JPH0792167A - ＩｇＥ吸着材 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 血中ＩｇＥと特異的に結合してこれを除去す
ることができるＩｇＥ吸着材を提供する。 【構成】 ＩｇＥＦｃε高アフィニティレセプターにお
けるアミノ酸配列中に存在しており、ＩｇＥとの結合性
を有するＩｇＥ結合性ペプチドまたは該ＩｇＥ結合性ペ
プチド領域を含む修飾ペプチドを水不溶性担体に固定化
したものであることを特徴とするＩｇＥ吸着材である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、何らかの原因により血
液中に過剰に産生されたＩｇＥ（イムノグロブリンＥ）
と特異的に結合してこれを除去することができるＩｇＥ
吸着材に関するものである。詳細には、血液中のＩｇＥ
により惹起される免疫障害であるＩ型アレルギー反応を
抑制し、特に薬物等による治療が困難なアトピー性疾患
や高ＩｇＥ症候群などの治療に非常に有用なＩｇＥ吸着
材である。

【０００２】

【従来の技術】Ｉ型アレルギーはダニ、カビ、花粉ある
いは種々の食物などのアレルゲンと呼ばれる外因性の抗
原との接触により引き起こされる過敏症の総称である。
アレルゲンが体内に侵入するとこれに特異的なＩｇＥが
産生され、肥満細胞や好塩基球の表面に存在するＦｃレ
セプターと結合する。この結合によりＩｇＥが２分子以
上架橋するとＦｃ部分に構造変化が生じ、肥満細胞に刺
激を与え細胞内の酵素系を活性化し、これら細胞の保有
する顆粒を放出させる。その結果顆粒中に含まれるヒス
タミン、セロトニン、ＳＲＳ−Ａなどの化学伝達因子が
遊離され、Ｉ型アレルギーの諸症状が引き起こされる。
このようなＩｇＥに関連するＩ型アレルギー症状として
は、喘息、花粉症、鼻アレルギー、蕁麻疹、アトピー性
皮膚炎などのアトピー性疾患や高ＩｇＥ症候群などが挙
げられる。

【０００３】ＩｇＥは分子量は約１９万とＩｇＧよりも
やや大きく、熱などに対する安定性は弱い。ＩｇＥの生
理学的な意義はあまり明らかにされていないが、寄生虫
の感染防御に関して重要な役割を果たしているものと考
えられている。正常人の血中にはＩｇＥは０．１ないし
０．４μｇ／ｍｌとごく微量しか存在しないが、上記の
ような通常のアトピー性疾患や高ＩｇＥ症候群の患者で
は多くの場合に高度の上昇が見られ、例えばアトピー性
疾患の患者では１０ないし３０μｇ／ｍｌ前後にまで達
する。

【０００４】我が国におけるアトピー性疾患患者数は年
々増加の傾向にあり、近年では小児における罹患率も高
くなってきている。これらの疾患の治療方法はその症状
や程度に応じて種々試みられており、例えば病因となる
抗原を見出しこれを回避する手段がある。具体的には、
室内塵、カビ、花粉などを遠ざけたり、原因となる食物
や薬剤の摂取を制限したりするものである。その他に、
薬物療法として気管支拡張剤、抗ヒスタミン剤、ステロ
イド剤、プロスタグランジンなどの投与によりアレルギ
ー反応系を抑制する方法がある。また、抗原の注射を、
最初は少量から始めて徐々にその量を増やしていく減感
作療法も行なわれている。その他に血漿交換療法なども
報告されているが、重篤なアトピー性疾患患者の場合に
はいずれの方法を用いても十分な効果が得られていない
場合が多い。また、高ＩｇＥ症候群の場合には感染率が
高いという問題があり、このような患者に対しても有効
な治療が確立されていない。従って、これらの患者に対
する有効な治療の確立が急がれているのが実情である。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記の問題
を解決するためになされたものであり、その目的は、Ｉ
ｇＥと特異的に結合してこれを除去することができ、そ
の結果、重篤なアトピー性疾患や高ＩｇＥ症候群を治癒
することができるＩｇＥ吸着材を提供しようとするもの
である。

【０００６】

【課題を解決するための手段】上記目的を達成すること
ができる本発明のＩｇＥ吸着材は、ＩｇＥＦｃε高アフ
ィニティレセプターにおけるアミノ酸配列中に存在して
おり、ＩｇＥとの結合性を有するＩｇＥ結合性ペプチド
または該ＩｇＥ結合性ペプチド領域を含む修飾ペプチド
を水不溶性担体に固定化したものであることに要旨を有
するものである。好適な実施態様では、上記ＩｇＥ結合
性ペプチドが、以下の（１）〜（９）：

【０００７】（１）Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−
Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｐ
ｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｔｈ
ｒ （２）Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｓ
ｎ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ
−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−
Ａｓｎ （３）Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌ
ｕ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ
−Ａｓｎ （４）Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ａｓ
ｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ
−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ （５）Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｌｅ
ｕ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ
−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ （６）Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｃｙ
ｓ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ
−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−
Ｔｙｒ−Ｔｙｒ （７）Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌ
ｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ
−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ （８）Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｉｌ
ｅ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｐｒｏ
−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ （９）Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ａｒ
ｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ
−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。

【０００８】さらに好適な実施態様では、上記修飾ペプ
チドは、上記ＩｇＥ結合性ペプチド領域の両末端または
片末端が （ａ）α−アミノ酸 （ｂ）α−アミノ酸を２から６０個含有するペプチド （ｃ）炭素数が１から２０個のω−アミノ酸、ジアミ
ン、またはジカルボン酸のいずれか のいずれかで修飾されたものである。

【０００９】

【作用】以下の記載ではＩｇＥＦｃε高アフィニティレ
セプターを単にＦｃεＲＩと略して記載し、また上記
（１）〜（９）に示すアミノ酸配列を単に（１）〜
（９）のアミノ酸配列と略して記載する。

【００１０】本発明において用いられるＩｇＥ結合性ペ
プチドとは、ＦｃεＲＩ中に存在しており、ＩｇＥとの
結合性を有するペプチドである。上記ＦｃεＲＩは分子
量４０ないし５０キロダルトンの１本のポリペプチドか
ら成る糖タンパク質であり、すでにｃＤＮＡがクローニ
ングされている（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１６，
３５８４，１９８８）。この糖タンパク質は２５７個の
アミノ酸から構成されており、Ｎ末端部には２５個のア
ミノ酸から成るシグナルペプチドが存在する。ＦｃεＲ
Ｉにおいて免疫原性を有するペプチドとしては、Ｆｃε
ＲＩのアミノ酸配列における３２ないし４８番目に相当
するＶＳＬＮＰＰＷＮＲＩＦＫＧＥＮＶＴ（上記（１）
のアミノ酸配列），４９ないし６７番目のＬＴＣＮＧＮ
ＮＦＦＥＶＳＳＴＫＷＦＨＮ（上記（２）のアミノ酸配
列），６７ないし７９番目のＮＧＳＬＳＥＥＴＮＳＳＬ
Ｎ（上記（３）のアミノ酸配列），８２ないし９５番目
のＮＡＫＦＥＤＳＧＥＹＫＣＱＨ（上記（４）のアミノ
酸配列），１０１ないし１１６番目のＳＥＰＶＹＬＥＶ
ＦＳＤＷＬＬＬＱ（上記（５）のアミノ酸配列），１２
７ないし１４６番目のＰＬＦＬＲＣＨＧＷＲＮＷＤＶＹ
ＫＶＩＹＹ（上記（６）のアミノ酸配列），１４５ない
し１６２番目のＹＹＫＤＧＥＡＬＫＹＷＹＥＮＨＮＩＳ
（上記（７）のアミノ酸配列），１８７ないし２０１番
目のＳＥＰＬＮＩＴＶＩＫＡＰＲＥＫ（上記（８）のア
ミノ酸配列），２３５ないし２５１番目のＫＩＫＲＴＲ
ＫＧＦＲＬＬＮＰＨＰＫ（上記（９）のアミノ酸配列）
の９つの領域がエンザイムイムノアッセイ（以下ＥＬＩ
ＳＡ法と言う）等の免疫学実験により確認された領域で
ある。これらの領域はいずれも親水性の比較的強い領域
であり、ＦｃεＲＩ分子表面に存在し、かつ免疫原性を
発現しやすい高次構造を形成していることが推定され
る。

【００１１】本発明に用いられるＩｇＥ結合性ペプチド
は、その領域中に好ましくは上記（１）〜（９）のいず
れかのアミノ酸配列を有している。これらのアミノ酸配
列は単独で含まれていてもよく、あるいは２種以上がペ
プチド結合していてもよい。このようなアミノ酸配列を
用いることにより、血液中のＩｇＥとの結合におけるペ
プチド構造の安定性が向上すると共に、該ペプチドを担
体に固定化する際には水系溶媒に対する溶解性やリガン
ドとしての安定性がさらに向上する。

【００１２】本発明に用いられる修飾ペプチドは、上記
ＩｇＥ結合性ペプチド領域を含むものであり、好ましく
は該ＩｇＥ結合性ペプチド領域の両末端または片末端
が、（ａ）α−アミノ酸、（ｂ）α−アミノ酸を２から
６０個含有するペプチド、（ｃ）炭素数が１から２０個
のω−アミノ酸、ジアミン、またはジカルボン酸のいず
れか、のいずれかで修飾されたものである。このような
修飾ペプチドを用いることにより、血液中のＩｇＥとの
結合におけるペプチド構造の安定性が向上すると共に、
担体に固定化する際には水系溶媒に対する溶解性やリガ
ンドとしての安定性がさらに向上する。

【００１３】このうち、上記α−アミノ酸としては、例
えばリジンのような水溶性を高めることができるアミノ
酸；システインなどが挙げられ、これらα−アミノ酸で
上記ＩｇＥ結合性ペプチド領域を修飾させることによ
り、担体への固定化を容易に行うことができる。

【００１４】また、上記α−アミノ酸を２から６０個含
有するペプチドとしては、例えばリジンを数個含有する
ペプチドなどが挙げられ、これらのペプチドでＩｇＥ結
合性ペプチドのＮ末端をアミド化させるなどの方法によ
り、担体への固定化を容易に行うことができるととも
に、リガンドの安定性などをさらに向上させることがで
きる。

【００１５】さらに、上記炭素数が１から２０個のω−
アミノ酸、ジアミン、またはジカルボン酸で上記ＩｇＥ
結合性ペプチドの片末端を修飾させることにより、Ｉｇ
Ｅとの結合性あるいはその強度をより高めることも可能
である。ここでジアミンとしては、エチレンジアミン、
トリメチレンジアミン、テトラメチレンジアミン、ペン
タメチレンジアミン、ヘキサメチレンジアミンなどの脂
肪族ジアミン；ｏ−フェニレンジアミン、ｍ−フェニレ
ンジアミン、ｐ−フェニレンジアミンなどの芳香族ジア
ミン；ポリアルキレンオキサイドの両末端にアミノ基を
有するものなどが挙げられ、またジカルボン酸として
は、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジ
ピン酸などの脂肪族飽和ジカルボン酸；マレイン酸、フ
マル酸などの脂肪族不飽和ジカルボン酸；フタル酸、イ
ソフタル酸、テレフタル酸などの芳香族ジカルボン酸；
ポリアルキレンオキサイドの両末端にカルボキシル基を
有するものなどが挙げられる。

【００１６】上記ＩｇＥ結合性ペプチドまたは修飾ペプ
チドの全アミノ酸の個数は２から７０個であることが好
ましいが、合成の困難さやコスト、構造上の安定性など
を考慮すると３０個以内がより好ましい。さらに免疫原
性を発揮するのに必要な高次構造の形成しやすさなども
考慮すると１０ないし２５個までが最も好ましい。

【００１７】上記ＩｇＥ結合性ペプチドの合成方法につ
いては特に限定されず、液相合成法および固相合成法の
いずれもが用いられるが、液相合成法よりも固相合成法
の方が操作が簡単である。固相合成法としては例えば、
有機溶媒に不溶性である支持体に、合成するペプチドの
Ｃ末端に対応するアミノ酸を結合させ、α−カルボキシ
ル基以外のα−アミノ基などの官能基をｔ−ブトキシカ
ルボニル基などの保護基で保護した後、これら保護され
た対応するアミノ酸をＮ末端方向に順次縮合反応により
結合させ、該保護基を脱離させる反応を交互に繰返すこ
とによりペプチド鎖を延長させる方法が用いられる。固
相ペプチド合成法は、用いられる保護基の種類によりｔ
ーＢｏｃ法とＦーｍｏｃ法とに大別される。

【００１８】この様にして目的とするＩｇＥ結合性ペプ
チドを合成した後、脱保護基反応およびペプチド鎖の支
持体からの切断を行なう。脱保護基反応にはフッ化水素
がしばしば用いられるが、安全性や取扱いやすさの点か
ら、ｔ−Ｂｏｃ法ではトリフルオロメタンスルホン酸
（以下ＴＦＭＳＡと言う）を、またＦーｍｏｃ法ではト
リフルオロ酢酸（以下ＴＦＡと言う）を用いるのが適当
である。例えばｔ−Ｂｏｃ法では、ＴＦＭＳＡ中で上記
ペプチドをチオアニソールおよび１，２−エタンジチオ
ールと反応させて保護基を脱離させた後、ＴＦＡにより
支持体からの切断を行ない、ペプチドを回収する。これ
を凍結乾燥することにより粗ペプチドが得られる。一
方、Ｆ−ｍｏｃ法ではＴＦＡ中において上記と同様の操
作で脱保護基反応およびペプチド鎖の支持体からの切断
反応を行なうことが可能である。

【００１９】上記粗ペプチドは逆相系カラムを用いた高
速液体クロマトグラフィ（以下ＨＰＬＣと言う）に供す
ることにより分取、精製を行なう。ＨＰＬＣは、タンパ
ク質の精製に通常用いられる水−アセトニトリル溶媒系
を基本として最適化条件で行なうのがよい。得られたク
ロマトピークに相当する画分を分取し、これを凍結乾燥
する。この様にして得られた精製ペプチド画分につい
て、マススペクトル分析による分子量解析、アミノ酸組
成分析あるいはアミノ酸配列解析などにより同定を行な
う。

【００２０】上記ＩｇＥ結合性ペプチドあるいは修飾ペ
プチドは、水不溶性担体に固定化されてＩｇＥ吸着材と
する。用いられる水不溶性担体としては特に限定されな
いが、該ＩｇＥ吸着材を血液浄化療法に用いる場合に
は、血液中の補体系や凝固系などに及ぼす影響を考慮し
て、セルロース、ポリエチレンテレフタレート、ポリス
チレン、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸エステ
ルあるいはこれらの誘導体の多孔質担体を用いることが
好ましい。平均細孔径は２０ないし３０００ｎｍである
ことが好ましく、３０ないし１０００ｎｍであることが
より好ましい。また担体の形態としてはビーズ状、繊維
状、膜状（中空糸も含む）などのいずれもが可能であ
る。

【００２１】また、上記ＩｇＥ結合性ペプチドあるいは
修飾ペプチドを水不溶性担体に固定化する際には、立体
障害を小さくして吸着効率を向上させ、非特異的吸着を
抑えるために、親水性スペーサーを介して固定化するこ
とが好ましい。用いられる親水性スペーサーとしては、
例えばその両末端がカルボキシル基、アミノ基、アルデ
ヒド基、エポキシ基などで置換されたポリアルキレンオ
キサイドの誘導体を用いることが好ましく、その重合度
は１０ないし１０００であることが好ましく、１００な
いし５００であることがより好ましい。

【００２２】上記固定化方法については特に限定される
ものではないが、酵素や抗体を水系溶媒中で担体に固定
化するのに一般に用いられるシッフ塩基反応、エポキシ
反応、カルボジイミド試薬などを用いた縮合反応などを
適用することが好ましい。上記ＩｇＥ結合性ペプチドや
修飾ペプチドは、比較的低分子量であり、酵素や抗体な
どのタンパク質と比べると比較的安定な物質であるの
で、酵素や抗体などを用いた場合と比較すると、その固
定化反応条件の制約が若干少なくなることも、本発明の
有利な要因の一つである。この様にして得られたＩｇＥ
吸着材は、カラムに充填して体外循環などによる血液浄
化療法に適用される。

【００２３】以下に実施例を示して本発明を詳細に説明
するが、これは本発明を限定するものではなく、前・後
記の趣旨を逸脱しない範囲で本発明を変更して実施する
ことは本発明の範囲内に含まれる。

【００２４】

【実施例】

＜実施例１＞ ＩｇＥ結合性ペプチド（１種類）のセル
ロースへの固定化 （１）ペプチドの合成 （１）〜（９）のアミノ酸配列からなる９種類のペプチ
ド： （１）ＶＳＬＮＰＰＷＮＲＩＦＫＧＥＮＶＴ （２）ＬＴＣＮＧＮＮＦＦＥＶＳＳＴＫＷＦＨＮ （３）ＮＧＳＬＳＥＥＴＮＳＳＬＮ （４）ＮＡＫＦＥＤＳＧＥＹＫＣＱＨ （５）ＳＥＰＶＹＬＥＶＦＳＤＷＬＬＬＱ （６）ＰＬＦＬＲＣＨＧＷＲＮＷＤＶＹＫＶＩＹＹ （７）ＹＹＫＤＧＥＡＬＫＹＷＹＥＮＨＮＩＳ （８）ＳＥＰＬＮＩＴＶＩＫＡＰＲＥＫ （９）ＫＩＫＲＴＲＫＧＦＲＬＬＮＰＨＰＫ はそれぞれ、ペプチドシンセサイザーＭｏｄｅｌ４３０
Ａ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いてｔ−Ｂ
ｏｃ法による固相合成法により合成した。すなわち、各
ペプチドのＣ末端に対応するアミノ酸が結合した支持体
であるＰＡＭ担体（０．５ｍｍｏｌ；アプライドバイオ
システムズ社製）を用いて、上記ペプチドシンセサイザ
ーに掲載されている合成プログラムに従って、ｔ−ブト
キシカルボニル基などの保護基で保護された対応するア
ミノ酸をＮ末端方向に順次縮合反応により結合させ、次
に脱保護基反応を行う工程を繰返してペプチド鎖を延長
した。すなわち、保護基であるｔ−ブトキシカルボニル
基をＴＦＡにより除去し、ジクロロメタン（以下ＤＣＭ
と言う）で洗浄し、ジイソプロピルエチルアミンで中和
した後、ジメチルホルムアミドで洗浄し、ジシクロカル
ボジイミド（ＤＣＣ）で縮合反応を行ない、ＤＣＭで洗
浄する操作を繰返した。なお、本実施例に用いられるア
ミノ酸は各アミノ酸配列中に存在するｔ−Ｂｏｃアミノ
酸（いずれもアプライドバイオシステムズ社製）の２．
０ｍｍｏｌのカートリッジを用いた。

【００２５】（２）脱保護基、ペプチド鎖の切断 上記の様にして（１）〜（９）のアミノ酸配列からなる
ペプチドが結合した各支持体１ｇに、チオアニソールを
１ｍｌ、１，２−エタンジオールを０．５ｍｌ加えて１
０分間撹拌した後、氷水で冷やしながらＴＦＡ１０ｍｌ
を加えてさらに１０分間撹拌した。次に、ＴＦＭＳＡを
１ｍｌ加えて室温で３０分間撹拌した。これに、あらか
じめ充分冷却しておいたジエチルエーテルを、沈殿が生
成しなくなるまで加えて撹拌し、ミディアム孔のガラス
フィルターを用いてジエチルエーテルで共洗いしながら
濾過し、ＴＦＡを加えてペプチドを溶解してエーテル中
に捕集した。エーテル中のペプチドをファイン孔のガラ
スフィルターで濾過し、ガラスフィルター上のペプチド
を２Ｎ酢酸に溶解して、凍結乾燥を行なうことにより粗
ペプチドを得た。

【００２６】（３）ペプチドの精製 上記各粗ペプチドを再度２Ｎ酢酸に溶解して、０．２μ
ｍのメンブレンフィルターで濾過した溶液をＨＰＬＣに
供した。ＨＰＬＣは６００Ｅシステム（ウォーターズ社
製）を用い、カラムは逆相系のＢＯＮＤＡＳＰＨＥＲＥ
−Ｃ１８（ウォーターズ社製）を用いた。移動相は０．
１％ＴＦＡを含む水をＡ液，０．０８％ＴＦＡを含む７
０％アセトニトリル／水（ｖ／ｖ）をＢ液として、Ａ液
からＢ液への濃度直線勾配により溶出した。いずれもク
ロマトピークはほぼ単一なものが得られ、主ピーク相当
画分を分取した。分取を数回繰返しこれを凍結乾燥する
ことにより精製ペプチドを得た。得られたペプチドはＢ
ＩＯＩＯＮ２０マスアナライザー（アプライドバイオシ
ステムズ社製）により解析して目的ペプチドが得られて
いることを確認した。

【００２７】（４）ペプチドの免疫原性 得られたペプチドの免疫原性をＥＬＩＳＡ法により評価
した。まず９６穴マイクロプレート（アミノプレート；
住友ベークライト製）において、グルタルアルデヒド溶
液（ｐＨ９．６）中で上記ペプチドを固相化（４℃，１
６時間）させた。次にスキムミルク溶液でブロッキング
（室温，２時間）した後、ＩｇＥ（ケミコン社製）溶液
を反応させた（４℃，１６時間）。さらにビオチン標識
抗ＩｇＥ抗体（タゴ社製）を反応させ（室温，２時
間）、その後アビジン標識西洋ワサビ由来ペルオキシダ
ーゼを反応させた（室温，２時間）。それぞれの工程の
間には洗浄を行なった。最後に過酸化水素−ｏ−フェニ
レンジアミン溶液（ｐＨ５．０）を加えて遮光下で反応
させ（室温，３０分）、６Ｎ硫酸を加えて反応を停止さ
せて４９２ｎｍで比色定量した。その結果いずれも陽性
と判定されたのでこれらをリガンドとした。

【００２８】（５）ペプチドのセルロースへの固定化 上記ペプチドを多孔質セルロースへ固定化させた。詳細
には、セルロースとしてセルロファインシリーズＧＣＬ
−１０００ｍ（チッソ製）を用い、過ヨウ素酸ナトリウ
ム３．５ｇを１Ｎ硫酸３００ｍｌ中に溶解して、該ＧＣ
Ｌ−１０００ｍを１００ｇ添加し、室温で２０時間撹拌
して反応させた。反応生成物を回収し、十分に洗浄して
［アルデヒド］−［セルロース］を得た。アルデヒドの
含有量はオキシム法により定量を行なったところ、０．
６２ｍｅｑ／ｇであった。

【００２９】次に分子量５０００であり、両末端にアミ
ノ基を有するポリアルキレンオキサイド（以下ＰＥＯア
ミンと言う）１５ｇをｐＨ９．５の炭酸緩衝液３００ｍ
ｌに溶解し、上記［アルデヒド］−［セルロース］を加
えて室温で２４時間撹拌して反応させた。反応生成物を
回収し、十分に洗浄して［ＰＥＯアミン］−［セルロー
ス］を得た。アミノ基の含有量は、ＣＯＭＴＩＴＥ１０
１（平沼産業製）を用いて塩酸による電位差滴定を行な
ったところ、０．５２ｍｅｑ／ｇであった。

【００３０】上記［ＰＥＯアミン］−［セルロース］を
ｐＨ９．５の炭酸緩衝液３００ｍｌに懸濁し、２５％グ
ルタルアルデヒド溶液３０ｍｌを加えて室温で２４時間
撹拌して反応させた。反応生成物を回収し、十分に洗浄
して［ＰＥＯアルデヒド］−［セルロース］を得た。ア
ルデヒドの含有量はオキシム法により定量を行なったと
ころ、０．４８ｍｅｑ／ｇであった。

【００３１】一方上記精製ペプチド２０ｍｇをｐＨ９．
５の炭酸緩衝液５０ｍｌに溶解し、上記［ＰＥＯアルデ
ヒド］−［セルロース］５ｇを加えて、室温で２４時間
撹拌して反応させた。反応生成物を回収し十分に洗浄し
て［ペプチド］−［セルロース］を得た。ペプチド固定
化率は反応残液中の窒素含有量をマイクロケルダール法
により定量することにより算出したところ、いずれも７
０ないし８０％であった。上記［ペプチド］−［セルロ
ース］をｐＨ９．０の炭酸緩衝液５０ｍｌに懸濁して水
素化ホウ素ナトリウム５００ｍｇを加えて、室温で２０
時間撹拌して反応させた。反応生成物を回収し十分に洗
浄して目的のＩｇＥ吸着材を得た。

【００３２】（６）ＩｇＥ吸着材の吸着性能評価 高ＩｇＥ値血清を用いて上記吸着材のＩｇＥの吸着性能
を評価した。すなわち、ガラス製ミニカラムに上記吸着
材ゲル５ｍｌ容量を充填した。ヘパリン含有生理食塩水
でカラムおよび血液回路を十分に洗浄した後、高ＩｇＥ
値（２２．４μｇ／ｍｌ）血清１００ｍｌをプールして
チュービングポンプを用いて１ｍｌ／分の速度で１時間
循環させた。処理後の血清中のＩｇＥ値をＲＡＳＴ法に
より定量し、吸着率（％）を算出した。またアルブミン
の吸着性能（非特異的吸着）に関しても、アルブミンＢ
−テストワコー（和光純薬工業製）を用いて定量し、同
様に吸着率（％）を算出した。なお処理前の血清中のア
ルブミン量は４．４ｇ／ｄｌであった。これらの結果を
表１に示す。なお、表中の（１）〜（９）は本実施例に
用いた（１）〜（９）のアミノ酸配列を示す。

【００３３】

【表１】

【００３４】表から明らかなように、いずれのＩｇＥ結
合性ペプチドを用いた場合においても、ＩｇＥ吸着率は
約４０〜６０％と高い値を示した。これに対して、アル
ブミンの非特異的吸着率は約０．２〜０．５％であり、
非常に低いことがわかった。

【００３５】＜実施例２＞ ＩｇＥ結合性ペプチド（２
種類のＩｇＥ結合性ペプチドを結合）のセルロースへの
固定化 分子量１００であり、両末端にカルボキシル基を有する
ポリアルキレンオキサイド（以下ＰＥＯ酸と言う）５ｇ
をｐＨ４．５のクエン酸緩衝液１００ｍｌに溶解し、こ
れに実施例１の（１）から（４）の工程を経て得られた
（８）および（９）のアミノ酸配列からなるペプチドを
１５ｍｇずつを加えて十分に氷冷して、さらに水溶性カ
ルボジイミドである１−エチル−３−（３−ジメチルア
ミノプロピル）−カルボジイミド（以下ＥＤＣと言う）
５ｍｇを加えて３０分間撹拌して反応させた後、さらに
室温で２０時間反応させて（８）および（９）のペプチ
ドがいずれもアミノ基でＰＥＯ酸に縮合した修飾ペプチ
ドの溶液を得た。

【００３６】上記修飾ペプチド溶液を十分に洗浄した
後、実施例１の（５）と同様の方法で得た［ＰＥＯアミ
ン］−［セルロース］（アミノ基含有量：０．５４ｍｅ
ｑ／ｇ）５ｇを加えてさらにＥＤＣ５ｍｇを加えて３０
分間撹拌して反応させた後、さらに室温で２０時間反応
させた。反応生成物を回収し、十分に洗浄して目的のＩ
ｇＥ吸着材を得た。ペプチド固定化率を実施例１と同様
にして求めたところ、約７５％であった。この様にして
得られたＩｇＥ吸着材の吸着性能に関しても実施例１と
同様の方法により実施した。結果を上記表１に併記す
る。

【００３７】表から明らかなように、本実施例のＩｇＥ
結合性ペプチドを用いた場合には、約９０％と非常に高
いＩｇＥ吸着率を示した。これは実施例１のいずれのペ
プチドを用いた場合よりも高く、２種類のＩｇＥ結合性
ペプチドを組み合わせて用いることによりＩｇＥ吸着能
は一層高まることが明らかになった。なお、本実施例に
おいても実施例１と同様にアルブミンの非特異的吸着率
は０．４％と非常に低かった。

【００３８】

【発明の効果】本発明のＩｇＥ吸着材は、血液中のＩｇ
Ｅと特異的に感度良く結合することができるので、重篤
なアトピー性疾患や高ＩｇＥ症候群の治療に適用するこ
とが可能である。また、本発明のＩｇＥ吸着材をカラム
に充填して血液浄化療法などの治療法にも用いることが
できるが、この治療法は副作用もなく安全性が高いもの
であり、保存などの安定性の面でも非常に有用であるこ
とが期待される。また、本発明のＩｇＥ吸着材はオート
クレーブによる蒸気滅菌を行なってもリガンドとしての
活性の低下がほとんど生じないことから、種々の医療機
材への適用が期待される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 稲森 和紀 滋賀県大津市堅田２丁目１番１号 東洋紡 績株式会社総合研究所内

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ＩｇＥＦｃε高アフィニティレセプター
   におけるアミノ酸配列中に存在しており、ＩｇＥとの結
   合性を有するＩｇＥ結合性ペプチドまたは該ＩｇＥ結合
   性ペプチド領域を含む修飾ペプチドを水不溶性担体に固
   定化したものであることを特徴とするＩｇＥ吸着材。
2. 【請求項２】 前記ＩｇＥ結合性ペプチドは、以下の
   （１）〜（９）よりなる群から選択されるアミノ酸配列
   を有する請求項１に記載のＩｇＥ吸着材。 （１）Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｐｒ
   ｏ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ
   −Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ （２）Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｓ
   ｎ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ
   −Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−
   Ａｓｎ （３）Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌ
   ｕ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ
   −Ａｓｎ （４）Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ａｓ
   ｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ
   −Ｇｌｎ−Ｈｉｓ （５）Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｌｅ
   ｕ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ
   −Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ （６）Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｃｙ
   ｓ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ
   −Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−
   Ｔｙｒ−Ｔｙｒ （７）Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌ
   ｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ
   −Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ （８）Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｉｌ
   ｅ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｐｒｏ
   −Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ （９）Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ａｒ
   ｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ
   −Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ
3. 【請求項３】 前記修飾ペプチドは、前記ＩｇＥ結合性
   ペプチド領域の両末端または片末端が （ａ）α−アミノ酸 （ｂ）α−アミノ酸を２から６０個含有するペプチド （ｃ）炭素数が１から２０個のω−アミノ酸、ジアミ
   ン、またはジカルボン酸のいずれか のいずれかで修飾されたものである請求項１または２に
   記載のＩｇＥ吸着材。