WO2004022744A1

WO2004022744A1 - ｔＲＮＡのアミノアシル化方法

Info

Publication number: WO2004022744A1
Application number: PCT/JP2003/011391
Authority: WO
Inventors: Masahiko Sisido; Keiko Ninomiya
Original assignee: Japan Science And Technology Agency
Priority date: 2002-09-09
Filing date: 2003-09-05
Publication date: 2004-03-18
Also published as: EP1548109A4; EP1548109A1; JPWO2004022744A1; US20060020111A1; CA2498422A1; US20080096259A1

Abstract

本発明は、これまでとは全く異なった、アミノアシルｔＲＮＡの化学的合成法であって、遺伝子工学的手法を必要とせず、簡便で、且つどのような非天然アミノ酸でもアミノアシル化することが出来、更には、放射性同位体を用いずに検出することが出来る、アミノアシルｔＲＮＡの効率的で且つ実用性の高い合成法を提供することを目的とする。本発明は、ｔＲＮＡとアミノ酸をミセル中の界面近傍に閉じこめ、両者を近接させて反応させるか、又は、ｔＲＮＡと特異的相補結合するペプチド核酸をアンチセンス分子として介在させることによりｔＲＮＡとアミノ酸を近接させて反応させる、上記アミノアシル化方法に関する。

Description

明細書 t RNAのアミノアシル化方法技術分野

本発明は、 t RN Aのアミノアシル化方法に関する。詳しくは、本発明は、非天然アミノ酸を蛋白質に導入する際に必須となる、アミノ酸（非天然アミノ酸）の t RN A (転移 RNA、トランスファ一 RNA) への付加方法 ( t RNAのアミノアシル化法）に関するものである。なお、本方法は当然のことながら天然アミノ酸にも適用可能である。背景技術

ゲノム研究が進み、総合的なプロテオーム研究が現実的なものとなってきている。'とは言え、構造が複雑で、数も多い蛋白質の働きを把握しょうというのは並大抵の難しさではない。そこで蛋白質の機能解析方法として蛋白質のある特定部位に機能性アミノ酸を導入することで複雑な蛋白質に人工的な機能を付加し、蛋白質の構造及び機能を解明することが必要とされるようになつてきた。

一方、非天然アミノ酸を導入した蛋白質の作成が、プロテオ一ム解析、薬効など有意な性能を示す蛋白質の創製、などから、必要視されている。

非天然アミノ酸含有蛋白質の作製には、非天然アミノ酸の t RNAへの付加 ( t R N Aのアミノアシル化）が、必須である。これについては、多くの研究がなされているが、その代表的手法も非常に煩雑なものである。これが、非天然ァミノ酸含有蛋白質の開発のネックとなっている。

現在、世界中の研究者達がアミノアシル化を様々な手法で試みている。最も一般的な手法として用いられているのは H e c h t らが開発した化学的アミノアシル化である。この手法は通常の t RNAよりも 2残基短い truncated t RNAを生化学的手法にて作製し、一方で化学的にアミノアシル化した 2残基を化学合成し、次に両者を連結酵素リガ一ゼで結合させる、という煩雑で、高度な技術が必要とされる手法である（例えば、先行技術文献 1参照。）。また、この手法では合成 . できるアミノアシル t R N Aの収量も少なく、収率アップもあまり期待出来ない < また、 S c h u 1 t z らは遺伝子工学的手法を用いて天然のアミノアシル t R NA合成酵素を改変し非天然アミノ酸の導入を試みている（例えば、先行技術文献 2参照。）。この手法は高度な技術が必要とされ、収率も低い。そして種々の側鎖構造を持ち得る非天然アミノ酸を基質とする為には技術的に限界がある。更に、菅らは H e c h t らとは異なった手法でアミノアシル化を試みている。この手法は試験管内で進化させた機能性 RNA (リポザィム）を作製し、 t RN Aをアミノアシル化させる (例えば、先行技術文献 3参照。）。この手法では非天然アミノ酸を用いたアミノアシル化は成功しておらず、また、 t RNAに対して基質となるアミノ酸 - RNAを 1 0 0倍等量加えなくては生成物を得られない < そして、何よりも操作が煩雑である。

山下らはアミノアシル t RN Aヒドロラーゼを利用したアミノアシル化を報告している（例えば、先行技術文献 4参照。）。この手法は実用性に乏しく、現実には殆ど用いられていない。理由としては、基質特異性の問題も含めてアミノアシル化の収率が低いこと、酵素の安定性が低いこと等が挙げられる。

また、本発明者らは、先にアンチセンス分子を用いた t RN Aのアミノアシル化について検討した結果を日本化学会で発表しているが（例えば、先行技術文献 5参照。）、ここではその可能性について発表したに過ぎず、この段階では、未だ t RNAのアミノアシル化に成功したわけではなく、 t R N Aのアミノアシル化の新規で効果的な方法が見出されたわけでも、 t RNAのアミノアシル化の具体的な操作手順が確立されたわけでもない。

本出願の発明に関連する先行技術文献としては以下のものがある。

1 · Heckler, T. G.； Chang, L.H.； Zama, Y.； Naka, T.； Chorghade, M. S.； Hecht, S.

M.バイオケミストリ一 (Biochemistry), 1984, 23, 1468-.

2. Noren, C. J,； An thony-Cahi 11 , S. J. ; Gr i f f i th, M. ； Schultz, P. G.サイ

エンス（Science), 1989， 244, 282-.

3. Bessho，Y. ;Hodgson,D.R- W;Suga，H.ネィチヤ一バイオテクノロジー

(Nature Biotechnology)， 2002, 20, 723 - 728.

4. 特開平 6 — 2 6 1 7 5 6号公報 5. 日本化学会講演予稿集， VOL.79th, No.2， 873頁， 2001年発明の開示

本発明は、これまでとは全く異なった、アミノアシル t RN Aの化学的合成法であって、遺伝子工学的手法を必要とせず、簡便で、且つどのような非天然アミノ酸でもアミノアシル化することが出来、更には、放射性同位体を用いずに検出することが出来る（従来技術として記載した上記 4例（先行技術文献 1〜4) は何れも放射性同位体を用いている。）、アミノアシル t RN Aの効率的で且つ実用性の高い合成法を提供することを目的とする。本発明は、 t RN Aを選択的にアミノアシル化してアミノアシル t RNAを製造するに際し、 t RN Aとアミノ酸を近接させて反応,させることを特徴とする、 t RNAのアミノアシル化方法に関する。

より具体的には、本発明は、 t RNAとアミノ酸をミセル中の界面近傍に閉じこめ、両者を近接させて反応させるか、又は、 t RN Aと特異的相補結合するべプチド核酸をアンチセンス分子として介在させることにより両者を近接させて反応させる、上記アミノアシル化方法に関する。

また、本発明は、下記一般式 [ 1 ]

H - c Am— P N A— L— E— Am [ 1 ]

[式中、一 c Am—はカチオン性アミノ酸残基又は 2〜 5のカチオン性アミノ酸から成るオリゴペプチド残基を表し、一 P NA—はペプチド核酸残基を表し、 ― L—はリンカ一を表し、一 E—は活性エステル残基を表し、一 Amは t RNAに導入すべきアミノ酸残基を表す。 ] で示される化合物を用いて t RN Aとの反応を行う上記アミノアシル化方法に関する。

更に、本発明は、上記アミノアシル化方法に使用し得る上記一般式 [ 1 ] で示される化合物に関する。図面の簡単な説明

第 1図は、ミセル系でのアミノアシル化に用いるぺプチド核酸の構造を示す。第 2図は、アンチセンス分子による t RNAアミノアシル化の反応機構を示す。第 3図は、アンチセンス分子を用いた t RNAアミノアシル化方法において用いられるアミノ酸—アンチセンス分子の構造を示す。

第 4図は、アンチセンス分子を用いた二元系におけるアミノアシル化の解析方法を示す。

第 5図は、 DNAをテンプレートとしたべプチド核酸によるアミノアシル化 (アンチセンス分子を用いた三元系アミノアシル化）の解析方法を示す。

第 6図は、各種非天然アミノ酸の例示である。

第 7図は、 H P L C及び T OF— MSによるアミノアシル化の検出を示す。発明を実施するための最良の形態

t RNAとアミノ酸を近接させて反応させる方法としては、例えば、 t RNA とアミノ酸をミセル中の界面近傍に閉じこめ、両者を近接させて反応させる方法

(以下、方法 1 と呼ぶ。）、 t RN Aと特異的相補結合するペプチド核酸をアンチセンス分子として介在させることにより両者を近接させて反応させる方法（以下、方法 2と呼ぶ。）等がある。

方法 1には、アミノ酸の力ルポキシル基を活性化して、これをミセル中に閉じこめ、このミセル中の界面近傍へ t RN Aの 3 ' 末端水酸基部分のみを挿入することにより、ミセル中界面近傍で、当該 3 ' 末端水酸基と活性化されたカルポキシル基とを近接させて反応させる方法（方法 1 — 1 ) と、アミノ酸のカルポキシル基をミセル内部で縮合剤を用いて活性化し、このミセル中の界面近傍へ t RN Aの 3 ' 末端水酸基部分のみを挿入することにより、ミセル中の界面近傍で、当該 3 ' 末端水酸基と活性化された力ルポキシル基とを近接させて反応させる方法

(方法 1 一 2 ) とが有る。

即ち、アミノアシル化反応とは t RNAの 3 ' 末端の水酸基（ 2 '—， 3 ' -何れも可）とアミノ酸の力ルポキシル基とが脱水縮合することを言うのであるが、ここで問題になるのは、どちらも反応性が低い t RNAの水酸基と力ルポキシル基とを副反応（例えば溶媒に用いている水と力ルポキシル基との縮合等）させることなく両者を反応させることである。その為にアミノ酸の力ルポキシ基を反応性が高い構造（活性化）にした上でこれを用いている。活性化の方法としては二つ有り、その一つは有機合成的手法を用いてアミノ酸を活性化する方法（即ち、上記方法 1一 1) で有り、他の一つはミセル内部で縮合剤を用い、アミノ酸を活性化する方法（即ち、上記方法 1一 2) である。

どちらの方法で行うかは任意であるが、方法 1一 2のメリットとしては、例えば、 1 ) アミノ酸を活性化させずに用いることが出来る、 2) ミセル中で活性ェステルを形成させるので活性化アミノ酸のように単離精製する必要が無く不安定な活性化アミノ酸でも用いることが出来る、等の点が挙げられる。

方法 1一 1で用いられる活性化アミノ酸としては、例えば、以下の如きものが挙げられる。

a) エステル系

アミノ酸シァノメチルエステル（N V o c— a a— O C M)

アミノ酸フエノールエステル（N V o c— a a—〇 P h e )

b) スクシンイミド系

アミノ酸スクシンイミドエステル（Nv o c— a a— O S u)

c ) チォエステル系

アミノ酸チォエステル（Nv o c— a a— S E)

アミノ酸チオフエノ一ルエステル（N v o c— a a— S P h e) d) イミダゾール系

アミノ酸イミダゾライド（N v o c— a a— I m)

e ) 酸無水物系

ァミノ酸対称酸無水物（（Nv o c— a a) ₂〇）

アミノ酸混合酸無水物（N V o c— a a— O— X)

注） N v o c ： 6—二トロべラトリル基、一 a a— ：アミノ酸残基

方法 1— 2 (ミセル内部で縮合剤を用い、アミノ酸を活性化する方法）で用いられる縮合剤としては、例えば、以下の如きものが挙げられる。

2—クロロー 1， 3—ジメチルイミダゾリジゥムへキサフルォロホスフェイト： C I P

N, N ' 一力ルポニルジイミダゾール： C D I ジェチルホスフォロシァニデート： D E P C

ジシクロへキシルカルポジィミド： D C C

なお、方法 1で用いられるアミノ酸は、アミノ基を保護して用いることが好ましい。保護基導入が必要な理由は、アミノ酸の活性化部位とァミノ基とを分子間で反応させないためである。ァミノ基の保護基としては、アミノアシル化後、容易に除去可能なもので有れば、何れの保護基でも良いが、例えば 6 -ニトロベラトリル基（N V o c ： 3 5 4 n mの紫外光を照射することで脱離可能）やペンテノィル基（P e n t e n o y 1 ) 等が好ましいものとして挙げられる。前者はアミノアシル化後蛋白質合成系に用いる際、 U Vランプを 1 0分ほど照射することで脱離可能である。また、後考はアミノアシル化後、蛋白質合成系に用いる際、約 1 O m Mのヨウ素液で 1 0分位室温で処理することにより簡単に脱離可能である。本発明の方法 1は、通常、界面活性剤の存在下で行われる。界面活性剤としては、カチオン性界面活性剤、ァニオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤の何れでも良く、また、数種の界面活性剤を混合した系（例えば非イオン性界面活性剤とカチオン性界面活性剤）も使用可能であるが、カチオン性界面活性剤を用いた系が最も高収率でアミノアシル t R N Aを得ることが出来る。カチオン性界面活性剤の好ましい具体例としては、例えばセチルトリメチルアンモニゥムクロリド（C T A C 1 ) 等が挙げられる。ァニオン性界面活性剤の好ましい具体例としては、例えばドデシル硫酸ナトリウム（S D S ) が挙げられる。両性界面活性剤の具体例としては、例えばホスファチジルエタノールアミン等が挙げられる。また、非イオン性界面活性剤としては、エーテル型、エーテルエステル型、エステル型、含窒素型等何れのものでも良いが、例えばポリオキシェチレンゾルビタン脂肪酸エステル等のエーテルエステル型の非イオン性界面活性剤が好ましいものとして挙げられる。より具体的な商品名としては、 T w e e n ^#— 2 0， 4 0 , 6 0， 8 5 '等が挙げられる。

また、界面活性剤を使用する代りに、ポリエチレンイミンゃ表面にカチオン性基を持ったデンドリマーを使用した系も可能である。

ミセルは O /W (水中油滴）型が好ましいが、 W/〇型（逆ミセル）やオイルフリーの系等も可能である。なお、オイルフリーの系で用いられる溶剤としては、例えば N， N—ジメチルホルムアミド（DMF) 等が挙げられる。

また、 O/W (水中油滴）型でのオイル分としては、例えば、トルエンや酢酸ェチル、テトラヒドロフラン（THF) 等が挙げられる。

本発明の方法 1において、ミセル中の界面近傍へ t RN Aの 3 ' 末端水酸基部分のみを挿入する方法としては、例えば、ペプチド核酸（PNA) 末端へ疎水性官能基を導入したものを、 t RN Aの 3 ' 末端近傍へ疎水基が来るように、 t R NAへ部位特異的相補結合させて、 3 ' 末端基部分を疎水性にする方法が挙げられる。

本発明の方法 1において用いられるペプチド核酸（PNA) としては、合成し易く t RNAとの結合を制御しやすい、鎖長 n = 4~ l 0のものが挙げられる。また、 PNAに導入する官能基としては、例えば、リトコール酸等のコール酸残基（ステロイド骨格を有する）、デカン酸等の水に難溶性の脂肪族カルボン酸残基、フルォレニルメチルォキシカルポニル基（Fmo c基）等のアミノ保護基等が挙げられる。 .

疎水性官能基をアミド結合によりべプチド核酸に導入する方法としては固相合成を用いる方法が一般的である。

方法 1で用いられるペプチド核酸（PNA) の他端は、通常、水溶性を高めるため、及びポリア二オンである t RNAとの親和性を高めるためにカチオン性ァミノ酸、例えばリジン等が 1乃至数分子（通常 2分子、例えば L y s L y s等）導入される。

方法 1で用いられる P N Aの構造の具体例を第 1図に示す。

本発明の方法 1における t RNAのアミノアシル化反応は、通常、エステル交換触媒の存在下に行われる。

本発明の方法において用いられるエステル交換触媒としては、中性付近で高い触媒活性を示すエステル交換触媒が挙げられ、より具体的には、例えば、イミダゾ一ル、ピリジン、ジメチルァミノピリジン等が挙げられ、イミダゾール（P K a 6.8 ) が特に好ましい。

アミノアシル化反応における反応温度は、通常 0〜 5 0 °Cである。

反応温度の決定は用いる P N Aの鎖長に依存する。即ち、短い鎖長を用いる場合は低温、長い鎖長は高温で、となる。

反応 p Hは生理的条件範囲、即ち、 pH 7付近（± 1.0) で行われる。

以下に、方法 1のアミノアシル化方法の操作手順の一例を示す。

アミノアシル化操作手順：

1. イミダゾ一ル緩衝液をマイクロチューブに入れ、次に界面活性剤を加える。

2. 超音波処理を 5分間行いミセル化する。

3. アミノ酸活性エステルを加え激しく撹拌する。

4. t RN Aを加えて撹拝し室温にて反応を開始させる（ 1時間）

反応後は、抽出（フエノ一ルクロ口ホルム抽出）によりペプチド核酸を t RN

Aから除去後、塩析（エタノール沈殿）により t RN Aを沈殿させることで単離する。

以下に、本発明のアミノアシル化方法全てに、ほぼ共通した単離精製方法の操作手順の一例を示す。

単離精製法操作手順

1. 反応混合液（〜2 0 i L) に 40 Lの 1. 5M N a 0 A c ( p H 4. 5 ). を加える。

2. 溶液と同量のフエノールを加える。

3. 激しく撹拌後、 4 、 1 5 0 0 0 r pmで、 1 0分間遠心する。

4. 上層（水層）を取り他のマイクロチューブに移す。このとき P NAは界面にあるので一緒に取らないようにする。

5. 下層（フエノール層）に 40 Lの 1. 5 M N a OA c ( p H 4. 5) を加える。

6. 激しく撹拌（ポルテックスで）後に 40 °C、 1 5 0 0 0 r p mで、 1 0分間遠心する。

7. 上層（水層）を取り他のマイクロチューブに移す。このとき PNAは界面にあるので一緒に取らないようにする。集めた上層と同量のクロ口ホルムを加え、撹拌後に 4°C、 1 5 0 0 0 r pmで、 2分間遠心しクロ口ホルム層（下層）を除去する。

8 · 溶液の 3倍量の 1 0 0 %エタノールを加え、軽く撹拌し— 3 0 °Cで， 3 0 分間放置する。

9. 4°C、 1 5 0 0 0 r pmで、 3 0分間遠心する。

1 0. 上清（上澄液）をピペットマンで取り除く。このときに下の沈殿物（核酸）を取らないように注意する。

1 1. 9 0 %エタノール 2 0 0 Lを静かに加える。

1 2. 4°C、 1 5 0 0 0 r pmで、 5分間遠心する。

1 3. 上清（上澄液）をピペットマンで取り除く。このときに下の沈殿物（核酸）を取らないように注意する。

1 4. 乾燥（減圧下）する。

アミノアシル化の解析は H P L C及び T〇 F— M Sを用いて行えば良い。方法としてはアンチセンス分子によりァミノァシル化された t RN Aを n u c 1 e a s e S 1にてアミノアシル末端をモノヌクレオチドに分解する方法が好適である, もし、ァミノァシル化されているのであればアミノアシル AMPを検出出来る。次に、 t RN Aと特異的相補結合するべプチド核酸をアンチセンス分子として介在させることにより t RNAとアミノ酸を近接させて反応させる方法（方法 2 ) について述べる。

t RNAの 3 ' 末端水酸基とアミノ酸を反応させるために、 t RNAに対して相補的配列をもつアンチセンス分子としてペプチド核酸（PNA) を用い、且つ、この P N A末端に予めアミノ酸活性化エステルを結合させておき（必要に応じてリンカ一なども併用）、このアミノ酸結合 P N Aを、アミノ酸が t RNAの 3 ' 水酸基に近接するように、 t RN Aへ相補結合させる、このようにして、エステル交換反応させれば、 3 ' 水酸基が選択的にアミノアシル化されることを本発明者らは見出した。

また、 DNAをアンチセンス分子として併用し、この DNAへ、上記のァミノ酸結合 P N Aを相補結合させると共に、アミノ酸が 3 ' 水酸基に近接するように D N Aを t RN Aに相補結合させる、これを、同様にエステル交換させて、 3 ' 水酸基がアミノアシル化出来ることも確認した。

便宜上、前者を二元系、後者を三元系と呼ぶ。

いずれにおいても、アンチセンス分子は、反応後、離脱させる。それぞれの特徴は反応停止剤が異なる点であり、前者（二元系）の場合はアンチセンス分子と相補対形成するアンチセンス分子を用いる点であり、後者（三元系）は温度を上昇させる（例えば 2 5°C) 点である。

また、前者は、 DN Aを用いないため、反応場の環境対応性に巾がある（PN Aがより安定）点であり、後者は、より多種類の非天然アミノ酸に対応出来る点である。

アミノアシル化の反応機構を第 2図に示す。

アンチセンス分子 (AOと記載）は 1 ) 混合することで t RN Aを塩基配列特異的に結合する、 2) 反応開始剤を加えることでアミノアシル化活性を発現する、 3 ) 反応停止剤を加えることで t RN Aと解離する、の三段階にて目的とする t RN Aを完璧な制御の下にアミノァシル化する。

以下、二元系、三元系で用いられるアンチセンス分子の構造について順を追つて説明する。

( 1 ) 二元系で用いられるアンチセンス分子について

好ましいアンチセンス分-了- (AO) の構造：

PNAとしては、 t RNAと結合する配列として、鎖長 4〜 1 0 (合成し易く t RN Aとの結合を制御しやすい鎖長範囲）のものが好ましい。具体例としては、例えば、鎖長 n = 9の AAGCGTGGT、鎖長 n = 8の A G C G T G G T、鎖長 n= 7の GC GTGGT、鎖長 n = 6の C GTG G T等が好ましいものの例として挙げられる。

水溶性を高めるため、そしてポリア二オンである t RNAとの親和性を高めるために末端にはカチオン性アミノ酸、例えばリジン等を 1乃至数分子（通常 2分子）導入することが好ましい。また、活性エステルと t RN Aの水酸基とを近接させるためにリンカ一を用いるのが好ましい。

リンカ一としては、例えば、一 CH₂CH₂CH₂—、一 CH₂CH₂CH₂CH₂— 一 CH₂OCH₂CH₂OCH₂CH₂—、或いは、下式 H 0 meta, or para

で示される基（ a b Zと略す。）等が挙げられる。

上記 a b Zはべプチド結合とフエニル環との間が共役系になっているために P N A - t RN Aの塩基対の共役系と π電子系相互作用することが期待され、結果として反応部位の近接が狙える可能性がある。

活性エステル化の方法としては、固相合成によりこれを行えばよい。

アミノ酸—アンチセンス分子（ a a- ΡΝΑ) の合成法の一例を以下に示す。

Fmo c— S AL— P EG— R e s i n (WATANABE chemical) に P N Aモノマ ― (アプライドバイオシステム社）を合成する配列に従い伸長させる。

縮合剤としては、例えば、 o—（ 7—ァゾベンゾトリアゾールー 1一ィル） 1 , 1 , 3， 3 -テトラメチルゥロニゥムへキサフルォロホスフェート： HATU (WATANABE Chemical) 、ジイソプロピルェチルァミン： D I EA (WATANABE ch emical) 等が使用し得る。

溶媒としては、例えば、ジメチルァセトアミド： DMAA (WADNABE chemica 1) を使用）等が好ましく使用し得る。

次いでリンカ一、活性エステル、アミノ酸を順次縮合させることで合成し、合成後はトリフルォロ酢酸（T FA) にて切り出しを行い、 HP L Cにて精製することにより目的物が得られる。 .

活性エステルとしては、例えば、チォエステル誘導体、シァノメチルエステル誘導体、スクシンイミドエステル、 m— （又は p—）置換フエニルエステル誘導体等が好ましく用いられる（第 3図に構造式記載）。

本発明で用いられるアミノ酸一アンチセンス分子（a a- P NA) の好ましい例としては、例えば、下記一般式 [ 1 ]

H- c Am- PNA-L^l-E-Am [ 1 ]

[式中、一 c Am—はカチオン性アミノ酸残基又は 2〜 5のカチオン性アミノ酸から成るオリゴペプチド残基を表し、一 P NA—はペプチド核酸残基を表し、一 L一はリンカ一を表し、一 E—は活性エステル残基を表し、一 Amは t RNAに導入すべきアミノ酸残基を表す。 ] で示される化合物が挙げられる。

各構成成分の詳細については既に述べた通りである。

なお、 t RN Aに導入すべきアミノ酸は、天然、非天然の何れにても良いが、これまで t RNAへの付加 ( t RNAのァミノァシル化) が非常に困難とされていた非天然アミノ酸に適用するのがより効果的である。

適用可能な非天然アミノ酸としては、例えば、蛍光性アミノ酸、電子供与性ァミノ酸、電子受容性アミノ酸、光分解性アミノ酸、光異性化アミノ酸等種々のァミノ酸が挙げられる。

本発明で用いられるアミノ酸一アンチセンス分子（a a- P NA) の好ましい例を構造式で示すと第 3図のようになる。

(2) 三元系で用いられるアンチセンス分子について、

ペプチド核酸（P NA) と併用するアンチセンス分子としては、 DNAが好ましい。 RNAは高価（DN Aの 1 0倍程度）であり、安定性が DN Aと比較して低く、 t RNAとの結合が DNAと比較して弱いので好ましくない。また、 PN Aは、長鎖 P N Aになると合成が容易ではなく、また、 t RNAとの結合が強すぎるので温度での制御が難しい等の問題点がある。

好ましい D N Aの鎖長としては（7〜： L 2) + (0〜 2) + ( 1 0 - 2 3) のものが挙げられる。

( 7- 1 2 ) ： PNAと結合（ハイプリッド）する配列。制御し易い長さに限定。

( 0〜 2 ) ：活性エステル部位の長さに対応したスぺ一サ一配列。

( 1 0〜 2 3 ) ： t R N Aと結合する配列。制御し易い長さに限定。

一方、アンチセンス分子（AO) の PNAとしては、 DNAと結合し、 t RN Aとは結合しない配列（鎖長 7 ~ 1 2) のものが好ましい。

長すぎると D N Aとの結合が強すぎる結果、結合を温度で解離することが難しくなり、一方、短すぎると DN Aとの結合が弱すぎる結果、アミノアシル化が起こらなくなる。なお、三元系で用いられる好ましいアミノ酸一アンチセンス分子（a a- P N A) の構造及び合成法は、 2元系におけるそれに準ずる。

次に、アンチセンス分子を用いた本発明のアミノァシル化法の反応条件について述べる。

反応温度は、通常、アミノアシル化活性がある 0〜2 0°Cで行われる。 3 7^：では不活性である。結合が完全に切れるのは 4 5 °Cであるが、それぞれの成分がしっかりと結合しないと反応効率は低下する。

反応温度の決定は用いる P N Aの鎖長に依存する。即ち短い鎖長を用いる場合は低温、長い鎖長は高温で、となる。反応 p Hは生理的条件範囲、つまり pH 7 付近（± 1. 0 ) で行う。

反応は、反応開始剤（触媒）の存在下で行われるが、用いられる反応開始剤としては、中性付近で高い触媒活性を示すエステル交換触媒が挙げられ、より具体的には、例えば、イミダゾ一ル、ピリジン、ジメチルァミノピリジン等が挙げられ、イミダゾール（p K a 6.8) が特に好ましい。

また、本反応においては、酢酸ナトリウム緩衝液等も反応開始剤として効果的に使用し得る。

反応の停止は、 2元系では反応停止剤を用いて行われる。

反応停止剤としては、 a a- P N Aと相補対を形成する P N Aオリゴマー（c P N A) が好ましく用いられる。二重鎖を形成するときの安定性は P N A— P N A > P N A— R N A> P N A— D N Aであることが知られている。従って、 c P N Aは t RNAと結合した a a-P NAを t RNAから引き剥がして PNA二重鎖を形成し得る。これにより反応を停止させることが出来る。

3元系では、反応の停止は、温度を上昇させることにより行われる。上昇させる温度としては、通常 2 5 °C乃至それ以上の温度である。

以下に、方法 2のァミノァシル化方法の操作手順の一例を示す。

アミノアシル化操作手順：

2元系の場合

1. バッファ一をマイクロチューブに入れ、 t RNA、 a a-PNAを加える。

2. 氷上に 5分間静置し、 t RNAと a a- PNAとを結合させる。 3. 反応開始剤（イミダゾ一ル緩衝液）を加え氷上にて反応させる（通常 1〜 2時間）。

；!〜 2時間反応させた後、反応停止剤 c P N Aを加え、反応を停止させる。また、 3元系の場合は概略、以下の通りである。 .

1. バッファ一をマイクロチューブに入れ、 t RN A及ぴテンプレート DNA を加えて、ポルテックス撹拌し、スピンダウンして、両者をハイブリッドさせる。

2. これに a a- P N Aを加えて、ポルテックス撹拌し、スピンダウンして、氷上に 5分間静置する。

3. 反応開始剤（イミダゾール緩衝液）を加え氷上にて反応させる（通常 2時間）。

2時間反応させた後、氷浴を外し、温度を 2 5 Cに上昇させて、反応を停止させる。

どちらの場合も、反応後の単離精製方法は、ミセル系での方法（方法 1 ) のところで記載した単離精製法に準じてこれを行うことで足りる。

2元系におけるァミノァシル化及び 3元系におけるアミノァシル化（DNAをテンプレートした P N Aによるアミノアシル化）のそれぞれについて解析し、図示化した結果を第 4図及び第 5図にそれぞれ示す。

本発明の方法によれば（方法 1及び 2の何れの方法においても）、天然、非天然を問わず、種々のアミノ酸を効率よく t RN Aに導入、ァミノアシル化することが出来るが、特に、従来のアミノアシル t RNA合成酵素では t RNAに結合出来なかった非天然アミノ酸、例えば天然アミノ酸と大きく構造が異なる非天然アミノ酸や、蛍光性を有するアミノ酸、光異性化能を有するアミノ酸、酸化能力を有するアミノ酸、 H I Vウィルスに薬効があるアミノ酸等を t RNAに導入するのがより効果的である。

第 6図に本発明の方法により t R N Aに導入可能な非天然アミノ酸を例示する。第 6図中、 1 , 8， 2 1 - 2 3, 3 0〜 3 5のアミノ酸は、蛍光性を有するァミノ酸であり、 2 5のアミノ酸は光異性化能を有するアミノ酸であり、 2 8のァミノ酸は酸化能力を有するアミノ酸であり、 1 5のアミノ酸は H I Vウィルスに薬効があるアミノ酸である。なお、特願 2 0 0 2— 2 6 2 3 0 1明細書に記載された内容を、本明細書にすベて取り込む。実施例

以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。実施例 1 (非イオン性ミセルを用いた t RNAのアミノアシル化）

非天然アミノ酸として側鎖にナフチル基を有する 2 -ナフチルァラニンを活性エステル化して用い、これをペプチド核酸（PNA) の存在下、 t RNAと反応させてアミノアシル化を行った。なお、 PNAとしては、疎水基として Fmo c 基を、また、可溶化部位として L y s L y s基を導入した、鎖長 n= 6の C GT G G Tを用いた。

〈アミノアシル化反応液の組成〉

0. 5 M Twe e n^#2 0 5 μ L (最終濃度- 2 5 0 mM)

Nv o c - n a p A l a - O C M ( 1 M /"トルエン）

1 11 L (最終濃度- 1 0 0 mM) ' 4 Mイミダゾ一ル— A c OH PH 6.5 1 L (最終濃度 = 40 0 mM) 0.4 mM t RNA 2 β L (最終濃度 = 8 0 zM)

0.8 mM Fmo c - P N A 1 n L (最終濃度 = 8 0 M)

1 0 L

〈操作手順〉

イミダゾール緩衝液、次いで Twe e n^#2 0を加え、超音波によりミセル化させた。次に活性化アミノ酸 N v o c— n a p A l a— O CMを加え、ピぺッチングにて混合した。透明になっていることを確認後、 t RNA及び Fmo c— P N Aを加えて反応を開始した。

1時間反応させた後、段落 [ 0 0 1 6] に記載の単離精製法の操作手順に従つてフエノールクロ口ホルム処理及びエタノール沈殿による t RNA精製を行なつた。収率： 1 4 %。

(n u c l e a s e処理及び H P L C分析〉

得られた化合物に n u c 1 e a s e S I緩衝液（PH4.5 ) を 1 0 / L加え、これに n u c l e a s e S I ( 1 0 01111 1 3 /^/ ）を 0. 5〃 Lピべッテイングしながら加えた。 3 7 °Cで 1 0分間インキュベートした後、 HP L Cで分祈した。

(H P L C測定条件）

0. 1 M 酢酸アンモニゥム /M e OH、流速 = 0.6m l /m i n、 C I 8力ラム、 2 % u p (0 - 1 0 0 %) 。

検出波長： 2 6 0 nm (U V- v i s検出器）， 2 8 5/3 3 0 nm (蛍光検出器）

その結果、 HP L Cによりナフチルァラニル AMPと思われるピークを検出し、そしてそのピークを T O F— M Sで分子量分析した結果、目的物であることが同定出来た（第 7図参照）。実施例 2 (非イオン性ミセルを用いた t RNAのアミノアシル化)

アミノアシル化反応液の組成を下記の如くした以外は実施例 1 と全く同様にして、反応及び後処理を行ない、得られた生成物を実施例 1と同様にして分析して、実施例 1と同様の結果を得た。収率： 1 3 %。

〈アミノアシル化反応液の組成〉

0.5 M Twe e n^#40 5 h (最終濃度 = 2 5 0 mM)

Nv o c - n a p A l a -O CM ( I M/トルエン）

1 n L (最終濃度 = 1 0 0 mM) 4Mイミダゾ一ルー A c〇H PH 6. 5 1 L (最終濃度 = 40 0 mM) 0.4 mM t R N A 2 L (最終濃度 = 8 0 M)

0.8 mM Fmo c - PNA 1 L (最終濃度 = 8 0 z M)

1 0 L 実施例 3 (カチオン性ミセルを用いた t RNAのアミノアシル化）〈アミノアシル化反応液の組成〉

2 0 mM CTAC 1 / 1 0 0 mMィミダゾ一ル（pH 7.5) 1 8 L l O OmM P e n t e n o y 1 - n a pA l a -O CM/DMF 1 L

2 0 0 M t R N A 1 U L

2 0 fi h 上記の反応液をポルテックスミキサーを用いて 1 0分間撹拌した。なお、撹拌を 2 0— 40秒行う毎に卓上遠心器で遠心し、壁面に付着した溶液を落とした。反応液に 1. 5 M A c 0 K 6 0 Lを加え、更にフエノール Zクロ口ホルム

( 1 ： 1 ) 8 0 Lを加えポルテックスミキサーで数秒間撹拌した（白色の懸濁液になった）。続いて 1 5 0 0 0 r p m、 4°Cで数秒間遠心し、上清を取った。採取した上清に CH C 1 ₃/ i - P r OH ( 24 : 1 ) 8 0 Lを加えポルテックスミキサーで数秒間撹拌した（白色の懸濁液になった）。先程と同様に 1 5 0 0 O r pm、 4 で数秒間遠心し、上清を取った。上清にエタノール 3 6 0 Lを加えて軽く混合し、 — 3 0 で 1時間放置した後、 1 5 0 0 0 r pm、 4でで 3 0分間遠心し、上清を除いた。

7 0 %エタノール（一 3 0 °C) 2 0 0mLを加えて 1 5 0 0 0 r pm， 4 で数秒間遠心し、上清を除いた。最期に 1 5分間程度減圧乾燥して、エタノールを完全に蒸発させたのを確認した。乾燥した試料は使用時まで一 3 0でで保存した。乾燥した試料に 1 O X n u c 1 e a s e S I緩衝液 1 0mL、 n u c l e a s e S I lmLを加えて、 3 7 で 1 5分間インキュベートした後、実施例 1 と同様にして H P L C分析を行ない、実施例 1 と同様の結果を得た。収率： 5 0 %。実施例 4 (ァニオン性ミセルを用いた t RNAのアミノアシル化）

〈アミノアシル化反応液の組成〉

1 0 mM S D S /m i 1 1 i Q (超純水） 1 7 L

2 0 0 iM t RNA 1 μ L 1 0 0 mM P e n t e n o y l - n a pA l a -OCM/THF 1 L

1 0 0 mM ィミダゾール緩衝液（ p H 7. 5 ) 1 β L

2 0 L 上記の反応液を室温で 5時間撹拌反応させた。その後、反応液に 1. 5 M A c OKを 6 0 L加え、フエノール/クロ口ホルム 8 0 Lで抽出し、更に、クロ口ホルム 8 0 で抽出した。

エタノール 3 6 0 Lを加え、軽く混合し、一 3 0 °Cで一時間静置した後、 1 5 0 0 0 r p m、 4でで 3 0分間遠心して、上清を除いた。 7 0 %エタノール (― 3 0で） 2 0 0 Lを加えて、 1 5 0 0 0 r p m、 4 °Cで 5秒間遠心し、上清を除いた後、減圧乾燥した。 l O X n u c l e a s e 3 1緩衝液1 0 及び. n u c l e a s e S I を加え、 3 7 °Cで 1 5分間インキュベートした後、実施例 1と同様にして H P L C分析を行ない、実施例 1 と同様の結果を得た。収率： 7 %。 . 実施例 5 [アンチセンス分子を用いた t R N Aのアミノアシル化 ( 2元系) ] 非天然アミノ酸として側鎖にナフチル基を有する 2—ナフチルァラニンを選択し、これをアンチセンス分子に導入した a a - P N Aを用いて、 t RNAのァミノァシル化を行った。なお、使用した a a- P N Aは、前記第 3図に示した a a - P N Aの構造式において、リンカーが前記した a b Z (パラ体）のものである。

〈アミノアシル化反応液の組成〉

a a-P N A ( 1 mM) 0. 5 L

t R NA ( 5 0 0 μ M) 1 u L

1 mMィミダゾ一ル 1 L

( 5 0 0 mM又は 1 M) イミダゾール 1 L

反応停止剤— (mL M) _ ― 0 . 5 L

4 1

〈操作手順〉

a a-P N A, t R A, I mMイミダゾ一ル（p H 7 . 0 ) を混合し、 4 °Cで 5分間静置した。次に 1 M (又は 5 0 0 mM) イミダゾ一ル（p H 7. 0 ) を加え、室温で 2時間静置しアミノアシル化を行った。反応停止剤である c P N A、 n u c l e a s e S I緩衝液 4 1 を加え、 3 7でで 1分間インキュベートして二重鎖 P N Aを形成させた。 5 °Cに急冷後、 1 0 0倍に希釈した n u c 1 e a s e S I ( 1 0 0 u n i t s / i L) 加え、 3 7。Cで 1 5分間インキュベー卜した。

反応後は実施例 1と同様にして後処理を行ない、得られた生成物を実施例 1と同様にして分析して、実施例 1 と同様の結果を得た。収率：約 5 %。実施例 6 [アンチセンス分子を用いた t RNAのアミノアシル化（2元系） ] 実施例 5において、 a a- P NAとして、第 3図に記載の鎖長 = 6の a a - P N Aを用いる代りに鎖長 = 9 (AAGC GTGGT) の a a -P N Aを用いて反応を行った。

〈アミノアシル化反応液の組成〉

a a-PNA ( 40 0 M) 1 L

t RNA ( 2 0 0 t M) 2 u L

1 mMリン酸緩衝液 2 t L

リン酸ナトリウム 3 L

m i 1 1 i Q (超純水） 2 L一

1 0 /i L

反応停止剤

40 0 μΜ c PNA 1 L

〈操作手順〉

I mMリン酸緩衝液、 m i 1 1 i Q及び t R N Aを混合し、 8 0でで 2分間ィンキュペートした後、 a a— P N Aを加え、 5 °Cで 2分間静置して八イブリダィゼ一シヨンさせた。

次いで、リン酸ナトリウムを加え、アミノアシル化を行った。

反応停止剤である c P N A及び 3 0 0 mM A c OK ( p H 4.5 ) 9 z Lを加え、反応停止した後、フエノール/クロ口ホルム処理、エタノール沈殿を行った。沈殿物を M i l l i Q 1 0 /z l に溶かし、 l O X n u c l e a s e S I緩衝液 9 L及び n u c 1 e a s e S I 1 1加え、 3 7 °Cで 1 5分間インキュべ —卜した。

反応後は実施例 1と同様にして後処理を行ない、得られた生成物を実施例 1と同様にして分析して、実施例 1と同様の結果を得た。収率 1 9 %。実施例 7 [アンチセンス分子を用いた t R N Aのアミノアシル化（ 3元系） ] 実施例 3で用いたものと同じ a a- PNAを用い、 PNAと t RNAとを近接させるテンプレートとして DNA 1 4 (RN Aと結合する DNAの鎖長が 1 4のもの）を用いて、 t RN Aのアミノアシル化を行った。

( 1 ) t RNAとテンプレート DNAとのハイブリダィゼーシヨン

マイクロチューブに以下の溶液をピベッティングにより混合し、ポルテックス撹拌し、スピンダウンした。

t RNA ( 5 0 0 μ M/Q) 2 5 L (最終濃度 = 3 5 7 / M)

D N A 1 4 (0.8 6 mM/Q) 7.2 6 L (最終濃度 = 1 7 8 M) l O OmMトリス緩衝液 pH 6.8 1.7 5 z L (最終濃度 = 5mM) m i 1 1 i Q (超純水) 0.9 8 L

3 5 L

この溶液を 8 0でで 1 0分間インキュベーション後、 P C Rの装置中にて室温まで冷却した。

(2) 次に、 1.6mLのマイクロチューブを用意しそれに上記ハイプリダイゼーシヨン溶液 1 3.5 Lを加えて氷上に静置した。

( 3) a a-P N A/ 1 0 mMトリス緩衝液 p H 6.8を氷上にて調製した。次いで、マイクロチューブに以下の溶液をピべッティングにより混合し、ポルテックス撹拌し、スピンダウンした。

a a-P N A ( 1.5 mM/D M S O) 0.5 2 L (室温に戻ってから開ける）

m i 1 1 i Q (超純水) 1. 5 6 L

2. 0 8 μ L

( ) 上記（2 ) のマイクロチューブに上記（ 3) で調製した a a-P N Aを 0. 5 Lづっ加えピペッティング、ポルテックス撹拌、スピンダウンし、氷上に 5 分間静置した。

( 5) 上記マイクロチューブに 4 Mイミダゾールー A c〇H緩衝液 PH 6. 5を 1.9 3 L加え、氷上にて反応を開始させた。反応時間は 2時間とした。

(6) 反応後は実施例 1 と同様にして後処理を行ない、得られた生成物を実施例 1と同様にして分析して、実施例 1と同様の結果を得た。収率： 6 %。

なお、上記（ 5) において、イミダゾ一ルー A c OH緩衝液の代りに酢酸ナトリウム緩衝液を使用したところ、収率が 9 %に向上した。実施例 8 [アンチセンス分子を用いた t RN Aのアミノアシル化（3元系） ] 実施例 4において、 t RN Aとテンプレート DN Aとのハイブリダィゼ一ション溶液における、テンプレートとしての D N A 1 4 (0.8 6 mM/Q) 7.2 6 L (最終濃度 = 1 7 8 M) の代りに、 DNA 2 3 (RNAと結合する DNA の鎖長が 2 3のもの）（ 0.9 2mM/Q) 6.7 9 ^ L (最終濃度 = 1 7 8 /2 M) を用い、 m i 1 1 i Q (超純水） 0.9 8 Lを 1.4 6 x Lとした以外は、実施例 4と全く同様にして、反応及ぴ後処理を行ない、得られた生成物を実施例 4と同様にして分析して、実施例 4と同様の結果を得た。収率： 5 %。実施例 9 (ポリエチレンイミンを用いた t RNAのァミノァシル化）

〈アミノアシル化反応液の組成〉

ポリエチレンィミン（ 1. 0 9mg) /m i 1 1 i Q 1 7 a L t RNA 1 li L

0. 1 M P e n t e n o y 1 -n a pA l a -OCM/DMF 1 L

1 0 0 mMイミダゾール（ p H 7. 5 ) 1 u L

2 0 u L 上記の反応液を室温で 3. 5時間撹拌反応させた。その後、反応液に 1. 5 M A c〇K 7 0 ; Lを加え、フエノール/クロ口ホルムを等量加えて抽出し、更に、クロ口ホルムを等量加えて抽出した。エタノール 3 6 0 ^ Lを加えて軽く混合し、 — 3 0 °Cで 1時間静置した後、 1 5 0 0 0 r pm、 4 °Cで 3 0分間遠心して上清を除いた。 7 0 %エタノール（一 3 0 °C) 2 0 0 /z Lを加えて、 1 5 0 0 0 r pm、 4°Cで 5秒間遠心し、上清を除いた後、減圧乾燥した。 l O X n u c l e a s e 3 1緩衝液 1 0 11 加ぇ、 l O X n u c l e a s e S I でモノマーに分解した。分解した溶液 1 1 H Lと酢酸アンモニゥム溶液 4 0 ^ Lを取り、これを実施例 1と同様にして H P L C分析し、実施例 1と同様の結果を得た。収率： 5 %。実施例 1 0 (表面にカチオン性基をもったデンドリマ一を用いたアミノアシル化）

〈アミノアシル化反応液の組成〉

A液： 0. 4 5 mMデンドリマー/ 1 0 0 mMイミダゾ一ル緩衝液 1 8 /i L (G 3 - C 6 NM e 3 1 . 2 m g , G 3 - C 1 I NM e 3 1. 4 m g , G 4 - C 6 NM e 3 2. 4 m g , G 4— C l l NM e 3 2. 8 m gをそれぞれ 1 0 0 mMイミダゾ一ル緩衝液に加えて溶解した。）

B液： l O O mM P e n t e n o y 1 - n a p A l a - O C M/DM F

1 L

C液： 0. 2 mM t R N A/H₂0 1 ja L

2 0 L 上記 A液， B液， C液の 3液をマイクロチューブ中で混合し、室温で 5分間、ポルテックスミキサ一（超音波）で撹拌した。その後、反応液に 1 . 5 MA c O K 6 0 μ Lを加えて反応を停止させ、フエノールクロ口ホルム 8 0 Lを加えて抽出した。上清を回収し、クロ口ホルム 6 0 Lを加えて抽出した。次いで、エタノール 3 6 O Lを加えて一 3 0でで 1時間静置した。 1 5 0 0 0 p p m、 4 ^で 3 0分間遠心し、上清を取り除いて 7 0 %エタノール（― 3 0 ^：) 加え、 1 5 0 0 0 p p m, 4 °Cで 5秒間遠心した。上清を取り除き、 1 5分間減圧乾燥して目的物を得た。収率 2 1 %。

生成物に l O X n u c l e a s e S I緩衝液 l O ^ Lと l O X n u c l e a s e S I 1 Lを加え、 3 7 °Cで 1 5分間インキュベートして S 1分解を行った。分解した溶液に酢酸アンモニゥム溶液を加えて全量を 5 にし、これを実施例 1と同様にして H P L C分析し、実施例 1 と同様の結果を得た。実施例 1 1 ( P e n t e n o y 1 - n a p A 1 a— O S uを用いたアミノアシル化）

活性エステルとして、シァノメチルエステル（OCM) の代りにスクシンイミドエステル（O S u) を用いて、実施例 3と同様にして t RN Aのアミノアシル化を行った。

〈アミノアシル化反応液の組成〉

2 0 mM CTAC 1 / 1 0 0 mMィミダゾ一ル（ρΗ 7. 5) 1 8 ji h

1 0 0 mM P e n t e n o y 1 - 2 - n a p A 1 a - O S u /DM F 1 μ L

2 0 上記試料を混合し実施例 3と同様に超音波で撹拌し反応させた後、実施例 3と同様にして後処理を行ない、実施例 1 と同様にして HP L C分析を行なって、実施例 1 と同様の結果を得た。収率 3 0 %。産業上の利用可能性

従来のアミノアシル化法の欠点は、 1 ) 天然アミノ酸に類似した構造を持つァミノ酸しか導入できない、 2 ) 導入したいアミノ酸に対応する人工アミノアシル合成酵素をそれぞれ作製しなくてはならず、また、作製する為に膨大な労力が必要とされる、という点が主に挙げられる。

これに対し、本発明の方法によれば、それぞれのアミノ酸に対応する人工アミノアシル合成酵素を作製、使用する必要が無く、有機化学的手法を用いて所望のアミノ酸を t RNAに導入することが出来るので、従来のアミノアシル t RN A 合成酵素では t RNAに結合出来なかった非天然アミノ酸、例えば天然アミノ酸と大きく構造が異なる非天然アミノ酸や、蛍光性を有するアミノ酸、光異性化能を有するアミノ酸、酸化能力を有するアミノ酸、 H I Vウィルスに薬効があるァミノ酸等々、どの様なアミノ酸でも効率よくアミノアシル化することが出来る。アミノアシル化 t RNAが容易に得られるようになれば、非天然アミノ酸導入蛋白質の実用化が進むであろうが、このとき、本発明者らが先に特許出願しているランダム揷入削除 DN A変異法（特願 2 0 0 1 - 5 7 47 8号明細書）の技術や、本発明者らが先に文献発表している 4塩基コドン法 [Ap p l M i c r o b i o l B i o t e c h n o l ( 2 0 0 1 ) 5 7 ： 2 7 4 - 2 8 1 ] の技術を用いて、有用な蛋白質合成がより効果的に行ない得る。

Claims

請求の範囲

1. t RN Aを選択的にアミノァシル化してアミノアシル t RN Aを製造するに際し、 t RN Aとアミノ酸を近接させて反応させることを特徴とする、 t RN Aのアミノアシル化方法。

2. t RNAとアミノ酸をミセル中の界面近傍に閉じこめ、両者を近接させて反応させる、請求の範囲第 1項に記載のアミノアシル化方法。

3. アミノ酸の力ルポキシル基を活性化して、これをミセル中に閉じこめ、このミセル中の界面近傍へ t RN Aの 3 ' 末端水酸基部分のみを揷入することにより、ミセル中界面近傍で、当該 3 ' 末端水酸基と活性化された力ルポキシル基とを近接させて反応させる請求の範囲第 2項に記載のアミノアシル化方法。

4. アミノ酸の力ルポキシル基をミセル内部で縮合剤を用いて活性化し、このミセル中の界面近傍へ t RN Aの 3 ' 末端水酸基部分のみを挿入することにより、ミセル中の界面近傍で、当該 3 ' 末端水酸基と活性化された力ルポキシル基とを近接させて反応させる請求の範囲第 2項に記載のアミノアシル化方法。

5. ペプチド核酸末端へ疎水性官能基を導入したものを、 t RNAの 3 ' 末端近傍へ疎水基が来るように、 t RN Aへ部位特異的相補結合させて、 3 ' 末端基部分を疎水性にすることにより、ミセル中の界面近傍へ t R N Aの 3 ' 末端水酸基部分のみを揷入する、請求の範囲第 3項又は第 4項に記載のアミノアシル化方法。

6. アミノ基を保護したアミノ酸を用いる請求の範囲第 2項〜第 5項の何れかに記載のアミノアシル化方法。

7. 界面活性剤の存在下で反応を行う請求の範囲第 2項〜第 6項の何れかに記載のアミノァシル化方法。

8. ポリエチレンィミン又は表面にカチオン性基を持ったデンドリマーの存在下で反応を行う請求の範囲第 2項〜第 6項の何れかに記載のアミノァシル化方法。

9. O/W (水中油滴）型のミセル中で反応を行う請求の範囲第 2項〜第 8項の何れかに記載のアミノアシル化方法。

1 0. オイルフリーの系で反応を行う請求の範囲第 2項〜第 8項の何れかに記載のアミノアシル化方法。

1 1. 中性付近で高い触媒活性を示すエステル交換触媒を用いて反応を行う請求の範囲第 2項〜第 1 0項の何れかに記載のアミノアシル化方法。

1 2. t R N Aと特異的相補結合するべプチド核酸をアンチセンス分子として介在させることにより t RNAとアミノ酸を近接させて反応させる、請求の範囲第 1項に記載のアミノアシル化方法。

1 3. アミノ酸を予めエステル結合によりアンチセンス分子に結合させて、 t RNAと反応させる請求の範囲第 1 2項に記載のアミノアシル化方法。

1 4. アミノ酸を活性エステルを介してアンチセンス分子に結合させたものを用いて反応を行う、請求の範囲第 1 3項に記載のアミノアシル化方法。

1 5. アンチセンス分子と活性エステルの間にリンカーを存在させたものを用いて反応を行う、請求の範囲第 1 4項に記載のアミノアシル化方法。

1 6. アンチセンス分子の他端にカチオン性アミノ酸が導入されたものを用いる請求の範囲第 1 3項〜第 1 5項の何れかに記載のアミノアシル化方法。

1 7. 下記一般式 [ 1 ]

H- c Am- PNA-L -E-Am [ 1 ]

[式中、 — c Am—はカチオン性アミノ酸残基又は 2〜 5のカチオン性アミノ酸から成るオリゴペプチド残基を表し、 —PNA—はペプチド核酸残基を表し、 ― L—はリンカ一を表し、一 E—は活性エステル残基を表し、一 Amは t RNAに導入すべきアミノ酸残基を表す。 ] で示される化合物を用いて t RNAと反応を行う請求の範囲第 1 2項に記載のアミノアシル化方法。

1 8. 中性付近で高い触媒活性を示すエステル交換触媒を用いて反応を行う請求の範囲第 1 2項〜第 1 7項の何れかに記載のアミノアシル化方法。

1 9. 反応停止剤を用いる請求の範囲第 1 2項〜第 1 8項の何れかに記載のァミノァシル化方法。

2 0. 反応停止剤が t RNAと特異的相補結合するペプチド核酸と相補対を形成するべプチド核酸である請求の範囲第 1 9項に記載のアミノアシル化方法。

2 1. t RN Aと特異的相補結合するペプチド核酸以外に、更に、 DNAをァンチセンス分子として用いて反応を行う請求の範囲第 1 2項〜第 1 8項の何れかに記載のアミノアシル化方法。

2 2. 反応系の温度を上昇させて反応を停止させる請求の範囲第 2 1項に記載のアミノアシル化方法。

2 3. 反応系の温度を 2 5 °Cに上昇させて反応を停止させる請求の範囲第 2 2 項に記載のアミノアシル化方法。

24. 一般式 [ 1 ]

H- c Am- PNA-L - E -Am [ 1 ]

[式中、 — c Am—はカチオン性アミノ酸残基又は 2〜 5のカチオン性アミノ酸から成るオリゴペプチド残基を表し、一 P N A—はペプチド核酸残基を表し、一 L—はリンカ一を表し、 — E—は活性エステル残基を表し、一 Amは t RNAに導入すべきアミノ酸残基を表す。 ] で示される化合物。

2 5. —般式 [ 1 ] において、 — c Am—が— L y s L y s—であり、 — PN A—が— CGTGGT—であり、 —Amが非天然アミノ酸である請求の範囲第 2 4項に記載の化合物。