EA030414B1 - Способы получения дикетопиперазинов и соединений, содержащих дикетопиперазины - Google Patents

Abstract

В изобретении представлены способы повышения количества дикетопиперазинов (DKP), таких как DA-DKP, в фармацевтических составах, содержащих белки и пептиды. В изобретении также предложены способы получения DKP, содержащие: (1) взаимодействие альбумина с ферментом (таким как дипептидилпептидаза IV (DPP-IV)), который отщепляет пару N-терминальных аминокислот от альбумина, и (2) нагрев альбумина в условиях, способствующих образованию DKP. Кроме того, также раскрыт способ обработки DKP- и альбуминсодержащих потоков для получения улучшенных, более качественных DKP-содержащих составов и очищенных альбуминсодержащих составов для терапевтического применения. Вместе с первым терапевтическим DKP-содержащим составом с низким содержанием альбумина также получают второй полезный терапевтический состав, отличающийся высокой концентрацией альбумина.

Description

изобретение относится к способам получения указанных терапевтических составов с использованием эффективных, высокопроизводительных процессов.

Сущность изобретения

Введение коммерческого человеческого сывороточного альбумина (ΗδΑ) потенциально показано таким пациентам, как пациенты со множественными травмами. Из-за его гетерогенности в терапевтическое действие ΗδΑ могут вносить вклад другие компоненты, такие как протеазы. Одна из таких протеаз, дипептидилпептидаза IV (ΌΡΡ-ΐν), может высвобождать известную иммуномодуляторную молекулу, аспартат-аланин-дикетопиперазин (ΌΑ-ΌΚΡ), на Ν-конце альбумина. Показано, что готовые коммерческие растворы ΗδΑ, полученные с помощью фракционирования по методу Кона, обладают ΌΡΡ-ΐνактивностью.

Одним аспектом настоящего изобретения является получение ΌΚΡ, таких как ΌΑ-ΌΚΡ. В одном из вариантов ΌΑ-ΌΚΡ получают из альбумина в присутствии ΌΡΡ-ΐν. В одном из вариантов ΌΡΡ-ΐν является эндогенной, например такой, которая присутствует в человеческой плазме или ΗδΑ. В одном из вариантов плазму или ΗδΑ нагревают. Без связи с какой-либо теорией считается, что нагрев может увеличить концентрацию ΌΡΡ-ΐν в результате повышения температуры раствора близко к температуре, оптимальной для ΌΡΡ-ΐν-активности, и/или в результате термической деструкции.

Другим аспектом настоящего изобретения является способ обработки потока исходного материала, содержащего альбумин и ΌΚΡ, такой как ΌΑ-ΌΚΡ, для получения составов. Способ включает в себя обработку потока исходного материала для получения первого потока с низким содержанием альбумина и первого потока с высоким содержанием альбумина, при этом первый поток с низким содержанием альбумина содержит первую часть ΌΚΡ, присутствующего в потоке исходного материала, а первый поток с высоким содержанием альбумина содержит вторую часть ΌΚΡ, присутствующего в потоке исходного материала. Первый поток с высоким содержанием альбумина подвергают воздействию для получения дополнительного ΌΚΡ с образованием реакционного потока, содержащего альбумин и ΌΚΡ. Реакционный поток обрабатывают для получения второго потока с низким содержанием альбумина и второго потока с высоким содержанием альбумина, при этом второй поток с низким содержанием альбумина содержит одну часть ΌΚΡ, присутствующего в реакционном потоке, а второй поток с высоким содержанием альбумина содержит вторую часть ΌΚΡ, присутствующего в реакционном потоке. В некоторых вариантах настоящего изобретения полученные потоки с высоким содержанием альбумина могут обладать терапевтическим действием, в том числе могут быть эффективными при лечении гипоальбуминемии и гиповолемии. В некоторых вариантах настоящего изобретения полученные потоки с низким содержанием альбумина, содержащие ΌΚΡ, могут обладать терапевтическим действием, в том числе могут быть эффективными при лечении воспалительных заболеваний.

Еще одним аспектом настоящего изобретения является способ обработки потока исходного материала, содержащего альбумин и ΌΚΡ, для получения терапевтических составов, как описано выше, дополнительно содержащий стадию анализа, при этом стадия анализа содержит анализ потока с высоким содержанием альбумина для получения по меньшей мере одного показателя и сравнение по меньшей мере одного показателя по меньшей мере с одним заданным значением, при этом если по меньшей мере один показатель больше или меньше заданного значения, реакционную стадию и стадию обработки повторяют до тех пор, пока по меньшей мере один показатель последующего потока с высоким содержанием альбумина не будет равен по меньшей мере одному заданному значению или меньше или больше него. Показателем может быть, например, количество альбумина в потоке или количество ΌΑ-ΌΚΡ.

Еще одним аспектом настоящего изобретения является состав, содержащий ΌΚΡ, концентрация альбумина в котором меньше его концентрации в коммерческих препаратах человеческого сывороточного альбумина (ΗδΑ), которая составляет около 50 г альбумина на литр ΗδΑ (г/л) в растворе альбумина с концентрацией 5 вес.% или около 250 г/л в растворе альбумина с концентрацией 25 вес.%. В некоторых вариантах настоящего изобретения концентрация альбумина в ΌΚΡ-содержащем составе может быть меньше приблизительно 250 г/л, меньше приблизительно 200 г/л, меньше приблизительно 100 г/л, меньше приблизительно 50 г/л, меньше приблизительно 40 г/л, меньше приблизительно 30 г/л, меньше приблизительно 20 г/л, меньше приблизительно 10 г/л, меньше приблизительно 5 г/л, меньше приблизительно 4 г/л, меньше приблизительно 3 г/л, меньше приблизительно 2 г/л, меньше приблизительно 1 г/л, меньше приблизительно 0,9 г/л, меньше приблизительно 0,8 г/л, меньше приблизительно 0,7 г/л, меньше приблизительно 0,6 г/л, меньше приблизительно 0,5 г/л, меньше приблизительно 0,4 г/л, меньше приблизительно 0,3 г/л, меньше приблизительно 0,2 г/л, меньше приблизительно 0,1 г/л, меньше приблизительно 0,09 г/л, меньше приблизительно 0,08 г/л, меньше приблизительно 0,07 г/л, меньше приблизительно 0,06 г/л, меньше приблизительно 0,05 г/л, меньше приблизительно 0,04 г/л, меньше приблизительно 0,03 г/л, меньше приблизительно 0,02 г/л, меньше приблизительно 0,01 г/л, меньше приблизительно 0,009 г/л, меньше приблизительно 0,008 г/л, меньше приблизительно 0,007 г/л, меньше приблизительно 0,006 г/л

- 2 030414

или меньше приблизительно 0,005 г/л. В других вариантах настоящего изобретения концентрация альбумина в ΌΚΡ-содержащем составе может быть около нуля г/л или неопределяемой величиной.

В некоторых вариантах настоящего изобретения составы, содержащие ΌΚΡ, могут обладать терапевтическим действием, в том числе могут быть эффективными при лечении воспалительных заболеваний.

Кроме того, в настоящем изобретении предложены способы синтеза ΌΚΡ. В одном варианте способ содержит нагрев плазмы млекопитающих в условиях, способствующих образованию ΌΚΡ. В одном варианте способ содержит взаимодействие плазмы с ферментом, который отщепляет две Ν-терминальные аминокислоты белка или пептида в условиях, эффективных для получения ΌΚΡ. В одном варианте способ содержит взаимодействие плазмы с ΌΡΡ-ΐν, которая отщепляет две Ν-терминальные аминокислоты белка или пептида в условиях, эффективных для получения ΌΑ-ΌΚΡ.

В изобретении также предложен способ получения улучшенного фармацевтического состава, содержащего белок или пептид. Способ содержит обработку плазмы для увеличения содержания ΌΚΡ, таких как ΌΑ-ΌΚΡ, в фармацевтическом составе, содержащем белок или пептид.

В изобретении также предложен улучшенный фармацевтический состав, содержащий белок или пептид. Улучшение заключается в том, что содержание ΌΚΡ в составе увеличено.

Вышеизложенное является упрощенным кратким изложением, обеспечивающим начальное понимание аспектов, вариантов и конфигураций, раскрытых в настоящем изобретении. Это краткое изложение не является ни всесторонним, ни исчерпывающим обзором аспектов, вариантов или конфигураций. Оно не предназначено ни для определения ключевых или критических элементов, ни для ограничения объема аспектов, вариантов или конфигураций, а служит для представления отдельных концепций в упрощенной форме в качестве введения к более подробному описанию, представленному ниже. Должно быть понятно, что в других аспектах, вариантах или конфигурациях могут использоваться отдельно или в сочетании один или несколько признаков, изложенных выше или подробно описанных ниже.

Перечень чертежей

Прилагаемые чертежи являются частью описания и включены в него с целью пояснения примеров осуществления и использования аспектов, вариантов или конфигураций и не должны истолковываться как ограничения аспектов, вариантов или конфигураций только проиллюстрированными и описанными примерами. Дополнительные признаки и преимущества будут понятны из последующего более подробного описания различных аспектов, вариантов или конфигураций.

Фиг. 1 - показана ΌΡΡ-ΐν-активность в 5% коммерческих растворах ΗδΑ. ΌΡΡ-ΐν-активность (N=3) представлена в виде общего количества р-нитроанилина (ρΝΑ, мкМ), полученного во время инкубации в течение 24 ч при 37°С. Использование ингибитора ΌΡΡ-ΐν (дипротина А) привело к полному подавлению ΌΡΡ-ΐν-активности (данные не показаны).

Фиг. 2 - показано влияние температуры на ΌΡΡ-ΐν-активность в 5% коммерческих растворах ΗδΑ (С8Ь ВеЬттд). ΌΡΡ-ΐν-активность (N=3) представлена в виде общего количества р-нитроанилина (ρΝΑ, мкМ), полученного во время инкубации в течение 2 ч при 37°С (сплошной столбец) и 60°С (вертикальные штрихи).

Фиг. 3 - показана ΌΡΡ-ΐν-активность в растворах ΗδΑ, полученных с помощью разных способов изготовления. ΌΡΡ-ΐν-активность (N=3) представлена в виде общего количества р-нитроанилина (ρΝΑ, мкМ), полученного во время инкубации в течение 24 ч при 37°С. ΌΡΡ-ΐν-активность измерялась в коммерческих растворах ΗδΑ, полученных с использованием фракционирования по методу Кона (сплошной столбец, εΗδΑ), и в растворе рекомбинантного ΗδΑ, полученного из риса (вертикальные штрихи, τΗδΑ).

Фиг. 4 - показано образование ΌΑ-ΌΚΡ в 5% коммерческом ΗδΑ, нагретом до 60°С. Количество образованного ΌΑ-ΌΚΡ (Ν=3) определяли в различные моменты времени в 5% коммерческом растворе ΗδΑ, нагретом до 60°С, в присутствии (▲) или отсутствие () ингибитора ΌΡΡ-ΐν. Низкомолекулярную фракцию (<5 кДа) 5% коммерческого раствора ΗδΑ отделяли и с помощью ΌΠΜδ (жидкостная хроматомасс-спектрометрия) проводили ее анализ на содержание ΌΑ-ΌΚΡ. Звездочка (*) соответствует статистической значимости (р<0.05) при сравнении с исходным 5% ΗδΑ.

Фиг. 5 - показан один вариант настоящего изобретения, содержащий две стадии обработки и одну реакционную стадию, в котором получают два отдельных потока ΌΚΡ-содержащего продукта и один поток альбуминсодержащего продукта.

Фиг. 6 - показан один вариант настоящего изобретения, подобный изображенному на фиг. 5, содержащий альбуминсодержащий рециркуляционный поток.

Фиг. 7 - показан один вариант настоящего изобретения, подобный изображенному на фиг. 5, содержащий разбавление потока для улучшения извлечения ΌΚΡ во время второй стадии обработки.

Номера позиций.

- 3 030414

№ - элемент

100 - стадия обработки

ПО - реакционная стадия

120 - поток исходного материала

130 - поток с высоким содержанием альбумина

140 - поток с низким содержанием альбумина

150 - фермент или катализатор

160 - поток конечного продукта с высоким содержанием альбумина

170 - рециркуляционный поток с высоким содержанием альбумина

180 - поток разбавителя

Подробное описание изобретения

Нижеизложенное подробное описание показывает изобретение на примерах и не ограничивает его. Данное описание позволяет специалистам осуществить и использовать изобретение.

Ссылки в описании на "один вариант", "вариант", "пример варианта" и т.п. указывают на то, что описанный вариант может включать конкретный признак, структуру или характеристику, но необязательно каждый вариант может включать конкретный признак, структуру или характеристику. Более того, такие выражения необязательно относятся к одному и тому же варианту. Кроме того, когда в связи с каким-либо вариантом описывается конкретный признак, структура или характеристика, то предполагается, что специалист в данной области сможет воспроизвести такой признак, структуру или характеристику в связи с другими вариантами, независимо от того, описаны такие варианты или нет. В настоящем изобретении выражения "по меньшей мере один", "один или несколько" и "и/или" являются многовариантными выражениями, которые при их использовании могут быть и соединительными, и разделительными. Например, каждое из выражений "по меньшей мере один А, В и С", "по меньшей мере один А, В или С", "один или несколько А, В и С", "один или несколько А, В или С" и "А, В, и/или С" означает один А, один В, один С, А и В вместе, А и С вместе, В и С вместе или А, В и С вместе. Человеческий сывороточный альбумин (ΗδΑ) является преобладающим циркулирующим в крови белком, который обладает свойством связывать и транспортировать лиганды, выполняет антиоксидантную функцию и проявляет ферментативную активность. Так как ΗδΑ необходим для регулирования объема крови и осмотического давления у тяжелобольных, он в массовых масштабах производится фармацевтической промышленностью. Предпочтительная технология изготовления коммерческого ΗδΑ основана на методе Кона и коллег, в котором ΗδΑ выделяют с помощью фракционирования холодным этанолом. Коммерческие препараты ΗδΑ обычно содержат стабилизаторы Ν-ацетилтриптофан (ΝΑΤ) и каприлат натрия в концентрациях 0,08 ммоль/г ΗδΑ. Срок годности коммерческих растворов ΗδΑ как правило составляет 3 года. Скорее всего, в результате образования активных форм кислорода со временем наблюдаются некоторые изменения свойств раствора, такие как изменение цвета, окисление белка, протеолиз, агрегация и выпадение осадка. В результате со временем окисляется стабилизатор ΝΑΤ, что приводит к образованию двух основных продуктов деструкции, данные о токсичности которых неизвестны. Поскольку фракционирование по методу Кона не является специфичным в отношении ΗδΑ, некоторые белки и пептиды выделяются вместе с ΗδΑ и соответственно присутствуют в коммерческих растворах. Кроме того, поскольку ΗδΑ обладает уникальной способностью связывать множество лигандов, в коммерческих растворах ΗδΑ с помощью протеомных технологий были найдены другие пептиды и белки с известной биологической активностью. Эти выделяемые совместно или связанные белки включают протеазы (калликреин, катепсин, карбоксипептидазы и дипептидазы), ингибиторы протеаз (кининоген), адгезивные белки клеточной поверхности (селектин, кадгерины и 1СЛМ [молекулы межклеточной адгезии]) и белки, связанные с иммунитетом (цепи иммуноглобулинов и компоненты системы комплемента). Недавно была подтверждена уникальная собственная протеолитическая активность молекулы ΗδΑ в восстановительных условиях. Таким образом, из-за его гетерогенной природы применение ΗδΑ может привести к появлению возможных нежелательных побочных эффектов у тяжелобольных пациентов.

Кроме белков, коммерческие растворы ΗδΑ содержат маленькие иммуносупрессивные молекулы, образованные из первых двух Ν-терминальных аминокислот ΗδΑ, аспартат-аланин-дикетопиперазин или ΌΑ-ΌΚΡ. По некоторым данным ΌΑ-ΌΚΡ модулирует продуцирование Т-клетками цитокинов посредством увеличения активности Кар1 и уменьшения факторов активации, имеющих отношение к пути передачи сигнала Т-клеточными рецепторами. Механизм образования ΌΑ-ΌΚΡ в коммерческих растворах ΗδΑ в настоящее время неизвестен, при этом есть одна теория, предполагающая, что вследствие уникальных химических свойств Ν-конца ΗδΑ происходит самодеструкция Ν-конца с последующим образованием ΌΑ-ΌΚΡ. Настоящее изобретение основано на присутствии протеаз в коммерческих растворах ΗδΑ, а именно дипептидилпептидазы IV (ΌΡΡ-ΐν). Как показано в примерах ниже, в трех коммерческих растворах ΗδΑ с помощью известного хромогенного анализа была измерена ΌΡΡ-ΐν-активность. Также эту активность ингибировали с помощью известного ингибитора ΌΡΡ-ΐν дипротина А. Таким образом, в

- 4 030414

коммерческих растворах ΗδΑ, кроме присутствия белка ΌΡΡ-ΐν, также наблюдается ΌΡΡ-ΐν-активность. Отсутствие такой активности в рекомбинантном ΗδΆ дает основание предполагать, что наблюдаемая ΌΡΡ-ΐν-активность была результатом процесса фракционирования по методу Кона.

Во время получения коммерческого ΗδΑ продукт пастеризуют нагреванием до 60°С в течение 1011 ч. Сообщалось, что максимальная ΌΡΡ-ΐν-активность в сыворотке, рекомбинантной ΌΡΡ-ΐν и ΌΡΡ-ΐν семенной жидкости наблюдается между 50 и 60°С с постепенным уменьшением активности при 65°С. Это уникальное свойство ΌΡΡ-ΐν делает ее подходящей для получения ΌΑ-ΌΚΡ в коммерческих растворах ΗδΑ. Также, вероятнее всего, компоненты с низкой молекулярной массой (не связанные с ΗδΑ) удаляются до стадии пастеризации. Следовательно, большая часть ΌΑ-ΌΚΡ, обнаруженного в коммерческих растворах ΗδΑ, образовалась бе ηονο, начиная со стадии пастеризации. В исследованных коммерческих растворах ΗδΑ существенная ΌΡΡ-ΐν-активность была определена при 60°С. Однако общая активность составила только 70-80% от активности, наблюдаемой при инкубации при 37°С. Образование ΌΑ-ΌΚΡ в коммерческом ΗδΑ при 60°С изучали с использованием метода ΌΟΜδ (жидкостная хроматомассспектрометрия) для обнаружения ΌΑ-ΌΚΡ. В исходных коммерческих растворах в течение 24 ч при 60°С ΗδΑ образовалось значительное количество ΌΑ-ΌΚΡ. Когда к коммерческим растворам ΗδΑ добавили ингибитор ΌΡΡ-ΐν дипротин А, то количество ΌΑ-ΌΚΡ, образованного за 24 ч при 60°С, уменьшилось приблизительно в 3 раза. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что ΌΡΡ-ΐν частично ответственна за образование ΌΑ-ΌΚΡ в коммерческих растворах ΗδΑ. Дипротин А не полностью прекращает образование ΌΑ-ΌΚΡ при 60°С. Дипротин А захватывается в виде тетраэдрического интермедиата, ковалентно связанного с δе^630 внутри активного центра ΌΡΡ-ΐν. Дипротин А (ΐ^-Ρτο-ΐ^) является субстратом ΌΡΡ-ΐν с низким оборотом, приводящим к явному конкурентному ингибированию. Возможно, что после инкубации в течение 24 ч при 60°С дипротин А в достаточной степени гидролизуется, чтобы допустить другие субстраты ΌΡΡ-ΐν, например Ν-конец ΗδΑ, внутрь активного центра. Возможно, что вместе с ферментативным образованием ΌΑ-ΌΚΡ происходит образование ΌΑ-ΌΚΡ в результате самодеструкции Ν-конца ΗδΑ. Известные субстраты ΌΡΡ-ΐν включают в себя некоторые хемокины, цитокины, нейропептиды, циркулирующие гормоны и биоактивные пептиды. Одним из наиболее изученных субстратов ΌΡΡ-ΐν является глюкагоноподобный пептид 1 (ΟΌΡ-1), который регулирует уровни циркулирующей в плазме глюкозы и, следовательно, играет важную роль в этиологии диабета ΐΐ типа. Ранее известные субстраты ΌΡΡ-ΐν являются полипептидами, и Ν-конец ΗδΑ был впервые описан как субстрат автором настоящего изобретения. Если ΗδΑ находится в своей естественной конформации, то из-за стерических затруднений доступ Ν-конца ΗδΑ к активному центру ΌΡΡ-ΐν маловероятен. Однако, чтобы происходило образование ΌΑ-ΌΚΡ, значительная часть Ν-конца ΗδΑ должна быть доступна для активного центра ΌΡΡ-ΐν. Без связи с какой-либо теорией имеются по меньшей мере два пути, посредством которых Ν-конец ΗδΑ может стать доступен для активного центра ΌΡΡ-ΐν. Во-первых, окисление ΗδΑ в коммерческих растворах во время хранения может вызвать расщепление ΗδΑ с образованием Ν-терминальных пептидов, которые являются лучшим субстратом для активного центра ΌΡΡ-ΐν. В коммерческих растворах ΗδΑ в значительных количествах обнаружены редокс-активные металлы, такие как железо и медь. Действительно, Ν-конец ΗδΑ связывает медь, что может привести к образованию ίη $ιΙιι активных форм кислорода (ΚΌδ), возможно вызывающих отщепление Ν-терминальных пептидов ΗδΑ. Во-вторых, медленная денатурация ΗδΑ может привести к разворачиванию Ν-конца, делая его более доступным субстратом ΌΡΡ-ΐν. Это частично подтверждается тем, что при 60°С ΗδΑ находится в обратимой несвернутой форме, возможно с открытым Ν-концом. Во время длительного хранения растворов ΗδΑ эта обратимая несвернутая форма может стать обычным явлением, что приведет к увеличению образования ΌΑ-ΌΚΡ.

Подтверждены иммуносупрессивные свойства вводимого ΗδΑ. У крыс с моделью геморрагического шока ΗδΑ дозозависимо уменьшал проницаемость легких и секвестрацию нейтрофилов в легких. У крыс с подобной моделью шока введенный ΗδΑ значительно подавил экспрессию интегринов и ΐΟΑΜ-1 - факторов, участвующих в адгезии иммунных клеток к эндотелию. ΗδΑ также подавил респираторный взрыв нейтрофилов в ответ на воздействие ΤΝΡα или комплемента, что привело к селективному и обратимому ингибированию распластывания нейтрофилов. Наконец, обнаружено, что ΗδΑ обладает наименьшим провоспалительным действием из реанимационных жидкостей, используемых в модели геморрагического шока. На основании предшествующих иммунологических исследований автора настоящего изобретения, ΌΑ-ΌΚΡ, по-видимому, частично ответственен за иммуносупрессивные свойства ΗδΑ.

Гетерогенность коммерческих растворов ΗδΑ может быть причиной множества положительных и отрицательных эффектов у тяжелобольных пациентов в зависимости от иммунологического состояния пациента. Некоторые из соединений, недавно идентифицированных в коммерческих растворах ΗδΑ, участвуют в иммунной регуляции и иммунной функции. Кроме того, стабилизатор ΝΑΤ (Νацетилтриптофан) является хорошо известным антагонистом рецептора нейрокинина-1, важного медиатора иммунного и воспалительного ответа, а также проницаемости сосудов. В настоящем изобретении рассмотрен механизм образования противовоспалительного ΌΑ-ΌΚΡ, который в микромолярных концентрациях найден в коммерческих растворах ΗδΑ. Коммерческие растворы ΗδΑ проявляют высокую

- 5 030414

ΌΡΡ-ΐν-активность, которая ингибируется дипротином А, известным ингибитором ΌΡΡ-ΐν. Также ΌΡΡΐν-активность является уникальной для коммерческих растворов ΗδΑ, так как в процессе изготовления по методу Кона другие компоненты плазмы, такие как ΌΡΡ-ΐν, отделяются. Наконец, в нагретых коммерческих растворах ΗδΆ наблюдается бе ηονο образование ΌΑ-ΌΚΡ и соответствующее ингибирование его образования в присутствии дипротина А. Таким образом, в коммерческих растворах ΗδΑ пептидаза ΌΡΡ-ΐν по-видимому участвует в образовании ΌΑ-ΌΚΡ, известного противовоспалительного соединения.

Другой аспект настоящего изобретения включает в себя способ обработки потока исходного материала, содержащего альбумин и ΌΚΡ, такой как ΌΑ-ΌΚΡ, для получения составов. Способ содержит обработку потока исходного материала для получения первого потока с низким содержанием альбумина и первого потока с высоким содержанием альбумина, при этом первый поток с низким содержанием альбумина содержит первую часть ΌΚΡ, присутствующего в потоке исходного материала, а первый поток с высоким содержанием альбумина содержит вторую часть ΌΚΡ, присутствующего в потоке исходного материала. Первый поток с высоким содержанием альбумина подвергают воздействию с целью получения дополнительного ΌΚΡ, в результате чего происходит образование реакционного потока, содержащего альбумин и ΌΚΡ. Реакционный поток обрабатывают для получения второго потока с низким содержанием альбумина и второго потока с высоким содержанием альбумина, при этом второй поток с низким содержанием альбумина содержит одну часть ΌΚΡ, присутствующего в реакционном потоке, а второй поток с высоким содержанием альбумина содержит вторую часть ΌΚΡ, присутствующего в реакционном потоке. В некоторых вариантах настоящего изобретения полученный поток с высоким содержанием альбумина может обладать терапевтическим действием при лечении состояний, которые обычно лечат коммерческими препаратами ΗδΑ, в том числе он может быть эффективным при лечении гипоальбуминемии и гиповолемии. В некоторых вариантах настоящего изобретения полученный ΌΚΡ-содержащий поток с низким содержанием альбумина может обладать терапевтическим действием, в том числе он может быть эффективным при лечении воспалительных заболеваний. В некоторых вариантах настоящего изобретения по меньшей мере два потока с низким содержанием альбумина, содержащие ΌΚΡ, объединены в один поток. Упоминаемый в настоящем изобретении поток исходного материала представляет собой любой водный раствор, который содержит альбумин и ΌΚΡ. По существу, термин "альбумин" включает в себя коммерчески доступные препараты альбумина, такие как растворы альбумина, полученные посредством процесса Кона, его вариаций, хроматографии и любых других подходящих способов получения терапевтических белков, используемых в медицине и ветеринарии. Термин "альбумин" также относится к альбумину любых видов животных, в том числе к человеческому и бычьему альбумину. "Альбумин" также включает в себя белок альбумин, полученный синтетическими способами, такими как рекомбинантная технология и/или клеточные системы экспрессии с использованием бактериальных клеток или клеток млекопитающих в качестве хозяев экспрессии.

В некоторых вариантах настоящего изобретения концентрация альбумина в альбумин- и ΌΚΡсодержащем потоке исходного материала может находиться в пределах приблизительно от 1 до 35 вес.%. В некоторых других вариантах концентрация альбумина в потоке исходного материала находится в пределах приблизительно от 2 до 30 вес.%. В других вариантах концентрация альбумина в потоке исходного материала находится в пределах приблизительно от 4 до 26 вес.%. В отдельных вариантах концентрация альбумина может быть около 5 вес.% или около 25 вес.%.

Упоминаемый в настоящем изобретении "дикетопиперазин" или ΌΚΡ относится к любому из соединений со следующей формулой:

где К¹ и К² могут быть одинаковыми или разными и каждый является боковой цепью аминокислоты, где аминокислота - глицин, аланин, валин, норвалин, α-аминоизомасляная кислота, 2,4диаминомасляная кислота, 2,3-диаминомасляная кислота, лейцин, изолейцин, норлейцин, серин, гомосерин, треонин, аспарагиновая кислота, аспарагин, глутаминовая кислота, глутамин, лизин, гидроксилизин, гистидин, аргинин, гомоаргинин, цитруллин, фенилаланин, р-аминофенилаланин, тирозин, триптофан, тироксин, цистеин, гомоцистеин, метионин, пеницилламин или орнитин; при условии, что если К¹ - боковая цепь аспарагина или глутамина, то К² не может быть боковой цепью лизина или орнитина, а если К¹ - боковая цепь лизина или орнитина, то К² не может быть боковой цепью аспарагина или глутамина. В некоторых вариантах настоящего изобретения ΌΚΡ (например, присутствующий по меньшей мере в одном из потоков: потоке исходного материала, альбуминсодержащем потоке, ΌΚΡ-содержащем потоке, потоке с высоким содержанием альбумина, потоке с низким содержанием альбумина и их сочетаниях) может включать в себя по меньшей мере один из дикетопиперазинов: аспарагиновая кислота-аланиндикетопиперазин (ΌΑ-ΌΚΡ), метионин-аргинин-дикетопиперазин (МК-ΌΚΡ), глутаминовая кислотааланин-дикетопиперазин (ΕΑ-ΌΚΡ), тирозин-глутаминовая кислота-дикетопиперазин (ΎΕ-ΌΚΡ), глицин- 6 030414

лейцин-дикетопиперазин (СЬ-ΌΚΡ), пролин-фенилаланин-дикетопиперазин (ΡΡ-ΌΚΡ), аланин-пролиндикетопиперазин (ΑΡ-ΌΚΡ) и их сочетания. В некоторых вариантах настоящего изобретения ΌΚΡ (например, присутствующий по меньшей мере в одном из потоков: потоке исходного материала, альбуминсодержащем потоке, ΌΚΡ-содержащем потоке, потоке с высоким содержанием альбумина, потоке с низким содержанием альбумина и их сочетаниях) может включать в себя ΌΆ-ΌΚΡ, также известный как 3метил-2,5-дикетопиперазин-6-уксусная кислота, то есть в котором К¹ это -СН2-СООН, а К² это -СН3.

В некоторых вариантах настоящего изобретения концентрация ΌΚΡ в потоке исходного материала может быть в интервале приблизительно от 0 до 200 мкМ ΌΚΡ. В других вариантах настоящего изобретения концентрация ΌΚΡ в потоке исходного материала может быть в интервале приблизительно от 50 до 100 мкМ ΌΚΡ. В некоторых вариантах настоящего изобретения содержание ΌΚΡ составляет как минимум 50% ΌΆ-ΌΚΡ, как минимум 60% ΌΆ-ΌΚΡ, как минимум 70% ΌΆ-ΌΚΡ, как минимум 80% ΌΆΌΚΡ, как минимум 90% ΌΆ-ΌΚΡ, как минимум 95% ΌΑ-ΌΚΡ, как минимум 98% ΌΆ-ΌΚΡ, как минимум 99% ΌΑ-ΌΚΡ, как минимум 99,9% ΌΑ-ΌΚΡ или 100% ΌΑ-ΌΚΡ.

В некоторых вариантах настоящего изобретения обработка по меньшей мере одного из потоков: потока исходного материала и реакционного потока, может включать в себя приемы разделения белков для выделения белка, например альбумина, из входящего потока в поток с высоким содержанием белка. Такие приемы могут включать в себя по меньшей мере фильтрацию, хроматографию, осаждение, экстракцию и их сочетания. В некоторых вариантах настоящего изобретения обработка по меньшей мере одного из потоков: потока исходного материала и реакционного потока, может включать в себя фильтрацию. В других вариантах обработка по меньшей мере одного из потоков: потока исходного материала и реакционного потока, может включать в себя тангенциальную фильтрацию.

Упоминаемая в настоящем изобретении фильтрация является механическим и/или физическим процессом отделения одной фракции альбуминсодержащего потока исходного материала от остальной фракции с использованием перепада давления в слое фильтрующей среды. Используемый в настоящем изобретении термин "механическая фильтрация" относится, помимо прочего, к эксклюзионной фильтрации. Используемый в настоящем изобретении термин "физическая фильтрация" относится, помимо прочего, к молекулярным взаимодействиям, таким как силы притяжения и отталкивания зарядов, образование водородных связей и взаимодействие диполей. Фильтрующая среда может включать в себя, помимо прочего, фильтровальную бумагу, стекловолокно, спеченное стекло, спеченные металлы, монолитную керамику, полимерные мембраны и любой из этих материалов со вспомогательным фильтрующим материалом, например диатомитом, или без него. Фильтрующая среда может быть гидрофильной и/или гидрофобной.

В некоторых вариантах настоящего изобретения фильтрация может включать в себя тангенциальную поточную фильтрацию. Используемый в настоящем изобретении термин "тангенциальный поток" относится к направлению движения альбуминсодержащего потока исходного материала относительно фильтрующей среды. Указанное направление потока может быть либо тангенциальным (также обычно называемым "поперечным потоком") либо "нормальным потоком", или их сочетанием. Тангенциальный поток относится к альбуминсодержащему потоку исходного материала, который характеризуется тем, что основная часть потока движется поперек поверхности фильтрующей среды, тогда как нормальный поток относится к потоку, который характеризуется тем, что основная часть потока движется сквозь фильтрующую среду под углом 90° относительно поверхности фильтрующей среды.

В некоторых вариантах настоящего изобретения перепад давления для любого типа фильтрации или для пропускания потока через другие типовые процессы обработки (например, хроматографию) может быть достигнут путем подачи под давлением по меньшей мере одного потока: потока исходного материала и реакционного потока, с помощью насоса или путем создания вакуума с той стороны фильтрующей среды, которая расположена ниже по потоку, или с помощью воздействия центробежных сил на фильтрующую среду и по меньшей мере один из потоков: поток исходного материала и реакционный поток или любыми другими подходящими способами или их сочетанием. Используемое в настоящем изобретении выражение "сторона, расположенная ниже по потоку" (также упоминаемая как сторона "с низким содержанием альбумина" и "ΌΚΡ-содержащая сторона") относится к стороне фильтрующей среды, где находиться ΌΚΡ-содержащий поток или фильтрат, в противоположность "стороне выше по потоку" (также упоминаемой как сторона "с высоким содержанием альбумина" или "альбуминсодержащая сторона"), которая относится к стороне фильтрующей среды, где находится ретентат. Используемый в настоящем изобретении термин "вакуум" относится к абсолютному давлению меньше 14,7 абсолютных фунтов на квадратный дюйм (ркта).

В некоторых вариантах настоящего изобретения обработка может включать в себя хроматографию. Упоминаемая в настоящем изобретении "хроматография" является механическим и/или физическим процессом отделения одной фракции по меньшей мере одного потока: потока исходного материала и реакционного потока от остальной фракции с использованием перепада давления в слое неподвижной фазы.

Используемый в настоящем изобретении термин "механическая хроматография" относится, помимо прочего, к эксклюзионной хроматографии. Используемый в настоящем изобретении термин "физическая

- 7 030414

хроматография" относится, помимо прочего, к аффинной хроматографии, ионообменной хроматографии, жидкостной экспресс-хроматографии белков и иммуносорбционной хроматографии. Неподвижная фаза стадии хроматографии может включать в себя, помимо прочего, смолы (а именно полистирол, полистирол-дивинилбензол и полиакриламид), ионообменные смолы (а именно смолы, содержащие сульфогруппы, четвертичные аммониевые, карбоксильные и диэтиламмониевые функциональные группы), поперечно сшитую агарозу, поперечно сшитые декстраны, фосфоцеллюлозу, пористое стекло и кварц, матрицы из оксида алюминия и диоксида циркония. Кроме того, неподвижная фаза может быть иммобилизована на частицах твердого носителя или на внутренней стенке цилиндра посредством физического притяжения, образования химических связей и/или посредством полимеризации ίη δίΐιι после нанесения покрытия. Иммобилизованная неподвижная фаза может покрывать внешние поверхности частиц и цилиндр и/или заполнять любые доступные поры в твердых частицах. Связанная неподвижная фаза может быть выбрана из группы, включающей в себя, помимо прочего, связанные с полимером, с привитым полимером, с привитыми алкильными, фенильными, цианогруппами, диольными группами и аминогруппами, а также кеппированные неподвижные фазы. Все эти термины известны рядовым специалистам в области хроматографии. Кроме того, неподвижная фаза может быть функционализирована биоспецифичными лигандами, которые включают в себя, помимо прочего, антитела, рецепторы белков, стероидные гормоны, витамины и ингибиторы ферментов.

В некоторых вариантах настоящего изобретения неподвижная фаза может быть помещена в хроматографическую колонку и иммобилизована в ней. На вход хроматографической колонки может подаваться по меньшей мере один из потоков: поток исходного материала и реакционный поток, а на выходе из колонки имеются потоки с высоким содержанием альбумина и низким содержанием альбумина, при этом разделение потоков с высоким содержанием альбумина и низким содержанием альбумина может осуществляться за счет различного времени элюирования. Перепад давления для пропускания потока исходного материала через хроматографическую колонку может создаваться посредством подачи под давлением по меньшей мере одного потока: потока исходного материала и реакционного потока с помощью по меньшей мере одного насоса.

В некоторых вариантах настоящего изобретения обработка может содержать эксклюзионный процесс, в котором поток исходного материала или реакционный поток или оба разделяются на поток ретентата с высоким содержанием альбумина и поток фильтрата с низким содержанием альбумина, содержащий ΌΚΡ. В некоторых вариантах настоящего изобретения ретентат содержит больше приблизительно 80 вес.%, больше приблизительно 85 вес.%, больше приблизительно 90 вес.%, больше приблизительно 95 вес.% или больше приблизительно 99 вес.% белков, присутствующих в альбумин- и ΌΚΡ-содержащем потоке исходного материала, в том числе белки с молекулярной массой, большей чем около 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 кДа.

В некоторых вариантах настоящего изобретения воздействие для получения ΌΚΡ может включать по меньшей мере одну обработку: термическую, химическую, ферментативную и их сочетания.

В некоторых вариантах настоящего изобретения воздействие на альбуминсодержащий поток может включать в себя по меньшей мере один из процессов: тепловую обработку, пастеризацию, ферментативное воздействие, химическое воздействие, а также их сочетания. В некоторых вариантах настоящего изобретения воздействие на альбуминсодержащий поток может включать в себя нагрев альбуминсодержащего потока до средней объемной температуры в интервале приблизительно от 40 до 80°С. В некоторых вариантах настоящего изобретения воздействие на альбуминсодержащий поток может включать в себя нагрев альбуминсодержащего потока до средней объемной температуры в интервале приблизительно от 50 до 70°С. В некоторых вариантах настоящего изобретения воздействие на альбуминсодержащий поток может включать в себя нагрев альбуминсодержащего потока до средней объемной температуры в интервале приблизительно от 55 до 65°С. В некоторых вариантах настоящего изобретения воздействие на альбуминсодержащий поток может включать в себя нагрев альбуминсодержащего потока до средней объемной температуры в интервале приблизительно от 57,5 до 62,5°С. В некоторых вариантах настоящего изобретения воздействие на альбуминсодержащий поток может включать в себя нагрев альбуминсодержащего потока до средней объемной температуры около 60°С.

В некоторых вариантах настоящего изобретения воздействие на альбуминсодержащий поток может содержать ферментативное воздействие на альбуминсодержащий поток по меньшей мере одного соединения: дипептидазы, калликреина, катепсина, карбоксипептидазы, а также их сочетаний. В некоторых других вариантах настоящего изобретения воздействие на альбуминсодержащий поток может содержать ферментативное воздействие на поток, по меньшей мере, дипептидилпептидазы IV. В некоторых вариантах настоящего изобретения по меньшей мере одно соединение: дипептидаза, калликреин, катепсин, карбоксипептидаза, а также их сочетания могут присутствовать в потоке исходного материала, полученного от коммерческого поставщика альбумина или некоммерческого поставщика альбумина. Например, альбуминсодержащий исходный материал может содержать ферментативно активные дипептидазы, которые способны образовывать дополнительный ΌΚΡ на последующей реакционной стадии или с течением времени, например, при хранении на складе в условиях окружающей среды. В некоторых вариантах на- 8 030414

стоящего изобретения поток исходного материала может содержать дипептидазу, активность которой, определенная с помощью анализа с использованием хромогенного субстрата, ΟΙν-ΡΐΌ-ρΝΑ, как описано в примерах, находится в интервале от более чем 0 мкМ ρΝΑ до приблизительно 200 мкМ ρΝΑ. В некоторых других вариантах настоящего изобретения поток исходного материала может содержать дипептидазу, активность которой находится в интервале приблизительно от 40 до 140 мкМ ρΝΑ.

В некоторых других вариантах настоящего изобретения по меньшей мере одно соединение: дипептидаза, калликреин, катепсин, карбоксипептидаза, а также их сочетания могут добавляться по меньшей мере к одному из потоков: потоку исходного материала, первому потоку с высоким содержанием альбумина, второму потоку с высоким содержанием альбумина, любым последующим потокам с высоким содержанием альбумина, а также их сочетаниям. В некоторых вариантах настоящего изобретения по меньшей мере к одному из потоков: потоку исходного материала, первому потоку с высоким содержанием альбумина, второму потоку с высоким содержанием альбумина, любым последующим потокам с высоким содержанием альбумина, а также их сочетаниям, может добавляться дипептидаза. В других вариантах настоящего изобретения по меньшей мере к одному из потоков: потоку исходного материала, первому потоку с высоким содержанием альбумина, второму потоку с высоким содержанием альбумина, любым последующим потокам с высоким содержанием альбумина, а также их сочетаниям, может добавляться дипептидаза, при этом пептидазная активность в потоке может быть увеличена до величины приблизительно от 0 до 200 мкМ ρΝΑ. В других вариантах пептидазная активность может быть увеличена до величины приблизительно от 40 до 150 мкМ ρΝΑ.

В некоторых других вариантах настоящего изобретения воздействие на поток с высоким содержанием альбумина может включать в себя каталитическое воздействие на альбумин, присутствующий в потоке с высоким содержанием альбумина, с помощью по меньшей мере одного редокс-активного металла, такого как железо или медь. Другие возможные металлические катализаторы включают в себя, помимо прочего, литий, калий, кальций, натрий, магний, алюминий, цинк, никель, свинец, марганец, олово, серебро, платину, золото и их сочетания. В некоторых вариантах настоящего изобретения воздействие на поток с высоким содержанием альбумина может осуществляться в присутствии по меньшей мере одного редокс-активного металла в виде гомогенного катализатора, гетерогенного катализатора или в обоих видах. В некоторых других вариантах настоящего изобретения воздействие на поток с высоким содержанием альбумина может содержать в себя пропускание потока через реактор с неподвижным слоем катализатора, который содержит твердый катализатор, состоящий по меньшей мере из одного редоксактивного металла, нанесенного на подложку. В некоторых других вариантах настоящего изобретения воздействие на поток с высоким содержанием альбумина может включать в себя воздействие на альбумин в суспензионном реакторе, в котором редокс-активный металл суспендирован в жидкой смеси и/или смешан с помощью устройства для перемешивания.

В некоторых вариантах настоящего изобретения реактор для воздействия на поток с высоким содержанием альбумина может содержать реактор периодического действия, реактор непрерывного действия и их сочетания. В некоторых других вариантах реактор может содержать реактор с перемешиванием, реактор непрерывного действия с перемешиванием, реактор с неподвижным слоем катализатора, реактор вытеснения и их сочетания.

В некоторых вариантах настоящего изобретения воздействие на поток с высоким содержанием альбумина может включать в себя нагрев потока с высоким содержанием альбумина до объемной температуры, более высокой, чем температура окружающей среды. Только в качестве примера в некоторых вариантах воздействие на поток с высоким содержанием альбумина может включать нагрев потока до температур меньше, чем температуры денатурации альбумина и ΌΚΡ, и больше приблизительно 20°С, больше приблизительно 30°С, больше приблизительно 40°С, больше приблизительно 50°С, больше приблизительно 60°С, больше приблизительно 70°С или больше приблизительно 80°С. В некоторых других вариантах настоящего изобретения воздействие на поток с высоким содержанием альбумина может включать в себя как нагрев потока с высоким содержанием альбумина, так и по меньшей мере ферментативное и/или химическое воздействие на поток с высоким содержанием альбумина.

В некоторых вариантах настоящего изобретения вдобавок к альбумину и ΌΚΡ поток исходного материала может содержать несколько дополнительных компонентов. Такие компоненты могут быть природными веществами, извлеченными из крови, из которой получали раствор альбумина, или они могут быть веществами, образованными при получении альбумина синтетическим способом, или они могут быть веществами, внесенными или образованными во время очистки природного продукта, например, помимо прочего, при очистке плазмы крови с использованием процесса Кона и его вариаций. Вещества, внесенные в альбуминсодержащий поток исходного материала, могут включать добавки, специально добавленные к альбуминсодержащим потокам исходного материала или до, или после синтеза синтетического альбумина либо до, или после очистки природного альбумина. Такие добавки включают, помимо прочего, натрий, калий, Ν-ацетилтриптофан, каприлат натрия и/или каприловую кислоту. Вещества, образованные во время очистки продукта из природного альбумина, включают, помимо прочего, аминокислоты, ΌΚΡ и любые другие соединения или вещества, образующиеся в результате термического, фи- 9 030414

зического, ферментативного или химического разрушения природных белков плазмы.

В некоторых вариантах настоящего изобретения первый поток с высоким содержанием альбумина может содержать по меньшей мере около 10%, по меньшей мере около 20%, по меньшей мере около 30%, по меньшей мере около 40%, по меньшей мере около 50%, по меньшей мере около 60%, по меньшей мере около 70%, по меньшей мере около 80%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 99%, по меньшей мере около 99,1%, по меньшей мере около 99,2%, по меньшей мере около 99,3%, по меньшей мере около 99,4%, по меньшей мере около 99,5%, по меньшей мере около 99,6%, по меньшей мере около 99,7%, по меньшей мере около 99,8%, по меньшей мере около 99,9%, по меньшей мере около 99,91%, по меньшей мере около 99,92%, по меньшей мере около 99,93%, по меньшей мере около 99,94%, по меньшей мере около 99,95%, по меньшей мере около 99,96%, по меньшей мере около 99,97%, по меньшей мере около 99,98%, по меньшей мере около 99,99% от веса альбумина в потоке исходного материала.

В качестве примера для случаев, когда в результате обработки альбуминсодержащего потока исходного материала получают альбуминсодержащий поток, содержащий по меньшей мере около 90% от веса альбумина в потоке исходного материала, если альбуминсодержащий поток исходного материала содержит 100 мл альбуминсодержащего исходного материала с концентрацией альбумина 0,03 г альбумина на миллилитр, то поток продукта, полученный на стадии обработки (то есть фильтрации, хроматографии и т.п.), содержит по меньшей мере 2,7 г альбумина. Также в качестве примера, если альбуминсодержащий поток исходного материала содержит 100 мл альбуминсодержащего исходного материала с концентрацией альбумина 0,5 г альбумина на миллилитр, то полученный альбуминсодержащий поток содержит по меньшей мере 45 г альбумина. Специалистам должно быть понятно, что пропорциональное увеличение или уменьшение вышеуказанных иллюстративных объемов и/или процентного содержания приведет к соответствующему изменению количества альбумина, присутствующего в потоке с высоким содержанием альбумина, которое можно вычислить с помощью простой математики.

В некоторых вариантах настоящего изобретения второй поток с высоким содержанием альбумина может содержать по меньшей мере около 10%, по меньшей мере около 20%, по меньшей мере около 30%, по меньшей мере около 40%, по меньшей мере около 50%, по меньшей мере около 60%, по меньшей мере около 70%, по меньшей мере около 80%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 99%, по меньшей мере около 99,1%, по меньшей мере около 99,2%, по меньшей мере около 99,3%, по меньшей мере около 99,4%, по меньшей мере около 99,5%, по меньшей мере около 99,6%, по меньшей мере около 99,7%, по меньшей мере около 99,8%, по меньшей мере около 99,9%, по меньшей мере около 99,91%, по меньшей мере около 99,92%, по меньшей мере около 99,93%, по меньшей мере около 99,94%, по меньшей мере около 99,95%, по меньшей мере около 99,96%, по меньшей мере около 99,97%, по меньшей мере около 99,98%, по меньшей мере около 99,99% от веса альбумина в реакционном потоке.

В некоторых вариантах настоящего изобретения последующий поток с высоким содержанием альбумина, полученный на стадии обработки, не относящейся к первым двум стадиям обработки, может содержать по меньшей мере около 10%, по меньшей мере около 20%, по меньшей мере около 30%, по меньшей мере около 40%, по меньшей мере около 50%, по меньшей мере около 60%, по меньшей мере около 70%, по меньшей мере около 80%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 99%, по меньшей мере около 99,1%, по меньшей мере около 99,2%, по меньшей мере около 99,3%, по меньшей мере около 99,4%, по меньшей мере около 99,5%, по меньшей мере около 99,6%, по меньшей мере около 99,7%, по меньшей мере около 99,8%, по меньшей мере около 99,9%, по меньшей мере около 99,91%, по меньшей мере около 99,92%, по меньшей мере около 99,93%, по меньшей мере около 99,94%, по меньшей мере около 99,95%, по меньшей мере около 99,96%, по меньшей мере около 99,97%, по меньшей мере около 99,98%, по меньшей мере около 99,99% от веса альбумина, присутствующего в потоке с высоким содержанием альбумина, который подается на стадии обработки, не относящейся к первым двум стадиям обработки.

В некоторых вариантах настоящего изобретения первая часть ΌΚΡ, присутствующая в первом потоке с низким содержанием альбумина, может содержать по меньшей мере около 5 вес.%, по меньшей мере около 10 вес.%, по меньшей мере около 20 вес.%, по меньшей мере около 30 вес.%, по меньшей мере около 40 вес.%, по меньшей мере около 50 вес.%, по меньшей мере около 60 вес.%, по меньшей мере около 70 вес.%, по меньшей мере около 80 вес.%, по меньшей мере около 90 вес.% или по меньшей мере около 99 вес.% ΌΚΡ, присутствующего в потоке исходного материала.

В некоторых вариантах настоящего изобретения первая часть ΌΚΡ, присутствующая во втором потоке с низким содержанием альбумина, может содержать по меньшей мере около 5 вес.%, по меньшей мере около 10 вес.%, по меньшей мере около 20 вес.%, по меньшей мере около 30 вес.%, по меньшей мере около 40 вес.%, по меньшей мере около 50 вес.%, по меньшей мере около 60 вес.%, по меньшей мере около 70 вес.%, по меньшей мере около 80 вес.%, по меньшей мере около 90 вес.% или по меньшей мере около 99 вес.% ΌΚΡ, присутствующего в реакционном потоке.

В некоторых вариантах настоящего изобретения последующая часть ΌΚΡ, присутствующая в последующем потоке с низким содержанием альбумина, полученном на стадии обработки, не относящейся к первым двум стадиям обработки, может содержать по меньшей мере около 5 вес.%, по меньшей мере

- 10 030414

по

по

по

по

по

по меньшей мере около 170 мкМ, по меньшей мере около 200 мкМ, по меньшей мере около 350 мкМ,

по меньпо меньпо меньпо меньоколо 10 вес.%, по меньшей мере около 20 вес.%, по меньшей мере около 30 вес.%, по меньшей мере около 40 вес.%, по меньшей мере около 50 вес.%, по меньшей мере около 60 вес.%, по меньшей мере около 70 вес.%, по меньшей мере около 80 вес.%, по меньшей мере около 90 вес.% или по меньшей мере около 99 вес. % ΌΚΡ, присутствующего в потоке с высоким содержанием альбумина, который подается на стадию обработки, не относящуюся к первым двум стадиям обработки.

В некоторых вариантах настоящего изобретения концентрация ΌΚΡ в первом потоке с низким содержанием альбумина может составлять по меньшей мере около 10 мкМ, по меньшей мере около 20 мкМ, по меньшей мере около 30 мкМ, по меньшей мере около 40 мкМ, по меньшей мере около 50 мкМ, по меньшей мере около 60 мкМ, по меньшей мере около 70 мкМ, по меньшей мере около 80 мкМ, по меньшей мере около 90 мкМ, по меньшей мере около 100 мкМ, по меньшей мере около 110 мкМ

меньшей мере около 120 мкМ, по меньшей мере около 130 мкМ, по меньшей мере около 140 мкМ.

меньшей мере около 150 мкМ, по меньшей мере около 160 мкМ,

меньшей мере около 180 мкМ, по меньшей мере около 190 мкМ

меньшей мере около 250 мкМ, по меньшей мере около 300 мкМ,

меньшей мере около 400 мкМ, по меньшей мере около 450 мкМ или по меньшей мере около 500 мкМ. В других вариантах концентрация ΌΚΡ во втором потоке с низким содержанием альбумина может составлять по меньшей мере около 10 мкМ, по меньшей мере около 20 мкМ, по меньшей мере около 30 мкМ, по меньшей мере около 40 мкМ, по меньшей мере около 50 мкМ, по меньшей мере около 60 мкМ, по меньшей мере около 70 мкМ, по меньшей мере около 80 мкМ, по меньшей мере около 90 мкМ, по меньшей мере около 100 мкМ, по меньшей мере около 110 мкМ, по меньшей мере около 120 мкМ, по меньшей мере около 130 мкМ, по меньшей мере около 140 мкМ, по меньшей мере около 150 мкМ,

шей мере около 160 мкМ, по меньшей мере около 170 мкМ, по меньшей мере около 180 мкМ

шей мере около 190 мкМ, по меньшей мере около 200 мкМ, по меньшей мере около 250 мкМ,

шей мере около 300 мкМ, по меньшей мере около 350 мкМ, по меньшей мере около 400 мкМ,

шей мере около 450 мкМ или по меньшей мере около 500 мкМ.

Еще одним аспектом настоящего изобретения является способ обработки потока исходного материала, содержащего альбумин и ΌΚΡ, с целью получения терапевтических составов, как описано выше, дополнительно содержащий стадию анализа, при этом стадия анализа включает анализ потока с высоким содержанием альбумина для получения по меньшей мере одного показателя, сравнение по меньшей мере одного показателя по меньшей мере с одной заданной величиной, причем если по меньшей мере один показатель больше или меньше заданной величины, реакционную стадию и стадию обработки повторяют до тех пор, пока по меньшей мере один показатель последующего потока с высоким содержанием альбумина не будет равен по меньшей мере одной заданной величине или больше или меньше нее. В некоторых вариантах настоящего изобретения стадия анализа может включать в себя жидкостную хроматографию высокого давления и масс-спектроскопию или любой другой способ анализа, подходящий для измерения требуемого показателя. В некоторых вариантах настоящего изобретения по меньшей мере одним показателем является масса полноразмерного альбумина, остающегося после по меньшей мере одной стадии обработки, а заданной величиной является доля теоретически максимальной массы альбумина, который может быть обработан для получения ΌΆ-ΌΚΡ. В других вариантах по меньшей мере одним показателем является масса ΌΚΡ, полученного по меньшей мере на одной стадии обработки, а заданной величиной является доля теоретической максимальной массы ΌΚΡ, который может быть получен из альбумина в потоке исходного материала.

В некоторых вариантах настоящего изобретения способ обработки потока исходного материала, содержащего альбумин и ΌΚΡ, с целью получения терапевтических составов может дополнительно содержать регулировку рН потока с высоким содержанием альбумина. В некоторых вариантах настоящего изобретения рН потока исходного материала может иметь заданную величину. В некоторых других вариантах до реакционной стадии и/или во время реакционной стадии рН потока с высоким содержанием альбумина регулируется до заданной величины. В некоторых других вариантах до стадии обработки и/или во время стадии обработки рН потока с высоким содержанием альбумина регулируется до заданной величины. рН потока с высоким содержанием альбумина может регулироваться для улучшения по меньшей мере одного процесса: ферментативной реакции, каталитической реакции, термической деструкции и их сочетаний. В некоторых вариантах настоящего изобретения регулирование рН потока с высоким содержанием альбумина может включать регулирование рН до величины в интервале приблизительно от 1,5 до 10. В некоторых других вариантах настоящего изобретения регулирование рН потока с высоким содержанием альбумина может включать регулирование рН до величины в интервале приблизительно от 4,0 до 8,0. В других вариантах настоящего изобретения рН потока с высоким содержанием альбумина устанавливается на уровне физиологического значения рН, то есть приблизительно на уровне рН 7,3-7,4. В некоторых вариантах настоящего изобретения способ обработки потока исходного материала, содержащего альбумин и ΌΚΡ, с целью получения терапевтических составов может дополнительно содержать разбавление потока с высоким содержанием альбумина. В некоторых других вариантах настоящего изобретения может быть разбавлен по меньшей мере один из потоков: поток исходного материала и реакционный поток. В других вариантах настоящего изобретения разбавление может осущест- 11 030414

вляться с использованием разбавителя, выбранного из группы, состоящей из солевого раствора, лактированного раствора Рингера, ацетатного раствора Рингера, растворов гидроксиэтилкрахмала и растворов декстрозы. Стадия разбавления может обеспечить возможность добавления к потокам с низким содержанием альбумина и/или потокам с высоким содержанием альбумина дополнительных компонентов, которые обладают различными дополнительными лечебными свойствами. Например, к потоку с низким содержанием альбумина и с высоким содержанием ΌΚΡ в качестве разбавителя может быть добавлен лактированный раствор Рингера, который будет участвовать в контроле метаболического ацидоза у пациентов с нарушенным иммунитетом. Чтобы удовлетворить особые терапевтические требования отдельного пациента или групп пациентов, в качестве разбавителей могут быть выбраны другие растворы, либо отдельно, либо в виде смесей, которые могут добавляться либо в один, либо в оба потока: поток с высоким содержанием альбумина и поток с низким содержанием альбумина.

Кроме того, на стадии разбавления разбавитель может восполнить вытесненный объем, что позволяет извлекать более высокий процент ΌΚΡ, присутствующего в исходном альбуминсодержащем материале. В некоторых вариантах настоящего изобретения стадия обработки может содержать эксклюзионное разделение, в процессе которого практически весь альбумин, присутствующий в потоке исходного материала, задерживается в ретентате. И наоборот, в этих вариантах альбумин, присутствующий в потоке исходного материала, практически не проходит через устройство эксклюзионного разделения вместе с фильтратом. В данном варианте альбумин может рассматриваться как частицы в суспензии, а остальная ΌΚΡ-содержащая водная фаза - как жидкость, в которой суспендированные альбуминовые частицы находятся во взвешенном состоянии. Соответственно фильтрат является, по существу, той же ΌΚΡсодержащей водной фазой, как и та, что остается в ретентате. Кроме того, в данном варианте во время одностадийного или даже многостадийного эксклюзионного процесса невозможно полностью удалить всю ΌΚΡ-содержащую водную фазу из альбумина. При отсутствии каких-либо вспомогательных средств поток с высоким содержанием альбумина будет удерживать часть ΌΚΡ-содержащей водной фазы. Разбавитель может обеспечить объем жидкости, который может восполнить эту ΌΚΡ-содержащую водную фазу и вытеснить некоторый ее процент из альбумина в фильтрат или поток с низким содержанием альбумина во время типового эксклюзионного процесса.

Еще одним аспектом настоящего изобретения является состав, содержащий ΌΚΡ, который содержит менее 10 вес.% альбумина. В некоторых вариантах настоящего изобретения концентрация альбумина в ΌΚΡ-содержащем составе может быть меньше приблизительно 1 вес.% или меньше приблизительно 0,1 вес.%. В других вариантах настоящего изобретения концентрация альбумина в ΌΚΡ-содержащем составе может быть около нуля весовых процентов или в неподдающихся обнаружению пределах.

В некоторых вариантах настоящего изобретения состав, содержащий ΌΚΡ, может обладать полезным терапевтическим действием, например, помимо прочего, он может быть эффективным при лечении воспалительных состояний.

В некоторых вариантах настоящего изобретения ΌΚΡ может включать по меньшей мере одно из соединений: аспарагиновую кислоту-аланин-ΌΚΡ, метионин-аргинин-ΌΚΡ, глутаминовую кислоту-аланинΌΚΡ, тирозин-глутаминовую кислоту-ΌΚΡ, глицин-лейцин-ΌΚΡ, пролин-фенилаланин-ΌΚΡ, аланинпролин-ΌΚΡ, а также их сочетания. В других вариантах ΌΚΡ может присутствовать в концентрации приблизительно от 25 до 200 мкМ.

В некоторых вариантах настоящего изобретения состав, содержащий ΌΚΡ, может дополнительно содержать по меньшей мере один из растворов: солевой раствор, лактированный раствор Рингера, ацетатный раствор Рингера, раствор гидроксиэтилкрахмала, раствор декстрозы, а также их сочетания. В некоторых вариантах настоящего изобретения состав, содержащий ΌΚΡ, может дополнительно содержать по меньшей мере один дополнительный компонент, выбранный из группы, состоящей из ацетилтриптофаната натрия, Ν-ацетилтриптофана, каприловой кислоты, ее солей, таких как каприлат натрия, и сочетаний этих веществ. Такие дополнительные компоненты могут присутствовать в количестве, в котором они обычно присутствуют в коммерческом ΗδΆ. Например, такие компоненты могут присутствовать в количестве приблизительно от 0,1 до 30 мМ или в интервале, нижняя граница которого может быть около 0,1 мМ, около 0,2 мМ, около 0,3 мМ, около 0,4 мМ, около 0,5 мМ, около 0,6 мМ, около 0,7 мМ, около 0,8 мМ, около 0,9 мМ, около 1 мМ, около 2 мМ, около 3 мМ, около 4 мМ, около 5 мМ, около 6 мМ, около 7 мМ, около 8 мМ, около 9 мМ, около 10 мМ, около 11 мМ, около 12 мМ, около 13 мМ, около 14 мМ, около 15 мМ или около 20 мМ. Такие интервалы могут иметь верхнюю границу около 1 мМ, около 2 мМ, около 3 мМ, около 4 мМ, около 5 мМ, около 6 мМ, около 7 мМ, около 8 мМ, около 9 мМ, около 10 мМ, около 11 мМ, около 12 мМ, около 13 мМ, около 14 мМ, около 15 мМ, около 16 мМ, около 17 мМ, около 18 мМ, около 19 мМ, около 20 мМ, около 21 мМ, около 22 мМ, около 23 мМ, около 24 мМ, около 25 мМ, около 26 мМ, около 27 мМ, около 28 мМ, около 29 мМ, около 30 мМ, около 31 мМ, около 32 мМ, около 33 мМ, около 34 мМ или около 35 мМ.

Способы по настоящему изобретению более эффективны по сравнению с ранее известными способами синтеза ΌΚΡ и обеспечивают получение большего количества ΌΚΡ. В частности, в этих вариантах способов по настоящему изобретению осуществляется синтез ΌΚΡ из плазмы млекопитающих. Плазма может быть плазмой млекопитающего, такого как кролик, коза, собака, кошка, лошадь или человек. Жи- 12 030414

вотное предпочтительно является человеком, а плазма предпочтительно является человеческой плазмой.

Плазма содержит компоненты для синтеза ΌΚΡ, в том числе альбумин, иммуноглобулин и эритропоэтин, а также другие белки и пептиды. Способы по настоящему изобретению включают синтез ΌΚΡ из плазмы, причем способы по настоящему изобретению могут значительно увеличить количество синтезированных ΌΚΡ по сравнению с известными в технике способами получения ΌΚΡ. Н8Л является основным компонентом присутствующих в плазме белков, состоящим из одноцепочечного полипептида, содержащего 585 аминокислотных остатков, и имеет молекулярную массу около 66000 Да (см. МшдЪейт Ρ.Ρ. е! а1. (1986), Мо1еси1аг 51гис1иге οί !йе Ьитаи а1Ъитт деие 15 геееа1ей Ъу 1шс1еоОйе зесщепсе \νί11ιίη 1122 οί сйготозоте 4. ί. Βίο1. Сйет. 261, рр. 6747-6757). Н8Л обычно получают посредством фракционирования человеческой плазмы по методу Кона, посредством спиртового фракционирования при низких температурах или подобными способами получения Н8Л-содержащих фракций (Н8Л отделяется во фракцию V) с последующей очисткой фракций путем использования различных технологий очистки. Затем Н8Л был очищен с использованием одного или нескольких способов: высаливания, ультрафильтрации, изоэлектрического осаждения, электрофореза, ионообменной хроматографии, гельфильтрационной хроматографии и/или аффинной хроматографии. Когда плазма обрабатывается с целью получения Н8Л или других растворов белков и/или пептидов, обработка уменьшает количество альбумина, иммуноглобулина, эритропоэтина и других белков и пептидов, из которых можно получать ΌΚΡ. Другими словами в плазме содержится большее количество альбумина, иммуноглобулина и эритропоэтина, а также других белков и пептидов, чем в Н8Л или других очищенных растворах пептидов или белков. Поэтому в некоторых описанных здесь способах по настоящему изобретению для получения ΌΚΡ используется плазма. Соответственно ΌΚΡ в настоящем изобретении могут быть получены путем нагрева плазмы. "Плазма" может относится к необработанной плазме или к раствору плазмы в фосфатном буфере при нейтральном значении рН. Предпочтительно раствор плазмы является концентрированным раствором (например около 100-500 мМ), чтобы произошло протонирование Ν-терминальной и/или Стерминальной аминокислоты. Плазма может быть нагрета до 60°С в течение по меньшей мере приблизительно 2 ч, 3 ч, 4 ч, 5 ч, 6 ч, 7 ч, 8 ч, 9 ч, 10 ч, 11 ч, 12 ч, 13 ч, 14 ч, 15 ч, 16 ч, 17 ч, 18 ч, 19 ч, 20 ч, 21 ч, 22 ч, 23 ч, 24 ч, 2 дней, 3 дней, 4 дней, 5 дней, 6 дней, 7 дней, 8 дней, 9 дней, 10 дней, чтобы произошло образование ΌΚΡ. Предпочтительно нужно избегать денатурации белка. Этого можно достичь посредством использования более коротких периодов времени и/или добавлением каприловой кислоты или Νацетилтриптофана в концентрации около 0,02М для каждого.

ΌΚΡ в настоящем изобретении также можно получать посредством взаимодействия плазмы с ферментом, который может отщеплять две Ν-терминальные аминокислоты от белков и пептидов (например, с дипептидилпептидазой, и в частности ΌΡΡ-ΐν) в плазме, или с ферментом, который может отщеплять две С-терминальные аминокислоты от белков или пептидов (например, с карбоксипептидазами). Реакцию нужно проводить при рН 6-8, предпочтительно в буфере, таком как фосфатный буфер, при температуре, достаточно высокой, чтобы ускорить реакцию, но не настолько высокой, чтобы происходила денатурация белка.

В одном варианте требуемый ΌΚΡ является ΌΆ-ΌΚΡ, фермент является ΌΡΡ-ΐν, температура составляет приблизительно от 40 до 80°С, предпочтительно около 60°С, продолжительность реакции приблизительно от 5 ч до 6 дней. В одном варианте ΌΡΡ-ΐν является эндогенной и уже присутствует в плазме, добавляется к плазме во время процесса или является их сочетанием. Температура процесса может быть по меньшей мере около 40, около 41, около 42, около 43, около 44, около 45, около 46, около 47, около 48, около 49, около 50, около 51, около 52, около 53, около 54, около 55, около 56, около 57, около 58, около 59, около 60, около 61, около 62, около 63, около 64, около 65, около 66, около 67, около 68, около 69, около 70, около 71, около 72, около 73, около 74, около 75, около 76, около 77, около 78, около 79 и около 80°С. Продолжительность реакции может быть по меньшей мере около 5, около 6, около 7, около 8, около 9, около 10, около 11, около 12, около 13, около 14, около 15, около 16, около 17, около 18, около 19, около 20, около 21, около 22, около 23 или более часов, около 1, около 1,1, около 1,2, около 1,3, около 1,4, около 1,5, около 1,6, около 1,7, около 1,8 около 1,9, около 2, около 2,1, около 2,2, около 2,3,

около 2,4, около 2,5, около 2,6, около 2,7, около 2,8, около 2,9, около 3, около 3,1, около 3,2, около 3,3,

около 3,4, около 3,5, около 3,6, около 3,7, около 3,8, около 3,9, около 4, около 4,1, около 4,2, около 4,3,

около 4,4, около 4,5, около 4,6, около 4,7, около 4,8, около 4,9, около 5, около 6, около 7, около 8, около 9 или около 10 дней.

ΌΚΡ, полученный способами по настоящему изобретению, может быть выделен из содержащего его раствора, в том числе из коммерчески доступных фармацевтических составов, содержащих альбумин, иммуноглобулин и эритропоэтин, хорошо известными способами, такими как эксклюзионная хроматография (например, фильтрация с использованием устройства Сеийтсои), аффинная хроматография (например, с использованием колонки, наполненной гранулами, к которым присоединены одинаковые или разные антитела к требуемым ΌΚΡ, или одинаковые или разные антитела к укороченному белку или пептиду), анионообменная или катионообменная хроматография. Очищенные ΌΚΡ могут использоваться и вводиться в фармацевтические составы, как описано выше.

- 13 030414

ΌΚΡ включают все возможные стереоизомеры, которые могут быть получены изменением конфигурации отдельных хиральных центров, осей или поверхностей. Другими словами, ΌΚΡ включают все возможные диастереомеры, а также все оптические изомеры (энантиомеры).

При практическом применении изобретения также могут использоваться физиологически приемлемые соли ΌΚΡ по настоящему изобретению. Физиологически приемлемые соли включают известные нетоксичны соли, такие как соли, являющиеся производными неорганических кислот (таких как хлористо-водородная, бромисто-водородная, серная, фосфорная, азотная и т.п.), органических кислот (таких как уксусная, пропионовая, янтарная, гликолевая, стеариновая, молочная, яблочная, винная, лимонная, глутаминовая, аспарагиновая, бензойная, салициловая, щавелевая, аскорбиновая кислота и т.п.) или оснований (таких как гидроксид, карбонат или бикарбонат фармацевтически приемлемых катионов металлов или органических катионов, образованных из Ν,Ν'-дибензилэтилендиамина, Ό-глюкозамина или этилендиамина). Соли получают традиционным способом, например нейтрализацией соединения в форме свободного основания кислотой.

Как указано выше, ΌΚΡ по настоящему изобретению или его физиологически приемлемые соли могут использоваться для лечения заболеваний, опосредованных Т-клетками, или для ингибирования активации Т-клеток. Для этого ΌΚΡ или его физиологически приемлемые соли вводят животному, нуждающемуся в таком лечении. Предпочтительно животное является млекопитающим, таким как кролик, коза, собака, кошка, лошадь или человек. Эффективные лекарственные формы, способы введения и величина дозы соединений по настоящему изобретению могут быть определены опытным путем, и специалистам известны способы их определения. Специалистам понятно, что величина дозы будет меняться в зависимости от конкретного применяемого соединения, заболевания или состояния, требующего лечения, тяжести заболевания или состояния, способа(ов) введения, скорости выведения соединения, длительности лечения, выявления любых других лекарств, вводимых животному, возраста, размера и вида животного и подобных факторов, известных в медицине и ветеринарии. В целом, подходящей ежедневной дозой соединения по настоящему изобретению будет такое количество соединения, которое является минимальной эффективной дозой, обладающей терапевтическим действием. Однако определение ежедневной дозы будет осуществляться лечащим врачом или ветеринаром по результатам тщательной медицинской оценки. Если требуется, эффективная ежедневная доза может вводиться в виде двух, трех, четырех, пяти, шести или более частей дозы, вводимых отдельно с соответствующими интервалами в течение дня. Введение соединения должно продолжаться до достижения приемлемого результата. Соединения по настоящему изобретению (а именно ΌΚΡ и их физиологически приемлемые соли) могут вводиться пациентамживотным для лечения любым подходящим способом, в том числе перорально, назально, ректально, вагинально, парентерально (например, внутривенно, интраспинально, внутрибрюшинно, подкожно или внутримышечно), интрацистернально, трансдермально, интракраниально, интрацеребрально и местно (в том числе буккально и сублингвально).

Предпочтительными способами введения являются пероральный и внутривенный. Хотя можно вводить одно соединение по настоящему изобретению, предпочтительно вводить такое соединение в виде фармацевтического препарата (состава). Фармацевтические составы по настоящему изобретению содержат соединение или соединения по настоящему изобретению в качестве активного ингредиента в смеси с одним или несколькими фармацевтически применимыми носителями и необязательно с одним или несколькими другими соединениями, лекарствами или другими материалами. Каждый носитель должен быть "применим" в том смысле, что он совместим с другими ингредиентами препарата и не наносит вреда животному. Фармацевтически применимые носители хорошо известны в данной области. Независимо от выбранного способа введения соединения по настоящему изобретению вводятся в состав фармацевтически применимых лекарственных форм традиционными способами, известными специалистам (см., например, Кештд1ои'8 Ρ1ι;·ιπη;κοιιΐΚ;·ι1 8с1спсс5).

Описанное выше, в целом, изобретение станет более понятным из следующих примеров, которые включены только с целью иллюстрации некоторых аспектов вариантов настоящего изобретения. Примеры не предназначены для ограничения изобретения, поскольку из изложенных выше сведений и следующих примеров специалистам должно быть понятно, что другие технические средства и способы могут соответствовать формуле изобретения и могут быть применены в пределах объема настоящего изобретения.

Пример 1.

Провели протеомный анализ коммерческих растворов Н8Л с целью изучения терапевтического действия, нежелательных реакций и механизмов, связанных с лечением с использованием растворов Н8Л. В данном исследовании идентифицировано в общей сложности 1219 отличных от Н8Л пептидов, соответствующих 141 белку. Что особенно важно, точно установлено присутствие пептидазы ΌΡΡ-ΐν в коммерческом растворе Н8Л. Поэтому можно предположить, что ΌΡΡ-ΐν из-за ее способности отщеплять пептиды после аланинового остатка участвует в образовании ΌΆ-ΌΚΡ в коммерческих растворах Н8Л. Для изучения данного предположения провели анализ коммерчески доступных растворов Н8Л на наличие ΌΡΡ-ΐν-активности с использованием хромогенного субстрата и известного ингибитора ΌΡΡ-ΐν. Также проверялось наличие ΌΡΡ-ΐν-активности в источнике рекомбинантного Н8Л, который не был по- 14 030414

лучен посредством фракционирования по методу Кона. И наконец, определили влияние температуры на ΌΡΡ-ΐν-активность, а также на образование ΌΑ-ΌΚΡ в коммерческих растворах ΗδΑ.

Материалы и способы.

Материалы.

В процессе исследования использовались три коммерчески доступных продукта, расфасованных по 250 мл с концентрацией ΗδΆ 5% (вес./об.) (С8Ь Вейттд ЬЬС, Капкакее, 1Ь, υδΆ; СпГо1к Вю1о§1са1к 1пс., Ьок Лп§е1е8, СА, υδΑ; Ос!арйагта υδΑ 1пс., НоЬокеп, N1, υδΑ). Ν-терминальный пептид ΗδΑ (ΌΑΗΚ (первые четыре аминокислоты Ν-конца)) изготовлен компанией ОюкуйЬ 1пс. (Аебюбапбк). Рекомбинантный ΗδΑ ^οΗδΑ™) был получен от Сеп1апЙ8 1пс. (Ьап О1едо, СΑ, υδΑ) и произведен из семян азиатского риса (Огу/а кайуа). Синтетический ΌΑ-ΌΚΡ произведен компанией δуη§еηе 1п1егпа11опа1 Ыб. (1пШа). Все другие реагенты, в том числе субстрат и ингибитор ΌΡΡ-ΐν, были получены от δ^дта-Α1б^^сЬ Со. ЬЬС (81. Ьошк, МО, υδΑ).

Анализ ΌΡΡ-ΐν.

ΌΡΡ-ΐν-активность анализировали с использованием хромогенного субстрата ΟΚ-ΡΐΌ-ρΝΑ. как описано в Е. №шо!о, δ. δида№а^а, Η. Такаба, е! а1., 1исгеа§е о! СО26/б1рерйбу1 рерббаке IV ехргеккюп оп йитаи дшдуа1 йЬтоЬ1ак!к ироп кОтикШоп \νί11ι суйкшек апб Ьас1епа1 сотропейк. йГес! Питии 67 (1999) 6225-33. Все реакции проводили в буфере для анализа ΌΡΡ-ΐν (рН 7.6), содержащем 0,1М ΗΕΡΕδ, 0,12 М ЦаС1, 5 мМ КС1, 8 мМ глюкозы и 10 мг/л бычьего сывороточного альбумина (ΒδΑ). 5%-ный коммерческий ΗδΑ, рекомбинантный ΗδΑ или чистый буфер (0.9% ЦаС1) смешивали с 1 мМ раствором ΟΚ-ΡιόрNΑ (субстрат ΌΡΡ-ΐν) в буфере для анализа или только с буфером для анализа (-СОЦ). Инкубацию осуществляли при 37 или 60°С в течение 2-24 ч. Для изучения ингибирования ΌΡΡ-ΐν перед добавлением субстрата ΌΡΡ-ΐν 1 мМ раствор дипротина А в буфере для анализа предварительно инкубировали с растворами ΗδΑ в течение 15 мин при 37°С. Для всех инкубируемых образцов снимали показания при 405 нм ^ресйаМах М2 крес1торйойте1ег, Мо1еси1аг Оезасек ЬЬС, δиηиуνа1е, СА υδΑ). Для каждого исследуемого раствора ΗδΑ каждое показание при 405 нм корректировали вычитанием А405 для инкубируемых образцов, содержащих субстрат ΌΡΡ-ΐν, из соответствующих А405 (это скорее всего аЬкогЬапсе а! 405 пт - поглощение при 405 нм) для инкубируемых образцов, содержащих -СОЦ.

Выделение фракции ΗδΑ с массой <5 кДа.

Для анализа образования ΌΑ-ΌΚΡ аликвотная часть была добавлена в микроцентрифужный фильтр (^уакрш 2, М\УСО 5,000, δа^Ю^^ик δ^άίιη Вю1есй, Соейпдеп, Сегтапу). Фильтры центрифугировали при 3500 об/мин в течение 30 мин при комнатной температуре. Фракции с массой <5 кДа собирали и переносили в отдельные пробирки для хранения с целью проведения ΕΟΜδ-анализа (жидкостная хроматомасс-спектрометрия).

^Смδ-анализ.

В каждую фракцию с массой <5 кДа и синтетический стандарт ΌΑ-ΌΚΡ (20-2000 нг/мл) добавили 0,01 мМ раствор Ь-триптофана-65 (индол-б5), который использовался как внутренний стандарт. 50 мкл ввели в сильные анионообменные колонки ^рЬепкогЬ, δ5 δΑΧ 250x4.0 тт, ^а!егк, МйГотб, ΜΑ, υδΑ), для жидкостной хроматографии высокого давления (ОТЬС, \Уа1егк 2795 δера^аί^оηк Моби1е, МбГотб, ΜΑ, υδΑ), объединенной с масс-спектрометром (ЬСТ-ТОР, Мютотакк, υΚ). Использовалась трехкомпонентная мобильная фаза, состоящая из бЩО (растворитель А) (дистиллированная вода), метанола (растворитель В) и 200 мМ формиата аммония (рН 5,4, растворитель С), при скорости потока 0,5 мл/мин с использованием градиента, указанного ниже (см. табл.).

ОТЬС-градиент, используемый при выделении ΌΑ-ΌΚΡ в растворах ΗδΑ с массой >5 кДа

Время (мин)	А (%)	В(%)	С (%)
0	25	40	35
10	10	40	50
15	10	40	50
15.01	25	40	35
20	25	40	35

Продукт, полученный на выходе ОТЬС, разделили в соотношении 1:20 (об./об.) и ввели в масспектрометр, в котором использовалась отрицательная электрораспылительная ионизация (-Εδΐ), диапазон сканирования был 80-1000 масса/заряд, напряжение на конусе 30 эВ, температура источника 100°С и температура газа 300°С. ΌΑ-ΌΚΡ определяли посредством регистрации ионов с массой [М^-]=185, которая соответствует ΌΑ-ΌΚΡ минус один протон (-Н+). ΌΑ-ΌΚΡ с открытой цепью Α^-ΑΠ можно также анализировать данным способом посредством регистрации ионов с массой [М^-]=203.

Статистические методы.

Количество полученного рNΑ в мкМ рассчитали на основании молярного коэффициента поглощения рNΑ в буфере ΗΕΡΕδ (см. К. ЬоИепЬегд, СМ. 1асккоп, 8о1Шюп сотрокйоп берепбеп! уапаПоп ίπ ех- 15 030414

Ιίηαΐίοη сосГПс1сШ5 Гог р-пйгоапЛше. ВюсЫт ВюрЬук Лс1а 742 (1983) 558-64). Статистический анализ осуществляли с использованием пакетов программ Е\се1 (М1сго8ой) и МаИаЪ К.13 (МаОЛУогкх). Группы сравнивали с использованием двустороннего критерия Стьюдента и уровня значимости р<0,05. Все данные представлены в виде средняя величина ±СО (стандартное отклонение).

Результаты.

Оценивалась активность дипептидилпептидазы IV (ΌΡΡ-ΐν) в коммерческих препаратах человеческого сывороточного альбумина (ΗδΑ). Выбранный способ анализа активности хорошо известен из литературы и содержит расщепление известного субстрата ΌΡΡ-ΐν ΟΙν-ΡΐΌ-ρΝΑ. Количество высвободившегося хромогена ρΝΑ определяли спектрофотометрическим способом при 405 нм. Были выбраны три коммерчески доступных 5% раствора ΗδΑ, не отдавая предпочтения какому-либо конкретному производителю. Требовалось только, чтобы у растворов не истек срок годности, и чтобы они были изготовлены различными производителями посредством процесса фракционирования по методу Кона. Для ферментативного анализа были выбраны температуры 37 и 60°С, так как первая соответствует физиологическим условиям, а последняя соответствует температуре пастеризации коммерческих растворов ΗδΑ.

ΌΡΡ-ΐν-активность при 37°С ΗδΑ определяли во всех трех 5% коммерческих растворах ΗδΑ. Все три коммерческих раствора ΗδΑ обладали значительной ΌΡΡ-ΐν-активностью, при этом активность ΗδΑ от ОБ ВеЫгпд была немного меньше, чем активность ΗδΑ от ОсЫрйагта и СпГоЕ (фиг. 1). Величина ΌΡΡ-ΐν-активности не коррелировала с датой истечения срока годности источника ΗδΑ. В присутствии известного ингибитора ΌΡΡ-ΐν (дипротина А) происходило полное подавление ΌΡΡ-ΐν. В результате этого в течение всего периода инкубации не происходило образования дополнительного хроматогена по сравнению с -ΤΌΝ (данные не показаны). В одном из коммерческих растворов ΗδΑ (ΟδΓ ВеЫгпд) изучалась ΌΡΡ-ΐν-активность при 60°С. Наблюдались значительные уровни ΌΡΡ-ΐν-активности (фиг. 2). Однако ΌΡΡ-ΐν-активность при 60°С составляла ~70-80% от исходной ΌΡΡ-ΐν-активности при 37°С.

При обеих температурах при повышении концентрации раствора ΗδΑ в отношении ΌΡΡ-ΐνактивности наблюдался дозозависимый эффект.

Для сравнения с ΌΡΡ-ΐν-активностью ΗδΑ, выделенного с помощью процесса, отличного от процесса фракционирования по методу Кона, провели анализ рекомбинантного ΗδΑ (τΗδΑ), полученного из риса. Один из коммерческих растворов ΗδΑ, полученных посредством фракционирования по методу Кона (οΗδΑ), также был включен в анализ ΌΡΡ-ΐν-активности. Концентрация ΗδΑ обоих типов изменялась в пределах от исходной (5% вес./об.) до разбавленных растворов (1 и 2,5%). При всех трех концентрациях величина ΌΡΡ-ΐν-активности в οΗδΑ-растворе была значительно выше, чем в τΗδΑ-растворе (фиг. 3). Также ΌΡΡ-ΐν-активность в τΗδΑ-растворах не была статистически значимой при сравнении с инкубацией только аналитического буфера. Таким образом, в τΗδΑ-растворах отсутствовала заметная ΌΡΡ-ΐν-активность.

Исследовали образование ΌΚΡ, ΌΑ-ΌΚΡ, в коммерческом растворе ΗδΑ, нагретом до 60°С в присутствии или отсутствие известного ингибитора ΌΡΡ-ΐν (дипротина А). С помощью центрифужной колонки с номинальным отсечением по молекулярной массе (М^СО) 5 кДа выделили низкомолекулярную фракцию ΗδΑ, содержащего ΌΑ-ΌΚΡ. Во фракции с молекулярной массой <5 кДа определили содержание ΌΑ-ΌΚΡ посредством ΓΟΜδ с использованием отрицательной электрораспылительной ионизации (-Εδΐ). В течение первых 24 ч инкубации при отсутствии ингибитора содержание ΌΑ-ΌΚΡ увеличилось на 30% от исходного уровня ΌΑ-ΌΚΡ (фиг. 4). В присутствии ингибитора ΌΑ-ΌΚΡ через 24 ч при 60°С наблюдалось только 10% увеличение образования ΌΑ-ΌΚΡ.

Пациентам, таким как пациенты с множественными травмами, может понадобиться введение коммерческого человеческого сывороточного альбумина (ΗδΑ). Из-за его гетерогенности в терапевтическое действие коммерческого ΗδΑ могут вносить вклад другие компоненты, например протеазы. Одна такая протеаза, дипептидилпептидаза ΐν (ΌΡΡ-ΐν), может отщеплять известную иммуномодуляторную молекулу, аспартат-аланин-дикетопиперазин (ΌΑ-ΌΚΡ), от Ν-конца альбумина. Коммерческие растворы ΗδΑ, полученные, например, фракционированием по методу Кона, проверялись на наличие ΌΡΡ-ΐνактивности с помощью специфического субстрата и ингибитора ΌΡΡ-ΐν. ΌΡΡ-ΐν-активность определяли при 37 и 60°С, так как коммерческие растворы ΗδΑ пастеризуют при 60°С в течение 10-11 ч. ΌΡΡ-ΐνактивность в коммерческих растворах ΗδΑ сравнили с другими источниками альбумина, такими как рекомбинантный альбумин. В коммерческих растворах ΗδΑ наблюдались значительные уровни ΌΡΡ-ΐνактивности. Указанную активность подавили с помощью специфического ингибитора ΌΡΡ-ΐν, подтвердив предположение о том, что в коммерческих растворах ΗδΑ имеется ΌΡΡ-ΐν-активность. Данная активность также присутствовала при 60°С и составляла 70-80% от активности, наблюдаемой при инкубации при 37°С. ΌΡΡ-ΐν-активность отсутствовала в рекомбинантном источнике, что подтверждает предположение о наличии ΌΡΡ-ΐν-активности только в растворах альбумина, полученных посредством процесса фракционирования по методу Кона. Наконец, при нагревании растворов ΗδΑ до 60°С наблюдалось увеличение образования ΌΑ-ΌΚΡ. Данное образование значительно уменьшалось в присутствии ингибитора ΌΡΡ-ΐν. ΌΡΡ-ΐν-активность в ΗδΑ может привести к образованию множества побочных продуктов для тяжелобольных пациентов, в том числе ΌΑ-ΌΚΡ.

- 16 030414

Пример 2.

Со ссылкой сначала на фиг. 5, на которой в виде блок-схемы показан один вариант настоящего изобретения: способ обработки потока 120 исходного материала, содержащего альбумин и необязательно ΌΚΡ, для получения терапевтических составов. Поток 120 исходного материала может состоять, например, из раствора соли, содержащего около 25 вес.% человеческого сывороточного альбумина, полученного по методу Кона, и аспарагиновая кислота-аланин-дикетопиперазин (ΌΆ-ΌΚΡ) в концентрации приблизительно от 50 до 100 мкМ ΌΆ-ΌΚΡ, не связанный с альбумином. Поток исходного материала может также содержать ацетилтриптофанат натрия, Ν-ацетилтриптофан и каприлат натрия в различных концентрациях. Поток исходного материала подается на первую стадию 100 обработки, содержащую, например, тангенциальную поточную фильтрацию, которая обеспечивает эксклюзионное разделение, при этом любые молекулы с молекулярной массой меньше чем приблизительно 66-69 кДа проходят через фильтр в первом потоке 140 с низким содержанием альбумина (фильтрат). В данном примере первый поток с низким содержанием альбумина, по существу, не содержит альбумина, ~0 вес.% альбумина. Другими словами, около 100% альбумина, присутствующего в потоке 120 исходного материала, остается в первом потоке 130 с высоким содержанием альбумина. Первый поток 140 с низким содержанием альбумина содержит раствор соли, концентрация ΌΆ-ΌΚΡ в котором составляет приблизительно от 50 до 100 мкМ ΌΆ-ΌΚΡ, не связанного с альбумином. В ретентате, первом потоке 130 с высоким содержанием альбумина, а также в любом ΌΚΡ-содержащем солевом растворе, который не прошел через фильтр для тангенциальной поточной фильтрации, остаются любые молекулы с молекулярной массой больше чем приблизительно 66-69 кДа.

В данном примере в потоке 120 исходного материала присутствует теоретически максимальное количество ΌΆ-ΌΚΡ либо в виде свободных молекул, являющихся продуктом термического, химического и/или ферментативного разрушения Ν-терминального и/или С-терминального концов или последующих концов альбумина либо в виде непрореагировавшего альбумина.

Со ссылкой на фиг. 5 первый поток 130 с высоким содержанием альбумина затем подается на реакционную стадию 110. Реакционная стадия может содержать реактор с контролируемыми температурой и рН, например реактор с перемешиванием или емкость, подобную ферментационной емкости. В данном примере фермент 150 присутствует, образуется в реакторе и/или вводится в определенном количестве в нагретый реактор, в котором поддерживается температура около 50°С, а также поддерживается значение рН около 5,0 посредством добавления разбавленной серной кислоты (не показана). В данном конкретном примере добавляемый фермент 150 содержит дипептидилпептидазу IV. На реакционной стадии 110 добавляют достаточное количество дипептидилпептидазы IV (ΌΡΡ-ΐν), чтобы обеспечить пептидазную активность приблизительно от 40 до 150 мкМ ρΝΑ. Реакционная стадия 110 в данном примере содержит реактор периодического действия, в котором реагенты, альбумин и ΌΡΡ-ΐν находятся при заданном значении температуры и рН в течение периода времени приблизительно от одного часа до 24 ч. Образующийся реакционный поток, второй поток 130 с высоким содержанием альбумина, затем обрабатывается на второй стадии 100 обработки.

В данном конкретном примере на реакционной стадии получают значительное количество дополнительного ΌΑ-ΌΚΡ посредством ферментативного разрушения Ν-терминального и/или Стерминального концов, или последующих концов, альбумина. Это может привести к повышению концентрации не связанного с альбумином ΌΑ-ΌΚΡ во втором потоке 130 с высоким содержанием альбумина. Таким образом, в то время как концентрация не связанного с альбумином ΌΑ-ΌΚΡ в потоке 120 исходного материала может составлять приблизительно от 50 до 100 мкМ ΌΑ-ΌΚΡ, концентрация не связанного с альбумином ΌΑ-ΌΚΡ во втором потоке 130 с высоким содержанием альбумина может составлять приблизительно от 100 до 150 мкМ ΌΑ-ΌΚΡ.

Второй поток 130 с высоким содержанием альбумина подается на вторую стадию 100 обработки. В данном примере вторая стадия 100 обработки представляет собой второй отдельный типовой процесс. Соответственно она может содержать второе устройство для тангенциальной поточной фильтрации или устройство для какой-либо совершенно другой технологии, например хроматографическую колонку. В качестве альтернативы вторая стадия обработки может осуществляться с использованием такого же оборудования, которое использовалось на первой стадии обработки, например, посредством периодического или полунепрерывного процесса. В данном примере на второй стадии 100 обработки используется второе специально предназначенное для этого устройство для тангенциальной поточной фильтрации, которое работает по тому же принципу, что и первое устройство, описанное выше в примере 2.

В данном примере 2, как описано выше, во втором потоке 130 с высоким содержанием альбумина концентрация ΌΑ-ΌΚΡ выше, чем в потоке 120 исходного материала. Однако из-за того, что часть солевого раствора была удалена на первой стадии 100 обработки, в нем присутствует меньшее количество не содержащего альбумина солевого раствора. Следовательно, дополнительный прирост выхода теоретического количества ΌΑ-ΌΚΡ в данном примере 2, по существу, больше. В результате фильтрации второго потока 130 с высоким содержанием альбумина образуется поток 160 конечного продукта с высоким содержанием альбумина, первый терапевтический состав, и второй поток 140 с низким содержанием альбумина (в данном случае не содержащий альбумина), содержащий солевой раствор, концентрация ΌΑ- 17 030414

ΌΚΡ в котором составляет приблизительно от 100 до 150 мкМ ΌΆ-ΌΚΡ, не связанного с альбумином. Первый и второй ΌΆ-ΌΚΡ-содержащие потоки с низким содержанием альбумина можно объединить в один поток с образованием второго терапевтического состава. Например, поток 160 продукта с высоким содержанием альбумина можно использовать для лечения состояний, таких как, например, недостаточное питание, голодание, нефротический синдром, панкреатит и перитонит. Комбинированный ΌΆ-ΌΚΡсодержащий поток, не содержащий альбумина, может в дальнейшем использоваться для лечения аутоиммунных нарушений у человека.

Хотя на фиг. 5 показана только одна реакционная стадия 110 и только две стадии 100 обработки, это не ограничивает объем настоящего изобретения одной реакционной стадией и двумя стадиями обработки. Дополнительные реакционные стадии и стадии обработки могут дополнительно увеличить выход ΌΆ-ΌΚΡ. Например, может быть получен суммарный выход после трех реакционных стадий 110 и четырех стадий 100 обработки. Специалистам должно быть понятно, что количество стадий обработки и реакционных стадий, а также порядок их следования относительно друг друга (например, последовательно, параллельно, с линией рециркуляции, без линии рециркуляции и т.п.) будет определяться на основе результатов всестороннего экономического анализа, которые будет различными для различных мест и различного применения.

Пример 3.

Теперь со ссылкой на фиг. 6, на которой в виде блок-схемы показан вариант примера 2, способ обработки потока 120 исходного материала, содержащего альбумин и необязательно ΌΚΡ, для получения терапевтических составов, дополнительно содержащий рециркуляционный поток 170 с высоким содержанием альбумина.

Данный пример также содержит две стадии 100 обработки и одну реакционную стадию 110. В данном примере предполагается случай, когда выход ΌΚΡ после этих стадий неприемлемо низкий, например, ниже 50%. Поэтому от потока 130 с высоким содержанием альбумина, выходящего на второй стадии 100 обработки, отделяют рециркуляционный поток 170 с высоким содержанием альбумина, который возвращают назад и смешивают с потоком 120 исходного материала перед подачей его на первую стадию 100 обработки, чтобы второй раз пропустить альбумин через систему для увеличения выхода больше 50%.

В данном примере предполагается, что процесс является непрерывным. Следовательно, поток 160 конечного продукта с высоким содержанием альбумина непрерывно удаляется из процесса, в то время как свежий исходный материал 120 непрерывно подается в процесс. Внутренняя линия 170 рециркуляции может быть значительно больше, чем поток 120 исходного материала и поток 160, при этом конкретные размеры и пропорции этих потоков зависят от выхода, получаемого за один цикл на стадиях 100 обработки.

Пример 4.

Со ссылкой на фиг. 7 показан еще один вариант способа обработки потока 120 исходного материала, содержащего альбумин и необязательно ΌΚΡ, для получения терапевтических составов, который является модифицированным способом примера 2, содержащим поток 180 разбавителя, подаваемого на второй стадии 100 обработки.

Данный пример предполагает необходимость подачи замещающей жидкости, которая будет вытеснять ΌΚΡ-содержащую водную фазу из альбумина во время стадии обработки. В данном примере в качестве потока 180 разбавителя использовался лактированный раствор Рингера, чтобы вытеснить большую часть ΌΚΡ, присутствующего в водной фазе, через устройство для тангенциальной поточной фильтрации.

Изобретение, изложенное в настоящем описании для иллюстрации, может быть соответствующим образом осуществлено на практике при отсутствии каких-либо элементов, которые не были специально указаны в настоящем изобретении. Однако специалистам понятно, что возможны многочисленные изменения, вариации, модификации, другие цели и способы применения способа, а также что изменения, вариации, модификации, другие цели и способы применения способа, которые находятся в пределах сущности и объема изобретения, считаются охваченными настоящим изобретением, которое ограничено только формулой изобретения, изложенной ниже.

Вышеизложенное пояснение изобретения представлено в целях иллюстрации и описания. Вышеизложенное не служит для ограничения изобретения вариантом или вариантами, раскрытыми в настоящем описании. В вышеизложенном подробном описании, например, различные признаки изобретения объединены в один или более вариантов с целью упрощения описания. Признаки вариантов изобретения могут быть объединены в альтернативные варианты, отличающиеся от рассмотренных выше. При рассмотрении данного способа по настоящему изобретению не предполагается, что заявленному изобретению требуется больше признаков, чем ясно изложено в каждом пункте формулы. Наоборот, как отражено в нижеизложенной формуле изобретения, аспекты изобретения отражаются не во всех признаках отдельного вышеизложенного раскрытого варианта. Соответственно нижеизложенная

Claims (9)

1. формула изобретения таким образом включена в данное подробное описание, при этом каждый пункт формулы сам по себе является отдельным предпочтительным вариантом изобретения. Кроме того, хотя описание изобретения

   - 18 030414

   включает описание одного или более вариантов, а также некоторых вариаций и модификаций, другие вариации, сочетания и модификации находятся в пределах объема изобретения, например такие, которые могут осуществить специалисты после понимания настоящего изобретения.

   Предполагается получение прав, которые включают альтернативные варианты в допустимых пределах, включая альтернативные, взаимозаменяемые и/или эквивалентные заявленным структуры, функции, диапазоны или стадии, независимо от того, раскрыты такие альтернативные, взаимозаменяемые и/или эквивалентные заявленным структуры, функции, диапазоны или стадии в настоящем описании или нет, и не предполагается публично раскрыть какой-либо патентоспособный объект.

   ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Способ обработки потока исходного материала, содержащего состав человеческого сывороточного альбумина и аспарагиновую кислоту-аланин-дикетопиперазин (ΌΑ-ΌΚΡ), для получения составов, содержащий

   фильтрацию потока исходного материала для получения первого потока с низким содержанием альбумина и первого потока с высоким содержанием альбумина, при этом первый поток с низким содержанием альбумина содержит первую часть ΌΑ-ΌΚΡ, присутствующего в потоке исходного материала, а первый поток с высоким содержанием альбумина содержит вторую часть ΌΑ-ΌΚΡ, присутствующего в потоке исходного материала;

   нагрев первого потока с высоким содержанием альбумина для получения ΌΑ-ΌΚΡ с образованием реакционного потока, содержащего альбумин и ΌΑ-ΌΚΡ; и

   фильтрацию реакционного потока для получения второго потока с низким содержанием альбумина и второго потока с высоким содержанием альбумина, при этом второй поток с низким содержанием альбумина содержит одну часть ΌΑ-ΌΚΡ, присутствующего в реакционном потоке, а второй поток с высоким содержанием альбумина содержит вторую часть ΌΑ-ΌΚΡ, присутствующего в реакционном потоке.
2. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что по меньшей мере один из первого и второго потоков с низким содержанием альбумина обладает терапевтическим действием.
3. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что по меньшей мере один из первого и второго потоков с высоким содержанием альбумина обладает терапевтическим действием.
4. 4. Способ по п.1, отличающийся тем, что фильтрация включает в себя тангенциальную поточную фильтрацию.
5. 5. Способ по п.1, отличающийся тем, что нагрев первого потока с высоким содержанием альбумина осуществляют до средней объемной температуры в интервале от 40 до 80°С.
6. 6. Способ по п.1, отличающийся тем, что нагрев первого потока с высоким содержанием альбумина осуществляют до средней объемной температуры в интервале от 40 до 80°С в присутствии дипептидилпептидазы ΐν.
7. 7. Способ по п.1, отличающийся тем, что поток исходного материала содержит по меньшей мере один дополнительный компонент, выбранный из группы, состоящей из ацетилтриптофаната натрия, Νацетилтриптофана, каприлата натрия, каприловой кислоты и их сочетаний.
8. 8. Способ по п.1, отличающийся тем, что ΌΑ-ΌΚΡ выбран из растворимого ΌΑ-ΌΚΡ, соли ΌΑ-ΌΚΡ и их сочетаний.
9. 9. Способ по п.1, отличающийся тем, что дополнительно содержит стадию анализа, включающую в

   себя

   анализ второго потока с высоким содержанием альбумина для получения по меньшей мере одного показателя; и

   сравнение по меньшей мере одного показателя по меньшей мере с одним заданным значением, при этом если по меньшей мере один показатель меньше заданного значения, то стадии нагрева и фильтрации повторяют до тех пор, пока по меньшей мере один показатель последующего потока с высоким содержанием альбумина не будет равен по меньшей мере одному заданному значению или больше него.

   - 19 030414