CN110650947A - 方法和分子 - Google Patents

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Abstract

本发明提供生物缀合方法和其中使用的化合物。所述生物缀合方法包括将含有第一不饱和官能团的生物分子与包含第二不饱和官能团的有效负载缀合的步骤，其中所述第一和第二不饱和官能团彼此互补，使得缀合是所述官能团通过形成环己烯环的狄尔斯‑阿尔德反应的反应。

Description

方法和分子
本公开涉及将生物分子与有效负载缀合的方法，由所述方法制备的分子，包含其的组合物，特别适用于所述方法的某些新型氨基酸结构，以及生物分子和组合物用于治疗(特别是治疗炎症反应(包括癌症))的用途。
背景技术
存在许多注册的药物产品，其包含与聚合物或毒素连接的蛋白质/多肽组分。聚合物通常是聚乙二醇，并且其通过使半胱氨酸或赖氨酸氨基酸残基(特别是赖氨酸残基的侧链)分别与马来酰亚胺基团或NHS-酯基团反应而与多肽缀合。其他治疗性化合物如抗体-药物缀合物(ADC)以类似方式制备，其中毒素/药物带有反应性马来酰亚胺基或其他用以附接到抗体的适当的官能团。这些反应的实例一般如下显示：
Figure BDA0002280513920000011
在多肽中使用天然氨基酸残基可以产生含有物质混合物的缀合产物。此外，如果用于缀合反应的目标氨基酸残基处于蛋白质折叠中或者例如溶剂不可接近，则可能需要苛刻的条件来驱动缀合反应完成。然而，因为分子的活性可能受到苛刻条件的损害，所以通常希望在生物分子存在下使用温和条件。
在过去的五到十年中，用于偶联生物分子中的天然残基的基本缀合反应变化非常小，这些反应的实例如下所示。然而，随着第二代生物制品(例如抗体药物缀合物)可能对诸如癌症的疾病的治疗作出显著贡献，这些反应变得越来越重要。化学(例如所谓的点击化学)可以用于与非天然官能团生物共轭，使用例如叠氮化物-炔烃环加成反应、应变叠氮化物-炔烃环加成、炔烃-硝酮加成、烯烃和叠氮化物的反应[3加2环加成]、烯烃和四嗪逆需求狄尔斯-阿尔德(Diels-Alder)反应、或烯烃和四唑[Husigen]反应。
这些反应所需的非天然官能团可以通过天然赖氨酸、半胱氨酸或酪氨酸的化学修饰，或通过表达将非天然氨基酸掺入蛋白质结构的蛋白质而安装到蛋白质上。这些化学方法的实例如下所示：
与天然蛋白官能团的缀合
Figure BDA0002280513920000021
与非天然蛋白官能团的缀合
Figure BDA0002280513920000022
虽然上面显示的许多缀合化学已经扩展了可用于制备生物缀合物的可能性，但是它们制备治疗分子的应用可能受限于以下：反应时间长，需要可以氧化蛋白质官能团的催化剂，影响例如聚集倾向的蛋白质性质的疏水反应配偶体，对爆炸性中间体(即叠氮化合物)的潜在安全性问题，仅举几个问题。
此外，采用上述化学方法以通过偶联非天然蛋白官能团来生产ADC需要开发含有适当互补反应基团的毒素/药物，这可能因为一些反应基团可能与某些有效负载不相容，和/或可能影响有效负载特性(如疏水性和溶解度)而使药物开发复杂化。目前，已经开发了许多ADC有效负载以包括用于缀合半胱氨酸硫醇的马来酰亚胺基团。将生物分子与另一种实体(例如聚合物或有效负载)缀合的替代方法将是有用的，其例如利用当前可用的官能团(例如马来酰亚胺基)并且已知与大范围期望的有效负载相容。此外，具有一种或多种以下性质的缀合反应将是有用的，特异性，快速，使用温和或中等条件，并且能够与不暴露于溶剂的氨基酸残基反应。
发明内容
因此，在一个方面中，提供了一种生物缀合方法，其包括将含有第一不饱和官能团的生物分子与包含第二不饱和官能团的有效负载缀合的步骤，其中所述第一和第二不饱和官能团彼此互补，使得缀合是所述官能团通过形成环己烯环的狄尔斯-阿尔德反应的反应。
本文所用的狄尔斯-阿尔德反应是指4+2环加成反应，其形成环己烯环，其可以是稠环系统的一部分。该反应的一般实例如下所示：
Figure BDA0002280513920000031
令人惊讶的是，本发明人已经确定该反应可以在温和条件下在包含生物分子的特异性缀合反应中使用。在某些情况下，反应在室温下需要两小时。在其他情况下，生物缀合反应可以分一步进行，而不需要除有效负载、蛋白质和溶剂之外的其他试剂。
此外，包含有效狄尔斯-阿尔德转化所需的二烯官能团的反应性交联剂和非天然氨基酸是可合成获得的，并且可以以简单和直接的途径以高产率生产。
二烯或亲二烯体可以通过加成接头或通过将非天然氨基酸掺入多肽序列而掺入生物分子中。然后可以将必要的互补官能团掺入有效负载中。
以下是有效负载与氨基酸中包含二烯的非天然氨基酸的缀合的示意图：
Figure BDA0002280513920000041
有利地，缀合反应的产物在体温下在生物环境中是稳定的。然而，如果需要，反应可以通过将缀合产物暴露于升高的温度，例如60℃或更高温度来逆转反应。
在一个实施例中，第一官能团(即在生物分子内)是二烯。
在一个实施例中，第二官能团(即在有效负载中)是亲二烯体，例如选自马来酰亚胺、马来酸酯、富马酸酯、丙烯酸酯、甲基丙烯酸、丙烯腈、丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、甲基乙烯基酮、乙烯基吡啶、酰胺和丁-2-炔二酸、醌、炔烃的酯。
在一个实施例中，第二官能团是二烯。
在一个实施例中，第一官能团(即在生物分子中)是亲二烯体，例如马来酸酯、马来酰亚胺、富马酸酯、丙烯酸酯、甲基丙烯酸、丙烯腈、丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、甲基乙烯基酮、乙烯基吡啶、酰胺和丁-2-炔二酸、醌、炔烃的酯。
在一个实施例中，第一官能团是非天然氨基酸中的亲二烯体，例如包含降冰片烯的非天然氨基酸。
在一个实施例中，二烯是直链二烯、碳环二烯或杂环二烯，例如二烯包括丁二烯、环戊二烯、1，3-环己二烯、呋喃或蒽。
在一个实施例中，二烯包含在非天然氨基酸中，例如衍生自赖氨酸、半胱氨酸、硒代半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、甘氨酸和酪氨酸的非天然氨基酸。
在一个实施例中，二烯在氨基酸的侧链中。
在一个实施例中，非天然氨基具有式(I)：
RX-X1-O0-1C(O)-氨基酸-残基 (I)
其中：
RX表示选自以下的不饱和基团：
i)C4-9直链共轭二烯，
ii)包含共轭二烯的C5-14碳环基，以及
iii)包含1、2或3个选自O、N和S的杂原子和共轭二烯的5至14元杂环基，
其中i)、ii)和iii)可以具有多达五个取代基(例如一个、两个或三个取代基)，例如，取代基独立地选自C1-3烷基、氧代、卤素、磺基、巯基、氨基、-C1-3亚烷基N3、或-C2-5炔基；并且
X1表示
i)饱和或不饱和的支链或非支链C1-8亚烷基链，其中至少一个碳(例如1、2或3个碳)被选自O、N、S(O)0-3的杂原子替换，其中所述链任选地被一个或多个独立地选自氧代、卤素、氨基、-C1-3亚烷基N3或-C2-5炔基的基团取代；或
ii)与来自碳环基或杂环基的碳一起表示与饱和或不饱和(特别是饱和的)支链或非支链的C1-6亚烷基链连接的环丙烷环，其中至少一个碳(例如1、2或3个碳)被选自O、N、S(O)0-3的杂原子替换，其中所述链任选地被一个或多个独立地选自氧代、卤素、氨基、-C1-3亚烷基N3或-C2-5炔基的基团取代，并且
-O0-1C(O)-通过氨基酸的侧链连接。
在一个实施例中，非天然氨基酸是式(II)结构的残基：
Figure BDA0002280513920000051
其中
X2表示-C-、-C(R’)-、-CH2或O；
R’表示H或C1-3烷基，
Ra表示
i)饱和或不饱和的支链或非支链C1-8亚烷基链，其中至少一个碳(例如1、2或3个碳)被选自O、N、S(O)0-3的杂原子替换，其中所述链任选地被一个或多个独立地选自氧代、卤素、氨基的基团取代；或
ii)与来自5元环的碳一起表示与饱和或不饱和(特别是饱和的)支链或非支链C1-6亚烷基链连接的环丙烷环，其中至少一个碳(例如1、2或3个碳)被选自O、N、S(O)0-3的杂原子替换，其中所述链任选地被一个或多个独立地选自氧代、卤素、氨基的基团取代；
Rb表示H、-OC1-3烷基、任选地具有羟基取代基的C1-6烷基、-C1-3亚烷基N3或-C2-5炔基；
Rc表示H、-OC1-3烷基、任选地具有羟基取代基的C1-6烷基、-C1-3亚烷基N3或-C2-5炔基；
Rd表示H、-OC1-3烷基、任选地具有羟基取代基的C1-6烷基、-C1-3亚烷基N3或-C2-5炔基；
Re表示H、饱和或不饱和(特别是饱和的)支链或非支链C1-8亚烷基链，其中一个或多个碳任选地被-O-替换，并且所述链任选地被一个或多个卤素原子(例如碘)、N3或-C2-5炔基取代。
在一个实施例中，Ra是-(CH2)mC(O)-、-CH2(CH3)C(O)-、-(CH2)mCH2OC(O)-、
-CHCHCH2OC(O)-或-OCH2CH2COC(O)-以及m表示0或1。
在一个实施例中，Rb是H、-OC1-3烷基、-CH3、-CH(CH3)2、CH2OH、-CH2N3或-CCH。
在一个实施例中，Rc是H、-OC1-3烷基、-CH3、-CH(CH3)2、CH2OH、-CH2N3或-CCH。
在一个实施例中，Rd是H、-OC1-3烷基、-CH3、-CH(CH3)2、CH2OH、-CH2N3或-CCH。
在一个实施例中，Re表示H或-CH2OCH2CH2N3。
在一个实施例中，非天然氨基酸是式(IIa)结构的残基：
Figure BDA0002280513920000061
其中Ra、Rb、Rc、Rd、Re和X2如上定义。
在一个实施例中，非天然氨基酸具有式(IIb)的结构：
Figure BDA0002280513920000071
其中Ra、Rb、Rc、Rd、Re和X2如上定义。
在一个实施例中，非天然氨基酸具有式(IIc)的结构：
Figure BDA0002280513920000072
其中Ra、Rb、Rc、Rd、Re如上定义，X2’是-C-或-CR’，如上定义。
一般来讲，化合物，例如式(I)、(II)、(IIa)、(IIb)和(IIc)最多仅含有一个叠氮基。
在一个实施例中，非天然氨基酸选自包括以下的群组：
Figure BDA0002280513920000081
在一个实施例中，该方法包括通过接头将二烯或亲二烯体(特别是二烯)与生物分子中的氨基酸残基缀合的前步骤，例如其中氨基酸是半胱氨酸或赖氨酸。
在一个实施例中，在加成到生物分子中的所述氨基酸残基之前，二烯具有式(III)的结构：
RX-Bn-X3 m-Yp-Z (III)
其中
n表示0或1；
m表示0或1；
p表示0或1；
RX表示选自以下的不饱和基团：
i)C4-9直链共轭二烯，
ii)包含共轭二烯的C5-14碳环基，以及
iii)包含1、2或3个选自O、N和S的杂原子和共轭二烯的5至14元杂环基，
其中i)、ii)和iii)可以具有多达五个取代基(例如一个、两个或三个取代基)，例如其中取代基独立地选自C1-3烷基、氧代、卤素、磺基、巯基、氨基、-C1-3亚烷基N3、或-C2-5炔基；并且
B表示C1-6亚烷基、-C3-4环烷基C1-6亚烷基-；其中任选地糖残基(例如葡萄糖、葡糖胺、半乳糖、半乳糖胺、乳糖、甘露糖和果糖)包含在其任一个的亚烷基链中，并且其中针对B定义的所述变量的任一个的亚烷基链任选地具有一个或两个独立地选自N-和O-连接的糖残基(例如葡萄糖、葡糖胺、半乳糖、半乳糖胺、乳糖、甘露糖和果糖)的取代基：
X3表示-(R1)NC(O)-、-C(O)N(R1)-、-OC(O)-、-OC(O)N-；
R1表示H或-CH2OCH2CH2R2；
R2表示-N3、C2-5炔基或卤素，例如碘；
Y表示-(OCH2)qC2-6亚烷基，或任选地被-NR3R4取代的-C2-6亚烷基，
其中q为1至7000；
R3和R4独立地表示H或C1-3烷基；
Z表示-C(O)OR5、R5’、-NC(O)R6、-C2-5亚烷基、CH2-O-NH2、炔烃、叠氮化物、3-芳基丙炔腈或卤素如碘；
R5表示C1-6烷基、琥珀酰亚胺、C6F4H(四氟己基)或H：
R5’表示硫桥连基团，例如二澳马来酰亚胺、二氯丙酮或其任一个的衍生物，
R6表示：
Figure BDA0002280513920000101
其中
R7是任选地具有一个或多个(例如一个、两个或三个)选自羟基、磺基、氨基和-(OCH2)vC2-6亚烷基的基团的C1-6亚烷基，和任选地具有一个或多个(例如一个、两个或三个)选自羟基、磺基、氨基和-(OCH2)vC2-6亚烷基的基团的苯基，
v是整数1、2、3、4或5
Figure BDA0002280513920000103
表示片段与分子其余部分连接的位置。
在一个实施例中，二烯具有以下结构：
Figure BDA0002280513920000102
Figure BDA0002280513920000111
在一个实施例中，反应在10℃至40℃的温度下进行，例如环境温度。
在一个实施例中，反应在含水溶剂，例如含水有机溶剂系统，缓冲液，例如PBS，任选地包含极性非质子溶剂，例如DMSO或表面活性剂，例如聚山梨醇酯80或其组合中进行。
在一个实施例中，治疗性生物分子是多肽，例如选自包含配体、受体、抗体分子的群组。
在一个实施例中，将生物分子工程化以从原始或天然序列添加或去除一个或多个赖氨酸残基。
在一个实施例中，将生物分子工程化以从原始或天然序列添加或去除一个或多个半胱氨酸残基。
在一个实施例中，将生物分子工程化以从原始或天然序列添加或去除一个或多个酪氨酸残基。
在一个实施例中，将生物分子工程化以将一个或多个天然或非天然氨基酸残基添加至原始或天然序列。
在一个实施例中，生物分子是治疗分子。
在一个实施例中，有效负载选自：
a.奥瑞他汀，例如选自包括MMAE(单甲基奥瑞他汀E)、MMAF(单甲基奥瑞他汀F)、多柔比星、微管溶素(tubulysin)和倍癌霉素的群组；
b.包含美登木素生物碱，例如N 2′-脱乙酰基-N 2′-(3-巯基-1-氧代丙基)-美登素(DM1)、N 2′-脱乙酰基-N2′-(4-巯基-1-氧代戊基)-美登素(DM3)和N 2′-脱乙酰基-N 2′(4-甲基-4-巯基-1-氧代戊基)-美登素(DM4)；
c.吡咯并苯并二氮杂卓(PBD)或亚氨基苯并二氮杂卓(IBD)；
d.拓扑异构酶抑制剂，例如SN-38、伊立替康、依沙替康或DxD1；
e.毒素；以及
f.聚合物，例如天然聚合物，例如淀粉、聚(谷氨酸)、聚(天冬氨酸)、聚(赖氨酸)或白蛋白或合成聚合物，例如PEG。
在另一个独立方面中，提供了由根据本公开的方法获得或可获得的、与有效负载缀合的生物分子。
在一个独立方面中，还提供了通过二烯和亲二烯体之间以形成环己烯环的狄尔斯-阿尔德反应与有效负载缀合的生物分子。
在一个实施例中，环己烯环是稠环系统的一部分，例如包含最多20个原子。
在一个实施例中，稠环系统具有式(IVa)：
Figure BDA0002280513920000121
其中
RY表示有效负载，例如如本文所定义；并且
RZ表示生物分子，例如如本文所定义，或
式(IVb)：
Figure BDA0002280513920000122
其中
RY表示有效负载，例如如本文所定义；
RZ表示生物分子，例如如本文所定义；并且
X4表示-O-或-CH2-。
在一个实施例中，生物分子是抗体或其结合片段。
还提供了与根据本公开的有效负载缀合的生物分子，其中该有效负载选自：
a.奥瑞他汀，例如选自包括微管溶素或吡咯并苯并二氮杂卓(PBD)MMAE(单甲基奥瑞他汀E)、MMAF(单甲基奥瑞他汀F)、多柔比星和倍癌霉素的群组；
b.包含美登木素生物碱，例如N2′-脱乙酰基-N2′-(3-巯基-1-氧代丙基)-美登素(DM1)、N 2′-脱乙酰基-N2′-(4-巯基-1-氧代戊基)-美登素(DM3)和N 2′-脱乙酰基-N 2′(4-甲基-4-巯基-1-氧代戊基)-美登素(DM4)；
c.毒素；
d.聚合物，例如天然聚合物，例如淀粉、聚(谷氨酸)或白蛋白或合成聚合物，例如PEG。
还提供了药物组合物，其包含与根据本公开的有效负载缀合的生物分子和稀释剂、载体和/或赋形剂，例如其中所述组合物是肠胃外制剂。
本公开进一步提供治疗患者的方法，其包括施用治疗有效量的本文公开的与有效负载缀合的生物分子或药物组合物。
因此，提供了本文公开的与有效负载缀合的生物分子或药物组合物，其用于治疗。
本文公开的与有效负载缀合的生物分子或药物组合物用于制备药物的用途是本发明的另一方面。
在一个独立方面中，提供了包含二烯或亲二烯体的非天然氨基酸，例如其中二烯或亲二烯体在侧链中。
在一个实施例中，本公开的非天然氨基酸衍生自赖氨酸天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、硒代半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、甘氨酸和酪氨酸。
在一个实施例中，根据本公开的非天然氨基酸具有式(I)：
RX-X1-O0-1C(O)-氨基酸-残基 (I)
其中：
RX表示选自以下的不饱和基团：
i)C4-9直链共轭二烯，
ii)包含共轭二烯的C5-14碳环基，以及
iii)包含1、2或3个选自O、N和S的杂原子和共轭二烯的5至14元杂环基，
其中i)，ii)和iii)可具有一个、两个或三个取代基；并且
X1表示C1-5烷基，以及
O0-1C(O)通过氨基酸的侧链连接。
在一个实施例中，非天然氨基酸具有式(II)：
Figure BDA0002280513920000141
或其盐，其中
X2表示-C-、CR’、-CH2或O；
Ra表示
i)饱和或不饱和的支链或非支链C1-8亚烷基链，其中至少一个碳(例如1、2或3个碳)被选自O、N、S(O)0-3的杂原子替换，其中所述链任选地被一个或多个独立地选自氧代、卤素、氨基的基团取代；或
ii)与来自5元环的碳一起表示与饱和或不饱和的(例如饱和的)支链或非支链C1-6亚烷基链连接的环丙烷环，其中至少一个碳(例如1、2或3个碳)被选自O、N、S(O)0-3的杂原子替换，其中所述链任选地被一个或多个独立地选自氧代、卤素、氨基的基团取代；
Rb表示H、-OC1-3烷基、任选地具有羟基取代基的C1-6烷基、-C1-3亚烷基N3或-C2-5炔基；
Rc表示H、-OC1-3烷基、任选地具有羟基取代基的C1-6烷基、-C1-3亚烷基N3或-C2-5炔基；
Rd表示H、-OC1-3烷基、任选地具有羟基取代基的C1-6烷基、-C1-3亚烷基N3或-C2-5炔基；
Re表示H、饱和或不饱和的支链或非支链C1-8亚烷基链，其中一个或多个碳任选地被-O-替换，并且该链任选地被一个或多个卤素原子(例如碘)、N3或-C2-5炔基取代。
在一个实施例中，Ra、Rb、Rc、Rd和Re如本文所定义。
在一个实施例中，非天然氨基酸是式(IIa)结构的残基：
Figure BDA0002280513920000151
或其盐，其中Ra、Rb、Rc、Rd、Re和X2如以上具有式(II)的化合物所定义。
在一个实施例中，非天然氨基酸具有式(IIb)的结构：
Figure BDA0002280513920000152
或其盐，其中Ra、Rb、Rc、Rd、Re和X2如以上具有式(II)的化合物所定义。
在一个实施例中，非天然氨基酸具有式(IIc)的结构：
Figure BDA0002280513920000153
或其盐，其中Ra、Rb、Rc、Rd、Re和X2如以上具有式(II)的化合物所定义。
在一个实施例中，非天然氨基酸选自包括以下的群组：
Figure BDA0002280513920000161
或其任一个的盐。
还提供了包含根据本公开的非天然氨基酸的多肽。
在一个实施例中，生物共轭反应不将生物分子与凝胶或颗粒缀合。
在一个独立方面中，提供了一种生物缀合方法，其包括将含有第一不饱和官能团的生物分子与包含第二不饱和官能团的实体缀合的步骤，其中所述第一和第二不饱和官能团是彼此互补的偶联物，使得所述互补偶联物的一个官能团是二烯，而所述互补偶联物中的另一个官能团是亲二烯体，所述缀合是所述官能团通过形成环己烯环的狄尔斯-阿尔德反应的反应，条件是二烯不是未取代的呋喃。
在一个独立方面中，提供了一种生物缀合方法，其包括将在非天然氨基酸中含有第一不饱和官能团的生物分子与含有第二不饱和官能团的实体缀合的步骤，其中所述第一和第二不饱和官能团是彼此互补的偶联物，使得所述互补偶联物的一个官能团是二烯，而所述互补偶联物中的另一个官能团是亲二烯体，所述缀合是所述官能团通过形成环己烯环的狄尔斯-阿尔德反应的反应。
具体实施方式
本文使用的生物分子是具有至少一种生物活性的多肽。
在一个实施例中，生物分子是治疗性生物分子，即可以用于治疗，特别是人类治疗的生物分子。
如本文所用的缀合(反应)是将分子与另一种实体连接的简单反应。在本说明书的上下文中，与例如有效负载缀合的生物分子是从缀合反应获得的产物。
本文所用的生物缀合方法是指将生物分子与另一种实体(例如有效负载)连接的方法。
在本说明书的上下文中的实体包括有效负载，例如聚合物和/或毒素、固体表面(例如板)、颗粒等。有效负载的实例在下面更详细地描述。
本文所用的氨基酸残基是指通过氨基酸的N和/或C末端与例如另一种氨基酸连接的天然或非天然氨基酸，特别是其中至少一个连接是肽键。
本文所用的非天然氨基酸是指不同于21种天然存在的氨基酸中一种的氨基酸。例如，非天然氨基酸包含二烯或亲二烯体，并且还在作为天然氨基酸特征的相对位置含有氨基和羧基官能团。某些非天然氨基酸及其制备方法公开在WO 2015/019192中，其通过引用并入本文。在一个实施例中，亲二烯体包含在非天然氨基酸中，例如降冰片烯赖氨酸，其公开在通过引用并入本文的US 2015/0005481中。
非天然氨基酸通常衍生自天然氨基酸。衍生自天然氨基酸是指非天然氨基酸基于(或结合)或类似于天然氨基酸的结构的事实，例如赖氨酸中的亚烷基链可缩短以提供与天然4碳链相反的3-碳链，但与赖氨酸的结构关系或相似性仍然存在。因此，天然氨基酸的衍生物包括修饰，例如掺入二烯或亲二烯体、延长或缩短亚烷基链、向侧链中的氮、氧、硫添加一个或多个取代基或将氮、氧或硫转化为不同的官能团或其任一种的组合。通常，大多数修饰是在非天然氨基酸中添加结构。然而，修饰可以包括去除或替换氨基酸中天然存在的原子。
本文所用的天然氨基酸是指21种蛋白质氨基酸(即精氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、硒代半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸)。
在一个实施例中，将包含二烯或亲二烯体的非天然氨基酸掺入生物分子的氨基酸序列中，例如掺入重组多肽的表达过程中。这是有利的，因为它使氨基酸精确定位，这则促进与有效负载的非常特异的缀合反应。
在一个实施例中，非天然氨基酸可以通过接头和缀合反应附加到生物分子上。
本文使用的亲二烯体是与二烯反应的官能团。在一个实施例中，亲二烯体包含烯烃(具有一个双键，特别是一个双键)。
本文使用的二烯是指两个双键(两个烯基团)。但是，所述的两个基团需要彼此接近。因此，除非上下文另有说明，否则本文所用的二烯通常是指共轭二烯。
本文所用的共轭二烯是指在直链或环状环境中的双键-单键-双键。
在直链环境中的共轭二烯包括C4-9直链共轭二烯，例如丁二烯、戊二烯、己二烯、庚二烯、辛二烯和壬二烯。在此上下文中，直链是指非环状的，因此包括含有共轭二烯的C4-9碳链的支链形式。
在环状环境中的共轭二烯包括例如单环碳环，例如环戊二烯或环己二烯，或在双环或三环碳环体系中，例如包含与另一环稠合的环戊二烯或环己二烯的体系。在一个实施例中，共轭二烯不是芳族的。共轭二烯不应与共轭反应混淆，两者是“无关的”。
本文所用的碳环是指环体系，其中构成体系的环由碳原子构成，即杂原子对环体系没有贡献。但是，碳环可以具有一个或多个取代基，取代基可以含有杂原子。在一个实施例中，碳环是部分不饱和的或芳族的。
环丙烷是三元碳环。在一些实施例中，环丙烷环附加于碳环二烯环或杂环二烯环，例如如本文的一些结构中所示。这是有利的，因为它使二烯自反应的倾向最小化，这可能发生反应性二烯。本说明书中的该环丙烷环本身不定义为取代基，而是根据与包含二烯的环系统连接的链或“接头”来定义。
如本文所用，包含共轭二烯的C5-14碳环基是指5至14元碳环体系，其可具有一个或多个取代基，例如一个、两个、三个、三个、四个取代基。
包含共轭二烯或亲二烯体的碳环是在非天然氨基酸中发现的反应性官能团的一部分，或者是在与“有效负载”缀合之前添加的接头的组分。C5-14碳环的实例包括环戊二烯(包括取代或未取代的环戊二烯)、环己二烯(包括取代或未取代的环己二烯)、蒽(包括取代或未取代的蒽)。
在一个实施例中，非天然氨基酸或接头中的环戊二烯是未取代的。在一个实施例中，环戊二烯通过环丙烷环与非天然氨基酸或接头连接。
在一个实施例中，非天然氨基酸或接头中的环戊二烯包含一个、两个、三个、四个或五个C1-3烷基取代基，例如环戊二烯具有五个甲基取代基。
本文所用的杂环基是指包含一个或多个，例如1、2、3或4个独立地选自O、N和S的杂原子的饱和或部分不饱和或芳族环，任选地，环中的一个或两个碳可具有氧代取代基。显然，任何未用于形成或保留环结构的杂原子的任何空位都可以在适当时用氢或取代基填充。因此，杂环上的取代基可以在碳上或在杂原子上，例如在适当时为N。
5至14元杂环将含有5至14个形成环体系的成员，例如包含一个、两个或三个杂原子。例如，杂环可以具有一个、两个或三个取代基。通常，杂环通常包含二烯或亲二烯体，因此是至少部分不饱和的并且可以是芳族的。
5至14元杂环通常包含用于掺入非天然氨基酸或接头的二烯或亲二烯体。包含二烯的杂环的实例包括呋喃(包括取代或未取代的呋喃，特别是取代的呋喃)和2H-吡喃(包括其取代或未取代的形式)。包含亲二烯体的杂环的实例包括马来酰亚胺、乙烯基吡啶、吡咯啉(如2-吡咯啉和3-吡咯啉)和3，4-二氢吡喃。
在一个呋喃中，其具有至少一个取代基，例如给电子取代基，例如烷氧基，特别是至少一个(例如一个)甲氧基。
当二烯或亲二烯体通过接头掺入生物分子中时，诸如N3、卤素、琥珀酰亚胺或炔烃的官能团可以与例如生物分子的氨基酸序列中的赖氨酸反应。
本文所用的烷基是指直链或支链烷基，例如但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、丁基、正丁基和叔丁基。在一个实施例中，烷基是指直链烷基。
本文所用的烷氧基是指直链或支链烷氧基，例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基。本文所用的烷氧基也延伸至其中氧原子位于烷基链内的实施例，例如-C1-3烷基OC1-3烷基，例如-CH2CH2OCH3或-CH2OCH3。因此，在一个实施例中，烷氧基通过碳与分子的其余部分连接。在一个实施例中，烷氧基通过氧与分子的其余部分连接，例如-C0烷基OC1-6烷基。在一个实施例中，本公开涉及直链烷氧基。
本文所用的氨基是指-NH2、C1-4单或二酰基氨基分别意指-NHC(O)C1-3烷基和(-NC(O)C1-3烷基)C(O)C1-3烷基)。
C1-4单或二烷基氨基分别意指-NHC1-4烷基和-N(C1-4烷基)(C1-4烷基)。
卤素或卤代包括氟、氯、澳或碘，特别是氟、氯或澳，尤其是氟或氯。
本文所用的氧代是指C＝O，通常表示为C(O)。
本文所用的亚烷基是指支链或非支链碳基，例如亚甲基(-CH2-)或其链。
本文所用的C2-5炔烃是指含有以下的基团或基：三键；和以直链或支链排列的2至5个碳原子。
关于饱和或不饱和的，支链或非支链的C1-8烷基链，其中至少一个碳(例如1、2或3个碳，合适地1或2个，特别是1个)被选自O、N、S(O)0-3的杂原子替换，其中所述链任选地被一个或多个独立地选自氧代、卤素的基团取代，本领域技术人员将清楚了解，该杂原子可以替换伯、仲或叔碳(即CH3、-CH2-或-CH-)或在技术上合适时的支链碳基团。
本文所用的N3是指叠氮化物。
本文所用的磺基是指与一个，两个或三个氧原子键合的硫原子。
本文所用的巯基是指与一个或多个氢原子键合的硫原子，其可以在质子化和非质子化形式之间平衡存在。
环己烯环，其是通过狄尔斯-阿尔德机理根据本公开的反应的共轭产物的特征，单环体系或稠环体系的一部分，例如双环体系。
用于加成到式(III)化合物的合适的糖包括葡萄糖、葡糖胺、半乳糖、半乳糖胺、甘露糖、果糖、半乳糖、麦芽糖和乳糖。有利地，添加糖分子可以增加溶解度。
用于本公开的多肽
在文中可互换使用的术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”是指具有任何长度的氨基酸的聚合物。该聚合物可以是直链或支链的，它可以包含修饰的氨基酸，并且它可以被非氨基酸中断。这些术语还涵盖已经被天然修饰或通过干预修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操纵或修饰，如与标记组分缀合。该定义中还包括，例如，含有一种或多种氨基酸类似物(包括例如，非天然氨基酸等)，以及本领域已知的其他修饰的多肽。应理解，因为本公开的多肽基于抗体。
本文使用的多肽是指5个或更多个氨基酸的序列，具有或不具有包含至少一个硫醇基团的二级或三级结构。因此，在本公开中，术语“多肽”包括肽、多肽和蛋白质。除非另有说明，否则它们可互换使用。
在一个实施例中，多肽是蛋白质。蛋白质通常含有二级和/或三级结构，并且可以是单体或多聚体形式。
在一个实施例中，蛋白质是作为单链或相关链或其结合片段的抗体。
本文所用的抗体分子是通用术语，其是指抗体、抗体结合片段和抗体形式，例如包含所述抗体或其结合片段的多特异性抗体。
如文中可互换使用的术语“抗体”或“免疫球蛋白”包括完整抗体及其任何抗原结合片段或单链。
典型的抗体包含通过二硫键互连的至少两条重(H)链和两条轻(L)链。每条重链由重链可变区(本文缩写为VH、VH区或VH结构域)和重链恒定区构成。重链恒定区由三个或四个恒定结构域CH1、CH2、CH3和CH4构成。该Fc区包括包含抗体除第一恒定区免疫球蛋白结构域之外的恒定区的多肽及其片段。因此，对于IgG，“Fc区”是指CH2和CH3，并且任选地在这些结构域的N-末端的全部或部分柔性铰链区。术语“Fc区”可以指分离的这个区域，或在抗体、抗体片段、或Fc融合蛋白的背景下的这个区域。
每条轻链由轻链可变区(本文缩写为VL、VL区或VL结构域)和轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个结构域CL构成。
VH和VL区可以进一步细分为称为互补决定区(CDR)的高变区，其间插入更保守的称为构架区(FW)的区域。每个VH和VL由三个CDR和四个FW构成，从氨基末端到羧基末端按照以下顺序排列：FW1、CDR1、FW2、CDR2、FW3、CDR3、FW4。可以根据它们各自的VH和VL区指定框架区。因此，例如，VH-FW1将是指VH的第一框架区。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子(包括免疫系统的不同细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q))的结合。
术语“抗体”意指通过位于免疫球蛋白分子的可变区内的至少一个抗原识别位点(也称为结合位点)识别并特异性地结合靶标如蛋白质、多肽、肽、碳水化合物、多核苷酸、脂质、或上述物质的组合的免疫球蛋白分子或其抗原结合片段。如本文所用，术语“抗体”涵盖完整的多克隆抗体、完整的单克隆抗体、抗体片段(例如Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段)、单链抗体片段(scFv和二硫键稳定化的scFv(dsFv))、多特异性抗体(例如由至少两种不同抗体产生的双特异性抗体或由抗体片段形成的多特异性抗体)(参见，例如，PCT公开WO 96/27011、WO 2007/024715、WO 2009018386、WO 2009/080251、WO 2013006544、WO 2013/070565和WO 2013/096291)、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、包含抗体的抗原结合片段的融合蛋白、以及包含抗原结合片段的任何其他经修饰的免疫球蛋白分子，只要这些抗体表现出所希望的生物学活性。
抗体可以是以下五大类免疫球蛋白中的任一种：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，或亚类(同种型)(例如IgG1、IμG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)，或同种异型(例如Gm，例如G1m(f、z、a或x)、G2m(n)、G3m(g、b或c)、Am、Em和Km(1、2或3))。不同类别的免疫球蛋白具有不同的和熟知的亚基结构和三维构型。抗体可以源自任何哺乳动物，包括但不限于人、猴、猪、马、兔、狗、猫、小鼠等等，或其他动物，如鸟类(例如鸡)。
术语“抗原结合片段”是指包含完整抗体的抗原性决定可变区的片段。本领域已知，抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段执行。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv片段、scFv、线性抗体、单链抗体、和由抗体片段形成的多特异性抗体。
因此，在一个实施例中，本发明中使用的抗体可包含具有全长重链或轻链的完整抗体分子或其片段，并且可以是但不限于Fab、修饰的Fab、Fab′、修饰的Fab′、F(ab’)2、Fv、单结构域抗体(例如VH或VL或VHH)、scFv、二、三或四价抗体、Bis-scFv、双抗体、三抗体、四抗体、其组合和以上中任一种的表位结合片段。
特别考虑的其他抗体是“寡克隆”抗体，它是不同单克隆抗体的预定混合物。参见例如PCT公开WO 95/20401；美国专利号5,789,208和6,335,163。优选地，寡克隆抗体由针对在单个细胞中产生的一个或多个表位的抗体的预定混合物组成。更优选地，寡克隆抗体包含能够与共同轻链配对以产生具有多种特异性的抗体的多个重链(例如，PCT公开WO 04/009618)。当需要靶向单个靶分子上的多个表位时，寡克隆抗体是特别有用的。本领域技术人员将知道或可以确定哪种类型的抗体或抗体混合物适用于预期目的和所希望的需要。
特别考虑用于本公开的其他部分是小的工程化蛋白结构域，例如支架(参见例如，美国专利公开号2003/0082630和2003/0157561)。支架是基于已知的天然存在的非抗体结构域家族，特别是蛋白质细胞外结构域，其通常具有小尺寸(约100AA至约300AA)并且包含与具有允许插入、缺失或其他取代的高构象耐受性的可变结构域缔合的高度结构化的核心。这些可变结构域可以为任何靶蛋白创建推定的结合界面。通常，通用蛋白骨架的设计由两个主要步骤组成：(i)选择具有所希望特征的适合的核心蛋白质和(ii)通过诱变接受高结构变异性的部分或全部结构域产生复杂的组合文库，以适当的形式展示这些文库(即噬菌体、核糖体、细菌或酵母)和筛选具有所希望的结合特征(例如靶特异性和/或亲和力)的诱变骨架的文库。亲本支架的结构可以是高度多样化的并且包括高度结构化的蛋白质结构域，其包括但不限于FnIII结构域(例如，AdNectins，参见例如Protein Eng.Des.Sel.[蛋白质工程设计与选择]18，435-444(2005)、US 2008/00139791和WO 2005/056764，TN3，参见例如WO 2009/058379和WO 2011/130324)；蛋白质A的Z结构域(Affibody，参见例如ProteinEng.Des.Sel.[蛋白质工程设计与选择]17，455-462(2004)和EP 1641818 A1)；来自LDL受体的结构域A(Avimers，参见，例如，Nature Biotechnology[自然生物技术]23(12)，1556-1561(2005)和Expert Opinion on Investigational Drugs[对研究药物的专家观点]16(6)，909-917(2007年6月))；锚蛋白重复结构域(DARPins，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]332，489-503(2003)，PNAS(2003)和Biol.[生物学]369，(2007)和WO 02/20565)；C型凝集素结构域(Tetranectins，参见，例如，WO 02/48189)。如果需要，可以将两个或多个这样的工程化支架结构域连接在一起，以形成多价结合蛋白。根据用途/疾病适应症，单个结构域可靶向单一类型的蛋白质或若干种类型的蛋白质。
实际上，任何分子(或其部分，例如亚基、结构域、基序或表位)可以被包括但不限于以下的部分靶向和/或并入其中：包括离子通道、离子泵的整合膜蛋白、G-蛋白质偶联受体、结构蛋白；粘附蛋白如整合素；转运蛋白；参与信号转导的蛋白质和包括G蛋白的脂质锚定蛋白、酶如激酶，包括膜锚定激酶、膜结合酶、蛋白酶、脂肪酶、磷酸酶、脂肪酸合成酶、消化酶如胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶、溶菌酶、聚合酶；受体如激素受体、淋巴因子受体、单核因子受体、生长因子受体、细胞因子受体；细胞因子；以及其他。
在一些方面中，本公开中使用的多肽靶向和/或并入选自如下的生长因子、细胞因子、细胞因子相关蛋白、生长因子、受体配体或受体的全部或部分(例如，亚基、结构域、基序或表位)，例如：BMP1、BMP2、BMP3B(GDF10)、BMP4、BMP6、BMP8、CSF1(M-CSF)、CSF2(GM-CSF)、CSF3(G-CSF)、EPO、FGF1(αFGF)、FGF2(βFGF)、FGF3(int-2)、FGF4(HST)、FGF5、FGF6(HST-2)、FGF7(KGF)、FGF9、FGF10、FGF11、FGF12、FGF12B、FGF14、FGF16、FGF17、FGF19、FGF20、FGF21、FGF23、FGFR、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FGFRL1、FGFR6、IGF1、IGF2、IGF1R、IGF2R、IFNA1、IFNA2、IFNA4、IFNA5、IFNA6、IFNA7、IFNAR1、IFNAR2、IFNB1、IFNG、IFNW1、FIL1、FIL1(EPSILON)、FIL1(ZETA)、IL1A、IL1B、IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8、IL9、IL10、IL11、IL12A、IL12B、IL13、IL14、IL15、IL16、IL17、IL17B、IL18、IL19、IL20、IL22、IL23、IL24、IL25、IL26、IL27、IL28A、IL28B、IL29、IL30、IL2RA、IL1R1、IL1R2、IL1RL1、IL1RL2、IL2RA、IL2RB、IL2RG、IL3RA、IL4R、IL5RA、IL6R、IL7R、IL8RA、IL8RB、IL9R、IL10RA、IL10RB、IL11RA、IL12RB1、IL12RB2、IL13RA1、IL13RA2、IL15RA、IL17R、IL17RA、IL17RB、IL17RC、IL17RD、IL18R1、IL20RA、IL20RB、IL21R、IL22R、IL22RA1、IL23R、IL27RA、IL28RA、PDGFA、PDGFB、PDGFRA、PDGFRB、TGFA、TGFB1、TGFB2、TGFB3、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR3、ACVRL1、GFRA1、LTA(TNF-β)、LTB、TNF(TNF-α)、TNFSF4(OX40配体)、TNFSF5(CD40配体)、TNFSF6(FasL)、TNFSF7(CD27配体)、TNFSF8(CD30配体)、TNFSF9(4-1BB配体)、TNFSF10(TRAIL)、TNFSF11(TRANCE)、TNFSF12(APO3L)、TNFSF13(April)、TNFSF13B、TNFSF14(HVEM-L)、TNFSF15(VEGI)、TNFSF18、TNFRSF1A、TNFRSF1B、TNFRSF10A(Trail-受体)、TNFRSF10B(Trail-受体2)、TNFRSF10C(Trail-受体3)、TNFRSF10D(Trail-受体4)、FIGF(VEGFD)、VEGF、VEGFB、VEGFC、KDR、FLT1、FLT4、NRP1、IL1HY1、IL1RAP、IL1RAPL1、IL1RAPL2、IL1RN、IL6ST、IL18BP、IL18RAP、IL22RA2、AIF1、HGF、LEP(瘦素)、PTN、ALK以及THPO。
在一些方面中，本公开中使用的多肽靶向和/或并入选自如下的趋化因子、趋化因子受体或趋化因子相关蛋白质的全部或部分(例如，亚基、结构域、基序或表位)，例如CCL1(I-309)、CCL2(MCP-1/MCAF)、CCL3(MIP-1a)、CCL4(MIP-1b)、CCL5(RANTES)、CCL7(MCP-3)、CCL8(mcp-2)、CCL11(嗜酸性粒细胞活化趋化因子)、CCL13(MCP-4)、CCL15(MIP-1d)、CCL16(HCC-4)、CCL17(TARC)、CCL18(PARC)、CCL19(MIP-3b)、CCL20(MIP-3a)、CCL21(SLC/二级淋巴组织趋化因子(exodus-2))、CCL22(MDC/STC-1)、CCL23(MPIF-1)、CCL24(MPIF-2/嗜酸性粒细胞活化趋化因子-2)、CCL25(TECK)、CCL26(嗜酸性粒细胞活化趋化因子-3)、CCL27(CTACK/ILC)、CCL28、CXCL1(GRO1)、CXCL2(GRO2)、CXCL3(GRO3)、CXCL5(ENA-78)、CXCL6(GCP-2)、CXCL9(MIG)、CXCL10(IP 10)、CXCL11(I-TAC)、CXCL12(SDF1)、CXCL13、CXCL14、CXCL16、PF4(CXCL4)、PPBP(CXCL7)、CX3CL1(SCYD1)、SCYE1、XCL1(淋巴细胞趋化因子)、XCL2(SCM-1b)、BLR1(MDR15)、CCBP2(D6/JAB61)、CCR1(CKR1/HM145))、CCR2(mcp-1RB/RA)、CCR3(CKR3/CMKBR3)、CCR4、CCR5(CMKBR5/ChemR13)、CCR6(CMKBR6/CKR-L3/STRL22/DRY6)、CCR7(CKR7/EBI1)、CCR8(CMKBR8/TER1/CKR-L1)、CCR9(GPR-9-6)、CCRL1(VSHK1)、CCRL2(L-CCR)、XCR1(GPR5/CCXCR1)、CMKLR1、CMKOR1(RDC1)、CX3CR1(V28)、CXCR4、GPR2(CCR10)、GPR31、GPR81(FKSG80)、CXCR3(GPR9/CKR-L2)、CXCR6(TYMSTR/STRL33/Bonzo)、HM74、IL8RA(IL8Ra)、IL8RB(IL8Rb)、LTB4R(GPR16)、TCP10、CKLFSF2、CKLFSF3、CKLFSF4、CKLFSF5、CKLFSF6、CKLFSF7、CKLFSF8、BDNF、C5R1、CSF3、GRCC10(C10)、EPO、FY(DARC)、GDF5、HIF1A、IL8、PRL、RGS3、RGS13、SDF2、SLIT2、TLR2、TLR4、TREM1、TREM2、以及VHL。
在一些方面中，本公开中使用的多肽靶向和/或并入选自如下的蛋白质的全部或部分(例如，亚基、结构域、基序或表位)，例如肾素；生长激素，包括人生长激素和牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺激素；促甲状腺激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰岛素A-链；胰岛素B-链；胰岛素原；促卵泡激素；降钙素；黄体生成素；胰高血糖素；凝血因子，例如因子VII、因子VIIIC、因子IX、组织因子(TF)和血管性假血友病因子(von Willebrandsfactor)；抗凝血因子，例如蛋白质C；心房钠尿因子；肺表面活性物质；纤溶酶原活化剂，例如尿激酶或人尿或组织型纤溶酶原活化剂(t-PA)；铃蟾肽；凝血酶；造血生长因子；肿瘤坏死因子-α和肿瘤坏死因子-β；脑啡肽酶；RANTES(通常在活化时调节所表达和分泌的T细胞)；人巨噬细胞炎症蛋白(MIP-1-α)；血清白蛋白，例如人血清白蛋白；缪勒管激素(Muellerian)-抑制物质；松弛素A-链；松弛素B-链；松弛素原(prorelaxin)；小鼠促性腺激素关联肽；微生物蛋白质，例如β-内酰胺酶；DNA酶；IgE；细胞毒性T-淋巴细胞相关抗原(CTLA)，例如CTLA-4；抑制素；激活素；蛋白质A或D；类风湿因子；神经营养因子例如骨源性神经营养因子(BDNF)，神经营养蛋白-3、-4、-5或-6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)，或神经生长因子；表皮生长因子(EGF)；胰岛素样生长因子结合蛋白；CD蛋白质例如CD2、CD3、CD4、CD8、CD11a、CD14、CD18、CD19、CD20、CD22、CD23、CD25、CD33、CD34、CD40、CD40L、CD52、CD63、CD64、CD80和CD147；促红细胞生成素；骨诱导因子；免疫毒素；超氧化物歧化酶；T-细胞受体；表面膜蛋白；衰变加速因子；病毒抗原例如像AIDS包膜的部分，例如gp120；运输蛋白；归巢受体；地址素；调节蛋白；细胞黏附分子例如LFA-1、Mac 1、p150.95、VLA-4、ICAM-1、ICAM-3和VCAM、a4/p7整合素，和(Xv/p3整合素，其包括a或其亚基，整合素α亚基例如CD49a、CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、α7、α8、α9、αD、CD11a、CD11b、CD51、CD11c、CD41、αIIb、αIELb；整合素β亚基例如CD29、CD 18、CD61、CD104、β5、β6、β7和β8；整合素亚基组合包括但不限于，αVβ3、αVβ5和α4β7；凋亡途径的成员；IgE；血型抗原；flk2/flt3受体；肥胖症(OB)受体；mpl受体；CTLA-4；蛋白质C；Eph受体例如EphA2、EphA4、EphB2等；人白细胞抗原(HLA)例如HLA-DR；补体蛋白例如补体受体CR1、C1Rq和其他补体因子例如C3和C5；糖蛋白受体例如GpIbα、GPIIb/IIIa和CD200。
还考虑了特异性结合和/或包含癌抗原的部分，癌抗原包括但不限于ALK受体(多效蛋白受体)、多效蛋白、KS 1/4泛癌抗原；卵巢癌抗原(CA125)；前列腺酸磷酸盐；前列腺特异性抗原(PSA)；黑色素瘤相关抗原p97；黑色素瘤抗原gp75；高分子量黑色素瘤抗原(HMW-MAA)；前列腺特异性膜抗原；癌胚抗原(CEA)；多形上皮粘蛋白抗原；人乳脂肪球抗原；结直肠肿瘤相关抗原例如：CEA、TAG-72、CO17-1A、GICA 19-9、CTA-1和LEA；伯基特淋巴瘤抗原-38.13；CD19；人B-淋巴瘤抗原-CD20；CD33；黑色素瘤特异性抗原例如神经节苷脂GD2、神经节苷脂GD3、神经节苷脂GM2和神经节苷脂GM3；肿瘤特异性移植型细胞表面抗原(TSTA)；病毒诱导的肿瘤抗原包括T-抗原、DNA肿瘤病毒和RNA肿瘤病毒的包膜抗原；肿瘤胚胎抗原-甲胎蛋白如结肠CEA、5T4肿瘤胚胎滋养细胞糖蛋白和膀胱肿瘤肿瘤胚胎抗原；分化抗原如人肺癌抗原L6和L20；纤维肉瘤抗原；人白血病T细胞抗原-Gp37；拟糖蛋白；鞘脂；乳腺癌抗原如EGFR(表皮生长因子受体)；NY-BR-16、NY-BR-16、HER2抗原(p185HER2)和HER3；多形上皮粘蛋白(PEM)；恶性人淋巴细胞抗原-APO-1；发现于胎儿红细胞中的分化抗原例如I抗原；发现于成人红细胞中的原内胚层I抗原；植入前胚胎；发现于胃腺癌中的I(Ma)；发现于乳腺上皮中的M18、M39；发现于骨髓细胞中的SSEA-1；VEP8；VEP9；Myl；VIM-D5；发现于结直肠癌中的D156-22；TRA-1-85(血型H)；发现于睾丸和卵巢癌中的SCP-1；发现于结肠腺癌中的C14；发现于肺腺癌中的F3；发现于胃癌中的AH6；Y半抗原；发现于胚胎癌细胞中的Ley；TL5(血型A)；发现于A431细胞中的EGF受体；发现于胰腺癌中的E1系列(血型B)；发现于胚胎癌细胞中的FC10.2；胃腺癌抗原；发现于腺癌中的CO-514(血型Lea)；发现于腺癌中的NS-10；CO-43(血型Leb)；发现于A431细胞的EGF受体中的G49；发现于结肠腺癌中的MH2(血型ALeb/Ley)；发现于结肠癌中的19.9；胃癌黏蛋白；发现于骨髓细胞中的T5A7；发现于黑色素瘤中的R24；发现于胚胎癌细胞中的4.2、GD3、D1.1、OFA-1、GM2、OFA-2、GD2和M1：22：25：8以及发现于4至8-细胞阶段胚胎中的SSEA-3和SSEA-4；皮肤T细胞淋巴瘤抗原；MART-1抗原；Sialy Tn(STn)抗原；结肠癌抗原NY-CO-45；肺癌抗原NY-LU-12变体A；腺癌抗原ART1；副肿瘤相关脑-睾丸-癌抗原(副肿瘤性抗原MA2；副肿瘤神经元抗原)；神经肿瘤腹抗原2(NOVA2)；肝细胞癌抗原基因520；肿瘤相关抗原CO-029；肿瘤相关抗原MAGE-C1(癌/睾丸抗原CT7)、MAGE-B1(MAGE-XP抗原)、MAGE-B2(DAM6)、MAGE-2、MAGE-4a、MAGE-4b和MAGE-X2；癌症-睾丸抗原(NY-EOS-1)和任何以上列出的多肽的片段。
在一个实施例中，使用的多肽是重组的。“重组”多肽或蛋白质是指经由重组DNA技术产生的多肽或蛋白质。如同已经通过任何合适的技术分离、分级或部分纯化或基本上纯化的天然或重组多肽一样，出于本公开的目的，在工程化宿主细胞中表达的重组产生的多肽和蛋白质也被视为是分离的。在文中公开的多肽可以使用本领域已知的方法重组产生。替代地，在文中公开的蛋白质和肽可以是化学合成的。
有效负载分子
实体包括颗粒(例如纳米颗粒或微粒)、固相支撑体(例如板)并且还包括有效负载。
有效负载通常不会扩展到包括颗粒或固相支撑体。通常，有效负载将为生物分子带来一些改进，例如增强或优化所得治疗性缀合产物的性质。改进包括靶向、增加的溶解度、增加的半衰期、效应子功能、额外的(进一步的新活性)、增加的活性、提供可检测的标记、降低毒性(例如有效负载可以将生物分子转化为前药)。
本文所用的有效负载是指分子或组分，其旨在通过与多肽缀合而“递送”至靶区域位置。通常，有效负载通常将是效应分子，例如选自由以下组成的群组：毒素，例如细胞毒素，诸如化学治疗剂、药物、前药、酶、免疫调节剂、抗血管生成剂、促凋亡剂、细胞因子、激素、抗体或其片段、合成或天然存在的聚合物、核酸及其片段，例如DNA、RNA及其片段(例如，反义分子或基因)、放射性核素，特别是放射性碘化物、放射性同位素、螯合金属、纳米颗粒和报告基团如荧光化合物或可通过NMR或ESR光谱检测的化合物。
在一个实施例中，该有效负载选自包含以下的群组：毒素、药物、放射性核素、免疫调节剂、细胞因子、淋巴因子、趋化因子、生长因子、肿瘤坏死因子、激素、激素拮抗剂、酶、寡核苷酸、DNA、RNA、siRNA、RNAi、微小RNA、肽核酸、光敏治疗剂、抗血管生成剂、促凋亡剂、非天然氨基酸、肽、脂质、聚合物、碳水化合物、支架分子、荧光标签、可视化肽、生物素、血清半衰期延长剂、捕获标签、螯合剂、固相支撑体、或其组合。
在一个实施例中，有效负载是药物分子(在本文中也称为药物)。本公开中使用的药物分子的实例包括氮芥、乙烯亚胺衍生物、烷基磺酸酯、亚硝基脲、吉西他滨、三氮烯、叶酸类似物、蒽环类、紫杉烷、COX-2抑制剂、嘧啶类似物、嘌呤类似物、抗生素、酶抑制剂、表鬼臼毒素、铂配位化合物、长春花生物碱、取代的脲、甲基肼衍生物、肾上腺皮质抑制剂、激素拮抗剂、内皮抑素、紫杉醇、喜树碱、阿霉素、阿霉素类似物、抗代谢物、烷化剂、抗有丝分裂剂、抗血管生成剂、酪氨酸激酶抑制剂、mTOR抑制剂、拓扑异构酶抑制剂、热休克蛋白(HSP90)抑制剂、蛋白体抑制剂、HDAC抑制剂、促凋亡剂、甲氨蝶呤、CPT-11、或其组合，并且其中轭合是。
在具体方面中，该药物是氨磷汀、顺铂、达卡巴嗪、更生霉素、氮芥、链佐星、环磷酰胺、卡莫司汀(carrnustine)、洛莫司汀、阿霉素脂、吉西他滨、柔红霉素、柔红霉素脂、丙卡巴肼、丝裂霉素、阿糖胞苷、依托泊苷、甲氨蝶呤，5-氟尿嘧啶、长春碱、长春新碱、博来霉素、紫杉醇、多西他赛、阿地白介素、天冬酰胺酶、白消安、卡铂、克拉屈滨、10-羟基-7-乙基-喜树碱(SN38)、吉非替尼、达卡巴嗪、氟尿苷、氟达拉滨、羟基脲、异环磷酰胺、伊达比星、美司钠、干扰素α、干扰素β、依立替康、米托蒽醌、拓扑替康、亮丙立德、甲地孕酮、美法仑、巯基嘌呤、普卡霉素、米托坦、培门冬酶、喷司他丁、哌泊澳烷、普卡霉素、链佐星、他莫昔芬、替尼泊苷、睾内酯、硫鸟嘌呤、塞替派、尿嘧啶氮芥、长春瑞滨、苯丁酸氮芥芳香酶抑制剂，以及其组合。
在一个实施例中，该药物选自包含以下的群组：烷基磷酸胆碱、拓扑异构酶I抑制剂、紫杉烷和苏拉明。
在一个实施例中，有效负载包含微管溶素，例如微管溶素A，其是具有抗菌活性的细胞毒性肽。
在一个实施例中，毒素包括细胞毒素或细胞毒性剂，包括对细胞有害(例如杀死)的任何试剂。实例包括aplidin、阿那曲唑、氮杂胞苷、硼替佐米、苔藓抑素-1、白消安、风车子抑碱、卡莫司汀、多拉司他汀、埃博霉素、星形孢菌素、美登木素生物碱、海绵毒素(spongistatins)、根霉素、软海绵素(halichondrins)、杆孢菌素(roridins)、hemiasterlins、紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、澳化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷(tenoposide)、长春新碱、长春花碱、秋水仙碱、多柔比星、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光辉霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素及其类似物或同系物。
在一个实施例中，所述药物(在此情况下也为细胞毒素)包含抗代谢物(例如甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶氨烯咪胺)、烷基化剂(例如氮芥、塞替派苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二澳甘露醇、链佐星、丝裂霉素C和顺式二胺二氯铂(II)(DDP)顺铂)、卡铂、蒽环类抗生素(例如柔红霉素(旧称道诺霉素)和多柔比星或多柔比星葡糖苷酸)、抗生素类(例如放线菌素D(旧称放线菌素)、博来霉素、光辉霉素、安曲霉素(AMC)、刺孢霉素(calicheamicin)或duocarmycins)以及抗有丝分裂剂(例如长春新碱和长春花碱)。
在一些方面中，该药物是奥瑞他汀(美国专利号5,635,483；5,780,588)，例如MMAE(单甲基奥瑞他汀E)或MMAF(单甲基奥瑞他汀F)。在其他方面中，该药物是多拉司他汀或多拉司他汀肽类似物或衍生物。多拉司他汀和奥瑞他汀已显示干扰微管动力学、GTP水解以及核与细胞分裂(Woyke等人，Antimicrob.Agents and Chemother[抗微生物制剂与化学疗法]45：3580-3584(2001))并且具有抗癌活性(US 5,663,149)。多拉司他汀或奥瑞他汀药物部分可以通过肽药物部分的N(氨基)末端或C(羧基)末端附接到轭合化合物。参见例如国际公开号WO 2002/088172，其通过引用以其全文并入本文。
在其他方面中，该药物是美登木素生物碱。在一些方面中，该美登木素生物碱是N2′-脱乙酰基-N 2′-(3-巯基-1-氧代丙基)-美登素(DM1)、N 2′-脱乙酰基-N2′-(4-巯基-1-氧代戊基)-美登素(DM3)或N 2′-脱乙酰基-N 2′(4-甲基-4-巯基-1-氧代戊基)-美登素(DM4)。美登木素生物碱是通过抑制微管蛋白聚合而起作用的有丝分裂抑制剂。美登素从东非灌木齿叶美登木(Maytenus serrata)中首次分离(美国专利号3,896,111)。随后地，发现某些微生物也产生诸如美登醇和C-3美登醇酯的美登木素生物碱(美国专利号4,151,042)。合成的美登醇及其衍生物和类似物公开于例如美国专利号4,137,230；4,248,870；4,256,746；4,260,608；4,265,814；4,294,757；4,307,016；4,308,268；4,308,269；4,309,428；4,313,946；4,315,929；4,317,821；4,322,348；4,331,598；4,361,650；4,364,866；4,424,219；4,450,254；4,362,663；和4,371,533中，其通过引用以其全文并入本文。
美登木素生物碱药物部分是抗体药物缀合物中有吸引力的药物部分，因为它们：(i)通过发酵或化学修饰、发酵产物的衍生化相对易于制备，(ii)可以用适于通过非二硫化接头与抗体缀合的官能团进行衍生化，(iii)在血浆中稳定，以及(iv)有效抵抗各种肿瘤细胞系。含有美登木素生物碱的缀合物，其制备方法及其治疗用途公开于例如美国专利号5,208,020、5,416,064和欧洲专利EP0425235；Liu等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]，93：8618-8623(1996)(描述了包含称为DM1的美登木素生物碱的免疫缀合物)；和Chari等人，Cancer Research[癌症研究]52：127-131(1992)中，其通过引用以其全文并入本文。
美登木素生物碱是本领域中熟知的并且可以通过已知技术合成或从天然来源分离。例如在美国专利号5,208,020中公开了适合的美登木素生物碱。示例性美登木素生物碱药物部分包括具有修饰的芳环的那些，例如：C-19-去氯(US 4,256,746)(通过氢化铝锂还原安莎霉素P2制备)；C-20-羟基(或C-20-去甲基)+/-C-19-去氯(美国专利号4,361,650和4,307,016)(通过使用链霉菌或放线菌进行去甲基化或使用LAH进行去氯制备)；和C-20-去甲氧基、C-20-酰氧基(-OCOR)、+/-去氯(美国专利号4,294,757)(通过使用酰氯进行酰化制备)，以及在其他位置进行修饰的那些。示例性美登木素生物碱药物部分还包括具有如下修饰的那些：C-9-SH，通过美登醇与H2S或P2S5的反应制备(美国专利号4,424,219)；C-14-烷氧基甲基(去甲氧基/CH2OR)(美国专利号4,331,598)；C-14-羟甲基或酰氧基甲基(CH2OH或CH2OAc)，由Nocardia制备(美国专利号4,450,254)；C-15-羟基/酰氧基，通过链霉菌转化美登醇制备(美国专利号4,364,866)；C-15-甲氧基，从滑桃树(Trewia nudiflora)中分离(美国专利号4,313,946和4,315,929)；C-18-N-去甲基，通过链霉菌对美登醇脱甲基化来制备(美国专利4,362,663和4,322,348)；以及4，5-脱氧，通过三氯化钛/LAH还原美登醇来制备(美国专利号4,371,533)。根据连接的类型，美登素化合物上的许多位置被认为适用作连接位置。例如，为了形成酯键，具有羟基的C-3位置、用羟甲基修饰的C-14位置、用羟基修饰的C-15位置以及具有羟基的C-20位置均是适合的。
在一些方面中，该药物是刺孢霉素。抗生素的刺孢霉素家族能够在亚皮摩尔浓度下产生双链DNA断裂。对于刺孢霉素家族的缀合物的制备，参见例如，美国专利号5,712,374、5,714,586、5,739,116、5,767,285、5,770,701、5,770,710、5,773,001、5,877,296，其通过引用以其全文并入本文。可以使用的刺孢霉素结构类似物包括但不限于γ1I、α2I、α3I、N-乙酰基-γ1I、PSAG以及θ11(Hinman等人，Cancer Research[癌症研究]53：3336-3342(1993)、Lode等人，Cancer Research[癌症研究]58：2925-2928(1998)以及上述的美国氰胺公司(American Cyanamid)的美国专利)。
在一些方面中，该药物是微管溶素。微管溶素是从粘细菌物种分离出的一类天然产物中的成员(Sasse等人，J.Antibiot[抗生素杂志]53：879-885(2000))。作为细胞骨架相互作用剂，微管溶素是抑制微管蛋白聚合并且导致细胞周期停滞和细胞凋亡的有丝分裂毒物(Steinmetz等人，Chem.Int.Ed[国际版应用化学]43：4888-4892(2004)；Khalil等人，ChemBioChem.[生物化学]7：678-683(2006)；Kaur等人，Biochem.J.[生物化学杂志]396：235-242(2006))。微管溶素是极强的细胞毒性分子，超过了任何临床相关传统化学治疗剂(例如，埃博霉素、紫杉醇和长春碱)的细胞生长抑制。此外，它们有效抵抗多重耐药性细胞系(Domling等人，Mol.Diversity[分子多样性]9：141-147(2005))。这些化合物以低皮摩尔范围内的IC50值显示出针对一组癌细胞系测试的高细胞毒性；因此，它们作为抗癌治疗剂是有意义的。参见例如国际公开号WO/2012019123，其通过引用以其全文并入本文。例如在US7,776,814中公开了微管溶素缀合物。
在一些方面中，该药物是吡咯并苯并二氮杂卓(PBD)。PBD是相对小的分子并且一些具有识别并共价结合DNA小沟中的特异性序列的能力并且因此展现抗菌/抗肿瘤活性。许多PBD及其衍生物是本领域已知的，例如PBD二聚体(例如，SJG-136或SG2000)、C2不饱和PBD二聚体、具有C2芳基取代的吡咯并苯并二氮杂卓二聚体(例如，SG2285)、通过水解活化的PBD二聚体前药(例如，SG2285)、以及聚吡咯-PBD(例如，SG2274)。在国际公开号WO 2000/012507、WO 2007/039752、WO 2005/110423、WO 2005/085251和WO 2005/040170以及美国专利号7,612,062中进一步描述PBD，这些专利各自均通过引用以其全文并入本文。
在一些方面中，该药物是拓扑异构酶抑制剂。拓扑异构酶抑制剂是阻断拓扑异构酶(拓扑异构酶I和II)作用的化合物，拓扑异构酶是在正常细胞周期中通过催化DNA链的磷酸二酯骨架的断裂和重新连接来控制DNA结构变化的酶。
在一些方面中，该毒素包含例如相思豆毒素、马钱子碱、毒芹素、白喉毒素、肉毒杆菌毒素、志贺毒素、内毒素、破伤风毒素、百日咳毒素、炭疽毒素、霍乱毒素、镰叶芹醇、α毒素、格尔德霉素、白树毒素、百脉根苷、蓖麻毒素、番木鳖碱、河豚毒素、皂苷、核糖核酸酶(RNA酶)、DNA酶I、葡萄球菌肠毒素-A、美洲商陆抗病毒蛋白、假单胞菌外毒素、假单胞菌内毒素、或其组合。在其他方面中，该毒素包含例如蒴莲根毒素A链、α-八叠球菌、油桐蛋白、香石竹毒蛋白、美洲商陆蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制剂、麻风树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草抑制剂、丝林霉素(mitogellin)、局限曲霉素、酚霉素、新霉素、单端孢菌毒素(tricothecenes)或其组合。参见例如国际公开号WO 1993/021232。
在一些方面中，该螯合剂是DTPA、EC、DMSA、EDTA、Cy-EDTA、EDTMP、DTPA、CyDTPA、Cy2DTPA、BOPTA、DTPA-MA、DTPA-BA、DTPMP、DOTA、TRITA、TETA、DOTMA、DOTA-MA、HP-DO3A、pNB-DOTA、DOTP、DOTMP、DOTEP、DOTPP、DOTBzP、DOTPME、HEDP、DTTP、N3S三酰胺硫醇、DADS、MAMA、DADT、N2S4联胺四硫醇、N2P2二硫醇-二膦、6-肼基烟酸、丙烯胺肟、四胺、环拉胺或其组合。
在一个实施例中，该药物是奥瑞他汀、微管溶素或吡咯并苯并二氮杂卓(PBD)。
在一个实施例中，该奥瑞他汀是MMAE(单甲基奥瑞他汀E)或MMAF(单甲基奥瑞他汀F)。
在一个实施例中，该药物是美登木素生物碱，例如N 2′-脱乙酰基-N 2′-(3-巯基-1-氧代丙基)-美登素(DM1)、N 2′-脱乙酰基-N2′-(4-巯基-1-氧代戊基)-美登素(DM3)或N2′-脱乙酰基-N 2′(4-甲基-4-巯基-1-氧代戊基)-美登素(DM4)。
放射性核素的实例包括3H、11C、13N、15O、18F、32P、33P、35S、47Sc、51Cr、54Mn、57Co、58Co、59Fe、62Cu、65Zn、67Cu、67Ga、68Ge、75Br、75Se、76Br、77Br、77As、80mBr、85Sr、89Sr、90Y、95Ru、97Ru、99Mo和99mTc、103Pd、103m Rh、103Ru、105Rh、105Ru、107Hg、109Pd、109Pt、111Ag、111In、112In、113mIn、113Sn、115In、117Sn、119Sb、121mTe、121I、122mTe、125mTe、125I、126I、131I、133I、133Xe、140La、142Pr、143Pr、149Pm、152Dy、153Sm、153Gd、159Gd、161Ho、161Tb、165Tm、166Dy、166Ho、167Tm、168Tm、169Er、169Yb、175Yb、177Lu、186Re、188Re、188W、189mOs、189Re、192Ir、194Ir、197Pt、198Au、199Au、201T1、203Hg、211At、211Bi、211Pb、212Pb、212Bi、213Bi、215Po、217At、219Rn、221Fr、223Ra、224Ac、225Ac、225Fm、252Cf及其组合。
在一个实施例中，放射性核素选自包括或由以下组成的群组：铬(51Cr)、钴(57Co)、氟(18F)、钆(153Gd、159Gd)、锗(68Ge)、钬(166Ho)、铟(115In、113In、112In、111In)、碘(131I、125I、123I、121I)、镧(140La)、镥(177Lu)、锰(54Mn)、钼(99Mo)、钯(103Pd)、磷(32P)、镨(142Pr)、钷(149Pm)、铼(186Re、188Re)、铑(105Rh)、钌(97Ru)、钐(153Sm)、钪(47Sc)、硒(75Se)、锶(85Sr)、硫(35S)、锝(99Tc)、铊(201T1)、锡(113Sn、117Sn)、氚(3H)、氙(133Xe)、镱(169Yb、175Yb)、钇(90Y)、锌(65Zn)或其组合。
在一个实施例中，该放射性核素通过螯合剂附接至本公开的缀合化合物。
在一个实施例中，该有效负载是血清半衰期延长剂，例如包含白蛋白、白蛋白结合多肽、PAS、人绒毛膜促性腺激素C-末端肽(CTP)的β亚基、聚乙二醇(PEG)、羟乙基淀粉(HES)、XTEN、白蛋白结合小分子、或其组合。
在效应分子是聚合物的情况下，它通常可以是合成的或天然存在的聚合物，例如任选取代的直链或支链聚亚烷基、聚亚烯基或聚氧化烯聚合物或支链或非支链多糖，例如同-多糖或杂-多糖。
可存在于上述合成聚合物上的具体任选取代基包括一个或多个羟基、甲基或甲氧基。
特定的天然存在的聚合物包括乳糖、透明质酸、硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、海藻酸、纤维素直链淀粉、葡聚糖、糖原或其衍生物。
在一些实施例中，聚合物是聚乙二醇(PEG)、支化PEG、多唾液酸(PSA)、羟基烷基淀粉(HAS)、羟基乙基淀粉(HES)、碳水化合物、多糖、出芽短梗孢糖、壳聚糖、透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、淀粉、葡聚糖、羧甲基葡聚糖、聚环氧烷(PAO)、聚亚烷基二醇(PAG)、聚丙二醇(PPG)聚噁唑啉、聚丙烯酰吗啉、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚磷腈、聚噁唑啉、聚乙烯-共-马来酸酐、聚苯乙烯-共-马来酸酐、聚(1-羟甲基乙烯基羟甲基甲酰基)(PHF)、2-甲基丙烯酰氧基-2′-乙基三甲基磷酸铵(MPC)。在一些实施例中，该聚合物是聚乙二醇。在本发明的一个实施例中，聚乙二醇的分子量范围为300Da至10,000,000Da、500Da至100,000Da、1000Da至50,000Da、1500Da至30,000Da、2,000Da至20,000Da、3,000Da至5,000Da和4,000Da至5,000Da。在其他实施例中，聚乙二醇的分子量为约1,000Da、约1,500Da、约2,000Da、约3,000Da、约4,000Da、约5,000Da、约10,000Da、约20,000Da、约30,000Da、约40,000Da、约50,000Da或更多。这可以转化为1至7000个PEG单体单元，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72，、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000个单元(在文中其他地方定义了q)。
在一个实施例中，有效负载或多肽(生物分子)包含可视化标记。可视化标记包括但不限于，发色团、荧光团、荧光蛋白、磷光染料、叠层染料、颗粒、半抗原、酶、放射性同位素或其组合。
在一个实施例中，该可视化标记是可视化肽。在一些方面中，该可视化肽能够在体外、体内、离体或其任何组合中可视化或定位缀合化合物。在一些方面中，该可视化肽是例如生物素受体肽、硫辛酸受体肽、荧光蛋白、用于连接双砷染料或用于缀合亚稳态锝的含半胱氨酸肽、用于缀合基于荧光共振能量转移(FRET)的亲近测定法所用的铕包合物的肽、或其任何组合。在一些方面中，该荧光蛋白是例如绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、增强型黄色荧光蛋白(EYFP)、或其任何组合。在一些方面中，该荧光蛋白是藻胆蛋白或其衍生物。
荧光蛋白，特别是藻胆蛋白，适用于产生叠层染料标记的标记试剂。出于获得较大的斯托克斯位移的目的，这些叠层染料包含荧光蛋白和荧光团，其中发射光谱从荧光蛋白的吸收光谱的波长发生更远的位移。这可以有效用于检测样品中的低量的靶标，其中发射的荧光被最大限度地优化，换言之很少甚至没有发射光被荧光蛋白重吸收。为了实现这一点，荧光蛋白和荧光团充当能量转移对，其中荧光蛋白在荧光团所吸收的波长下发射，并且荧光团随后在距离荧光蛋白比仅存在荧光蛋白时所能够获得的波长更远的波长下发射。功能组合可以是本领域中已知的藻胆蛋白和磺基罗丹明荧光团或磺化花青荧光团。该荧光团有时充当能量供体并且荧光蛋白是能量受体。
在其他方面中，该双砷染料是4’，5’-双(1，3，2-二硫砷杂环戊烷-2-基)荧光素(FlAsH)。在一些方面中，该生物素受体肽有助于基于抗生物素蛋白的试剂和基于链霉抗生物素蛋白的试剂的缀合。在一些方面中，该硫辛酸受体肽有助于硫醇反应性探针缀合至结合硫辛酸或直接连接荧光硫辛酸类似物。
在一个实施例中，R1或多肽(特别是R1)包含荧光标签。在一些方面中，该荧光标签包含例如荧光素型染料、罗丹明型染料、丹酰型染料、丽丝胺型染料、花青型染料、藻红蛋白型染料、德克萨斯红型染料、或其任何组合。适于缀合至文中公开的半胱氨酸工程化抗体或其抗原结合片段的荧光团包括不限于：芘(包括任选相应的衍生化合物)、蒽、萘、吖啶、芪、吲哚或苯并吲哚、噁唑或苯并噁唑、噻唑或苯并噻唑、4-氨基-7-硝基苯-2-氧杂-1，3-二唑(NBD)、花青(包括任何相应的化合物)、羰花青(包括任何相应的化合物)、喹诺酮、卟啉、水杨酸酯、邻氨基苯甲酸酯、薁、二萘嵌苯、吡啶、喹啉、硼聚苯并氮杂吲哚(包括任何相应的化合物)、呫吨(包括任何相应的化合物)、噁嗪(包括任何相应的化合物)或苯并噁嗪、卡巴秦(包括任何相应的化合物)、芴酮、香豆素(包括公开的相应化合物)、苯并呋喃(包括相应的化合物)以及苯甲酮(benzphenalenone)(包括任何相应的化合物)以及其衍生物。如本文所用，噁嗪包括试卤灵(包括任何相应化合物)、氨基噁嗪酮、二氨基噁嗪、以及其苯并取代的类似物、或其任何组合。
在某些方面中，该荧光团包括例如呫吨(对甲氨基酚、罗丹明、荧光素以及其衍生物)、香豆素、花青、芘、噁嗪、硼聚苯并氮杂吲哚、或其任何组合。在一些实施例中，此类荧光团是例如磺化呫吨、氟化呫吨、磺化香豆素、氟化香豆素、磺化花青、或其任何组合。还包括以下列商品名出售且通常已知为以下的染料：ALEXA
Figure BDA0002280513920000371
CY
Figure BDA0002280513920000372
OREGON
Figure BDA0002280513920000373
PACIFIC
Figure BDA0002280513920000374
和
经由本文公开的接头“Z”附接的荧光团的选择将确定最终化合物的吸收和荧光发射特性。可以使用的荧光团标记的物理特性包括但不限于，光谱特征(吸收、发射和斯托克斯位移)、荧光强度、寿命、极化以及光致漂白率、或其组合。所有这些物理特性可以用于将一个荧光团与另一个荧光团区分开，并且从而允许多元分析。在某些方面中，荧光团在大于480nm的波长下具有吸收极大值。在一些方面中，荧光团在处于或接近488nm至514nm(特别适用于由氩离子激光激发源的输出激发)或在接近546nm(特别适用于由水银弧光灯激发)处吸收。在一些方面中，荧光团可以针对组织或完整生物体应用在NIR(近红外区域)中发射。荧光标记的其他所希望的特性可以包括细胞渗透性和低毒性，例如，如果将在细胞或生物体(例如，活体动物)中执行抗体的标记。
在一个实施例中，多肽包含捕获标签。在一些方面中，该捕获标签是生物素或His6标签。生物素是有用的，这是因为它可以在酶系统中起作用以进一步放大可检测的信号，并且它还可以出于分离目的用作标签以用于亲和色谱。出于检测目的，可以使用对于生物素具有亲和力的酶缀合物，诸如抗生物素蛋白-HRP。
随后可以添加过氧化物酶底物以产生可检测的信号。除生物素之外，可以使用其他半抗原，包括激素、天然发生和合成的药物、污染物、过敏原、效应分子、生长因子、趋化因子、细胞因子、淋巴因子、氨基酸、肽、化学中间体、核苷酸及类似物。
在一个实施例中，该有效负载包含酶。酶是有效标记物，因为可以获得可检测的信号的放大，从而得到增加的测定灵敏度。酶自身通常不产生可检测的响应，但是当它被适当的底物接触时，起到分解底物的作用，这样使得转化的底物产生荧光信号、比色信号或发光信号。因为标记试剂上的一种酶可以导致多个底物被转化成可检测的信号，所以酶将可检测的信号放大。选择酶底物以产生可测量的产物，例如，比色发光、荧光发光或化学发光。这类底物在本领域中广泛使用且是本领域已知的。
在一些实施例中，比色或荧光底物和酶组合使用氧化还原酶如辣根过氧化物酶和底物如3，3’-二氨基联苯胺(DAB)和3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)，这产生有区别的颜色(分别是棕色和红色)。产生可检测的产物的其他比色氧化还原酶底物包括但不限于：2，2-联氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)、邻苯二胺(OPD)、3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)、邻联茴香胺、5-氨基水杨酸、4-氯-1-萘酚。荧光底物包括但不限于，高香草酸或4-羟基-3-甲氧基苯乙酸、还原的吩噁嗪和还原的苯并噻嗪，包括
Figure BDA0002280513920000381
Red试剂及其变体和还原的二氢呫吨，包括二氢荧光素以及二氢若丹明，包括二氢若丹明123。
本公开还延伸至使用作为酪胺酰胺的过氧化物酶底物，该过氧化物酶底物表示一类独特的过氧化物酶底物，因为它们在酶作用之前可以是固有可检测的，但在如酪胺酰胺信号放大(TSA)所描述的过程中通过过氧化物酶作用“固定在适当位置”。这些底物广泛地用于标记样品(这些样品是细胞、组织或阵列)中的靶标以用于其随后通过显微术、流式细胞术、光学扫描以及荧光测定法进行检测。
本公开还延伸至比色(并且在一些情况下是荧光)底物和酶组合，该比色底物和酶组合有时使用磷酸酶诸如酸性磷酸酶、碱性磷酸酶或这种磷酸酶的重组版本与比色底物诸如5-澳-6-氯-3-吲哚基磷酸酯(BCIP)、6-氯-3-吲哚基磷酸酯、5-澳-6-氯-3-吲哚基磷酸酯、对硝基苯基磷酸酯或邻硝基苯基磷酸酯或者与荧光底物诸如4-甲基伞形酮基磷酸酯、6，8-二氟-7-羟基-4-甲基香豆素基磷酸酯(DiFMUP，美国专利号5,830,912)、荧光素二磷酸酯、3-邻甲基荧光素磷酸酯、试卤灵磷酸酯、9H-(1，3-二氯-9，9-二甲基吖啶-2-酮-7-基)磷酸酯(DDAO磷酸酯)或ELF 97、ELF 39或相关磷酸酯的组合。
本公开还延伸至包含糖苷酶的有效负载(具体地说β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸糖苷酶和β-葡糖苷酶)是另外适合的酶。适当的比色底物包括但不限于，5-澳-4-氯-3-吲哚基β-D-吡喃半乳糖苷(X-gal)和类似的吲哚基半乳糖苷、葡糖苷和葡糖苷酸、邻硝基苯基β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)、以及对硝基苯基β-D-吡喃半乳糖苷。在一些实施例中，荧光底物包括试卤灵β-D-吡喃半乳糖苷、荧光素二半乳糖苷(FDG)、荧光素二葡糖苷酸以及它们的结构变体、4-甲基伞形酮基β-D-吡喃半乳糖苷、羧基伞形酮基β-D-吡喃半乳糖苷以及氟化香豆素β-D-吡喃半乳糖苷。
另外的酶包括但不限于，水解酶如胆碱酯酶和肽酶、氧化酶如葡萄糖氧化酶和细胞色素氧化酶、以及还原酶，对于这些酶适合的底物是已知的。
酶以及其产生化学发光的适当底物适用于并入本公开的分子中。这些包括但不限于天然和重组形式的荧光素酶和水母发光蛋白。磷酸酶、糖苷酶和氧化酶的产生化学发光的底物，如含有稳定的二氧杂环丁烷、鲁米诺、异氨基苯二酰肼以及吖啶酯的那些是额外有效的。
其他定义
在详细描述提供的实施例之前，应当理解本公开并不限于特定的组合物或方法步骤，并且这些组合物或方法步骤可以改变。如在本说明书和随附权利要求书中所使用，除非上下文另外明确说明，否则单数形式“一个/种(a/an)”和“所述(the)”包括复数参考对象。术语“一个”(或“一种”)、连同术语“一个或多个/一种或多种”和“至少一个/一种”在文中可以互换地使用。
此外，当在文中使用时“和/或”被理解为这两个指定的特征或组分中每一者与或不与另一者的特定公开。因此，术语“和/或”如文中短语如“A和/或B”中使用时，旨在包括“A和B”、“A或B”、“A”(单独)、以及“B”(单独)。同样，术语“和/或”如短语如“A、B和/或C”中使用时，旨在涵盖以下方面中的每一者：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；和C(单独)。
除非另外定义，否则文中使用的所有技术和科学术语具有如本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。例如，Concise Dictionary of Biomedicine andMolecular Biology[简明生物医学和分子生物学词典]，Juo，Pei-Show，第2版，2002，CRC出版社；Dictionary of Cell and Molecular Biology[细胞和分子生物学词典]，第3版(1999)Academic Press[学术出版社]；以及Oxford Dictionary Of Biochemistry AndMolecular Biology[生物化学和分子生物学牛津词典]，修订版，2000，Oxford UniversityPress[牛津大学出版社]为技术人员提供在本公开中使用的许多术语的通用词典注释。
单位、前缀和符号是以它们的国际单位系统(Système International deUnites)(SI)接受形式表示。数值范围包括限定该范围的数值。除非另外说明，否则氨基酸序列是以氨基至羧基取向从左向右书写。本文提供的标题不是对不同方面的限制，其可以通过参考整个说明书而得到。因此，下面直接定义的术语通过以其全文参考说明书更完整地定义。
氨基酸在本文中通过其通常已知的三个字母符号或由IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号来表示。同样地，核苷酸通过它们的普遍公认的单字母代码来提及。当抗体内氨基酸残基的位置用数字表示时，编号根据卡巴特(KABAT)编号系统进行。
术语“受试者”是指任何动物(例如哺乳动物)，包括但不限于人类、非人灵长类动物、啮齿动物等，它们是特定治疗的接受者。典型地，术语“受试者”和“患者”在提及人类受试者时可以互换地使用。
术语“药物组合物”是指一种呈允许活性成分(例如，本文公开的缀合化合物)的生物活性有效的这种形式的制剂，以及其不包含对于将施用该组合物的受试者而言具有不可接受的毒性的额外组分。这种组合物可以包含一种或多种药物上可接受的赋形剂。这样的组合物可以是无菌的。
文中公开的缀合化合物的“有效量”是足以实施具体阐述目的的量。“有效量”可以根据所述目的凭经验和以常规方式来确定。
术语“治疗有效量”是指本文公开的缀合化合物或其他药物有效“治疗”受试者或哺乳动物的疾病或病症的量。
当本文使用时，词语“标记”是指一种直接或间接缀合至本文公开的工程化抗体或其片段(例如半胱氨酸工程化抗体或其片段)以便产生“标记的”缀合化合物的可检测化合物或组合物。该标记可以是本身可检测的(例如，放射性同位素标记或荧光标记)，或在酶标记的情况下，可以催化可检测底物化合物或组合物的化学改变。
术语诸如“治疗(treating/treatment/to treat)”是指(1)治愈、减缓已诊断病理病状或病症、减少其症状和/或停止其进展的治疗措施，以及(2)防止和/或减缓目标病理病状或病症进展的预防性或防御性措施。因此，需要治疗的那些包括已具有病症的那些；倾向于患有病症的那些；以及在他们中需要预防病症的那些。在某些方面中，如果患者表现出例如疾病或病症(例如某种类型的癌症)的全部、部分或暂时缓解，则受试者根据本公开的方法被成功“治疗”该疾病或病症(例如癌症)。
术语“多核苷酸”或“核酸”在本文可互换使用，并且是指具有任何长度的核苷酸聚合物，包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基，和/或它们的类似物，或可以通过DNA或RNA聚合酶并入聚合物的任何底物。多核苷酸可以包含修饰的核苷酸，如甲基化核苷酸和它们的类似物。
如本文使用的，术语“载体”是指一种构建体，该构建体能够在宿主细胞中递送以及在一些方面中表达一个或多个目的基因或序列。载体的实例包括但不限于：病毒载体、裸DNA或RNA表达载体、质粒、粘粒或噬菌体载体、与阳离子缩合剂缔合的DNA或RNA表达载体、包封在脂质体中的DNA或RNA表达载体，以及某些真核细胞(如生产细胞)。
如本文所使用的，在本说明书的上下文中的术语“包含”应解释为“包括”。
如本文所使用的，“在本公开中使用的”是指在本文公开的方法中使用的，在本文公开的包括中间体的分子中使用的或两者，根据所用术语的上下文。
应当理解，当文中用语言“包含”来说明多方面时，还提供了以“由......组成”和/或“基本上由......组成”描述的其他类似方面。
本文描述的任何肯定实施例或其组合可以是否定排除的基础，即免责声明。
组合物
本公开延伸至包含本文所述分子(例如本公开的水解分子)的组合物，特别是包含本公开分子和药物赋形剂、稀释剂或载体的药物组合物(或诊断组合物)。
该组合物通常作为无菌药物组合物的一部分提供，该组合物通常包括药学上可接受的载体。在疫苗制剂的情况下，本发明的药物组合物可另外包含药物上可接受的佐剂。
本公开还延伸至制备所述组合物的方法，例如制备药物或诊断组合物，其包括添加本公开的分子(例如本发明的公开内容的水解分子)并将其与药物上可接受的赋形剂、稀释剂或载体中的一种或多种混合在一起。
本公开的抗体可以是药物或诊断组合物中的唯一活性成分，或者可以伴有其他活性成分。
药物组合物适合地包含治疗有效量的根据本公开的分子。如本文所用的术语“治疗有效量”是指治疗、改善或预防靶向疾病或病症，或表现出可检测的治疗或预防效果所需的治疗剂的量。治疗有效量可以最初在细胞培养测定中或在动物模型中(通常在啮齿动物、兔、狗、猪或灵长动物)中评估。动物模型也可以用来确定合适的浓度范围和施用途径。然后，这类信息可用于确定在人类中施用的有用剂量和途径。
组合物可以单独施用给患者，或者可以与其他药剂、药物或激素组合(例如同时、依次或分开)施用。
药物上可接受的载体本身不应诱导产生对接受组合物的个体有害的抗体，并且不应该是有毒的。适合的载体可以是大的，代谢缓慢的大分子，例如蛋白质、多肽、脂质体、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚氨基酸、氨基酸共聚物和无活性病毒颗粒。
治疗组合物中的药物上可接受的载体可另外含有液体，例如水、盐水、甘油和乙醇。另外，辅助物质，例如湿润剂或乳化剂或pH缓冲物质可以存在于此类组合物中。这些载体使药物组合物能够配制成片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液和悬浮液，供患者摄取。
适合的施用形式包括适于肠胃外施用的形式，例如通过注射或输注，例如通过单次快速静脉注射(bolus injection)或连续输注。当产品用于注射或输注时，它可以采取在油性或水性载体中的悬浮液、溶液或乳液的形式，并且它可以含有配制剂，例如悬浮剂、防腐剂、稳定剂和/或分散剂。替代地，本公开的分子可以呈干燥形式，用于在使用前用合适的无菌液体重构。
适合地，在根据本公开的制剂中，最终制剂的pH与抗体的等电点值是不相似的，例如如果制剂的pH为7，那么pI为8-9或更高可能是合适的。虽然不希望受理论束缚，但认为这可最终提供具有改进的稳定性的最终制剂，例如抗体保留在溶液中。
本发明的药物组合物可以通过许多途径施用，这些途径包括但不限于口服、静脉内、肌肉内、动脉内、髓内、鞘内、心室内、透皮、经皮(例如，参见WO 98/20734)、皮下、腹膜内、鼻内、肠内、局部、舌下、阴道内或直肠途径。无痛皮下喷射器也可用于施用本发明的药物组合物。通常，治疗组合物可以制备成注射剂，作为液体溶液或悬浮液。也可以制备适于在注射之前溶解或悬浮在液体载体中的固体形式。
该组合物的直接递送通常通过注射、皮下、腹膜内、静脉内或肌内，或递送至组织的间隙来完成。该组合物也可以施用至病变中。剂量治疗可以是单剂量方案或者多剂量方案。
药物上可接受的载体的充分讨论在Remington′s Pharmaceutical Sciences[雷明顿药物科学]，(Mack出版公司，新泽西州1991)中可获得。
治疗
本公开还延伸至通过施用治疗有效量的根据本公开的分子或组合物(例如包含其的药物组合物)来治疗有此需要的患者的方法。
在一个实施例中，提供了本公开的分子或包含其的组合物，其用于治疗，特别是用于治疗本文所述的疾病或病症，例如癌症。
在一个实施例中，提供了本公开的分子或包含其的组合物在制备用于治疗本文所述的病症或疾病(例如癌症)的药物中的用途。
因此，本发明的分子可用于治疗和/或预防病理状况。
本发明提供的抗体可用于治疗疾病或病症，包括炎性疾病和病症、免疫疾病和病症、纤维化病症和癌症。
术语“炎性疾病”或“病症”和“免疫疾病或病症”包括类风湿性关节炎、银屑病关节炎、斯提耳氏病、穆-韦综合征(Muckle Wells disease)、银屑病、克罗恩病、溃疡性结肠炎、SLE(系统性红斑狼疮)、哮喘、过敏性鼻炎、特应性皮炎、多发性硬化、血管炎、I型糖尿病、移植和移植物抗宿主病。
术语“纤维化病症”包括特发性肺纤维化(IPF)、系统性硬化症(或硬皮病)、肾纤维化、糖尿病性肾病、IgA肾病、高血压、终末期肾病、腹膜纤维化(持续性非卧床腹膜透析)、肝硬化、年龄相关性黄斑变性(ARMD)、视网膜病、心脏反应性纤维化、瘢痕形成、瘢痕疙瘩、烧伤、皮肤溃疡、血管成形术、冠状动脉搭桥手术、关节成形术和白内障手术。
术语“癌症”包括由上皮细胞产生的恶性新生长，在皮肤中，或者更常见的是，身体器官(例如：乳房、卵巢、前列腺、结肠、肺脏、肾脏、胰腺、胃、膀胱或肠)的衬壁中发现。癌症倾向于渗透到相邻的组织和传播(转移)到远端器官，例如：到骨骼、肝脏、肺脏或大脑。
待治疗的受试者可以是动物。然而，在一个或多个实施例中，所述组合物适于施用于人受试者。
在本说明书的上下文中，“包含”应解释为“包括”。
包含某些特征/元件的本发明的实施例也旨在延伸到“由相关元件/特征组成”或“基本上由相关元件/特征组成”的替代实施例。
在技术上合适的情况下，可以将本发明的实施例组合。
诸如专利和申请的技术参考文献通过引用并入文中。
本文具体和明确地叙述的任何实施例可单独或与一个或多个其他实施例组合形成免责声明的基础。
仅在以下实例中通过举例说明进一步描述本发明，所述实例参考附图，其中：
缩写
NNAA非天然氨基酸
DAR药物：抗体比率，通常也用于描述任何缀合物质如接头的比率。
附图说明
图1.1.显示在mAb与呋喃-NHS反应之前(A)和之后(B)完整的去糖基化质谱。
图1.2.显示与MMAE反应20小时后mAb-呋喃-接头样品的还原型去糖基化质谱。
图1.3.显示mAb-呋喃-接头烯丙基羰基赖氨酸反应产物的还原型去糖基化质谱分析。
图2.1.实例2中描述的环戊二烯交联剂(A)和环戊二烯NNAA(B)的一般设计。
图3.1.显示在mAb与CP1-NHS反应之前(A)和之后(B)完整的去糖基化质谱。
图3.2.显示mAb-CP1-接头马来酰亚胺基MMAE反应产物的还原型糖基化质谱，将其放大以显示mAb重链和轻链。
图3.3.显示mAb-CP1-接头马来酰亚胺基MMAE反应产物的还原型去糖基化质谱，将其放大以显示mAb重链区。
图3.4.显示mAb-CP1-接头烯丙基羰基赖氨酸反应产物的还原型去糖基化质谱分析，其表明未发生缀合。
图4.1.显示在mAb与CP1-NHS反应之前(A)和之后(B)完整的去糖基化质谱。
图4.2.显示未修饰的mAb、mAb-CP1-接头(在图中表示为mAb-CP1)和在15分钟和2.5小时处AM-MMAE反应的mAb-CP1-接头(在图中表示为mAb-CP1 AM-MMAE)的还原型去糖基化质谱。
图4.3.mAb-CP1-接头与马来酰亚胺基-MMAE的反应。未反应的CP1二烯由还原型去糖基化质谱的峰强度确定。
图5.1.显示在mAb与CP1-NHS反应之前(A)和之后(B)完整的去糖基化质谱。
图5.2.显示未修饰的mAb、CP-1修饰的mAb和在5分钟和150分钟时PM-MMAE反应的CP1-mAb-接头的还原型去糖基化质谱。
图5.3.显示mAb-CP1-接头与马来酰亚胺基-MMAE的反应。A)未反应的CP1二烯随时间变化的摩尔浓度。每个mAb的未反应的CP1二烯由还原型去糖基化质谱的峰强度确定。B)用于计算反应速率的浓度倒数图。
图6.1.显示在包含突变体或wt TRS的哺乳动物细胞中表达后12G3H11 K274CP1-NNAA mAb的滴度。CP1-NNAA在培养基中的最终浓度和进料时间如x轴所示变化。
图6.2.显示12G3H11 K274CP1-NNAA mAb的还原型糖基化质谱分析。A)显示mAb轻链(LC)和重链(HC)的质量范围。B)仅显示mAb重链的放大光谱。
图6.3.显示12G3H11 K274CP1-NNAA mAb的SEC分析，其表明获得了单体产物。显示了高分子量固体(HMWS)。
图6.4.显示1C1 K274CP1-NNAA mAb通过SDS-PAGE的分析。
图6.5.显示12G3H11 K274CP1-NNAA mAb-MMAE缀合产物的还原型去糖基化质谱分析。
图6.6.显示1C1 K274CP1-NNAA mAb-AM-MMAE缀合产物的还原型糖基化质谱分析。
图6.7.显示CP1-NNAA和化合物异构体的化学结构，其以1∶1的比率存在。
图6.8.显示化合物50(文献中描述的CP1-NNAA的呋喃类似物)的化学结构。该化合物用作12G3H11mAb表达研究的对照。
图6.9.显示12G3H11 K274CP1-NNAA mAb-MMAE缀合产物的还原型去糖基化质谱分析。A)未反应的抗体，B)AM-MMAE反应产物，C)PM-MMAE反应产物。将图谱放大以显示抗体重链和轻链。
图6.10.显示1C1 K274CP1-NNAA mAb-AM-MMAE缀合产物的还原型糖基化质谱分析。A)未反应的抗体，B)AM-MMAE反应产物。将图谱放大以显示抗体重链和轻链以及高分子量物质。
图7.1.显示12G3H11 K274CP1-NNAA AM-MMAE ADC的大鼠血清稳定性。将ADC在大鼠血清中于37℃温育7天，并在还原的质谱分析之前通过免疫捕获回收。将图谱放大以显示重链(HC)质量区域中的细节。没有观察到显著的去缀合。
图7.2.显示12G3H11 K274CP1-NNAA PM-MMAE ADC的大鼠血清稳定性。将ADC在大鼠血清中于37℃温育7天，并在还原的质谱分析之前通过免疫捕获回收。将图谱放大以显示重链(HC)质量区域中的细节。没有观察到显著的去缀合，但是在苯基乙酰胺基团处观察到接头切割。有关切割产物的描述，请参见附录7。
图7.3.显示12G3H11 K274CP1-NNAA AM-MMAE ADC的小鼠血清稳定性。将ADC在小鼠血清中于37℃温育7天，并在还原的质谱分析之前通过免疫捕获回收。将图谱放大以显示重链(HC)质量区域中的细节。没有观察到显著的去缀合，但是在val-cit二肽处观察到几乎完全的接头切割。有关切割产物的描述，请参见附录7。
图7.4.显示12G3H11 K274CP1-NNAA PM-MMAE ADC的小鼠血清稳定性。将ADC在小鼠血清中于37℃温育7天，并在还原的质谱分析之前通过免疫捕获回收。将图谱放大以显示重链(HC)质量区域中的细节。没有观察到显著的去缀合，但是观察到几乎完全的接头切割。有关切割产物的描述，请参见附录7。
图7.5.显示MMAE有效负载的化学结构及其分子量。
图7.6.显示ADC在小鼠血清中温育后观察到的主要切割产物的化学结构。A)和B)分别显示AM-MMAE和PM-MMAE缀合物的保留在抗体上的物质(CP1-马来酰亚胺键未显示)。C)显示val-cit二肽切割后释放的物质。
图7.7.显示大鼠血清温育后PM-MMAE切割产物的化学结构。A)保留在抗体上的物质和B)释放的物质。
图8.1.实例8中描述的螺环戊二烯交联剂(A)和螺环戊二烯NNAA(B)的一般设计。
图9.1.显示与CP2-NHS反应之前(A)和之后(B)完整的去糖基化质谱。(B)中峰下方的数字表示引入mAb中的CP2-接头基团的数目。通过峰强度对CP2-接头引入的估计产生每个mAb 3.29个CP2-接头。
图9.2.显示在与AM-MMAE和PM-MMAE反应之前和之后，mAb-CP2-接头的还原型去糖基化质谱分析。将图谱放大以显示重链和轻链。
图9.3.显示mAb-CP2-接头马来酰亚胺基MMAE反应产物的还原型去糖基化质谱。将图谱放大以显示抗体重链。
图10.1.显示在4小时和48小时处mAb-CP2-接头和AM-MMAE-反应的mAb-CP2-接头的还原型去糖基化质谱。将图谱放大以只显示重链。
图10.2.显示在4小时和48小时处mAb-CP2-接头和PM-MMAE-反应的mAb-CP2-接头的还原型去糖基化质谱。将图谱放大以只显示重链。
图10.3.显示mAb-CP2-接头与马来酰亚胺基-MMAE的反应。A)未反应的CP2二烯随时间变化的摩尔浓度。每个mAb的未反应的CP2二烯由还原型去糖基化质谱的峰强度确定。B)用于计算反应速率的浓度倒数图。
图11.1.显示在包含突变体或野生型tRS的哺乳动物细胞中表达后12G3H11K274CP2-NNAA mAb的滴度和细胞活力。
图11.2.显示1C1 K274CP2-NNAA mAb的去糖基化质谱。
图11.3.显示1C1 S239CP2-NNAA mAb的去糖基化质谱分析。
图11.4.显示1C1野生型mAb的去糖基化质谱分析。
图11.5.显示1C1 K274CP2-NNAA mAb的SEC分析，其表明获得了单体产物。
图11.6.显示1C1 S239CP2-NNAA mAb的SEC分析，其表明获得了单体产物。
图11.7.显示1C1-K274CP2-NNAA mAb和1C1-S239CP2-NNAA mAb通过SDS-PAGE的分析。
图12.1.显示mAb-CP2-NNAA ADC和239C-mAb ADC生成的一般方案。
图12.2.显示在与AM-MM反应之前和之后mAb-CP2-NNAA和mAb-半胱氨酸分子的还原型糖基化质谱分析。将图谱放大以显示mAb重链。
图12.3.显示在与AM-MMAE反应之前和之后mAb-CP2-NNAA和mAb-半胱氨酸分子的还原型糖基化质谱分析。将图谱放大以显示mAb轻链。
图12.4.显示mAb-CP2-NNAA ADC和mAb-半胱氨酸ADC的疏水相互作用色谱分析。
图12.5.显示mAb-CP2-NNAA ADC和mAb-半胱氨酸ADC的还原型反相高效色谱分析。
图12.6.显示mAb-CP2-NNAA ADC和mAb-半胱氨酸ADC的还原型SDS-PAGE分析。
图12.7.显示在37℃下在大鼠血清中温育7天之前和之后mAb-CP2-NNAA ADC的还原型去糖基化质谱分析。将质谱放大以仅显示重链(HC)。
图12.8.显示在37℃下在大鼠血清中温育7天之前和之后mAb-CP2-NNAA ADC DAR的定量。DAR由图12.7中所示的质谱的峰高计算。将值报告为平均值±标准偏差，n＝3。
图12.9.显示mAb-CP2-NNAA和mAb-半胱氨酸ADC对体外PC3癌细胞的细胞毒性。
图13.1.显示A)CP1-NHS和B)CP1b-NHS接头中的酯位置。
图14.1.显示mAb-CP1b缀合物的质谱分析。峰上方的数字表示与mAb缀合的接头(B和E)或AM-MMAE(C和F)的数目。在分析之前，所有样品用EndoS去糖基化。
图14.2.显示mAb-F2缀合物的质谱分析。峰上方的数字表示与mAb缀合的接头(B和E)或AM-MMAE(C和F)的数目。在分析之前，所有样品用EndoS去糖基化。
图14.3.显示mAb-半胱氨酸缀合物的质谱分析。指出了mAb轻链(LC)和重链(HC)(A-D)，以及缀合的MMAE的数目(B和D)。所有样品用EndoS去糖基化并在分析前还原。
图14.4.显示mAb、mAb-接头缀合物和ADC的rRP-HPLC分析。指出了mAb轻链和重链，对于ADC样品还指出了与mAb缀合的MMAE的数目。
图14.5.显示mAb、mAb-接头缀合物和ADC的SEC分析。显示了高分子量物质(HMWS)。
图14.6.显示在大鼠血清中温育7天后药物在ADC上的保留。
图14.7.显示了ADC对受体阳性A)NCI-N87细胞和B)SKBR3细胞的体外活性。
图14.8.显示赫赛汀(Herceptin)-接头ADC对小鼠皮下N87异种移植肿瘤模型的抗肿瘤活性。
图15.1.显示1C1 K274CP1-NNAA AZ1508 ADC的SDS-PAGE分析。A)未还原的B)还原的。
图15.2.显示1C1 K274CP1-NNAA mAb AZ1508缀合产物的还原型糖基化质谱分析。A)未反应的mAb B)AZ1508反应产物。将图谱放大以显示抗体重链(HC)和轻链(LC)。
图15.3.显示1C1 K274CP1-NNAA AZ1508 ADC的SEC分析，其表明获得了高单体产物。显示了高分子量固体(HMWS)。
图16.1.显示1C1 CP2-NNAA AZ1508 ADC和1C1半胱氨酸AZ1508 ADC的SDS-PAGE分析。A)未还原的样品，B)还原的样品。
图16.2.显示用于分析1C1 S239CP2-NNAA AZ1508 ADC的分析数据。A)未反应的mAb的还原型糖基化质谱分析。B)AZ1508反应产物的还原型糖基化质谱分析。C)未反应的抗体和AZ1508缀合产物的HIC分析，D)AZ1508反应产物的SEC分析。将图谱放大以在(A)和(B)中显示抗体重链(HC)和轻链(LC)。
图16.3.显示用于分析1C1 K274CP2-NNAA AZ1508 ADC的分析数据。A)未反应的mAb的还原型糖基化质谱分析。B)AZ1508反应产物的还原型糖基化质谱分析。C)未反应的抗体和AZ1508缀合产物的HIC分析，D)AZ1508反应产物的SEC分析。将图谱放大以在(A)和(B)中显示抗体重链(HC)和轻链(LC)。
图16.4.显示用于分析1C1 N297CP2-NNAA AZ1508 ADC的分析数据。A)未反应的mAb的还原型糖基化质谱分析。B)AZ1508反应产物的还原型糖基化质谱分析。C)未反应的抗体和AZ1508缀合产物的HIC分析，D)AZ1508反应产物的SEC分析。将图谱放大以在(A)和(B)中显示抗体重链(HC)和轻链(LC)。
图16.5.显示用于分析1C1 S239C AZ1508 ADC的分析数据。A)未反应的mAb的还原型糖基化质谱分析。B)AZ1508反应产物的还原型糖基化质谱分析。C)未反应的抗体和AZ1508缀合产物的HIC分析，D)AZ1508反应产物的SEC分析。将图谱放大以在(A)和(B)中显示抗体重链(HC)和轻链(LC)。
图16.6.显示用于分析1C1 K274C AZ1508 ADC的分析数据。A)未反应的mAb的还原型糖基化质谱分析。B)AZ1508反应产物的还原型糖基化质谱分析。C)未反应的抗体和AZ1508缀合产物的HIC分析，D)AZ1508反应产物的SEC分析。将图谱放大以在(A)和(B)中显示抗体重链(HC)和轻链(LC)。
图16.7.显示用于分析1C1 N297C AZ1508 ADC的分析数据。A)未反应的mAb的还原型糖基化质谱分析。B)AZ1508反应产物的还原型糖基化质谱分析。C)未反应的抗体和AZ1508缀合产物的HIC分析，D)AZ1508反应产物的SEC分析。将图谱放大以在(A)和(B)中显示抗体重链(HC)和轻链(LC)。
图17.1.显示在大鼠血清中温育之前和之后1C1 CP2-NNAA ADC和1C1半胱氨酸-AZ1508 ADC的代表性还原型糖基化质谱。(A)位置S239，(B)位置K274，(C)位置N297。表明了未缀合物质和缀合物质。
图17.2.显示在37℃下在大鼠血清中温育7天后，保持附接于CP2-NNAA或半胱氨酸工程化抗体的AZ1508的定量。药物：抗体比率(DAR)由还原型糖基化质谱计算。数据代表平均值±标准偏差，n＝3。
图17.3.显示在37℃下在小鼠血清中温育7天后，保持附接于CP2-NNAA或半胱氨酸工程化抗体的AZ1508的定量。药物：抗体比率(DAR)由还原型糖基化质谱计算。去乙酰化的AZ1508被认为是用于分析的缀合物质。数据代表平均值±标准偏差，n＝3。
图18.1.显示通过还原型糖基化质谱测量的1C1 CP1-NNAA和1C1 CP2-NNAA mAb与AZ1508的缀合动力学。对于1C1 K274CP1-NNAA，1C1 K274CP2-NNAA和1C1 N297CP2-NNAA，将数据绘制为平均值±绝对误差，n＝2，并且对于1C1 S239CP2-NNAA为平均值±标准偏差n＝3。
图18.2.显示浓度倒数图，其显示CP1-NNAA和CP2-NNAA mAb与AZ1508反应时二烯的消耗。(A)1C1 K274CP1-NNAA，(B)1C1 S239CP2、1C1 K274CP2-NNAA和N297CP2-NNAA mAb。对于1C1 K274CP1-NNAA.1C1 K274CP2-NNAA和1C1 N297CP2-NNAA，将数据绘制为平均值±绝对误差，n＝2，并且对于1C1 S239CP2-NNAA为平均值±标准偏差n＝3。
图19.1.显示1C1 CP2-NNAA AZ1508 ADC对小鼠PC3异种移植肿瘤模型的抗肿瘤活性。
图20.1.显示在与1C1野生型(WT)或1C1 K274CP1-NNAA抗体(CP1-NNAA mAb)在25℃下温育2小时之前和之后60nm马来酰亚胺官能化的金纳米颗粒的动态光散射分析(DLS)。
实例
实例1.用于产生ADC的呋喃-马来酰亚胺反应
将呋喃-马来酰亚胺反应评估为产生ADC的缀合方式。呋喃-NHS由合成化学有限公司(SynChem，Inc.)以90％纯度提供。
在mAb上引入呋喃官能团：通过赖氨酸伯胺与NHS-酯活化的呋喃接头的反应将呋喃二烯官能团安装到IgG1 mAb上。该方法产生随机缀合的酰胺连接的呋喃基团，其中修饰的mAb称为mAb-呋喃接头。注意，在某些图中，mAb-呋喃-接头可以表示为mAb-呋喃，参见附图标题以进行说明。将Mab溶液用PBSpH 7.2调节至5mg/mL(3mL，15mg mAb，0.1μmol，1当量)，然后加入10％v/v 1M NaHCO3。将该溶液在冰上冷却，加入30μL呋喃-NHS(10mM原液的DMAc溶液，0.3μmol，3当量)。使反应在冰上进行5分钟，然后在室温下进行1小时并持续混合。通过质谱法监测反应进程，并分多个30μL部分加入呋喃-NHS，直至达到约2个呋喃/mAb的缀合度。总共添加3次呋喃-NHS，总体积为90μL(0.9μmol，9当量)。通过0℃下对PBS，1mMEDTA，pH 7.4透析(Slide-A-Lyzer，10kDa MWCO)24小时来纯化反应的mAb。
方案1.1.在mAb上引入呋喃功能团。
呋喃修饰的mAb与马来酰亚胺基-MMAE的反应：通过将呋喃基团经狄尔斯-阿尔德4+2环加成偶联至MMAE上包含的烷基-或苯基-马来酰亚胺基团，将MMAE ADC有效负载安装到mAb-呋喃-接头上。首先，将mAb-呋喃-接头溶液(286μL，3.5mg/mL，6.7nmol，1当量)与10％v/v NaH2PO4和20％v/vDMSO合并。接下来，将AM-MMAE或PM-MMAE溶液(10μL的10mM原液的DMAc溶液，100nmol，15当量)加入到抗体溶液中。将反应混合物在环境气氛下封端，并在37℃下反应20小时并伴以混合。在20小时反应期结束后，加入N-乙酰基半胱氨酸(8μL的100mM溶液，8当量)，并将溶液在室温下进一步温育15分钟以淬灭马来酰亚胺基团。淬灭后，使用PD Spintrap G-25装置(通用电气医疗集团生命科学部(GE Healthcare Life Sciences))纯化缀合物，然后如下所述通过去糖基化质谱法进行分析。如上所述，使用200mM原液的75mM NaOH溶液(10μL，2μmol，300当量)使烯丙基羰基-赖氨酸与呋喃-接头修饰的mAb反应。
A)
Figure BDA0002280513920000522
B)
Figure BDA0002280513920000531
方案1.2.A)mAb-呋喃-接头与马来酰亚胺基-MMAE的反应，B)AM-MMAE和PM-MMAE的化学结构。
质谱分析：首先，通过将50μL样品(1mg/mL mAb)与5μL糖基缓冲液1(新英格兰生物实验室(New England BioLabs))和5μL Remove-iT EndoS(在PBS中1∶10稀释，20,000个单位/mL，新英格兰生物实验室)合并，然后在37℃温育1小时，用EndoS(新英格兰生物实验室)将mAb或mAb缀合物去糖基化。通过添加5μL Bond-Breaker TCEP溶液(0.5M，赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific))并在37℃温育10分钟来制备还原样品。使用配备有RP-HPLC柱(ZORBAX 300Diphenyl RRHD，1.8微米，2.1mm×50mm)的Agilent 6520B Q-TOF质谱仪进行质谱分析。高效液相色谱(HPLC)参数如下：流速，0.5ml/min；流动相A为0.1％(v/v)甲酸的HPLC级H2O溶液，而流动相B为0.1％(v/v)甲酸的乙腈溶液。将柱在90％A/10％B中平衡，其也用于使mAb样品脱盐，然后在20％A/80％B中洗脱。在100-3000m/z，正极性，气体温度350℃，雾化器压力48lb/in2，和毛细管电压5,000V下收集质谱数据。使用供应商提供的(Agilent v.B.04.00)MassHunter定性分析软件进行数据分析并将解卷积光谱的峰强度用于推导每个样品中物质的相对比例。
图1.1.在mAb与呋喃-NHS反应之前(A)和之后(B)完整的去糖基化质谱。
图1.2.与MMAE反应20小时后mAb-呋喃-接头样品的还原型去糖基化质谱。将图谱放大以仅显示mAb重链的质量区域。对于mAb轻链观察到类似的结果。观察到MMAE在有和没有呋喃的情况下加成到mAb重链，这表明非特异性缀合。
表1.1.mAb-呋喃-接头反应在37℃下进行20小时的总结
Figure BDA0002280513920000532
Figure BDA0002280513920000541
*(相对于mAb)
图1.3.mAb-呋喃-接头烯丙基羰基赖氨酸反应产物的还原型去糖基化质谱分析。没有观察到对应于缀合物的预期质量的峰。烯丙基羰基赖氨酸的结构如下图所示。
使用胺反应性呋喃-NHS分子将呋喃官能团引入抗体。呋喃官能度通过mAb修饰反应中使用的呋喃-NHS的量来控制。通过相应地调节摩尔进料比可以实现更多或更少的呋喃。mAb-呋喃-接头与马来酰亚胺基-MMAE的反应是低效且非特异性。即使在37℃下反应20小时后，烷基-或苯基-马来酰亚胺有效负载也未达到超过5％的特异性缀合。与AM-MMAE相比，PM-MMAE对mAb的非特异性反应(可能通过胺的迈克尔加成(Michael addition))大约高12倍，这表明该马来酰亚胺基团的反应性更高。此外，对于PM-马来酰亚胺MMAE有效负载，非特异性反应(可能针对胺类)似乎比对呋喃的特异性反应高约4倍。呋喃-马来酰亚胺偶联不适合生产ADC。
实例2.含环戊二烯(CP1)的化合物的合成
基于图2.1中所示的一般设计制备交联剂和非天然氨基酸(NNAA)。
材料和方法：除非另有说明，否则使用试剂级溶剂在N2气氛下进行反应。将DCM和甲苯储存在
Figure BDA0002280513920000542
分子筛上。使THF通过活性氧化铝柱。所有商业获得的试剂均按原样使用。用E.Merck硅胶60F254预涂板(0.25mm)进行薄层色谱(TLC)，并通过暴露于UV光(254nm)观察或用对茴香醛、茚三酮或高锰酸钾染色。使用正相硅胶(
Figure BDA0002280513920000543
0.040-0.063mm，Geduran)进行快速柱色谱。在Varian光谱仪(400、500或600MHz)上记录1H NMR光谱，并相对于氘代溶剂信号报告。1H NMR光谱的数据报告如下：化学位移(δppm)、多重性、偶合常数(Hz)和积分。在Varian光谱仪(100、125或150MHz)上记录13C NMR光谱。13C NMR光谱的数据以化学位移(δppm)表示。质谱是从具有场解吸(FD)源的(沃特世有限公司(Waters Corp.))GCT高级高分辨率飞行时间质谱仪上的UC Santa Barbara质谱设施获得的。
CP1-NNAA(4)的合成
Figure BDA0002280513920000551
2-(环戊二烯基)乙醇异构体(1)：
将澳乙酸甲酯(6.0mL，63mmol，1.05当量)加入THF(60mL)中并冷却至-78℃。在10分钟内逐滴加入环戊二烯基钠(2M THF溶液，30mL，60mmol，1当量)。将反应在-78℃下搅拌2小时。将反应用H2O(6mL)和硅胶(6g)淬灭并使其温热至室温。将反应混合物通过二氧化硅塞过滤，然后用DCM(100mL)冲洗。将有机层合并，除去溶剂，得到棕色油状的2-(环戊二烯基)乙酸甲酯异构体(1∶1)，将其直接用于下一步骤。
将LAH(4.55g，120mmol，2当量)加入THF(300mL)中并冷却至0℃。在1小时内分4份逐滴加入溶解在THF(10mL)中的粗制2-(环戊二烯基)乙酸甲酯(60mmol)。使反应温热至室温并搅拌直至原料消耗(TLC，2小时)。将反应冷却至0℃并逐滴用H2O(10mL)缓慢淬灭，然后用NaOH(4M H2O，5mL)淬灭。加入H2O(20mL)，过滤混合物，并用Et2O(100mL)冲洗。将滤液合并，并且除去溶剂。将残余物悬浮在盐水(100mL)中并用Et2O(3×100mL)萃取。将有机层合并，用盐水(100mL)洗涤，通过MgSO4干燥，过滤，除去溶剂。将残余物通过二氧化硅塞(己烷∶EtOAc，2∶1)过滤，除去溶剂，得到1(5.45g，83％)，呈琥珀色油状物。为防止二聚化，应将1冷冻储存在苯基质中。
Rf(己烷∶EtOAc，4∶1)∶0.11；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ6.50-6.13(m，3H)，3.81(td，J＝6.3，10.1Hz，2H)，3.01(d，J＝1.6Hz，1H)，2.95(d，J＝1.6Hz，1H)，2.70(dt，J＝1.2，6.5Hz，1H)，2.66(dt，J＝1.4，6.4Hz，1H)，1.52(s，1H)ppm。
Figure BDA0002280513920000561
4-硝基苯基碳酸2-(环戊二烯基)乙基酯异构体(2)：
将2(2.86g，26.0mmol，1当量)加入DCM(100mL)中并冷却至0℃。加入吡啶(5.2mL，65mmol，2.5当量)，然后在10分钟内分2份加入氯甲酸4-硝基苯基酯(5.76g，28.6mmol，1.1当量)。移去冰浴，搅拌反应直至原料消耗(TLC，40分钟)。将反应物倒入分液漏斗中并用饱和NH4Cl的H2O溶液(100mL)洗涤。用DCM(100mL)萃取水层。将有机层合并，用盐水(50mL)洗涤，用Na2SO4干燥，过滤，并且除去溶剂。将残余物进行快速柱色谱(己烷∶EtOAc，6∶1)，得到2(5.69g，80％)，呈黄色油状物，其在冰箱中固化。
Rf(己烷∶EtOAc，4∶1)∶0.43；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.34-8.24(m，2H)，7.40-7.34(m，2H)，6.56-6.13(m，3H)，4.47(td，J＝6.8，10.2Hz，2H)，3.02(d，J＝0.8Hz，1H)，2.98(d，J＝1.2Hz，1H)，2.88(dtd，J＝1.0，6.9，16.1Hz，2H)ppm。
Figure BDA0002280513920000562
Fmoc-Lys(2-(环戊二烯基)乙基甲酸酯)-OH异构体(3)：
将2(3.60g，13.1mmol，1当量)加入DMF(30mL)中，然后加入Fmoc-Lys-OH(5.78g，15.7mmol，1.2当量)和DIPEA(5.4mL，32mmol，2.4当量)。搅拌反应直至原料消耗(NMR，3.5小时)，然后倒入EtOAc(100mL)和H2O(140mL)中。将水层用HCl(1M，60mL)酸化，倒入分液漏斗，分层。将水层用EtOAc(2x 100mL)萃取。将有机层合并，用盐水(100mL)洗涤，用Na2SO4干燥，过滤，除去溶剂。将残余物进行快速柱色谱(己烷∶EtOAc，3∶1，然后DCM∶MeOH∶AcOH，89∶10∶1)，得到3(4.73g，72％)，呈白色泡沫。
Rf(DCM∶MeOH∶AcOH，89∶10∶1)∶0.50；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.76(d，J＝7.4Hz，2H)，7.66-7.56(m，2H)，7.39(t，J＝7.4Hz，2H)，7.31(t，J＝7.2Hz，2H)，6.57-5.96(m，3H)，5.85-5.54(m，1H)，4.84-4.11(m，7H)，3.27-2.61(m，6H)，1.99-1.11(m，6H)ppm。
CP1-NNAA(4)：
将3(4.61g，9.13mmol，1当量)加入DMF(130mL)中，然后加入哌啶(14.4mL)。搅拌反应直至原料消耗(TLC，90分钟)，然后除去溶剂。将Et2O(100mL)加入残余物中，并将悬浮液超声处理5分钟。过滤悬浮液并用Et2O(100mL)冲洗。将固体悬浮在MeOH(10mL)中，搅拌10分钟，加入Et2O(40mL)，过滤悬浮液并用Et2O(50mL)冲洗。将化合物真空干燥，得到褐色粉末状的4(2.15g，84％)。
1H NMR(400MHz，甲醇-d4+一滴TFA)δ6.53-6.07(m，3H)，4.29-4.11(m，2H)，3.96(t，J＝6.3Hz，1H)，3.11(t，J＝1.0Hz，2H)，3.01-2.62(m，3H)，2.02-1.81(m，2H)，1.62-1.35(m，4H)ppm；C14H22N2O4[M+H]+的MS(FD)准确质量计算值：283.17，实测值：283.19。
CP1-NHS(6)的合成
Figure BDA0002280513920000572
4-(2-(环戊二烯基)乙氧基)-4-氧代丁酸异构体(5)：
将DCM(1.5mL)加入含有1(0.33g，3.0mmol，1当量)的小瓶中。加入Et3N(0.42mL，3.0mmol，1当量)，DMAP(37mg，0.30mmol，0.1当量)和琥珀酸酐(0.33g，3.3mmol，1.1当量)，将反应物在空气气氛下封端，在室温下搅拌直至原料消耗(TLC，60分钟)。将反应混合物倒入含有DCM(50mL)的分液漏斗中，用HCl水溶液(1M，50mL)萃取，然后用H2O(50mL)萃取。将有机层用MgSO4干燥，过滤，除去溶剂，得到褐色粉末状的5(0.57g，90％)。
Rf(EtOAc)∶0.67；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ11.49(br.s.，1H)，6.49-6.05(m，3H)，4.27(td，J＝7.0，9.0Hz，2H)，2.94(d，J＝17.6Hz，2H)，2.80-2.56(m，6H)ppm。
Figure BDA0002280513920000581
CP1-NHS(6)：
将THF(10mL)加入含有5(0.42g，2.0mmol，1当量)的小瓶中。加入NHS(0.32g，2.8mmol，1.4当量)，EDC·HCl(0.46g，2.4mmol，1.2当量)和DCM(5mL)，将反应物在空气气氛下封端，并在室温下搅拌过夜。除去溶剂，将残余物进行快速柱色谱(己烷∶EtOAc，1∶1)，得到6(0.48g，78％)，呈澄清的粘性油状物。将CP1-NHS在与抗体缀合后称为CP1-接头。
Rf(己烷∶EtOAc，1∶1)∶0.38；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ6.49-6.40(m，3H)，6.31(dd，J＝1.2，5.1Hz，1H)，6.25(td，J＝1.5，2.8Hz，1H)，6.11(td，J＝1.8，3.0Hz，1H)，4.30(td，J＝7.0，9.0Hz，4H)，3.00-2.90(m，8H)，2.85(br.s.，8H)，2.80-2.68(m，8H)；13C NMR(125MHz，CDCl3)δ170.8，170.8，168.9，168.8，167.6，167.6，144.3，142.3，134.2，134.1，132.3，131.4，128.4，128.0，64.5，64.2，43.5，41.4，29.7，29.0，28.7，26.2，25.5ppm。
环戊二烯(CP)官能化的非天然氨基酸(NNAA)的合成始于市售NaCp与澳乙酸甲酯的反应。将粗制酯用LAH还原成醇1，其以异构体的混合物(约1∶1)形式获得。1在-20℃下储存时会二聚化，应将其冷冻储存在苯基质中或立即使用。1与氯甲酸4-硝基苯酯的反应产生活化的氨基甲酸酯2，可将其在-20℃下储存数周。尝试了2与赖氨酸铜的反应，但用8-羟基喹啉或EDTA处理后分离NNAA 4并不富有成效。2与Boc-Lys-OH的反应提供了71％的Boc保护的NNAA(或使用三光气以38％直接来自1)，但是使用TFA、甲酸或路易斯酸去除Boc基团的努力导致CP环的快速分解。2与Fmoc-Lys-OH的反应产生Fmoc保护的3，其可以使用哌啶脱保护以获得NNAA 4。化合物4在常用的氘代溶剂中具有不佳的溶解度。可以加入一滴TFA以增加溶解度，但在几小时后会导致分解。由于顺序[1，5]-氢化物转移，因此当溶解在D2O中时，4中的CP质子与催化NaOH交换。
CP1官能化的NHS-酯的合成始于1与琥珀酸酐以生成酸5的反应。使酸5与EDC·HCl和N-羟基琥珀酰亚胺反应以得到NHS酯6。在室温下，6上的CP环在数天内发生二聚化，但可将其在-20℃下储存一个月以上。
实例3.通过交联剂修饰的mAb制备ADC的CP1二烯-马来酰亚胺缀合物
评估环戊二烯-马来酰亚胺反应的生物缀合，其中环戊二烯基团通过接头引入。
在mAb上引入CP1官能团：通过赖氨酸伯胺与CP1-NHS(化合物6)的反应将CP1二烯官能团安装到IgG1 mAb上。该方法产生随机缀合的酰胺连接的环戊二烯基团，其中修饰的mAb称为mAb-CP1-接头。注意，在一些图中，mAb-CP1-接头也可称为mAb-CP1，参见附图标题以进行说明。典型的mAb修饰反应描述如下。将Mab溶液用PBS pH 7.2调节至5mg/mL(3mL，15mg mAb，100nmol，1当量)，然后加入10％v/v 1M NaHCO3。将该溶液在冰上冷却，加入30μLCP1-NHS(10mM原液的DMAc溶液，300nmol，3当量)。反应在冰上进行5分钟，然后在室温下反应1小时并伴以持续混合。通过0℃下对PBS，1mM EDTA，pH 7.4透析(Slide-A-Lyzer，10kDaMWCO)24小时来纯化反应的mAb。通过如下所述的完整去糖基化质谱法定量CP1-接头引入，并且在该实施方案中发现为每个mAb2.3个CP1，这对应于CP1-NHS向抗体缀合物的77％转化。在各种条件下进行的该反应的结果总结在附录A3.1中描述。
Figure BDA0002280513920000591
方案3.1.用CP1-NHS修饰mAb以产生mAb-CP1-接头。
CP1-修饰的mAb与马来酰亚胺基-MMAE的反应：将mAb-CP1-接头(2.3个CP1二烯/mAb，1mg，6.7nmol mAb，1当量)用PBS(pH 7.4)稀释至3.5mg/mL的最终浓度。接着，加入DMSO，得到20％v/v溶液，然后加入1M磷酸二氢钠，得到10％v/v溶液。加入所有溶液组分，得到包含2.7mg/mL mAb，41.4μM CP1二烯，1.78M DMSO，110mM磷酸钠，100mM NaCl，pH 5.5的混合物。将AM-MMAE或PM-MMAE(10μL的10mM原液的DMAc溶液，100nmol，15当量)加入抗体溶液中。将反应混合物短暂涡旋，并在22℃或37℃下进行混合。反应4小时后，加入N-乙酰半胱氨酸(8μL的100mM溶液，120当量)以淬灭未反应的马来酰亚胺基团。然后使用PD SpintrapG-25装置(通用电气医疗集团生命科学部(GE Healthcare Life Sciences))纯化样品以从混合物中除去小分子组分。然后通过如下所述的还原型去糖基化质谱法分析样品。
方案3.2.mAb-CP1-接头与马来酰亚胺基MMAE的反应。
质谱分析：如实例1中所述分析样品。
图3.1.在mAb与CP1-NHS反应之前(A)和之后(B)完整的去糖基化质谱。(B)中峰下方的数字表示引入mAb中的CP1-接头基团的数目。注意，(A)中的一组较高MW峰代表糖基化的mAb。通过峰强度对CP1-接头引入的估计产生每个mAb 2.3个CP1-接头。
表3.1 CP1-NHS mAb反应的总结
图3.2.mAb-CP1-接头马来酰亚胺基MMAE反应产物的还原型糖基化质谱，将其放大以显示mAb重链和轻链。
图3.3.mAb-CP1-接头马来酰亚胺基MMAE反应产物的还原型去糖基化质谱，将其放大以显示mAb重链区。DAR-0表示没有MMAE与mAb重链缀合，DAR-1表示一个MMAE与mAb重链缀合，而DAR-2表示两个MMAE与mAb重链缀合。在反应产物中未检测到未缀合的CP1-接头峰，并且从相应的重链CP1-接头峰追踪到所有MMAE缀合物峰，这表明缀合对CP1-接头基团是特异性的。
表3.2.mAb-CP1-接头马来酰亚胺基-MMAE反应的总结a
a所有反应均在2.7mg/mL mAb-CP1-接头下进行4小时。
图3.4.mAb-CP1-接头烯丙基羰基赖氨酸反应产物的还原型去糖基化质谱分析。没有观察到对应于缀合物的预期质量的峰。
安装在抗体表面上的CP1二烯基团在室温下在4小时内与马来酰亚胺基-MMAE前药完全反应。通过质谱法未观察到非特异性缀合，因为从mAb-CP1-接头峰追踪到所有CP1-接头-MMAE缀合物峰，而非未修饰的mAb峰(即缺少CP1-接头)。这与mAb-呋喃-接头与马来酰亚胺基MMAE的反应形成鲜明对比，其中仅观察到约2％-20％的缀合，包括在37℃下20小时后的非特异性缀合。二烯-马来酰亚胺与mAb-CP1-接头的缀合是对基于mAb-呋喃--接头的偶联的改进。
实例4.mAb-CP1-接头与马来酰亚胺基-MMAE在0.6摩尔当量的马来酰亚胺基-MMAE与CP1-mAb-接头上包含的二烯基团下的缀合的动力学
mAb-CP1-接头与马来酰亚胺基MMAE的反应动力学在0.6摩尔当量的马来酰亚胺基-MMAE与mAb-CP1-接头上包含的二烯的比色测定法中研究。
在mAb上引入CP1官能团：通过赖氨酸伯胺与CP1-NHS(化合物6)的反应将CP1二烯官能团安装到IgG1 mAb上。该方法产生随机缀合的酰胺连接的环戊二烯基团。将得到的缀合物称为mAb-CP1-接头，也可称为mAb-CP1，参见附图标题以进行说明。将Mab溶液用PBS pH7.2调节至3.7mg/mL(3mL，11.1mg mAb，74nmol，1当量)，然后加入10％v/v 1M NaHCO3。将该溶液在冰上冷却，加入40μL CP1-NHS(10mM原液的DMAc溶液，400nmol，5.4当量)。在持续混合下，反应在室温下进行1小时。通过0℃下对PBS，1mM EDTA，pH 7.4透析(Slide-A-Lyzer，10kDa MWCO)24小时来纯化反应的mAb。通过如下所述的完整去糖基化质谱法定量CP1二烯引入，并且发现为每个mAb3.99个CP1二烯，这对应于CP1-NHS向抗体缀合物的74％转化。
mAb-CP1-接头与马来酰亚胺基-MMAE的反应：将CP1-修饰的mAb(3.99个CP1二烯/mAb，3mg，80nmol CP1二烯，1当量)用PBS(pH 7.4)稀释至1.7mg/mL的最终浓度。接着，加入DMSO，得到20％v/v溶液，然后加入1M磷酸二氢钠，得到10％v/v溶液。加入所有溶液组分，得到包含1.3mg/mL mAb，34.6μM CP1二烯，1.78M DMSO，110mM磷酸钠，100mM NaCl，pH 5.5的混合物。将AM-MMAE或PM-MMAE(5.2μL的10mM原液的DMSO溶液，52nmol，0.67当量)加入抗体溶液中。将反应混合物短暂涡旋，并在22℃下进行混合。在不同时间点取出等分试样(180μL)并加入N-乙酰基半胱氨酸(2μL 100mM溶液，38当量)以淬灭马来酰亚胺基团。然后使用PDSpintrap G-25装置(通用电气医疗集团生命科学部(GE Healthcare Life Sciences))纯化样品以从混合物中除去小分子组分。然后通过如下所述的还原型去糖基化质谱法分析样品。
质谱分析：如实例1中所述分析样品。
CP1二烯-马来酰亚胺反应速率常数的计算：马来酰亚胺基-MMAE与抗体二烯反应的二级速率常数由去糖基化还原型质谱中的峰强度确定。通过mAb-CP1-接头峰的消失和mAb-CP1-接头-AM MMAE峰的出现监测反应进程，但仅使用抗体重链上的mAb-CP1-接头峰强度来计算反应的CP1二烯的相对丰度。使用以下等式计算mAb重链上未反应的CP1二烯基团的相对量：
a＝未修饰重链的峰强度
b＝具有一个CP1-接头基团的重链的峰强度之和
c＝具有两个CP1-接头基团的重链的峰强度之和
d＝具有三个CP1-接头基团的重链的峰强度
注意：含有马来酰亚胺基-MMAE的重链也包括在计算中。例如，CP1-接头-2+1马来酰亚胺基-MMAE将作为CP1-接头-1物种包括在内。
结果
图4.1.在mAb与CP1-NHS反应之前(A)和之后(B)完整的去糖基化质谱。
图4.2.未修饰的mAb、mAb-CP1-接头(mAb-CP1)和在15分钟和2.5小时处AM-MMAE反应的mAb-CP1-接头(mAb-CP1 AM-MMAE)的还原型去糖基化质谱。
图4.3.mAb-CP1-接头与马来酰亚胺基-MMAE随时间的反应。未反应的二烯由还原型去糖基化质谱的峰强度确定。
表4.1 mAb-CP1-接头缀合结果的总结a
有效负载 进料<sup>b</sup> 反应的二烯<sup>c</sup>
AM-MMAE 0.65 60.0％
PM-MMAE 0.65 63.4％
a所有缀合反应在pH 5.5，20％DMSO，22℃和1.3mg/mL mAb下进行3.5小时
b进料以摩尔当量马来酰亚胺基-MMAE：CP1二烯计算
c由还原型去糖基化质谱的峰强度计算。
CP1二烯(包含在mAb-CP1-接头上)与马来酰亚胺基-MMAE的反应在水性条件下是快速且特异性的，反应约10分钟完成。基于马来酰亚胺基-MMAE的计算的摩尔进料比与由完整质谱观察到的缀合度相匹配，因为MMAE摩尔进料和二烯到缀合物的转化基本上是相同的。
实例5.mAb-CP1-接头与马来酰亚胺基-MMAE在1.0摩尔当量的马来酰亚胺基-MMAE与二烯基团下的缀合的动力学
评估CP1二烯与马来酰亚胺基MMAE在22℃下的反应动力学。
在mAb上引入CP1官能团：通过赖氨酸伯胺与CP1-NHS(化合物6)的反应将CP1二烯官能团安装到IgG1 mAb上。该方法产生随机缀合的酰胺连接的环戊二烯基团。将Mab溶液用PBS pH 7.2调节至5mg/mL(3mL，5mg mAb，100nmol，1当量)，然后加入10％v/v 1M NaHCO3。将该溶液在冰上冷却，加入40μL CP1-NHS(10mM原液的DMAc溶液，400nmol，4当量)。将反应混合物短暂涡旋并在室温下温育1小时并伴有持续混合。通过0℃下对PBS，1mM EDTA，pH7.4透析(Slide-A-Lyzer，10kDa MWCO)24小时来纯化反应的mAb。通过如下所述的完整去糖基化质谱法定量CP1二烯引入，并且发现为每个mAb3.7个CP1二烯，这对应于CP1-NHS向抗体缀合物的92％转化。
mAb-CP1-接头与马来酰亚胺基-MMAE的反应：将mAb-CP1-接头(3.7个CP1二烯/mAb，3mg，74nmol CP1二烯，1当量)用PBS(pH 7.4)稀释至1.7mg/mL的最终浓度。接着，加入DMSO，得到20％v/v溶液，然后加入1M磷酸二氢钠，得到10％v/v溶液。加入所有溶液组分，得到包含1.3mg/mL mAb，32.3μM CP1二烯，1.78M DMSO，110mM磷酸钠，100mM NaCl，pH 5.5的混合物。将AM-MMAE或PM-MMAE(7.4μL的10mM原液的DMSO溶液，74nmol，1当量)加入抗体溶液中。将反应混合物短暂涡旋，并在22℃下进行混合。在不同时间点取出等分试样(180μL)并加入N-乙酰基半胱氨酸(3μL的100mM溶液，51当量)以淬灭未反应的马来酰亚胺基团。然后使用PD Spintrap G-25装置(通用电气医疗集团生命科学部(GE Healthcare LifeSciences))纯化样品以从混合物中除去小分子组分。然后通过如下所述的还原型去糖基化质谱法分析样品。
质谱分析：如实例1中所述分析样品。
CP1二烯-马来酰亚胺反应速率常数的计算：马来酰亚胺基-MMAE与mAb二烯反应的二级速率常数由去糖基化还原型质谱中的峰强度确定。通过mAb-CP1-接头峰的消失和mAb-CP1-接头-马来酰亚胺基-MMAE峰的出现监测反应进程，但仅使用抗体重链上的mAb-CP1-接头峰强度来计算反应的CP1二烯的相对丰度。使用以下等式计算mAb-CP1-接头上未反应的CP1二烯基团：
Figure BDA0002280513920000641
a＝未修饰重链的峰强度
b＝具有一个CP1-接头基团的重链的峰强度之和
c＝具有两个CP1-接头基团的重链的峰强度之和
d＝具有三个CP1-接头基团的重链的峰强度
e＝未修饰轻链的峰强度
f＝具有一个CP1-接头基团的轻链的峰强度之和
g＝具有两个CP1-接头基团的轻链的峰强度之和
以摩尔浓度为单位进一步分析缀合数据以确定动力学常数。由通过绘制1/[CP1]对时间和线性回归分析产生的曲线的斜率确定二阶速率常数。使用下面所示的等式由二级反应速率常数计算反应半衰期：
Figure BDA0002280513920000651
k2＝二级速率常数
[CP1]0＝在时间＝0时的CP1二烯浓度
图5.1.在mAb与CP1-NHS反应之前(A)和之后(B)完整的去糖基化质谱。峰上方的数字表示该mAb物种上存在的CP1接头基团的数目。
图5.2.未修饰的mAb、mAb-CP1-接头(mAb-CP1)和在5分钟和150分钟时PM-MMAE反应的mAb-CP1-接头(mAb-CP1 PM-MMAE)的还原型去糖基化质谱。将图谱放大以只显示重链。
图5.3.mAb-CP1-接头与马来酰亚胺基-MMAE的反应。A)未反应的CP1二烯随时间变化的摩尔浓度。每个mAb的未反应的CP1二烯由还原型去糖基化质谱的峰强度确定。B)用于计算反应速率的浓度倒数图。
表5.1 mAb-CP1-接头与马来酰亚胺基MMAE反应的二烯-马来酰亚胺偶联动力学的总结a，b，c
有效负载 二级速率常数(M<sup>-1</sup>s<sup>-1</sup>) t<sub>1/2</sub>(min) 转化率(％)<sup>d</sup>
AM-MMAE 36±1.4 13.5 90
PM-MMAE 54±1.2 8.9 97
a所有缀合反应在pH 5.5，20％DMSO，22℃和1.3mg/mL CP1-修饰的mAb下进行
b所用的MMAE∶CP1二烯的摩尔比为1∶1
c由还原型去糖基化质谱的峰强度计算
d反应150分钟后
CP1二烯与马来酰亚胺基-MMAE的反应是快速且特异性的，半衰期为约几分钟。马来酰亚胺基-MMAE的反应转化率为90％或更高。苯基马来酰亚胺反应速率略高于烷基马来酰亚胺速率，然而，这两种类型的马来酰亚胺的速率和最终转化率是相当的。
实例6.将CP1-NNAA引入抗体
将CP1-NNAA引入抗体的位置K274，对引入抗体后表达的mAb的质量和CP1二烯的反应性进行评估。
CP1-NNAA原液的制备：将CP1-NNAA(0.5g，1.77mmol)与6.81mL H2O和1.38mL 1MNaOH合并。将所得浆液在室温下搅拌直至所有固体溶解(10分钟)。在完全溶解后，将浅黄色溶液通过0.2μm过滤器，等分，并储存在-80℃下直至使用。该过程产生8.2mL的216mM CP1和168mM NaOH原液。
抗体表达：将在Fc位置K274或S239处具有琥珀突变的12G3H11或1C1 IgG1抗体基因克隆到专有的pOE抗体表达载体中。通过PEImax(1.5L的G22细胞)将构建体与编码PylRS双突变体(Y306A/Y384F)或野生型PylRS的质粒和含有tRNA表达盒(pORIP 9X tRNA)的串联重复的质粒转染到CHO-G22中。转染后4小时，将3.3％进料F9(专有)和0.2％进料F10(专有)加入细胞中，并将细胞在34℃下进一步温育。对于1C1.K274转染的细胞，第二天加入CP1-NNAA，最终浓度为0.26mM。在第3天和第7天再次向细胞进料6.6％进料F9和0.4％进料F10。将细胞离心沉淀并在第11天收集上清液。通过IgSelect亲和柱(通用电气医疗集团生命科学部(GE Health Care Life Science))纯化上清液。抗体利用50mM甘氨酸，30mM NaCl，pH3.5洗脱缓冲液洗脱，用1M Tris缓冲液pH 7.5中和，并透析到PBS pH 7.2中。通过280nm下的吸光度测量确定洗脱的抗体浓度。对于1C1.K274，反向计算的滴度为47mg/L。12G3H11mAb以较小规模以类似方式表达，其中变化CP1-NNAA进料浓度和进料时间。使用标准方法通过SDS-PAGE分析回收的抗体。还通过如下所述的尺寸排阻色谱和质谱分析抗体。引入CP1-NNAA的抗体表示为mAb-CP1-NNAA，以将其区别于mAb-CP1-接头构建体，或mAb-[位置]CP1-NNAA，其中[位置]表示突变为CP1-NNAA的氨基酸编号和氨基酸符号。
尺寸排阻色谱(SEC)：使用配备有三重检测器阵列的Agilent 1100毛细管LC系统(维斯科泰克301，维斯科泰克，霍森市，德克萨斯州(Viscotek 301，Viscotek，Houson，TX))进行SEC分析；将波长设定为280nm，并使用100mM磷酸钠缓冲液pH 6.8以1mL/min的流速在TSK-GEL G3000SWXL柱(托索生物科学有限公司，蒙哥马利维尔，宾夕法尼亚州(TosoBioscience LLC，Montgomeryville，PA))上运行样品。
mAb-CP1-NNAA与马来酰亚胺基MMAE的缀合：将mAb-CP1-NNAA(0.4mg，2.7nmol，1当量)用PBS(0.133mL)调节至3mg/mL。分别加入DMSO(27μL)和1M磷酸二氢钠(13μL)，得到约20％和10％v/v溶液。将马来酰亚胺基-MMAE(5μL的10mM原液的DMSO溶液，13nmol，5当量)加入mAb-CP1-NNAA溶液中并将混合物短暂涡旋。用AM-MMAE和PM-MMAE制备ADC。在持续混合下，反应在室温下进行1小时。加入N-乙酰基半胱氨酸(1.1μL 100mM，108nmol，40当量)，将溶液再温育15分钟以淬灭未反应的马来酰亚胺基团。然后使用PD Spintrap G-25装置(通用电气医疗集团生命科学部(GE Healthcare Life Sciences))纯化样品以从混合物中除去小分子组分。随后通过如下所述的还原型质谱分析样品。
Figure BDA0002280513920000671
方案6.1.A)mAb-CP1-NNAA与马来酰亚胺基MMAE的反应。通过赖氨酸向CP1-NNAA的突变将CP1-NNAA引入位置K274。
质谱分析：对于去糖基化的mAb分析，将EndoS(5μL Remove-iT EndoS(PBS中1∶10稀释，20,000个单位/mL，新英格兰生物实验室)与50μL样品(1mg/mL mAb)和5μL糖基缓冲液1(新英格兰生物实验室)合并，然后在37℃温育1小时。通过添加5μL Bond-Breaker TCEP溶液(0.5M，赛默飞世尔科技公司)并在37℃温育10分钟来制备还原样品。使用配备有RP-HPLC柱(ZORBAX 300Diphenyl RRHD，1.8微米，2.1mm×50mm)的Agilent 6520B Q-TOF质谱仪进行质谱分析。高效液相色谱(HPLC)参数如下：流速，0.5ml/min；流动相A为0.1％(v/v)甲酸的HPLC级H2O溶液，而流动相B为0.1％(v/v)甲酸的乙腈溶液。将柱在90％A/10％B中平衡，其也用于使mAb样品脱盐，然后在20％A/80％B中洗脱。在100-3000m/z，正极性，气体温度350℃，雾化器压力48lb/in2，和毛细管电压5,000V下收集质谱数据。使用供应商提供的(Agilent v.B.04.00)MassHunter定性分析软件进行数据分析并将解卷积光谱的峰强度用于推导如前所述的每个样品中物种的相对比例。
图6.1.在包含突变体或wt tRNA合成酶(TRS)的哺乳动物细胞中表达后，12G3H11K274CP1-NNAA mAb的滴度。CP1-NNAA在培养基中的最终浓度和进料时间如x轴所示变化。注意，非天然氨基酸＃50的结构如图6.8所示。
表6.1 1C1 K274CP1-NNAA mAb产生的总结
CP1 NNAA进料(mM) 0.26
体积(L) 1.7
回收的质量(mg) 67
滴度(mg/L) 39
单体(％) 90.8
图6.2. 12G3H11 K274CP1-NNAA mAb的还原型糖基化质谱分析。A)显示mAb轻链(LC)和重链(HC)的质量范围。B)仅显示mAb重链的放大光谱。假定将CP1NNAA引入抗体重链中，观察到的重链质量(51129.55amu)与计算的重链质量(51127amu)紧密匹配。
图6.3. 12G3H11 K274CP1-NNAA mAb的SEC分析，其表明获得了单体产物。显示了高分子量物质(HMWS)。
图6.4. 1C1-K274CP1-NNAA mAb(1C1.K274CP1)通过SDS-PAGE的分析。
图6.5. 12G3H11 K274CP1-NNAA mAb-MMAE缀合产物的还原型去糖基化质谱分析。A)未反应的抗体，B)AM-MMAE反应产物，C)PM-MMAE反应产物。将图谱放大以仅显示mAb重链。
图6.6. 1C1 K274CP1-NNAA mAb-AM-MMAE缀合产物的还原型糖基化质谱分析。A)未反应的抗体，B)AM-MMAE反应产物。将图谱放大以仅显示mAb重链(HC)。显示重链和轻链的缩小图谱如图6.9和6.10所示。
图6.7.显示CP1-NNAA的化合物异构体的化学结构，其以1∶1的比率存在。
图6.8.化合物50(文献中描述的CP1-NNAA的呋喃类似物)的化学结构。该化合物用作12G3H11mAb表达研究的对照。
图6.9. 12G3H11 K274CP1-NNAA mAb-MMAE缀合产物的还原型去糖基化质谱分析。A)未反应的抗体，B)AM-MMAE反应产物，C)PM-MMAE反应产物。将图谱放大以显示抗体重链和轻链。
图6.10. 1C1 K274CP1-NNAA mAb-AM-MMAE缀合产物的还原型糖基化质谱分析。A)未反应的抗体，B)AM-MMAE反应产物。将图谱放大以显示抗体重链和轻链以及高分子量物质。
表6.2 K274CP1-NNAA mAb-MMAE缀合数据的总结a，b，c
Figure BDA0002280513920000691
a所有缀合反应均在pH 5.5，20％DMSO，22℃和3mg/mL CP1-NNAA mAb下进行。将CP1-NNAA引入位置K274代替赖氨酸
b所用的MMAE∶CP1二烯的摩尔比为2.5∶1
c由还原型质谱的峰强度计算
dDAR＝药物与抗体的比率，DAR计算中不包括接头切割物质
使用两种不同的抗体构建体确认在位置K274处将CP1-NNAA引入抗体中；12G3H11和1C1。回收的抗体质量高，没有截短的产物和非常少的聚集体。考虑到进料到细胞的少量CP1-NNAA，1C1抗体的1.7L规模生产所达到的滴度相当高。在表达和纯化过程中保持CP1二烯反应性，如抗体几乎完全转化为ADC所示。
实例7.CP1-NNAA mAb马来酰亚胺基MMAE抗体药物缀合物的血清稳定性
通过在大鼠和小鼠血清中于37℃温育7天，在离体生理环境中4+2环加成产物(环戊二烯-马来酰亚胺键)的稳定性。
ADC的产生：在位置K274具有CP1-NNAA的12G3H11 K274CP1-NNAA与马来酰亚胺基MMAE缀合以产生所需的ADC。首先，用PBS(0.133mL)将12G3H11 K274CP1-NNAA mAb(0.4mg，2.7nmol，1当量)调节至3mg/mL。分别加入DMSO(27μL)和1M磷酸二氢钠(13μL)，得到约20％和10％v/v溶液。将马来酰亚胺基-MMAE(5μL的10mM原液的DMSO溶液，13nmol，5当量)加入12G3H11 K274CP1-NNAA mAb溶液中并将混合物短暂涡旋。在持续混合下，反应在室温下进行1小时。加入N-乙酰基半胱氨酸(1.1μL 100mM，108nmol，40当量)，将溶液再温育15分钟以淬灭未反应的马来酰亚胺基团。然后使用PD Spintrap G-25装置(通用电气医疗集团生命科学部(GE Healthcare Life Sciences))纯化样品以从混合物中除去小分子组分。随后通过如下所述的还原型质谱分析样品以确认缀合并定量药物：抗体比率。
血清稳定性测定：在全大鼠血清(杰克逊免疫研究公司(JacksonImmunoresearch)编号：012-000-120)和全小鼠血清(杰克逊免疫研究编号：015-000-120)中评估ADC样品。根据制造商的方案，用无菌水重构冻干的血清产品。将ADC样品加入血清中，得到0.2mg/mL抗体溶液。使ADC/血清混合物通过0.2μm过滤器，在气密小瓶中封端并在37℃下温育。取出等分试样并冷冻以用作T＝0d参照。将剩余的样品在37℃下温育7天，然后使用Fc特异性抗人IgG-琼脂糖树脂(西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))通过免疫捕获回收抗体(缀合的和未缀合的)。用PBS冲洗树脂两次，用IgG洗脱缓冲液冲洗一次，然后用PBS再冲洗两次。然后将ADC血清样品与抗人IgG树脂(100μL ADC-血清混合物，50μL树脂浆液)合并，并在室温下温和混合15分钟。通过离心回收树脂，然后用PBS洗涤两次。将树脂颗粒重悬于100μL IgG洗脱缓冲液(赛默飞世尔科技公司)中，并在室温下进一步温育5分钟。通过离心除去树脂，然后将20μL 10X糖基缓冲液1(新英格兰生物实验室)和5μL Endo S(Remove iT EndoS，新英格兰生物实验室)加入上清液中，然后在37℃温育1小时。将去糖基化的人抗体溶液无菌过滤，用TCEP(Bond Breaker 0.5M TCEP溶液，赛默飞世尔科技公司)还原，并通过LC/MS分析。由质谱的峰高确定缀合抗体百分比和接头切割产物的定量。
质谱分析：如实例1中所述分析样品。
图7.1. 12G3H11 K274CP1-NNAA AM-MMAE ADC的大鼠血清稳定性。将ADC在大鼠血清中于37℃温育7天，并在还原的质谱分析之前通过免疫捕获回收。将图谱放大以显示重链(HC)质量区域中的细节。没有观察到显著的去缀合。
图7.2. 12G3H11 K274CP1-NNAA PM-MMAE ADC的大鼠血清稳定性。将ADC在大鼠血清中于37℃温育7天，并在还原的质谱分析之前通过免疫捕获回收。将图谱放大以显示重链(HC)质量区域中的细节。没有观察到显著的去缀合，但是在苯基乙酰胺基团处观察到接头切割。有关切割产物的描述，请参见附录7。
图7.3. 12G3H11 K274CP1-NNAA AM-MMAE ADC的小鼠血清稳定性。将ADC在小鼠血清中于37℃温育7天，并在还原的质谱分析之前通过免疫捕获回收。将图谱放大以显示重链(HC)质量区域中的细节。没有观察到显著的去缀合，但是在val-cit二肽处观察到几乎完全的接头切割。有关切割产物的描述，请参见附录7。
图7.4. 12G3H11 K274CP1-NNAA PM-MMAE ADC的小鼠血清稳定性。将ADC在小鼠血清中于37℃温育7天，并在还原的质谱分析之前通过免疫捕获回收。将图谱放大以显示重链(HC)质量区域中的细节。没有观察到显著的去缀合，但是观察到几乎完全的接头切割。有关切割产物的描述，请参见附录7。
表7.1 12G3H11 K274CP1-NNAA MMAE ADC血清稳定性数据的总结a，b
Figure BDA0002280513920000711
a用具有K274CP1-NNAA突变的12G3H11 mAb制备的ADC。
b将样品在37℃下温育7天
c由还原型去糖基化质谱的峰强度计算。
d切割接头物质不包括在DAR计算中。理论DAR＝2。
eval-cit二肽切割和苯基乙酰胺切割都导致整体接头切割和药物损失。
f观察到接头中的苯基乙酰胺切割，但未观察到val-cit二肽切割。
图7.5.显示分子量的MMAE有效负载的化学结构。
图7.6.ADC在小鼠血清中温育后观察到的主要切割产物的化学结构。A)和B)分别显示AM-MMAE和PM-MMAE缀合物的保留在抗体上的物质(CP1-马来酰亚胺键未显示)。C)显示val-cit二肽切割后释放的物质。
图7.7.大鼠血清温育后PM-MMAE切割产物的化学结构。A)保留在抗体上的物质和B)释放的物质。
无论MMAE有效负载上包含的马来酰亚胺的类型如何，mAb-CP1-NNAA和马来酰亚胺基-MMAE之间的环戊二烯-马来酰亚胺缀合产物在大鼠和小鼠血清中在7天的时间段内是稳定的。发现ADC有效负载的其他部分在马来酰亚胺-CP1二烯键结之前降解。具体地，苯基马来酰亚胺-和烷基马来酰亚胺-MMAE有效负载在小鼠血清中表现出高val-cit二肽切割，这可能是由于对高度暴露的K274缀合位点的酶促可及性。苯基-马来酰亚胺缀合物在苯基马来酰亚胺和val-cit二肽之间的苯基乙酰胺上显示出额外的结构可靠性。这种切割在大鼠血清中比在小鼠血清中更明显。尚不清楚该过程中的哪一点发生苯基乙酰胺切割，因为它从第0天到第7天没有增加。在免疫捕获期间可能发生切割，其包括低pH冲洗步骤。总之，证明了环戊二烯-马来酰亚胺缀合产物在生理环境中的稳定性。
实例8.含螺环戊二烯(CP2)的化合物的合成
制备含螺环戊二烯的交联剂和非天然氨基酸(NNAA)，其一般结构如下所示：
图8.1.实例8中描述的螺环戊二烯交联剂(A)和螺环戊二烯NNAA(B)的一般设计。
CP2-NNAA(10)的合成始于市售的NaCp溶液与表氯醇在Carreira反应的改进形式中的反应。 1 使用外消旋表氯醇，但是可以使用对映体纯的表氯醇以91％ee合成7。7与氯甲酸4-硝基苯酯的反应产生活化的氨基甲酸酯8。8与Fmoc-Lys-OH的反应产生Fmoc保护的9，其可以使用哌啶脱保护以获得NNAA10。与4相比，化合物10显示出对酸更高的稳定性，并且当在-20℃下储存时，其合成中没有一个中间体显示出二聚化或分解。
CP2官能化的NHS-酯12的合成始于7与琥珀酸酐以生成酸11的反应。使酸7与EDC·HCl和N-羟基琥珀酰亚胺反应以得到NHS酯12。当在室温下储存数天时，化合物12似乎不会二聚化。
材料和方法：除非另有说明，否则使用试剂级溶剂在N2气氛下进行反应。将DCM和甲苯储存在
Figure BDA0002280513920000721
分子筛上。使THF通过活性氧化铝柱。所有商业获得的试剂均按原样使用。用E.Merck硅胶60F254预涂板(0.25mm)进行薄层色谱(TLC)，并通过暴露于UV光(254nm)观察或用对茴香醛、茚三酮或高锰酸钾染色。使用正相硅胶(
Figure BDA0002280513920000722
0.040-0.063mm，Geduran)进行快速柱色谱。在Varian光谱仪(400、500或600MHz)上记录1H NMR光谱，并相对于氘代溶剂信号报告。1H NMR光谱的数据报告如下：化学位移(δppm)、多重性、偶合常数(Hz)和积分。在Varian光谱仪(100、125或150MHz)上记录13C NMR光谱。13C NMR光谱的数据以化学位移(δppm)表示。质谱是从具有场解吸(FD)源的(沃特世有限公司(Waters Corp.))GCT高级高分辨率飞行时间质谱仪上的UC Santa Barbara质谱设施获得的。
CP2-NNAA(10)的合成
Figure BDA0002280513920000731
螺[2.4]庚-4，6-二烯-1-基甲醇(7)：
将环戊二烯钠(2M THF溶液，10mL，20mmol，4当量)加入THF(40mL)中并冷却至0℃。逐滴加入表氯醇(0.39mL，5.0mmol，1当量)并将反应在0℃下搅拌1.5小时，然后在室温下再搅拌2小时。用H2O(40mL)淬灭反应，然后转移到分液漏斗中。加入NaHCO3在H2O(40mL)和乙醚(40mL)中的饱和溶液，并且分层。将有机层用盐水(40mL)洗涤，经MgSO4干燥，过滤，然后除去溶剂。将残余物进行快速柱色谱(己烷∶EtOAc，2∶1)，得到7(0.48g，78％)，呈棕色油状物。
Rf(己烷∶EtOAc，2∶1)∶0.22；1H NMR(500MHz，CDCl3)δ6.64(td，J＝1.6，5.1Hz，1H)，6.51(td，J＝1.7，5.1Hz，1H)，6.27(tdd，J＝1.0，2.1，5.2Hz，1H)，6.12(td，J＝1.7，5.1Hz，1H)，4.08-3.88(m，1H)，3.59(dd，J＝8.8，11.7Hz，1H)，2.48-2.40(m，1H)，1.87(dd，J＝4.3，8.7Hz，1H)，1.69(dd，J＝4.4，7.0Hz，1H)，1.57(br.s.，1H)ppm；13C NMR(125MHz，CDCl3)δ139.4，133.9，131.7，128.6，64.9，41.9，30.0，17.6ppm。
Figure BDA0002280513920000732
碳酸4-硝基苯基螺[2.4]庚-4，6-二烯-1-基甲酯(8)：
将7(2.80g，22.9mmol，1当量)加入DCM(100mL)中并冷却至0℃。加入吡啶(4.61mL，57.3mmol，2.5当量)，接着加入氯甲酸4-硝基苯酯(5.08g，25.2mmol，1.1当量)。将反应在0℃下搅拌直至原料消耗(TLC，30分钟)。将反应物倒入分液漏斗中并用NH4Cl的H2O(100mL)饱和溶液洗涤。将水层用DCM(50mL)萃取。将有机层合并，用盐水(50mL)洗涤，用Na2SO4干燥，过滤，并且除去溶剂。将残余物进行快速柱色谱(己烷∶EtOAc，6∶1至4∶1)，得到8(5.17g，79％)，呈琥珀色油状物。
Rf(己烷∶EtOAc，4∶1)∶0.28；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.28(d，J＝9.0Hz，2H)，7.37(d，J＝9.0Hz，2H)，6.62(td，J＝1.7，5.2Hz，1H)，6.53(td，J＝1.7，4.8Hz，1H)，6.25(td，J＝1.8，5.5Hz，1H)，6.11(td，J＝1.6，5.1Hz，1H)，4.53(dd，J＝7.6，11.5Hz，1H)，4.40(dd，J＝7.4，11.3Hz，1H)，2.52(quin，J＝7.6Hz，1H)，1.92(dd，J＝4.7，8.6Hz，1H)，1.76(dd，J＝4.7，6.7Hz，1H)ppm；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ155.4，152.3，145.3，138.6，133.8，131.7，129.4，125.2，121.7，70.9，41.5，24.6，16.9ppm。
Figure BDA0002280513920000741
Fmoc-Lys(螺[2.4]庚-4，6-二烯-1-基甲基碳酸酯)-OH(9)：
将8(5.12g，17.8mmol，1当量)加入DMF(40mL)中，然后加入Fmoc-Lys-OH(7.87g，21.4mmol，1.2当量)和DIPEA(7.44mL，42.7mmol，2.4当量)。搅拌反应直至原料消耗(NMR，3.5小时)，然后倒入EtOAc(100mL)和H2O(140mL)中。用HCl(1M，100mL)将水层酸化至pH 2-3，倒入分液漏斗中，分层。将水层用EtOAc(2x 100mL)萃取。将有机层合并，用盐水(100mL)洗涤，用Na2SO4干燥，过滤，除去溶剂。将残余物进行快速柱色谱(己烷∶EtOAc，3∶1，然后DCM∶MeOH∶AcOH，89∶10∶1)并除去溶剂。通过将产物悬浮在DCM中，用盐水洗涤，用Na2SO4干燥有机层，过滤，然后除去溶剂以得到呈蛋壳泡沫的9(7.43g，81％)来除去残留的AcOH和DMF。
Rf(DCM∶MeOH，90∶10)∶0.39；1H NMR(500MHz，CDCl3)δ8.62(br.s.，1H)，7.75(d，J＝7.3Hz，2H)，7.66-7.49(m，2H)，7.39(t，J＝7.4Hz，2H)，7.30(t，J＝7.3Hz，2H)，6.54(br.s.，1H)，6.47(br.s.，1H)，6.21(br.s.，1H)，6.04(br.s.，1H)，5.74(d，J＝7.3Hz，1H)，4.91(br.s.，1H)，4.53-4.00(m，5H)，3.21-3.00(m，2H)，2.97(s，1H)，2.90(d，J＝0.8Hz，1H)，2.47-2.31(m，1H)，1.95-1.27(m，6H)ppm；13C NMR(125MHz，CDCl3)163.2，156.7，143.6，141.2，138.9，134.5，130.9，128.9，127.6，127.0，125.1，119.9，115.6，67.0，66.5，53.5，47.1，41.6，40.4，36.8，31.8，29.2，25.7，22.2，21.4，17.1δppm。
Figure BDA0002280513920000751
CP2-NNAA(10)：
将9(5.50g，10.6mmol，1当量)加入DMF(150mL)中，然后加入哌啶(16.8mL)。搅拌反应直至原料消耗(TLC，90分钟)，然后除去溶剂。将Et2O(100mL)加入残余物中，并将悬浮液超声处理5分钟。过滤悬浮液并用H2O(2×100mL)和Et2O(100mL)冲洗。将固体悬浮在MeOH(10mL)中，在温和加热(约40℃)下搅拌10分钟，加入Et2O(40mL)，过滤悬浮液并用Et2O(2×50mL)冲洗。将化合物真空干燥，得到10(2.24g，71％)，呈白色粉末。
Rf(DCM∶MeOH，85∶15)∶0.29；1H NMR(400MHz，DMSO-d6+1dropTFA)δ8.20(br.s.，3H)，7.16(t，J＝5.5Hz，1H)，6.48(td，J＝1.8，5.1Hz，1H)，6.40(d，J＝5.1Hz，1H)，6.32(d，J＝5.1Hz，1H)，6.12(td，J＝1.9，4.9Hz，1H)，4.24(dd，J＝6.7，11.7Hz，1H)，3.99(dd，J＝7.6，11.5Hz，1H)，3.88(d，J＝5.1Hz，1H)，2.94(d，J＝5.9Hz，2H)，2.37(quin，J＝7.5Hz，1H)，1.83-1.63(m，4H)，1.44-1.19(m，4H)ppm；13C NMR(100MHz，DMSO-d6+1滴TFA)：
171.2，156.2，139.3，135.2，130.4，128.3，65.3，51.9，42.0，29.7，28.9，25.7，21.6，16.4；C15H22N2O4[M]+的MS(EI)准确质量计算值：294.1580，实测值：294.1571。
CP2-NHS(12)的合成
Figure BDA0002280513920000752
4-氧代-4-(螺[2.4]庚-4，6-二烯-1-基甲氧基)丁酸(11)：
将DCM(1.5mL)加入含有1(0.37g，3.0mmol，1当量)的小瓶中。加入Et3N(0.42mL，3.0mmol，1当量)，DMAP(37mg，0.30mmol，0.1当量)和琥珀酸酐(0.33g，3.3mmol，1.1当量)，将反应物在空气气氛下封端，并在室温下搅拌直至原料消耗(TLC，1.75小时)。将反应混合物倒入含有DCM(50mL)的分液漏斗中，并用HCl水溶液(1M，50mL)洗涤。用DCM(50mL)萃取水层，将有机层合并，用Na2SO4干燥，过滤，除去溶剂，得到对于下一反应纯度足够的11。
Rf(EtOAc)∶0.56；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ10.60(br.s.，1H)，6.57(td，J＝1.9，5.3Hz，1H)，6.50(td，J＝1.8，5.1Hz，1H)，6.21(td，J＝1.7，5.2Hz，1H)，6.07(td，J＝1.8，5.1Hz，1H)，4.37(dd，J＝7.4，11.7Hz，1H)，4.20(dd，J＝7.0，11.7Hz，1H)，2.74-2.57(m，4H)，2.42(quin，J＝7.8Hz，1H)，1.85(dd，J＝4.5，8.4Hz，1H)，1.69(dd，J＝4.3，7.0Hz，1H)ppm。
Figure BDA0002280513920000761
CP2-NHS(12)：
将THF(10mL)加入含有11(理论上3.0mmol，1当量)的小瓶中。加入NHS(0.48g，4.2mmol，1.4当量)，EDC·HCl(0.69g，3.6mmol，1.2当量)和DCM(5mL)，将反应物在空气气氛下封端，并在室温下搅拌过夜。除去溶剂，将残余物进行快速柱色谱(己烷∶EtOAc，1∶1)，得到12(0.59g，62％，分两步)，呈无色粘性油状物。
Rf(己烷∶EtOAc，1∶1)∶0.34；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ6.56(td，J＝1.8，5.1Hz，1H)，6.48(td，J＝1.8，5.1Hz，1H)，6.21(td，J＝1.6，3.4Hz，1H)，6.06(td，J＝1.6，3.4Hz，1H)，4.36(dd，J＝7.4，11.7Hz，1H)，4.21(dd，J＝7.4，11.7Hz，1H)，2.93(t，J＝7.0Hz，2H)，2.83(s，4H)，2.73(t，J＝7.4Hz，2H)，2.42(quin，J＝7.6Hz，1H)，1.83(dd，J＝4.3，8.6Hz，1H)，1.68(dd，J＝4.5，6.8Hz，1H)ppm；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ170.8，168.9，167.6，138.8，134.3，131.2，129.0，66.6，41.5，28.6，26.2，25.5，25.1，17.3ppm。
1.Ledford，B.E.；Carreira，E.M.，Total Synthesis of(+)-Trehazolin：Optically Active Spirocycloheptadienes as Useful Precursors for the Synthesisof Amino Cyclopentitols[(+)-Trehazolin的全合成：光学活性螺环庚二烯作为合成氨基环戊糖醇的有用前体]Journal of the American Chemical Society[美国化学协会期刊]1995，117，11811-11812。
实例9.CP2二烯-马来酰亚胺缀合以通过交联剂修饰的mAb制备ADC
评估了螺环戊二烯-马来酰亚胺反应用于生物缀合的可行性。螺环戊二烯基团通过实例3中所述的相同的一般策略经胺反应性异双官能接头引入。
在mAb上引入CP2官能团：通过赖氨酸伯胺与NHS-酯活化的CP2二烯的反应将CP2二烯官能团安装到IgG1 mAb上。该方法产生随机缀合的酰胺连接的环戊二烯基团。得到的抗体称为mAb-CP2-接头，但也可以在图中表示为mAb-CP2。参见附图标题以进行说明。典型的mAb修饰反应描述如下。将Mab溶液用PBS pH 7.2调节至5mg/mL(3mL，15mg mAb，100nmol，1当量)，然后加入10％v/v1M NaHCO3。将该溶液在冰上冷却，加入35μL CP2-NHS(10mM原液的DMAc溶液，350nmol，3.5当量)。反应在冰上进行5分钟，然后在室温下反应1小时并伴以持续混合。通过0℃下对PBS，1mM EDTA，pH 7.4透析(Slide-A-Lyzer，10kDa MWCO)24小时来纯化反应的mAb。通过如下所述的完整去糖基化质谱法定量CP2引入，并且在该实例中发现为每个mAb3.29个CP2-接头(因此为二烯)，这对应于CP2-NHS向抗体缀合物的94％转化。
Figure BDA0002280513920000771
方案9.1.用CP2-NHS修饰mAb
CP2修饰的mAb与马来酰亚胺基-MMAE的反应：用PBS(pH 7.4)稀释mAb-CP2-接头(3.29个CP2二烯/mAb，1mg，6.7nmol mAb，1当量)至3.16mg/mL的最终浓度。接着，加入DMSO，得到20％v/v溶液，然后加入1M磷酸二氢钠，得到10％v/v溶液。加入所有溶液组分，得到包含2.43mg/mL mAb，53.3μM CP2，1.78M DMSO，110mM磷酸钠，100mM NaCl，pH 5.5的混合物。将AM-MMAE或PM-MMAE(10μL的10mM原液的DMAc溶液，100nmol，15当量)加入抗体溶液中。将反应混合物短暂涡旋，并在22℃或37℃下进行混合。反应4小时后，加入N-乙酰半胱氨酸(8μL的100mM溶液，120当量)以淬灭未反应的马来酰亚胺基团。使用PD Spintrap G-25装置(通用电气医疗集团生命科学部(GE Healthcare Life Sciences))纯化样品以从混合物中除去小分子组分。然后通过如下所述的还原型去糖基化质谱法分析样品。
Figure BDA0002280513920000781
方案9.2.mAb-CP2-接头与马来酰亚胺基MMAE的反应。
质谱分析：如实例1中所述分析样品。
图9.1.与CP2-NHS反应之前(A)和之后(B)完整的去糖基化质谱。(B)中峰下方的数字表示引入mAb中的CP2-二烯基团的数目。通过峰强度对CP2-接头引入的估计产生每个mAb3.29个CP2-二烯。
表9.1 CP2-NHS mAb反应的总结
图9.2.在与AM-MMAE和PM-MMAE反应之前和之后，mAb-CP2-接头的还原型去糖基化质谱分析。将图谱放大以显示重链和轻链。
图9.3.mAb-CP2-接头马来酰亚胺基MMAE反应产物的还原型去糖基化质谱。将图谱放大以显示抗体重链。在每个峰上方指示缀合物质的数目。
表9.2 mAb-CP2-接头马来酰亚胺基-MMAE反应的总结a
Figure BDA0002280513920000783
a所有反应均在2.43mg/mL mAb-CP2-接头下进行4小时。
安装在抗体表面上的CP2二烯基团在室温下在4小时内与马来酰亚胺基-MMAE前药部分反应。通过质谱法未观察到非特异性缀合，因为从mAb-CP2-接头峰追踪到所有缀合物峰，而非未反应的mAb。该反应比呋喃二烯更有效，但与马来酰亚胺基-MMAE有效负载反应的效率低于CP1二烯。该方法可用于生物缀合物的生产。
实例10.mAb-CP2-接头与马来酰亚胺基-MMAE在1.0摩尔当量的马来酰亚胺基-MMAE与二烯基团下的缀合的动力学
评估CP2二烯与马来酰亚胺基MMAE在22℃下的反应动力学。
在mAb上引入CP2二烯官能团：通过赖氨酸伯胺与NHS-酯活化的CP2的反应将CP2官能团安装到IgG1 mAb上。该方法产生随机缀合的酰胺连接的环戊二烯基团。典型的mAb修饰反应描述如下。将Mab溶液用PBS pH 7.2调节至5mg/mL(3mL，15mg mAb，100nmol，1当量)，然后加入10％v/v 1M NaHCO3。将该溶液在冰上冷却，加入35μL CP2-NHS(10mM原液的DMAc溶液，350nmol，3.5当量)。反应在冰上进行5分钟，然后在室温下反应1小时并伴以持续混合。通过0℃下对PBS，1mM EDTA，pH 7.4透析(Slide-A-Lyzer，10kDa MWCO)24小时来纯化反应的mAb。通过如下所述的完整去糖基化质谱法定量CP2-接头引入，并且在该实例中发现为每个mAb3.29个CP2-接头(因此为二烯)，这对应于CP2-NHS向抗体缀合物的94％转化。
CP2修饰的mAb与马来酰亚胺基-MMAE的反应：将mAb-CP2-接头(3mg，3.29个CP2/mAb，66nmol CP2二烯，1当量)用PBS(pH 7.4)稀释至1.7mg/mL的最终浓度。接着，加入DMSO，得到20％v/v溶液，然后加入1M磷酸二氢钠，得到10％v/v溶液。加入所有溶液组分，得到包含1.3mg/mL mAb，32.3μM CP2二烯，1.78M DMSO，110mM磷酸钠，100mM NaCl，pH 5.5的混合物。将AM-MMAE或PM-MMAE(6.6μL的10mM原液的DMSO溶液，66nmol，1当量)加入抗体溶液中。将反应混合物短暂涡旋，并在22℃下进行混合。在不同时间点取出等分试样(180μL)并加入N-乙酰基半胱氨酸(3μL的100mM溶液，45当量)以淬灭未反应的马来酰亚胺基团。然后使用PD Spintrap G-25装置(通用电气医疗集团生命科学部(GE Healthcare Life Sciences))纯化样品以从混合物中除去小分子组分。然后通过如下所述的还原型去糖基化质谱法分析样品。
质谱分析：如实例1中所述分析样品。
CP2二烯-马来酰亚胺反应速率常数的计算：马来酰亚胺基-MMAE与mAb-CP2-接头中的CP2-二烯反应的二级速率常数由去糖基化还原型质谱中的峰强度确定。通过mAb-CP2-接头峰的消失和mAb-CP2-接头-MMAE缀合物峰的出现监测反应进程，但仅使用抗体重链上的mAb-CP2-接头峰强度来计算反应的CP2二烯的相对丰度。使用以下等式计算mAb重链上未反应的CP2二烯基团：
a＝未修饰重链的峰强度
b＝具有一个CP2二烯基团的重链的峰强度之和
c＝具有两个CP2二烯基团的重链的峰强度之和
d＝具有三个CP2二烯基团的重链的峰强度
e＝未修饰轻链的峰强度
f＝具有一个CP2二烯基团的轻链的峰强度之和
g＝具有两个CP2二烯基团的轻链的峰强度之和
以摩尔浓度为单位进一步分析缀合数据以确定动力学常数。由通过绘制1/[CP2二烯]对时间和线性回归分析产生的曲线的斜率确定二阶速率常数。使用下面所示的等式由二级反应速率常数计算反应半衰期：
Figure BDA0002280513920000802
k2＝二级速率常数
[CP2]0＝在时间＝0时的CP2二烯浓度
图10.1.在4小时和48小时处mAb-CP2-接头和AM-MMAE-反应的mAb-CP2-接头的还原型去糖基化质谱。将图谱放大以只显示重链。标记每个峰以指示缀合物质的数目。
图10.2.在4小时和48小时处mAb-CP2-接头和PM-MMAE-反应的CP2-mAb的还原型去糖基化质谱。将图谱放大以只显示重链。标记每个峰以指示缀合物质的数目。
图10.3.mAb-CP2-接头与马来酰亚胺基-MMAE的反应。A)未反应的CP2二烯随时间变化的摩尔浓度。每个mAb的未反应的CP2二烯由还原型去糖基化质谱的峰强度确定。B)用于计算反应速率的浓度倒数图。
表10.1 mAb-CP2-接头二烯与马来酰亚胺基-MMAE反应的动力学数据的总结a，b，c
Figure BDA0002280513920000811
a所有缀合反应在pH 5.5，20％DMSO，22℃和1.3mg/mL CP2-修饰的mAb下进行
b所用的MMAE∶CP2二烯的摩尔比为1∶1
c由48小时处测量的还原型去糖基化质谱的峰强度计算。
CP2二烯与马来酰亚胺基-MMAE的反应比CP1二烯更慢，半衰期为约数小时。与CP1二烯不同，苯基-与烷基-马来酰亚胺的反应速率没有差异。反应48小时后，AM-MMAE的反应转化率为90％，PM-MMAE仅为73％。考虑到两种底物的相似速率常数，一部分苯基马来酰亚胺可能在这些条件下延长时间后降解，因此限制了总转化率。
实例11.将CP2-NNAA引入抗体
将CP2-NNAA引入抗EphA2(1C1)抗体的位置K274或S239，对引入抗体后表达的mAb的质量和CP2-NNAA二烯的反应性进行评估。
CP2 NNAA原液的制备：将CP2 NNAA(0.5g，1.7mmol)与7.8mL 0.2M NaOH的H2O溶液合并。将所得浆液在室温下搅拌直至所有固体溶解(10分钟)。在完全溶解后，将浅黄色溶液通过0.2μm过滤器，等分，并储存在-80℃下直至使用。该过程产生8.2mL的216mM CP2 NNAA原液。
Figure BDA0002280513920000812
CP2-NNAA的结构
抗体表达：将在Fc位置K274或S239处具有琥珀突变的12G3H11或1C1 IgG1抗体基因克隆到专有的pOE抗体表达载体中。通过PEImax(1.5L的G22细胞)将构建体与编码PylRS双突变体(Y306A/Y384F)或野生型PylRS的质粒和含有tRNA表达盒(pORIP 9X tRNA)的串联重复的质粒转染到CHO-G22中。转染后4小时，将3.3％进料F9(专有)和0.2％进料F10(专有)加入细胞中，并将细胞在34℃下进一步温育。对于1C1 K274和1C1 S239转染的细胞，第二天加入CP2-NNAA，最终浓度为0.26mM。在第3天和第7天再次向细胞进料6.6％进料F9和0.4％进料F10。将细胞离心沉淀并在第11天收集上清液。通过IgSelect亲和柱(通用电气医疗集团生命科学部(GE Health Care Life Science))纯化上清液。抗体利用50mM甘氨酸，30mMNaCl，pH 3.5洗脱缓冲液洗脱，用1M Tris缓冲液pH 7.5中和，并透析到PBS pH 7.2中。通过280nm下的吸光度测量确定洗脱的抗体浓度。对于1C1 K274CP2-NNAA，反向计算的滴度为57mg/L，而1C1 S239CP2-NNAA为76mg/L。12G3H11 mAb以较小规模以类似方式表达，其中变化CP2-NNAA进料浓度。使用标准方法通过SDS-PAGE分析回收的抗体。还通过如下所述的尺寸排阻色谱和质谱分析抗体。引入CP2-NNAA的抗体表示为mAb-CP1-NNAA，以将其区别于mAb-CP2-接头构建体，或mAb-[位置]CP2-NNAA，其中[位置]表示突变为CP2-NNAA的氨基酸编号和氨基酸符号。
尺寸排阻色谱：使用配备有三重检测器阵列的Agilent 1100毛细管LC系统(维斯科泰克301，维斯科泰克，霍森市，德克萨斯州(Viscotek 301，Viscotek，Houson，TX))进行SEC分析；将波长设定为280nm，并使用100mM磷酸钠缓冲液pH 6.8以1mL/min的流速在TSK-GEL G3000SWXL柱(托索生物科学有限公司，蒙哥马利维尔，宾夕法尼亚州(TosoBioscience LLC，Montgomeryville，PA))上运行样品。
质谱分析：对于去糖基化的mAb分析，将EndoS(5μL Remove-iT EndoS(PBS中1∶10稀释，20,000个单位/mL，新英格兰生物实验室)与50μL样品(1mg/mL mAb)和5μL糖基缓冲液1(新英格兰生物实验室)合并，然后在37℃温育1小时。通过添加5μL Bond-Breaker TCEP溶液(0.5M，赛默飞世尔科技公司)并在37℃温育10分钟来制备还原样品。使用配备有RP-HPLC柱(ZORBAX 300Diphenyl RRHD，1.8微米，2.1mm×50mm)的Agilent 6520B Q-TOF质谱仪进行质谱分析。高效液相色谱(HPLC)参数如下：流速，0.5ml/min；流动相A为0.1％(v/v)甲酸的HPLC级H2O溶液，而流动相B为0.1％(v/v)甲酸的乙腈溶液。将柱在90％A/10％B中平衡，其也用于使mAb样品脱盐，然后在20％A/80％B中洗脱。在100-3000m/z，正极性，气体温度350℃，雾化器压力481b/in2，和毛细管电压5,000V下收集质谱数据。使用供应商提供的(Agilent v.B.04.00)MassHunter定性分析软件进行数据分析并将解卷积光谱的峰强度用于推导每个样品中物质的相对比例。
图11.1.在包含突变体或野生型tRS的哺乳动物细胞中表达后12G3H11 K274CP2-NNAA mAb的滴度和细胞活力。CP2-NNAA在培养基中的最终浓度如图例所示。具有突变体tRS的12G3H11 K274CP2-NNAA mAb表达与具有野生型tRS的叠氮基-赖氨酸相当，具有最小毒性。
表11.1 1C1 K274CP2-NNAA和1C1 S239CP2-NNAA mAb产生的总结
Figure BDA0002280513920000831
图11.2.去糖基化1C1 K274CP2-NNAA mAb的质谱分析。A)完整的mAb B)还原型mAb，经放大以显示轻链(LC)和重链(HC)。假定将两个CP2-NNAA引入完整mAb结构中，观察到的完整质量与计算的完整质量(147546.03)紧密匹配。假定将一个CP2-NNAA引入抗体重链中，观察到的重链质量与计算的重链质量(50325.93)紧密匹配。未观察到CP2-NNAA引入mAb轻链中。1C1野生型mAb的类似光谱如图11.4所示。
图11.3.去糖基化1C1 S239CP2-NNAA mAb的质谱分析。A)完整的mAb B)还原型mAb，经放大以显示轻链(LC)和重链(HC)。假定将两个CP2氨基酸引入完整mAb结构中，观察到的完整质量与计算的完整质量(147628.23)紧密匹配。假定将CP2-NNAA引入抗体重链中，观察到的重链质量与计算的重链质量(50367.03)紧密匹配。未观察到CP2-NNAA引入mAb轻链中。1C1野生型mAb的类似光谱如图11.4所示。
图11.4.去糖基化1C1野生型mAb的质谱分析。A)完整的mAb B)还原型mAb，经放大以显示轻链(LC)和重链(HC)。A)显示完整mAb的质量范围，B)显示轻链(LC)和重链(HC)的质量范围。
表11.2 1C1-K274CP2-NNAA和1C1-S239CP2-NNAA mAb的质谱数据的总结
Figure BDA0002280513920000841
图11.5. 1C1 K274CP2-NNAA mAb的SEC分析，其表明获得了单体产物。显示了高分子量物质(HMWS)。
图11.6. 1C1 S239CP2-NNAA mAb的SEC分析，其表明获得了单体产物。
图11.7. 1C1-K274CP2-NNAA mAb和1C1-S239CP2-NNAA mAb通过SDS-PAGE的分析。
通过质谱确认CP2-NNAA在位置K274和S239处引入抗体中。回收的抗体质量高，没有截短的产物和非常少的聚集体。考虑到进料到细胞的少量CP2-NNAA，1C1抗体的2L规模生产所达到的滴度相当高。
实例12.用1C1 K274CP2-NNAA和1C1 S239CP2-NNAA mAb制备和评估ADC
通过与AM-MMAE缀合评估抗EphA2(1C1)抗体在位置K274或S239处引入mAb后CP2-NNAA的反应性。评估得到的ADC以确定药物：抗体比率(DAR)，血清稳定性和体外细胞毒性。
CP2-mAb ADC的制备：简单地通过将抗体与烷基-马来酰亚胺MMAE(AM-MMAE)混合，一步制备CP2-NNAA mAb ADC。首先，用PBS(4mL总体积)将1C1-S239CP2-NNAA mAb溶液(8mg，53nmol，1当量)稀释至2mg/mL。分别加入DMSO(813μL)和1M磷酸二氢钠(407μL)，得到约20％和约10％v/v溶液。将AM-MMAE(53.3μL的10mM原液的DMSO溶液，533nmol，10当量)加入1C1-S239CP2-NNAA mAb溶液中并将混合物短暂涡旋。在持续混合下，反应在室温下进行7小时。加入N-乙酰基半胱氨酸(43μL的100mM原液水溶液，4.3μmol，80当量)，将溶液再温育15分钟以淬灭未反应的马来酰亚胺基团。然后将反应混合物用蒸馏水稀释3倍并进行CHT色谱(Bio-Scale Mini Cartridge CHT II型40μm介质柱)。用从缓冲液A(10mM磷酸盐，pH 7.0)至缓冲液B(10mM含有2M NaCl的磷酸盐pH 7.0)的梯度洗脱ADC，历时25分钟。在CHT色谱后，通过在4℃下在slide-a-lyzer盒中透析，将样品缓冲液交换到补充有1mM EDTA，pH 7.4的PBS。除了反应在室温下进行17小时外，以相同的方式将1C1-K274CP2-NNAA mAb与AM-MMAE缀合。
位点特异性半胱氨酸ADC的制备：对于一些实验，将mAb-CP2-NNAA ADC与半胱氨酸缀合的ADC进行比较。为此目的，产生在位置239处包含半胱氨酸的抗体(称为1C1-239C)。AM-MMAE与1C1-239C的缀合分三步进行；i)还原和透析，ii)氧化，iii)与AM-MMAE的反应。首先，通过将4mL 2.5mg/mL抗体在含有1mM EDTA(10mg抗体，66.7nM，1当量)的10mM PBS pH7.4中的溶液与53μL的50mM TCEP水溶液(2.7μmol，相对于mAb为40当量)合并，然后在37℃下温和混合3小时以轻度还原抗体，从而产生游离巯基。将还原的抗体转移至slide-a-lyzer透析盒(10K MWCO)，并用PBS，1mM EDTA，pH7.4，4℃透析24小时，同时改变几次缓冲液。通过加入脱氢抗坏血酸(27μL的50mM原液的DMSO溶液，1.3μmol，20当量)，然后在室温下混合4小时，将还原的抗体氧化以重新形成内部二硫化物。将氧化的抗体溶液与20％v/vDMSO合并，然后加入AM-MMAE(53μL的10mM原液的DMSO溶液，530nmol，8当量)。在混合下，使反应在室温下进行1小时，然后加入N-乙酰基半胱氨酸(43μL的100mM原液水溶液，4.2μmol，64当量)以淬灭未反应的马来酰亚胺。然后将反应混合物用蒸馏水稀释3倍，并如上所述进行CHT色谱和透析。
图12.1.mAb-CP2-NNAA ADC和mAb-239C ADC的产生，以及AM-MMAE的结构。注意，mAb-CP2-NNAA ADC的产生在一步中实现，而mAb-239C ADC的产生分4个步骤发生。(B)中描述的R基团可以是内源性含硫醇的小分子，例如半胱氨酸。
质谱分析：如实例1中所述分析样品。
HIC色谱分析：在室温下，使用蛋白质组学HIC丁基NPS柱(4.6x 35mm，5μm，Sepax)通过尺寸排阻色谱法分析ADC，在22分钟内用100％A至100％B的梯度洗脱(流动相A：25mMTris pH 8.0，1.5M(NH4)2SO4，流动相B：25mM Tris pH 8.0，5％(v/v)异丙醇)。通过280nm处的UV吸光度检测蛋白质。每次分析注射约50-100μg蛋白质。
rRP-HPLC分析：对于每次分析，使用42mM二硫苏糖醇(DTT)在PBS pH 7.2中的溶液将抗体和ADC在37℃下还原20分钟。将10μg还原抗体和ADC加载到PLRP-S，
Figure BDA0002280513920000861
柱(2.1x50mm，Agilent)上，并在40℃以0.5mL/min的流速洗脱，梯度为5％B至100％B，历时25分钟(流动相A：0.1％三氟乙酸水溶液，和流动相B：0.1％三氟乙酸的乙腈溶液)。使用来自色谱图的积分峰面积确定缀合百分比。
ADC的血清稳定性：将ADC在大鼠血清中温育以挑战狄尔斯-阿尔德缀合物的稳定性。将ADC加入正常大鼠血清(杰克逊免疫研究公司)中以达到0.2mg/mL(1.33μM抗体)的最终浓度，加入血清的ADC溶液总体积小于10％。将ADC-血清混合物无菌过滤，从该混合物中取出等分试样并冷冻作为t＝0对照。然后将剩余的样品在37℃下在密封容器中进一步温育而不伴以搅拌。使用Fc特异性抗人IgG-琼脂糖树脂(西格玛-奥德里奇公司)通过免疫沉淀从大鼠血清中回收缀合和未缀合的人抗体。用PBS冲洗树脂两次，用IgG洗脱缓冲液冲洗一次，然后用PBS再冲洗两次。然后将ADC-小鼠血清样品与抗人IgG树脂(100μL ADC-血清混合物，50μL树脂浆液)合并，并在室温下混合15分钟。通过离心回收树脂，然后用PBS洗涤两次。将洗涤的树脂重悬于100μL IgG洗脱缓冲液(赛默飞世尔科技公司)中，并在室温下进一步温育5分钟。离心除去树脂，然后向上清液中加入20μL 10X糖基缓冲液1(新英格兰生物实验室)。将回收的人抗体溶液无菌过滤，并与EndoS在37℃温育1小时。然后用TCEP还原去糖基化的mAb，并如上所述通过LC/MS分析。从质谱的峰高确定缀合的抗体百分比。
体外细胞毒性分析：人前列腺癌细胞系PC3获自美国典型培养物保藏中心(ATCC)。在37℃下，在5％CO2中，将PC3细胞维持在补充有10％热灭活的胎牛血清(HI-FBS)(生命科技公司(Life Technologies))的RPMI1640培养基(生命科技公司(Life Technologies))中。使细胞生长至指数生长期，通过温和胰蛋白酶消化收获，并以1500个细胞/孔接种到96孔培养板中。使细胞粘附24小时，然后用抗体和ADC处理，从4000ng/mL开始，以9种浓度一式两份进行4倍连续稀释。将处理过的细胞培养6天，并按照制造商的方案使用CellTiter-Glo发光活力测定(普洛麦格公司(Promega))测定细胞活力。将细胞活力计算为对照未处理细胞的百分比。通过Prism软件(GraphPad)使用逻辑非线性回归分析确定ADC的细胞毒性的IC50。
图12.2.与AM-MM反应之前和之后mAb-CP2-NNAA和mAb-半胱氨酸的还原型糖基化质谱分析。将图谱放大以显示mAb重链。指示了ADC样品的药物：抗体比率(DAR)0和1峰，对每种构建体预期每个重链一种药物(DAR1)。
图12.3.在与AM-MMAE反应之前和之后mAb-CP2-NNAA和mAb-半胱氨酸的还原型糖基化质谱分析。将图谱放大以显示mAb轻链。未检测到AM-MMAE轻链缀合物，这表明缀合对mAb重链是位点特异性。
表12.1通过质谱法表征mAb-CP2-NNAA ADC的总结a
Figure BDA0002280513920000871
a通过糖基化还原型质谱分析amAb重链
b由缀合和非缀合物质的相对峰高计算得出
图12.4.mAb-CP2-NNAA和mAb-半胱氨酸ADC的疏水相互作用色谱分析。对应于1C1CP2-NNAA的保留时间的峰的消失和具有增加的保留时间的峰的出现表明AM-MMAE与mAb的缀合。注意，对于1C1 K274CP2-NNAA，检测到ADC DAR 1和DAR 2物质。
图12.5.mAb-CP2-NNAA和mAb-半胱氨酸ADC的还原型反相高效色谱分析。ADC中重链峰的消失和保留时间较长的峰的出现表明AM-MMAE与重链的缀合。缀合前后轻链(LC)峰保留时间没有变化，这表明缀合对mAb重链具有特异性。
表12.2通过色谱方法表征ADC的总结
Figure BDA0002280513920000881
a由缀合和非缀合物质之间的相对峰面积计算得出
图12.6.mAb-CP2-NNAA和mAb-半胱氨酸ADC的还原型SDS-PAGE分析。
图12.7.在37℃下在大鼠血清中温育7天之前和之后mAb-CP2-NNAA ADC的还原型去糖基化质谱分析。将质谱放大以仅显示重链(HC)。血清温育的样品(D和H)中未缀合的HC信号的缺乏表明狄尔斯-阿尔德缀合物是稳定的。
图12.8.在37℃下在大鼠血清中温育7天之前和之后mAb-CP2-NNAA ADC DAR的定量。DAR由图12.7中所示的质谱的峰高计算。将值报告为平均值±标准偏差，n＝3。在这些条件下未检测到药物损失。
图12.9.mAb-CP2-NNAA和mAb-半胱氨酸ADC对体外PC3癌细胞的细胞毒性。mAb-CP2-NNAA AM-MMAE ADC表现出与通过AM-MMAE的位点特异性半胱氨酸缀合制备的类似ADC相似的效力。
CP2-NNAA二烯与AM-MMAE上含有的马来酰亚胺反应，具有类似的半胱氨酸巯基转化率。制备mAb-CP2-NNAA ADC与mAb-半胱氨酸ADC的关键差异在于缀合过程中步骤数的减少。半胱氨酸mAb需要3步和2天来产生，而CP2-NNAA mAb ADC在不到24小时内以一步产生。得到的mAb-CP2-NNAA ADC在生理学相关条件下是稳定的，并且当在37℃下在大鼠血清中温育7天时没有显示药物损失。CP2-NNAA mAb ADC在体外是有效的，具有与通过位点特异性半胱氨酸缀合制备的ADC类似的活性。
实例13.环戊二烯和含呋喃化合物的合成。
材料和方法：除非另有说明，否则使用试剂级溶剂在N2气氛下进行反应。将DCM和甲苯储存在
Figure BDA0002280513920000882
分子筛上。使THF通过活性氧化铝柱。所有商业获得的试剂均按原样使用。用E.Merck硅胶60F254预涂板(0.25mm)进行薄层色谱(TLC)，并通过暴露于UV光(254nm)观察或用对茴香醛、茚三酮或高锰酸钾染色。使用正相硅胶(
Figure BDA0002280513920000883
0.040-0.063mm，Geduran)进行快速柱色谱。在Varian光谱仪(400、500或600MHz)上记录1H NMR光谱，并相对于氘代溶剂信号报告。1H NMR光谱的数据报告如下：化学位移(δppm)、多重性、偶合常数(Hz)和积分。在Varian光谱仪(100、125或150MHz)上记录13C NMR光谱。13C NMR光谱的数据以化学位移(δppm)表示。质谱是从具有场解吸(FD)源的(沃特世有限公司(Waters Corp.))GCT高级高分辨率飞行时间质谱仪上的UC Santa Barbara质谱设施获得的。
CP3-NHS(13)的合成
Figure BDA0002280513920000891
琥珀酸2，5-二氧代吡咯烷-1-基(1，2，3，4，5-五甲基环戊-2，4-二烯基)甲酯(13)：
将DCM(8mL)加入含有(1，2，3，4，5-五甲基环戊-2，4-二烯基)甲醇1(0.33g，2.0mmol，1当量)的小瓶中。加入Et3N(0.64mL，4.6mmol，2.3当量)，DMAP(46mg，0.38mmol，0.2当量)和琥珀酸酐(0.46g，4.6mmol，2.3当量)，将反应物在空气气氛下封端，并室温下搅拌过夜。用H2O(1mL)淬灭反应，然后倒入分液漏斗中。加入HCl(1M，50mL)并用DCM(2×50mL)萃取。合并有机层，用盐水(50mL)洗涤，用Na2SO4干燥，过滤，并且除去溶剂，得到4-氧代-4-((1，2，3，4，5-五甲基环戊-2，4-二烯基)甲氧基)丁酸，将其直接用于下一反应。
Rf(EtOAc)∶0.24；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ3.98(s，2H)，2.64-2.59(m，2H)，2.59-2.54(m，2H)，1.76(s，6H)，1.74(s，6H)，0.95(s，3H)ppm。
将THF(10mL)加入含有4-氧代-4-((1，2，3，4，5-五甲基环戊-2，4-二烯基)甲氧基)丁酸(约2mmol)的小瓶中。加入NHS(0.61g，5.3mmol，2.7当量)，EDC·HCl(0.87g，4.6mmol，2.3当量)和DCM(6mL)，将反应物在空气气氛下封端，并在室温下搅拌过夜。除去溶剂，将残余物进行快速柱色谱(己烷∶EtOAc，3∶1→2∶1)，得到7(0.39g，55％，分两步)，呈白色固体。
Rf(己烷∶EtOAc，7∶3)∶0.27；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ4.00(s，2H)，2.89(t，J＝6.7Hz，2H)，2.85(br.s.，4H)，2.67(t，J＝7.8Hz，2H)，1.77(s，6H)，1.74(s，6H)，0.95(s，3H)ppm；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ170.7，168.9，167.6，138.4，135.0，68.2，55.3，28.6，26.2，25.5，16.8，11.0，10.1ppm；IR(ATR)2973，2935，1815，1782，1729，1208，1089，1069，967cm-1；C19H25NO6[M]+的HRMS(EI)准确质量计算值：363.1682，实测值：363.1676。
F2-NHS(17)的合成
Figure BDA0002280513920000901
9，9-二乙氧基-6-羟基壬-7-炔酸甲酯(14)：
将3，3-二乙氧基丙-1-炔(0.72mL，5.0mmol，1当量)加入THF(15mL)中，然后冷却至-78℃。逐滴加入nBuLi(2.33M己烷溶液，2.4mL，5.5mmol，1.1当量)，然后将反应混合物在-78℃下再搅拌30分钟。逐滴加入溶解在THF(5mL)中的6-氧代己酸甲酯(0.87g，6.0mmol，1.2当量)，然后将反应混合物在-78℃下搅拌1小时。将反应混合物倒入含有饱和碳酸氢钠水溶液(100mL)的分液漏斗中，然后用Et2O(2×50mL)萃取。将合并的有机层用盐水(50mL)洗涤，经MgSO4干燥，过滤，除去溶剂，并将残余物进行快速柱色谱(己烷∶EtOAc，2∶1)，得到14(1.1g，80％)，呈一种透明无色油状物。
Rf(己烷∶EtOAc，6∶4)∶0.41；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ5.28(d，J＝1.6Hz，1H)，4.47-4.36(m，J＝3.5Hz，1H)，3.76-3.67(m，2H)，3.67-3.63(m，3H)，3.56(qd，J＝7.0，9.4Hz，2H)，2.34-2.27(m，3H)，1.76-1.59(m，4H)，1.54-1.42(m，2H)，1.21(t，J＝7.0Hz，6H)ppm；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ174.0，91.2，86.2，80.0，61.8，60.8，60.8，51.5，36.9，33.8，24.6，24.4，15.0ppm；IR(ATR)3451，2932，1736，1437，1328，1135，1051，1012cm-1；C14H23O5[M-H]+的HRMS(EI)准确质量计算值：271.1545，实测值：271.1546。
5-(3-甲氧基呋喃-2-基)戊酸甲酯(15)：
将MeOH(3.9mL)加入含有14(1.06g，3.89mmol，1当量)的小瓶中。加入PPh3AuNTf2(29mg，0.039mmol，0.01当量)，将反应物在空气气氛下封端，并在室温下搅拌过夜。将反应混合物倒入含有盐水(50mL)的分液漏斗中，然后用DCM(2×50mL)萃取。将合并的有机层用盐水(50mL)洗涤，用Na2SO4干燥，过滤，除去溶剂，并将残余物进行快速柱色谱(己烷∶EtOAc，15∶1→9∶1)，得到15(0.35g，43％)，呈一种透明无色油状物。
Rf(己烷∶EtOAc，9∶1)∶0.35；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.11(d，J＝2.0Hz，1H)，6.27(d，J＝2.0Hz，1H)，3.72(s，3H)，3.66(s，3H)，2.61(t，J＝6.8Hz，2H)，2.33(t，J＝7.2Hz，2H)，1.69-1.60(m，4H)ppm；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ174.1，143.3，139.2，138.9，102.9，59.4，51.4，33.7，27.5，24.5，24.3ppm；IR(ATR)2950，1734，1662，1600，1230，1179，1111cm-1；C11H16O4[M]+的HRMS(EI)准确质量计算值：212.1049，实测值：212.1045。
Figure BDA0002280513920000911
5-(3-甲氧基呋喃-2-基)戊酸(16)：
向含有溶解在MeOH(4mL)中的15(0.331g，1.56mmol，1当量)的小瓶中加入NaOH(0.125g，3.12mmol，2当量)在H2O(4mL)中的溶液。将反应物在空气气氛下封端，并在室温下搅拌30分钟。将反应混合物倒入含有H2O(50mL)的分液漏斗中，加入HCl(1M H2O溶液)至pH2-3(约4mL)。用DCM(2×50mL)萃取水层。将合并的有机层用盐水(50mL)洗涤，用Na2SO4干燥，过滤，除去溶剂，得到16(0.280g，90％)，呈一种透明无色油状物。
Rf(己烷∶EtOAc，1∶1)∶0.55；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ10.37(br.s.，1H)，7.12(d，J＝2.0Hz，1H)，6.28(d，J＝2.0Hz，1H)，3.73(s，3H)，2.62(t，J＝6.5Hz，2H)，2.38(t，J＝6.5Hz，2H)，1.73-1.61(m，4H)ppm；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ179.8，143.4，139.1，139.0，102.9，59.4，33.7，27.4，24.4，24.0ppm；IR(ATR)3133，2940，1706，1662，1454，1411，1279，1236，1109cm-1；C10H14O4[M]+的HRMS(EI)准确质量计算值：198.0892，实测值：198.0890。
Figure BDA0002280513920000912
5-(3-甲氧基呋喃-2-基)戊酸2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯(17)：
将THF(5mL)加入含有16(0.265g，1.34mmol，1当量)的小瓶中。加入NHS(0.216g，1.87mmol，1.4当量)，EDC·HCl(0.308g，1.61mmol，1.2当量)和DCM(3mL)，将反应物在空气气氛下封端，并在室温下搅拌过夜。除去溶剂，将残余物进行快速柱色谱(己烷∶EtOAc，2∶1→1∶1)，得到17(0.293g，74％)，呈一种无色粘性油状物。
Rf(己烷∶EtOAc，2∶1)∶0.33；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.11(d，J＝2.0Hz，1H)，6.27(d，J＝2.0Hz，1H)，3.72(s，3H)，2.82(br.s.，4H)，2.69-2.54(m，4H)，1.81-1.60(m，4H)ppm；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ169.1，168.5，143.5，139.1，138.7，102.8，59.3，30.5，27.0，25.5，24.2，23.8ppm；IR(ATR)2948，1814，1735，1638，1413，1206，1058，1046cm-1；C14H17NO6[M]+的HRMS(EI)准确质量计算值：295.1056，实测值：295.1062。
CP1b-NHS(19)的合成
3-(环戊-1，3-二烯基)丙酸和3-(环戊-1，4-二烯基)丙酸(12)：
将3-澳丙酸乙酯(1.65mL，12.9mmol，1当量)加入THF(30mL)中并冷却至-78℃。在5分钟内逐滴加入环戊二烯基钠(2M THF溶液，6.45mL，12.9mmol，1当量)，并将反应在-78℃下搅拌3.5小时。将反应物倒入DCM(20mL)中并加入硅胶(6g)。将反应混合物用DCM(100mL)通过硅胶过滤，除去溶剂，得到3-(环戊二烯基)丙酸乙酯异构体，呈黄色油状物。
光谱数据与文献报道的数据相匹配。3
Rf(己烷∶EtOAc，9∶1)∶0.45；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ6.47-6.02(m，3H)，4.17-4.11(m，2H)，2.96(s，0.31H)，2.91(d，J＝1.4Hz，1.69H)，2.78-2.68(m，J＝1.7Hz，2H)，2.59-2.53(m，2H)，1.26(t，J＝7.1Hz，3H)。
向溶解在EtOH(20mL)中的3-(环戊二烯基)丙酸乙酯异构体(约12.9mmol)溶液中加入NaOH(2.0g，50mmol，3.9当量)在H2O(20mL)中的溶液。将反应物在室温下搅拌15分钟。将反应混合物倒入含有H2O(50mL)和DCM(50mL)的分液漏斗中。将水层用HCl(1M H2O溶液)酸化至pH 2(约70mL)。分离各层，然后用DCM(50mL)萃取水层。将合并的有机层用盐水(50mL)洗涤，用Na2SO4干燥，过滤，除去溶剂，得到18(0.50g，28％，分两步)，呈棕色固体。
Rf(己烷∶EtOAc，1∶2)∶0.69；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ10.57(br.s.，1H)，6.49-6.02(m，3H)，2.97(d，J＝1.6Hz，1.07H)，2.92(d，J＝1.2Hz，0.93H)，2.82-2.68(m，2H)，2.68-2.58(m，2H)ppm；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ179.7，179.7，147.1，144.9，134.2，134.1，132.3，131.1，127.0，126.4，43.3，41.3，33.9，33.3，25.5，24.7ppm；IR(ATR)3070，2926，1705，1412，1283，1205，913cm-1；C8H10NO2[M]+的HRMS(EI)准确质量计算值：138.0681，实测值：138.0678。
Figure BDA0002280513920000931
3-(环戊-1，3-二烯基)丙酸2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯和3-(环戊-1，4-二烯基)丙酸2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯(19)：
将THF(10mL)加入含有18(0.460g，3.33mmol，1当量)的小瓶中。加入NHS(0.537g，4.66mmol，1.4当量)，EDC·HCl(0.766g，4.00mmol，1.2当量)和DCM(6mL)，将反应物在空气气氛下封端，并在室温下搅拌过夜。除去溶剂，将残余物进行快速柱色谱(己烷∶EtOAc，2∶1→1∶1)，得到19(0.438g，56％)，呈一种蛋壳粉末。
Rf(己烷∶EtOAc，2∶1)∶0.29；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ6.47-6.08(m，3H)，2.97(d，J＝1.2Hz，1.2H)，2.92(d，J＝1.6Hz，0.8H)，2.90-2.75(m，8H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ169.1，168.2，168.1，145.7，143.9，134.4，133.8，132.2，131.4，127.7，127.1，43.2，41.4，30.8，30.2，25.5，25.3，24.5；IR(ATR)2947，1810，1779，1735，1420，1366，1204，1062，1046cm-1；C12H13NO4[M]+的HRMS(EI)准确质量计算值：235.0845，实测值：235.0848。
使用Cp*Li和3-澳丙酸乙酯合成五甲基环戊二烯(CP3)NHS衍生物的尝试失败，而不是消除丙烯酸乙酯。CP*Li与澳乙酸甲酯的反应是成功的，但在酯水解和再酸化后，化合物经历了意外的环化。我们的第三种策略使用Boydston(1，2，3，4，5-五甲基环戊-2，4-二烯基)甲醇，1其与琥珀酸酐反应生成中间体酸，其不经进一步纯化即可使用。与EDC·HCl和N-羟基琥珀酰亚胺的反应产生NHS酯13。
呋喃(F2)NHS衍生物的设计和合成的灵感来自Sheppard对3-烷氧基呋喃的研究。2将3，3-二乙氧基丙-1-炔的锂盐加入到6-氧代己酸甲酯中形成醇14，使用催化金(I)的甲醇溶液将其环化，得到3-甲氧基呋喃15。将15的酯水解，然后与EDC·HCl和N-羟基琥珀酰亚胺反应得到NHS酯17。
不含内酯(CP1b)的CP1 NHS衍生物的合成始于NaCP与3-澳丙酸乙酯的反应，然后酯水解以得到酸12。与EDC·HCl和N-羟基琥珀酰亚胺的反应得到NHS酯19。CP1和CP1b之间的结构差异如图13.1所示。
图13.1.A)CP1-NHS和B)CP1b-NHS接头中酯位置的总结。
1.Peterson，G.I.；Church，D.C.；Yakelis，N.A.；Boydston，A.J.，1，2-oxazinelinker as a thermal triggerfor self-immolative polymers[1，2-恶嗪接头作为自我牺牲聚合物的热触发剂].Polymer[聚合物]2014，55，5980-5985。
2.Foster，R.W.；Benhamou，L.；Porter，M.J.；
Figure BDA0002280513920000941
D.-K.；Hailes，H.C.；Tame，C.J.；Sheppard，T.D.，Irreversible endo-Selective Diels-Alder Reactions ofSubstituted Alkoxyfurans：A General Synthesis of endo-Cantharimides[取代烷氧基呋喃的不可逆内切选择性狄尔斯-阿尔德反应：内甲基斑蝥胺的一般合成].Chemistry[化学](Weinheim an Der Bergstrasse，德国)2015，21，6107-6114。
3.
Figure BDA0002280513920000942
J.；Mukhopadhyay，A.；Santos-Silva，T.；M.J.；
Figure BDA0002280513920000944
C.C.，Ring-Functionalized Molybdenocene Complexes[环官能化的茂钼配合物].Organometallics[有机金属化合物]2009，28，2871-2879。
实例14.用接头修饰的抗体制备的ADC的评估。
评估了通过AM-MMAE与接头修饰的抗体的狄尔斯-阿尔德缀合产生的ADC的稳定性和效力。将狄尔斯-阿尔德缀合物与半胱氨酸缀合物进行比较。
材料。使用标准分子生物学方法表达和纯化所有抗体(IgG1形式)。除非另有说明，否则所有试剂均购自商业供应商。呋喃-2-基甲基琥珀酰胺酸NHS酯(F1-NHS)和马来酰亚胺基己酰基-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄氧基羰基-单甲基-奥瑞他汀-E(AM-MMAE)购自合成化学有限公司(SynChem，Inc.)(麋鹿林村，伊利诺伊州(Elk Grove Village，IL))。
mAb-接头缀合物的制备：通过上述含NHS酯的接头17和19(F2和CP1b)与赖氨酸胺的反应，将二烯官能团随机引入抗体中。通过反应中使用的NHS-接头的量来控制mAb修饰的程度，并且根据实验靶向不同的接头密度。用CP1修饰mAb的一般程序描述如下：首先，用PBSpH 7.2将mAb溶液调节至5mg/mL(3mL，15mg mAb，100hmol，1当量)，然后加入10％v/v 1MNaHCO3。将该溶液在冰上冷却，加入30μL CP1b-NHS(10mM原液的DMAc溶液，300nmol，3当量，也称为CP1-接头)。反应在冰上进行5分钟，然后在室温下反应1小时并伴以持续混合。通过4℃下对PBS，1mM EDTA，pH 7.4透析(Slide-A-Lyzer，10kDa MWCO)24小时来纯化反应的mAb。通过如下所述的完整去糖基化质谱法定量CP1-接头引入。
方案14.1mAb-CP1b-接头和mAb-F2-接头缀合物的制备。
ADC的制备：使用经由接头的狄尔斯-阿尔德缀合和直接缀合至抗体半胱氨酸硫醇，由赫赛汀(中靶)或IgG-1同种型对照-1(脱靶)mAb制备抗体药物缀合物。狄尔斯-阿尔德ADC由CP1b-NHS(化合物19)和F2-NHS(化合物17)接头修饰的抗体制备，使用如下针对mAb-CP1b-接头所述的相同的一般程序：用PBS，pH 7.4将mAb-CP1b-接头(10mg，67nmol，1当量)稀释至4.27mg/mL，然后分别加入DMSO(493μL)和1M磷酸二氢钠(247μL)，得到约20％和10％v/v溶液。将AM-MMAE(53.3μL的10mM原液的DMSO溶液，530nmol，8当量)加入抗体溶液中，并在室温下在混合下继续反应4小时。加入N-乙酰基半胱氨酸(43μL的100mM水溶液，4.3μmol，64当量)以淬灭未反应的马来酰亚胺。使用CHT色谱法从反应混合物中纯化ADC。将ADC溶液用蒸馏水稀释3倍并加载到Bio-Scale Mini Cartridge CHT II型40μm介质柱上。用从缓冲液A(10mM磷酸盐，pH 7.0)至缓冲液B(10mM含有2M NaCl的磷酸盐pH 7.0)的梯度洗脱ADC，历时25分钟，流速为5mL/min。在CHT色谱后，使用slide-a-lyzer盒在4℃下将ADC样品缓冲液交换至PBS。对于用mAb-F2-接头构建体制备的ADC遵循相同的程序，除了AM-MMAE缀合反应在室温下持续24小时。注意，与AM-MMAE反应之前每种mAb的二烯含量在表14.1中提供。用于缀合反应的相对于mAb的8当量的AM-MMAE对应于相对于二烯的约2摩尔当量的AM-MMAE。
还通过将AM-MMAE缀合至抗体铰链区中包含的半胱氨酸硫醇来制备ADC。首先，用含有1mM EDTA的PBS将抗体(10mg，67nmol，1当量)溶液调节至2.5mg/mL。接下来，加入TCEP(10μL的50mM水溶液，500nmol，7.5当量)以还原铰链二硫化物，并将混合物在37℃下在混合下温育1小时。接着，加入DMSO(410μL，10％v/v反应最终浓度)，并在混合下，在室温下继续反应1小时。加入N-乙酰基半胱氨酸以淬灭未反应的马来酰亚胺基团，并如上所述通过CHT色谱法和透析纯化ADC。通过缀合至铰链半胱氨酸制备的ADC在名称中用Cys表示，例如：赫赛汀-Cys-MMAE。
rRP-HPLC分析：对于每次分析，使用42mM二硫苏糖醇(DTT)在PBS pH 7.2中的溶液将抗体和ADC在37℃下还原20分钟。将10μg还原抗体和ADC加载到PLRP-S，
Figure BDA0002280513920000961
柱(2.1x50mm，Agilent)上，并在40℃下以0.5mL/min的流速洗脱，梯度为5％B至100％B，历时60分钟(流动相A：0.1％三氟乙酸水溶液，和流动相B：0.1％三氟乙酸的乙腈溶液)。使用来自色谱图的积分峰面积确定缀合百分比。
尺寸排阻色谱分析：使用配备有三重检测器阵列的Agilent 1100毛细管LC系统(维斯科泰克301，维斯科泰克，霍森市，德克萨斯州(Viscotek 301，Viscotek，Houson，TX))进行SEC分析；将波长设定为280nm，并使用100mM磷酸钠缓冲液，10％异丙醇，pH 6.8以1mL/min的流速在TSK-GEL G3000SWXL柱(托索生物科学有限公司，蒙哥马利维尔，宾夕法尼亚州(Toso Bioscience LLC，Montgomeryville，PA))上运行样品(50μg)。
血清稳定性分析：将ADC在大鼠血清中温育以挑战抗体-有效负载连接的稳定性。将ADC加入正常大鼠血清(杰克逊免疫研究公司)中以达到0.2mg/mL(1.33μM抗体)的最终浓度，加入血清的ADC溶液总体积小于10％。将ADC-血清混合物无菌过滤，从该混合物中取出等分试样并冷冻作为t＝0对照。然后将剩余的样品在37℃下在密封容器中进一步温育7天。使用Fc特异性抗人IgG-琼脂糖树脂(西格玛-奥德里奇公司)通过免疫沉淀从大鼠血清中回收缀合和未缀合的人抗体。用PBS冲洗树脂两次，用IgG洗脱缓冲液冲洗一次，然后用PBS再冲洗两次。然后将ADC-小鼠血清样品与抗人IgG树脂(100μL的ADC-血清混合物，50μL树脂浆液)合并，并在室温下混合15分钟。通过离心回收树脂，然后用PBS洗涤两次。将洗涤的树脂重悬于100μL IgG洗脱缓冲液(赛默飞世尔科技公司)中，并在室温下进一步温育5分钟。离心除去树脂，然后向上清液中加入20μL 10X糖基缓冲液1(新英格兰生物实验室)。将回收的人抗体溶液无菌过滤，并与EndoS在37℃温育1小时。然后用TCEP还原去糖基化的mAb，并如上所述通过LC/MS分析。如实例12所述从质谱的峰高确定缀合的抗体百分比。
质谱分析：如实例1中所述分析样品。
体外细胞毒性分析：SKBR3和N87癌细胞系获自美国典型培养物保藏中心(ATCC)。在37℃下，在5％CO2中，将细胞维持在补充有10％热灭活的胎牛血清(HI-FBS)(生命科技公司(Life Technologies))的RPMI 1640培养基(生命科技公司(Life Technologies))中。使在指数生长期收获的SKBR3和NCI-N87细胞以2500和2000个细胞/孔接种到96孔培养板中并使其粘附过夜。然后在第二天用ADC处理细胞，从4000和64,000ng/mL(9个浓度)一式两份进行4倍连续稀释。将处理过的细胞培养6天，并按照制造商的方案使用CellTiter-Glo发光活力测定(普洛麦格公司(Promega))测定细胞活力。将细胞活力计算为未处理对照细胞的百分比。通过Prism软件(GraphPad)使用逻辑非线性回归分析确定IC50值。
体内肿瘤生长抑制：用F2和CP1b接头修饰的mAb制备的赫赛汀-MMAE ADC在小鼠皮下N87异种移植模型中进一步评估体内抗肿瘤活性。通过将N87细胞(50％基质胶中的5百万个N87细胞)皮下接种到4-6周龄雌性无胸腺裸鼠中来制备肿瘤。当肿瘤达到约200mm3时，将小鼠随机分成组，每组5只小鼠。以指定剂量静脉内施用ADC，并在细胞接种后第5天给药。用卡尺每周两次测量肿瘤尺寸(长轴和短轴)。使用以下等式计算肿瘤体积：
Figure BDA0002280513920000971
其中，
a＝肿瘤长轴，单位mm
b＝肿瘤短轴，单位mm
图14.1.mAb-CP1b-接头缀合物的质谱分析。峰上方的数字表示与mAb缀合的接头(B和E)或AM-MMAE(C和F)的数目。在分析之前，所有样品用EndoS去糖基化。
图14.2.mAb-F2-接头缀合物的质谱分析。峰上方的数字表示与mAb缀合的接头(B和E)或AM-MMAE(C和F)的数目。在分析之前，所有样品用EndoS去糖基化。
图14.3.mAb-半胱氨酸缀合物的质谱分析。指出了mAb轻链(LC)和重链(HC)(A-D)，以及缀合的AM-MMAE的数目(B和D)。所有样品用EndoS去糖基化并在分析前还原。
图14.4.mAb、mAb-接头缀合物和ADC的rRP-HPLC分析。指出了mAb轻链和重链，对于ADC样品还指出了与mAb缀合的AM-MMAE的数目。
图14.5.mAb、mAb-接头缀合物和ADC的SEC分析。显示了高分子量物质(HMWS)。
图14.6.A)在大鼠血清中温育7天后，ADC的还原型去糖基化的质谱分析。将图谱放大以仅显示重链。将药物损失表示为DAR-1和DAR-2物质峰高相对于DAR-0峰高度的降低。B)使用质谱数据定量剩余药物(％)。将数据显示为平均值+/-标准偏差，n＝3。
图14.7.ADC对A)NCI-N87细胞和B)SKBR3细胞的体外活性。
图14.8.赫赛汀-接头MMAE ADC对小鼠皮下N87肿瘤模型的肿瘤生长抑制活性。
表14.1接头缀合的和半胱氨酸缀合的ADC的总结
Figure BDA0002280513920000981
Figure BDA0002280513920000991
a在没有接头的情况下制备的ADC与天然半胱氨酸缀合
表14.2接头缀合的和半胱氨酸缀合的ADC的体外效力。
a由MS计算的平均DAR以及表14.1中报道的rRP-HPLC值
通过马来酰亚胺-MMAE与赫赛汀和IgG同种型对照mAb的狄尔斯-阿尔德反应或迈克尔加成来制备ADC。通过交联剂将狄尔斯-阿尔德反应性基团引入赖氨酸胺，然后与AM-MMAE反应，而AM-MMAE与天然半胱氨酸硫醇发生迈克尔加成(称为Cys-ADC)。两种缀合方法均产生异质ADC，其药物含量为每mAb 3-4个MMAE药物。
AM-MMAE对CP1b-和F2接头-修饰的mAb的狄尔斯-阿尔德加成是有效的，通过质谱确认了几乎定量的转化率。此外，如SEC分析所示，用环戊二烯或甲氧基-呋喃接头修饰mAb并随后通过狄尔斯-阿尔德反应附接AM-MMAE不会增加缀合物产物中的聚集体含量。总的来说，狄尔斯-阿尔德缀合产生的ADC具有高质量。
通过质谱分析大鼠血清中的ADC稳定性证明，用mAb-CP1b-接头和mAb-F2-接头制备的狄尔斯-阿尔德构建体比通过与半胱氨酸硫醇迈克尔加成产生的构建体更稳定。在37℃下在大鼠血清中温育7天导致mAb-半胱氨酸ADC的60％药物损失，而mAb-CP1b-接头和mAb-F2-接头ADC在相同条件下显示小于10％的药物损失。
赫赛汀mAb-CP1b-接头和赫赛汀mAb-F2-接头ADC是针对Her2阳性N87和SKBR3细胞系的细胞增殖的有效抑制剂，IC50值与相应的半胱氨酸连接的ADC相似。非靶向同种型对照ADC比中靶赫赛汀构建体的效力低2000-4000倍，对狄尔斯-阿尔德和半胱氨酸ADC构建体观察到相似的体外效力。最后，用CP1b和F2接头修饰的mAb制备的赫赛汀ADC是体内肿瘤生长的有效抑制剂。在N87皮下肿瘤模型中以3mg/kg的ADC剂量观察到30天完全肿瘤停滞。该结果证实，通过狄尔斯-阿尔德反应产生的ADC在体内足够稳定以引发治疗效果。
实例15.在水性缓冲液和有机溶剂中狄尔斯-阿尔德反应速率常数的比较。
测定在有机条件下小分子二烯-马来酰亚胺反应的动力学，以与在水性条件下的基于抗体的反应进行比较。对以下测定接头修饰的mAb上的二烯与马来酰亚胺之间的反应速率常数：mAb-CP1b-接头、mAb-CP2-接头、mAb-CP3-接头和mAb-F2-接头。
二烯-马来酰亚胺在有机溶剂中的反应速率的测定：将二烯和N-乙基马来酰亚胺的CDCl3溶液在NMR管中合并(各自最终浓度为0.01M)，并在室温下通过1H NMR监测。使用N-乙基马来酰亚胺的乙基峰(3.59或1.20ppm)和DA-缀合物的乙基峰(通常为4.40或1.05ppm)的积分来计算原料[A]的浓度。
[A]＝0.01M*(原料积分)/(原料+产物的积分)
将浓度倒数(1/[A])对时间(s)作图。从最佳拟合线获得二级反应速率(M-1s-1)。使用三次实验的平均速率和标准偏差。
mAb-接头缀合物的制备：通过实例9和实例14中描述的含NHS酯的接头CP1b-接头(化合物19)，CP2-接头(化合物12)，CP3-接头(化合物13)和F2-接头(化合物17)的反应将二烯官能团随机引入抗体中。方案15.1中显示了CP3-NHS与mAb的反应。通过反应中使用的NHS-接头的量来控制mAb修饰的程度，并且根据实验靶向不同的接头密度。如实例1中所述，通过完整的去糖基化质谱法测定每mAb的接头(和因此为二烯)的数目。
Figure BDA0002280513920001001
方案15.1.mAb-CP3-接头的制备。
接头修饰的mAb与马来酰亚胺基-MMAE的反应：如实例10所述，使接头修饰的mAb中含有的二烯与1摩尔当量的AM-MMAE(二烯：马来酰亚胺)在水性缓冲液中反应。
mAb-接头二烯-马来酰亚胺反应速率常数的计算：如实例10中所述，通过去糖基化的还原型质谱中的峰强度测定马来酰亚胺基-MMAE与mAb-接头中的二烯的反应的二阶速率常数。对于一种样品，如实例4所述仅分析重链峰。
表15.1 AM-MMAE与二烯接头修饰的mAb在水性缓冲液中以及N-乙基马来酰亚胺与二烯接头在CDCl3中的反应速率的总结。
Figure BDA0002280513920001011
Figure BDA0002280513920001021
a)所有缀合反应在补充有100mM磷酸二氢钠，20％DMSO，pH 5.5的PBS中进行。
b)所有反应均以相对于二烯1当量AM-MMAE进行。所有反应的mAb浓度均为1.3mg/mL±0.35mg/mL。
c)所有反应均在CDCl3中用二烯-接头(0.01M)和N-乙基马来酰亚胺(0.01M)在室温下进行。
d)k2(H2O)由未反应的mAb-接头峰的浓度计算(去糖基化和还原行质谱分析)。分析了重链和轻链。
e)k2(CDCl3)由1H NMR光谱中的诊断峰的积分计算。这些值是3次运行平均值和标准偏差。
f)使用CP1b接头。
g)ND，未确定。
h)仅分析重链。
马来酰亚胺化合物和二烯化合物在抗体/水性条件和小分子/有机溶剂条件下的反应速率常数的比较证明了，该反应用于生物缀合应用的几个关键特征。首先，在典型的生物缀合条件下，未修饰的呋喃对马来酰亚胺化合物与抗体的缀合反应性不足。这可以通过AM-MMAE与IgG-呋喃的缀合来证明，其在20小时后显示出最小的反应，并且与其他二烯相比，在有机条件下与马来酰亚胺反应的速率常数降低约100-1000倍。其次，证实了在抗体缀合的情况下狄尔斯-阿尔德反应在水性条件下的加速。反应速率加速对于该化学物质用于生产生物缀合物的实际应用是至关重要的，单独考虑有机条件速率常数将使狄尔斯-阿尔德反应对于本文所述的所有二烯不具吸引力。例如，CP1-接头中含有的环戊二烯在与马来酰亚胺(AM-MMAE)的水性基于抗体的反应中表现出约10分钟的反应半衰期，而相应的有机相反应需要3.6天。最后，结果表明二烯反应性是可调的，其中化学结构的改变可以增加或降低与亲二烯体的反应速率。总之，环戊二烯和修饰的呋喃官能团适合在温和条件下以1-2mg/mL范围内的抗体浓度在抗体和马来酰亚胺化合物之间进行有效的生物缀合反应，而简单的未修饰的呋喃则不然。
实例15.用1C1-K274CP1 NNAA mAb和AZ1508药物接头产生ADC
评估了用引入抗体的位置K274的CP1-NNAA和AZ1508药物-接头制备ADC的可行性。
抗体生成。使用实例6中描述的方法将CP1-NNAA引入1C1抗体中。
1C1 K274CP1-mAb与AZ1508的缀合：用PBS(0.133mL)将K274CP1 NNAA-mAb(0.4mg，2.7nmol，1当量)调节至3mg/mL。分别加入DMSO(27μL)和1M磷酸二氢钠(13μL)，得到约20％和10％v/v溶液。将AZ1508(5μL的10mM原液的DMSO溶液，13nmol，5当量)加入1C1 K274CP1-mAb溶液中并将混合物短暂涡旋。在持续混合下，反应在室温下进行17小时。加入N-乙酰基半胱氨酸(1.1μL 100mM，108nmol，40当量)，将溶液再温育15分钟以淬灭未反应的马来酰亚胺基团。然后将样品用水稀释3倍并使用CHT色谱纯化。随后如实例6和12中所述通过还原型质谱法和SEC分析样品。
A)
Figure BDA0002280513920001041
B)
Figure BDA0002280513920001042
方案15.1.A)K274CP1-NNAA mAb与AZ1508的反应。B)AZ1508的结构。
1C1 K274CP1-NNAAADC的表征：如实例6和12中所述通过还原型质谱法和SEC分析样品。如实例12中所述进行PC3细胞中的体外活性。
图15.1. 1C1 K274CP1-NNAA AZ1508 ADC的SDS-PAGE分析。A)未还原的B)还原的。
图15.2. 1C1 K274CP1-NNAA mAb AZ1508缀合产物的还原型糖基化质谱分析。A)未反应的mAb B)AZ1508反应产物。将图谱放大以显示抗体重链(HC)和轻链(LC)。
图15.3. 1C1 K274CP1-NNAA AZ1508 ADC的SEC分析，其表明获得了高单体产物。显示了高分子量固体(HMWS)。
表15.1 1C1 K274CP1-NNAA AZ1508 ADC性质的总结a，b，c
Figure BDA0002280513920001043
a所有缀合反应均在pH 5.5，20％DMSO，22℃和3mg/mL 1C1 K274CP1-NNAA mAb下进行。将CP1-NNAA引入位置K274代替赖氨酸
b所用AZ1508∶CP1二烯的摩尔比为2.5∶1
c由还原型质谱的峰强度计算
dDAR＝药物与抗体的比率
e在EphA2受体阳性PC3细胞中测定
确认了引入1C1抗体的位置K274后CPl-NNAA二烯对AZ1508的反应性。ADC产物质量高，缀合率＞95％，聚集体很少。得到的ADC对受体阳性PC3细胞具有活性。
实例16.用1C1 S239CP2-NNAA，1C1 K274CP2-NNAA和1C1 N297CP2-NNAA抗体和AZ1508药物-接头产生ADC，并与类似的半胱氨酸连接的位点特异性AZ1508 ADC比较。
利用在位置S239、K274和N297引入CP2-NNAA的1C1抗体，通过将表达质粒中的天然氨基酸密码子突变为琥珀终止密码子来制备具有AZ1508药物-接头的ADC。将CP2-NNAA引入单独抗体的每个位置。
抗体产生：将CP2-NNAA引入1C1抗体中，并使用实例6中描述的方法表达。使用标准分子生物学技术通过定点诱变将半胱氨酸引入1C1抗体中。
1C1 CP2-NNAA mAb与AZ1508的缀合：使用实例12中描述的方法，对所有三种CP2-NNAA抗体构建体进行相同的缀合方法，唯一的区别是AM-MMAE被AZ1508替换。注意，通过简单地将AZ1508与CP2-NNAA mAb混合然后混合来实现药物-接头缀合。
Figure BDA0002280513920001051
方案16.1.A)CP2-NNAA mAb与AZ1508的反应。对于AZ1508的结构，参见方案15.1。
1C1半胱氨酸王程化mAb与AZ1508的缀合。使用实例12中描述的相同方法制备位点特异性半胱氨酸连接的AZ1508ADC，唯一的区别是AM-MMAE被AZ1 508取代。注意，在添加AZ1508之前，必须还原，透析和氧化半胱氨酸-mAb。
1C1 CP2-NNAA ADC和1C1半胱氨酸王程化ADC的表征。如实例6和12中所述，通过SDS-PAGE，还原型质谱，HIC，rRP-HPLC和SEC分析样品。如实例12中所述进行培养的PC3细胞中的体外活性。
图16.1. 1C1 CP2-NNAA AZ1508 ADC和1C1半胱氨酸AZ1508 ADC的SDS-PAGE分析。A)未还原的样品，B)还原的样品。
图16.2. 1C1 S239CP2-NNAA AZ1508 ADC的分析。A)未反应的mAb的还原型糖基化质谱分析。B)AZ1508反应产物的还原型糖基化质谱分析。C)未反应的抗体和AZ1508缀合产物的HIC分析，D)AZ1508反应产物的SEC分析。将图谱放大以在(A)和(B)中显示抗体重链(HC)和轻链(LC)。
图16.3. 1C1 K274CP2-NNAA AZ1508 ADC的分析。A)未反应的mAb的还原型糖基化质谱分析。B)AZ1508反应产物的还原型糖基化质谱分析。C)未反应的抗体和AZ1508缀合产物的HIC分析，D)AZ1508反应产物的SEC分析。将图谱放大以在(A)和(B)中显示抗体重链(HC)和轻链(LC)。
图16.4. 1C1 N297CP2-NNAA AZ1508 ADC的分析。A)未反应的mAb的还原型糖基化质谱分析。B)AZ1508反应产物的还原型糖基化质谱分析。C)未反应的抗体和AZ1508缀合产物的HIC分析，D)AZ1508反应产物的SEC分析。将图谱放大以在(A)和(B)中显示抗体重链(HC)和轻链(LC)。
图16.5. 1C1 S239C AZ1508 ADC的分析。A)未反应的mAb的还原型糖基化质谱分析。B)AZ1508反应产物的还原型糖基化质谱分析。C)未反应的抗体和AZ1508缀合产物的HIC分析，D)AZ1508反应产物的SEC分析。将图谱放大以在(A)和(B)中显示抗体重链(HC)和轻链(LC)。
图16.6. 1C1 K274C AZ1508 ADC的分析。A)未反应的mAb的还原型糖基化质谱分析。B)AZ1508反应产物的还原型糖基化质谱分析。C)未反应的抗体和AZ1508缀合产物的HIC分析，D)AZ1508反应产物的SEC分析。将图谱放大以在(A)和(B)中显示抗体重链(HC)和轻链(LC)。
图16.7. 1C1 N297C AZ1508 ADC的分析。A)未反应的mAb的还原型糖基化质谱分析。B)AZ1508反应产物的还原型糖基化质谱分析。C)未反应的抗体和AZ1508缀合产物的HIC分析，D)AZ1508反应产物的SEC分析。将图谱放大以在(A)和(B)中显示抗体重链(HC)和轻链(LC)。
表16.1 1C1 CP2-NNAA和半胱氨酸mAb ADC的总结a，b
Figure BDA0002280513920001071
a所有CP2 NNAA缀合反应在pH 5.5，20％DMSO，22℃和3mg/mL mAb下进行。
b使用的AZ1508∶CP2的摩尔比为2.5∶1
c由SEC迹线的峰面积测定
dDAR＝药物与抗体的比率
e由还原型质谱的峰强度计算出来
f在分析完整的ADC后，通过峰面积测定
g通过还原型质谱测定
h在EphA2受体阳性PC3细胞中测定。
将CP2-NNAA引入1C1抗体的三个位置，并确认对AZ1508的反应性。注意，将CP2-NNAA引入单独抗体的每个位置。用CP2-NNAA mAb制备的ADC具有高质量，缀合率＞95％和聚集体很少。得到的CP2-NNAA AZ1508 ADC对受体阳性PC3细胞具有活性。
CP2-NNAA ADC与相应的半胱氨酸工程化抗体的比较显示，位置N297适于用CP2-NNAA突变而不是半胱氨酸。如SDS-PAGE结果所证明的，在该位置引入半胱氨酸在缀合过程中导致二硫键加扰。对于N297CP2-NNAA ADC没有观察到二硫键加扰。这证明可以将CP2-NNAA引入不适合半胱氨酸引入的位置，其中半胱氨酸可以影响抗体框架中的天然二硫键。
实例17.CP1-NNAA和CP2-NNAA AZ1508 ADC在小鼠和大鼠血清中的稳定性
评估通过狄尔斯-阿尔德缀合制备的AZ1508 ADC的血清稳定性。相对于抗体和有效负载(即狄尔斯-阿尔德加合物)之间的化学键评估ADC的稳定性。还提供了类似的半胱氨酸连接的(硫代琥珀酰亚胺)ADC的稳定性用于比较。
方法：将1C1 AZ1508 ADC在小鼠血清或大鼠血清中，在37℃离体温育7天，通过免疫捕获回收，并如实例7中所述通过质谱法分析。如实例7中所述，通过质谱中峰高度测定缀合和未缀合抗体的相对量。对于小鼠血清培养的样品，观察到AZ1508的脱乙酰化。脱乙酰化的AZ1508被认为是用于计算DAR的缀合物质。
图17.1.在大鼠血清中温育之前和之后1C1 CP2-NNAA-和1C1半胱氨酸-AZ1508ADC的代表性还原型糖基化质谱。天然氨基酸突变为CP2-NNAA或半胱氨酸，如(A)位置S239，(B)位置K274，(C)位置N297所示。表明了未缀合物质和缀合物质。
图17.2.在37℃下在大鼠血清中温育7天后，保持附接于CP2-NNAA或半胱氨酸工程化抗体的AZ1508的定量。药物：抗体比率(DAR)由还原型糖基化质谱计算。数据代表平均值±标准偏差，n＝3。
图17.3.在37℃下在小鼠血清中温育7天后，保持附接于CP2-NNAA或半胱氨酸工程化抗体的AZ1508的定量。药物：抗体比率(DAR)由还原型糖基化质谱计算。去乙酰化的AZ1508被认为是用于分析的缀合物质。数据代表平均值±标准偏差，n＝3。
图17.4.在37℃下在大鼠血清中温育7天后，保持附接于CP1-NNAA抗体的AZ1508的定量。药物：抗体比率(DAR)由还原型糖基化质谱计算。数据代表平均值±标准偏差，n＝3。
在大鼠或小鼠血清中于37℃温育7天后，1C1 CP2-NNAA AZ1508ADC的分析证明狄尔斯-阿尔德加合物是稳定的，因为未观察到药物损失。在位置K274制备的1C1 CP1-NNAAAZ1508在大鼠血清中37℃温育7天后也未显示出药物损失，然而，对于经历相同条件的类似的半胱氨酸连接的ADC，观察到显著的药物损失。半胱氨酸连接的ADC稳定性取决于位置，其中位置S239是稳定的，而位置K274和N297则不是。在半胱氨酸连接的ADC的情况下，AZ1508通过硫代琥珀酰亚胺键与抗体偶联，其可能经历逆迈克尔去缀合反应，导致药物损失。该过程比掩埋位置更多地影响暴露位置，因此对半胱氨酸连接的ADC观察到位置依赖性稳定性。另一方面，对于CP1和CP2二烯，狄尔斯-阿尔德加合物在对于硫代琥珀酰亚胺不稳定的位置是稳定的。因此，就缀合物稳定性而言，与环戊二烯NNAA的狄尔斯-阿尔德缀合代表了对基于硫醇的缀合策略的优势。
实例18.含有CP1-NNAA或CP2-NNAA的1C1 mAb与AZ1508的反应动力学。
在引入1C1抗体框架中的位置S239、K274或N297后评估二烯NNAA的反应性。
方法：将1C1 CP1-NNAA或CP2-NNAA抗体(3mg，1.3mg/mL mAb，17.4μM二烯，1当量)与AZ1508(4μL 10mM原液的DMSO溶液，40nmol，1当量)在0.1M磷酸钠，0.15M NaCl，20％DMSO，pH 5.5中在22℃反应。在预定时间点从反应混合物中取出等分试样(100μL)并加入N-乙酰基半胱氨酸(3μL 100mM水溶液，8当量)，然后在室温下温育15分钟以淬灭未反应的马来酰亚胺。然后使用PD Spintrap G-25装置(通用电气医疗集团生命科学部(GEHealthcare Life Sciences))纯化样品以从混合物中除去小分子组分，随后通过还原型糖基化质谱法分析。质谱分析程序和动力学常数计算描述于实例5和10中。
图18.1.通过还原型糖基化质谱测量的1C1 CP1-NNAA和1C1 CP2-NNAA mAb与AZ1508的缀合动力学。对于1C1 K274CP1-NNAA，1C1 K274CP2-NNAA和1C1 N297CP2-NNAA，将数据绘制为平均值±绝对误差，n＝2，并且对于1C1 S239CP2-NNAA为平均值±标准偏差n＝3。
图18.2.浓度倒数图，其显示CP1-NNAA和CP2-NNAA mAb与AZ1508反应时二烯的消耗。(A)1C1 K274CP1-NNAA，(B)1C1 S239CP2、1C1 K274CP2-NNAA和N297CP2-NNAA mAb。对于1C1 K274CP1-NNAA，1C1 K274CP2-NNAA和1C1 N297CP2-NNAA，将数据绘制为平均值±绝对误差，n＝2，并且对于1C1 S239CP2-NNAA为平均值±标准偏差n＝3。
表18.1. 1C1 CP1-NNAA和CP2-NNAA mAb与AZ1508反应动力学数据总结。a，b，c
Figure BDA0002280513920001091
Figure BDA0002280513920001101
a所有缀合反应在补充有100mM磷酸二氢钠，20％DMSO，pH 5.5的PBS中进行。
b使用的AZ1508∶CP1-NNAA或CP2-NNAA二烯的摩尔比为1∶1。对于所有反应，mAb浓度为1.3mg/mL(17.3μM二烯)。
c通过还原型糖基化质谱监测二烯的反应。
d由二烯浓度倒数(M)与时间(s)曲线的最佳拟合线确定。
e使用实例5和10中所示的半衰期等式计算。
具有CP1-NNAA或CP2-NNAA的抗体与含有马来酰亚胺的药物-接头AZ1508以1∶1摩尔当量的二烯∶马来酰亚胺反应。CP1-NNAA mAb的反应半衰期为12分钟，CP2-NNAA mAb为3-10小时。48小时测量期后达到的最终转化率为87％-100％。
实例19.用CP2-NNAA mAb和AZ1508制备的ADC的抗肿瘤活性。
对用1C1 CP2-NNAA和AZ1508药物-接头制备的ADC评估其抑制小鼠PC3异种移植物的肿瘤生长的能力。
ADC制备：如实例16中所述用1C1 mAb制备ADC。用同种型对照抗体(称为R347)制备非EphA2结合ADC。对于1C1 mAb，将CP2-NNAA引入位置S239和N297，对于R347 mAb，引入位置S239。
体内方法：肿瘤生长抑制研究在查尔斯河探索服务北卡罗来纳州(Charles RiverDiscovery Services North Carolina)(CR Discovery Services)根据实验动物护理和使用指南关于束缚，饲养，外科手术，饲料和液体监管和兽医护理的建议进行。通过将PC3细胞(在50％基质胶中的1000万个细胞)皮下接种到8-9周龄雌性无胸腺裸鼠中，在小鼠中建立PC3异种移植肿瘤模型。17天后，将其指定为研究的第1天，肿瘤体积达到约150-200mm3，将小鼠随机分组，每组8只小鼠。在研究的第1天，开始给药并通过尾静脉注射以3mg/kg施用ADC。ADC每周以3mg/kg给药一次，持续三周，总共三次。随后用卡尺每周两次测量肿瘤尺寸(长轴和短轴)。使用实例14中的等式计算肿瘤体积。
图19.1.施用CP2-NNAA AZ1508 ADC后小鼠中PC3异种移植物的肿瘤生长抑制。用在位置S239或N297引入的CP2-NNAA制备中靶1C1 mAb ADC，而用在位置S239引入的CP2制备非靶向同种型对照R347 mAb ADC。在第0、7和14天(以箭头指示)以3mg/kg静脉内给药ADC。数据表示为平均±标准偏差.N＝8。
1C1 CP2-NNAA AZ1508 ADC在第一次注射ADC后在小鼠中有效抑制小鼠EphA2阳性PC3异种移植模型中的肿瘤生长至少60天。用非结合R347 mAb制备的脱靶ADC不如中靶ADC有效。
实例20.CP1-NNAA抗体与马来酰亚胺官能化纳米颗粒的缀合。
使1C1 K274CP1-NNAA抗体与60nm马来酰亚胺官能化的金纳米颗粒反应。
方法：根据制造商的说明书，由商业试剂盒(西格玛-奥德里奇公司，目录号9009465)制备马来酰亚胺官能化的60nm金纳米颗粒。首先，将冻干的马来酰亚胺官能化的金纳米颗粒产物重悬于试剂盒中提供的100μL反应缓冲液中。接下来，在PBS中以0.5mg/mL制备野生型(WT)或K274CP1-NNAA 1C1抗体的溶液。将纳米颗粒溶液(10μL)和抗体溶液(10μL)合并，并通过上下吸移数次进行混合。缀合反应在25℃下持续2小时，然后使用Zetasizer-Nano ZS(马尔文仪器公司，英国(Malvern Instruments，UK))进行光散射分析。每个缀合反应一式三份进行。
Figure BDA0002280513920001111
方案20.1. 1C1 K274CP1-NNAA mAb与马来酰亚胺官能化的金纳米颗粒的反应。
图20.1.在与1C1野生型(WT)或1C1 K274CP1-NNAA抗体(CP1-NNAA mAb)在25℃下温育2小时之前和之后60nm马来酰亚胺官能化的金纳米颗粒的动态光散射分析(DLS)。
表1.纳米颗粒和纳米颗粒-mAb缀合物的光散射数据的总结。
a)每个反应样品代表一个独立的实验。
b)将大小表示为数均直径(纳米)。
引入CP1-NNAA的抗体通过狄尔斯-阿尔德反应与马来酰亚胺官能化的纳米颗粒缀合。

Claims (62)

1.一种生物缀合方法，其包括将含有第一不饱和官能团的生物分子与包含第二不饱和官能团的有效负载缀合的步骤，其中所述第一和第二不饱和官能团彼此互补，使得缀合是所述官能团通过形成环己烯环的狄尔斯-阿尔德反应的反应。
2.根据权利要求1所述的生物缀合方法，其中所述第一官能团是二烯。
3.根据权利要求2所述的生物缀合方法，其中所述第二官能团是亲二烯体，例如马来酰亚胺、马来酸酯、富马酸酯、丙烯酸酯、甲基丙烯酸、丙烯腈、丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、甲基乙烯基酮、酰胺和丁-2-炔二酸、醌、炔烃的酯。
4.根据权利要求1所述的生物缀合方法，其中所述第二官能团是二烯。
5.根据权利要求4所述的生物缀合方法，其中所述第一官能团是亲二烯体，其选自马来酸酯、马来酰亚胺、富马酸酯、丙烯酸酯、甲基丙烯酸、丙烯腈、丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、甲基乙烯基酮、酰胺和丁-2-炔二酸、醌、炔烃的酯。
6.根据权利要求3或5所述的生物缀合方法，其中所述亲二烯体包含在非天然氨基酸中，例如包含降冰片烯的非天然氨基酸。
7.根据权利要求2至6中任一项所述的生物缀合方法，其中所述二烯是直链二烯、碳环二烯或杂环二烯。
8.根据权利要求7所述的生物缀合方法，其中所述二烯包含丁二烯、环戊二烯、1，3-环己二烯、呋喃或蒽。
9.根据权利要求2至8中任一项所述的生物缀合方法，其中所述二烯包含在非天然氨基酸中。
10.根据权利要求9所述的生物缀合方法，其中所述二烯是衍生自赖氨酸、半胱氨酸、硒代半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的非天然氨基酸。
11.根据权利要求8或9所述的生物缀合方法，其中所述二烯在所述氨基酸的侧链中。
12.根据权利要求8至10中任一项所述的生物缀合方法，其中所述非天然氨基酸具有式(I)：
RX-X1-O0-1C(O)-氨基酸-残基 (I)
其中：
RX表示选自以下的不饱和基团：
iv)C4-9直链共轭二烯，
v)包含共轭二烯的C5-14碳环基，以及
vi)包含1、2或3个选自O、N和S的杂原子和共轭二烯的5至14元杂环基，
其中i)、ii)和iii)可以具有多达五个取代基(例如一个、两个或三个取代基)，例如，所述取代基独立地选自C1-3烷基、氧代、卤素、磺基、巯基、氨基、-C1-3亚烷基N3、或-C2-5炔基；以及；并且
X1表示
i)饱和或不饱和的支链或非支链C1-8亚烷基链，其中至少一个碳(例如1、2或3个碳)被选自O、N、S(O)0-3的杂原子替换，其中所述链任选地被一个或多个独立地选自氧代、卤素、氨基、-C1-3亚烷基N3或-C2-5炔基的基团取代；或
ii)与来自碳环基或杂环基的碳一起表示与饱和或不饱和(特别是饱和的)支链或非支链的C1-6亚烷基链连接的环丙烷环，其中至少一个碳(例如1、2或3个碳)被选自O、N、S(O)0-3的杂原子替换，其中所述链任选地被一个或多个独立地选自氧代、卤素、氨基、-C1-3亚烷基N3或-C2-5炔基的基团取代，并且
O0-1C(O)通过氨基酸的侧链连接。
13.根据权利要求12所述的生物缀合方法，其中所述取代基独立地选自氧代、卤素、磺基、巯基、氨基、-C1-3亚烷基N3、或-C2-5炔基。
14.根据权利要求12或13所述的生物缀合方法，其中所述非天然氨基酸是式(II)结构的残基：
Figure FDA0002280513910000021
其中
X2表示-C-、-C(R’)-、-CH2或O；
Ra表示
i)饱和或不饱和的支链或非支链C1-8亚烷基链，其中至少一个碳(例如1、2或3个碳)被选自O、N、S(O)0-3的杂原子替换，其中所述链任选地被一个或多个独立地选自氧代、卤素、氨基的基团取代；或
ii)与来自式(II)中定义的5元环的碳一起表示与饱和或不饱和的支链或非支链C1-6亚烷基链连接的环丙烷环，其中至少一个碳(例如1、2或3个碳)被选自O、N、S(O)0-3的杂原子替换，其中所述链任选地被一个或多个(例如1、2或3个)独立地选自氧代、卤素、氨基的基团取代；
Rb表示H、-OC1-3烷基、任选地具有羟基取代基的C1-6烷基、-C1-3亚烷基N3或-C2-5炔基；
Rc表示H、-OC1-3烷基、任选地具有羟基取代基的C1-6烷基、-C1-3亚烷基N3或-C2-5炔基；
Rd表示H、-OC1-3烷基、任选地具有羟基取代基的C1-6烷基、-C1-3亚烷基N3或-C2-5炔基；
Re表示H、饱和或不饱和的支链或非支链C1-8亚烷基链，其中一个或多个碳任选地被-O-替换，并且该链任选地被一个或多个卤素原子(例如碘)、N3或-C2-5炔基取代。
15.根据权利要求14所述的生物缀合方法，其中Ra为-CH(CH2)CH2COC(O)-、-OCH2CH2COC(O)-、-(CH2)mCH2OC(O)-、-CH(CH2)C(O)-、-(CH2)mCH2C(O)-、-CH(CH3)C(O)-、C1-6亚烷基(例如-CH2CH2-)，并且
m表示0或1。
16.根据权利要求14或15所述的生物缀合方法，其中Rb为H、-OC1-3烷基、-CH3、-CH(CH3)2、CH2OH、-CH2N3或-CCH。
17.根据权利要求14至16中任一项所述的生物缀合方法，其中Rc为H、-OC1-3烷基、-CH3、-CH(CH3)2、CH2OH、-CH2N3或-CCH。
18.根据权利要求14至17中任一项所述的生物缀合方法，其中Rd为H、-OC1-3烷基、-CH3、-CH(CH3)2、CH2OH、-CH2N3或-CCH。
19.根据权利要求14至18中任一项所述的生物缀合方法，其中Re表示H或-CH2OCH2CH2N3。
20.根据权利要求14至19中任一项所述的生物缀合方法，其中所述非天然氨基酸是式(IIa)结构的残基：
Figure FDA0002280513910000041
其中Ra、Rb、Rc、Rd、Re和X2如上定义。
21.根据权利要求14至19中任一项所述的生物缀合方法，其中所述非天然氨基酸具有式(IIb)的结构：
Figure FDA0002280513910000042
其中Ra、Rb、Rc、Rd、Re和X2如上定义。
22.根据权利要求14至19中任一项所述的生物缀合方法，其中所述非天然氨基酸具有式(IIc)的结构：
Figure FDA0002280513910000043
其中Ra、Rb、Rc、Rd、Re如上定义以及X2’为-C-或CR’。
23.根据权利要求9至22中任一项所述的生物缀合方法，其中所述非天然氨基酸选自包含以下的群组：
24.根据权利要求1至23中任一项所述的生物缀合方法，其中所述亲二烯体是非天然氨基酸的侧链。
25.根据权利要求1至24中任一项所述的生物缀合方法，其中所述方法包括通过接头将所述二烯或亲二烯体(特别是所述二烯)与所述生物分子中的氨基酸残基缀合的前步骤。
26.根据权利要求25所述的生物缀合方法，其中所述氨基酸是半胱氨酸或赖氨酸。
27.根据权利要求25或26所述的生物缀合方法，其中在加成到所述生物分子中的所述氨基酸残基之前，所述二烯具有式(III)的结构：
RX-Bn-X3 m-Yp-Z(III)
或其与O或N连接糖的衍生物
其中
n表示0或1；
m表示0或1；
p表示0或1；
RX表示选自以下的不饱和基团：
i)C4-9直链共轭二烯，
ii)包含共轭二烯的C5-14碳环基，以及
iii)包含1、2或3个选自O、N和S的杂原子和共轭二烯的5至14元杂环基，
其中i)、ii)和iii)可以具有多达五个取代基(例如一个、两个或三个取代基)，例如，其中所述取代基独立地选自C1-3烷基、氧代、卤素、磺基、巯基、氨基、-C1-3亚烷基N3、或-C2-5炔基；并且
B表示C1-6亚烷基、-C3-4环烷基C1-6亚烷基-；其中任选地糖残基(例如葡萄糖、葡糖胺、半乳糖、半乳糖胺、乳糖、甘露糖和果糖)包含在其任一个的所述亚烷基链中，并且其中针对B定义的所述变量的任一个的所述亚烷基链任选地具有一个或两个独立地选自N-和O-连接的糖残基(例如葡萄糖、葡糖胺、半乳糖、半乳糖胺、乳糖、甘露糖和果糖)的取代基；
X3表示-(R1)NC(O)-、-C(O)N(R1)-、-OC(O)-、-OC(O)N-；
R1表示H或-CH2OCH2CH2R2；
R2表示-N3、C2-5炔基或卤素，例如碘；
Y表示-(OCH2)qC2-6亚烷基，或任选地被-NR3R4取代的-C2-6亚烷基，
其中q为1至7000；
R3和R4独立地表示H或C1-3烷基；
Z表示-C(O)OR5、R5’、-NC(O)Rb、-C2-5亚烷基、CH2-O-NH2、炔烃、叠氮化物、3-芳基丙炔腈或卤素如碘；
R5表示C1-6烷基、琥珀酰亚胺、C6F4H(四氟己基)或H：
R5’表示硫桥连基团，例如二澳马来酰亚胺、二氯丙酮或其任一个的衍生物，
R6表示：
Figure FDA0002280513910000071
其中
R7是任选地具有一个或多个(例如一个、两个或三个)选自羟基、磺基、氨基和-(OCH2)vC2-6亚烷基的基团的C1-6亚烷基，和任选地具有一个或多个(例如一个、两个或三个)选自羟基、磺基、氨基和-(OCH2)vC2-6亚烷基的基团的苯基，
v是整数1、2、3、4或5
Figure FDA0002280513910000072
表示片段与分子其余部分连接的位置。
28.根据权利要求25至27中任一项所述的生物缀合方法，其中所述二烯具有以下结构：
Figure FDA0002280513910000081
29.根据权利要求1至28中任一项所述的生物缀合方法，其中所述反应在10℃至40℃的温度下进行，例如环境温度。
30.根据权利要求1至29中任一项所述的生物缀合方法，其中所述反应在含水溶剂，例如含水有机溶剂系统，缓冲液，例如PBS，任选地包含极性非质子溶剂，例如DMSO或表面活性剂，例如聚山梨醇酯80或其组合中进行。
31.根据权利要求1至30中任一项所述的生物缀合方法，其中所述生物分子是多肽。
32.根据权利要求31所述的生物缀合方法，其中所述多肽选自包含配体、受体、抗体分子的群组。
33.根据权利要求1至32中任一项所述的生物缀合方法，其中所述生物分子是治疗分子。
34.根据权利要求1至33中任一项所述的生物缀合方法，其中将所述生物分子工程化以从原始或天然序列去除一个或多个赖氨酸残基。
35.根据权利要求1至34中任一项所述的生物缀合方法，其中所述有效负载选自：
a.奥瑞他汀，例如选自包括微管溶素或吡咯并苯并二氮杂卓(PBD)MMAE(单甲基奥瑞他汀E)、MMAF(单甲基奥瑞他汀F)、多柔比星、微管溶素和倍癌霉素的群组；
b.包含美登木素生物碱，例如N 2′-脱乙酰基-N 2′-(3-巯基-1-氧代丙基)-美登素(DM1)、N 2′-脱乙酰基-N2′-(4-巯基-1-氧代戊基)-美登素(DM3)和N 2′-脱乙酰基-N 2′(4-甲基-4-巯基-1-氧代戊基)-美登素(DM4)；
c.毒素；
d.聚合物，例如天然聚合物，例如淀粉、聚(谷氨酸)、聚(天冬氨酸)、聚(赖氨酸)或白蛋白或合成聚合物，例如PEG。
36.一种与有效负载缀合的生物分子，其由根据权利要求1至35中任一项所述的方法获得或可获得。
37.一种与有效负载缀合的生物分子，其中将所述生物分子与所述有效负载连接的所述缀合反应是通过二烯和亲二烯体之间以形成环己烯环的狄尔斯-阿尔德反应。
38.根据权利要求37所述的与有效负载缀合的生物分子，其中所述环己烯环是稠环系统的一部分，例如包含最多20个原子。
39.根据权利要求38所述的与有效负载缀合的生物分子，其具有式(IVa)：
Figure FDA0002280513910000101
其中
RY表示所述有效负载；并且
RZ表示所述生物分子。
40.根据权利要求38所述的与有效负载缀合的生物分子，其具有式(IVb)：
Figure FDA0002280513910000102
其中
RY表示所述有效负载；
RZ表示所述生物分子；并且
X4表示-O-或-CH2-。
41.根据权利要求36至40中任一项所述的与有效负载缀合的生物分子，其中：所述生物分子是抗体或其结合片段。
42.根据权利要求36至41中任一项所述的与有效负载缀合的生物分子，其中：所述有效负载选自：
a.奥瑞他汀，例如选自包括微管溶素或吡咯并苯并二氮杂卓(PBD)MMAE(单甲基奥瑞他汀E)、MMAF(单甲基奥瑞他汀F)、多柔比星和倍癌霉素的群组；
b.包含美登木素生物碱，例如N 2′-脱乙酰基-N 2′-(3-巯基-1-氧代丙基)-美登素(DM1)、N 2′-脱乙酰基-N2′-(4-巯基-1-氧代戊基)-美登素(DM3)和N 2′-脱乙酰基-N 2′(4-甲基-4-巯基-1-氧代戊基)-美登素(DM4)；
c.毒素；
d.聚合物，例如天然聚合物，例如淀粉、聚(谷氨酸)或白蛋白或合成聚合物，例如PEG。
43.一种药物组合物，其包含根据权利要求36至42中任一项所述的与有效负载缀合的生物分子，和稀释剂、载体和/或赋形剂。
44.根据权利要求43所述的药物组合物，其中所述组合物为肠胃外制剂。
45.一种治疗患者的方法，其包括施用治疗有效量的根据权利要求36至42中任一项所述的与有效负载缀合的生物分子或根据权利要求43或44所述的药物组合物。
46.根据权利要求36至42中任一项所述的与有效负载缀合的生物分子和稀释剂或根据权利要求43或44所述的药物组合物，其用于治疗。
47.根据权利要求36至42中任一项所述的与有效负载缀合的生物分子和稀释剂或根据权利要求43或44所述的药物组合物用于制备药物的用途。
48.一种非天然氨基酸，其包含二烯或亲二烯体。
49.一种非天然氨基酸，其中所述二烯或亲二烯体在侧链中。
50.根据权利要求48或49所述的非天然氨基酸，其衍生自赖氨酸天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸。
51.根据权利要求48至50中任一项所述的非天然氨基酸，其具有式(I)：
RX-X1-O0-1C(O)-氨基酸残基 (I)
其中：
RX表示选自以下的不饱和基团：
iv)C4-9直链共轭二烯，
v)包含共轭二烯的C5-14碳环基，以及
vi)包含1、2或3个选自O、N和S的杂原子和共轭二烯的5至14元杂环基，
其中i)、ii)和iii)可以具有多达五个取代基(例如一个、两个或三个取代基)，例如，所述取代基独立地选自C1-3烷基、氧代、卤素、磺基、巯基、氨基、-C1-3亚烷基N3、或-C2-5炔基；并且
X1表示
iii)饱和或不饱和的支链或非支链C1-8亚烷基链，其中至少一个碳(例如1、2或3个碳)被选自O、N、S(O)0-3的杂原子替换，其中所述链任选地被一个或多个独立地选自氧代、卤素、氨基、-C1-3亚烷基N3或-C2-5炔基的基团取代；或
iv)与来自碳环基或杂环基的碳一起表示与饱和或不饱和(特别是饱和的)支链或非支链的C1-6亚烷基链连接的环丙烷环，其中至少一个碳(例如1、2或3个碳)被选自O、N、S(O)0-3的杂原子替换，其中所述链任选地被一个或多个独立地选自氧代、卤素、氨基、-C1-3亚烷基N3或-C2-5炔基的基团取代，并且
-O0-1C(O)-通过氨基酸的侧链连接。
52.根据权利要求51所述的非天然氨基酸，其中所述非天然氨基酸具有式(II)：
Figure FDA0002280513910000121
或其盐，其中
X2表示-C-、-CH2或O；
Ra表示
i)饱和或不饱和的支链或非支链C1-8亚烷基链，其中至少一个碳(例如1、2或3个碳)被选自O、N、S(O)0-3的杂原子替换，其中所述链任选地被一个或多个独立地选自氧代、卤素、氨基的基团取代；或
ii)与来自5元环的碳一起表示与饱和或不饱和的支链或非支链C1-6亚烷基链连接的环丙烷环，其中至少一个碳(例如1、2或3个碳)被选自O、N、S(O)p的杂原子替换，其中所述链任选地被一个或多个独立地选自氧代、卤素、磺基、巯基、氨基的基团取代；
Rb表示H、-OC1-3烷基、任选地具有羟基取代基的C1-6烷基、-C1-3亚烷基N3或-C2-5炔基；
Rc表示H、-OC1-3烷基、任选地具有羟基取代基的C1-6烷基、-C1-3亚烷基N3或-C2-5炔基；
Rd表示H、-OC1-3烷基、任选地具有羟基取代基的C1-6烷基、-C1-3亚烷基N3或-C2-5炔基；
Re表示H、饱和或不饱和的支链或非支链C1-8亚烷基链，其中一个或多个碳任选地被-O-替换，并且该链任选地被一个或多个卤素原子(例如碘)、N3或-C2-5炔基取代。
53.根据权利要求52所述的非天然氨基酸，其中Ra为-(CH2)mC(O)-、-CH2(CH3)C(O)-、-(CH2)mCH2OC(O)-、-CHCHCH2OC(O)-、-OCH2CH2COC(O)-，并且
m表示0或1。
54.根据权利要求52或53所述的非天然氨基酸，其中Rb为H、-OC1-3烷基、-CH3、-CH(CH3)2、CH2OH、-CH2N3或-CCH。
55.根据权利要求52至53中任一项所述的非天然氨基酸，其中Rc为H、-OC1-3烷基、-CH3、-CH(CH3)2、CH2OH、-CH2N3或-CCH。
56.根据权利要求52至55中任一项所述的非天然氨基酸，其中Rd为H、-OC1-3烷基、-CH3、-CH(CH3)2、CH2OH、-CH2N3或-CCH。
57.根据权利要求52至56中任一项所述的非天然氨基酸，其中Re表示H或-CH2OCH2CH2N3。
58.根据权利要求52至57中任一项所述的非天然氨基酸，其中所述非天然氨基酸是式(IIa)结构的残基：
Figure FDA0002280513910000131
或其盐，其中Ra、Rb、Rc、Rd、Re和X2如以上具有式(II)的化合物所定义。
59.根据权利要求52至58中任一项所述的非天然氨基酸，其中所述非天然氨基酸具有式(IIb)的结构：
Figure FDA0002280513910000141
或其盐，其中Ra、Rb、Rc、Rd、Re和X2如以上具有式(II)的化合物所定义。
60.根据权利要求52至58中任一项所述的非天然氨基酸，其中所述非天然氨基酸具有式(IIc)的结构：
Figure FDA0002280513910000142
或其盐，其中Ra、Rb、Rc、Rd、Re如上所定义，并且X2’是-C-或-CR’，如上所定义。
61.根据权利要求60所述的非天然氨基酸，其中所述非天然氨基酸选自包含以下的群组：
Figure FDA0002280513910000143
Figure FDA0002280513910000151
或其任一个的盐。
62.一种多肽，其包含根据权利要求51至61中任一项所述的非天然氨基酸。
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