BRPI0514435B1 - isolamento sequêncial de proteínas e esquemas de purificação através de cromatografia por afinidade - Google Patents

Abstract

isolamento seqüencial de proteínas e esquemas de purificação através de cromatografia por afinidade a invenção revela métodos para o isolamento e purificação seqüencial de proteínas e purificação a partir de uma amostra biológica através de cromatografia por afinidade. a cromatografia por afinidade é conduzida usando ligantes ou complexos de ligante-suporte que se ligam seletivamente e especificamente a proteínas na amostra biológica. os ligantes ou os complexos de ligante-suporte foram colocados em contato seqüencialmente em uma ordem pré-determinada com a amostra biológica para permitir que cada ligante ou complexo ligante-suporte se ligue seqüencialmente a uma proteína da amostra biológica.

Description

ISOLAMENTO SEQUENCIAL DE PROTEÍNAS E ESQUEMAS DE PURIFICAÇÃO ATRAVÉS DE CROMATOGRAFIA POR AFINIDADE

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

Esse pedido reivindica benefício do Pedido de Patente

Provisório No. de Série 60/602,868, depositado em 20 de agosto de 2004, os conteúdos inteiros do qual são por meio deste incorporados por referência na sua totalidade.

I. CAMPO DA INVENÇÃO

Essa invenção se refere a métodos para o isolamento de proteínas a partir de amostras biológicas. Particularmente, a invenção se refere aos métodos recuperar seqüencialmente proteínas altamente purificadas a partir de amostras biológicas.

II. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

O processamento e desenvolvimento de proteínas requerem um processamento de alta eficiência com um número mínimo de etapas e o máximo rendimento para alcançar a pureza exigida. Os processos de separação e de purificação 20 de proteínas apresentam desafios únicos devido à variedade de proteínas, à natureza diferente de possíveis contaminantes e/ou impurezas associadas com cada preparação de proteína, e à grande quantidade de proteínas geralmente necessária para a produção de biofármacos. Tecnologias de //

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purificação convencionais geralmente envolvem uma série de etapas de purificação com o objetivo de isolar uma única proteína alvo. Com cada etapa, o rendimento decresce e os custos de produção aumentam. Os custos de separação e de 5 purificação de proteínas tipicamente representam mais de 50% dos custos de produção total de todas as proteínas terapêuticas.

Cromatografia por afinidade é uma das técnicas de separação mais importantes no núcleo da descoberta de 10 drogas e do desenvolvimento de processos. Quanto mais seletiva(s) é/são a(s) etapa(s) de afinidade, melhor é a eficiência do empreendimento inteiro, o que é um requerimento crítico em experimentos de fracionamento de proteínas. Cromatografia por afinidade encontra uma variedade de aplicações práticas na purificação, detecção e remoção de moléculas alvo a partir do escoamento de componentes múltiplos. A cromatografia por afinidade é baseada em interações específicas e tridimensionais entre

as moléculas alvo e entidades ãs	quais elas se ligam	(isto
20 é,	ligantes)	. Ligantes	podem	ser	isolados ou gerados	para
se	ligarem	de uma	forma	específica e	reversível a

praticamente qualquer molécula alvo. Ligantes potenciais incluem moléculas biológicas tais como proteínas, anticorpos, peptídeos e semelhantes, e ligantes sintéticos /Λ ♦ ··· · ··· · · · ··· ··· «···· · · · · » ♦ • · ··*» · · · · ♦ · ·· • · ·· · · ······ · · • ·«·· · · ····· ··· · s ·« * · · · · especificamente projetados ou selecionados. Bibliotecas de milhões de ligantes em potencial podem ser geradas usando técnicas de sínteses combinatoriais, muitas das quais são bem conhecidas na técnica (ver, por exemplo, Lam et al. , 5 Nature: 354, 82-84 (1991)) . Para auxiliar na separação de moléculas alvo de uma amostra, ligantes podem ser afixados a uma matriz de suporte sólido, tal como partículas individuais (por exemplo, contas de resina de cromatografia) ou suportes contíguos (por exemplo, 10 arranjos). Ligantes imobilizados em uma matriz de suporte sólido podem, então, ser empregados para purificar alvos de soluções complexas.

Provavelmente, o maior sucesso da cromatografia por afinidade em escala tenha sido conseguido no campo da 15 purificação de anticorpos monoclonais biofarmacêuticos. A demanda para a resina de Proteína A é maior do que 10.000 litros anualmente, e aumentando a 50% por ano, representando um mercado de adsorvente de Proteína A em excesso de $ 50 milhões U.S. em 2002. O uso de cromatografia por imunoafinidade capacita a produção tanto dos fatores de coagulação VIII e IX derivados de plasma e de coagulação recombinante, assim como outras proteínas plasmáticas e biofármacos a partir de fontes naturais e recombinantes.

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Uma das formas mais poderosas de cromatografia por afinidade moderna para uso no processamento à jusante, entretanto, não se baseia em ligantes derivados de fontes naturais tais como anticorpos, mas no uso de ligantes de 5 afinidade sintéticos altamente estáveis. Ver, por exemplo, Sproule et.al., New Strategy for the Design of Ligands for the Purification of pharmaceutical proteins by affinity chromatography; J. Chromãtography B, 740, 17-33 (2 000) .

Essa tentativa usa ligantes personalizados ou projetados ao 10 invés de usar compostos produzidos comercialmente.

Dentre as proteínas plasmáticas isoladas na técnica, albumina e gamaglobulina têm sido particularmente alvejadas para propósitos medicinais. Os procedimentos comumente empregados para isolar essas proteínas do plasma foram 15 baseados no processo de precipitação com etanol gelado desenvolvido por E. J. Cohn e colaboradores durante os anos de 1940. Ver Cohn et.al., Preparation and Properties of Serum and Plasma Proteins. IV. A System for the Separation into Fractions of the Protein and Lipoprotein Components of 20 Biological Tissues and Fluids,· J. Am. Chem. Soc., 68, 459475 (1946). Esse processo foi originalmente desenvolvido para produzir albumina em alto rendimento mas não foi projetado para isolar e purificar os diversos arranjos de proteínas agora produzidos a partir do plasma.

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Particularmente, os rendimentos de componentes de proteínas

	plasmáticas minoritárias por	essas	técnicas	são
	invariavelmente tão baixos	que as	técnicas	são
	inevitavelmente ineficientes em	termos de	rendimento	de

fracionamento total. Ver, por exemplo, a Patente Americana No. 5,138,034 de Uemura et al.

A aplicação da cromatografia por afinidade na purificação da albumina do soro é conhecida na técnica, ver Harvey MJ. In: Curling JM (ed) Methods of Plasma Protein 10 Fractionation. Academic Press London. pp 189-200. A primeira separação de proteínas do plasma relatada é datada cerca de 30 anos atrás e envolvia a depleção da albumina do soro humano (HSA) por cromatografia do plasma para capacitar a identificação e a purificação de proteínas de 15 baixa concentração. Travis, J., and Pannell, R. Behring Inst. Mitt. 54: 30-32 (1974). Esse trabalho foi executado usando um conjugado de dextrana Procion Blue-Sepharose® e identificou um problema inicial com a cromatografia por afinidade de corante, a saber, o vazamento de corante no 20 eluente. Os autores estavam interessados no isolamento da antitripsina alfa-1 do plasma e descreveram a difícil separação dessa proteína da albumina em força iônica alta onde qualquer ligante de troca iônica não-específico está em pequena quantidade.

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O isolamento de várias outras proteínas do plasma também é relatado. Por exemplo, os métodos da técnica anterior descreveram o isolamento e a purificação das frações de Fator VIII e de fibronectina das proteínas do 5 plasma, ver, por exemplo, Patentes Americanas Nos.

4,822,872; 4,093,608; e 4,565,651. Métodos para o isolamento e purificação da antitrombina-III são revelados na, por exemplo, Patente Americana No. 3,842,061. Métodos para o isolamento e purificação do plasminogênio são 10 descritos em, por exemplo, Science: 170, 1095 (1970),

Patentes Americanas Nos. 4,361,652 e 4,361,653. Métodos para o isolamento e purificação de imunoglobulinas são descritos, por exemplo, nas Patentes Americanas Nos. 4,371,520 e 4,093,606. Métodos para o isolamento e 15 purificação da hepataglobulina são descritos nas, por exemplo, Patentes Americanas Nos. 4,061,735 e 4,137,307. Esses métodos, entretanto, não têm a especificidade e seletividade necessária para o isolamento de proteínas usado na produção de agentes biofarmacêuticos múltiplos do 20 mesmo material de partida, por exemplo, plasma humano.

Embora os processos para isolar proteínas a partir de amostras biológicas tenham fornecido alguma melhoria na qualidade do produto, em termos de atividade e pureza específica aumentada, e também em termos de rendimento e

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recuperação, ainda permanece uma necessidade para uma melhoria adicional do processo para obter um concentrado de proteínas em alto rendimento e alta pureza com a minimização da redução na atividade específica das 5 proteínas isoladas geralmente associadas com processos da técnica anterior. Isso é particularmente verdade em situações onde alvos múltiplos de proteínas são simultaneamente isolados a partir de uma fonte comum. Essa invenção resolve essas e outras necessidades sentidas há 10 muito tempo, através do fornecimento de métodos utilizando técnicas de cromatografia por afinidade para isolar e purificar várias proteínas de maneira eficiente a partir de materiais biológicos e, particularmente, do plasma, através da combinação de processos de adsorção em seqüências pré15 determinadas e definidas.

III. RESUMO DA INVENÇÃO

A invenção, conforme aqui revelada e descrita, fornece métodos para o isolamento e purificação de proteínas seqüencial a partir de amostras biológicas. Os métodos 20 compreendem (i) o fornecimento de uma amostra biológica, (ii) o fornecimento de dois ou mais ligantes, cada um dos quais se liga especificamente e seletivamente a uma proteína alvo a partir da amostra biológica, em que cada um dos ligantes é opcionalmente ligado a um suporte para

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formar dois ou mais complexos ligante-suporte, (iii) o contato sequencial de dois ou mais ligantes ou complexos de suporte e ligante em uma ordem pré-determinada com a amostra biológica para permitir que cada ligante ou complexo suporte e ligante se liguem seqüencialmente à proteína alvo da amostra biológica, em que a amostra biológica não é processada através de uma etapa de précondicionamento antes do contato, (iv) a eluição da proteína alvo ligada a cada um dos dois ou mais ligantes ou 10 complexos de suporte e ligante, e (v) o isolamento da proteína alvo seqüencialmente da amostra biológica. A etapa de pré-condicionamento compreende vários processos tais como, por exemplo, precipitação com álcool, crioprecipitação, remoção de lipídeos e/ou proteínas 15 lipídicas, precipitação de euglobulina ou uma combinação destes, dentre outros.

Em uma modalidade, a amostra biológica é o plasma e a proteína alvo compreende fibrinogênio (Fg), inibidor da alfa-1 proteinase (A1PI) , apolipoproteína Al (ApoAl), 20 imunoglobulinas (igG), paraoxonase (PON), fatores de coagulação, fator de Von Willebrand (vWF), Fator VIII (FVIII), albumina de soro humana (HSA) , plasminogênio (Pg) ou qualquer combinação dos mesmos.

Em outra modalidade, a amostra biológica compreende /f

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«I uma fermentação in vitro ou cultura celular ou um tecido ou fluido extraído de um animal transgênico ou planta, e as proteínas são proteínas recombinantes.

Em ainda outra modalidade, a atividade da paraoxonase é substancialmente mantida na amostra biológica durante o isolamento de proteína.

Em uma modalidade, o vWF/FVIII é isolado do plasma antes de outras proteínas, ou depois de outras proteínas.

Em outra modalidade, a apolipoproteína Al é isolada do plasma depois de outras proteínas.

Em ainda outra modalidade, albumina é isolada do plasma antes da IgG ou depois da IgG.

Em outra modalidade, plasminogênio é isolado do plasma antes do fibrinogênio.

Em ainda outra modalidade, a ordem pré-determinada do contato de dois ou mais ligantes com a amostra biológica resulta na ligação seqüencial de vWF/FVIII, Pg, Fg, ApoAl/PON, IgG, HSA e A1PI na ordem citada.

Em outra modalidade, a ordem pré-determinada do contato de dois ou mais ligantes com a amostra biológica resulta na ligação seqüencial de vWF/FVIII, ApoAl/PON, Pg, Fg, IgG, HSA e A1PI, na ordem citada.

Em uma modalidade adicional, a ordem pré-determinada do contato de dois ou mais ligantes com a amostra biológica

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resulta na ligação sequencial de vWF/FVIII, IgG, HSA e A1PI na ordem citada.

Os ligantes da invenção compreendem moléculas baseadas em polipeptídeos ou ácidos nucléicos, anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno, moléculas nãopolipeptídicas ou baseadas em nucleotídeos, miméticos de carboidratos, peptidomiméticos, moléculas pequenas, materiais inorgânicos, corantes, carboidratos, lipídeos ou qualquer combinação destes.

Em uma modalidade, os ligantes são peptídeos compreendendo de cerca de 1 até cerca de 15 aminoácidos.

Em outra modalidade, os ligantes e/ou complexos de suporte-ligante compreendem ligantes de afinidade sintética tais como ligantes Mimetic Blue®, ligantes MAbsorbent®, 15 ProMetic PBL 112-80, ProMetic PBL 112-81, ProMetic PBL 11282 e ProMetic PBL 112-83.

O suporte compreende um material sintético, um material natural ou ambos. Exemplos de suportes incluem agarose, poliacrilamida, dextrana, celulose, polissacarídeo, nitrocelulose, sílica, alumina, óxido de alumínio, titânia, óxido de titânio, zircônia, estireno, nylon de polivinildifluoreto, copolímero de estireno e de divinilbenzeno, éster de polimetacrilato, hidroxietilmetacrilato, acrílico, álcool polivinílico, <Zt>

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polietilenoglicol, polímero ou copolímero derivado de azlactona, vidro, celulose, agarose, derivados de qualquer um dos precedentes e combinações de qualquer um dos precedentes.

Em uma modalidade preferida, o suporte ê um polissacarídeo ou conta de resina.

Em outro aspecto, a invenção fornece uma preparação compreendendo proteína plasmática substancialmente pura produzida pelo isolamento seqüencial de proteínas da invenção.

Em uma modalidade, o plasma ê substancialmente purificado com uma pureza de pelo menos 70%.

Em outra modalidade, a preparação é substancialmente purificada, livre de quaisquer impurezas causadas por imunoadsorventes, e que tenha sido submetida a pelo menos uma etapa de inativação de patógeno.

Em ainda outra modalidade, a amostra biológica é tratada com um agente tamponante antes da etapa de contato a fim de ainda conservar a concentração e atividade de um ou mais agentes alvo na amostra biológica.

Em outro aspecto, a preparação é formulada como uma composição farmacêutica.

Esses e outros aspectos e modalidades da invenção são revelados aqui em detalhes.

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IV. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Métodos para o isolamento e purificação eficiente de proteínas a partir de amostras biológicas são aqui revelados. Particularmente, a presente invenção revela 5 métodos de purificação seqüencial de proteínas do plasma usando cromatografia de afinidade. Os métodos de purificação seqüencial de proteínas da presente invenção usam dois ou mais ligantes, cada ligante sendo opcionalmente ligado a um suporte para formar um complexo 10 ligante-suporte. Cada ligante ou complexo de suporteligante se liga especificamente e seletivamente a uma proteína plasmática alvo em uma ordem pré-determinada para permitir que cada ligante ou complexo de suporte-ligante se ligue seqüencialmente a uma proteína alvo do plasma.

Os métodos de isolamento e purificação seqüencial de proteínas da invenção são altamente específicos e não requerem pré-condicionamento específico do plasma, conforme rotineiramente usado na técnica anterior, antes de entrar em contato com o ligante. Tal etapa de pré-condicionamento 20 não inclui o tamponamento ou a filtração geral. A etapa de pré-condicionamento dentro do escopo da invenção inclui, por exemplo, métodos e processos tais como precipitação com álcool, crioprecipitação, remoção de lipídeos e/ou proteínas lipídicas, precipitação de euglobulina ou uma combinação destes, dentre outros. É pretendido aqui que as etapas de pré-condicionamento anteriormente mencionadas sejam especificamente excluídas da invenção reivindicada.

Os métodos de purificação de proteína do plasma da presente invenção são altamente valiosos na produção de biofármacos por causa da sua capacidade de produzir proteínas plasmãticas substancialmente puras e altamente ativas de maneira eficiente e rápida. Os métodos da presente invenção são também úteis em uma variedade de outras aplicações 10 incluindo prognóstico, diagnóstico e/ou detecção de anormalidades.

1. Definições

As definições usadas nesse pedido são para propósitos ilustrativos e não limitam o escopo da invenção.

Conforme aqui utilizado, amostra inclui qualquer amostra contendo uma proteína alvo que possa ser isolada e purificada pelo método da invenção. Amostras podem ser obtidas a partir de qualquer fonte que contenha potencialmente uma proteína alvo. Tais fontes incluem animais, plantas, solo, ar, água, fungos, bactérias e vírus, dentre outras. Amostras de animais são obtidas, por exemplo, de biópsia tecidual, sangue, cabelo, raspagens bucais, plasma, soro, pele, ascite, efusão plural, fluido toracentese, fluido espinhal, fluido linfático, medula .^3 • ··· · ··· · · · ·· ··· «»«·· ♦ ♦ · · · · • · · ♦ · · · ♦ · · · · ·· • · ·· ♦ · ···»«· · * • ···· · · ····· • ♦ · · · · · · · · · ·

óssea,	fluido respiratório,	fluido intestinal,	fluido
genital,	fezes, urina, esputo,	lágrimas, saliva,	tumores,
órgãos,	tecidos, amostras dos	constituintes de	cultura
celular	in vitro, células fetais, células placentárias ou
células	amnióticas e/ou fluido,	dentre outras.

Conforme aqui utilizado, cultura celular inclui qualquer cultura procariótica ou eucariótica tal como, por exemplo, cultura celular bacteriana, de levedura ou outra microbiológica, cultura de células de mamíferos, cultura de 10 células vegetais, e cultura de células de insetos, caldo de fermentação e outras culturas celulares usadas para a produção e distribuição de biofármacos e a preparação da terapêutica.

Conforme aqui utilizado, plasma se refere a 15 componentes sanguíneos líquidos e inclui derivados do plasma e composições contendo plasma.

Conforme aqui utilizado, ligação é amplamente definido dentro do escopo da invenção e inclui qualquer tipo de processo de ligação física, química ou biológica 2 0 entre duas entidades e inclui, por exemplo, e não a título de limitação, interação por absorção, adsorção, ligação covalente, troca iônica, hidrofóbica, de ligação de hidrogênio, dipolo, quadrupolo ou por afinidade, formação de espécies carregadas, ligação de ligantes por afinidade φ φφφ φ ·«· φ φ φ φφφ φφφ φφφφφ φφφ φ φφ φ φ φφφφ φ φ · · · φ φφ φ φ φφ φ φ φφφφφφ φ φ

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ΦΦΦ Φ · ΦΦΦ · Φ Φ Φ (por exemplo, incluindo peptídeos, oligonucleotídeos, proteínas, braços espaçadores, porções hidrofôbicas e materiais fluorados), dentre outros.

Conforme aqui utilizado, ligantes são definidos amplamente dentro do escopo da invenção e incluem entidades químicas ou biológicas que se ligam a uma proteína alvo.

Ligantes são compostos, moléculas, células e constituintes celulares que se ligam a uma proteína alvo e podem ser isolados de materiais naturalmente ou sinteticamente produzidos. Ligantes podem ser endógenos ou exógenos para um procarioto ou eucarioto. Ligantes incluem peptídeos, polipeptídeos, peptidomiméticos, moléculas pequenas, corantes, compostos contendo triazina, anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno, moléculas baseadas em ácidos nucléicos, não-polipeptídeos ou moléculas baseadas em nucleotídeos, carboidratos, miméticos de carboidratos, lipídeos, materiais inorgânicos, inibidores, substratos ou qualquer combinação destes.

Conforme aqui utilizado, substancialmente purificado ou substancialmente livre se refere a proteínas que são removidas a partir de seu ambiente natural e são isoladas ou separadas, e são pelo menos cerca de 70% livre, preferivelmente cerca de 85% livre, mais preferivelmente cerca de 95% livre e, mais preferivelmente, cerca de 99% ou

mais livre de outros componentes com os quais elas estejam naturalmente associadas.

Conforme aqui usado, moléculas baseadas. em polipeptídeos incluem quaisquer proteínas, polipeptídeos ou fragmentos de peptídeos, peptídeos naturais, peptídeos recombinantes, peptídeos sintéticos, fragmentos biologicamente ativos, polipeptídeos substancialmente homólogos, oligopeptídeos, homodímeros, heterodímeros, variantes dos polipeptídeos, polipeptídeos modificados, 10 derivados, análogos, proteínas de fusão, agonistas, antagonistas e anticorpos, dentre outros.

Conforme aqui utilizado, moléculas pequenas incluem, mas não estão limitadas, a carboidratos, miméticos de carboidratos, peptidomiméticos, compostos orgânicos ou inorgânicos (isto é, incluindo compostos heterorgânicos e organometálicos) com um peso molecular menor do que cerca de 10.000 gramas por mol, compostos orgânicos ou inorgânicos com um peso molecular menor do que cerca de 5.000 gramas por mol, compostos orgânicos ou inorgânicos 20 com um peso molecular menor do que cerca de 1.000 gramas por mol, compostos orgânicos ou inorgânicos com um peso molecular menor do que cerca de 500 gramas por mol e sais, ésteres e outras formas quimicamente aceitáveis de tais compostos.

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Conforme aqui utilizado, ο termo patógeno pretende significar qualquer agente replicável que possa ser encontrado em uma amostra biológica, tal como uma amostra sanguínea ou infectar um organismo. Tais patógenos incluem 5 os vários vírus, bactérias, protozoários e parasitas conhecidos pelos indivíduos versados na técnica, que geralmente são encontrados ou infectam o sangue como um todo ou componentes sanguíneos e outros contaminantes patogênicos ainda não conhecidos. Exemplos ilustrativos de 10 tais patógenos incluem, mas não estão limitados, a bactérias, tais como espécies de Streptococcus, espécies de Escherichiae espécies de Bacillus; vírus, tais como vírus da imunodeficiência humana e outros retrovírus, vírus da herpes, paramixovírus, citomegalovírus, vírus da hepatite 15 (incluindo hepatite A, hepatite B e hepatite C), pox-vírus e togavírus; e parasitas, tais como parasitas da malária, incluindo as espécies Plasmodium, e parasitas tripanossômicos.

Outros termos usados no campo da purificação protéica, 20 conforme aqui utilizados, serão geralmente entendidos por um indivíduo normalmente versado na técnica aplicável.

Em uma modalidade, a invenção fornece métodos para a extração de proteínas plasmáticas específicas do plasma. Esses métodos utilizam resinas de cromatografia às quais

* · · ······ • ····♦· · · * * · · · · · • · · ♦ · · · ligantes, seletivos e específicos para duas ou mais proteínas plasmáticas são ligados a isso. As resinas são colocadas em contato com o plasma, cujo contato resulta na ligação seletiva da proteína alvo com o ligante. A proteína 5 alvo pode, a seguir, ser eluída com alta recuperação e pureza. Sendo assim, de acordo com o método da presente invenção, o plasma pode ser eficientemente fracionado em vários componentes das proteínas plasmáticas. Seqüências preferidas para a extração e subsequente isolamento de 10 proteínas plasmáticas específicas são aqui reveladas.

Proteínas plasmáticas dentro do escopo da invenção incluem qualquer e todas das mais de 10.000 diferentes proteínas que ocorrem no plasma, incluindo, por exemplo, e não a título de limitação, a butirilcolinesterase (BChE), 15 fatores de coagulação sangüíneos (por exemplo, fibrinogênio, fator II, fator V, fator VII, fator VIII, fator IX, fator X, fator XI e fator XII), fibronectina, protrombina, proteína C, plasminogênio, antitrombina-III, haptoglobina, transferrina, albumina, inibidor da 20 proteinase alfa 1, apolipoproteína Al (também conhecido como lipoproteína Apo-Al) , imunoglobulinas, paraoxonase, fator de Von Willebrand (vWF) , todos os quais são naturalmente encontrados no plasma de um organismo em um estado sadio.

Alternativamente, a proteína plasmática dentro do escopo da invenção está presente no plasma associado com um estado de doença, o qual pode ou não ser encontrado no plasma de um indivíduo saudável. Também englobadas dentro do escopo da invenção estão as proteínas plasmáticas que estão presentes no plasma como o resultado da administração de um agente, por exemplo, um fármaco. Sob esse aspecto, a proteína plasmática pode ser uma proteína de príon PrPsc infecciosa.

1. Ligantes

O método de purificação protéica da invenção utiliza dois ou mais ligantes que estão ligados a um sistema de suporte. Os ligantes podem compreender um ou mais grupos

funcionais	para	proporcionar	interações iônicas,
15 hidrofóbicas,	ligações de hidrogênio	ou	interações de Van	z r
der Waal com	grupos	correspondentes	na	biomolécula a ser
separada. Ligantes	adequados para	o	método inventivo

incluem compostos químicos sintéticos que são produzidos, por exemplo, a título de síntese direta, ou bibliotecas de 20 diversidade, tais como bibliotecas de peptídeos ou de nãopeptídeos aleatórias ou combinatoriais. Outras bibliotecas conhecidas na técnica incluem bibliotecas quimicamente sintetizadas, bibliotecas recombinantes (por exemplo, bibliotecas de exibição de fagos) e bibliotecas baseadas em

• · ·«*··« ♦ · · · »····» · -» * · · · · * • « * + tradução in vitro. As bibliotecas podem ser tríadas para moléculas que se ligam especificamente a uma proteína alvo da invenção.

Exemplos de bibliotecas quimicamente sintetizadas são descritas, por exemplo, em Fodor et al., Science 251:767773 (1991); Houghten et al. , Nature 354:84-86 (1991);

Brenner and Lemer, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:5381-5383 (1992), e na Patente Americana No. 6,117,996, dentre outras. Exemplos de bibliotecas de exibição de fagos estão 10 descritas, por exemplo, em Scott and Smith, Science

249:386-390 (1990); Devlin et al., Science 249:404-406 (1990); e Christian et al. , J. Mol. Biol. 227:711-718 (1992), dentre outros. Bibliotecas baseadas em tradução in vitro são descritas, por exemplo, em Mattheakis et al. , 15 Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91:9022-9026 (1994), dentre outros.

Em uma modalidade, o ligante da invenção é um peptídeo consistindo essencialmente de cerca de 3 até cerca de 5, 8,

10, 15 ou 3 0 aminoácidos ou mais. Os aminoácidos são aminoácidos D e/ou L. 0 peptídeo pode ser convenientemente selecionado de qualquer biblioteca peptídica, incluindo bibliotecas peptídicas aleatórias, bibliotecas peptídicas combinatoriais ou bibliotecas peptídicas tendenciosas. O termo tendenciosa é aqui utilizado para significar que o

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método de geração da a biblioteca é manipulado de forma a restringir um ou mais parâmetros que governam a diversidade da coleção resultante de moléculas.

Nas bibliotecas de peptídeos, o número de peptídeos discretos de sequências diferidas aumenta dramaticamente com a quantidade de reações de acoplamento efetuadas, do tamanho do peptídeo e o número de aminoácidos distintos utilizados. Por exemplo, a incorporação aleatória de 19 aminoácidos em pentapeptídeos produz até 2.476.099 (19⁵) peptídeos individuais de seqüência diferidas (Lam et al., supra). Métodos combinatoriais permitem a geração de bibliotecas de ligantes diretamente em um suporte. Tipicamente, os ligantes são sintetizados em partículas de suporte de forma que múltiplas cópias de um único ligante sejam sintetizadas em cada partícula (por exemplo, conta), embora isso não seja necessário no contexto da invenção.

Outro exemplo de uma biblioteca que pode ser usada, na qual as funcionalidades amida nos peptídeos tenham sido pré-metiladas a fim de gerar uma biblioteca combinatorial quimicamente transformada, é descrito por Ostresh et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91:11138-11142 (1994).

Bibliotecas não-peptídicas podem ser amplamente classificadas em dois tipos: oligômeros e monômeros decorados. Bibliotecas de monômeros decorados empregam uma

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estrutura de esqueleto relativamente simples na qual uma variedade de grupos funcionais é adicionada. Geralmente o esqueleto será uma molécula com uma atividade farmacológica útil conhecida. Por exemplo, o esqueleto deve ser a 5 estrutura benzodiazepínica.

Bibliotecas de oligômeros não-peptídicos utilizam um grande número de monômeros que são montados juntos de maneiras que criam novas formas que dependem da ordem dos monômeros. Dentre as unidades monoméricas que estão sendo 10 usadas estão os carbamatos, pirrolinonas e morfolinos.

Peptóides, e oligômeros semelhantes a peptídeos nos quais a cadeia lateral está ligada ao grupo amino alfa ao invés do carbono alfa, forma a base de outra versão de bibliotecas de oligômeros não-peptídicos. As primeiras bibliotecas de 15 oligômeros não-peptídicos utilizaram um único tipo de monômero e, dessa forma, continha uma estrutura repetitiva. Bibliotecas recentes têm utilizado mais de um monômero, conferindo flexibilidade às bibliotecas adicionadas.

Outras bibliotecas não-peptídicas que são úteis na 20 presente invenção são, por exemplo, bibliotecas descritas por Ecker and Crooke, Bio/Technology 13:351-360 (1995) .

Essas bibliotecas usam compostos tais como, por exemplo, benzodiazepinas (ver, por exemplo, Bunin et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91:4708-4712 (1994)) podem ser adaptados para uso. Adicionalmente, bibliotecas peptóides (por exemplo, Simon et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:9367-9371 (1992)) também podem ser usadas. Outros compostos usados nas bibliotecas peptídicas incluem 5 hidantoínas, piperazinodionas, bifenilas, análogos de açúcar, beta-mercaptocetonas, ácidos arilacéticos, acilpiperidinas, benzopiranos, cubanos, xantinas, aminimidas e oxazolonas, dentre outros.

A varredura das bibliotecas pode ser efetuada por qualquer uma de uma variedade de métodos comumente conhecidos. Ver, por exemplo, as referências a seguir, as quais revelam a varredura de bibliotecas de peptídeos: Parmley and Smith, Adv. Exp. Med. Biol. 251:215-218 (1989); Scott and Smith, id.; Fowlkes et al., BioTechniques 13:42215 427 (1992); Oldenburg et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA

89:5393-5397 (1992); e Yu et al. , Cell 76:933-945 (1994), dentre outras. A varredura para identificar uma molécula que se liga a uma proteína alvo pode também ser executada pelo contato dos membros da biblioteca com a proteína alvo 20 imobilizada em uma fase sólida e pela coleta daqueles membros da biblioteca que se ligam à proteína de interesse.

Exemplos de tais métodos de varredura, nomeadas técnicas de garimpo, são descritos a título de exemplo em Fowlkes et al., id.

Preferivelmente, os ligantes da invenção são projetados por química combinatória e modelagem e inclui ligantes sintéticos/biomiméticos que podem ser simétricos ou assimétricos, moléculas individuais ou ramificadas. Os 5 ligantes preferivelmente são resistentes ao álcali e resistem ã regeneração alcalina normal e procedimentos de sanitização. Os ligantes da invenção têm vazamento muito baixo, são seguros e possuem alta capacidade de ligação e especificidade ã proteína alvo.

Ligantes ou sistemas de suporte-ligante preferidos usados dentro do escopo da invenção incluem, a título de exemplo e não de limitação, ligantes Mimetic Blue® (para coluna HSA), e a resina é designada Mimetic Blue® SAHL P6XL; ligantes MAbsorbent® (para ligação de IgG), e o 15 adsorvente designado MAbsorbent® A2P; ProMetic PBL 112-80 adsorvente para A1PI; ProMetic PBL 112-81 adsorvente para fibrinogênio; ProMetic PBL 112-82 adsorvente para plasminogênio; ProMetic PBL 112-83 adsorvente para vWF/Fator VIII; ECH-Lys-Sepharose FF. Lot# 243526; SAHL 20 P6XL-Resina; e resinas ligantes de peptídeos incluindo ARQFDF (SEQ ID NO: 1) . Os adsorventes acima mencionados usam Purabead 6XL (agarose ligada de forma cruzada) como a matriz de suporte. Matrizes de suporte Purabead 6 ou 6XL não adsorvem essas proteínas por si só.

2. Suporte

Em uma modalidade do método inventivo, o ligante está ligado a um suporte. O termo suporte, conforme aqui utilizado, se refere a qualquer matriz de suporte, tais 5 como aqueles suportes sólidos conhecidos na técnica, os quais servem para imobilizar o ligante. Um suporte ou matriz de suporte é qualquer substância sólida ou líquida, porosa ou não-porosa, bidimensional ou tridimensional à qual um ligante pode estar ligado e a qual fornece uma 10 forma conveniente de separar o ligante dos solutos em uma solução de contato. Preferivelmente, o suporte é inerte, depois da ligação do ligante de forma que a reação covalente com o alvo é minimizada.

Também é incluído, dentro do escopo da invenção, o uso de braços espaçadores para o acoplamento de ligantes ao suporte. Braços espaçadores podem tomar uma variedade de formas diferentes, incluindo mas sem se limitar a materiais hidroxilados como polietilenoglicóis, óxidos de polietileno, ' alcanos lineares .ou ramificados, diaminas, glicóis, anéis aromáticos e carboidratos ou qualquer combinação destes, dentre outros.

Em uma modalidade, a matriz de suporte compreende partículas porosas que são capazes de adsorção ou de absorção do agente alvo. As partículas são opcionalmente \35

• φ φ φφφ φφφ φ φ φ φ « revestidas com um ou mais materiais para modificar as propriedades de superfície da matriz do suporte, cujos materiais são não-incháveis ou incháveis em fluidos orgânicos ou fluidos aquosos e são substancialmente 5 insolúveis em água ou fluidos.

Uma matriz de suporte preferida usada com o esquema de purificação sequencial de proteínas da presente invenção é uma partícula porosa. Partículas porosas para separações por adsorção estão disponíveis em uma grande variedade de 10 materiais diferentes, incluindo sílica, vidro, celulose, agarose e uma ampla variedade de polímeros diferentes, incluindo polimetilmetacrilato de poliestireno, poliacrilamida, agarose, hidrogel, resinas acrílicas e outros tipos de géis usados para eletroforese. Muitas das 15 partículas de adsorção porosa tais como sílica, vidro e polímeros podem ser secos e têm poros interconectados com áreas de superfície na faixa de cerca de 1-2 m²/g de partículas secas até acima de 300 m²/g de partículas secas. Outros tipos de partículas são hidrogéis ligados de forma 20 cruzada.

Matrizes de suporte particularmente preferidas são resinas de agarose e metacrilato polihidroxilado. Vários géis de agarose e resinas poliméricas em forma de pérolas são comercialmente disponíveis. Esses suportes podem ser

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adquiridos com ligantes pré-ligados ou alternativamente, os ligantes podem ser indiretamente ligados ou diretamente imobilizados no suporte usando métodos padronizados (ver, por exemplo, Harlow and Lane, Antibodies, Cold Spring

Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1988);

Biancala et al., Letters ín Peptide Science, 7(291), 297(2000); MacBeath et al. , Science, 289, 1760-1763 (2000);

Cass et al. , ed. , Proceedings of the Thirteenth American Peptide Symposium. Leiden, Escom, 975-979 (1994) ; Patente

Americana No. 5,576,220; Cook et al. , Petxahedron Letters;

35, 6777-6780 (1994) ; e Fodor et al., acima. Em uma modalidade, o(s) ligante(s) é/são sintetizados na superfície do suporte, a qual é vantajosa na geração de bibliotecas de peptídeos. O(s) ligante(s) podem ser 15 quimicamente conjugados ao suporte ou podem estar ligados através de ligantes, tais como estreptavidina, betaalanina, glicina, polímeros contendo glicina-serina, hidrocarbonetos de cadeia curta de fórmula -(CH₂), polietilenoglicol, ácido epsílon-aminocapróico e ligantes 2 0 compreendendo -O(CH₂)_n, θπι que n é 1-30.

3. Ligação e elulção das proteínas alvo

Ligação da proteína alvo ou da biomolécula alvo ao ligante ou ao complexo ligante-suporte é normalmente efetuado através do contato do ligante ou do complexo

ligante-suporte com uma solução aquosa contendo os alvos. Isso pode ser conseguido em uma variedade de formas incluindo, mas sem se limitar, à passagem da solução contendo o alvo através de um leito ou coluna empacotada do complexo ligante-suporte, ou a adsorção em lote em uma pasta ou tanque agitado. Preferivelmente, a proteína alvo é capturada pela passagem da solução aquosa através de uma coluna de çromatografia usando uma bomba para controlar a taxa de fluxo. A ligação de forma ideal da proteína alvo 10 deveria ser efetuada de tal forma que o ajuste anterior da solução não fosse necessário e a solução contendo o alvo fosse aplicada diretamente ao complexo ligante-suporte. Entretanto, onde requeridas para ligação, as propriedades da solução contendo o alvo podem ser ajustadas por, por 15 exemplo, diluição, alterações do pH, força iônica ou polaridade, alterações de temperatura e a adição de agentes solúveis incluindo, mas sem se limitar, a sais de tampões, sais inorgânicos, sais orgânicos, compostos quelantes, tióis, detergentes, tensoativos, solventes orgânicos, 20 álcoois, glicóis, agentes caotrópicos, íons metálicos ou qualquer combinação destes.

Para recuperar a proteína alvo do ligante ou do complexo ligante-suporte, o ligante ou o complexo suporteligante pode ser colocado em contato com uma solução (por

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exemplo, uma solução de transferência ou tampão de eluição) que promova a dissociação da proteína alvo do ligante ou do complexo ligante-suporte. A solução de transferência pode ser selecionada a partir de tampões de 5 várias concentrações salinas, pH, ou capacidade de desnaturação, solventes orgânicos, agentes modificadores de polaridade, tais como álcoois e água deionizada. Alternativamente, ou em adição, um gradiente elétrico ou alteração de temperatura pode dissociar a proteína alvo do 10 complexo proteína-ligante-suporte. Soluções de transferência também podem compreender ligantes (diferentes do ligante do complexo proteína-ligante-suporte), cofatores para a proteína alvo, moléculas enantioméricas específicas e semelhantes, O uso de deferentes soluções de 15 transferência permite a investigação das condições de eluição ou transferência de uma proteína alvo específica. A dissociação e as condições de transferência empregadas no método inventivo são selecionadas para minimizar a ruptura do ligante e da proteína alvo. Em outras palavras, a 20 eluição e as condições de transferência não devem liberar o ligante do suporte ou desnaturar a proteína alvo, a não ser que isso seja desejado.

Em uma modalidade, a proteína alvo é detectada e identificada no suporte de proteína-ligante antes da

·♦···♦ φ φ • φ φ φ φ φ • ♦ · φ φ eluição. Α detecção e identificação da proteína alvo no suporte proteína-ligante pode compreender a realização do ensaio de ligação. Um ensaio de ligação envolve tipicamente o contato do suporte proteína-ligante, com uma porção 5 conhecida por se ligar ao substrato. Porções de ligação para uso em ensaios de ligação incluem, por exemplo, seus anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno, proteínas ou oligonucleotídeos. Preferivelmente, o suporte proteínaligante entra em contato com um anticorpo ou um fragmento 10 de ligação a antígeno seu que se liga ã proteína alvo (ou subproduto químico ou biológico da proteína alvo ou um fragmento seu) . A porção de ligação preferivelmente ê marcada com uma identificação detectável tal como, por exemplo, um radioisótopo, um cromóforo ou uma identificação 15 fluorescente. Em um ensaio de ligação como tal, um sinal emitido pela identificação detectável é detectado, sinalizando dessa forma a presença da proteína alvo. Uma vez que a presença da proteína alvo no suporte proteínaligante é elucidado, a proteína pode ser isolada.

Ensaios de ligação para a detecção de um alvo são ainda descritas em, por exemplo, Harlow and Lane, acima;

Sambrook et al., Molecular Cloníng, A Laboratory Manual, 2^a edição, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); e Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and

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Research Chemicals (9th ed.), Molecular Probes, Eugene, OR (2002). Opcionalmente, o método inventivo pode ainda compreender uma etapa de lavagem para remover o excesso de porções ligantes não-ligadas ou marcadores antes da 5 detecção.

Alternativamente, o método inventivo pode compreender a efetuação de um ensaio de atividade enzimática para caracterizar uma proteína alvo com base na atividade biológica. Um substrato enzimático é aplicado ao suporte 10 proteína-ligante o qual permite a modificação enzimática do substrato pela proteína alvo para formar um produto. O produto é, a seguir, detectado, identificando dessa forma a presença da proteína alvo na amostra.

A ligação e a eluição das proteínas alvo pode ser medida por qualquer método adequado, muitos dos quais existem e cujo desempenho e adequabil idade para um propósito particular serão conhecidos por uma pessoa habilitada na técnica.

4. Métodos de uso

A presente invenção, conforme aqui descrita, fornece métodos para o isolamento sequencial de proteínas a partir de amostras biológicas, cujos métodos produzem proteínas altamente ativas e substancialmente purificadas. Os métodos da invenção são altamente sensíveis e capazes de separar

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quantidades mínimas de proteínas alvo de uma amostra. Os métodos de purificação sequencial de proteínas da invenção são úteis em uma variedade de aplicações incluindo prognóstico, diagnóstico, detecção, purificação, separação, processamento de produtos gênicos in vitro expressos, e produção de biofãrmacos. As técnicas de purificação e extração da invenção oferecem vantagens sobre as técnicas de purificação convencionais pela redução da quantidade de etapas de purificação, aumento dos rendimentos, aumento da 10 pureza e superação de limitações associadas com os métodos tradicionais.

Particularmente, os métodos da presente invenção otimizam o processo de purificação protéica e melhoram o processo de produção de biofãrmacos pelo aumento da 15 eficiência e pureza. Biofãrmacos são medicamentos que compreendem proteínas, peptídeos ou outros polinucleotídeos complexos ou macromoléculas baseadas em proteínas (coletivamente produtos gênicos). Seu processo de produção envolve a recuperação do produto gênico desejado a 20 partir da biomassa do hospedeiro, tais como fontes biológicas não-humanas ou de plasma (por exemplo, culturas de células recombinantes ou não-recombinantes, leite de animais transgênicos ou outras fontes recombinantes ou nãorecombinantes) . Os produtos de recuperação comercialmente

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viáveis de uma proteína desejada a partir de uma biomassa é desafiador, uma vez que o último contém proteínas hospedeiras, moléculas de ácido nucléico e outras entidades químicas de ocorrência natural indesejáveis.

Em uma modalidade, os métodos da presente invenção são usados para o isolamento das proteínas do sangue como um todo, de concentrados de células sanguíneas vermelhas, de concentrados de plaquetas, plasma, derivados de plasma, leucócitos, sangue sem leucócitos, cultura de células de 10 mamíferos, caldos de fermentação e outros meios usados para a produção e distribuição de biofármacos e o preparo de terapêuticas.

Em uma modalidade preferida, os métodos da presente invenção isolaram proteínas de plasma altamente ativas 15 seqüencialmente de uma amostra de plasma. Proteínas múltiplas podem ser separadas a partir da amostra concomitantemente e rapidamente pelos métodos da presente invenção a partir de qualquer corrente na indústria de processamento de plasma visando a produção de produtos 20 terapêuticos e/ou farmacêuticos. Um exemplo da ordem de isolamento de proteínas plasmáticas está revelado na Tabela 1 abaixo.

Tabela 1: Esquema de purificação da proteína plasmática

Cascata completa	Cascata 1	Cascata abreviada	Cascata invertida
vWF/FVIII	vWF/FVIII		vWF/FVIII
PON
Pg	pg
Fg	Fg
IgG	igG	IgG	HAS
HSA	UF/DF	HAS	IgG
UF/DF	HSA	UF/DF	UF/DF
A1PI	UF/DF	A1PI	A1PI
	A1PI	_

A proteína plasmática isolada é substancialmente purificada, com uma pureza de cerca de 70%, preferivelmente cerca de 85%, mais preferivelmente cerca de 95%, e mais preferivelmente cerca de 99% ou mais. É aqui pretendido que pela declamação de tais valores de purificação específicos, os valores declamados também incluem todas aquelas quantidades inteiras específicas entre os valores declamados. Por exemplo, cerca de 85% pretende também englobar 80%, 81%, 82%, 83% e 84%, sem declamar efetivamente cada grau específico de purificação substancial nesse ponto.

Será entendido por qualquer pessoa normalmente habilitada nas técnicas relevantes que outras modificações e adaptações adequadas aos métodos e aplicações aqui descritos são prontamente aparentes a partir da descrição da invenção aqui contida em vista da informação conhecida 5 pelo artesão normalmente versado, e pode ser feita sem sair do escopo da invenção ou qualquer modalidade sua. Tendo agora descrito a presente invenção em detalhes, a mesma será mais claramente entendida pela referência aos seguintes exemplos, os quais estão aqui incluídos somente 10 para propósitos de ilustração e não são pretendidos para serem limitantes da invenção.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Definição dos Cenários de Seqüência de Cascata Linear 1-7

A cascata linear foi composta de cinco colunas de cromatografia por afinidade: Albumina (HSA), Fibrinogênio (Fg) , IgG, Plasminogênio (Pg) e PONl/ApoAl. Inicialmente, essas colunas correram sucessivamente em quatro sequências diferentes para determinar a seqüência ótima para a cascata 20 linear. Para simplificar a análise da amostra no processo, somente o fluxo contínuo não-diluído foi coletado como a carga para a próxima coluna na seqüência. Especificamente, isso ajudou a manter a concentração das proteínas de fundo constante por todo o experimento. Isso também simplificou a » · »

comparação de produção versus consumo em cada coluna.

Amostras da carga e de cada fluxo contínuo foram ensaiadas para monitorar a recuperação das proteínas alvejadas e nãoalvejadas no fluxo contínuo. Esses valores foram usados 5 para monitorar cada coluna para determinar a sua capacidade de capturar sua proteína alvo com retenção mínima de proteínas alvo à jusante. A seqüência que melhor se adapta a esse critério foi usada como a Seqüência de Cascata Linear (LCS). Uma vez que os dados analíticos das primeiras 10 corridas ficaram disponíveis, três seqüências adicionais foram testadas, e a coluna A1PI foi adicionada para os Cenários 6 e 7.

Materiais e equipamento

As seguintes resinas foram usadas nas cascatas 15 empacotadas em colunas Pharmacia XK 5 0 (20 ou 3 0 m de comprimento):

Coluna de plasminogênio: Pharmacia ECH-Lys-Sepharose

FF. Lot# 243526.

Coluna de fibrinogênio: ProMetic Purabead, (2 colunas 20 em série) Lot#CG1251 e Lot#CG1252.

Coluna de IgG: ProMetic MAbsorbent A2P, Lot#FA0582-Z.

Coluna HSA: ProMetic Mimetic Blue SAHL P6XL Lote #

FA0500Z.

Coluna PONl/ApoAl: Peptide International, Toyopearl • ♦ · · · ·

WWLHAN Lot#217772.

’ Coluna A1PI: ProMetic 12/330 P6XL Resin Lote # CG « 1255.

Toda a cromatografia foi efetuada usando o sistema cromatografico AKTA Explorer 100 com 950 coletores de frações (Amersham Biosciences).

Ultrafiltração (UF) / diafiltração (DF) foi efetuada com o Sistema de Ultrafiltração Sartorius Sartcon Slice 200 usando duas membranas de acetato de celulose Hydrosart de 10 200 cm² (10 kD de peso molecular de corte).

Métodos

Para cada corrida, a carga para a primeira coluna foi reunida com plasma humano + Tris 50 mM, pH 7,5 filtrada em 0,2 gm. O fluxo contínuo para cada coluna foi coletado em frações e reunidas baseando-se no perfil de absorvância de

UV (A_2so) do cromatograma. Essa reunião foi usada como o material de carga para a próxima coluna na sequência. Se a próxima coluna tivesse que correr no dia seguinte, o fluxo contínuo foi submetido a filtração estéril ( filtração a

0 vácuo em 0,2 μιη) e estocado em temperatura ambiente. Nos cenários 6 e 7, UF/DF foi usado para reduzir o volume e efetuar uma troca de tampão no fluxo contínuo reunido conforme indicado na Tabela 2 abaixo. Isso foi necessário

··· ···

para colocar o material de carga A1PI dentro do tampão de corrida da coluna A1PI (fosfato de sódio 15 mM, pH 6,1).

Tabela 2: Sequências de coluna

Cenário#l	Pg -» Fg - > IgG - HSA -+ ApoA-l/PONl
Cenário#2	IgG Fg Pg - HSA -+ ApoA-l/PONl
Cenário#3	Pg _> Fg HSA -> IgG
Cenário#4	Pg -> Fg-> ApoA-l/PONl^ HSA > IgG
Cenário#5	ApoAl/PONl -> Pg -> Fg HSA -> IgG
Cenário#6	Pg _>pg ApoAl/PONl -► HSA -+ UF/DF -> IgG A1PI.
Cenário#7	ApoAl / P0N1-» Pg-> Fg-> HSA- IgG^ UF/DF Al PI

* 10

Resultados

As tabelas e os gráficos de rendimentos das etapas estão apresentados abaixo para cada cenário. N/A significa que o dado não está disponível. <LOD significa que o nível de proteína foi abaixo do limite de detecção para aquele ensaio particular.

Tabela 3: Rendimentos Porcentuais da Etapa para o Cenário #1

	Pg	Fg	IgG	HAS	ApoAl
Pg FT	4,6%	98,9%	96,0%	101,7%	91,8%
Fg FT	0,0%	94,5%	90,8%	84,9%
IgG FT		78,3%	84,5%

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Tabela 4: Rendimentos Porcentuais da Etapa para o

Cenário #2

Tabela 5: Rendimentos Porcentuais da Etapa para o

Cenário #3

	Pg	Fg	HSA	igs	ApoAl	A1PI
Pg	FT	3,47%	90,06%	86,14%	89,61%	86,05%	85,68%
Fg	FT	y -· 1	1,01%	81,67%	70,80%	70,20%	75,03%
HSA	FT		22,74%	74,39%	73,74%	61,34%
IgG	FT		6,82%	1,37%	67,40%

Tabela 5 resume os resultados do cenário #3.

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Tabela 6: Rendimentos Porcentuais da Etapa para o

Cenário #4

	pg	?g	ApoAl	HAS	IgG	A1PI
Pg FT	2,0%	96,0%	90,0%	94, 0%	93, 0%	93%
Fg FT	'	4,0%	83,0%	83,0%	86,0%	84%
ApoAl FT			...	99, 0%	83,0%	79%
HSA FT			• 4i <’ ·· * * j< i : v ·<·** et»	1,0%	89,0%	101%
IgG FT	fc	=:=:j í'i :.'ι.Ζ =:=·-:·		J: . «·: :? h u; ~£ί:-Λ’	0,0%	79%

Tabela 6 resume os resultados do cenário #4.

Tabela 7: Rendimentos Porcentuais da Etapa para o

Cenário #5

	ApoAl	pg	Fg	HSA	IgG
PON1 FT	8,20%	78,0%*	N/A	89,10%	93,10%
Pg FT		0,10%	62,00%	87,70%	86,60%
Fg FT			2,50%	73,80%	72,20%
HSA FT	M·	MBMMI		5,00%	60,80%
IgG FT	·- j ;==:; ·..=: -.... :=.=.--:· .'= · =·— -.===:. -r. . ·==-..:·.·:.·· =: ?:·. · ·<=££?:;::7.=1=		0,70%

*Baseado no ensaio de atividade, dados de Nefelometria não disponíveis.

Tabela 7 resume os resultados do cenário #5.

Tabela 8: Rendimentos Porcentuais da Etapa para o

Cenário #6

41	* ♦ B *	• ··	• 9 φ	• •	«·	t » B	• • ♦ ·	• B ·	«tl • B	• • B
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	•	U		•	B ·	•	•	B	• *	• ·
	B	• B·	•		♦	BB·	B	•	•	•

	pg	pg	ApoAl	HSA	A1PI	IgG
Pg FT	2,00%	91,48%	82,09%	89,67%	81,29%	89,06%
Fg FT		22,90%	75,10%	104,50%	103,12%	106,60%
P0N1FT		<LOD	94,13%	88,76%	99,26%
HSA FT	ΐβίΙββΙίΜίίβββΚΒΜΚΜϊβϊΒ	1,89%	88,57%	73,34%
A1PIFT		<LOD	60,52%
IgG FT	ij^»iB»«ÍMMlMÍiiÍS^» __	<LOD

Tabela 8 resume os resultados do cenário #6.

Tabela 9: Rendimentos Porcentuais da Etapa para o

Cenário #7

	ApoAl	pg	Fg	HSA FT	IgG FT	A1PI
ApoAl	25,4%	73,6%	78,5%	75,9%	76, 0%	63,7%
Pg	hhHHHHhk	< 2,6%	85,5%	88,7%	87,6%	85,4%
Fg	SSBMSMSBS		9,5%	71,4%	72,8%	57,9%
HSA FT	— W.ri=· <:·;!··; s-lh·		Λ®	3, 7%	42, 1%	58, 7%
IgG FT	jfW	W?Be	$ ^·· II		. .'	54,8%
A1PI	osO iÈOfci	BpOB	. ι^ϊ„ϊ;μ	MM·	1 _	< 9,2%

Tabela 9 resume os resultados do cenário #7.

Conclusões

Na corrida precedente do Cenário #1 (mesma seqüência que aquela do Cenário #1), o material de partida foi plasma filtrado sem qualquer sistema de tampão adicionado.

5!

42		• · ·	• · · · ·	• * ·♦»···
	« · • •	• • • · ·	• · · · • · · · · ♦ ♦ · ·	·♦···· · · • · · · * ·

Conforme o plasma foi carregado na coluna, houve um pico * substancial no pH do fluxo contínuo. Como um resultado * dessa observação, tampão Tris 1M, pH 7,5 foi adicionado ao plasma até uma concentração final de Tris de 50 mM antes de ser carregado na primeira coluna. Ver o Exemplo 3 abaixo para um resumo do processo de seleção de tampão. Os sete cenários demonstraram a praticabilidade de correr uma cascata linear de colunas de afinidade como um processo eficaz para purificar proteínas do plasma. Os dados foram analisados e a seqüência foi selecionada baseando-se nas seguintes observações. No Cenário 1, a recuperação das proteínas alvo à jusante permaneceu satisfatoriamente alta por toda a corrida. No Cenário 2, a coluna de IgG exauriu quase que completamente a corrente de alimentação de

Plasminogênio, Fibrinogênio e ApoAl. Novamente no Cenário

3, a coluna de IgG capturou a ApoAl. Com base dessa observação, foi determinado que as colunas PON1, Pg e Fg tinham que ser colocadas antes da coluna de IgG na seqüência.

Os seguintes pontos forma tomados em consideração ao decidir a ordem das etapas de cromatografia na cascata linear de acordo com esse experimento:

• Os passos de captura para a PON1, Pg e Fg deveriam ser colocados antes do IgG.

• Uma vez que a albumina e o citrato vão interferir com a cromatografia A1PI, a coluna de A1PI deve ser colocada depois da coluna de albumina. O fluxo contínuo necessita de uma etapa de processo UF/DF para uma troca de tampão, antes da coluna A1PI.

• IgG deve ser colocado antes da albumina para evitar perdas de IgG.

Sendo assim, a sequência de cascata linear nesse experimento foi escolhida como sendo.·

PONl/ApoAl —> Plasminogênio —> Fibrinogênio -> IgG —>

HSA -9· UF/DF A1PI.

Deve ser notado que, em outro experimento, a coluna PONl/ApoAl foi removida da sequência de cascata atual e que a vWF/FVIII foi inserida antes da Plasminogênio quando a 15 resina ficou disponível.

Exemplo 2: Captura por afinidade das proteínas plasmãticas

A seguinte sequência de colunas usada nesse experimento:

VWF/FVIII —> Plasminogênio —> Fibrinogênio —>IgG —>

UF/DF HSA UF/DF.

Preparo do plasma: quatro litros de plasma reunido congelado foi obtido a partir de estocagem a -20 °C. O plasma reunido foi descongelado em 37,0 ° C em banho maria. Uma vez que o plasma foi descongelado, ele foi rapidamente removido do banho-maria. 0 plasma foi ajustado para Tris 20 mM, NaCl 50 mM usando uma diluição de 50 x de

Tris 1 M, pH 7,5 e uma diluição de 4 0 x de NaCl 2 Μ. O plasma foi bem misturado e filtrado usando um filtro esterilizante SartoPure 300 PP2 (8 gm).

a. Captura por afinidade do Fator de von Willebrand / Fator viu (vWF/FVIIi)

Uma coluna de leito empacotada de 7 cm x 10,6 cm foi preparada contendo 410 mL de adsorvente de afinidade desenvolvido para a captura da Captura por Afinidade vWF/FVIII. A coluna foi tipicamente mantida em uma solução de estocagem contendo NaOH 0,1 N quando não em uso por 15 períodos prolongados de tempo. A coluna previamente estocada foi lavada a uma taxa de fluxo de 8 0 cm/h com 3

CVs de água Milli Q até que a condutividade caísse pra 1 mS/cm. A coluna foi equilibrada com 4 CVs de tampão de equilíbrio (EQ) composto por Tris 20 mM, citrato 20 mM, 20 NaCl 140 mM, pH 7,5. O plasma filtrado foi aplicado na coluna. O efluente de fluxo contínuo foi coletado quando a absorvância a 280 nm alcançou 5% da unidade de absorvância foi de escala completa (AUFS = 2) .

A coluna foi lavada com 4CV de tampão EQ enquanto

continuou a coletar o efluente da coluna até que a absorvância caísse para 5% da AUFS. A solução foi misturada completamente mas gentilmente e, a seguir, filtrada através de uma SartoClean CA 3/0,8 um (H8) seguido por um filtro de 5 0,45/0,22 um de Sartobran P (H8) . O filtro foi posteriormente rinsado com 500 mL de tampão EQ. 0 filtrado combinado foi gentilmente misturado. Essa solução filtrada constituiu a fração de fluxo contínuo da etapa de captura vWF/FVIII (vWF-FVIII-FT (fluxo contínuo)). O vWF/FVIII foi 10 eluído com 4 CV de tampão de eluição composto por Tris 2 0 mM, NaCl 500 mM, CaCl₂ 3 mM, polissorbato 80 0,01%, etilenoglicol 30%, pH 6,5. A taxa de fluxo de coluna foi ajustada para 30 cm/h. A coluna do eluato foi iniciada uma

vez que a	o, o	de UV aumentou	até	2%	da AUFS. 0	eluato foi
15 continuamente	coletado	até	que	a	absorvância	caísse de
volta para	2%	: da AUFS.	O eluato	da	coluna foi	gentilmente
misturado	e	estocado a	-80	°C	até	: ficar pronto para o

processamento adicional. A resina foi regenerada com uma solução de CIP-1 composta por NaOH 0,5 N/Triton X100 1%. A 20 solução CIP-1 foi aplicada à coluna na direção ascendente do fluxo em uma taxa de fluxo reduzida de 5 mL/min para aproximadamente 3 CV. A resina foi, a seguir, lavada com 2

CV de uma solução CIP-2 composta de 30% de isopropanol em

NaOH 0,5 N a 5 mL/min. A resina foi equilibrada com 3 CV de

	46	• 9 9 ·	• 9 ♦ · » · · • · · 9 9 ·	• < 9 9 9 • 9 ·	• 9 · •
		• · • 9	♦ ♦ 9 9 9 9 9 9·· 9 99· · · · · 9	9·9 «99 9 9 · · · 9 9 ·	9 9 · •

Solução de Estocagera até o próximo uso.

b. Captura por afinidade de Plasminogênio (Pg)

Uma coluna de leito empacotada de 5 cm x 13 cm foi preparada contendo 225 mL de adsorvente de afinidade desenvolvido para a Captura de Plasminogênio. A coluna foi tipicamente mantida em uma solução de estocagem contendo

NaOH 0,1 N quando não em uso por períodos curtos de tempo. A coluna previamente estocada foi lavada em uma taxa de fluxo de 16 0 cm/h com 1-2 CVs de água Mil li Q até que a 10 condutividade caísse para 1 ms/cm. A coluna foi equilibrada com 3-4 CVs de tampão de equilíbrio (EQ) composto por Tris 20 mM, citrato 20 mM, NaCl 140 mM, pH 7,5. O vWF/FVIII-FT foi aplicado a partir da etapa de captura anterior na coluna. O efluente de fluxo contínuo foi coletado quando a 15 absorvância a 280 nm alcançou 5% da AUFS (escala completa de unidades de absorvância).

A coluna foi lavada com 2-3 CV de tampão EQ enquanto continuou a coletar o efluente da coluna até que a absorvância caísse para 5% da AUFS. A solução foi misturada 20 gentilmente e, a seguir, filtrada através de um filtro Sartobran de 0,22 um. O filtro foi posteriormente rinsado com 500 mL de tampão EQ. O filtrado combinado foi gentilmente misturado. Essa solução filtrada constituiu a fração de fluxo contínuo da etapa de captura de

SC

47	• · Φ 4	• 4 4 4	• 4 4	• 4 4 •	4 4 4	4 •	4 •	4 4 4 4	4 4 4 4
	• 4 4 4	4 4 • · ·	• 4 4 4 4	4 4 · 4	4 4 4 4 >	4 4 4 4 •	4*4 4 4	4 * 4 4	4 4 4 4

Plasminogênio (Pg-FT) . Ά coluna foi lavada com 2 CV de tampão de lavagem composto por 3 0 mM de caprilato, em EQ, pH 7,5 seguido por 2 CV de tampão EQ. O Plasminogênio foi eluído com 2-3 CV de tampão de eluição composto por fosfato de Na 50 mM, EACA 0,5 M, pH 7,0. A coleta do eluente foi iniciada uma vez que a UV % aumentou para 2% de AUFS. O eluente foi continuamente coletado até que a absorvância caísse de volta para 2% das AUFS. O eluente da coluna foi misturado gentilmente e estocado a -80 °C até ficar pronto 10 para o processamento adicional. A resina foi regenerada com uma solução de CIP-1 composta por NaOH 0,5 N. A solução

CIP-1 foi aplicada à coluna na direção ascendente do fluxo a uma taxa de fluxo reduzida de 4 0 mL/min por aproximadamente 4 CV. A resina foi equilibrada com 3 CV de 15 Solução de Estocagem até o próximo uso.

c. Captura por afinidade do Fibrinogênio (Fg)

Uma coluna de leito empacotada de 10 cm x 10,1 cm foi preparada contendo 790 mL de adsorvente de afinidade desenvolvido para a captura de Fibrinogênio. A coluna foi 20 tipicamente mantida em uma solução de estocagem contendo NaOH 0,1 N quando não em uso por períodos curtos de tempo. A coluna previamente estocada foi lavada em uma taxa de fluxo de 60 cm/h com 1-2 CVs de água Milli Q até que a condutividade caísse para 1 mS/cm.

5?

A coluna foi equilibrada com 3-4 CVs de tampão de equilíbrio (EQ) composto por Tris 20 mM, citrato 20 mM, NaCl 140 mM, pH 7,5. A Pg-FT foi aplicada a partir da etapa de captura anterior na coluna. O efluente de fluxo contínuo foi coletado quando a absorvância a 280 nm alcançou 5% da

AUFS (escala completa de unidades de absorvância). A coluna foi lavada com 4-5 CV de tampão EQ e o efluente da coluna foi continuamente coletado até que a absorvância caísse para 5% da AUFS. A solução foi misturada gentilmente e, a 10 seguir, filtrada através de um filtro Sartobran de 0,22 um.

O filtro foi posteriormente rinsado com 500 mL de tampão EQ e o filtrado combinado foi gentilmente misturado. Essa solução filtrada constituiu a fração de fluxo contínuo da etapa de captura de fibrinogênio (Fg-FT). O Fibrinogênio 15 foi eluído com 4-5 CV de tampão de eluição composto por 20 mM de Tris, citrato 20 mM, NaCl 140 mM, colato 1%, propilenoglicol 10%, pH 7,5. A coleta do eluente foi iniciada uma vez que a UV % aumentou para 2% de AUFS. 0 eluente foi continuamente coletado até que a absorvância 20 caísse de volta para 2% das AUFS. O eluente da coluna foi misturado gentilmente e estocado a -80 °C até ficar pronto para o processamento adicional. A resina foi regenerada com uma solução de CIP-1 composta por NaOH 1,0 N. A solução CIP-1 foi aplicada à coluna na direção ascendente do

♦ ♦ ♦ • · · · • ··· ··» fluxo a uma taxa de fluxo reduzida de 8 0 mL/min por aproximadamente 4 CV. A resina foi equilibrada com 3 CV de Solução de Estocagem até o próximo uso.

d. Captura por afinidade de imunoglobulina G (IgG)

A carga foi preparada pela adição de 1/10 de volume de tampão de ajuste de carga (caprilato 300 mM em EQ) à Fg-FT e bem misturada. Uma coluna de leito empacotada de 14 cm x 12,2 cm foi preparada contendo 1.880 mL de adsorvente de afinidade desenvolvido para a captura da IgG. A coluna foi tipicamente mantida em uma solução de estocagem contendo NaOH 0,1 N quando não em uso por períodos curtos de tempo. A coluna previamente estocada foi lavada em uma taxa de fluxo de 73 cm/h com 2 CVs de água Milli Q até que a condutividade caísse para 1 mS/cm. A coluna foi equilibrada com 2 CVs de tampão de lavagem composto por Tris 20 mM, citrato 20 mM, NaCl 1 M, pH 7,5, seguido por 3-5 CV de tampão de equilíbrio de IgG composto por caprilato 30 mM, Tris 20 mM, citrato 20 mM, NaCl 140 mM, pH 7,5. A Fg-FT foi aplicada a partir da etapa de captura anterior na coluna. O efluente de fluxo contínuo foi coletado quando a absorvância a 280 nm alcançou 5% da AUFS (escala completa de unidades de absorvância).

A coluna foi lavada com 4-5 CV de tampão de lavagem para coletar o até que a absorvância caísse para 5% da

* »♦·	♦	* « Φ •	*	4
*	•
• *	«		•	«	• · ·	·
						•
• · Φ			4	• t·	•	•

AUFS. A solução foi misturada gentilmente e, a seguir, filtrada através de um filtro Sartobran de 0,22 um. O filtro foi posteriormente rinsado com 500 mL de tampão EQ e o filtrado combinado foi gentilmente misturado. Essa 5 solução filtrada constituiu a fração de fluxo contínuo da etapa de captura de IgG (IgG-FT). Antes da eluição do IgG, a coluna foi condicionada com 1 CV de tampão de pré-eluição composto por citrato 50 mM, pH 6,0. Eluiu o IgG com 4 CV de tampão de eluição composto de citrato 50 mM, pH 3,0. A 10 coleta do eluente foi iniciada uma vez que a UV % aumentou para 2% de AUFS. O eluente foi continuamente coletado até que a absorvância caísse de volta para 2% das AUFS. O eluente da coluna foi misturado gentilmente e o pH foi ajustado para mais de 7,0 com um volume suficiente de Tris 15 Base 1 M e, a seguir, estocado a -80 °C até ficar pronto para o processamento adicional. A resina foi regenerada com uma solução de CIP-1 composta de NaOH 1,0 N. A solução CIP1 foi aplicada à coluna na direção ascendente do fluxo em uma taxa de fluxo reduzida de 170 mL/min para 2 0 aproximadamente 4 CV, seguido por 3 CV de água Milli-Q na direção descendente do fluxo. A resina foi equilibrada com 3 CV de Solução de Estocagem até o próximo uso.

e. Ultrafiltração / diafiltração

A filtração foi efetuada para concentrar o produto de

-· 4	» « «	«	• 4 ·	9	•	«44	* 4 4
4	4	·· 4	•	• 4	4	4	4	4
4 f»		4 *	44	4	<* 4	» 4	•	• 4
* 9	•	M 4	C	4	4 ♦ 4	444		4
	*	f-1 4	4 ·	4	4	•	• 4	4 4
	• L4	*	•	4 « 4	9	•	4	4

Gc>

IgG-FT até alcançar o volume alvo de aproximadamente 1,52L. A diafiltração foi conduzida contra 6 volumes de tampão EQ com uma pressão de entrada de filtro (Pl) de 18 + 1 psi e uma TMP de 15 + 1 psi. O permeado foi amostrado para medidas de pH e de condutividade no início da diafiltração e em aproximadamente cada volume retentado de diafiltração para monitorar quando a diafiltração foi completa.

f. Captura por afinidade de albumina (HSA)

Uma coluna de leito empacotada de 20 cm x 17,8 cm foi preparada contendo 5.600 mb de adsorvente de afinidade desenvolvido para a captura da albumina. A coluna foi tipicamente mantida em uma solução de estocagem contendo NaOH 0,1 N quando não em uso por períodos curtos de tempo. A coluna anteriormente estocada foi lavada em uma taxa de fluxo de 86 cm/h com 2 CVs de água Milli Q até que a condutividade caísse para 1 ms/cm. A coluna foi equilibrada com 3-4 CV de tampão EQ. O retentado de UF/DF foi aplicado a partir da etapa anterior na coluna. O efluente de fluxo contínuo foi coletado quando a absorvância a 280 nm alcançou 5% da AUFS (escala completa de unidades de absorvância).

A coluna foi lavada com 2-3 CV de tampão de EQ para coletar o efluente da coluna até que a absorvância caísse para 5% da AUFS. A solução foi misturada gentilmente. Essa

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solução filtrada constituiu a fração de fluxo contínuo da etapa de captura de albumina (HSA-FT). Antes da eluição da albumina, a coluna foi condicionada com 2 CV de tampão de pré-eluição composto por citrato 50 mM, NaCl 300 mM, pH 5 7,5. A albumina eluiu com 2-3 CV de tampão de eluição composto por citrato de Na 50 mM, caprilato de Na 50 mM, pH 6,2. A coleta do eluente foi iniciada uma vez que a UV % aumentou para 2% de AUFS. O eluente foi continuamente coletado até que a absorvância caísse de volta para 2% das 10 AUFS. 0 eluente da coluna foi misturado gentilmente e, a seguir, estocado a -80 °C até ficar pronto para o processamento adicional. A resina foi regenerada com uma solução de CIP-1 composta de NaOH 1,0 N. A solução CIP-1 foi aplicada ã coluna na direção ascendente do fluxo a 15 uma taxa de fluxo reduzida de 4 00 mL/min por aproximadamente 4 CV, seguido por 3 CV de água Milli-Q na direção descendente do fluxo. A resina foi equilibrada com 3 CV de Solução de Estocagem até o próximo uso.

g. Concentrando o fluxo contínuo de HSA.

Conectar a bolsa de HSA-FT contendo o resto da amostra ao tubo de entrada no reservatório do produto. Iniciar a bomba em uma Taxa de fluxo constante de 1.300 mL/min no sistema Slice 200. Ajustar a pressão na saída do filtro (P2) para 13+1 psi. Isso deve resultar em uma pressão de • · * · ♦ · entrada do filtro (Pl) de 18 + 1 psi e em uma TMP de 15+1 psi. Enquanto ocorre a concentração do produto, HSA-FT adicional foi continuamente adicionado no reservatório do sistema. A concentração do HSA-FT continuou até que o 5 volume alvejado de aproximadamente 1,5-2 L fosse alcançado.

A recirculação continuou por aproximadamente 1 minuto sem pressão ou filtração através da membrana antes de colher o produto da UF do sistema de filtração. Cerca de 500-1.000 mL do tampão de equilíbrio foi adicionado ao reservatório 10 para rinsar o sistema de filtração. A recirculação começou lentamente para evitar a formação de espuma da rinsagem do sistema por aproximadamente 3 a 5 minutos, sem filtração ou pressão. O produto da UF foi combinado, rinsado e estocado a -80 °C. O concentrado de HAS-FT foi considerado 15 um material de partida apropriado para a purificação do

A1PI.

Resultados

Tabela 10: Atributos chave para a captura de vWF/FVIII

Amostra	Média	DP
Carga:
Concentração de vWF (ug/mL)	10,88	1,34
Concentração de FVIII (ng/mL)	78,5	6,7
Volume (L)	4061	116

54 ζ·φ · • · • · • • ·	• · · · · · · · • « · ·· · ♦ • · »' · ··· • · · · · · · · • ♦ · · · · • · · · ·
Amostra	Média	DP
Carga:
pH	7,73	0,06
Condutividade (mS/cm)	15,6	0,5
Fluxo contínuo :
Concentração de vWF (ug/mL)	1,09	0,39
Concentração de FVIII (ng/mL)	12,87	2,23
Volume (L)	5597,1	87,5
PH	7,6	0, 13
Condutividade (mS/cm)	17	0,577
Eluição:
Concentração de vWF (ug/mL)	26,8	5,48
Concentração de FVIII (ng/mL)	298,5	72,1
Volume (L)	697,1	121,6
pH	8,47	0,56
Condutividade (mS/cm)	22,64	0,69

Tabela 11: Atributos chave para a captura de plasminogênio

Amostra	Média	DP
Carga:
Título (g/L)	0,081	0,003
Vol (L)	5859	145

55	• ·	Φ 4 4 •	4 φ φ	• Φ · 4	4 Φ 4	4 4	4 Φ	Φ 4 4 4	4 4 4 Φ
	• · • 4	• • φ	• · • Φ Φ Φ	Φ 4 4 4 4	4 4 4	4 4 Φ 4 4 4	Φ Φ 44 · 4	4 4 4 4	Φ 4 Φ 4 Φ
	«	4 4 4	Φ	4	4 4 Φ	4	Φ	4	•

Amostra	Média	DP
Carga:
pH	7,75	0,09
Condutividade (mS/cm)	17,32	1,19
Fluxo contínuo:
Título (g/L)	0, 005	0,005
Vol (L)	6346	269 '
PH	7,71	0,07
Condutividade (mS/cm)	17,50	0,76
Eluição:
Título (g/L)	1,488	0,127
Vol (L)	236,3	17,5
pH	7,27	0,06
Condutividade (mS/cm)	14,71	3,68

Tabela 12: Atributos chave para a captura de fibrinogênio

Amostra	Média	DP
Carga:
Título (g/L)	1,43	0,06
Vol (L)	6716	181
pH	7,72	0,04
Condutividade (mS/cm)	16,57	0,84

•	• · ♦	•	··· *	•	•	♦ · «	* · ·
*	•	• *>	•	• ·	•		•	•	•
	•	» ·	* «	•	•	*	• ·	•	• ·
•	• • * · 4	♦ · • ·	« • · ♦	* • 4 · ♦	• · · « •	·♦ · • •	• • · *	• • · «

Amostra	Média	DP
Fluxo contínuo:
Título (g/L)	0,0323	0,005
Vol (L)	9507	231
pH	7,55	0,08
Condutividade (mS/cm)	17,00	0,96
Eluição:
Título (g/L)	3,433	0,253
Vol (L)	2539	227
pH	7,55	0,08
Condutividade (mS/cm)	14,00	1,41

Tabela 13: Atributos chave para a captura de IgG

Amostra	Média	DP
Carga:
Título (g/L)	2,251	0,259
Vol (L)	10429	267
pH	7,54	0,25
Condutividade (mS/cm)	18,52	0,92
Fluxo contínuo:
Título (g/L)	0,015	0,003
Vol (L)	12620	876
pH	7,61	0,09

9	9*9	9	9 9 9	* ·	9	9 99	9*9
	•	9	í.»	9	9 9	9		9	•	9
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	9	9		w 9	9		9	9	9 9	9 ♦
	• 99				9 9 9		9	•	•	9

Amostra	Média	DP
Condutividade (mS/cm)	32,17	6,05
Eluição:
Título (g/L)	3,762	0,481
Vol (L)	6086	741
PH	7,64	0,64
Condutividade (mS/cm)	10,64	6,55

Tabela 14: Atributos chave para a captura de HSA

Amostra	Média	DP
Carga:
Título (g/L)	28,55	1,84
Vol (L)	3814	211
pH	7,45	0,08
Condutividade (mS/cm)	17,21	1,75
Fluxo contínuo:
Título (g/L)	0,047	0,003
vol (L)	10463	2015
pH	7,39	0,13
Condutividade (mS/cm)	17,42	1,79
Eluição:
Título (g/L)	18,27	2,47
Vol (L)	5906	650

58	u « 0 ·	fc fc · •	• ·	•	•	•
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• ····♦· ·· • · ··· r · J · * • · * · * • * ·

Amostra	Média	DP
Eluição:
pH -	6,76	0,04
Condutividade (mS/cm)	22, 00	3, 78

Tabela 15: Rendimentos do processo para proteínas alvo

Proteína	Tipo de Ensaio	Rendimento médio	Desv. Pad.
Fator de Von	ELISA	43%	12%
Willebrand
Fator VIII	ELISA	65%	11%
Plasminogênio	Nefelometria	72%	6%
Fibrinogênio	Nefelometria	79%	6%
IgG	Nefelometria	87%	7%
HSA	Nefelometria	88%	8%
A1PI	Nefelometria	90%	6%

Tamponamento do Plasma linear.

Esse experimento sistema de tamponamento

Exemplo 3: Avaliação e Seleção do Sistema de para uso no processo de cascata foi realizado para determinar o ótimo para o esquema de purificação da proteína plasmática da sequência de cascata linear. Foi observado que durante a carga da coluna de IgG o pH se

CF

elevou 2 unidades acima daquela do plasma {pH ~ 7,5) . Uma alteração do pH durante a carga de IgG foi observada várias vezes e aparentou ser dependente no grau de depleção de proteína da carga. Isso sugeriu que certas proteínas plasmáticas têm capacidade tamponante, e a remoção dessas proteínas da solução de carga pode aumentar a probabilidade de uma alteração no pH. Um sistema tamponante para o plasma foi necessário para preservar a concentração de proteína e a atividade no plasma. O sistema de tamponamento teve que 10 ser tal que o pH permaneceu em uma faixa aceitável de cerca de 7,5 + 0,4 por todo o processo.

Para assegurar que a mudança de pH não ocorresse na corrida subseqüente, a carga do plasma para a operação subsequente foi tamponado usando uma solução estoque de 15 Tris 1 M em pH 7,5. Esse tampão estoque foi criado usando os estoques separados, Tris Base 1 M e Tris HC1 1 M. Esses tampões foram titulados um com o outro até pH 7,5. O tampão estoque foi, a seguir, diluído em 1:20 em plasma antes da filtração. A carga final preparada continha plasma ajustado 20 com Tris 50 mM, filtrado com um filtro de 0,45/0,2 μπι. Esse sistema tamponante foi usado para a determinação de experimentos de sequência de cascata linear (LCS) 1-7. Tampão Tris 5 0 mM foi usado no plasma e tampão de corrida por todo o processo. Não foi observado nenhum problema de

<2?

• ···444

44

4 44 4

4* *4

4 * 44

44 pH durante a carga da coluna enquanto o Tris 50 mM, pH 7,5 estava em uso. A Tabela 15 resume as etapas do rendimento das purificações de LCS efetuados usando Tris 50 mM, pH 7,5 como o tampão de plasma.

Tabela 15: Rendimentos porcen.tu.ais das etapas das proteínas alvo através do LCS tamponado com Tris 50 mM, pH 7,5.

Tampão Tris 50mM	Fg	FXIII	IgG	A1PI	A1PI (atividade)
Pg	95 ±	91,3 ±	98 ±	100 ±	100.3 ±
	2,7	7,4	3,7	13	15,8
	(n=6)	(n=4)	(n=7)	(n=7)	(n=5)
Fg			86,6 ±	95,5 ±	107,7 ±9,1
			8	5,3	(n=5)
			(n=7)	(n=7)
igG				87,8 ±	96,7 ± 7,4
				13,3	(n=5)
				(n=7)
HSA				96,1 ± 19,5 (n=7)	98,5 ± 23 (n=4)

Um sistema de tamponamento alternativo foi procurado

devido aos custos estimados relativamente altos de tampão Tris 50 mM em escala de produção. Vários experimentos foram efetuados em pequenas alíquotas de plasma tamponado com bicarbonato, fosfato e Tris em pH 7,5. Esses experimentos 5 foram executados durante o curso de vários dias para simular o LCS de múltiplos dias. Alíquotas da mesma reunião de plasma forma tamponadas e deixadas para incubar em temperatura ambiente (TA) por vários dias. Amostras de todas foram analisadas para a atividade e concentração de 10 proteínas. São apresentados na Tabela 16 os rendimentos por etapa de incubação quando o plasma é tamponado com cada sistema. Plasma tamponado com Tris 50 mM foi efetuado várias vezes como a marca de referência para comparação.

Tabela 16: Resumo dos Estudos de Tamponamento de 15 Plasma Preliminares

Rendimentos depois da incubação era TA

	FG	FG (act)	FXIII (act)	IgG	A1PI	A1PI (ac)
Em plasma	100%	99%	100%	95%	101%	98%
tamponado com Tris 50 mM, t= 24 h	(n=2)	(n=2)	(n=2)	(n=2)	(n=2)	(n=2)
Em plasma	113,00	99,00%	104,00	108,00	97,00%	8,00%

y/

	FG	FG (act)	FXIII (act)	IgG	A1PI	A1PI (ac)
tamponado com bicarbonato de sódio 20 mM, t=24 h	o, o		%	%
Em plasma tamponado com bicarbonato de sódio 50 mM, t=24 h	98,00%	114,00 %	115,00 %	102,00 %	97,00%	97,00%
Em plasma tamponado com fosfato de sódio 50 mM, t=24 h	96,00%	95,00%	95,00%	99,00%	97,00%	103,00 %
Em plasma tamponado com fosfato de sódio, 50 mM,	109,00 %	99,00%	100,00 %	100,00 0_ 'o	100,00 %	97,00%

7Λ * 4· 4 4·

	FG	FG (act)	FXIII (act)	IgG	A1PI	A1PI (ac)
t=48h (rendimento é apresentado como de t=24 até t=48h

Os resultados indicaram que não há grande perda de proteína ou atividade com vários tampões testados em comparação com o controle, água. Nenhuma das proteínas alvo foram afetadas adversamente pela adição de um agente 5 tamponante ao plasma. Cada esquema tamponante foi, a seguir, testado em um estudo de cascata para determinar as condições de tamponamento ótimas.

Um sistema de tamponamento de fosfato de sódio 10 mM foi avaliado durante os experimentos de LCS. Durante o 10 preparo da carga de plasma, uma solução estoque de fosfato de Na 0,2 M foi diluída com fosfato de Na 10 mM com uma diluição de 20 vezes do tampão estoque com plasma. O plasma tamponado com fosfato 10 mM foi filtrado a 0,2 μπι antes de seu uso no estudo de cascata linear. Durante a testagem desse esquema de tamponamento notavelmente mais baixa para fatores que foram indicativos a atividade protéica foi proteínas alvo e outros da atividade protéica. A tabela 17 abaixo resume os rendimentos da etapa de várias corridas de LCS usando tampão fosfato 10 mM.

Tabela 17: Rendimentos poroentuais das Etapas das proteínas alvo através do LCS tamponado com fosfato de sódio 10 mM, pH 7,5.

Tampão fosfato mM	10	Fg	FXIII	IgG	A1PI	A1PI (atividade)
pg		94 ±	80,4 ±	96,9	+	97,3	+	95,5 ± 7,8
		3,5	7,4	5,1		6,2		(n=6)
		(n=6)	(n=5)	(n=6)		(n=6)
Fg				78,2	+	90,9	±	89,5 ± 25
				5,5		8		(n=5)
				(n=6)		(n=6)
IgG						87,2	+	80 ± 21
						7,4		(n=4)
						(n=5)
HSA				94 8,1 (n=3)	±	ND

vq

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Enquanto o plasma tamponado com Tris a 50 mM foi bem sucedido ao evitar oscilações de pH, uma forma mais eficaz em termos de custo de tamponar o plasma foi necessária. Como resultado, Tris 20 mM, pH 7,5 foi usado para o LCS. 0 5 plasma foi ajustado para Tris 2 0 mM em pH 7,5 por uma diluição de 50 vezes de Tris 1 M, pH 7,5. Esse tampão estoque foi feito conforme acima, titulando tris base com Tris HC1. A Tabela 18 mostra que o desempenho das corridas de LCS pelo uso de plasma titulado com Tris 2 0 mM é 10 comparável com aquela de tampão Tris 50 mM conforme descrito acima em termos de recuperações de proteína alvo, capacidade tamponante e estabilidade da carga.

Tabela 18: Rendimentos em porcentagem das Etapas através do LCS tamponado com Tris 20 mM, pH 7,5.

	Tampão Tris 20 mM	Fg	FXIII	IgG	A1PI	A1PI (atividade)
*	Pg	97 ±	88,7 ±	103,2	+	99,3	±	104,3 ± 13
		5,6	17	13,4		8		(n=4)
*		(n=8)	(n=8)	(n=8)		(n=8)
	Fg			86,4	±	90	±	90 ± 12
				7,1		6,2		(n=4)
				(n=8)		(n=8)
	IgG				87,1	±	91,7 ± 7

Tampão Tris 20 mM	Fg	FXIII	igG	A1PI	A1PI (atividade)
				3,2	(n=3)
				(n=7)
HSA				95 ±	88,2 ± 19
				6,8	(n=3)
				(n=6)

Tabela 19: Rendimentos da Etapa HSA através do LCS usando sistemas tamponantes diferentes.

HSA com vários tampões	Tris 50 mM	Fosfato 10 mM	Tris 20 mM
Pg	97,4 ± 3,9	95,5 + 4,3	95,6 ± 8,1
	(n = 6)	(n = 6)	(n = 8)
Fg	95 ± 5,7	94,8 + 9,2	97,8 ± 4,6
	(n = 6)	(n = 6)	(n = 7)
IgG	84 + 9,8	79,1 ± 18,3	86,4 ± 2,1
	(n = 6)	(n = 5)	(n = 7)
Rendimento	77,4	71,6	80,1
global

A Tabela 19 representa os resultados de uma comparação entre os sistemas tamponantes avaliados em termos dos

rendimentos da etapa HSA através do LCS. No global, as recuperações das etapas para a captura do HSA dentre os três tampões testados foram comparáveis umas com as outras, exceto para o fosfato 10 mM, um rendimento mais baixo para 5 o HSA foi evidenciado com a etapa de captura de IgG.

Também, IgG, uma proteína alvo de alto valor, tinha uma recuperação mais baixa durante a etapa de captura de fibrinogênio quando tampão fosfato 10 mM foi aplicado. Todos os valores foram rendimentos porcentuais indicados 10 para cada etapa de captura. Os dados foram reunidos de corridas de 0,5 L, as etapas de recuperação foram calculadas sozinhas baseando-se na quantidade de albumina presente na carga e no fluxo contínuo.

Foi concluído que um tampão contendo Tris 50 mM foi um 15 tampão de plasma eficaz que pode ser muito caro conforme o processo é aumentado proporcionalmente para a produção. Várias alternativas para o Tris foram avaliadas e submetidas às corridas de LCS completas. Essas alternativas foram julgadas baseando-se na capacidade tamponante, 20 facilidade de uso, custo e conservação de concentração e atividade protéica. Foi descoberto que uma molaridade de Tris (20 mM) reduzida em pH 7,5 foi eficaz como tampão de plasma. ·

A presente invenção pode ser modalizada em outras

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τι formas específicas sem sair do espírito de seus atributos essenciais e, concordantemente, deve ser feita referência às reivindicações em anexo, ao invés da especificação antecedente, conforme indicando o escopo da invenção.

Claims (9)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Método de isolamento e purificação sequencial de proteínas caracterizado pelo fato de compreender (i) fornecer de uma amostra de plasma, (ii) fornecer de ligantes, cada um dos quais se ligando especificamente a proteinas alvo na amostra de plasma, em que cada um dos ligantes é opcionalmente ligado a um suporte para formar complexos ligante—suporte, (iii) colocar os ligantes ou complexos ligante—suporte em contato sequencialmente e em uma ordem pré—determinada com a amostra de plasma para permitir que cada ligante ou complexo ligante—suporte se ligue às proteínas alvo da amostra de plasma, em que a ordem pré-determinada de colocar os ligantes ou complexos ligante—suporte com a amostra de plasma resulta na ligação do plasminogênio antes do IgG e do IgG antes da albumina, e em que antes do referido contato a amostra de plasma é isenta de processamento através de uma etapa de précondicionamento selecionada do grupo que consiste em precipitação com álcool, crioprecipitação, remoção de lipídeos e/ou proteínas lipídicas, precipitação de euglobulina ou uma combinação destas, (iv) eluir a proteína alvo ligada a cada ligantes ou complexos ligante—suporte, e (v) isolar proteína(s) alvo sequencialmente da amostra de plasma.
2. 2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as proteinas alvo compreendem fibrinogênio, inibidor da alfa—1 proteinase, apolipoproteína A1, imunoglobulinas, paraoxonase, fatores

   Petição 870180168934, de 28/12/2018, pág. 18/24

   2/3 de coagulação, VWF/VIII, albumina plasminogênio ou qualquer combinação sua.
3. 3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que fibrinogênio é isolado do plasma antes de IgG.
4. 4. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a atividade da paraoxonase é retida na amostra de plasma durante o isolamento de proteínas.
5. 5. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que vWF/FVIII é isolado do plasma antes do plasminogênio.
6. 6. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a apolipoproteína A1 é isolada do plasma antes do IgG.
7. 7. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o inibidor da alfa-1proteinase é isolado do plasma após a albumina.
8. 8. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que plasminogênio é isolado do plasma antes do fibrinogênio.
9. 9. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o ligante compreende um peptídeo, polipeptídeo, peptidomimético, molécula pequena, corante, composto contendo triazina, anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno, molécula baseada em ácido nucléico, não-polipeptideo ou molécula baseada em nucleotídeo, carboidrato, miméticos de carboidratos, lipídeos, material