JP4421041B2 - ペプチドおよび該ペプチドを固定化した吸着材 - Google Patents
ペプチドおよび該ペプチドを固定化した吸着材 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4421041B2 JP4421041B2 JP35288299A JP35288299A JP4421041B2 JP 4421041 B2 JP4421041 B2 JP 4421041B2 JP 35288299 A JP35288299 A JP 35288299A JP 35288299 A JP35288299 A JP 35288299A JP 4421041 B2 JP4421041 B2 JP 4421041B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- peptide
- amino acid
- carrier
- endotoxin
- adsorbent
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
【発明の属する技術分野】
本発明はペプチドおよび該ペプチドを担体に固定化した吸着材に関する。本発明によって提供されるペプチドは、エンドトキシンと結合する能力に優れているので、該ペプチドを担体に固定化した吸着材は、エンドトキシンを含む液体からエンドトキシンを除去するのに有用である。
【0002】
エンドトキシンは、生活環境に多く存在するグラム陰性菌外膜由来の物質で、極微量で発熱や致死毒性等の生物活性を示し、敗血症やショックなどをひき起こす臨床上有害な物質である。エンドトキシンは透析用水などにも含まれていることが多く、したがって、透析用水などからエンドトキシンを除去することは敗血症やエンドトキシンショックの予防に有効である。
【0003】
【従来の技術】
これまで、透析用水などに含まれるエンドトキシンを除去するのに、活性炭やポリミキシンBを固定化した材料が使用されている。活性炭は吸着性に優れており、エンドトキシンを吸着するが、それ以外の有用な物質も吸着し、エンドトキシンという観点からみれば、必ずしも吸着能が高いとはいえない。また、ポリミキシンBは抗生物質であるため高価である。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、本発明の目的は、エンドトキシンを選択的に吸着除去することができ、滅菌処理時や保存時における吸着除去能力の低下が極めて少なく、しかも安価で安全性の高い吸着材を提供することにある。
【0005】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、このような吸着材を得るため鋭意検討を重ね、特定のペプチドを担体に固定化した吸着材が上記目的に適う吸着材であることを見出し、本発明に至った。すなわち、本発明は、下記の化学式(I)で表されるアミノ酸配列を含有し、10〜12個のアミノ酸残基からなるペプチドである。なお、式中、XはArg、His又はLysである。また、本発明のもう一つの発明は、上記ペプチドを担体に固定化した吸着材である。
【化2】
Phe-His-X-Asn-His-X-Ser-Pro-Val-Thr (I)
【0006】
【発明の実施の形態】
本発明のペプチドは、化学式(I)で表されるアミノ酸配列を含有し、10〜12個のアミノ酸残基からなる。なお、本発明において、各種アミノ酸残基は次の略号で記述する。また本発明においては、常法に従ってペプチドのアミノ酸配列を、そのN末端のアミノ酸残基が左側に位置し、C末端のアミノ酸配列が右側に位置するように記述する。
Arg: L−アルギニン残基
Asn: L−アスパラギン残基
Gln: L−グルタミン残基
Gly: グリシン残基
His: L−ヒスチジン残基
Lys: L−リジン残基
Phe: L−フェニルアラニン残基
Pro: L−プロリン残基
Ser: L−セリン残基
Thr: L−スレオニン残基
Trp: L−トリプトファン残基
Val: L−バリン残基
【0007】
本発明のペプチドは、化学式(I)で表されるアミノ酸配列を含有し、10〜12個のアミノ酸残基からなる。該ペプチドは、実質的に化学式(I)で表されるアミノ酸配列だけから成っていてもよいし、また、化学式(I)で表されるアミノ酸配列のN末端および/またはC末端に任意のアミノ酸残基またはアミノ酸配列を更に含有していてもよい。
【0008】
本発明のペプチドを合成するには、ペプチド合成において通常用いられる方法、例えば固相合成法、または段階的伸長法、フラグメント縮合法のような液相合成法によればよい。固相合成法は操作が簡便であり、本発明のペプチドを合成するのに好ましい方法である。固相合成法は、例えば、ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・ケミカル・ソサエティー(Journal of the American Chemical Society)、第85巻、第2149〜2154頁(1963年);日本生化学会編「生化学実験講座1タンパク質の化学IV化学修飾とペプチド合成」(昭和52年11月15日、(株)東京化学同人発行)、第207〜495頁;日本生化学会編「続生化学実験講座2 タンパク質の化学(下)」(昭和62年5月20日、(株)東京化学同人発行、第641〜694頁などに詳述されている。
【0009】
本発明のペプチドを固相合成法により具体的に製造するには、例えば、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体などの、反応溶媒に不溶性の重合体に、目的とするペプチドのC末端からN末端方向に向かって、対応するアミノ酸を該アミノ酸が有するα−カルボキシル基以外のα−アミノ基などの官能基を保護したうえで縮合させて結合させる操作と、該結合したアミノ酸におけるα−アミノ基などのペプチド結合を形成するアミノ基が有する保護基を除去する操作を順次繰り返すことによってペプチド鎖を伸長させ、目的とするペプチド鎖を形成し、次いで該ペプチド鎖を重合体から脱離させ、かつ保護されている官能基から保護基を除去すればよい。得られたペプチドの精製は逆相高速液体クロマトグラフィーで行うのが効果的である。
【0010】
本発明のペプチドは、担体に固定化することにより、該ペプチドのエンドトキシンとの結合能力を利用して、溶液中に存在するエンドトキシンを吸着除去する目的の吸着材として有効に用いることができる。本発明のペプチドを固定化する担体としては、ペプチドとの間で共有結合を形成させるためのアミノ基、カルボキシル基、水酸基などの反応性の官能基を有するものが使用される。また、上記の担体は水、生理食塩水などの溶液に不溶性であることが必要である。担体は粒子状、繊維状、シート状、中空糸状などの任意の形状のものを使用することができ、具体的には、CMセルロファインCL(チッソ(株)製)などのセルロース粒子、CM−トヨパール650C(東ソー(株)製)などのポリビニルアルコール系担体、ポリアクリルアミド系担体、アガロース系担体などの有機系担体、多孔性ガラスなどの無機質担体を例示することができる。
【0011】
本発明のペプチドを担体へ固定化するには、一般にペプチドまたはタンパク質を担体上に固定化する方法、例えば、担体が有するカルボキシル基をN−ヒドロキシコハク酸イミドと反応させることによって、スクシンイミドオキシカルボニル基に変換し、これに本発明のペプチドをアミノ基の部分で反応させる方法(活性エステル法)、担体が有するアミノ基またはカルボキシル基にジシクロヘキシルカルボジイミドなどの縮合試薬の存在下で、本発明のペプチドのカルボキシル基またはアミノ基を縮合反応させる方法(縮合法)、担体と本発明のペプチドとをグルタルアルデヒドなどの2個以上の官能基を有する化合物を用いて架橋する方法(担体架橋法)などに従って行えばよい。
【0012】
エンドトキシンを除去するには、上記ペプチドを担体に固定化して吸着材とし、好ましくは、カラムに充填し、エンドトキシンを含有する水などの溶液と接触させて、エンドトキシンを吸着させることによって行われる。カラムの材質としては、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネイト、ポリエステル、ポリメチルメタクリレートなどが例示される。以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。
【0016】
【実施例】
実施例1
化学式(I)で表されるアミノ酸配列を含有するペプチド(Lys-Lys-Phe-His-Arg-Asn-His-Arg-Ser-Pro-Val-Thr)の合成
(1) 4−ヒドロキシメチル−フェノキシ−メチル基を0.89ミリモル/g(樹脂)の割合で有するスチレン/ジビニルベンゼン共重合体(99/1モル比)からなる粒状樹脂(米国アプライド・バイオシステムズ社製「HMPレジン」)0.25ミリモルを用い、目的とするペプチドのカルボキシル末端からアミノ末端に向かって順次対応するアミノ酸を結合させて、ペプチドを合成した。その際に、上記合成反応(結合反応)では、原料アミノ酸として、米国アプライド・バイオシステムズ社製のNα−9−(フルオレニルメトキシカルボニル)−Ng−メトキシ−2,3,6−トリメチルベンゼンスルホニル−L−アルギニン(Fmocアルギニン)、Nα−9−(フルオレニルメトキシカルボニル)−Nω−トリチル−L−アスパラギン(Fmocアスパラギン)、Nα−9−(フルオレニルメトキシカルボニル)−Nτ−トリチル−L−ヒスチジン(Fmocヒスチジン)、Nα−9−(フルオレニルメトキシカルボニル)−Nε−(t−ブトキシカルボニル)−L−リジン(Fmocリジン)、9−(フルオレニルメトキシカルボニル)−L−フェニルアラニン(Fmocフェニルアラニン)、9−(フルオレニルメトキシカルボニル)−L−プロリン(Fmocプロリン)、9−(フルオレニルメトキシカルボニル)−O−t−ブチル−L−セリン(Fmocセリン)、9−(フルオレニルメトキシカルボニル)O−t−ブチル−L−スレオニン(Fmocスレオニン)、9−(フルオレニルメトキシカルボニル)−L−バリン(Fmocバリン)、を、それぞれ1ミリモル用いた。
【0017】
(2) 全てのアミノ酸についての反応操作が終了した後、(1)で得られた樹脂をグラスフィルター上でジクロロメタンおよびメタノールを用いて順次洗浄し、次いで真空乾燥することによって890mgのペプチド−樹脂を得た。このペプチド−樹脂に、5%の水、5%のチオアニソール、7.5%のフェノール、2.5%のエタンジチオールを含むトリフルオロ酢酸10mlを添加して20時間処理して、ペプチドの保護基の脱離と、固相(樹脂)からのペプチド脱離を行った。それによって生成した溶液をジエチルエーテルに加えてペプチドを沈殿させ、生成した沈殿をジエチルエーテルで数回洗浄して、粗生成物(粗製ペプチド)を得た。
【0018】
(3) 上記(2)で得られた粗生成物を、分取用高速液体クロマトグラフィー(カラム:デルタパックC18 47×300mm プレップパック1000加圧モジュール付)(ミリポア・ウォーターズ社製)で精製し、それにより得られた精製ペプチドを、分析用高速液体クロマトグラフィー(島津製作所製「LC6A」、カラム:東ソー株式会社製「TSKgel ODS−80TM CTR、移動相:トリフルオロ酢酸を0.05容量%含有するアセトニトリルと水の混合溶媒)に付し、アセトニトリル濃度を30分間で5容量%から50容量%に徐々に変化させたところ、11.8分の位置に単一のピークが示された。FAB(高速原子衝撃)法マススペクトルにより求めた精製ペプチドの分子量は1507であり(分子量の理論値=1507)、化学式(I)で表されるペプチドであることを確認した。結果を表1及び表2に示す。
【0019】
【表1】
【0020】
【表2】
【0021】
ペプチドの担体への固定
ジオキサン50ml中に、セルロース粒子(チッソ(株)製、CMセルロファインCL)10gを懸濁し、得られた懸濁液にN−ヒドロキシコハク酸イミド0.5gおよびジシクロヘキシカルカルボジイミド1.0gを加え、混合物を室温下で一晩振とう撹拌した。得られた混合物を0.02モル/Lのリン酸塩緩衝液(pH7.4)で洗浄し、吸引濾過した。得られた粒子を、実施例1で得られたペプチドを含有する50ミリモルのシクロヘキサンジオンを添加した0.1モル/Lのホウ酸緩衝液(pH8.5)と混合し、この混合物を室温で一晩撹拌することにより、該ペプチドが固定化された吸着材1を得た。得られた混合物を吸引濾過し、その濾液を分析用逆相高速液体クロマトグラフィーに付すことにより、担体上へのペプチドの固定化率を求めたところ、100%の固定化率であった。
【0022】
実施例2、比較例1〜2
注射用蒸留水(大塚製薬社製)にLPS(生化学工業社製)を添加した溶液0.5mlに、前記吸着材1を50mg(実施例2)、コントロールとして未処理の粒子状担体(セルロース粒子:チッソ(株)製CMセルロファイン)50mg(比較例1)、活性炭(クレハ化学)50mg(比較例2)を各々加え、37℃で2時間懸濁させた。得られた懸濁物を遠心分離し、上清を得た。得られた上清中のエンドトキシン濃度をエンドトキシンSPテスト(生化学工業(株)社製)を用いて測定した。吸着除去率を、吸着除去率(%)=(コントロール液の濃度―試験液の濃度)/(コントロール液の濃度)により算出し、結果を表3に示した。
【0023】
表3から本発明の効果は明らかである。また、本発明で得た吸着材は、滅菌処理しても、長期間保存した後に使用しても殆ど同じ吸着能を示した。
【0024】
【表3】
【0025】
【発明の効果】
本発明によれば、エンドトキシンと特異的に結合する能力を有するペプチドが提供される。該ペプチドを担体上に固定化した吸着材は、エンドトキシンを選択的に吸着除去することができる。このようなペプチドを担体に固定化した吸着材は、滅菌処理時や保存時における吸着除去能の低下が極めて少なく、しかも安価に製造することができ、安全性も高いので、透析用水や医薬品などからエンドトキシンを効率的に除去することができ、敗血症やエンドトキシンショックを予防することが可能である。
【0027】
【配列表】
配列番号:1
配列の長さ:12
配列の型:アミノ酸
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
配列
Lys-Lys-Phe-His-Arg-Asn-His-Arg-Ser-Pro-Val-Thr
1 5 10
Claims (2)
- 下記の化学式(I)で表されるアミノ酸配列を含有し、10〜12個のアミノ酸残基からなるペプチド。
【化1】
Phe-His-X-Asn-His-X-Ser-Pro-Val-Thr (I)
(式中、XはArg、His又はLysを表す。) - 請求項1記載のペプチドを担体に固定化した吸着材。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP35288299A JP4421041B2 (ja) | 1999-12-13 | 1999-12-13 | ペプチドおよび該ペプチドを固定化した吸着材 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP35288299A JP4421041B2 (ja) | 1999-12-13 | 1999-12-13 | ペプチドおよび該ペプチドを固定化した吸着材 |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2001163897A JP2001163897A (ja) | 2001-06-19 |
JP2001163897A5 JP2001163897A5 (ja) | 2006-11-02 |
JP4421041B2 true JP4421041B2 (ja) | 2010-02-24 |
Family
ID=18427106
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP35288299A Expired - Fee Related JP4421041B2 (ja) | 1999-12-13 | 1999-12-13 | ペプチドおよび該ペプチドを固定化した吸着材 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP4421041B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2012050386A (ja) * | 2010-09-01 | 2012-03-15 | Kaneka Corp | 2種類以上の多孔質充填剤を充填するカラム |
JP5836577B2 (ja) * | 2010-09-14 | 2015-12-24 | 株式会社カネカ | クリングル配列を有する蛋白質またはペプチドを精製または除去するアフィニティ担体の製造方法、その精製方法、除去方法 |
-
1999
- 1999-12-13 JP JP35288299A patent/JP4421041B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2001163897A (ja) | 2001-06-19 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
KR100960743B1 (ko) | 신규 펩티드, 신규 흡착재, 흡착기 및 흡착방법 | |
AU2011201741A1 (en) | Peptide purification by means of hard metal ion affinity chromatography | |
JPH03275699A (ja) | 新規なペプチド | |
JP4421041B2 (ja) | ペプチドおよび該ペプチドを固定化した吸着材 | |
EP0426857A1 (en) | Peptide and adsorbent comprising same immobilized on carrier | |
JP3329868B2 (ja) | ペプチドおよびこれを担体上に固定化してなる吸着剤 | |
AU706019B2 (en) | Peptide ligands which bind to von Willebrand factor | |
US4889917A (en) | Peptide | |
JP3357139B2 (ja) | 抗デオキシリボ核酸抗体の吸着剤 | |
JP6024101B2 (ja) | 血液凝固因子又は細胞接着因子に対する吸着剤及び精製方法 | |
US5132402A (en) | Adsorbent, method for production thereof, and method for use thereof | |
CA1320794C (en) | Peptide, adsorbent, method for production thereof, and method for use thereof | |
JP5682916B2 (ja) | 水不溶性担体及びエンドトキシン吸着材 | |
JP3574471B2 (ja) | 抗表皮細胞間抗体結合性ペプチドおよび吸着剤 | |
JP5150897B2 (ja) | 塩類含有溶液からのヒスチジン含有ペプチドの回収方法 | |
JP2795747B2 (ja) | ペプチドおよびこれを担体上に固定化してなる吸着剤 | |
JPH0544960B2 (ja) | ||
JP3828214B2 (ja) | ペプチドおよびその塩 | |
JPH06263795A (ja) | ペプチドおよびこれを担体上に固定化してなる吸着剤 | |
JPH01230526A (ja) | 吸着剤およびその製造方法 | |
CA2140257A1 (en) | Sorbent families | |
JP2001163897A5 (ja) | ||
JP3383332B2 (ja) | 新規ペプチド及びエンドトキシン除去方法 | |
JPH01180451A (ja) | アフィニティー分離用吸着体 | |
JPH02209892A (ja) | 新規なペプチドおよびその用途 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20060920 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20060920 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20090707 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20090903 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20091110 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20091202 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121211 Year of fee payment: 3 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |