ES2710025T3 - Esquemas de aislamiento y purificación secuencial de proteínas mediante cromatografía de afinidad - Google Patents

Abstract

Un procedimiento de aislamiento y purificación secuencial de proteínas que comprende (i) proporcionar una muestra de plasma, (ii) proporcionar ligandos que se unan, cada uno de ellos, específicamente a una proteína diana de la muestra biológica, donde cada uno de los ligandos está opcionalmente fijado a un soporte para formar complejos ligando-soporte, (iii) poner en contacto los ligandos o complejos ligando-soporte, secuencialmente y en un orden predeterminado, con la muestra de plasma para permitir que cada ligando o complejo ligando-soporte una selectivamente la proteína diana de la muestra de plasma, donde el orden predeterminado de puesta en contacto los ligandos o complejos ligando-soporte con la muestra de plasma deriva en la unión de plasminógeno antes de IgG y de IgG antes de albúmina, y donde, antes de dicha puesta en contacto, la muestra biológica no se procesa mediante una etapa de preacondicionamiento seleccionada del grupo que consiste en precipitación con alcohol, crioprecipitación, eliminación de lípidos y/o proteínas lipídicas, precipitación de euglobulina, o una combinación de las mismas, (iv) eluir la proteína diana unida a cada uno de los ligandos o complejos ligando-soporte, y (v) aislar la proteína diana secuencialmente de la muestra biológica.

Description

DESCRIPCION

Esquemas de aislamiento y purificacion secuencial de protemas mediante cromatograffa de afinidad

I. CAMPO DE LA INVENCION

Esta invencion se refiere a procedimientos de aislamiento de protemas a partir de muestras biologicas. En particular, la invencion se refiere a procedimientos para recuperar protemas altamente purificadas secuencialmente a partir de muestras biologicas, como se definen en las reivindicaciones.

II. ANTECEDENTES DE LA INVENCION

El procesamiento y desarrollo de protemas requiere un procesamiento de alta eficiencia con el mmimo numero de etapas y el maximo rendimiento para conseguir la pureza necesaria. Los procedimientos de separacion y purificacion de protemas presentan unos retos unicos debido a la variedad de protemas, la diferente naturaleza de los posibles contaminantes y/o impurezas asociados a la preparacion de cada protema, y la gran cantidad de protemas normalmente necesaria para la produccion de productos biofarmaceuticos. Las tecnologfas de purificacion convencionales generalmente implican una serie de etapas de purificacion con el objetivo de aislar una unica protema diana. Con cada etapa, se reduce el rendimiento y aumentan los costes de fabricacion. Los costes de separacion y purificacion de protemas habitualmente representan mas del 50 % de los costes totales de fabricacion de todas las protemas terapeuticas.

La cromatograffa de afinidad es una de las tecnicas de separacion mas importantes como base para el descubrimiento de farmacos y el desarrollo de procedimientos. Cuanto mas selectivas sean la una o mas etapas de afinidad, mayor eficiencia de todo el proceso, lo que representa un requisito cfftico en los experimentos de fraccionamiento de protemas. La cromatograffa de afinidad cuenta con cierto numero de aplicaciones practicas en la purificacion, deteccion y extraccion de moleculas diana de corrientes multicomponente. La cromatograffa de afinidad se basa en interacciones tridimensionales espedficas entre las moleculas diana y las entidades a las que se unen (es decir, los ligandos). Se pueden aislar o generar ligandos para que se unan de una forma espedfica y reversible a practicamente cualquier molecula diana. Los ligandos potenciales incluyen moleculas biologicas tales como protemas, anticuerpos y peptidos, y ligandos sinteticos disenados o seleccionados espedficamente. Se pueden generar bibliotecas de millones de ligandos potenciales usando tecnicas de smtesis combinatoria, muchas de las cuales se conocen bien en la tecnica (vease, por ejemplo, Lam y col., Nature: 354, 82-84 (1991)). Para ayudar a la separacion de moleculas diana de una muestra, los ligandos se pueden fijar a una matriz de soporte solida, tal como parffculas individuales (p. ej., lechos de resinas cromatograficas) o soportes contiguos (p. ej., distribuciones ordenadas). Los ligandos inmovilizados sobre una matriz de soporte solida pueden, a continuacion, emplearse para purificar dianas a partir de soluciones complejas. Quiza, el mayor logro de la cromatograffa de afinidad a escala se ha conseguido en el campo de la purificacion de anticuerpos monoclonales biofarmaceuticos. La demanda de resina de protema A es superior a 10000 litros anuales y aumenta un 50 % al ano, lo que representa un mercado de adsorbente de protema A de mas de 50 millones de dolares estadounidenses en 2002. El uso de la cromatograffa de inmunoafinidad permite la produccion de los factores de coagulacion VIII y IX, tanto derivados de plasma como recombinantes, asf como de otras protemas plasmaticas y productos biofarmaceuticos procedentes de fuentes naturales y recombinantes.

Una de las formas de la cromatograffa de afinidad moderna mas potentes para su uso en el procesamiento aguas abajo, sin embargo, no se basa en ligandos derivados de fuentes naturales tales como anticuerpos, sino en el uso de ligandos de afinidad sinteticos altamente estables. Vease, por ejemplo, Sproule y col., New Strategy for the Design of Ligands for the Purification of pharmaceutical proteins by affinity chromatography; J. Chromatography B, 740, 17-33 (2000J.Esta estrategia usa ligandos personalizados o disenados en lugar de utilizar compuestos comercialmente disponibles.

Entre las protemas plasmaticas aisladas en la tecnica, la albumina y la gammaglobulina se han destinado particularmente a fines medicinales. Los procedimientos empelados normalmente para aislar estas protemas plasmaticas se basaban en el procedimiento de precipitacion con etanol fffo desarrollado por E. J. Cohn y colaboradores durante los anos 40. Vease, Cohn y col., Preparation and Properties of Serum and Plasma Proteins. IV. A System for the Separation into Fractions of the Protein and Lipoprotein Components of Biological Tissues and Fluids; J. Am. Chem. Soc., 68, 459-475 (1946J. Este procedimiento fue desarrollado originalmente para producir albumina con alto rendimiento, pero no fue disenado para aislar y purificar la variada gama de protemas actualmente producidas a partir de plasma. En particular, mediante estas tecnicas, los rendimientos de los componentes menores de las protemas plasmaticas son invariablemente tan bajos que las tecnicas son inevitablemente ineficientes en terminos de rendimiento del fraccionamiento general. Vease, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 5.138.034 de Uemura y col.

La aplicacion de la cromatograffa de afinidad a la purificacion de albumina serica se conoce en la tecnica, vease, Harvey MJ., en: Curling JM (ed) Methods of Plasma Protein Fractionation. Academic Press London. pags. 189-200. La primera separacion de protemas a partir de plasma notificada data de aproximadamente hace 30 anos y afectaba a la deplecion de albumina serica humana (ASH) del plasma mediante cromatograffa para permitir la identificacion y purificacion de protemas de concentracion baja. Travis, J., y Pannell, R. Behring Inst. Mitt. 54: 30-32 (1974). Este trabajo se llevo a cabo utilizando un conjugado de dextrano Procion Blue-Sepharose® e identifico un problema inicial con la cromatograffa de afinidad con colorantes, es decir, la fuga del colorante al eluato. Los autores estaban interesados en el aislamiento de alfa-1-antitripsina a partir de plasma y describieron la diffcil separacion de esta protema de la albumina a alta fuerza ionica, a la que toda union por intercambio ionico no espedfica se encuentra en un mmimo.

Tambien se notifico el aislamiento de diversas otras protemas a partir de plasma. Por ejemplo, los procedimientos de la tecnica anterior describfan el aislamiento y purificacion de la protema plasmatica factor VIII y fracciones de fibronectina, vease, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.° 4.822.872; 4.093.608 y 4.565.651. Los procedimientos de aislamiento y purificacion de antitrombina-III se describen en, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 3.842.061. Los procedimientos de aislamiento y purificacion de plasminogeno se describen en, por ejemplo, Science: 170, 1095 (1970), las patentes de EE. UU. n.° 4.361.652 y 4.361.653). Los procedimientos de aislamiento y purificacion de inmunoglobulinas se describen, por ejemplo, en las patentes de EE. UU. n.° 4.371.520 y 4.093.606). Los procedimientos de aislamiento y purificacion de heptaglobulina se describen en, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.° 4.061.735 y 4.137.307). Estos procedimientos, sin embargo, carecen de la especificidad y selectividad necesarias para el aislamiento de protemas usadas en la produccion de multiples agentes biofarmaceuticos a partir del mismo material de partida, p. ej., plasma humano.

El documento WO0/48703 A1 describe un procedimiento de purificacion consecutiva de una o mas protemas diana (IgG) a partir de plasma humano no procesado. El documento no menciona union secuencial de plasminogeno antes de IgG y de IgG antes de albumina a los ligandos.

Aunque los procedimientos para aislar protemas a partir de muestras biologicas han proporcionado alguna mejora en la calidad del producto, en terminos de actividad espedfica y pureza mejoradas, y tambien en el rendimiento o la recuperacion, todavfa hay una necesidad de mejora adicional de los procedimientos para obtener un concentrado proteico, con alto rendimiento y alta pureza, con minimizacion de la reduccion de la actividad espedfica de las protemas aisladas asociada frecuentemente a los procedimientos de la tecnica anterior. Esto es particularmente cierto en situaciones en las que se afslan simultaneamente multiples dianas proteicas a partir de una fuente comun. Esta invencion resuelve estas y otras necesidades existentes desde hace tiempo proporcionando procedimientos que utilizan tecnicas de cromatograffa de afinidad para aislar y purificar diversas protemas eficientemente a partir de materiales biologicos, y particularmente a partir de plasma, combinando procedimientos de adsorcion en secuencias predeterminadas y definidas.

III. RESUMEN DE LA INVENCION

La invencion, como se describe y describe en este documento, proporciona procedimientos de aislamiento y purificacion secuencial de protemas a partir de muestras de plasma. Los procedimientos comprenden (i) proporcionar una muestra de plasma, (ii) proporcionar ligandos que se unan, cada uno de ellos, selectiva y espedficamente a una protema diana de la muestra biologica, donde cada uno de los ligandos esta opcionalmente fijado a un soporte para formar complejos ligando-soporte, (iii) poner en contacto los ligandos o complejos ligando-soporte, secuencialmente y en un orden predeterminado, con la muestra de plasma para permitir que cada ligando o complejo ligando-soporte una secuencialmente la protema diana de la muestra de plasma, donde el orden predeterminado de poner en contacto los ligandos o complejos ligando-soporte con la muestra de plasma deriva en la union de plasminogeno antes de IgG y de IgG antes de albumina, y donde, antes de dicha puesta en contacto, la muestra biologica no se procesa mediante una etapa de preacondicionamiento seleccionada del grupo que consiste en precipitacion con alcohol, crioprecipitacion, eliminacion de lfpidos y/o protemas lipfdicas, precipitacion de euglobulina, o una combinacion de las mismas, (iv) eluir la protema diana unida a cada uno de los ligandos o complejos ligando-soporte, y (v) aislar la protema diana secuencialmente de la muestra biologica. La etapa de preacondicionamiento comprende diversos procedimientos tales como, por ejemplo, precipitacion con alcohol, crioprecipitacion, eliminacion de lfpidos y/o protemas lipfdicas, precipitacion de euglobulina, o una combinacion de los mismos, entre otros.

En una realizacion, la protema diana comprende fibrinogeno (Fg), inhibidor de la proteinasa alfa-1 (A1PI), apolipoprotema A1 (ApoA1), inmunoglobulinas (IgG), paraoxonasa (PON), factores de coagulacion, factor de Von Willebrand (vWF), Factor VIII (FVIII), albumina serica humana (ASH), plasminogeno (Pg), o cualquier combinacion de los mismos.

En otra realizacion mas, la actividad de paraoxonasa se mantiene sustancialmente en la muestra biologica durante el aislamiento de protema.

En una realizacion, se afsla vWF/FVIII del plasma antes de plasminogeno.

En otra realizacion, se afsla apolipoprotema A1 del plasma antes de IgG.

En otra realizacion, se afsla plasminogeno del plasma antes de fibrinogeno.

El orden predeterminado de poner en contacto los dos o mas ligandos con la muestra biologica puede derivar en la union secuencial de vWF/FVIII, Pg, Fg, ApoA1/PON, IgG, ASH y A1PI en el orden indicado.

El orden predeterminado de poner en contacto los dos o mas ligandos con la muestra biologica puede derivar en la union secuencial de vWF/FVIII, ApoA1/ PON, Pg, Fg, IgG, ASH y A1PI en el orden indicado.

El orden predeterminado de poner en contacto los dos o mas ligandos con la muestra biologica puede derivar en la union secuencial de vWF/FVIII, IgG, ASH y A1PI en el orden indicado.

Los ligandos de la invencion comprenden moleculas a base de polipeptidos o acidos nucleicos, anticuerpos o fragmentos de union al antfgeno, moleculas no a base de polipeptidos o nucleotidos, mimeticos de carbohidratos, peptidomimeticos, moleculas pequenas, materiales inorganicos, colorantes, carbohidratos, lfpidos, o cualquier combinacion de los mismos.

En una realizacion, los ligandos son peptidos que comprenden de 1 a 15 aminoacidos.

En otra realizacion, los ligandos y/o complejos ligando-soporte comprenden ligandos de afinidad sinteticos tales como ligandos Mimetic Blue®, ligandos MAbsorbent®, ProMetic PBL 112-80, ProMetic PBL 112-81, ProMetic PBL 112-82 y ProMetic PBL 112-83.

El soporte comprende un material sintetico, un material natural, o ambos. Los ejemplos de soportes incluyen agarosa, poliacrilamida, dextrano, celulosa, polisacarido, nitrocelulosa, sflice, alumina, oxido de aluminio, dioxido de titanio, oxido de titanio, circona, estireno, difluoruro de polivinilo, nailon, copolfmero de estireno y divinilbenceno, ester de polimetacrilato, metacrilato de hidroxietilo, acnlico, alcohol polivimlico, polietilenglicol, polfmero o copolfmero de azlactona derivatizada, vidrio, celulosa, agarosa, derivados de cualquiera de los anteriores, y combinaciones de cualquiera de los anteriores.

En una realizacion preferida, el soporte es un lecho de polisacarido o resina.

El plasma se puede purificar sustancialmente con una pureza de al menos un 70 %.

La preparacion se puede purificar sustancialmente, libre de impurezas causadas por el inmunoadsorbente, y someter a al menos una etapa de inactivacion de patogenos.

En otra realizacion mas, la muestra de plasma se trata mediante un agente tamponador antes de la etapa de puesta en contacto con el fin de conservar adicionalmente la concentracion y actividad de uno o mas agentes diana en la muestra de plasma.

La preparacion puede formularse en forma de una composicion farmaceutica.

Estos y otros aspectos y realizaciones de la invencion se describen en detalle en este documento.

IV. DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION

En este documento se describen procedimientos para el aislamiento y la purificacion eficientes de protemas a partir de muestras de plasma. En particular, la presente invencion describe procedimientos de purificacion secuencial de protemas a partir de plasma usando cromatograffa de afinidad. Los procedimientos de purificacion secuencial de protemas de la presente invencion usan dos o mas ligandos, cada ligando esta opcionalmente fijado a un soporte para formar un complejo ligando-soporte. Cada ligando o complejo ligando-soporte se une selectiva y espedficamente a una protema plasmatica diana en un orden predeterminado para permitir que cada ligando o complejo ligando-soporte una secuencialmente una protema diana del plasma.

Los procedimientos de aislamiento y purificacion secuencial de protemas de la invencion son altamente espedficos y no requieren preacondicionamiento espedfico del plasma, como se usaba rutinariamente en la tecnica anterior, antes de la puesta en contacto con el ligando. Tal etapa de preacondicionamiento no incluye tamponamiento o filtracion general. La etapa de preacondicionamiento dentro del alcance de la invencion incluye, por ejemplo, procedimientos y procesamientos tales como precipitacion con alcohol, crioprecipitacion, eliminacion de lfpidos y/o protemas lipfdicas, precipitacion de euglobulina, o una combinacion de los mismos, entre otros. En este documento, se entiende que las etapas de preacondicionamiento antes mencionadas quedan espedficamente excluidas de la invencion reivindicada. Los procedimientos de purificacion de protemas plasmaticas de la presente invencion son muy valiosos en la produccion de productos biofarmaceuticos gracias a su capacidad para producir protemas plasmaticas sustancialmente puras y altamente activas de forma eficiente y rapida. Los procedimientos de la presente invencion tambien son utiles en una variedad de otras aplicaciones, que incluyen el pronostico, el diagnostico y/o la deteccion de anomalfas.

1. Definiciones

Como se usa en este documento, «muestra» incluye cualquier muestra de plasma que contenga una protema diana que se pueda aislar y purificar mediante el procedimiento de la invencion.

Como se usa en este documento, «cultivo celular» incluye cualquier cultivo procariota o eucariota tal como, por ejemplo, cultivo bacteriano, de levaduras y de otras celulas microbiologicas, cultivo de celulas de mairnfero, cultivo de celulas vegetales y cultivo de insectos, caldos de fermentacion y otros cultivos celulares usados para la produccion y el suministro de productos biofarmaceuticos y la preparacion de productos terapeuticos.

Como se usa en este documento, «plasma» se refiere a componentes de la sangre lfquidos e incluye derivados del plasma y composiciones que contienen plasma.

Como se usa en este documento, «fijacion» se define en general dentro del alcance de la invencion e incluye cualquier tipo de procedimiento de union ffsico, qmmico o biologico entre dos entidades e incluye, por ejemplo y no de forma limitante, absorcion, adsorcion, enlace covalente, intercambio ionico, hidrofobico, enlace de hidrogeno, interaccion entre dipolos, cuadrupolos o por afinidad, formacion de especies cargadas, la fijacion de ligandos de afinidad (p. ej., incluyendo peptidos, oligonucleotidos, protemas, brazos espaciadores, restos hidrofobicos y materiales fluorados), entre otros.

Como se usa en este documento, «ligandos» se define en general dentro del alcance de la invencion e incluye entidades qmmicas o biologicas que se unen a una protema diana. Los ligandos son compuestos, moleculas, celulas y componentes celulares que se unen a una protema diana y pueden aislarse a partir de materiales naturales o producidos sinteticamente. Los ligandos pueden ser endogenos o exogenos a un procariota o eucariota. Los ligandos incluyen peptidos, polipeptidos, peptidomimeticos, moleculas pequenas, colorantes, compuestos que contienen triazina, anticuerpos o fragmentos de union al antfgeno, moleculas a base de acidos nucleicos, moleculas no a base de polipeptidos o nucleotidos, carbohidratos, mimeticos de carbohidratos, lfpidos, materiales inorganicos, inhibidores, sustratos o cualquier combinacion de los mismos.

Como se usa en este documento, «sustancialmente purificada» o «sustancialmente libre» se refiere a protemas que se han retirado de su entorno natural y se han aislado o separado, y estan al menos aproximadamente un 70 % libres, preferentemente aproximadamente un 85 % libres, mas preferentemente aproximadamente un 95 %, y lo mas preferentemente aproximadamente un 99 % o mas libres de otros componentes con los que estan asociadas de forma natural.

Como se usa en este documento, «moleculas a base de polipeptidos» incluye todas las protemas, polipeptidos o fragmentos peptfdicos, peptidos naturales, peptidos recombinantes, peptidos sinteticos, fragmentos biologicamente activos, polipeptidos sustancialmente homologos, oligopeptidos, homodfmeros, heterodfmeros, variantes de los polipeptidos, polipeptidos modificados, derivados, analogos, protemas de fusion, agonistas, antagonistas y anticuerpos, entre otros.

Como se usa en este documento, «moleculas pequenas» incluye carbohidratos, mimeticos de carbohidratos, peptidomimeticos, compuestos organicos o inorganicos (es decir, incluyendo compuestos heteroorganicos y organometalicos) que tengan un peso molecular inferior a aproximadamente 10000 gramos por mol, compuestos organicos o inorganicos que tengan un peso molecular inferior a aproximadamente 5000 gramos por mol, compuestos organicos o inorganicos que tengan un peso molecular inferior a 1000 gramos por mol, compuestos organicos o inorganicos que tengan un peso molecular inferior a 500 gramos por mol, y sales, esteres y otras formas qmmicamente aceptables de tales compuestos.

Como se usa en este documento, por el termino «patogeno» se entiende cualquier agente replicable que pueda encontrarse en una muestra biologica, tal como una muestra de sangre, o infectar un organismo. Tales patogenos incluyen los diversos virus, bacterias, protozoos y parasitos conocidos por los expertos en la materia que se encuentran generalmente en, o infectan, la sangre total o componentes de la sangre y otros contaminantes patogenos aun no conocidos. Los ejemplos ilustrativos de tales patogenos incluyen bacterias, tales como especies de Streptococcus, especies de Escherichia y especies de Bacillus; virus, tales como virus de la inmunodeficiencia humana y otros retrovirus, virus del herpes, paramixovirus, citomegalovirus, virus de la hepatitis (incluyendo hepatitis A, hepatitis B y hepatitis C), poxvirus y togavirus; y parasitos, tales como parasitos malaricos, incluyendo especies Plasmodium, y parasitos tripanosomicos.

Generalmente, un experto en la tecnica aplicable entendera otros terminos usados en el campo de la purificacion de protemas como se usan en este documento.

En una realizacion, la invencion proporciona procedimientos de extraccion de protemas plasmaticas espedficas del plasma. Estos procedimientos utilizan resinas cromatograficas a las que se fijan ligandos selectivos y espedficos para dos o mas protemas plasmaticas. Las resinas se ponen en contacto con plasma, contacto que deriva en la union selectiva de la protema diana con el ligando. La protema diana puede, a continuacion, eluirse con una alta recuperacion y pureza. Por tanto, de acuerdo con el procedimiento de la presente invencion, el plasma se puede fraccionar eficientemente en diversas protemas plasmaticas que lo componen. Las secuencias preferidas para la extraccion y posterior aislamiento de protemas plasmaticas espedficas se describen en este documento.

Las protemas plasmaticas dentro del alcance de la invencion incluyen todas y cada una de las mas de 10000 protemas diferentes presentes en el plasma, incluyendo, por ejemplo y no de forma limitante, butirilcolinesterasa (BChE), factores de la coagulacion sangumea (p. ej., fibrinogeno, factor II, factor V, factor VII, factor VIII, factor IX, factor X, factor XI y factor XII), fibronectina, protrombina, protema C, plasminogeno, antitrombina-III, haptoglobina, transferrina, albumina, inhibidor de la proteinasa alfa-1, apolipoprotema A1 (tambien conocida como lipoprotema Apo-A1), inmunoglobulinas, paraoxonasa, factor de Von Willebrand (vWF), todas las cuales se encuentran de forma natural en el plasma de un organismo en estado sano.

Como alternativa, la protema plasmatica dentro del alcance de la invencion esta presente en plasma asociado a un estado enfermo, la cual puede o no encontrarse en el plasma de un sujeto sano. Tambien quedan abarcadas dentro del alcance de la invencion las protemas plasmaticas que estan presentes en el plasma como consecuencia de la administracion de un agente, p. ej., un farmaco. A este respecto, la protema plasmatica puede ser una protema prionica PrPsc.

1. Ligandos

El procedimiento de purificacion de protemas de la invencion utiliza dos o mas ligandos que estan fijados a un sistema de soporte. Los ligandos pueden comprender uno o mas grupos funcionales para proporcionar interacciones ionicas, hidrofobicas, por enlaces de hidrogeno o de Van der Waal's con los correspondientes grupos de la biomolecula que se va a separar. Los ligandos adecuados para el procedimiento inventivo incluyen compuestos qmmicos sinteticos que se producen, por ejemplo, por medio de smtesis directa, o bibliotecas de diversidad, tales como bibliotecas peptfdicas o no peptfdicas aleatorias o combinatorias. Otras bibliotecas conocidas en la tecnica incluyen bibliotecas sintetizadas qmmicamente, bibliotecas recombinantes (p. ej., bibliotecas de expresion en fago) y bibliotecas basadas en traduccion in vitro. Las bibliotecas se pueden cribar para encontrar moleculas que se unan espedficamente a una protema diana de la invencion.

Ejemplos de bibliotecas sintetizadas qmmicamente se describen, por ejemplo, en Fodor y col., Science 251:767-773 (1991) ; Houghten y col., Nature 354:84-86 (1991); Brenner y Lemer, Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 89:5381-5383 (1992) y la patente de EE. UU. n.° 6.117.996,entre otros. Ejemplos de bibliotecas de expresion en fago se describen, por ejemplo, en Scott y Smith, Science 249:386-390 (1990); Devlin y col., Science 249:404-406 (1990) y Christian y col., J. Mol. Biol. 227:711-718 (1992), entre otros. Bibliotecas basadas en traduccion in vitro se describen, por ejemplo, en Mattheakis y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 91:9022-9026 (1994), entre otros.

En una realizacion, el ligando de la invencion es un peptido que consiste esencialmente en de 3 a 5, 8, 10 o 15 aminoacidos. Los aminoacidos son D y/o L-aminoacidos. El peptido se puede seleccionar convenientemente de cualquier biblioteca peptidica, incluyendo bibliotecas peptidicas aleatorias, bibliotecas peptidicas combinatorias, o bibliotecas peptidicas sesgadas. El termino «sesgada» se usa en este documento para indicar que el procedimiento de generar la biblioteca se manipula con el fin de restringir uno o mas parametros que gobiernan la diversidad de la coleccion de moleculas resultante.

En las bibliotecas peptfdicas, el numero de peptidos discretos de secuencias diferentes aumenta drasticamente con el numero de reacciones de acoplamiento realizadas, el tamano del peptido y el numero de aminoacidos distintos utilizados. Por ejemplo, la incorporacion aleatoria de 19 aminoacidos en pentapeptidos produce hasta 2476099 (195) peptidos individuales de secuencia diferente (Lam y col., arriba). Los procedimientos combinatorios permiten la generacion de bibliotecas de ligandos directamente sobre un soporte. Habitualmente, los ligandos se sintetizan sobre partmulas de soporte de tal forma que se sintetizan multiples copias de un unico ligando sobre cada partmula (p. ej., lecho), aunque esto no es necesario en el contexto de la invencion.

Otro ejemplo de una biblioteca que puede usarse, en la que las funcionalidades amida de los peptidos se han permetilado para generar una biblioteca combinatoria transformada qmmicamente, es descrito por Ostresh y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 91:11138-11142 (1994).

Las bibliotecas no peptfdicas pueden clasificarse en general en dos tipos: monomeros y oligomeros decorados. Las bibliotecas de monomeros decorados emplean una estructura de armazon relativamente sencilla sobre la que se anade una variedad de grupos funcionales. Con frecuencia, el armazon sera una molecula con una actividad farmacologica util conocida. Por ejemplo, el armazon podna ser la estructura de la benzodiacepina.

Las bibliotecas de oligomeros no peptfdicas utilizan un gran numero de monomeros que se juntan de modos que crean nuevas formas que dependen del orden de los monomeros. Entre las unidades de monomero que se han usado estan los carbamatos, las pirrolinonas y los morfolinos. Los peptoides, y oligomeros similares a peptidos en los que la cadena lateral esta fijada al grupo amino alfa en lugar de al carbono alfa, constituyen la base de otra version de bibliotecas de oligomeros no peptfdicas. Las primeras bibliotecas de oligomeros no peptfdicas utilizaban un unico tipo de monomero y, por tanto, conteman una cadena principal repetitiva. Las bibliotecas recientes han utilizado mas de un monomero, aportando a las bibliotecas una flexibilidad anadida.

Otras bibliotecas no peptfdicas que son utiles en la presente invencion son, por ejemplo, las bibliotecas descritas por Ecker y Crooke, Bio/Technology 13:351-360 (1995). Estas bibliotecas que usan compuestos tales como, por ejemplo, benzodiacepinas (vease, p. ej. Bunin y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 91:4708-4712 (1994)) se pueden adaptar para su uso. Adicionalmente, tambien se pueden usar bibliotecas de peptoides (p. ej., Simon y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 89:9367-9371 (1992)). Otros compuestos usados en bibliotecas peptfdicas incluyen hidantomas, piperazinadionas, bifenilos, analogos de azucares, beta-mercaptocetonas, acidos arilaceticos, acilpiperidinas, benzopiranos, cubanos, xantinas, aminimidas y oxazolonas, entre otros.

El cribado de las bibliotecas se puede conseguir mediante cualquiera de una variedad de procedimientos comunmente conocidos. Vease, p. ej., la bibliograffa siguiente, que describe el cribado de bibliotecas peptidicas:Parmley y Smith, Adv. Exp. Med. Biol. 251:215-218 (1989); Scott y Smith, id.; Fowlkes y col., BioTechniques 13:422-427 (1992); Oldenburg y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 89:5393-5397 (1992) y Yu y col., Cell 76:933-945 (1994), entre otros. El cribado para identificar una molecula que une una protema diana tambien se puede llevar a cabo poniendo en contacto los miembros de la biblioteca con la protema diana inmovilizada sobre una fase solida y recolectando los miembros de la biblioteca que se unen a la protema de interes. Ejemplos de tales procedimientos de cribado, denominados tecnicas de seleccion por afinidad o «panning», se describen a modo de ejemplo en Fowlkes y col. id. Preferentemente, los ligandos de la invencion se disenan mediante modelado y qrnmica combinatoria e incluyen ligandos sinteticos/biomimeticos que pueden ser moleculas simetricas o asimetricas, sencillas o ramificadas. Los ligandos preferentemente son resistentes a los alcalis y resisten los procedimientos de regeneracion alcalina y desinfeccion normales. Los ligandos de la invencion tienen perdidas muy bajas, son seguros y poseen una alta capacidad de union y especificidad a la protema diana.

Los ligandos o sistemas de soporte y ligandos preferidos usados dentro del alcance de la invencion incluyen, a modo de ejemplo y no de limitacion, ligandos Mimetic Blue® (para columnas de ASH), y la resina se denomina Mimetic Blue® SAHL P6XL; ligandos MAbsorbent® (para la union de IgG), y el adsorbente se denomina MAbsorbent® A2P; adsorbente ProMetic PBL 112-80 para A1PI; adsorbente ProMetic PBL 112-81 para fibrinogeno; adsorbente ProMetic PBL 112-82 para plasminogeno; adsorbente ProMetic PBL 112-83 para vWF/Factor VIII; ECH-Lys-Sepharose FF, n.° de lote 243526; resina SAHL P6XL; y resinas de ligandos peptfdicos que incluyen ARQFDF (SEQ ID NO: 1). Los adsorbentes antes mencionados usan Purabead 6XL (agarosa reticulada) como matriz de soporte. Las matrices de soporte Purabead 6 o 6XL no adsorben estas protemas por sf mismas.

2. Soporte

En una realizacion del procedimiento inventivo, el lijando esta fijado a un soporte. El termino «soporte», como se usa en este documento, se refiere a cualquier matriz de soporte, tal como los soportes solidos conocidos en la tecnica, que sirva para inmovilizar el ligando. Un soporte o matriz de soporte es cualquier sustancia solida o lfquida, porosa o no porosa, bidimensional o tridimensional, a la que se puede fijar un ligando y que proporciona un medio conveniente de separacion del ligando de los solutos en una solucion de puesta en contacto. Preferentemente, el soporte es inerte despues de la fijacion del ligando de tal forma que se minimiza la reaccion covalente con la diana.

Tambien se incluye dentro del alcance de la invencion el uso de brazos espaciadores para el acoplamiento de los ligandos al soporte. Los brazos espaciadores pueden tomar una amplia variedad de formas diferentes, incluyendo materiales hidroxilados como polietilenglicoles, oxidos de polietileno, alcanos lineales o ramificados, diaminas, glicoles, anillos aromaticos y carbohidratos o cualquier combinacion de los mismos, entre otros.

En una realizacion, la matriz de soporte comprende partmulas porosas que tienen capacidad de adsorcion o absorcion del agente diana. Las partmulas estan opcionalmente revestidas con uno o mas materiales para modificar las propiedades superficiales de la matriz de soporte, dichos materiales tienen o no capacidad de hinchamiento en fluidos organicos o fluidos acuosos y son sustancialmente insolubles en agua o fluidos.

Una matriz de soporte preferida usada con el esquema de purificacion secuencial de protemas de la presente invencion es una partmula porosa. Se comercializan partmulas porosas de una gran variedad de materiales diferentes para separaciones por adsorcion, incluyendo sflice, vidrio, celulosa, agarosa y una amplia variedad de polfmeros diferentes, incluyendo poliestireno, polimetilmetacrilato, poliacrilamida, agarosa, hidrogel, resinas acnlicas y otros tipos de geles usados para electroforesis. Muchas de las partmulas de adsorcion porosas, tales como sflice, vidrio y polfmeros, se pueden secar y tienen poros interconectados con areas superficiales en el intervalo de aproximadamente 1-2 m²/g de partmulas secas a mas de 300 m²/g de partmulas secas. Otros tipos de partmulas son los hidrogeles reticulados.

Las matrices de soporte particularmente preferidas son agarosa y resina de metacrilato polihidroxilada. Se comercializan diversos geles de perlas de agarosa y resinas polimericas. Estos soportes se pueden adquirir con ligandos prefijados o, como alternativa, los ligandos se pueden fijar indirectamente o inmovilizar directamente sobre el soporte usando procedimientos estandar (vease, por ejemplo, ,Harlow y Lane, Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1988); Biancala y col., Letters in Peptide Science, 7(291), 297(2000); MacBeath y col., Science, 289, 1760-1763 (2000); Cass y col., ed., Proceedings of the Thirteenth American Peptide Symposium. Leiden, Escom, 975-979 (1994); la patente de EE. UU. n.° 5.576.220; Cook y col., Tetrahedron Letters; 35, 6777-6780 (1994) y Fodor y col., arriba. En una realizacion, el uno o mas ligandos se sintetizan sobre la superficie del soporte, lo que resulta ventajoso en la generacion de bibliotecas peptfdicas. El uno o mas ligandos se pueden conjugar qmmicamente al soporte o se pueden fijar a traves de conectores, tales como estreptavidina, beta-alanina, glicina, polfmeros que contienen glicina-serina, hidrocarburos de cadena corta de la formula -(CH²), polietilenglicol, acido epsilon-aminocaproico, y conectores que comprenden -O(CH²)n, donde n es 1-30.

3. Union y elucion de protemas diana

La union de la protema diana o biomolecula diana al ligando o complejo ligando-soporte normalmente se realiza poniendo en contacto el ligando o complejo ligando-soporte con una solucion acuosa que contiene las dianas. Esto se puede conseguir de una variedad de formas, que incluyen el paso de la solucion que contiene la diana a traves de un lecho o una columna empaquetados del complejo ligando-soporte, o la adsorcion por lotes en un tanque o una suspension agitados. Preferentemente, la protema diana se captura mediante el paso de la solucion acuosa a traves de una columna cromatografica usando una bomba para controlar el caudal. La union ideal de la protema diana debena realizarse de tal forma que no sea necesario un ajuste previo de la solucion y la solucion que contiene la diana se aplique directamente al complejo ligando-soporte. Sin embargo, cuando es necesario para la union, se pueden ajustar las propiedades de la solucion que contiene la diana mediante, por ejemplo, dilucion, cambios de pH, fuerza ionica o polaridad, cambios de temperatura, y la adicion de agentes solubles, que incluyen sales, sales inorganicas, sales organicas, compuestos quelantes, tioles, detergentes, tensioactivos, disolventes organicos, alcoholes, glicoles, agentes caotropicos, iones metalicos o cualquier combinacion de los mismos.

Para recuperar la protema diana del ligando o el complejo ligando-soporte, el ligando o complejo ligando-soporte se pueden poner en contacto con una solucion (p. ej., una «solucion de transferencia» o «tampon de elucion») que favorezca la disociacion de la protema diana del ligando o el complejo ligando-soporte. La solucion de transferencia se puede seleccionar de entre tampones de diversas concentraciones salinas, pH o capacidad de desnaturalizacion, disolventes organicos, agentes modificadores de la polaridad tales como alcoholes y agua desionizada. Como alternativa, o ademas, un gradiente electrico o un cambio de temperatura pueden disociar la protema diana del complejo protema-ligando-soporte. Las soluciones de transferencia tambien pueden comprender ligandos (diferentes del ligando del complejo protema-ligando-soporte), cofactores para la protema diana y moleculas enantiomericas espedficas. El uso de diferentes soluciones de transferencia permite la investigacion de las condiciones de elucion o transferencia de una protema diana espedfica. Las condiciones de disociacion y transferencia empleadas en el procedimiento inventivo se seleccionan para minimizar la alteracion del ligando y la protema diana. En otras palabras, las condiciones de elucion y transferencia no debertan liberar el ligando del soporte ni desnaturalizar la protema diana, a menos que se desee.

En una realizacion, la protema diana se detecta e identifica sobre el soporte de protema-ligando antes de la elucion. La deteccion e identificacion de la protema diana sobre el soporte de protema-ligando puede comprender la realizacion de un ensayo de union. Un ensayo de union habitualmente implica la puesta en contacto del soporte de protemaligando con un resto que se sabe que se une a un sustrato. Los restos de union para uso en ensayos de union incluyen, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de union al antfgeno de los mismos, protemas, u oligonucleotidos. Preferentemente, el soporte de protema-ligando se pone en contacto con un anticuerpo o un fragmento de union al antfgeno del mismo que une la protema diana (o un subproducto qmmico o biologico de la protema diana o un fragmento del mismo). El resto de union preferentemente esta marcado con un marcador detectable tal como, por ejemplo, un radioisotopo, un cromoforo o un marcador fluorescente. En tal ensayo de union, se detecta una senal emitida por el marcador detectable, senalando de ese modo la presencia de la protema diana. Una vez que se ha dilucidado la presencia de la protema diana sobre el soporte de protema-ligando, se puede aislar la protema.

Los ensayos de union para la deteccion de una diana se describen adicionalmente en, por ejemplo, Harlow y Lane, arriba; Sambrook y col., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a edicion, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) y Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (9a ed.), Molecular Probes, Eugene, OR (2002). Opcionalmente, el procedimiento inventivo puede comprender ademas una etapa de lavado para retirar el exceso de restos de union o marcadores no unidos antes de la deteccion.

Como alternativa, el procedimiento inventivo puede comprender la realizacion de un ensayo de actividad enzimatica para caracterizar una protema diana en base a su actividad biologica. Se aplica un sustrato enzimatico al soporte de protema-ligando que permite la modificacion enzimatica del sustrato por parte de la protema diana para formar un producto. A continuacion, se detecta el producto, identificando de ese modo la presencia de la protema diana en la muestra.

La union y elucion de protemas diana se puede medir mediante cualquier procedimiento adecuado, muchos de los cuales existen y cuya ejecucion e idoneidad para un fin particular seran conocidas por un experto en la materia. 4. Procedimientos de uso

La presente invencion, como se describe en este documento, proporciona procedimientos de aislamiento secuencial de protemas a partir de muestras biologicas, dichos procedimientos producen protemas altamente activas y sustancialmente purificadas. Los procedimientos de la invencion son altamente sensibles y capaces de separar cantidades mmimas de protemas diana de una muestra. Los procedimientos de purificacion secuencial de protemas de la invencion son utiles en una variedad de aplicaciones, que incluyen el pronostico, diagnostico, deteccion, purificacion, separacion, procesamiento de productos genicos expresados in vitro y produccion de productos biofarmaceuticos. Las tecnicas de purificacion y extraccion de la invencion ofrecen ventajas sobre las tecnicas de purificacion convencionales reduciendo el numero de etapas de purificacion, mejorando los rendimientos, aumentando la pureza y venciendo las limitaciones asociadas a los procedimientos tradicionales.

En particular, los procedimientos de la presente invencion optimizan el procedimiento de purificacion de protemas y mejoran el procedimiento de fabricacion de productos biofarmaceuticos aumentando la eficiencia y pureza. Los productos biofarmaceuticos son farmacos que comprenden protemas, peptidos u otros polinucleotidos complejos o macromoleculas a base de protemas (en conjunto «productos genicos»). Su procedimiento de fabricacion implica la recuperacion del producto genico deseado a partir de su biomasa huesped, tal como plasma o fuentes biologicas no humanas (p. ej., cultivos celulares recombinantes o no recombinantes, leche de animales transgenicos u otras fuentes recombinantes o no recombinantes). La recuperacion de rendimientos comercialmente viables de una protema deseada a partir de una biomasa es un reto, ya que esta contiene protemas huesped, moleculas de acido nucleico y otras entidades qmmicas presentes de forma natural no deseadas.

Los procedimientos de la presente invencion se usan para el aislamiento de protemas a partir de plasma.

En una realizacion preferida, los procedimientos de la presente invencion afslan secuencialmente protemas plasmaticas altamente activas de una muestra de plasma. Se pueden separar multiples protemas simultanea y rapidamente mediante los procedimientos de la presente invencion a partir de cualquier corriente de la industria del procesamiento de plasma destinada a la produccion de productos terapeuticos y/o farmaceuticos. Un ejemplo del orden de aislamiento de protemas plasmaticas se describe en la Tabla 1 que se presenta a continuacion.

Tabla 1: Esquema de purificacion de protemas plasmaticas

Cascada completa Cascada 1 Cascada abreviada Cascada inversa

vWF/FVIII vWF/FVIII vWF/FVIII

PON

Pg Pg

Fg Fg

IgG IgG IgG ASH

ASH UF/DF ASH IgG

UF/DF ASH UF/DF UF/DF

A1PI UF/DF A1PI A1PI

A1PI

La protema plasmatica aislada esta «sustancialmente purificada», teniendo una pureza de aproximadamente un 70 %, preferentemente aproximadamente un 85 %, mas preferentemente aproximadamente un 95 % y lo mas preferentemente aproximadamente un 99 % o mas. En este documento se entiende que, mediante la enumeracion de tales valores de purificacion espedficos, los valores indicados tambien incluyen todas las cantidades de numeros enteros espedficas comprendidas entre los valores indicados. Por ejemplo, aproximadamente un 85 % se entiende que tambien abarca un 80 %, 81 %, 82 %, 83 % y 84 %, sin necesidad de enumerar realmente cada grado espedfico de purificacion sustancial en el mismo.

Habiendo descrito la presente invencion en detalle, la misma se entendera mas claramente por referencia a los ejemplos siguientes, que se incluyen en este documento con fines meramente ilustrativos.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Definicion de los escenarios de secuencia de cascada lineal 1-7

La cascada lineal estuvo compuesta por cinco columnas de cromatograffa de afinidad: Albumina (ASH), Fibrinogeno (Fg), IgG, Plasminogeno (Pg) y PON1/ApoA1. Inicialmente, estas columnas se sometieron sucesivamente a ciclos en cuatro secuencias diferentes para determinar la secuencia optima para la cascada lineal. Con el fin de simplificar el analisis de muestras durante el procedimiento, solo se recogio el volumen de elucion no diluido como carga para la columna siguiente de la secuencia. Espedficamente, esto ayudo a mantener la concentracion de protemas originales constante a lo largo de todo el experimento. Tambien simplifico la comparacion de salida frente a entrada en cada columna. Se ensayaron muestras de la carga y de cada volumen de elucion para monitorizar la recuperacion de las protemas diana y no diana en el volumen de elucion. Estos valores se usaron para monitorizar cada columna con el fin de determinar su capacidad para capturar su protema diana con una retencion minima de protemas diana aguas abajo. La secuencia que mejor se ajusta a este criterio se uso como la secuencia de cascada lineal (SCL). Una vez que estuvieron disponibles los datos analfticos de los primeros ciclos, se probaron tres secuencias adicionales, y se anadio la columna de A1PI a los Escenarios 6 y 7.

Materiales y equipos

Se usaron las resinas siguientes en las cascadas empaquetadas en columnas Pharmacia XK 50 (20 o 30 m de longitud):

Columna de plasminogeno: Pharmacia ECH-Lys-Sepharose FF, n.° de lote 243526.

Columna de fibrinogeno: ProMetic Purabead, (2 columnas en serie), n.° de lote CG1251 y n.° de lote CG1252.

Columna de IgG: ProMetic MAbsorbent A2P, n.° de lote FA0582-Z.

Columna de ASH: ProMetic Mimetic Blue SAHL P6XL, n.° de lote FA0500Z.

Columna de PON1/ApoA1: Peptide International, Toyopearl WWLHAN, n.° de lote 217772.

Columna de A1PI: Resina ProMetic 12/330 P6XL, n.° de lote CG 1255.

Todas las cromatograffas se realizaron usando el sistema cromatografico AKTA Explorer 100 con 950 colectores de fracciones (Amersham Biosciences). Se realizo ultrafiltracion (UF)/ diafiltracion (DF) con el sistema de ultrafiltracion Sartocon Slice 200 de Sartorius usando dos membranas de acetato de celulosa Hydrosart de 200 cm2 (peso molecular de corte 10 kD).

Procedimientos

Para cada ciclo, la carga para la primera columna fue plasma humano combinado Tris 50 mM, pH 7,5 filtrado a 0,2 pm. El volumen de elucion de cada columna se recogio en fracciones y se agrupo en base al perfil de absorbancia UV (A280) del cromatograma. Esta agrupacion se uso como material de carga para la columna siguiente de la secuencia. Si la columna siguiente se iba a someter a un ciclo al dfa siguiente, el volumen de elucion se filtraba de forma esteril (filtro de vado de 0,2 pm) y se almacenaba a temperatura ambiente. En los Escenarios 6 y 7, se uso UF/DF para reducir el volumen y realizar un intercambio de tampon en el volumen de elucion agrupado como se indica en la T abla 2 que se presenta a continuacion. Esto era necesario para llevar el material de carga de A1PI en el tampon de migracion de la columna de A1PI (fosfato sodico 15 mM, pH 6,1).

Tabla 2: Secuencias de columna

Escenario n.° 1 Pg ^ Fg ^ IgG ^ ASH ^ ApoA-1/PON1

Escenario n.° 2 IgG ^ Fg ^ Pg ^ ASH ^ ApoA-1/PON1

Escenario n.° 3 Pg ^ Fg ^ ASH ^ IgG

Escenario n.° 4 Pg ^ Fg ^ ApoA-1/PON1 ^ ASH ^ IgG

Escenario n.° 5 ApoA1/PON1 ^ Pg ^ Fg ^ ASH ^ IgG

Escenario n.° 6 Pg ^ Fg ^ ApoA1/PON1 ^ ASH ^ UF/DF ^ IgG ^ A1PI.

Escenario n.° 7 ApoA1/PON1 ^ Pg ^ Fg ^ ASH ^ IgG ^ UF/DF ^ A1PI

Resultados

A continuacion, se muestran las tablas y graficas de rendimiento por etapa. N/A significa que los datos no estaban disponibles. < LOD significa que el nivel de protema era inferior al lfmite de deteccion para ese ensayo en particular.

Tabla 3: Rendimientos porcentuales por etapa para el Escenario n.° 1

Pg Fg IgG ASH ApoA1

VE Pg 4,6 % 98,9 % 96,0 % 101,7 % 91,8 %

VE Fg 0,0 % 94,5 % 90,8 % 84,9 %

VE IgG 3,0 % 78,3 % 84,5 %

VE ASH 2,8 % 81,9 %

VE PON1 N/A

La Tabla 3 resume los resultados del escenario n.° 1.

Tabla 4: Rendimientos porcentuales por etapa para el Escenario n.° 2

IgG Fg Pg ASH ApoA1 A1PI VE IgG 2,19 % 2,97 % 3,51 % 81,81 % 2,09 % 77,19 % VE Fg < LOD < LOD 93,29 % < LOD 89,01 % VE Pg < LOD 112,26 % < LOD 113,34 %

VE ASH 1,00 % < LOD 88,42 %

VE PON1 < LOD 1,00 %

La Tabla 4 resume los resultados del escenario n.° 2.

Tabla 5: Rendimientos porcentuales por etapa para el Escenario n.° 3

Pg Fg ash IgG ApoA1 A1PI VE Pg 3,47 % 90,06 % 86,14 % 89,61 % 86,05 % 85,68 % VE Fg 1,01 % 81,67 % 70,80 % 70,20 % 75,03 %

VE ASH 22,74 % 74,39 % 73,74 % 61,34 %

VE IgG 6,82 % 1,37 % 67,40 %

La Tabla 5 resume los resultados del escenario n.° 3.

Tabla 6: Rendimientos porcentuales por etapa para el Escenario n.° 4

Pg Fg ApoA1 ASH IgG A1PI VE Pg 2,0 % 96,0 % 90,0 % 94,0 % 93,0 % 93 % VE Fg 4,0 % 83,0 % 83,0 % 86,0 % 84 % VE ApoA1 1,0 % 99,0 % 83,0 % 79 %

VE ASH 1,0 % 89,0 % 101 %

VE IgG 0,0 % 79 %

La Tabla 6 resume los resultados del escenario n.° 4.

Tabla 7: Rendimientos porcentuales por etapa para el Escenario n.° 5

ApoA1 Pg Fg ASH IgG

VE PON1 8,20 % 78,0 %* N/A 89,10 % 93,10 %

VE Pg 0,10 % 62,00 % 87,70 % 86,60 % VE Fg 2,50 % 73,80 % 72,20 %

VE ASH 5,00 % 60,80 %

VE IgG 0,70 % * con base en el ensayo de actividad, datos de nefelometna no disponibles

La Tabla 7 resume los resultados del escenario n.° 5.

Tabla 8: Rendimientos porcentuales por etapa para el Escenario n.° 6

Pg Fg ApoA1 ASH A1PI IgG VE Pg 2,00 % 91,48 % 82,09 % 89,67 % 81,29 % 89,06 % VE Fg 22,90 % 75,10 % 104,50 % 103,12 % 106,60 % Pg Fg ApoA1 ASH A1PI IgG

VE PON1 < LOD 94,13 % 88,76 % 99,26 %

VE ASH 1,89 % 88,57 % 73,34 %

VE A1PI < LOD 60,52 %

VE IgG < LOD < LOD

La Tabla 8 resume los resultados del escenario n.° 6.

Tabla 9. Rendimientos porcentuales por etapa para el Escenario n.° 7

ApoA1 Pg Fg VE ASH VE IgG A1PI

ApoA1 25,4 % 73,6 % 78,5 % 75,9 % 76,0 % 63,7 %

Pg < 2,6 % 85,5 % 88,7 % 87,6 % 85,4 %

Fg 9,5 % 71,4 % 72,8 % 57,9 %

VE ASH 3,7 % 42,1 % 58,7 %

VE IgG < 0,2 % 54,8 %

A1PI < 9,2 %

La Tabla 9 resume los resultados del escenario n.° 7.

Conclusiones

En el ciclo anterior al escenario n.° 1 (misma secuencia que la del escenario n.° 1), el material de partida fue plasma filtrado sin ningun sistema tamponador anadido. A medida que se cargaba el plasma en la columna, habfa un pico sustancial en el pH del volumen de elucion. Como consecuencia de esta observacion, se anadio tampon T ris 1 M, pH 7,5, al plasma hasta una concentracion final de Tris 50 mM antes de cargarlo en la primera columna. Vease el Ejemplo 3, que se presenta a continuacion, para consultar un resumen del procedimiento de seleccion de tampon. Los siete escenarios demostraron la viabilidad de utilizar una cascada lineal de columnas de afinidad como un procedimiento efectivo para purificar protemas plasmaticas. Se analizaron los datos y se selecciono la secuencia en base a las observaciones siguientes. En el Escenario 1, la recuperacion de protemas diana aguas abajo permanecio relativamente alta a lo largo del ciclo. En el escenario 2, la columna de IgG agoto practicamente por completo la corriente de alimentacion de plasminogeno, fibrinogeno y ApoA1. De nuevo, en el Escenario 3, la columna de IgG capturo ApoA1. Con base en esta observacion, se determino que las columnas de PON1, Pg y Fg se debfan colocar antes de la columna de IgG en la secuencia.

A la hora de decidir el orden de las etapas cromatograficas en la cascada lineal de acuerdo con este experimento, se tomaron en consideracion los puntos siguientes:

■ Las etapas de captura para PON1, Pg y Fg se debenan colocar antes de la de IgG.

■ Puesto que la albumina y el citrato interferiran con la cromatograffa de A1PI, la columna de A1PI se debena colocar despues de la columna de albumina. El volumen de elucion requiere una etapa de procesamiento por UF/DF para un intercambio de tampon antes de la columna de A1PI.

■ La IgG se debena colocar antes de la albumina para evitar perdidas de IgG.

Por lo tanto, se eligio que la secuencia de cascada en este experimento fuera: PON1/ApoA1 ^ Plasminogeno ^ Fibrinogeno ^ IgG ^ ASH ^ UF/DF ^ A1PI.

Cabe senalar que, en otro experimento, se retiro la columna de PON1/ApoA1 de la secuencia de cascada actual y se introdujo vWF/FVIII antes del plasminogeno cuando la resina estaba disponible.

Ejemplo 2: Captura por afinidad de protemas plasmaticas

En este experimento se uso la secuencia de columnas siguiente:

vWF/FVIII ^ Plasminogeno ^ Fibrinogeno ^ IgG ^ UF/DF ^ ASH ^ UF/DF.

Preparacion del plasma: Se obtuvieron cuatro litros de plasma combinado congelado a partir de un almacenamiento a -20 °C. Se descongelo la combinacion de plasma a 37,0 °C ± 2 °C en un bano de agua. Una vez descongelado el plasma, se retiro rapidamente del bano de agua. Se ajusto el plasma a Tris 20 mM, NaCl 50 mM usando una dilucion de 50x de Tris 1 M, pH 7,5, y una dilucion de 40x de NaCl 2 M. Se mezclo bien el plasma y se filtro usando un filtro esteril SartoPure 300 PP2 (8 pm).

a. Captura por afinidad de factor de von Willebrand/factor VIII (vWF/FVIII)

Se preparo una columna de lecho empaquetado de 7 cm x 10,6 cm que contema 410 mL del adsorbente de afinidad desarrollado para la captura por afinidad de vWF/FVIII. La columna se mantuvo habitualmente en una solucion de almacenamiento que contema NaOH 0,1 N cuando no se usaba durante periodos de tiempo prolongados. Se lavo la columna previamente almacenada con un caudal de 80 cm/h con 3 VC de agua Milli Q hasta que la conductividad cayo por debajo de 1 mS/cm. Se equilibro la columna con 4 VC de tampon de equilibrio (EQ) compuesto por Tris 20 mM, citrato 20 mM, NaCl 140 mM, pH 7,5. Se aplico el plasma filtrado a la columna. Cuando la absorbancia a 280 nm alcanzo el 5 % de las unidades de absorbancia de la escala completa (AUFS = 2), se recogio el efluente de volumen de elucion.

Se lavo la columna con 4 VC de tampon EQ y se continuo recogiendo efluente de la columna hasta que la absorbancia cayo por debajo del 5 % de las AUF^s . Se mezclo concienzuda, pero cuidadosamente, la solucion y, a continuacion, se filtro a traves de un filtro SartoClean CA (H8) de 3/0,8 um seguido de un Sartobran P (H8) de 0,45/0,22 um. El filtro se lavo posteriormente con 500 mL de tampon EQ. Se mezclo cuidadosamente el filtrado combinado. Esta solucion filtrada constituyo la fraccion de volumen de elucion de la etapa de captura de vWF/FVIII (vWF/FVIII-VE (volumen de elucion)). Se eluyo el vWF/FVIII 4 VC de tampon de elucion compuesto por Tris 20 mM, NaCl 500 mM, CaCl²3 mM, polisorbato 80 al 0,01 %, etilenglicol al 30 %, pH 6,5. El caudal de la columna se fijo en 30 cm/h. Una vez que el % UV aumenta al 2 % de las AUFS, se inicio la recogida de eluato. Se recogio el eluato de forma continua hasta que la absorbancia volvio a caer al 2 % de las AUFS. Se mezclo el eluato de la columna cuidadosamente y se almaceno a -80 °C hasta que estuvo preparado para su procesamiento adicional. La resina se regenero con una solucion CIP-1 compuesta por NaOH 0,5 N/Triton X100 al 1 %. Se aplico la solucion CIP-1 a la columna en la direccion de «flujo ascendente» a un caudal reducido de 5 mL/min durante aproximadamente 3 VC. A continuacion, se lavo la resina con 2 VC de una solucion CIP-2 compuesta por isopropanol al 30 % en NaOH 0,5 N a 5 mL/min. La resina se equilibro con 3 VC de solucion de almacenamiento hasta su siguiente uso.

b. Captura por afinidad de plasminogeno (Pg)

Se preparo una columna de lecho empaquetado de 5 cm x 13 cm que contema 255 mL del adsorbente de afinidad desarrollado para la captura de plasminogeno. La columna se mantuvo habitualmente en una solucion de almacenamiento que contema NaOH 0,1 N cuando no se usaba durante periodos de tiempo cortos. Se lavo la columna previamente almacenada con un caudal de 160 cm/h con 1-2 VC de agua Milli Q hasta que la conductividad cayo por debajo de 1 mS/cm. Se equilibro la columna con 3-4 VC de tampon de equilibrio (EQ) compuesto por Tris 20 mM, citrato 20 mM, NaCl 140 mM, pH 7,5. Se aplico el vWF/FVIII-VE procedente de la etapa de captura anterior a la columna. Cuando la absorbancia a 280 nm alcanza el 5 % de las AUFS (unidades de absorbancia de la escala completa), se recogio el efluente de volumen de elucion.

Se lavo la columna con 2-3 VC de tampon EQ y se continuo recogiendo el efluente de la columna hasta que la absorbancia cayo por debajo del 5 % de las AUFS. Se mezclo cuidadosamente la solucion y, a continuacion, se filtro a traves de un filtro Sartobran de 0,22 um. El filtro se lavo posteriormente con 500 mL de tampon EQ. Se mezclo cuidadosamente el filtrado combinado. Esta solucion filtrada constituyo la fraccion de volumen de elucion de la etapa de captura de plasminogeno (Pg-VE). Se lavo la columna con 2 VC de tampon de lavado compuesto por caprilato 30 mM en EQ, pH 7,5, seguido de 2 VC de tampon EQ. Se eluyo el plasminogeno con 2-3 VC de tampon de elucion compuesto por fosfato de Na 50 mM, EACA 0,5 M, pH 7,0. Una vez que el % UV aumento al 2 % de las AUFS, se inicio la recogida de eluato. Se recogio el eluato de forma continua hasta que la absorbancia volvio a caer al 2 % de las AUFS. Se mezclo el eluato de la columna cuidadosamente y se almaceno a -80 °C hasta que estuvo preparado para su procesamiento adicional. La resina se regenero con una solucion CIP-1 compuesta por NaOH 0,5 N. Se aplico la solucion CIP-1 a la columna en la direccion de «flujo ascendente» a un caudal reducido de 40 mL/min durante aproximadamente 4 VC. La resina se equilibro con 3 VC de solucion de almacenamiento hasta su siguiente uso.

c. Captura por afinidad de fibrinogeno (Fg)

Se prepare una columna de lecho empaquetado de 10 cm x 10,1 cm que conterna 790 mL del adsorbente de afinidad desarrollado para la captura de fibrinogeno. La columna se mantuvo habitualmente en una solucion de almacenamiento que conterna NaOH 0,1 N cuando no se usaba durante periodos de tiempo cortos. Se lavo la columna previamente almacenada con un caudal de 60 cm/h con 1-2 VC de agua Milli Q hasta que la conductividad cayo por debajo de 1 mS/cm.

Se equilibro la columna con 3-4 VC de tampon de equilibrio (EQ) compuesto por Tris 20 mM, citrato 20 mM, NaCl 140 mM, pH 7,5. Se aplico el Pg-VE procedente de la etapa de captura anterior a la columna. Cuando la absorbancia a 280 nm alcanzo el 5 % de las AUFs (unidades de absorbancia de la escala completa), se recogio el efluente de volumen de elucion. Se lavo la columna con 4-5 VC de tampon EQ y se recogio el efluente de la columna de forma continua hasta que la absorbancia cayo por debajo del 5 % de las AUFS. Se mezclo cuidadosamente la solucion y, a continuacion, se filtro a traves de un filtro Sartobran de 0,22 um. El filtro se enjuago posteriormente con 500 mL de tampon EQ y se mezclo cuidadosamente el filtrado combinado. Esta solucion filtrada constituyo la fraccion de volumen de elucion de la etapa de captura de fibrinogeno (Fg-VE). Se eluyo el fibrinogeno con 4-5 Vc de tampon de elucion compuesto por Tris 20 mM, citrato 20 mM, NaCl 140 mM, colato al 1 %, propilenglicol al 10 %, pH 7,5. Una vez que el % UV aumento al 2 % de las AUFS, se inicio la recogida de eluato. Se recogio el eluato de forma continua hasta que la absorbancia volvio a caer al 2 % de las AUFS. Se mezclo el eluato de la columna cuidadosamente y se almaceno a -80 °C hasta que estuvo preparado para su procesamiento adicional. La resina se regenero con una solucion CIP-1 compuesta por NaOH 1,0N. Se aplico la solucion CIP-1 a la columna en la direccion de «flujo ascendente» a un caudal reducido de 80 mL/min durante aproximadamente 4 VC. La resina se equilibro con 3 VC de solucion de almacenamiento hasta su siguiente uso.

d. Captura por afinidad de inmunoglobulina G (IgG)

Se prepare la carga anadiendo 1/10 volumenes de tampon de ajuste de carga (caprilato 300 mM en EQ) al Fg-VE y se mezclo bien. Se prepare una columna de lecho empaquetado de 14 cm x 12,2 cm que conterna 1880 mL del adsorbente de afinidad desarrollado para la captura de IgG. La columna se mantuvo habitualmente en una solucion de almacenamiento que conterna NaOH 0,1 N cuando no se usaba durante periodos de tiempo cortos. Se lavo la columna previamente almacenada con un caudal de 73 cm/h con 2 VC de agua Milli Q hasta que la conductividad cayo por debajo de 1 mS/cm. Se equilibro la columna con 2 VC de tampon de lavado compuesto por Tris 20 mM, citrato 20 mM, NaCl 1 M, pH 7,5, seguido de 3-5 VC de tampon de equilibrio de IgG compuesto por caprilato 30 mM, tris 20 mM, citrato 20 mM, NaCl 140 mM, pH 7,5. Se aplico el Fg-VE procedente de la etapa de captura anterior a la columna. Cuando la absorbancia a 280 nm alcanzo el 5 % de las AUFS (unidades de absorbancia de la escala completa), se recogio el efluente de volumen de elucion.

Se lavo la columna con 4-5 VC de tampon de lavado y se continuo recogiendo el efluente de la columna hasta que la absorbancia cayo por debajo del 5 % de las AUFS. Se mezclo cuidadosamente la solucion y, a continuacion, se filtro a traves de un filtro Sartobran de 0,22 um. El filtro se enjuago posteriormente con 500 mL de tampon EQ y se combino cuidadosamente el filtrado combinado. Esta solucion filtrada constituyo la fraccion de volumen de elucion de la etapa de captura de IgG (IgG-VE). Antes de la elucion de la IgG, se acondiciono la columna con 1 VC de tampon de preelucion compuesto por citrato 50 mM, pH 6,0. Eluir la IgG con 4 VC de tampon de elucion compuesto por citrato 50 mM, pH 3,0. Una vez que el % UV aumento al 2 % de las AUFS, se inicio la recogida de eluato. La recogida de eluato continuo hasta que la absorbancia volvio a caer al 2 % de las AUFS. Se mezclo cuidadosamente el eluato de la columna y se ajusto el pH por encima de 7,0 con un volumen suficiente de Tris Base 1 M y, a continuacion, se almaceno a -80 °C hasta que estuvo preparado para su procesamiento adicional. La resina se regenero con una solucion CIP-1 compuesta por NaOH 1,0N. Se aplico la solucion CIP-1 a la columna en la direccion de «flujo ascendente» a un caudal reducido de 170 mL/min durante aproximadamente 4 VC seguida de 3 VC de agua Milli-Q en la direccion de flujo descendente. La resina se equilibro con 3 VC de solucion de almacenamiento hasta su siguiente uso.

e. Ultrafiltracion/Diafiltracion

Se realizo filtracion para concentrar el producto IgG-VE hasta que se alcanzo el volumen objetivo de aproximadamente 1,5-2 L. Se realizo diafiltracion contra 6 volumenes de tampon EQ con una presion de entrada del filtro (P1) de 18 ± 1 psi y una PTM de 15 ± 1 psi. Se tomaron muestras del permeado para realizar mediciones de pH y conductividad al comienzo de la diafiltracion y a aproximadamente cada volumen de retenido de la diafiltracion para monitorizar cuando era completa la diafiltracion.

f. Captura por afinidad de albumina (ASH)

Se prepare una columna de lecho empaquetado de 20 cm x 17,8 cm que contema 5600 mL del adsorbente de afinidad desarrollado para la captura de albumina. La columna se mantuvo habitualmente en una solucion de almacenamiento que contema NaOH 0,1 N cuando no se usaba durante periodos de tiempo cortos. Se lavo la columna previamente almacenada con un caudal de 86 cm/h con 2 VC de agua Milli Q hasta que la conductividad cayo por debajo de 1 mS/cm. Se equilibro la columna con 3-4 VC de tampon EQ. Se aplico el retenido de la UF/DF de la etapa anterior a la columna. Cuando la absorbancia a 280 nm alcanzo el 5 % de las AUFS (unidades de absorbancia de la escala completa), se recogio el efluente de volumen de elucion.

Se lavo la columna con 2-3 VC de tampon EQ y se continuo recogiendo el efluente de la columna hasta que la absorbancia cayo por debajo del 5 % de las AUFS. Se mezclo la solucion cuidadosamente. Esta solucion filtrada constituyo la fraccion de volumen de elucion de la etapa de captura de albumina (ASH-VE). Antes de la elucion de la albumina, se acondiciono la columna con 2 VC de tampon de preelucion compuesto por citrato 50 mM, NaCl 300 mM, pH 7,5. Se eluyo la albumina con 2-3 VC de tampon de elucion compuesto por citrato de Na 50 mM, caprilato de Na 50 mM, pH 6,2. Una vez que el % UV aumento al 2 % de las AUFS, se inicio la recogida de eluato. Se recogio el eluato de forma continua hasta que la absorbancia volvio a caer al 2 % de las AUFS. Se mezclo el eluato de la columna cuidadosamente y, a continuacion, se almaceno a -80 °C hasta que estuvo preparado para su procesamiento adicional. La resina se regenero con una solucion CIP-1 compuesta por NaOH 1,0N. Se aplico la solucion CIP-1 a la columna en la direccion de «flujo ascendente» a un caudal reducido de 400 mL/min durante aproximadamente 4 VC seguida de 3 VC de agua Milli-Q en la direccion de flujo descendente. La resina se equilibro con 3 VC de solucion de almacenamiento hasta su siguiente uso.

g. Concentracion del volumen de elucion de ASH

Conectar la bolsa de ASH-VE que contiene el resto de la muestra a la entrada del tubo en el deposito de producto. Poner en marcha la bomba a un «caudal constante» de 1300 mL/min en el sistema Slice 200. Ajustar la presion en la salida del filtro (P2) a 13 ± 1 psi. Esto debena conducir a una presion de entrada (P1) del filtro de 18 ± 1 psi y una PTM de 15 ± 1 psi. Durante la concentracion del producto, se alimento ASH-VE adicional de forma continua al deposito del sistema. La concentracion de ASH-VE continuo hasta que se alcanzo el volumen objetivo de aproximadamente 1,5­ 2 L. La recirculacion continuo durante aproximadamente 1 minuto sin presion o filtracion a traves de la membrana antes de recoger el producto de UF del sistema de filtro. Se anadieron aproximadamente 500-1 000 mL de tampon de equilibrio al deposito para enjuagar el sistema de filtro. La recirculacion comenzo lentamente para evitar la «formacion de espumas» en el enjuagado del sistema durante aproximadamente de 3 a 5 minutos, sin filtracion ni presion. El producto de UF se combino, enjuago y almaceno a -80 °C. El concentrado de ASH-VE se considero un material de partida apropiado para la purificacion de A1PI.

Resultados

Tabla 10: Atributos clave para la captura de vWF/FVIII

Muestra Media DE

Carga:

Concentracion de vWF (ug/mL) 10,88 1,34 Concentracion de FVIII (ng/mL) 78,5 6,7

Volumen (L) 4061 116

pH 7,73 0,06 Conductividad (mS/cm) 15,6 0,5

Volumen de elucion:

Concentracion de vWF (ug/mL) 1,09 0,39 Concentracion de FVIII (ng/mL) 12,87 2,23

Volumen (L) 5597,1 87,5

pH 7,6 0,13 Conductividad (mS/cm) 17 0,577

Elucion:

Concentracion de vWF (ug/mL) 26,8 5,48 Concentracion de FVIII (ng/mL) 298,5 72,1 Volumen (L) 697,1 121,6 pH 8,47 0,56 Conductividad (mS/cm) 22,64 0,69

Tabla 11: Atributos clave para la captura de plasminogeno

Muestra Media DE Carga:

Tttulos (g/L) 0,081 0,003 Vol (L) 5859 145

PH 7,75 0,09

Conductividad (mS/cm) 17,32 1,19 Volumen de elucion:

Tttulos (g/L) 0,005 0,005 Vol (L) 6346 269

PH 7,71 0,07

Conductividad (mS/cm) 17,50 0,76 Elucion:

Tttulos (g/L) 1,488 0,127 Vol (L) 236,3 17,5

PH 7,27 0,06

Conductividad (mS/cm) 14,71 3,68

Tabla 12: Atributos clave para la captura de fibrinogeno

Muestra Media DE Carga:

Tttulos (g/L) 1,43 0,06 Vol (L) 6716 181

PH 7,72 0,04

Conductividad (mS/cm) 16,57 0,84 Volumen de elucion:

Tttulos (g/L) 0,0323 0,005 Vol (L) 9507 231

PH 7,55 0,08

Conductividad (mS/cm) 17,00 0,96 Elucion:

Tttulos (g/L) 3,433 0,253 Elucion:

Vol (L) 2539 227

PH 7,55 0,08

Conductividad (mS/cm) 14,00 1,41

Tabla 13: Atributos clave para la captura de IgG

Muestra Media DE Carga:

Tttulos (g/L) 2,251 0,259 Vol (L) 10429 267

PH 7,54 0,25

Conductividad (mS/cm) 18,52 0,92 Volumen de elucion:

Tttulos (g/L) 0,015 0,003 Vol (L) 12620 876

PH 7,61 0,09

Conductividad (mS/cm) 32,17 6,05 Elucion:

Tttulos (g/L) 3,762 ,481 Vol (L) 6086 741

PH 7,64 0,64

Conductividad (mS/cm) 10,64 6,55

Tabla 14: Atributos clave para la captura de ASH

Muestra Media DE Carga:

Tttulos (g/L) 28,55 1,84 Vol (mL) 3814 211

PH 7,45 0,08

Conductividad (mS/cm) 17,21 1,75 Volumen de elucion:

Tttulos (g/L) 0,047 0,003 Vol (mL) 10463 2015

PH 7,39 0,13

Conductividad (mS/cm) 17,42 1,79 Elucion:

Tttulos (g/L) 18,27 2,47 Vol (mL) 5906 650

PH 6,76 0,04 Elucion:

Conductividad (mS/cm) 22,00 3,78

Tabla 15: Rendimientos del procedimiento para protelnas diana

Protema Tipo de ensayo Rendimiento medio Desv. est.

Factor de Von Willebrand ELISA 43 % 12 %

Factor VIII ELISA 65 % 11 % Plasminogeno Nefelometna 72 % 6 %

Fibrinogeno Nefelometna 79 % 6 %

IgG Nefelometna 87 % 7 %

ASH Nefelometna 88 % 8 %

A1PI Nefelometna 90 % 6 %

Ejemplo 3: Evaluacion y seleccion del sistema tamponador del plasma para uso en el procedimiento de cascada lineal

Este experimento se realizo con el fin de determinar el sistema tamponador optimo para el esquema de purificacion de protemas plasmaticas de secuencia de cascada lineal Se observo que, durante la carga de la columna de IgG, el pH ascend^a a 2 unidades por encima de el del plasma (pH ~ 7,5). Se observo un cambio de pH durante la carga de IgG varias veces y pareda ser dependiente del grado de reduccion de protema de la carga. Esto sugena que ciertas proteinas plasmaticas tienen capacidad tamponadora y la retirada de estas proteinas de la solucion de carga puede aumentar la probabilidad de un cambio en el pH. Era necesario un sistema tamponador en el plasma para preservar la concentracion y actividad de la protema en el plasma. El sistema tamponador debfa ser tal que el pH permaneciera en un intervalo aceptable de aproximadamente 7,5 ± 0,4 a lo largo de todo el procedimiento.

Para garantizar que no se produjera un cambio de pH en el ciclo posterior, se tampono la carga de plasma para la operacion siguiente usando una solucion madre de Tris 1 M a pH 7,5. Esta solucion madre de tampon se creo usando dos soluciones madre individuales, Tris Base 1 M y Tris HCl 1 M. Estos tampones se valoraron entre sf a pH 7,5. A continuacion, se diluyo la solucion madre de tampon 1:20 en plasma antes de su filtracion. La carga final preparada contema plasma ajustado con Tris 50 mM, filtrado con un filtro de 0,45/0,2 pm Este sistema tamponador se uso para la determinacion de los experimentos de secuencia de cascada lineal (SCL) 1-7. Se uso tampon Tris 50 mM en el plasma y tampon de migracion a lo largo de todo el procedimiento. No se observaron problemas de pH durante la carga de la columna cuando se usaba Tris 50 mM, pH 7,5. La Tabla 15 resume los rendimientos por etapa de las purificaciones SCL realizadas usando T ris 50 mM, pH 7,5, como tampon del plasma.

Tabla 15: Rendimiento porcentual por etapa de las proteinas diana a lo largo de las SCL tamponadas con Tris 50 mM, pH 7,5.

Tampon Tris

_{50 mM} Fg FXIII IgG A1PI A1PI (actividad)

95 ± 2,7 91,3 ± 7,4 98 ± 3,7 100 ± 13 100,3 ± 15,8

Pg (n = 6) (n = 4) (n = 7) (n = 7) (n = 5)

86,6 ± 8 95,5 ± 5,3 107,7 ± 9,1

Fg (n = 7) (n = 7) (n = 5)

_IgG 87,8 ± 13,3 96,7 ± 7,4

(n = 7) (n = 5)

_ASH 96,1 ± 19,5 98,5 ± 23 (n = 4)

(n = 7)

Se busco un sistema tamponador alternativo debido a los relativamente altos costes proyectados del tampon Tris 50 mM a escala de fabricacion. Se realizaron varios experimentos sobre almuotas pequenas de plasma tamponado con bicarbonato, fosfato y Tris a pH 7,5. Estos experimentos se llevaron a cabo durante el curso de varios dfas para simular la SCL en multiples dfas. Se tamponaron almuotas del mismo combinado de plasma y se dejaron incubar a temperatura ambiente (TA) durante varios dfas. Las muestras de cada una se analizaron para determinar la actividad y concentracion de protema. En la Tabla 16 se presentan los rendimientos por etapa de incubacion cuando el plasma esta tamponado con cada sistema. El plasma tamponado con Tris 50 mM se realizo varias veces como valor de referencia para su comparacion.

Tabla 16: Resumen de los estudios de tamponamiento de plasma preliminares.

Rendimientos despues de la incubacion a TA

FG FG (act) FXIII (act) igG A1PI A1PI (ac) En plasma tamponado con 100 % 99 % 100 % 95 % 101 % 98 %

Tris 50 mM, t = 24 h (n = 2) (n = 2) (n = 2) (n = 2) (n = 2) (n = 2)

En plasma tamponado con

bicarbonato sodico 20 mM,

t = 24 113,00 % 99,00 % 104,00 % 108,00 % 97,00 % 84,00 %

En plasma tamponado con

bicarbonato sodico 50 mM,

t = 24 98,00 % 114,00 % 115,00 % 102,00 % 97,00 % 97,00 %

En plasma tamponado con

fosfato sodico 50 mM,

t = 24 h 96,00 % 95,00 % 95,00 % 99,00 % 97,00 % 103,00 %

En plasma tamponado con

fosfato sodico 50 mM,

t = 48 h (el rendimiento se

presenta en forma de t = 24

a t =48 h) 109,00 % 99,00 % 100,00 % 100,00 % 100,00 % 97,00 %

Los resultados indican que no habfa mayor perdida de protema o actividad con los diversos tampones probados en comparacion con el control, agua. Ninguna de las protemas diana se vio afectada negativamente por la adicion de un agente tamponador al plasma. Cada esquema de tamponamiento se probo, a continuacion, en un estudio de cascada para determinar las condiciones de tamponamiento optimas.

Durante los experimentos SCL, se evaluo un sistema tamponador de fosfato sodico 10 mM. Durante la preparacion de la carga de plasma, se diluyo una solucion madre de fosfato de Na 0,2 M a fosfato de Na 10 mM con una dilucion de la solucion madre de tampon de 20 veces con plasma. El plasma tamponado con fosfato 10 mM se filtro a 0,2 pm antes de su uso en el estudio de cascada lineal. Durante el estudio de este esquema de tamponamiento, la actividad de la protema fue notablemente inferior para las protemas diana y otros factores que eran indicativos de actividad proteica. La Tabla 17, que se presenta a continuacion, resume los rendimientos por etapa de varios ciclos SCL usando tampon fosfato 10 mM.

Tabla 17: Rendimiento porcentual por etapa de las protemas diana a lo largo de las SCL tamponadas con fosfato sodico 10 mM, pH 7,5.

Tampon fosfato FXIII IgG A1PI A1PI

_{10 mM} Fg (actividad)

94 ± 3,5 80,4 ± 7,4 96,9 ± 5,1 97,3 ± 6,2 95,5 ± 7,8

Pg (n = 6) (n = 5) (n = 6) (n = 6) (n = 6)

^{78,2 ± 5,5} 90,9 ± 8 89,5 ± 25

Fg _{(n = 6)} (n = 6) (n = 5)

_IgG 87,2 ± 7,4 80 ± 21 (n = 4)

(n = 5)

_ASH 94 ± 8,1 ND

(n = 3)

Aunque el plasma tamponado con Tris 50 mM habfa resultado un exito a la hora de evitar fluctuaciones de pH, era necesario un medio de tamponamiento del plasma con una mejor relacion entre coste y eficacia. Como consecuencia,

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento de aislamiento y purificacion secuencial de protemas que comprende (i) proporcionar una muestra de plasma, (ii) proporcionar ligandos que se unan, cada uno de ellos, espedficamente a una protema diana de la muestra biologica, donde cada uno de los ligandos esta opcionalmente fijado a un soporte para formar complejos ligando-soporte, (iii) poner en contacto los ligandos o complejos ligando-soporte, secuencialmente y en un orden predeterminado, con la muestra de plasma para permitir que cada ligando o complejo ligando-soporte una selectivamente la protema diana de la muestra de plasma, donde el orden predeterminado de puesta en contacto los ligandos o complejos ligando-soporte con la muestra de plasma deriva en la union de plasminogeno antes de IgG y de IgG antes de albumina, y donde, antes de dicha puesta en contacto, la muestra biologica no se procesa mediante una etapa de preacondicionamiento seleccionada del grupo que consiste en precipitacion con alcohol, crioprecipitacion, eliminacion de lfpidos y/o protemas lipfdicas, precipitacion de euglobulina, o una combinacion de las mismas, (iv) eluir la protema diana unida a cada uno de los ligandos o complejos ligando-soporte, y (v) aislar la protema diana secuencialmente de la muestra biologica.

2. El procedimiento de la reivindicacion 1, donde las protemas diana comprenden fibrinogeno, inhibidor de la proteinasa alfa-1, apolipoprotema A1, inmunoglobulinas, paraoxonasa, factores de coagulacion, vWF/FVIII, albumina, plasminogeno, o una combinacion de los mismos.

3. El procedimiento de la reivindicacion 2, donde se afsla fibrinogeno del plasma antes de IgG.

4. El procedimiento de la reivindicacion 2, donde la actividad de paroxonasa se retiene en la muestra biologica durante el aislamiento de la protema.

5. El procedimiento de la reivindicacion 2, donde se afsla vWF/FVIII del plasma antes de plasminogeno.

6. El procedimiento de la reivindicacion 2, donde se afsla apolipoprotema A1 del plasma antes de IgG.

7. El procedimiento de la reivindicacion 2, donde se afsla inhibidor de la proteinasa alfa-1 del plasma despues de albumina.

8. El procedimiento de la reivindicacion 2, donde se afsla plasminogeno del plasma antes de fibrinogeno.

9. El procedimiento de la reivindicacion 1, donde el ligando comprende un peptido, un polipeptido, un peptidomimetico, una molecula pequena, colorante, un compuesto que contienen triazina, un anticuerpo o fragmento de union al antfgeno, una molecula a base de acidos nucleicos, una molecula no a base de polipeptidos o nucleotidos, un carbohidrato, mimeticos de carbohidratos, lfpidos, un material inorganico, un inhibidor, un sustrato o cualquier combinacion de los mismos.

10. El procedimiento de la reivindicacion 9, donde los ligandos comprenden peptidos que consisten en de 3 a 5, 8, 10 o 15 aminoacidos.

11. El procedimiento de la reivindicacion 1, donde el soporte comprende un material sintetico, un material natural, o ambos.

12. El procedimiento de la reivindicacion 1, donde el soporte comprende agarosa, poliacrilamida, dextrano, celulosa, polisacarido, nitrocelulosa, sflice, alumina, oxido de aluminio, dioxido de titanio, oxido de titanio, circona, estireno, difluoruro de polivinilo nailon, copolfmero de estireno y divinilbenceno, ester de polimetacrilato, polfmero o copolfmero de azlactona derivatizada, vidrio, celulosa, agarosa, derivados de cualquiera de los anteriores y combinaciones de cualquiera de los anteriores.

13. El procedimiento de la reivindicacion 1, donde el soporte es un lecho de resina.

14. El procedimiento de la reivindicacion 1, donde el plasma se trata mediante un agente tamponador antes de la etapa de puesta en contacto con el fin de conservar adicionalmente la concentracion y actividad de uno o mas agentes diana en la muestra de plasma.