CN114533895A - 偶联抗体的化合物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明内容涉及化学合成小分子免疫激动剂和抗体偶联缀合物，属于化学生物学领域。本发明提供了偶联抗体的化合物及其应用。本发明应用抗体Fc亲和肽诱导的抗体偶联法，一步达到对抗体Fc区的限定偶联，或一步增倍对抗体的Fc区亲和作用。本发明的偶联方法能够较大提高ADC的制备效率及产品均一性、偶联小分子的Fc分布比例高，偶联产物的抗肿瘤效果很大提高。
Description
技术领域
本发明内容涉及化学合成小分子免疫激动剂，和抗体偶联缀合物，属于化学生物学领域。
技术背景
抗体偶联药物(ADC)作为大分子靶向药物，具有靶向性强和特异性高等优点。但是抗体随机偶联小分子化合物的位点不确定性，造成了产品均一性差的问题，这对于生产的稳定性和产品质量控制带来了很大的困难，也影响抗体的靶向活性。
本发明应用抗体Fc亲和肽诱导的抗体偶联法，一步达到对抗体Fc区的限定偶联，或一步增倍对抗体的Fc区亲和作用。比较随机偶联方法，本发明的偶联方法能够较大提高ADC的制备效率及产品均一性、偶联小分子的Fc分布比例高，偶联产物的抗肿瘤效果很大提高。
本发明在前期研究经验基础上，筛选合成了新的系列小分子免疫激动剂，验证了免疫激活效果和偶联抗体的免疫激活效果及其抗肿瘤效果。
发明内容
本发明第一方面提供了一种化合物，其结构如式I所示：
其中，Fc-亲和肽表示和抗体的Fc区具有亲和力的多肽；Y表示具有免疫调节功能和/或抗肿瘤作用的
的非羧基部分；X＝O或NH；n＝1-10；
优选地，所述抗体为IgG抗体；
优选地，所述Fc-亲和肽选自：
优选地，
选自表1：
本发明第二方面提供了一种制备抗体偶联缀合物的方法，其中使用第一方面所述的化合物与抗体在抗体的Fc区发生偶联反应，从而获得抗体偶联缀合物，其合成路线如下所述：
其中，Fc-亲和肽和Y如第一方面所述；X＝O或NH；n＝1-10。
本发明第三方面提供了一种化合物，其结构如式II所示：
其中Fc-亲和肽如第一方面所述；X＝O或NH；
优选地，所述化合物的结构如式III或式III-1所示：
本发明第四方面提供了一种化合物，其选自以下：
本发明第五方面提供了第四方面所述的化合物在制备第一方面所述的化合物中的用途；和/或在制备抗体偶联缀合物、蛋白偶联缀合物和多肽偶联缀合物中的用途。
本发明第六方面提供了第一方面或第三方面所述的化合物在制备抗体偶联缀合物、蛋白偶联缀合物和多肽偶联缀合物中的用途。
本发明第七方面提供了第一方面所述的表1中的化合物，在制备第一方面所述的化合物中的用途；和/或在制备抗体偶联缀合物、蛋白偶联缀合物和多肽偶联缀合物中的用途；和/或在制备免疫调节药物中的用途。
本发明第八方面提供了一种化合物，其结构如式IV或V所示：
其中的Fc-Peptide表示对抗体的Fc区具有亲和力的多肽；优选地，Fc-Peptide选自：
优选地，所述抗体为IgG抗体。
本发明第九方面提供了一种制备抗体偶联缀合物的方法，其中，使用第八方面所述的化合物与抗体在抗体的Fc区发生偶联反应，生成偶联抗体产物VI；随后，偶联抗体产物VI在还原剂的存在下生成还原产物VII；然后还原产物VII与
发生偶联反应，生成抗体偶联缀合物VIII；其合成路线如下：
优选地，所述抗体为IgG抗体。
在一个具体的实施方案中，
选自表2：
本发明第十方面提供了表2中的化合物在制备抗体偶联缀合物、蛋白偶联缀合物和多肽偶联缀合物中的用途；和/或在制备免疫调节药物中的用途。
本发明第十一方面提供了第八方面所述的化合物在制备抗体偶联缀合物、蛋白偶联缀合物和多肽偶联缀合物中的用途。
本发明第十二方面提供了抗体偶联缀合物在制备免疫调节药物中的用途；其中偶联到抗体上的化合物选自表1中的化合物或表2中的化合物；优选地，所述抗体是曲妥珠单抗或阿特珠单抗。
本发明第十三方面提供了一种化合物，其选自表6：
本发明第十四方面提供了表6中的化合物在制备第一方面所述的化合物、表1中的化合物或表2中的化合物中的用途；和/或在制备抗体偶联缀合物、蛋白偶联缀合物和多肽偶联缀合物中的用途；和/或在制备免疫调节药物中的用途。
附图说明
图1表示抗体的一步法Fc区偶联示意图。
图2表示Fc区双偶联示意图。
图3表示常用抗体分析方法。
图4表示应用IdeS酶特异裂解单抗得到2个Fc单链。
图5表示应用IdeS酶特异裂解偶联小分子的单抗得到2个偶联的Fc单链。
图6表示酶切抗体的特点比较(https://www.biomart.cn/11964/news/2889992.htm https://www.genovis.com/products/igg-proteases/fabricator/)。
图7表示FabRICATOR-HPLC系统分离效果。
图8表示曲妥珠单抗去糖质谱。
图9表示肝微粒体酶的代谢作用。
图10表示Cathepsin-B酶催化裂解释放化合物作用。
图11表示抗体偶联缀合物的溶酶体代谢产物。
图12表示Her2-GY101抑制肿瘤图。
图13表示阿特珠单抗-5-5-8抑制肿瘤图。
具体实施方式
本发明提供了一种制备抗体偶联缀合物的方法，其基本合成路线如图1所示，
其中，Fc-亲和肽表示和抗体的Fc区具有亲和力的多肽；Y表示具有免疫调节功能和/或抗肿瘤作用的
的非羧基部分；
X＝O或NH。
优选Fc-亲和肽(Fc-Peptide)为：
Fc-Peptide中的S-S代表二个半胱氨酸(cysteine)之间形成的二硫键。可以替换为任意对抗体Fc段具有高亲和力的多肽或化合物。例如Fc-III肽[DCAWHLGELVWCT：(C-C连接环肽)(Science，Vol：287.；18February,2000,1279-1283)]及其衍生改进的其它Fc亲和肽。
本发明提供了一种化合物，其结构如式I所示：
本发明提供了一种化合物，其结构如式II所示:
X＝O或NH。
当X＝NH时，式II的代表式为式III：
当X＝O时，式II的代表式为III-1：
式I中的
一般代表具有功能的小分子羧酸化合物，根据抗体的作用，包括但不限于小分子免疫激活剂，TLR7、TLR8、TLR2、TLR4、TLR9等免疫调节剂(激动剂和拮抗剂)，STING激动剂，免疫抑制剂，酶抑制剂，抗肿瘤靶向药物，抗肿瘤毒素，抗炎小分子和抗炎激素，蛋白信号指示肽，抗原肽，趋化因子抑制剂，受体激活剂或抑制剂，发色指示剂等。
以化合物5和6为代表的式III-1的化合物(5)及式I的化合物(6)的合成路线如下：
合成路线1.化合物5和6的合成
GY101为：
化合物5的类似物8也可以如下路线合成：
由图1可见，本发明的抗体Fc区定位偶联小分子化合物只用一步反应，即达到Fc区偶联的选择性，又同时消除了Fc亲和肽，简洁易行，效率高。
以化合物5和6为代表的偶联链合成方法举例：
将化合物1(115mg，1mmol)溶解在四氢呋喃(THF)中(5mL)，加入化合物2(95mg)，室温搅拌反应6小时。减压旋转蒸发除去溶剂，残余物用10％碳酸钠溶液溶解，过滤得清液，滤液在冰水浴冷却下，用稀盐酸调节pH5，析出固体产物，过滤，真空干燥得化合物3(188mg，收率91％)；ESI-MS:m/z＝206.10[M+H]+。
取化合物3(100mg，0.48mmol)溶解在5mL的无水二甲基亚砜(DMSO)中，加入EDC.HCl(109mg，0.57mmol)，混合物室温震荡6小时。加入Fc-Peptide(996mg，上海诺优生物科技有限公司合成)，室温搅拌过夜。反应混合物用HPLC分离纯化，冷冻干燥得化合物5(615mg，收率56％)。LC-MS：m/z＝764[(M/3)+H]+。
将化合物5(300mg)和GY101(65mg)混合溶解在5mL的DMSO中，加入15mg的EDC.HCl,混合物室温搅拌过夜。反应液冷冻干燥，缓慢加入0℃的水5mL，保持0℃搅拌均匀，析出的固体过滤，真空干燥得化合物6(312mg，收率86％)；LC-MS：m/z＝923[(M/3)+H]+。
以化合物8为代表的偶联链合成方法举例：
取150mg的Fc-peptide溶解在3mL的DMSO中，加入26mg的二甲氨基吡啶(DMAP)和15mg的Traut(2-亚氨基硫烷盐酸盐)。混合物室温反应2小时，直接冷冻干燥。冻干物溶解在少量溶剂(5：1，水/三氟乙酸(TFA))，HPLC纯化，冷冻干燥得67mg化合物7(收率43％)。LC-MS：m/z＝726[1M/3]+。
将50mg的化合物7和3mg的化合物1混合溶解在2mL的DMSO中，室温密闭震荡反应2小时。冷冻干燥，冻干物溶解在少量溶剂(5：1，水/TFA)，HPLC纯化，冷冻干燥得化合物8纯品45mg(收率85％)。LC-MS：m/z＝764[(M/3)+H]+。
化合物5也可以如下方法一步合成：
将Fc-Peptide：2-2：1，以等摩尔比混合溶解在DMSO中，加入2当量的DMAP，室温搅拌6小时，后处理同合成路线1，即得化合物5。
化合物4的类似物4-3也可以由如下路线合成：
将化合物a和b(1：1mol)混合在DMSO中，室温反应2小时后冷冻干燥。干燥物溶解在乙酸酐中回流1小时，冷却后加入2倍溶剂量的乙醚析出化合物e。滤出干燥。化合物e溶解在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，加入3倍当量的羟胺回流反应4小时，减压蒸出溶剂得化合物g。将化合物g溶解在甲醇中，加入2当量的LiOH，40度反应1小时，减压蒸出溶剂，残余物溶解在适量纯冰水，用冰醋酸调节至pH值4-5之间，析出化合物3-3，HPLC纯化得3-3，LC-MS：m/z＝220.03[M+1]+。将3-3溶解在适量的二氧六环溶剂，加入等当量的EDC.HCl,室温搅拌反应10小时，减压蒸馏除去溶剂，残余物用冰水搅拌5分钟，离心分离出固体，真空干燥即得4-3。
用合成化合物6同样的方法，使用表1中的化合物可得如下式I-1或I-2的化合物，质谱检测结果如下：
表1中化合物的合成
HPLC条件
流动相：45％乙腈和55％水(1％甲酸)，等梯度洗脱，流速5mL/min；紫外：254nm；仪器型号：Agilent 1260infinity；色谱柱型号：YMC-Pack ODS-A，250×20mm S-5μm.12nm。
LC-MS条件
流动相：
紫外：254nm
物质鉴定质谱仪型号Angilent
液相：1260infinity||
质谱：G6125B
色谱柱型号：YMC-Pack ODS-A 150×4.6mm S-5μm.12nm
Compound 1011的合成：
将化合物GY101(100mg)溶解在乙二醇二甲醚中(5mL)，加入10mg的对甲苯磺酸和二氢吡喃(55μL),混合物于50℃震荡反应6小时。降压蒸馏除去溶剂，残余物HPLC分离纯化得化合物1011(65mg,收率56％)；ESI-MS:m/z＝579.2[M+H]+。
Compound 2T(Scheme-1)的合成：
将化合物GY100(100mg)，溶解在适量DMSO中，加入0.1当量的DMAP；10℃温度下滴加等当量的化合物a(52mg)，缓慢升温室温搅拌3小时。冷冻干燥，粗品溶解在少量甲醇，HPLC分离产品得纯品GY194(107mg，收率78％)，ESI-MS:m/z＝361.1[M+H]+。
将GY194(100mg)，化合物b(65mg)溶解在纯水和DMSO的混合溶剂(1：3体积比溶剂)1mL中，加入8mg的L-抗坏血酸钠和8mg的无水硫酸铜。混合物室温反应5小时。冷冻干燥，粗品溶解在少量甲醇，HPLC分离产品得纯品compound 2T(102mg，收率62％)，ESI-MS:m/z＝594.3[M+H]+。
Compound 4T(Scheme-2)的合成：
将a1(100mg)，GY100(125mg)溶解在纯水和DMSO的混合溶剂(1：3体积比溶剂)2mL中，加入18mg的L-抗坏血酸钠和18mg的无水硫酸铜。混合物室温反应6小时。冷冻干燥，粗品溶解在少量甲醇，HPLC分离产品得纯品Bi-102-NH(81mg，收率36％)，ESI-MS:m/z＝942.5[M+H]+。
将化合物Bi-102-NH(50mg)和化合物b1(7mg)等摩尔混合在无水四氢呋喃，加入等当量的N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)，混合物室温反应12小时。减压蒸除溶剂，残余物溶解在少量水中，用醋酸调节pH值4，HPLC分离得纯品Compound 4T(44mg，收率77％)，ESI-MS:m/z＝1070.5[M+H]+。
Compound 5T(Scheme-3)的合成：
取Bi-102-NH(100mg)和1.2倍摩尔当量的b2(18mg)及c2(27mg)溶解在3mL的二氧六环中，加入1.2倍当量的DIPEA；混合物室温搅拌反应12小时。减压蒸馏除去溶剂，残余物溶解在3：1体积比的甲醇-水溶剂2mL中，盐酸调节pH值4，产物HPLC分离纯化，得化合物Compound 5T(33mg，收率25％)，ESI-MS:m/z＝1254.6[M+H]+，628.2[(M/2)+H]+。
Compound 6T的合成：
将化合物GY100(100mg)和N3-PEG3-NH(89mg)溶解在DMF-去离子水溶剂(3：1体积比，4mL)，加入10mg的无水CuSO4、10mg的L-抗坏血酸钠。混合物室温搅拌10小时。反应混合物冷冻干燥，冻干物直接HPLC分离纯化得化合物100-1(117mg，收率62％)；ESI-MS:m/z＝494.2[M+H]+。
取100-1(100mg)溶解在DMF中(5mL)，加入DIPEA(36μL)；10℃的冰水外浴冷却下，缓慢加入丁二酸酐(21mg)。加完后室温自然搅拌12小时。减压蒸馏除去溶剂，残余物加入10mL去离子水，用稀盐酸调节pH至4，析出白色固体，离心过滤，得化合物6T(94mg，收率78％)；ESI-MS:m/z＝594.3[M+H]+
Compound 7T的合成：
取VCB-3(100mg)溶解在1mL的DMSO中，加入丁二酸酐(16mg)，加入20μL的TEA，混合物室温搅拌6小时，反应混合物冷冻干燥，冻干物加入2mL水，用醋酸调节pH4.5，析出固体，离心分离得Conpound 7T(98mg，收率85％)；ESI-MS:m/z＝723.3[M+H]+。
Compound 7T-1的合成：
将等摩尔比例的7T和GY155混合溶解在DMF-水(3：1)体系中，在CuSO4和L-抗坏血酸钠催化下进行click反应，反应物冷冻干燥后，冻干物用HPLC分离纯化即得7T-1：ESI-MS:m/z＝615.0[(M/2)+H]+。
Compound 14(Schems-4)的合成：
将化合物a3(100mg)和b3(42mg)溶解在5mL无水二氧六环溶剂中，加入等当量的N-羟基丁二酰亚胺(NHS)和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)及DIPEA，室温搅拌6小时。减压蒸馏除去溶剂，HPLC纯化得SZU-275(ESI-MS:m/z＝471.4[M+H]+)。加入10mg的LiOH，5mL甲醇，溶液加热回流30分钟。减压蒸馏去除溶剂，加入3mL纯水，醋酸调节pH4，析出compound 14(75mg，收率56％)，ESI-MS:m/z＝457.2[M+H]+。
Compound 15(Schems-5)的合成：
将化合物a4(300mg)溶解在10mL的DCM中，加入等当量的丁二酸酐。冷却下缓慢加入3当量的无水AlCl3；混合物在氮气保护下回流1小时。减压蒸出溶剂，加入冰水搅拌析出固体，过滤、干燥得b4。将b4溶解在10mL无水乙醇，冰水冷却下缓慢滴加入3mL的SOCl2；氮气保护下室温反应过夜。减压蒸馏除去溶剂，残余物硅胶柱层析(CH2Cl2：甲醇＝5：1体积)，得化合物c4(209mg)。
取化合物c4(100mg)，溶解在5mL的乙腈中，加入AgF2(3当量)；反应混合物避光于50℃反应1小时。减压蒸馏出溶剂得化合物d4，加入浓盐酸3mL室温搅拌过夜。过滤，减压蒸馏出溶剂，残余物HPLC纯化，得Compound 15(45mg，收率47％)；ESI-MS:m/z＝255.0[M+H]+。
Compound 17(Schems-6)的合成：
取化合物a5(100mg)和溴丙炔(47mg)溶解在5mL的DMF中。加入等当量的K2CO3，混合物室温搅拌反应6小时。反应混合物过滤，滤液中加入1.5mL的水，化合物c5(87mg)，6mg的无水硫酸铜和6mg的L-抗坏血酸钠后，混合物室温反应6小时，加入3mL浓盐酸，室温搅拌过夜。反应混合物减压浓缩，HPLC分离纯化，得化合物Compound 17(46mg，收率23％)，ESI-MS:m/z＝509.2[M+H]+。
Compound 17-1的合成：
化合物17-1的合成方法按照化合物1-1的相同合成方法，得化合物17-1(收率55％)：ESI-MS:m/z＝593.3[M+H]+。
Compound 19(Schems-7)的合成：
将a6(300mg)和NHS(105mg)混合溶解在10mL的DMSO中，加入等当量的EDC.HCl和3当量的DIPEA，混合物室温搅拌2小时；继续加入b6(82mg)后，室温搅拌反应过夜。反应液冷冻干燥，干燥物与10mL甲醇和5mL水含LiOH(100mg)的溶液混合，混合物40℃搅拌反应4小时。减压蒸馏除去溶剂，残余物加入10mL水，过滤，滤液用稀盐酸调节pH值4，过滤出固体，将固体溶解在少量DMF中，用HPLC纯化，得化合物d6(221mg，收率31％)，ESI-MS:m/z＝775.3[M+H]+。
取d6(100mg)和NHS(15mg)溶解在5mL的DMSO中，加入等当量的EDC.HCl和3当量的DIPEA，混合物室温搅拌2小时。再将27mg的e6溶剂在200μL的DMSO中，于10℃下缓慢滴入；然后自然室温搅拌反应6小时。反应混合液冷冻干燥，干燥物溶于少量甲醇，用HPLC分离纯化，得Compound 19(67mg，收率54％)，ESI-MS:m/z＝964.5[M+H]+。
Compound 20(Schems-8)的合成：
取a7(100mg)溶解在2mL的干燥DMSO中，加入DIPEA(40mg)，5℃下缓慢加入己二酸酐(36mg)，自然室温反应6小时。反应液冷冻干燥，冻干物加入到5mL水中，稀盐酸调节pH值5，析出固体过滤，干燥得compound20(105mg，收率77％)；ESI-MS:m/z＝482.2[M+H]+。
Compound 21(Schems-9)的合成：
化合物21的合成与化合物20的合成方法相同，得化合物21；ESI-MS:m/z＝480.2[M+H]+。Compound 22(Schems-10)的合成：
将TN-acid(50mg)溶解在3mL的DMSO中，加入38μL的TEA；加入SZU-102(105mg)，室温反应6小时。冷冻干燥，冻干物溶解在少量甲醇-水(3:1体积)，稀盐酸调节pH值5，用HPLC纯化得compound22(99mg,收率65％)；ESI-MS:m/z＝1147.4[M+H]+。
化合物TN-Acid的合成按照如下路线：
将T-Amine(200mg)和B-Yene(80mg)以及K2CO3(180mg)在DMF(10mL)中混合溶解，加入微量KI催化。混合物室温搅拌反应12小时，将反应物过滤，向滤液中加入1/3体积的水、和反应物等当量的N3-Acid、L-抗坏血酸钠(8mg)、无水硫酸铜(8mg)，室温反应6小时。反应混合物过滤，滤液减压蒸馏除去溶剂，残余物HPLC分离纯化得化合物BocTN(125mg，收率33％)；ESI-MS:m/z＝575.3[M+H]+。
将100mg的BocTN加入到3mL的TFA/DCM(1:3体积)的溶液中，室温搅拌1小时。反应物直接HPLC纯化，洗脱液冷冻干燥得TN-Acid.3TFA(90mg，收率72％)；ESI-MS:m/z＝375.2[M+H]+。
Compound 23(Schems-11)的合成：
将化合物a9(300mg)溶解在5mL的DMSO中，加入等摩尔的DIPEA；室温下缓慢加入b9(130mg)，继续于室温反应12小时。反应物冷冻干燥，冻干物加入5mL水，用醋酸调节pH4，析出固体化合物，真空干燥得c9(322mg)；ESI-MS:m/z＝372.1[M+H]+。
取化合物c9(300mg)溶解在5mL的DMSO中，加入等摩尔的NHS、EDC.HCL和DIPEA，室温搅拌1小时。加入d9(176mg)，继续室温搅拌反应过夜。反应混合物冷冻干燥，加入5mL水，析出的固体真空干燥得化合物e9(286mg，62％)；ESI-MS:m/z＝572.2[M+H]+。
取化合物e9(250mg)溶解在10mL甲醇，加入f9(53mg)，室温反应12小时。加入Pd/C(250mg)，通入氢气(常温常压)氢化还原24小时。反应物过滤，减压蒸馏除去溶剂，残余物用制备HPLC纯化得h9(149mg，收率51％)；ESI-MS:m/z＝666.2[M+H]+。
取h9(120mg)、CS2(67mg)、TEA(125μL)溶解在1mL的DMF中，室温反应过夜。加入TsCl(63mg)，继续室温反应5小时。产物直接HPLC纯化，纯化液冷冻干燥得化合物i9(48.5mg，收率38％)；ESI-MS:m/z＝708.2[M+H]+。
取化合物i9(30mg)、化合物j9(21mg)和TEA(10μL)混合溶解在2mL的DMSO中，室温反应过夜。冷冻干燥，干燥物中加入少量甲醇溶解，HPLC纯化，纯化液冷冻干燥，得Compound23(26mg，收率51％)；ESI-MS:m/z＝1193.4[M+H]+。
Compound 24(Schems-12)的合成：
将Bi-102-NH(47mg)和DMAP(6mg)混合溶解在2mL的DMSO中，15℃下缓慢加入b10(32mg)，继续室温搅拌反应6小时。加入0.5mL的TFA，室温搅拌1小时。反应混合物冷冻干燥，冻干物溶解于少量甲醇，HPLC纯化得化合物c10(30mg,收率45％)；ESI-MS:m/z＝1347.7[M+H]+。
将c10溶解在适量DMSO中，加入2倍当量的DIPEA，1倍当量的b1，室温反应1小时，冷冻干燥，冻干物溶解在纯水和甲醇(1：1体积)，醋酸调节pH5，HPLC纯化，得化合物Compound24；ESI-MS:m/z＝1475.7[M+H]+。
Compound 25(Schems-13)的合成：
将化合a11(100mg)溶解在5mL的DMSO中，加入2当量的NHS、EDC.HCl和DIPEA，混合室温搅拌3小时，缓慢加入274mg的化合物e11，继续室温搅拌反应过夜。反应液冷冻干燥，冻干物溶解在10mL的二氯甲烷，冰水浴冷却下，慢慢加入3mL的TFA，室温搅拌5小时。减压蒸馏除去溶剂，残余物HPLC纯化，得c11的TFA盐纯品(205mg，收率56％)；ESI-MS:m/z＝842.4[M+H]+。
将化合物c11(100mg)溶解在3mL的DMF中，加入41mg的d11，50mg的K2CO3，混合物搅拌室温反应12小时，过滤，滤液减压蒸馏除去溶剂，残余物加入2mL的浓盐酸，室温搅拌8小时。减压蒸馏除去溶剂，加甲醇-水(1：1体积)溶解，HPLC纯化，纯化液冷冻干燥得Compound25的盐酸盐(46mg，收率42％)；ESI-MS:m/z＝1018.4[M+H]+。
Compound 26(Schems-14)的合成：
Compound 26的合成方法与Compound 25的合成方法相同，得Compound 26的盐酸盐；ESI-MS:m/z＝966.5[M+H]+。
Compound 27(Schems-15)的合成：
将化合物a13(50mg)和GY100(42mg)溶解在DMSO-水(4：1体积)的混合溶液中，加入L-抗坏血酸钠(4mg)、无水硫酸铜(4mg)，室温反应6小时。反应混合物过滤，滤液冷冻干燥，残余物HPLC分离纯化得化合物Compound27(33mg，收率36％)；ESI-MS:m/z＝1150.6[M+H]+。
Compound 28(Schems-16)的合成：
将化合物142(345mg)溶解在15mL的DMSO中，缓慢加入等当量的依康酸酐(112mg)；将等当量的DIPEA(130mg)溶解在1mL的二氯甲烷中，缓慢滴入后，反应混合物于室温搅拌反应12小时。反应物冷冻干燥，干燥物溶解在5mL纯水中，用醋酸调节pH至4，析出固体过滤，真空干燥，得化合物a14(420mg，收率92％)；ESI-MS:m/z＝457.2[M+H]+。
取化合物a14(200mg)溶解在5mL的DMSO中，加入化合物142(150mg)，再加入EEDQ(130mg)。反应混合物室温搅拌过夜后，直接冷冻干燥，干燥物溶解在少量甲醇，用HPLC制备分离纯化，得化合物b14(274mg，收率80％)；ESI-MS:m/z＝783.2[M+H]+。
取化合物b14(100mg)溶解在3mL的二氧六环中，加入DIPEA(50mg)、加入c14(18mg)。反应混合物在氮气保护下室温搅拌8小时。减压蒸馏除去溶剂，残余物中加入纯水溶解，过滤，滤液用稀盐酸调节pH值5，析出固体，真空干燥得化合物Compound 28(52mg，收率45％)；ESI-MS:m/z＝903.3[M+H]+。
Compound 30(Schems-17)的合成：
将化合物a15(1g)和化合物b15(358mg)等摩尔量溶解在二氯甲烷溶剂中(20mL)，加入K2CO3(700mg)于室温搅拌12小时。过滤，滤液减压蒸除溶剂，得c15粗品。取此粗品(100mg)和GY155(250mg)溶解在5mL的DMSO中，加入1mL纯水、10mg的L-抗坏血酸钠和10mg的无水CuSO4。混合物室温反应过夜，然后直接冷冻干燥；冻干物和10mL的NaHCO3饱和溶液于50℃搅拌反应12小时；反应液过滤得清液，清液用TFA调节pH值至5，用制备HPLC纯化，纯化液减压蒸馏浓缩得Compound 30纯品的TFA盐(145mg，收率38％)。ESI-MS:m/z＝659.3[M+H]+。
Compound 31(Schems-18)的合成：
将化合物c15(200mg)与10mL的饱和NaHCO3溶液于溶液于50℃搅拌反应12小时；反应液过滤得清液，清液用TFA调节pH值至5，用制备HPLC纯化，纯化液减压蒸馏浓缩得a16的TFA盐(136mg,收率46％)；ESI-MS:m/z＝154.0[M+H]+。
取a16-TFA盐(100mg),阳离子交换树脂(Dowex50)进行分离，产品用5％氨-甲醇溶液洗脱，减压蒸除溶剂得a16(41mg，收率71％)；ESI-MS:m/z＝154.0[M+H]+。
取a16(30mg)溶解在溶解在12mL的水-乙腈溶剂(2：1体积比)，冰水浴冷却至5℃，加入CDMT(34.4mg)，N-甲基吗啉(30mg)；反应液室温搅拌反应1小时，再加入Bi-102-NH(185mg)，继续室温搅拌反应过夜。反应液冷冻干燥，冻干物用HPLC分离纯化得Bi-102-ABY(112mg，收率53％)；ESI-MS:m/z＝1077.2[M+H]+。
取Bi-102-ABY(100mg)，b16(15mg)，无水硫酸铜(3mg)，L-抗坏血酸钠(3mg)混合在4mL的水-DMF(1：3体积)溶剂中；混合物室温反应12小时。反应液冷冻干燥，HPLC分离纯化得化合物Compound 31(Bi-102-AB)(49mg，收率43％)；ESI-MS:m/z＝617.0[(M/2)+H]+。
Compound 32的合成：
Compound 32(GY102-Ncid)的合成，按照Compound 31(Bi-102-AB)的合成相同的方法，得化合物a17：ESI-MS:m/z＝615.5[M+H]+；进一步和c5进行click反应得Compound 32(收率47％)；ESI-MS:m/z＝848.4[M+H]+。
Compound 33(Schems-19)的合成：
将化合物a15和a18等摩尔量溶解在适量的DMF溶剂中，加入等当量的K2CO3和催化量的KI；混合物室温搅拌反应12小时。反应液过滤，滤液减压蒸馏除去溶剂，加入饱和NaHCO3溶液，二氯甲烷萃取3次，合并萃取液，蒸馏除去二氯甲烷得b18(收率80--86％)；ESI-MS:m/z＝206.1[M+H]+。
取b18(50mg),GY155(246mg),无水硫酸铜(20mg),L-抗坏血酸钠(20mg)混合溶解在DMF-水(3:1体积)的溶剂(12mL)中；混合物室温搅拌反应12小时。冰水浴搅拌5℃下缓慢加入4mL的浓盐酸，加完后继续室温搅拌6小时。降压蒸馏除去溶剂，残余物5℃下缓慢加入饱和NaHCO3溶液至pH8。反应物用阳离子交换树脂(Dowex50)进行分离，产品用5％氨-甲醇溶液洗脱，减压蒸除溶剂得Compound 33(Bi-GY155-Ncid)(90mg，收率31％)；ESI-MS:m/z＝594.1[(M/2)+H]+。
Compound 34(Schems-20)的合成：
参照化合物5-20的合成方法，将N3-PEG3-M替换为N3-PEG3-Acid，可得Compound34；ESI-MS:m/z＝454.1[(M/3)+H]+。
Compound 35(Schems-21)的合成：
将BG001(100mg)和BocNB(72mg)混合溶解在5mL的DMF中，加入100mg的K2CO3；形成的混合物室温搅拌10小时。过滤，滤液与5℃冰水冷却下加入1mL的TFA后，继续室温搅拌3小时。反应液减压蒸馏除去溶剂，残余物加入5mL冷水，用Na2CO3中和至pH9，二氯甲烷(10mL)萃取3次，合并萃取液，蒸馏除去溶剂得BG002(103mg，收率91％)；ESI-MS:m/z＝362.2[M+H]+。
将Boc-Val-Ala-PAB-PNP(100mg)溶解在无水DMSO(3mL)中；BG002(65mg)溶解在1mL的无水DMSO中，加入DIPEA(35μL)；在冰水浴冷却下，将BG002的溶液缓慢滴加入Boc-Val-Ala-PAB-PNP的溶液中，加完后，室温震荡反应3小时后，反应物冷冻干燥，向冻干物中加入二氯甲烷-TFA(3：1体积比，4mL)，继续室温震荡反应1小时。真空室温抽除溶剂，残余物用HPLC分离纯化得Val-Ala-PAB-BG.2TFA盐(93mg，收率57％)；ESI-MS:m/z＝681.4[M+H]+。
取Val-Ala-PAB-BG.2TFA(80mg)和DIPEA(60μL)溶解在2mL的DMSO中，加入丁二酸酐(10mg)；混合物室温震荡反应8小时。反应液冷冻干燥，冻干物溶解在甲醇-水(1：1体积比，1mL)中，用少许醋酸调节pH6，然后直接HPLC分离纯化得化合物35(26mg，收率38％)；ESI-MS:m/z＝781.4[M+H]+。
Compound 36(Schems-22)的合成：
将化合物KJ-001(126mg)和3-溴丙炔(60mg)溶解在5mL的DMF中，加入100mg的K2CO3；混合物室温搅拌反应过夜。过滤，滤液减压浓缩至少量体积，继续冷冻干燥。冻干物加入浓盐酸(2mL)搅拌8小时，用Na2CO3中和至pH6析出固体，过滤，水洗得KJ-017(113mg，收率82％)；ESI-MS:m/z＝276.1[M+H]+。
取KJ-017(100mg)和N3-NHB(68mg)溶解在4mL的DMF-水(3：1体积比)中，加入8mg的无水CuSO4和8mg的L-抗坏血酸钠；形成的混合物室温搅拌12小时。过滤，滤液冷冻干燥，冻干物加入DCM-TFA(3：1体积比，4mL)后，室温搅拌3小时，真空室温抽除溶剂，残余物加入饱和NaHCO3溶液充分搅拌，析出的固体离心沉淀分离得KJ-018(80mg，收率61％)；ESI-MS:m/z＝362.2[M+H]+。
按照合成化合物35的同样步骤方法，将KJ-018和Boc-Val-Ala-PAB-PNP反应后再用DCM-TFA脱Boc得到Val-Ala-PAB-KJ(ESI-MS:m/z＝681.3[M+H]+)；Val-Ala-PAB-KJ和丁二酸酐反应得到化合物36(ESI-MS:m/z＝781.3[M+H]+)。
Compound 37(Schems-23)的合成：
按照化合物35、36的相同合成方法，可以得到化合物GY018((ESI-MS:m/z＝348.2[M+H]+)；得到化合物37((ESI-MS:m/z＝767.3[M+H]+)。
表1中的化合物可以和各种碱生成盐，提高水溶解性。
另一方面，为了更进一步加强Fc区偶联的选择性，本发明应用双Fc亲和肽偶联法，其合成路线如图2所示，其中的Fc-Peptide意义如前所述；使用式IV或V的化合物与抗体在抗体的Fc区发生偶联反应，生成偶联抗体产物VI；随后，偶联抗体产物VI在还原剂的存在下生成还原产物VII；然后还原产物VII与
发生偶联反应，生成抗体偶联缀合物VIII；
代表带有马来酰亚胺基团的化合物，其典型代表化合物为小分子免疫激动剂，如下表2中所示；式IV和V的化合物结构如下所示：
化合物5-2-1的合成
将PEG3-Diacid(1000mg，4.5mmol)溶解在20mL的无水DMSO中，加入HNS(1035mg)、EDC.HCL(1898mg)；混合物于室温搅拌8小时。加入SZU-142(1550mg)，室温搅拌过夜。反应混合物冷冻干燥，冻干物加入5℃的纯水(20mL)，析出产品，真空干燥得SZU-PEG3-NHS(2100mg，收率72％)，ESI-MS:m/z＝646.2[M+H]+。
取SZU-PEG3-NHS(200mg)溶解在3mL的二氯甲烷(DCM)中，加入Diamine(60mg)，室温搅拌反应3小时。冰水浴冷却下缓慢加入1mL的TFA，继续室温搅拌1小时，反应混合物减压蒸馏，残余物加入再加入5mL的氯仿和TEA(0.5mL)，继续减压蒸馏至干；蒸干物用2mL的DMSO溶解。另将MC-VC-PAB-PNP(230mg)溶解在无水DMSO(1mL)。将上述蒸干物的DMSO溶液加入DIPEA(50μL),在冷水浴温度(5℃)缓慢滴加入MC-VC-PAB-PNP的DMSO溶液中。继续室温搅拌反应2小时。反应物冷冻干燥，冻干物溶解在少许甲醇，用HPLC纯化，得化合物5-2-1(158mg，收率48％)；ESI-MS:m/z＝608.8[(M/2)+H]+。
化合物5-3的合成
将MC-VC-PAB-PNP(111mg)溶解在无水DMSO(1mL)。将GY102(72mg)溶解在0.5mL的DMSO，加入DIPEA(30μL),在冷水浴温度(5℃)缓慢滴加入MC-VC-PAB-PNP的DMSO溶液中。继续室温搅拌反应2小时。反应物冷冻干燥，冻干物溶解在少许甲醇，用HPLC纯化，得化合物5-3(135mg，收率85％)；ESI-MS:m/z＝1062.5[M+H]+。
化合物5-3-1的合成
将化合物SZU-101-Ester(200mg)溶解在3mL的无水DMSO中，缓慢加入到NH2-PEG3-N3(80mg)和DIPEA(64μL)的DMSO(2mL)混合溶液中。加完后在室温震荡反应6小时。反应液冷冻干燥，冻干物用HPLC分离纯化得101-PEG3-N3(166mg，收率70％)；ESI-MS:m/z＝645.3[M+H]+。
取101-PEG3-N3(100mg)溶解在无水甲醇(5mL)，加入30mg的活性钯-碳(pd/C)，真空抽除空气后，通入氢气在室温常压下密闭氢化24小时。过滤出pd/C，滤液真空浓缩除去甲醇，HPLC纯化得101-PEG3-NH2(61mg，收率64％)；ESI-MS:m/z＝619.3[M+H]+。
将MC-VC-PAB-PNP(50mg)溶解在1mL的无水DMSO中；取101-PEG3-NH2(42mg)和DIPEA(13μL)溶解在1.5mL的DMSO形成混合液，在冰水浴10℃下缓慢滴加入MC-VC-PAB-PNP的无水DMSO溶液中。加完后，质谱监测自然室温反应至完成。反应混合物冷冻干燥，冻干物HPLC分离纯化得5-3-1(65mg，收率79％)；ESI-MS:m/z＝608.6[M/2]+,ESI-MS:m/z＝405.8[(M/2)+H]+。
化合物5-4的合成
将M-PEG2(50mg)和NHS(23mg)溶解在干燥的DMSO(2mL)中，加入1.1当量的EDC.HCl(41mg)和DIPEA(37μL)，混合物室温搅拌2小时。加入VCB-3(121mg)，反应混合物室温搅拌过夜。反应物冷冻干燥后，直接HPLC分离纯化，得化合物5-4(112mg，收率67％)；ESI-MS:m/z＝862.4[M+H]+。
化合物5-4-1的合成
取化合物5-4(100mg)与N3-PEG3-N3(16mg)混合溶解在DMF-水(4：1体积比，5mL)中，加入无水CuSO4(10mg),L-抗坏血酸钠(10mg)，形成的混合物室温搅拌12小时。反应液冷冻干燥，冻干物加入1mL的N-甲基吡咯烷酮溶解，离心除去不溶物，离心得清液用HPLC分离纯化，得二聚物5-4-1(27mg，收率23％)；ESI-MS:m/z＝656.6[(M/3)+H]+。
化合物5-5的合成
将VCB-3和MC-NHSester等摩尔量溶解在无水二氧六环溶剂中，混合物室温搅拌反应12小时。加入3倍体积量的饱和碳酸氢钠水溶液，析出固体，冰水浴冷冻搅拌6小时，过滤得纯品5-5(收率52-62％之间)；ESI-MS:m/z＝774.3[M+H]+。
同样方法，用NH2-VCB-3
替换VCB-3可得
ESI-MS:m/z＝977.4[M+H]+。
同理，用合成5-4-1的方法，用5-5-1替换5-4，可得5-5-2：
ESI-MS:m/z＝733.6[(M/3)+H]+。
化合物5-5-3的合成
将GY100(500mg)与Boc-Benz-Br(510mg)混合溶解在15mL的DMF中，加入K2CO3(266mg)，形成的混合物于室温搅拌反应过夜。反应液过滤，滤液中加入1mL的TFA，于15℃搅拌1小时，继续于15℃缓慢加入K2CO3中和至pH值8-9之间；中和液过滤，滤液冷冻干燥，干燥物用少许甲醇溶解，制备HPLC分离纯化得N-Benz-100(337mg，收率48％)；ESI-MS:m/z＝367.1[M+H]+。
将V-Ala(100mg)和NHS(45mg)溶解在3mL的无水THF中，依次加入EDC.HCl(80mg)，DIPEA(73μL)；形成的混合物于室温搅拌1小时，加入N-Benz-100(127mg)反应6小时。加入0℃的水5mL，析出白色固体，过滤，真空干燥得VA-100(135mg)；ESI-MS:m/z＝637.3[M+H]+。
取VA-100(100mg)，加入DCM-TFA(3：1体积比，1mL)室温震荡1小时。减压蒸馏(25℃)至干，真空干燥得N-VA-100的TFA盐(收率100％)：ESI-MS:m/z＝537.2[M+H]+。
取N-VA-100的TFA盐(100mg)和DIPEA(54μL)溶解在THF(2mL)中，加入M-PEG3-NHS(72mg),室温震荡6小时。HPLC直接分离纯化得5-5-3(120mg，收率88％)；ESI-MS:m/z＝891.5[M+H]+。
化合物5-5-4的合成
取5-5-3(90mg)和GY155(51mg)共同溶解在DMSO-水(3：1体积比，2mL)，加入8mg的无水CuSO4，8mg的L-抗坏血酸钠；形成的混合物室温搅拌8小时，反应液冷冻干燥，冻干物HPLC分离纯化得5-5-4(77.5mg，收率55％)；ESI-MS:m/z＝466.5[(M/3)+H]+。
化合物5-5-5的合成
按照5-4-1的合成方法，用5-5-3取代5-4，可得5-5-5；ESI-MS:m/z＝676.4[(M/3)+H]+：
化合物5-5-6的合成
用合成5-5-4的合成方法，用OZ-PEG3-N3取代GY155，可得5-5-6；ESI-MS:m/z＝628.2[(M/2)+H]+。
化合物5-5-7的合成
将SZU-128(100mg)溶解在5mL的DMF中，加入Boc-Benz-Br(55mg)、30mg的K2CO3；形成的混合物室温搅拌反应12小时。反应液过滤，滤液冷冻干燥，冻干物HPLC分离纯化的NBZ-128(90mg，收率75％)；ESI-MS:m/z＝632.3[M+H]+。
将V-Ala(32mg)、NHS(13mg)、EDC.HCl(22mg)混合溶解在1mL的THF中，混合液室温震荡反应6小时。取NBZ-128(70mg)溶解在1mL的DMSO中，缓慢滴加在上述混合液中，加完后继续室温震荡反应1小时，加入DIPEA(20μL)；继续室温震荡反应6小时。然后加入0.5mL的TFA，室温继续反应3小时。反应液直接用HPLC分离纯化的N-VA-128(72mg，收率81％)；ESI-MS:m/z＝802.3[M+H]+。
将M-PEG3-NHS(35mg)溶解在1mL的无水DMSO中；取N-VA-128(60mg)和DIPEA(13μL)溶解在2mL的无水DMSO，缓慢滴加入M-PEG3-NHS溶液中，加完后室温震荡反应10小时。反应液冷冻干燥，冻干物溶解在少量甲醇中，用HPLC分离纯化得5-5-7(61mg，收率71％)；ESI-MS:m/z＝1156.6[M+H]+。
化合物5-5-8的合成
将合成5-5-3路线中的起始化合物GY100替换为GY121，其它的反应物和试剂的摩尔比量不变，可得化合物5-5-8；ESI-MS:m/z＝919.5[M+H]+：
化合物5-5-9的合成
将GY100和N3-PEG3-N3等摩尔比例溶解在DMF-水(3：1)体系中，在CuSO4和L-抗坏血酸钠催化下进行click反应，HPLC分离纯化即得GY199；ESI-MS:m/z＝767.3[M+H]+。
将GY199和Boc-Benz-Br以1:2的摩尔比混合溶解在适量DMF中，加入1倍摩尔的K2CO3，形成的混合液室温反应10小时。反应液过滤，滤液冷冻干燥，冻干物中加入1:3体积比的TFA/DCM混合溶剂，室温搅拌1小时。真空抽除去溶剂得NB-199的TFA盐，加去离子水溶解，Na2CO3中和至pH9析出固体产品NB-199，ESI-MS:m/z＝978.5[M+H]+。
将NB-199和MC-Val-Ala-OH以1:2摩尔比溶解在干燥的乙二醇二甲醚中，加入2摩尔当量的EDC.HCl,形成的混合物室温搅拌反应12小时。减压蒸馏除去溶剂，残余物用少量甲醇溶解，用HPLC纯化得5-5-9，ESI-MS:m/z＝852.0[(M/2)+H]+。
化合物5-6的合成
将SZU-136(100mg)溶解在3mL的DMSO中，加入N3-PEG3-NH2(52mg)，1mL纯水和硫酸铜(6mg)，L-抗坏血酸钠(6mg)。混合物室温反应6小时。冷冻干燥除去溶剂，冻干物加入1mL甲醇溶解，HPLC纯化得135-NH2(94mg，收率62％)；ESI-MS:m/z＝643.3[M+H]+。
取50mg的135-NH2溶解在无水二氧六环溶剂(0.5mL)，将此溶液缓慢滴加入MC-VC-PAB-PNP(57mg)的无水DMSO(1mL)中；滴加完后继续加入13μL的DIPEA，继续室温震荡反应3小时。反应物冷冻干燥，冻干物溶于少量甲醇，HPLC纯化得化合物5-6(84mg，收率88％)；ESI-MS:m/z＝413.6[(M/3)+H]+。
化合物5-7的合成
将MC-VC-PAB-PNP(30mg)溶解在0.5mL的无水二氧六环中，缓慢滴加Bi-102-NH(38mg)和7μL的DIPEA溶解在无水二氧六环(0.5mL)溶液；混合物室温震荡反应6小时。反应物直接HPLC分离纯化得5-7(47mg，收率75％)；ESI-MS:m/z＝513.6[(M/3)+H]+。
化合物的5-8合成
将等摩尔的GY100和3-叠氮基丙胺混合溶解在水-DMSO(1:3体积比)的适量溶剂中，加入催化量的硫酸铜和L-抗坏血酸钠。参考5-6第一步的合成方法，得GY100-NH2；ESI-MS:m/z＝362.2[M+H]+。再将GY100-NH2和MC-PEG2-Ester等摩尔混合在THF溶剂中室温反应4小时，HPLC分离纯化即得化合物5-8(收率90％)；ESI-MS:m/z＝601.2[M+H]+。
化合物5-9的合成
将GY101和MC-Emine等摩尔混合溶解在适量无水DMSO中，加入等当量的EDC.HCL，室温搅拌反应6小时。冷冻干燥，冻干物加入等体积的水，析出固体产品，离心分离，真空干燥得5-9(收率65％)；ESI-MS:m/z＝617.2[M+H]+。
化合物5-10的合成
参考5-6第一步的合成方法，得化合物5-10(收率85％)；ESI-MS:m/z＝794.3[M+H]+。
化合物5-11的合成
将GY102和MC-NHSester等摩尔混合在THF溶剂中室温反应4小时，HPLC分离纯化即得化合物5-11(收率90％)；ESI-MS:m/z＝631.2[M+H]+。
化合物5-12的合成
将化合物Bi-N3-PEG3(840mg)溶解在无水THF(四氢呋喃)(15mL)中，加入Boc-C6-B(560mg)和加入无水K2CO3(414mg)；混合物于室温搅拌6小时。反应液过滤，滤液降压蒸馏除去溶剂，残余物加入溶剂DMF(20mL)和GY100(1044mg)混合物溶解后，再加入5mL纯水、硫酸铜(50mg)，L-抗坏血酸钠(50mg)。形成的反应混合物于室温反应8小时。反应混合物用阳离子交换树脂(Dowex50)进行分离，产品用5％氨-甲醇溶液洗脱，减压蒸除溶剂得NH2-Bi-102(1005mg，收率48％)；ESI-MS:m/z＝1045.6[M+H]+。
取NH2-Bi-102(200mg)溶解在DMSO(2mL)中；另将MC-NHSester(51mg)溶剂在DMSO(1mL)中，于室温缓慢滴加在NH2-Bi-102溶液中。加完后，继续室温搅拌反应6小时，反应物直接冷冻干燥，然后HPLC纯化得5-12(195mg，收率85％)；ESI-MS:m/z＝1196.6[M+H]+。
化合物5-13的合成
取MC-VC-PAB-PNP(50mg)溶解在DMSO(1mL)中；另取NH2-Bi-102(71mg)溶解在DMSO(2mL)中，于室温缓慢滴加入MC-VC-PAB-PNP溶液中。加完后继续室温震荡反应4小时。反应产物用HPLC分离纯化得5-13(86mg，收率77％)；ESI-MS:m/z＝548.0[(M/3)+H]+。
化合物5-14的合成
取化合物MC-NHSester(43mg)溶解在无水DMSO(1mL)中，室温缓慢滴加101-PEG-NH2(100mg)和DIPEA(30μL)的2mL的DMSO溶液。形成的混合物室温震荡反应6小时，反应液冷冻干燥，冻干物接着HPLC分离纯化得5-14(68mg，收率55％)；ESI-MS:m/z＝770.3[M+H]+。
化合物5-15的合成
将SZU-PEG3-NHS(100mg)混合在5mL的无水THF中，缓慢加入MC-Emine(22mg)和DIPEA(27μL)的THF(1mL)溶液；加完后，室温反应2小时。减压蒸馏除去溶剂，加入5mL去离子水，析出固体产品，真空干燥得5-15(83mg，收率81％)；ESI-MS:m/z＝671.2[M+H]+。
化合物5-16的合成
将化合物Triamine(102mg)溶解在DMF(2mL)中；SZU-PEG-ester(602mg)的DMF(3mL)的溶液滴加入Triamine的溶液中，加完后，继续室温搅拌过夜。加入TFA(1mL)继续反应2小时。减压蒸馏除去溶剂，残余物加入饱和NaHCO3溶液(5mL)，震荡均匀后，过滤析出的固体，真空干燥得Bi-SZU-PEG2(443mg，收率82％)；ESI-MS:m/z＝1076.4[M+H]+。
取Bi-SZU-PEG2(100mg)溶解在DMF(2mL)中，缓慢加入Bi-Ester(43mg)的DMF溶液(1mL)；反应混合物震荡反应12小时，直接冷冻干燥，加入饱和NaHCO3溶液(5mL)，室温震荡反应6小时，离心分离析出的固体，去离子水洗，真空干燥得5-16(99mg，收率77％)；ESI-MS:m/z＝693.2[(M/2)+H]+。
化合物5-17的合成
将化合物GY100(300mg)和3-叠氮丙胺(115mg)混合溶解在5mL的DMF中，加入1mL去离子水；再加入硫酸铜(25mg)、L-抗坏血酸钠(25mg)。形成的混合物室温搅拌反应10小时。反应混合物用阳离子交换树脂(Dowex50)进行分离，产品用5％氨-甲醇溶液洗脱，减压蒸除溶剂得GY-NH2(216mg，收率52％)；ESI-MS:m/z＝362.2[M+H]+。
将MC-NHSester(74mg)溶解在DMSO(1mL)中；将GY-NH2(100mg)的DMSO溶液(2mL)缓慢滴加入MC-NHSester溶液中；加完后继续室温反应6小时。反应混合物冷冻干燥，干燥物加入5mL的饱和NaHCO3溶液，充分震荡1小时，将析出的固体过滤，去离子水洗，真空干燥得5-17(111mg，收率78％)；ESI-MS:m/z＝513.2[M+H]+。
化合物5-18的合成
参照5-17的合成方法，得化合物5-18(收率72％)；ESI-MS:m/z＝584.2[M+H]+。
化合物5-19的合成
将Br-PEG3-NH(713mg)和Bi-Yne-NH(186mg)混合溶解在20mL的二氯甲烷中，加入无水K2CO3(300mg)；混合物于室温搅拌反应12小时。反应液过滤，滤液与冰水冷却下(5℃)缓慢加入5mL的TFA(三氟乙酸)，加完后，于室温反应3小时。减压蒸馏除去溶剂得固体产物，真空干燥得Yen-PEG3-NH2.2TFA(959mg)；ESI-MS:m/z＝269.2[M+H]+。
取Yen-PEG3-NH2.2TFA(60mg)加入3mL的DMF和1mL的去离子水，加入GY155(110mg)，10mg的CuSO4和10mg的L-抗坏血酸钠。混合物于室温震荡反应12小时。反应混合物用阳离子交换树脂(Dowex50)进行分离，产品用5％氨-甲醇溶液洗脱，减压蒸除溶剂得Bi-155-NH2(64mg，收率43％)；ESI-MS:m/z＝614.0[(M/2)+H]+。
取Bi-155-NH2(50mg)溶解在2mL的DMF中，加入MC-NHSetser(11mg)，形成的混合物室温搅拌8小时。产物直接HPLC纯化，得化合物5-19(37mg，收率66％)；ESI-MS:m/z＝689.2[(M/2)+H]+。
化合物5-20的合成
将T-Amine(607mg)和3-溴丙炔(240mg)混合溶解在二氯甲烷(20mL)中，加入K2CO3(280mg)。形成的混合液室温搅拌反应12小时。反应液过滤，滤液加入5mL的TFA，继续室温搅拌3小时。减压蒸馏除去溶剂得固体，用去离子水溶解固体，然后真空干燥得Y-Amine的TFA盐(841mg)；ESI-MS:m/z＝144.1[M+3H]3+。
取Y-Amine的TFA盐(483mg)和DIPEA(550μL)加入15mL干燥的DMSO溶剂；另将SZU-PEG2-Ester(1200mg)溶解在15mL的干燥DMSO中，缓慢加入到以上溶液中。加完后，继续室温搅拌过夜。反应液冷冻干燥，干燥物溶解在少量甲醇，产物用硅胶柱层析分离(MeOH：DCM＝1:5体积)，得Bi-SZU-PEG2-Y(580mg，收率52％)；ESI-MS:m/z＝1114.5[M+H]+。
取Bi-SZU-PEG2-Y(100mg)和N3-PEG3-M(33mg)溶解在3mL的DMF中，加入纯水0.7mL，无水硫酸铜(7mg)，L-抗坏血酸钠(7mg)；混合物室温震荡反应过夜。反应液冷冻干燥，冻干物用HPLC分离纯化得5-20(63mg，收率47％)；ESI-MS:m/z＝495.5[(M/3)+H]+。
化合物5-21的合成
将化合物GY003(252mg)和3-溴丙炔(119mg)混合溶解在DMF溶解中(5mL)，加入等当量的无水K2CO3，混合物室温搅拌10小时。过滤，滤液减压蒸馏除去溶剂，加入6N的盐酸(3mL)室温搅拌过夜，然后用Na2CO3中和反应液至中性，析出白色固体，过滤出固体，充分水洗，真空干燥得化合物GY001(206mg，收率75％)；ESI-MS:m/z＝276.1[M+H]+。
取GY001(150mg)和N3-PEG3-NH2(119mg)混合物溶解在DMF-H2O溶剂(4:1体积，5mL)，加入无水CuSO4(10mg)，L-抗坏血酸钠(10mg)；混合物室温反应过夜。反应液减压蒸馏除去大部分溶剂，残余液用HPLC分离纯化得GY004(140mg，收率52％)；ESI-MS:m/z＝494.2[M+H]+。
取化合物GY004(100mg)溶解在无水THF中(5mL)，加入MC-NHSester(55mg)和PIPEA(36μL)，混合物室温搅拌过夜。减压蒸馏除去溶剂，残余物HPLC分离纯化得化合物5-21(95mg，收率73％)；ESI-MS:m/z＝645.3[M+H]+。
用合成5-21的方法，用5-溴戊炔取代3-溴丙炔可以得到化合物5-22：
ESI-MS:m/z＝673.3[M+H]+。
同理，该系列化合物的衍生结构通式可以表示如下IX式：
化合物IV和V的合成
参照化合物6的合成方法,将化合物5与Bi-SS-Acid二聚合可得V：ESI-MS:m/z＝798.2[(M/6)+H]+。
用合成化合物V同样的方法，将化合物8与Bi-SS-Acid二聚可得化合物IV：ESI-MS:m/z＝797.1[(M/6)+H]+；
实施例1
以HER2抗体为代表的一步法抗体Fc区偶联合成方法和分析：
1、仪器设备
2、试剂，试液
3、液相色谱条件
(1)流动相梯度
| Time | A相(含0.1％甲酸的水溶液) | B相(含0.1％甲酸的乙腈溶液) |
| 1min | 80％ | 5％ |
| 8min | 20％ | 80％ |
| 12min | 20％ | 80％ |
| 12.1min | 80％ | 5％ |
(2)检测参数
| 参数 | 参数值 |
| 检测波长 | <u>NA</u> |
| 流速 | <u>0.3</u>mL/min |
| 进样量 | <u>10</u>μL |
| 柱温 | <u>60℃</u> |
| 采集时间 | <u>12</u>min |
| 洗脱模式 | 梯度洗脱 |
4、质谱条件
| 参数 | 参数值 |
| 离子源 | ESI |
| 扫描模式 | TOF MS |
| 扫描范围(Da) | 1000-4000 |
| 喷雾气 | 50psi |
| 辅助加热气 | 50psi |
| 气帘气 | 30psi |
| 温度 | 500℃ |
| 去簇电压 | 275V |
应用化合物5或化合物8偶联：
1)Fc区定位偶联法
取HER2抗体(Trastuzumab,100mg)溶解在20mL的PBS中(HER2溶液)。将化合物6(7.7mg)溶解在100μL的无水DMSO中，加入到HER2溶液中；向形成的混合液中加入5mg的DIPEA，反应混合物于25℃搅拌过夜。用30kDa MWCO离心超滤管进行离心超滤，将抗体置换至纯净水,冷冻干燥得抗体偶联GY101产物HER2-GY101：72mg。用SEC-QTOF-MS测得平均偶联比DAR＝2。(偶联比分布DAR＝1:3％；DAR＝2:95％；DAR＝3:1％；)。
2)随机偶联法
取HER2抗体(Trastuzumab,100mg)溶解在20mL的PBS中(HER2单抗溶液)。将化合物NHS(N-羟基丁二酰亚胺，2mg)的2mL无水DMSO溶液中，加入3.33mg的EDC.HCl和8mg的GY101，于室温搅拌1小时形成的混合溶液，加入到HER2单抗溶液中进行偶联反应。反应混合液于10℃加入5mg的DIPEA，混合物于25℃搅拌过夜。用30kDa MWCO离心超滤管进行离心超滤，将抗体置换至纯净水,冷冻干燥得抗体随机偶联GY101产物HER2-GY101-2：66mg。用SEC-QTOF-MS测得偶联比分布DAR＝1:9％；DAR＝2:25％；DAR＝3:32％；DAR＝4:27％；DAR＝5:7％。
偶联区分析：
目前常用HPLC联合MS的抗体分析方法如图3所示(以曲妥珠单抗为例)。
本发明采用(d)法，该法直接应用IdeS酶特异裂解得到scFc(单链Fc段)，如图4所示。
同理，该法直接应用IdeS酶特异裂解偶联小分子的单抗得到偶联Fc的2个scFc(单链Fc段)，如图5所示。
应用(IdeS)FabRICATOR酶的优点是一种独特的半胱氨酸蛋白酶，在铰链区下方的一个单一氨基酸位点酶切IgG，特点是：高特异性单一酶切位点，30分钟快速酶切，操作简单快捷，如图6所示。
进一步应用FabRICATOR-HPLC系统联合SEC-QTOF-MS进行分离和质谱鉴定技术，分析偶联前抗体和偶联后抗体的scFc分子量差异，以及F(ab’)2分子量差异，即可得到偶联部位的定位，如图7所示。
1)曲妥珠单抗去糖化预处理：酶切除糖
取20μg待测样于EP管中,加入2μL GlycoBuffer 2(10X)后,加入超纯水使体系最终体积为20μL。随后在偶联前和偶联后样品中加入3μL PNGase F于37℃水浴中反应24h,将上述样品稀释10倍(终浓度为0.1mg/mL),并按照上述检测参数测试待测样品。
曲妥珠单抗平均分子量：145531.5。质谱检测，去糖后得到单一分子量的单抗：145170.8，如图8所示。
2)IdeS酶解
本发明中去糖化的曲妥珠单抗偶联前，及偶联GY101(HER2-GY101)的IdeS酶解:
将溶于25mM Tris缓冲液中含1mg/mL的HER2-GY101单抗样品与IdeS蛋白酶(FabRICATOR；Genovis公司)一起置于37℃下温育30min。
(具体操作指南见：https://img48.chem17.com/1/20180530/ 636632881599574575394.pdf)。
按照上述分析方法，应用化合物5或8制备GY101偶联曲妥珠单抗(HER2-GY101)的Fc区偶联选择性为95％：偶联前后(2倍scFc差值)/偶联前后单抗差值＝Fc偶联％：
同样方法，应用表1中各化合物偶联曲妥珠单抗，对其进行分析鉴定，结果显示Fc区偶联比例％均在95±1的范围内。偶联表1中各化合物的DAR平均值为2。
用上述方法检测GY101和Trastuzumab随机偶联的产物HER2-GY101-2，得到偶联前后的平均差值为scFc：436.6；单抗：1431.5。可见随机偶联的Fc区偶联选择性为61％。
同样方法，应用表1中各化合物随机偶联曲妥珠单抗，对其进行分析鉴定，结果显示，Fc区偶联比例％均在45％---65％的范围内。
各化合物偶联Trastuzumab单抗的免疫活性用诱导产生免疫细胞因子TNF-ɑ的功能来表示，其EC50值总结如表5所示。
实施例2：以PD-L1(Atezolizumab)抗体为代表的双Fc亲和肽偶联法,对抗体Fc区偶联合成方法和分析：
Atezolizumab平均分子量：144590.5，按照曲妥珠单抗的方法，得到Atezolizumab去糖化分子量：144230.5。
1)偶联链IV或V偶联Atezolizumab反应：
取PD-L1抗体(Atezolizumab，100mg，)溶解在20mL的PBS中。化合物IV或者化合物V(15mg,5倍mol)，溶解在1mL的DMSO中，加入5mg的DMAP，于25℃搅拌过夜。用30kDa MWCO离心超滤管进行离心超滤，将抗体置换至纯净水,冷冻干燥得纯化偶联抗体产物Atezolizumab-Bi-SS-Conjugate：93mg。
用SEC-QTOF-MS测得平均偶联比DAR＝1。(偶联比分布DAR＝1:98％；DAR＝2:1％；DAR＝3:1％；)。
2)还原
取Atezolizumab-Bi-SS-Conjugate(90mg)溶解在DPBS中(15mg/mL),用浓度为5mM的EDTA溶液调节pH 7.0。加入1.2当量的TCEP(三(2-羧乙基)膦)溶液(用5mM浓度的TCEP水溶液)于室温还原2小时。用30KD的Vivaspin超滤离心管(Vivaspin centrifugalconcentrator)超滤纯化后，直接换液在4.2mM的组氨酸溶液中进行小分子偶联。
3)偶联小分子
将上述还原抗体的组氨酸溶液(5mL)用Tris缓冲溶液调节pH值7.5-8之间；加入化合物5-5-8(5.5mg)的N,N-二甲基乙酰胺(150μL)溶液。此反应混合物于20℃震荡6小时。用30DK的Vivaspin超滤离心管(Vivaspin centrifugal concentrator)超滤纯化后，换液得到Atezolizumab偶联5-5-8(Atezolizumab-5-5-8)在4.2mM的组氨酸溶液，进行偶联区质谱分析。分析方法与曲妥珠单抗的偶联前后分析方法相同。
4)5-5-8随机偶联Atezolizumab单抗
取PD-L1抗体(Atezolizumab,90mg)溶解在20mL的DPBS中(20mg/mL),用浓度为5mM的EDTA溶液调节pH 7.0。加入12当量的TCEP溶液(用5mM浓度的TCEP水溶液)于室温还原5小时,用30KD的Vivaspin超滤离心管(Vivaspin centrifugal concentrator)过滤纯化后，直接换液在4.2mM的组氨酸溶液20mL中,按照3)中的方法进行偶联和纯化处理得到随机偶联产物Atezolizumab-5-5-8-2。
5)分析结果：
根据质谱分析，按照上述偶联方法程序，应用偶联链IV或V制备5-5-8偶联Atezolizumab得到Atezolizumab-5-5-8新抗体的平均偶联比DAR＝1.98。Fc区偶联选择性为98％：偶联前后(2倍scFc差值)/偶联前后单抗差值＝Fc％(Fc区偶联选择度)：
用同样方法和反应比例，Atezolizumab单抗偶联表2中各化合物所得Bi-FcConjugate的分析鉴定结果的Fc区偶联比例％均在97±1的范围内；偶联化合物IV或V的DAR平均值为1，偶联表2中各化合物的DAR平均值为2。
用上述方法检测5-5-8和Atezolizumab单抗随机偶联的产物Atezolizumab-5-5-8-2，得到偶联前后的平均差值为scFc：459.6；单抗：4376.6。可见其随机偶联的Fc区偶联选择性为21％。
同样方法，应用表2中各化合物随机偶联阿特珠单抗，对其进行分析鉴定，结果显示Fc区偶联比例％均在15％---25％的范围内。
各化合物偶联Atezolizumab单抗的免疫活性用诱导产生免疫细胞因子TNF-ɑ的功能来表示，其EC50值总结如表5所示。
实施例3[Trastuzumab-(化合物)2]和[Atezolizumab-(化合物)2]的免疫活性检测
人外周单核细胞(PBMC)的制备：
1)取健康志愿者人的外周血于肝素抗凝管中，取足5mL新鲜血液，加入PBS按1：1稀释血液(一般采血管2mL+2mL)。
2)取淋巴细胞分离液5mL于15mL灭菌离心管中待用。
3)吸取稀释血液，在离分层液上方1cm处，沿试管壁徐徐加入，使稀释血液重叠于分层液上，并与分离液形成明显界面。
4)室温，离心2000rpm，20min。此时离心管中形成5层：最上面是血浆，血浆层和淋巴细胞分离液之间是淋巴细胞层呈白膜状。
5)小心吸取中间呈白膜状的单个核细胞层，尽量全部吸出单个核细胞。加5倍以上体积的PBS洗2次，每次离心1500rpm，10min。
6)去上清液，加入1640培养基1mL混匀，取少量进行细胞计数。
方法(A)
将制备好的PBMC铺在96-孔板(costar，3894)中，每孔置入2x105个细胞。取表5中的各抗体偶联缀合物或表6中的各化合物，取十个均匀梯度分布浓度点(0.0001--10μM，含0.1％DMSO的RPMI-1460培养液)加入铺好细胞的各孔。然后在5％的CO2培养箱，于37℃孵育24小时；应用Human-TNF-α试剂盒(cisbio)，根据试剂盒说明书步骤测量细胞培养上清液中的TNF-α。同时用Imiquimod做对照，计算各抗体偶联缀合物或化合物的EC50值。
(Imiquimod是FDA批准临床应用的唯一小分子免疫激动剂，用于激发免疫细胞因子，抑制病毒感染和抗皮肤黑色素瘤)。
方法(B)-酶代谢法
取人肝微粒体酶试剂盒(型号MVT-1.0，北京汇智泰康医药技术有限公司)：
1)冰浴融化试剂盒各组分，置于冰上待用；2)将需要测试的组分按照设置的浓度配比混匀，于37℃预孵育5min；3)将以上混合液195μL/管分装至离心管中，于37℃水浴中保温，各样中加入5μL肝微粒体，吸吹3次混匀于37℃水浴条件下启动代谢反应；4)于2小时时间点，向孵育体系中加入终止液终止反应；20K的分子膜过滤得到的滤液，然后各组分按照方法(A)进行测试，确定EC50值。
方法(C)-酶裂解法
将各抗体偶联缀合物分别与Cathepsin-B酶(10μg，Cat.#:10483-H08H,SinoBiological),在PBS中以0.0001--10μM之间梯度分十个浓度组，室温共孵育3小时；20K的分子膜过滤得到的滤液，然后各组分按照方法(A)进行测试，确定EC50值。
各化合物偶联Trastuzumab(曲妥珠单抗)和各化合物偶联Atezolizumab(阿特珠单抗)的免疫活性用刺激人的PBMC细胞产生免疫细胞因子TNF-ɑ的EC50值来表示，其EC50值总结如表5所示，其测试方法如实施例3中(A)，(B)，(C)所述。
[Trastuzumab-(化合物)2]表示表1中的化合物偶联曲妥珠单抗生成的新型免疫激活型抗体。
[Atezolizumab-(化合物)2]表示表2中的化合物偶联阿特珠单抗生成的新型免疫激活型抗体。
注：酶代谢和酶裂解参考图9和图10
由实施例3结果可知，[Trastuzumab-(化合物)2]和[Atezolizumab-(化合物)2]的免疫活性是由释放偶联的化合物导致，其典型的化合物的核心化合物如表6所示，其免疫活性按照例3中的各个方法检测结果如表6所示。
实施例4.表1中化合物偶联抗体得到的抗体偶联缀合物的抗肿瘤活性验证
1)高表达HER2的小鼠乳腺癌细胞构建
参考文献方法得到鼠源的HER2乳腺癌细胞：“高表达HER2的自发转移性乳腺癌小鼠模型的建立与应用”，Chinese Pharmacological Bulletin(中国药理学通报),2014,Nov；30(11):1611---1616。
2)HER2乳腺肿瘤模型构建与给药治疗(以HER2-GY101为例)
按照上述参考文献方法建立BALB/c小鼠乳腺肿瘤模型。将荷瘤小鼠随机分为PBS对照组(溶剂组)、曲妥珠单抗组(15mg/kg)、HER2-GY101-2组(15mg/kg)、[曲妥珠单抗(15mg)+GY101(1mg/kg)]组、HER2-GY101(15mg/kg)组,第7天开始每隔3天腹腔注射给药1次(按照给药剂量配制注射剂，溶剂为混合：5％DMSO；+40％PEG300；+5％Tween 80；+50％PBS)，给药4次，每次体积100μL。第25天计算肿瘤抑制率：[(对照组肿瘤体积-治疗组肿瘤体积)/对照组肿瘤体积]x 100％，得出HER2-GY101组的肿瘤抑制率为90％；HER2-GY101-2组的抑瘤率为55％。见图12，可见HER2-GY101组的肿瘤抑制率显著高于HER2-GY101-2和曲妥珠单抗组。
用同样方法验证表1组各化合物的[Trastuzumab-(化合物)2]的抗肿瘤效果，其肿瘤抑制率在85％---95％之间。均显著高于随机偶联组和原始抗体组。
实施例5.表2中化合物偶联抗体得到的抗体偶联缀合物的抗肿瘤活性验证(以Atezolizumab-5-5-8为例)
1)小鼠黑色素瘤肿瘤模型的建立：消化离心收集对数生长期的B16细胞，用PBS洗两遍后计数，将细胞浓度调整为2×105个/mL。小鼠为6周龄的SPF级C57BL/6小鼠。用剃毛器将小鼠右侧背部的毛剃干净，用注射器吸取100μL细胞悬液，排净气泡后注射在小鼠后背皮下，待肿瘤直径达到4～5mm之间时，开始进行给药。
2)将荷瘤小鼠随机分为PBS对照组(溶剂组)、化合物5-5-8(1mg/kg)组、阿特珠单抗组(15mg/kg)、阿特珠单抗-5-5-8-2组(15mg/kg)、阿特珠单抗-5-5-8(15mg/kg)组,每隔6天腹腔注射给药(按照给药剂量配制注射剂，溶剂为混合：5％DMSO；+40％PEG300；+5％Tween 80；+50％PBS)，给药4次，每次体积100μL。第28天计算肿瘤抑制率：[(对照组肿瘤体积-治疗组肿瘤体积)/对照组肿瘤体积]x 100％，得出阿特珠单抗-5-5-8组的肿瘤抑制率为97％；阿特珠单抗-5-5-8-2组的抑瘤率为69％。见图13，可见阿特珠单抗-5-5-8组的肿瘤抑制率显著高于阿特珠单抗-5-5-8-2组和阿特珠单抗组。
用同样方法验证表2组各化合物的[Atezolizumab-(化合物)2]的抗肿瘤效果，其肿瘤抑制率在85％---98％之间。均显著高于随机偶联组和原始抗体组。
由于人用抗体IgG的Fc区氨基酸序列基本相同，与靶向Fc区肽(Fc-亲和肽)亲和力也基本相同。因此本发明的偶联抗体方法科学合理，可以推理其也适用于其它的人用抗体。
本发明的抗体偶联缀合物可以被靶向细胞内的溶酶体代谢为相应的活性产物，除了图9和图10的代谢方式，在靶细胞内的代谢产物还包括图11中的代谢产物。
Claims (15)
1.一种化合物，其结构如式I所示：
其中，Fc-亲和肽表示和抗体的Fc区具有亲和力的多肽；Y表示具有免疫调节功能和/或抗肿瘤作用的
的非羧基部分；X＝O或NH；n＝1-10；
优选地，所述抗体为IgG抗体；
优选地，所述Fc-亲和肽选自：
优选地，
选自表1：
2.一种制备抗体偶联缀合物的方法，其中使用权利要求1中所述的化合物与抗体在抗体的Fc区发生偶联反应，从而获得抗体偶联缀合物，其合成路线如下所述：
其中，Fc-亲和肽和Y如权利要求1所述；X＝O或NH；n＝1-10。
3.一种化合物，其结构如式II所示：
其中Fc-亲和肽如权利要求1中所述；X＝O或NH；
优选地，所述化合物的结构如式III或式III-1所示：
4.一种化合物，其选自以下：
5.权利要求4中所述的化合物在制备权利要求1中所述的化合物中的用途；和/或在制备抗体偶联缀合物、蛋白偶联缀合物和多肽偶联缀合物中的用途。
6.权利要求1或3中所述的化合物在制备抗体偶联缀合物、蛋白偶联缀合物和多肽偶联缀合物中的用途。
7.权利要求1中所述的表1中的化合物在制备权利要求1中所述的化合物中的用途；和/或在制备抗体偶联缀合物、蛋白偶联缀合物和多肽偶联缀合物中的用途；和/或在制备免疫调节药物中的用途。
8.一种化合物，其结构如式IV或V所示：
其中的Fc-Peptide表示对抗体的Fc区具有亲和力的多肽；优选地，Fc-Peptide选自：
优选地，所述抗体为IgG抗体。
9.一种制备抗体偶联缀合物的方法，其中，使用权利要求8中所述的化合物与抗体在抗体的Fc区发生偶联反应，生成偶联抗体产物VI；随后，偶联抗体产物VI在还原剂的存在下生成还原产物VII；然后还原产物VII与
发生偶联反应，生成抗体偶联缀合物VIII；其合成路线如下：
优选地，所述抗体为IgG抗体。
10.根据权利要求9所述的方法，其中
选自表2：
11.权利要求10中所述的表2中的化合物在制备抗体偶联缀合物、蛋白偶联缀合物和多肽偶联缀合物中的用途；和/或在制备免疫调节药物中的用途。
12.权利要求8中所述的化合物在制备抗体偶联缀合物、蛋白偶联缀合物和多肽偶联缀合物中的用途。
13.抗体偶联缀合物在制备免疫调节药物中的用途；其中偶联到抗体上的化合物选自权利要求1中所述的表1中的化合物或权利要求10中所述的表2中的化合物；优选地，所述抗体是曲妥珠单抗或阿特珠单抗。
14.一种化合物，其选自表6：
15.权利要求14中所述的表6中的化合物在制备权利要求1中所述的化合物、权利要求1中所述的表1中的化合物或权利要求10中所述的化合物中的用途；和/或在制备抗体偶联缀合物、蛋白偶联缀合物和多肽偶联缀合物中的用途；和/或在制备免疫调节药物中的用途。
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