/P9523−5ML)5mLをカラムへ流した(1回)。その後、TBを5mL流して、吸着していない血漿成分を洗い流した(1回)。これらのカラム出口からの液は合わせて素通り・洗浄液として回収した。洗浄終了後に、1M NaClを含んだTBを5mLカラムに流し(1回)、そのカラム出口からの液は、溶出液として回収した。以上の操作は全て室温下(25℃)で行った。
素通り・洗浄液及び溶出液それぞれに含まれるFN及びvWFの各量をELISAによって測定した。
本発明の吸着剤は血漿中のFN及びvWFを効率よく吸着し、また1M NaClを含む溶出液により容易に吸着したFN及びvWFを回収することができた。特にvWFはコ
ラーゲンに比べて吸着剤への吸着量が多く、本発明の吸着剤がvWFへの親和性が高いことがわかった。また、特にFNは吸着剤への吸着量はコラーゲンと同程度であるものの、塩濃度を上昇させるだけの簡便な溶出操作のみで容易に回収できることがわかった。
溶出液を0.7Mアルギニン及び0.3MNaClを含んだTBに変更した以外は、前記吸着溶出実験1と同様に行った。素通り・洗浄液及び溶出液それぞれに含まれるFN量をELISAによって測定した。
表2及び表4より、FNの吸着量は実施例1と比較例1とで同程度であるが、その溶出条件において本発明の吸着剤が有利であることがわかった。すなわち、比較例1(コラーゲン)では1M NaClの条件では吸着したFNの34.4%しか溶出できず、0.7M アルギニン及び0.3M NaClの条件で99.2%溶出できた。それに対し、実施例1では、アルギニンを用いずとも1M NaClの温和な条件で吸着したFNの100%の回収が可能であった。
や細胞接着因子の精製やそれを用いたバイオ医薬品の製造に適用できるので、産業上非常に有用である。
Claims (7)
- 式(1)で示されるペプチドフラグメントを吸着部位として有するポリペプチドを含有することを特徴とする、フォン・ウィルブランド因子又はフィブロネクチンに対する吸着剤。
―(Pro−Hyp−Gly)n― (1)
(式(1)中、nは2〜9000の整数である。) - 前記ポリペプチドの重量平均分子量が570〜700万である、請求項1に記載の吸着剤。
- 請求項1又は2に記載の吸着剤を固定化した固相担体。
- 試料溶液中のフォン・ウィルブランド因子又フィブロネクチンを精製する方法であって、
請求項1又は2に記載の吸着剤又は請求項3に記載の固相担体に、前記試料溶液を接触させて前記フォン・ウィルブランド因子又はフィブロネクチンを前記吸着剤に吸着させる吸着工程を含む方法。 - さらに前記吸着工程後の吸着剤又は固相担体に溶出剤を含む溶出液を接触させて前記フォン・ウィルブランド因子又はフィブロネクチンを溶出させる溶出工程を含む、請求項4に記載の方法。
- 前記試料が血漿である、請求項4又は5に記載の方法。
- 前記溶出剤が、NaCl、KCl、MgCl2、CaCl2、Na2SO4、NaBr、KBr、酢酸ナトリウム、トリス塩酸塩、リン酸塩、グアニジン塩、アルギニンおよびその塩、並びに尿素から選ばれる、請求項5又は6に記載の方法。
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