JPH01230526A - 吸着剤およびその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、新規な吸着剤およびその製造方法に関する。

不発明によって提供される吸着剤はニコチン性アセチル
コリンレセプターに対するヒト抗体を特異的に吸着しう
る。従って、本発明によって提供において有用である。

〔従来の技術〕

ネイ５−　ヤ−（Ｎａｔｕｒｅ　）、第２９９巻、第７
９３〜７９７頁（１９８２年）には、シビレエイの１種
であるトルベト・カリホルニ力（Ｔｏｒｐｅｄｏ　ｃａ
ｌｉｆｏｒｎｉｃａ　）の電気器官から取得されるニコ
チン性アセチルコリンレセプターのα−サブユニット前
駆体が４６１個のアミノ酸から構成されており、その−
次構造を解明し得たことが報告されている。この報告に
よれば、該α−サブユニット前駆体の一次構造における
第１８３〜２００位のアミノ酸配列は式−Ｇｌｙ−Ｔ　
ｒｐ−Ｌｙｓ　−Ｈｉｓ　−Ｔ　ｒｐ−Ｖａ　ｌ　−Ｔ
ｙｒ　−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ　−Ｃｙｓ　−Ｃｙｓ−Ｐ　ｒ
ｏ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ
−テ示されテイル。

プロシーデインゲス・オブ・ザ・ナンヨナル・アカデミ
−・オプ・サイエンシス・オブ・ザ・ユナイテッド・ス
テーク・オプ・アメリカ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆ
　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　
５ｃｉｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＵｎｉｔｅｄＳｔａ
ｔｅｓ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａ）、第８４巻、第３６３
３〜３６３７頁（１９８７年）には、トルベト・カリホ
ルニカース系担体（ＣＮＢｒ−活性化セファロースＣＬ
−４Ｂ（ＣＮＢｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ　５ｅｐｈａｒ
ｏｓｅ　ＣＬ　−４Ｂ　）　〕に固定化して形成させた
吸着剤が、ニコチン性アセチルコリンレセプターに対す
るマウス抗体およびウサギ抗体と結合することが報告さ
れている。バイオグミカル・アンド・バイオフィジカル
・リサーチ・コミュ＝　ケ−ションス（Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｃａｌ　ａｎｄ　ＢｉｏｐｈｙｓｉｃａｌＲｅｓｅａ
ｒｃｈ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ　）、第１３５
巻、第８２〜８９頁（１９８６年）には、トルベト・カ
リホルニ力から取得されたニコチン性アセチルコリンレ
セ″ブタ−のα−サブユニットをグロテアーゼで分解す
ることによって該α−サブユニットの一次構造における
第１５３〜３５０位のアミノ酸配列に対応すると考えら
れる分子量１８キロドルトンのフラグメントが得られ、
このフラグメントがニコチン性アセチルコリンレセプタ
ーのリガンド結合部位に対−するマウスモノクローン抗
体およびα−プンガロトキシンと結合することが報告さ
れている。

〔発明が解決しようとする課題〕

重症筋無力症の治療において重症筋無力症の主な手段は
まだ確立されていないのが実状である。

しかして１本発明の目的は、ニコチン性アセチルコリン
レセプターに対するヒト抗体を有効に吸着する能力を有
し、かつ効率的に製造される新規な吸着剤およびその製
造方法を提供することにある０ 〔課題を解決するための手段〕 本発明によれば、上記の目的は、一般式％式％（１） 〔式中、Ａはペプチド残基を表わし；ＸおよびＹは一方
が単結合を表わすか、またはＡｓｐ、　Ｇｌｕ、　Ｌｙ
ｓおよび式−ＮＨ（ＣＨ２）ｎＣ−（式中、ｎは１〜１
７の整数を表わす。）で示される二価の基からなる群か
ら選ばれるアミノ酸残基もしくは抜群から選ばれる少な
くとも１種のアミノ酸残基の２〜１０個がペプチド結合
によって形成するペプチド残基を表わし、他方がＡｓｐ
、　Ｇｌｕ、　Ｌｙｓおよび式−ＮＨ（ＣＨ２）ｎＣ−
（式中、ｎは前記定義のとおりである。）で示されアミ
ン基を表わす。〕 で示され、かつニコチン性アセチルコリンレセプターに
対するヒト抗体と結合する能力を有する及プチド〔以下
、これをペプチド（１）と称することがある〕を担体上
に固定化してなるニコチン性アセチルコリンレセプター
に対する抗体用の吸着剤を提供することによって達成さ
れ、またペプチド（１）を担体上に固定化することを熱
処理する前記吸着剤の製造方法を提供することによって
達成される。

本明細書において各種アミノ酸残基を慣例の略号で記述
する。略号は本発明の技術分野においてよく知られたも
のであり、その例を以下に列記する。

Ａｓｐ　：　Ｌ−アスパラギン酸残基 Ｃｙｓ　：　Ｌ−システィン残基 Ｇｌｕ　：　Ｌ−グルタミン酸残基 （：；ｌｙ　ニゲリシン残基 Ｈｉｓ　：　Ｌ−ヒスチジン残基 Ｌｅｕ　：　Ｌ−ロイシン残基 Ｌｙｓ　：　Ｌ−リジン残基 Ｐｒｏ　：　Ｌ−プロリン残基 Ｔｈｒ　：　Ｌ　−トレオニン残基 Ｔｒｐ　：　Ｌ　−トリプトファン残基Ｔｙｒ　：　Ｌ
−チロシン残基 Ｖａｌ　：　Ｌ　−ハＩＩ　：／　残基また本明細書に
おいては、常法に従ってアミノ酸配列をＮ末端のアミノ
酸が左側に位置し、Ｃ末端のアミノ酸が右側に位置する
ように記述する。

ペプチド（１）は担体上に効率的に、すなわち高収率で
固定化することができる。担体上に固定化されたペプチ
ド（１）は、血液、血漿、血清などの体液中のニコチン
性アセチルコリンレセプターに対するヒト抗体を吸着す
る能力を発現する。

ペプチド（１）が有する一般式（１）におけるＡは上記
のとおり定義されるが、Ａが表わすペプチド残基の例と
して１式 ％式％ （式中、Ｃｙｓ　−Ｃｙｓにおいて各々のＣｙｓが有す
るメルカプト基は相互に結合してジスルフィド結合を形
成していてもよい。ン で示されるペプチド残基が挙げられ、また式（１１）で
合する能力に関して１式（ＩＩ）で示されるペプチド残
基と等価であるペプチド残基が挙げられる。

ペプチド（［）が有する一般式（１）におけるＸおよび
Ｙは上記のとおり定義されるが、ＸおよびＹの両方が単
結合であるペプチドならびにＸおよびＹのいずれかが上
記で定義されたものと異なるアミノ酸残基またはペプチ
ド残基であるペプチドは、担体上に効率よく固定化され
ない場合があるだけでなく、担体上に固定化された場合
にニコチン性アセチルコリンレセプターに対するヒト抗
体を吸着する能力が充分には発現しない場合がある。ペ
プチド（［）が有する一般式（１）におけるＸおよびＹ
が表わすペプチド残基としては１例えば、次のペプチド
残基を挙げることができる。

−Ａｓｐ−Ａｓｐ−，−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−、−Ｌｙｓ−
Ｌｙｓ−、−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−。

−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−、−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−、−Ｇｌｕ−
Ｌｙｓ−、−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−。

−Ｌｙｓ−ＮＨ（ＣＨｚ）１、Ｃ＋、　−Ｇｌｙ−Ａｓ
ｐ−、−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ　＋。

−Ｌｙｓ＝Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−，（−Ａｓｐ＋５．　＋Ｇ
ｌｕ＋、、　（：Ｌｙｓ＋５゜−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌ
ｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−。

−Ａｓｐ　−Ｇｌｕ−ＮＨ（ＣＨ２）１７Ｃ−Ｌｙｓ　
−Ｇｌｙ　−Ｌｙｓ　−。

窮 （−Ａ　ｓ　ｐ昂、÷Ｇｌｕｅｏ、　＋Ｌ’ｌｓｈ。ｒ
　＋””＊ａ。

−Ｌｙｓ−Ｇｌ　ｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ（ＣＨ２）１．Ｃ−
Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−。

−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−
Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ペプチド責Ｉ）が固
定化される担体としては、親水性の表面を有し、ペプチ
ドとの間で共有結合を形成させるために利用しうるアミ
ノ基、カルボキシル基、水酸基などの反応性の官能基を
有し、体液に不溶性であり、かつ多孔性であるものが好
ましであるかまたは平均細孔径が約５０〜１０００ナノ
メートルの範囲内であるものを使用するのが好ましい。

担体は粒子状、ｆｆｌ維状、シート状、中空糸状などの
任意の形状であることができる。かかる担体としては、
例えば、ＣＭ−セルロファインＣＨ（排除限界タンパク
質分子食：約３Ｘ１０６；生化学工業株式会社販売）な
どのセルロース系担体；ＣＭ−）ヨパール６５０Ｃ（排
除限界タンパク質分子量＝５×１０６；東ソー株式会社
製）などのポリビニルアルコール系担体；ＣＭ−）ＩＪ
スアクリルＭ　（ＣＭ−Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ　Ｍ　）　
（排除限界タンパク質分子量：　１　ｘ　１０７　；ス
ウェーデン国ファルマシアーＬＫ　Ｂ　（Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ−ＬＫＢ　）社製〕などのポリアクリルアミド系
担体；セファロースＣＬ　−４８（５ｅｐｈａｒｏｓｅ
ＣＬ−４Ｂ）Ｃ排除限界タンパク質分子景：２ｘｌＯ７
；スウェーデン国７７　ルマシ７−　Ｌ　Ｋ　Ｂ　（Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ−ＬＫＢ）社製〕などのアガロース系
担体などの有機質担体；およびＣＰＧ−１０−１０００
Ｃ排除限界タンパク質分子量：ｌＸ１０８；平均細孔径
：１１００ｎ；米国エレクトロ一二ニークレオニクス（
Ｅｌｅｃｔｒ。

二・ 固定化量は、吸着剤がニコチン性アセチルコリンレセプ
ターに対するヒト抗体の有意景を吸着しつるために通常
約３×１０　モル／２（担体）以上であることが必要で
あり、担体上に固定化されたペプチド（［）がヒト抗体
の吸着に有効に利用されるために約１×１０−７〜２　
Ｘ　１０−’モル／り（担体）の範囲内であるのが好ま
しい。

以下に１本発明の吸着剤の製造方法について述べる０ ペプチド（１）の担体上への固定化は、一般にペプチド
またはタンパク質を担体上に固定化する場合に採用され
る方法に従って行われる。その固定化方法としては１例
えば、担体が有するカルボキシル基ｉＮ−ヒドロキシコ
ノ・り酸イミドと反応させることによってスクシンイミ
ドオキシカルボニル基に変換し、これ、にペプチド（１
）をアミン基の部分で反応させる方法（活性エステル法
）、担体が有するアミノ基またはカルボキシル基にジシ
クロヘキシルカルボジイミドなどの縮合試薬の存在下で
ペプチド（１）のカルボキシル基またはアミ７基を縮ル
法で担体上に固定化して得られる吸着剤が最も高いニコ
チン性アセチルコリンレセプターに対スるヒト抗体の吸
着能力を有する。

このようにしてペプチド（１）を担体上に固定化し、次
いで所望により該担体上に固定化されたペプチド（１）
を熱処理することによって本発明の吸着剤が製造゛され
る。担体上に固定化されたペプチド責１）は、熱処理を
受けることによってニコチン性アセチルコリンレセプタ
ーに対するヒト抗体を吸着する活性をより顕著に発現す
る。熱処理温度は６０℃以上であることが好ましいが、
熱処理温度が高すぎる場合にはペプチド（１）および／
または担体が分解する場合があるので、該熱処理温度は
１８０℃以下に抑えることが好ましい。また熱処理時間
は約５分間以上であることが好ましいが、熱処理時間が
長すぎる場合にはペプチド責Ｉ）および／または担体が
分解する場合があるので、該熱処理時間は約１時間以内
とするのが好ましい。熱処理は、担体がペプチド（１）
の分解を抑制しつる点から好ましい。゛ペプチド（１）
の合成は、ペプチドの合成において通常用いられる方法
、例えば、固相合成法；または段階的呻長法、フラグメ
ント縮合法のような液相合成法により行われるが、固相
合成法により行うのが操作上簡匡である〔例えば、ジャ
ーナル・オブ・ジ・アメリカン・ケミカル・ソサエティ
（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　
Ｃｈｅｍｉｃａｌ　５ｏｃｉｅｔｙ）　、第８５巻、第
２１４９〜２１５４頁（１９６３年）；日本生化学金偏
「生化学実験講座１　タンパク質の化学■化学修飾とペ
プチド合成」（昭和５２年１１月１５日　株式会社東京
化学同人発行）、第２０７〜４９５頁；日本生化学金偏
［続生化学実験講座２タンパク質の化学（下）−１（昭
和６２年５月２０日株式会社東京化学同人発行）、第６
４１〜６９４頁など参照〕。

ペプチド（１）の固相合成法による製造は１例えば、目
的とするペプチド責Ｉ）のＣ末端に対応するアミノ酸ま
たはアミノ酸アミドが有するα−カルポキンル基または
α−カルバモイル基からそれぞれ水素目的とするペプチ
ド（１）のＮ末端の方向に向って、対応するアミノ酸を
該アミノ酸が有するα−カルボキシル基以外のα−アミ
７基などの官能基を保護したうえで縮合させて結合させ
る操作と該結合したアミノ酸におけるα−アミ７基など
のペプチド結合を形成するアミン基が有する保護基を除
去する操作を順次繰返すことによって、ペプチド鎖を伸
長させ、目的とするペプチド（１）に対応するペプチド
鎖を形成し１次いで該ペプチド鎖を重合体から脱離させ
、かつ保護されている官能基から保護基を除去すること
により目的とするペプチド（＋）を得１次いでこれを精
製することによって実施される。ここで、ペプチド鎖の
重合体からの脱離および保護基の除去は、フッ化水素を
用いて同時に行うのが副反応を抑制する観点から好まし
い。また、得られたペプチド（１）の精製は逆相液体ク
ロマトグラフィーで行うのが効果的である。

本発明の吸着剤を用いるニコチン性アセチルコリンレセ
プターに対する抗体の除去は、本発明の吸着剤を該抗体
を含有する血液、血漿、血清などの入口部と出口部を有
し、かつ入口部と吸着剤層の間および出口部と吸着剤層
の間にそれぞれポリエステルなどの材質のフィルターを
備えていることが望ましい。カラムの材質としては、ポ
リエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリ
エステル、ポリメチルメタクリレートなどが例示される
。これらのうちポリプロピレンおよびポリカーボネート
が、吸着剤を充填したカラムを使用前にオートクレーブ
滅菌、γ−線滅菌などの滅菌に付することかできる点に
おいて特に好適である。

上記の充填されたカラムを使用する患者の体液からのニ
コチン゛性アセチルコリンレセプターに対する抗体の除
去は、例えば体外血液循環系で行われる。体外血液循環
系としては次の二つを例示することができる。

（１）　　患者の血管から取り出した血液を本発明の吸
着剤を充填したカラムに送り、そこで血液からニコチン
性アセチルコリンレセプターに対する抗体を吸着により
除去し、次いでカラムを通過した処理された血液を患者
の血管に循環する。

漿成分からニコチン性アセチルコリンレセプターに対す
る抗体を吸着により除去し、カラムを通過した処理され
た血漿成分を上記の分離された血球成分と混合し、次い
で得られた混合物を患者の血管に循環する。

〔実施例〕

以下、実施例により本発明を説明するが１本発明は実施
例により限定されるものではない。

合成例１ 式Ｈ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｈｉ
ｓ−Ｔｒｐ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ
−Ｃｙｓ−Ｐ　ｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｐ　ｒｏ−Ｔｙ
ｒ−Ｌｅ　ｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ’−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｏ
Ｈで示されるペプチドをペプチド自動合成装置〔米国ア
プライド・バイオシステムズ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓ
ｙｓｔｅｍｓ　）社製モデ”　４３０　Ａ　（Ｍｏｄｅ
ｌ　４３０　Ａ）〕を用いて固相合成法により合成した
。４−（Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）グリシルオキ
シメチル〕フェニルアセトアミドメチル 基を０．７８ミリモル／７（ｍ脂）の割合で有するン（
Ｇｌｙｃｉｎｅ）、　ｔ−Ｂｏｃ−Ｇｌｙ）を０．６４
Ｆ用い、これに第１辰に示す一連の操作に従って目的と
するペプチドのＮ末端の方向に向ってＬ−アスパラギン
酸、Ｌ−システィン、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−
ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−プロリン、Ｌ−トレオニン
、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロ７ンおよびＬ−バリン
から選ばれる対応するアミノ酸を順次結合させた。縮合
反応において上記のアミノ酸はそれぞれＮ−（ｔ−ブト
キシカルボニル）、−（）４−ベンジル−Ｌ−アスパラ
ギンｅ　無水物、Ｎ−（１−ブトキシカルボニル）−８
−（、、ｐ−メトキ７ベンジル）−Ｌ−システィン無水
物、　　Ｎ−（を−ブトキシカルボニル）グリジン無水
物、Ｎ“−（ｔ＋ｍ　　− 一フトキシカルボニル）−Ｎ　　　）シルーＬ−ヒスチ
ジン無水物、Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−ロ
イシン無水物、　Ｎ２−　（ｔ−ブトキシカルボニル＞
　−Ｎ６−ベンジルオキ／カルボニル−Ｌ−リジン無水
物、Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−プロリン無
水物、Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）　−０３−ヘン
シル−Ｌ−トレオニン無水物、Ｎ″−（ｔ−ブトキシカ
ルボニル）　−Ｌ　−）　ＩＪ　フトとして用い、それ
らの使用量は基質に対して約２倍モル量とした。縮合反
応は室温下で行い１反応時間は縮合させるアミノ酸の種
類によって異な名が１８〜３０分間の範囲内であった。

またＮ″−（ｔ−ブトキシカルボニル）　−Ｈｌｍ−）
ンルーＬ−ヒスチジン無水物を用いる縮合反応では変換
率が低いために、第１表に示す一連の操作を終了したの
ち、さらに第１表における工程４〜６の操作を繰り返す
ことによって縮合反応を再度実施したっトリフルオロ酢
酸を３３容 （６〜１６ｍ１） ２　洗　　浄　ジクロロメタン　　　　　　　　１３ジ
イソプロピルエチルアミ ３　中　　和　ンを１０容景チ含有するジ　　１２メチ
ルホルムアミド溶液 ４　洗　　浄　ジメチルホルムアミド　　　　１５アミ
ノ酸を含有するジメチ ５　縮合反応　ルホルムアミド溶液　　　　１８〜３０
　　　１（１０〜２５ｍ１） ６　洗　　浄　ジクロロメタン　　　　　　　　１５全
てのアミノ酸についての反応操作が終了したのち、得ら
れた樹脂をグラスフィルター上でジエチルエーテル、ジ
クロロメタンおよびメタノールを用いて順次洗浄し、次
いで真空乾燥することによって２．１７の乾燥樹脂を得
た。ポリトリフルオロモノクロロエチレン製の反応容器
（株式会社ぺ分間、次いで０℃の温度で３０分間攪拌し
た。得られた反応混合物からフッ化水素、アニソールお
よびエチルメチルスルフィドを減圧下に除去し。

残留物をグラスフィルター上でジエチルエーテルを用い
て充分洗浄した。得られた残留物を２規定の酢酸水溶液
で抽出し、抽出液を凍結乾燥することによりペプチドの
粗製物を０．５５’得た。

得られた粗製物を分取用逆相高速液体クロマトグラフィ
ー〔カラム：オクタデシル化シリカゲル（粒径：５μｍ
）充填カラム（内径：１０１、長さ：　３００＋ａｔ）
［：株式会社ケムコ製デベロシル（Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ
）　ＯＤＳ　１０　ｗｘφＸ　３００ｍ］　；移動相ニ
トリフルオロ酢酸を０．０５容８％含有するアセトニト
リルと水の混合溶媒（アセトニトリルの濃度は２０分間
で２０容量チから３５容量チになるように漸次変化させ
た）〕で精製することによって。

目的とするペプチドの精製物を５０　ｍｑ得た。

得られた精製物を分析用逆相高速液体クロマトグラフィ
ー〔カラム：オクタデシル化シリカゲル（粒径：５μｍ
）充填カラム（内径＝４閣、長さ：水の混合溶媒（アセ
トニトリルの濃度は３０分間で５容量チから５０容量チ
になるように漸次変化させた）；流速：１ｍ／／分；検
出法：波長２１０ｎｍにおける吸光度〕に付したところ
、１９．２分に単一の鋭いピークが示された。ＦＡＢ（
高速原子衝撃）法マススペクトルにより求められた精製
物の分子量は２８１４であった（理論値：２８１５．２
１）。

また、精製物を塩酸を用いて加水分解して得られた生成
物をアミノ酸組成分析に付した結果は次のとおりであっ
た（括弧内の数字は理論値を示す）。

リジン：　５．２３　（５）、　　グリシン：　１．９
４（２）、　　）リプトファン：　２．０２　（２）、
　　ヒスチジン：　０．９８　（１）、　バｉ　７　：
　０．９２（１）、　チロシン：　３．０７（３１，）
レオニン：　２．０７（２）、　　／ステン：　０．８
５　（１）、　　プロリン゛：２、１３　（２）、　ア
スパラギン酸：　２．１０　（２）、　　ロイシン：１
．０Ｏ（１）。

、合成例２〜１６ 合成例１におけると同様な方法でペプチドの固相合成お
よび精製を行うことにより第２表に示すペプチドを得た
。ただし、固相用の樹脂として、合成例２および合成例
１０では４−（Ｎ−（ｔ−ンゼン共重合体〔スチレンと
ジビニルベンゼンの構成比（モル比）：９９対１〕から
なる粒状樹脂〔米国アプライド・バイオシステムズ（Ａ
ｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　）社ＭｐＡＭグリ
シン（Ｇｌｙｃｉｎｅ　）、　ｔ　−Ｂｏｃ　−Ｇｌｙ
　）を用い１合成例３、合成例５１合成例８および合成
例１２では４−（Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−□
４−ベンジルーα−Ｌ−アスパルチルオキシメチル〕フ
ェニルアセトアミドメチル基を０．７８　ミＩＪモル／
２（樹脂）の割合で有するスチレン−ジビニルベンゼン
共重合体〔スチレンとジビニルベンゼンの構成比（モル
比）：９９対１〕からなる粒状樹脂〔米国アプライド・
バイオシステムス（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅ
ｍｓ　）社製　ＰＡＭ７スパラギン酸（Ａｓｐａｒｔｉ
ｃ　ａｃｉｄ）、　　ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−Ａｓｐ（ＯＢｚ
ｌ））を用い１合成例４および合成例６では４−（Ｎ−
（ｔ　−ブトキシカルボニル）Ｏ５−ベンジル−α−Ｌ
−グルタミルオキシメチル〕フェニルアセトアミドメチ
ル基を０．７８ミｌＪモル／２（樹脂）の割合で有する
スチレン−ジビニルベンゼン共重合体〔スチレンとジビ
ニルベンゼンの構成比（モル＋１ −Ｇｌｕ（０Ｂｚｌ　））を用い、合成例７５合成例９
および合成例１１でＨ４−（Ｎ２−（ｔ−ブトキシカル
ボニル）−Ｎ６−（クロロベンジルオキシカルボニル）
−Ｌ−リジルオキシメチル〕フェニルアセトアミドメチ
ル基を０．７８　ミリモル／１（ＷＲ脂）の割合で有す
るスチレン−ジビニルベンゼン共重合体〔スチレンとジ
ビニルベンゼンの構成比（モル比）′：９９対ｌ〕から
なる粒状樹脂〔米国アプライド・バイオシステムズ（Ａ
ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製ＰＡＭリジ
ン（Ｌｙｓｉｎｅ）、　ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ（Ｑ’
−Ｚ）　）を用い、また合成例１３〜１６ではα−アミ
ノ−ｐ−メチルベンジル基を０．７８ニ−ＩＪモル／７
（樹脂）の割合で有するスチレン−ジビニルベンゼン共
重合体〔スチレンとジビニルベンゼンの構成比（モル比
）＝９９対１〕からなる粒状樹脂〔米国アプライド・バ
イオシステムス（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ
ｓ）社製ｐ−メ−ｙ−ルＢ　ＨＡ　ｖジン（ｐ−Ｍｅｔ
ｈｙｌ　ＢＨＡ　Ｒｅ５ｉｎ）　’］を用いた。また縮
合反応においてＬ−グルタミン酸、１２−アミノドデカ
ン酸および１８−アミノオクタデカン酸はそれぞれ、Ｎ
−（ｔ−ブトキシカルたＱ 得られたペプチドの精製物を分析用逆相高速液体クロマ
トグラフィーに付したところ、いずれも単一のピークが
示された。それらの精製物につい−（ＦＡＢ、４マスス
ペクトルにより求められた分子量および塩酸を用いて加
水分解して得られた生成物のアミノ酸組成分析値をそれ
ぞれ第３表に示す。

２　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｇｌｙ　　　
　　　　　ＯＨ３−ＮＨ（ＣＨ２）１７ＣＯ−ＯＨ ４−ＮＨ（ＣＨ２）　ＣＯ−＋Ｇｌｕ＋５０Ｈ＋１ ５　　　＋Ｌｙｓ＋５＋Ａｓｐ％　　　　　　ＯＨ６＋
ＬｙＳ＋−１ｏＧｌｕｏＨ ７＋Ｇｌｙ−３−，−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−ＯＨ９Ｇｌｙ　
　　　　　　　　　　−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−ＯＨ１１Ｇｌ
ｕ　　　　　　　−ＡＳＰ−ＧＩＩＪ−ＮＨ（ＣＨ２）
１７ＣＯ−０ＨＬｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ− １３Ｌｙｓ　　　　　　　　　　−ＮＨ（ＣＨ２）１□
ＣＯ−ＮＨ４Ｉ　４　　−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−−Ａｓｐ−
Ｇ１３’−ＮＨ２Ｉ５　　　＋Ｇｌｕｅ、　　　　　　
　　　Ｌｙｓ　　　　　　　　ＮＨ２Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−
Ｌｅｕ−Ａｓｐ−で示されるペプチド残基である。

第　　　３　　　表 括弧内の数字は理論値を示す。

第　　３　　表　　（続き　） 括弧内の数字は理論値を示す。

第　　３　　表　　（続き　） 括弧内の数字は理論値を示す。

第　　３　　表　　（絖き　） 括弧内の数字は理論値を示す。

第　　３　　表　　（続き　） 括弧内の数字は理論値を示す。

合成例１７および１８ 合成例１におけると同様な方法でペプチドの固相合成お
よび精製を行うことにより、式Ｈ−Ｇｌｙ−Ｔ　ｒｐ−
Ｌｙｓ−Ｈｉ　５−Ｔｒ　ｐ−Ｖａｌ−Ｔｙ　ｒ−Ｔｙ
　ｒ　−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ　−Ｊ Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｏ
Ｈで示されるペプチド（合成例１７）および式Ｈ−Ｌｅ
ｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｔ　ｒ
　ｐ−Ｖａｌ　−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｃ
ｙｓ−Ｐ　ｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｈ　ｒ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−
Ｌｅｕ−Ａｓｐ−ＯＨで示されるペプチド（合成例１８
）を得た。ただし、固相用の樹脂として、４−（Ｎ−（
ｔ−ブトキシカルボニル）−０４−ベンジル−α−Ｌ−
アスパルチルオキシメチル〕フェニルアセトアミドメチ
ル基を０．７８ミリモル／２（樹脂）の割合で有するス
チレン−ジビニルベンゼン共重合体〔スチレンとジビニ
ルベンゼンの構成比（モル比）：９９対１〕からなる粒
状樹脂〔米国アプライド・バイオシステム、ｘ：　（Ａ
ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　）社製ＰＡＭア
スパラギン酸（Ａｓｐａｒｔｉｃ　ａｃｉｄ　）、　ｔ
−Ｂｏｃ−Ｌ−Ａｓｐ　（０Ｂｚｌ　）　）を用いた。

得られたペプチドの精製物を分析用逆相高速液体クロマ
トグラフィーに付したところ、いずれも単一のピークが
示された。それらの精製物についてＦＡＢ法マススペク
トルにより求められた分子量および塩酸を用いて加水分
解して得られた生成物のアミノ酸組成分析値をそれぞれ
第４表に示す。

第　　　　４　　　　表 括弧内の数字は理論値を示す。

実施例１ （ａ）　　金属ナトリウムの存在下で蒸留することによ
って得られたジオキサン５Ｑｍ／中にセルロース粒子（
生化学工業株式会社販売、ＣＭ−セルロファインＣＨ）
１０ｆを悪濁し、得られた懸濁液にＮ−ヒドロキンコハ
ク酸イミド０．５７およびジシクロへキ／ル力ルポジイ
ミド１．０２を加え、混合物を室温下で１晩振盪攪拌し
た。得られた混合物を０．０２モル／７！のリン酸塩緩
衝液（田ニア、４）で洗浄し、吸引濾過した。得られた
粒子を、合成例１で得られたペプチドの２０■を含有す
る０、０２モル／ｊのリン酸塩緩衝液（１ニア、４）２
０肩ｌと混合し、この混合物を４℃の温度で１晩攪拌し
た。

得られた混合物を吸引濾過した。濾液を分析用逆相高速
液体クロマトグラフィーに付したが、残存するペプチド
は認められなかった（担体上へのペプチドの固定化率：
約１００％）。このようにして、合成例１で得られたペ
プチドの２０”＋９が固定化されたセルロース粒子（熱
処理されていない吸着剤）を約１０１得た。

（ｂ）　　上記のようにして得られたペプチドが固定化
されたセルロース粒子の１ｆずつを、塩化ナトリウムを
０．１５モル／ｌ含有する０、０２モル／ｅのリン酸塩
緩衝液（Ｆｌｌニア、４）の各５　ｍｅ中に悪濁し、そ
れぞれ８０℃（水浴上、常圧下）、１００℃（水た０ 実施例２ （ａ）　　実施例１（ａ）においてセルロース粒子１０
２の代りにポリビニルアルコール粒子（東ノー株式会社
製ＣＭ−トヨパール６５０Ｃ）１０りを用い、かつ合成
例１で得られたペプチド２０■の代りに合成例２で得ら
れたペプチド２０■を用いる以外は同様な方法により、
合成例２で得られたペプチドの１８．４■が固定化され
たポリビニルアルコール粒子（熱処理されていない吸着
剤）を約１０ｙ得た（ペプチドの固定化率：約９２％）
。

（ｂ）　　上記のようにして得られたペプチドが固定化
されたポリビニルアルコール粒子の１２を、塩化ナトリ
ウムを０．１５モル／ｌ含有する０、０２モル／ｌのリ
ン酸塩緩衝１（Ｆ＋′ｌ：　７，４　）　５ｒＩｔｅ中
に懸濁し、オートクレーブ滅菌器中で加圧下に１２１℃
の温度で２０分間熱処理した。このようにして熱処理さ
れた吸着剤を得た。

実施例３ （ａ）　　多孔性ガラス粒子〔米国エレクトロ一二ニー
クレオニクス（Ｅｌｅｃｔｒｏ−ｎｕｃｌｅｏｎｉｃｓ
　）社製ＣＰＧ−１０−１０００）１０９を、γ−アミ
ノプロピルトリエトキシンランを５ゴ含有するトルエン
溶液１００１中で２４時間加熱還流下に反応させた。得
られた混合物を、金属ナトリウムの存在下で蒸留するこ
とによって得られたジオキサンで洗浄し、吸引濾過した
。得られた粒子を、金属ナトリウムの存在下で蒸留する
ことによって得られたジオキサンｌＱＱｍ／中に憑濁し
、この懸濁液に無水コノ・り酸３りを加え、混合物を室
温下で１晩攪拌した。得られた混合物を、金属ナトリウ
ムの存在下で蒸留することによって得られたジオキサン
で洗浄し、吸引濾過した。得られた粒子を、金属ナトリ
ウムの存在下で蒸留することによって得られたジオキサ
ン５Ｑｍｅ中に懸濁し、この懸濁液にＮ−ヒドロキシコ
ハク酸イミド０．５２およびジシクロへキ／ル力ルポジ
イミド１．０２を加え、混合物を室温下で１晩攪拌した
。得られた混合物を０．０２モル／ｌのリン酸塩緩衝液
（ｐｉ−１ニア、４）で洗浄し、吸引濾過した。得られ
た粒子を、合成例３で得られたペプチド２０■を含有す
る０、０２モル／ｌのリン酸塩緩衝液（Ｆ４（ニア、４
）２０ａｔ／と混合し、この混合物を４℃の温度で１晩
攪拌した。得られた混合物を吸引濾過し、合成例３で得
られたペプチドの２０ηが固定化された多孔性ガラス粒
子（熱処理されていない吸着剤）を約１（１’得た（ペ
プチドの固定化率：約１００％）０ （ｂ）　　上記のようにして得られたペプチドが固定化
された多孔性ガラス粒子の１２をペプチドが固定化され
たポリビニルアルコール粒子１Ｆ＋７）代ｊｌ）Ｉｃ用
いる以外は実施例２（ｂ）におけると同様な方法により
、熱処理された吸着剤を得た。

実施例４〜１６ （ａ）　　第５表に示すペプチドの２０■を用いる以外
は実施例１（ａ）、実施例２　（ａ）　ｉたは実施例３
（ａ）のいずれかにおけると同様な方法によりペプチド
が固定化された粒子状担体（熱処理されていない吸着剤
）をそれぞれ得た。使用した粒子状担体および担体上へ
のペプチドの固定化率をそれぞれ第５表に示す。

（ｂ）　　上記のようにして得られたペプチドが固定化
された粒子状担体のｌｆを実施例２（ａ）で得られたペ
プチドが固定化されたポリビニルアルコール粒子１２０
代シに用いる以外は実施例２（ｂ）におけると同様な方
法により、熱処理された吸着剤をそれぞれ得た。

第　　　５　　　表 ４　合成例４で得られたもの　セルロース粒子　　　約
１００５　合成例５で得られたもの　セルロース粒子　
　　約　９８６　合成例６で得られたもの　セルロース
粒子　　　約１００７　合成例７で得られたもの　ポリ
ビニルアルコール粒子　約　９５８　合成例８で得られ
たもの　ポリビニルアルコール粒子　約９５９　合成例
９で得られたもの　セルロース粒子　　　約　９５１０
　　合成例１０で得られたもの　セルロース粒子　　　
約　９８１１　　合成例１１で得られたもの　セルロー
ス粒子　　　約１００１２　　合成例１２で得られたも
の　セルロース粒子　　　約１００１３　　合成例１３
で得られたもの　ポリビニルアルコール粒子　約　９０
１４　　合成例１４で得られたもの　ポリビちルアルコ
ール粒子　約１００１５　　合成例１５で得られたもの
　多孔性ガラス粒子　　約　９５１６　　合成例１６で
得られたもの　多孔性ガラス粒子　　約１００（注）セ
ルロース粒子：生化学工業株式会社販売ＣＭ−セルロフ
ァインＣＨ ポリビニルアルコール粒子：東ソー株式会社製ＣＭ−ト
ヨパール６５０Ｃ 多孔性ガラス粒子：米国エレクトロ一二ニークレオニク
ス（Ｅｌｅｃｔｒｏ−ｎｕｃｌｅｏｎｉｃｓ　）社ｆｆ
ｃＰＧ−１０−１０００比較例１ 体）実施例１（ａ）において合成例１で得られたペプチ
ド２０ｒＩＰｑの代りに合成例１７で得られたペプチド
２０ηを用いる以外は同様な方法により、合成例１７で
得られたペプチドの１４．４■が固定化されたセルロー
ス粒子を約１０２得た（ペプチドの固定化率：約７２％
）。

（ｂ）　　上記のようにして得られたペプチドが固定化
されたセルロース粒子の１２をペプチドが固定化された
ポリビニルアルコール粒子１りの代りに用いる以外は実
施例２（ｂ）におけると同様な方法により、熱処理され
た吸着剤を得た。

比較例２ （ａ）　　実施例２（ａ）において合成例２で得られた
ペプチド２０■の代りに合成例１８で得られたペプチド
２０■を用いる以外は同様な方法によりペプチドのポリ
ビニルアルコール粒子への固定化操作を行った。合成例
１８で得られたペプチドはリン酸塩緩衝液中での溶解度
が低いため、濾液中に残存するペプチドを分析用逆相高
速液体クロマトグラフィーにより定量することが不可能
であった。

（ｂ）　　上記の固定化操作に付して得られたポリビニ
ルアルコール粒子の１ｙを実施例２（ａ）で得られたペ
プチドが固定化されたポリビニルアルコール粒子１りの
代りに用いる以外は実施例２（ｂ）におけると同様な方
法により、熱処理された吸着剤を得た。

試験例１ 重症筋無力症患者の血清０．５　ｒｎｌに実施例１で得
られた熱処理されていない吸着剤または熱処理された吸
着剤の５０■を加え、３７°Ｃの温度で３時間懸濁させ
た。得られた懸濁物を遠心分離し、上清を得た。得られ
た上清中におけるニコチン性アセチルコリンレセプター
に対するヒト抗体の濃度をＣｏｎ　Ａ法〔蛋白質　核酸
　酵素、第２６巻、第１５７８〜１５９１頁（１９８１
年）など参照〕により求めた。すなわち、被検液をニコ
チン性アセチルコリンレセプターおよび放射線標識した
α−ブンガロトキシンと順次接触させ、得られた処理液
をコンカナバリンＡ　（Ｃｏｎ　Ａ　）を固定化したセ
ファロース（５ｅｐｈａｒｏｓｅ　）を充填したカラム
に通したのちカラムの放射活性を計測することによって
、該被検液中に含まれていたα−ブンガロトキシンとニ
コチン性アセチルコリンレセプターとの結合を阻害する
ヒト抗体の量をトキ７ン結合阻害活性度（カラムの放射
活性の減少率）として定量した。

結果を第６表に示す。なお、比較のために、合成例１で
得られたペプチドの代りにグリシンを用いる以外は実施
例１（ａ）におけると同様な方法によシ得られたグリシ
ンが固定化されたセルロース粒子、およびこのグリ７ン
が固定化されたセルロース粒子をペプチドが固定化され
たセルロース粒子の代シに用いる以外は実施例１（ｂ）
におけると同様な方法により１２１°Ｃで熱処理して得
られた吸着剤を使用した場合に得られた結果をあわせて
第６表に示す。

第　　　６　　　表 合成例１で得られたペプチド　　熱処理せず　　　　３
８合成例１で得られたペプチド　　　８０　　　　　３
０合成例１で得られたペプチド　　　１００　　　　　
２８合成例１で得られたペプチド　　　１２１　　　　
　２６合成例１で得られたペプチド　　　１５０　　　
　　２７グリ／ン　　　　　　　　　　　熱処理せず　
　　　４４グリ７ン　　　　　　　　　　　　１２１　
　　　　４５試験例２ 試験例１において実施例１で得られた熱処理されていな
い吸着剤および熱処理された吸着剤の代りに実施例２〜
１６で得られた熱処理された吸着剤を用いる以外は同様
な方法により、血清の懸濁処理を行い、得られた上清中
におけるニコチン性アセチルコリンレセプターに対する
ヒト抗体の濃度を求めた。得られた結果を第７表に示す
。なお、比較のために、比較例１または比較例２で得ら
れた熱処理された吸着剤を使用した場合に得られた結果
、ならびに試験例１で比較のために使用したものと同じ
グリシンが固定化されたセルロース粒子を１２１℃で熱
処理して得られた吸着剤を使用した場合に得られた結果
を第７表にあわせて示す。

第　　　７　　　表 吸　　　着　　　剤　　　　　トキノン結合阻害活性度
（働実施例２で得られたもの　　　　　　　　　２２実
施例３で得られたもの　　　　　　　　　　１９実施例
４で得られたもの　　　　　　　　　　１７実施例５で
得られたもの　　　　　　　　　１８実施例６で得られ
たもの　　　　　　　　　１８実施例７で得られたもの
　　　　　　　　　２１実施例８で得られたもの　　　
　　　　　　２０実施例９で得られたもの　　　　　　
　　　１８実施例１０で得られたもの　　　　　　　　
　１９実施レリ１１で得られたもの　　　　　　　　　
　２２実施例１２で得られたもの　　　　　　　　　２
０実施例１３で得られたもの　　　　　　　　　２２実
施例１４で得られたもの　　　　　　　　　１７実施例
１５で得られたもの　　　　　　　　　２０実施例１６
で得られたもの　　　　　　　　　１８比較例１で得ら
れたもの　　　　　　　　　２８比較例２で得られたも
の　　　　　　　　　３６グリ／ンが固定化されたセル
ロース 粒子を１２１℃で熱処理することに　　　　　３４よっ
て得られたもの 〔発明の効果〕 本発明によれば、上記の実施例から明らかなとおり、ニ
コチン性アセチルコリンレセプターに対するヒト抗体を
有効に吸着する能力を有する新規な吸着剤が提供される
。該吸着剤はペプチド（１）を使用することによって効
率的に製造される。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）一般式 Ｈ−Ｘ−Ａ−Ｙ−Ｚ（ I ） 〔式中、Ａはペプチド残基を表わし；ＸおよびＹは一方
   が単結合を表わすか、またはＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓお
   よび式▲数式、化学式、表等があります▼（式中、ｎは
   １〜１７の整数を表わす。）で示される二価の基からな
   る群から選ばれるアミノ酸残基もしくは該群から選ばれ
   る少なくとも１種のアミノ酸残基の２〜１０個がペプチ
   ド結合によつて形成するペプチド残基を表わし、他方が
   Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓおよび式▲数式、化学式、表等
   があります▼（式中、ｎは前記定義のとおりで ある。）で示される二価の基からなる群から選ばれるア
   ミノ酸残基もしくは該群から選ばれる少なくとも１種の
   アミノ酸残基の２〜１０個がペプチド結合によつて形成
   するペプチド残基を表わし；Ｚは水酸基またはアミノ基
   を表わす。〕で示され、かつニコチン性アセチルコリン
   レセプターに対するヒト抗体と結合する能力を有するペ
   プチドを担体上に固定化してなるニコチン性アセチルコ
   リンレセプターに対する抗体用の吸着剤。
2. （２）一般式 Ｈ−Ｘ−Ａ−Ｙ−Ｚ（ I ） （式中、Ａ、Ｘ、ＹおよびＺは請求項１における定義の
   とおりである。） で示され、かつニコチン性アセチルコリンレセプターに
   対するヒト抗体と結合する能力を有するペプチドを担体
   上に固定化することを特徴とする請求項１記載の吸着剤
   の製造方法。
3. （３）ペプチドを担体上に固定化し、次いで該担体上に
   固定化されたペプチドを熱処理する請求項２記載の製造
   方法。