CN109305936A - 一种化合物及其制备方法和在抗体药物偶联物制备中的用途 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及一种化合物及其制备方法和在抗体药物偶联物制备中的用途，利用本公开的化合物以及偶联方案进行生物分子与修饰物的偶联，可以避免由于非天然氨基酸掺入所造成的蛋白表达量降低、稳定性下降的缺陷。可以对不含糖链的多肽或蛋白进行定点修饰，并且偶联过程不需要借助有机溶剂，获得的生物偶联物的生物活性更高。

Description

一种化合物及其制备方法和在抗体药物偶联物制备中的用途
技术领域
本公开涉及生物化学领域，具体地，涉及一种化合物及其制备方法和在抗体药物偶联物制备中的用途。
背景技术
抗体药物偶联物(Antibody Drug Conjugate，ADC)是将单克隆抗体与药物进行偶联所获得的偶联产物。抗肿瘤抗体可特异的识别肿瘤细胞，虽然具有一定抗肿瘤活性，但是效果往往不能满足治疗肿瘤的要求。通过化学键将细胞毒药物与单克隆抗体进行偶联，利用抗体可特异性识别肿瘤细胞的特性，可以“精确”地把毒性小分子运送到肿瘤细胞，在提高肿瘤部位药物浓度的同时降低正常组织、器官的药物浓度，达到高效低毒的抗肿瘤效果。近年来使用单克隆抗体向肿瘤细胞直接递送抗癌药获得了大量关注。两种新的抗体药物偶联物已经被FDA批准用于治疗癌症。(贝伦妥单抗维多汀)是CD30引导的抗体药物偶联物(ADC)，其适应症为复发性或难治性霍奇金淋巴瘤和系统性渐变性大细胞淋巴瘤(ALCL)。(ado-曲妥珠单抗emtansine)是被批准用于患有HER2阳性、晚期(转移性)乳腺癌患者的新疗法。
合适的连接和偶联方法对于生物偶联物特别是ADC的发展是至关重要的。以ADC为例，偶联物不同或小分子偶联位置不同的ADC往往具有不同的亲和力、内吞性质、药效、药代动力学以及毒性，从而给药物的质量控制和临床使用带来困难，对ADCs开发不利。传统的非定点偶联获得的ADCs的偶联位置不定，主要通过赖氨酸或半胱氨酸残基，利用化学方法将小分子与抗体偶联，这类偶联方法往往不需要对抗体进行修饰或改造。无法控制药物和抗体偶联的位置和数目，所合成的抗体-药物偶联物结构不均一，批次可重复性差，治疗指数低。目前有利用蛋白序列掺入非天然氨基酸的方法，再用化合物进行定点氨基酸修饰，但是非天然氨基酸容易造成蛋白表达量降低，或者蛋白稳定性下降。现有技术有通过特定的酶催化作用，把特定的药物连接到抗体的糖链上，进行定点修饰，但是这种方式要求蛋白有特定的糖基化修饰才可以实现反应。化合物修饰蛋白的反应经常需要有机溶剂，而有机溶剂的介入容易造成蛋白失活。
鉴于现有技术存在的上述缺陷，人们越来越多的关注通过定点偶联的方法生产新一代ADCs，从而有效控制药物结合的位置，获得药抗比均一的偶联物。
发明内容
本公开的目的是提供一种可以简便高效的对生物分子进行定点偶联修饰的技术。
为实现上述目的，本公开的第一个方面提供一种化合物，其中，所述化合物的结构如式(I)所示：
式(I)中，R1为(CH2)n或PEG。
可选的，n为1-20的整数，PEG的分子量为400-12000。
本公开的第二个方面提供本公开第一个方面所述的化合物的制备方法，其中，所述方法包括以下步骤：
(1)将前体化合物溶解于非质子极性溶剂中获得前体化合物溶液，将所述前体化合物溶液与碱金属叠氮盐的水溶液在相转移催化剂存在的条件下接触反应，获得中间产物；
(2)将所述中间产物溶解于二氯甲烷中获得中间产物溶液，将所述中间产物溶液在0-10℃下与氯铬酸吡啶盐接触反应获得反应产物；
其中，所述前体化合物的结构如式(Ⅱ)所示，所述中间产物的结构如式(Ⅲ)所示：
在式(Ⅱ)中，R2为Cl、Br或I；在式(Ⅱ)和式(Ⅲ)中，R1为(CH2)n或PEG，其中，n为1-20的整数，PEG的分子量为400-12000。
可选的，所述非质子极性溶剂为四氢呋喃、二氯甲烷或二甲基甲酰胺；所述碱金属叠氮盐为叠氮化钠或叠氮化钾；所述相转移催化剂为四丁基硫酸氢胺。
可选的，相对于1mmol的所述前体化合物，碱金属叠氮盐的用量为1.6-2.4mmol，相转移催化剂的用量为0.08-0.12mmol，氯铬酸吡啶盐的用量为0.8-1.2mmol。
可选的，所述前体化合物溶液中前体化合物的浓度为0.5-0.6mmol/mL；所述碱金属叠氮盐的水溶液的浓度为1-1.2mmol/mL；所述中间产物溶液的浓度为0.1-1mmol/mL。
本公开的第三个方面提供一种生物偶联物的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(a)在磷酸盐缓冲液中将生物分子与权利要求1或2所述的化合物进行第一偶联1-24h，获得第一偶联混合物；
(b)将所述第一偶联混合物与含有二苯并环辛炔基团的修饰物接触，进行第二偶联1-24h，获得所述生物偶联物；
其中，所述生物分子为多肽片段或蛋白质。
可选的，所述含有二苯并环辛炔基团的修饰物为标记物或药物。
本公开的第四个方面涉及利用本公开第三个方面所述的制备方法所制备获得的生物偶联物。
本公开还提供了所述生物偶联物在制备抗肿瘤的药物中的用途。
利用本公开的化合物以及偶联方案进行偶联与目前偶联技术相比较具有如下优点：
1、没有掺入任何非天然氨基酸，避免了由于非天然氨基酸掺入所造成的蛋白表达量降低、稳定性下降的缺陷。
2、可以定点修饰无糖基化蛋白，避免了酶催化技术中必须要求蛋白有特定的糖基化修饰才可以进行反应的缺陷，增加了可修饰蛋白的种类。
3、反应过程温和，不需要在有机溶剂存在的情况下进行，避免了有机溶剂介入对蛋白活性的影响。
4、不需要催化反应，相比于现有其他偶联修饰反应的复杂步骤，偶联步骤简便。
本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
附图是用来提供对本公开的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本公开，但并不构成对本公开的限制。在附图中：
图1是实施例1的中间产物和最终6-AM－2-PCA的质谱结果；
(A)显示中间产物[M+H]+峰是165.0773，[M+Na]+峰是187.0589；
(B)显示MS检测的 6-AM－2-PCA的分子量是162.15，[M+H]+峰163.0634，[M+Na]+峰是 185.0437。
图2是6-AM－2-PCA修饰多肽的质谱分析结果。
图3是6-AM－2-PCA偶联标记的抗体的荧光显色示踪。
图4是Cy5.5荧光标记的抗Her2抗体与乳腺癌细胞系SK-BR-3的结合；
(A)Cy5.5标记抗体与细胞的结合；(B)DAPI染色的细胞核；(C)为A和B影像的重叠。
具体实施方式
以下结合附图对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。
本公开的目的是提供一种可以简便高效的对生物分子进行定点偶联修饰的技术。
为实现上述目的，本公开的第一个方面提供一种化合物，其中，所述化合物的结构如式(I)所示：
式(I)中，R1为(CH2)n或PEG。
在本公开的一种优选的实施方式中，(CH2)n中n为1-20的整数，在本公开的另一种优选的实施方式中，R1为分子量为400-12000的PEG。
特别优选的，当R1为(CH2)n并且n为1-4的整数时，获得的化合物在用于偶联生物分子与修饰物时生物分子的活性和亲和力更好。
可以理解的是，根据本领域的公知常识，本领域技术人员能够明确而毫无异议的确定PEG表示聚乙二醇，而且在式(I)所示的化合物中，PEG的连接方式也是本领域技术人员可以明确而毫无异议的确定的。
本公开的第二个方面提供本公开第一个方面所述的化合物的制备方法，其中，所述方法包括以下步骤：
(1)将前体化合物溶解于非质子极性溶剂中获得前体化合物溶液，将所述前体化合物溶液与碱金属叠氮盐的水溶液在相转移催化剂存在的条件下接触反应，获得中间产物；
(2)将所述中间产物溶解于二氯甲烷中获得中间产物溶液，将所述中间产物溶液在0-10℃下与氯铬酸吡啶盐接触反应获得反应产物；
其中，所述前体化合物的结构如式(Ⅱ)所示，所述中间产物的结构如式(Ⅲ)所示：
在式(Ⅱ)中，R2为Cl、Br或I；在式(Ⅱ)和式(Ⅲ)中，R1为(CH2)n或PEG，其中，n为1-20的整数，PEG的分子量为400-12000。
优选的，当R1为(CH2)n并且n为1-4的整数时，获得的化合物在偶联生物分子与标记物时生物分子的活性和亲和力更高。
本公开中，所述非质子极性溶剂为本领域所公知的本身不易给出质子，又有很强的溶解能力的一类溶剂。
可选的，所述非质子极性溶剂为四氢呋喃、二氯甲烷或二甲基甲酰胺；所述相转移催化剂为四丁基硫酸氢铵。所述碱金属叠氮盐为叠氮化钠或叠氮化钾，优选的，所述碱金属叠氮盐为叠氮化钠。
可选的，所述前体化合物溶液中前体化合物的浓度为0.5-0.6mmol/mL；所述碱金属叠氮盐的水溶液的浓度为1-1.2mmol/mL。在一种特别优选的实施方式中，所述前体化合物溶液中，前体化合物的浓度为0.55mmol/mL；所述碱金属叠氮盐的水溶液的浓度为1.1mmol/mL。
在本公开的一种优选的实施方式中，步骤(1)的接触反应在15-25℃的温度下避光进行1-12h，获得含有中间产物的反应混合物，可以利用硅胶层析方法对所述反应混合物进行层析，获得中间产物。
在本公开的一种实施方式中，将所述中间产物溶解于二氯甲烷获得中间产物溶液；所述中间产物溶液的浓度为0.1-1mmol/mL。将所述中间产物溶液冷却至0℃并缓慢搅拌1-12h使中间产物充分溶解，而后缓慢加入氯铬酸吡啶盐并在0℃下搅拌反应0.8-1.2h，反应结束后利用硅胶层析方法纯化获得反应产物。
其中，相对于1mmol的所述前体化合物，碱金属叠氮盐的用量为1.6-2.4mmol，相转移催化剂的用量为0.08-0.12mmol，氯铬酸吡啶盐的用量为0.8-1.2mmol；在本公开的一种特别优选的实施方式中，相对于1mmol的所述前体化合物，碱金属叠氮盐的用量为1.8-2.2mmol，相转移催化剂的用量为0.09-0.11mol，氯铬酸吡啶盐的用量为0.09-1.1mmol。
本公开中，对于纯化中间产物和反应产物的硅胶层析方法和试剂没有特别的要求，本领域技术人员可以根据中间产物和反应产物合理的选择适合的硅胶层析方案。
本公开的第三个方面提供一种生物偶联物的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(a)在磷酸盐缓冲液中将生物分子与式(I)所示的化合物进行第一偶联1-24h，获得第一偶联混合物；
(b)将所述第一偶联混合物与含有二苯并环辛炔基团的修饰物接触，进行第二偶联1-24h，获得所述生物偶联物；
其中，所述生物分子为N端具有α氨基的多肽片段、蛋白质。
在本公开中，所述多肽片段为由7-100个氨基酸分子脱水缩合而成的化合物。可选的，所述多肽片段可以具有开放的α-NH2基团，具体的，所述多肽片段可以为含有抗体N末端的恒定区FR1氨基酸序列的多肽片段。
在本公开中，蛋白质为由氨基酸以脱水缩合的方式组成的多肽链经过盘曲折叠形成的具有一定空间结构的蛋白质类物质。可选的，所述蛋白质可以为抗体、干扰素或细胞因子等。可以理解的是，本公开的偶联技术既可以对无糖基化蛋白进行偶联修饰也可以对糖基化的蛋白进行偶联修饰。
其中，所述抗体为由效应B细胞分泌，被免疫系统用来鉴别与中和外来物质如细菌、病毒等的蛋白质。
具体的，所述蛋白质可以为抗Her2抗体。
其中，所述磷酸盐缓冲液的pH值优选为7-8，生物分子在所述磷酸盐缓冲液中的浓度为10-50mmol/mL，相对于1mmol的所述生物分子，式(I)所示的化合物的用量为10-200mmol。
根据本公开的一种实施方式，步骤(b)中，可以将含有DBCO基团的修饰物直接加入所述第一偶联混合物进行第二偶联，从而实现对生物分子的定点偶联。
可选的，所述含有二苯并环辛炔基团的修饰物为标记物或药物。
所述标记物可以为荧光基团或其它有标记作用的物质。
所述荧光基团的种类包括但不限于本领域所公知的荧光基团FITC、TRITC、Rhodamine、PE、Cy3/5、AMCA、Dylight，所述有标记作用的物质的种类包括但不限于化学分子等能够对生物分子起标识或者示踪作用的分子。所述药物可以为利用化学方法或生物学方法制备或合成的可以作用于受体从而影响受体的生理、生化或病理过程的物质。可选的，所述药物的种类可以为抗肿瘤类药物。
本公开的第四个方面涉及利用本公开第三个方面所述的制备方法所制备获得的生物偶联物。
应当理解的是，含有本公开所述的生物偶联物的组合物或制剂也属于本公开的保护范围。
本公开还提供了所述生物偶联物在制备抗肿瘤的药物中的用途。
其中，所述药物为以所述生物偶联物为单一活性成分或作为活性成分之一。
其中，所述药物还包括药学上可接受的赋形剂、载体和稀释剂中的至少一种。所述药物为混悬剂、粉针或注射剂。可以为静脉、皮下、透皮或肌内给药剂型。
所述药物可以与已经可用的治疗手段(例如化学治疗、外科手术治疗或放疗)联用。
除了在所概述的任意方法中使用药物以外，本发明的药物可用作其他疗法的添加剂。应该清楚本发明的治疗可以与任何其他已知的治疗方法联用。
实施例
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中，如无特别说明，所用的各试剂均可通过商购获得，如无特别说明，所用的方法为本领域的常规方法。
实施例1
本实施例用于说明6-叠氮甲基-2吡啶甲醛的合成。
在四氢呋喃中溶解前体化合物6-溴甲基-2-吡啶甲醇(即本公开式(Ⅱ)所示的前体化合物中R1为CH2，R2为Br)至终浓度为0.55mmol/mL获得10ml前体化合物溶液，在前体化合物溶液中加入浓度为1.1mmol/mL的叠氮化钠(NaN3)水溶液10mL和四丁基硫酸氢铵0.55mmol。在25℃下避光搅拌3小时，获得反应混合物，对反应混合物进行硅胶层析纯化，获得中间产物6-叠氮甲基-2吡啶甲醇。
在二氯甲烷中溶解中间产物6-叠氮甲基-2吡啶甲醇并冷却到0℃获得20ml中间产物浓度为0.25mmol/ml的中间产物溶液，搅拌10分钟，缓慢加入5mmol氯铬酸吡啶盐，搅拌反应1h，然后终止反应，硅胶层析纯化最终产物6-叠氮甲基-2吡啶甲醛(化合物1，缩写6-AM－2-PCA)。中间产物、化合物1均由质谱确证分子量(如图1A和B所示)。
实施例2-7
利用实施例1的方法分别合成式(I)所示的化合物，区别仅在于，式(I)中R1为(CH2)n并且n的取值分别为2、3、4、10、16和20，获得化合物2-7。
实施例8
利用实施例1的方法分别合成式(I)所示的化合物，区别仅在于，式(Ⅱ)所示的前体化合物中R1为分子量为1000的PEG，获得化合物8。
对比例1
利用实施例1的方法分别合成化合物，区别仅在于，前体化合物的结构如式(Ⅳ)所示，获得化合物9(3-叠氮甲基-2吡啶甲醛)。
对比例2
利用实施例1的方法分别合成化合物，区别仅在于，前体化合物的结构如式(Ⅴ)所示，获得化合物10(4-叠氮甲基-2吡啶甲醛)。
对比例3
利用实施例1的方法分别合成化合物，区别仅在于，前体化合物的结构如式(Ⅵ)所示，获得化合物11(5-叠氮甲基-2吡啶甲醛)。
对比例4
利用实施例1的方法分别合成化合物，区别仅在于，前体化合物的结构如式(Ⅶ)所示，获得化合物12(6-叠氮-2吡啶甲醛)。
实施例9
本实施例用于说明6-AM－2-PCA对多肽N端α型氨基酸的特异修饰。
用抗Her2抗原的抗体轻链的多肽片段(ADVVMTQSP，如SEQ ID NO.1所示)、N端乙酰化保护的轻链多肽(Ac-ADVVMTQSP)和阴性对照多肽(DYKDDDDKC，如SEQ ID NO.2所示)检测6-AM－2-PCA的修饰效果。在pH为7.5的50mM磷酸盐溶液中分别将多肽和6-AM－2-PCA按照1:100的摩尔比反应12小时，用HPLC纯化并质谱检测。结果如图2所示，质谱结果分析了偶联之后的样品的分子量。ADVVMTQS的N末段氨基酸侧链NH2为α构型，可以和6-AM－2-PCA反应，在质谱图中可以发现反应产物的峰(1113.4752)，多肽自身的峰为947.40(图2A)。而N端NH2基团乙酰化的Ac-ADVVMTQSP多肽不能和6-AM－2-PCA反应，未发现相应的峰(图2B)。阴性对照多肽(DYKDDDDKC)包括两个赖氨酸(Lys)具有侧链ε-NH2，并未发现相应的反应产物(图2C)。以上结果说明6-AM－2-PCA仅和抗体侧链的α-NH2基团反应，具有序列与构象特异性。
实施例10
本实施例用于说明利用6-AM－2-PCA制备生物偶联物。
偶联抗Her2抗原的抗体Fab和IgG蛋白。将浓度为1-200mM的6-AM－2-PCA与1mM的抗体在50mM磷酸缓冲液(pH7.5)中反应1-12小时，然后加入购于Jena Bioscience公司的DBCO标记Cy5.5荧光素，继续反应1-12小时。反应产物用超滤管(10000分子量)浓缩纯化。接着将标记后的抗体固定在PVDF膜上，拍摄荧光显色的抗体带。同时设置未标记的抗体组作为对照。如图3所示，可以清晰地观察到荧光标记的Fab(图3A)或者IgG抗体(图3B)。
测试例1
本测试例用于说明偶联后的抗体活性。
(1)利用实施例10的方法制备生物偶联物，分别使用化合物1-12将Her2抗原的抗体Fab段(ADVVMTQSP)与DBCO标记Cy5.5荧光素进行偶联。反应产物用超滤管(10000分子量)浓缩纯化。接着利用HPLC方法统计不同化合物的偶联修饰效果，统计结果如表1所示。
表1 不同的化合物修饰的对比。
化合物 多肽ADVVMTQSP 化合物 多肽ADVVMTQSP
1 80％ 7 59％
2 76％ 8 54％
3 73％ 9 43％
4 68％ 10 40％
5 57％ 11 37％
6 62％ 12 6％
由表1的结果可以得知，利用本公开所述的化合物，对多肽的修饰效果可以达到54-80％，特别的，当式(I)中n的取值为1-4时，获得的多肽修饰效果更好可以达到68-80％，当n取0时(由式(Ⅶ)所示化合物制备)，修饰效果最差。
(2)利用实施例10的方法制备生物偶联物，分别使用化合物1-12将IgG抗体与DBCO标记Cy5.5荧光素进行偶联，获得偶联修饰后抗体，利用表面等离子体共振(SPR)技术分析偶联修饰后的IgG抗体与Her2抗原的结合性。将抗体固定在芯片上，将修饰或者未修饰的抗体流过芯片，检测抗体结合常数和解离常数，计算亲和性Kd数值。结果如表2所示。
表2 修饰或者未修饰的抗Her2抗体结合Her2抗原的亲和性常数。
从表2的结果可以看出，利用化合物1-8进行偶联修饰，偶联修饰后抗体的亲和性基本没有受到影响，特别的，当式(I)中n的取值为1-4时，获得的抗体的亲和力保持效果更高。
(3)将乳腺癌细胞系SK-BR-3固定在玻片上，利用实施例1中制备的化合物1将Cy5.5荧光标记与抗Her2抗体进行偶联修饰，将获得的偶联修饰后抗体与SK-BR-3孵育1小时，细胞核用DAPI染色。荧光显微镜仪检测抗体结合细胞的情况，如图4，可以观测到抗体结合乳腺癌细胞，说明抗体对抗原仍保持良好的亲和性。
以上结合附图详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳亦诺生物医药有限公司
<120> 一种化合物及其制备方法和在抗体药物偶联物制备中的用途
<130> 6477ZQ
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> This sequence is synthesized in lab.
<400> 1
Ala Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro
1 5
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> This sequence is synthesized in lab.
<400> 2
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Cys
1 5

Claims (10)

1.一种化合物，其特征在于，所述化合物的结构如式(I)所示：
式(I)中，R1为(CH2)n或PEG。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中，n为1-20的整数，PEG的分子量为400-12000。
3.权利要求1或2所述的化合物的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)将前体化合物溶解于非质子极性溶剂中获得前体化合物溶液，将所述前体化合物溶液与碱金属叠氮盐的水溶液在相转移催化剂存在的条件下接触反应，获得中间产物；
(2)将所述中间产物溶解于二氯甲烷中获得中间产物溶液，将所述中间产物溶液在0-10℃下与氯铬酸吡啶盐接触反应获得反应产物；
其中，所述前体化合物的结构如式(Ⅱ)所示，所述中间产物的结构如式(Ⅲ)所示：
在式(Ⅱ)中，R2为Cl、Br或I；在式(Ⅱ)和式(Ⅲ)中，R1为(CH2)n或PEG，其中，n为1-20的整数，PEG的分子量为400-12000。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其中，所述非质子极性溶剂为四氢呋喃、二氯甲烷或二甲基甲酰胺；所述碱金属叠氮盐为叠氮化钠或叠氮化钾；所述相转移催化剂为四丁基硫酸氢胺。
5.根据权利要求3或4所述的制备方法，其中，相对于1mmol的所述前体化合物，碱金属叠氮盐的用量为1.6-2.4mmol，相转移催化剂的用量为0.08-0.12mmol，氯铬酸吡啶盐的用量为0.8-1.2mmol。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其中，所述前体化合物溶液中前体化合物的浓度为0.5-0.6mmol/mL；所述碱金属叠氮盐的水溶液的浓度为1-1.2mmol/mL；所述中间产物溶液的浓度为0.1-1mmol/mL。
7.一种生物偶联物的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(a)在磷酸盐缓冲液中将生物分子与权利要求1或2所述的化合物进行第一偶联1-24h，获得第一偶联混合物；
(b)将所述第一偶联混合物与含有二苯并环辛炔基团的修饰物接触，进行第二偶联1-24h，获得所述生物偶联物；
其中，所述生物分子为多肽片段或蛋白质。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其中，所述含有二苯并环辛炔基团的修饰物为标记物或药物。
9.权利要求7或8所述的制备方法所制备获得的生物偶联物。
10.权利要求9所述的生物偶联物在制备抗肿瘤的药物中的用途。
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