CN105188737A - 生产二酮基哌嗪和含有二酮基哌嗪的组合物的方法 - Google Patents

Abstract

本申请公开了制备在蛋白质和肽的药物组合物中增加量的二酮基哌嗪(DKP)(如DA-DKP)的方法。本公开还提供了制备DKP的方法，包括(1)将白蛋白与酶(例如二肽基肽酶IV(DPP-IV))接触，所述酶将一对N端氨基酸从该白蛋白上裂解，和(2)在有效导致DKP形成的条件下将该白蛋白加热。此外，还公开对含DKP-和含白蛋白的流的处理，以生产治疗用途的改进的、高价值的DKP组合物和纯化的白蛋白组合物。除了包含低白蛋白含量的第一治疗DKP组合物外，还生产了以高白蛋白浓度为特征的第二有用治疗组合物。

Description

生产二酮基哌嗪和含有二酮基哌嗪的组合物的方法

本申请请求保护于2013年2月1日提交的美国临时申请号61/759,922的优先权权益，将其全部内容引入本文作为参考。

技术领域

本文提供了生产二酮基哌嗪，例如天冬氨酸-丙氨酸二酮基哌嗪(DA-DKP)的方法，包括采用肽酶(例如二肽基肽酶IV(DPP-IV))的方法。还提供了用于制备蛋白质和肽的药物组合物的方法，其提高了二酮基哌嗪在该组合物中的含量。此外，提供了用于处理含二酮基哌嗪和白蛋白的物流的方法，以生产治疗用途的二酮基哌嗪组合物和纯化的白蛋白组合物。除了包含低白蛋白含量的第一治疗性的二酮基哌嗪组合物，还可生产以高白蛋白浓度为特征的第二治疗性组合物。

背景技术

白蛋白是可溶的、单体的、球状蛋白(分子量约66kDa)且其是在哺乳动物血浆中发现的最丰富的蛋白质，其以0.03-0.05克/毫升的正常浓度范围存在。白蛋白在心血管系统中起着多种重要的作用，包括维持血液渗透压。高浓度的白蛋白通过从周围组织的细胞内间隙转移液体至血管内系统，导致血浆容积膨胀。此外，白蛋白作为递送类固醇激素、血晶素和脂肪酸的转运蛋白发挥作用。白蛋白还有助于维持血液pH并参与凝血途径。

由于这些基本功能，血流中正常白蛋白浓度对维持体内稳态至关重要。血液白蛋白浓度的降低或增高均可造成严重的健康问题。血液中低白蛋白浓度，低白蛋白血症，可由以下疾病所导致，例如肝功能不全和肾功能异常，以及创伤、重度烧伤和败血病。已证明从白蛋白治疗中获益的其他病症包括，但不限于，营养不良，饥饿，肾病综合征，胰腺炎和腹膜炎。出于该原因，含有巴氏灭菌的白蛋白的溶液通常在手术室和紧急医疗处理情况下作为复苏液施用。

用于危重疾病中的市售人血清白蛋白(HSA)溶液有时是在特定情况下，例如烧伤、急性肺损伤(ALI)和休克用于恢复血容量。对于这些病人而言，HSA给药是有争议的，最新证据表明，与更便宜的替代品，例如盐水相比，死亡率充其量是没有减少而已。此外，市售HSA溶液的异质性已经被证明并包括HSA分子的氧化和截断。在市售HSA溶液的加工和储存过程中，该蛋白质截断发生在该蛋白质的N端并导致HSA的前两个氨基酸，Asp-Ala的裂解。由于HSA的N端特有的性质，这个二肽还被转化成环状二肽，称其为天冬氨酸-丙氨酸二酮基哌嗪(DA-DKP)，也称为3-甲基-2,5-二酮基哌嗪-6-乙酸。已发现，DA-DKP大量存在于市售的HSA溶液中，且DA-DKP本身对体外的活化PBMC和T淋巴细胞具有免疫抑制作用。

由HSA形成DA-DKP的机理目前尚不清楚，但是N端的自发降解和/或涉及肽酶的酶促反应在理论上可能起着作用。二肽基肽酶IV(DPP-IV)，也称为腺苷脱氨酶络合蛋白质2或CD26(分化簇26)，是一种肽酶，其优选地从蛋白质的N端裂解Xaa-Pro和Xaa-Ala二肽。据报道，DPP-IV在免疫和内皮细胞的细胞表面以及在可溶形式的血清中具有活性。DPP-IV的主要功能被认为是修饰生物活性肽、细胞因子和其他细胞表面蛋白质，用于调节免疫反应和细胞分化。此外，已经阐明了一个新的机理，其涉及DPP-IV介导的细胞外基质(ECM)的降解，从而导致内皮细胞侵入到成胶基质中。

DKP已经显示出具有其自身独特的治疗用途，包括有治疗人自身免疫疾病的潜力。例如，DA-DKP已经显示出对活化的外周血单核细胞和T淋巴细胞具有显著的免疫抑制作用。关于HSA、DA-DKP以及与其有关的治疗性治疗的其他公开可见于美国专利号6,555,543；美国专利号7,732,403和美国专利申请号US2013-0090292A1，其全部内容引入本文作为参考。

因此，考虑到DKP用于治疗人自身免疫和其他病症中的潜在治疗用途以及白蛋白在治疗低白蛋白血症、血容量不足和各种其他病症中的重要性，因此需要高品质的治疗性DKP组合物和高品质的白蛋白复苏液。本公开内容涉及以有效、高产率的操作生产这两种治疗组合物的方法。

发明内容

市售的人血清白蛋白(HSA)的施用有可能被指定的用于患者，例如多重创伤患者。由于其异质性，其他组分(例如蛋白酶)可促成市售HSA的治疗效果。一种这样的蛋白酶(二肽基肽酶IV(DPP-IV))可从白蛋白的N端释放已知的免疫调节分子，天冬氨酸-丙氨酸二酮基哌嗪(DA-DKP)。例如，通过科恩分级分离法制备的市售HSA溶液显示出具有DPP-IV活性。

本公开的一个方面是生产DKP，例如DA-DKP。在一个实施方案中，DA-DKP在DPP-IV的存在下由白蛋白生产。在一个实施方案中，所述DPP-IV是内源性的，例如在人血浆或HSA中。在一个实施方案中，血浆或HSA被加热。尽管不希望受到理论的束缚，但认为所述加热可通过提高该溶液的温度使更接近DPP-IV活性的最佳温度和/或通过热降解来提高DPP-IV的浓度。

本公开的另一方面是处理包含白蛋白和DKP(例如DA-DKP)的进样流以生产组合物的方法，该方法包括加工该进样流以生产第一白蛋白缺乏流和第一白蛋白富集流，其中所述第一白蛋白缺乏流包含存在于进样流中的DKP的第一部分，而第一白蛋白富集流包含存在于进样流中的DKP的第二部分。将第一白蛋白富集流反应以生产额外的DKP，从而导致包含白蛋白和DKP的反应流。将该反应流处理以生产第二白蛋白缺乏流和第二白蛋白富集流，其中所述第二白蛋白缺乏流包含存在于该反应流中的DKP的一部分，而该第二白蛋白富集流包含存在于该反应流中的DKP的第二部分。

在本公开的一些实施方案中，所生产的白蛋白富集流可具有治疗价值，包括但不限于，在治疗低白蛋白血症和血容量不足中的作用。在本公开的一些实施方案中，所生产的缺乏白蛋白、含DKP的物流可具有治疗价值，包括但不限于，在治疗炎性病症中的作用。

本公开的另一方面，如上所述，是处理包含白蛋白和DKP的进样流以生产治疗性组合物的方法，还包括分析步骤，其中该分析步骤包括分析白蛋白富集流以得到至少一个度量，将所述至少一个度量与至少一个参考值相比较，其中当所述至少一个度量大于或小于该参考值时，重复该反应和加工步骤直至随后的白蛋白富集流的所述至少一个度量不大于或大于所述至少一个参考值。例如，该度量可以是该物流中白蛋白的量或DA-DKP的量。

本公开的另一方面是包含DKP的组合物，其含有比市售的人血清白蛋白(“HSA”)制剂中白蛋白的浓度要小的白蛋白，所述市售制剂中白蛋白的浓度为在5重量％白蛋白溶液中每升HSA约50克白蛋白(g/L)或在25重量％白蛋白溶液中约250g/L。在本公开的一些实施方案中，白蛋白在含DKP的组合物中的浓度可小于约250g/L、小于约200g/L、小于约100g/L、小于约50g/L、小于约40g/L、小于约30g/L、小于约20g/L、小于约10g/L、小于约5g/L、小于约4g/L、小于约3g/L、小于约2g/L、小于约1g/L、小于约0.9g/L、小于约0.8g/L、小于约0.7g/L、小于约0.6g/L、小于约0.5g/L、小于约0.4g/L、小于约0.3g/L、小于约0.2g/L、小于约0.1g/L、小于约0.09g/L、小于约0.08g/L、小于约0.07g/L、小于约0.06g/L、小于约0.05g/L、小于约0.04g/L、小于约0.03g/L、小于约0.02g/L、小于约.01g/L、小于约.009g/L、小于约.008g/L、小于约.007g/L、小于约.006g/L或小于约.005g/L。在本公开的另一实施方案中，白蛋白在含DKP组合物中的浓度可为约0g/L，或不能检测量。

在本公开的一些实施方案中，包含DKP的组合物可具有治疗价值，包括但不限于，在治疗炎性病症中的作用。

此外，本公开提供了合成DKP的方法。在一个实施方案中，所述方法包括在有效导致DKP形成的条件下，加热哺乳动物血浆。在一个实施方案中，该方法包括将血浆与酶接触，所述酶在有效生产DKP的条件下裂解蛋白质或肽的两个N端氨基酸。在一个实施方案中，该方法包括将血浆与DPP-IV接触，所述DPP-IV在有效生产DA-DKP的条件下裂解蛋白质或肽的两个N端氨基酸。

本公开还提供制备蛋白质或肽的改进的药物组合物的方法。该方法包括处理血浆以增加DKP(例如DA-DKP)在蛋白质或肽的药物组合物中的含量。

本公开还提供了改进的蛋白质或肽的药物组合物。该改进是，所述组合物包含增加量的DKP。

上述内容是简要的概述以提供对本文所公开的方面、实施方案和结构的初步理解。这个概述既不是本文的方面、实施方案和结构的广泛概述也不是详尽的概述。其既不旨在确定关键或重要原理，也不是描述该方面、实施方案或结构的范围，而是以简化形式呈现所选概念，用以引入下文更加详尽的描述。可以理解，其他方面、实施方案和结构可能参与，单独或组合，一或多个上述或下文详述的特征。

附图说明

附图被并入并形成说明书的一部分用以说明以下实例，即所述方面、实施方案或结构如果制成并使用且不应被理解为限制该方面、实施方案或结构仅为所说明和描述的实施例。其他特征和优势将通过下面更详尽的各个方面、实施方案或结构的说明变得显而易见。

图1表明在5％市售HSA溶液中的DPP-IV活性。DPP-IV活性(N＝3)表示为：在37℃培养24小时的过程中，所产生的对硝基苯胺(pNA，μM)的总量。使用DPP-IV抑制剂(抑二肽素A，diprotinA)导致完全抑制DPP-IV的活性(数据未显示)。

图2表明温度对在5％市售HSA的溶液(CSLBehring)中的DPP-IV活性的影响。DPP-IV活性(N＝3)表示为：在37℃(实心柱)和60℃(垂直线)培养2小时的过程中，所产生的对硝基苯胺(pNA，μM)的总量。

图3表明在通过不同制备方法生产的HSA溶液中的DPP-IV活性。DPP-IV活性(N＝3)表示为：在37℃培养24小时的过程中，所产生的对硝基苯胺(pNA，μM)的总量。DPP-IV活性是在使用科恩分级分离法制成的市售HSA溶液中(实心棒，cHSA)以及在水稻中制成的重组HSA溶液中(垂直线，rHSA)测定的。

图4表明在以60℃加热的5％市售HSA中制成的DA-DKP。DA-DKP的生产(N＝3)是在以60℃加热的5％市售HSA中的不同时间点进行测定的，其存在(▲)或不存在(■)DPP-IV抑制剂。分离5％市售HSA溶液的低分子量部分(<5kDa)并用LCMS分析DA-DKP含量。星号(*)代表相比于净(neat)5％HSA的统计学显著性(p<0.05)。

图5表明本公开的一个实施方案，包括两个加工步骤和一个反应步骤，其产生两个单独的含DKP的产物流和一个含白蛋白的产物流。

图6表明本公开的一个实施方案，类似于图5，包含含白蛋白的再循环流。

图7表明本公开的实施方案，类似于图5，包含在第二加工步骤过程中协助DKP回收的稀释流。

参考数码

#-组分

100-加工步骤

110-反应步骤

120-进样流

130-白蛋白富集流

140-白蛋白缺乏流

150-酶或催化剂

160-最终白蛋白富集产物流

170-白蛋白富集再循环流

180-稀释流

实施方案描述

以下详细说明是通过举例而非限定来介绍本发明的。该描述将清楚地使本领域技术人员能够实施并使用本发明。

对于说明书中的“一个实施方案”、“实施方案”“示例实施方案”等，指的是，所述实施方案可包括特定的特征、结构或特性，但每个实施方案不一定包括该特定的特征、结构或特性。此外，该短语不一定指的是同一实施方案。此外，当特定的特征、结构或特性结合实施方案进行描述时，应认为，无论是否进行了明确阐述，将该特征、结构或特性与其他实施方案组合是在本领域技术人员的知识范围内的。

如本文所用，“至少一个”、“一个或多个”和“和/或”是开放式表述，其在操作时既可以是结合的也可以是分开的。例如，以下各表述“A、B和C中至少一个”、“A、B或C中至少一个”、“A、B和C中的一个或多个”、“A、B或C中的一个或多个”和“A、B和/或C”是指单独的A、单独的B、单独的C、A和B一起、A和C一起、B和C一起，或A、B和C一起。

人血清白蛋白(HSA)是最丰富的循环蛋白质，其具有与配体结合和转运性质、抗氧化功能和酶活性。因为HSA在调控危重疾病中的血容量和渗透压中非常重要，因此在制药工业上大量的生产它。市售HSA的优选的制造技术是基于Cohn及其同事的方法，其使用低温乙醇分级分离法来分离HSA。市售的HSA制剂通常含有0.08mmol/gHSA浓度的稳定剂N-乙酰基-色氨酸(NAT)和辛酸钠。市售HSA溶液的贮存期限通常为3年。最有可能是由于活性氧的产生，观察到了在溶液性质上的一些与长时间有关的变化，例如颜色变化、蛋白质的氧化、蛋白水解、聚集和沉降。因此，所述稳定剂NAT随时间被氧化，导致产生两种主要的降解物，其没有已知的毒性数据。

由于所述科恩分级分离法的操作并非特异性地针对HSA，因此一些蛋白质和肽与HSA共纯化，并因此存在于该市售溶液中。此外，由于HSA具有结合多个配体的独特能力，因此，其他具有已知生物活性的肽和蛋白质已使用蛋白质组技术在市售HSA溶液中得以鉴定。这些共纯化或结合的蛋白质包括蛋白酶(激肽释放酶、组织蛋白酶、羧肽酶和二肽酶)、蛋白酶抑制剂(激肽原)、细胞表面粘附蛋白(选择蛋白、钙粘素和ICAM)和参与免疫的蛋白质(免疫球蛋白链和补体系统的组分)。最近，在还原条件下的HSA分子的独特固有的蛋白水解活性已被记录。因此，由于其异质性，施用HSA可能会给危重病患引入潜在的无法保证的副作用。

除了蛋白质，市售的HSA溶液含有衍生自HSA的前两个N端氨基酸的小的免疫抑制分子，天冬氨酸-丙氨酸二酮基哌嗪或DA-DKP。DA-DKP被认为是通过提高Rap1活性并降低与T细胞受体信号转导途径有关的致活因子来调节T细胞细胞因子的产生。DA-DKP在市售HSA溶液中形成的机理目前尚不清楚，但是一种理论认为，由于该N端的独特的化学性质，HSA的N端自发降解以及随后的DA-DKP。

本公开是基于蛋白酶(尤其是二肽基肽酶IV(DPP-IV))在市售HSA溶液中的存在。如下面实施例中所证明的，使用已知的生色测定，将DPP-IV活性在三种市售HSA溶液中进行测试。并且，将这个活性用已知的DPP-IV抑制剂(抑二肽素抑二肽素A)进行废除。因此，除了存在于DPP-IV蛋白质中，DPP-IV活性还存在于市售的HSA溶液中。该活性并不存在于重组HSA中，意味着，所观测到的DPP-IV活性是科恩分级分离法操作的结果。

在市售HSA的制备过程中，将该产物通过在60℃加热巴氏消毒10-11小时。据报道，在血清中最佳DPP-IV活性是在50和60℃之间的，在65℃重组体和胚胎DPP-IV的活性逐渐降低。DPP-IV的这一特有性质使其成为在市售HSA溶液中生产DA-DKP的候选。此外，低分子量成分(除了结合至HSA)最有可能在巴氏消毒步骤之前被除去。因此，在市售HSA溶液中测定的大多数DA-DKP是从先前的巴氏消毒步骤重新生产的。在所研究的市售HSA溶液中，显著的DPP-IV活性是在60℃测定的。但是，总体活性仅为在37℃培养中存在的活性的70-80％。

在60℃，市售HSA中生产的DA-DKP是使用检测DA-DKP的LCMS方法进行检测的。在市售HSA的净溶液中，在60℃持续24小时后，产生大量的DA-DKP。当将DPP-IV抑制剂抑二肽素A加至所述市售HSA溶液中，在24小时的时间段内，在60℃所生产的DA-DKP的量降低约3倍。因此，这一发现表明，DPP-IV部分地导致在市售HSA溶液中DA-DKP的形成。在60℃，抑二肽素A并没有完全阻止DA-DKP的形成。抑二肽素A作为共价结合至DPP-IV活性位点内侧的Ser630的四面体中间体被捕获。抑二肽素A(Ile-Pro-Ile)是DPP-IV的底物，其具有低催化效率，从而导致明显的竞争抑制。有可能抑二肽素A在60℃培养24小时后被水解至足够程度，从而使得其他DPP-IV底物进入该活性位点，例如HSA的N末端。与DA-DKP的酶形成结合，有可能是通过HSA的N末端的自发降解形成DA-DKP。

DPP-IV的已知底物包括多种趋化因子、细胞因子、神经肽、循环激素和生物活性肽。主要研究的DPP-IV底物之一是类高血糖素肽1(GLP-1)，其调节循环血浆葡萄糖水平并因此在II型糖尿病的病因学中至关重要。以前已知的DPP-IV底物是多肽，且本发明人首次将HSA的N末端描述为底物。由于HSA天然构型的位阻，HSA的N末端根本不可能进入到DPP-IV的活性位点。但是，需要使大部分的HSA的N末端进入到该DPP-IV的活性位点，以形成DA-DKP。

虽然不希望受到任何理论的束缚，仍存在至少两种方式使得HSA的N末端可出现在DPP-IV的活性位点。第一，在贮存过程中，HSA在市售溶液中的氧化可导致HSA的裂解，从而导致N末端肽的产生，所述N末端肽是DPP-IV活性位点更好的底物。氧化还原活性金属(例如铁和铜)被发现在市售HSA溶液中大量存在。事实上，所述HSA的N末端结合铜，其可能导致原位产生活性氧(ROS)，从而可导致HSA的N末端肽的裂解。第二，HSA的缓慢变性可导致N末端的展开，使其成为更易通过的DPP-IV底物。这一点可得到以下事实的部分支持：在60℃，HSA处于可逆的展开形式，其可能暴露于N末端。在HSA溶液的延长贮存过程中，这个可逆的展开形式可能变得更加普遍，从而导致产生更多的DA-DKP。

所施用的HSA的免疫抑制能力是有据可查的。在大鼠的失血性休克模型中，HSA以剂量依赖性的方式降低肺的渗透性和嗜中性粒细胞的隔离。在类似的大鼠休克模型中，所施用的HSA显著下调整联蛋白和ICAM-1的表达(参与免疫细胞到内皮的粘附的因子)。HSA还抑制了响应于TNFα或补体暴露的的嗜中性粒细胞的呼吸爆发，从而导致选择性和可逆地抑制嗜中性粒细胞的扩散。最终发现，HSA是失血性休克模型中所用的复苏液中促炎作用最低的因子。依据本发明人之前的免疫学研究，DA-DKP似乎是HSA的免疫抑制能力的部分原因。

市售HSA溶液的异质性可对危重病患产生许多有益或有害的影响，这取决于所述患者的免疫状态。最近在市售HSA溶液中确定的一些化合物参与免疫调节和功能。此外，所述稳定剂NAT是一个众所周知的神经激肽-1受体拮抗剂，其为免疫和炎性反应以及血管通透性的重要调控剂。本公开涉及以微摩尔浓度存在于市售HSA溶液中的抗炎因子DA-DKP的形成机理。市售HSA溶液含有显著水平的DPP-IV活性，其被抑二肽素A(已知的DPP-IV抑制剂)所抑制。此外，由于所述分离其他血浆成分(例如DPP-IV)的Cohn制造操作，DPP-IV活性是市售HSA溶液特有的。最终，观察到在加热的市售HSA溶液中重新形成的DA-DKP，并在抑二肽素A的存在下伴随相应的形成抑制。因此，在市售HSA溶液中，所述肽酶DPP-IV表现为参与DA-DKP(已知的抗炎化合物)的形成。

本公开的另一方面涉及处理包含白蛋白和DKP(例如DA-DKP)的进样流以生产组合物的方法，该方法包括加工该进样流以生产第一白蛋白缺乏流和第一白蛋白富集流，其中所述第一白蛋白缺乏流包含存在于该进样流中的第一部分的DKP，且所述第一白蛋白富集流包含存在于该进样流中的第二部分的DKP。将所述第一白蛋白富集流反应以产生额外的DKP，从而形成包含白蛋白和DKP的反应流。将该反应流加工，从而生成第二白蛋白缺乏流和第二白蛋白富集流，其中所述第二白蛋白缺乏流包含存在于该反应流中的一部分DKP，且所述第二白蛋白富集流包含存在于该反应流中的第二部分的DKP。

在本公开的一些实施方案中，所生成的白蛋白富集流可能在治疗一些病症中具有治疗价值，包括但不限于，在治疗低白蛋白血症和血容量不足中的疗效，所述病症通常用市售HSA制剂进行治疗。在本公开的一些实施方案中，所生成的缺乏白蛋白、含DKP的流可具有治疗价值，包括但不限于，在治疗炎性病症中的疗效。

在本公开的一些实施方案中，将至少两个含DKP的白蛋白缺乏流合并成单个流。

本文中所提及的进样流是指含有白蛋白和DKP的任意水溶液。因此，术语“白蛋白”包括市售可得的白蛋白制剂，例如通过Cohn方法、其变型、色谱法和用于生产人或动物用治疗蛋白的任何其他合适的方法所生产的白蛋白溶液。术语“白蛋白”还指来自任意物种的白蛋白，包括但不限于，人和牛的白蛋白。“白蛋白”还包括通过合成方法生产的白蛋白蛋白质，例如通过重组技术和/或细胞表达系统，其使用细菌或哺乳动物表达宿主。

在本公开的一些实施方案中，白蛋白在含白蛋白和含DKP的进样流中的浓度可在约1重量％至约35重量％的范围。在一些其他实施方案中，白蛋白在该进样流中的浓度在约2重量％至约30重量％的范围。还在另一实施方案中，白蛋白在该进样流中的浓度为约4重量％至约26重量％的范围。在具体实施方案中，白蛋白的浓度可为约5重量％或约25重量％。

本文提及的“二酮基哌嗪”或DKP是指具有下式的任意化合物：

其中R¹和R²可以是相同或不同的，且各自为氨基酸的侧链，其中所述氨基酸为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、正缬氨酸、a-氨基异丁酸、2,4-二氨基丁酸、2,3-二氨基丁酸、亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、丝氨酸、高丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、羟赖氨酸、组氨酸、精氨酸、高精氨酸、瓜氨酸、苯丙氨酸、对氨基苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、甲状腺氨酸、半胱氨酸、高半胱氨酸、甲硫氨酸、青霉胺或鸟氨酸；但是，条件是，当R¹是天冬酰胺或谷氨酰胺的侧链时，那么R²不能是赖氨酸或鸟氨酸的侧链，且当R¹是赖氨酸或鸟氨酸的侧链时，那么R²不能是门冬酰胺或谷氨酰胺的侧链。

在本公开的一些实施方案中，所述DKP(例如，存在于进样流、含白蛋白的流、含DKP的流、白蛋白富集流、白蛋白缺乏流及其组合中的至少一个)可包括以下至少一种：天冬氨酸-丙氨酸二酮基哌嗪(DA-DKP)、甲硫氨酸-精氨酸二酮基哌嗪(MR-DKP)、谷氨酸-丙氨酸二酮基哌嗪(EA-DKP)、酪氨酸-谷氨酸二酮基哌嗪(YE-DKP)、甘氨酸-亮氨酸二酮基哌嗪(GL-DKP)、脯氨酸-苯丙氨酸二酮基哌嗪(PF-DKP)、丙氨酸-脯氨酸二酮基哌嗪(AP-DKP)及其组合。在本公开的一些实施方案中，所述DKP(例如，存在于进样流、含白蛋白的流、含DKP的流、白蛋白富集流、白蛋白缺乏流及其组合中的至少一个)可包括DA-DKP，也称其为3-甲基-2,5-二酮基哌嗪-6-乙酸，即，其中R¹是–CH₂-COOH和R²是–CH₃。

在本公开的一些实施方案中，所述进样流可包含浓度在约0μMDKP至约200μMDKP范围内的DKP。还在本公开的另一实施方案中，所述进样流可包含浓度在约50μMDKP至约100μMDKP范围内的DKP。在本公开的一些实施方案中，所述DKP为至少50％的DA-DKP、至少60％的DA-DKP、至少70％的DA-DKP、至少80％的DA-DKP、至少90％的DA-DKP、至少95％的DA-DKP、至少98％的DA-DKP、至少99％的DA-DKP、至少99.9％的DA-DKP或100％的DA-DKP。

在本公开的一些实施方案中，进样流和反应流中至少一个的加工可包括蛋白质分离技术，其将进入流中的蛋白质(例如白蛋白)分成蛋白质富集流。该技术可包括过滤、色谱法、沉降、萃取及其组合中的至少一种。在本公开的一些实施方案中，进样流和反应流中至少一个的加工可包括过滤。还在另一实施方案中，进样流和反应流中至少一个的加工可包括切向过滤。

本文中提及的过滤是指机械和/或物理操作，其通过使用跨过滤介质的压力差，将含白蛋白的进样流中的一部分与剩余部分分离。本文所用术语“机械过滤”是指，但并不限于，尺寸排阻过滤。本文所用术语“物理过滤”是指，但不限于，分子间的相互作用，例如电荷吸引力和排斥力、氢键和偶极相互作用。过滤介质可包括，但不限于，滤纸、玻璃纤维、烧结玻璃、烧结金属、单片陶瓷(monolithicceraic)、高分子膜以及带或不带助滤器(例如，但不限于，硅藻土)的任一这些过滤介质。过滤介质可以是亲水的和/或疏水的。

在本公开的一些实施方案中，过滤可包括切向流过滤。本文所用术语“切向流”是指含白蛋白的进样流相对于该过滤介质的流向。这个流向可以是切向的(通常也称为“横向流”)，或者是“法向流”(normalflow)，或二者的组合。切向流是指含白蛋白的进样流，其特征在于该流的大多数均流经该过滤介质表面，而法向流是指以下述内容为特征的流：该流大多数均以相对于该过滤介质表面90°角的方向流经该过滤介质。

在本公开的一些实施方案中，任一过滤类型的压力差，或引起流过其他加工单元操作(例如，色谱法)的压力差可通过以下实现：使用泵对进样流和反应流中的至少一个进行加压、或将过滤介质的下流侧呈真空、或向该过滤介质和进样流和反应流中至少一个施加离心力，或通过任何其他的合适方式或其组合。本文所用的“下流侧”是指过滤介质包含含DKP流或滤液的那侧(也称为“白蛋白缺乏”和“含DKP侧”)，相比于“上流侧”或含白蛋白流，其是指过滤介质包含渗余物的那侧(也称为“白蛋白富集”和“含白蛋白侧”)。本文所用“真空”是指绝对压力小于14.7磅/平方英寸绝对压强(psia)。

在本公开的一些实施方案中，加工可包括色谱法。本文提及的“色谱法”是指机械和/或物理操作，其使用跨固定相的压力差将进样流和反应流中的至少一个的一种级分与剩余级分分离。本文所用术语“机械色谱法”是指，但不限于，尺寸阻排色谱。本文所用术语“物理色谱法”是指，但不限于，亲和色谱、离子交换色谱、快速蛋白液色谱和免疫亲和色谱。

色谱步骤中的固定相，可包括，但不限于，树脂(即，聚苯乙烯、聚苯乙烯二乙烯基苯和聚丙烯酰胺)、离子交换树脂(即，磺化、季铵、羧化和二乙基铵官能团)、交联琼脂糖、交联葡聚糖、磷酸纤维素、多孔玻璃和二氧化硅、氧化铝和氧化锆基质。此外，可将所述固定相固定在固体载体颗粒上，或圆筒的内壁上，其可通过物理吸附、化学结合和或涂布后的原位聚合。固定了的固定相可涂布颗粒和圆筒的外表面，和/或填充在固体颗粒内的任何可用的孔。该键合的固定相可选自，但不限于，结合多聚体的、接枝多聚体的、封端固定相、结合烷基的、结合苯基的、结合氰基的、结合二醇的和结合氨基的固定相，这些都是色谱领域一般技术人员已知的术语。此外，所述固定相可用生物特异性配体官能团化，所述生物特异性配体包括，但不限于，抗体、蛋白质受体、类固醇激素、维生素和酶抑制剂。

在本公开的一些实施方案中，可将固定相容纳并固定在色谱柱上。可将进样流和反应流中至少一个放入色谱柱的入口，随后白蛋白富集和白蛋白缺乏流从该柱的出口流出，其中白蛋白富集和白蛋白缺乏流的分离可通过不同的洗脱时间来实现。用于递送进样流穿过该色谱柱的压力差可通过使用至少一个泵将进样流和反应流中的至少一个进行加压从而得以实现。

在本公开的一些实施方案中，加工可包括尺寸排阻方法，其中进样流或反应流或这二者被分成白蛋白富集渗余物流和含有DKP的白蛋白缺乏滤液流。在本公开的一些实施方案中，所述渗余物保留大于约80重量％、大于约85重量％、大于约90重量％、大于约95重量％或大于约99重量％的存在于含白蛋白和含DKP的进样流中的蛋白质，包括分子量大于约10kDa、20kDa、30kDa、40kDa、50kDa、60kDa、70kDa、80kDa、90kDa或100kDa的蛋白质。

在本公开的一些实施方案中，DKP反应可包括热处理、化学处理、酶处理及其组合中的至少一个。

在本公开的一些实施方案中，含白蛋白的流的反应可包括热处理、巴氏消毒、酶反应、化学反应及其组合中的至少一个。在本公开的一些实施方案中，含白蛋白的流的反应可包括将含白蛋白的流加热至约40℃至约80℃范围的平均整体温度。在本公开的一些实施方案中，含白蛋白的流的反应可包括将含白蛋白的流加热至约50℃至约70℃范围的平均整体温度。在本公开的一些实施方案中，含白蛋白的流的反应可包括将该含白蛋白的流加热至约55℃至约65℃范围的平均整体温度。在本公开的一些实施方案中，含白蛋白的流的反应可包括将该含白蛋白的流加热至约57.5℃至约62.5℃范围的平均整体温度。在本公开的一些实施方案中，含白蛋白的流的反应可包括将该含白蛋白的流加热至约60℃的平均整体温度。

在本公开的一些实施方案中，含白蛋白的流的反应可包括该含白蛋白的流与二肽酶、激肽释放酶、组织蛋白酶、羧肽酶及其组合中的至少一种的酶反应。在本公开一些其他实施方案中，含白蛋白的流的反应可包括该流与至少二肽基肽酶IV的酶反应。

在本公开的一些实施方案中，所述二肽酶、激肽释放酶、组织蛋白酶、羧肽酶及其组合中的至少一种可存在于进样流中，所述进样流是从市售的白蛋白供应商或非市售的白蛋白供应商处得到的。例如，含白蛋白的原料可含有酶促活性二肽酶，其能够在随后的反应步骤中或经过一段时间(例如，在环境条件下储存)产生额外的DKP。在本公开的一些实施方案中，进样流可包含二肽酶，其中在使用显色底物(在实施例中描述为Gly-Pro-pNA)进行的试验中所测定的二肽酶活性的范围为大于0μMpNA至约200μMpNA。在本公开的其他一些实施方案中，进样流可包含二肽酶，其中所述二肽酶活性的范围为约40μMpNA至约140μMpNA。

在本公开的一些其他实施方案中，可将二肽酶、激肽释放酶、组织蛋白酶、羧肽酶及其组合中的至少一种加至进样流、第一白蛋白富集流、第二白蛋白富集流、任意随后的白蛋白富集流及其组合中的至少一个中。在本公开的一些实施方案中，可将二肽酶加至进样流、第一白蛋白富集流、第二白蛋白富集流、任意随后的白蛋白富集流及其组合中的至少一个中。在本公开的其他实施方案中，可将二肽酶加至进样流、第一白蛋白富集流、第二白蛋白富集流、任意随后的白蛋白富集流及其组合中的至少一个中，其中所述肽酶活性可升至约0μMpNA至约200μMpNA。在其他实施方案中，所述肽酶活性可升至约40μMpNA至约150μMpNA。

在本公开的一些其他实施方案中，白蛋白富集流的反应可包括存在于白蛋白富集流中的白蛋白与至少一种氧化还原活性金属(例如铁和铜)的催化反应。其他可能的金属催化剂包括，但不限于，锂、钾、钙、钠、镁、铝、锌、镍、铅、锰、锡、银、铂、金及其组合。在本公开的一些实施方案中，白蛋白富集流的反应可包含至少一种氧化还原活性金属，其以均相催化剂、非均相催化剂或者两者的形式存在。在本公开的一些其他实施方案中，白蛋白富集流的反应可包括将该流穿过含有固体催化剂的填充床反应器，所述固体催化剂含有至少一种氧化还原活性金属，该金属附于底物上。在本公开的一些其他实施方案中，白蛋白富集流的反应可包括白蛋白在浆料反应器中的反应，其中将该氧化还原活性金属混悬于液体混合物中和/或使用混合装置将其混合。

在本公开的一些实施方案中，用于白蛋白富集流的反应的反应器可包括批次反应器、连续反应器及其组合。在一些其他实施方案中，反应器可包括搅拌釜反应器、连续搅拌釜反应器、填充床反应器、活塞流反应器及其组合。

在本公开的一些实施方案中，白蛋白富集流的反应可包括将白蛋白富集流加热，使得整体温度高于环境温度。仅作为示例，在一些实施方案中，白蛋白富集流的反应可包括将该流加热至一定温度，该温度小于使白蛋白和DKP变性的温度且大于约20℃、大于约30℃、大于约40℃、大于约50℃、大于约60℃、大于约70℃或大于约80℃。在本公开的一些其他实施方案中，白蛋白富集流的反应可包括加热白蛋白富集流以及至少使白蛋白富集流发生酶反应和/或化学反应。

在本公开的一些实施方案中，除了白蛋白和DKP，进样流可包含许多其他组分。该组分可以是天然存在的物质，其衍生自产生白蛋白溶液的血液中，或者它们是经合成制得的白蛋白的合成方法产生的物质，或者它们可以是经天然产物的纯化所引入或生产的物质，例如，但不限于，使用Cohn方法及其变型纯化血浆。引入到含白蛋白的进样流的物质可包括有意加入到该含白蛋白进样流的添加剂，其可在合成性白蛋白的合成前或合成后，或天然存在的白蛋白的纯化前或纯化后加入。该添加剂包括，但不限于钠、钾、N-乙酰基色氨酸、辛酸钠和/或辛酸。在纯化天然白蛋白产物过程中产生的物质包括，但不限于，氨基酸、DKP和任何其他通过天然存在的血浆白蛋白热降解、物理降解、酶降解或化学降解而得到的化合物或物质。

在本公开的一些实施方案中，所述第一白蛋白富集流可包含至少约10重量％、至少约20重量％、至少约30重量％、至少约40重量％、至少约50重量％、至少约60重量％、至少约70重量％、至少约80重量％、至少约90重量％、至少约99重量％、至少约99.1重量％、至少约99.2重量％、至少约99.3重量％、至少约99.4重量％、至少约99.5重量％、至少约99.6重量％、至少约99.7重量％、至少约99.8重量％、至少约99.9重量％、至少约99.91重量％、至少约99.92重量％、至少约99.93重量％、至少约99.94重量％、至少约99.95重量％、至少约99.96重量％、至少约99.97重量％、至少约99.98重量％、至少约99.99重量％进样流中的白蛋白。

通过举例的方式，对于以下这种情况，其中加工含白蛋白的进样流会导致含白蛋白的流包含该进样流中至少约90重量％的白蛋白，如果该含白蛋白的进样流以0.03克白蛋白/毫升的白蛋白浓度包含100毫升含白蛋白的进料，那么由加工步骤(即，过滤、色谱法等)形成的产物流包含至少2.7克的白蛋白。同样以举例的方式，如果含白蛋白的进样流以0.5克白蛋白/毫升的白蛋白浓度包含100毫升含白蛋白的进料，那么所得的含白蛋白的流包含至少45克的白蛋白。本领域技术人员显而易见的是，将上述示例性的体积和/或百分比按比例增加或降低，将导致存在于白蛋白富集和白蛋白缺乏流中的白蛋白量的相应变化，正如使用简单的数学所计算的。

在本公开的一些实施方案中，第二白蛋白富集流可包含至少约10重量％、至少约20重量％、至少约30重量％、至少约40重量％、至少约50重量％、至少约60重量％、至少约70重量％、至少约80重量％、至少约90重量％、至少约99重量％、至少约99.1重量％、至少约99.2重量％、至少约99.3重量％、至少约99.4重量％、至少约99.5重量％、至少约99.6重量％、至少约99.7重量％、至少约99.8重量％、至少约99.9重量％、至少约99.91重量％、至少约99.92重量％、至少约99.93重量％、至少约99.94重量％、至少约99.95重量％、至少约99.96重量％、至少约99.97重量％、至少约99.98重量％、至少约99.99重量％反应流中的白蛋白。

在本公开的一些实施方案中，通过除前两步加工步骤之外的加工步骤制成的随后的白蛋白富集流可包含至少约10重量％、至少约20重量％、至少约30重量％、至少约40重量％、至少约50重量％、至少约60重量％、至少约70重量％、至少约80重量％、至少约90重量％、至少约99重量％、至少约99.1重量％、至少约99.2重量％、至少约99.3重量％、至少约99.4重量％、至少约99.5重量％、至少约99.6重量％、至少约99.7重量％、至少约99.8重量％、至少约99.9重量％、至少约99.91重量％、至少约99.92重量％、至少约99.93重量％、至少约99.94重量％、至少约99.95重量％、至少约99.96重量％、至少约99.97重量％、至少约99.98重量％、至少约99.99重量％的存在于白蛋白富集流(其在除前两步加工步骤之外的加工步骤进样)中的白蛋白。

在本公开的一些实施方案中，存在于第一白蛋白缺乏流中的第一部分的DKP可包含至少约5重量％、至少约10重量％、至少约20重量％、至少约30重量％、至少约40重量％、至少约50重量％、至少约60重量％、至少约70重量％、至少约80重量％、至少约90重量％或至少约99重量％的存在于该进样流中的DKP。

在本公开的一些实施方案中，存在于第二白蛋白缺乏流中的第一部分的DKP可包含至少约5重量％、至少约10重量％、至少约20重量％、至少约30重量％、至少约40重量％、至少约50重量％、至少约60重量％、至少约70重量％、至少约80重量％、至少约90重量％或至少约99重量％存在于该反应流中的DKP。

在本公开的一些实施方案中，由于除前两步加工步骤之外的加工步骤而存在于随后的白蛋白缺乏流中的随后部分的DKP，可包含至少约5重量％、至少约10重量％、至少约20重量％、至少约30重量％、至少约40重量％、至少约50重量％、至少约60重量％、至少约70重量％、至少约80重量％、至少约90重量％或至少约99重量％的存在于该白蛋白富集流(其在除前两步加工步骤之外的加工步骤进样)中的DKP。

在本公开的一些实施方案中，所述第一白蛋白缺乏流可包含至少约10μM、至少约20μM、至少约30μM、至少约40μM、至少约50μM、至少约60μM、至少约70μM、至少约80μM、至少约90μM、至少约100μM、至少约110μM、至少约120μM、至少约130μM、至少约140μM、至少约150μM、至少约160μM、至少约170μM、至少约180μM、至少约190μM、至少约200μM、至少约250μM、至少约300μM、至少约350μM、至少约400μM、至少约450μM或至少约500μM浓度的DKP。在其他实施方案中，所述第二白蛋白缺乏流可包含至少约10μM、至少约20μM、至少约30μM、至少约40μM、至少约50μM、至少约60μM、至少约70μM、至少约80μM、至少约90μM、至少约100μM、至少约110μM、至少约120μM、至少约130μM、至少约140μM、至少约150μM、至少约160μM、至少约170μM、至少约180μM、至少约190μM、至少约200μM、至少约250μM、至少约300μM、至少约350μM、至少约400μM、至少约450μM或至少约500μM浓度的DKP。

如上所述，本公开的其他方面是处理包含白蛋白和DKP的进样流以生产治疗组合物的方法，其还包括分析步骤，其中所述分析步骤包括分析白蛋白富集流以得到至少一个度量，将所述至少一个度量与至少一个参考值相比较，其中当所述至少一个度量大于或小于该参考值，那么重复该反应和加工步骤至少随后的白蛋白富集流的所述至少一个度量不大于或大于至少一个参考值。

在本公开的一些实施方案中，该分析步骤可包括高压液相色谱法和质谱法或用于测量感兴趣度量的任何其他合适的分析方法。在本公开的一些实施方案中，所述至少一个度量为至少一个加工步骤之后所剩的全长白蛋白的质量，而该参考值是可被加工用于生产DA-DKP的白蛋白的理论最大质量的分数。在其他实施方案中，所述至少一个度量为至少一个加工步骤之后制成的DKP的质量，而该参考值是可由进样流中的白蛋白制成的DKP的理论最大质量的分数。

在本公开的一些实施方案中，处理包含白蛋白和DKP的进样流以生产治疗组合物的方法可进一步包括调节白蛋白富集流的pH。在本公开的一些实施方案中，可将进样流进行pH调节。在一些其他的实施方案中，可在反应步骤前和/或在反应步骤过程中对白蛋白富集流进行pH调节。在一些其他的实施方案中，可在加工步骤前和/或在加工步骤过程中对白蛋白富集流进行pH调节。可调节白蛋白富集流的pH以提高酶促反应、催化反应、热降解及其组合中的至少一个。在本公开的一些实施方案中，调节白蛋白富集流的pH可包括将该pH调节至约1.5至约10.0的范围。在本公开的一些其他实施方案中，对白蛋白富集流的pH的调节可包括调节该pH至约4.0-约8.0的范围。在本公开的其他实施方案中，将白蛋白富集流的pH调节至约生理pH，即，调节至约pH7.3-7.4。

在本公开的一些实施方案中，处理包含白蛋白和DKP的进样流以生产治疗组合物的方法还可包括稀释白蛋白富集流。在本公开的一些其他实施方案中，可将进样流和反应流中的至少一个进行稀释。在本公开的一些其他实施方案中，使用选自以下的稀释剂可完成稀释：盐水、乳酸盐林格氏溶液、林格氏乙酸盐溶液、羟乙基淀粉溶液和右旋糖溶液。

稀释步骤可提供用于添加额外的成分至白蛋白缺乏流和/或白蛋白富集流的方法，所述额外的成分具有各种额外的治疗价值。例如，乳酸盐林格氏溶液可作为稀释剂添加至白蛋白缺乏流(富含DKP)，用于帮助控制缺乏免疫力的患者中的代谢性酸中毒。可选择用作稀释剂的其他溶液，单独使用或作为混合物使用，以满足具体患者或人群的特定治疗需求，并将其加至白蛋白富集流和白蛋白缺乏流中的一个或这两者中。

此外，稀释步骤可提供稀释剂，该稀释剂提供排代容积(displacementvolume)使得存在于起始白蛋白进样材料中的DKP的回收百分比更高。在本公开的一些实施方案中，所述加工步骤可包括尺寸排阻分离，其中存在于进样流中的白蛋白基本上全部保留在渗余物中。相反地，在这些实施方案中，存在于该进样流中的白蛋白基本上都没有随着滤液一起穿过该尺寸排阻分离单元。在这种情况下，所述白蛋白可被看作是浆液中的颗粒，而所剩余的含DKP的水相被看作是将该白蛋白颗粒悬浮在该浆液中的液体。因此，该滤液与该渗余物中所保留的一样，基本上是相同的含DKP水相。此外，在这种情况下，单级甚至多级尺寸阻排单元操作均不能完全将全部的含DKP的水相从该白蛋白中除去。如果没有一些辅助，那么该白蛋白富集流将保留一些含DKP的水相。稀释剂通过尺寸排阻单元操作并进入到该渗余物或白蛋白缺乏流中，从而可提供液体体积，其可从该白蛋白中冲洗和取代一部分的含DKP的水相。

本公开的另一方面是包含DKP的组合物，其含有小于10重量％的白蛋白。在本公开的一些实施方案中，白蛋白在含DKP的组合物中的浓度可为小于约1重量％或小于约0.1重量％。在本公开的其他实施方案中，白蛋白在含DKP的组合物中的浓度可为约0重量％或不能检测的限度。

在本公开的一些实施方案中，包含DKP的组合物可提供治疗益处，例如，但不限于，在治疗炎性病症中的作用。

在本公开的一些实施方案中，所述DKP可包括以下的至少一种：天冬氨酸-丙氨酸DKP、甲硫氨酸-精氨酸DKP、谷氨酸-丙氨酸DKP、酪氨酸-谷氨酸DKP、甘氨酸-亮氨酸DKP、脯氨酸-苯丙氨酸DKP、丙氨酸-脯氨酸DKP及其组合。在其他实施方案中，所述DKP可以约25μMDKP至约200μMDKP的浓度范围存在。

在本公开的一些实施方案中，所述包含DKP的组合物还可包含以下至少一种：盐水、乳酸盐林格氏溶液、林格氏乙酸盐溶液、羟乙基淀粉溶液、右旋糖溶液及其组合。在本公开的一些实施方案中，所述包含DKP的组合物还可包含选自以下的至少一种额外组分：乙酰色氨酸钠、N-乙酰基色氨酸、辛酸及其盐(例如辛酸钠)，及其组合。该额外的组分可以市售HSA中常见的量存在。例如，该组分可以约0.1mM至约30mM的量或以下范围的量存在，该范围具有的范围下端选自：约0.1mM、约0.2mM、约0.3mM、约0.4mM、约0.5mM、约0.6mM、约0.7mM、约0.8mM、约0.9mM、约1mM、约2mM、约3mM、约4mM、约5mM、约6mM、约7mM、约8mM、约9mM、约10mM、约11mM、约12mM、约13mM、约14mM、约15mM或约20mM。该范围可具有的范围上端选自：约1mM、约2mM、约3mM、约4mM、约5mM、约6mM、约7mM、约8mM、约9mM、约10mM、约11mM、约12mM、约13mM、约14mM、约15mM、约16mM、约17mM、约18mM、约19mM、约20mM、约21mM、约22mM、约23mM、约24mM、约25mM、约26mM、约27mM、约28mM、约29mM、约30mM、约31mM、约32mM、约33mM、约34mM或约35mM。

本公开的方法有利地提供了增加量的DKP，其相比于之前已知的合成DKP的方法而言更加有效。特别地，本公开方法的这些实施方案是从哺乳动物血浆合成DKP。该血浆可来自哺乳动物，例如兔、山羊、狗、猫、马或人。该动物优选是人，且该血浆优选是人血浆。

血浆含有用于合成DKP的成分，包括白蛋白、免疫球蛋白和促红细胞生成素，以及其他的蛋白质和肽。本公开的方法包括由血浆合成DKP，其中，相比于生产DKP的现有技术的方法，本公开的方法可有利地增加所合成的DKP的量。

HSA是存在于血浆中的主要蛋白质组分，其由包含585个氨基酸残基的单链多肽组成并具有约等于66,000道尔顿的分子量(参见Minghetti，P.P.等人(1986)，Molecularstructureofthehumanalbumingeneisrevealedbynucleotidesequencewithin11-22ofchromosome4.J.Biol.Chem.261,第6747-6757页)。HSA通常是通过以下制备的：对人血浆进行科恩分级分离、低温乙醇分级分离或类似的方法，以生产含HSA的级分(HSA在级分V中被分馏)，然后通过使用各种纯化技术将该级分纯化。然后使用盐析方法、超滤方法、等电沉淀方法、电泳法、离子交换色谱技术、凝胶过滤色谱技术和/或亲和色谱技术中的一种或多种将该HSA纯化.

当将血浆加工以生产HSA或其他蛋白质和/或肽的溶液时，该加工降低白蛋白、免疫球蛋白和促红细胞生成素，以及其他蛋白质和肽的量，这些可用于形成DKP。换句话说，血浆相比于HSA或其他纯化的肽或蛋白质溶液具有更大量的白蛋白、免疫球蛋白和促红细胞生成素，以及其他的蛋白质和肽。因此，本文描述的所公开一些方法使用血浆来生产DKP。

因此，用于本公开的DKP可通过加热血浆来制备。“血浆”可以指的是未加工血浆或在中性pH的磷酸盐缓冲液中的血浆溶液。优选地，所述血浆溶液是浓溶液(例如约100-500mM)，从而实现N端和/或C端氨基酸的质子化。所述血浆可在60℃加热至少约2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天，从而导致所述DKP的形成。优选地，应避免蛋白质的变性。这可通过使用更短的时间和/或加入各约0.02M的辛酸或N-乙酰基色氨酸来实现。

用于本公开的DKP还可通过以下制备：将血浆与酶接触，所述酶能将两个N端氨基酸从血浆中的蛋白质或肽上裂解(例如，二肽基肽酶，且尤其是DPP-IV)，或者酶可将两个C端氨基酸从该蛋白质或肽上裂解(例如，羧肽酶)。该反应应在足以加速该反应但不会使蛋白质变性的温度下，在pH6-8下进行，优选是在缓冲液中，例如磷酸盐缓冲液。

在一个实施方案中，所需的DKP是DA-DKP，该酶为DPP-IV，温度是约40℃至约80℃，且优选地是约60℃，该反应时间从约5小时至约6天。在一个实施方案中，所述DPP-IV是内源性且已在该血浆中的DPP-IV、在加工过程中被加入血浆中的DPP-IV或其组合。该加工温度可为至少约40、约41、约42、约43、约44、约45、约46、约47、约48、约49、约50、约51、约52、约53、约54、约55、约56、约57、约58、约59、约60、约61、约62、约63、约64、约65、约66、约67、约68、约69、约70、约71、约72、约73、约74、约75、约76、约77、约78、约79和约80℃。该反应时间可为至少约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23或更多小时、约1、约1.1、约1.2、约1.3、约1.4、约1.5、约1.6、约1.7、约1.8约1.9、约2、约2.1、约2.2、约2.3、约2.4、约2.5、约2.6、约2.7、约2.8、约2.9、约3、约3.1、约3.2、约3.3、约3.4、约3.5、约3.6、约3.7、约3.8、约3.9、约4、约4.1、约4.2、约4.3、约4.4、约4.5、约4.6、约4.7、约4.8、约4.9、约5，、约6、约7、约8、约9或约10天。

通过本公开的方法制成的DKP可通过熟知的方法，例如尺寸排阻色谱法(例如，Centricon过滤)、亲和色谱(例如，使用一列小珠，其附着着靶向所需DKP的抗体或靶向截短蛋白或肽的一种或多种抗体)、阴离子交换法或阳离子交换法，从含有它们的溶液中纯化，包括从含有白蛋白、免疫球蛋白和促红细胞生成素的市售可得的药物组合物中纯化。可使用纯化的DKP并将其并入到上述药物组合物中。

所述DKP包括所有可能的立体异构体，其可通过改变单个手性中心、轴或表面的构型获得。换句话说，所述DKP包括所有可能的非对映异构体，以及所有的旋光异构体(对映体)。

本公开DKP的生理学上可接受的盐还可用于实施本公开。生理学上可接受的盐包括常规的无毒的盐，例如衍生自无机酸(例如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、硝酸等)、有机酸(例如乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、硬脂酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、谷氨酸、天冬氨酸、苯甲酸、水杨酸、草酸、抗坏血酸等)或碱(例如药学上可接受的金属阳离子或衍生自N,N-二苄乙烯二胺、D-葡糖胺或乙二胺的有机阳离子的氢氧化物、碳酸盐或碳酸氢盐)的盐。该盐是用常规方式制备的，例如，用酸中和化合物的游离碱形式。

如上所述，本公开的DKP或其生理学上可接受的盐，可用于治疗T细胞介导的疾病或用于抑制T细胞的活化。为了做到这点，将DKP或其生理学上可接受的盐给药至需要该治疗的动物。优选地，该动物是哺乳动物，例如兔、山羊、狗、猫、马或人。本公开化合物的有效剂型、给药方式和剂量可根据经验确定，并且能够在本领域技术范围内做出此类决定。本领域技术人员应理解，该剂量将根据所采用的具体化合物、所治疗的疾病或病症、该疾病或病症的严重性、给药途径、化合物的排泄速率、治疗的持续时间、向该动物所给药的任何其他药物的确定、该动物的年龄、尺寸和物种以及在医学和兽医学领域已知的类似因素而改变。通常，本公开化合物的合适的每日剂量将是化合物有效地产生治疗效果所用的最低剂量。但是，该每日剂量将通过主治医师或兽医师在合理的医学判断范围内进行确定。如果需要，该有效日剂量可按如下给药：在一天内，以合适的时间间隔分别给药2、3、4、5、6或更多的分剂量。应持续给药该化合物直至达到可接受的响应。

可以任意合适的给药途径将本公开化合物(即，DKP及其生理学上可接受的盐)给药至动物患者用于治疗，所述给药途径包括口服、经鼻、直肠、阴道、胃肠外(例如，静脉内、脊柱内、腹膜内、皮下或肌内)、脑池内、经皮、颅内、脑内和局部(包括颊和舌下)给药。优选的给药途径是口服和静脉内。

尽管可以单独给药本公开的化合物，但优选将所述化合物作为药物制剂(组合物)给药。本公开的药物组合物包含作为活性成分的本公开化合物，其与一种或多种药学上可接受的载体和，任选地，与一种或多种其他化合物、药物或其他材料混合。各个载体必须是“可接受的”，意味着其与该制剂的其他成分相容且对该动物无害。药学上可接受的载体是本领域熟知的。无论所选择的给药途径如何，都应通过本领域技术人员已知的常规方法将本公开的化合物配制于药学上可接受的剂型中。参见，例如，Remington’sPharmaceuticalSciences.

通过参考以下实施例，将更容易理解上面概括性描述的本发明，所包括的实施例仅为了说明本发明实施方案的一些方面。所述实施例不旨在限制本发明，本领域技术人员将通过上述教导和以下实施例中理解到，其他技术和方法可满足本权利要求，并且可在不脱离请求保护的发明范围的情况下采用。

实施例1

蛋白质组分析是在市售HSA溶液中进行的，用以了解治疗效果、不良反应和在使用HSA溶液的治疗中所涉及的机理。在这一研究中，对不同于HSA的141个蛋白质所对应的共计1219个肽进行鉴定。更重要的是，确定肽酶DPP-IV在该市售HSA溶液中。因此，由于其裂解丙氨酸残基之后的肽的能力，因此认为DPP-IV可能参与市售HSA溶液中DA-DKP的形成。为了验证这一假设，使用显色底物和已知的DPP-IV抑制剂来测试市售可得的HSA溶液的DPP-IV活性。DPP-IV活性的存在还在重组HSA来源中进行测试，所述重组HSA来源不是经由科恩分级分离法生产的。最终，评估了温度对市售HSA溶液中DPP-IV活性以及DA-DKP的生产的影响。

材料和方法

材料。在整个研究中使用了三种市售可得的250mL5％HSA(w/v)产品(CSLBehringLLC，Kankakee，IL，USA；GrifolsBiologicalsInc.，LosAngeles，CA，USA；OctapharmaUSAInc.，Hoboken，NJ，USA)。所述N端HSA肽(DAHK)是由DiosynthInc.(荷兰)制造。重组HSA(ecoHSA^TM)获自GenlantisInc.(SanDiego，CA，USA)并在亚洲水稻(AsianRice)(稻(Oryzasativa))的种子中生产。合成的DA-DKP是由SyngeneInternationalLtd.(印度)生产的。所有其他的试剂(包括DPP-IV底物和抑制剂)均获自Sigma-AldrichCo.LLC(St.Louis，MO，USA)。

DPP-IV测试。DPP-IV活性是使用显色底物，Gly-Pro-pNA进行测定的，其描述于E.Nemoto,S.Sugawara,H.Takada,等人,IncreaseofCD26/dipeptidylpeptidaseIVexpressiononhumangingivalfibroblastsuponstimulationwithcytokinesandbacterialcomponents.InfectImmun67(1999)6225-33。所有反应在DPP-IV测试缓冲液(pH7.6)中进行，所述测试缓冲液由0.1MHEPES、0.12MNaCl、5mMKCl、8mM葡萄糖和10mg/ml牛血清白蛋白(BSA)组成。将5％市售HSA、重组HSA或缓冲液空白对照(0.9％NaCl)与1mMGly-Pro-pNA(DPP-IV底物)的测试缓冲液合并或仅与测试缓冲液(-CON)合并。在37℃或60℃培养2-24小时。对于DPP-IV抑制研究，在加入DPP-IV底物前，将1mM抑二肽素A的测试缓冲液与HSA溶液在37℃预培养15分钟。所有的培养在405nm处读取(SpectraMaxM2分光光度计，MolecularDevicesLLC，Sunnyvale，CA，USA)。在405nm处的各读数通过以下进行校正：针对所测的各HSA溶液，将含DPP-IV底物的培养的A405从对应的-CON培养的A405中减去。

<5kDaHSA级分的分离。对于DA-DKP形成的分析，将等分试样加至微型离心过滤器(microcentrifugalfilter)(Vivaspin2，MWCO5,000，SartoriusStedimBiotech，Goettingen，Germany)。将过滤器在室温以3,500rpm离心30分钟。收集该<5kDa的级分并将其转移至用于LCMS分析的独立的存储管中。

LCMS测试。向各<5kDa的级分和DA-DKP合成标准品(20-2000ng/mL)中掺入0.01mML-色氨酸-d5(吲哚-d5)，其用作内标物。将50μL注入强阴离子交换柱(Spherisorb，S5SAX250mmx4.0mm，Waters，Milford，MA，USA)，该柱连接至配有质谱仪(LCT-TOF，Micromass，UK)的高效液相色谱(HPLC，Waters2795SeparationsModule，Milford，MA，USA)。由dH₂O(溶剂A)、甲醇(溶剂B)和200mM甲酸铵(pH5.4，溶剂C)组成的三重移动相使用以下梯度(表1)，以0.5mL/min的流速使用。

表1.在分离>5kDaHSA溶液中的DA-DKP所用的HPLC梯度。

将该HPLC的输出液分成1:20(v/v)并注入使用负电喷雾离子化(-ESI)的质谱仪中，其扫描范围是80-1000m/z，锥孔电压是30eV、离子源温度100℃，且气体温度300℃。DA-DKP是通过检测[M^-]＝185测定的，[M^-]＝185对应的是DA-DKP减去一个单个质子(–H+)。DA-DKP的直链，Asp-Ala，还可使用这个方法通过检测[M^-]＝203进行分析。

统计方法。以μM为单位，所生成的pNA的量是基于在HEPES缓冲液中的pNA摩尔消光系数计算的(参见R.Lottenberg，C.M.Jackson，Solutioncompositiondependentvariationinextinctioncoefficientsforp-nitroaniline.BiochimBiophysActa742(1983)558-64)。统计分析是使用程序包Excel(Microsoft)和MatlabR13(MathWorks)进行的。使用双尾学生T检验对各组进行比较，显著性水平在p<0.05。所有数据均以平均值±SD进行报道。

结果

二肽基肽酶IV(DPP-IV)的活性是在人血清白蛋白(HSA)的市售制剂中进行评估的。所选择的活性测试在文献中是有据可查的并涉及已知的DPP-IV底物即Gly-Pro-pNA的裂解。所得色原体(pNA)的释放在405nm处进行分光光度计测量。选择三种市售可得的5％HSA溶液，无特定的制造商偏好。唯一的要求就是，该溶液未过期且由不同的制造商使用科恩分级分离法生产。对于该酶测试的培养温度，选择37℃和60℃，因为前者代表生理条件，而后者代表市售HSA溶液的巴氏消毒温度。

DPP-IV在37℃的活性在所有这三种5％市售HSA溶液中进行测定。所有这三种市售HSA溶液含有显著的DPP-IV活性，其中CSLBehringHSA的活性稍低于Octapharma和GrifolsHSA的活性(图1)。DPP-IV活性的量与该HSA来源的有效期无关。在已知的DPP-IV抑制剂(抑二肽素A)的存在下，DPP-IV被完全抑制。这导致在整个培养过程中，相比于–CON(数据未显示)，没有额外的色原体产生。在一种市售HSA溶液中(CSLBehring)，测试了在60℃的DPP-IV活性。DPP-IV活性以显著水平呈现(图2)。但是，60℃的DPP-IV活性是37℃的原始DPP-IV活性的约70-80％。在这两个温度下，随着HSA溶液浓度的增加，观察到DPP-IV活性的剂量响应。

为了比较在使用非科恩分级分离法分离出的HSA中DPP-IV活性，对水稻中生产的重组HSA(rHSA)进行分析。一种通过科恩分级分离法生产的市售HSA溶液(cHSA)也包括在该DPP-IV活性测试中。对于这两种HSA类型，浓度范围从净溶液(5％w/v)至稀溶液(1％和2.5％)。在全部这三种浓度下，DPP-IV活性在cHSA溶液中的量显著高于在rHSA溶液中的量(图3)。此外，DPP-IV活性在rHSA溶液中与在仅含测试缓冲液的培养中没有统计学上显著差异。因此，在rHSA溶液中未呈现出显著的DPP-IV活性。

所述DKP(DA-DKP)的形成是在60℃加热的市售HSA溶液中测定的，该溶液中存在或不存在已知的DPP-IV抑制剂(抑二肽素A)。将含有DA-DKP的HSA的低分子量级分使用5kDaMWCO旋转柱进行分离。通过使用负电喷雾离子化(-ESI)的LCMS测定<5kDa级分的DA-DKP含量。在第一个24小时过程中，在不含抑制剂的培养中的DA-DKP含量比基线DA-DKP水平升高30％(图4)。在DPP-IV抑制剂的存在下，在60℃，经24小时，DA-DKP产生仅升高10％。

可指定在患者(例如多重创伤患者)中给药市售人血清白蛋白(HSA)。由于其异质性，其他成分，例如蛋白酶，可有助于市售HSA的疗效。一种这样的蛋白酶，二肽基肽酶IV(DPP-IV)，可从白蛋白的N末端释放已知的免疫调节分子，天冬氨酸-丙氨酸二酮基哌嗪(DA-DKP)。用具体的DPP-IV底物和抑制剂测试例如通过科恩分级分离法制备的市售HSA溶液的DPP-IV活性。DPP-IV活性在37℃和60℃进行测试，因为市售HSA溶液在60℃巴氏消毒10-11小时。市售HSA溶液中的DPP-IV活性与其他白蛋白来源(例如重组白蛋白)中的DPP-IV活性相比较。显著水平的DPP-IV活性存在于市售HSA溶液中。该活性使用特定的DPP-IV抑制剂进行消除，意味着DPP-IV活性存在于市售HSA中。在60℃也呈现出该活性，其为在37℃培养所保持的活性的70-80％。在该重组来源中未呈现DPP-IV活性，意味着DPP-IV活性仅存在于使用科恩分级分离法生产的白蛋白溶液。最终，当将HSA溶液在60℃加热时，观察到DA-DKP形成增加。该形成在DPP-IV抑制剂的存在下显著降低。HSA中的DPP-IV活性可在危重患者中导致许多副产物的形成，包括DA-DKP。

实施例2

首先参考图5，本公开的一个实施方案如方框图所示，处理包含白蛋白和任选的DKP的进样流120以生产治疗组合物的方法。该进样流120可包含，例如，盐水溶液，其含有经Cohn方法生产的约25重量％人血清白蛋白并在无白蛋白的情况下含有天冬氨酸-丙氨酸二酮基哌嗪(DA-DKP)，其浓度范围约50μMDA-DKP至约100μMDA-DKP。所述进样流还可包含各种浓度的乙酰色氨酸钠、N-乙酰基色氨酸和辛酸钠。将所述进样流进样至第一加工步骤100，包括例如，切向流过滤，其提供尺寸排阻分离，其中分子量小于约66至约69kDa的任意分子穿过该过滤器进入第一白蛋白缺乏流140(滤液)。在这个实施例中，所述第一白蛋白缺乏流基本上不包含白蛋白；约0重量％的白蛋白。换句话说，在该进样流120中的约100％的白蛋白保留在第一白蛋白富集流130中。所述第一白蛋白缺乏流140包含盐水溶液，其在无白蛋白的情况下所具有的DA-DKP浓度范围为约50μMDA-DKP至约100μMDA-DKP。所述渗余物将分子量大于约66-约69kDa的任何分子以及未被压入切向流过滤器的任何含DKP的盐水溶液保留在第一白蛋白富集流130中。

在这个实施例中，DA-DKP的理论最大量存在于该进样流120中，其既可以作为白蛋白N末端和/或C末端或连续末端的热降解、化学降解和/或酶降解产物存在的游离分子，也可以作为未反应的白蛋白。

参考图5，然后将所述第一白蛋白富集流130进样至反应步骤110。该反应步骤可包括温度和pH控制反应器，例如搅拌釜反应器或类似于发酵容器的容器。在该实施例中，酶150存在于、产生于和/或计量至加热反应器中，该加热反应器维持在约50℃且通过加入稀硫酸维持pH约5.0(未示出)。在这个特定的实施例中，所加入的酶150包括二肽基肽酶IV。将足量的二肽基肽酶IV(DPP-IV)加至该反应步骤110中以提供约40μMpNA至约150μMpNA的肽酶活性。在这一实施例中的反应步骤110是批次反应器，其中所述反应物、白蛋白和DPP-IV以设定点温度和pH维持在该反应器中约1小时至约24小时。随后将所得反应流即第二白蛋白富集流130在第二加工步骤100中进行加工。

在这个具体实施例中，该反应步骤通过酶降解白蛋白的N末端和/或C末端、或连续末端从而产生显著量的额外的DA-DKP。这可导致在无白蛋白的情况下DA-DKP在第二白蛋白富集流130中的浓度升高。因此，尽管该进样流120的DA-DKP在无白蛋白的情况下可具有约50μMDKP至约100μMDA-DKP的浓度范围，则该第二白蛋白富集流130的DA-DKP浓度范围在无白蛋白的情况下可为约100μMDKP至约150μMDA-DKP。

将第二白蛋白富集流130进样至第二加工步骤100中。在这个实施例中，所述第二加工步骤100是第二个独立单元操作。因此，它可以是第二个切向流过滤单元或一些完全不同的技术；例如，色谱柱。或者，所述第二加工步骤可使用与在第一加工步骤中所用的相同的设备完成，例如，以分批或半分批方式运行。在这个实施例中，该第二加工步骤100是第二个专用的切向流过滤单元，其以实施例2中所述的第一单元相同的原理进行操作。

在上述实施例2中，所述第二白蛋白富集流130比进样流120含有更高浓度的DA-DKP。但是，由于在第一加工步骤100中将无白蛋白盐水溶液除去，因此不存在该盐水溶液。因此，在该实施例2中，在DA-DKP理论产量上增加的增益本身就更大。

过滤第二白蛋白富集流130形成最终白蛋白富集产物流160、第一治疗组合物和第二白蛋白缺乏(在这种情况下无白蛋白)流140，该第二白蛋白缺乏流140在无白蛋白的情况下包含盐水溶液，伴有约100μMDKP至约150μMDA-DKP的DA-DKP浓度范围。含DA-DKP的第一和第二白蛋白缺乏流可与一个流组合形成第二治疗组合物。例如，所述白蛋白富集产物流160可用于治疗病症，例如，但不限于，营养不良、饥饿导致的疾病(starvation)、肾病综合征、胰腺炎和腹膜炎。该组合的含DA-DKP的无白蛋白流还可用于治疗人自身免疫疾病。

尽管图5显示了仅有一个反应步骤110和仅有两个加工步骤100，但是这并不旨在将本公开的范围限制为一个反应步骤和两个加工步骤。其他的反应和加工步骤也可提高DA-DKP的产率。例如，在三个反应步骤110和四个加工步骤100之后可实现累计产率。本领域技术人员将理解，加工和反应步骤的数量，以及它们相对于彼此的排布(例如，串联、并排、有循环回路、无循环回路等)将取决于综合经济分析，该分析在每个位点以及每个应用都有所不同。

实施例3

现参考图6，实施例2的变化以方框图的形式来描述处理包含白蛋白和任选地DKP的进样流120以生产治疗组合物的方法，所述治疗组合物还包含白蛋白富集的再循环流170。

这个实施例还包括两个加工步骤100和一个反应步骤110。在这个实施例中，假定一种情况，其中在这些步骤之后的DKP产率不能接受的低；例如，小于50％。那么，将从第二加工步骤100流出的白蛋白富集流130分流成白蛋白富集的再循环流170，将其循环回去，使得在将其输送入第一加工步骤100之前与进样流120组合，从而使第二次穿过该系统的白蛋白的产率上升至50％以上。

在这个实施例中，认为该过程是以连续模式运行的。因此，最终白蛋白富集产物流160连续地从该过程离开，而新鲜原料120被连续地输送入该过程中。内部循环回路170可显著大于进样流120和流160，而这些流的实际量和比例取决于在该加工步骤100中每通过一次所得到的产率。

实施例4

现参考图7，另一个实施方案描述的是处理包含白蛋白和任选地DKP的进样流120以生产治疗组合物的方法，其中修改实施例2使包括进料至第二加工步骤100的稀释流180。

本实施例认为需要一种替代液(displacementfluid)，其在加工步骤过程中替代白蛋白中的含DKP水相。在这个实施例中，乳酸盐林格氏溶液被用作稀释流180以替代更多的存在于经切向流过滤单元的水相中的DKP。

在本文中示例性公开的发明可在缺乏任意元素下被适当地实施，其在本文中并未具体公开。然而，本领域技术人员显而易见的是，对该方法的许多改变、变更、修改、其他用途以及应用是可能的，并且不脱离本发明精神和范围的这些改变、变更、修改、其他用途以及应用被认为也涵盖在本发明中，其仅通过所附权利要求进行限定。

本发明的上述讨论是以说明和描述的目的进行呈现。上述内容并不旨在限定本发明为本文公开的一种或多种形式。在例如上述发明详述中，将本发明的各个特征组合在一起形成一个或多个实施方案，用以简化本公开的内容。可将本发明实施方案的特征组合成为除上述讨论之外的替代实施方案。不应将本公开的这种方法解释成反映了以下这种目的：请求保护的发明需要的特征比各权利要求中明确陈述的要多。相反，正如所附权利要求所反映的，发明方面在于小于单个上述公开的实施方案的全部特征。因此，所附权利要求由此被并入发明详述中，而各权利要求以其自身作为本发明单独的优选实施方案。

此外，尽管本发明说明书已包括了一或多个实施方案以及一些变更和修改的描述，但在理解了本公开之后，其它的变更、组合和修改也在本发明的范围内，例如，可能在本领域技术和知识范围内的那些。目的是为了获得权利，其包括在允许范围内的替代实施方案，包括请求保护的那些的替代、可互换和/或等同的结构、功能、范围或步骤，无论该替代、可互换和/或等同的结构、功能、范围或步骤在本文中是否公开，且并不打算公开地贡献任何专利性主题。

Claims (54)

1.处理包含白蛋白和天冬氨酸-丙氨酸二酮基哌嗪(DA-DKP)的进样流以生产组合物的方法，该方法包括：

加工该进样流以生产第一白蛋白缺乏流和第一白蛋白富集流，其中所述第一白蛋白缺乏流包含存在于该进样流中的第一部分的DA-DKP，且所述第一白蛋白富集流包含存在于该进样流中的第二部分的DA-DKP；

使该第一白蛋白富集流反应以生产DA-DKP，从而使反应流包含白蛋白和DA-DKP；和

加工该反应流以生产第二白蛋白缺乏流和第二白蛋白富集流，其中所述第二白蛋白缺乏流包含存在于该反应流中的一部分DA-DKP，且第二白蛋白富集流包含存在于该反应流中的第二部分的DA-DKP。

2.根据权利要求1的方法，其中第一和第二白蛋白缺乏流中的至少一个具有治疗价值。

3.根据权利要求1的方法，其中第一和第二白蛋白富集流中的至少一个具有治疗价值。

4.根据权利要求1的方法，其中加工进样流和反应流中的至少一个包括以下中的至少一种：过滤、色谱法、沉降、萃取及其组合。

5.根据权利要求4的方法，其中加工进样流和反应流中的至少一个包括过滤，其中所述过滤包括切向流过滤。

6.根据权利要求4的方法，其中加工进样流和反应流中的至少一个包括色谱法，其中所述色谱法包括以下中的至少一种：尺寸排阻色谱法、亲和色谱法、阴离子交换色谱法和离子交换色谱法。

7.根据权利要求1的方法，其中反应包括以下中的至少一种：热处理、化学反应、酶反应及它们的组合。

8.根据权利要求7的方法，其中反应包括将第一白蛋白富集流加热至范围在约40℃至约80℃的平均整体温度。

9.根据权利要求7的方法，其中反应包括将第一白蛋白富集流与以下至少一种进行的酶反应：二肽酶、激肽释放酶、组织蛋白酶、羧肽酶及其组合。

10.根据权利要求7的方法，其中反应包括将第一白蛋白富集流至少与二肽基肽酶IV的酶反应。

11.根据权利要求7的方法，其中反应包括将第一白蛋白富集流至少与内源性二肽基肽酶IV的酶反应。

12.根据权利要求1的方法，其中反应包括在二肽基肽酶IV的存在下，将所述第一白蛋白富集流加热至范围在约40℃至约80℃的平均整体温度。

13.根据权利要求12的方法，其中所述二肽基肽酶IV是内源性二肽基肽酶IV。

14.根据权利要求1的方法，其中所述进样流包含至少一种其他成分，所述其他成分选自：乙酰色氨酸钠、N-乙酰基色氨酸、辛酸钠、辛酸及其组合。

15.根据权利要求1的方法，其中所述DA-DKP选自可溶的DA-DKP、DA-DKP盐及其组合。

16.根据权利要求1的方法，其中所述第一白蛋白富集流包含进样流中至少约90重量％的白蛋白。

17.根据权利要求1的方法，其中所述第二白蛋白富集流包含反应流中至少约90重量％的白蛋白。

18.根据权利要求1的方法，其中存在于第一白蛋白缺乏流中的第一部分的DA-DKP占存在于进样流中的DA-DKP的至少约80重量％。

19.根据权利要求1的方法，其中存在于第二白蛋白缺乏流中的第一部分的DA-DKP包含存在于该反应流中的至少约90重量％的DA-DKP。

20.根据权利要求1的方法，其中所述第一白蛋白缺乏流包含浓度至少约50μM的DA-DKP。

21.根据权利要求1的方法，其中所述第二白蛋白缺乏流包含浓度至少约50μM的DA-DKP。

22.根据权利要求1的方法，还包括分析步骤，其中所述分析步骤包括：

分析所述第二白蛋白富集流得到至少一个度量；和

将该至少一个度量与至少一个参考值相比较，其中当所述至少一个度量小于该参考值时，重复该反应和加工步骤直至随后的白蛋白富集流的所述至少一个度量大于或等于所述至少一个参考值。

23.根据权利要求22的方法，其中所述分析步骤包括选自高压液相色谱法和质谱法的方法。

24.根据权利要求22的方法，其中所述至少一个度量是在加工步骤中生产的DA-DKP的质量，且所述参考值是进样流中每单位质量的白蛋白可生产DA-DKP的理论最大质量的一部分。

25.根据权利要求1的方法，还包括调节进样流的pH。

26.根据权利要求1的方法，还包括调节反应流的pH。

27.根据权利要求1的方法，还包括稀释该进样流。

28.根据权利要求1的方法，还包括稀释该反应流。

29.根据权利要求1的方法，还包括稀释该进样流、反应流或这两者，其中稀释是用选自以下中至少一种稀释剂：盐水、乳酸盐林格氏溶液、林格氏乙酸盐溶液、羟乙基淀粉溶液和右旋糖溶液。

30.组合物，其包含浓度大于约100μM的DA-DKP。

31.根据权利要求30的组合物，其中白蛋白的浓度小于1重量％。

32.根据权利要求30的组合物，其中DA-DKP的浓度大于约150μM。

33.根据权利要求30的组合物，其中DA-DKP的浓度大于约200μM。

34.根据权利要求30的组合物，其中所述组合物由人血清白蛋白组合物制备。

35.根据权利要求34的组合物，其中所述人血清白蛋白组合物是市售的人血清白蛋白组合物。

36.根据权利要求34的组合物，其中所述制备包括白蛋白的酶转化以生产DA-DKP。

37.根据权利要求36的组合物，其中所述制备还包括从该组合物中分离白蛋白。

38.根据权利要求30的组合物，还包含至少一种其他成分，其选自：盐水、乳酸盐林格氏溶液、林格氏乙酸盐溶液、羟乙基淀粉溶液、右旋糖溶液及其组合。

39.根据权利要求30的组合物，还包含至少一种其他成分，其选自：乙酰色氨酸钠、N-乙酰基色氨酸、辛酸钠、辛酸及其组合。

40.制备含DA-DKP的组合物的方法，其包括：

在过滤血浆之前，进行：

a)将未过滤的血浆与酶接触，该酶将N末端二肽从血浆中的蛋白质上裂解，和

b)将该血浆在有效导致DA-DKP或其生理学上可接受的盐形成的条件下加热。

41.根据权利要求40的方法，其中所述蛋白质是白蛋白。

42.根据权利要求40的方法，其中该加热步骤在约40℃至约80℃的温度进行。

43.根据权利要求40的方法，其中所述酶包括二肽基肽酶IV。

44.根据权利要求43的方法，其中所述二肽基肽酶IV内源于该血浆。

45.根据权利要求40的方法，还包括调节该血浆的pH。

46.根据权利要求40的方法，其中所述血浆还包含至少一种其他成分，其选自：乙酰色氨酸钠、N-乙酰基色氨酸、辛酸钠、辛酸及其组合。

47.根据权利要求40的方法，其中该产品具有治疗价值。

48.制备含DA-DKP的组合物的方法，其包括：

a)将含白蛋白的溶液与酶接触，该酶将一对N端氨基酸从该白蛋白上裂解，和

b)将含白蛋白的溶液在有效导致DA-DKP或其生理学上可接受的盐形成的条件下加热。

49.根据权利要求48的方法，其中该加热步骤在约40℃至约80℃的温度进行。

50.根据权利要求48的方法，其中所述酶包括二肽基肽酶IV。

51.根据权利要求50的方法，其中所述二肽基肽酶IV内源于含白蛋白的溶液。

52.根据权利要求48的方法，还包括调节含白蛋白的溶液的pH。

53.根据权利要求48的方法，其中所述含白蛋白的溶液还包含至少一种其他成分，其选自：乙酰色氨酸钠、N-乙酰基色氨酸、辛酸钠、辛酸及其组合。

54.根据权利要求48的方法，其中产品具有治疗价值。