BR112012020934B1 - Processo para purificação da alfa-manosidase lisossomal humana recombinante a partir de uma cultura celular, composição, processo em batelada alimentada ou produção contínua da alfa-manosidase lisossomal humana recombinante e uso da composição - Google Patents

Abstract

processo para purificação da alfa-manosidase recombinante a partir de uma cultura celular, composição, alfa-manosidase recombinante, uso de uma composição e método para tratar alfa-manosidose e/ou reduzir ou aliviar os sintomas associados à alfa-manosidose a presente invenção refere-se a um processo para purificação da alfa-manosidase recombinante, um processo para produção de alfa-manosidase, uma composição que compreende alfa-manosidase, o uso da composição como um medicamento, o uso como um medicamento para o tratamento da alfa-manosidose e um método para tratar a alfa-manosidose e/ou aliviar os sintomas da alfa-manosidose.

Description

CAMPO TÉCNICO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a um processo para a purificação de alfa-manosidase recombinante, um processo para a produção de alfa-manosidase, uma composição que compreende alfa-manosidase, o uso da composição como um medicamento, o uso como um medicamento para o tratamento de alfa-manosidose e um método para tratar alfa-manosidose e/ou aliviar os sintomas de alfa-manosidose.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Alfa-manosidose A alfa-manosidose é uma doença autossômica recessiva que ocorre ao redor do mundo com uma frequência de entre 1/1.000.000 e 1/500.000. A manosidose é encontrada em todos os grupos étnicos na Europa, América, África e também na Ásia. É detectada em todos os países com um bom serviço diagnóstico para desordens de depósito lisossômico em uma frequência semelhante. As pessoas nascem aparentemente saudáveis, entretanto os sintomas das doenças são progressivos. A alfa-manosidose exibe heterogeneidade clínica, se situando na faixa de formas muito sérias a muito suaves. Sintomas clínicos típicos são: retardo mental, alterações do esqueleto, sistema imunológico deficiente resultando em infecções recorrentes, deficiência auditiva e, frequentemente, a doença está associada a características faciais típicas como uma face grosseira, uma testa proeminente, um canal nasal achatado, um nariz pequeno e uma boca ampla. Nos casos mais severos (manosidose tipo I) as crianças sofrem de hepatoesplenomegalia e morrem durante os primeiros anos de vida. Possivelmente essa morte precoce é causada por severas infecções devido à imunodeficiência causada pela doença. Em casos mais suaves (manosidose tipo 2) os pacientes geralmente alcançam idade adulta. As fraquezas do esqueleto dos pacientes resultam na necessidade de cadeira de rodas com 20 a 40 anos. A doença causa uma disfunção difusa do cérebro que resulta, com frequência, em desempenho mental fraco que exclui qualquer coisa, a não ser as habilidades mais básicas de simples leitura e escrita. Esses problemas associados a deficiências auditivas e outras manifestações clínicas impedem que o paciente tenha uma vida independente, cuja consequência é a necessidade de cuidados por toda a vida.

Alfa-manosidase lisossômica

A alfa-manosidose resulta de uma atividade deficiente de alfa-manosidase lisossômica (LAMAN, EC3.2.1.24). A doença é caracterizada por acúmulo intracelular massivo de oligossacarídeos ricos em manose, que são oligossacarídeos que portam resíduos de ocl,2-, ccl,3- e al,6-manosil nas terminações não redutoras dos mesmos. Esses oligossacarídeos se originam principalmente da degradação intralisossômica de glicoproteínas com oligossacarídeos N- ligados. Entretanto, alguns se originam do catabolismo de oligossacarídeos ligados a dolicol e de glicoproteínas incorretamente dobradas redirecionadas ao citosol para degradação pelo proteassoma (Hirsch et al. EMBO J. 22, 1036 a 1046, 2003 e Saint-Pol et al. J. Biol. Chem. 274, 13547 a 13555, 1999). O depósito lisossômico é observado em uma ampla variedade de tipos de células e tecidos, incluindo neurônios em todas as regiões do cérebro. A LAMAN é uma exoglicosidase que hidrolisa esses resíduos de alfa-D-manose não redutores terminais em alfa-D-manosídeos da extremidade não redutora durante a degradação ordenada das glicoproteínas N-ligadas (Aronson e Kuranda FASEB J 3:2615 a 2622. 1989). A enzima precursora humana é sintetizada como um polipeptídeo de 1.011 aminoácidos incluindo um peptídeo sinal de 49 resíduos. O precursor é processado de modo proteolítico em três glicopeptídeos principais de 15, 42 e 7 0 kD para a enzima madura no lisossomo. O glicopeptídeo de 70 kD é adicionalmente processado em três subunidades ligadas por pontes de dissulfeto. (Berg et al. Mol. Gen. e Metabolism 73, 18 a 29, 2001, Nilssen et al. Hum. Mol. Genet. 6, 717 a 726. 1997).

O gene alfa-manosidase lisossômico O gene que codifica para LAMAN (MANB) é localizado no cromossomo 19 (19cen-ql2), (Kaneda et al. Chromosoma 95:8 a 12. 1987). O MANB consiste em 24 exões, abrangendo 21,5 kb (Números de acesso no GenBank U60885 a U60899; Riise et al. Genomics 42:200 a 207, 1997). O transcrito de LAMAN é » 3.500 nucleotideos (nts) e contém urn quadro de leitura aberto que encodifica 1.011 aminoácidos (GenBank U60266.1).

A clonagem e sequenciamento do cDNA humano que encodifica LAMAN foi publicado em três artigos (Nilssen et al. Hum. Mol. Genet. 6, 717 a 726. 1997; Liao et al. J.Biol.Chem. 271, 28348 a 28358. 1996; Nebes et al. Biochem.Biophys.Res.Commun. 200, 239 a 245. 1994). Curiosamente, as três sequências não são idênticas. Em comparação com a sequência de Nilssen et al (n2 acesso U60266.1), uma mudança de TA para AT nas posições 1670 e 1671 que, em uma substituição de valina por ácido aspártico, foi descoberta por Liao et al. e Nebes et al. Também se verificou uma mudança de C para A na posição 1152, que não resulta em quaisquer mudanças na sequência de aminoácidos.

Diagnóstico

O diagnóstico de alfa-manosidose é atualmente é feito com base em avaliação clínica, detecção de oligossacarídeos ricos em manose na urina e medições diretas de atividade de alfa-manosidase em vários tipos de células, como leucócitos, fibroblastos e amniócitos (Chester et al. , Em: Durand P, O'Brian J (eds) Genetic errors of glycoprotein metabolism. Edi-Ermes, Milan, pp 89 a 120. 1982; Thomas e Beaudet . Em: Scriver CR, Beaudet AL, Sly WA, Valle D (eds) The metabolic and molecular bases of inherited disease. Volume 5. McGraw-Hill, Nova York, páginas 2529 a 2562. 1995).

Devido ao fato de os sintomas inicialmente serem, com frequência, suaves e o diagnóstico bioquímico ser difícil, o diagnóstico é, com frequência, feito tardiamente no curso da doença. É evidente que os pacientes e suas famílias se beneficiariam substancialmente de um diagnóstico precoce.

Modelos animais

A alfa manosidose foi descrita em gado (Hocking et al. Biochem J 128:69 a 78. 1972), gatos (Walkley et al. Proc. Nat. Acad. Sei. 91: 2970 a 2974, 1994), e porquinhos-da-índia (Crawley et al. Pediatr Res 46: 501 a 509, 1999) . Um modelo de camundongo foi recentemente gerado por rompimento alvejado do gene de alfa-manosidase (Stinchi et al. Hum Mol Genet 8: 1366 a 72, 1999) .

Como em humanos, a alfa manosidase parece ser causada por mutações específicas no gene que codifica para alfa-manosidase lisossômica. Berg et al. (Biochem J. 328:863 a 870.1997) relataram a purificação de alfa-manosidase lisossômica de fígado de felino e a determinação da sequência de cDNA do mesmo. A enzima ativa consiste em 3 polipeptídeos, com massas molecular relatadas como sendo 72, 41 e 12 kD. De modo semelhante à enzima humana, demonstrou-se que a enzima felina é sintetizada como um precursor de cadeia única com um peptídeo sinal putativo de 50 aminoácidos seguido por uma cadeia de polipeptídeos de 957 aminoácidos, que é clivada nos 3 polipeptídeos da enzima madura. A sequência de aminoácidos deduzida foi 81,1% e 83,2% idêntica às sequências humanas e bovinas, respectivamente. Uma deleção de 4-bp foi identificada em um gato persa afetado; a deleção resultou em um deslocamento de quadro do códon 583 e terminação prematura no códon 645. Nenhuma atividade enzimática poderia ser detectada no fígado do gato. Um gato de pelos longos doméstico expressando um fenótipo mais suave teve atividade enzimática de 2% do normal; esse gato não possuía a deleção de 4-bp. Tollersrud et al. (Eur J Biochem 246:410 a 419 .1997) purificaram a enzima de fígado bovino para homogeneidade e clonaram o gene. O gene foi organizado em 24 exões que abrangiam 16 kb. Com base na sequência do gene, foram identificadas duas mutações no gado.

Necessidade médica de terapia de alfa-manosidase À luz das manifestações clínicas severas que resultam do acúmulo de oligossacarídeos ricos em manose, a falta de tratamento eficaz para a alfa-manosidose é bem reconhecida. Atualmente, a principal opção terapêutica para o tratamento da doença é o transplante de medula óssea, entretanto, é o objetivo da presente invenção promover terapia de substituição enzimática como uma alternativa futura potencial.

Transplante de medula óssea

Em 1996 Walkley et al. (Proc. Nat. Acad. Sei. 91: 2.970 a 2.974, 1994) publicaram um artigo sobre 3 filhotes de gato com manosidose que foram tratados com transplante de medula óssea (BMT) em 1991. Nos 2 animais que foram sacrificados observou-se uma normalização não apenas no corpo mas, sobretudo, também no cérebro. O 3o gato ficou bem após 6 anos. Normalmente, um gato não tratado morre com 3 a 6 meses.

Em 1987 uma criança com manosidose foi tratada com BMT (Will et al. Arch Dis Child 1987 Oct; 62 (10) : 1044 a 9). Ele morreu após 18 semanas devido a complicações relacionadas ao procedimento. No cérebro, pouca atividade enzimática foi verificada. Esse resultado decepcionante poderia ser explicado por um pesado tratamento imunossupressor antes da morte, ou que leva tempo para que a atividade enzimática aumente no cérebro após o BMT. A doadora foi a mãe (que, como portadora, se esperava que tivesse menos de 50% de atividade enzimática) ou pode ser que o BMT em homens não tenha efeito na função enzimática no cérebro. Apesar de ter resultados variáveis, as poucas tentativas do transplante de medula óssea indicaram, assim, que um enxerto bem sucedido pode corrigir as manifestações clínicas de alfa-manosidose, pelo menos em parte. Entretanto, o desafio de reduzir as complicações sérias relacionadas ao procedimento quando se aplica o transplante de medula óssea em terapia humana ainda permanece não superado. Terapia de substituição enzimática

Quando as doenças de depósito lisossômico foram descobertas, criou-se esperança de que essas poderiam ser tratadas por substituição enzimática. A terapia de substituição enzimática provou ser eficiente na doença de Gaucher. Quando a glucocerebrosidase lisossômica exógena é injetada no paciente, essa enzima é absorvida pelas células com deficiência da enzima (Barton et al. N Engl J Med 324:1464 a 1470). Tal absorção é regulada por determinados receptores na superfície celular como, por exemplo, o receptor de manose-6-fosfato, que é quase ubíquo na superfície de células e outros receptores como o receptor de asialoglicoproteína e o receptor de manose, que são restritos a determinados tipos de células como células da linha celular de macrófagos/monócitos e hepatócitos. A absorção celular da enzima é, portanto, fortemente dependente do perfil de glicosilação da mesma. Se projetada de modo apropriado, a enzima deficiente poderia ser substituída por injeções regulares de enzima exógena da mesma maneira que os pacientes diabéticos recebem insulina. Estudos in vitro com a alfa- manosidase lisossômica purificada ativa adicionada ao meio de fibroblastos com deficiência da enzima mostraram correção do acúmulo de substrato lisossômico. O tratamento in vivo, por outro lado, foi dificultado em parte pelo problema de produção da quantidade suficiente de enzimas, devido à dificuldade de produção de grande escala e aos procedimentos de purificação e por complicações que resultam de reações imunes contra a enzima exógena.

Sobretudo, entretanto, considerações especiais se aplicam em relação às doenças de depósito lisossômico com um componente neurológico principal, como alfa-manosidose, em que as manifestações clínicas estão relacionadas ao depósito lisossômico aumentado no sistema nervoso central. Assim, a terapia de substituição enzimática não provou ser eficaz contra a variante neuronopática aguda da doença de Gaucher (Prows et al. Am J Med Genet 71:16 a 21) .

A entrega de enzimas terapêuticas ao cérebro é impedida pela ausência de transporte dessas grandes moléculas através da barreira sangue-cérebro. A partir da noção geral de que a barreira sangue-cérebro deva ser contornada a fim de se ver um efeito de agentes terapêuticos no cérebro, o uso de uma ampla diversidade de sistemas de entrega foi contemplado. Essas incluem técnicas invasivas como abertura osmótica da barreira sangue-cérebro com, por exemplo, manitol, e técnicas não invasivas como endocitose mediada por receptor de enzimas quiméricas. Como se espera que a substituição enzimática precise de administração da enzima de modo regular, o uso de técnicas invasivas deve ser evitado. O uso das técnicas não invasivas, apenas recentemente provou ter resultados promissores em modelos animais (para alfa-manosidose, consulte abaixo, para outras desordens lisossômicas consulte, por exemplo: Grubb et al. PNAS 2008, 105(7) pp. 2616 a 2621). Contemplou-se que o depósito reduzido em órgãos viscerais e nas meninges poderia reduzir a quantidade de oligossacarídeos que é portada ao cérebro. Tais considerações, entretanto, não são consideradas como aplicáveis às desordens lisossômicas em que o dano neurológico é primário e severo (Neufeld, E. F. Enzyme replacement therapy, em "Lysosomal disorders of the brain" (Platt, F. M. Walkley, S. V: eds Oxford University Press).

Entretanto, conforme descrito em Roces et al. Human Molecular Genetics 2004, 13(18) páginas 1979 a 1988, Blanz et al. Human Molecular Genetics 2008, 17(22) páginas 3437 a a3445 e no documento WO 05/094874, provou-se possível aumentar os níveis de LAMAN no sistema nervoso central de animais com o uso, por exemplo, de injeção intravenosa de uma formulação que compreende alfa-manosidase, reduzindo, desse modo, os níveis intracelulares de oligossacarídeos neutros ricos em manose em uma ou mais regiões do sistema nervoso central. Isso indica que a alfa-manosidase recombinante é útil na terapia de substituição enzimática dos pacientes que sofrem de alfa-manosidose. Assim, um obstáculo principal que permanece no sentido de fornecer tratamento eficaz de alfa- manosidose com o uso de substituição enzimática é fornecer quantidades suficientes de alfa-manosidase recombinante pura de uma maneira rentável. Produção e purificação de alfa-manosidase

O documento WO 02/099092 descreve um processo de produção de pequena escala para rhLAMAN em células de CHO com o uso de meio livre de soro a 37 °C. Um processo de purificação de pequena escala também é descrito, e envolve a diafiltração da enzima crua e cromatografia de troca aniônica fraca com o uso de colunas DEAE sepharose FF na etapa de captura, seguida por várias etapas de purificação cromatográfica gue envolvem cromatografia de modo misto e interação hidrofóbica.

O documento WO 05/094874 descreve um processo de produção de pequena escala para rhLAMAN em células de Ovário de Hamster Chinês (CHO) com o uso de meio livre de soro a 3 7 °C. Um processo de purificação de pequena escala análogo àquele do documento WO 02/099092 também é descrito.

O documento WO 05/077093 descreve a produção de enzimas lisossômicas altamente fosforiladas. No exemplo IV, um método de purificação para alfa-glucosidase ácida (GAA) com o uso de uma resina multimodal (azul-sepharose) é descrito. A GAA, embora uma enzima lisossômica, é entretanto inteiramente diferente da rhLAMAN. A GAA é altamente fosforilada, enquanto rhLAMAN tem um baixo grau de fosforilação. Além disso, a classificação de identidade de sequência é menor do que 12% entre GAA e rhLAMAN e, finalmente, os pontos isoelétricos teóricos diferem por mais de uma unidade de pH (5,42 e 6,48 respectivamente). Assim, o método conforme descrito no documento WO 05/077093 para purificar GAA não é aplicável a rhLAMAN.

Um processo de produção de pequena escala para rhLAMAN em células de CHO com o uso de 0,25% (V/V) de soro e adição de DMSO foi descrito (Berg et al. Molecular Genetics and Metabolism, 73, páginas 18 a 29, 2001. Descrevem-se, também, dois processos de purificação que envolvem a) um procedimento em três etapas que envolve ultrafiltração, cromatografia de troca aniônica e filtração de gel ou b) cromatografia de imunoafinidade de etapa única. Descreve-se, ainda, como o método a) resulta na enzima de 13 0 kDa que se fragmenta inteiramente em fragmentos de 55 kDa e 72 kDa, enquanto que o método b) resulta em fragmentação parcial do precursor de 130 kDa em quantidades significativas dos fragmentos de 55 e 72 kDa.

Por isso, um processo aprimorado para a produção e purificação de alfa-manosidase recombinante seria vantajoso. Em particular, um processo aprimorado para o cultivo em grande escala de uma linha celular que pode de expressar alfa-manosidase e um processo de purificação em grande escala mais eficaz para isolar alfa-manosidase pura com uma alta atividade enzimática a partir de uma cultura celular seria vantajoso.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Assim, um objetivo da presente invenção se refere a um processo de produção e purificação para alfa-manosidase recombinante.

Em particular, é um objetivo da presente invenção fornecer um processo de produção e purificação escalável que resolve os problemas mencionados acima da técnica anterior com o fornecimento de quantidades suficientes de alfa- manosidase de alta pureza com alta atividade enzimática, fornecendo, desse modo, um tratamento para os pacientes que sofrem de alfa-manosidose.

Assim, um aspecto da invenção se refere a um processo para a purificação de alfa-manosidase recombinante a partir de uma cultura celular, em que uma fração da dita cultura celular que compreende alfa-manosidase recombinante é submetida a cromatografia em uma resina que compreende um ligante multimodal. Verificou-se, surpreendentemente, que esse processo de purificação resultou em uma composição que compreende alfa-manosidase recombinante com pureza mais alta e uma porcentagem maior da espécie de glicoproteína desejada de 13 0 kDa do que se alcançou previamente. Alcançar porcentagens altas persistentes (como mais do que 80%) da glicoproteína não fragmentada de 130 kDa após purificação é vantajoso, já que isso fornece um produto mais uniforme em comparação com uma enzima fragmentada que, por sua vez, eleva a capacidade de obter um produto de grau farmacêutico.

Outro aspecto da presente invenção se refere a um processo para batelada alimentada ou produção contínua de alfa-manosidase recombinante, que compreende as etapas a seguir: a. inocular um reator de produção que compreende um meio de base com células que podem de produzir alfa- manosidase recombinante no dia 0, para fornecer uma cultura celular; b. adicionar um meio de alimentação à dita cultura celular pelo menos uma vez a partir do dia 1; c. ajustar a temperatura da dita cultura celular para o máximo de 35 °C, como 34 °C, 33°C, 32°C, preferencialmente, o máximo de 31°C, após o dia 3 ou quando a densidade celular viável for mais alta do que 2,1 MVC/ml, não importando qual vem primeiro.

Os inventores verificaram surpreendentemente que o processo de produção acima resultou em uma cultura celular que compreende alfa-manosidase recombinante em altos rendimentos que foi prontamente transferível para a coluna de purificação da presente invenção sem qualquer diluição.

Ainda outro aspecto da presente invenção é fornecer uma composição que compreende alfa-manosidase recombinante purificada, em que pelo menos 80% da alfa-manosidase está presente como uma glicoproteína de 130 kDa.

Um outro aspecto da presente invenção é uma composição que compreende alfa-manosidase recombinante purificada para usar no tratamento de alfa-manosidose.

Ainda outro aspecto da presente invenção é um método para tratar alfa-manosidose e/ou reduzir ou aliviar os sintomas associados à alfa-manosidose, sendo que o dito método compreende uma etapa de administrar uma composição que compreende alfa-manosidase recombinante purificada a um indivíduo com necessidade da mesma.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

A Figura 1 mostra um esboço do projeto de processo de purificação atualmente preferencial para alfa-manosidase a partir da colheita para arquivamento de substância de fármaco. A Figura 2 mostra um exemplo de um cromatograma de coluna Capto™ MMC para alfa-manosidase.

A Figura 3 mostra um exemplo de um cromatograma de coluna de butil Sepharose™ FF para alfa-manosidase. A Figura 4 mostra um exemplo de um cromatograma de coluna de CHT tipo 1 para alfa-manosidase.

A Figura 5 mostra um exemplo de um cromatograma de coluna de Q sepharose™ HP para alfa-manosidase. A Figura 6 mostra um cromatograma SDS-page da composição de alfa-manosidase purificada que indica a distribuição da espécie de glicoproteína de 130 kDa, 75 kDa e 55 kDa.

A Figura 7 mostra três diagramas de HPLC para alfa- manosidase purificada em que a quantidade de espécie de 13 0 kDa é representada em comparação com a espécie de 55 e 75 kDa. O primeiro pico a partir da esquerda é a espécie de 55 kDa, seguida pela espécie de 130 kDa e 75 kDa, respectivamente. O processo de 2 etapas acontece sem o uso de uma etapa de cromatografia de ligante multimodal, enquanto que os processos de 3 e 4 etapas usam uma etapa de cromatografia de ligante multimodal. A presente invenção será descrita agora em mais detalhes a seguir.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Definições

Antes de se discutir a presente invenção em mais detalhes, os termos e convenções a seguir serão definidos primeiro: Alfa-manosidase recombinante No contexto da presente invenção, a alfa-manosidase recombinante é definida como alfa-manosidase que, em virtude da origem ou manipulação da mesma, não é igual a todas ou uma porção das alfa-manosidades de tipo selvagem encontradas na natureza. Assim, é construída com o uso de técnicas recombinantes que envolvem moléculas de DNA recombinante, ou seja, sequências de DNA híbrido que compreendem pelo menos duas sequências de DNA fundidas, sendo que a primeira sequência normalmente não é fundida com a segunda sequência na natureza. A proteína de alfa-manosidase recombinante pode ser de origem humana ou não humana. Em particular, pode ser uma alfa-manosidase lisossômica humana recombinante (rhLAMAN) . O produto da alfa-manosidase pode ser um único polipeptídeo ou uma mistura de um único polipeptídeo e frações do mesmo. Também a alfa-manosidase pode ser submetida a modificações pós-tradução e pode, portanto, estar na forma de uma glicoproteína. Cultura celular

Uma cultura celular é o processo pelo qual as células são cultivadas em condições controladas. No presente contexto, as células da cultura celular são especificamente projetadas para expressar uma proteína de interesse, como alfa-manosidase recombinante. A cultura celular pode estar situada em um biorreator, que é especialmente projetado para permitir o controle das condições químicas e físicas. Fração No presente contexto, uma fração se refere a uma fração de uma cultura celular. A fração pode constituir toda a cultura celular, mas é frequentemente uma fração tratada da cultura, como uma fração clarificada, filtrada, concentrada, diluída ou parcialmente purificada.

Resina No contexto da presente invenção, uma resina constitui a base de uma fase estacionária em um sistema de cromatografia, em que vários grupos químicos ou substâncias são fixados para fornecer uma determinada quantidade de afinidade para uma dada molécula ou proteína de interesse. As resinas são frequentemente microesferas poliméricas com ligantes fixados de modo covalente, sendo que as ditas resinas são insolúveis nas fases móveis líquidas usadas. Ligante multimodal

Por ligante multimodal entenda-se qualquer ligante que é projetado para interagir com a molécula ou proteína de interesse de pelo menos 2 modos. As interações individuais podem ser, independentemente, hidrofóbicas, hidrofílicas, iônicas, interações de Van der Waals, ligação de hidrogênio ou qualquer outra interação física ou química intermolecular. No presente contexto, um ligante é uma substância química orgânica fixada a uma resina conforme definido acima. Um ligante multimodal terá diferentes afinidades em relação a diferentes substâncias que são passadas através da coluna de cromatografia dissolvidas em uma fase móvel. As diferenças na afinidade levam a variações no tempo de retenção das diferentes substâncias na coluna de cromatografia, possibilitando a separação das substâncias. Os tempos de retenção também são dependentes de outros fatores como, por exemplo, os constituintes da fase móvel, pH e temperatura. As resinas que compreendem ligantes multimodais são, às vezes, chamadas também de resinas de "modo misto" mas, no presente contexto, as resinas que compreendem um ligante multimodal não devem ser confundidas com as assim chamadas de "resinas de troca iônica de modo misto" que compreendem vários "ligantes" diferentes na mesma resina, que podem ter cargas opostas, como por exemplo, -OH, -Ca+ e -PO42' no caso da resina de hidroxiapatita cerâmica(CHT). Nessas resinas, os ligantes individuais não são multimodais. Carregamento

No presente contexto, carregamento se refere à transferência de uma colheita, eluato ou outra solução em um sistema cromatografico, como uma coluna de cromatografia que compreende uma resina como uma fase estacionária.

Tampão

O termo tampão é bem conhecido como uma descrição geral de uma solução que contém um ácido fraco e/ou o sal correspondente do mesmo ou uma base fraca e/ou o sal correspondente da mesma, que é resistente a mudanças no pH. No contexto da presente invenção, os tampões usados são adequados para usar em sistemas cromatográficos, tais tampões incluem, mas não se limitam a: tampões de Fosfato, por exemplo, fosfato dissódico (Na2HPO4) , fosfato de sódio ou fosfato de potássio, tampões de acetato, por exemplo, acetato de sódio ou acetato de potássio, tampões de sulfato, por exemplo, sulfato de sódio ou sulfato de potássio, sulfato de amónio ou Hepes, ou outros tampões, por exemplo, borato de sódio ou tampão tris-HCl. Ultrafiltração

Ultrafiltração é um método de separação no qual se usa pressão hidráulica para forçar moléculas e solvente através de uma membrana que compreende poros de um tamanho particular, também conhecidos como o valor ou tamanho de corte. Apenas moléculas que têm um peso molecular menor do que o valor de corte da membrana podem cruzar a membrana, enquanto aquelas com um peso molecular maior não cruzam a membrana e formam o assim chamado retentado. As moléculas presentes no retentado podem, desse modo, ser concentradas como os fluxos de solvente através da membrana.

Em uma modalidade, particular, a concentração de uma solução ou composição que compreende um polipeptídeo como alfa-manosidase pode ser realizada por Filtração de fluxo tangencial (TFF). Esse método é útil, em particular, para concentração em grande escala, isto é, para concentração de soluções com um volume a partir de um litro até várias centenas de litros. Assim, esse método é útil, em particular, para a produção de soluções concentradas de um polipeptídeo de interesse em uma escala industrial.

A técnica de TFF é realizada com base no uso de um aparelho particular que faz com que a solução que deve ser filtrada flua através de uma membrana semipermeável; apenas moléculas que são menores do que os poros da membrana passarão através da membrana, formando o material filtrado, deixando a matéria maior a ser coletada (retentado). Com o método de TFF, duas pressões diferentes são aplicadas; uma para bombear a solução no sistema e para circular a mesma no sistema (pressão de entrada) , e outra pressão é aplicada sobre a membrana (pressão de membrana) para forçar as moléculas pequenas e o solvente através da membrana. A pressão de entrada pode tipicamente estar na faixa de 1 a 3 bar (100 a 300 kPa), como entre 1,5 a 2 bar (150 a 200 kPa). A pressão transmembranar (TMP) pode tipicamente ser maior do que 1 bar (100 kPa). A composição concentrada de um polipeptídeo de interesse pode ser coletada como o retentado quando TFF é usada para concentrar a composição. Membranas úteis para TFF podem tipicamente ser feitas de celulose regenerada ou polietersulfona (PES).

Diafiltração

No presente contexto, a diafiltração é um processo de filtração em que uma espécie de interesse está no retentado, isto é, não se permite que passe através do filtro, enquanto que outros componentes como, por exemplo, tampões e sais passam através do filtro. Assim, a diafiltração pode, por exemplo, ser usada para trocar um tampão por outro ou para concentrar soluções que contêm uma espécie de interesse como alfa-manosidase recombinante.

Um primeiro aspecto da presente invenção é fornecer um processo para a purificação de alfa-manosidase recombinante a partir de uma cultura celular, em que uma fração da dita cultura celular que compreende alfa-manosidase recombinante é submetida a cromatografia em uma resina que compreende um ligante multimodal. A vantagem de usar resinas que compreendem um ligante multimodal, no presente contexto, é que essas resinas possibilitam a ligação da espécie de alfa-manosidase em soluções que têm altos níveis de condutividade. Isso tem a vantagem de que a colheita não diluída com altos níveis de condutividade pode ser usada, e nenhuma troca do tampão de colheita é necessária. A etapa de cromatografia que compreende um ligante multimodal pode, portanto, preferencialmente ser a primeira etapa de cromatografia após isolar a fração da cultura celular. A dita etapa de cromatografia que compreende um ligante multimodal pode frequentemente ser chamada de "etapa de captura", já que a proteína de interesse é inicialmente retida na coluna (isto é, capturada), enquanto muitas impurezas passam através da coluna durante as etapas de lavagem. A proteína é subsequentemente eluída com o uso de um tampão de eluição específico.

Assim, em uma modalidade da invenção um processo é fornecido, em que a fração da cultura celular que compreende a alfa-manosidase recombinante é uma colheita não diluída clarificada. No contexto da presente invenção, o termo "colheita não diluída clarificada" significa uma colheita de uma cultura celular, que é livre de sólidos ou material não dissolvido, isto é, é uma solução clara. A colheita pode ter sido submetida a um tratamento a fim de convertê-la em uma solução clara. Tais tratamentos podem incluir, mas não se limitam a: Filtração e centrifugação. Além disso, a colheita não é significativamente diluída antes da sujeição às etapas de cromatografia. Por isso, a colheita é diluída a menos do que 10%, como menos do que 7%, menos do que 5%, menos do que 2%, menos do que 1%, menos do que 0,5%, como menos do que 0,1%. Na modalidade com a máxima preferência, a colheita não é diluída.

Em outra modalidade, um processo é fornecido, em que a colheita não diluída clarificada tem uma condutividade de 10 a 20 ms/cm, como 12 a 17 ms/cm, preferencialmente, 15 ms/cm. A condutividade é medida antes do carregamento da colheita em um sistema de cromatografia.

Em uma modalidade, a dita cromatografia é realizada em uma resina que compreende um ligante multimodal, que tem um grupo ácido sulfônico ou ácido carboxílico. Os ácidos sulfônico e/ou carboxílico compreendidos nesses ligantes podem estar na forma protonada ou em uma forma desprotonada (sal) dependendo das condições no sistema cromatográfico, particularmente, do pH da fase móvel.

Em ainda outra modalidade, um processo é fornecido, em que o ligante multimodal ligado pela resina é a substância da fórmula (I), (II) ou (III):

em que R das substâncias da fórmula (II) e (III) é um grupo funcional da fórmula (IV):

O ligante multimodal representado pelo grupo funcional da fórmula (IV) é geralmente chamado de "Cibracon Blue 3G" e os exemplos de produtos comerciais representados pelas substâncias da fórmula (I) , (II) e (III) são "Capto™ MMC", "Capto™ Blue" e "Blue sepharose™ fast flow" respectivamente. Outras resinas úteis do tipo multimodal incluem: Capto™ Adhere, MEP HyperCel™, HEA HyperCel™ e PPA HyperCel™. No contexto da presente invenção, tais resinas provaram ser especialmente eficazes na purificação inicial de uma colheita não diluída que compreende alfa-manosidase recombinante.

Uma modalidade adicional da invenção fornece um processo em que a fração da dita cultura celular carregada na resina que compreende um ligante multimodal é submetida a pelo menos uma etapa de lavagem com uma solução que compreende isopropanol, preferencialmente, pelo menos 1% (V:V) de isopropanol, como pelo menos 2%, 3%, 4%, 4,5% (V:V) de isopropanol, preferencialmente, pelo menos 5% (V:V) de isopropanol. A vantagem de usar uma solução que compreende isopropanol é que a mesma fornece uma remoção melhor de proteínas de células hospedeiras indesejadas (HCP's), especificamente, ajuda a remover uma protease responsável pela degradação proteolítica da espécie de rhLAMAN de 130 kDa. HCP's devem ser entendidas como proteínas endógenas à célula hospedeira usada na cultura celular durante a produção. Embora o isopropanol seja preferencial, outros álcoois úteis para esse processo incluem etanol, n-propanol e n-butanol.

Em ainda outra modalidade, um processo é fornecido, em que o pH da solução usada para a etapa de lavagem está na faixa de pH 3,5 a 6,5, como pH 4,0 a 6,0, pH 4,5 a 5,5, preferencialmente, pH 4,7 a 5,0.

Outra modalidade fornece um processo em que a solução usada para a etapa de lavagem compreende um tampão de acetato, preferencialmente, em uma concentração na faixa de 0.05 a 1,6 M, como 0,1 a 1,5 M, 0,5 a 1,4 M, 0,7 a 1,3 M, 0,8 a 1,2 M, 0,9 a 1,1 M, preferencialmente, 0,95 M. O tampão de acetato pode, preferencialmente, ser selecionado a partir do grupo que consiste em acetato de sódio, acetato de potássio, acetato de lítio, acetato de amónio.

Ainda outra modalidade fornece um processo em que um primeiro eluato que compreende alfa-manosidase recombinante é eluído a partir da resina que compreende um ligante multimodal com o uso de uma solução aquosa que compreende etileno glicol ou propileno glicol. Verificou-se que a adição de etileno glicol ao tampão de eluição eleva significativamente o rendimento de alfa-manosidase recombinante eluída. O propileno glicol também elevou o rendimento, mas o etileno glicol é preferencial.

Uma modalidade fornece um processo em que a concentração de etileno glicol ou propileno glicol na solução aquosa é de 20 a 60%, 20 a 50%, 25 a 50%, 30 a 50%, 35 a 45%, como 40%.

Em uma modalidade preferencial, um processo é fornecido, em que a solução aquosa que compreende etileno glicol ou propileno glicol compreende cloreto de sódio. Verificou-se que a adição de cloreto de sódio a essa solução eleva significativamente os rendimentos promovendo a eluição da enzima rhLAMAN.

Em outra modalidade, a concentração de cloreto de sódio na solução aquosa que compreende etileno glicol ou propileno glicol está na faixa de 0,2 a 2,4 M, como na faixa de 0,4 a 2,2 M, 0,6 a 2,0 M, 0,8 a 1,9 M, 1,0 a 1,8 M, 1,2 a 1,7 M, 1,4 a 1,6 M, preferencialmente, 1,5 M. Alternativamente, a concentração de cloreto de sódio pode estar na faixa de 0,2 a 1,6 M ou na faixa de 1,4 a 2,4 M.

Em uma modalidade preferencial, a solução aquosa que compreende etileno glicol ou propileno glicol compreende um tampão. 0 dito tampão pode, preferencialmente, ser um tampão de fosfato, como fosfato de sódio ou fosfato de potássio. Embora tampões de fosfato sejam preferenciais, tampões úteis adicionais para a solução aquosa incluem tampões de borato e citrato, tampões de Tris, MES, MOPS e Hepes.

Em outra modalidade preferencial, a concentração dos sais de tamponamento na solução aquosa que compreende etileno glicol ou propileno glicol é 50 a 350 mM, 55 a 300 mM, 65 a 280 mM, 70 a 250 mM, 75 a 200, 80 a 200 mM, 85 a 150 mM, preferencialmente 90 mM.

Em ainda outra modalidade preferencial, o pH da solução aquosa que compreende etileno glicol ou propileno glicol é pH 7,0 a 9,0, como pH 7,1 a 8,5, pH 7,2 a 8,3, pH 7,5 a 8,0, preferencialmente, pH 7,7.

Em uma modalidade, um processo é fornecido, em que um primeiro eluato que compreende alfa-manosidase obtido a partir da resina que compreende um ligante multimodal é adicionalmente submetido a um processo que compreende as etapas de i) aplicar uma fração que compreende alfa- manosidase a uma resina de cromatografia de interação hidrofóbica para fornecer um eluato que compreende a alfa- manosidase recombinante, ii) passar uma fração que compreende alfa- manosidase através de uma resina de troca iônica de modo misto para permitir a retenção de contaminantes para fornecer um fluxo passante que compreende a alfa-manosidase recombinante; e iii) submeter uma fração que compreende alfa- manosidase a cromatografia em uma resina de troca aniônica para fornecer um eluato que compreende a alfa-manosidase recombinante.

Em uma modalidade, um processo é fornecido e envolve as etapas i) a iii) conforme descrito acima, em que a fração na etapa i) foi submetida a purificação na dita resina que compreende um ligante multimodal, a fração da etapa ii) é derivada do eluato da etapa i) , e a fração da etapa iii) é derivada do fluxo passante da etapa ii). Em outras palavras, as etapas i) a iii) são realizadas na ordem em que estão listadas, entretanto sem impedir etapas intermediárias entre as etapas i) e iii) . Essas podem ser etapas de purificação intermediárias e/ou etapas de redução de vírus ou de remoção de vírus.

Em uma modalidade preferencial, a resina de cromatografia de interação hidrofóbica da etapa i) é uma resina substituída por alquila, preferencialmente, resina butil sepharose. Resinas substituídas por alquila podem incluir resinas etil, butil e octil sepharose. Além disso, resinas fenil sepharose também são aplicáveis. Exemplos de tais resinas são Butyl-S Sepharose™ 6 Fast Flow, Butyl Sepharose™ 4 Fast Flow, Octyl Sepharose™ 4 Fast Flow, Phenyl Sepharose™ 6 Fast Flow (high sub) e Phenyl Sepharose™ 6 Fast Flow (low sub), Butyl Sepharose™ High Performance, Phenyl Sepharose™ High Performance. A vantagem de uma etapa de purificação que envolve resinas que interagem de modo hidrofóbico e, particularmente, a resina butil sepharose, é a remoção eficaz das proteínas da célula hospedeira e resíduos de DNA, enquanto se retém bom rendimento da enzima rhLAMAN.

Em ainda outra modalidade, a etapa i) compreende pelo menos uma etapa de lavagem, em que a solução usada para lavar compreende um tampão de fosfato e um tampão de acetato, preferencialmente, fosfato de sódio e acetato de sódio. Essa etapa de lavagem de tampão dual provou ser especialmente eficaz na remoção de impurezas como proteínas da célula hospedeira e resíduos de DNA.

Em ainda outra modalidade, a concentração de tampão de fosfato na lavagem de tampão dual da etapa i) está na faixa de 5 a 40 mM, como 10 a 30 mM, 15 a 25 mM, preferencialmente, 20 mM, e a concentração de tampão de acetato está na faixa de 0,9 a 1,5 M, como 1,0 a 1,4 M, 1,1 a 1,3 M, preferencialmente 1,2 M.

Em outra modalidade, a etapa i) compreende pelo menos uma etapa de lavagem, em que a solução usada para lavar compreende não mais do que um tampão, preferencialmente, um tampão de fosfato, preferencialmente, fosfato de sódio.

Em outra modalidade, o um tampão da pelo menos uma etapa de lavagem que compreende não mais do que um tampão está presente em uma concentração na faixa de 0,4 a 0,8 M, como 0,5 a 0 a 7 M, preferencialmente, 0,6 M.

Em uma modalidade, um processo é fornecido em que a resina de troca iônica de modo misto da etapa ii) é uma resina de fluoropatita ou hidroxipatita cerâmica, preferencialmente, resina de hidroxipatita cerâmica tipo I (CHT I) . Mostrou-se que a aplicação dessa etapa de cromatografia separa de modo eficaz a uma quantidade significativa de impurezas de DNA da composição de alfa- manosidase recombinante e liga as proteínas da célula hospedeira enquanto o produto da enzima rhLAMAN passa pela coluna sem ligação.

Em outra modalidade, a resina de troca aniônica da etapa iii) é uma resina de troca aniônica forte, como uma resina de troca aniônica forte de amónio quaternário. Tais resinas estão incluídas mas não se restringem aos exemplos a seguir: Q-sepharose™ HP, Q-sepharose™ FF, DEAE-sepharose , Capto™ Q, Uno™ Q, ANX sepharose™.

Em ainda outra modalidade, um processo é fornecido, em que uma etapa de desativação de vírus é realizada, preferencialmente, em entre a etapa ii) e a etapa iii).

Em uma modalidade preferencial, a etapa de desativação de vírus compreende misturar o fluxo passante da etapa ii) com uma solução aquosa de isopropanol (1:1 V/V de fluxo passante/isopropanol aquoso) para pelo menos 2 horas, preferencialmente, seguida pela concentração por ultrafiltração e remoção de isopropanol com o uso de diafiltração. O isopropanol aquoso durante a desativação pode estar na faixa de 10 a 50% de isopropanol, como 20 a 40%, 25 a 35%, 28 a 32%, preferencialmente, 30% de isopropanol. A solução de 1:1 V/V de fluxo passante e isopropanol aquoso, assim, tem uma concentração final de isopropanol de 15%.

Outra modalidade preferencial é um processo em que uma etapa de redução de vírus é realizada, preferencialmente, após a etapa de cromatografia iii).

Em uma modalidade, a etapa de redução de vírus compreende a filtração de uma solução que compreende alfa- manosidase recombinante, preferencialmente, o eluato da etapa iii) , através de um filtro, preferencialmente, um filtro de remoção de vírus, como um filtro ultipor™ VF grade DV20, ou um filtro planova™ 15N ou 20N, Preferencialmente um filtro Planova™ 15N é usado.

O processo de purificação da presente invenção pode vantajosamente ser realizado em uma grande escala, assim, nas modalidades preferenciais, o processo é realizado em colunas de cromatografia que têm um volume de coluna de pelo menos 0,5 1, como pelo menos 1,0 1, 2,0 1, 5,0 1, 10 1, preferencialmente, pelo menos 13,0 1.

Em outra modalidade da presente invenção, o processo de purificação conforme descrito acima é fornecido, em que a alfa-manosidase tem uma sequência selecionada a partir de: A) a sequência apresentada em SEQ ID NO 2 B) um análogo da sequência em A C) uma subsequência da sequência em A) ou B)

Em que a sequência descrita por SEQ ID NO 2 representa a sequência de aminoácido para a alfa-manosidase lisossômico humana recombinante (rhLAMAN) como fornecido em WO 02/099092. 0 termo "subsequência" significa um fragmento da sequência parental que tem um tamanho de não menos do que 50% da sequência parental, como não menos do que 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou não menos que 95% da sequência parental. Consequentemente, as subsequências em questão devem ter um comprimentc 3 de 505 a 1009 resíduos de aminoácidos consecutivos, como de 525 a 1009, de 550 a 1009, 575 a 1009, 600 a 1009, 625 a 1009. 650 a 1009, 675 a 1009, 700 a 1009, 725 a 1009, 750 a 1009, 775 a 1009, 800 a 1009, 825 a 1009. 850 a 1009, 875 a 1009, 900 a 1009, 925 a 1009, 950 a 1009, 975 a 1009, 980 a 1009, 990 a 1009 ou como de 1000 a 1009 resíduos de aminoácidos consecutivos. Além disso, as subsequências relevantes de SEQ ID NO: 2 ou análogas das mesmas devem reter o sítio catalítico. Apesar de a estrutura 3D de LAMAN humana ser conhecida, a estrutura 3D da LAMAN bovina foi reportada e baseada nos dados, e foi concluído que os seguintes aminoácidos participam no sítio ativo e/ou são responsáveis por coordenar o átomo Zn2+ exigido para atividade também em LAMAN humana: AA 72=H, AA 74=D, AA 196=D, AA 446=H (Base de dados UniProtKB/Swiss-Prot: 000754, MA2B1_HUMAN_, Heikinheimo et al. J. Mol. Biol. 327, 631 a 644, 2003). Foi mostrado que mutações de AA 72 e 196 em LAMAN humana resultam em perda quase completa de atividade enzimática (Hansen et al., Biochem. J. (2004), 381, pp. 537 a 567). Para exibir atividade, uma subsequência da rhLAMAN deve reter pelo menos as regiões contendo os quatro aminoácidos acima.

Preferencialmente, as subsequências de rhLAMAN também compreendem uma ou mais partes conformacionais adicionais, que incluem, por exemplo, sítios de ligação, voltas beta, pontes dissulfureto, códons de parada e outros. Na forma humana de LAMAN existem diversas doenças que causam mutações que indicam importância para o aminoácido particular, por exemplo, AA 53, 72, 77, 188, 200, 355, 356, 359, 402, 453, 461, 518, 563, 639, 714, 750, 760, 801, 809, 916 (The human ® - gene mutation database, HMDG professional, Cardiff University, 2009) e existem também aminoácidos que são de importância para glicosilações, que incluem AA 133, 310, 367, 497, 645, 651, 692, 766, 832, 930 e 989 e aminoácidos envolvidos em pontes dissulfureto como AA 55+358, 268+273, 412+472 e 493+501.

"Análoga" significa uma sequência com uma determinada porcentagem de identidade de sequência com a sequência parental, isso pode ser pelo menos 60% de identidade de sequência, como pelo menos 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou preferencialmente 99% de identidade de sequência. Será entendido que os análogos e subsequências demonstradas acima são preferencialmente equivalentes de maneira funcional à alfa-manosidase que tem a sequência de aminoácido demonstrada em SEQ ID NO: 2 no sentido que elas podem exercer substancialmente a mesma atividade enzimática.

O termo "substancialmente a mesma atividade enzimática" refere-se a uma parte equivalente ou análoga que tem pelo menos 50%, preferencialmente pelo menos 60%, mais preferencialmente pelo menos 70%, mais preferencialmente pelo menos 75%, mais preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 95% e com o máximo de preferência, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% da atividade da enzima natural. Um exemplo de um análogo equivalente de maneira funcional da enzima pode ser uma proteína de fusão que inclui o sítio catalítico da enzima em uma forma funcional, mas pode também ser um variante homólogo da enzima derivada de outra espécie. Além disso, moléculas completamente sintéticas que imitam a atividade enzimática específica da enzima relevante devem constituir "análogos equivalentes de maneira funcional". Análogos não humanos de LAMAN são geralmente não aplicáveis para terapia visto que eles podem induzir potencialmente a formação de anticorpos no paciente e causar doença. Análogos humanos, contudo podem ser úteis em terapia de substituição enzimática, quando as mutações não são doenças que causam e não diminuem a atividade enzimática desejada de maneira significante. Exemplos de tais mutações são: His70Leu, Gln240Arg, Ser250Ala, Leu278Val, Ser282Pro, Thr312Ile, Ala337Arg, Ser413Asn, Ser481Ala, Gln582Glu, Arg741Gly, Thr873Pro (Fonte: http://www.ensembl.org; transcript ID ENST00000456935). Além disso, Pro669Leu e Asp402Lys são conhecidos pelos inventores por não causar doença.

Geralmente, técnicos no assunto poderão prontamente inventar ensaios apropriados para a determinação de atividade enzimática. Para LAMAN, um ensaio de atividade enzimática apropriado é revelado em WO 02/099092 página 26, linhas 8-28. Brevemente, o seguinte procedimento pode ser realizado para triar propósitos usando as placas de 96 cavidades de fundo plano: 75 μl de tampão de ensaio de 4X (8 mM de p-Nitrofenil- alfa-D-manopiranosídeo, 2 mg/ml BSA, 0,4 M Na Acetato (pH 4,5) é adicionado a 75 μl de amostra ou uma diluição apropriada da mesma (em 10 mM Tris pH 7,4 contendo 150 mM de NaCl + 10% de superbloco) . As placas são incubadas em 37°C por 3 0 min e interrompidas com 75 μl de 1,8 M Na2CO3 e a absorbância gravada em 4 05 nm em um leitor de placa. As placas de 96 cavidades são lidas em um espectrofotômetro. A atividade específica é definida como μmoles de p-Nitrofenil- alfa-D-manopiranosídeo hidrolisado por minuto por mg proteína.

Como comumente definido, "identidade" é aqui definido como a identidade de sequência entre genes ou proteínas no nível de nucleotídeo ou aminoácido, respectivamente. Dessa forma, no presente contexto "identidade de sequência" é uma medida de identidade entre proteínas no nível de aminoácido e uma medida de identidade entre ácidos nucleicos em nível de nucleotídeo. A identidade de sequência de proteína pode ser determinada por comparar a sequência de aminoácido em uma dada posição em cada sequência quando as sequências são alinhadas. Se maneira semelhante, a identidade de sequência de ácido nucleico pode ser determinada por comparar a sequência de nucleotídeo em uma dada posição em cada sequência quando as sequências são alinhadas.

Para determinar a porcentagem de identidade de duas sequências de aminoácidos ou de dois ácidos nucleicos, as sequências são alinhadas para propósitos de comparação ideal (por exemplo, lacunas podem ser introduzidos na sequência de uma primeira sequência de aminoácido ou ácido nucleico para alinhamento ideal com uma segunda sequência amino ou ácido nucleico). Os resíduos de aminoácido oü nucleotídeos em posições de aminoácido correspondentes ou posições de nucleotídeo são então comparados. Quando uma posição na primeira sequência é ocupada pelo mesmo resíduo de aminoácido ou nucleotídeo como a posição correspondente na segunda sequência, então as moléculas são idênticas em tal posição. A porcentagem de identidade entre as duas sequências é uma função do número de posições idênticas compartilhado pelas sequências (ou seja, % de identidade = # de posições idênticas/total de # de posições (por exemplo, posições sobrepostas) x 100) . Em uma modalidade, as duas sequências são do mesmo comprimento.

Uma forma é alinhar manualmente as sequências e contar o número de aminoácidos idênticos. Alternativamente, o alinhamento de duas sequências para a determinação de porcentagem de identidade pode ser cumprido usando um algoritmo matemático. Tal algoritmo é incorporado nos programas NBLAST e XBLAST. Pesquisas de nucleotídeo NBLAST e XBLAST podem ser realizadas com o programa NBLAST, classificação = 100, comprimento de palavra = 12, para obter sequências de nucleotídeo homólogas a uma moléculas de ácido nucleico da invenção. Pesquisas de proteína BLAST podem ser realizadas com o programa XBLAST, classificação = 50, comprimento de palavra = 3 para obter sequências de aminoácidos homólogas a uma molécula de proteína da invenção. Para obter alinhamentos incompletos para propósitos de comparação, o Gapped BLAST pode ser utilizado.

Alternativamente, PSI-Blast pode ser usado para realizar uma pesquisa iterada, que detecta relacionamentos distantes entre moléculas. Quando utiliza os programas NBLAST, XBLAST, e Gapped BLAST, os parâmetros padrão dos respectivos programas podem ser usados. Consulte, http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Alternativamente, a identidade de sequência pode ser calculada após as sequências terem sido alinhadas, por exemplo, pelo programa na base de dados EMBL (www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST). Geralmente, as definições padrão em relação a, por exemplo, "matriz de classificação" e "penalidade de lacuna" podem ser usadas para alinhamento. No contexto da presente invenção, as definições padrão de BLASTN e PSI BLAST podem ser vantajosas.

A porcentagem de identidade entre duas sequências pode ser determinada usando técnicas semelhantes àquelas descritas acima, com ou sem permitir lacunas. Ao calcular a porcentagem de identidade, apenas combinações exatas são contadas.

Outra modalidade da presente invenção é uma composição que compreende alfa-manosidase obtenível pelo processo de purificação descrito acima.

Em um segundo aspecto da presente invenção um processo é fornecido para produção por batelada alimentada ou contínua de alfa-manosidase recombinante, que compreende as seguintes etapas: a. inoculação de um reator de produção que compreende um meio de base com células que podem produzir alfa-manosidase recombinante no dia 0, para fornecer uma cultura celular; b. adição de um meio de alimentação à dita cultura celular pelo menos uma vez do dia 1; c. ajuste da temperatura da dita cultura celular em, no máximo 35°C, como 34°C, 33°C, 32°C, preferencialmente no máximo 31°C, ou após o dia 3 ou quando a densidade celular viável é mais alta do que 2,1 MVC/ml, o que vier primeiro.

No processo acima, o dia de inoculação é definido como o dia 0, e o dia seguinte é o dia 1 e assim por diante. A temperatura de início usada do dia 0 até o ajuste descrito no ponto c está na faixa de 36 a 37°C, preferencialmente 3 6,5°C. Deve ser entendido que as temperaturas mencionadas acima são temperaturas de medida real, pontos não definidos, ou seja, na configuração de biorreator usada para a presente invenção, a temperatura de 31°C mencionada acima exigiu um ponto definido de temperatura de 32 °C. Igualmente, uma temperatura de 36,5°C exige uma temperatura de ponto definido de 37°C.

Células hospedeiras adequadas para a expressão e produção de alfa-manosidase recombinante são derivadas de organismos multicelulares, preferencialmente de mamíferos. Em particular, as células usadas para produzir alfa-manosidase recombinante podem ser selecionadas do grupo que consiste em linhagem CVI de rim de macaco transformada por SV40 (COS-7); linhagem de rim embrionário humano (293 ou 293 células subclonadas para crescimento em cultura em suspensão); células de rim de hamster bebê (BHK); Células de ovário de hamster chinês/-DHFR (CHO); células de Sertoli de camundongo (TM4) ; células de rim de macaco (CV I) ; células de rim de macaco verde africano (VERO-76); células de carcinoma cervical humano (HELA); células de rim canino (MDCK); Células de fígado de rato búfalo (BRL 3A) ; células de pulmão humano (W138); Células de fígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamário de camundongo (MMT 060562); células TRI; células MRC 5; FS4 células; e uma linhagem de hepatoma humano (Hep G2) . Linhagens de célula de inseto ou células de fibroblastos humanos estão também disponíveis como células hospedeiras adequadas.

A produção de alfa-manosidase recombinante é obtida usando células transfectadas com um construto de ácido nucleico apropriado usando técnicas conhecidas aos técnicos no assunto. Em particular, o construto de ácido nucleico pode compreender uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo que consiste em: i) a sequência de ácido nucleico demonstrada em SEQ ID NO: 1; e ii) uma sequência de ácido nucleico que codifica uma subsequência ou análogo da sequência demonstrada em SEQ ID NO 2 como fornecido acima.

As células podem preferencialmente ser de uma linhagem celular de ovário de hamster chinês de rLAMAN (CHO) desenvolvidas especialmente com o propósito de produzir a enzima recombinante como descrito em WO 02/099092. Uma cultura dessa linhagem celular DSM ACC2549 que foi depositada em DSMZ GmbH, Maschroderweg 1b, D-38124 Braunschweig, Alemanha, com o propósito de depósito de patente de acordo com o Tratado de Budapeste em 6 de Junho de 2002. Essa célula pode ser obtida usando um plasmídeo de expressão pLamanExpl que tem a sequência mostrada em SEQ ID NO 1.

O processo das etapas a a c pode ainda compreender a seguinte etapa: d. Um processo para purificação de alfa-manosidase recombinante da dita cultura celular, em que uma fração da dita cultura celular que compreende alfa-manosidase recombinante é submetida a cromatografia em uma resina que compreende um ligante multimodal que tem um grupo ácido carboxílico ou ácido sulfônico, como descrito acima.

Ainda em outra modalidade, a cultura celular usada no processo de produção é essencialmente livre de quaisquer suplementos derivados de animais, como suplementos de óleo de fígado de bacalhau. Ao evitar o uso de tais suplementos, é reduzido o risco de contaminação viral no produto enzimático final.

Em uma modalidade preferencial do processo de produção, a colheita não diluída da produção por batelada alimentada ou contínua tem uma concentração de alfa- manosidase de pelo menos 0,1 g/1, como pelo menos 0,2 g/1, 0,3 g/1, 0,4 g/1, preferencialmente pelo menos 0,5 g/1.

Em outra modalidade, a colheita não diluída da produção por batelada alimentada ou contínua tem uma atividade enzimática na faixa de 3 a 35 U/ml, como 5 a 35 U/ml, 7 a 35 U/ml, preferencialmente na faixa de 10a 35 U/ml. Deve ser entendido que ainda sob otimização de processo, a atividade enzimática da colheita pode se tornar ainda mais alta do que 35 U/ml.

O processo de produção pode vantajosamente ser realizado em uma ampla escala. Então, em um processo da modalidade, a produção por batelada alimentada ou contínua é realizada em um volume de pelo menos 30 1, como pelo menos 50 1, 75 1, 100 1, 150 1, 200 1, preferencialmente pelo menos 250 1.

Em outra modalidade da presente invenção, um processo de produção, como descrito acima, é fornecido, visto que a alfa-manosidase tem uma sequência selecionada a partir de: A) a sequência demonstrada em SEQ ID NO 2 B) um análogo da sequência em A C) uma subsequência da sequência em A) ou B)

Outra modalidade da presente invenção é uma composição que compreende alfa-manosidase obtenível pelo processo de produção descrito acima. Tais composições podem, em modalidades preferenciais, compreender ingredientes de produto ativo adicionais (API), adjuvantes, e/ou excipientes.

Em um terceiro aspecto da presente invenção, uma composição é fornecida por compreender alfa-manosidase recombinante purificada, em que pelo menos 80% da alfa- manosidase está presente como 130 kDa de glicoproteína.

Em uma modalidade preferencial, a composição que compreende alfa-manosidase recombinante purificada é fornecida, visto que a alfa-manosidase recombinante se mantém estável em solução líquida por pelo menos 4 dias quando armazenada em +5°C ou por pelo menos 24 meses quando armazenada em -20°C.

A composição atualmente preferencial para a solução de tampão de fórmula para o produto de enzima de rhLAMAN é descrita abaixo e as estabilidades alcançadas são também listadas: Na2HPO4 3,50 mM (Fosfato de sódio dibásico) NaH2PO4 0,17 mM (Fosfato de sódio monobásico) Glicina de 27 mM Manitol de 250 mM pH 7,70, 290 mOsm/kg (solução isotônica) Estabilidade em uso: Solução estável +5°C - 4 dias +20°C - 6 horas -20°C - 24 meses Liofilizada +5°C - 24 meses

Em outra modalidade da presente invenção, uma composição como descrito acima é fornecida, em que a alfa- manosidase tem uma sequência selecionada a partir de: A) a sequência demonstrada em SEQ ID NO 2 B) um análogo da sequência em A C) uma subsequência da sequência em A) ou B)

Outra modalidade preferencial é a composição acima que compreende alfa-manosidase recombinante purificada para uso como um medicamento.

Ainda em uma modalidade, a composição acima que compreende alfa-manosidase recombinante purificada é para uso no tratamento de alfa-manosidose.

Ainda outra modalidade é o uso da composição acima que compreende alfa-manosidase recombinante purificada para a preparação de medicamento para o tratamento de alfa- manosidose.

Outra modalidade é um método de tratar alfa- manosidose e/ou reduzir ou aliviar os sintomas associados com alfa-manosidose, sendo que o dito método compreende uma etapa de administrar uma composição que compreende uma alfa- manosidase recombinante purificada, como fornecido acima a um indivíduo em necessidade da mesma.

Deve ser notado que modalidades e recursos descritos no contexto de um dos aspectos da presente invenção também se aplicam a outros aspectos da invenção.

Todas as referências de patentes e não patentes citadas no presente pedido, são então incorporadas a título de referência em sua totalidade.

A invenção será agora descrita em detalhes adicionais nos seguintes exemplos não limitantes.

Exemplos

Abreviações usadas: CIP: Limpar no lugar CV: Volume de coluna Cv: Densidade celular viável DF: Diafiltração DO: Oxigênio dissolvido IPA: Isopropanol MVC/ml: 106 células viáveis / ml NaPi: Fosfato de sódio NaAc: Acetato de sódio OD: Densidade óptica EG: etileno glicol TFF: Filtração de fluxo tangencial TMP: Pressão transmembrana UF: Ultrafiltração

Exemplo 1 - Procedimento de purificação geral atualmente preferencial O procedimento de purificação para obter os rendimentos ideais e purezas para alfa-manosidase no contexto da presente invenção é como descrito abaixo. As condições padrão para regeneração e limpeza de resinas são usadas, como prescrito para a resina individual (consulte também os exemplos 2 a 5). As resinas usadas estão disponíveis em GE healthcare life sciences e BioRad. • Fornecer fração de uma colheita de uma produção de alfa-manosidase, e clarear a fração sem diluição significante. Preferencialmente nenhuma diluição é feita no total. • Realizar uma etapa de captura que envolve cromatografia de coluna da fração acima em uma resina que compreende um ligante multimodal. Essas resinas são selecionadas do grupo que consiste em: Capto™ MMC, Capto™ Adhere, PlasmidSelect™ Xtra, Capto™ Blue, Blue Sepharose™ Fast Flow resin, MEP HyperCel™, HEA HyperCel™ e PPA HyperCel™.

Diversas lavagens são realizadas em pH 4,5 a 8,5, e os tampões de lavagem são selecionados do grupo que consiste em: acetato de sódio, acetato de potássio, acetato de amónio, fosfato de sódio, fosfato de potássio, sulfato de sódio, sulfato de potássio, sulfato de amónio, MES, MOPS, Hepes, borato de sódio, tris-HCl, tampão de citrato ou combinações dos mesmos (grupo de tampão A, doravante). Em pelo menos uma lavagem, contudo, a solução de lavagem compreende isopropanol e o pH está entre pH 4 a 6. 0 tampão de eluição é selecionado do grupo de tampão A, e a solução de eluição compreende etileno glicol. A eluição pH é mantida em pH 7,0 a 8,5. • Realizar uma etapa intermediária ativa que envolve cromatografia de coluna de uma composição que compreende alfa-manosidase em uma resina de interação hidrofóbica. Essas resinas são selecionadas do grupo que consiste em: Butyl-S Sepharose™ 6 Fast Flow, Butyl Sepharose™ 4 Fast Flow, Octyl Sepharose™ 4 Fast Flow, Phenyl Sepharose™ 6 Fast Flow (high sub) e Phenyl Sepharose™ 6 Fast Flow (low sub), Butyl Sepharose™ High Performance, Phenyl Sepharose™ High Performance.

Diversas lavagens são realizadas em pH 7 a 8. Os tampões de lavagem são selecionados do grupo de tampão A. O tampão de eluição é também selecionado do grupo de tampão A e a eluição de pH está entre pH 7 e 8. • Realizar uma etapa intermediária passiva que envolve cromatografia de coluna de uma composição que compreende alfa-manosidase em uma resina de troca de íon de modo misto para fornecer um fluxo passante. Essas resinas são selecionadas do grupo que consiste em: resina de cerâmica de hidroxiapatita tipo I ou II (preferencialmente tipo I) , ou fluoroapatita. Uma lavagem é realizada para fornecer um fluxo passante em pH 7 a 8. 0 tampão de lavagem é selecionado de grupo de tampão A. • Realizar uma etapa de polimento que envolve cromatografia de coluna de uma composição que compreende alfa-manosidase em uma resina de troca de ânion. Essas resinas são selecionadas do grupo que consiste em: Q- sepharose™ HP, Q-sepharose™ FF, DEAE-sepharose™, Capto™ Q, Uno™ Q, ANX sepharose™.

Diversas lavagens são realizadas em pH 7 a 8. Os tampões de lavagem são selecionados do grupo de tampão A e tampão TRIS-HC1. O tampão de eluição é também selecionado de grupo de tampão A e a eluição de pH é mantida entre pH 7 e 8. • Realizar uma etapa de desativação de vírus por trazer uma solução da alfa-manosidase em contato com isopropanol.

Realizar uma etapa de remoção de vírus usando nano-f i1tração. As razões de rendimentos e componentes de produto para a composição purificada que compreende alfa-manosidase de acordo com a presente invenção são mostradas na tabela 1 abaixo, em comparação a métodos anteriores, em que:

Método 1 é: 0 método atualmente preferencial de acordo com a presente invenção. Método 2 é: Semelhante ao método 1 sem uma etapa de polimento. Além disso, é fornecido sem as etapas de lavagem que compreende isopropanol para a etapa de captura e com menos lavagens na etapa intermediária ativa, e finalmente, sem as etapas de desativação de vírus/remoção. Método 3 é: Como descrito em WO 02/099092 (ligantes multimodais não usados). Tabela 1: rendimentos e purezas resultantes de procedimentos de purificação passados e atuais

Consulte também o exemplo 10 e a figura 7.

Exemplo 2 - Etapa de captura cromatográfica usando um ligante multimodal

Colheita clarificada não diluída que compreende alfa-manosidase ligada por interação de modo misto a uma resina de tipo de ligante multimodal como Capto MMC, como usado nesse exemplo. 0 aumento de sal e adição de etileno glicol elui o produto. A capacidade de Capto™ MMC foi de 260 U/ml de resina. 0 estágio de captura foi realizado usando as seguintes etapas: • Regenerar a coluna com 1 a 2 volumes de colunas (CV) de 3 M de NaCl, pH 10 a 12 em 300 cm/hora. • Equilibrar com 5 CV de 50 mM de tampão de fosfato de sódio (NaPi), 0,15 M de NaCl pH 7,5 em 300 cm/hora. • Carregar colheita clarificada não diluída (condutividade de ~15 mS/cm) em 300 cm/hora. • Lavagem 1: 4 CV de tampão de equilíbrio. • Lavagem 2: 3 CV de 0,95 M de NaAc, 5% (v:v) de isopropanol, pH 4,9 em 300 cm/hora. • Lavagem 3: 4 CV de tampão de equilíbrio (até a linha de base estável, -0,06 Au com 5 mm de célula de fluxo) de tampão de equilíbrio em 300 cm/hora. • Eluir o produto com 6 CV de 1,5 M de NaCl, 40% de etileno glicol em 90 mM de NaPi, pH 7,7 no máximo 120 cm/hora. Iniciar a coleta quando a absorbância aumentar (cerca de 10 mAu da nova linha de base). Coletar -4 CV. • Regenerar a coluna, como acima, com 3 CV, direção de fluxo descendente, máximo de 120 cm/hora. • Limpar no lugar (CIP) e higienizar, preferencialmente com direção do fluxo ascendente, com 3 CV H2O, 3 CV 1 M NaOH (-60 minutos de tempo de contato) , 2 a 3 CV de tampão de fosfato, pH de -7,3 CV 20 mM de fosfato de sódio + 20% de etanol. Armazenar em 20 mM de fosfato de sódio + 20% de etanol. • Tabela 2 mostra um exemplo de um esquema de purificação. A Tabela 3 resume a etapa. A Figura 2 mostra um exemplo de um cromatograma para essa etapa.

Tabela 2: Esquema de purificação de estágio de captura: Capto™ MMC embalado em uma coluna de 13,5 x 2 ml (27 ml) XK 16 (continuado na próxima página)

Tabela 3: Sumário de condições para estágio de captura de Capto™ MMC

Exemplo 3=Etapa ativa intermediária cromatografica usando interação hidrofóbica

O produto do estágio de captura que compreende ligações de alfa-manosidase por interações hidrofóbicas após adição de sulfato de sódio para resinas do tipo de interação hidrofóbica, como Butyl Sepharose™ 4 FF, como usado nesse exemplo. A redução da concentração de sal elui o produto. A capacidade era de 195 U/ml de resina. As seguintes etapas foram usadas no estágio ativo intermediário: • Regenerar a coluna com 1 CV 20 mM de tampão de fosfato de sódio (NaPi), pH 7,5 em 100 cm/hora. • Equilibrar a coluna com 5 CV 0,5 M de Na2SO4, 20 mM de NaPi, pH 7,5 em 150 cm/hora. • Misturar o agrupamento do produto da etapa 1 com o mesmo volume de 20 mM de NaPi, 0,8 M de Na2SO4, pH 7,5 e carregá-lo na coluna em 70 cm/hora. A mistura pode ser realizada em linha ou no máximo 3 horas antes do carregamento começar. A mistura de 1:1 volume:volume (v:v) corresponde a aproximadamente 1,11:1, peso:peso (w:w) (eluição:tampão de sulfato de sódio). Se necessário a carga condicionada deve ser filtrada através de filtro de 0,45 μm (PES ou PVDF hidrofílico) antes do carregamento. • Lavar a coluna com 3 CV de tampão de equilíbrio em 70 cm/hora para remover etileno glicol, em adição a proteínas de célula hospedeira, da etapa anterior. • Lavar com 3,5 CV de 20 mM de NaPi, 1,2 M de NaAc, pH 7,5 em 100 cm/hora. • Lavar com 3,5 CV de 0,6 M de NaPi, pH 7,0 em 150 cm/hora.

Eluir o produto com 4 CV de 60 mM NaPi, pH 7,5 em 150 cm/hora. Coletar o pico do aumento inicial de absorbância até a linha de base ser alcançada, -2 CV. • Regenerar a coluna com 2 CV 20 mM de NaPi, pH 7,5 seguida por 3 CV de H2O em 150 cm/hora. • Limpar e higienizar com 3 CV 1 M NaOH (60 min de tempo de contato), 1 CV H2O, 1 a 3 CV de tampão de fosfato e 2 CV 20 mM de fosfato de sódio + 20% de etanol. Armazenar em 20 mM de fosfato de sódio + 20% de etanol.

A Tabela 4 mostra um exemplo de um esquema de purificação. A Tabela 5 resume a etapa. A Figura 3 mostra um exemplo de um cromatograma para essa etapa.

Tabela 4: Esquema de purificação ativo intermediário usando Butyl Sepharose™ 4FF embalado em uma coluna de 13,5 cm x 2 cm2 (27 ml) XK 16 (continuado na 15 próxima página).

Tabela 5: Sumário de condições para etapa de Butyl Sepharose™ 4FF.

Exemplo 4 - Etapa passiva intermediária cromatografica usando troca de íon de modo misto

Dois eluatos que compreendem alfa-manosidase da etapa ativa intermediária foram agrupados e misturados em 1:1 5 (peso: peso) com água para reduzir a condutividade e são carregados em uma resina de troca de íon de modo misto, como nesse exemplo, uma resina de Cerâmica de hidroxiapatita I (CHT I) . 0 produto passa sem ligação, enquanto as proteínas de célula hospedeira se ligam à coluna. O fluxo passante, 10 contendo o produto foi coletado. A capacidade foi de 550 de U/ml de resina. As seguintes etapas foram usadas nesse exemplo a partir de um estágio passivo intermediário: • Regenerar a coluna com 2 CV de 0,6 M NaPi pH 7,0 em 300 cm/hora. • Equilibrar a coluna com 5 CV de 60 mM NaPi, pH 7,5 em 300 cm/hora. • Carregar o eluato condicionado de etapa 2 em 300 cm/hora e coletar o fluxo passante, contendo o produto. A condutividade e pH do carregamento será de ~10 mS/cm e 7,3, respectivamente. Coletar o fluxo passante, contendo o produto de um aumento de OD de 20 mAu até OD estar de volta em 2 0 mAU, aproximadamente, com volume de carregamento e lavagem de 2 CVs. No fim da etapa, filtrar o agrupamento de produto através de 0,45 μm filtro de PES ou PVDF hidrofílico. • Lavar a coluna com 4 CV de tampão de equilíbrio em 300 cm/hora. • Regenerar a coluna com 3 CV de 0,6 M de NaPi, pH 7,0 em 300 cm/hora. • Limpar e higienizar com 3 CV 1 M NaOH (60 min de tempo de contato), 1 CV de 60 mM de NaPi, pH 7,5 e 2 CV 20 mM de fosfato de sódio + 20% de etanol. Armazenar em 20 mM de fosfato de sódio + 20% de etanol.

A Tabela 6 mostra um exemplo de um esquema de purificação. A Tabela 7 resume a etapa. A Figura 4 mostra um exemplo de um cromatograma essa etapa. Tabela 6: Esquema de purificação para estágio passivo intermediário usando CHT I embalado em uma coluna de 10 cm x 2 cm2 (20 ml) XK 16.

Tabela 7: Sumário de condições para etapa de CHT I (continuada na próxima página).

Exemplo 5 - Etapa de desativação de vírus

A desativação de vírus pode ser realizada em 5 diferentes estágios do processo. Nesse exemplo, a desativação de vírus foi realizada após a etapa passiva intermediária e antes da etapa de polimento. A desativação de vírus do agrupamento passivo intermediário que compreende alfa- manosidase é obtida por 135±15 min de incubação em 21±5°C com 10 15% de isopropanol (1:1 de mistura com 30% de isopropanol aquoso) . O tanque pode ser resfriado por uma jaqueta de arrefecimento em +4°C para manter o processo em 21±5°C. A filtração de fluxo tangencial (TFF), com 100 kDa de membrana polietersulfona, triagem A (de Millipore ou Sartorius) foi 15 usada para remover o isopropanol e alterar para tampão de fosfato de sódio. As seguintes etapas foram usadas para desativar vírus nesse exemplo: • Misturar o produto (fluxo passante) da etapa passiva intermediária com 3 0% de isopropanol em 60 mM de fosfato de sódio, 1:1 (v:v), que corresponde a 1:0:94 (w/w). Misturar, por exemplo, por bombeamento por recirculação. A concentração de proteína de produto será de -0,3-1 mg/ml. • Incubar o agrupamento de solvente/produto em temperatura ambiente por 135±15 min. • Equilibrar a membrana TFF com tampão de fosfato de sódio de 60 mM. • Concentrar o agrupamento para concentração alvo de 2 mg/ml (0,5 a 3 mg/ml) por ultrafiltração em pressão transmembrana (TMP) de 0,11 MPa (1.1 bar)), em 21+5 °C, pressão interna=~0,14 MPa a 0,15 MPa (-1,4 a 1,5 bar e pressão externa=0,07--0,08 MPa (0,7~-0,8 bar). • Trocar -6 volumes por diafiltração contra tampão de fosfato de sódio de 60 mM. Iniciar em 0,1 MPa (1 bar) de TMP (0,14 MPa (1,4 bar) interno/0,06 MPa (0,6 bar) externo). Após o primeiro volume ser trocado, a TMP pode ser aumentada em 0,11 MPa (1,1 bar). • Coletar o retentado. Enxaguar a membrana com 2 a 3 volumes de sistema de tampão de diluição para remover o produto ligado de maneira livre. Coletar o enxágue junto com o retentado. A concentração de proteína alvo final é de 2 mg/ml (0,5 a 3 mg/ml). • Limpar a membrana com H2O, seguida por 0,5 M de NaOH (60 min de tempo de contato) . Armazenar em 0,1 M de NaOH. • Tabela 10 mostra as condições para a etapa de desativação de vírus/TFF

Tabela 10: Sumário de condições para a etapa desativação de vírus/TFF

NaPi= 60 mM de fosfato de sódio, pH 7,5

Exemplo 6 - Etapa de polimento Cromatografico usando troca de ânion

A condutividade do retentado compreende que a alfa- manosidase do estágio passivo intermediário foi reduzida por diluição 6 vezes com Tampão de condicionamento (20 mM de Tris-HCl, 10 mM de NaCl, 75 mM de manitol, 0,005% de tween™ 80, pH 7,5) para ligação por interação iônica em uma resina de troca de ânion, como nesse exemplo, a resina de troca de ânion forte de alto desempenho de amónio quaternário (resina Q Sepahrose™ HP) . O retentado foi também diluído diretamente antes do carregamento ou por diluição em linha. O produto foi eluído, em um recipiente pré-preenchido com 1CV de tampão de eluição, por adição de cloreto de sódio. A capacidade é de 4 00 U/ml de resina. As seguintes etapas foram usadas para o estágio de polimento nesse exemplo: • Regenerar a coluna com 1 CV 50 mM de NaPi, 1 M cloreto de sódio, pH 7,5 em 120 cm/hora. • Equilibrar a coluna com 5 CV 20 mM de Tris- HC1, 10 mM de cloreto de sódio, pH 7,5 em 120 cm/hora. • Carregar o retentado diluído da etapa 4 em 120 cm/hora. • Lavar a coluna com 5 CV de tampão de equilíbrio e 1 CV de 20 mM de fosfato de sódio, pH 7,5 em 120 cm/hora. • Eluir o produto com 4 CV de 5 0 mM de fosfato de sódio, 0,2 M de cloreto de sódio, pH 7,5 em 120 cm/hora no recipiente pré-preenchido (1 CV de tampão de eluição) Coletar o pico do aumento inicial (iniciar a coleta em 10 a 20 mAu) de absorbância até 30 a 50 mAu (2 mm de célula de fluxo), 0,5 a 1,5 CV,. • Regenerar a coluna com 3 CV 50 mM de NaPi, 1 M cloreto de sódio, pH 7,5 em 120 cm/hora. • Limpar e higienizar com 3 CV 1 M NaOH (60 min de tempo de contato) e 3 CV 10 mM de NaOH. Armazenar em 10 mM de NaOH.

A Tabela 8 mostra um exemplo de um esquema de purificação. A Tabela 9 resume a etapa. A Figura 5 mostra um exemplo de um cromatograma. Tabela 8: Exemplo do esquema de purificação para a etapa de polimento com o uso da resina Q Sepharose™ HP 19 cm x 2 cm2 (38 ml) (continua na próxima página).

Tabela 9: Sumário das condições para a etapa de Q Sepharose™ HP.

Exemplo 7 - Etapa de redução de vírus

A redução de vírus pode ser realizada em diferentes estágios do processo. Neste exemplo, a redução de vírus foi realizada após a etapa de polimento. O eluato da etapa de polimento é nanofiltrado, após 0,1 μm de pré-filtração, através de um filtro Planova™ 15N. As seguintes etapas foram usadas: *0 eluato da etapa de polimento é pré-filtrado através de um filtro de 0,1 μm. O filtro é enxaguado com um volume pequeno de fosfato de sódio a 50 mM, cloreto de sódio a 0,2 M, pH 7,5 para remover o produto ligado fracamente. • 0 eluato é filtrado a uma pressão de 0,08 MPa (0,8 bar), a temperatura ambiente. A filtração é seguida por uma pós lavagem de aproximadamente três volumes de sistema Planova 15 com fosfato de sódio a 50 mM, cloreto de sódio a 0,2 M, pH 7,5.

Exemplo 8 - Formulação e armazenamento

A filtração de fluxo tangencial (TFF), com uma membrana de polietersulfona de 100 kDa, Tela A, (Sartorius™ ou Millipore™) altera o tampão para tampão de formulação. O tanque pode ser resfriado por um invólucro de resfriamento a +4°C para manter o processo a 21 +5 °C. A capacidade estimada é 100 1/m2. As seguintes etapas foram usadas para formulação e armazenamento: • Equilibrar a membrana de NaHPO4 3,5 mM, Na2HPO4 0,17 mM, manitol 250 mM, glicina 27 mM, pH 7,7 (tampão de formulação). • Diluir o produto purificado que compreende alfa-manosidase com tampão de formulação de aproximadamente 1 volume para a concentração alvo de 2 a 3 mg/ml. Se a concentração de proteína for baixa no produto é possível (mas não necessário) concentrar a 4 a 6 mg/ml para reduzir o volume antes da diluição com o tampão de formulação. • Concentrar -duas vezes a concentração alvo de 6 mg/ml por ultrafiltração a TMP 0,8 e a 21±5°C. • Trocar 6 volumes por diafiltração contra o tampão de formulação a TMP 0.8, 21+5 °C. • Concentrar ~1,5 vezes por ultrafiltração e coletar o retentado. Enxaguar a membrana com 1 volume de sistema do tampão de formulação para remover produto ligado fracamente. Coletar o enxágue juntamente com o retentado. Uma alternativa é medir o OD 280 no enxágue e agrupar somente se contiver o produto. A concentração de proteína alvo final é 7+2 mg/ml. • Limpar a membrana com H20, seguida por NaOH 5 0,5 M (tempo de contato de 60 minutos). Armazenar em NaOH 0,1 M.

Tabela 11: Sumário de condições para a etapa de TFF de formulação (continua na próxima página).

O produto foi diluído a 5 mg/ml e filtrado por esterilização. A substância de fármaco filtrada é preenchida em garrafas e congelada.

Exemplo 9 - Processo de cultivo de batelada alimentada para alfa manosidase

Após o descongelamento celular, as células foram expandidas em frascos de agitação, biorreator de sementes de 10 1 e biorreator de sementes de 50 1 antes de sua transferência para um biorreator de produção (250 1). No dia de inoculação do biorreator de produção, a densidade celular no biorreator de sementes de 50 1 foi entre 2 e 2,5 MVC/ml. As células foram inoculadas no reator de produção do biorreator de sementes a uma densidade celular de 0,5 MVC/ml de modo que o volume de suspensão de célula fosse 100 1 quando a introdução foi concluída. O dia de inoculação é chamado de dia 0, o dia seguinte é chamado de dia 1 e assim por diante. A partir do dia 1 até o final da execução, o meio de alimentação foi adicionado diariamente em estímulo de acordo com uma taxa predefinida (consulte abaixo). A partir do dia 1 até o final da execução, glutamina e glicose foram adicionadas diariamente em estímulo de acordo com regras e taxas predefinidas (consulte abaixo). Quando a densidade celular viável de 2: 2,2 MVC/ml ou no dia 3, o que vier primeiro, a temperatura foi diminuída para a temperatura de produção Tabela 12: Temperaturas reais e condições experimentais.

(*) Entre o dia 0 e o dia 2, somente C02 foi automaticamente adicionado pelo controle de pH. Álcali não foi adicionado a menos que o pH fosse < 6,60.

• Meio de base O meio ACF (ExCell302, SAFC) suplementado com glutamina a 2 mM e contendo glicose a 11,1 mM (2 g/1). O meio de base sem glutamina pode ser transferido para o biorreator de produção até 3 dias e armazenado a 36,5 °C, isto é, durante o teste de esterilidade do biorreator. De outra maneira, o meio é armazenado a 4 °C. • Meios de alimentação O meio de alimentação, E35, foi 35 % de concentrado de alimentação CHO CD Efficient Feed B (InVitrogen cat nr. SKU# A10240-01) diluído no meio ACF sem glutamina e contendo glicose a 11,1 mM. O meio de alimentação foi armazenado no escuro a 4 °C. 0 meio de alimentação pode suportar o escuro durante até 96 horas, isto é, quatro dias, a temperatura ambiente durante o cultivo. Tabela 13: Volume de meio de alimentação adicionado por dia

• Aditivos a) Solução de estoque de glicose a 2.500 mM. b) Solução de estoque de glutamina a 200 mM. c) Na2CO3 0,5 M alcalino. • Entrega do meio de alimentação, glicose e glutamina

O meio de alimentação foi bombeado diariamente em estímulo. Glicose e glutamina foram adicionadas diariamente para manter suas concentrações dentro dos alvos dados adicionando-se, em estímulo, soluções de estoque de glicose e glutamina em quantidades de acordo com o abaixo. Regras de adição de glutamina: • Dia 1 ao dia 3: adicionar um volume de solução de estoque de glutamina de modo que a concentração de glutamina no biorreator seja 2mM. • A partir do dia 4: adicionar um volume de solução de estoque de glutamina de modo que a concentração de glutamina no biorreator seja ImM. 5 Regras de adição de glicose: • Dia 0 ao dia 8: nenhuma adição de solução de estoque de glicose • A partir do dia 9, se a concentração de glicose no biorreator de produção 8 mM, adicionar um volume 10 de solução de estoque de glicose de modo que a concentração de glicose no biorreator seja 8 mM. Vista geral do processo: Tabela 15: Vista geral dia por dia do processo de CUltivo:

Exemplo 10 - Caracterização do produto purificado que compreende alfa-manosidase A Tabela 16 abaixo mostra como o esquema de purificação da presente invenção forneceu alfa- manosidase com uma alta proporção das espécies de 5 glicoproteína de 130 kDa, em comparação aos produtos de decomposição de 75 e 55 kDa respectivamente. Também é mostrado como um processo de 250 1 com o uso de um processo de purificação de 4 etapas com etapas de lavagem melhoradas para ambas a etapa de captura que compreende ligantes 10 multimodais e a etapa ativa intermediária assim como uma etapa de polimento de Q sepharose HP realizada melhor que o processo de 30 1 com o uso de um processo de 3 etapas com respeito a ambos o rendimento, pureza total e o rendimento das espécies de 130 kDa.

Tabela 16: Rendimentos das espécies de alfa- manosidase no produto purificado

A distribuição de espécies é vista no diagrama de HPLC da Figura 7 para três processos, em que os acima representam os processos de 4 etapas e 3 etapas respectivamente. O processo de 2 etapas mostrado é sem usar uma etapa de ligante multimodal. O primeiro pico da esquerda é a espécie de 55 kDa, seguida pelas espécies de 130 kDa e 75 kDa respectivamente.

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Claims (15)

1. PROCESSO PARA PURIFICAÇÃO DA ALFA-MANOSIDASE LISOSSOMAL HUMANA RECOMBINANTE A PARTIR DE UMA CULTURA CELULAR, caracterizado por uma fração da dita cultura celular que compreende a alfa-manosidase lisossomal humana recombinante ser submetida à cromatografia em uma resina que compreende um ligante multimodal, em que o dito ligante multimodal fixado à resina é uma substância que possui um grupo ácido carboxílico ou ácido sulfônico.

2. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela dita fração da cultura celular que compreende a alfa-manosidase lisossomal humana recombinante ser uma colheita não diluída clarificada.

3. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo ligante multimodal de ligação de resina ser uma substância de fórmula (I), (II) ou (III): em que o R das substâncias da fórmula (II) e (III)

é um grupo funcional da fórmula (IV):

4. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pela fração da dita cultura celular carregada na resina que compreende um ligante multimodal ser submetida a pelo menos uma etapa de lavagem com uma solução que compreende isopropanol.

5. PORCESSO, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pela solução compreender pelo menos 1% volume:volume (v:v) de isopropanol.

6. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por um primeiro eluato que compreende a alfa-manosidase lisossomal humana recombinante ser eluído a partir da resina que compreende um ligante multimodal com o uso de uma solução aquosa que compreende etilenoglicol ou propilenoglicol.

7. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado por um primeiro eluato que compreende alfa manosidase lisossomal humana recombinante obtido a partir da resina que compreende um ligante multimodal ser submetido adicionalmente a um processo que compreende as etapas de: i) aplicar uma fração que compreende alfa-manosidase lisossomal humana recombinante a uma resina de cromatografia de interação hidrofóbica para fornecer um eluato que compreende a alfa-manosidase lisossomal humana recombinante, ii) passar uma fração que compreende alfa-manosidase lisossomal humana recombinante através de uma resina de troca iônica mista para permitir a retenção de contaminantes para fornecer um fluxo passante que compreende a alfa-manosidase lisossomal humana recombinante; e iii) submeter uma fração que compreende alfa- manosidase lisossomal humana recombinante à cromatografia em uma resina de troca aniônica para fornecer um eluato que compreende a alfa-manosidase lisossomal humana recombinante.

8. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pela alfa-manosidase lisossomal humana recombinante ter a sequência SEQ ID NO:2.

9. COMPOSIÇÃO, caracterizada por compreender alfa- manosidase lisossomal humana recombinante obtido pelo processo de purificação, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 7 ou 8.

10. PROCESSO EM BATELADA ALIMENTADA OU PRODUÇÃO CONTÍNUA DA ALFA-MANOSIDASE LISOSSOMAL HUMANA RECOMBINANTE, caracterizado por compreender as seguintes etapas: a. inocular um reator de produção que compreende um meio de base com células que têm a capacidade de produzir alfa- manosidase lisossomal humana recombinante no dia 0, para fornecer uma cultura celular; b. adicionar um meio de alimentação à dita cultura celular pelo menos uma vez a partir do dia 1; c. ajustar a temperatura da dita cultura celular para no máximo 35°C, ou após o dia 3 ou quando a densidade celular viável for maior que 2,1 MVC/ml, o que vier primeiro; e d. um processo de purificação conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8.

11. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pela cultura celular ser essencialmente livre de quaisquer suplementos derivados de animais, tais como suplementos de óleo de fígado de bacalhau.

12. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 ou 11, caracterizado pelo processo em batelada alimentada ou produção contínua ser realizado em um volume de pelo menos 30L.

13. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 12, caracterizado pela alfa-manosidase lisossomal humana recombinante ter a sequência SEQ ID NO:2.

14. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 13, caracterizado pela etapa d) ser um processo de purificação de acordo com a reivindicação 7.

15. USO DA COMPOSIÇÃO, conforme definida na reivindicação 9, caracterizado por ser na fabricação de um medicamento para o tratamento de alfa-manosidose.

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