JP5682916B2 - 水不溶性担体及びエンドトキシン吸着材 - Google Patents
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Description
〔1〕基材と、上記基材に結合した下記式1で表されるリンカーと、を備える、水不溶性担体。
[式1中、Bnはベンジル基、xは2〜6の数、Bは保護基又は水素原子を示す。*は基材と結合していることを示す。]
〔2〕上記基材が、ポリビニルアルコール樹脂である、〔1〕に記載の水不溶性担体。
〔3〕基材と、上記基材に結合した下記式2で表されるリンカーと、上記リンカーに結合したエンドドキシン吸着リガンドLと、を備える、エンドトキシン吸着材。
[式2中、Bnはベンジル基、xは2〜6の数を示す。*は基材と結合していること、**はLと結合していることを示す。]
〔4〕上記基材が、ポリビニルアルコール樹脂である、〔3〕に記載のエンドトキシン吸着材。
〔5〕xが2である、〔3〕又は〔4〕に記載のエンドトキシン吸着材。
〔6〕Lが下記式3で表される、〔3〕〜〔5〕のいずれかに記載のエンドトキシン吸着材。
[式3中、AA1、AA2、AA3及びAA4はそれぞれ独立にアミノ酸残基を示す。**はリンカーと結合していることを示す。]
〔7〕〔1〕又は〔2〕に記載の水不溶性担体と、エンドドキシン吸着リガンドとを反応させて得られるエンドトキシン吸着材。
〔8〕xが2である、〔7〕に記載のエンドトキシン吸着材。
〔9〕上記エンドドキシン吸着リガンドが、下記式4で表される、〔7〕又は〔8〕に記載のエンドトキシン吸着材。
[式4中、AA1、AA2、AA3及びAA4はそれぞれ独立にアミノ酸残基を示す。]
本発明の水不溶性担体は、基材と、その基材に結合した下記式1で表されるリンカーと、を備えるものである。式1中、Bnはベンジル基、xは2〜6の数、Bは保護基又は水素原子を示す。*は基材と結合していることを示す。なお、基材には、下記式1で表されるリンカーが、複数結合していてもよい。
基材は、親水性の表面を有し、かつリンカーを化学結合により基材上に固定化するために利用し得る反応性の官能基(以下「反応性官能基」という。)を有するものである。反応性官能基としては、アミノ基、カルボキシル基、水酸基等が好ましい。また、非特異的吸着を抑制する観点から、反応性官能基として、電気的に中性である水酸基を有するものが、より好ましい。
リンカーは、基材とリガンドを結合する際のスペーサーの役割を果たすものをいう。具体的には、下記式1で表される。式1中、Bnはベンジル基を示す。リンカーは、式1中、*で示す部位で、基材の反応性官能基と共有結合している。
本発明の水不溶性担体は、基材の反応性官能基と、リンカーの前駆体とを共有結合させることにより得ることができる。リンカーの前駆体としては、基材の反応性官能基と共有結合を形成可能な残基を有し、その残基と反応性官能基とで共有結合を形成することにより、上記式1で表されるリンカーを形成可能な1つの化合物であってもよいし、逐次反応させることにより上記式1で表されるリンカーを形成可能な複数の化合物であってもよい。
[式8中、Bnはベンジル基、xは2〜6の数を示す。]
本発明の水不溶性担体は、リンカー末端のアミノ基(Bが保護基の場合は、常法に従って脱保護すればよい)との化学結合によって、被吸着物質を吸着し得る任意のリガンドを結合させ、その被吸着物質の吸着材として使用することができる。本発明の水不溶性担体は、上記式1で表されるリンカーを有するため、このようなリガンドの機能(被吸着物質の吸着能)を十分に発揮させることができるとともに、リガンドの固定化を容易(簡便)に行うことができる。
本発明に係るエンドトキシン吸着リガンドは、エンドトキシンを吸着し得る化合物であればよい。エンドトキシン吸着リガンドとしては、高分子化合物、低分子化合物、ペプチド化合物等特に限定はないが、ぺプチド化合物は、有効なリガンドとなり得る。具体的には、特開2002−311029号公報に開示されたペプチド化合物は有効である。即ち、下記式4のような分岐リジン残基を持つペプチド化合物を、エンドトキシン吸着リガンドとして好ましく用いることができる。
本発明のエンドトキシン吸着材は、基材と、基材に結合した下記式2で表されるリンカーと、リンカーに結合したエンドドキシン吸着リガンドLと、を備える。なお、式2中、Bnはベンジル基、xは2〜6の数を示す。*は基材と結合していること、**はLと結合していることを示す。
上記式1で表されるリンカーに対して、所望のリガンド(例えば、エンドトキシン吸着性リガンド)を結合させるための一例としては、式1中のBがアミノ基の保護基の場合は、常法に従って脱保護し、アミノ基をフリーの状態にする。その後、例えば、リガンドにカルボキシル基がある場合は、リンカーのアミノ基とリガンドのカルボキシル基を脱水縮合させて、化学的に結合することができる。その他、リンカーのアミノ基とリガンドとの結合方法については、適宜選択することができる。
クロロメチルオキシラン、水素化ホウ素ナトリウム、ジメチルスルホキシド(DMSO)、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム及びN,N−ジメチルホルムアミド(DMF)は、ナカライテスク株式会社から購入し、水酸化ナトリウムは、和光純薬工業株式会社から購入した。無水ジクロロメタンは、水素化カルシウムを脱水剤に用いて蒸留してから反応に用いた。ジメチルスルホキシド(40mL)で膨潤させたポリビニルアルコール樹脂(PVA樹脂)(水酸基担持量:110μmol/mL,4.0g,12.4mL,1.36mmol)に対して、細砕した水酸化ナトリウム(4.8g,0.12mol)を室温で作用させて30秒間震盪し、さらに水素化ホウ素ナトリウム(30mg,0.79mmol)、及びクロロメチルオキシラン(31.4mL,0.40mol)作用させて、35℃で5時間震盪した。反応溶液を濾過により除去した後、樹脂をメタノール(35℃,15分間×3回)、及び水(45℃,5分間×8回)で洗浄した。
使用した各種アミノ酸は、ペプチド研究所又は渡辺化学工業株式会社から購入した。1−ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)はペプチド研究所から、またN,N’−ジイソプロピルカルボジイミド(DIC)は東京化成から購入した。ペプチド鎖の伸長反応は、標準的なFmocペプチド固相合成法に従って行った。ペプチド縮合にはHOBt/DIC法を用いた。すなわち、実施例1に記載の方法に従って得られた水不溶性担体(100mg,32.7μmol)に対して、20%トリフルオロ酢酸/ジクロロメタン溶液(2.0mL)を室温で1時間作用させることによってBoc基を脱保護した。反応溶液を濾過により除去した後、水不溶性担体をジクロロメタン(5分間×5回)、ジメチルホルムアミド(5分間×5回)を用いて洗浄した。次いで得られた水不溶性担体に対して、Fmon−Lys(Fmoc)−OH(58.0mg,98.2μmol)、HOBt(13.3mg,98.2μmol)、及びDIC(15.4μL,98.2mmol)のジメチルホルムアミド溶液(1.5mL)を作用させ、室温で5時間震盪した。反応溶液を濾過した後、ジメチルホルムアミドで(5分間×5回)洗浄した。同様の方法を用いてBoc基の脱保護とFmoc−保護アミノ酸の導入を順次繰り返すことにより、ペプチド鎖の伸長を行った。以上の方法により、表1に示すAA1−AA4のアミノ酸を導入し、ペプチド配列a〜lを有するエンドトキシン吸着材を得た。
1.エンドトキシン吸着材及び試験器具の前処理
実施例2で作製したエンドトキシン吸着材の中から、ペプチド配列a、c、e及びfを有するエンドトキシン吸着材を使用した。
上記エンドトキシン吸着材及び使用器具は、0.2mol/L NaOH(和光純薬株式会社)用いて16時間アルカリ液処理し、16時間後にパイロジエンフリー水(大塚製薬株式会社)で洗浄し、最終洗浄液が中性であることをpH試験紙(メルク社製)で確認したものを使用し、ガラス器具は乾熱滅菌(250℃、3時間)を行ったものを使用した。
抗凝固剤としてヘパリン(三菱ウェルファーマ)を15IU/mL及び100IU/mLの濃度で添加し、健常人ボランティアより血液を得た。採血後の血液を3500rpmで15分間遠心分離し、得られた上清を血漿とした。血液(全血)及び血漿にLPS(Lipopolysaccharide;SIGMA L2630)を1μL/mL添加し、エンドトキシン添加サンプル液とした。
実施例2で合成したエンドトキシン吸着材1mLとエンドトキシン添加サンプル液12mLを三角フラスコに入れ、37℃温浴で30分間、振盪を加えて反応した。
対照として、実施例1で合成した水不溶性担体1mL(実施例2で合成したエンドトキシン吸着材1mL中に含まれる水不溶性担体の量に相当する)とエンドトキシン添加サンプル液12mLを三角フラスコに入れ、37℃温浴で30分間、振盪を加えて反応した。
反応後の溶液からエンドトキシン吸着材を除去し、分析サンプルとした。エンドトキシンの濃度を比濁時間分析法により測定し、反応前の濃度と反応後の濃度を求め、エンドトキシン吸着率(%)=(1−吸着反応後濃度/吸着反応前濃度)×100を算出して、エンドトキシン吸着能を評価した(表2中、「Et吸着率(%)」と表示した)。また、反応後の血液凝固物の有無(表2中、「凝固物の有無」と表示した)については、目視にて確認した。
結果を表2に示した。実施例3で用いられたエンドトキシン吸着材は、ヘパリン存在のヒト血漿及びヒト全血中においてもエンドトキシン吸着能があることが認められた。特に、ペプチド配列cを有するエンドトキシン吸着材においては、ヒト全血においても血液凝固物が認められず、かつ、良好なエンドトキシン吸着能があることが確認された。
Claims (6)
- 基材と、該基材に結合した下記式2で表されるリンカーと、該リンカーに結合したエンドドキシン吸着リガンドLと、を備え、Lが下記式3で表される、エンドトキシン吸着材。
[式2中、Bnはベンジル基、xは2〜6の数を示す。*は基材と結合していること、**はLと結合していることを示す。]
[式3中、AA1、AA2、AA3及びAA4はそれぞれ独立にアミノ酸残基を示す。**はリンカーと結合していることを示す。] - 前記基材が、ポリビニルアルコール樹脂である、請求項1に記載のエンドトキシン吸着材。
- xが2である、請求項1又は2に記載のエンドトキシン吸着材。
- 水不溶性担体と、エンドドキシン吸着リガンドとを反応させて得られるエンドトキシン吸着材であって、
前記水不溶性担体が、基材と、該基材に結合した下記式1で表されるリンカーと、を備え、
[式1中、Bnはベンジル基、xは2〜6の数、Bは保護基又は水素原子を示す。*は基材と結合していることを示す。]
前記エンドドキシン吸着リガンドが、下記式4で表される、エンドトキシン吸着材。
[式4中、AA1、AA2、AA3及びAA4はそれぞれ独立にアミノ酸残基を示す。] - 前記基材が、ポリビニルアルコール樹脂である、請求項4に記載のエンドトキシン吸着材。
- xが2である、請求項4又は5に記載のエンドトキシン吸着材。
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